UNIVERSIDADE ESTADUAL DE SANTA CRUZ PRÓ-REITORIA DE...

UNIVERSIDADE ESTADUAL DE SANTA CRUZ

PRÓ-REITORIA DE PESQUISA E PÓS-GRADUAÇÃO PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM GENÉTICA E BIOLOGIA

MOLECULAR

Análise do perfil proteômico e estudo de secretoma de Ceratocystis cacaofunesta induzido com fragmentos de ramo

de Theobroma cacao

DEYSE LARA VIEIRA MALHEIRO

ILHÉUS – BAHIA – BRASIL Maio de 2015


Análise do perfil proteômico e estudo do secretoma de Ceratocystis cacaofunesta induzido com fragmentos de ramo

de Theobroma cacao

Dissertação apresentada a

Universidade Estadual de Santa

Cruz, como parte das exigências

para obtenção do título de mestre

em Genética e Biologia Molecular

ÁREA DE CONCENTRAÇÃO: Biotecnologia e Genômica

ILHÉUS – BAHIA – BRASIL

Maio de 2015

ii


Análise do perfil proteômico e estudo do secretoma de Ceratocystis cacaofunesta induzido com fragmentos de ramo

de Theobroma cacao

Dissertação apresentada a

Universidade Estadual de Santa

Cruz, como parte das exigências

para obtenção do título de mestre

em Genética e Biologia Molecular

ÁREA DE CONCENTRAÇÃO: Biotecnologia e Genômica

______________________________ ______________________________

Dr. Leandro Lopes Loguercio Dr. Ronan Xavier Corrêa

(UESC) (UESC) ______________________________ ______________________________

Dra. Claudia Fortes Ferreira Dr. Carlos Priminho Pirovani (Embrapa) Orientador (UESC)

iii

―Combati o bom combate, terminei a minha carreira, guardei a FÉ!‖

2 Timóteo, 4:7

iv

A minha mãe, por ser meu maior exemplo de força e superação!

Dedico.

v

Agradecimentos

Agradeço primeiramente a Deus, Pai Misericordioso, por me permitir concluir os planos que Ele tinha pra mim. E a minha Mãe Maria, pela intercessão.

A Universidade Estadual de Santa Cruz, em especial ao programa de Pós Graduação em Genética e Biologia Molecular, pela oportunidade.

Ao Centro de Apoio a Pesquisa (Capes) pela concessão da bolsa e a Fundação

de Amparo a Pesquisa do Estado da Bahia (FAPESB), pelo auxílio no projeto.

Ao Prof. Dr. Carlos Priminho Pirovani, pela indispensável orientação e constante incentivo, que foram fundamentais nesse trabalho.

À co-orientadora, Prof. Dra. Karina Gramacho, pela paciência e apoio.

À colaborabora do projeto, Msc. Dilze Argôlo, pela paciência e solicitude.

Aos colegas dos laboratórios de Fitopatologia Molecular e Ceratocystis no CEPEC/CEPLAC, pela ajuda na fase inicial dos experimentos.

A Horlei e Leilinha, pela preciosa ajuda em todos os momentos.

À família Proteômica pela união!

À Milena Amaral pela indispensável ajuda nos experimentos com protease e inibidor.

À Lu, Joise, Katy e Juliano pela ajuda com a proteômica.

À Lívia, por gentilmente me ceder o TcCYS4 purificada.

À Fernanda, pela ajuda na atividade de celulase.

À Thay Tosto, pela ajuda imprescindível em todas as análises estatísticas.

A Duca e Milena Dórea pela grande ajuda no Blast2GO.

Aos meus amigos Gonça, Velly, Lôra, Chelle e Dessa por torcerem tanto por mim!

As CBGets, minhas grandes amigas, meus dias não teriam sido os mesmos

sem vocês! Obrigada, pela ajuda nos experimentos e na análise de dados. Cada

uma de vocês tiveram importantes e indispensáveis contribuições nesse

processo. Serei eternamente grata, pela amizade e paciência.

À mainha e painho, por serem meus maiores incentivadores e por se esforçarem tanto para que eu chegasse até aqui. Vocês são tudo para mim!

Aos meus irmãos, minha cunhada e Lili, por estarem sempre comigo.

vi

A Dona Eloísa, por cuidar de mim como uma mãe! Nunca esquecerei o que

fez por mim!

vii

ÍNDICE

LISTA DE ABREVIATURAS ..................................................................................... xi LISTA DE FIGURAS................................................................................................... xii LISTA DE TABELAS (ANEXOS) .............................................................................. xiv RESUMO ...................................................................................................................... xv ABSTRACT .................................................................................................................. xvi 1 INTRODUÇÃO ......................................................................................................... 1 2 REVISÃO BIBLIOGRÁFICA .................................................................................. 3 2.1 O gênero Ceratocystis ......................................................................................... 3 2.2 O fungo Ceratocystis cacaofunesta e o Theobroma cacao .......................... 5 2.2.1O fungo Ceratocystis cacaofunesta (caracterização) .................................. 5 2.2.2 Histórico .............................................................................................................. 6 2.2.3 Sintomas e modo de transmissão do mal do facão .................................... 8 2.3 Estudos proteômicos como suporte para entendimento da interação da planta- patógeno (fungo) ........................................................................................... 9 3. MATERIAIS E MÉTODOS .................................................................................... 12 3.1 Material biológico e cultivo de Ceratocystis cacaofunesta ............................ 12 3.2 Caracterização do fungo Ceratocystis cacaofunesta em meio de cultura líquido .............................................................................................................. 13 3.2.1 Rendimento micelial e rendimento proteico secretado ............................... 13 3.2.2 Microscopia ........................................................................................................ 13 3.2.3 Atividade Enzimática de GPX secretada (aos 2,5,7 e 9 dias de cultivo)........................................................................................................................... 14 3.3 Indução por diferentes genótipos de cacau ..................................................... 14 3.3.1 Perfil em SDS-Page das proteínas secretadas em meio indutor .............. 15 3.3.2 Ensaio da atividade de Celulase em sobrenadante de cultura ................. 16 3.4 Proteômica de micélio ......................................................................................... 17 3.4.1Obtenção de micélio e extração de proteínas do fungo Ceratocystis cacaofunesta ............................................................................................................... 17 3.4.2 Eletroforese Bidimensional .............................................................................. 17 3.4.3 Análise da imagem dos géis pelo programa Image Master ....................... 18 3.4.4 Extração de peptídeos em gel e análise por espectrometria de massas (LC/MS/MS) .................................................................................................. 19

viii

3.4.5 Categorização funcional de proteínas ........................................................... 20 3.5 Atividade enzimática do extrato proteico micelial ........................................... 20 3.5.1 Ensaio da atividade de cisteíno-protease e teste de atividade inibitória com TcCYS4 (inibidor de protease do T. cacao) ................................... 20 3.5.2 Ensaio da atividade de Catalase (CAT) ........................................................ 22 3.5.3 Ensaio da atividade de Peroxidase do Guaiacol (GPX) ............................. 22 4 RESULTADOS ......................................................................................................... 24 4.1 Caracterização do fungo Ceratocystis cacaofunesta em meio de cultura líquido (Secretoma) ....................................................................................... 24 4.1.1 Rendimento proteico em 2, 5, 7 e 9 DAI ....................................................... 24 4.1.2 Microscopia .............................................................................................25 4.1.3 Atividade Enzimática de GPX secretada ..................................................... 26

4.2 Indução por diferentes genótipos de cacau ..................................................... 26 4.2.1 Perfil em SDS-Page das proteínas secretadas em meio indutor .............. 26 4.2.2 Atividade de Celulase em sobrenadante de cultura .................................... 28 4.3 Proteômica do micélio ......................................................................................... 29 4.3.1 Perfil proteico global do micélio Ceratocystis cacaofunesta submetido a cultivo na presença de ramos de cacau ........................................... 29 4.4 Identificação das proteínas do mapa proteômico de referência do micélio Ceratocystis cacaofunesta (controle) ......................................................... 35 4.5 Categorização funcional das proteínas identificadas ..................................... 38 4.6 Atividade enzimática do extrato proteico micelial ........................................... 39 4.6.1 Atividade de cisteíno-protease e atividade inibitória com TcCYS4 (inibidor de protease do T. cacao) ........................................................................... 39 4.6.2 Atividade de Catalase (CAT)........................................................................... 41 4.6.3 Atividade de Peroxidase do Guaiacol (GPX) ............................................... 42 5 DISCUSSÃO ............................................................................................................ 44 5.1 Rendimento proteico em 2, 5, 7 e 9 DAI .......................................................... 44 5.2 Microscopia ........................................................................................................... 45 5.3 Identificação de proteínas secretadas, por espectrometria de massas .. 45 5.4 Celulase em meio de cultura induzido (secretoma) ....................................... 48 5.5 Extração de Proteínas (Micélio) ......................................................................... 48 5.6 Proteínas identificadas no micélio de C. cacaofunesta ................................. 50 5.6.1Óxido- Redutases .............................................................................................. 50

ix

5.6.2 Proteínas relacionadas ao estresse .............................................................. 51 5.6.3 Metabolismo, energia e processos biossintéticos ....................................... 53 5.6.4 Proteínas estruturais ........................................................................................ 54 5.7 Atividade de proteases e inibidores .................................................................. 54 5.8 Estresse oxidativo ................................................................................................ 55 6 CONCLUSÕES ........................................................................................................ 57 7 REFERÊNCIAS ....................................................................................................... 58

x

LISTA DE ABREVIATURAS CONT: Controle TSH: TSH1188 I-TSH: Induzido por

TSH1188 CCN: CCN51 I-CCN: Induzido por CCN51 Cc20: Isolado Cc20 de Ceratocystis cacaofunesta ROS: Espécies Reativas de Oxigênio SDS-Page: Eletroforese em gel de poliacrilamida contendo dodecil sulfato de

sódio 2-DE: Eletroforese em gel bidimensional LC/MS/MS: Cromatografia líquida acoplada ao espectrômetro de massas

MS/MS: Espectrômetro de massas GPX: Peroxidase do Guaiacol

CAT: Catalase GAPDH: Gliceraldeído-3-fosfato dehidrogenase

HSP: Proteína de choque térmico PRX: Peroxirredoxina

ADH: Álcool desidrogenase

xi

LISTA DE FIGURAS

Figura 1: Microscopia eletrônica de esporos de Ceratocystis fimbriata e Ceratocystis cacaofunesta. Engelbrecht et al, 2005.

Figura 2: Proteína total secretada por Ceratocystis cacaofunesta em diferentes

tempos de cultivo.

Figura 3: Microscopia do micélio de C. cacaofunesta (aumento 40X no

microscópio óptico), crescido em meio líquido mineral por 2,5,7 e 9 dias.

Figura 4: Atividade enzimática de GPx no sobrenadante de meio de cultura de

C. cacaofunesta, coletados em em 2, 5, 7 e 9 dias.

Figura 5: Perfil proteico em SDS- Page do secretoma de C. cacaofunesta, obtido

por SDS – Page após cultivo em meio não indutor, induzido por CCN51 e em

meio induzido por TSH1188.

Figura 6: Atividade enzimática de celulase no sobrenadante de meio de cultura

de C. cacaofunesta, em meio não indutor, induzido por CCN51 e em meio

induzido por TSH1188.

Figura 7: Perfis proteicos do micélio de C. cacaofunesta obtidos por 2D-Page

após cultivo em meio não indutor, induzido por CCN51 e em meio induzido por

TSH1188.

Figura 8: Scatter plot (% vol vs %vol) entre as réplicas do 2D-PAGE de proteínas

do micélio de C. cacaofunesta após cultivo em meio não indutor.

Figura 9: Scatter plot (% vol vs %vol) entre as réplicas do 2D-PAGE de proteínas

do micélio de C. cacaofunesta após cultivo em meio induzido por CCN51.

Figura 10: Scatter plot (% vol vs %vol) entre as réplicas do 2D-PAGE de

proteínas do micélio de C. cacaofunesta após cultivo em meio induzido por

TSH1188.

xii

Figura 11: Diagrama de Venn mostrando a distribuição dos spots totais obtidos

do perfil proteico do micélio de C. cacaofunesta (isolado Cc20), entre o controle

e o induzido por CCN 51.


do perfil proteico do micélio de C. cacaofunesta (isolado Cc20), entre o controle

e o induzido por TSH 1188.


do perfil proteico do micélio de C. cacaofunesta (isolado Cc20), entre o induzido

por CCN 51 e o induzido por TSH 1188.

Figura 14: Perfil proteico de C. cacaofunesta obtidas por 2D-Page após cultivo

em meio não indutor.

Figura 15: Categorização funcional de proteínas identificadas de C.

cacaofunesta cultivadas em meio não indutor.

Figura 16: Atividade enzimática de cisteíno-protease no micélio do fungo C.

cacaofunesta.

Figura 17: Atividade residual de cisteíno-protease no micélio do fungo C.

cacaofunesta.

Figura 18: Atividade enzimática da catalase no micélio do fungo C.

cacaofunesta.

Figura 19: Atividade enzimática de GPX no micélio do fungo C. cacaofunesta.

xiii

LISTA DE TABELAS

Tabela 1: Variações na concentração do inibidor TcCYS4.

Tabela 2: Proteínas identificadas por espectrometria de massas (MS/MS) no

secretoma de Ceratocystis cacaofunesta induzido com fragmentos de ramo de T. cacao.

Tabela 3: Lista de proteínas identificadas no micélio de Ceratocystis

cacaofunesta crescido em meio não indutor (controle).

xiv

RESUMO

MALHEIRO, Deyse Lara Vieira, M.S, Universidade Estadual de Santa Cruz - UESC. Análise do perfil proteômico e estudo do secretoma de Ceratocystis cacaofunesta induzido com fragmentos de ramo de Theobroma cacao. Orientador: Carlos Priminho Pirovani. Co-orientador: Karina Perez Gramacho; Colaboradora: Dilze Santos Argôlo

O fungo Ceratocystis cacaofunesta, fitopatógeno do Theobroma cacao, é um

ascomiceto, típico de xilema, que causa murcha e consequente morte nas

plantas, por obstrução dos vasos condutores. Estudos proteômicos sobre esse

fungo são bastante escassos. Neste trabalho, descrevemos os perfis proteicos

do secretoma deste fitopatógeno, quando induzidos, in vitro, por fragmentos de

ramos de dois genótipos de T. cacao (TSH1188 e CCN51). Além disso,

comparamos o proteoma micelial dos mesmos tratamentos utilizados para

estudo do secretoma. Por fim, analisamos enzimas associadas a estresse

oxidativo para ambos os tratamentos. A extração proteica foi baseada no uso de

SDS-denso e fenol tamponado com TrisHCl, pH 8,0. As proteínas obtidas,

através do proteoma (secretoma), foram identificadas por espectrometria de

massas (ms/ms). Do total de 39 bandas excisadas do gel, foram identificadas

três proteínas no secretoma de C. cacaofunesta. No perfil proteômico micelial

para os três tratamentos (controle, induzido por TSH1188 e induzido por CCN51)

foi comparado a distribuição global de spots, levando em consideração a massa

molecular (KDa) e ponto isoelétrico (pI), como também foi feita a identificação

dos spots do controle. Nos tratamentos controle, induzido por TSH1188 e

induzido por CCN51 foram detectados 425, 389 e 483 spots, respectivamente.

