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UNIVERSIDADE ESTADUAL DE CAMPINAS INSTITUTO DE BIOLOGIA EVELINE SOARES MENEZES BUSCA POR ALVO MOLECULAR ASSOCIADO AO PROCESSO DE BIOGÊNESE MITOCONDRIAL EM CÉLULAS PANCREÁTICAS SECRETORAS DE INSULINA CAMPINAS 2018
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UNIVERSIDADE ESTADUAL DE CAMPINAS
INSTITUTO DE BIOLOGIA
EVELINE SOARES MENEZES
BUSCA POR ALVO MOLECULAR ASSOCIADO AO PROCESSO DE BIOGÊNESE
MITOCONDRIAL EM CÉLULAS PANCREÁTICAS SECRETORAS DE INSULINA
CAMPINAS
2018
EVELINE SOARES MENEZES
BUSCA POR ALVO MOLECULAR ASSOCIADO AO PROCESSO DE BIOGÊNESE
MITOCONDRIAL EM CÉLULAS PANCREÁTICAS SECRETORAS DE INSULINA
Dissertação apresentada ao Instituto de
Biologia da Universidade Estadual de
Campinas como parte dos requisitos
exigidos para obtenção do título de
Mestra em Biologia Funcional e
Molecular, na Área de Fisiologia.
Orientador: LEONARDO REIS SILVEIRA
CAMPINAS
2018
ESTE ARQUIVO DIGITAL CORRESPONDE À
VERSÃO FINAL DA DISSERTAÇÃO DEFENDIDA
PELA ALUNA EVELINE SOARES MENEZES
E ORIENTADA PELO PROF.DR. LEONARDO DOS
REIS SILVEIRA
Agência(s) de fomento e nº(s) de processo(s): CAPES
Ficha catalográfica
Universidade Estadual de Campinas Biblioteca do Instituto de Biologia
Mara Janaina de Oliveira - CRB 8/6972
Menezes, Eveline Soares, 1992-
M524b Busca por alvo molecular associado ao processo de biogênese
mitocondrial em células pancreáticas secretoras de insulina / Eveline
Soares Menezes. – Campinas, SP : [s.n.], 2018.
Orientador: Leonardo dos Reis Silveira.
Dissertação (mestrado) – Universidade Estadual de Campinas,
Instituto de Biologia.
1. Piruvato carboxilase. 2. Células secretoras de insulina. 3.
Mitocôndria - Fisiologia. 4. Insulina - Secreção. I. Silveira, Leonardo dos
Reis, 1970-. II. Universidade Estadual de Campinas. Instituto de
Biologia. III. Título. Informações para Biblioteca Digital
Título em outro idioma: Molecular target search associated to the process of
mitochondrial biogenesis in insulin secreting pancreatic cells Palavras-chave em inglês: Pyruvate carboxylase Insulin-secreting cells Mitochondria - Physiology Insulin - Secretion Área de concentração: Fisiologia Titulação: Mestra em Biologia Funcional e Molecular Banca examinadora: Leonardo dos Reis Silveira [Orientador] Helena Cristina de Lima Barbosa Sampaio Gabriela Felix Persinoti Data de defesa: 26-03-2018 Programa de Pós-Graduação: Biologia Funcional e Molecular
Campinas, 26 de março de 2018.
COMISSÃO EXAMINADORA
Prof. Dr. Leonardo dos Reis Silveira (Instituto de Biologia, UNICAMP)
Prof. Dra. Helena Cristina de Lima Barbosa Sampaio (Instituto de Biologia,
UNICAMP)
Dra. Gabriela Felix Persinoti (CNPEM - CTBE Laboratório Nacional de Ciência e
Tecnologia do Bioetanol)
Os membros da Comissão Examinadora acima assinaram a Ata de Defesa, que se
encontra no processo de vida acadêmica do aluno.
A minha tia avó, Maria Virgulino (in memorian),
Por ter dedicado toda a sua vida à
família, por ter acreditado em mim e por
ter me ensinado a nunca perder a fé.
AGRADECIMENTOS
Este trabalho foi desenvolvido com o apoio financeiro da CNPQ – Conselho
Nacional de apoio Científico e Tecnológico.
O meu mais genuíno agradecimento aos meus pais que me apoiaram em todas as
decisões que tomei ao longo da minha vida acadêmica. Obrigada pelo amor, pelo carinho,
por todos os sacrifícios e por todos os puxões de orelha nos últimos dois anos. Graças a
vocês sempre tive força pra continuar lutando em busca da realização dos meus sonhos.
Sem o suporte de vocês eu não teria chegado tão longe. Obrigada!
A Mainha, por ser um exemplo de caráter, determinação e integridade! Obrigada
por sempre ter acreditado no meu potencial e pela confiança depositada. Obrigada pelas
palavras de incentivo, pela positividade e pela fé que sempre me ensinou a ter. Obrigada
por ser nosso porto seguro, por ser uma verdadeira guerreira, por sempre se manter
presente mesmo a quilômetros de distância e por esse amor incondicional que você nunca
deixou de transmitir.
A Painho, pela paciência e por ser um verdadeiro paizão! Não poderia pedir por
um pai mais sensacional do que esse, que sempre participou efetivamente de todos os
momentos da minha vida e nunca mediu esforços para me proporcionar o melhor. Sem
suas habilidades e agilidade pra resolver todos os contratempos que eu trago, nada disso
seria possível! Eu já teria perdido no mínimo uns 3 voos, já teria sido barrada sem carteira
de identidade e, provavelmente teria perdido alguns prazos de matrículas.
A Éverton, meu querido irmão favorito, companheiro de aventuras, de viagens e
de aperreios! Obrigada por ter cuidado de mim todos esses anos que estive no “ninho”,
por ter me ensinado a sempre mirar alto nos meus sonhos e por sempre ter acreditado que
eu conseguiria ter sucesso.
O meu muito obrigada para minha cunhada Bruna, que foi uma irmã pra mim e
sempre me apoiou nessa jornada. E claro, obrigada ao nosso pinguinho de gente Marina,
minha primeira sobrinha, que com tão pouco tempo de vida já transborda amor e carinho,
deixando qualquer preocupação parecer mais leve com essa alegria contagiante!
Aos meus tios e primos, por todo o carinho e todo o suporte que vocês me deram
sempre que precisei! Obrigada pelos momentos de alegria e pelo amor que demonstram
por essa sobrinha – prima nômade. Obrigada por sempre torcerem por mim; mesmo longe,
sinto-me muito amada e acolhida por vocês!
Aos meus avós (in memorian): Edite, João Enoque, Maria da Luz e João Antônio,
por terem me proporcionado uma infância incrível, por terem sido exemplos de respeito
e humildade, pelo amor que tinham pelos filhos e netos, pela união e por toda força que
tiveram até os últimos momentos de vida. Sem seus ensinamentos, essa conquista não
seria possível!
As minhas queridas amigas de Petrolina: Bruna, Milla, Luana, Denise, Gisienne,
que mesmo de longe conseguem me apoiar, me alegrar e me mostrar que toda trajetória
pode ser mais leve e mais fácil quando temos pessoas iluminadas na vida. Eu sei que
nunca paro em lugar nenhum, e vivo morrendo de saudades, mas sou muito grata por tê-
las em minha vida.
A Família Arizona, por todo apoio, carinho e zueiras. Com vocês na torcida sinto
que posso sempre ir mais longe! Gui e Isa, muito obrigada, migos! Todos os “relaxa você
consegue”, “não desiste, miga”, “parabéns”, “falta pouco”, “vai dá tudo certo”, foram
fundamentais nessa jornada!
A minha Lilly Pad, por ter sido uma amiga leal, positiva e nunca ter perdido o
contato mesmo depois do intercâmbio. Por se fazer presente nos momentos que mais
precisei e por ter sido uma verdadeira irmã de coração desde quando nos conhecemos.
Obrigada por ter me animado quando achei que não tinha mais motivação, por me mostrar
o potencial que tenho e por sempre me fazer acreditar que nada é impossível!
As minhas pretas Cau, Berty, Aninha, Lari e Bela, por se manterem na minha vida
desde sempre e por sonharem junto comigo. Vocês participaram de perto e de longe de
cada conquista e cada realização dessa minha trajetória. Obrigada pela positividade, por
me salvarem de qualquer perrengue, pelos conselhos, pelas resenhas e por sempre estarem
dispostas à estender uma mão ou duas quando preciso!
As meninas do pensionato, foram 2 anos maravilhosos convivendo com vocês!
Cada dia aprendendo um pouquinho de suas respectivas culturas, ou compartilhando um
pouco da minha, fez com o tempo passasse mais rápido e mais leve! Um dia era ouvindo
forró do Ceará com Rayanne, no outro tomando chimarrão argentino enquanto me
consultava com nossa médica Cynthia, e de vez em quando ainda me danava a querer
falar em Espanhol com Jéssica, que já deixou minha hospedagem garantida na Bolívia.
A Lu, Alice, Jú e Conrado, não tenho palavras para agradecer o quanto me senti
acolhida por essa família linda na minha trajetória aqui em Campinas. Fui bem tratada
desde o primeiro dia que pisei os pés no pensionato, e daí pra frente o carinho por vocês
só aumentou. Obrigada por terem me deixado à vontade, por serem sempre prestativos e
pelo carinho! No final do dia, o cansaço, as frustações e a saudade, ficavam menores só
em conversar com vocês!
A minha querida amiga Edna, pelo companheirismo. Foi ótimo conviver com
você, roommate! Obrigada pelas suas palavras, atitudes e lealdade. Seu apoio foi muito
importante nesse capítulo da minha vida. E saiba que essa amizade vai durar por muitos
anos! Vem Mochilão 2018!!!
Aos amores que o esporte me deu de presente, Majú, Marlon, Mandy e Nalau, por
todas histórias, alegrias, conquistas e lágrimas. Cada momento que disfrutamos juntos foi
especial. Sou muito grata por tê-los em minha vida! Cada palavra, cada abraço e cada
“você consegue Eve” fez com eu desse sempre o melhor de mim e não desistisse na
primeira queda. Esse cuidado, carinho e respeito que demonstram por mim significa
muito! Vou colocar cada um num potinho e levar comigo pra onde eu for viu? E quero
ver todo mundo me visitando no Nordeste!
Aos meus mozões Rafa, Jú e Léozinho, por tudo. Sem vocês o lab não seria o
mesmo! Eu não ouviria: “Miga, trouxe chocolate pra melhorar seu dia”; “Troca meio pra
mim por favor?”; “Eve, me ajuda!”; “Você vai conseguir, xuxu!”; “Vai dá tudo certo,
mozão”; “Te espero pra bandejar!”; “Seu PCR vai terminar tarde? Relaxa, te faço
companhia!” Obrigada por me animarem quando tudo parecia não ter mais solução, pelas
palavras de conforto, pelos mimos diários, pelo carinho, pela cumplicidade, pela
confiança, pela parceria, pela honestidade, pelos conselhos, pelas lágrimas, pelas
gargalhadas, e por deixarem nossa amizade cada dia mais forte! Vou sentir muitas
saudades, mas vou levar vocês no coração! E aguardo vocês na Bahia, hein?!
A Martita. Suas palavras e sabedoria sempre conseguiram me iluminar nos
momentos mais difíceis. Serei eternamente grata por tudo que você fez por mim; seja uma
carona ou um conselho que me faz pensar com calma antes de tomar qualquer decisão.
