UNIVERSIDADE ESTADUAL DE CAMPINAS INSTITUTO DE ......GUSTAVO HENRIQUE BUENO DUARTE, aprovada pela...

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UNIVERSIDADE ESTADUAL DE CAMPINAS INSTITUTO DE QUÍMICA

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GUSTAVO HENRIQUE BUENO DUARTE �

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METABOLÔMICA POR LC-ESI-QTOF-MS EM PLASMA DE CAMUNDONGOS NOD/SCID SOB TRATAMENTO QUIMIOTERÁPICO: POTENCIAIS

BIOMARCADORES DE LEUCEMIA

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CAMPINAS 2016

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GUSTAVO HENRIQUE BUENO DUARTE

METABOLÔMICA POR LC-ESI-QTOF-MS EM PLASMA DE CAMUNDONGOS NOD/SCID SOB TRATAMENTO QUIMIOTERÁPICO: POTENCIAIS

BIOMARCADORES DE LEUCEMIA

Dissertação de Mestrado apresentada ao Instituto de

Química da Universidade Estadual de Campinas como

parte dos requisitos exigidos para a obtenção do título

de Mestre em Química na área de Química Analítica

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Orientador: Prof. Dr. Marcos Nogueira Eberlin

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ESTE EXEMPLAR CORRESPONDE À VERSÃO FINAL DA DISSERTAÇÃO DEFENDIDA PELO ALUNO GUSTAVO HENRIQUE BUENO DUARTE, E ORIENTADA PELO PROF. DR. MARCOS NOGUEIRA EBERLIN.

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CAMPINAS 2016

Agência(s) de fomento e nº(s) de processo(s): CAPES

Ficha catalográfica

Universidade Estadual de Campinas

Biblioteca do Instituto de Química

Camila Barleta Fullin - CRB 8462

Duarte, Gustavo Henrique Bueno, 1989-

D812m DuaMetabolômica por LC-ESI-QTOF-MS em plasma de camundongos

NOD/SCID sob tratamento quimioterápico : potenciais biomarcadores de

leucemia / Gustavo Henrique Bueno Duarte. – Campinas, SP : [s.n.], 2016.

DuaOrientador: Marcos Nogueira Eberlin.

DuaDissertação (mestrado) – Universidade Estadual de Campinas, Instituto de

Química.

Dua1. Metabolômica. 2. Leucemia linfóide aguda. 3. LC-ESI-QTOF-MS. I.

Eberlin, Marcos Nogueira,1959-. II. Universidade Estadual de Campinas.

Instituto de Química. III. Título.

Informações para Biblioteca Digital

Título em outro idioma: Metabolomics by LC-ESI-QTOF-MS in NOD/SCID mice under

chemoterapy treatment : potential biomarkers of leukemia

Palavras-chave em inglês:Metabolomics

Acute lymphoblastic leukemia

LC-ESI-QTOF-MS

Área de concentração: Química Analítica

Titulação: Mestre em Química na área de Química Analítica

Banca examinadora:Marcos Nogueira Eberlin [Orientador]

Ana Valéria Colnaghi Simionato Cantú

Thaís Regiani Cataldi

Data de defesa: 07-07-2016

Programa de Pós-Graduação: Química

BANCA EXAMINADORA

Prof. Dr. Marcos Nogueira Eberlin (Orientador)

Profa. Dra. Thaís Regiani Cataldi (ESALQ-USP)

Profa. Dra. Ana Valéria Colnaghi Simionato Cantú (IQ-UNICAMP)

A Ata da defesa com as respectivas assinaturas dos membros encontra-se no processo de

vida acadêmica do(a) aluno(a).

Este exemplar corresponde à redação final da

Dissertação de Mestrado defendida pelo aluno

GUSTAVO HENRIQUE BUENO DUARTE, aprovada

pela Comissão Julgadora em 07 de julho de 2016.

AGRADECIMENTOS

Em primeiro lugar agradeço à minha família, meu pai, Célio, minha mãe,

Darlene e o meu irmão, Leonardo por sempre me apoiar em todas as etapas dessa

jornada, me amparar nos momentos difíceis e por acreditar em mim em momentos

onde nem mesmo eu acreditava; sem esse apoio todo eu jamais conseguiria nem

mesmo sair do lugar.

Agradeço imensamente ao meu orientador, Prof. Dr. Marcos Nogueira

Eberlin pela confiança em abrir as portas e me acolher junto ao seu laboratório e ao

seu grupo de pesquisas em um momento tão delicado pelo qual eu passava na

época; por compartilhar de todo o seu conhecimento, e por me deixar à vontade

para usufruir de toda a estrutura sem igual do laboratório ThoMSon.

Devo muito tanto aos colegas que me ajudaram de uma maneira mais

efetiva na execução deste trabalho, principalmente o Vinícius, Rosy, Gilberto,

Eduardo; quanto aos colegas Jandyson, Renan, Fabinho, José, Célio, Núbia, Javier,

Andréia, Roberta Rosana, Regina, Dena, Dani, Damila, Ana Carol, Adriana, Anna,

Almas, Almir, Lú, Deleon, Bas e muitos outros, pelos ensinamentos compartilhados e

por tornar o ambiente do laboratório muito mais familiar e descontraído. De forma

alguma me esqueceria da Dona Cida que sempre mantém o laboratório em ordem e

em condições para que todos os alunos possam desempenhar o seu trabalho da

melhor maneira possível.

Agradeço à banca examinadora que participou do exame de qualificação,

Profa Dra Alessandra Sussulini e Profa Dra Ana Valéria Colnaghi Simionatu Cantú

pela valiosa contribuição a este trabalho. E também a banca examinadora desta

defesa pela disponibilidade em estar presente e pela contribuição na qualidade do

trabalho

RESUMO

A metabolômica é uma abordagem analítica recente que visa à análise de

metabólitos endógenos e exógenos presentes em amostras biológicas. A

metabolômica pode ser aplicada em diversas áreas, inclusive na busca de

biomarcadores para doenças. A Leucemia Linfóide Aguda (LLA) é o tipo de câncer

pediátrico mais comum, e grande parte das pesquisas em metabolômica nesta área

restringem-se à cultura de células. Nesse trabalho foi otimizado um método de

análise metabolômica por LC-ESI-QTOF-MS para a obtenção do fingerprinting

metabólico. Em seguida, o método otimizado foi aplicado em um estudo de interesse

da área oncológica avaliando o perfil de metabólitos endógenos em plasma de

camundongos da linhagem NOD/SCID comparando-se grupos saudáveis, com LLA,

e com LLA que receberam tratamento quimioterápico composto por vincristina,

dexametasona e asparaginase. Os dados obtidos foram submetidos à validação

cruzada com o propósito de avaliar a eficiência do método na classificação de cada

um dos grupos estudados. Na etapa de otimização do método de metabolômica,

inicialmente foram testadas diferentes abordagens metodológicas e os resultados

destas abordagens foram comparados entre si, e avaliou-se a melhor abordagem de

acordo com o número de íons detectados por cada uma delas. Precipitação de

Proteínas e precipitação de proteínas com posterior separação de fases foram

testados como preparos de amostra. Ainda nos testes de abordagens metodológicas

foram utilizadas duas colunas cromatográficas diferentes, uma C18 e uma C18

Hydro. Depois, o método otimizado foi aplicado aos grupos de camundongos

propostos ao estudo. Foram aplicados técnicas de análise multivariada de dados

para realizar o tratamento das informações adquiridas. A análise de componentes

principais (PCA), análise de agrupamento hierárquico (HCA) e análise discriminante

por quadrados mínimos parciais (PLS-DA) mostraram a segregação entre os grupos

estudados. Os dados submetidos à validação cruzada retornaram valores

satisfatórios para os parâmetros diagnósticos do modelo de classificação (Exatidão,

R2 e Q2). Como informação adicional, foi investigada a identidade de alguns dos

principais candidatos a biomarcadores relacionados a este estudo de forma a

fornecer dados para estudos posteriores.

ABSTRACT

Metabolomics is a recent analytical approach which aims to analyse the

endogenous and exogenous metabolites present in biological samples. It can open

new avenues in several research areas, including the search for useful biomarkers of

a particular disease. Acute Lymphoblastic Leukemia (ALL) is the most common type

of pediatric cancer, and most of the metabolomics research in this area is restricted

to the cell culture. In this work, we have optimized a metabolomics method by LC-

ESI-QTOF-MS for obtaining metabolic fingerprinting. Then, this optimized method

was applied in a study of interest in oncology evaluating the profile of endogenous

metabolites in NOD/SCID mice plasma comparing healthy groups, with ALL, and

groups with ALL which received chemotherapy consisting of vincristine,

dexamethasone and asparaginase. The data was Cross Validated in order to

evaluate its efficacy in the classification of each of the groups. In the method

optimization step, different methodological approaches were initially tested and

results of these approaches were compared and evaluated as the best approach

according to the number of ions detected by each of them. Protein precipitation and

subsequent protein precipitation with phase separation were tested as sample

preparation. Still in the methodological approach tests, two different chromatographic

columns, a C18 and a C18 Hydro were used. Then the optimized method was

applied to proposed study groups of mice. Multivariate data analysis techniques were

applied to process the acquired data. The Principal Component Analysis (PCA),

Hierarchical Cluster Analysis (HCA) and Partial Least Squares Discriminant Analysis

(PLS-DA) showed segregation between groups. Cross-validation returned values

suitable for the diagnostic parameters of the classification model (Accuracy, R2 and

Q2). Moreover, the identity of some of the main candidate biomarkers related to this

study was also investigated to provide data for further studies.

Lista de Figuras

Figura 1. Representação esquemática de um Espectrômetro de Massas. ............... 18

Figura 2. Faixas de aplicação das técnicas de ionização utilizadas em metabolômica.

. ................................................................................................................................. 19

Figura 3. Fórmulas estruturais da vincristina (A), dexametasona (B) e asparaginase

(C). ............................................................................................................................ 22

Figura 4. Fluxograma mostrando os testes realizados na etapa de otimização do

preparo de amostra e número de íons detectados para cada teste. ......................... 31

Figura 5. Cromatograma de íons totais da fração aquosa analisada no modo positivo

utilizando uma coluna C18 Hydro com vazão de fase móvel de 0,4 mLmin-1. (A) CNT,

(B) LEU_CNT e (C) LEU_VXL. .................................................................................. 37

Figura 6. Score Plot (A) e Loading Plot (B) da PCA para a fração aquosa analisada

modo positivo. ........................................................................................................... 38

Figura 7. Porcentagem de Variância explicada em função do número de PC’s

utilizados para compor os scores do PCA para a fração aquosa analisada no modo

positivo. ..................................................................................................................... 39

Figura 8. Dendrograma com os dados obtidos para a fração aquosa analisada no

modo positivo. ........................................................................................................... 40

Figura 9. Score Plot (A) e Loading Plot (B) do PLS-DA para a fração aquosa

analisada no modo positivo. ...................................................................................... 41

Figura 10. VIP plot com as 15 variáveis com maior influência no modelo PLS-DA

obtido para fração aquosa analisada no modo positivo. ........................................... 44

Figura 11. Cromatograma de íons totais da fração orgânica analisada no modo

positivo utilizando uma coluna C18 com vazão de fase móvel de 0,4 mLmin-1. (A)

CNT, (B) LEU_CNT e (C) LEU_VXL. ........................................................................ 45

Figura 12. PCA Score plot (esquerda) e HCA (direita) obtidos a partir dos dados da

fração orgânica analisada no modo positivo. ............................................................ 45

Figura 13. Score plot (esquerda) e VIP plot (direita) do PLS-DA com os 15 potenciais

marcadores para a fração orgânica analisada no modo positivo .............................. 47

Figura 14. Cromatograma de íons totais da fração aquosa analisada no modo

negativo utilizando uma coluna C18 Hydro com vazão de fase móvel de 0,4 mLmin-1.

(A) CNT, (B) LEU_CNT e (C) LEU_VXL. .................................................................. 48


fração aquosa analisada no modo negativo. ............................................................. 49


marcadores para a fração aquosa analisada no modo negativo. .............................. 50

Figura 17. Cromatograma de íons totais da fração orgânica analisada no modo

negativo utilizando uma coluna C18 com vazão de fase móvel de 0,4 mLmin-1. (A)

CNT, (B) LEU_CNT e (C) LEU_VXL. ........................................................................ 52


fração orgânica analisada no modo negativo. ........................................................... 53


marcadores para a fração orgânica analisada no modo negativo. ............................ 53

Figura 20. Espectro de MS/MS do tipo varredura de íons produtos para o íon m/z

496 com tempo de retenção de 12 minutos do extrato aquoso analisado no modo

positivo utilizando 30 V de energia de colisão. .......................................................... 56

Figura 21. Espectro de MS/MS do tipo varredura de íons produtos para o íon 520

com tempo de retenção de 13 minutos do extrato aquoso analisado no modo positivo

utilizando 30 V de energia de colisão. ....................................................................... 57

Figura 22. Fórmula estrutural geral para fosfolipídios com indicações das posições

sn-1, sn-2 e sn-3. No caso de LysoPC's a posição sn-2 sofre hidrólise. ................... 58

Figura 23. Fórmulas estruturais do (A) ácido hidróxi eicosatetraenóico, (B) ácido

dihidróxi eicosatrienóico, (C) ácido eicosapentaenóico. ............................................ 59

Figura 24. Espectro de MS/MS do tipo varredura de íons produtos para o íon 303

com tempo de retenção de 16 minutos do extrato aquoso analisado no modo

positivo. ..................................................................................................................... 60

Figura 25. Espectros de MS/MS dos íons referentes às variáveis M409T14_2 e

M307T11. Utilizando: 10 V (A), 20 V (B) e 30 V (C) de energia de colisão para o íon

409 e 10 V (D), 20 V (E) e 30 V (F) de energia de colisão para o íon 307. ............... 62

Figura 26. Dados para o extrato aquoso no modo positivo exibindo: (A) EIC para o

íon m/z 166.0871 com ampliação na região de m/z 50-225 Da (B) espectro de MS

para o pico cromatográfico que elui em 9 minutos de análise, (C) espectro de MS/MS

para o íon m/z 166.0871 e (D) MS/MS para o íon m/z 120.0909. ............................ 64

Lista de Tabelas

Tabela 1. Gradiente de eluição para o extrato aquoso .............................................. 27

Tabela 2. Gradiente de eluição para o extrato orgânico ............................................ 28

Tabela 3. Valores utilizados nos parâmetros de processamento de dados do

software XCMS online ............................................................................................... 29

Tabela 4. Parâmetros estatísticos de avaliação do modelo PLS-DA em função do

número de componentes no modelo para a fração aquosa analisada no modo

positivo ...................................................................................................................... 42


número de componentes no modelo para a fração orgânica analisada no modo

positivo ...................................................................................................................... 47


número de componentes no modelo para a fração aquosa analisada no modo

negativo ..................................................................................................................... 51


número de componentes no modelo para a fração orgânica analisada no modo

negativo. .................................................................................................................... 54

Lista de Abreviaturas e Siglas

ACN Acetonitrila

APCI Atmospheric Pressure Chemical Ionization

APPI Atmospheric Pressure Photoionization

CE-MS Capillary Electrophoresis Mass Spectrometry

CID Collision Induced Dissociation

CNT grupo controle

DNA Deoxyribonucleic acid

EIC Extracted Ion Chromatogram

ESI Electrospray Ionization

FT-ICR Fourier Transform Ion Cyclotron Resonance

GC-MS Gas Chromatography Mass Spectrometry

HMDB Human Metabolome Database

HPLC High Performance Liquid Chromatography

KEGG Kyoto Encyclopedia of Gene and Genomics

LC

LCAT

Liquid Chromatography

Lecitina:colesterol aciltransferase

LC-ESI-MS Liquid Chromatography Electrospray Ionization Mass Spectrometry

LC-ESI-QTOF Liquid Chromatography Electrospray Ionization Time of Flight

LC-MS Liquid Chromatography Mass Spectrometry

LEU_CNT grupo leucemia controle

LEU_VXL grupo leucemia tratado com Vincriscina, Dexametasona e

Asparaginase

LLA Leucemia Linfóide Aguda

LOOCV Leave One Out Cross Validation

m/z razão massa/carga

m/z/RT relação razão massa/carga / tempo de retenção

mRNA messenger Ribonucleic acid

MS Mass Spectrometry

MS/MS Mass Spectrometry/Mass Spectrometry

NOD/SCID Non-obese Diabetic/Severe Combined Immunodeficient

PC fosfatidilcolina

PCA Principal Component Analysis

PE fosfatidiletanolamina

PLS-DA Partial Least Squares Discriminant Analysis

QTOF Quadrupole Time of Flight

RMN Ressonância Magnética Nuclear

SCID Severe Combined Immunodeficient

TOF Time of Flight

VIP Variable Importance on Projection

[M+H]+ molécula protonada

[M+H-2H2O]+ molécula protonada com perda de duas moléculas de água

SUMÁRIO

1- INTRODUÇÃO ...................................................................................................... 15

1.1 Metabolômica ................................................................................................... 15

1.2 Espectrometria de Massas no contexto da Metabolômica ............................... 17

1.3 Leucemia Linfóide Aguda ................................................................................. 20

2- OBJETIVOS .......................................................................................................... 24