253 spots foram retirados do controle e 105 foram submetidos à identificação por

ms/ms. Um total de 29 spots tiveram as proteínas identificadas e distribuídas em

categorias funcionais. Dentre as classes, encontram-se proteínas associadas a

oxido-redução, metabolismo, síntese e dobramentos de proteínas, etc. A

identificação dessas proteínas pode ajudar a conhecer melhor o patógeno e

aprimorar formas de combate a ele, em prol da cultura cacaueira.

PALAVRAS-CHAVE: Proteoma, secretoma, espectrometria de massas,

atividade enzimática.

xv

ABSTRACT

MALHEIRO, Deyse Lara Vieira, MS, Universidade Estadual de Santa Cruz - UESC. Analysis of proteomic profile and study of secretome of Ceratocystis cacaofunesta induced with Theobroma cacao branch

fragments. Orientador: Carlos Priminho Pirovani. Co-orientadora: Karina Perez

Gramacho; Collaborator: Dilze Santos Argôlo.

The Ceratocystis cacaofunesta fungus, the pathogen Theobroma cacao is an

ascomycete, typical of xylem that cause wilting and eventual death in plants

through the obstruction of conducting vessels. Proteomic studies of this fungus

are rather scarce. In this paper, it is described the protein profiles of secretome

in this pathogen, when induced in vitro by branches of two genotypes of T. cacao

(TSH1188 and CCN51). Besides that, it was compared the proteome mycelial of

the same treatments used for the study secretome. Finally, it was analyzed

enzymes associated to an oxidative stress for both treatments. The protein

extraction was based on the use of SDS-dense and phenol buffered with Tris-

HCl, pH 8.0. The proteins obtained through the proteome (secretome), were

identified by mass spectrometry (MS / MS). In the total of 39 bands excised of

the gel, three proteins were identified in secretome C. cacaofunesta. In proteome

mycelial profile for the three treatments (control, induced by TSH1188 and

induced by CCN51) it was compared to a global distribution of spots taking into

account the molecular mass (kDa) and isoelectric point (pI), as well, it was done

the identification of the spots control. In the control treatments, induced TSH1188

and induced by CCN51 it was found 425, 389 and 483 spots respectively. 253

spots were removed of the control and 105 were selected for identification by

ms/ms. 29 spots, in the total, had their proteins identified and distributed into

functional categories. Among the classes, it is found proteins associated to oxide-

reduction, metabolism, synthesis and folding proteins, etc. Identifying these

proteins can help to understand the pathogen, in order to enhance ways to

combat it on behalf of cocoa cultivation.

KEYWORDS: Proteome, secretome, mass spectrometry, enzymatic activity.

xvi

1 INTRODUÇÃO

O complexo Ceratocystis fimbriata Ellis e Halsted lato senso é composto

de muitas espécies de fungos que infecta uma ampla gama de hospedeiros

economicamente importantes, no qual a grande maioria é de plantas lenhosas.

O Theobroma cacao é um dos hospedeiros de uma espécie desse complexo

(Engelbrecht et al., 2005; Harrington, 2005).

O fungo fitopatógeno do cacaueiro foi recentemente nomeado como

Ceratocystis cacaofunesta por pequenas diferenças morfológicas como tamanho

do peritécio, genéticas (ITS) e de inter-esterelidade com outros membros do

Complexo C. fimbriata (Engelbrecht et al., 2005).

C. cacaofunesta é um ascomiceto, típico de xilema (Harrington, 2000), e

entra na planta normalmente por cortes no lenho (Alfenas, et al. , 2009; Ferreira,

et al., 2006), o que dá o nome popular da doença causada por esse patógeno

de: Mal-do-Facão. Após a instalação do fungo nos vasos condutores, há o

surgimento de estrias no parênquima medular e progressão dessas, via

parênquima radial, o que ocasiona a morte de porções do câmbio vascular e

impede a passagem da seiva bruta para as partes aéreas da planta, causando a

murcha (Ferreira et al., 2006).

A murcha do ceratocystis no cacaueiro foi reportada pela primeira vez no

Brasil em 1978, na região amazônica e os primeiros relatos do fungo na Bahia

foi em mudas por enxertia em 1997 (Bezerra, 1997) e em plantas adultas em

1998 (Bezerra, 1998). Alguns estudos envolvendo genótipos de cacau presentes

na Bahia já foram realizados, e determinaram genótipos que são resistentes e

susceptíveis ao isolado Cc20 de C. cacaofunesta. Os genótipos TSH1188 e

CCN51, foram considerados como resistente e como susceptível ao fungo,

respectivamente (Sanches, et al. 2008; Santos, et al., 2012).

Somente um estudo de caracterização molecular do fungo C.

cacaofunesta é conhecido. Nesse estudo são englobadas genômica,

transcriptômica e proteômica mitocondrial (Ambrosio et al., 2013). Diante da

escassez de estudos proteômicos sobre o fungo, faz-se necessário e relevante,

realizar estudos sobre as possíveis alterações que ocorrem no perfil proteico

secretado (secretoma) e micelial de C. cacaofunesta bem como alterações

bioquímicas e metabólicas, durante a interação in vitro com genótipos de T.

cacao que são resistente (TSH1188) e susceptível (CCN 51) ao fungo.

1

Com o objetivo de compreender as alterações supracitadas foram

analisados e comparados os perfis proteicos do secretoma de C. cacaofunesta

(não induzido e induzidos). Também foi feita a proteômica basal (identificação dos

spots do controle) do fungo crescido em meio de cultura líquido e analisadas as

atividades de enzimas envolvidas em processo oxidativos para ambos os

estudos.

2

2 REVISÃO BIBLIOGRÁFICA

2.1 O gênero Ceratocystis

O complexo Ceratocystis fimbriata lato senso é composto de muitas

espécies de fungos que infecta uma ampla gama de hospedeiros

economicamente importantes como a manga (Mangifera indica), teca branca

(Gmelina arbórea), seringueira (Hevea brasiliensis), cacau (Theobroma cacao),

Eucalyptus spp., inhame (Colocasia esculenta), batata doce (Ipomoeas batatas)

e figo (Ficus carica) (Engelbrecht et al., 2005; Harrington, 2005).

A espécie C. fimbriata infecta numerosas famílias de plantas, em sua

maioria lenhosas, em mais de 41 países, abrangendo seis continentes (CAB

Internacional, 2005). Atualmente são conhecidos quatro clados filogenéticos:

clado latino americano (Harrington, 2000), o clado norte-americano (Johnson,

2005), o clado asiático (Thorpe, 2005), e as espécies africanas (Heath, 2009).

Esses clados estão baseados em isolamento geográfico e consequentemente

variação genética.

O fitopatógeno C. fimbriata é típico de xilema (Harrington, 2000), e entra

na planta normalmente por cortes no lenho, invadindo células do parênquima

radial, escurece tecidos infectados e causa murcha por obstrução dos vasos

xilemáticos (Alfenas, et al. , 2009; Ferreira, et al., 2006). Essa obstrução é uma

consequência da rápida colonização do fungo, principalmente em genótipos

susceptíveis, bem como de uma resposta do hospedeiro a presença deste.

Com exceção da batata doce e inhame, em que o fungo causa a podridão

seca (Harrington et al., 2005), em todas as outras espécies lenhosas as espécies

do gênero Ceratocystis causam murcha.

O primeiro relato da murcha de Ceratocystis no Brasil foi em São Paulo

em uma plantação de Crotalaria juncea, uma leguminosa utilizada normalmente

para proteger o solo de erosões (Costa & Krug, 1935). Posteriormente foi

encontrado em manga (Viegas, 1960), figo (Valarini & Tokeshi,1980) e inhame

(Harrington et al., 2005) em São Paulo; Eucalipto na Bahia (Ferreira et al., 1999)

3

e Minas Gerais (Alfenas et al., 2004); cacau no Alto Amazonas (Bastos,1978) e

Bahia (Bezerra, 1997).

Todos os membros do grupo são homotálicos, possuindo mating type

unidirecional (Harrington e Mcnew, 1997), o que limita a diversidade das

espécies. No entanto, a condição homotálica não tem restringido o conjunto de

espécies do gênero de colonizar uma ampla gama de hospedeiros; há uma

variação genética considerável dentro do complexo e essa normalmente está

associada a diferentes regiões geográficas e patógenos hospedeiro específicos.

Por exemplo, populações geograficamente distantes tendem a ser

geneticamente diferenciadas, tanto pela dispersão limitada (por insetos, por

estaquia, por vento ou chuva) quanto pela própria especiação que decorre disso

(Harrington, Thorpe e Alfenas, 2011).

A dispersão do fungo ocorre principalmente pela ação de besouros do tipo

coleópteros, do vento e da chuva. Os esporos transportados normalmente são

os aleuroconídios (esporos de resistência) ou ascósporos (esporos sexuados).

A dispersão também é corriqueiramente facilitada pela ação do homem através

da técnica de estaquia. No eucalipto, por exemplo, a infecção pode-se dar

através das raízes por solo contaminado com aleuroconídios (Laia, Alfenas e

Harrington, 2000), ou através de feridas nas quais os esporos sexuados

penetram com o auxílio de insetos (Engelbrecht, Harrington e Alfenas, 2007). No

entanto, como a maioria do eucalipto no Brasil é plantada com estacas

enraizadas de rápido crescimento, é provável que o Ceratocystis seja

amplamente disseminado em material de propagação sem sintoma aparente,

porém contaminado (Harrington, 2000).

Estudos moleculares, por exemplo, com marcadores microssatélites

polimórficos têm mostrado a identificação de populações nativas e introduzidas

do fungo como forma de entender a dispersão das espécies do complexo.

Populações nativas demonstram ter sofrido um severo gargalo genético,

enquanto as populações introduzidas apresentam baixa variabilidade genética

porque provavelmente foram advindas de estaquia e persistem essencialmente

como clones (Ferreira, 2010).

4

2.2 O fungo Ceratocystis cacaofunesta e o Theobroma cacao

2.2.1 O fungo Ceratocystis cacaofunesta (caracterização)

O fungo Ceratocystis cacaofunesta é um organismo pertencente ao

Domínio Eukarya; Reino Eumycota; Classe dos Ascomycetes; Ordem

Ophiostomales; Família Ophiostomataceae; e Gênero Ceratocystis.

Esse fungo possui peritécios pretos, elipsoides, com rostro (pescoço)

longo e cilíndrico e na extremidade ocorre a liberação dos ascósporos (esporos

sexuais). Os ascósporos do C. cacaofunesta (específico do fungo do cacaueiro),

são um pouco maior que os do complexo C. fimbriata, medindo de 5,0-7,5 µm x

3,5-5,0 µm enquanto os do C. fimbriata medem (4-7µm de largura e 3-4 µm de

diâmetro); os peritécios medem de 110-250 µm x 120-250 µm. e são extrusados

na extremidade do rostro (Engelbrecht et al., 2005). Comumente quando há um

aumento de temperatura e umidade, a massa que envolve os ascos absorve

umidade e aumenta de tamanho exercendo uma pressão de dentro para fora do

peritécio, sendo o rostro o local por onde o material é exposto ao ambiente

(Guerrero, 1975; Chong, 1961).

Figura 1 - Microscopia Eletrônica de esporos. A- C. fimbriata e B- C. cacaofunesta. Engelbrecht et al., 2005.

5

Quanto a caracterização molecular do fungo, somente um estudo foi feito

da genômica, transcriptômica e proteômica mitocondrial (Ambrosio, et al., 2013).

Este estudo identificou 103.147 pb numa molécula de DNA mitocondrial circular

de fita única. Dentre os genes, foram encontrados 15 conservados, os quais

estão envolvidos com fosforilação oxidativa e síntese de ATP. Dentre as

proteínas codificadas pelo genoma mitocondrial, 584 tiveram a localização

predita pelos softwares Target P e Wolf PSORT, 24% destas foram validadas

experimentalmente (Ambrosio, et al., 2013). Portanto os estudos moleculares

têm muito a contribuir para o conhecimento desse fitopatógeno.

2.2.2 Histórico

O fungo causador do mal-do-facão faz parte do clado latino americano do

complexo de espécies de Ceratocystis fimbriata em que estão inclusos

patógenos que tem diferentes tipos de hospedeiros, dentre eles, o Theobroma

cacao. A murcha do ceratocystis no cacaueiro, foi primeiramente reportada no

Equador em 1918 e após 1940, foi encontrada na Colômbia, Costa Rica,

Venezuela, Guatemala, Peru e por fim no Brasil, na região amazônica em 1978

e no sul da Bahia no final da década de 90 (Rorer, 1918; Thorold, 1975;

Schieber,1960; Soberanis, 1999; Bastos e Evans, 1978; Bezerra, 1997).

Estudos moleculares com marcadores microssatélites e de DNA

fingerprints foram feitos a fim de descobrir dentre os países no qual o C.

cacaofunesta estava presente qual seria o seu centro de origem. Os resultados

mostraram que os valores de diversidade genética de duas populações

introduzidas de C. platani em Modesto, na Califórnia e sul da Europa

(Engelbrecht et al., 2004) foram semelhantes às encontradas nas populações C.

cacaofunesta na Costa Rica, Colômbia e Bahia, no Brasil, o que sugere que

essas três populações de C. cacaofunesta são resultados de introduções por

estacas de T. cacao. Em relação à Costa Rica e Colômbia, é provável que

tenham sido originadas em alguma região do Alto Amazonas que não em

6

Rondônia, já que quando o C. cacaofunesta foi reportado nesses países ainda

não havia a estação experimental de Rondônia (Engelbrecht, et al., 2007). Já os

isolados presentes na Bahia são, provavelmente, advindos de Rondônia, isso

porque, a doença na Bahia apareceu em uma estação experimental (Bezerra,

1997) operada pela mesma agência federal que opera a Estação experimental

Rondoniana onde os isolados foram coletados (Bastos, 1978). Além disso, o

baixo nível de fluxo gênico entre os isolados da Bahia e da Costa Rica / Colômbia

propõe que a população Bahia foi o resultado de uma introdução independente.

Sugere-se que as populações do Alto Amazonas e Equador sejam nativas, o que

faz sentido, uma vez que ambos são centros de origem de T. cacao (Engelbrecht,

et al., 2007).