Obrigada por ser autêntica, direta e leal! Obrigada por me fazer querer lutar pelo certo e
pelos meus direitos e, obrigada também por me repreender quando estou errada!
Ao time Leoninos (ex e atuais): Hygor, Tanes, Lucas, Michel, Luciana, Rafael,
André, Bianca, Cidnei, Marie, Rafaela e Dimitrius. Vocês são a equipe mais unida e
divertida que eu já tive o prazer de trabalhar! Seja na bancada, nas quadras de tênis ou
nos churrascos, é sempre uma alegria estar com vocês. Muito obrigada por me salvarem
dos apuros na bancada, por sempre estarem dispostos a ajudar, por sempre conseguirem
esclarecer minhas dúvidas experimentais e da vida também! Aprendi muito com cada um
de vocês e tenho muito orgulho de ter feito parte dessa equipe!
Aos meus “padrinhos acadêmicos” Carlos e Amanda Sponton, muito obrigada!
Vocês são os melhores conselheiros e motivadores que toda marinheira de primeira
viagem gostaria de ter! Carlão, obrigada pela paciência, pelos ensinamentos, por me
acudir nos perrengues de bancada, e por me mostrar que o caminho da ética é sempre o
caminho ideal à se seguir! Amandxinha, obrigada por ser esse amor de pessoa comigo,
por sempre transbordar energia positiva, pelo carinho e prestatividade!
A toda equipe do OCRC, professores, alunos e funcionários. Sem a colaboração
de vocês eu não teria chegado tão longe! Meu mais sincero agradecimento ao Cláudio, a
Leli, a Mônica, e a Tati, que são verdadeiros “super-heróis” no lab e realizam missões
quase que impossíveis diariamente para garantir que tudo funcione bem!
Ao professor Leonardo, por ter aceitado me guiar nesses dois anos e ter me
ensinado não só sobre mitocôndria, mas por ter me dado conselhos que vou levar pra vida
toda!
Ao professor Paulo Schwingel, por ter me aconselhado, por ter me guiado no final
da minha graduação ter me indicado o programa de pós do IB – Unicamp.
Ao professor Henrique pela colaboração, e em especial ao Caique Malospítiro,
que me ensinou grande parte do que eu sei sobre clonagem.
Ao professor Murilo Viera, por ter colaborado no projeto num momento que eu
achava que não tinha mais saída. Suas considerações e ajuda foram essenciais para a
evolução do projeto.
Ao professor Gonçalo e Nicholas Vinícius pela colaboração com as análises de
bioinformática realizadas no LGE!
RESUMO
O desenvolvimento do Diabetes Mellitus Tipo 2 (DM2) ocorre devido à disfunção das
células β pancreáticas e presença da resistência periférica à ação da insulina. No músculo
esquelético, a resistência à insulina, defeito incial do DM2, se caracteriza por uma
atividade anaplerótica mitocondrial reduzida e consequentemente, baixos níveis de
expressão da PC. A literatura mostra um consenso de que nos estágios iniciais desta
doença há um ganho no conteúdo em massa de células β pancreáticas, seguido pelo
aumento da produção e secreção de insulina. Enquanto no estágio crônico, há uma
redução da atividade mitocondrial, diminuição da massa celular e comprometimento na
produção de insulina, sugerindo uma estreita associação entre o conteúdo de massa
celular, secreção de insulina e a capacidade mitocondrial. Durante o DM2, ocorre ainda
falha na adaptação metabólica das células β pancreáticas. A enzima piruvato carboxilase
(PC) desempenha papel essencial na secreção de insulina, contribuindo para o aumento
do processo de anaplerose no ciclo de Krebs ao utilizar o piruvato como principal
substrato. No entanto, durante o DM2, a expressão dessa enzima é fortemente atenuada.
Esse fenômeno tem sido pouco explorado em células β pancreáticas com relação ao
controle molecular do processo de biogênese mitocondrial. Embora a literatura demonstre
aumento dos níveis de PC durante a secreção de insulina e, consequentemente, maior
atividade mitocondrial, pouco se sabe sobre a regulação do processo de biogênese
mitocondrial dessas células. A pesquisa em evidência demonstra que proteínas as quais
interagem com o promotor distal da PC podem ser possíveis alvos relacionados ao
controle da função e biogênese mitocondrial e, portanto, da secreção de insulina em
células pancreáticas MIN6. Neste contexto, o estudo em questão poderá trazer novos
insights sobre os mecanismos moleculares envolvidos com o processo de biogênese
mitocondrial e consequentemente proteção das células β contra a falha da função
mitocondrial/secreção de insulina, bem como abrir perspectivas para a busca de novas
moléculas com potencial terapêutico, capazes de melhorar a função e sobrevivência de
células produtoras de insulina.
ABSTRACT
Type 2 Diabetes (T2D) occurs due to the pancreatic β cells dysfunction. There is
agreement that in the early stage of T2D the pancreatic β cell mass grows up fast, followed
by increased production and secretion of insulin. In contrast, under chronic stage of T2D,
pancreatic β cells mass is impaired followed by lower insulin production, suggesting a
close association between cell mass content and mitochondrial oxidative capacity. T2D
is also expected to impair metabolic β cells adaptation. Under physiological conditions,
pyruvate carboxylase (PC) exert a central role over insulin secretion process as indicated
by elevated concentration of Krebs Cycle Intermediates and increased insulin secretion.
However, the mechanism behind mitochondrial biogenesis process is still unknown. Here
we are demonstrating that the distal PCX promoter, which is responsible for anaplerosis
process, might be an interesting bait to identify different targets related to the control of
the mitochondrial biogenesis in MIN6 pancreatic cells. This study, therefore, brings a
new insight to identify new molecular players associated with the mechanism of
mitochondrial biogenesis and consequently protection of β cells against mitochondrial
function/insulin secretion failure.
Lista de Abreviações
ASCL2 – do inglês, achaete-scute family bHLH transcription factor 2
EGR1 – do inglês, early growth response 1
ESRR – receptor relacionado ao receptor de estrogênio
G6F – glicose-6-fosfatase
GLUT2 – transportador de glicose tipo 2
GPD1 – glicerol-3-fosfato desidrogenase 1
HNF4G – do inglês, hepatocyte nuclear factor 4, gamma
MAFG – do inglês, v-maf musculoaponeurotic fibrosarcoma oncogene family, protein G
(avian)
MYOD1 – do inglês, myogenic differentiation 1
MYOG – do inglês, myogenin
NKX2 – do inglês, 3 - NK2 homeobox 3
NKX2-9 – do inglês, NK2 homeobox 9
NR2C2 – do inglês, nuclear receptor subfamily 2, group C, member 2
NR2F6 – do inglês, nuclear receptor subfamily 2, group F, member 6
PC – enzima piruvato carboxilase
PCX – gene da proteína piruvato carboxilase
PCX1 – região promotora proximal do gene da proteína piruvato carboxilase
PCX2 – região promotora distal do gene da proteína piruvato carboxilase
PDX1 – do inglês, pancreatic and duodenal homeobox 1
PGC-1α – co-ativador 1 alfa do receptor ativado por proliferadores de peroxissoma
PPAR – receptor gama ativado por proliferadores de peroxissoma
SP1 – do inglês, trans-acting transcription factor 1
SP2 – do inglês, Sp2 transcription factor
TCF12 – do inglês, transcription factor 12
TFAM – fator de transcrição mitocondrial
THAP1 – do inglês, THAP domain containing, apoptosis associated protein
UCP2 – proteína desacopladora 2
SUMÁRIO
1. INTRODUÇÃO ...................................................................................................................... 16
1.2. OBJETIVO ..................................................................................................................... 21
1.2.1 OBJETIVOS ESPECÍFICOS ..................................................................................... 21
2. MATERIAIS E MÉTODOS ................................................................................................... 22
2.1. Cultivo de células ............................................................................................................ 22
2.1.1 Cultivo de células INS-1E ......................................................................................... 22
2.1.2 Cultivo de células MIN6 ............................................................................................ 22
2.2. Grupos experimentais ...................................................................................................... 22
2.2.1 Células INS-1E .......................................................................................................... 22
2.2.2 Células MIN6 ............................................................................................................ 22
2.3. Secreção de insulina estimulada por glicose ................................................................... 23
2.4. Transfecção gênica .......................................................................................................... 23
2.5. Determinação da concentração de proteínas totais .......................................................... 24
2.6. Western Blotting ............................................................................................................. 24
2.7. Expressão gênica (mRNA) e transcrição reversa (RT) .................................................... 25
2.8. Reação de PCR em tempo real (RT-PCR) ....................................................................... 26
2.9. Consumo de oxigênio ...................................................................................................... 27
2.11. Análise de bioinformática ............................................................................................. 27
2.12. Análise estatística .......................................................................................................... 28
3. RESULTADOS ....................................................................................................................... 30
3.1. Transfecção de Pdx1 em células beta INS-1E ................................................................. 30
3.2. Regiões promotoras da PC .............................................................................................. 32
3.3. Análise in silico utilizando o programa AliBaba2.1 ....................................................... 33
3.4. Análise in silico utilizando a base de dados EPD ............................................................ 34
3.5. Cruzamento das análises realizadas no EPD e AliBaba2.1 .............................................. 35
3.6. Rede de interações dos alvos encontrados na PCX2 ........................................................ 36
3.7. Interações entre os alvos encontrados na PCX2 ............................................................... 39
3.8. Análise do enriquecimento de promotores de genes associados ao processo de biogênese
mitocondrial ........................................................................................................................... 40
3.9. Secreção de insulina em linhagem de células MIN6 ........................................................ 42
3.10. Expressão de mRNAs dos respectivos alvos encontrados no EPD em linhagem de
células MIN6 ........................................................................................................................... 43
3.11. Amplificação dos promotores da PC fusionados à biotina ............................................. 45
4. DISCUSSÃO ........................................................................................................................... 46
5. CONCLUSÕES ....................................................................................................................... 50
REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS ........................................................................................ 51
ANEXO I. Comitê de Ética ....................................................................................................... 55
ANEXO II. Declaração................................................................................................................56
ANEXO III. Rede de interações dos alvos – imagens do GeneMania.........................................57
16
1. INTRODUÇÃO
As Ilhotas de Langerhans do pâncreas endócrino são responsáveis pela regulação
dos níveis de glicose sanguínea (Kahn et al., 2006), sendo compostas por cinco tipos celulares
que produzem e secretam hormônios fundamentais para o funcionamento desse órgão: células
α, que secretam glucagon; células β, que secretam insulina; células γ/PP, que secretam
polipeptídeo pancreático; células δ, que secretam somatostatina; e células ε, que secretam
grelina. Dentre esses componentes, a célula β se destaca por ser o tipo celular mais abundante
do pâncreas endócrino, tanto em roedores quanto em humanos, compreendendo cerca de 60-
70% e 50-70% das ilhotas de cada espécie, respectivamente (Cabrera et al., 2006).
