UNIVERSIDADE FEDERAL DA BAHIA ESCOLA DE MEDICINA ... · A todos os companheiros de pós-graduação...
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UNIVERSIDADE FEDERAL DA BAHIA ESCOLA DE MEDICINA VETERINÁRIA E ZOOTECNIA PÓS-GRADUAÇÃO EM CIÊNCIA ANIMAL NOS TRÓPICOS MESTRADO AVALIAÇÃO DO INFILTRADO MACROFÁGICO NOS CARCINOMAS MAMÁRIOS DE CADELAS E SUA CORRELAÇÃO COM A TAXA DE SOBREVIDA. CARLOS HUMBERTO DA COSTA VIEIRA FILHO SALVADOR – BAHIA MARÇO/2015
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UNIVERSIDADE FEDERAL DA BAHIA
ESCOLA DE MEDICINA VETERINÁRIA E ZOOTECNIA PÓS-GRADUAÇÃO EM CIÊNCIA ANIMAL NOS TRÓPICOS
MESTRADO
AVALIAÇÃO DO INFILTRADO MACROFÁGICO NOS
CARCINOMAS MAMÁRIOS DE CADELAS E SUA CORRELAÇÃO
COM A TAXA DE SOBREVIDA.
CARLOS HUMBERTO DA COSTA VIEIRA FILHO
SALVADOR – BAHIA MARÇO/2015
II
UNIVERSIDADE FEDERAL DA BAHIA
PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM CIÊNCIA ANIMAL NOS TRÓPICOS
AVALIAÇÃO DO INFILTRADO MACROFÁGICO NOS CARCINOMAS
MAMÁRIOS DE CADELAS E SUA CORRELAÇÃO COM A TAXA DE
SOBREVIDA.
CARLOS HUMBERTO DA COSTA VIEIRA FILHO Medicina Veterinária
SALVADOR – BAHIA MARÇO – 2015
III
CARLOS HUMBERTO DA COSTA VIEIRA FILHO
AVALIAÇÃO DO INFILTRADO MACROFÁGICO NOS
CARCINOMAS MAMÁRIOS DE CADELAS E SUA CORRELAÇÃO
COM A TAXA DE SOBREVIDA.
Dissertação apresentada ao Programa de Pós-
Graduação em Ciência Animal nos Trópicos, da
Universidade Federal da Bahia, como requisito
para a obtenção do título de Mestre em Ciência
Animal nos Trópicos.
Orientador: Profa. Dra. Alessandra Estrela Lima
Co-orientadora: Prof. Dra. Stella Maria Barrouin Melo
SALVADOR-BA
MARÇO/2015
IV
“Nossas dúvidas são traidoras
e nos fazem perder o que, com
freqüência, poderíamos
ganhar, por simples medo de
arriscar.”
Willian Shaekspeare
“Vim, vi e venci”.
Júlio César
V
Agradeço a minha querida família, minha mãe e
meu pai, por me permitirem buscar meus sonhos
e alcançar meus objetivos, e por me oferecerem
apoio sempre.
VI
AGRADECIMENTOS
A Deus, por me proteger e me guiar durante todos esses anos.
A minha mãe, ao meu pai, minha irmã e familiares por tudo, carinho, apoio e dedicação.
Ao meu avô Argone (in memorian), que sei estar feliz por esta minha realização e me
guiando da melhor forma possível.
Aos meus orientadores, pais e amigos de estágio, iniciação científica, monografia,
residência e mestrado durante esses 08 anos de Patologia Prof. Eduardo Luiz Trindade
Moreira e Profa. Alessandra Estrela Lima, que acreditaram em meu potencial e me
proporcionaram a oportunidade de expandir meus conhecimentos e concluir mais esta
etapa na minha vida.
A Suélen, pelo carinho e compreensão nesses anos em que estamos juntos. Te amo!
A Karine e Lorena, eternas irmãs patológicas, pelo apoio e auxílio no desenvolvimento
deste trabalho mesmo distantes.
Ao Prof. Tiago Peixoto, que apesar de pouco tempo em contato como residente me
passou muito conhecimento e sempre está a disposição para discussão de casos
interessantes.
A todos os companheiros de pós-graduação (Mario Jorge, Keidy, Michelle, Dani,
Muller, Aline e Ariane) que me ajudaram no desenvolvimento deste projeto, em
especial a Marília por todo apoio e companheirismo durante essa jornada.
As residentes Nara, Soraya (Soy), Adriana, Viviane e Virginia pela disposição e ajuda
para a conclusão desse trabalho.
VII
As bolsistas PIBIC – Sheila e Ludmilla que ajudaram no desenvolvimento do projeto.
Aos técnicos do LPV – Eva, Altemar, Williane, Zacarias e Washington pela
disponibilidade para ajudar sempre que necessário nas atividades do laboratório.
Aos estagiários do LPV – Ludmilla, Sheila, Thanielle, Jamile, Ane, Gilmar, Estela,
Viviane, Virginia, Marcela. Gilmar e Simone pela disposição sempre que necessitei de
ajuda.
Aos Setores de Cirurgia e Clínica de Pequenos Animais do HOSPMEV/UFBA pelo
apoio e disponibilização da sua estrutura para a realização do projeto.
Aos meus amigos do bairro (Ednei, Edcarlos, Alexandre “Sapuia”, Alisson e Silvano)
pelas horas de descontração para descansar a “cabeça” e voltar aos estudos, entendendo
também meus momentos de ausência.
A Profa. Stella Maria Barrouin pela co-orientação e apoio no desenvolvimento deste
trabalho.
A Emanoel (Guga) pela paciência, disponibilidade e grande ajuda na realização das
análises estatísticas.
As Instituições e Laboratórios parceiros no desenvolvimento do Projeto de neoplasias
mamárias em cadelas – Centro de Pesquisa Reneé Rachou, LIVE-HOSPMEV/UFBA e
LPC-UFMG.
Aos professores e funcionários do Setor de Anatomia Veterinária da EMEVZ/UFBA
por entenderem a minha necessidade de realizar o mestrado.
A Escola de Medicina Veterinária e Zootecnia da Universidade Federal da Bahia que
me deu condições para realização desse trabalho.
VIII
LISTA DE FIGURAS
Página
Figura 1 Modelo da função das células na resposta imune inata e
adquirida associadas ao câncer.
23
Figura 2 Migração de monócitos circulantes para o microambiente
tumoral.
25
Figura 3 Papel protetor do receptor de progesterona na mama ao inibir
a ativação do NF-κB.
30
Figura 4 Animais divididos em grupos a partir da presença ou
ausência de metástase e em subgrupos pela utilização ou não
de tratamento quimioterápico com a Carboplatina.
35
Figura 5 Clínica, cirurgia e tratamento quimioterápico. 37
Figura 6 Metástases de CaTMB observadas durante exame
necroscópico.
37
Figura 7 Avaliação macroscópica da cadeia mamária. 41
Figura 8 Critérios utilizados na graduação de tumores mamários de
cadelas conforme o grau de malignidade.
42
Figura 9 Análise quantitativa do infiltrado inflamatório associado ao
tumor.
44
Figura 10 Análise da imunomarcação com as proteínas SOCS1 e
SOCS3 no infiltrado inflamatório macrofágico associado ao
tumor.
46
Figura 11 Carcinoma em Tumor Misto Benigno (CaTMB) com
metástase para linfonodo e análise morfológica e quantitaiva
do infiltrado inflamatório associado a neoplasia.
51
Figura 12 Composição do infiltrado inflamatório associado ao CaTMB. 54
Figura 13 Caracterização da expressão das proteínas SOCS1 e SOCS3
no infiltrado macrofágico associado ao CaTMB em cadelas.
55
Figura 14 Expressão das moléculas MHCI e MHCII nos monócitos e
densidade de macrófagos intratumorais no carcinoma em
tumor misto.
59
Figura 15 Taxas de sobrevida dos animais com CaTMB. 60
IX
LISTA DE TABELAS
Página
Tabela 1 Intervalo de intensidade dos tipos celulares nos carcinomas
mamários (ESTRELA-LIMA, 2011).
44
Tabela 2 Dados referentes aos anticorpos utilizados. 45
Tabela 3 Análise morfológica e quantitativa do infiltrado inflamatório
macrofágico peri e intratumoral, associado com a presença ou
ausência de metástase e tratamento.
50
Tabela 4 Associação entre parâmetros clinico- patológicos com intervalos
distintos de macrófagos <400 ou ≥400.
53
Tabela 5 Análises univariada e multivariada dos parâmetros clínico-
patológicos associados com o maior intervalo macrofágico (≥400).
61
X
LISTA DE ANEXOS
Página
Anexo 1 Certificado de aprovação na CEUA (EMEVZ/UFBA) 72
Anexo 2 Ficha oncológica específica. 73
Anexo 3 Termo de doação para realização da necropsia. 75
Anexo 4 Tabela com os resultados da análise hematológica. 76
XI
LISTA DE ABREVIATURAS
BSA
CaTMB
cm
CD
CEUA
Albumina bovina sérica
Carcinoma em Tumor Misto Benigno
Centímetro
Cluster de diferenciação
Comitê de Ética e Experimentação Animal
CD4
COX-2
EDTA
Marcador de superfície celular da subpopulação de linfócitos T auxiliares
Ciclo-oxigenase 2
Ácido Etileno Diamino Tetracético
EMEVZ Escola de Medicina Veterinária e Zootecnia
FACS
FITC
FL1
FL2
FL3
FSC
G
Fluorecence Acitivated Cell Sorter
Isotiocianato de fluoresceína
Fluorescência tipo 1
Fluorescência tipo 2
Fluorescência tipo 3
Forward scatter (Tamanho celular)
Grama
HE
HER-2
HOSPMEV
Hematoxilina-Eosina
Receptor de Fator de Crescimento Epidérmico 2
Hospital de Medicina Veterinária
XII
ICB
IMF
LIVE
LLD
LLE
MHCI
MHCII
Mg
Instituto de Ciências Biológicas
Intensidade média de fluorescência
Laboratório de Infectologia Veterinária
Látero-lateral direita
Látero-lateral esquerda
Complexo Maior de Histocompatibilidade classe I
Complexo Maior de Histocompatibilidade classe II
Miligramas
mL Mililitro
mm
m2
OMS
OSH
PBS
PE-Cy-5
pg
R-PE
rpm
SOCS
SSC
TMB
Milímetro
Metro quadrado
Organização Mundial de Saúde
Ovariossalpingohisterectomia
Salina tamponada com fosfato
Ficoeritrina conjugada com cianina
Picograma
Ficoeritrina
Rotações por minuto
Supressor de sinalização de citocinas
Side Angle Light Scatter (Granulosidade celular)
Tetrametilbenzidina
XIII
UFBA Universidade Federal da Bahia
UFMG
VD
μg
μL
μm
Universidade Federal de Minas Gerais
Ventro-dorsal
Micrograma
Microlitro
Micrômetro
n =
Número de casos
XIV
SUMÁRIO
Página
Resumo
Abstract
1. Introdução ................................................................................................... 17
2. Revisão de literatura .................................................................................. 19
2.1 Neoplasias mamárias em cadelas............................................................. 19
2.2 Inflamação e o câncer......................................... ..................................... 22
2.3 Macrófagos e neoplasias mamárias................... ...................................... 28
3. Hipóteses....................................................................................................... 32
4. Objetivos ...................................................................................................... 32
4.1 Objetivo geral .......................................................................................... 32
4.2 Objetivos específicos ............................................................................... 32
5. Materiais e Métodos ..................................................................................... 34
5.1 Seleção de animais e grupos experimentais............................................. 34
5.2 Avaliação clínica e mastectomia ............................................................. 35
5.3 Acompanhamento e sobrevida................................................................. 36
5.4 Imunofenotipagem do sangue periférico no contexto ex vivo................. 38
5.5 Biópsia excisional e histopatológico....................... ................................ 40
5.6 Caracterização da neoplasia............................ ........................................ 40
5.6.1 Classificação histopatológica................................. ................................. 40
5.6.2 Graduação histopatológica................................................................ 42
5.6.3 Análise morfológica e quantitativa do infiltrado inflamatório
tumoral........................................... ..................................................................