3- MATERIAIS E MÉTODOS .................................................................................... 25

3.1 Padrões analíticos, solventes e células ........................................................... 25

3.2 Experimentos com Animais .............................................................................. 25

3.3 Preparo de Amostra ......................................................................................... 26

3.4 Aquisição de Dados ......................................................................................... 27

3.5 Processamento de dados ................................................................................ 28

4- RESULTADOS E DISCUSSÃO ............................................................................ 30

4.1 Otimização do Método ..................................................................................... 30

4.2 Fingerprinting Metabólico ................................................................................. 36

4.2.1 Fração Aquosa – Modo Positivo ................................................................ 36

4.2.2 Fração Orgânica – Modo Positivo .............................................................. 44

4.2.3 Fração Aquosa – Modo Negativo............................................................... 47

4.2.4 Fração Orgânica – Modo Negativo ............................................................ 51

4.3 MS/MS de potenciais biomarcadores .............................................................. 55

5 – CONCLUSÕES ................................................................................................... 65

6 – REFERÊNCIAS ................................................................................................... 66

7 - ANEXOS .............................................................................................................. 76

Anexo 1. Parecer do comitê de ética ..................................................................... 76

8 – ADENDO ............................................................................................................. 77

15

1- INTRODUÇÃO

1.1 Metabolômica

Após a genômica[1], transcriptômica[2], e a proteômica[3], a

metabolômica surgiu como uma estratégia analítica recente para o estudo do

metabolismo em um nível global, para um dado sistema biológico.[4] O termo

metabolômica é relativamente recente e foi introduzido inicialmente no ano 2000 por

Fiehn e colaboradores.[5] A integração de dados de metabolômica com as demais

“ômicas” pode ser aplicado para a construção de redes moleculares (do inglês

molecular networks), as quais podem ajudar a compreender os complexos

processos bioquímicos de uma melhor maneira.[6] Esse campo de pesquisa tem

como objetivo a análise de metabólitos endógenos e exógenos com massas

moleculares menores do que 1000 Da presentes em amostras biológicas como

células, tecidos e fluidos corporais.[7] Esses metabólitos são os produtos finais de

processos celulares e existem em um estado de equilíbrio dinâmico sob condições

normais. Porém, quando o corpo recebe algum estímulo externo, a natureza e/ou a

concentração destes metabólitos são alteradas. Desta forma, a metabolômica foca

em tais mudanças, de modo a explicar essas modificações de um ponto de vista

metabólico, e têm sido, portanto, amplamente utilizada na descoberta de

biomarcadores para doenças, que podem tornar-se úteis em diversas aplicações

como diagnóstico precoce, acompanhamento da evolução de um tratamento e

descoberta de novas drogas farmacêuticas.[4] O metaboloma auxilia na

compreensão do fenótipo adquirido.[8] Porém, o objetivo inicial da metabolômica em

analisar e quantificar todos os metabólitos em um dado sistema torna-se inviável

devido à complexidade do metaboloma. Em seres humanos tal complexidade

envolve a presença de mais 40.000 metabólitos endógenos e mais os exógenos

(metabólitos oriundos da alimentação, drogas e microbiota). No caso de plantas,

este número pode ultrapassar 200.000 metabólitos devido ao metabolismo

secundário das plantas. Tais metabólitos possuem uma diversidade muito ampla em

suas propriedades físicas e químicas de acordo com os dados contidos nos banco

de dados disponíveis como o HMDB (Human Metabolome Database), o KEGG

16

(Kyoto Encyclopedia of Gene and Genomics), o Lipid Maps, o Mass Bank, dentre

outros.[9] [10] [11] [12] Além da diversidade de grupos funcionais que por sua vez

refletem nas propriedades químicas e físicas, os metabólitos endógenos também

variam bastante em sua faixa de concentração, que pode chegar a 12 ordens de

grandeza, ao passo que os instrumentos analíticos atuais possuem a sua melhor

faixa dinâmica em torno de 4 ordens de grandeza; desta forma, a questão da

instrumentação analítica representa um grande desafio para os pesquisadores desta

área.[6]

Devido à diversidade química e à ampla faixa de concentrações, a

identificação e a quantificação dos metabólitos deve ser realizada utilizando uma

instrumentação capaz de detectar com sensibilidade adequada e, de forma

inequívoca, permitir a identificação de tais compostos. As duas maiores plataformas

usadas em metabolômica são a Ressonância Magnética Nuclear (RMN) e a

Espectrometria de Massas (MS, do inglês, Mass Spectrometry), na qual cada uma

delas possui suas próprias vantagens e desvantagens. RMN não realiza a

separação dos analitos, e dependendo do solvente deuterado utilizado, a amostra

pode ser recuperada para outras análises. Vários tipos de pequenas moléculas

podem ser medidos simultaneamente, e como tal, RMN está perto de ser um

detector universal. As principais vantagens de RMN são a reprodutibilidade analítica

e a simplicidade no preparo da amostra. Porém, RMN é relativamente pouco

sensível, e em análises de metabólitos ocorre frequentemente uma sobreposição de

sinais muito maior quando comparado às técnicas de espectrometria de massas.

Nas plataformas de metabolômica por Espectrometria de Massas, as

técnicas hifenadas como Cromatografia Gasosa (GC-MS, do inglês Gas

Chromatography – Mass Spectrometry), Cromatografia Líquida (LC-MS, do inglês

Liquid Chromatography – Mass Spectrometry) e Eletroforese Capilar (CE-MS, do

inglês Capillary Electrophoresis – Mass Spectrometry) são as mais populares na

determinação do perfil metabólico de uma amostra biológica devido às suas altas

sensibilidade e seletividade, alto desempenho e ampla cobertura.[4]

Os estudos de metabolômica podem ser divididos em duas grandes

abordagens: untargeted e targeted (respectivamente do inglês, “não direcionada” e

“direcionada”), no qual cada uma delas possui as suas próprias vantagens e

desvantagens. Na abordagem untargeted, que também pode ser encontrada na

17

literatura como fingerprinting (do inglês, “impressão digital”) consiste na análise

abrangente de todos os metabólitos passíveis de detecção em uma amostra,

incluindo espécies químicas desconhecidas. Devido à natureza multivariada dos

dados gerados, a informação oriunda de metabolômica untargeted geralmente é

tratada utilizando técnicas quimiométricas multivariadas para reduzir os extensos

conjuntos de dados em um conjunto menor de variáveis, facilitando a sua

interpretação. As variáveis relevantes devem ser identificadas posteriormente.

Dessa forma, a metabolômica untargeted oferece a oportunidade para a descoberta

de biomarcadores que podem ser úteis em diagnósticos, tratamentos dentre outros.

Porém, os principais desafios deste tipo de abordagem incidem nos protocolos, no

tempo necessário para a aquisição dos dados, no processamento de grande volume

de dados, na dificuldade na identificação e caracterização dos compostos, na

dependência da faixa dinâmica da técnica analítica utilizada e na coexistência de

espécies altamente detectáveis e espécies em concentração traço.[13]

Em contrapartida, a metabolômica targeted consiste na medida da

concentração de um número limitado e conhecido de metabólitos. Para realizar a

análise, deve se conhecer a estrutura química do metabólito alvo e possuir um

método analítico para medir de forma adequada a sua concentração na amostra.

Uma análise targeted nada mais é do que uma abordagem quantitativa e, portanto,

apresenta limites de detecção muito menores para metabólitos conhecidos quando

comparado à abordagem untargeted. A maior limitação dos métodos targeted para

metabolômica é que os compostos devem ser conhecidos a priori, e também devem

estar disponíveis comercialmente na forma pura. Atualmente, um grande número de

metabólitos não pode ser identificado nas amostras devido à indisponibilidade de

padrões na forma purificada. Além disso, a abordagem targeted não pode ser usada

para identificar modificações metabólicas globais.[14]

1.2 Espectrometria de Massas no contexto da Metabolômica

Um espectrômetro de massas é composto de quatro partes principais

(Figura 1): um sistema de introdução de amostra, que pode ser por inserção direta

ou utilizando alguma técnica de separação; uma fonte de ionização, um analisador

de massas e um detector. Enquanto a fonte de ionização converte moléculas em

18

íons, o analisador de massas resolve estes íons em função da sua relação

massa/carga (m/z) seja por meio de um tubo de vôo, seja por um campo magnético

ou elétrico antes de serem medidos pelo detector.

Figura 1. Representação esquemática de um Espectrômetro de Massas.

Algumas opções de fonte de ionização incluem a ionização por

eletrospray (ESI - do inglês Electrospray Ionization)[15], ionização química à pressão

atmosférica (APCI - do inglês Atmospheric Pressure Chemical Ionization)[16] e

fotoionização à pressão atmosférica (APPI - do inglês Atmospheric Pressure

Photoionization)[17], dentre outras. Devido à diversidade de propriedades químicas

dos metabólitos, é recomendado realizar a análise nos modos positivo e negativo, ou

seja, análise de cátions e ânions respectivamente, realizando a aquisição dos

espectros em uma faixa de massas de forma a cobrir a faixa de metabólitos

desejada. Na grande maioria dos trabalhos publicados, ESI é o método de ionização

de escolha para estudos de metabolômica por MS devido à sua “ionização suave”,

produzindo um vasto número de íons. ESI, na maioria das vezes, gera íons intactos;

este fato pode auxiliar em uma identificação inicial do composto através de sua

massa exata. APCI e APPI também geram pouca ou nenhuma fragmentação e são

mais tolerantes à utilização de tampões do que a fonte ESI. Esses métodos de

ionização são complementares ao ESI e são úteis para análises de compostos

apolares e termicamente estáveis. A Figura 2 mostra a faixa de aplicação das

técnicas de ionização em termos de massa molecular e polaridade.

Introdução de

Amostras

Fonte de Ionização

Analisador de m/z

Detector

19

Figura 2. Faixas de aplicação das técnicas de ionização utilizadas em metabolômica. (adaptado) [18]

Os analisadores de massas mais comuns são: quadrupolo[19], ion

trap[20], tempo de vôo TOF (do inglês, Time of Flight)[21], Orbitrap[22], e

Ressonância Ciclotrônica de Íons com Transformada de Fourier FT-ICR (do inglês

Fourier Transform Ion Cyclotron Resonance)[23]. Espectrômetros de massas

híbridos ou sequenciais referem-se à combinação de dois ou mais analisadores.

Espectrômetros de massas de alta resolução como TOF e ultra-alta resolução como

FT-ICR e Orbitrap fornecem medidas de massa exata que podem auxiliar na

identificação dos metabólitos de interesse. Além disso, por meio de experimentos de

dissociação induzida por colisão (CID - do inglês, Collision Induced Dissociation),

que podem ser realizados tanto em analisadores híbridos (ex. triplo quadrupolo[24]

ou um quadrupolo-TOF[25]) quanto em analisadores de Trap é possível selecionar

compostos e depois fragmentá-los, obtendo desta forma o perfil de fragmentação da

espécie para auxiliar na identificação dos metabólitos.

Grande parte dos estudos de metabolômica utiliza técnicas de separação

antes da análise por MS. HPLC (do inglês, High Performance Liquid

Chromatography, ou simplesmente, LC) permite a separação de compostos com

uma ampla faixa de polaridades, seja por eluição isocrática (onde a composição da

fase móvel não varia durante a análise cromatográfica), seja por eluição com

gradiente (onde a composição da fase móvel varia durante a análise

100.000

10.000

1.000

100

Apolar Polar

INT

ER

VA

LO

DE

MA

SS

AS

(Da)

POLARIDADE

Faixa de massas de aplicação em Metabolômica

20

cromatográfica). Além do modo de eluição, a utilização de fases estacionárias com

tamanhos de partículas menores, que operam em pressões superiores, também

possibilita uma maior separação dos compostos com uma ampla faixa de

polaridades. Portanto, a utilização de uma etapa de separação cromatográfica

acrescenta uma nova dimensão à análise, referente ao tempo de retenção dos

compostos.

LC-ESI-MS é a técnica de escolha para obter o fingerprint metabólico em

amostras biológicas complexas. A separação cromatográfica prévia pode reduzir a

complexidade e amenizar os efeitos de matriz durante a ionização. As colunas mais

utilizadas são a C18 para a fase reversa, e a HILIC (do inglês Hydrophilic Interaction

Liquid Chromatography) para a fase normal. A escolha da coluna deverá ser

realizada de acordo com a abrangência requerida pelo estudo. Uma boa separação

cromatográfica melhora a sensibilidade da detecção por MS e consequentemente

melhora a qualidade dos dados adquiridos devido à redução de ruído.[18]

1.3 Leucemia Linfóide Aguda

A metabolômica tem sido empregada em estudos envolvendo Leucemia

Linfóide Aguda (LLA).[26] [27] [28] [29] A Leucemia Linfoide Aguda é o tipo de

câncer pediátrico mais comum, correspondendo a um quarto de todas as neoplasias

malignas diagnosticadas em crianças menores do que 15 anos de idade. [30] Sua

maior incidência se dá na faixa de 3 a 4 anos de idade, em crianças do sexo

masculino, de raça branca.[31] A LLA é uma doença agressiva, caracterizada pelo

acúmulo de células linfoides na medula óssea e no sangue periférico, impedindo a

produção de células normais. Em decorrência disso, como manifestações primárias,

o número de hemácias e plaquetas diminuem, e leucócitos aumentam, causando

anemia, aparecimento de infecções e aumento na incidência de sangramentos.

Outros sintomas comuns são febre, manifestações hemorrágicas, palidez, fadiga,

dor óssea, entre outros.[32]

Entretanto, outras doenças podem apresentar sintomas semelhantes, tais

como infecções, reumatismo, entre outras. Portanto, a confirmação é realizada por

meio de um mielograma, exame no qual se retira uma alíquota do sangue da medula

do paciente em questão para a análise morfológica das células. Este diagnóstico

21

pode ser complementado com os exames de imunofenotipagem, citogenética e

biologia molecular, sendo os dois últimos os determinantes para traçar a abordagem

terapêutica.

Apesar dos muitos avanços no tratamento da LLA, os protocolos

atualmente se baseiam na combinação de vincristina, asparaginase e um

glicocorticóide (na grande maioria das vezes, dexametasona). Esse protocolo está

estabelecido há mais de 50 anos, e apresenta taxas de remissão de 93%[33] a

95%.[30] A Vincristina (Figura 3A), um alcaloide da vinca, é um quimioterápico

usado para vários tratamentos incluindo câncer de mama, doença de Hodgkin’s,

sarcoma de Kaposi’s e câncer de testículo. Os alcaloides da vinca são compostos

estruturalmente similares compreendidos por 2 unidades multianéis, a vindolina e a

catarantina. A Vincristina liga-se à proteínas microtubulares do tubo mitótico,

levando à cristalização do microtubulo e à morte celular. [34] A Dexametasona

(Figura 3B) e seus derivados, são glicocorticóides sintéticos, que na forma não

ligada atravessa as membranas celulares e liga-se com elevada afinidade aos

receptores citoplasmáticos específicos de glicocorticoídes formando complexos. Tais

complexos atravessam o núcleo da célula e ligam-se à elementos do DNA e

modificam a transcrição do mRNA e a posterior síntese de enzimas, que são

responsáveis pelo efeito de supressão a transcrição do mRNA em células

linfoides.[35] Já a asparaginase (Figura 3C) converte a asparagina em ácido

aspártico e amônia; em um número significante de pacientes com leucemia, as

células malignas dependem de uma fonte exógena de asparagina para sobreviver,

enquanto células normais são capazes de sintetizar asparagina e assim são menos

afetadas pela sua depleção causada pelo tratamento com asparaginase; dessa

forma, as células leucêmicas são conduzidas à morte.[36]

22

Figura 3. Fórmulas estruturais da vincristina (A), dexametasona (B) e asparaginase (C).