Além de compreender a maior parte do pâncreas, a célula β é o único tipo de célula
mamífera, dentre os outros cinco tipos celulares do pâncreas endócrino, que possui a capacidade
de produzir insulina, hormônio responsável pelo controle da captação de glicose sanguínea nos
tecidos periféricos (Gao et al., 2014; Hunter and Stein, 2017). Essa função primária ocorre em
resposta à nutrientes, hormônios e estímulos nervosos, favorecendo a manutenção da glicemia
numa faixa estreita de variação fisiológica (Kulkarni, 2004). Durante a secreção de insulina
estimulada por glicose, a glicose entra na célula β através dos transportadores de glicose
(GLUT-2), onde é convertida em glicose-6-fosfato na reação de glicoquinase, e em seguida é
convertida em piruvato em uma sequência de reações anaeróbias. O piruvato entra nas
mitocôndrias, sendo oxidado pelo Ciclo do Ácido Tricarboxílico (TCA). Como resultado, há
aumento na produção de coenzimas reduzidas, NADH e FADH2, seguido do aumento na
produção de ATP mitocondrial. Com os níveis de ATP aumentados, ocorre fechamento dos
canais de K+ ATP-dependente e despolarização da célula β pancreática, resultando na abertura
dos canais Ca2+ voltagem-dependente e ativando o mecanismo de mobilização dos grânulos de
insulina, e consequentemente, levando a liberação dos mesmos. (Newgard, 2002) (Figura 1).
17
Figura 1. Eventos bioquímicos na secreção de insulina estimulada por glicose (figura adaptada
de Newgard, 2001).
Padrões alterados de comportamento alimentar tais como: consumo excessivo de
energia e/ou desnutrição precoce favorecem o desenvolvimento de diversos quadros
patológicos como resistência à insulina, obesidade e diabetes (Seidell, 2000; DeFronzo and
Ferrannini, 1991). Neste contexto, a disfunção de células β pancreáticas é um componente
importante no desenvolvimento do diabetes mellitus tipo 2 (DM2). Atualmente, existe um
consenso de que no estágio inicial dessa doença há ganho no conteúdo de massa de células β
pancreáticas seguido do aumento na produção e secreção de insulina. Ao contrário, no estágio
crônico, há uma redução da massa, seguido de diminuição da produção de insulina, sugerindo
uma íntima associação entre o conteúdo de massa celular/produção de insulina e a capacidade
oxidativa mitocondrial. Portanto, evidências apontam a dependência de uma função
mitocondrial elevada para manutenção da secreção de insulina das células β (Silva et al., 2000).
Gauthier et al. (2009), mostraram em camundongos que mutações no gene do fator
transcricional de diferenciação celular PDX1 resultaram em redução do fator de transcrição
mitocondrial (TFAM), um efeito que foi refletido no aumento da glicemia basal desses animais.
O Pdx1 é primeiro fator de transcrição produzido no desenvolvimento do pâncreas,
portanto, humanos ou camundongos que não possuem esse fator apresentam agenesia
pancreática, devido à incapacidade de produzir ducto e células exócrinas ou endócrinas. Esse
fator de transcrição atua como regulador do desenvolvimento e do destino da célula beta,
ativando simultaneamente genes essenciais para sua identidade e inibindo aqueles ligados à
18
identidade das células α pancreática (Gao et al., 2013). Sendo assim, a expressão de Pdx1 se
torna indispensável em células β durante seu desenvolvimento. A remoção de Pdx1 de células
β, em fase de formação, causa hiperglicemia, comprometendo as células insulínicas e ocorrendo
um aumento nas células α. No entanto, ainda não está claro na literatura quais as vias de
sinalização são ativadas pelo Pdx1. Além disso, estudos anteriores comprovam que a deleção
de Pdx1 resulta no desaparecimento de identidade da célula β, dessa forma, contribuindo para
a patogênese do DM2 (Gao et al. 2014; Gao et al. 2013).
Constatou-se que a superexpressão de TFAM em ilhotas isoladas de animais com
deleção de PDX1 aumentou o número de cópias de DNA mitocondrial (mtDNA), o consumo
de oxigênio, a síntese de ATP e, consequentemente, a secreção de insulina induzida por glicose,
destacando a importância da mitocôndria na função da célula β. Em camundongos mutantes
(Pdx1+/-), foi observada reduzida secreção de insulina e aumento de apoptose (Silva et al.,
2000). Ambos efeitos foram atenuados no uso de ilhotas isoladas expressando o dominante
negativo do Pdx1 (DN79PDX1). Nessas condições, os níveis transcricionais de TFAM foram
substancialmente reduzidos, sugerindo que o Pdx1 pode ser um regulador importante do TFAM
(Gauthier et al., 2009). Em adição, a redução da função mitocondrial de células β de animais
obesos/diabéticos tem sido associada a um aumento na expressão da proteína UCP2, indicando
que o desacoplamento da fosforilação oxidativa é um importante componente do mecanismo
de redução da secreção de insulina nessas células (Zhang et al., 2001).
Esses achados sugerem fortemente que o controle molecular da biogênese
mitocondrial pode ser um importante mecanismo na manutenção da função mitocondrial e da
secreção de insulina em células β. O processo de biogênese mitocondrial, caracterizado pela
importação e formação dos complexos da cadeia respiratória e replicação do mtDNA e pela
síntese de novas mitocôndrias, pode sofrer uma regulação transcricional (Dominy and
Puigserver, 2013). Os receptores nucleares desempenham um papel fundamental, atuando como
mediadores desse processo, onde há um equilíbrio entre sua ativação e repressão. Assim, o
controle de processo pode ser realizado através da ação coordenada de correguladores que
possuem característica repressora e/ou ativadora (Feige; Auwerx, 2007; Kelly; Scarpulla, 2004;
Li et al., 2011; Yu et al., 2005).
Embora, no tecido muscular esteja bem estabelecido o papel do cofator de
transcrição mitocondrial PGC1α, nesse controle aumentando a função mitocondrial do músculo
esquelético, em células β, surpreendentemente, esse cofator foi claramente associado com
redução da função mitocondrial indicando que esse controle ainda é desconhecido nesse tecido.
De fato, a infecção de células β de animais diabéticos com adenovirus contendo PGC1α resultou
19
em prejuízo da secreção de insulina estimulada por glicose, um efeito consistente com redução
da expressão dos genes da glicose-6-fosfatase, do GLUT2, da glicokinase e da glicerol-3-
fosfato desidrogenase, sugerindo fortemente que o PGC1α exerce importante efeito na
patogênese do DM2 (Yoon et al., 2003).
Piruvato Carboxilase e Célula β
Além dos co-ativadores de receptores nucleares, existem enzimas que também são
essenciais no balanço energético da secreção de insulina em células β. É o caso da enzima
piruvato carboxilase (PC), que possui uma capacidade anaplerótica de extrema importância,
pois catalisa a carboxilação com ATP de piruvato em oxaloaceato (Jitrapakdee et al., 1998). A
PC está expressa em altos níveis na maior parte das células beta (Menefee and Zeczycki, 2014)
e afeta diretamente a secreção de insulina estimulada por glicose (Xu et al., 2008). A partir do
piruvato e do bicarbonato a enzima piruvato carboxilase é capaz de gerar oxaloacetato
(Jitrapakdee et al., 2008). Após a conversão do piruvato em oxaloacetato catalizado pela PC,
ocorre a anaplerose mitocondrial, favorecendo o aumento na produção do NADH e do processo
de fosforilação oxidativa (Jensen et al., 2008).
É interessante observar que a inibição da expressão de PC em células beta inibe a
secreção de insulina estimulada por glicose. Em contrapartida, quando a PC é superexpressa
em células β, ocorre aumento da secreção de insulina estimulada por glicose (Xu et al., 2008).
Franssonn et al. (2006), observaram o papel da piruvato carboxilase na anaplerose para a
secreção de insulina em ilhotas de ratos utilizando ácido fenilacético para inibir a expressão
dessa enzima. Através dos efeitos analisados no metabolismo dessas ilhotas, foi constatado que
a enzima piruvato carboxilase e, consequentemente, a anaplerose, é fundamental para o
aumento adequado da fração ATP:ADP frente ao metabolismo do combustível; esse aumento
estimula e mantém a secreção de insulina. Quando submetida à condições de baixa glicose, a
PC é relativamente inativa, devido aos baixos níveis de ATP da matriz mitocondrial e à uma
oferta limitada tanto de piruvato, quanto do seu ativador alostérico, o acetil CoA (Klingenberg
and Rottenberg, 1977). A PC e as vias de anaplerose são importantes na secreção aumentada
de insulina e crescimento de células β, que são características da adaptação da célula β à
resistência à insulina (Liu et al.,2002). Em adição, a baixa expressão da PC em ilhotas parece
estar diretamente associada à obesidade e ao DM2. De fato, os níveis de PC se encontram
reduzidos nas ilhotas de humanos e roedores diabéticos quando comparados com grupos
controles não-diabéticos (MacDonald et al., 2009). Recentemente, mostramos ainda que o
20
aumento na expressão de PC em células musculares foi capaz de aumentar a função
mitocondrial e a resposta a insulina, um efeito diretamente associado ao aumento na expressão
de PGC1α e da transativação do elemento responsivo de PPAR (manuscrito submetido ao BBA,
2018).
O gene da PC é composto por duas regiões promotoras: região proximal e região
distal (Figura 2); sendo a região proximal responsável pelo papel de produzir mRNA de PC nos
tecidos gluconeogênicos (fígado e rim) e nos tecidos lipogênicos (tecido hepático e adiposo), e
a região distal diretamente associada ao controle do processo de anaplerose em modelos de
ilhotas pancreáticas de murinos e humanos (Jitrapakdee et al., 1998; (Thonpho et al., 2013).
Diante desse cenário complexo de interações de genes associados as vias de biogênese
mitocondrial, o presente estudo visa à busca de genes alvos que participam da regulação dessas
vias. O conhecimento do mecanismo pelo qual esses alvos regulam a função mitocondrial
certamente poderá abrir novas perspectivas terapêuticas no controle da disfunção mitocondrial
em células β e o consequente desenvolvimento do DM2. Dessa forma, estamos propondo
utilizar o promotor do gene da PC como “isca” na busca de alvos responsáveis pelo processo
de biogênese mitocondrial em células secretoras de insulina MIN6. Para isso, realizamos
análises de bioinformática utilizando o promotor da PC para identificar os alvos moleculares
supostamente associados ao processo de controle da função/biogênese mitocondrial e,
consequentemente da secreção de insulina em células beta da linhagem MIN6. Em caso de
sucesso na busca de alvos, tentaremos confirmar esses achados em camundongos controles e
resistentes a insulina após infecção adenoviral, contendo a sequência dos genes selecionados
neste estudo. Portanto, vale ressaltar que o estudo dos mecanismos moleculares envolvidos na
proteção das células β contra a falha da função mitocondrial/secreção de insulina trará
informações importantes na busca de novas moléculas com potencial terapêutico, capazes de
melhorar a função e sobrevivência das células produtoras de insulina.
Figura 2. Representação esquemática da estrutura física do gene que codifica para a proteína
piruvato carboxilase (PC).
21
1.2 OBJETIVO
Identificar possíveis alvos moleculares supostamente associados ao processo de
controle da função/biogênese mitocondrial e, consequentemente, da secreção de insulina em
células β pancreáticas, por meio de análises de bioinformática e experimentos funcionais,
utilizando o promotor do gene (PCX), uma enzima chave no processo de secreção de insulina,
como “isca”.