Os primeiros relatos do fungo na Bahia foram em mudas por enxertia em

1997 (Bezerra, 1997) e em plantas adultas em 1998 (Bezerra, 1998).

A espécie Ceratocystis cacaofunesta, foi descrita como diferente de C.

fimbriata em 2005, quando pesquisas confirmaram pequenas diferenças

morfológicas como tamanho do peritécio, genéticas (ITS) e de inter-esterelidade

com outros membros do clado (Engelbrecht et al., 2005), perfazendo 37 isolados

de Theobroma cacao, Ipomoea batatas e Platanus sp.

Acredita-se que especialização à determinado hospedeiro ou a perda

aparente da agressividade para outros hospedeiros esteja sendo o caminho para

a descrição de novas espécies (Engelbrecht; Harrington 2005) antes designadas

como fazendo parte do grande clado de C. fimbriata.

Em 2005, um estudo do CEPEC- CEPLAC mostrou que a doença

causada pelo Ceratocystis em cacaueiro, esteve presente em 42 fazendas de 22

municípios situados em nove agrossistemas baianos. Dentre os municípios

estudados, Uruçuca apresentou maior incidência da doença, comprometendo

30% de sua produção. Dentre as variedades acometidas estavam: TSH 516,

TSH 1188, dentre outros (Almeida et al., 2005).

Em 2012, um estudo de histopatologia da interação feito na Bahia com o

isolado Cc20 e com dois genótipos CCN51 e TSH1188 mostraram claramente

que esses são susceptível e resistente respectivamente, à infecção por este

isolado do fungo. A intensidade da infecção varia, mas ela ocorre em ambos.

Isso acontece porque quando os conídios são restringidos no início da infecção,

7

essa consegue ser contida, e quando não a planta logo apresenta sintoma de

murcha (Santos et al., 2013). O genótipo TSH1188 também mostrou ser

resistente ao isolado ALF-78. (Sanches, 2008).

2.2.3 Sintomas e modo de transmissão do mal-do-facão

O gênero Ceratocystis é um fungo hemibiotrófico, que pode viver no solo

e na matéria orgânica. Como um típico patógeno de xilema, seu principal sintoma

é constatável nas secções transversais de órgãos lenhosos na forma de estrias

que podem estar associadas a presença de compostos fenólicos, mais presentes

em interações em que há resistência (Santos et al. 2012) ou a necrose também

presente no mesmo tipo de interação. (Ferreira et al., 2006).

As estrias surgem no parênquima medular e progridem via parênquima

radial matando uma porção do câmbio vascular, e impedindo a passagem da

seiva bruta para as partes aéreas da planta, causando murcha (Ferreira et al.,

2006). Em genótipos resistentes, a oclusão de alguns vasos é compensada pela

produção de novos elementos do xilema, que evitam que a planta colapse

(Santos et al. 2012).

Além disso, estudos mostram a presença de uma fitotoxina produzida por

Ceratocystis chamada cerato platanina provocando respostas relacionadas a

defesa, como a produção de fitoalexina e a morte celular (Pazzagli et al, 2006).

Respostas como esta são observadas, com maior intensidade, em interações

com genótipos susceptíveis ao fungo com produção excessiva de grãos de

amido e em interação com plantas resistentes ao fungo com necrose aparente

em cortes histológicos (Santos et al. 2012).

Em plantios em áreas urbanas, o fungo é transmitido principalmente por

poda, por isso o nome, mal-do-facão (Engelbrecht et al. 2007). No entanto,

espécies de Ceratocystis também são fortemente associadas à dispersão por

insetos (Harrington, 2009). Árvores infectadas são frequentemente atacadas por

besouros Ambrosia (Coleoptera: Curculionidae: Scolytinae e Platypodinae) que

carregam esporos presos ao seu exoesqueleto e formam galerias que permitem

que os esporos sejam levados pelo vento ou pela chuva. Nessas

8

dispersões normalmente os esporos de resistência, aleuroconídios, conseguem

sobreviver mais tempo a condições adversas se tornando os propágulos mais

eficientes. Uma forma de dispersão menos comum, além de dispersão através

aleurioconídios, é das massas de ascósporos (esporos sexuados) formadas na

extremidade do peritécio que podem ser dispersos por outros tipos de insetos,

como moscas e besouros nitidulídeo (Harrington, 2009). A infecção, pela ação

da chuva e do vento ocorre quando o esporo tem contato com um ferimento no

caule de um hospedeiro ou pela infecção na raiz, que até então é a forma menos

relatada na literatura (Kile, 1993).

Dentre estas formas, destaca-se a atividade dos besouros, uma vez que

a dispersão pelo vento e água é dificultada pela forte ligação existente entre os

ascósporos e o peritécio; no caso dos besouros, esta ligação é contrabalanceada

pela ligação dos ascósporos ao exoesqueleto do inseto, o que justifica a

vantagem na dispersão; além disso, algumas espécies desse gênero produzem

odor característico para atrair os besouros (Harrington, 2009). Uma vez na

árvore, o fungo se move através do xilema (característica de patógenos de

murcha) e provoca úlceras.

A espécie C. cacaofunesta é homotálica, possui acasalamento

unidirecional por meio de comutação, podendo persistir de maneira

essencialmente clonal através da reprodução assexuada e produção de esporos

sexuais por meio de autofecundação (Witthuhn et al., 2000) que tende a limitar

a diversidade genética da população. Além disso, os aleuroconídios (esporos de

resistência), podem viver meses ou anos na madeira de plantas doentes, se

tornando fontes potenciais de contaminação (Grousclaude et al., 1995).

2.3 Estudos proteômicos como suporte para entendimento da interação planta-patógeno (fungo)

Em meados de 1990, os estudos in vitro passaram a ter novos focos, e assim

começava a era das “ômicas”. Os estudos de genômica, transcriptômica, proteômica

e metabolômica em conjunto contribuem para o entendimento

9

global de um organismo, haja vista a complexidade destes (González Fernández

et al., 2010).

Ao longo dos anos, vários estudos têm sido realizados para analisar as

interações planta-patógeno e a grande quantidade de biomoléculas envolvidas

nesta interação torna-a extremamente complexa e dinâmica. Fungos patógenos

de plantas, por exemplo, tem um complicado ciclo de vida, com reprodução

assexuada e sexuada dependendo do grau de infecção, sendo diferente para

cada patógeno (González Fernández et al., 2010).

Estudos da interação planta-fungo podem ser feitos utilizando-se diversas

ferramentas envolvendo genética clássica, biologia celular e bioquímica,

acompanhadas de bioinformática. Estudos do genoma desses fungos têm sido

imprescindíveis para o entendimento da dinâmica da interação. (González

Fernández et al., 2010). Neste sentido, os estudos subsequentes ao do genoma,

que pode ser o do proteoma (no qual o foco é no produto gênico) são adicionais

e fundamentais, uma vez que é valioso para a compreensão de redes

regulatórias e tem como objetivo desvendar a expressão e modificação

proteicas, em condições pré-determinadas, a depender do estudo que está

sendo feito (Thurston et al., 2005). Portanto, trata-se de um estudo qualitativo e

quantitativo no que diz respeito ao grande número de proteínas que influenciam

diretamente no funcionamento bioquímico das células, o que permite um

entendimento global do organismo durante seu crescimento, desenvolvimento e

comportamento diante de estímulos ambientais ou quando submetidos a

situações de estresse biótico ou abiótico (Chen e Harmon, 2006).

As técnicas da proteômica clássica envolvem gel de poliacrilamida

bidimensional (2D), análise por espectrometria de massas e validação dos

resultados com banco de dados específico para o organismo em estudo, quando

há, ou para organismos próximos / modelo (Chalmers e Gaskell, 2000).

Geralmente, nesses estudos, as análises feitas são comparativas entre

tratamentos, em relação a proteínas expressas. Isso traz respostas de como o

organismo reagiu às diferentes condições as quais foi submetido (Cantú et al.,

2008).

10

Nos últimos cinco anos, ocorreram grandes avanços numa área da

proteômica, denominada secretoma; no entanto o primeiro estudo sobre

secretoma foi feito há 15 anos, com o Bacillus subtilis (Tjalsma et al., 2000). O

secretoma pode ser caracterizado somente como o conjunto de proteínas

secretadas por células (Brown, 2012) ou como o conjunto das proteínas da

membrana plasmática que estão voltadas para o espaço extracelular juntamente

com as proteínas segregadas pela célula (Stastna & Van Eyk 2012). As proteínas

secretadas, corriqueiramente possuem um peptídeo sinal na região N-terminal

que as direcionam para o sistema clássico do retículo endoplasmático/complexo

de Golgi (Alexandersson et al, 2013). Contudo, já foram encontradas em plantas

de Solanum licopersycum (Konozy et al., 2013), proteínas secretadas que não

possuíam peptídeo sinal, o que sugere a existência de um sistema de secreção

alternativo.

O estudo do secretoma tem tomado importância na medida em que a

comunicação através da secreção de proteínas e metabólitos numa interação

planta-patógeno, por exemplo, determina a progressão ou não da doença (Brown,

2012).

Numa interação as proteínas secretadas são cruciais para respostas de

estresse, por exemplo, quando a planta é submetida a efetores de patógenos.

Estudo in vitro do secretoma de MoniIliophtora perniciosa, por exemplo,

comprovaram um estresse severo em tecidos de um genótipo de Theobroma

cacao resistente (TSH1188) a M. perniciosa, quando foram submetidos ao

secretoma do mesmo (Alvim et al., 2009).

11

3 MATERIAL E MÉTODOS

A metodologia foi descrita da seguinte forma:

1- Metodologia comum entre os dois estudos (secretoma e proteômica de

micélio)

2- Metodologia específica para secretoma

3- Metodologia específica para proteômica micelial

3.1 Material biológico e cultivo do Ceratocystis cacaofunesta

O isolado do fungo denominado Cc20, foi utilizado no presente estudo.

Trata-se de um isolado da coleção micológica do fungo da CEPEC/CEPLAC

(Laboratório de Ceratocystis), representando isolados da região produtora de

cacau do sul da Bahia- Brasil. Este isolado vem sido corriqueiramente utilizado

em pesquisas com Ceratocystis (Santos, 2012; Sanches, 2009) e apresenta

baixo nível de infecção na variedade TSH1188 e alto nível de infecção na

variedade CCN51 do Theobroma cacao (Sanches, 2009).

Para obtenção das amostras, o fungo foi crescido em placa de Petri de 9

cm. de diâmetro, contendo meio BDA (Batata Ágar dextrose) em que foram

colocados 3 massas de ascósporos (colônia não monospórica) formando um

triângulo na placa e deixado crescer por 10 dias em BOD. Um plug (disco) do

micélio de 1 cm de diâmetro foi utilizado para coletar o micélio crescido em BDA

e colocá-lo para crescer no meio líquido mineral líquido (Glicose 1% (p/v),

NH4H2PO4 0,1% (p/v), KCl 0,02% (p/v), MgSO4.7H2O 0,02% (p/v), CuSO4

5%(p/v), ZnSO4.7 H2O 1% (p/v), extrato de levedura 0,5% (p/v)). No meio líquido

mineral o fungo cresceu em BOD com fotoperíodo de 12 horas.

Para conhecer o comportamento do fungo no meio utilizado, foi feito um

ensaio inicial no qual foram observados parâmetros como crescimento micelial

e quantidade de proteínas secretadas no meio de cultura líquido. De acordo com

as observações feitas determinou-se que as coletas do micélio e do meio de

cultura seriam feitas 2, 5, 7 e 9 dias após inoculação (DAI) (30 repetições

biológicas por tempo).

12

Após análise da quantidade de proteínas secretadas, foi feito um outro

ensaio no qual foram utilizados os parâmetros do ensaio anterior para definir o

tempo de 6 DAI (dias após inoculação em meio líquido) para coleta das amostras

do micélio e do sobrenadante submetidos à indução com dois genótipos de T.

cacao para estudos proteômicos de micélio, análise de proteínas secretadas (50

repetições biológicas) e de enzimas para ambos.

Os fragmentos de ramo de T. cacao citados acima foram colocadas no

meio de cultura líquido concomitante à colocação do disco de micélio.

3.2 Caracterização do fungo Ceratocystis cacaofunesta em meio de cultura líquido

3.2.1 Rendimento micelial e rendimento proteico secretado

Para análise de rendimento micelial, o micélio de 30 repetições (por

tempo) foi coletado em microtubos individuais nos tempos de 2, 5, 7 e 9 dias e

liofilizado. Após liofilização, a massa foi aferida em uma balança de precisão e o

rendimento de biomassa seca para 30 repetições por tempo, foi calculado. O

rendimento de biomassa micelial foi correlacionado ao rendimento proteico que

foi dosado no sobrenadante de cada réplica através do 2-D Quant-kit (GE

Healthcare), usando albumina do soro bovino (BSA), como padrão de acordo

recomendações do fabricante.

3.2.2 Microscopia

As análises em microscópio ótico foram realizadas para verificar as

estruturas fúngicas que estavam presentes em cada tempo de coleta. Um

pequeno fragmento do micélio de réplicas escolhidas aleatoriamente foi

colocado na lâmina de microscopia e espalhado para que as estruturas não se

sobrepusessem. Uma gota de azul de tolueno e uma lamínula foram colocados

sobre o esfregaço. As lâminas foram visualizadas em microscópio óptico

Olympus em um aumento de 40X, e a identificação das estruturas foi feita com

o auxílio da Msc. Dilze Maria Argôlo e do Dr. José Luiz Bezerra na CEPLAC –

Ilhéus, BA.

13

3.2.3 Atividade Enzimática de GPx secretada (aos 2, 5, 7 e 9 dias de cultivo)

O sobrenadante dos quatro tempos de coleta (2,5,7 e 9 dias) foi submetido

a uma mini-diálise (em microtubo) para remoção de contaminantes de baixo

peso molecular. Esse procedimento consistiu de quatro trocas, sendo três com

água e a última com tampão fosfato de sódio pH 6,0. Três microtubos (réplicas)

de cada tempo foram utilizados para essa atividade. Para a determinação da

atividade de GPX, colocou-se em cada poço, de uma placa de 96 poços, de

fundo plano, tampão de reação contendo 130 µL de tampão fosfato de sódio puro

(50 mmol L-1, pH 6,0) e 10 µL de sobrenadante fúngico (secretado). No momento

imediatamente anterior à leitura, foi adicionado 140 µL de tampão de reação

GPX 2x [guaiacol 40 mmol L-1, H2O2 a 0,06% e fosfato de sódio (20 mmol L-1,

pH 6,0)], totalizando 280 µL por poço (volume final da reação). A atividade

ocorreu a 30°C e a reação foi iniciada somente quando se adicionou o guaiacol

ao poço. A leitura foi feita com absorbância de 470 ƞm, a cada 15 segundos,

durante 3 minutos, em espectrofotômetro de microplacas SpectraMax Paradigm

(Molecular Devices) e os dados brutos foram gerados pelo programa Softmax

Pro Software 6.4 (Molecular Devices).