43
5.7 Avaliação Imunoistoquímica......... ...................................................... 45
5.8 Tratamento quimioterápico ..................................................................... 47
5.9 Análise estatística..................... .............................................................. 48
6. Resultados e Discussão ................................................................................ 49
7. Conclusões ................................................................................................... 62
8. Referências ....................... ........................................................................... 63
9. Anexos ........................................................................................................ 72
XV
Avaliação do infiltrado macrofágico nos carcinomas mamários de cadelas e sua
correlação com a taxa de sobrevida.
Resumo
O infiltrado inflamatório no microambiente tumoral, em especial nos tumores
mamários, tem despertado grande interesse na oncologia, por desempenhar diferentes
funções na progressão ou regressão tumoral a depender dos tipos e subtipos celulares
envolvidos. O presente estudo objetivou avaliar (1) a presença e intensidade de
infiltrado macrofágico no microambiente tumoral; (2) a expressão das proteínas SOCS1
e SOCS3 nos macrófagos; e (3) a possível relação destes parâmetros com a evolução
tumoral e a sobrevida, como um possível fator prognóstico em cadelas portadoras de
carcinomas mamários. Foram estudadas 22 cadelas com diagnóstico histopatológico de
carcinoma em tumor misto benigno de mama (CaTMB), divididas em dois grupos,
sendo G1 constituído por cadelas sem metástase (11) e G2 com metástase (11); em G1 e
G2 os animais foram subclassificados de acordo com a utilização ou não do tratamento
quimioterápico. As cadelas foram submetidas a análise clínico-patológica (tamanho do
tumor; presença de metástase em linfonodo; estadiamento clínico; graduação
histológica; distribuição e intensidade do infiltrado inflamatório; quantificação e
verificação do estado de ativação de macrófagos no infiltrado por análise
imunoistoquímica da expressão de SOCS1 e SOCS3), imunofenotipagem de leucócitos
do sangue periférico por citometria de fluxo com marcadores celulares CD14, MHCI e
MHCII, e avaliação da taxa de sobrevida. A morfometria do infiltrado inflamatório
associado ao tumor revelou, em todos os grupos, predominância da distribuição
multifocal e intensidade moderada. A maior proporção de macrófagos no infiltrado
inflamatório (≥400) foi associada a uma maior taxa de sobrevida. A imunomarcação
revelou maiores proporções de macrófagos SOCS3 positivos nas cadelas que não
apresentavam metástases para linfonodo, enquanto que os macrófagos SOCS1 positivos
predominaram nas cadelas com metástase (p<0,05). Adicionalmente, a análise
multivariada revelou associações entre estadiamento clínico, graduação histológica,
sobrevida, tratamento quimioterápico e expressão de moléculas MHCI em monócitos
circulantes. Os resultados das análises quantitativa e qualitativa dos macrófagos no
infiltrado inflamatório indicam que o estado de ativação, sugerido pela maior expressão
das proteínas SOCS3 e 1, define a relação do infiltrado macrofágico com a resposta
imune antitumoral ou com a progressão tumoral associada ao desenvolvimento de
metástases, respectivamente.
Palavra-chave: Tumor de mama, cadela, sistema imune, monócitos.
16
Macrophage infiltration evaluation in mammary carcinomas in female dogs and their
correlation with survival rate.
Abstract
The inflammatory infiltrate in the tumor microenvironment, particularly in breast
tumors, has aroused great interest in oncology due to their different roles in tumor
progression or regression depending on the types and cell subsets involved. The
objective of this study was to evaluate the presence and intensity of macrophage
infiltrate in the tumor microenvironment; the expression of SOCS1 and SOCS3 proteins
in these macrophages; and the relation of the former parameters to tumor development
and survival, as possible prognostic factors of breast carcinomas evolution in female
dogs. Were studied 22 female dogs with histopathological diagnosis of carcinoma in
benign mixed tumor (CaTMB), divided into two groups consisting of animals without
metastasis (G1=11) and animals with metastasis (G2=11); in G1 and G2, the dogs were
graded according with the use or not of chemotherapy. All animals underwent
clinicopathological analysis (tumor size, lymph node metastasis, clinical stage,
histological grade, distribution and intensity of the inflammatory infiltrate, especially
macrophages, as well as their possible activation state by immunohistochemical analysis
anti-SOCS1 and anti-SOCS3) immunophenotyping by flow cytometry of PBMC for cell
markers CD14, MHCI and MHCII, and assessment of survival rate. The morphology of
the inflammatory infiltrate associated with tumor showed, in all groups, prevalence of
multifocal distribution and moderate intensity. The higher intensity of the macrophage
infiltrate (≥400) was associated with a higher survival rate. The immunostaining
revealed a higher proportion of positive macrophages for SOCS3 in dogs who had no
metastasis to lymph node, while the positive SOCS1 macrophages predominated in
animals with metastases (p <0.05). In addition, the multivariate analysis revealed
associations between clinical staging, graduation, survival, chemotherapy and
expression of MHCI molecules in circulating monocytes. The results obtained in the
present study indicated that the activation state, suggested by expression of SOCS3 and
1 proteins, defines the relationship of the macrophage infiltration with antitumor or
immune response to tumor progression associated with the development of metastasis,
respectively.
Keyword: tumor mammary gland, female dog, immune system, monocytes.
17
1. INTRODUÇÃO
A avaliação do infiltrado inflamatório presente no microambiente tumoral, em
especial nos tumores mamários, tem despertado grande interesse na oncologia humana e
atualmente também na veterinária. Acredita-se que a depender dos tipos e subtipos
celulares envolvidos e da intensidade da inflamação, observam-se diferentes funções na
progressão ou regressão tumoral, na resposta ao tratamento, bem como, nas taxas de
sobrevida (ESTRELA-LIMA et al., 2010; HEYS et al., 2012; KIM et al., 2012; SAEKI
et al., 2012).
Dentre as células inflamatórias, os macrófagos são as primeiras células a
responder ao estímulo neoplásico e representa o segundo tipo celular mais frequente
nos infiltrados inflamatórios associados aos carcinomas mamários em cadelas,
superados apenas pelos linfócitos (ESTRELA-LIMA et al., 2010). Alguns estudos
prévios, realizados in vivo e in vitro, vêm demonstrando haver diferenças na resposta
frente ao tumor a depender do estado de ativação dos macrófagos, determinados pelos
produtos (citocinas e quimiocinas) liberados no microambiente tumoral. Estes estudos
ainda sugerem que as células do sistema fagocítico mononuclear, em especial os
macrófagos na sua forma de ativação M1, possam ser importantes na imunidade anti-
tumoral por estarem relacionados com um melhor prognóstico, Enquanto, os
macrófagos M2 estariam correlacionados a presença de tumores de pior prognóstico,
progressão tumoral e ao desenvolvimento de metástases (MANTOVANI et al., 2002;
ONO, 2008; HEYS et al., 2012; SHAN DENG et al., 2012; JOSHI et al., 2014).
Nos carcinomas mamários das mulheres o infiltrado inflamatório relacionado a
uma melhor resposta a quimioterapia apresentava infiltrado macrofágico do tipo pró-
inflamatório. Enquanto que, a pior sobrevida esteve relacionada ao infiltrado de
macrófagos anti-inflamatórios (MANTOVANI et al., 2002;HEYS et al., 2012; SHAN
DENG et al., 2012). Tendo em vista, que a cadela é considerada modelo de estudos para
carcinogênese mamária (QUEIROGA et al., 2011), torna-se imprescindível a
18
determinação do estado de ativação macrofágica nos carcinomas mamários desta
espécie.
Neste contexto, tendo em vista a necessidade de entendimento da dinâmica
interação entre a inflamação e o desenvolvimento tumoral, com a realização deste
trabalho objetivou-se avaliar o infiltrado macrofágico no microambiente tumoral, sua
intensidade e possível estado de ativação, bem como verificar se existe correlação entre
os resultados obtidos e a progressão tumoral, resposta ao tratamento e sobrevida,
atuando como um possível fator prognóstico e preditivo em cadelas portadoras de
carcinomas mamários.
19
2. REVISÃO DE LITERATURA
2.1 Neoplasias mamárias em cadelas
As neoplasias mamárias são os tumores mais frequentes em cadelas
(PELETEIRO, 1994; CASSALI, 2000; DOBSON et al., 2002; MISDORP, 2002;
ESTRELA-LIMA, 2011) e mulheres (HENDERSON; FEIGELSON, 2000). A etiologia
dos tumores mamários é considerada multifatorial, com participação de fatores
ambientais, genéticos, nutricionais e especialmente hormonais (ALENZA et al., 2000;
HENDERSON; FEIGELSON, 2000; SILVA et al., 2004; CLEARY et al., 2010;
QUEIROGA et al., 2011; MISRA et al., 2012). Os principais hormônios que estimulam
a proliferação celular, promovendo as alterações genéticas que darão origem à célula
neoplásica mamária em cães e humanos são o estrógeno, a prolactina, progesterona, os
andrógenos, o hormônio do crescimento e os hormônios tireoidianos (NOGUEIRA;
BRENTANI, 1996; ALENZA et al., 2000; SILVA et al. 2004; QUEIROGA et al.,
2011).
Aparentemente não existe predisposição racial para o acometimento por tumores
mamários na espécie canina (CAVALCANTI; CASSALI, 2006; EZERSKYTE et al.,
2011). Entretanto, estudos realizados no Brasil revelam maior frequência em cães sem
raça definida e mestiços de poodle (LAVALLE et al, 2009; RIBEIRO, 2012). A
frequência do tumor de mama em cadelas aumenta significativamente com a idade,
tendo uma maior susceptibilidade animais na faixa etária entre cinco e doze anos de
idade, com rara ocorrência em animais jovens (MOULTON, 1990; MISDORP, 2002).
O uso de progestágenos para o controle do estro, a pseudociese, a obesidade e dietas
ricas em gorduras, bem como, a avaliação de biomarcadores de estresse oxidativo e
inflamação tem sido citados como fatores de risco associados ao câncer de mama
(PELETEIRO, 1994; ALENZA et al., 2000; ZUCCARI et al., 2008; CLEARY et al.,
2010; YEON et al., 2011).
20
A incidência das neoplasias mamárias na cadela aumenta com a maior
expectativa de vida e com o uso de progestágenos para o controle do cio, sendo menor
quando as cadelas são ovariectomizados ainda jovens (SCHNEIDER et al., 1969;
LANA et al., 2007). Contudo, para Sorenmo et al. (2000) maior taxa de sobrevida esta
relacionada à castração quando realizada até 24 meses antes da exérese do nódulo
primário ou quando associada a mastectomia.
A avaliação clínica do paciente é importante para determinar o tempo de
evolução da neoplasia, fornecendo melhor entendimento sobre o seu comportamento
biológico e informações para determinação do diagnóstico, prognóstico e tratamento
(De NARDI et al., 2008; LAVALLE et al., 2009). Essa avaliação faz parte da
construção do diagnóstico, que tem início com a anamnese geral e específica do sistema
reprodutivo do animal, realização de exame físico detalhado, exames complementares e
de imagem, além da verificação de sinais clínicos que indiquem possível envolvimento
metastático (LAVALLE et al., 2009; ALEXANDER et al., 2012; PEÑA et al., 2012).