1.2.1 OBJETIVOS ESPECÍFICOS
Avaliar a transcrição dos genes PDX1, PGC1α, TFAM, Glicose-6-fosfatase, GLUT2 e
Glicerol-3-fosfato desidrogenase em células INS-1E;
Realizar a superexpressão da proteína PDX1 em linhagem de células INS-1E e avaliar
a transcrição dos genes PGC1α, TFAM, Glicose-6-fosfatase, GLUT2, e Glicerol-3-
fosfato desidrogenase;
Analisar a região promotora da PC e identificar os alvos que possuem sítios de ligação
nesse promotor, por meio de softwares de bioinformática;
Identificar a rede de interações dos alvos encontrados no promotor da PCX;
Avaliar o enriquecimento de promotores de genes associados ao processo de biogênese
mitocondrial em busca dos alvos encontrados nas análises de bioinformática;
Avaliar a transcrição dos genes previamente selecionados pela análise de bioinformática
em ensaios de secreção de insulina estimulada com glicose (genes Thap1, Nr2f6, Tcf12,
Nr2c2, Sp2, Mafg, Nkx2-9, Sp1, Hnf4g, Nkx2-3, Myod1, Myog, Ascl2) em células
MIN6;
Escolher o alvo e realizar a superexpressão e/ou silenciamento em células MIN6 para
posterior análise da expressão gênica de alvos associados à secreção de insulina, o
consumo de oxigênio e secreção de insulina induzida por glicose e demais análises
fenotípicas;
Realizar transfecção da região promotora da PCX em células MIN6 para posterior
ensaio de imunoprecipitação de cromatina (ChiP) com o propósito de busca e/ou
validação de alvos.
22
2. MATERIAIS E MÉTODOS
2.1. Cultivo de células
2.1. 1 Cultivo de células INS-1E
As células foram mantidas em placas de cultura estéril (Falcon), contendo meio
RPMI 1640 (Vitrocell Embriolife), acrescido de 11 mM de glicose, 5% de soro fetal bovino
(FBS), 10 mM de Hepes, 1 mM de piruvato de sódio, 50 µM de β-Mercaptoetanol, 100 U/mL
de Penicilina (Sigma, St Louis, USA) e 100 μg/mL de estreptomicina (Sigma, St. Louis, USA),
em atmosfera umedecida, contendo 5 % CO2, à temperatura constante de 37 ºC. As células, na
densidade de 500.000, foram cultivadas em placas de 6 wells e mantidas nesse meio em
atmosfera umedecida e, ao atingir 90% de confluência, foram transfectadas com o plasmídeo
(MR227421) da Origene (Figura 3), contendo o gene de expressão do fator de transcrição Pdx1
ou com um vetor vazio (PCMV_GFP).
2.1.2 Cultivo de células MIN6
As células da linhagem MIN6 foram mantidas em placas de cultura estéril (Nest),
contendo meio Dulbecco Mem Alta Glicose (Vitrocell Embriolife), composto de: bicarbonato
de sódio, glutamina, antibiótico, antimicótico e, acrescido de soro fetal bovino (10%) e β-
Mercaptoetanol (285 µM), em atmosfera umedecida, contendo 5% CO2, à temperatura
constante de 37ºC. As células, na densidade de 500.000, foram cultivadas em placas de 6 wells
e mantidas nesse meio em atmosfera umedecida e, ao atingir 90% de confluência, foram
submetidas ao ensaio de secreção de insulina estimulada por glicose para posterior coleta de
RNA.
2.2. Grupos experimentais
2.2.1. Células INS-1E
a) Controle (GFP)
b) Transfectada com Pdx1
2.2.2. Células MIN6
a) Controle (2.8mM de glicose)
b) Tratada (25 mM de glicose)
23
2.3 Secreção de insulina estimulada por glicose
Células MIN6, passagem 34 e 48, foram submetidas a um starvation por 60min,
mantidas em meio Krebs contendo 0,3% de albumina bovina (m/v), em ambiente controlado
(37°C, umidificado e gaseificado com carbogênio). Em seguida, a solução foi removida e
substituída por nova solução de incubação, contendo Krebs 2,8 mM ou 25 mM de glicose. Essas
células foram mantidas por mais 60min em ambiente controlado (37°C, umidificado e
gaseificado) e posteriormente submetidas ao protocolo de extração de RNA. Os sobrenadantes
foram coletados e armazenados a uma temperatura de -20 °C para posterior dosagem de
insulina. A concentração de insulina nos diferentes experimentos foi determinada por
radioimunoensaio.
2.4. Transfecção gênica
O plasmídeo MR227421 – Origene USA (Figura 3), contendo o gene de
expressão do fator de transcrição Pdx1, foi amplificado em bactérias (DH59 E.Coli). As células
INS-1E, confluência de 80%, foram lavadas com PBS e o meio de cultura substituído por
OPTIMEM (meio com soro reduzido). O plasmídeo, contendo DNA do Pdx1 (2 µg/mL), foi
adicionado ao meio OPTIMEM juntamente com o reagente p3000 (2 µL/µg de DNA). Em
seguida, foi acrescentado lipofectamina (5 µL/well), e esse mix mantido por 15 min em
temperatura ambiente. Após a associação entre o DNA e os lipossomos, as células foram
transfectadas por um período de 4 h. Posteriormente, esse meio foi substituído por meio de
cultura (descrito em 2.1.1), e mantido em atmosfera umedecida, contendo 5% CO2, à
temperatura constante de 37ºC. Após período de 48 h, as células foram coletadas.
24
Figura 3. Mapa do plasmídeo contendo o trecho do gene que expressa o Pdx1 (esquema do
vetor de Pdx1 baseado no site da OriGene, USA).
2.5. Determinação da concentração de proteínas totais
A concentração de proteínas das amostras foi determinada através de absorbância
595 nm, na qual foi feita uma curva padrão em concentrações crescentes de proteína (albumina)
e as amostras foram diluídas 20 vezes para a determinação da concentração (Bradford, 1976).
2.6. Western Blotting
Inicialmente, as células foram homogeneizadas em tampão contendo Tris (50 mM
pH 7,4) NaCl (150 mM), EDTA (1 mM), Triton X-100 (1%), deoxicolato de sódio (1 %) e
solução de dodecil sulfato de sódio (SDS 1%), acrescido de inibidores de proteases (aprotinina,
5 μg/mL, leupeptina 1 mg/mL, fluoreto de fenilmetilsufonil PMSF a 2 mM) e inibidores de
fosfatase (ortovanadato de sódio a 100 mM; pirofosfato de sódio a 100 mM, fluoreto de sódio
a 10 mM). As amostras foram sonicadas por 30 s, vortexadas e incubadas no gelo por 30 min.
Em seguida, foram centrifugadas a 15000 xg, 4 °C por 20 min. Uma alíquota do sobrenadante
contendo o lisado de células foi utilizada para determinação da concentração de proteínas totais
pelo método de Bradford (1976). Para a determinação de proteínas, estas foram fracionadas por
SDS-PAGE por eletroforese em gel SDS-PAGE. As amostras foram aquecidas a 97 °C por 3
min e 40 µg de proteína foi aplicada em um sistema mini-gel vertical, (modelo Protean III Cell
25
Biorad®) de acrilamida: bisacrilamida com 1,5 mm de espessura e gel de separação de 10 %
ou 8 %, de acordo com a proteína analisada. Foi utilizado marcador de peso molecular (Biorad®
All Blue e Dual Color) contendo proteínas conhecidas de 10 a 250 kDa. As corridas de
eletroforese foram realizadas em cubas de acrílico utilizando tampão de corrida (Tris-HCl 25
mM, glicina 115 mM, SDS 0,1%, mantido a 4 °C) sob potencial de 100 volts, durante 120min.
Após corrida eletroforética, as proteínas presentes no gel de poliacrilamida foram transferidas
para membrana de nitrocelulose (Biorad®), de acordo com o método descrito por Towbin et al.
(1979), utilizando tampão de transferência (Tris-HCl 24,8 mM, glicina 192 mM), potencial de
110 V e corrente de 400 mA em equipamento Biorad® Trans-Blot SD Cell, EUA. A membrana
foi bloqueada em temperatura ambiente por 60min em tampão TBS-T (Tris-HCl 0,02 M, NaCl
0,16 M e Tween-20 0,1%, pH 7,4) contendo leite desnatado em pó (10%) ou BSA (5%) e
incubada overnight (4°C), com diluições recomendadas de anticorpos primários, Pdx1 (Santa
Cruz 390792) e β-actina (Santa Cruz 81178). Em seguida, a membrana foi lavada duas vezes
por 5 min com TBST e incubada com anticorpo secundário, conjugado com peroxidase em
solução TBST contendo leite (2%) por 60min. Posteriormente, foram realizadas três lavagens
de 10 min com TBST. Por último, a membrana foi incubada por 1min com reagente de detecção:
Western Blotting Amersham ECL (GE Healthcare).
2.7. Expressão gênica (mRNA) e transcrição reversa (RT)
As células INS-1E e MIN6 (3x105 células) foram lisadas em Trizol (800 μL),
acrescidas de clorofórmio (160 μL) e centrifugadas (12.000 xg). A fase aquosa foi transferida e
em seguida foi adicionado isopropanol (400 μL). O RNA formado foi lavado com etanol (75%)
e centrifugado a 7.500 xg por 5 min. O sedimento de RNA foi seco à temperatura ambiente,
resuspendido em água livre de RNAse e armazenado a -80°C. A quantificação do RNA foi
realizada por espectrofotometria (260/280 nm). A síntese do DNA complementar (cDNA) foi
realizada a partir do RNA total (2 µg) com a seguinte mistura de reagentes: 146 ng de random
primers e 200 U da enzima transcriptase reversa, tampão da enzima (Tris-HCl a 50 mM (pH 8),
KCl a 75 mM, MgCl2 a 3 mM), DTT (5 mM), dNTP (500 µM) no volume final de reação de 20
µL. Esta mistura foi incubada por 10 min (25°C), permitindo a hibridização dos
oligonucleotídios ao RNA. Na sequência, a amostra foi aquecida a 37ºC por 120 min e 85ºC
por 5 min.
26
2.8. PCR em tempo real (RT-PCR)
A expressão dos genes foi quantificada por PCR em tempo real. As reações foram
realizadas em mistura (12 µL), contendo cDNA da amostra (2 µL), sequência de primers (0,5
µL), água free RNAse(10,5 µL) e mix SYBR Green PCR Master (12,5 µL); (dNTP, tampão de
reação, Taq DNA polimerase e SYBER Green I) (Invitrogen). As as sequências de primers
foram descritas na tabela 1.
Para o PCR dos promotores do gene da PC, sintetizamos as sequências das duas
regiões promotoras da PCX fusionadas ou não à biotina (lista de primers na tabela 2) e
utilizamos o protocolo da enzima Platinum Taq DNA Polymerase High Fidelity (ThermoFisher,
Pub. no. MAN0000948 Rev. A.0), onde determinamos os seguintes parâmetros: para uma
reação de 25 µL, utilizamos 10X PCR Buffer (2,5 µL), 10 mM dNTP mix (0,5 µL), 10 µM
forward primer (5 µL), 10 µM reverse primer (5 µL), Template DNA (1,75 µL), Platinum Taq
DNA Polymerase (0,1 µL), 50 mM MgCl2 (0,75 µL) e água free RNAse (13,9 µL).