Os avanços nos estudos relacionados à leucemia infantil são em grande

parte oriundos de estudos empíricos e não foram estimulados por melhorias

significativas nos sistemas de modelos experimentais para estudar a fisiopatologia

da doença. Em sua maioria, os estudos experimentais foram realizados utilizando

linhagens celulares de leucemia infantil, que por sua vez são de relevância limitada

para a compreensão da doença. Um modelo ideal deve mimetizar a proliferação e a

disseminação de células leucêmicas que ocorrem no paciente e comportar-se de

forma semelhante quando for submetido aos tratamentos com quimioterápicos.[37]

Desde a década de 60, camundongos nude têm sido usados como

modelos animais para o estudo in vivo de doenças. Porém os transplantes de

tumores hematológicos nessa linhagem de camundongos têm se mostrado difícil de

uma maneira geral. Uma alternativa atrativa ao camundongo nude surgiu com o

(A)(B)

(C)

23

desenvolvimento dos camundongos SCID (do inglês – Severe Combined

Immunodeficient) na década de 80.[38] [39] Inicialmente os enxertos de tumores

hematológicos se mostraram bem sucedidos. No entando, esses camundongos

apresentam uma imunidade residual, que posteriormente se mostrou problemática

com relação à receptividade dos camundongos a inoculações de tumores. Em um

grande estudo, de 681 amostras de biópsia de medula óssea, apenas 104 foram

enxertadas com sucesso em camundongos SCID.[40]

Posteriormente, a mutação dos camundongos SCID foi cruzada com

camundongos NOD (do inglês – non-obese diabetic). O resultado foi um animal com

defeitos imunológicos adicionais além dos vistos nos camundongos SCID.[41] [42].

Hudson e colaboradores compararam xenotransplantes de tumores linfoide em

camundongos nude, SCID, NOD/SCID e Rag-1-deficiente, e observou-se que dentre

os camundongos utilizados no estudo, apenas os camundongos NOD/SCID

aceitaram 100% dos tumores inoculados e se mostraram o modelo animal mais

adequado dentre os testados no referido trabalho.[43] Fusetti e colaboradores

inocularam 12 linhagens diferentes de leucemia humana em camundongos

NOD/SCID das quais 10 tiveram o transplante aceito pelos camundongos.[44]

Nesse sentido, o camundongo NOD/SCID (do inglês non-obese

diabetic/severe combined immunodeficient) se apresenta como um modelo animal

de escolha para estudos relacionados à leucemia infantil por ser altamente receptivo

a enxerto de biópsias de LLA primárias de humanos. [45] [46] [47] Além disso,

células humanas inoculadas em NOD/SCID infiltram-se na medula óssea, baço e

fígado, e são encontradas em grande quantidade no sangue periférico com

características da doença original. [37] [48] Uma vantagem adicional do modelo em

camundongos NOD/SCID para a LLA é que ele apresenta a doença no seu sangue

periférico [49] e, dessa forma, é possível monitorar a resposta a drogas

quimioterápicas em ''tempo real'' por citometria de fluxo. As amostras e os ensaios

feitos neste modelo são significativamente correlacionados com a evolução clínica

dos pacientes tratados com as drogas quimioterápicas de quem os xenotransplantes

foram derivados. Alguns trabalhos de pesquisa mostram resultados com exemplos

de aplicação de camundongos imunodeficientes para avaliação de novas estratégias

terapêuticas para tratamento de linfomas como quimioterapia [50] [51] [52] [53] [54],

imunoterapia [55] [56] e terapia genética.[57] [58] [59] Portanto, este modelo

24

experimental se mostra altamente relevante para testes de estratégias de

tratamento.

2- OBJETIVOS

Realizar estudo de metabolômica por LC-MS envolvendo camundongos

NOD/SCID leucêmicos avaliando os efeitos da administração de vincristina,

dexametasona e asparaginase, pode fornecer dados inéditos à literatura. Desta

forma propõe-se como objetivos os itens listados a seguir:

2.1 Objetivos Gerais

I. Otimizar um método de metabolômica untargeted usando LC-MS para

análise de plasma de camundongos.

II. Aplicar o método estabelecido para avaliar as diferenças em

camundongos NOD/SCID com leucemia linfóide aguda quando submetidos ou não à

tratamento quimioterápico com Vincristina, Dexametasona e Asparaginase por meio

da obtenção do Fingerprinting metabólico.

III. Avaliar a eficiência do método estabelecido na classificação dos

diferentes grupos utilizados no estudo através dos parâmetros de validação cruzada.

2.2 Objetivos Específicos

I. Otimizar o preparo de amostras de plasma visando a detecção do maior

número de compostos.

II. Otimizar o método cromatográfico (escolha de coluna, fase móvel e

gradiente) visando a detecção do maior número de compostos.

III. Estabelecer estratégias de tratamento de dados, desde a exportação

de cromatogramas até a análise multivariada dos dados, que possibilitam revelar os

potenciais compostos biomarcadores.

25

3- MATERIAIS E MÉTODOS

3.1 Padrões analíticos, solventes e células

Água deionizada foi obtida de um sistema de purificação de água da

marca Millipore (Billerica, Massachusetts, Estados Unidos). Metanol e acetonitrila

foram obtidos da JT-Baker (Phillisburg, Nova Jersey, Estados Unidos); clorofórmio,

diclorometano, acetato de amônio, ácido fórmico e o meio de cultura RPMI1640

foram obtidos da Sigma-Aldrich (Sant Louis, Missouri, Estados Unidos). O soro fetal

bovino, penicilina, estreptomicina foram obtidos da Gibco (Merelbeke, East Flanders,

Bélgica). O sulfato de vincristina foi obtido da Libbs (Embu das Artes, São Paulo,

Brasil), o fosfato dissódico de dexametasona foi obtido da Hypofarma (Ribeirão das

Neves, São Paulo, Brasil), a L-asparaginase foi obtida da Laboratórios Bagó (Rio de

Janeiro, Rio de Janeiro, Brasil) e a heparina foi obtida da Cristália (Itapira, São

Paulo, Brasil). As células de leucemia da linhagem RS4[60] (CRL 1873) foram

adquiridas da American Type Culture Collection (Manassas, Virginia, Estados

Unidos).

3.2 Experimentos com Animais

Camundongos machos da linhagem NOD/SCID foram obtidos do Centro

Multidisciplinar para Investigação Biológica na Área da Ciência em Animais de

Laboratório (CEMIB Unicamp).

Todos os camundongos foram mantidos em gaiolas e os experimentos

foram conduzidos usando protocolos e condições aprovados pelo Comitê de Ética

no Uso de Animais (CEUA/Unicamp, Protocolo 3387-1).

Os camundongos foram supridos com comida estéril e água antes da

inoculação das células de leucemia.

As células RS4 foram cultivadas em frasco plástico (25 cm2) contendo

meio de cultura RPMI 1640 suplementado com 10% de soro fetal bovino, 1% de

penicilina (10000 IUmL-1), e estreptomicina (10 mgmL-1) à 37°C em atmosfera

umidificada com 5% de CO2. O meio de cultura foi trocado a cada 48 horas.

26

Em seguida, foram inoculadas nos camundongos 2,5 – 5 x 106 células de

leucemia, e o diagnóstico da doença foi realizado por Citometria de Fluxo através do

monitoramento da razão entre as células de leucemia humana e células de leucemia

murina no sangue periférico do animal.

Os animais foram divididos em três grupos, cada um com 5

camundongos.[61] O primeiro denominado CNT correspondente ao grupo controle,

não recebeu inoculação de células de leucemia e foi tratado com placebo. Já o

segundo grupo, denominado LEU_CNT recebeu a inoculação das células

leucêmicas e foi tratado com placebo. Por fim o terceiro grupo, denominado

LEU_VXL recebeu a inoculação de células de leucemia e foi tratado com uma

combinação de quimioterápicos composto por Vincristina (0,15 mg.kg-1),

Dexametasona (5 mgkg-1) e Asparaginase (1000 Ukg-1) com administração

intraperitoneal. Foi coletado um volume de cerca de 300 µL de amostra de sangue

para cada camundongo, e a coleta se deu via plexo retro orbital. Foi utilizada

Heparina como anticoagulante e o plasma foi separado dos eritrócitos por

centrifugação. Todas as etapas referentes a esse item foram realizadas no Centro

Integrado de Pesquisas Oncohematológicas na Infância (CIPOI) localizado na

Faculdade de Ciências Médicas da Unicamp.

3.3 Preparo de Amostra

Ao tubo de microcentrífuga contendo 100 µL da amostra de plasma foram

adicionados 300 µL de Metanol gelado e agitou-se o tubo por 10 minutos. Em

seguida centrifugou-se o tubo por 3 minutos p/ 12052 g. Foram coletados 300 µL do

sobrenadante e transferiu-se para um novo tubo de microcentrífuga, sendo

adicionados 450 µL de uma solução de Diclorometano:Clorofórmio:Metanol

(1:1:0,25). Depois, adicionou-se 200 µL de água e agitou-se o tubo por 10 minutos.

Em seguida centrifugou-se o tubo por 3 minutos por 12052 g. Após a centrifugação,

coletou-se a fração superior da mistura (fração aquosa) e transferiu-se para outro

tubo de microcentrífuga. Os tubos contendo as frações individuais separadas

(aquosa e orgânica) foram levados ao speedvac e o conteúdo foi seco sob pressão

reduzida. O resíduo seco foi ressuspendido em 100 µL de ACN:H2O 80:20 agitando-

se por 5 minutos, após a agitação a solução foi centrifugada por 3 minutos por

27

12052 g e 80 µL da solução foi transferido para um vial contendo um insert para,

assim, poder ser injetado no instrumento.

3.4 Aquisição de Dados

A cromatografia foi realizada empregando um cromatógrafo líquido 1290

Infinity (Agilent., Santa Clara, Califórnia, Estados Unidos). A separação

cromatográfica do extrato aquoso foi realizada utilizando uma coluna Synergi Hydro

RP 80 A (Phenomenex., Torrance, Califórnia, Estados Unidos) de dimensões 150 x

4,6 mm com 4 µm de tamanho de partícula, e a separação cromatográfica do extrato

orgânico foi realizada utilizando uma coluna Poroshell 120 EC-C18 (Agilent) de

dimensões 50 x 4,6 mm com 2,7 µm de tamanho de partícula. A fase móvel utilizada

para a corrida cromatográfica do extrato aquoso e orgânico consistiu de Acetonitrila

(fase B) e Água com 0,1% (v/v) de ácido fórmico (fase A) para o modo positivo; para

o modo negativo, foi utilizada a mesma fase B e como fase A foi utilizado Acetato de

Amônio 5 mM. A eluição da fase móvel se deu na forma de gradiente. A vazão de

fase móvel foi de 0,4 mLmin-1 e o volume de injeção foi de 5 µL. A Tabela 1 exibe o

gradiente de eluição para o extrato aquoso e a Tabela 2 exibe o gradiente de eluição

para o extrato orgânico.

Tabela 1. Gradiente de eluição para o extrato aquoso

Tempo (min) Proporção de fase

móvel B (%)

0 2

6 25

10 80

12 90

20 95

23-26 2

28

Tabela 2. Gradiente de eluição para o extrato orgânico

Tempo (min) Proporção de fase

móvel B (%)

0 75

6 85

12 90

14 92

17 99

18-22 75

Os espectros de massas foram adquiridos utilizando um espectrômetro de

massas híbrido com analisador de massas do tipo QTOF modelo 6550 (Agilent). As

amostras foram analisadas no modo positivo e modo negativo de ionização. Os

parâmetros instrumentais utilizados foram: VCap de 3.500 V para o modo positivo e

2.800 V para o modo negativo; voltagem do fragmentor de 175 V, voltagem do

skimmer de 60 V,OCT 1 RF Vpp de 750 V, Gas Temperature de 260°C, Sheath Gas

Temperature de 300°C, Drying Gas de 12 Lmin-1, Sheath Gas Flow de 12 Lmin-1 . Os

espectros de massas foram adquiridos em modo centróide e a faixa de massas

utilizada para a aquisição foi de 100-1700 Da.

3.5 Processamento de dados

Os dados brutos foram convertidos para o formato de arquivo .mzData

usando o conversor disponível no software MassHunter Qualitative (Agilent), ao

passo que as interferências isotópicas foram eliminadas utilizando o mesmo sistema

de conversão. Após a conversão, os arquivos foram importados para o software

XCMS online (https://xcmsonline.scripps.edu/)[62] para alinhamento não linear no

domínio do tempo, integração automática, extração das intensidades dos picos e

demais pré-processamentos pertinentes. Os valores referentes aos principais

parâmetros utilizados são descritos na Tabela 3.

29

Tabela 3. Valores utilizados nos parâmetros de processamento de dados do software XCMS online

Feature Detection

maximal m/z deviation (ppm) 5

minimum peak width (s) 1.8

maximum peak width (s) 3

Signal/Noise threshold 6

mzdiff 0.01

prefilter intensity 100

Noise Filter 10

Retention Time

Correction

Method centWave

profStep 1

Alignment

mzwid 0.015

minfrac 0.5

Allowable retention time deviations (s) 5

Statistics Statistical test Kruskal Wallis non parametric

p-value threshold 0.05

Annotation

Search for isotopes + adducts

m/z absolute error 0.015

ppm error 10

Identification

ppm 10

adducts

[M+H]+ , [M+NH4]

+ , [M+Na]

+ ,

[M+K]+

[M+H-H2O]+ [M+H-2

H2O]+/ [M-H]

- , [M+Ac]

-

matrix model mouse

Visualization EIC width 200

Em seguida, a matriz de dados obtida contendo a intensidade dos íons

para cada cromatograma de íon extraído (EIC – do inglês Extracted Ion

Chromatogram) foi normalizada pela soma (análogo à normalização pela Corrente

Iônica Total) para corrigir a diferença na resposta do espectrômetro de massas entre

as injeções devido a quaisquer variações possíveis. Os dados foram escalados

utilizando o escalamento de Pareto[63] antes das análises estatísticas multivariadas.

Os dados escalados foram inicialmente submetidos à análise exploratória de dados

utilizando os métodos não supervisionados de Análise de Componentes Principais

(PCA – do inglês, Principal Component Analysis)[64] e Análise de Agrupamento

Hierárquico (HCA – do inglês, Hierarquical Cluster Analysis)[65]. Por fim, foi

empregada a análise discriminante por quadrados mínimos parciais (PLS-DA – do

30

inglês, Partial Least Squares Discriminant Analysis)[66], um método supervisionado

de classificação para identificar os metabólitos alterados entre os grupos e

estabelecer os potenciais biomarcadores. O modelo resultante desta análise foi

validado utilizando validação cruzada, e a capacidade de predição do modelo foi

avaliada utilizando os parâmetros de exatidão, R2 e Q2. Foram considerados

potenciais biomarcadores as variáveis localizadas longe do agrupamento central da

maioria das variáveis no loading plot bem como os resultados fornecidos pelo índice

VIP. A normalização dos dados, escalamento e análises estatísticas uni e

multivariadas foram realizadas utilizando a plataforma online MetaboAnalyst 3.0

(www.metaboanalyst.ca)[67].

4- RESULTADOS E DISCUSSÃO

4.1 Otimização do Método

As amostras de plasma foram analisadas por LC-MS comparando-se três

diferentes abordagens: 1) a primeira abordagem consistiu apenas em um simples

procedimento de precipitação de proteínas com metanol [68] [69] [70] [71] e posterior

análise por LC-MS utilizando uma coluna do tipo C18; 2) a segunda abordagem

consistiu no mesmo procedimento de precipitação de proteínas aplicado em 1) e

adicionando-se posteriormente um procedimento de separação de fases, analisando

as frações obtidas (aquosa e orgânica) separadamente utilizando uma coluna do tipo

C18 para realizar a separação cromatográfica de ambas; e 3) a terceira abordagem

consistiu em uma precipitação de proteínas com metanol seguido por fracionamento

por separação de fases usando uma mistura de solventes orgânicos da mesma

forma que em 2) e posterior análise por LC-MS utilizando uma coluna C18 para a

fração orgânica e uma coluna do tipo Synergi Hydro para a fração aquosa. As três

abordagens estão sintetizadas no fluxograma da Figura 4.

31

Figura 4. Fluxograma mostrando os testes realizados na etapa de otimização do preparo de amostra e número de íons detectados para cada teste.

Com relação à cromatografia, a escolha de uma coluna com alta

eficiência de separação é um pré-requisito em análises de metabolômica e, para tal,

a coluna escolhida para realizar os testes referentes às abordagens 1), 2) e 3) foi

uma coluna do tipo C18 de fase reversa Poroshell (50 mm X 4,6 mm X 2,7 µm,

Agilent) que possui um recheio de micropartículas de sílica porosa, adequada para

separações de uma ampla faixa de pequenas moléculas. Para a realização do teste

3) além da Poroshell, foi utilizada uma coluna de fase reversa Synergi Hydro (150

mm X 4,6 mm X 4 µm, Phenomenex) que possui uma fase estacionária composta

por um grupo polar embutido ao grupo C18, mantendo o caráter de fase reversa,

bem como fornecendo uma maior capacidade de retenção para compostos

hidrofílicos via interações polares, ligação de hidrogênio ou interações eletrostáticas.