3.3 Indução por diferentes genótipos de cacau

O cultivo do fungo C. cacaofunesta foi feito de acordo com o tópico 3.1,

sendo cultivado primeiramente em meio ágar dextrose e posteriormente em meio

líquido, onde foram colocando os indutores, como está explicado abaixo.

Os fragmentos de ramos jovens (parte superior da planta) de TSH1188 e

CCN51, advindos de plantas alocadas no campo na CEPEC/CEPLAC, foram

coletados para a indução. Após a coleta esses fragmentos foram cortados em

pedaços de aproximadamente 1 cm e pesados, para garantir que todas as

repetições (50 por tratamento) contendo 50 ml de meio de cultura mineral,

tivesse 0,5 g. de tecido.

14

Após pesagem, os fragmentos de ramos foram autoclavados, por 20

minutos a 120 graus e ao atingir a temperatura ambiente (pós autoclavagem)

foram colocados no meio líquido, junto com o disco de micélio.

3.3.1 Perfil em SDS-Page das proteínas secretadas em meio indutor

As coletas de sobrenadante de C. cacaofunesta cultivado em 50 ml de

meio de cultura líquido mineral por 6 dias, na presença de fragmentos de ramos

de T. cacao (CCN 51 e TSH1188) foram feitas da seguinte forma: o

sobrenadante de cultivo crescido foi filtrado inicialmente em algodão (para

retirada das partículas maiores) e posteriormente filtrado em membrana de

nitrocelulose de 0,22 µm (Millipore). O sobrenadante foi liofilizado e

ressuspendido em 5 ml de água ultrapura autoclavada. A metodologia utilizada

para extração foi semelhante à de Alvim et al. (2009), com pequenas

modificações, sendo elas, uma lavagem a mais em etanol e uma a mais em

acetona, devido à grande quantidade de impurezas na amostra. Os pellets

resultantes de extração foram ressuspensos em 50 µL de tampão de reidratação

(uréia 7 mol.L-1, tiouréia 2 mol.L-1, CHAPS 1%, DTT 0,1 mol.L-1, IPG 0.5% pH 3–

10 NL e traços de azul de bromofenol) e quantificados com 2-D Quant-kit (GE

Healthcare). As amostras foram quantificadas pelo método de Bradford (1976) e

analisadas por SDS-PAGE (Laemmli, 1970) em minicubas de eletroforese

(Omniphor) com géis de 8 x 10 cm, contendo 12,5% de acrilamida.

15

3.3.2 Ensaio da atividade de Celulase em sobrenadante de cultura

A coleta do sobrenadante de meio de cultura foi feita a partir de amostras com 6

DAI em um tubo Falcon (advindo de um pool de 10 réplicas biológicas) de cada

tratamento (controle, induzido por CCN51 e induzido por TSH1188) contendo

50mL de meio líquido liofilizado. O sobrenadante liofilizado foi ressuspenso em

5mL de tampão citrato de sódio (pH 4,2 e 0,5 M). Em um microtubo, foi colocado

500 uL do sobrenadante diluído em tampão, com 500 uL de uma solução de

tampão citrato de sódio com carboximetilcelulose 1%. Essa solução foi incubada

em banho maria a 57 ºC por uma hora. Após esse tempo, foi retirado 10 uL de

cada microtubo e foi adicionado 1 mL do reagente do kit de quantificação de

glicose QuimiGlix-OX Glicose Oxidase (Ebram) de acordo com as instruções do

fabricante. Dos 1.900 uL gerados, um volume de 280 uL (capacidade máxima do

poço) foi transferido para microplacas de Elisa, de fundo plano, que

representaram a triplicata de cada tratamento. A placa, com as amostras foi

incubada dentro do SpectraMax Paradigm (Molecular Devices) por 10 minutos a

37ºC. A leitura da absorbância a 500 ƞm em espectrofotômetro de microplacas

e os dados brutos foram gerados pelo Softmax Pro Sotware 6.4 (Molecular

Devices), no ponto final da reação. A quantidade de glicose liberada foi

determinada com base na equação y= 0,2174x + 0,2062 (R2= 0,9955) de uma

curva padrão utilizando glicose PA como padrão. A atividade de celulase foi

expressa pela quantidade de glicose presente na amostra, liberada pela

degradação de carboximilcelulose. Os dados foram expressos em Unidade

enzimática (U) por ml (sobrenadante de cultura), em que uma Unidade

enzimática é definida como a quantidade de enzima capaz de liberar 1 µmol de

glicose por minuto da reação.

16

3.4 Proteômica de micélio

3.4.1 Extração de proteínas miceliais do fungo Ceratocystis cacaofunesta

O micélio foi retirado do meio líquido e colocado em um microtubo, que

havia sido pesado individualmente anteriormente. Esse micélio foi liofilizado e

massa foi aferida para cálculo de rendimento proteico. Para proteômica foi feita

a maceração em N2 líquido do micélio liofilizado e pesado 0,05 g por repetição

dentro dos seus respectivos tratamentos (controle, induzido por CCN51 e

induzido por TSH1188). A extração foi realizada segundo Pirovani et al. (2008).

As proteínas resultantes da extração foram quantificados por 2-D Quant-kit (GE

Healthcare), usando albumina do soro bovino (BSA), como padrão.

3.4.2 Eletroforese Bidimensional Um total de 420 μg de proteínas extraídas foi utilizado por tira de gel e por

tratamento. As tiras utilizadas foram as de 13 cm, com gradiente de pH

imobilizado 3 a 10 NL (pH 3-10NL, 130 × 3 × 0.5 mm; GE Healthcare,

Immobiline™ Dry-Strip). O protocolo seguido para isoeletrofocalização, no Ethan

IPGphor III (GE Healthcare), foi: 12 h (overnight) à 20ºC para hidratação do gel;

1 h a 500 Vh, 1 h e 4 min a 1000 Vh, 2 h e 30 min a 8000 Vh e 22 min a 8000 Vh

à 20ºC da focalização propriamente dita, totalizando 17h e 15m. Após a

isoeletrofocalização as tiras do gel foram colocadas em tubos de ensaios de vidro

e tampadas para serem equilibradas para a segunda dimensão. O equilíbrio das

tiras de gel foi feito em três passos: 15 min. em tampão de equilíbrio (ureia 6

mol.L-1, SDS 2%, glicerol 30%, Tris–HCl 0,05 mol.L-1, pH 8.8) contendo DTT

1% ; 15 min. em tampão de equilíbrio contendo iodoacetamida a 2,5% e 15 min.

em tampão de corrida 1X ( Tri s, 0,025 mol.L-1, Glicina 0,19 mol.L-1, SDS 0.1%,

pH 8.3); em todas as etapas as tiras de gel foram mantidas sob agitação lenta.

17

A segunda dimensão foi feita em gel de poliacrilamida 12,5 % e em um

sistema de eletroforese vertical (SE 600 Ruby - GE Healthcare). As tiras já

focalizadas foram colocadas na região superior de cada gel e do lado esquerdo

foi colocado o marcador de peso molecular (GE Healthcare- 14 a 97 KDa), em

um pedaço de papel filtro. Em seguida foram cobertos com a agarose (25

mmol.L-1 de Tris base, 192 mmol.L-1 de glicina, 0.1 % de SDS, 0.5 % de agarose,

0.002 % de azul de bromofenol). A corrida foi realizada com a corrente elétrica

de 45 mA por 15 minutos, 120 mA por 30 minutos e 150 mA em uma fonte Bio-

Rad Power Pac 3000. A temperatura foi mantida por volta de 11 ºC durante toda

a corrida.

Após a corrida com duração média de 4 horas, os géis foram fixados em

etanol 40% e ácido acético 10% por 30min.; posteriormente foram corados com

azul de Comassie coloidadas (Neuhoff et al., 1988) por sete dias sob agitação e

descorados por sete dias com trocas diárias de água, também sob agitação.

Após essas etapas, os géis foram mantidos em ácido acético 7%.

3.4.3 Análise da imagem dos géis pelo programa Image Master

As imagens dos géis foram digitalizadas com o scanner LabScanner

(Amersham Bioscience) e analisados com o ImageMaster 2D Platinum 7.0 (GE

Healthcare). A quantidade e intensidade de spots, foram observados assim

como a reprodutibilidade dentro das triplicatas. Os spots foram detectados

automaticamente e a comparação (matching) foi feita utilizando alinhamento por

landmarks, inicialmente entre as triplicatas, para averiguar reprodutibilidade e

posteriormente entre os tratamentos. Os valores de massa molecular (MM)

foram obtidos em relação ao padrão (Marcador Molecular da GE Healthcare) e

o ponto isoelétrico (pI) a partir dos pontos iniciais e final da strip (3-10 NL GE

Healthcare Immobiline™ Dry-Strip). Após a marcação dos spots, a amostra

controle foi utilizada como parâmetro para comparação com as amostras

induzidas por CCN51 (susceptível) e TSH1188 (resistente). O spots foram

considerados como diferencialmente expressos quando o (fold) ≥ 2,0. Esse

parâmetro é dado pelo programa Image Master.

18

3.4.4 Extração de peptídeos em gel e análise por espectrometria de massas (LC/MS/MS)

Os spots foram excisados de dois géis para cada tratamento para garantir

que aqueles com menor expressão também fossem identificados. Após excisados

em pequenos pedaços e colocados individualmente em microtubos, eles foram

fragmentados. Em seguida, lavados três vezes com 100 µL de NH4HCO3 100 %

contendo acetonitrila a 50 % para descorar o gel. Em cada lavagem o

sobrenadante era descartado. Posteriormente, ocorreu outra lavagem com 200

µL de água Mili-Q para retirar o excesso da solução anterior e então submetê-los

a desidratação em 100 µL de acetonitrila 100 %. Após incubação de 5 minutos, o

sobrenadante foi descartado e foi feita a secagem no Concentrator 5301

(Eppendorf) por aproximadamente 10 minutos. Em seguida, adicionou-se 5 µL de

solução gelada de tripsina Gold (25 ng.µL-1 - Promega) e manteve-se os

microtubos em gelo por 10 minutos. Após esse tempo adicionou-se

aproximadamente 20 µL de NH4HCO3 (25 mmol.L-1). Os spots contendo tripsina

foram incubados por 16 horas em estufa a 37 °C. Por fim, o sobrenadante dos

tubos foram coletados e transferidos para novos tubos e os peptídeos foram re-

extraídos com 50 µL de acetonitrila 50 % contendo ácido fórmico a 5 %, sob

agitação durante 30 minutos em termomix Thermo Finemixer (SH2000-DX). O

volume de cada amostra foi reduzido no Speed Vac até atingir aproximadamente

20 µL.

Os fragmentos proteicos, resultantes da digestão foram analisadas por LC-

MS/MS (Online nano flow liquid chromatography tandem mass spectrometry) em

um cromatógrafo nanoAcquity (Waters, Milford, MA) acoplado ao espectrômetro

de massas Q-Tof micro (Waters) (Oliveira et al., 2012). Os dados brutos (.RAW)

gerados pelo espectrômetro foram processados pelo software ProteinLynx e

convertidos em arquivos PKL. No software Mascot os arquivos foram submetidos

contra o banco de dados do NCBInr. Os parâmetros utilizados para a pesquisa

foram: digestão pela enzima tripsina, como modificação fixa carbamidometil

(Cys), e como modificação variável oxidação (Met); máximo de uma perda de sítio

de clivagem; e 0.3 Da para o erro de tolerância de peptídeos e 0.1 Da para erros

dos íons fragmentados; formato Micromass PKL e instrumento ESI-QUAD-TOF.

19

3.4.5 Categorização funcional de proteínas

Os arquivos no formato FASTA das proteínas identificadas no Mascot

foram obtidos no site do NCBI utilizando o número de acesso. Esses arquivos

foram utilizados no software BLAST 2GO para categorização funcional das

proteínas.

3.5 Atividade enzimática do extrato proteico micelial

3.5.1 Ensaio da atividade de cisteíno-protease e teste de atividade inibitória com TcCYS4 (inibidor de protease do T. cacao)

Quatro microtubos de cada tratamento (controle, induzido por CCN51 e induzido

por TSH1188) foram utilizados para fazer um pool de micélio liofilizado com o

peso de 0,05 g. Foi adicionado à amostra 800 uL de uma solução contendo

tampão fosfato de sódio 100mM e pH 7,4, EDTA 10mM e β-mercaptoetanol 2mM

em cada microtubo. As amostras foram sonicadas por 5 s intercalado com 10 s

de repouso, utilizando o parâmetro amplitude 40 % em ultrassonicador (Pgex

30) promovendo o rompimento total das membranas. A sonicação foi toda feita

em gelo para evitar degradação da amostra. Em seguida, foi feita uma

centrifugação por 15 minutos a 14.000 rpm. para obtenção do extrato enzimático

(sobrenadante). O inibidor utilizado para TcCYS4 a 23 µmol produzido e

purificado a partir de um clone de expressão heteróloga em bactéria, produzido

por Pirovani et al. (2010). Para este ensaio, foram definidas quantidade fixas de

amostras (extrato) e substrato BApNA (Benzoilarginina-p-Nitroanilid-Dimetil-

Sulfóxido de Sódio) e variações na concentração do inibidor. O volume final por

poço foi de 140 µL e o ensaio foi feito em placa de Elisa. O esquema abaixo

mostra as variações de CYS.

20

Tabela 1- Variações na concentração do inibidor TcCYS4. Em vermelho, estão as variações no

volume do inibidor (uL). O tampão fosfato de sódio puro foi utilizado para ajustar o volume final

da reação. Todas essas reações foram feitas em triplicata para o controle, induzido por CCN51

e induzido por TSH1188.

Reações Extrato Substrato Inibidor (TcCYS4) Tampão fosfato

Enzimático (µL) BApNA (µL) (µL) puro (µL)

1 45 75 20 0

2 45 75 12,5 7,5

3 45 75 5 15

4 45 75 0 20

A atividade residual da enzima foi medida através da hidrólise do BapNA

(substrato cromogênico) com leitura a 410 ƞm, a cada 10 mim, durante 1h, em

espectrofotômetro de microplacas SpectraMax Paradigm (Molecular Devices) e

os dados brutos foram dados pelo programa Softmax Pro 6.4 (Molecular

Devices). O percentual de 100 % da atividade residual de tripsina foi determinado

a partir do controle (sem inibidor), a atividade para as três concentrações do

inibidor foi dada em relação ao controle.