27
PRIMER ESPÉCIE EMPRESA SEQUÊNCIA
Piruvato Carboxilase Camundongo/Rato EXTEND Foward ATCCTCCTCGGCCCCTGTTG
Reverse TCGGAGCAGGACACAGGGCA
PGC1α Camundongo/Rato IDT Forward CAAGCCAAACCAACAACTTTATCTCT
Reverse CACACTTAAGGTTCGCTCAAAAGT
Pdx1 Rato IDT Forward CCTTTCCCGAATGGAACCGA
Reverse TTTTCCACGCGTGAGCTTTG
Ucp2 Rato
IDT
Forward AGCAGTTCTACACCAAGGGC
Reverse TGGAAGCGGACCTTTACCAC
Glut2 Rato IDT Forward TTCAGCAACTGGGTCTGCAA
Reverse AAGAACACGTAAGGCCCGAG
Gpd1 Rato IDT Forward GATAGACGAGGGCCCCAATG
Reverse AGCCAATGGTCGTCTCACAG
Tfam Rato EXTEND Forward CCAAAAAGACCTCGGTCAGC
Reverse GTGACTCATCCTTAGCCCCC
Ascl2 Camundongo EXTEND Forward AGCACACCTTGACTGGTACG
Reverse AGTGGACGTTTGCACCTTCA
Myod1 Camundongo EXTEND Forward CATAGACTTGACAGGCCCCG
Reverse TCTGGTGAGTCGAAACACGG
Myog Camundongo EXTEND Forward GTGCCCAGTGAATGCAACTC
Reverse GCTGTCCACGATGGACGTAA
Mafg Camundongo EXTEND Forward CGAGAGTTGAACCAGCACCT
Reverse GCTCCTCCTTCTGTGTCACC
Nkx2-9 Camundongo EXTEND Forward CCAGACCTTGGAGTTGGAGC
Reverse ACCAGATCTTGACCTGCGTG
Nkx2-3 Camundongo EXTEND Forward AGAGGAGGTTGTGAGCGAAC
Reverse TGAGCTTGCGAGAAGAGCAC
Nr2c2 Camundongo EXTEND
Forward TGGAGCACATCTGGAAGCTG
Reverse GCTTGTGCCTGTCAAACCTG
Nr2f6 Camundongo EXTEND
Forward CTCTTCACGCCTGATGCCT
Reverse GTACTGGGCACGCACATACT
Thap1 Camundongo
EXTEND Forward CTACGACAAGGACAAGCCCG
Reverse TGCCTCCCACTGCTTACAAA
Tcf12 Camundongo
EXTEND Forward CTTCACTCCCTGCAGTCTCG
Reverse TGGCTAGTAGGCAGACTGGT
Sp1 Camundongo
EXTEND Forward CGCACAACTTTCACAGGGTG
Reverse GAGACTGTGCGGTTCTTGGA
Sp2 Camundongo
EXTEND Forward AGGGAGCCGATCAAATGCAA
Reverse CACCTGGATGGTCTGGGAAC
Hnf4g Camundongo
EXTEND Forward CAGGAAAGCACTATGGGGCA
Reverse CAACAACACACTGCCGACTG
Tabela 1. Lista de primers utilizados.
28
Primer Empresa Sequência
PCX1 IDT Forward 5’ TCT TGG CCT GAT CAA TGA TG 3’
Reverse 5’ TTG CAC CAG GAA GAG TAA GG-3’
PCX2 IDT Forward 5’ TGC TCT GCT TCT CTC TCA CCT-3’
Reverse 5’ CTG CAC ACA GAG GAC GTG AT-3’
PCX1 biotina IDT Forward 5’-/5Biosg/TCT TGG CCT GAT CAA TGA TG-3’
Reverse 5’-/5Biosg/TTG CAC CAG GAA GAG TAA GG-3’
PCX2 biotina IDT Forward 5’-/5Biosg/TGC TCT GCT TCT CTC TCA CCT -3’
Reverse 5’-/5Biosg/CTG CAC ACA GAG GAC GTG AT -3’
Tabela 2. Lista de primers utilizados para amplificação dos promotores do gene da PCX.
2.9. Consumo de oxigênio
As células foram mantidas em placas de 6 wells e, após a transfecção, foram
tripsinizadas e centrifugadas a 1000 xg, 25ºC por 5 min. Em seguida, as células foram
ressuspensas em meio Krebs (500 μL) sem albumina e contendo glicose (5,6 mM) em pH 7,3.
O consumo de oxigênio das células foi monitorado em respirômetro (Oroboros Oxygraph-2K).
As células (2x106) foram contadas em câmara de Neubauer e incubadas em câmara fechada
contendo 1,5 mL do meio Krebs. Após estabelecimento da linha de base, glicose (22,2 mM) foi
adicionada para realização dos experimentos.
2.10. Análise de bioinformática
Para encontrar as sequências dos promotores do gene da proteína piruvato
carboxilase e para descobrir as possíveis proteínas que interagem com a seqüência escolhida,
utilizamos o banco de dados de Promotores Eucarióticos (EPD) (Périer et al., 2000). Para essa
análise, o nível de significância considerado foi de p= 0,00001. Esta ferramenta nos permitiu
acessar um conjunto de promotores eucarióticos validados que foram determinados
experimentalmente. Posteriormente, à fim de descobrir a rede de interações e prever funções
dos alvos encontrados no banco de dados EPD, submetemos cada um dos alvos no programa
GeneMANIA (Warde-Farley et al., 2010), e escolhemos Mus Musculus como espécie de
interesse. Os dados gerados por esse programa são baseados em associação funcional,
29
facilitando a busca de novos membros de uma via ou complexo. Além disso, submetemos as
sequências dos promotores PCX1 e PCX2 no programa AliBaba2.1 (Grabe, 2002) para prever
sítios de ligação de possíveis alvos nessas sequências de DNA e comparar se eram semelhantes
aos alvos encontrados no EPD.
2.11. Análise estatística
Os dados estão apresentados como média ± erro padrão da média (EPM) e foram
analisados pelo teste one-way/two-way ANOVA. O teste t de student foi utilizado para
comparação de duas médias, usando o programa Prisma 6.0. O valor p<0,0001 e de p<0,05 foi
adotado para considerar médias estatisticamente diferentes.
30
3. RESULTADOS
3.1. Transfecção de Pdx1 em células beta INS-1E
O co-ativador 1 alfa do receptor ativado por proliferadores de peroxissoma (PGC-1α)
têm sido descrito como um dos mais importantes reguladores do metabolismo oxidativo e do
processo de biogênese mitocondrial em diferentes tecidos, incluindo o músculo esquelético, o tecido
hepático e adiposo ((Dominy and Puigserver, 2013). Através da sua interação com receptores
nucleares, incluindo receptor gama ativado por proliferadores de peroxissoma (PPAR), receptor
relacionado ao receptor de estrogênio (ESRR) e proteínas modificadoras de cromatina como as
histonas acetilases (HAT), o PGC-1α controla o processo de biogênese mitocondrial através da
transcrição de grupos seletos de genes (Sacarpulla, 2008). Porém, não foram identificados estudos
que evidenciem o controle molecular do processo de biogênese mitocondrial em células β
pancreáticas. Nesse sentido, decidimos investigar a expressão do PGC-1α em células com elevada
expressão do fator de trancrição homeobox duodenal e pancreático 1 (PDX1), um conhecido indutor
do processo de diferenciação celular e consequentemente da secreção de insulina. Com este
propósito, células INS-1E foram transfectadas, utilizando-se do plasmídeo que contém o gene do
PDX1, ou plasmídeo vazio como experimento controle (PCMV_GFP). Foram realizadas as análises
da intensidade de fluorescência do GFP e do conteúdo de mRNA do PDX1. Na imagem de
fluorescência, observamos uma boa eficiência de transfecção quando comparamos a imagem das
células transfectadas com vetor vazio (controle) à imagem da célula transfectada com o plasmídeo
PDX1 (painel A, figura 1). Além disso, o conteúdo de tanscrito do PDX1 comprovou essa eficiência,
onde houve um aumento acentuado no conteúdo e na transcrição do PDX1, como indicado nos
paineis B e C, respectivamente. Surpreendentemente, a superexpressão do Pdx1 em células INS-1E,
não induziu aumento na expressão do PGC1α, sugerindo que outros mecanismos possam controlar
molecularmente o processo de biogênese mitocondrial em resposta ao aumento da demanda
energética em células INS-1E. Similarmente, a superexpressão do Pdx1 não induziu o aumento na
expressão dos genes: fator de transcrição mitocondrial A (TFAM) e proteína desacopladora 2
(UCP2). Porém, dois genes que estão associados ao transporte e metabolismo da glicose foram
aumentados nesse modelo: o glicerol-3-fosfato desidrogenase 1 (GPD1) e o transportador de glicose
tipo 2 (GLUT2). Apesar do PGC-1α ser um importante regulador do processo molecular de
biogênese mitocondrial, em células INS-1E ele parece não desempenhar essa função. Dessa forma,
destaca-se a importância de descobrir um alvo novo responsável por esse papel em células beta INS-
1E.
31
Figura 4 – A. Eficiência de transfecção em células INS-1E. Imagem de células controles
transfectadas com vetor vazio e de fluorescência de células transfectadas com o plasmídeo da
Pdx1; B. Conteúdo da proteína Pdx1 dos grupos controle e transfectado com o vetor do PDX1 em
células beta INS-1E; C. Conteúdo de mRNA da PDX1 em células do grupo controle e em células
superexpressando a PDX1. ***p<0,0001 comparado ao grupo controle, n=4; D. Expressão dos
genes: glicerol-3-fosfato desidrogenase 1 (GPD1); fator de transcrição mitocondrial A (TFAM);
proteína desacopladora 2 (UCP2); transportador de glicose tipo 2 (GLUT2); glicose-6-fosfatase
(G6F); co-ativador 1 alfa do receptor ativado por proliferadores de peroxissoma (PGC-1α).
*p<0,05 comparado com o grupo controle, n=4; E. Respiração celular em baixa glicose, alta
glicose, oligomicina e estado desacoplado CCCP.
bactina
Controle Pdx1
32
3.2. Regiões promotoras da PC
Utilizamos o promotor do gene Piruvato Carboxilase (PCX) como “isca”, por ser
um gene muito bem expresso em células β pancreáticas com elevada função secretora de
insulina. Através do banco de dados de alta precisão EPD - Eukaryotic Promoter Database
(Périer et al., 2000), realizamos a busca dos promotores da PCX, selecionando apenas o
organismo Mus Musculus. Os resultados mostraram 2 sequências curtas equivalentes à região -
499 a +100 do promotor 1 e 2 da PCX, respectivamente.
PCX1
Figura 5 – Segmento de sequência curta correspondente à região -499 a +100 do promotor 1
(primário, com maior uso) da piruvato carboxilase (PCX1).
PCX2
Figura 6 – Segmento de sequência curta correspondente à região -499 a +100 do promotor 2
da piruvato carboxilase (PCX2).
33
3.3. Análise in silico utilizando o programa AliBaba2.1
Para prever os sítios de ligação putativos de fatores de transcrição na sequência de
DNA da PCX1 (-499 a +100) e da PCX2 (-499 a +100), também utilizamos o programa
AliBaba2.1. Na sequência da PCX1 e da PCX2, 73 e 55 segmentos foram identificados como
potenciais locais de ligação, respectivamente. As figuras 7A e 7B mostram os alvos que
possuíam pelo menos 2 sítios putativos de ligação nas duas sequências dos promotores da PC.