O tratamento de eleição para a neoplasia mamária na cadela é a mastectomia,
que quando realizada na fase inicial da doença possibilita a cura, excetuando-se os casos
de carcinoma inflamatório, tumor extremamente agressivo, em que o procedimento
cirúrgico é contra indicado devido à liberação de fatores que afetam a hemostasia,
resultando em choque hipovolêmico. (De NARDI et al., 2008; PAOLONI; KHANNA,
2008; LAVALLE et al., 2009; RIBEIRO et al., 2015). Nos casos de estadiamento
clínico avançado o tratamento adjuvante com o uso de quimioterápicos anti-neoplásicos,
em especial a carboplatina, e o uso de anti-inflamatórios não esteroidais COX-2
seletivos, juntamente com a mastectomia tem trazido benefícios para as pacientes
(LAVALLE et al., 2012).
Macroscopicamente as neoplasias mamárias na cadela apresentam-se, na maioria
das vezes, como nódulos circunscritos detectáveis clinicamente à inspeção e/ou
palpação, com dimensões, consistência e mobilidade à pele e musculatura variáveis,
podendo estar associados à ulceração cutânea com contaminação bacteriana secundária
e reações inflamatórias locais. Frequentemente observam-se múltiplos tumores em uma
21
mesma mama ou envolvendo simultaneamente várias mamas (tumores multicêntricos),
os quais podem apresentar diferentes tipos histológicos, no qual o tumor de pior
prognóstico determinará a evolução clínica do paciente (MISDORP, 2002; SORENMO
et al., 2011; CASSALI et al., 2014). As glândulas inguinais e abdominais caudais são os
sítios mais frequentes de desenvolvimento tumoral, possivelmente por apresentarem
uma maior quantidade de parênquima mamário e maior resposta proliferativa à ação de
hormônios (MISDORP, 2002; SANTOS et al., 2010; EZERSKYTE et al., 2011;
SORENMO et al., 2011).
Na rotina dos laboratórios de patologia veterinária, a frequência de tumores
mamários de caráter benigno e maligno pode variar bastante devido à existência de
diferentes métodos de classificação histopatológica e ausência de critérios homogêneos
na diferenciação dos tipos tumorais (GOLDSCHMIDT et al., 2011; CASSALI et al.,
2014). A classificação histopatológica e a graduação dos tumores mamários são de
suma importância por predizerem o comportamento biológico da neoplasia
(BOSTOCK, 1986; GOLDSCHMIDT et al., 2011; PEÑA et al., 2012; CASSALI et al.,
2014). Dentre os tumores malignos mais frequentes, observam-se os carcinomas, e
dentre estes, o Carcinoma em Tumor Misto Benigno (CaTMB) é o subtipo mais
comumente observado (CASSALI, 2000; MARTINS et al., 2002; RIBEIRO et al.,
2009; ESTRELA-LIMA et al., 2010; DAMASCENO, 2012).
A exemplo da graduação e da classificação histopatológicas, o estadiamento
clínico e a análise imunoistoquímica das neoplasias mamárias, vêm sendo utilizados
como importantes fatores prognósticos e preditivos e para definição do padrão
imunofenotipico das neoplasias, respectivamente (MULAS et al., 2005; ZUCCARI et
al., 2008; HORTA et al., 2012; TANAKA et al., 2013). Os fatores prognósticos são
aqueles que preveem o risco de morte e/ou recidiva devido ao carcinoma mamário,
independente da utilização de tratamento. Enquanto que, os fatores preditivos são
aqueles que diferenciam os pacientes entre os que responderão a um tipo de tratamento
específico (CAVALCANTI; CASSALI, 2006).
22
2.2 Inflamação e o câncer
O sistema imune é formado por diferentes tipos celulares e uma complexa rede
de sinais químicos capazes de responder a alterações na homeostase do organismo
(ONO, 2008). Uma das suas funções primordiais é reconhecer e combater clones de
células com alterações no DNA antes que formações neoplásicas se iniciem. Porém,
tem-se demonstrado que essa efetividade antitumoral do sistema imune varia de acordo
com tipo tumoral envolvido e a capacidade da neoplasia em superar os mecanismos de
defesa do organismo (COUSSENS; WERB, 2002).
Parte da resposta imune inata antitumoral se dá a partir da ação das células
natural killers (células NK). Enquanto que na resposta imune adquirida os linfócitos T,
em especial os T CD8⁺, são os principais mediadores da resposta adquirida (Figura 1).
Porém, existem poucas evidências na efetividade contra o desenvolvimento neoplásico
(VISSER et al., 2006).
Em 1863, Virchow criou a hipótese que o processo neoplásico se iniciava em
locais acometidos por um processo inflamatório crônico usando como base o
conhecimento que alguns irritantes levam a lesão tecidual e posterior inflamação, com a
liberação de fatores de crescimento e quimiocinas que estimulam a proliferação celular
(BALKWILL; MANTOVANI, 2001). Atualmente, crescentes evidências associam a
progressão tumoral com processos inflamatórios e a atividade desregulada das diversas
células do sistema imune, estimulados pela liberação, a partir das células neoplásicas e
inflamatórias, de mediadores cruciais para o desenvolvimento tumoral (UENO et al.,
2000; CHOW et al., 2014).
23
Figura 1. Modelo da função das células na resposta imune inata e adquirida associadas ao
câncer. Os antígenos neoplásicos primeiros são transportados para os órgãos
linfoides pelas células dendríticas (CD) que ativam a resposta imune adaptativa,
resultando em promotores tumorais e anti-tumorais. A ativação dos linfócitos B e da
resposta imune humoral resulta na ativação crônica das células imunes inatas nos
tecidos neoplásicos. Estas células ativadas, como mastócitos, granulócitos e
macrófagos, promovem o desenvolvimento tumoral pela liberação de moléculas
solúveis que modulam a expressão genética em células neoplásicas iniciadas,
resultando na alteração da progressão do ciclo celular e aumento da sobrevida. As
células inflamatórias promovem a remodelação do estroma e a angiogênese pela
produção de mediadores pró-angiogênicos e proteases extracelulares. Em contraste, a
ativação da resposta imune adaptativa provoca respostas anti-tumorais mediadas pela
citotoxicidade das células T (por indução de FAS, perforina e/ou vias de citocinas),
pela citotoxicidade celular mediada por anticorpo e lise mediada pelo complemento
induzida por anticorpo (modificado de VISSER et al., 2006).
24
O processo inflamatório tem sido incriminado como um componente crítico no
microambiente tumoral, podendo retardar ou contribuir para a proliferação,
sobrevivência e disseminação das células neoplásicas. Estimulando a invasão, a
migração e o desenvolvimento de metástases devido à produção de citocinas,
quimiocinas e fatores angiogênicos (EIRÓ; VIZOSO, 2012; HEYS et al., 2012). A
influência das células inflamatórias no desenvolvimento neoplásico, em especial os
macrófagos, vem sendo relatada em estudos com neoplasias mamárias, tumores sólidos
de pulmão em ratos, melanoma e mesotelioma em humanos (COUSSENS; WERB,
2002; MURAMATSU et al., 2010; HEYS et al., 2012).
Fortes associações têm sido encontradas entre a inflamação crônica, constituída
principalmente por linfócitos e macrófagos, e o desenvolvimento de câncer em
humanos, a exemplo da relação entre as neoplasias malignas do cólon e a colite
ulcerativa crônica; paratuberculose e a esquistossomose; o carcinoma hepato-celular e a
infecção pelo vírus da hepatite C, e os carcinomas gástricos com o Helicobacter pylori.
No entanto, o recrutamento destas células inflamatórias também podem representar uma
resposta por parte do hospedeiro contra a neoplasia (COUSSENS; WERB, 2002; EIRÓ;
VIZOSO, 2012).
O microambiente tumoral mamário é infiltrado por uma população heterogênea
de células inflamatórias, composta por linfócitos, macrófagos e polimorfonucleares, em
especial os neutrófilos quando o tumor apresenta área de ulceração e necrose. Estudos
realizados em cadelas e mulheres revelam ser os linfócitos o tipo celular predominante
nos infiltrados inflamatórios dos carcinomas mamários, com células T CD4+
(T
auxiliares) correlacionadas ao desenvolvimento de metástases e pior sobrevida
(ESTRELA-LIMA et al., 2010; TAN et al., 2011; RUFFELL et al., 2012).
Os macrófagos são células do sistema fagocitário mononuclear, originadas na
medula óssea, onde recebem o nome de monócitos, maturadas e ativadas por estímulos
externos nos diferentes tecidos e órgãos, cuja função primordial é a fagocitose e
apresentação de antígenos para os linfócitos T CD4⁺ durante a resposta imunológica
25
celular. Desta forma, são importantes células efetoras nas respostas imunes natural e
adquirida (CORTEZ-RETAMOZO et al., 2012).
Os monócitos circulantes são recrutados para o sítio tumoral pela proteína
quimioatraente de monócitos (MCP-1) e o fator de crescimento de colônias-1 (CSF-1)
produzidos pelas células tumorais e liberadas no microambiente neoplásico. Ocorre a
diferenciação em macrófagos e expressão do fator de crescimento de endotélio vascular
(VEGF), uma citocina quimioatraente para macrófagos, aumentando, desta forma, o
aporte deste tipo celular para o tumor (LEEK et al., 1996; ZHANG et al., 1997; QIAN
et al., 2009) (Figura 2).
Figura 2. Migração de monócitos circulantes para o microambiente tumoral. Os monócitos
circulantes são recrutados para o sítio tumoral pela MCP-1 e o CSF-1, ambos
produzidos pelas células tumorais e liberadas no microambiente neoplásico, onde se
diferenciam em macrófagos que expressam o VEGF, citocina quimioatraente para
macrófagos. Aumentando, desta forma, o aporte deste tipo celular para o
microambiente tumoral.
26
Klimp et al., (2002) sugere que a função dos macrófagos na destruição ou na
progressão das células tumorais vai depender do seu estado de ativação, da sua
concentração no ambiente tumoral, bem como, no grau de desenvolvimento da
neoplasia. Segundo Normann (1985) a densidade populacional dos macrófagos no
microambiente tumoral é caracterizada em quatro fases, nas quais se destacam a fase
inicial e final. Na fase inicial os macrófagos estão em número elevado e distribuídos de
forma homogênea por toda massa neoplásica, duas fases intermediárias onde a
população permanece constante, e a fase final, quando ocorre a depleção do seu
contingente apesar do contínuo crescimento da neoplasia.
A ativação dos macrófagos é regulada por diversos fatores no microambiente
tumoral, fazendo com que estes sofram polarização. Os macrófagos classicamente
ativados denominados M1 ou pró-inflamatórios, são potentes células efetores no
combate a patógenos e aos tumores, ao contrário os macrófagos ativados
alternativamente (M2 ou anti-inflamatórios) promovem a cicatrização, o reparo e a
progressão tumoral a partir da produção de fatores de crescimento, produção de
citocinas de caráter anti-inflamatório e imunomoduladores sobre células Treg
(MANTOVANI, 2007; QIAN; POLLARD, 2010; OHARA et al., 2013; MARTINEZ;
GORDON, 2014).
Os principais estímulos para a ativação dos macrófagos na sua forma clássica
são o IFN-γ produzido principalmente pelos linfócitos Th1, componentes e produtos de
microrganismos (lipopolissacarídeos-LPS e peptideoglicanos), TNF-α, IL-6 e o fator
estimulante de colônias granulócitos-macrófagos (GM-CSF) (ADAMS; HAMILTON,
1992; YAGISAWA et al., 1999; KLIMP et al., 2002; JOHNSTON; O´SHEA, 2003;
MARTINEZ; GORDON, 2014). Enquanto que, para a ativação alternativa os fatores
envolvidos são a IL-4 produzida pelas células Th2, eosinófilos, basófilos e pelos
próprios macrófagos, a IL-13, a IL-10, glicocorticoides, complexos antígeno-anticorpo e
o fator estimulante de colônias de macrófagos (M-CSF) (ADAMS; HAMILTON, 1992;
LEVANO et al., 2011; MARTINEZ; GORDON, 2014).