% inibição = [(∆ABS410 SI – ∆ABS410 CI) / ∆ABS410 SI] x 100 Em que: ∆ABS410 SI corresponde à variação da absorbância a 410 ƞm na

ausência de inibidor (reação 4) e, ∆ ABS410 CI corresponde à variação da

absorbância a 410 ƞm na presença do inibidor, para cada diferente concentração.

21

3.5.2 Ensaio da atividade de Catalase (CAT) – EC: 1.11.1.6

A atividade da catalase (CAT) é medida pela velocidade da conversão do

H2O2 em água e oxigênio (como mostrado abaixo) no decorrer de um tempo,

que no caso desse estudo, foi de 300 s.

2 H O Catalase 2 H O + O 2 2 2 2

Quatro microtubos de cada tratamento (controle, induzido por CCN51 e

induzido por TSH1188) formando um pool de 0,05 g foram utilizados para essa

atividade. Foi colocado 800 uL de tampão fosfato de sódio, 50 mM, pH 7 sobre

a massa de micélio liofilizado supracitada. As amostras foram sonicadas por 5 s

intercalado com 10 s de repouso, utilizando o parâmetro amplitude 40 % em

ultrassonicador (Pgex 30). A sonicação foi toda feita no gelo para evitar

degradação da amostra. Em seguida, foi feita uma centrifugação por 15 minutos

a 14.000 rpm para obtenção do extrato bruto (sobrenadante) para a cinética. A

análise da atividade ocorreu à 30°C e a reação foi iniciada pela adição de H2O2

a 30 mM. O branco da reação foi livre de extrato fúngico. A leitura foi feita com

absorbância de 240 ƞm em espectrofotômetro de microplacas SpectraMax

Paradigm (Molecular Devices) e os dados brutos foram dados pelo programa

Softmax Pro 6.4 (Molecular Devices).

3.5.3 Ensaio da atividade de Peroxidase do Guaiacol (GPx)-E.C. 1.11.1.7

Um microtubo de cada tratamento (controle, induzido por CCN51 e

induzido por TSH1188) contendo micélio liofilizado (0,05 g de um pool) foi

utilizado para essa atividade. Um volume de 800 uL de uma solução contendo

tampão fosfato de sódio 50 mmol. L-1, pH 6,0 foi adicionado às amostras. Em

22

seguida, as amostras foram sonicadas com os mesmo parâmetros descritos no

item 3.7. Para a determinação da atividade de GPX, colocou-se em cada poço

um mix contendo 140 µL de tampão de reação GPX 2x [guaiacol 40 mmol L-1,

H2O2 a 0,06% e fosfato de sódio (20 mmol L-1, pH 6,0)],135 µL de tampão fosfato

de sódio (50 mmol L-1, pH 6,0) e 5 µL de extrato fúngico, totalizando 280 µL

(volume final da reação). A atividade ocorreu a 30°C e a reação foi iniciada

somente quando se adicionou o guaiacol na mesma. A leitura foi feita com

absorbância de 470 ƞm em espectrofotômetro de microplacas SpectraMax

(Molecular Devices) e os dados brutos foram dados pelo programa Softmax Pro

4.8 (Molecular Devices). A atividade de GPX foi expressa com o aumento do

consumo de guaiacol em µmol s-1 g -1 de biomassa seca e a conversão dos

dados obtidos em valores de absorbância para consumo de guaiacol foi feita

através da equação y=0,616x + 0,002 (R2= 0,99) (Camillo et al. 2013).

23

4 RESULTADOS 4.1 Caracterização do fungo Ceratocystis cacaofunesta em meio de cultura líquido (Secretoma)

4.1.1 Rendimento proteico de acordo ao tempo de crescimento do fungo 2, 5, 7 e 9 DAI

Com a finalidade de obter uma referência de rendimento proteico

secretado pelo fungo Ceratocystis cacaofunesta em meio de cultura líquido

mineral foram feitas coletas em diferentes tempos que ficaram estabelecidos

como 2,5,7 e 9 dias após a inoculação (DAI). A figura 2 mostra que houve um

grande aumento de proteínas secretadas entre 5 e 7 dias, variando de 0,2 a 0,53

mg de proteínas por ml de meio de cultura. Este resultado bem como o de

microscopia foi utilizado para definir o tempo de 6 dias, como o tempo ideal para

coleta sob indução do micélio e do sobrenadante proteico.

Pro

teín

a m

g/m

l

0,8 0,7 0,6 0,5 0,4 0,3 0,2 0,1

0 2 5 7 9

Tempo de cultivo (DAI)

Figura 2- Proteína total secretada por Ceratocystis cacaofunesta cultivada em 50 mL de meio

de cultura líquido mineral e coletada em diferentes tempos de cultivo. As proteínas foram

quantificadas pelo método de Bradford.

24

4.1.2 Microscopia

Na microscopia de C. cacaofunesta, foi possível observar aleuroconídios,

conídios, peritério e ascósporos nos diferentes tempos. A figura 3 mostra os

aleuconídios imaturos e conídios, únicas estruturas presentes no tempo de dois

DAI. Nos tempos de 5, 7 e 9 DAI, todas as estruturas conhecidas do fungo já

estavam presentes, portanto, embora as figuras b, c e d estejam mostrando

estruturas diferentes (conídios, aleurocononídios – cinco dias, peritério – sete

dias, ascósporos- nove dias), estas estão presentes nos três tempos de coleta.

Para as barras, foram utilizadas medidas bases das estruturas: Conídios: (16,1

a 20,6 x 2,9 a 3,9 µm); aleuroconídios: (12,6 a 13,9 x 8,5 a 10,4 µm); ascósporos:

(4,6 a 5,5 x 3,7 a 4,3µm) e peritécios: (corpo= 205,6 a 234,4 x 177,7 a 204,0 µm

rostro=336,4 a 540,4 x 27,8 a 21,9 µm).

Figura 3- Microscopia do micélio de Ceratocystis cacaofunesta (aumento 40X no microscópio

óptico), crescido em meio líquido mineral por A, 2 dias; B, 5 dias – aleuroconídios maduros e

conídios; C, 7 dias – peritécio e D, 9 dias, ascósporos. Barras: A e B=10 µm; C= 100 µm, D=5

µm.

25

4.1.3 Atividade enzimática de GPX secretada (aos 2,5,7 e 9 dias

de cultivo)

Foi observado um aumento da atividade de GPX no sobrenadante de

meio de cultura líquido entre 2 e 7 DAI, que variou entre 0,011 e 0,45 umol . min-

1 . gmf-1 , respectivamente. Já entre 7 e 9 dias de cultivo, observou-se um

pequeno decréscimo na atividade de GPX de 0,440 para 0,414 umol . min-1 .

gmf-1 como mostrado na figura 4. No teste de Tukey, não houve diferença

significativa, entre 7 e 9 dias, mas somente entre 2 e 5 dias e 5 e 7 dias (p<0,005).

GP

X (

um

ol .

min

-1 g

Ms-

1)

0,5

0,45 0,4

0,35 0,3

0,25 0,2

0,15

0,1

0,05

0 2 5 7 9

Tempo de cultivo (DAI)

Figura 4- Atividade enzimática da peroxidase do guaiacol no sobrenadante de meio de cultura

de Ceratocystis cacaofunesta, coletados em diferentes tempos de cultivo. A atividade de GPX

está expressa em micromol de guaiacol consumido por grama de matéria liofilizada por segundo.

4.2 Indução proteica por diferentes genótipos de cacau

4.2.1 Rendimento proteico e Perfil em SDS-Page das proteínas secretadas em meio indutor

26

Após definição do tempo de seis dias para coleta, visando a análise do

secretoma do Ceratocystis cacaofunesta foi feita uma extração de acordo com

Alvim, 2009 (item 3.3.1). O rendimento proteico para cada tratamento foi de: 0,748

ug.uL para o fungo induzido por TSH1188; 1,187 ug.uL-1 para o fungo induzido

por CCN51 e 1,902 no controle. A figura 5 mostra o perfil de proteínas separadas

em gel SDS-PAGE 12,5 % dos três tratamentos com 40 µg de proteína. A

separação das proteínas apresentou um perfil semelhante para os diferentes

tratamentos, embora haja diferença na intensidade das bandas entre eles. Todas

as bandas marcadas por setas na figura 5 foram excisadas, tratadas com tripsina

e submetidas à identificação por espectrometria de massas. No entanto, somente

três delas foram identificadas e estão marcadas em vermelho na figura. A proteína

identificada do controle é uma glicoamilase e as duas do tratamento induzido por

TSH1188 (I-TSH) são inibidor de tripsina e cerato platanina (Tabela 2).

Tabela 2- Proteínas identificadas por espectrometria de Massas (MS/MS) resultantes do

secretoma de C. cacaofunesta induzido com fragmentos de galho de T. cacao.

Banda Entrada Score Massa Pi Organismo Nome

Banda 2 (controle) giǀ630355067 62 ~ 61 kDa 4,72 Gloeophyllum Glicoamilase trabeum

Banda 10 (I-TSH) giǀ508773991 82 ~24 kDa 5,71 Theobroma cacao Inibidor de tripsina

Banda 12 (I- TSH) giǀ5921720 161 ~13 kDa 4,33 Ceratocystis Cerato - platanina plantani

27

Figura 5- SDS- Page do secretoma de Ceratocystis cacaofunesta obtido 6 DAI. M= marcador;

Cont= controle; I-CCN= Induzido por CCN51; I-TSH = Induzido por TSH1188. As setas pretas

indicam todas as bandas que foram excisadas e as bandas circuladas em vermelho, as que foram

identificadas por espectrometria de massas.

4.2.2 Atividade de Celulase do sobrenadante de cultura

A atividade de celulase em meio de cultura líquido foi estatisticamente

diferencial entre os tratamentos controle, induzido por TSH1188 e por CCN51

(p< 0,005), sendo que tratamento com CCN51 apresentou uma atividade

bastante superior que os outros. Os dados da figura 6 estão expressos em

unidades enzimáticas por miligrama de proteína.

28

enzi

má

tica

s/ m

g d

e

ptn

to

tal

Un

ida

des

3,5

3 2,5

2 1,5

1 0,5

0 Controle I- CCN I- TSH

Tratamentos Figura 6- Atividade enzimática da celulase no sobrenadante de meio de cultura de Ceratocystis

cacaofunesta, induzidos por genótipos contrastantes de T. cacao. As barras representam o erro

padrão das médias de quatro repetições.

4.3 Proteômica do micélio

4.3.1 Perfil proteico global do micélio Ceratocystis cacaofunesta submetido a cultivo na presença de ramos de cacau

Uma massa de 500 µg do extrato proteico extraído do micélio de

Ceratocystis cacaofunesta para cada um dos três tratamentos (controle, I-CCN e

I-TSH) foi submetido à separação por eletroforese bidimensional. Todos os

mapas proteicos apresentaram uma ampla distribuição de spots na faixa de pI

4,0-10 NL e na faixa de massa 20 a 97 kDa (Fig. 7). Uma faixa de pI de 3 a 10 NL

foi utilizada com o intuito de abranger o maior número possível de proteínas, no

entanto proteínas com pI abaixo de quatro, foram inferiores a 1% nos três

tratamentos (dados obtidos do software Image Master). O perfil de separação foi

semelhante entre o controle e os tratados.

29

A B

C

Figura 7- Perfil de proteínas do micélio de Ceratocystis cacaofunesta (500ug) obtidas por 2D-

Page após cultivo em meio não indutor (A); em meio induzido por CCN51 (B) ou em meio

induzido por TSH1188 (C). Os números à esquerda representam a massa molecular das bandas

do padrão de kDa. O pH utilizado foi 3-10 NL e estão indicados na região superior dos géis.

30

A reprodutibilidade entre as triplicatas dos géis dentro dos tratamentos

citados acima foi obtida pela construção de Scatter Plots, dadas pelo programa

Image Master GE. Como pode ser visto nas figuras 8,9 e 10, a comparação foi

feita dois a dois e as correlações próximas e acima de 0,9 foram consideradas na

análise.

Figura 8- Scatter plot (% vol vs %vol) entre as réplicas do gel 2D-PAGE de proteínas do

micélio de Ceratocystis cacaofunesta (500ug) após cultivo em meio sem indutor (amostra controle).

31


micélio de Ceratocystis cacaofunesta (500ug) após cultivo em meio induzido por CCN51.


micélio de Ceratocystis cacaofunesta (500ug) após cultivo em meio induzido por TSH1188.

32

Após a detecção dos spots nos géis com o software Image Master 2D-

Platinum foram encontrados 425, 453 e 389 spots para os tratamentos controle,

induzido por CCN51 e induzido por TSH1188, respectivamente. As comparações

foram realizadas em três análises: controle x induzido por CCN51, controle x

induzido por TSH1188, e induzido por CCN51 x induzido por TSH1188. Na

primeira análise (Controle x I-CCN51) houve 305 spots comuns, 120 spots

exclusivos para o gel do controle e 159 spots exclusivos para o gel I-CCN (Figura

11). Quando comparado os géis da segunda análise (Controle x I-TSH) foram

encontrados 209 spots em comum entre ambos e a ocorrência de 216 spots

exclusivos nos géis do controle e 180 nos géis de I-TSH (Figura 12). A

comparação resultante da terceira análise (I-CCN X I-TSH) 193 spots comuns,

260 spots exclusivos dos géis do tratamento I-CCN e 193 exclusivos dos géis do

tratamento I-TSH (Figura 13).

Figura 11- Diagrama de Venn mostrando a distribuição dos spots totais obtidos do perfil proteico

do micélio de Ceratocystis cacaofunesta (isolado Cc20) entre o controle e o induzido por CCN

51.

33


do micélio de Ceratocystis cacaofunesta (isolado Cc20) entre o controle e o induzido por TSH

1188.


do micélio de Ceratocystis cacaofunesta (isolado Cc20) entre o induzido por CCN 51 e o induzido

por TSH 1188.

34

4.4 Identificação das proteínas do mapa proteômico de referência do micélio Ceratocystis cacaofunesta (controle)

Um total de 253 spots foram excisados e destes, 105 foram submetidos a

identificação por espectrometria de massas do tipo Nano -ESI- Q-TOF, em dois

géis do tratamento controle, para garantir que os spots de menor expressão

também fossem identificados. Um total de 25 spots tiveram as proteínas

correspondentes identificadas (Tabela 3). Estes spots estão destacados por

setas vermelhas na figura 14, que corresponde à imagem do gel de referência

para o extrato proteico do micélio de C. cacaofunesta crescido em meio líquido

mineral (Controle). As sequências dos peptídeos geradas pela análise de ms/ms

e o arquivo com extensão (.PKL) gerados pelo software ProteinLynx V. 3.2

(Waters-Micromass, Milford, MA, United States) foram utilizados para a busca

por similaridade de sequências proteicas do banco de dados NCBInr, com o

software Mascot ( http://www.matrixscience.com/).