Figura 7 – Lista dos fatores de transcrição que estão ancorando no DNA da região promotora
1 da PC (PCX1) (painel A) e da região promotora 2 da PC (PCX2) (painel B), respectivamente.
Neurofibromin 1 (NF-1); transcription factor Sp1 (SP1); upstream stimulatory factor (USF);
transcription factor AP-2, alph (AP-2alph); (CP1); cyclic AMP-responsive element-binding
protein 1 (CRE-BP1); CCAAT box-binding transcription factor (CTF); glucocorticoid receptor
(GR); octamer binding transcription factor Oct-1 (Oct-1); CCAAT/enhancer binding protein
(C/EBP), alpha (C/EBPalpha); poly(rC) binding protein 1 (alpha-CP1); nuclear receptor
subfamily 2, group F, member 2 (ARP-1); chorion transcription factor Cf2 type 3(CF2-III);
odd-skipped related transcription factor (Odd); YY1 transcription factor (YY1).
Sp1NF-1
USF
AP-2
alph
CP1
CRE-B
P1CTF
GR
oct-1
0
10
20
30
40
Nú
me
ro d
e s
ítio
s p
uta
tivo
s
PCX1
A.
C/E
BPal
p
alpha-
CP1
ARP-1
CF2-
III
NF-1
Odd
YY1Sp1
Oct
-1
0
5
10
15
Nú
me
ro d
e s
ítio
s p
uta
tiv
os
PCX2
B.
34
3.4. Análise in silico utilizando a base de dados EPD
Ainda utilizando o banco de dados EPD, acessamos a sequência do promotor 2 do
PCX. Esse promotor foi escolhido por ser importante no processo de anaplerose em células β
pancreáticas (Jitrapakdee et al., 1998). Nessa análise, foi possível encontrar os sítios de ligação
putativos de vários fatores de transcrição dos quais foram selecionados os mais significativos
(p=0,00001) e que possuíam mais posições em entradas de sequência de nucleotídeos. A tabela
1, mostra a lista de genes selecionados através deste processo.
SIGLA
NOME
Ascl2 achaete-scute family bHLH transcription
factor 2
Myod1 myogenic differentiation 1
Myog myogenin
Mafg v-maf musculoaponeurotic fibrosarcoma
oncogene factor, protein G
Nkx2-9 NK2 homeobox 9
Nkx2-3 NK2 homeobox 3
Nr2c2 nuclear receptor subfamily 2, group C,
member 2
Nr2f6 nuclear receptor subfamily 2, group F,
member 6
Thap1 THAP domain containing, apoptosis
associated protein 1
Tcf12 transcription factor 12
Sp1 transcription factor Sp1
Sp2 transcription factor Sp2
Hnf4g hepatocyte nuclear factor 4, gamma
Tabela 3 – Siglas e nomes dos alvos que possivelmente estão interagindo com a região
promotora PCX2, nível de significância de p=0,00001.
35
3.5. Cruzamento das análises realizadas no EPD e AliBaba2.1
Comparamos os resultados encontrados tanto no EPD quanto no AliBaba2.1 para
confirmar os possíveis alvos ligantes nos promoters PCX1 e PCX2. Os alvos EGR1, Myod e
Sp1 apareceram nas análises da PCX1 nos dois programas. No entanto, na análise do promotor
PCX2, apenas o alvo SP1 apareceu em comum entre os dois programas utilizados. Esse
resultado sugere fortemente que o alvo SP1 pode estar se ligando na região promotora da PCX2
e pode ser um forte candidato associado ao processo de biogênese mitocondrial em células β
pancreáticas.
Figura 8 – Diagrama de Venn mostrando os genes em comum entre o programa AliBaba2.1 e
a base de dados EPD das sequências promotoras PCX1 e PCX2, respectivamente. Early Growth
Response 1 (EGR1); Myogenic Differentiation 1 (MyoD); transcription factor 1 (SP1).
PCX1 PCX2
36
3.6. Redes de interações dos alvos encontrados na PCX2
Para acessar a rede de interações preditas de cada alvo encontrado no EPD,
realizamos uma análise in silico, através da plataforma Gene Mania. Os resultados dos alvos
mostraram informações, como: expressão gênica; interação proteína-proteína; interação
genética; domínio de proteína; e vias. Além disso, os dados também revelaram proteínas
encontradas no mesmo local, genes expressos no mesmo tecido, e relações funcionais previstas
entre genes. Dentre essas redes, podemos destacar algumas interações interessante dos alvos
encontrados no EPD, como: interação do alvo SP1 com Hdac1 e com Rxrα (figura 9.1 A);
interação do alvo Nr2c2 com Rxrβ e com Foxo1 (figura 9.1 B); e interação do alvo Hnf4g com
Esrrg (figura 9.1 C).
37
Figura 9 – Rede de interações preditas dos alvos encontrados no EPD no organismo Mus
Musculus, retirado do servidor Gene Mania, mostrando a rede de interações físicas e genéticas,
co-expressão, vias, relações funcionais preditas entre genes, co-localização e similaridade de
domínios proteicos. A) achaete-scute family bHLH transcription factor 2 (ASCL2); B)
hepatocyte nuclear factor 4, gamma (HNF4G); C) Sp2 transcription factor (SP2); D)
transcription factor 12 (TCF12); E) nuclear receptor subfamily 2, group F, member 6 (NR2F6);
F) nuclear receptor subfamily 2, group C, member 2 (NR2C2); G) NK2 homeobox 3 (NKX2-
3); H) myogenin (MYOG); I) myogenic differentiation 1 (MYOD1); J) THAP domain
containing, apoptosis associated protein 1 (THAP1); K) v-maf musculoaponeurotic
fibrosarcoma oncogene family, protein G (MAFG); L) transcription factor 1 (SP1). Obs.: Figura
mais legível no Anexo III.
38
Figura 9.1 – Rede de interações preditas dos alvos Sp1, Nr2c2 e Hnf4g encontrados no EPD
no organismo Mus Musculus, retirado do servidor Gene Mania, mostrando a rede de interações
físicas e genéticas, co-expressão, vias, relações funcionais preditas entre genes, co-localização
e similaridade de domínios proteicos. A) histone deacetylase 1 (HDAC1), retinoid x receptor
alpha (RXRα); B) retinoid x receptor beta (RXRβ), forkhead box protein o1 (FOXO1); C)
estrogen related receptor gamma (ESRRG).
39
3.7. Interações entre os alvos encontrados na PCX2
A plataforma GeneMania também foi utilizada para confirmar as interações
existentes entre o grupo de genes encontrados, como demonstra a figura abaixo. Observamos
que o percentual mais elevado de interações foi o de similaridade de domínios proteicos,
mostrando que dois produtos de genes estão vinculados por possuírem o mesmo domínio
protéico.
A.
B.
0 10 20 30 40
Shared protein domains
Co-expression
Predicted
Co-localization
Other
Networks (%)
Figura 10 – A. Rede de interações preditas entre os alvos encontrados no EPD no organismo
Mus Musculus, retirado do servidor Gene Mania, mostrando a rede de interações físicas e
genéticas, co-expressão, relações funcionais preditas entre genes, co-localização e similaridade
40
de domínios proteicos; B. Gráfico comprovando o percentual da rede de interações entre os
alvos.
3.8. Análise do enriquecimento de promotores de genes associados ao processo de biogênese
mitocondrial
Através do servidor UCSC Genome Browser, acessamos o genoma humano (Human
GRCh19) e realizamos a análise de genes relacionados ao controle e função mitocondrial,
verificando sua possível ocupação com os nossos alvos de interesse. Os seguintes genes
mitocondriais foram selecionados para essa análise: NRF1, PPARGC1A, TFAM, ESSRA e
NCOR1. De acordo com os dados do projeto ENCODE, observamos que os alvos TCF12, THAP1,
SP1, HNF4g, NR2C2 se ligam nas regiões promotoras dos genes mitocondriais, confirmando a
hipótese de que nossos alvos podem estar associados com o processo de controle e função
mitocondrial. Destacamos, ainda, a similaridade de sequência nos sítios de ligação das espécies
Mus musculus, Rattus norvegicus e Homo sapiens, indicando que estes mesmos alvos podem atuar
nas outras duas espécies.
A.
B.
41
C.
D.
E.
Figura 11. Ocupação das regiões promotoras dos genes mitocondriais Nuclear respiratory
factor 1 (NRF1), PPARG coactivator 1 alpha (PPARGC1A), Mitochondrial Transcription
factor A (TFAM), Estrogen-related receptor alpha (ESSRA) e Nuclear receptor corepressor 1
(NCOR1) pelos alvos TCF12, THAP1, SP1, HNF4g, NR2C2. A primeira linha indica o gene
observado em azul; a segunda linha Layered H3K27Ac: nível de acetilação da lisina 27 da
histona H3 em diferentes tipos celulares; terceira linha: locais de interação dos alvos;
alinhamento entre as sequências de humano e murinos.
42
3.9. Secreção de insulina em linhagem de células MIN6
Para confirmar se linhagem de células utilizadas estavam funcionais, analisamos a
secreção de insulina estimulada por glicose de células MIN6 na passagem 48 através de
radioimunoensaio. Podemos observar que, de fato, quando estimuladas com alta concentração
de glicose (16.6 mM) essas células secretam mais insulina, comparando com o grupo que foi
submetido à baixa concentração de glicose (2.8 mM).
2.
8mM
16.6
mM
0.0
0.2
0.4
0.6
0.8
1.0
***
Secre
cao
de In
su
lin
a (
ng
/mL
)
Figura 12 – Secreção estática de insulina de células MIN6 na passagem 48, estimuladas por 1h
com 2,8mM e 16,6 de glicose. As barras representam a média ± SD ***p<0,05 comparado com
o grupo controle (2,8mM); n=8.
43
3.10. Expressão de mRNAs dos respectivos alvos encontrados no EPD em linhagem de
células MIN6
Avaliamos a transcrição dos alvos encontrados (banco de dados EPD) durante
ensaio de secreção de insulina sob condições de baixa e elevada oferta de glicose em células da
linhagem MIN6. As alterações na expressão destes genes sugerem papeis importantes destes
alvos durante o processo de secreção de insulina, indicando que o aumento significativo na
expressão dos genes Thap1, Nr2f6, Tcf12, Nr2c2, Mafg bem como a redução dos genes Sp2,
Mafg, Nkx2-3, possam estar diretamente associados ao processo de controle molecular da
função mitocondrial e consequentemente de secreção de insulina em células MIN6.
Figura 13 – Expressão de mRNAs dos alvos encontrados no software EPD. O ensaio foi
realizado em meio DMEN contendo baixa (5.6mM) e elevada (25mM) oferta de glicose em
linhagem de células MIN6. Genes: achaete-scute family bHLH transcription factor 2 (ASCL2);
myogenic differentiation 1 (MYOD1); myogenin (MYOG); v-maf musculoaponeurotic
fibrosarcoma oncogene family, protein G (MAFG); NK2 homeobox 9 (NKX2-9); NK2
homeobox 3 (NKX2-3); nuclear receptor subfamily 2, group C, member 2 (NR2C2); nuclear
receptor subfamily 2, group F, member 6 (NR2F6); THAP domain containing, apoptosis
associated protein 1 (THAP1); transcription factor 12 (TCF12); transcription factor 1 (SP1);
44
Sp2 transcription factor (SP2); hepatocyte nuclear factor 4, gamma (HNF4G). *p<0,05
comparado com o grupo controle, n=3.