A coluna Hydro também possibilita a utilização de porcentagens maiores de água na

composição do gradiente de fase móvel em relação às colunas C18 convencionais,

o que contribui na retenção de compostos mais polares.

Sobrenadante

LC

(Coluna C18)

Sobrenadante

Precipitação de Proteínas

Plasma

TESTE 1


Sobrenadante

Separação de Fases

Aquoso Orgânico

MS MS

TESTE 2

987 (+)

195 (-)

137 (+)

127 (-)1124 (+)

322(-)

Total: 1446

MS

TESTE 1

212 (+)

159 (-)

Total : 371


Sobrenadante


Aquoso Orgânico

MS MS

987 (+)

195 (-)

137 (+)

127 (-)1124 (+)

322(-)

Total: 1446


Sobrenadante


Aquoso Orgânico

MS MS

TESTE 3

987 (+)

195 (-)

657 (+)

259 (-)1644 (+)

474(-)

Total: 2118


Sobrenadante


Aquoso Orgânico

MS MS

TESTE 3

987 (+)

195 (-)

LC

(Coluna C18)

LC

(Coluna C18)

LC

(Coluna Hydro)

LC

(Coluna C18)

195 % a mais de íons detectados em

relação ao Teste 175 % a mais de íons detectados em

relação ao Teste 2

32

O tempo estabelecido para o gradiente foi de 18 minutos para as corridas

realizadas na coluna Poroshell (com 4 minutos de reequilíbrio) e 23 minutos para as

corridas realizadas na coluna Hydro (com 3 minutos de reequilíbrio). No intuito de

cobrir a maior faixa possível de metabólitos em suas diversas polaridades, o

gradiente de eluição é um parâmetro essencial e deve ser escolhido

cuidadosamente, de acordo com a faixa de metabólitos que se deseja analisar,

especialmente em uma matriz complexa como o plasma. Gradientes típicos em

estudos de metabolômica variam entre 15 a 30 minutos de corrida cromatográfica.

Para assegurar a repetibilidade das separações, parâmetros como a vazão de

solvente e a temperatura precisam ser cuidadosamente controlados, bem como o

tempo de análise; tempos menores aumentam a repetibilidade da análise ao custo

da diminuição da faixa de metabólitos a ser coberta, tornando a análise menos

informativa e menos adequada em estudos de metabolômica untargeted. A

composição do gradiente em função do tempo de análise para ambas as colunas foi

escolhida com base em um estudo da literatura, e realizando-se as adaptações

pertinentes.[72]

Como fase móvel foram testados os pares de solventes metanol/água e

acetonitrila/água e verificou-se que utilizando acetonitrila/água ruído nos

cromatogramas foi inferior em relação ao ruído quando se utilizou metanol/água; a

redução do ruído é um parâmetro importante para viabilizar a detecção de

metabólitos pouco abundantes, que podem ser importantes para o estudo em

questão.

A troca de polaridade do modo de ionização foi realizada ao final de cada

análise para evitar uma possível queda de sensibilidade que pode ocorrer durante

uma análise onde é realizada troca de polaridade intermitente. A fonte de ionização

selecionada para a utilização nessa etapa foi a de ESI, pois é a fonte que dentre as

acopláveis com HPLC, possui o sistema de ionização mais brando; os íons são

transferidos diretamente da solução líquida para a fase gasosa.[72] [73] Esta fonte

possui a maior abrangência de metabólitos dentre todas as fontes disponíveis. No

âmbito da metabolômica, tal abrangência inclui biomoléculas como aminoácidos,

lipídios, carboidratos e muitos outros, sem necessidade de derivatização,

contribuindo para a simplificação do preparo de amostra, sendo assim a fonte de

ionização mais adequada para estudos de metabolômica untargeted.

33

Para avaliar qual abordagem metodológica foi mais eficiente, comparou-

se a quantidade de íons detectados pelo algoritmo de extração de íons do software

de tratamento de dados XCMS online. O método mais adequado, neste caso, é

aquele capaz de fornecer um maior número de íons, o que consequentemente

resulta em mais informação a respeito da amostra. Os métodos de preparo de

amostra testados nesta etapa foram selecionados de forma a processar a amostra

com um menor número de etapas possíveis, tanto para tornar o método mais

simples, com menor custo, quanto para e evitar a perda de metabólitos, que pode

ocorrer com o aumento da carga de processamento da amostra. Uma vez que este

estudo trata-se de uma abordagem de metabolômica untargeted, é importante obter

um grande volume de dados, pois não são conhecidas, a priori, as alterações que os

tratamentos podem acarretar aos metabólitos plasmáticos dos camundongos da

linhagem NOD/SCID. Outro aspecto que também foi levado em consideração no

momento de selecionar os testes de preparo de amostra foi a quantidade limitada de

plasma disponível para a realização dos testes, uma vez que os camundongos

utilizados no estudo pesam aproximadamente 20 gramas e não é possível extrair

deles volume de plasma superior a 150 µL.

Nas três abordagens utilizadas no preparo de amostra, fez-se necessária

a etapa de precipitação de proteínas. Em matrizes complexas como o plasma, é

importante realizar a etapa de precipitação de proteínas, para evitar que esta classe

de moléculas possa interferir na detecção de metabólitos. Além disso, durante a

cromatografia há a possibilidade de precipitação das mesmas na coluna

cromatográfica ao realizar o gradiente de fase móvel, visto que proteínas são

insolúveis na maioria dos solventes orgânicos. Há também a possibilidade de

adsorção irreversível dessas proteínas ao recheio da coluna de fase reversa,

sujando o leito e causando elevação de pressão.

A coluna do tipo C18 foi escolhida nesta primeira abordagem devido à sua

disponibilidade no laboratório, e por ser uma coluna amplamente utilizada em

estudos de metabolômica onde é empregada uma separação prévia por

cromatografia. Em particular, nos métodos de detecção por MS em estudos com

matrizes biológicas complexas, como o plasma, a importância de uma separação

cromatográfica prévia torna-se ainda maior no sentido de minimizar a coeluição de

metabólitos, pois o efeito de matriz para este caso é bastante pronunciado. Colunas

34

do tipo C18 são capazes de reter lipídios, que são uma classe de metabólitos que

possuem uma ionização bastante eficiente, portanto, essa retenção é importante no

sentido de detectar classes de metabólitos que apresentam menor capacidade de

ionização, separando-os dos lipídios. A ideia principal deste teste foi avaliar a

possibilidade da utilização de uma única etapa de precipitação de proteínas como

preparo de amostra na etapa de aplicação do estudo com o objetivo de tornar a

análise bastante simplificada, reduzindo-se ao máximo possível o número de etapas

de preparo de amostra e aquisição de dados, tornando a análise mais barata,

simples e rápida. Após aplicar o algoritmo de extração de íons aos dados adquiridos

nesta abordagem de preparo de amostra verificou-se a detecção de 371 íons no

total, sendo 212 íons para o modo positivo e 159 íons para o modo negativo.

Em seguida foi testada a abordagem 2), visando observar o efeito da

separação de fases utilizando a mistura de solventes diclorometano, clorofórmio e

metanol (1:1:0,25) na quantidade de informação obtida. Após aplicar o mesmo

algoritmo de extração de íons utilizado em 1) aos dados adquiridos nesta

abordagem de preparo de amostra, verificou-se a detecção de 1446 íons no total,

sendo 137 para o modo positivo, 127 para o modo negativo na fração aquosa, e 987

para o modo positivo, 195 para o modo negativo na fração orgânica, resultando em

um aumento de 195% no total de íons detectados nesta abordagem em relação ao

total obtido em 1). Apesar do tempo adicional acrescentado ao preparo de amostra

ao adicionar um procedimento de separação de fases, bem como ao tempo adicional

necessário para a análise de ambas as amostras, observa-se claramente um ganho

significativo de informação para este tipo de abordagem em relação à primeira

abordagem. O número bastante inferior de íons detectados na fração aquosa em

relação à fração orgânica se deve possivelmente à natureza química dos compostos

obtidos em ambos os extratos. Enquanto a fração aquosa possui metabólitos

altamente polares, tais compostos interagem muito pouco com uma fase C18, sendo

pouco retidos e havendo a possibilidade de estarem eluindo no tempo morto de

análise, ao passo que os metabólitos contidos na fração orgânica são mais capazes

de interagir com a fase alquílica da coluna C18 apresentando uma retenção bastante

superior aos metabólitos da fração aquosa e, portanto, sendo detectados de uma

maneira mais adequada.

35

Por fim, foi testada a abordagem 3) onde o objetivo foi avaliar a utilização

de uma segunda coluna, com um mecanismo de separação diferente da coluna C18

convencional, e utilizá-la na análise da fração aquosa a fim de tentar reter um

número maior de compostos. A coluna Hydro apresenta propriedades de retenção

diferentes da coluna C18, desta forma sendo capaz de reter classes diferentes de

metabólitos contidos no extrato aquoso que porventura seriam pouco retidos na

coluna C18. Após aplicar o mesmo algoritmo de extração de íons utilizado nas

primeiras abordagens verificou-se a detecção de 2118 íons no total, sendo 936 na

fase aquosa (657 para o modo positivo, 279 para o modo negativo), e 1182 íons na

fase orgânica (987 para o modo positivo, 195 para o modo negativo), resultando em

um aumento de 73% no total de íons detectados nesta abordagem em relação ao

total obtido em 2) e 285% quando comparado ao total obtido em 1).

Desta forma, comparando o número de íons detectados utilizando as três

abordagens testadas é possível observar que para obter um maior número de íons,

e consequentemente manter a análise mais abrangente e informativa, é bastante útil

incluir ao preparo de amostra um procedimento de fracionamento ao sobrenadante

oriundo da etapa de precipitação de proteínas, bem como lançar mão da utilização

de uma segunda coluna cromatográfica de fase diferente à da C18.

A análise realizada no teste 1), utilizando apenas precipitação de

proteínas é menos informativa em parte devido à pouca eficiência da coluna C18

utilizada em reter classes de metabólitos remanescentes no sobrenadante após a

precipitação de proteínas, tais como aminoácidos, ácidos orgânicos, ácido úrico e

hormônios[74], possivelmente por apresentem pouca ou nenhuma retenção nesta

coluna e/ou por sofrerem efeito de supressão iônica causado pelos demais

metabólitos existentes no sobrenadante. Ácidos graxos, mono,di, triacilgliceróis e

fosfolipídios são conhecidos por interferirem na detecção de metabólitos coeluentes

que ionizam menos eficientemente. [75] [76] Apesar das interferências acarretadas

na análise por parte dos fosfolipídios é importante manter essa classe de

metabólitos na análise[74], pois se acredita que fosfolipídios apresentem papéis

sinalizadores no interior de células e também no plasma. Mudanças nos níveis de

fosfolipídios podem fornecer informações importantes em mecanismos específicos

em mamíferos. Os níveis de fosfolipídios são afetados, por exemplo, em esteatose

hepática [77], hiperhomocisteinemia [78], câncer de cólon [79] dentre outros

36

exemplos [80] [81] [82] e devido à importância dessa classe de compostos em

diversos estudos, decidiu-se mantê-los na análise.

Ao utilizar a abordagem de preparo de amostra com fracionamento, foi

possível, por exemplo, otimizar a detecção dos metabólitos polares, primeiramente

pois estes metabólitos migram para a fração aquosa, excluindo desta fração

fosfolipídios, mono, di e triacilgliceróis e lipídios de uma forma geral, que por sua vez

terão tendência de migração para a fase orgânica, reduzindo o efeito de matriz em

ambos os extratos. Por fim, foi possível adicionar à análise uma coluna capaz de

interagir melhor com os metabólitos polares causando maior retenção em relação à

coluna C18, sendo, portanto, mais adequada para este tipo de análise. Também foi

possível observar que o fracionamento também aumentou o número de metabólitos

detectados na fração orgânica em relação ao número de metabólitos detectados na

abordagem onde não é realizado fracionamento. Dessa forma, admitiu-se que,

possivelmente, alguns metabólitos contidos na fração aquosa também podem ser

capazes de interferir na detecção de metabólitos contidos na fração orgânica,

resultando na diminuição de metabólitos detectados.

De posse dessas informações, utilizou-se o preparo de amostra com

separação de fases e separação cromatográfica de cada fase em colunas diferentes

para conduzir as etapas posteriores do estudo.

4.2 Fingerprinting Metabólico

O fingerprint metabólico foi obtido por meio da aquisição de dados no

sistema LC-ESI-QTOF em amostras de plasma do camundongo NOD/SCID

comparando-se os 3 grupos diferentes descritos na seção 3.2.Os resultados são

exibidos nos tópicos a seguir.

4.2.1 Fração Aquosa – Modo Positivo

Os cromatogramas típicos obtidos comparando os grupos CNT,

LEU_CNT e LEU_VXL para a fração aquosa no modo positivo de análise são

apresentados a seguir.

37

Figura 5. Cromatograma de íons totais da fração aquosa analisada no modo positivo utilizando uma coluna C18 Hydro com vazão de fase móvel de 0,4 mLmin-1. (A) CNT, (B) LEU_CNT e (C) LEU_VXL.

Os dados adquiridos foram pré-processados de modo a permitir a

utilização dos métodos quimiométricos pertinentes, conforme descrito na seção 3.5.

Os métodos de pré-processamento incluem vários fatores para a seleção dos picos,

conforme listado no Tabela 3. Ao final do pré-processamento é gerada uma tabela

onde as amostras e seus grupos são mostrados nas linhas e as variáveis (m/z/RT)

são mostradas nas colunas. Essa tabela é utilizada para executar os métodos

quimiométricos.

Primeiramente foi realizada uma análise exploratória multivariada não

supervisionada dos dados utilizando-se a PCA com o intuito de verificar as variáveis

responsáveis pela maior variância entre os dados. O foco principal deste tipo de

análise é reter a maior quantidade de informação possível dentro de um universo de

inúmeras variáveis, utilizando um número menor de variáveis, onde estas novas

variáveis são ortogonais entre si, e descrevem um decréscimo de variância entre

cada variável, sempre de maneira complementar entre si. Estas novas variáveis são

chamadas de “Componentes Principais”. Como consequência, o número de

variáveis é reduzido significativamente, sem perder informações importantes; por

esta razão, a PCA é um método de projeção/compressão de dados. Em análises

desta natureza, as amostras são agrupadas de acordo com sua semelhança, sem

informação prévia sobre os grupos, apenas utilizando os dados instrumentais

fornecidos.

8x10

0

0.2

0.4

0.6

0.8

1

+ESI TIC Scan Frag=175.0V CNT_M1_Polar_POS.d

1

7x10

0

0.5

1

1.5

2

+ESI TIC Scan Frag=175.0V LEU CNT_M1_Polar_POS.d

1

7x10

0

0.5

1

1.5

2

2.5

3

3.5

+ESI TIC Scan Frag=175.0V LEU VXL_M1_Polar_POS.d

1

Acquisition Time (min)1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23

(A)

(B)

(C)

Inte

nsity

(Co

un

ts)

38

Como consequência da análise de PCA são gerados dois tipos de plot’s

que devem sempre ser analisados em conjunto, o score plot e o loading plot. O

score plot mostra as coordenadas das amostras no novo sistema de eixos/variáveis

formado pelas componentes principais. Já o loading plot mostra o quanto cada

variável original contribuiu na construção de cada componente principal; bem como

explica o porquê dos agrupamentos observados no score plot.

No score plot (Figura 6A) foi possível observar que amostras similares

(mesmo grupo) foram agrupadas, havendo distinção completa entre os grupos

estudados. No loading plot (Figura 6B), é possível verificar de acordo com a sua

distribuição, quais variáveis foram responsáveis pelas separações observadas no

score plot, onde essas variáveis são apresentadas no formato massa/carga seguido

de seu respectivo tempo de retenção, ou seja, por exemplo, para a variável

M409T12_2 localizada no canto superior direito corresponde a um íon de m/z 409 e

que possui um tempo de retenção de 12 minutos.

Figura 6. Score Plot (A) e Loading Plot (B) da PCA para a fração aquosa analisada modo positivo.

A primeira componente principal (PC1) foi responsável por diferenciar os

camundongos saudáveis daqueles nos quais havia sido inoculada as células de

leucemia. Já a segunda componente principal (PC2) foi responsável por diferenciar

os camundongos leucêmicos tratados com VXL daqueles não tratados. A Figura 7

mostra um gráfico de porcentagem de variância explicada em função do número de

(A) (B)

PC 1 (43%) Loadings 1

PC

2 (

22,1

%)

Load

ings

2

39

componentes principais; este tipo de gráfico permite visualizar o número de

componentes principais necessárias para descrever de forma adequada a variância

do conjunto de dados. O resultado deste gráfico para os dados da fração aquosa

são exibidos a seguir.