27
Os macrófagos M1 são capazes de reconhecer, ligar-se e subsequentemente
destruir as células tumorais de forma específica a partir de diferenças na composição da
membrana celular, como alterações na quantidade de fosfatidilserina, carboidratos
estruturais e expressão de antígenos tumorais (UTSUGI et al., 1991; KLIMP et al.,
2002). Entretanto, os tumores podem evadir as respostas imunes a partir da menor
expressão de moléculas do MHC II inibindo a resposta as células T efetoras, diminuição
ou ausência da expressão de antígenos tumorais e a produção de substâncias
imunossupressoras, como o TGF-β, que inibe a função de células efetoras
(RODRIGUEZ-LECOMPTE et al., 2004).
A tentativa de determinação do estado de ativação dos macrófagos vem sendo
realizada a partir da expressão de diversas proteínas (ITALIANI; BORASCHI, 2014),
dentre elas as proteínas SOCS (supressoras da sinalização de citocinas), essas são
reguladoras do feed back negativo na sinalização das citocinas pela via JAK-STAT. Em
mamíferos a família SOCS é constituisa por 08 membros (CIS e SOCS1-7), todos
compostos estruturalmente por um domínio SH2 central, uma região variável na
extremidade N-terminal e outra região com 40 aminoácidos homóloga a C-terminal,
denominada de SOCS box. As proteínas SOCS 1 e 3 são as mais estudadas pelo seu
elevado potencial de ação e função na inflamação e no desenvolvimento neoplásico
(STARR; HILTON, 1998).
As proteínas SOCS tem se demonstrado como reguladores na polarização dos
macrófagos, sendo SOCS3 necessária para a sua ativação na forma clássica e SOCS1
para a ativação alternativa (JOHNSTON; O´SHEA, 2003; BAETZ et al., 2004;
OHARA et al., 2013), a partir da regulação da sensibilidade dos macrófagos a IL-6 e ao
IFN-γ, respectivamente (QIN et al., 2012). As proteínas da família SOCS também são
expressas pelas células neoplásicas, bloqueando assim, o estímulo à proliferação celular
por fatores produzidos pelas células inflamatórias e estromais, e liberados no
microambiente tumoral (ROTTAPEL et al., 2002; SASI et al., 2010).
28
2.3 Macrófagos e neoplasias mamárias
Need e colaboradores (2014) demonstraram que a população de macrófagos na
glândula mamária de ratas varia ao longo do ciclo estral, atingindo seu pico nas fases de
metaestro e diestro, quando a concentração de progesterona é mais alta, e menores
números no proestro e estro quando esta concentração diminui. Estas células participam
da regressão da glândula mamária, a partir da fagocitose das células epiteliais em
apoptose. Assim, condições anti-inflamatórias em resposta à diminuição da
progesterona e aumento do estrógeno pode criar um ambiente favorável para a iniciação
tumoral devido à diminuição da resposta imune celular mediada pelos macrófagos.
A sinalização química de curto alcance realizada pelos macrófagos está
relacionada ao desenvolvimento de metástases, devido à liberação do fator de
crescimento epidérmico (EGF) e resposta ao fator de crescimento de colônias-1 (CSF-
1). Além do contato direto entre macrófagos, células endoteliais e tumorais
(KNÚTSDÓTTIR et al., 2014; ROHAN et al., 2014).
Estudos in vitro utilizando culturas de células de carcinoma mamário e
macrófagos vêm demonstrando que esses últimos se infiltram no tumor usando as
células mesenquimais e a sua capacidade de migração ameboide, aumentando também a
migração e a invasão das células tumorais (GUIET et al., 2011). Esse aumento potencial
da malignidade se dá a partir da remodelação do estroma (GUIET et al., 2011), após
liberação de metaloproteinases, colagenases, elastases e lipases (MANTOVANI, 2007)
e produção de citocinas e quimiocinas (CCL2, CCL3, VEGF) que induzem a aquisição
do fenótipo macrofágico pelas células tumorais, como antígenos específicos (CSF-1R)
(KROL et al., 2012).
Ueno e colaboradores (2000) investigaram a expressão local de citocinas,
quimiocinas e fatores angiogênicos (IL-1/-4/-6/-8/-10/-12, TNF-α, IFN-γ, MCP-1 e
VEFG) no câncer de mama de mulheres em associação com a avaliação do infiltrado
macrofágico intratumoral. Os resultados demonstraram que as concentrações da
proteína quimioatrante de monócitos-1 (MCP-1) e de fatores de crescimento endotelial
29
(VEGF) estavam associados a maior densidade de macrófagos no microambiente
tumoral, representando um significativo indicador de recidiva precoce, sendo um
possível fator prognóstico.
Estudo realizado com ratos obesos portadores de carcinoma mamário e
alimentados com uma dieta rica em gordura demonstrou concentrações elevados da
MCP- 1 no sangue, em conjunto com um significativo infiltrado macrofágico e aumento
na formação de microvasos no estroma tumoral, sugerindo desta forma que a dieta rica
em lipídeos promova no microambiente uma resposta inflamatória favorável a
progressão da neoplasia mamária (NGAN et al., 2013).
Foi demonstrado que as células neoplásicas de carcinomas mamários secretam
microvesículas, chamadas de exossomos, que são internalizadas pelos macrófagos,
estimulando-os a secretar citocinas (TNF-α), se diferenciar em M1 e exercer sua função
pró-inflamatória durante a progressão tumoral (CHOW et al., 2014), utilizando
mecanismos como a liberação de enzimas lisossomais, intermediários reativos do
oxigênio, óxido nítrico, TNF-α ou a fagocitose para a destruição das células tumorais
(DAEMEN et al., 1989; KLIMP et al., 2002). Os exosomos liberados a partir das
células neoplásicas e de células da medula óssea também vêm sendo incriminados no
estimulo a progressão tumoral e desenvolvimento de metástases (PEINADO et al.,
2011; NIKITINA et al., 2013).
O estudo realizado com ratos portadores de câncer de mama e deficientes do
receptor de quimiocina CXCR3, demonstrou um aumento na produção da IL-4 e
polarização de macrófagos M2 no microambiente tumoral, contribuindo para promoção
do crescimento tumoral (OGHUMU et al., 2014). Em contrapartida outro estudo,
também realizado em ratos portadores de neoplasia mamária, foi observado à redução
nas metástases pulmonares e de macrófagos M2 intra-tumorais nos animais que tiveram
a inibição da ciclo-oxigenase-2 (COX-2) com o etodolac (bloqueador da COX2),
sugerindo que o bloqueio da COX-2 pode auxiliar no controle da progressão dos
tumores mamários, suprimindo a diferenciação dos macrófagos na sua forma M2 e
30
consequentemente a liberação de fatores de crescimento endotelial e metaloproteinases,
além de, estimular a resposta imune anti-tumoral (NA et al., 2013).
O infiltrado inflamatório rico em macrófagos no câncer de mama humano está
associado a uma elevada produção de citocinas, a ativação do NF-κB e aumento da
expressão de COX-2. O aumento dos níveis de prostaglandinas dentro do estroma
tumoral regula positivamente a expressão dos genes que codificam aromatase e HER-
2/neu (receptor do fator de crescimento epidermal humano). As concentrações elevadas
de estrógeno produzido no interior da neoplasia e pelas células estromais, age
juntamente com o aumento das prostaglandinas e do HER-2/neu para aumentar ainda
mais a resposta inflamatória macrofágica e a proliferação das células tumorais, o que
leva à progressão do tumor. A presença de receptores de progesterona nas células
tumorais inibe a ativação do fator de transcrição nuclear NF-κB interrompendo o ciclo e
inibindo a progressão tumoral (MENDELSON; HARDY, 2006) (Figura3).
Figura 3. Papel protetor do receptor de progesterona na mama ao inibir a ativação do NF-
κB. O câncer de mama humano negativo para receptor de progesterona está
associado a uma resposta inflamatória, com o aumento de macrófagos, aumento da
produção de citocinas, NF-κB e aumento da expressão de COX-2. O aumento da
produção de prostaglandinas regula a expressão dos genes que codificam a
aromatase e HER-2/neu. A elevada concentração de estrógeno formado no tumor e
nas células estromais, age em conjunto com o aumento das prostaglandinas e HER-
2/neu aumentando ainda mais a resposta inflamatória e a proliferação neoplásica. A
presença do receptor de progesterona inibe a ativação do NF-κB interrompendo o
ciclo (modificado de MENDELSON; HARDY, 2006).
31
Nos carcinomas mamários das mulheres os infiltrados inflamatórios
relacionados a uma melhor resposta a quimioterapia e pior sobrevida apresentavam
infiltrados macrofágicos pró-inflamatórios (SOCS3 – M1) e anti-inflamatórios (SOCS1
– M2), respectivamente (HEYS et al., 2012). Os tratamentos quimioterápicos a
radioterápicos possuem influência na polarização da resposta macrofágica, podendo
estimular a quimio-resistência ou a destruição do tumor (MANTOVANI e
ALLAVENA, 2015). Tendo em vista, que a cadela é considerada modelo de estudos
para carcinogênese mamária (QUEIROGA et al., 2011), torna-se imprescindível a
determinação do estado de ativação macrofágico nos carcinomas mamários desta
espécie para um melhor entendimento das relações no microambiente tumoral.
Neste contexto, o estudo da intensidade e dos tipos celulares envolvidos na
resposta inflamatória tumoral, é importante para determinação de biomarcadores
prognósticos e preditivos, podendo ser utilizado para o desenvolvimento de novas
terapêuticas imunológicas, a partir da manipulação dos macrófagos e do seu estado de
ativação (SOLINAS et al., 2009; ESTRELA-LIMA et al 2010; HEYS et al., 2012; KIM
et al., 2012; KAZI et al., 2014; KEKLIKOGLOU; De PALMA, 2014).
32
3. HIPÓTESES
O infiltrado inflamatório macrofágico intratumoral (TAM) associado aos
carcinomas mamários em cadelas promove o desenvolvimento ou retardo tumoral a
depender da distribuição, intensidade e o predomínio da expressão das proteínas SOCS1
e SOCS3;
Diferenças na intensidade do TAM e a expressão das proteínas SOCS
(pró e anti-inflamatório) contribuem para o aumento nas taxas de sobrevida e na
resposta ao tratamento quimioterápico.
4. OBJETIVO
4.1 Objetivo Geral
Caracterizar o infiltrado macrofágico associado ao Carcinoma em Tumor Misto
Benigno da Mama de cadela (CaTMB) correlacionando os resultados com fatores
prognósticos, a resposta à quimioterapia e com a taxa de sobrevida.
4.2 Objetivos específicos
Caracterizar os tipos celulares, a intensidade, a distribuição e localização
predominantemente (peri e intratumoral) dos focos inflamatórios associados aos
carcinomas mamários de cadelas;
Identificar por imunomarcação os macrófagos na massa tumoral
identificando a expressão das proteínas SOCS1 e SOCS3;
33
Associar os dados encontrados com os fatores sabidamente prognósticos
(estadiamento, graduação, tamanho) no câncer de mama da cadela, visando analisar
possíveis fatores determinantes da resposta imune no desenvolvimento neoplásico e
tratamento quimioterápico, particularmente os associados às condições de
susceptibilidade;
Identificar a partir da imunofenotipagem do sangue periférico a
expressão de moléculas MHCI e MHCII nos monócitos circulantes, comparando com a
densidade do TAM;
Identificar a sobrevida das cadelas a partir de acompanhamentos
trimestrais no mínimo até 12 meses após o procedimento cirúrgico.