45
3.11. Amplificação dos promotores da PC fusionados à biotina
Paralelo às análises de bioinformática e funcionais, sintetizamos os promotores do
gene da PCX sem biotina e fusionados à biotina. Em seguida, amplificamos esses
oligonucleotídeos para posteriormente transfectar esses promotores em células de linhagem
MIN6 e realizar um ensaio de imunoprecipitação (ChiP) a fim de descobrir se as proteínas
encontradas nesse ensaio foram as mesmas descobertas nas análises de bioinformática. A
amplificação dos oligos sem biotina foi satisfatória, como demonstrada na figura 14 – A. No
entanto, ainda precisamos realizar mais testes em busca das condições ideais de amplificação
dos oligos contendo biotina, pois em nossas tentativas não observamos o resultado esperado
(figura 14 – B).
Figura 14 – A) Comprovação do PCR mostrando a amplificação dos promotores PCX1 e PCX2
sem biotina. B) Testes de PCR de amplificação dos oligos contendo biotina.
Ladder
Primers com biotina
- - F - - R F R
2kbp
1kbp
A.
B.
2kbp
1kbp
PCX1 PCX2
46
4. DISCUSSÃO
O principal achado deste estudo foi a identificação de possíveis alvos com potencial
para regular o processo de biogênese mitocondrial em células β pancreáticas. Embora, nos
tecidos periféricos esteja bem estabelecido o papel do co-ativador de PPAR (PGC1α) nesse
controle aumentando a função mitocondrial, em células β, surpreendentemente, esse co-
ativador foi claramente associado com redução da função mitocondrial, indicando que esse
controle ainda é desconhecido nesse tecido. Como evidenciado anteriormente, a infecção de
células β com adenovirus contendo o gene de expressão do PGC1α, resultou em prejuízo da
secreção de insulina estimulada por glicose, um efeito consistente com redução da expressão
dos genes da glicose-6-fosfatase, do GLUT2, da glicokinase e da glicerol-3-fosfato
desidrogenase, importantes para a secreção de insulina. É importante observamos ainda que, a
superexpressão do fator de transcrição PDX1, reduziu a expressão gênica do PGC1α em células
INS-1E. Desse modo o Pdx1 parece ser um importante regulador do TFAM. Os achados
indicam que o silenciamento do Pdx1 resultou na diminuição de TFAM em células β
pancreáticas de camundongos transfectados com TFAM. Portanto, sugerem que o PGC1α, pelo
menos em células β pancreáticas, parece não exercer controle sobre o processo de biogênese
mitocondrial. Apesar do seu papel bem estabelecido no desenvolvimento da célula β, não
encontramos nenhuma diferença significativa no consumo de oxigênio das células transfectadas
com Pdx1, comparadas com o grupo controle.
Como principal estratégia neste estudo, utilizamos a região promotora do gene que
expressa a proteína piruvato carboxilase (PCX) como “isca”, na busca por alvos moleculares
que possam regular o processo de biogênese/função mitocondrial e, consequentemente, a
secreção de insulina em células β pancreáticas. Vale ressaltar que a PC induz anaplerose com
extrema eficiência metabólica, pois sua expressão é muito alta em células betas saudáveis,
catalisando a carboxilação do piruvato em oxaloaceato e favorecendo a secreção de insulina
estimulada por glicose (Jitrapakdee et al., 1998; Xu et al., 2008).
Além disso, a PC também tem uma participação importante nos eventos de
progressão do DM2, doença caracterizada pelos elevados níveis de glicose e ácidos graxos
livres que resultam na perda de célula β (Poitout and Robertson, 2008). Quando essa célula é
submetida à condições de hiperglicemia e hiperlipidemia ocorre uma redução de várias enzimas
respiratórias mitocondriais, como por exemplo, a piruvato carboxilase (Lu et al., 2010). O
fornecimento insuficiente de combustível para o ciclo de TCA mitocondrial através do
47
tratamento de células beta com ácido fenilacético/ etomoxir é capaz de induzir principalmente
morte apoptótica, e a toxicidade gerada nesse tratamento é similar à glicolipotoxicidade
induzida por um tratamento com alta glicose/ palmitato. Com o combustível e metabolismo de
oxidação nas mitocôndrias comprometidos, pode ocorrer sinais de morte tanto pela ativação do
estresse oxidadtivo, quanto do estresse do retículo endoplasmático (Lee et al., 2014), que está
associado à lipotoxicidade induzida por palmitato ou à glicolipotoxicidade induzida por alta
glicose/palmitato (Cunha et al., 2008).
O gene da PC possui uma região promotora proximal e uma região promotora
distal. Enquanto a proximal é ativa em tecidos gliconeogênicos e no adipócito, a região distal
está diretamente associada ao controle do processo de anaplerose. Baseados nesse princípio,
utilizamos a base de dados de Promotores Eucarióticos (EPD) (Périer et al.,2000) e foi possível
identificar sítios putativos para ligação de fatores de transcrição na sequência PCX1 (-499 a
+100) e PCX2 (-499 a +100) na região promotora. As análises revelaram grande quantidade de
sítios putativos para ligação das proteínas Arnt, hif1a; Arnt; E2f6; Egr1; Ehf; Elf3; Elk4; Etv6;
Glis1; Gabpa; Hes5; Hes7; Hey2; Hes2; Insm1; Mzf1; Mlxip; Myod1; Myog; Nfya; Nfyb;
Nhlh1; Npas2; Runx2; Runx3; Sp1; Sp2; Tcf21; Znf354c; Zfx na sequência PCX1 e ligação
das proteínas Thap1; Nr2f6; Tcf12; Nr2c2; Sp2; Mafg; Nkx2-9; Sp1; Hnf4g; Nkx2-3; Myod1;
Myog; Ascl2 na sequência PCX2. Similarmente, utilizamos o software AliBaba2.1 e foi
possível identificar sítios putativos de ligação das proteínas Sp1; Nf-1; Usf; Gr; Oct-1; Cre-
bp1; Cp1; Ctf; Ap-2alph na sequência PCX1 e ligação das proteínas Sp1; Nf-1; C/ebpalp;
alpha-CP1; Arp-1; Odd; Cf2-III; Oct-1; Yy1 na sequência PCX2. Um fato interessante, foi a
detecção do fator de transcrição Sp1 em ambos softwares no promotor PCX2. Esse resultado
indica fortemente que o alvo SP1 realmente se liga na região promotora da PCX2 e pode ser
um forte candidato associado ao processo de biogênese mitocondrial em células β pancreáticas.
Como revisado por (Samson and Wong, 2002), o Sp1 possui atividade modificada pelo seu
estado de fosforilação em resposta à uma série de sinais, portanto, esse fator de transcrição
desempenha papel fundamental mediando cross-talk entre as vias de sinalização e transcrição
gênica. Apesar de ser responsável por esse papel, o Sp1 possui efeitos positivos ou negativos,
dependendo da região do promotor em que se liga. Um fato interessante constatado foi a
detecção deste alvo tanto na região promotora proximal (CCAAT/-65/-61) quanto na região
promotora distal (CCAAT/-95/-91) do gene PCX, indicando um amplo e complexo papel desse
fator de transcrição no controle da expressão do gene PCX.
É importante observarmos ainda, pelas análises de interactoma, que nas interações
existentes entre o grupo de genes alvos encontrados na região promotora PCX2, houve
48
percentual mais elevado de similaridade de domínios proteicos, mostrando que dois produtos
de genes estão vinculados por possuírem o mesmo domínio protéico. Esse achado sugere que
os domínios dessas proteíans possuem estruturas parecidas ou são oriundos de genes homólogos
e, dessas forma, podem estar envolvidos em processos similares, ou ainda desempenhar funções
semelhantes. No estudo em questão, acreditamos que esses alvos podem participar do controle
do processo de biogênese mitocondrial.
Nessa investigação, o embasamento da hipótese reside em algumas interações
físicas de alvos que participam de vias relevantes, a exemplo do Nr2c2, que possui interação
com Rxrb (Retinoid X Receptor Beta) e Foxo1, gene que desempenha um papel importante no
crescimento e diferenciação miogênica. O Sp1 possui interação predita com Rxrα (Retinoid X
Receptor Alpha), que está associado ao controle da transcrição de genes da fosforilação
oxidativa (OXPHOS); além disso, a superexpressão de Rxrα pode atenuar a resistência à
insulina (Lee et al., 2015). Outra interação relevante foi a de Hnf4g com Esrrg (Estrogen
Related Receptor Gamma), um gene que já foi reportado na literatura como responsável pela
modulação da produção celular e sinalização de estrogênio no câncer de mama (Ijichi et al.,
2011).
Como validação do papel do Sp1 regulando a expressão do gene PCX, realizamos
ainda as análises de Chip-Seq (servidor UCSC Genome Browser) de genes já estabelecidos e
diretamente associados ao processo de biogênese de mitocôndrias, incluindo o NRF1,
PPARGC1A, TFAM, ESSRA e NCOR1. O Sp1, notavelmente, foi identificado nos promotores
de NRF1, PPARGC1A, TFAM, ESSRA e NCOR1, com indícios significativos de que este
enriquecimento do Sp1 nesses promotores pode constituir-se de um importante regulador do
processo de biogênese mitocondrial em células β pancreáticas. Apesar das análises de
bioinformática apontarem para a indicação do Sp1, as análises de expressão gênica em células
MIN6, estimuladas com glicose 5.6 e 25 mM, revelaram um aumento significativo na expressão
dos genes Thap1, Nr2f6, Tcf12, Nr2c2 e redução na expressão do Sp1, Hnf4g e Nkx2-3. No
entanto, nenhuma análise proteica dos níveis de expressão do Sp1 foi até o presente momento
realizada.
Para validação destes experimentos, amplificamos o promotor PCX2 sem biotina e
nosso próximo passo será amplificar esse promotor ligado à biotina para transfectá-lo nas
células MIN6 e, coletar o extrato nuclear das células transfectadas para posterior análise de
imunoprecipitação, a fim de encontrar os alvos detectados na bioinformática e nos
experimentos funciona
49
5. CONCLUSÕES
Mostramos que proteínas que interagem com o promotor distal da PC podem ser
possíveis alvos relacionados ao controle da função e biogênese mitocondrial e, portanto, da
secreção de insulina em células pancreáticas MIN6. Em especial, nossos achados são bastante
significativos por indicarem o Sp1 como um importante fator de transcrição com potencial para
regular o processo de biogênese mitocondrial em células β-pancreática. O estudo dos
mecanismos moleculares envolvidos na proteção das células β contra a falha da função
mitocondrial/secreção de insulina, certamente, trará informações importantes na busca de novas
moléculas com potencial terapêutico, capazes de melhorar a função e sobrevivência das células
produtoras de insulina. O conhecimento do mecanismo pelo qual esses alvos regulam a função
mitocondrial certamente poderá abrir novas perspectivas terapêuticas no controle da disfunção
mitocondrial em células β e o consequente desenvolvimento DM2.
50
6. Referências Bibliográficas
Bradford M. 1976. A rapid and sensitive method for the quantitation of microgram quantities
of protein utilizing the principle of protein-dye binding. Analytical Biochemistry 7(72):
248–254.