Figura 14- Perfil proteico de Ceratocystis cacaofunesta (500ug) obtidas por 2D-Page após cultivo

em meio não indutor. Os spots estão indicados com setas e suas identidades estão disponíveis

na Tabela 1. Os números à esquerda indicam a massa molecular das bandas do padrão de kDa.

O pH utilizado foi 3-10 NL e estão indicados na região superior do gel.

35

http://www.matrixscience.com/

Tabela 3- Massa corresponde aos valores de massa molecular (Da) e pI estimado pelo programa Image Master de acordo a homologia encontrada no NCBInr. O score corresponde ao valor da cobertura calculada no Mascot.

SPOT ENTRADA SCORE MW/pI NOME ORGANISMO

40 gi|597580083 56 37984/7.53 alcohol dehydrogenase 1 Marssonina brunnea f. sp. 'multigermtubi' MB_m1

83 gi|461990 353 50141/9.17 Full=Elongation factor 1-alpha; Trichoderma reesei Short=EF-1-alpha

171 gi|550807342 149 85887/ 6.02 5- Sporothrix schenckii methyltetrahydropteroyltriglutamate- ATCC 58251 homocysteine S-methyltransferase

276 gi|212538521 276 55696/5.16 ATP synthase F1, beta subunit, Talaromyces putative marneffei ATCC 18224

15 gi|50556012 81 16072/ 10.17 40S ribosomal protein S17 Yarrowia lipolytica

23 gi|310790200 144 25749/ 9.69 cyclophilin type peptidyl-prolyl cis- Colletotrichum trans isomerase/CLD graminicola M1.001

27 gi|310796158 220 23856/ 9.26 ribosomal protein S7 Colletotrichum graminicola M1.001

31 gi|85101451 108 58271/6.37 vacuolar aspartyl aminopeptidase Neurospora crassa Lap4 OR74A

49 gi|121714277 56 43608/8.24 proteasome regulatory particle Aspergillus clavatus subunit Rpt6, putative NRRL 1

87 gi|296817611 119 35720/5.80 transaldolase Arthroderma otae CBS 113480

90 gi|85082069 148 31709 /4.80 ribosome-associated protein Neurospora crassa OR74A

104 gi|628845025 88 49701/6.34 dihydrolipoyllysine-residue Coniophora puteana succinyltransferase 1 RWD-64-598 SS2

36

http://www.matrixscience.com/cgi/protein_view.pl?file=..%2Fdata%2F20150302%2FFTguObTme.dat&hit=gi%7C461990&db_idx=1&px=1&ave_thresh=50&_ignoreionsscorebelow=0&report=0&_sigthreshold=0.05&_msresflags=1025&_msresflags2=2&percolate=-1&percolate_rt=0&_minpeplen=7&sessionID=guest_guestsession

http://www.matrixscience.com/cgi/protein_view.pl?file=..%2Fdata%2F20150317%2FFTgTmxTTe.dat&hit=gi%7C550807342&db_idx=1&px=1&ave_thresh=51&_ignoreionsscorebelow=0&report=0&_sigthreshold=0.05&_msresflags=1025&_msresflags2=2&percolate=-1&percolate_rt=0&_minpeplen=7&sessionID=guest_guestsession

http://www.matrixscience.com/cgi/protein_view.pl?file=..%2Fdata%2F20150317%2FFTgTmxTaT.dat&hit=gi%7C212538521&db_idx=1&px=1&ave_thresh=50&_ignoreionsscorebelow=0&report=0&_sigthreshold=0.05&_msresflags=1025&_msresflags2=2&percolate=-1&percolate_rt=0&_minpeplen=7&sessionID=guest_guestsession

http://www.matrixscience.com/cgi/protein_view.pl?file=..%2Fdata%2F20150317%2FFTgTmxYSR.dat&hit=gi%7C50556012&db_idx=1&px=1&ave_thresh=50&_ignoreionsscorebelow=0&report=0&_sigthreshold=0.05&_msresflags=1025&_msresflags2=2&percolate=-1&percolate_rt=0&_minpeplen=7&sessionID=guest_guestsession

http://www.matrixscience.com/cgi/protein_view.pl?file=..%2Fdata%2F20150317%2FFTgTmxYEE.dat&hit=gi%7C310790200&db_idx=1&px=1&ave_thresh=50&_ignoreionsscorebelow=0&report=0&_sigthreshold=0.05&_msresflags=1025&_msresflags2=2&percolate=-1&percolate_rt=0&_minpeplen=7&sessionID=guest_guestsession

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http://www.matrixscience.com/cgi/master_results.pl?file=..%2Fdata%2F20150317%2FFTgTmxYeR.dat;sessionID=guest_guestsession#Hit1

http://www.matrixscience.com/cgi/protein_view.pl?file=..%2Fdata%2F20150317%2FFTgTmxYmh.dat&hit=gi%7C121714277&db_idx=1&px=1&ave_thresh=49&_ignoreionsscorebelow=0&report=0&_sigthreshold=0.05&_msresflags=1025&_msresflags2=2&percolate=-1&percolate_rt=0&_minpeplen=7&sessionID=guest_guestsession

http://www.matrixscience.com/cgi/protein_view.pl?file=..%2Fdata%2F20150317%2FFTgTmxYOt.dat&hit=gi%7C296817611&db_idx=1&px=1&ave_thresh=49&_ignoreionsscorebelow=0&report=0&_sigthreshold=0.05&_msresflags=1025&_msresflags2=2&percolate=-1&percolate_rt=0&_minpeplen=7&sessionID=guest_guestsession

137 gi|310789903 489 66957/5.37 hsp70-like protein Colletotrichum

graminicola M1.001 140 gi|88766397 267 80195/4.98 heat shock protein 90 Metarhizium

anisopliae 141 gi|85112452 71 64592/ 6.20 sulfate adenylyltransferase Neurospora crassa

OR74A 179 gi|189197839 55 92691/ 6.69 elongation factor 2 Pyrenophora tritici-

repentis Pt-1C-BFP 182 gi|6320593 253 93686/5.92 elongation factor 2 Saccharomyces

cerevisiae S288c 195 gi|641483179 178 33475 /8.86 translation elongation factor 1- Hypocrea

alpha, partial stilbohypoxyli 240 gi|302918488 196 23068/ 4.51 predicted protein Nectria

haematococca mpVI 77-13-4

249 gi|729187357 199 24551 / 5.61 Putative Mitochondrial Torrubiella peroxiredoxin PRX1 hemipterigena

250 gi|629697057 260 41164/8.75 Isocitrate dehydrogenase [NAD] Metarhizium acridum subunit 1 precursor CQMa 102

251 gi|6322416 50 69909/6.95 succinate dehydrogenase SDH1b Saccharomyces cerevisiae S288c

252 gi|511010625 119 42413 / 5.67 S-adenosylmethionine synthase Mucor circinelloides f. circinelloides 1006PhL

272 gi|120690 67 36285/6.72 RecName: Full=Glyceraldehyde-3- Cryphonectria phosphate dehydrogenase; parasitica Short=GAPDH; AltName:

Full=GPD-1

312 gi|425887004 73 32173 / 5.65 tetrahydroxynaphthalene reductase Lomentospora prolificans

37

http://www.matrixscience.com/cgi/master_results.pl?file=..%2Fdata%2F20150317%2FFTgTmxYaO.dat;sessionID=guest_guestsession#Hit3

http://www.matrixscience.com/cgi/master_results.pl?file=..%2Fdata%2F20150317%2FFTgTmxYaS.dat;sessionID=guest_guestsession#Hit1

http://www.matrixscience.com/cgi/master_results.pl?file=..%2Fdata%2F20150317%2FFTgTmxYah.dat;sessionID=guest_guestsession#Hit1

http://www.matrixscience.com/cgi/master_results.pl?file=..%2Fdata%2F20150317%2FFTgTmxYnE.dat;sessionID=guest_guestsession#Hit1

http://www.matrixscience.com/cgi/protein_view.pl?file=..%2Fdata%2F20150317%2FFTgTmxYnR.dat&hit=gi%7C641483179&db_idx=1&px=1&ave_thresh=50&_ignoreionsscorebelow=0&report=0&_sigthreshold=0.05&_msresflags=1025&_msresflags2=2&percolate=-1&percolate_rt=0&_minpeplen=7&sessionID=guest_guestsession

http://www.matrixscience.com/cgi/protein_view.pl?file=..%2Fdata%2F20150318%2FFTgTmxSSS.dat&hit=gi%7C729187357&db_idx=1&px=1&ave_thresh=49&_ignoreionsscorebelow=0&report=0&_sigthreshold=0.05&_msresflags=1025&_msresflags2=2&percolate=-1&percolate_rt=0&_minpeplen=7&sessionID=guest_guestsession

http://www.matrixscience.com/cgi/master_results.pl?file=..%2Fdata%2F20150318%2FFTgTmxSSh.dat;sessionID=guest_guestsession#Hit1

http://www.matrixscience.com/cgi/master_results.pl?file=..%2Fdata%2F20150318%2FFTgTmxSEh.dat;sessionID=guest_guestsession#Hit2

http://www.matrixscience.com/cgi/master_results.pl?file=..%2Fdata%2F20150318%2FFTgTmxSEe.dat;sessionID=guest_guestsession#Hit1

http://www.matrixscience.com/cgi/master_results.pl?file=..%2Fdata%2F20150318%2FFTgTmxSeO.dat;sessionID=guest_guestsession#Hit1

http://www.matrixscience.com/cgi/master_results.pl?file=..%2Fdata%2F20150318%2FFTgTmxSee.dat;sessionID=guest_guestsession#Hit1

4.5 Categorização funcional das proteínas identificadas

As 25 proteínas identificadas no gel de referência (controle) de C.

cacaofunesta foram categorizadas de acordo com sua função fisiológica

baseado na análise do Gene Ontology pelo software Blast2GO

(http://www.blast2go.com) (Figura 15). As proteínas foram separadas nas

seguintes categorias: Óxido redução (24%), Proteínas estruturais (28%),

Metabolismo e energia (28%), resposta à estresse (12%) e processos

biossintéticos (8%).

Figura 15- Categorização funcional de proteínas expressas no proteoma basal de C.

cacaofunesta crescido em meio de cultura líquido. A porcentagem de proteínas presentes em

cada categoria está indicada na figura.

38

Dentre as proteínas de óxido- redução, estão representadas a álcool

desidrogenase (spot 40), peroxiredoxina (spot 249), isocitrato desidrogenase

(spot 250), succinato desidrogenase (spot 251), gliceraldeído-3-fosfato

desidrogenase (spot 272), e tetrahidronaftalina redutase (spot 312). Dentre

essas, a álcool desidrogenase (ADH), a peroxiredoxina (peroxidase) e a

gliceraldeído-3-fosfato desidrogenase também estão associadas a resposta a

estresse.

As proteínas relacionadas ao estresse encontradas nesse trabalho são

representadas pelas chaperones moleculares HSP70 (spot 137) e HSP 90 (spot

140), que são up reguladas em situações de estresse, e uma subunidade do

proteassoma (spot 49).

Na categoria de proteínas estruturais encontra-se três fatores de

elongação (spot 179, 182 e 195) de dois tipos: EF-1 e EF-2 e uma subunidade

ribossomal (40S – spot 27) que são indispensáveis na síntese proteica.

O grupo de metabolismo e energia compreendem as proteínas com

atividade de ATPase, como 5- metiltransferase (spot 171), ATP sintase (spot

276), atividade de isomerase (spot 23) e aminopeptidase (spot 31), e succinato

desidrogenase (spot 251).

Por fim, na categoria processos biossintéticos estão as proteínas com

atividade de transferase, succinil transferase (spot 104) e transaldolase (spot

87).

4.6 Atividade enzimática do extrato proteico micelial

4.6.1 Atividade de cisteíno- protease e atividade inibitória com TcCYS4 (inibidor de protease do T. cacao)

A atividade de proteases do tipo cisteíno nos tratamentos supracitados

variou, sendo no controle bem inferior que nos tratamentos e essa foi significativa

(p<0,005) no teste de Tukey. Dentre os tratamentos, o que apresentou maior

atividade de cisteíno- protease foi o I-TSH.

39

∆A

BS4

10

0,45

0,4 0,35

0,3 0,25

0,2 0,15

0,1 0,05


Tratamentos Figura 16- Atividade de cisteíno-proteases do micélio do fungo C. cacaofunesta. As amostras

são controle (fungo crescido em meio de cultura), induzido por ramos de CCN51 e induzido por

ramos TSH 1188. As colunas verticais indicam as médias dos valores das absorbâncias (n = 4).

Para teste de inibição com a cistatina TcCYS4, inibidor recombinante de

cisteíno-protease do cacau (Pirovani et al., 2010) e específico para cisteíno

proteases do tipo papaína, foram escolhidos os dados gerados pela reação 1

(vide 3.5.1) em que o volume final de inibidor, na reação foi de 20 µL. A figura 17

mostra que no extrato do micélio de Ceratocystis cacaofunesta de todos os

tratamentos testados (controle, I-CCN e I-TSH) há cisteíno protease do tipo

papaína. Além disso, ocorre variação na inibição entre os tratamentos, no

entanto, essa variação não foi significativa nos tratamentos controle e I-CCN. A

inibição foi calculada, aferindo em 100 % de atividade de protease, na ausência

do inibidor (0 µL) que é o controle do experimento.

40

% ∆

AB

S41

0

120

100

80

60

40

20

0

Controle I- CCN I- TSH Tratamentos

0 ul

20 ul.

Figura 17- Atividade residual de cisteíno- proteases do micélio do fungo C. cacaofunesta. As

barras cinza escuro representam a atividade de cisteíno- protease na ausência do inibidor (0 µl)

e as barras cinza claro representam a atividade residual com 20 µl do inibidor no volume final da

reação. Os tratamentos são controle (fungo crescido em meio de cultura), induzido por CCN51

e induzido por TSH 1188. As colunas verticais indicam atividade residual de protease (%).

4.6.2 Atividade de Catalase (CAT)

A atividade de catalase é medida pelo consumo de peróxido de hidrogênio

(substrato) do meio, em relação ao tempo. A análise da atividade de catalase

para a amostra controle apresentou maior consumo de peróxido de hidrogênio,

apresentando portanto, maior atividade. Já entre os tratamentos induzidos (I-

TSH e I-CCN), o I-CCN apresentou a menor atividade para catalase. A análise

estatística feita pelo teste de Tukey foi significativa entre os tratamentos com

p<0,005. A figura 18 mostra a atividade da CAT nos três tratamentos.

41

CA

T (m

mo

l H2O

2 g

-1 M

S m

in-1

)

50 40 30 20 10


Tratamentos

Figura 18- Atividade da Catalase em micélio do fungo C. cacaofunesta. Os tratamentos são

controle (fungo crescido em meio de cultura), induzido por CCN51 e induzido por TSH1188. As

colunas verticais indicam a atividade de catalase em mmol H2O2 g-1 MS min-1. As barras acima

das colunas representam o erro padrão das médias (p<0,005).