34
5. MATERIAIS E MÉTODOS
A pesquisa foi desenvolvida no Hospital de Medicina Veterinária Professor
Renato Medeiros Neto (HOSPMEV/UFBA), na cidade de Salvador, Bahia e envolveu
os seguintes setores: Laboratório de Patologia Veterinária, Clínica e Cirurgia de
Pequenos Animais, Diagnóstico por Imagem, Laboratório de Análises Clínicas,
Laboratório de Infectologia Veterinária (LIVE) e Laboratório de Diagnóstico das
Parasitoses dos Animais. Como instituições parceiras, participaram da pesquisa o
Centro de Pesquisas René Rachou - Fundação Oswaldo Cruz (Belo Horizonte, Minas
Gerais) e o Laboratório de Patologia Comparada do Departamento de Patologia Geral
(ICB - UFMG).
5.1 Seleção de animais e Grupos experimentais
Foram estudadas 22 cadelas com diagnóstico histopatológico de Carcinoma em
Tumor Misto Benigno de mama (CaTMB), atendidas no Hospital Veterinário da UFBA
(Bahia-Brasil) no período de março de 2013 a fevereiro de 2015.
Todos os proprietários foram previamente informados sobre a realização do
projeto de pesquisa que possui aprovação da Comissão de Ética e no Uso de Animais
(CEUA – nº 011/13) (Anexo 1). Nenhum dos animais fez uso prévio (mínimo de trinta
dias) de fármacos antineoplásicos ou antiinflamatórios, sendo esse aspecto um critério
definitivo para a inclusão dos animais na pesquisa.
Os animais selecionados foram divididos em dois grupos, o primeiro constituído
por animais sem metástase (11) e o segundo composto de animais com metástase (11),
diagnosticada a partir da realização de exames de imagem e histopatológico. Dentro de
cada grupo os animais foram subclassificados de acordo com a utilização ou não do
tratamento quimioterápico (Figura 4).
35
Figura 4. Animais divididos em grupos a partir da presença ou ausência de
metástase e em subgrupos pela utilização ou não de tratamento
quimioterápico com a Carboplatina. Legenda: CaTMB = Carcinoma em
Tumor Misto Benigno; S/metástase = Animais sem metástase regional;
C/metástase = Animais com metástase regional ;S/ quimioterapia = Animais
não submetidos ao tratamento quimioterápico; C/ quimioterapia = Animais
submetidos ao tratamento quimioterápico.
5.2 Avaliação Clínica e Mastectomia
Inicialmente, todos os animais com lesão mamária foram submetidos ao exame
clínico completo (anamnese geral e específica do sistema reprodutivo, aferição de
parâmetros fisiológicos – temperatura, frequência cardíaca, frequência respiratória,
tempo de perfusão capilar, auscultação cardiorrespiratória), sendo os dados transcritos
em uma ficha oncológica específica (Anexo 2). O estadiamento clínico foi realizado
com base no tamanho do tumor (T), envolvimento neoplásico de linfonodos regionais
(N) e presença de metástases à distância (M), de acordo com o sistema TNM
(modificado de OWEN, 1980) (Figura 5A). Foram avaliados tumores de tamanho igual
ou superior a 3,0 cm. A avaliação macroscópica dos linfonodos inguinais e axilares foi
realizada pela palpação dos mesmos e a presença ou não de envolvimento neoplásico
determinado pela a análise macroscópica e o exame histopatológico após a exérese
cirúrgica da mama envolvida. Ao final do exame ambulatorial, foi realizada a colheita
36
de sangue periférico para hemograma e bioquímica sérica (ureia, creatinina, FA e ALT)
para a avaliação do estado geral da paciente e como exames pré-cirúrgicos, além disso,
os animais foram encaminhados para realização de radiografia simples de tórax em três
incidências: látero-lateral direita (LLD), látero-lateral esquerda (LLE) e ventro-dorsal
(VD) para pesquisa de metástase pulmonar e ultrassonografia de abdômen total.
A abordagem cirúrgica foi determinada pelo tamanho do tumor, sua localização
e drenagem linfática, considerando-se também margens de segurança (Figura 5B). As
cadelas foram monitoradas durante o período pós-cirúrgico com utilização de bandagem
compressiva por 48 horas.
5.3 Acompanhamento e Sobrevida
Os exames radiológicos foram realizados trimestralmente, os exames
laboratoriais (hemograma e bioquímico – ureia, creatinina, ALT e FA) e clínicos
mensalmente no mínimo até nove meses após a cirurgia, período de acompanhamento,
no qual foram coletados dados sobre a sobrevida livre da doença e a sobrevida global.
O tempo de sobrevida global foi definida (em dias) como sendo o período entre
a exérese cirúrgica do tumor primário e a data de óbito pela doença. Os animais que
vieram a óbito foram necropsiados no Setor de Patologia Veterinária/HOSPMEV-
UFBA para determinação da causa mortis e detecção de possíveis metástases. Este
procedimento foi realizado após autorização dos proprietários por escrito em formulário
específico (Anexo 3) (Figura 6).
37
Figura 5. Clínica, cirurgia e tratamento quimioterápico. A) Anamnese- transcrição dos
dados em ficha oncológica específica. B) Realização da mastectomia determinada
pelo tamanho do tumor, sua localização e drenagem linfática. C) Cadela portadora
de CaTMB com metástase submetida ao tratamento anti-neoplásico com a
Carboplatina.
Figura 6. Metástases de CaTMB observadas durante exame necroscópico. A) Pulmão com
nódulos metastáticos distribuídos multifocalmente em todos os lobos pulmonares. B)
Nódulo metastático único na superfície renal.
38
5.4 Imunofenotipagem de sangue periférico no contexto ex vivo
Para avaliação da resposta imune celular, foram colhidos 4 mL de sangue de
todos os animais, imediatamente antes do procedimento cirúrgico (30 minutos antes da
mastectomia). O sangue foi colhido em seringas descartáveis estéreis de 5 mL, através
de venopunção da jugular, e em seguida transferido para tubos estéreis contendo
EDTA, que foram mantidos a temperatura ambiente. Os parâmetros hematológicos e
imunofenotípicos foram avaliados por um analisador automático de células do sangue
(ADVIA ® 60, Bayer HealthCare, Tarrytown, NY, EUA) e um citômetro de fluxo
(FACScalibur, Becton Dickinson, San Jose, CA, EUA), respectivamente.
Os anticorpos monoclonais utilizados (anti-CD14 Cy-5, anti-MHCI FITC e
anti-MHCII R-PE, todos Serotec LTD – Oxford, England) foram diluídos em PBS-W
[solução salina tamponada com fosfato-PBS = 0,15M, 8g/l de NaCl, 2g/l de KCl, 2g/l
de KH2PO4 e 1,15g/l de Na2HPO4, pH 7,2 com 0,5% de albumina bovina sérica
(BSA) e 0,1% de azida sódica] na diluição previamente estabelecida (ESTRELA-
LIMA et al., 2012).
Em um tubo cônico de poliestireno medindo 12x75 milímetros (FALCON® –
BECTON DICKINSON) contendo 40μL de sangue total contendo EDTA e 1μL de
anti-MHCI (FITC) + 2μL anti-MHCII (R-PE) + 1μL anti-CD14 (Cy-5). A amostra de
sangue periférico foi homogeneizada cuidadosamente e incubada em temperatura
ambiente, durante 30 minutos, ao abrigo da luz. Em seguida, as hemácias foram lisadas
adicionando-se 3mL de solução de lise (FACS LISYNG SOLUTION – BECTON
DICKINSON), sob agitação no vórtex. A suspensão celular permaneceu em repouso
por 10 minutos a temperatura ambiente, ao abrigo da luz; após esse período a mesma
foi centrifugada a 400 x g por sete minutos, a temperatura ambiente. Após a
centrifugação, o sobrenadante foi desprezado vertendo-se o tubo e as células foram
então, homogeneizadas no vórtex a baixa velocidade. Foram adicionados 3mL de PBS-
W e a suspensão celular foi submetida novamente a centrifugação a 400 x g, por sete
minutos a temperatura ambiente, sendo novamente desprezado o sobrenadante e, o
sedimento ressuspenso e homogeneizado cuidadosamente; essa última lavagem foi
repetida mais uma vez. As células foram fixadas com 100μL de solução fixadora para
39
citometria – MaxFacsFix (MFF) (10,0g/l de paraformaldeído, 10,2g/l de cacodilato de
sódio e 6,65g/l de cloreto de sódio, pH 7,2) e submetidas à leitura no citômetro de
fluxo onde foram avaliados 10 mil eventos. Os controles negativos foram anticorpos
obtidos da empresa correspondente apresentando mesmo isotipo e produzidos na
mesma espécie.
Após todo o procedimento de marcação da fenotipagem, a amostra foi enviada
ao Centro de Pesquisas René Rachou - Fundação Oswaldo Cruz (Belo Horizonte,
Minas Gerais), local onde foi analisada no citômetro FACScalibur (BECTON
DICKINSON, San Jose, CA, EUA), acoplado a um sistema de computador com
programa específico (CELL QUEST®). A caracterização fenotípica, por citometria de
fluxo, inclui a análise básica de três parâmetros celulares: tamanho (determinado pela
difração frontal do raio laser – “Forward scatter” - FSC), granulosidade ou
complexidade interna (determinada pela refração e reflexão lateral do raio laser –
“Side Scatter” - SSC), e intensidade relativa de cada fluorescência.
A obtenção dos dados por citometria teve início com a identificação da
população celular de interesse (R1), após ajustes de ganho de tamanho (FSC) e
granulosidade (SSC) e/ou fluorescências (FL1, FL2 e FL3). Com a seleção da região
de interesse (R1), foi feita a análise dos aspectos fenotípicos considerando duas
abordagens distintas: a primeira, a partir do percentual de células positivas expressas
em gráficos de dispersão pontual de fluorescência, equivalente à população positiva
para o marcador avaliado; e a segunda, avaliando a intensidade média de fluorescência
(IMF) equivalente à densidade de expressão de um determinado marcador fenotípico,
em gráficos do tipo histograma em escala logarítmica.
A primeira abordagem foi empregada para quantificar fenótipos celulares que
apresentam distribuição bimodal, ou seja, caracterizadas por apresentarem populações
positivas e negativas para o referido marcador fenotípico. Na segunda abordagem foi
utilizada uma análise semi-quantitativa da expressão do marcador fenotípico que
possui distribuição unimodal, ou seja, toda a população celular de interesse expressa
constitutivamente o referido marcador fenotípico. Nessas situações, alterações na
densidade de expressão podem ocorrer, o que irá promover o deslocamento da
40
população celular ao longo do eixo da intensidade de fluorescência. Em todo o
experimento foi analisado para cada amostra os controles das reações, que são
importantes para avaliação da qualidade do perfil celular e detecções de eventual
ocorrência de fluorescências inespecíficas.
5.5 Biópsia Excisional e Histopatológico
Imediatamente após a cirurgia, as cadeias mamárias foram analisadas
macroscopicamente e colhidos fragmentos da(s) mama(s) afetada(s), incluindo pele e
tecido subcutâneo além dos linfonodos regionais (Figura 7) para realização do exame
histopatológico tendo por objetivo determinar o diagnóstico histopatológico da
neoplasia mamária. Na presença de tumores múltiplos em uma mesma cadeia, no
momento da exérese cirúrgica, a colheita dos fragmentos foi realizada separadamente e
os frascos identificados com a glândula afetada e fixados em formol neutro e tamponado
com fosfato a 10% e processados pela técnica rotineira de inclusão em parafina. As
secções histológicas de 4µm foram coradas por Hematoxilina-Eosina (LUNA, 1968;
ESTRELA-LIMA et al., 2010).