Figura 7. Porcentagem de Variância explicada em função do número de PC’s utilizados para compor os scores do PCA para a fração aquosa analisada no modo positivo.

Utilizando duas componentes principais é possível explicar 65,1% da

variância total do conjunto de dados (43% em PC1 e 22,1% em PC2); a partir da

utilização da terceira componente principal em diante, a variação da variância

explicada por cada componente principal subsequente para descrever o conjunto de

dados é menor (8,3% em PC3, 5,1% em PC4, 4,2% em PC5, 3,3% em PC 6 e assim

por diante). Portanto é razoável utilizar duas componentes principais nesta situação

para descrever de forma adequada o conjunto de dados analisado.

Observando o loading plot é possível notar claramente que algumas

poucas variáveis distanciaram-se da grande maioria das variáveis, que por sua vez

encontraram-se localizadas junto do agrupamento central, indicando que as

variáveis localizadas nos extremos exercem uma contribuição maior e diferenciada

Número de PC’s

Va

riâ

nci

a E

xpli

cad

a

40

na separação dos grupos no score plot e na construção de cada componente

principal em questão, enquanto as variáveis centrais são comuns a todos os grupos.

Ainda utilizando o conjunto de dados oriundo da fração aquosa, foi

realizada uma análise por HCA. O resultado desta análise é apresentado na Figura

8:

Figura 8. Dendrograma com os dados obtidos para a fração aquosa analisada no modo positivo.

A HCA também é um método multivariado não supervisionado de

reconhecimento de padrões com o intuito de realizar uma análise exploratória de

dados por meio da redução da dimensionalidade de informação. Nesta análise, as

amostras também são agrupadas de acordo com a sua similaridade. E como

resultado gerado, o chamado dendrograma, mostra na forma de um gráfico

bidimensional a estrutura hierárquica dos dados que apresenta a similaridade entre

as amostras e, idealmente, amostras do mesmo grupo devem possuir uma distância

menor entre si (e, portanto, agrupando-se) do que amostras de grupos

diferentes.[83] Observando o dendrograma apresentado é possível notar o

agrupamento das amostras referentes ao seu respectivo grupo. Além disso, também

41

é possível observar que o grupo CNT está mais distante dos demais grupos, e ainda

é possível observar que os grupos LEU_CNT e LEU_VXL estão mais próximos entre

si; este comportamento é concordante com a tendência apresentada pelo PCA.

O conjunto de dados pré-processado também foi submetido à análise

discriminante por PLS-DA. A Figura 9 mostra os resultados obtidos no score plot e

no loading plot do PLS-DA. Este método de análise tem por objetivo tornar evidentes

possíveis similaridades ou diferenças específicas, através da organização

preferencial de componentes principais que se mostrem correlacionadas com

variáveis classificatórias de interesse (para este caso, os grupos CNT, LEU_CNT e

LEU_VXL). Conforme esperado, a mesma tendência de separação entre os

diferentes grupos e o agrupamento de amostras similares foi observada no score

plot. No loading plot o agrupamento da maioria das variáveis no centro enquanto

algumas poucas permaneceram isoladas nos extremos reproduziu também o

resultado da análise por PCA. Desta forma é possível tratar as variáveis que

exerceram uma contribuição maior na construção das componentes principais como

potenciais biomarcadores.

Figura 9. Score Plot (A) e Loading Plot (B) do PLS-DA para a fração aquosa analisada no modo positivo.

O modelo de classificação estabelecido para o conjunto de dados foi

avaliado utilizando validação cruzada. Basicamente, nos métodos de validação

cruzada reserva-se um número específico de amostras para a construção do modelo

(A) (B)

Componente1 (42.8%)

Co

mp

on

en

te 2

(2

1%

)

Loadings 1

Loa

din

gs

2

42

(conjunto de treinamento) e um número específico para o teste do modelo

construído (conjunto de validação). Dentre os diferentes métodos disponíveis para a

realização da validação cruzada, a escolha adequada do método irá depender

basicamente da quantidade de amostras disponíveis para utilizar tanto para o

conjunto de treinamento quanto para o conjunto de validação. Para o conjunto de

dados deste estudo foi utilizado o método LOOCV (do inglês Leave One Out Cross-

Validation), no qual consiste em escolher uma das amostras para compor o conjunto

de validação e as demais amostras remanescentes são usadas para o conjunto de

treinamento. Em seguida, uma nova amostra é retirada para compor o conjunto de

treinamento e a amostra que antes foi utilizada para o conjunto de treinamento desta

vez irá compor o conjunto de validação; essas operações são repetidas de maneira

iterativa. O método LOOCV é utilizado quando o número de amostras é pequeno e

não é possível destinar um conjunto de amostras para o conjunto de validação. A

Tabela 4 mostra os resultados para os parâmetros estatísticos considerados na

validação do modelo em função do número de componentes principais utilizadas

para descrever os dados.

Tabela 4. Parâmetros estatísticos de avaliação do modelo PLS-DA em função do número de componentes no modelo para a fração aquosa analisada no modo positivo

Medida 1 Comp 2 Comp’s 3 Comp’s 4 Comp’s 5 Comp’s 6 Comp’s

Exatidão 0,3333 1,0 1,0 1,0 1,0 1,0

R2 0,95861 0,97632 0,99752 0,99927 0,99989 0,99998

Q2 0,93065 0,93869 0,94451 0,94979 0,95148 0,95152

Utilizando apenas duas componentes, os valores de R2 e Q2 são 0,97632

e 0,93869, e o valor para Exatidão é 1,0, respectivamente. Os parâmetros

estatísticos R2 e Q2 são as ferramentas diagnósticas mais importantes para avaliar o

desempenho do modelo construído. O parâmetro R2 é chamado de “qualidade de

ajuste” (do inglês goodness of fit) e mede o quão bem o modelo pode ser feito para

ajustar os dados brutos. R2 varia entre 0 e 1, onde 1 indica um modelo perfeito e 0

indica nenhum tipo de ajuste ou modelagem. A principal desvantagem do parâmetro

R2 é que ele pode ser ajustado para próximo de 1 incluindo mais termos ao modelo

43

(no caso deste estudo, Componentes), e, portanto, somente R2 não é um indicador

suficiente para avaliar a validade do modelo. Um parâmetro muito melhor de

indicação da utilidade de um modelo de regressão é dado por Q2. Esse parâmetro é

chamado “qualidade de predição” (do inglês goodness of prediction) e estima o

poder preditivo do modelo, ou seja, a capacidade do modelo de prever resultados

oriundos de amostras desconhecidas. Q2 representa um indicador de desempenho

mais realista e útil, uma vez que reflete no objetivo final da modelagem – predições

para novos experimentos. Assim como R2, Q2 tem um limite superior em 1. Para que

um modelo passe por esses testes, tanto R2 quanto Q2 devem ser altos, e

preferencialmente não separados por valores maiores que 0,2 – 0,3. Diferenças

maiores entre esses valores indicam um alerta de um modelo inapropriado. De uma

forma geral, Q2>0,5 pode ser considerado como bom e Q2>0,9 como excelente.[84]

A exatidão, em geral é usado para descrever a proximidade de uma medida com um

valor tido como verdadeiro.[85] Em modelos de classificação, a Exatidão representa

o número de amostras preditas corretamente em relação ao total de amostras no

conjunto teste.[86] É recomendado utilizar o menor número possível de

componentes na construção do modelo a partir do qual não haja um ganho

significativo na exatidão e nos demais parâmetros de avaliação do modelo, e isso

deve ser feito mantendo os valores destes parâmetros próximos a 1 e, assim,

garantir a alta capacidade de predição do modelo. A utilização de um número de

componentes superior ao necessário resulta na inclusão de informações

desnecessárias ao modelo, tornando-o superajustado e desta forma comprometendo

a sua capacidade preditiva.

Os altos valores que foram obtidos pelos parâmetros R2, Q2 e exatidão

garantem a racionalidade do modelo construído para o presente estudo.

Outro critério importante a ser utilizado na seleção de potenciais

biomarcadores fornecido pelo PLS-DA são os resultados do VIP (do inglês Variable

Influence on Projection), as variáveis que apresentam valores mais distantes de 1

apresentam por sua vez uma maior influência na separação dos grupos. Foram

encontradas no total 83 variáveis com valor maior do que 1. A Figura 10 ilustra o

resultado desta análise para as 15 variáveis com maiores valores de VIP, onde as

caixas coloridas indicam a concentração relativa da variável em questão para cada

um dos grupos estudados.

44

Figura 10. VIP plot com as 15 variáveis com maior influência no modelo PLS-DA obtido para fração aquosa analisada no modo positivo.

4.2.2 Fração Orgânica – Modo Positivo

Os cromatogramas característicos obtidos comparando os grupos CNT,

LEU_CNT e LEU_VXL para a fração orgânica no modo positivo de análise são

apresentados na Figura 11.

45

Figura 11. Cromatograma de íons totais da fração orgânica analisada no modo positivo utilizando uma coluna C18 com vazão de fase móvel de 0,4 mLmin-1. (A) CNT, (B) LEU_CNT e (C) LEU_VXL.

Assim como os dados referentes ao extrato aquoso, os dados brutos

referentes ao extrato orgânico também foram submetidos aos pré-processamentos

de forma a obter a tabela de dados para utilizar os métodos quimiométricos

pertinentes. A Figura 12 exibe os resultados score plot do PCA e o dendrograma da

HCA.

Figura 12. PCA Score plot (esquerda) e HCA (direita) obtidos a partir dos dados da fração orgânica analisada no modo positivo.

7x10

2

4

6

+ESI TIC Scan Frag=175.0V CNT_M1_Apolar_POS.d

1 1

7x10

2

4

6

+ESI TIC Scan Frag=175.0V LEU CNT_M1_Apolar_POS.d

1 1

7x10

0

2

4

6

8

+ESI TIC Scan Frag=175.0V LEU VXL_M1_Apolar_POS.d

1 1

Acquisition Time (min)0.5 1 1.5 2 2.5 3 3.5 4 4.5 5 5.5 6 6.5 7 7.5 8 8.5 9 9.5 10 10.5 11 11.5 12 12.5 13 13.5 14 14.5 15 15.5 16 16.5 17 17.5

(A)

(B)

(C)

Inte

nsity

(Co

unt

s)

PC 1 (28.4%)

PC

2 (

17%

)

46

Observando o score plot da Figura 12, é possível notar uma separação

entre o grupo CNT e o grupo LEU_VXL, no entanto ocorreu uma pequena

sobreposição entre a elipse a 95% de confiança entre o grupo controle e o grupo

leucemia. A tendência de similaridade entre esses grupos também pode ser

observada no dendrograma onde uma das amostras do grupo CNT foi agrupada

junto ao grupo LEU_CNT (a amostra do grupo CNT que, no score plot encontra-se

mais próxima do grupo LEU_CNT). A informação contida nas duas primeiras

componentes do score plot é capaz de explicar 45,5% da variância total do conjunto

de dados, um valor inferior quando comparado ao resultado obtido pelo extrato

aquoso.

O conjunto de dados também foi submetido à análise por PLS-DA (Figura

13). Os resultados obtidos para os parâmetros de validação são exibidos na Tabela

5. Para obter valores acima 0,9 é necessário incluir ao modelo no mínimo um

número correspondente a 5 componentes. Os valores de Exatidão, Q2 e R2

utilizando três componentes para a construção do modelo de classificação foram

0,9333 para Exatidão, 0,99992 para R2 e 0,95274 para Q2 e foram considerados

satisfatórios, garantindo a capacidade de predição do modelo. Por fim, a partir do

modelo PLS-DA construído com esses dados foram obtidas 35 variáveis com valores

de VIP >1 e consideradas como potenciais biomarcadores para esse conjunto de

dados.

47

Figura 13. Score plot (esquerda) e VIP plot (direita) do PLS-DA com os 15 potenciais marcadores para a fração orgânica analisada no modo positivo

Tabela 5. Parâmetros estatísticos de avaliação do modelo PLS-DA em função do número de componentes no modelo para a fração orgânica analisada no modo positivo


Exatidão 0,66667 0,86667 0,86667 0,86667 0,93333 1,0

R2 0,97014 0,99459 0,99709 0,99937 0,99992 0,99997

Q2 0,88396 0,9299 0,94103 0,94889 0,95274 0,95679

4.2.3 Fração Aquosa – Modo Negativo

A Figura 14 exibe os cromatogramas brutos obtidos comparando os

grupos CNT, LEU_CNT e LEU_VXL das amostras correspondentes à fração aquosa

analisada no modo negativo.

Componente 1 (28.2%)

Com

pone

nte

2 (1

1.5%

)

48

Figura 14. Cromatograma de íons totais da fração aquosa analisada no modo negativo utilizando uma coluna C18 Hydro com vazão de fase móvel de 0,4 mLmin-1. (A) CNT, (B) LEU_CNT e (C) LEU_VXL.

Após a realização dos pré-processamentos pertinentes aos

cromatogramas brutos, a matriz de dados subsequente foi então submetida também

aos métodos quimiométricos. A Figura 15 ilustra os resultados das análises

exploratórias multivariadas não supervisionadas.

7x10

0

0.25

0.5

0.75

1

1.25

1.5

1.75

-ESI TIC Scan Frag=175.0V CNT_M1_Polar_NEG.d

1 1

7x10

0

0.2

0.4

0.6

0.8

1

-ESI TIC Scan Frag=175.0V LEU CNT_M1_Polar_NEG.d

1 1

6x10

0

2

4

6

8

-ESI TIC Scan Frag=175.0V LEU VXL_M1_Polar_NEG.d

1 1

Acquisition Time (min)1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23

Inte

nsity

(Co

un

ts)

(A)

(B)

(C)

49

Figura 15. PCA Score plot (esquerda) e HCA (direita) obtidos a partir dos dados da fração aquosa analisada no modo negativo.

Analisando o score plot exibido na Figura 15 nota-se a separação

completa do grupo CNT na primeira componente principal, onde as duas primeiras

componentes principais descreveram uma porcentagem de variância acumulada de

70% dos dados, entretanto observou-se uma sobreposição na elipse a 95% de

confiança do grupo LEU_CNT com o grupo LEU_VXL o que indicaria, considerando

somente esta análise, que as mudanças no perfil dos metabólitos endógenos que

possuem afinidade pela fração aquosa são úteis na diferenciação de camundongos

saudáveis de camundongos leucêmicos, porém são insuficientes para diferenciar

camundongos leucêmicos de camundongos leucêmicos submetidos ao protocolo de

quimioterápicos avaliado nesse estudo, e desta forma se constataria de uma forma

equivocada que os camundongos submetidos aos quimioterápicos não estariam

respondendo ao tratamento, porém, para as mesmas amostras, quando analisadas

no modo positivo observou-se um comportamento contrário, ou seja, que o perfil de

metabólitos passíveis de ionização no modo positivo geraram mudanças suficientes

que viabilizassem tanto a detecção da doença, quanto a visualização da resposta

inicial ao tratamento (Figura 6). Uma inspeção atenta aos cromatogramas brutos

mostra que o cromatograma referente ao grupo CNT mostrou-se nitidamente

PC 1 (56.2%)

PC

2 (

13.8

%)

50

diferente em relação aos cromatogramas referentes aos grupos LEU_CNT e

LEU_VXL (principalmente quando se observa o intervalo da análise cromatográfica

compreendido entre 11 a 15 minutos), que por sua vez mostraram-se bastante

semelhantes entre si, isso possivelmente explica, em parte, o comportamento

observado no PCA. Já no HCA, observando a escala de distâncias no eixo inferior

do dendrograma, nota-se o afastamento bastante acentuado do grupo CNT em

relação aos grupo LEU_CNT e LEU_VXL, enquanto que os grupos LEU_CNT e

LEU_VXL estiveram mais próximos entre si. Diferentemente do resultado do HCA

para a fração orgânica analisada no modo positivo (Figura 12), para este caso,

nenhuma amostra mostrou tendência de agrupamento em um grupo diferente do

qual ela pertence, entretanto nota-se que uma amostra do grupo LEU_VXL

distanciou-se bastante das demais amostras correspondentes ao mesmo grupo,

ficando mais próxima do grupo CNT (a amostra denominada LEU_VXL_M3). A

Figura 16 exibe o score plot e o índice VIP da análise de PLS-DA para esse

conjunto de dados.

Figura 16. Score plot (esquerda) e VIP plot (direita) do PLS-DA com os 15 potenciais marcadores para a fração aquosa analisada no modo negativo.