Cabrera O, Berman DM, Kenyon NS, Ricordi C, Berggren PO, Caicedo A. 2006. The unique
cytoarchitecture of human pancreatic islets has implications for islet cell function.
Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America
103(7):2334-2339.
Cunha DA., Hekerman P, Ladriere L, Bazarra-Castro A, Ortis F, Wakeham MC, Moore F,
Rasschaert J, Cardozo AK, Bellomo E, Overbergh L, Mathieu C, Lupi R, Hai T,
Herchuelz A, Marchetti P, Rutter GA, Eizirik DL, Cnop M. 2008. Initiation and
execution of lipotoxic ER stress in pancreatic beta-cells. J. Cell. Sci. 121, 2308–2318.
DeFronzo RA, Ferrannini E. 1991. Insulin resistance. A multifaceted syndrome responsible for
NIDDM, obesity, hypertension, dyslipidemia, and atherosclerotic cardiovascular
disease. Diabetes care 14(3):173-194.
Dominy JE and Puigserver P. 2013. Mitochondrial biogenesis through activation of nuclear
signaling proteins. Cold Spring Harbor Perspectives in Biology 5(7): a015008.
Edlund H. 1998. Transcribing pancreas. Diabetes 47(12):1817-1823.
Feige JN and Auwerx J. 2007. Transcriptional coregulators in the control of energy
homeostasis. Trends in Cell Biology 17(6):292-301.
Fransson U, Rosengren AH, Schuit FC, Renström E, Mulder H. 2006. Anaplerosis via pyruvate
carboxylase is required for the fuel-induced rise in the ATP:ADP ratio in rat pancreatic
islets. Diabetologia 49(7):1578-86.
Fu Z, Gilbert ER, Liu D. 2013. Regulation of insulin synthesis and secretion and pancreatic
Beta-cell dysfunction in diabetes. Current diabetes reviews 9(1):25-53.
Gao T, McKenna B, Li C, Reichert M, Nguyen J, Singh T, Yang C, Pannikar A, Doliba N,
Zhang T, Stoffers DA, Edlund H, Matschinsky F, Stein R, Stanger BZ. 2014. Pdx1
maintains beta cell identity and function by repressing an alpha cell program. Cell
metabolism 19(2):259-271.
Gao T, Zhou D, Yang C, Singh T, Penzo-Mendez A, Maddipati R, Tzatsos A, Bardeesy N,
Avruch J, Stanger BZ. 2013. Hippo signaling regulates differentiation and maintenance
in the exocrine pancreas. Gastroenterology 144(7):1543-1553, 1553.e1541.
51
Gauthier BR, Wiederkehr A, Baquie M, Dai C, Powers AC, Kerr-Conte J, Pattou F, MacDonald
RJ, Ferrer J, Wollheim CB. 2009. PDX1 deficiency causes mitochondrial dysfunction
and defective insulin secretion through TFAM suppression. Cell metabolism 10(2):110-
118.
Grabe N. 2002. AliBaba2.1: context specific identification of transcription factor binding sites.
In Silico Biology 2(1):S1-15.
Hunter CS, Stein RW. 2017. Evidence for Loss in Identity, De-Differentiation, and Trans-
Differentiation of Islet beta-Cells in Type 2 Diabetes. Frontiers in genetics 8:35.
Ijichi N, Shigekawa T, Ikeda K, Horie-Inoue K, Fujimura T, Tsuda H, Osaki A, Saeki T, Inoue
S. 2011. Estrogen-related receptor gamma modulates cell proliferation and estrogen
signaling in breast cancer. The Journal of Steroid Biochemistry and Molecular Biology
123(1-2): 1–7.
Jensen MV, Joseph JW, Ronnebaum SM, Burgess SC, Sherry AD, Newgard CB. 2008.
Metabolic cycling in control of glucose-stimulated insulin secretion. American journal
of physiology Endocrinology and metabolism 295(6):E1287-1297.
Jitrapakdee S, Gong Q, MacDonald MJ, Wallace JC. 1998. Regulation of rat pyruvate
carboxylase gene expression by alternate promoters during development, in genetically
obese rats and in insulin-secreting cells. Multiple transcripts with 5'-end heterogeneity
modulate translation. The Journal of biological chemistry 273(51):34422-34428.
Kahn SE, Hull RL, Utzschneider KM. 2006. Mechanisms linking obesity to insulin resistance
and type 2 diabetes. Nature 444(7121):840-846.
Kelly DP and Scarpulla RC. 2004. Transcriptional regulatory circuits controlling mitochondrial
biogenesis and function. Genes & Development 15;18(4):357-68.
Kent WJ, Sugnet CW, Furey TS, Roskin KM, Pringle TH, Zahler AM, Haussler D. 2002. The
human genome browser at UCSC. Genome Research 12(6):996-1006.
Klingenberg M, Rottenberg H. 1977. Relation between the gradient of the ATP/ADP ratio and
the membrane potential across the mitochondrial membrane. Eur J Biochem 73:125–
130.
Kulkarni RN. 2004. The islet beta-cell. The international journal of biochemistry & cell biology
36(3):365-371.
Lee J, Jung I, Choi S, Lee S, Lee SJ, Han SJ, Kim HJ, Kim DJ, Lee K, Kang Y. 2014. Toxicity
generated through inhibition of pyruvate carboxylase and carnitine palmitoyl
transferase-1 is similar to high glucose/palmitate-induced glucolipotoxicity in INS-1
beta cells. Molecular and Cellular Endocrinology 383 (2014) 48–59.
52
Lee SE, Koo YD, Lee JS, Kwak SH, Jung HS, Cho TM, Park YJ, Chung SS, Park KS. 2015.
Retinoid x receptor α overexpression alleviates mitochondrial dysfunction-induced
insulin resistance through transcriptional regulation of insulin receptor substrate.
Molecules and Cells 38(4): 356–361.
Li P, Fan W, Xu J, Lu M, Yamamoto H, Auwerx J, Sears DD, Talukdar S, Oh D, Chen A,
Bandyopadhyay G, Scadeng M, Ofrecio JM, Nalbandian S, Olefsky JM. 2011.
Adipocyte NCoR knockout decreases PPARγ phosphorylation and enhances PPARγ
activity and insulin sensitivity. Cell. 11;147(4):815-26.
Liu YQ, Jetton TL and Leahy JL. 2002. β-cell adaptation to insulin resistance - Increased
pyruvate carboxylase and malate-pyruvate shuttle activity in islets of nondiabetic zucker
fatty rats. The Journal of Biological Chemistry 277, 39163-39168.
Lu H, Koshkin V, Allister EM., Gyulkhandanyan AV, Wheeler MB. 2010. Molecular and
metabolic evidence for mitochondrial defects associated with beta-cell dysfunction in a
mouse model of type 2 diabetes. Diabetes 59,448–459.
MacDonald MJ, Longacre MJ, Langberg EC, Tibell A, Kendrick MA, Fukao T, Ostenson CG.
2009. Decreased levels of metabolic enzymes in pancreatic islets of patients with type
2 diabetes. Diabetologia 52(6):1087-1091.
Madla A. Passos et.al., 2018. Pyruvate carboxylase overexpression induces metabolic shift and
improvement of mitochondrial function through increase on NAD+/NADH ratio.
Manuscrito submetido a revista Biochimica et Biophysica Acta.
Martin CC, Oeser JK, O'Brien RM. 2004. Differential regulation of islet-specific glucose-6-
phosphatase catalytic subunit-related protein gene transcription by Pax-6 and Pdx-1.
The Journal of biological chemistry 279(33):34277-34289.
McKnight SL, Lane MD, Gluecksohn-Waelsch S. 1989. Is CCAAT/enhancer-binding protein
a central regulator of energy metabolism? Genes & development 3(12b):2021-2024.
Menefee AL, Zeczycki TN. 2014. Nearly 50 years in the making: defining the catalytic
mechanism of the multifunctional enzyme, pyruvate carboxylase. The FEBS journal
281(5):1333-1354.
Newgard CB. 2002. While tinkering with the beta-cell...metabolic regulatory mechanisms and
new therapeutic strategies: American Diabetes Association Lilly Lecture, 2001.
Diabetes 51(11):3141-3150.
Périer RC, Praz V, Junier T, Bonnard C, Bucher P. 2000. The eukaryotic promoter database
(EPD) Nucleic Acids Research 28(1):302–303.
53
Poitout V, Robertson RP. 2008. Glucolipotoxicity: fuel excess and beta-cell dysfunction.
Endocrine Reviews. 29, 351–366.
Samson SL, Wong NC. 2002. Role of Sp1 in insulin regulation of gene expression. Journal of
molecular endocrinology 29(3):265-279.
Seidell JC. 2000. Obesity, insulin resistance and diabetes--a worldwide epidemic. The British
journal of nutrition 83 Suppl 1:S5-8.
Silva JP, Kohler M, Graff C, Oldfors A, Magnuson MA, Berggren PO, Larsson NG. 2000.
Impaired insulin secretion and beta-cell loss in tissue-specific knockout mice with
mitochondrial diabetes. Nature genetics 26(3):336-340.
Scarpulla RC. 2008. Transcriptional paradigms in mammalian mitochondrial biogenesis and
function. Physiolical Reviews 88(2): 611–638
Towbin H, Staehelin T, Gordon J. 1979. Electrophoretic transfer of proteins from
polyacrylamide gels to nitrocellulose sheets: procedure and some applications.Proc Natl
Acad Sci U S A. 76(9):4350-4.
Thonpho A, Rojvirat P, Jitrapakdee S, MacDonald MJ. 2013. Characterization of the distal
promoter of the human pyruvate carboxylase gene in pancreatic beta cells. PloS one
8(1):e55139.
Wang H, Maechler P, Ritz-Laser B, Hagenfeldt KA, Ishihara H, Philippe J, Wollheim CB.
2001. Pdx1 level defines pancreatic gene expression pattern and cell lineage
differentiation. The Journal of biological chemistry 276(27):25279-25286.
Xu J, Han J, Long YS, Epstein PN, Liu YQ. 2008. The role of pyruvate carboxylase in insulin
secretion and proliferation in rat pancreatic beta cells. Diabetologia 51(11):2022-2030.
Yoon JC, Xu G, Deeney JT, Yang SN, Rhee J, Puigserver P, Levens AR, Yang R, Zhang CY,
Lowell BB, Berggren PO, Newgard CB, Bonner-Weir S, Weir G, Spiegelman BM.
2003. Suppression of beta cell energy metabolism and insulin release by PGC-1alpha.
Developmental cell 5(1):73-83.
Yu C, Markan K, Temple KA, Deplewski D, Brady MJ and Cohen RN. 2005. The nuclear
receptor corepressors NCoR and SMRT decrease reroxisome proliferator-activated
receptor γ transcriptional activity and repress 3T3-L1 adipogenesis.The Journal of
Biological Chemistry 280, 13600-13605.
Zhang CY, Baffy G, Perret P, Krauss S, Peroni O, Grujic D, Hagen T, Vidal-Puig AJ, Boss O,
Kim YB, Zheng XX, Wheeler MB, Shulman GI, Chan CB, Lowell BB. 2001.
Uncoupling protein-2 negatively regulates insulin secretion and is a major link between
obesity, beta cell dysfunction, and type 2 diabetes. Cell 105(6):745-755.
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ANEXO I
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ANEXO II
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ANEXO III
Rede de interações dos alvos – imagens do GeneMania
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