5.6 Caracterização da Neoplasia
5.6.1 Classificação Histológica
Todos os exames histopatológicos foram realizados no Laboratório de Patologia
Veterinária HOSPMEV/UFBA e para todos os casos foram confeccionadas duplicatas
das lâminas, visando à análise por dois patologistas veterinários (LPV/UFBA e
LPC/UFMG). A identificação do tipo histológico seguiu a classificação da Organização
Mundial de Saúde (OMS) (MISDORP et al., 1999) e padronização do Consensus for the
Diagnosis, Prognosis and Treatment of Canine Mammary Tumors (CASSALI et al.,
2014).
41
Figura 7. Avaliação macroscópica da cadeia mamária. A) Mensuração de toda a cadeia
mamária, localização e caracterização dos nódulos. B) Secção evidenciando a
superfície de corte da neoplasia mamária com aspecto multilobular. C) Dissecação
da gordura inguinal para localização do linfonodo regional (em destaque).
42
5.6.2 Graduação Histológica
Foi utilizado o grau histológico de Nottingham que inclui: percentual de
diferenciação tubular; avaliação do pleomorfismo nuclear e índice mitótico (ELSTON;
ELLIS, 1993; CASSALI et al., 2014) (Figura 8).
Características Pontuação
Formação tubular
75% do tumor
10 a 75% do tumor
< 10% do tumor
1
2
3
Pleomorfismo nuclear
Tamanho nuclear semelhante á célula normal
Moderado aumento e variabilidade
Grande variação
1
2
3
Índice mitótico
0 a 8 mitoses
9 a 16 mitoses
17 ou mais mitoses
1
2
3
Alocação do grau tumoral
Total de escore
Grau de malignidade
3 – 5
6 – 7
8 – 9
I
II
III
Figura 8. Critérios utilizados na graduação de tumores mamários de cadela conforme o
grau de malignidade. (FONTE: CAVALVANTI, 2006, modificado de ELSTON;
ELLIS, 1993; CASSALI et al., 2014)
43
5.6.3 Análise Morfológica e Quantitativa do Infiltrado inflamatório Tumoral
A análise morfológica da reação inflamatória associada ao tumor, quanto a sua
distribuição e intensidade, foi realizada nos oito campos mais representativos
(“hotspots”), com auxilio de um microscópio Olympus BX-41 (ocular 10Χ e objetiva de
40Χ), nas secções histológicas de 4μm coradas pelo HE, segundo protocolo
estabelecido por Estrela-Lima et al. (2010). A distribuição do infiltrado inflamatório foi
classificada nas áreas periféricas e intra-tumorais em: i) focal: presença de 1-3 focos
inflamatórios; ii) multifocal: presença de mais de três focos inflamatórios e iii) difusa:
presença de células inflamatórias uniformemente distribuídas na secção de tumor. A
intensidade da reação inflamatória foi categorizada em três subgrupos (discreta,
moderada ou intensa) com base na análise morfométrica do infiltrado inflamatório total.
Para a análise quantitativa após a identificação e marcação dos oito campos, foi
realizada a captura de imagens em câmera digital Zeiss Axiocam/cc5 adaptada a um
Microscópio Carl Zeiss Scope.A1, utilizando-se o software de captura Versão Zen 2012
(Blue Edition – Service Pack 1)®
e o software Corel DRAW®
versão X7 para análise
das imagens. Linfócitos, macrófagos, plasmócitos, neutrófilos e eosinófilos foram
identificados com base nas suas características morfológicas e quantificados nas
imagens capturadas de secções coradas pela HE. O número total de células foi obtido
pela soma dos oito campos analisados, sendo a média utilizada para determinar os
intervalos de intensidade. O infiltrado inflamatório foi classificado em: i) discreto; ii)
moderado: e iii) intenso (Figura9/Tabela 1).
44
Figura 9. Análise quantitativa do infiltrado inflamatório associado ao tumor. A) Células
inflamatórias mistas peritumorais. HE. 200X. B) Infiltrado inflamatório misto
intratumoral. HE. 400X. Linfócitos-vermelhos, macrófagos-amarelos, plasmócitos-
verdes. C) Infiltrado inflamatório predominantemente macrofágico. Imunomarcação
citoplasmática. CD68. 400X. D) Infiltrado inflamatório misto peritumoral.
Cromotrope 2R. 400X.
Tabela 1. Intervalo de intensidade dos tipos celulares nos carcinomas mamários (ESTRELA-
LIMA, 2011).
Tipo celular Intensidade
Discreta Moderada Intensa
Linfócito X<300 300≤ X <600 x ≥600
Macrófago X<200 200≤ X <400 x ≥400
Plasmócito X<200 200≤ X <400 x ≥400
Neutrófilo X<200 200≤ X <400 x ≥400
Eosinófilo X<50 50≤ X <100 x≥100
Total X<500 500≤ X <1000 x ≥1000
45
5.7 Avaliação Imunoistoquímica
Esta técnica foi realizada no Laboratório de Patologia Comparada do
Departamento de Patologia Geral (ICB - UFMG), sendo utilizadas secções de 4µm
obtidas de cada caso e coletadas sobre lâminas gelatinizadas. As lâminas foram
desparafinizadas, reidratadas em uma série de álcoois progressivamente diluídos, e
submetidas à recuperação antigênica em calor-úmido (banho-maria a 95° por 20
minutos) tampão citrato (Target Retrieval Solution) (SOCS 1 e SOCS 3), pH 6.0, exceto
as lâminas destinadas a marcação de CD68. Nestas foi realizado tratamento enzimático
por meio de proteinase K e incubadas em câmara úmida durante 5 minutos a
temperatura ambiente. Posteriormente todas as lâminas foram incubadas em peróxido de
hidrogênio 3% em metanol para o bloqueio da atividade da peroxidase endógena por 15
minutos. Após o resfriamento, as lâminas foram cobertas com soro bloqueio (Lab
Vision™ Ultra V Block - Thermo Scientific) por 15 minutos. Os dados dos anticorpos
utilizados estão descritos na tabela 2.
As secções histológicas foram incubadas com o anticorpo primário por 1 hora
a 25°C e na sequência aplicado o método de revelação polimérica (ADVANCE HRP–
ready to use–DakoCytomation). Por último, as secções foram expostas ao cromógeno
3,3 – diaminobenzidina e contra-coradas com hematoxilina de Mayer’s. Controles
negativos foram obtidos pela substituição do anticorpo primário por PBS
(DAMASCENO et al., 2014).
Tabela 2. Dados referentes aos anticorpos utilizados.
Anticorpo Origem Clone Diluição Localização
CD68 ABD Serotec MCA5709 1:60 Citoplasmática
SOCS1 Santa Cruz SC-9021 1:60 Citoplasmática
SOCS3 Santa Cruz SC-9023 1:80 Citoplasmática
46
Para a análise da imunomarcação dos anticorpos CD68, SOCS1 e SOCS3
(macrófagos e a expressão das proteínas SOCS, sugerindo o seus subtipos de ativação,
respectivamente) após a identificação e marcação dos oito campos mais representativos
da resposta inflamatória (“hotspots”) em cada caso, foi realizada a captura de imagens
em câmera digital Zeiss Axiocam/cc5 adaptada a um Microscópio Carl Zeiss Scope.A1,
utilizando-se o software de captura Versão Zen 2012 (Blue Edition – Service Pack 1)®
e o software Corel DRAW®
versão X7 para análise das imagens. Somente a marcação
presente no citoplasma foi considerada, independente da intensidade da mesma (Figura
10).
Figura 10. Análise da imunomarcação com as proteínas SOCS1 e SOCS3 no infiltrado
inflamatório macrofágico associado ao tumor. A/B) Anticorpo anti-SOCS1 –
infiltrado inflamatório macrofágico discreto associado ao processo neoplásico em
animais portadores de metástase. 200X/400X. C/D) Expressão da proteína SOCS3 no
denso infiltrado macrofágico sem metástase para linfonodo. 200X/400X.
47
5.8 Tratamento Quimioterápico
As cadelas foram submetidas primeiramente à mastectomia e após a recuperação
cirúrgica, com completa cicatrização por primeira intenção e retirada dos pontos, em
média 10 dias após a exérese da cadeia mamária, foi iniciado o tratamento
quimioterápico em 05 animais de cada grupo (Figura 5C).
Foram realizadas o mínimo de uma sessão e o máximo de seis sessões com
intervalos de 21 dias, utilizando a carboplatina, endovenosa, na dosagem de 300mg/m2,
com tempo de infusão de 5 minutos. Os animais foram mantidos em fluidoterapia com
solução fisiológica quatro horas antes e quatro horas após a administração do
quimioterápico, sendo aplicado ainda, por via subcutânea, metoclopramida (0,5 mg/kg),
ranitidina (1mg/kg), prometazina (0,1 mg/kg) e citrato de Maropitant - Cerenia®
(1ml/10kg). Os mesmos medicamentos, com exceção do Cerenia®
, cuja via exclusiva de
administração é subcutânea, ainda foram prescritos, via oral, por três dias consecutivos.
Foram realizados ainda hemograma e bioquímica sérica (uréia, creatinica, FA e ALT)
um dia antes da aplicação do medicamento, 48 horas, sete e 11 dias após a
administração, durante todos os ciclos para avaliação do estado geral do paciente
durante o período do nadir da droga.
A quimioterapia foi realizada em uma sala exclusiva, sendo o fármaco
previamente manipulado em uma capela de exaustão para a individualização da dose
por paciente e administrado por um Médico Veterinário devidamente paramentado
(máscara, luva, gorro e avental descartável). Os resíduos foram devidamente
identificados e descartados separadamente, de acordo com o padrão preconizado para
produtos contaminados com agente anti-neoplásicos.
48
5.9 Análise Estatística
Inicialmente, para avaliação da normalidade da distribuição, os dados foram
submetidos a teste de Kolmogorov-Smirnov. Para os dados paramétricos e não
paramétricos foram utilizados o teste t de Student /Mann-Whitney U (comparação de
dois grupos), ou ANOVA / Teste de Kruskal-Wallis (mais de dois grupos),
respectivamente. Da mesma forma possiveis correlações foram investigadas pelos testes
de Pearson ou Spearman (SAMPAIO, 2002). As curvas de sobrevida foram estimadas
pelo metódo de Kaplan-Meier e comparadas pelo teste de Log-rank (Mantel-Cox) ou
Cox na análise univariada ou multivariada, respectivamente, correlacionando a
intensidade do infiltrado macrofágico com as respostas clínico-patológicas.
Os dados foram agrupados da seguinte forma: diagnóstico histológico (CaTMB);
metástase para linfonodos (sim ou não); estadiamento clínico (II, III, IV ou V);
graduação histológica (I, II ou III); distribuição inflamatória (focal, multifocal ou
difusa), utilização da quimioterapia com carboplatina (sim ou não) intensidade
inflamatória (discreta,moderada ou intensa), intensidade do infiltrado macrofágico
(<400 ou ≥ 400), percentual de macrófagos ativados (anti-inflamatórios SOCS1 – M2
≥ 50% e pró-inflamatórios SOCS3 – M1≥ 50%) e a taxa de sobrevida (baixa- menor
ou igual a 6 meses; e alta - maior que 6 meses). Em todos os casos, o valor de p <0,05
foi considerado estatisticamente significativo. As análises foram realizadas utilizando o
softwares Prism 5.0 (GraphPad, San Diego, CA, EUA) e SPSS 17 (SPSS Inc., Chicago,
IL, EUA).
49
6. Resultados e Discussão
A função dos macrófagos infiltrantes nos carcinomas mamários caninos ainda
não está totalmente estabelecida. Portanto, a existência de relação entre características
imunofenotípicas predominantes do infiltrado macrofágico e fatores prognósticos
clássicos pode indicar uma importante associação entre a resposta imune do hospedeiro
e a evolução da doença.