Com

pone

nte

2 (2

1%)

51

Observando-se o score plot do PLS-DA, localizado à esquerda, nota-se

novamente a separação completa do grupo CNT (similar ao observado no PCA) e

um resultado um pouco melhor com relação aos grupos LEU_CNT e LEU_VXL,

porém ainda é possível visualizar uma pequena sobreposição nas elipses a 95% de

confiança correspondentes à esses dois grupos, onde a mesma amostra citada

anteriormente, que exibe um comportamento anômalo, certamente exerce influência

sobre o resultado observado e uma amostra com comportamento similar as demais

correspondentes ao mesmo grupo possivelmente contribuiria para a obtenção de

melhores resultados para esse conjunto de dados. A Tabela 6 mostra os resultados

dos parâmetros da validação cruzada referente à esse conjunto de dados. A

utilização de 3 Componentes para esse modelo representa um número adequado,

pois além de se ter valores acima de 0,9 para todos os parâmetros, à partir da

quarta componente em diante, apesar dos valores mais elevados obtidos pelo

parâmetro R2 resultantes do aumento de Componentes ao modelo, da terceira para

a quarta Componente não é mais observado um ganho significativo no valor do

parâmetro Q2, que mudou de 0,90069 para 0,90607 (menos de 1% de aumento).

Tabela 6. Parâmetros estatísticos de avaliação do modelo PLS-DA em função do número de componentes no modelo para a fração aquosa analisada no modo negativo


Exatidão 0,33333 1,0 1,0 1,0 1,0 1,0

R2 0,77725 0,94804 0,97884 0,98755 0,99714 0,99924

Q2 0,67312 0,86666 0,90069 0,90607 0,89096 0,89342

4.2.4 Fração Orgânica – Modo Negativo

E por fim a amostras do estudo referentes ao extrato orgânico também

foram analisadas no modo negativo. Os cromatogramas brutos obtidos comparando-

se os grupos CNT, LEU_CNT e LEU_VXL são exibidos na Figura 17.

52

Figura 17. Cromatograma de íons totais da fração orgânica analisada no modo negativo utilizando uma coluna C18 com vazão de fase móvel de 0,4 mLmin-1. (A) CNT, (B) LEU_CNT e (C) LEU_VXL.

Os dados pré-processados oriundos desta análise foram

subsequentemente submetidos às análises quimiométricas, onde seus respectivos

resultados são exibidos na Figura 18, Figura 19 e Tabela 7.

O score plot da análise de PCA (Figura 18) mostra que não houve

qualquer tipo ou tendência de separação por parte dos grupos, o que se observa de

fato é a uma sobreposição nas elipses a 95% de confiança referente aos três

grupos; e consequentemente a análise de HCA também mostra no dendrograma

que não existem similaridades entre amostras dentro um mesmo grupo que

permitam que sejam formados agrupamentos de amostras referentes ao seu

respectivo grupo. Realizando uma visualização atenta aos cromatogramas brutos

(Figura 17) nota-se que os 3 cromatogramas exibidos mostram-se bastante

similares entre si, o que possivelmente explica, ao menos, em parte, o

comportamento observado nas análises exploratórias. Com relação ao PLS-DA

(Figura 19), nota-se uma tendência de separação entre os grupos CNT E LEU_VXL

na primeira componente do score plot, entretanto observa-se uma sobreposição na

elipse a 95% de confiança correspondente ao grupo LEU_CNT com os grupos CNT

e LEU_VXL. A separação pobre observada no PLS-DA para esse conjunto de

dados acabou refletindo nos resultados dos parâmetros referentes à validação

7x10

0

0.5

1

1.5

2

-ESI TIC Scan Frag=175.0V CNT_M1_Apolar_NEG.d

1 1

7x10

0

0.25

0.5

0.75

1

1.25

1.5

1.75

-ESI TIC Scan Frag=175.0V LEU CNT_M1_Apolar_NEG.d

1 1

7x10

0

0.5

1

1.5

-ESI TIC Scan Frag=175.0V LEU VXL_M1_Apolar_NEG.d

1 1

Acquisition Time (min)0.5 1 1.5 2 2.5 3 3.5 4 4.5 5 5.5 6 6.5 7 7.5 8 8.5 9 9.5 10 10.5 11 11.5 12 12.5 13 13.5 14 14.5 15 15.5 16 16.5 17 17.5

Inte

nsity

(Co

un

ts)

(A)

(B)

(C)

53

cruzada (Tabela 7), onde tais resultados se mostraram inferiores quando

comparados aos demais resultados de validação cruzada (fração aquosa e orgânica

analisada no modo positivo e fração aquosa analisada no modo negativo).

Figura 18. PCA Score plot (esquerda) e HCA (direita) obtidos a partir dos dados da fração orgânica analisada no modo negativo.

Figura 19. Score plot (esquerda) e VIP plot (direita) do PLS-DA com os 15 potenciais marcadores para a fração orgânica analisada no modo negativo.

PC 1 (46,3%)

PC

2 (

19,7

%)


Co

mp

on

en

te 2

(2

1%

)

54

Tabela 7. Parâmetros estatísticos de avaliação do modelo PLS-DA em função do número de componentes no modelo para a fração orgânica analisada no modo negativo.


Exatidão 0,6 0,6 0,6666 0,6666 0,6 0,73333

R2 0,80126 0,88378 0,92965 0,9514 0,97634 0,98566

Q2 0,6606 0,67392 0,73856 0,79404 0,76949 0,7557

Comparando os resultados referentes aos itens 4.2.1, 4.2.2, 4.2.3 e 4.2.4

foi possível observar que os resultados obtidos pela fração aquosa analisada no

modo positivo mostraram-se melhores em comparação aos resultados obtidos pela

fração orgânica analisada no mesmo modo, e as frações aquosa e orgânica

analisadas em modo negativo, tomando como base os resultados fornecidos da

PCA, HCA e também PLS-DA (scores, loadings, dendrograma e validação cruzada),

mostrando, assim, que os metabólitos endógenos que possuem afinidade por essa

fração, que são passíveis de detecção no modo positivo; bem como as estratégias

adotadas no preparo de amostra (utilizando separação de fases), na separação

cromatográfica (utilizando uma coluna Hydro) e no tratamento dos dados mostraram-

se determinantes para a classificação adequada de cada um dos grupos propostos

no estudo e na busca por potenciais biomarcadores. Os modelos de PLS-DA

gerados com os dados da fração orgânica analisada no modo positivo e da fração

aquosa analisada no modo negativo se mostraram, no entanto, úteis na distinção

entre camundongos saudáveis e camundongos com leucemia (grupo CNT e

LEU_CNT, respectivamente). E por fim os resultados da fração orgânica analisada

no modo negativo se mostraram insuficientes na distinção entre camundongos

saudáveis (CNT) e camundongos com leucemia (LEU_CNT). Apesar do tempo

necessário por amostra para a aquisição de todos esses dados (cerca de 96 minutos

para cada amostra), caso o propósito do estudo seja meramente a diferenciação de

camundongos saudáveis de leucêmicos, ou verificar a resposta de camundongos

leucêmicos quando submetidos ao tratamento quimioterápico com vincristina,

dexametasona e asparaginase, uma análise de 26 minutos (correspondente ao

tempo da corrida cromatográfica para a fração aquosa analisada no modo positivo)

apresentou resultados satisfatórios, e desta forma, dispensa a realização das

55

demais análises referentes à fração orgânica no modo positivo e a fração aquosa e

orgânica no modo negativo .

4.3 MS/MS de potenciais biomarcadores

Neste tópico são discutidas as tentativas de identificação dos principais

potenciais biomarcadores, bem como as dificuldades e desafios inerentes a essa

etapa. Após verificar que os compostos oriundos do extrato aquoso quando

analisados no modo positivo de ionização fornecem os melhores resultados e são os

melhores classificadores de cada um dos grupos envolvidos no estudo, a etapa

posterior consistiu na tentativa de identificação dos íons correspondentes às

variáveis que exercem maior influência no respectivo modelo de PLS-DA. Esta etapa

foi realizada apenas com o intuito de fornecer informações adicionais e

complementares ao estudo, de forma a auxiliar em futuros trabalhos, uma vez que

os objetivos gerais inicialmente propostos foram alcançados. Nesta etapa foram

escolhidas as variáveis com o índice VIP superior a 1, e a tentativa de identificação

se deu por meio da medida da massa exata, que fornece a fórmula molecular do

metabólito, e por meio de experimentos do CID que por sua vez fornecem

informações estruturais; e com esses dados foi realizada uma busca na base de

dados do METLIN, HMDB, Lipid Maps e KEGG. Para exemplificar essa tarefa,

escolheu-se a variável M496T12 que apresentou o valor de p = 0,00137 e índice VIP

de 2,4979; com 0,6 ppm de erro a fórmula molecular atribuída para o íon de m/z

496,3401 foi C24H50NO7P. O íon precursor foi observado na forma [M+H]+. A Figura

20 exibe o espectro de MS/MS para o íon 496 com as estruturas propostas para o

íon precursor e para os principais fragmentos observados utilizando 30 V de energia

de colisão.

Por se tratar de uma matriz complexa e com uma diversidade grande de

metabólitos como o plasma, a medida de massa exata é insuficiente para a

identificação final do metabólito. De acordo com a busca efetuada no banco de

dados, a fórmula C24H50NO7P pode corresponder a algumas fosfatidilcolinas (PC’s) e

à fosfatidiletanolamina PE (19:0/0:0), no entanto observa-se no espectro um íon

intenso de m/z 184,0734, correspondente à fosfocolina, m/z 104,1070

correspondente à colina e o m/z 86,0970 correspondente à perda de água da colina.

56

Estes são íons produtos característicos de PC’s na qual elimina a possibilidade da

variável M496T12 corresponder à uma PE. A comparação do espectro obtido

experimentalmente com o espectro do banco de dados e publicações[87] [29] supõe

à variável M496T12 como sendo possívelmente a LysoPC(16:0).

Figura 20. Espectro de MS/MS do tipo varredura de íons produtos para o íon m/z 496 com tempo de retenção de 12 minutos do extrato aquoso analisado no modo positivo utilizando 30 V de energia de colisão.

A medida de massa exata, e o espectro de MS/MS possibilitou a

percepção de outras PC’s presentes entre os principais potenciais marcadores por

meio da fragmentação característica desta classe. A variável M520T13 é um outro

exemplo. Com um valor de p = 0,000223 e índice VIP de 2,1457, a medida da massa

exata fornece a fórmula C26H50NO7P com um erro de 1,15 ppm para a m/z 520,3404

correspondente à LysoPC (18:2), observado no espectro na forma [M+H]+. Assim

como no caso da variável M496T12, a variável M520T13 também retornou uma

fosfatidiletanolamina, a PE (10:0/11:0) como uma sugestão do banco de dados,

inclusive, para este caso, com um erro em ppm inferior à LysoPC (18:2) para a

fórmula C26H52NO8P (0,19 ppm). Mais uma vez o experimento de MS/MS se mostrou

determinante para auxiliar nas etapas de identificação do metabólito e sua classe

mediante o perfil de fragmentação. O íon m/z 520,3404 quando submetido à MS/MS

apresenta os fragmentos 184, 104 e 86, típicos de fosfatidilcolinas. Além disso, o

4x10

0

0.1

0.2

0.3

0.4

0.5

0.6

0.7

0.8

0.9

1

1.1

1.2

1.3

1.4

1.5

1.6

1.7

+ESI Product Ion (11.709-12.054 min, 6 Scans) Frag=175.0V [email protected] (496.3400[z=1] -> **) Polar.d

184.0739

104.1070

60.0806166.0625 313.2715 353.1179258.1149 496.3388405.1788

Mass-to-Charge (m/z)40 60 80 100 120 140 160 180 200 220 240 260 280 300 320 340 360 380 400 420 440 460 480 500 520 540

Inte

nsiit

y(C

ou

nts

)

86.0970124.9997

57

banco de dados sugeriu outras fosfatidilcolinas para a medida de massa exata

apresentada. Optou-se pela LysoPC (18:2) devido à informações encontradas na

literatura.[29] A Figura 21 mostra o espectro de MS/MS deste composto utilizando

20 V de energia de colisão.

Figura 21. Espectro de MS/MS do tipo varredura de íons produtos para o íon 520 com tempo de retenção de 13 minutos do extrato aquoso analisado no modo positivo utilizando 30 V de energia de colisão.

Com relação as LysoPC’s, essa classe de compostos consiste em

diferentes combinações de ácidos graxos ligados à fosfocolina, e variam em

números de carbonos e em insaturações na cadeia alquílica localizada na posição

sn-1(Figura 22). 16, 18 e 20 carbonos são as quantidades mais comuns

encontradas em LysoPC’s, que por sua vez são encontradas em pequenas

quantidades em tecidos. No plasma sanguíneo, quantidades significativas de

LysoPC’s são formadas pelo sistema enzimático lecitina:colesterol aciltransferase

(LCAT), no qual é secretado pelo fígado e são encontradas em concentrações que

variam de 31,5 µM[74] a 37,4 µM.[9] O referido sistema enzimático cataliza a

transferência de ácidos graxos da posição sn-2 das PC’s antecessoras para

colesterol livre em plasma, com formação de ésteres de colesterol e as posteriores

LysoPC’s sucessoras.[88] Essa classe de moléculas está envolvida em diversos

processos biológicos incluindo sinalização celular, metabolismo energético, e

integridade/estabilidade celular. Alterações nos níveis de LysoPC’s já foram

relatados em alguns cânceres incluindo câncer de mama,[89] carcinoma

5x10

0

0.2

0.4

0.6

0.8

1

1.2

1.4

1.6

1.8

2

2.2

2.4

2.6

2.8

3

3.2

+ESI Product Ion (12.776-13.328 min, 36 Scans) Frag=175.0V (520.3400[z=1] -> **) LEU_CNT_M2_MSMS_10_20_30_40_TODOS_Polar.d

184.0728

104.1061

520.3367

86.0966

124.9989502.3252166.0624 258.1083 337.2710 443.2522

Mass-to-Charge (m/z)

20 40 60 80 100 120 140 160 180 200 220 240 260 280 300 320 340 360 380 400 420 440 460 480 500 520 540 560 580 600 620 640

Inte

ns

ity(C

ou

nts

)

58

epidermóide do esôfago,[90] câncer de ovário,[91] e carcinoma hepatocelular, [92]

No caso da LysoPC (16:0) e da LysoPC (18:2), Bai e colaboradores observaram

alterações nos níveis desses compostos em um estudo envolvendo leucemia em

seres humanos, no qual o autor atribui a alteração no metabolismo de

glicerofosfolipídios ao caráter proliferativo anormal de células de câncer que

necessitam de síntese de ácidos graxos para desempenhar a referida função.[29]

[93]

Figura 22. Fórmula estrutural geral para fosfolipídios com indicações das posições sn-1, sn-2 e sn-3. No caso de LysoPC's a posição sn-2 sofre hidrólise.

E para complementar, é apresentado um último caso, correspondente à

variável M303T16, que apresentou um valor de p = 0,0000235 e índice VIP de

1,1692. Foi observado um íon precursor de m/z 303,2321. O banco de dados sugere

alguns eicosanóides como resultados da busca de acordo com a medida de massa

exata fornecida, onde alguns dos compostos dessa classe correspondem à

diferentes ácidos hidróxi eicosatetraenóicos, variando nas posições das 4

insaturações e da hidroxila ligada à porção alifática, e o íon precursor

correspondente à esses compostos surge no espectro na forma [M+H-H2O]+ onde

ocorre uma perda da hidroxila da estrutura na forma de uma perda neutra de água

logo na fonte de ionização, dando origem à mais uma insaturação ao íon precursor.

Além disso, outros eicosanóides sugeridos pela busca no banco de dados

59

correspondem à diferentes ácidos dihidróxi eicosatrienóicos variando nas posições

das 3 insaturações e das duas hidroxilas ligada à porção alifática, do qual o íon

precursor correspondente à esses compostos surge no espectro na forma [M+H-

2H2O]+ onde ocorre uma perda de ambas hidroxilas da estrutura na forma de duas

perdas neutras prévias de água na fonte de ionização, dando origem à duas novas

insaturações ao íon precursor, resultando em ambos os casos numa estrutura similar

ao ácido eicosapentaenóico (Figura 23). O ácido eicosapentaenóico, na forma

[M+H]+ foi também uma outra sugestão do banco de dados. É importante notar que

em todas as possibilidades apresentadas (ácidos hidróxi eicosatetranóicos, ácidos

dihidróxi eicosatrienóicos e ácido eicosapentanóico), serão gerados o mesmo íon

precursor, e consequentemente serão gerados espectros de MS/MS com perfil de

fragmentação muito similares entre si, e dessa forma, não é possível realizar

afirmações acerca do tipo de aduto do qual íon m/z 303,2321 seria oriundo.

Figura 23. Fórmulas estruturais do (A) ácido hidróxi eicosatetraenóico, (B) ácido dihidróxi eicosatrienóico, (C) ácido eicosapentaenóico.