4.6.3 Atividade de Peroxidase do Guaiacol (GPX)

A atividade da peroxidase do guaiacol (GPX) foi analisada utilizando

guaiacol como o único doador de elétrons para a redução do peróxido. O

tratamento que apresentou maior atividade para GPX foi o induzido por TSH

1188, seguido do tratamento controle e posteriormente o induzido por CCN51. A

análise estatística feita pelo teste de Tukey apresentou variação significativa entre

os tratamentos controle e induzido por CCN51(p<0,005).

42

GP

X (

mm

ol g

-1 M

S m

in-1

)

140 120 100

80

60

40

20


Tratamentos Figura 19- Atividade da GPX em micélio do fungo C. cacaofunesta. Os tratamentos são controle

(fungo crescido em meio de cultura), induzido por CCN51 e induzido por TSH1188. As colunas

verticais indicam a atividade de GPX em mmol g-1 MS min-1. As barras acima das colunas

representam o erro padrão das médias (p<0,005).

43

5 DISCUSSÃO 5.1 Rendimento proteico no secretado em 2, 5, 7 e 9 DAI

Nenhuma análise do perfil proteico secretado do fungo C. cacaofunesta

foi publicada até o momento. Este tipo de análise, especialmente, utilizando

meios de cultura com material de genótipos contrastantes de cacau pode

fornecer informação sobre variações metabólicas do patógeno, bem como

apontar para mecanismos de patogenicidade. Nesse trabalho, inicialmente,

buscou-se avaliar o rendimento proteico em relação do tempo de crescimento do

fungo em meio de cultura, sem que houvesse indutores.

O gráfico de rendimento proteico em 2, 5, 7 e 9 dias após inoculação

(Figura 2) deixa evidente o aumento de proteínas secretadas, que

provavelmente está associada ao aumento da massa micelial, ou seja, quanto

mais biomassa, maior a concentração de proteínas secretadas. As análises

mostraram um aumento expressivo de proteínas secretadas no meio de cultura

entre o quinto e o sétimo dia de cultivo. Alvim (2009) mostrou no seu trabalho

que alterações nas fontes de carbono em meio de cultura têm influência sobre a

secreção de proteínas, uma vez que o metabolismo do fungo in vitro, é alterado.

O sequenciamento do Ceratocystis cacaofunesta começou a ser feito

recentemente (Ambrosio et al., 2013), mas por ainda não estar disponível on line,

as proteínas identificadas para esse fungo são baseadas em homologia com

organismos modelo e não com o banco de dados próprio. Neste sentido, dá-se

a limitação mais aprofundada desse estudo, pois a eficácia no estudo do

secretoma depende de um sequenciamento prévio do organismo, bem como de

um arcabouço computacional robusto para previsão de sinais de secreção

(Kamoun, 2010). Além disso, estudos prévios (Brown et al., 2012) mostram que

a obtenção do secretoma in vitro tem sido bastante difícil, tanto pela pequena

quantidade de proteínas presentes na amostra que são secretadas, como pelo

método de extração que permita a obtenção de uma amostra limpa, com o

mínimo de perda de proteínas possíveis nas lavagens feitas durante a extração.

44

Devido a essa limitação, a fim de aumentar as chances de abarcar o maior

número possíveis de proteínas secretadas, foram feitos os testes iniciais com

diferentes tempos de crescimento e dosagem de rendimento proteico, o que

justifica nossa escolha pelo tempo de 6 DAI.

5.2 Microscopia

A presença da totalidade de estruturas sexuais conhecidas para o fungo

na sua forma madura somente foram observadas 5 DAI in vitro (Figura 3). No

entanto, macroscopicamente aos 2 DAI já havia uma quantidade de biomassa

micelial significativa. Em trabalhos de inoculação em plântulas de cacau, foi

observado massa micelial com 1 DAI e há relatos de estruturas sexualmente

maduras aos 4 DAI (Santos, et al., 2012). Admite-se, portanto, que o intervalo

feito entre as coletas de 2 a 5 DAI neste trabalho, possa ter impedido a

observação de estruturas maduras anterior aos 5 DAI.

As estruturas de resistência, chamadas aleuroconídios foram encontradas

desde os 2 DAI (Figura 3). Essas estruturas já foram relatadas em estados

iniciais da infecção in vivo (Firmino, 2011) e acredita-se que possa sobreviver a

condições adversas por meses ou anos (Grousclaude, 1995). Sugere-se

portanto que a sua presença em meio de cultura líquido mesmo quando ainda

havia uma grande quantidade de nutrientes para crescimento fúngico esteja

associada a uma preparação metabólica para situações de estresse por

escassez de nutrientes.

5.3 Identificação de proteínas secretadas, por espectrometria de

massas

As proteínas secretadas (secretoma) por fungos fitopatogênicos são a

chave para conhecer a interação planta-patógeno uma vez que podem alterar o

metabolismo do hospedeiro, fornecendo ao fitopatógeno um ambiente adequado

para a conclusão do seu ciclo de vida (Kamoun, 2012).

45

Nossos resultados demonstram que a indução in vitro com fragmentos de

cacau permitiu a secreção tanto das proteínas dos fragmentos de caule de T.

cacao (Tabela 2) utilizados, quanto do micélio de C. cacaofunesta crescido em

meio de cultura.

Estudos de secretoma, corriqueiramente têm sido feitos utilizando SDS-

Page (Alvim, et al., 2009, Brown et al., 2012; Konozy, et al., 2013). O rendimento

proteico obtido nesse trabalho foi compatível com o observado em outros

trabalhos, que variaram de 40 a 100 µg (Brown et al., 2012; Konozy, et al., 2013).

No entanto a quantidade de bandas no gel variou bastante, o que está associado

as condições de crescimento do fungo, dada à alterações no seu metabolismo

(Alvim, et al., 2009; Fernandez-Acero et al., 2009), bem como ao tipo de extração

utilizada. A digestão tríptica associada ao SDS-Page tem sido eficaz em estudos

de secretoma (Alexssanderson, et al., 2013), o que foi parcialmente confirmado

no nosso trabalho, haja vista que a separação baseada somente em peso

molecular (SDS-Page) pode dificultar a identificação de proteínas com peso

molecular muito próximos, apresentando-se como bandas únicas no gel.

Foram identificadas três proteínas secretadas, sendo uma delas no

tratamento controle que é uma glicoamilase e outras duas proteínas no

tratamento I-TSH as quais são inibidor de tripsina e uma cerato- platanina.

As amilases são um grupo de enzimas que possuem ação sobre o amido,

liberando pequenos polímeros compostos de unidades de glicose (Gupta, et al.,

2003). Elas estão envolvidas na aquisição de nutrientes (Feng et al, 2005;.

Kamoun, 2007), e já foram reportadas em Aspergilus niger (Morais, 2004). Em

A. niger, a amilase encontrada foi a mesma reportada nesse trabalho: A α-

amilase ou glicoamilase. Acredita-se, que dentre os fungos, haja uma preferência

por metabolizar glicose, por essa ser facilmente metabolizável, sem que haja a

expressão de proteínas específicas para tal. Com o esgotamento dessa fonte, o

organismo passa a expressar enzimas específicas, como a amilase, a fim de

metabolizar outra fonte de carbono presente no meio, como o amido. Sugere-se

que a observação dessa enzima no secretoma de seis DAI, indique um início da

escassez de nutrientes no meio líquido mineral.

46

Medina et al., (2004) afirma que a ampliação da utilização de nutrientes,

pelo fungo aumenta a sua versatilidade metabólica e essa versatilidade está

diretamente relacionada ao sucesso na interação.

Os inibidores de tripsina são um tipo de inibidor de protease e estão

associados, entre outras funções na defesa de plantas contra patógenos (Ruan,

et al., 2011). Isso acontece porque muitos possuem especificidade por proteases

exógenas (Zavala, et al., 2004) e esta interação acontece porque eles se ligam

a uma fenda catalítica muito específica (Lau e Cheng, 2006). O inibidor de

tripsina identificado no secretoma do tratamento induzido por TSH1188 deste

trabalho, apresentou homologia com um inibidor de tripsina do Theobroma

cacao. Em estudos com bibliotecas de EST’s da interação Theobroma cacao

– Moniliophthora perniciosa foram encontradas 32 sequências para inibidores de

tripsina apenas na variedade resistente estudada (TSH1188), indicando que

esses inibidores podem estar associados ao processo de resistência da planta

em relação ao ataque pelo patógeno (Gesteira, et al., 2007).

A proteína cerato- platanina faz parte de uma classe importante de

proteínas conhecidas como efetores, que são moléculas produzidas por

patógenos durante a infecção (Hogenhout et al., 2009). Estas proteínas

modulam a imunidade inata da planta promovendo supressão ou indução da

defesa das plantas. Quando promove supressão, favorecem o patógeno

permitindo a infecção parasitária (Kamoun, 2007). A expressão dessa proteína

em contato com o indutor de I-TSH1188 sugere uma batalha imunológica entre

patógeno e hospedeiro, já que esse genótipo é resistente ao Ceratocystis

cacaofunesta.

A identificação de efetores no secretoma tem sido crucial para o

entendimento de interação planta patógeno (Alexsanderson et al., 2013). Além

disso, conhecer o patógeno é fundamental para desenvolver estratégias de

proteção efetiva incluindo o desenvolvimento de plantas resistentes, fungicidas

e outras estratégias de controle biológico (González Fernández et al., 2010).

47

5.4 Celulase em meio de cultura induzido (secretoma)

As celulases são biocatalisadores que tem expressão induzida na maioria

dos fungos apenas quando existe celulose ou algum indutor. Entretanto, já se

sabe que existe uma expressão a nível basal, que é alterada de acordo a

necessidade do organismo. Quando existe outra fonte de carbono facilmente

degradável no meio, como a glicose, ocorre a repressão catabólica da celulase

(Ruegger e Tauk-Tornisielo, 2004). A observação de atividade de celulases em

meio de cultura, sem indutor, nos traz inferências quanto ao metabolismo fúngico.

No entanto, nesse trabalho, a utilização de meio de cultivo com indutor do T.

cacao, nos trouxe respostas que podem nos dar inferências quanto à atividade

das celulases numa interação planta patógeno in vivo. Isso ocorre, porque as

celulases fúngicas tem um importante papel na interação planta – fungo, uma vez

que compõem um complexo de proteínas que agem sinergicamente para destruir

a parede celular das plantas, através da quebra da celulose (Coradetti et al.,

2012). Os resultados obtidos, dentre os tratamentos, mostrou que o induzido por

CCN (I-CCN) genótipo do T. cacao susceptível ao isolado Cc20, apresentou uma

alta atividade de celulase, em relação aos outros tratamentos. Isso se torna

evidente quando se pensa que o aparato de defesa desse genótipo não é

suficiente para conter a colonização fúngica, como foi observado anteriormente

em trabalhos de histopatologia da interação C. cacaofunesta – T. cacao. A

quantidade de celulases secretadas por esse fungo nessa interação, portanto,

pode ser um ponto importante para o conhecimento do razão da susceptibilidade

desse genótipo.

5.5 Extração de Proteínas (Micélio)

O processo de extração proteica tem sido referido como sendo uma etapa

crucial para um gel 2D-Page com uma boa resolução (Bhadauria et al., 2010).

48

Um protocolo ideal para extração de proteoma de fungos é o que consegue

capturar o maior número de proteínas possíveis, sem que haja contaminantes

no gel (Bhadauria et al., 2010), pois eles podem interferir em processos que

ocorrem após a extração, como separação em gel 2D e análise em

espectrometria de massas (Newton et al., 2004). Portanto, a diminuição de

contaminantes durante uma boa extração, possibilita como resultado final, um

gel bidimensional sem arrastes e que conserva, bastante visíveis características

como ponto isoelétrico e massa molecular (Chen e Harmom, 2006), que é

individual para cada proteína.

No caso específico de fungos filamentosos, o maior desafio no processo

de extração é o rompimento da parede celular que é robusta (Bhadauria et al.,

2010).

Na extração escolhida para esse trabalho foi utilizado sonicação para

auxiliar na ruptura da parede fúngica e liberação de proteínas, o que mostrou

bastante eficiência, combinada com a extração fenólica com o uso de SDS-

Denso (Pirovani et al, 2008).

A qualidade da técnica, também permitiu a observação nesse trabalho, de

que entre os géis dos tratamentos induzidos contém diferentes quantidades de

spots, sendo que o I-CCN (genótipo susceptível ao Cc20) tem uma quantidade

superior ao I-TSH (resistente ao Cc20). O uso de fragmentos de ramos desses

genótipos contrastantes, como indutores, sugere-se aqui, que os mesmos

estejam modulando respostas imunológicas no proteoma de C. cacaufunesta,

Esse protocolo já foi utilizado em vários estudos com o fungo M. perniciosa,

onde se obteve géis de alta resolução, com um grande número de spots

detectados (Camillo et al., 2013; Silva et al., 2013; Mares, 2013).

49

5.6 Proteínas identificadas no micélio de C. cacaofunesta

5.6.1Óxido- Redutases

Na interação planta-patógeno, os dois organismos presentes estão

sujeitos ao estresse oxidativo. Isso se dá porque existe o embate fitopatológico,

que é caracterizado pela explosão oxidativa (Camillo et al., 2013). Nesse sentido,

as enzimas responsáveis pela detoxificação reduzem a citotoxidade das

espécies reativas de oxigênio (ROS). As enzimas do tipo óxido-redutases têm

sido corriqueiramente relatadas em proteomas de fungos patogênicos, tais

como, Colletotrichum acutatum (Brown et al., 2008), C. acutatum (El-Akhal et al.,

2013), M. perniciosa (Mares, et al., 2013; Camillo, et al., 2013), Botrytis cinerea

(Fernandez-Acero et al., 2010).

A enzima detoxificante peroxirredoxina (spot 249) faz parte de um grupo

de proteínas sensíveis à oxidação que atuam como sensores na oxidorredução

(Poynton e Hampton, 2013). Trata-se de uma das primeiras enzimas de

combate a ROS, durante uma interação (Heller e Tudzynski, 2011). Está

diretamente relacionada à resposta a estresse. Essa proteína/enzima já foi

encontrada em M. perniciosa, um fitopatógeno do cacaueiro assim como o C.

cacaofunesta, atuando no combate ao estresse oxidativo (Mondego et al., 2008;

Camillo et al., 2013).

As enzimas como isocitrato desidrogenase (spot 250) são muito

abundantes e geralmente encontradas em estudos proteômicos de várias

espécies de fungos, tais como B. cinerea (Fernandez-Acero et al., 2010) e

Uromyces appendiculatus (Cooper et al., 2007).