Características clínicas e patológicas
Dentre os animais estudados (22), os cães da raça Poodle (10/45,45%) foram os
mais acometidos seguida dos sem raça definida (7/31,80%) com a idade média de 12
anos (faixa etária de 08 - 15 anos). As mamas inguinais (8/18,20%), independente da
lateralidade, foram as mais acometidas por tumores, em sua maioria, maiores que 5 cm
(17/77,27%) assim como descrito na literatura por MISDORP, 2002; EZERSKYTE et
al., 2011; SORENMO et al., 2011. O estadiamento clínico III foi predominante
(14/63,6%), bem como, o grau histopatológico II (21/95,46%). Nenhum dos animais
avaliados apresentava metástase a distância, contudo, 11 animais (50%) apresentaram
metástase para linfonodo regional.
Como em outros estudos realizados anteriormente em Salvador e em outras
unidades da federação, os resultados do presente estudo não demonstraram uma
predisposição racial, mas sim uma maior freqüência em animais da raça Poodle e sem
raça definida (LAVALLE et al, 2009; ESTRELA-LIMA, 2010; RIBEIRO, 2012;
TORÍBIO et al., 2012). Porém, essa maior frequência provavelmente é um viés
resultante da moda de se criar cães dessas raças no início dos anos 2000. Quando se
tratou da idade, as cadelas acometidas se apresentavam dentro da faixa etária citada na
literatura, em que as cadelas mais acometidas apresentam idade avançada (MOULTON,
1990; PELETEIRO, 1994; De NARDI et al., 2008; EZERSKYTE et al., 2011).
Na maioria dos animais foram observados tumores multicêntricos, cerca de
72,72% (16/22), com diferentes tipos histológicos. Nestes casos segundo CASSALI et
al., 2014 o tumor de pior prognóstico determinará a evolução clínica do paciente.
50
A avaliação dos parâmetros hematológicos antes do procedimento cirúrgico não
apresentaram diferenças nos animais estudados, independente da presença ou ausência
de metástases. O que os tornavam aptos ao procedimento cirúrgico (Anexo 4).
Análise quantitativa, da distribuição e imunomarcação do infiltrado
macrofágico
A avaliação morfológica do infiltrado inflamatório, independente dos grupos,
revelou predominância da distribuição multifocal e intensidade moderada (Tabela 3
/Figura 11). A análise morfológica e morfométrica comparativa entre o infiltrado
inflamatório macrofágico peri (áreas circunvizinhas a neoplasia) e intratumoral (estroma
tumoral) não demonstrou diferença significativa (Tabela 3).
Tabela 3. Análise morfológica e quantitativa do infiltrado inflamatório macrofágico peri e
intratumoral, associado com a presença ou ausência de metástase e tratamento.
CaTMB (-) Trat (-) CaTMB (-) Trat(+) CaTMB (+) Trat(-) CaTMB (+) Trat(+)
PERI INTRA PERI INTRA PERI INTRA PERI INTRA
Distribuição
Focal 0%(0/5) 0%(0/5) 20%(1/5) 20%(1/5) 16,66%(1/6) 0%(0/6) 16,66%(1/6) 0%(0/6)
Multifocal 100%(5/5) 60%(3/5) 80%(4/5) 80%(4/5) 83,33%(5/6) 66,66%(4/6) 83,33%(5/6) 100%(6/6)
Difuso 0%(0/5) 40%(2/5) 0%(0/5) 0%(0/5) 0%(0/6) 33,33%(2/5) 0%(0/6) 0%(0/6)
CaTMB (-) Trat (-) CaTMB (-) Trat(+) CaTMB (+) Trat(-) CaTMB (+) Trat(+)
PERI INTRA PERI INTRA PERI INTRA PERI INTRA
Intensidade
Discreto 20%(1/5) 40%(2/5) 60%(3/5) 0%(0/5) 33,33%(2/6) 33,33%(2/6) 50%(3/6) 0%(0/6)
Moderado 80%(4/5) 60%(3/5) 40%(2/5) 100%(5/5) 66,66%(4/6) 50%(3/6) 16,66%(1/6) 83,33%(5/6)
Intenso 0%(0/5) 0%(0/5) 0%(0/5) 0%(0/5) 0%(0/6) 16,66%(1/6) 33,33%(2/6) 16,66%(1/6)
51
Figura 11.Carcinoma em Tumor Misto Benigno (CaTMB) com metástase para linfonodo e
análise morfológica e quantitativa do infiltrado inflamatório associado a
neoplasia. A) CaTMB – proliferação epitelial com crescimento infiltrativo associada
a reatividade de células mioepiteliais produtoras de matriz mixoide. HE – 200X. B)
Metástase para linfonodo com células neoplásicas no seio subcapsular (cabeça de
seta) e vaso linfático (seta). HE – 100X. C) CaTMB – Intenso infiltrado inflamatório
macrofágico peritumoral (seta) e discreto infiltrado inflamatório mononuclear
intratumoral (cabeça de seta). HE – 100X. D) Detalhe do infiltrado macrofágico
peritumoral observado na figura D. HE – 400X.
52
A morfometria do infiltrado inflamatório associado ao tumor revelou ser os
linfócitos a população celular predominante, seguido dos macrófagos (confirmação
realizada pela análise quantitativa em lâminas coradas em HE pela sua morfologia e
imunomarcação com anticorpo CD68), exceto no grupo dos animais sem metástase e que
receberam o tratamento quimioterápico (CaTMB (-) Trat(+)), em que a densidade dos macrófagos
foi significativamente maior (Figura 12). Confirmando os resultados observados na
literatura humana e veterinária, em que dentre as células do sistema imune, o linfócito é o
tipo mais observado seguido dos macrófagos nos carcinomas mamários (DAMASCENO,
2009; ESTRELA-LIMA et al., 2010; HEYS et al., 2012).
O infiltrado macrofágico com intervalo ≥ 400 teve associação significativa com o
alto grau histológico e tratamento quimioterápico (tabela 4). Semelhante ao descrito por
Heys e colaboradores (2012) que observaram, em um estudo realizado com mulheres
portadoras de carcinomas mamários, uma maior densidade do infiltrado macrofágico
naqueles tumores com grau histológico avançado e resposta a quimioterapia. O que pode
ser explicado, mais uma vez pelo estado de ativação dos macrófagos, em se tratando da
graduação, pela predominância do infiltrado macrofágico na sua forma anti-inflamatória e
na resposta a quimioterapia pela predominância do infiltrado macrofágico na sua forma
pró-inflamatória.
A avaliação das secções histológicas imunomarcadas com os anticorpos anti-
SOCS1 e anti-SOCS3 para caracterização do infiltrado macrofágico associado ao
carcinoma em tumor misto de cadelas, neste estudo, revelou que a maior expressão das
proteínas SOCS predominante nos macrófagos associados a neoplasias com metástase para
linfonodo era do tipo SOCS1 positivo. Enquanto que os tumores sem desenvolvimento de
metástase local apresentava como população predominante, os macrófagos SOCS3
positivos (Figura 13).
O estudo realizado por Estrela-Lima e colaboradores (2010), além de definir o
linfócito como principal tipo celular, seguido dos macrófagos, também revelou ser os
linfócitos T CD4⁺ predominantes nos carcinomas e carcinoma em tumor misto com
metástase, e as células T CD8⁺ relacionadas aos carcinomas em tumores mistos sem
metástases, ou seja T CD4⁺ relacionado a evolução neoplásica enquanto T CD8⁺ ao
53
combate tumoral. Os resultados obtidos nesse estudo demonstram que assim como os
subtipos de linfócitos o estado de ativação dos macrófagos, aparentemente definirá seu
papel como um potente efetor contra o câncer ou estimulador do desenvolvimento tumoral.
Tabela 4. Associação entre parâmetros clinico - patológicos com intervalos distintos de
macrófagos <400 ou ≥400.
Intervalo de macrófagos
Parâmetros <400 ≥400
p-valor
Condição Vivo 5 (22 73%) 6 (27,27%) 0, 65
Morto 5 (22,73%) 6 (27,27%)
Sobrevida <180 dias 1 (4,55%) 4(18,18%) 0 097
>180 dias 9 (40,91%) 8(36,36%)
Metástase Não 5 (22,73%) 5 (22,73%) 0,696
Sim 5 (22,73%) 7 (31, 1%)
Graduação 1 4 (18,18%) 0 (0,00%) 0,029*
2 6 (27,27%) 12 (54,55%)*
Tamanho 3-5cm 4 (18,18%) 1 (4,55%) 0,105
>5cm 6 (27,27%) 11 (50,00%)
Quimioterapia Não 9 (40,91%) 2 (9,10%)* 0,001*
Sim 1 (4,55%) 10 (45,45%)
Distribuição Peri 4 (18,18%) 1 (4,55%) 0,105
Intra 6 (27,27%) 11 (55,00%)
Intervalo Total Discreto 1 (4,55%) 0 (0,00%) 0,467
Moderado 4 (18,18%) 4 (18,18%)
Intenso 5 (22,73%) 8 (36,36%)
Diferença significativa p<0.05.
Existe uma complexa interação entre linfócitos, em especial os linfócitos T CD4⁺
e macrófagos no microambiente tumoral. Durante o seu processo de ativação os
linfócitos T CD4⁺ se diferenciam nas formas Th1 e Th2, responsáveis pela ativação dos
54
macrófagos na sua forma clássica e alternativa respectivamente (MARTINEZ;
GORDON, 2014). A diferenciação dos linfócitos no fenótipo Th1 é induzida
principalmente pela IL-12 e o IFN-γ, este último secretado pelas células NK no combate
as células neoplásica, age sobre macrófagos e células dendríticas resultando na maior
produção da IL-12. O fenótipo Th2 ocorre devido à exposição gradual dos linfócitos
CD4⁺ a IL-4 produzida pelos mastócitos e por elas mesmas em pequenas quantidades
quando estimuladas por antígenos (ROMAGNANI, 1997; ROMAGNANI et al., 1998).
Figura 12. Composição do infiltrado inflamatório associado ao CaTMB. População dos
leucócitos infiltrados no CaTMB, subcategorizados de acordo com a ausência (-) ou
presença (+) de metástase em linfonodo e a realização do tratamento quimioterápico.
As células inflamatórias foram caracterizadas por análise de imagens, tal como
descrito em Materiais e Métodos. L=linfócitos; M=macrófagos; P=plasmócitos;
N=neutrófilos; E=eosinófilos.
55
A polarização dos macrófagos para a sua forma de ativação alternativa (M2) tem
sido relacionada a linhagens de células de tumor de mama com aumento na produção da
IL-4 por parte das células Th2, granulócitos e pelos próprios macrófagos (OGHUMU et
al., 2014). Enquanto que, a ativação clássica dos macrófagos na imunidade antitumoral
acontece principalmente a partir da liberação do IFN-γ por parte dos linfócitos Th1
(MARTINEZ; GORDON, 2014).
Os resultados aqui observados corroboram os resultados da literatura que
relatam o infiltrado macrofágico na sua forma M2 (se utilizarmos como base a
expressão da proteína SOCS1 para diferenciação do tipo macrofágico, como utilizado
por Heys et al., 2012), associado a neoplasias de pior prognóstico, por promover o seu
crescimento, progressão e desenvolvimento de metástases através da produção e
liberação de fatores de crescimento (NF-κB), citocinas imunomoduladoras (IL-10, TGF-
β), estimular a angiogênese, a remodelação do estroma tumoral (metaloproteinases) e
inibição da resposta imune anti-tumoral (MANTOVANI et al., 2002; MANTOVANI,
2007; SHAN DENG et al., 2012).