Apesar da impossibilidade de realizar a afirmação à respeito do tipo de

aduto referente, bem como ao tipo do suposto eicosanoide; analisando atentamente

o espectro de MS/MS obtido experimentalmente, fornecido pela Figura 24 em

-H2O -2H2O

(A) (B)

(C)

60

comparação com outros espectros de MS/MS de eicosanóides, e metabólitos de

outras classes que possuem o íon precursor de mesma m/z, fornecidos pelo banco

de dados, observou-se uma similaridade entre os espectros de MS/MS referentes à

eicosanoides oriundos do banco de dados com o espectro obtido

experimentalmente, e uma disparidade com os espectros de MS/MS fornecidos pelo

banco de dados referentes à metabólitos de outras classes que possuem o íon

precursor de m/z 303, reforçando a possibilidade do espectro obtido

experimentalmente corresponder à um eicosanoide devido à semelhança deste dado

com a informação obtida do banco de dados.

Figura 24. Espectro de MS/MS do tipo varredura de íons produtos para o íon 303 com tempo de retenção de 16 minutos do extrato aquoso analisado no modo positivo.

Ainda com relação ao espectro de MS/MS fornecido pela Figura 24, é

possível notar duas tendências importantes. A primeira é que alguns íons do

espectro (região entre 60-150 Da) apresentam diferenças de massa de 14 Da, o que

normalmente corresponde à um grupo CH2, além das perdas neutras de C2H4. A

segunda observação é que para alguns íons além das diferenças de 14 unidades, é

possível observar um íon correspondente com 2 unidades de massa a mais,

normalmente com intensidade inferior, o que normalmente refere-se à mesma

estrutura, porém com uma insaturação a menos. Esse é um comportamento típico

de estruturas alquílicas com insaturações quando submetidos à MS/MS, e

2x10

0

0.2

0.4

0.6

0.8

1

1.2

1.4

1.6

1.8

2

2.2

2.4

2.6

2.8

3

3.2

3.4

3.6

3.8

+ESI Product Ion (15.477-15.893 min, 37 Scans) Frag=175.0V (303.2300[z=1] -> **) LEU_CNT_M2_MSMS_10_20_30_40_TODOS_Polar.d

91.0545

303.2305

105.0702

67.053681.0698

131.0845

145.1005

285.2193157.1002 201.1267

243.2109 267.2091

Mass-to-Charge(m/z)30 40 50 60 70 80 90 100 110 120 130 140 150 160 170 180 190 200 210 220 230 240 250 260 270 280 290 300 310 320

93.069769.0964

107.0858

Inte

ns

ity(C

ou

nts

)

61

observando a porção alquílica da estrutura do íon precursor, essa observação se

mostra concordante com a porção alquílica da estrutura dos eicosanóides.

Com relação aos ácidos dihidróxi eicosatrienóicos, esses compostos

pertencem à classe de compostos orgânicos conhecido como leucotrienos, e são

encontrados em biofluídos como sangue e fluído cerebrospinhal em concentrações

variando de 0,00051 µM [94] a 0,000244 µM [74] no sangue humano. Sobre o ácido

hidróxi tetraenóico, trata-se de um produto da oxidação radicalar do ácido

araquidônico. Alterações nos níveis de ácidos hidróxi tetraenóicos foram relatadas

em pacientes com doença da artéria coronária.[95] Tanto no caso dos ácidos

dihidróxi eicosatrienóicos quanto no caso dos ácidos hidróxi eicosatetraenóicos

ambos são compostos pertencentes à classe dos eicosanoides contendo grupos

hidroxila ligados à cadeia alifática, possuindo insaturações nas ligações carbono-

carbono. Eicosanóides gerados do metabolismo do ácido araquidônico pelas

enzimas do citocromo P450 possuem diversas funções biológicas, tais como,

sinalização celular, integridade/estabilidade de membrana, envolvimento na

regulação do tônus vascular, transporte tubular renal, contratilidade cardíaca,

inflamação e proliferação celular.[96] Alguns estudos relacionam leucotrienos a

algumas neoplasias como câncer coloretal,[97] câncer de pulmão,[98] e câncer de

cólon.[99]

Dentre os compostos que apresentaram índice VIP maior que 1, e

consequentemente foram considerados potenciais biomarcadores para a fração

aquosa no modo positivo, somente foi possível obter informações de maneira a

caracterizá-los parcialmente, em um número muito inferior em relação ao total de

compostos. Um dos maiores desafios em metabolômica untargeted por LC-MS se dá

na etapa de identificação de compostos. Essa é uma questão, inclusive, que carece

de desenvolvimentos recentes mais efetivos. Metabólitos incluem uma larga

variedade de estruturas como açúcares, lipídios, esteroides, aminoácidos, etc,

consequentemente com arranjos atômicos diversos. Sua diversidade química e de

propriedades físicas dificultam a criação regras gerais para a predição de padrões

de fragmentação[18], diferentemente de, por exemplo, peptídeos, onde sua

fragmentação ocorre preferencialmente nas ligações peptídicas, facilitando a

identificação em aplicações de sequenciamento de proteínas em proteômica, por

meio de perdas neutras de aminoácidos. Além disso, muitos metabólitos não geram

62

um perfil de fragmentação que os torne passível de interpretação; e para muitos

casos, pouca ou nenhuma fragmentação é observada, como por exemplo, em

compostos que possuem afinidade pela formação de adutos de sódio[100], o que

dificulta a obtenção de informação a respeito de sua estrutura; como um exemplo de

íons de difícil fragmentação, a Figura 25 mostra os espectros de MS/MS para os

íons referentes às variáveis M409T14_2 e M307T11 utilizando diferentes energias

de colisão. Tais variáveis também exibiram comportamento de potenciais

biomarcadores com valores de p = 0,005406 e 0,0012884 e índices VIP de 1,2946 e

1,047, respectivamente. Observando-se atentamente aos espectros exibidos nota-se

praticamente nenhuma fragmentação para os íons 409 e 307, mesmo com o

aumento da energia de colisão. Apesar da diminuição da intensidade referente ao

íon precursor, (chegando até o ruído na Figura 25 F) o que indicaria a fragmentação

do íon, não se observa um perfil de fragmentação passível de interpretação,e dessa

forma não é possível realizar qualquer afirmação correspondente à estrutura ou

parte da estrutura destes íons.

Figura 25. Espectros de MS/MS dos íons referentes às variáveis M409T14_2 e M307T11. Utilizando: 10 V (A), 20 V (B) e 30 V (C) de energia de colisão para o íon 409 e 10 V (D), 20 V (E) e 30 V (F) de energia de colisão para o íon 307.

4x10

0

2

4

+ESI Product Ion (13.374-13.943 min, 6 Scans) Frag=175.0V [email protected] (409.1600[z=1] -> **)

409.1598

117.0925 143.0116 377.129386.0843 324.2168195.1239 221.1487 277.6114 349.2559

4x10

0

1

2


409.1598

289.103285.064858.0666 238.1935 331.1878139.1107 394.1889353.2142202.1080

3x10

0

2


409.1597

289.103995.086569.0694 121.1025 245.0810156.1047 312.3280195.0306

3x10

0

0.5

1


307.1134

156.0789100.0531 227.1011205.1333 291.1452259.0916130.0532

2x10

0

1


307.1133

213.1112188.045886.0947 116.0699 248.1643139.0784 293.2262

1x10

0

2


130.0876102.090758.0741 173.0618 290.1857248.1105

219.0921

Counts vs. Mass-to-Charge (m/z)60 70 80 90 100 110 120 130 140 150 160 170 180 190 200 210 220 230 240 250 260 270 280 290 300 310 320 330 340 350 360 370 380 390 400 410 420 430 440 450

(A)

(B)

(C)

(D)

(E)

(F)

63

O contrário também pode ocorrer, ou seja, metabólitos extremamente

lábeis podem fragmentar-se na fonte de ionização e dessa forma, dependendo da

extensão da fragmentação, a informação da fórmula molecular obtida a partir da

molécula precursora intacta pode ser perdida, prejudicando ainda mais a tarefa de

identificação; apesar desse fato não ter sido um problema para a identificação do

eicosanoide mencionado anteriormente, onde o íon precursor é detectado com

perda prévia de água, tampouco em casos análogos; a fragmentação na fonte pode

tornar-se problemática em relação à identificação de compostos que fragmentam na

fonte onde tal fragmentação não é proveniente de uma ou duas perdas neutras de

água, e, para quaisquer casos similares que possam surgir, o banco de dados será

incapaz de determinar qual foi a perda neutra na fonte de ionização .A Figura 26

ilustra o exemplo da fenilalanina. Observando atentamente a ilustração nota-se na

parte superior (Figura 26A) o EIC para o íon de m/z 166.9781 que mostra o tempo

da análise cromatográfica na qual íons que possuem essa m/z eluem. O espectro de

MS para esse pico cromatográfico (Figura 26 B) mostra a existência de dois íons,

m/z 166.0870 e m/z 120.0809, o que inicialmente levaria a conclusão da existência

de dois metabólitos diferentes que eluem nessa região. Entretanto o espectro de

MS/MS para o íon m/z 166.0870 (Figura 26 C) mostra o íon m/z 120.0809 como um

de seus fragmentos, além dos demais fragmentos concordantes com o perfil de

fragmentação da fenilalanina. E por fim o espectro de MS/MS do íon m/z 120.0809

(Figura 26 D) mostra exatamente o mesmo perfil de fragmentação do íon m/z

166.0870 mostrando que os íons m/z 166.0870 e m/z 120.0809 exibidos no espectro

de MS (Figura 26B) tratam-se da fenilalanina que fragmentou-se na fonte. É

importante salientar que para esse caso, a diferença de massa entre o íon precursor

e o íon produto é de 46 Da, e, como essa perda neutra não está inclusa nos casos

[M+H-H2O]+ e nem [M+H-2H2O]+, o software de processamento de dados, bem como

o banco de dados seriam incapazes de detectar a redundância dessa informação e

interpretaria ambos os íons como metabólitos distintos Para o caso da fenilalanina,

essa situação pode ser contornada, pois os dados de MS/MS para esse metabólito

são amplamente difundidos, além disso é possível visualizar o íon precursor na

forma não fragmentada, entretanto essa situação pode tornar-se problemática com

relação à metabólitos que fragmentam-se numa extensão na qual não é possível

64

visualizar o íon precursor no espectro de MS, bem como com relação à metabólitos

que carecem de dados de MS/MS em bancos de dados e publicações.

Figura 26. Dados para o extrato aquoso no modo positivo exibindo: (A) EIC para o íon m/z 166.0871 com ampliação na região de m/z 50-225 Da (B) espectro de MS para o pico cromatográfico que elui em 9 minutos de análise, (C) espectro de MS/MS para o íon m/z 166.0871 e (D) MS/MS para o íon m/z 120.0909.

Outro fator que dificulta a identificação de metabólitos por LC-MS é o

banco de dados incipiente e de cobertura limitada, justamente por ser uma área do

conhecimento de aplicação recente. As informações de identificação de metabólitos

em bancos de dados por MS/MS estão disponíveis em uma quantidade muito inferior

quando comparada à quantidade de informações referentes à identificação de

compostos unicamente pela massa exata. A tentativa de identificação de um

metabólito somente com as informações de massa exata é, de certa forma,

insuficiente e inadequada, mesmo para valores baixos de erros em ppm, pois a

complexidade de matrizes biológicas permite a coexistência de compostos de

6x10

0

0.2

0.4

0.6

0.8

1

+ESI Scan (8.811 min) Frag=175.0V QC_Geral_MSMS_Polar_POS.d

120.0809166.0870

127.0503 153.0664 194.1189141.9588 208.1339175.0191

3x10

0

2

4

6

8

+ESI Product Ion (8.474-9.133 min, 18 Scans) Frag=175.0V (166.0871[z=1] -> **) QC_Geral_MSMS_Polar_POS.d

120.080977.0387

103.0542

51.022891.0542

65.0386131.0501

4x10

0

0.2

0.4

0.6

0.8

1

+ESI Product Ion (8.462-9.029 min, 15 Scans) Frag=175.0V (120.0812[z=1] -> **) QC_Geral_MSMS_Polar_POS.d

77.038751.0228 103.0542

91.054265.0387 120.0808

Mass-to-Charge (m/z)

40 45 50 55 60 65 70 75 80 85 90 95 100 105 110 115 120 125 130 135 140 145 150 155 160 165 170 175 180 185 190 195 200 205 210 215 220 225

6x10

0

0.2

0.4

0.6

0.8

1

1.2

+ESI EIC(166.0871) Scan Frag=175.0V QC_Geral_MSMS_Polar_POS.d

1 1

.Acquisition Time (min)

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23

EIC 166.0871

Inte

ns

ity

(Co

un

ts)

(A)

(B)

(C)

(D)

MS

MS/MS

166.0871

MS/MS

120.0909

Inte

ns

ity

(Co

un

ts)

166.0870

46 Da

65

fórmula molecular similar, porém com padrões de fragmentação completamente

distintos. Com relação à identificação de compostos por MS/MS pelo perfil de

fragmentação experimental e posterior comparação com os dados de MS/MS de

bancos de dados, ainda para este caso, essa abordagem possui a sua limitação:

tomando como exemplo de comparação a biblioteca de GC-MS, onde as

informações do perfil de fragmentação são provenientes de fragmentos oriundos

diretamente da fonte de ionização de EI, onde é sabido que essa fonte de ionização

permite uma extensa fragmentação, reprodutível o suficiente de modo a reunir os

dados em bibliotecas para a aplicação em identificação; não é possível, no entanto

obter o mesmo comportamento de reprodutibilidade para fragmentações por CID,

que são realizadas no interior do espectrômetro de massas. Essa fragmentação é

sujeita à variações, que se dão tanto na fonte de ionização de ESI, quanto no interior

de célula de colisão, onde um mesmo metabólito pode gerar fragmentos distintos em

diferentes instrumentos, e desta forma, dificultando o processo de identificação do

metabólito. Atualmente, para uma identificação inequívoca do metabólito por LC-MS

é necessário utilizar padrões analíticos do metabólito que se deseja identificar e

submetê-los às mesmas condições instrumentais (gradiente de eluição

cromatográfica, voltagens da fonte de ionização de ESI e energia de colisão), e caso

se obtenham os mesmos resultados (tempo de retenção e perfil de fragmentação

por MS/MS) é possível realizar a identificação definitiva e inequívoca do metabólito.

E desta forma, portanto, é importante deixar claro que, as estratégias empregadas

no presente trabalho, bem como os resultados obtidos, permitiram uma identificação

parcial dos metabólitos mencionados.

5 – CONCLUSÕES

Nesse estudo foi otimizado um método baseado em estratégias de

metabolômica por LC-MS. Por meio de diferentes metodologias testadas, como

precipitação de proteínas, separação de fases, e uso de diferentes colunas para

cada fração, foi possível avaliar a melhor estratégia que ofereceu como retorno a

maior quantidade de íons detectados e este método foi aplicado em um estudo de

interesse da área oncológica. Esta foi a primeira vez em que a abordagem por

66

metabolômica foi aplicada na comparação dos fingerprintings metabólicos em

camundongos NOD/SCID comparando-se grupos saudáveis, leucêmicos e

leucêmicos tratados com vincristina, dexametasona e asparaginase. Por meio das

estratégias adotadas para a realização do tratamento dos dados adquiridos, o

método proposto foi capaz de detectar as alterações geradas nos níveis de

metabólitos e, consequentemente, utilizando PLS-DA foi possível classificar de

forma eficiente todos os grupos de camundongos propostos pelo estudo, desde o

diagnóstico da leucemia até o monitoramento da resposta inicial ao tratamento mais

comum aplicado, atendendo todos os requisitos mínimos de avaliação de eficiência

do modelo de classificação, oferecendo uma ferramenta adicional útil para a

utilização em estudos na área oncológica. Como informação adicional, foi possível

verificar que parte desses potenciais biomarcadores correspondem à

glicerofósfolipídios e a eicosanóides, que puderam ser parcialmente identificados e

necessitam de investigações posteriores mais aprofundadas.

6 – REFERÊNCIAS

1. Sanger, F., S. Nicklen, and A.R. Coulson, DNA sequencing with chain-

terminating inhibitors. Proceedings of the National Academy of Sciences, 1977.

74(12): p. 5463-5467.

2. Garlow, S.J., And Now, Transcriptomics. Neuron, 2002. 34(3): p. 327-328.

3. Pandey, A. and M. Mann, Proteomics to study genes and genomes. Nature,

2000. 405(6788): p. 837-46.

4. Wang, Y., et al., Current state of the art of mass spectrometry-based

metabolomics studies – a review focusing on wide coverage, high throughput and

easy identification. RSC Advances, 2015. 5(96): p. 78728-78737.