Algumas enzimas óxido redutases também tem sido relatadas como

relacionadas à patogenicidade, como gliceraldeído- 3- fosfato- desidrogenase

(spot 272) (Fernandez-Acero et al., 2009) e álcool desidrogenase (spot 40) em

Diplodia seriata (Cobos et al., 2010). As álcool desidrogenases (ADHs) fazem

parte da fermentação etanólica (metabolismo energético). Sob a alta produção

de acetaldeído, as enzimas ADHs convertem-no em etanol, numa reação em

que ocorre a oxidação de NADH em NAD+. A presença de alcetaldeído tem

sido associado à danificação de células vegetais. As enzimas participantes da

fermentação alcoólica são conhecidas como sendo expressas em condições de

anóxia em fungos e provavelmente, por essa razão, a maioria dos fungos nos

50

quais é encontrada, sejam necrotróficos (Aspergillus, Leptosphaeria, Fusarium,

etc). No entanto, elas também podem estar associadas a altos níveis de açúcar

celulares (Godfrey et al., 2009), o que poderia justificar a sua presença em

fungos hemibiotróficos e biotróficos.

Camillo (2013) observou a enzima ADH, no proteoma de M. perniciosa

onde foi associada provavelmente ao crescimento de hifas. Em fungos

biotróficos, como Puccinia graminis, esta enzima não foi encontrada e esta

ausência é sustentada pela evolução. Neste trabalho foram encontradas tanto

ADH (spot 40), quanto isocitrato desidrogenase dependente de NAD (spot 250),

contrariando a ausência destas nos proteomas de fungos biotrófico.

5.6.2 Proteínas relacionadas ao estresse

As HSPs (Heat Shock Protein) ou “chaperones” moleculares são um

grupo de proteínas relacionadas ao dobramento de polipeptídeos recém-

sintetizados (Beissinger e Buchner, 1998) e estão associadas à manutenção das

proteínas em sua conformação correta (Wang et al., 2004), tanto em condições

fisiológicas, quanto de estresse. As HSPs são expressas constitutivamente, e

nas condições de estresse são up reguladas (Raggan et al., 2011), por esta

razão são consideradas como sendo envolvidas nas respostas de defesa (Wang

et al., 2004).

Na interação M. perniciosa –T. cacao ocorre aumento na expressão de

HSPs do fungo durante o processo infeccioso, o que sugere uma percepção

molecular do fungo ao ambiente hostil (condição de estresse) ao qual está sendo

submetido (Cooper, Garrett e Campbell, 2006). Camillo, et al., (2013) sugere que

o aumento da expressão dessas proteínas no fungo, em situação de indução in

vitro, pode indicar um aumento na tolerância do M. perniciosa ao estresse

durante a infecção com o hospedeiro T. cacao.

As HSPs 70 (spot 137) e 90 (spot 140) são ―chaperones‖ dependentes

de ATP para executar suas funções e são capazes de mudar a sua conformação

para ter alta ou baixa afinidade com substratos proteicos (Beissinger e Buchner,

1998). Essa mudança depende das condições as quais o organismo está sendo

submetido.Também há evidências da presença da HSP70, na parede celular de

fungos o que pode representar um mecanismo de virulência para a

sobrevivência

51

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/?term=Beissinger%20M%5BAuthor%5D&cauthor=true&cauthor_uid=9563819


deste (Eroles et al., 1997). A HSP90 é uma proteína dimérica (Li et al., 2012),

altamente abundante e essencial em vários processos celulares, incluindo o

controle do ciclo celular. É reportada, assim como as HSP70, como sendo

importante atuante na resposta ao estresse celular (Jackson, 2013).

Como já citado, essas proteínas são bastante comuns em proteomas, por

serem expressas constitutivamente. Mares et al. (2013) encontrou em suas

pesquisas com M. perniciosa, tanto HSP70, quanto HSP90, no mapa de

referência do fungo. Mas Camillo, et al. (2013) observou a HSP70 em micélio

saprofítico do fungo M. perniciosa cultivado com fluído apoplástico de genótipo

resistente e susceptível de T. cacao.

Pelo que já foi mencionado, sugere-se que a presença de HSP70 e

HSP90 no mapa de referência do fungo C. cacaofunesta, tenha relação com

uma modificação adaptativa da composição proteica celular advinda de uma

adaptação ao meio de cultura líquido mineral. Além disso, e baseado em

evidências complementares da presença de proteínas relacionadas ao estresse

no proteoma, a presença das “chaperonas” também pode se dar por uma

condição estressante no meio, e que pode-se relacionar com a identificação do

spot 31 desse estudo.

O proteassoma degrada proteínas ligadas a ubiquitinas. O proteassoma

26S é um complexo dinâmico de 32 diferentes proteínas (Verma, et al., 2000)

dentre as quais a RPT6 é uma subunidade reguladora (Shouduri, et al., 2008)

que foi identificada nesse trabalho através do spot 49. A associação

proteassoma – ubiquitina representa uma importante via para a degradação de

proteínas intracelulares (Drews et al., 2007), por isso o reconhecimento e a

degradação das proteínas marcadas com ubiquitinas pelo proteassoma está

fortemente associada a manutenção do crescimento celular normal (Wang et al.,

2007). O proteassoma 26S também foi identificado no proteoma conidial (El-

Akhal, et al., 2013) e na formação de apressórios (Brown et al., 2008) de C.

acutatum. Nesse fungo, a detecção desse complexo proteico foi relacionada a

funções específicas durante a germinação, como regulação do ciclo celular,

sinalização celular e a eliminação de proteínas anormais. Sugere-se, portanto,

que a expressão de uma subunidade do proteassoma observada no proteoma

basal de C. cacaofunesta ocorra por uma regulação do ciclo celular.

52

5.6.3 Metabolismo, energia e processos biossintéticos

Uma parte das enzimas encontradas nesse trabalho como fazendo parte

da categoria metabolismo, energia e processos biossintéticos, fazem parte da

via glicolítica e são gliceraldeído-3-fosfato dehidrogenase (GAPDH) (spot 272) e

ATP sintase (spot 252). A proteína gliceraldeído-3-fosfato desidrogenase

(GAPDH) é uma importante enzima da glicólise e da gliconeogênese e sua

função é catalisar a fosforilação oxidativa do substrato gliceraldeído-3-fosfato em

1,3- bifosfoglicerato. Trata-se de uma proteína multifuncional (Deveze-Alvarez, García-Soto e Martínez-Cadena, 2001) presente na superfície celular de

diversos fungos patogênicos (Lim et al., 2001; Pitarch et al., 2002), onde

desempenha uma função importante no processo de adesão do fungo na

superfície do hospedeiro e está associada a patogenicidade deste (Barbosa et

al., 2006). Já foi observada durante o desenvolvimento de fungos (Godfrey et al.,

2009). A GAPDH também foi encontrada no proteoma de M. perniciosa exposta

a PR-10 (proteína relacionada à patogênese), onde foi associada também a

funções nucleares como na transcrição de genes, na replicação e reparação do

DNA, etc. (Silva, et al., 2013).

As ATPases são enzimas que hidrolisam ATP e usa a energia advinda

dessa hidrólise para diversos processos celulares (Dias e Coelho, 2007). As

proteínas associadas à síntese de ATP já foram citadas como tendo genes

conservados no único estudo do genoma/proteoma mitocondrial de C.

cacaofunesta do qual se tem conhecimento (Ambrosio et al, 2013).

As Metiltetraidropteroiltriglutamato-homocisteína metiltransferase (spot

171) são proteínas que tem uma regulação central no metabolismo da metionina

e processos metabólicos de carbono. A homocisteína que é um pequeno

aminoácido dessa proteína determina o fornecimento da metionina na síntese

proteica, bem como gera precursores para reações de metilação, como a S-

adenosilmetionina (spot 252), biossíntese de cisteína, dentre outros.

Acredita-se que uma variação de expressão das enzimas associadas à

síntese proteica, esteja relacionada ao remodelamento celular para sobreviver

as diferentes condições impostas pelos tratamentos, controle, I-TSH e I-CCN.

53

5.6.4 Proteínas Estruturais

O desenvolvimento do fungo no meio de cultura requer a expressão de

proteínas relacionadas à transcrição e a síntese proteica. Isso inclui subunidades

ribossômicas, como a 40S (spot 15), fatores de elongação do tipo 1 e 2 (spot 83,

179, 182 e 195), dentre outros.

Os fatores de elongação que são indispensáveis na tradução de

eucariotos são EF1 e EF2; estes fazem parte de uma superfamília denominada

GTPase (Justice et al., 1998).

O fator de alongação 2 (EF2) é uma proteína que catalisa a translocação

ribossomal durante a síntese proteica. Tem sido relacionada à resistência de

fungos, pois inibidores seletivos da síntese proteica fúngica tem interação

específica com este fator de elongação (Justice et al., 1998). Por essa razão,

tem sido alvo de pesquisas com anti-fúngicos e sua presença no proteoma de C.

cacaofunesta é bastante importante e deve servir de foco para pesquisas

posteriores com agentes antifúngicos, em prol da cultura cacaueira.

5.7 Atividade de proteases e inibidores

As proteases apresentam um papel fundamental em vários processos

biológicos, onde clivam ligações peptídicas modulando a atividade de uma

proteína ou degradando-a. Além disso, podem atuar no metabolismo celular

como catalisadores inespecíficos (Page & Cera 2008) e estão associados a

modificações pós-traducionais (Ryan, 1990). A atividade catalítica das proteases

é regulada por inibidores proteicos, que atuam de maneira específica (Ryan,

1990). No caso das cisteíno proteases (tipo papaína), os inibidores proteicos são

do tipo cistatina. Por isso o estudo deles é tão importante em prol das culturas

que são acometidas por fitopatógenos.

No gráfico de atividade de cisteíno protease, observou uma tendência

crescente de atividade entre controle, I-CCN, I-TSH, respectivamente. Isso

provavelmente se deve ao fato da “percepção metabólica” do fungo, a presença

de um indutor no meio de cultura líquido. A diferença na atividade entre o controle

e os tratados também corroboram para essa afirmação. Trabalhos anteriores

mostram que, a presença de inibidores de protease nas plantas, faz parte de

uma resposta fitoquímica, contra a presença de proteases de patógenos (Joshi

et al., 1998).

54

Apesar de utilizarmos nesse trabalho indutores do T. cacao, não teríamos

como fazer testes de inibição sem que os inibidores do tipo cistatina fossem

purificados. Para isso, utilizamos TcCYS4 (recombinante do cacau e específico

para cisteíno-proteases do tipo papaína produzido por Pirovani, et al., 2010), e

constatamos a diferença na inibição (ou atividade residual de cisteíno protease)

entre os tratamentos feitos. A maior inibição ocorreu no controle e em I-TSH,

enquanto I-CCN foi pouco inibido. Como na atividade de protease observou-se

que havia uma atividade menor do controle em relação aos outros tratamentos,

sugere-se que uma fração percentual maior da enzima disponível foi inibida,

porque havia menos cisteíno-proteases disponíveis. No entanto, embora I-TSH

tenha apresentado uma alta atividade de cisteíno-protease, bem superior ao

tratamento controle, a inibição do I-TSH foi bastante semelhante a inibição

ocorrida no controle (considerando o erro padrão). Em I-CCN a inibição foi

bastante inferior aos do outros tratamentos, por essa razão, sugere-se a

presença nessa amostra de outros tipos de proteases como aspártico-protease,

serino-protease ou metalo-protease, dentre outros, já que TcCYS4 é específico

para cisteíno- proteases.

5.8 Estresse Oxidativo

Os organismos aeróbios usam o oxigênio para a respiração e

fornecimento de energia. No entanto, efeitos secundários de O2, chamados de

espécies reativas de oxigênio (ROS), são altamente tóxicos para os constituintes

celulares, como DNA, lipídios e proteínas (Fridovich, 1998). Para proteger as

células do estresse oxidativo, os organismos possuem sistemas de defesa

enzimáticos e não enzimáticos. A catalase faz parte do sistema de defesa

enzimático e é produzida durante o metabolismo celular normal; quando há

exposição da célula a uma situação de estresse oxidativo, a quantidade de

catalase produzida, aumenta (Angelova et al., 2005). A atividade de catalase

para esse experimento é considerada basal, ou seja, a quantidade desta enzima

presente na amostra é suficiente para reparar pequenos níveis de dano celular,

mas não parece estar associada ao estresse oxidativo. Essas observações se

devem ao fato que no tratamento controle do experimento, a atividade está

superior aos tratamentos induzidos (I-TSH e I-CCN).

55

A peroxidase do guaiacol é outra enzima do sistema de defesa enzimático

que está associado a “retirada” de espécies reativas de oxigênio presente nas

células, como forma de evitar o estresse oxidativo (Scheel et al. 2000). Na

atividade de peroxidase do guaiacol nesse experimento (Figura 19), os

tratamentos, controles e TSH tiveram perfis bastante semelhantes, levando em

consideração o erro padrão. No entanto, houve uma diferença bastante

significativa entre os tratamento I-CCN e I-TSH. A atividade diminuída do

tratamento induzido por I-CCN pode ser devido do fato desse genótipo ser

suscetível e não expressar algumas proteínas associadas ao estresse oxidativo.

Fica claro, portanto, pela diferença entre os tratamentos, que C. cacaofunesta

apresenta uma versatilidade na adaptação às condições de indução no meio de

cultura, o que correlaciona-se com sua versatilidade em uma interação planta-

patógeno in vivo.

56

6 CONCLUSÕES

- A combinação de rendimento proteico, rendimento micelial e microscopia

foram eficientes para definição do tempo de estudo do secretoma.

- O método de extração empregado nesse trabalho, descrito por Alvim, et al.

(2009) é o adequado para obtenção do secretoma de C. cacaofunesta.

- A obtenção do proteoma micelial feito utilizando-se SDS-denso associado ao

fenol, estabelecido por Pirovani et al. (2008) foi bastante eficaz, haja vista o alto

rendimento da extração, bem como a nitidez dos spots apresentados no gel 2D-

Page. - Fragmentos de ramos de cacau contrastantes para resistência ao mal-do-

facão induz variações diferenciais no perfil proteico do fungo C. cacaofunesta em

meio de cultura. - As tecnologias associadas à proteômica são eficazes para a obtenção do mapa

de referência de C. cacaofunesta. - Fragmentos de ramos de cacau contrastantes para resistência ao mal-do-facão

não parecem induzir estresse oxidativo no tratamento I-CCN no fungo C.

cacaofunesta. - O catalase é uma importante ferramenta do fungo C. cacaofunesta para a

colonização do genótipo CCN51 do T. cacao. - O inibidor TcCYS4, do T. cacao, foi eficiente na inibição das cisteíno-proteases

produzidas por C. cacaofunesta em meio de cultura líquido.

57

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