Figura 13. Caracterização da expressão das proteínas SOCS1 e SOCS3 no infiltrado
macrofágico associado ao CaTMB em cadelas. A) Grupo de animais sem
metástase apresentando maior número de TAM SOCS3 positivos – p-valor 0,014
(SOCS1 - 128±103,5 / SOCS3 - 343±124,75). B) Grupo de animais com metástase
apresentando maior número de TAM SOCS1 positivos – p valor 0,0097 (SOCS1 -
161±33,1 / SOCS3 - 124±25).
56
Na e colaboradores (2013) relataram em um estudo realizado com ratos
portadores de neoplasia mamária, que os animais submetidos ao bloqueio da COX-2
apresentavam uma redução do número de casos metástases associado ao aumento do
TNF-α, que sabidamente é um dos principais estímulos para a ativação dos macrófagos
na sua forma clássica (MARTINEZ; GORDON, 2014). Os infiltrados macrofágicos
tumorais com predomínio do tipo M1 são relacionados ao combate as células tumorais
por sua ação citotóxica direta ou sensibilização de linfócitos T CD8⁺ (MANTOVANI,
2007).
Imunofenotipagem no sangue periférico no contexto ex vivo – IMF CD14+
MHCI e MHCII
A imunofenotipagem do sangue periférico, por citometria de fluxo, não
demonstrou diferenças significativas na expressão das moléculas MHCI e MHC II em
monócitos CD14+
nos diferentes grupos (Figura 14). Contudo, de forma interessante,
observa-se a mesma distribuição na concentração nos grupos, quando comparamos a
expressão do MHC II em monócitos CD14+ e a densidade de macrófagos infiltrados no
tumor (Figura 14).
Na resposta imune as moléculas do MHC são necessárias para apresentar os
antígenos aos linfócitos T. As moléculas da classe II são, em geral, encontradas somente
nas células dendríticas, nos linfócitos B e nos macrófagos. A sua expressão é regulada
por várias citocinas, em especial o IFN-γ que é o principal estimulador da expressão das
moléculas da classe II nos macrófagos, principalmente em resposta a estímulos
inflamatórios e imunológicos. No presente estudo a expressão das moléculas MHCII
nos monócitos circulantes acompanhou o padrão de distribuição da densidade do
infiltrado macrófagico tumoral nos diferentes grupos. Este achado pode resultar da
liberação da proteína quimioatraente de monócitos-1 no microambiente tumoral pelas
células neoplásicas atraindo os monócitos do sangue periférico das cadelas portadoras
de carcinoma em tumor misto para o sítio tumoral. Contudo, a sua complexa interação
com as outras células inflamatórias no microambiente, em especial os linfócitos T
CD4⁺, irá determinar o seu estado de ativação, o que aparentemente definirá seu papel
57
como um potente efetor contra o câncer ou estimulador do desenvolvimento tumoral
(ZHANG et al., 1997; QIAN et al., 2009).
Comparação das curvas de sobrevida
Para avaliação da curva de sobrevida, inicialmente foi realizada a estratificação
com base nos grupos experimentais, presença ou ausência de metástase, realização do
tratamento quimioterápico com a Carboplatina e a densidade do infiltrado inflamatório.
Dos 22 animais 15 vieram a óbito durante o período de acompanhamento, sendo
que destes, 12 foram necropsiados e identificadas metástases à distância em pele (3/12),
fígado (3/12), rins (2/12) e pulmão (9/12)). Também foi identificada síndrome
paraneoplásica e choque hipovolêmico como a causa mortis mais frequente,
principalmente nos grupos dos animais tratados. Em estudo realizado com ratos por
Siddik e colaboradores (1987) para avaliar a toxicidade de carboplatina, foi observado
que na dose máxima recomendada (5 mL/Kg - IV), os animais apresentaram
principalmente durante o nadir da droga (9-14 dias), emagrecimento, anemia grave
(devido aumento da fragilidade osmótica e secundária a trombocitopenia), leucopenia e
trombocitopenia.
Os resultados demonstraram haver diferença significativa apenas quando
avaliamos os grupos de animais com metástase submetidos ou não ao tratamento
quimioterápico. A sobrevida mínima após a cirurgia foi de 60 dias e o maior período,
dentro do intervalo de estudo, foi 695 dias, esses permanecendo ainda vivos e em
acompanhamento (Figura 15).
Na comparação das curvas de sobrevida, quando estratificada baseada no
intervalo do infiltrado de macrófagos (<400 ou ≥400), os animais com infiltrado
macrofágico tumoral ≥ 400 (Média = 364 dias) apresentam visualmente uma taxa de
sobrevida maior, contudo, sem diferença estatística significativa (Figura 15). Esta
tendência de maior sobrevida dos animais com maior densidade de macrófagos
associados ao tumor corrobora com os resultados de Damasceno, 2009, mas contrasta
58
com os resultados apresentados por Heys e colaboradores (2012) que correlacionaram
uma maior sobrevida com a menor densidade do infiltrado macrofágico.
Alguns resultados avaliados separadamente, podem ser considerados bastante
controversos, a exemplo, da tendência a uma maior sobrevida em pacientes com maior
densidade de infiltrado macrofágico associado ao tumor e da constatação da maior
densidade de macrófagos no grupo com metástase (CaTMB+ (Q)), sabidamente de pior
prognóstico. Entretanto, deve-se atentar para a predominância neste mesmo grupo da
maior expressão da proteína SOCS1. Desta forma, nota-se que além da densidade, a
expressão das proteínas SOCS e o possível estado de ativação dos macrófagos é
determinante para sua função no microambiente tumoral.
59
Figura 14. Expressão das moléculas MHCI e MHCII nos monócitos circulantes e
densidade de macrófagos intratumorais no carcinoma em tumor misto. Topo do
quadro) Expressão de MHCI e MHCII em monócitos CD14+
nos diferentes grupos
experimentais, segregados pela presença ou ausência de metástase para linfonodo,
seguido da subcategorização baseada na realização ou não do tratamento
quimioterápico com Carboplatina. As populações dos monócitos foram identificadas
por citometria de fluxo como descrito em Materiais e Métodos. Os dados foram
expressos como percentagem de células positivas dentro dos monócitos capturados.
Quadro inferior) Densidade do infiltrado macrofágico nos diferentes grupos
experimentais. Diferenças significativas para p<0.05 foi destacado por asterisco.
60
Figura 15. Taxas de sobrevida dos animais com CaTMB. Curvas de sobrevida Kaplan-Meier
dos animais com base no intervalos de macrófagos <400 (MAC<400) ou ≥400
(MAC≥400) (topo do quadro) e dos grupos experimentais subcatergorizados de
acordo com a ausência (-) ou presença (+) de metástase em linfonodo e a realização
(T) ou não do tratamento quimioterápico (parte inferior do quadro). Os animais
foram submetidos a acompanhamento trimestral após a cirurgia e as taxas de
sobrevida (%) expressas em dias, tal como descrito em Materiais e Métodos. As
curvas de sobrevida foram estimadas pelo método de Kaplan-Meier, seguido pelo
teste de Log-rank. Diferenças significativas para p<0.05 foi destacado por asterisco.
61
Análise univariada e multivariada
A análise univariada correlacionando os parâmetros clinico-patológicos relacionados à
maior densidade do infiltrado macrofágico (≥400) foram o estadiamento clínico, a graduação
histopatológica, o tamanho da neoplasia, o tratamento quimioterápico e a expressão de
moléculas MHCI em monócitos circulantes. Resultado semelhante foi observado na análise
multivariada, em que apresentaram diferença significativa em relação ao estadiamento clínico,
graduação, sobrevida, tratamento quimioterápico e a expressão de moléculas MHCI em
monócitos circulantes (Tabela 5).
Estes resultados indicam que maiores infiltrados macrofágicos tenha como
predominante a expressão da proteína SOCS1 estimulando desta forma o crescimento e
a progressão tumoral.
Tabela 5. Análises univariada e multivariada dos parâmetros clínico-patológicos
associados com o maior intervalo macrofágico (≥400).
Parâmetros Análises (pvalor)
Univariada Multivariada
Estadio Clinico 0,006* 0,025*
Graduação 0,015* 0,007*
Tamanho 0,011* 0,078
Metastase 0,696 0,572
Sobrevida 0,084 0,045*
Quimioterapia 0,001* 0,001*
Ativação 0,696 0,721
IMF CD14+MHC II
+ 0,335 0,944
IMF CD14+MHC I
+ 0,001* 0,018*
Peri.0/Intra.1 0,072 0,078
Infiltrado Total 0,303 0,140
*Selecionado pelas análises uni e multivariada. Para a análise univariada foi utilizada a
Correlação de Sperman para verificação entre variáveis. Análise multivariada – regressão
logística. Diferenças significativas para p<0.05 foi destacado por asterisco.
62
7. CONCLUSÕES
Os resultados obtidos nesse estudo, nas condições metodológicas empregadas,
permitiram concluir:
A partir da análise morfométrica das respostas inflamatórias associada aos
carcinomas em tumores mistos de cadelas foi observado que o macrófago é o
segundo tipo celular predominante, em um infiltrado inflamatório
predominantemente moderado e com distribuição multifocal;
A imunomarcação dos macrófagos infiltrantes revelou maior porcentagem de
macrófagos SOCS3 positivos no grupo de animais sem metástase, sugerindo o
efeito antitumoral destas células, enquanto que os macrófagos SOCS1 positivos
foram predominantes nos animais portadores de metástase, contribuindo desta
forma para a progressão tumoral e o desenvolvimento de metástases;
As maiores taxas de sobrevida estiveram relacionadas à maior densidade do
infiltrado macrofágico com predomínio da expressão da proteína SOCS3.
63
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Saúde, v.15, n.4, p.189-198, 2008.
72
9. ANEXOS
Anexo 1: Certificado de aprovação na CEUA (EMEVZ/UFBA).
73
Anexo 2: Ficha oncológica específica.
74
75
Anexo 3: Termo de doação para realização da necropsia.
UNIVERSIDADE FEDERAL DA BAHIA ESCOLA DE MEDICINA VETERINÁRIA E ZOOTECNIA
HOSPITAL DE MEDICINA VETERINÁRIA
TERMO DE DOAÇÃO
Pelo presente termo, eu ___________________________________________________,
RG ______________________________, CPF________________________________,
endereço ______________________________________________________________
______________________________________________________________________, faço a
doação do corpo a este Hospital Veterinário do animal da espécie ___________________, raça
________________________, sexo __________, pelagem _________________, nome
_______________, idade __________, para que esta instituição utilize-o para realização da
necropsia em aulas práticas ou projetos de pesquisa.
Salvador, ____ de ______________ de ______
____________________________________________________
Assinatura do doador
Obs: Anexar a Ficha Histórico/Laudo Técnico emitida pelo Médico Veterinário
______________________________________________________________________ Av. Adhemar de Barros, 500 – Ondina
Tel: (71) 3283-6738
Email: [email protected]
76
Anexo 4: Tabela com os resultados da análise hematológica.
Parâmetros hematológicos em cadelas com CaTMB segregadas quanto a presença ou ausência
de metástase.
Parâmetros
hematológicos
CaTMB (-) CaTMB (+)
Hemácias 6,55 ±0,99 6,35 ±0,85
Plaquetas 408000 ±132125 420000 ±101750
Leu
cóci
tos
Total 12,600 ±6050 13950 ±3538
Neutrófilos 7097 ±721 11029 ±178,2
Eosinófilos 405,5 ±721 577,5 ±178,15
Monócitos 373,5 ±721 507 ±178,15
Linfócitos 1337 ±721 1482 ±178,5
Basófilo 0 0
a Hemácias são expressadas como número x 106/mm
3 de sangue.
b Plaquetas são expressadas como número x 103/mm
3 de sangue.
c Subpopulações de células sanguíneas brancas são expressadas como número x 103/mm
3 de
sangue.