5. Fiehn, O., et al., Metabolite profiling for plant functional genomics. Nature

Biotechnology, 2000. 18(11): p. 1157-61.

67

6. Yin, P. and G. Xu, Current state-of-the-art of nontargeted metabolomics based

on liquid chromatography-mass spectrometry with special emphasis in clinical

applications. Journal of Chromatography A, 2014. 1374: p. 1-13.

7. Holmes, E., I.D. Wilson, and J.K. Nicholson, Metabolic phenotyping in health

and disease. Cell, 2008. 134(5): p. 714-7.

8. Fukusaki, E., Application of Metabolomics for High Resolution Phenotype

Analysis. Mass Spectrometry (Tokyo), 2014. 3(Special Issue 3): p. S0045.

9. Wishart, D.S., et al., HMDB: the Human Metabolome Database. Nucleic Acids

Research, 2007. 35(Database issue): p. D521-6.

10. Kanehisa, M., KEGG: Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes. Nucleic

Acids Research, 2000. 28(1): p. 27-30.

11. Cotter, D., et al., LMPD: LIPID MAPS proteome database. Nucleic Acids

Research, 2006. 34(Database issue): p. D507-10.

12. Horai, H., et al., MassBank: a public repository for sharing mass spectral data

for life sciences. Journal of Mass Spectrometry, 2010. 45(7): p. 703-714.

13. Roberts, L.D., et al., Targeted metabolomics. Current Protocols in Molecular

Biology, 2012. Chapter 30: p. Unit 30 2 1-24.

14. Shulaev, V., Metabolomics technology and bioinformatics. Briefings in

Bioinformatics, 2006. 7(2): p. 128-39.

15. Fenn, J., et al., Electrospray ionization for mass spectrometry of large

biomolecules. Science, 1989. 246(4926): p. 64-71.

16. Horning, E.C., et al., New picogram detection system based on a mass

spectrometer with an external ionization source at atmospheric pressure. Analytical

Chemistry, 1973. 45(6): p. 936-943.

17. Robb, D.B., T.R. Covey, and A.P. Bruins, Atmospheric Pressure

Photoionization: An Ionization Method for Liquid Chromatography−Mass

Spectrometry. Analytical Chemistry, 2000. 72(15): p. 3653-3659.

68

18. Zhou, B., et al., LC-MS-based metabolomics. Molecular Biosystems, 2012.

8(2): p. 470-81.

19. Marmet, P., Quadrupole Mass Analyzers. Journal of Vacuum Science and

Technology, 1971. 8(1): p. 262.

20. Helmut, S. and P. Wolfgang, Apparatus for separating charged particles of

different specific charges, 1960, US Patent, 2939952.

21. Goudsmit, S.A., A Time-of-Flight Mass Spectrometer. Physical Review, 1948.

74(5): p. 622-623.

22. Hu, Q., et al., The Orbitrap: a new mass spectrometer. Journal of Mass

Spectrometry, 2005. 40(4): p. 430-43.

23. Hipple, J.A., H. Sommer, and H.A. Thomas, A Precise Method of Determining

the Faraday by Magnetic Resonance. Physical Review, 1949. 76(12): p. 1877-1878.

24. Glish, G.L., et al., A new “hybrid” sector/quadrupole mass spectrometer for

mass spectrometry/mass spectrometry. International Journal of Mass Spectrometry

and Ion Physics, 1982. 41(3): p. 157-177.

25. Chernushevich, I.V., A.V. Loboda, and B.A. Thomson, An introduction to

quadrupole-time-of-flight mass spectrometry. Journal of Mass Spectrometry, 2001.

36(8): p. 849-65.

26. Blankenberg, F.G., et al., Quantitative analysis of apoptotic cell death using

proton nuclear magnetic resonance spectroscopy. Blood, 1997. 89(10): p. 3778-

3786.

27. Rainaldi, G., et al., Metabolomics using 1H-NMR of apoptosis and Necrosis in

HL60 leukemia cells: differences between the two types of cell death and

independence from the stimulus of apoptosis used. Radiation Research, 2008.

169(2): p. 170-80.

28. Tiziani, S., et al., Metabolomics of the tumor microenvironment in pediatric

acute lymphoblastic leukemia. PLoS One, 2013. 8(12): p. e82859.

69

29. Bai, Y., et al., Biomarker identification and pathway analysis by serum

metabolomics of childhood acute lymphoblastic leukemia. Clinica Chimica Acta,

2014. 436: p. 207-16.

30. Pui, C.-H., Recent Research Advances in Childhood Acute Lymphoblastic

Leukemia. Journal of the Formosan Medical Association, 2010. 109(11): p. 777-787.

31. Pedrosa, F. and M. Lins, Leucemia linfóide aguda: uma doença curável.

Revista Brasileira de Saúde Materno Infantil, 2002. 2(1).

32. Nehmy, R.M.Q., et al., A perspectiva dos pais sobre a obtenção do

diagnóstico de leucemia linfóide aguda em crianças e adolescentes: uma

experiência no Brasil. Revista Brasileira de Saúde Materno Infantil, 2011. 11(3): p.

293-299.

33. Ortega, J.A., et al., L-Asparaginase, vincristine, and prednisone for induction

of first remission in acute lymphocytic leukemia. Cancer Research, 1977. 37(2): p.

535-40.

34. http://www.drugbank.ca/drugs/DB00541 , Acesso em 19/01/2016.



37. Lock, R.B., The nonobese diabetic/severe combined immunodeficient

(NOD/SCID) mouse model of childhood acute lymphoblastic leukemia reveals

intrinsic differences in biologic characteristics at diagnosis and relapse. Blood, 2002.

99(11): p. 4100-4108.

38. Bosma, G.C., R.P. Custer, and M.J. Bosma, A severe combined

immunodeficiency mutation in the mouse. Nature, 1983. 301(5900): p. 527-530.

39. Imada, K., Immunodeficient Mouse Models of Lymphoid Tumors. International

Journal of Hematology, 2003. 77(4): p. 336-341.

40. Uckun, F.M., et al., Prognostic significance of B-lineage leukemic cell growth

in SCID mice: a Children's Cancer Group Study. Leukemia & Lymphoma, 1998. 30(5-

6): p. 503-14.

70

41. Greiner, D.L., et al., Improved engraftment of human spleen cells in

NOD/LtSz-scid/scid mice as compared with C.B-17-scid/scid mice. The American

Journal of Pathology, 1995. 146(4): p. 888-902.

42. Shultz, L.D., et al., Multiple defects in innate and adaptive immunologic

function in NOD/LtSz-scid mice. The Journal of Immunology, 1995. 154(1): p. 180-

91.

43. Hudson, W.A., et al., Xenotransplantation of human lymphoid malignancies is

optimized in mice with multiple immunologic defects. Leukemia, 1998. 12(12): p.

2029-33.

44. Fusetti, L., et al., Human myeloid and lymphoid malignancies in the non-obese

diabetic/severe combined immunodeficiency mouse model: frequency of apoptotic

cells in solid tumors and efficiency and speed of engraftment correlate with vascular

endothelial growth factor production. Cancer Research, 2000. 60(9): p. 2527-34.

45. Baersch, G., et al., Good engraftment of B-cell precursor ALL in NOD-SCID

mice. Klinische Padiatrie, 1997. 209(4): p. 178-85.

46. Borgmann, A., et al., Childhood All Blasts Retain Phenotypic and Genotypic

Characteristics Upon Long-Term Serial Passage in Nod/Scid Mice. Pediatric

Hematology-Oncology, 2000. 17(8): p. 635-650.

47. Lee, J.Y., D.C. Kim, and H.-J. Kim, Humanized (SCID) Mice as a Model to

Study human Leukemia. Biomedical Science Letters, 2015. 21(2): p. 51-59.

48. Liem, N.L., et al., Characterization of childhood acute lymphoblastic leukemia

xenograft models for the preclinical evaluation of new therapies. Blood, 2004.

103(10): p. 3905-14.

49. Nijmeijer, B., Monitoring of engraftment and progression of acute

lymphoblastic leukemia in individual NOD/SCID mice. Experimental Hematology,

2001. 29(3): p. 322-329.

50. Locatelli, S.L., et al., Perifosine and sorafenib combination induces

mitochondrial cell death and antitumor effects in NOD/SCID mice with Hodgkin

lymphoma cell line xenografts. Leukemia, 2013. 27(8): p. 1677-87.

71

51. Bottero, V., et al., Kaposi's sarcoma-associated herpesvirus-positive primary

effusion lymphoma tumor formation in NOD/SCID mice is inhibited by neomycin and

neamine blocking angiogenin's nuclear translocation. Journal of Virology, 2013.

87(21): p. 11806-20.

52. Tan, C. and T.A. Waldmann, Proteasome inhibitor PS-341, a potential

therapeutic agent for adult T-cell leukemia. Cancer Research, 2002. 62(4): p. 1083-6.

53. Bellamy, W.T., Expression of vascular endothelial growth factor and its

receptors in multiple myeloma and other hematopoietic malignancies. Semininars in

Oncology, 2001. 28(6): p. 551-9.

54. Salven, P., L. Teerenhovi, and H. Joensuu, A high pretreatment serum

vascular endothelial growth factor concentration is associated with poor outcome in

non-Hodgkin's lymphoma. Blood, 1997. 90(8): p. 3167-72.

55. Gruss, H.J., et al., Pleiotropic effects of the CD30 ligand on CD30-expressing

cells and lymphoma cell lines. Blood, 1994. 83(8): p. 2045-56.

56. Nagy, Z.A., et al., Fully human, HLA-DR-specific monoclonal antibodies

efficiently induce programmed death of malignant lymphoid cells. Nature Medicine,

2002. 8(8): p. 801-7.

57. Cotter, F.E., J. Waters, and D. Cunningham, Human Bcl-2 antisense therapy

for lymphomas. Biochimica et Biophysica Acta (BBA) - Gene Structure and

Expression, 1999. 1489(1): p. 97-106.

58. Cotter, F.E., et al., Antisense oligonucleotides suppress B-cell lymphoma

growth in a SCID-hu mouse model. Oncogene, 1994. 9(10): p. 3049-55.

59. Mohammad, R., et al., Bcl-2 antisense oligonucleotides are effective against

systemic but not central nervous system disease in severe combined

immunodeficient mice bearing human t(14;18) follicular lymphoma. Clinical Cancer

Research, 2002. 8(4): p. 1277-83.

60. Stong, R.C., et al., Human acute leukemia cell line with the t(4;11)

chromosomal rearrangement exhibits B lineage and monocytic characteristics. Blood,

1985. 65(1): p. 21-31.

72

61. Sumner, L.W., et al., Proposed minimum reporting standards for chemical

analysis Chemical Analysis Working Group (CAWG) Metabolomics Standards

Initiative (MSI). Metabolomics, 2007. 3(3): p. 211-221.

62. Tautenhahn, R., et al., XCMS Online: a web-based platform to process

untargeted metabolomic data. Analytical Chemistry, 2012. 84(11): p. 5035-9.

63. van den Berg, R.A., et al., Centering, scaling, and transformations: improving

the biological information content of metabolomics data. BMC Genomics, 2006. 7: p.

142.

64. Hotelling, H., Analysis of a complex of statistical variables into principal

components. Journal of Educational Psychology, 1933. 24(6): p. 417-441.

65. Bridges, C.C., Hierarchical Cluster Analysis. Psychological Reports, 1966.

18(3): p. 851-854.

66. Barker, M. and W. Rayens, Partial least squares for discrimination. Journal of

Chemometrics, 2003. 17(3): p. 166-173.

67. Xia, J., et al., MetaboAnalyst: a web server for metabolomic data analysis and

interpretation. Nucleic Acids Research, 2009. 37(Web Server issue): p. W652-60.

68. Cruickshank-Quinn, C., et al., Multi-step preparation technique to recover

multiple metabolite compound classes for in-depth and informative metabolomic

analysis. Journal of Visualized Experiments, 2014(89).

69. Johansson-Persson, A., et al., LC-QTOF/MS metabolomic profiles in human

plasma after a 5-week high dietary fiber intake. Analytical and Bioanalytical

Chemistry, 2013. 405(14): p. 4799-809.

70. Shang, J., et al., UHPLC/Q-TOF MS-based plasma metabolic profiling

analysis of the bleeding mechanism in a rat model of yeast and ethanol-induced

blood heat and hemorrhage syndrome. Journal of Pharmaceutical and Biomedical

Analysis, 2014. 92: p. 26-34.

71. Michopoulos, F., et al., UPLC-MS-Based Analysis of Human Plasma for

Metabonomics Using Solvent Precipitation or Solid Phase Extraction. Journal of

Proteome Research, 2009. 8(4): p. 2114-2121.

73

72. Want, E.J., et al., Global metabolic profiling of animal and human tissues via

UPLC-MS. Nature Protocols, 2013. 8(1): p. 17-32.

73. Banerjee, S. and S. Mazumdar, Electrospray ionization mass spectrometry: a

technique to access the information beyond the molecular weight of the analyte.

International Journal of Analytical Chemistry, 2012. 2012: p. 282574.

74. Psychogios, N., et al., The human serum metabolome. PLoS One, 2011. 6(2):

p. e16957.

75. Tulipani, S., et al., Comparative analysis of sample preparation methods to

handle the complexity of the blood fluid metabolome: when less is more. Analytical

Chemistry, 2013. 85(1): p. 341-8.

76. Ferreiro-Vera, C., F. Priego-Capote, and M.D. Luque de Castro, Comparison

of sample preparation approaches for phospholipids profiling in human serum by

liquid chromatography-tandem mass spectrometry. Journal of Chromatography A,

2012. 1240: p. 21-8.

77. Lagace, T.A. and N.D. Ridgway, The role of phospholipids in the biological

activity and structure of the endoplasmic reticulum. Biochimica et Biophysica Acta,

2013. 1833(11): p. 2499-510.

78. Devlin, A.M. and T.J. Green, Mechanisms of altered fatty acid and

phospholipid levels in hyperhomocysteinemia. Clinical Lipidology, 2009. 4(2): p. 159-

166.

79. Davies, J.M., et al., Stool phospholipid signature is altered by diet and tumors.

PLoS One, 2014. 9(12): p. e114352.

80. Agatha, G., R. Häfer, and F. Zintl, Fatty acid composition of lymphocyte

membrane phospholipids in children with acute leukemia. Cancer Letters, 2001.

173(2): p. 139-144.

81. Murphy, E.J., et al., Phospholipid composition and levels are altered in down

syndrome brain. Brain Research, 2000. 867(1-2): p. 9-18.

82. Ramos, T.M.d.B., et al., Alterações nos níveis de colesterol, triglicerídeo e

fosfolipídeo total em plasma de Callithrix jacchus (sagüi) reinfectado por

74

Schistosoma mansoni. Revista da Sociedade Brasileira de Medicina Tropical, 2004.

37: p. 37-40.

83. Blekherman, G., et al., Bioinformatics tools for cancer metabolomics.

Metabolomics, 2011. 7(3): p. 329-343.

84. Eriksson, L., Design of Experiments: Principles and Applications2008:

Umetrics.

85. BS ISO 5725-1., Accuracy (trueness and precision) of measurement methods

and results - Part 1: General principles and definitions.: p. 1.

86. Liu, H., et al., Regularized partial least squares for multi-label learning.

International Journal of Machine Learning and Cybernetics, 2016.

87. Kim, S.C., et al., Differential levels of L-homocysteic acid and

lysophosphatidylcholine (16:0) in sera of patients with ovarian cancer. Oncology

Letters, 2014. 8(2): p. 566-574.

88. http://www.hmdb.ca/metabolites/HMDB02815 , Acesso em 11/05/2016.

89. Qiu, Y., et al., Mass spectrometry-based quantitative metabolomics revealed a

distinct lipid profile in breast cancer patients. International Journal of Molecular

Sciences, 2013. 14(4): p. 8047-61.

90. Xu, J., et al., Global and targeted metabolomics of esophageal squamous cell

carcinoma discovers potential diagnostic and therapeutic biomarkers. Molecular &

Cellular Proteomics, 2013. 12(5): p. 1306-18.

91. Zhang, T., et al., Discrimination between malignant and benign ovarian tumors

by plasma metabolomic profiling using ultra performance liquid

chromatography/mass spectrometry. Clinica Chimica Acta, 2012. 413(9-10): p. 861-

8.

92. Ressom, H.W., et al., Utilization of metabolomics to identify serum biomarkers

for hepatocellular carcinoma in patients with liver cirrhosis. Analytica Chimica Acta,

2012. 743: p. 90-100.

75

93. Dolce, V., et al., Glycerophospholipid Synthesis as a Novel Drug Target

Against Cancer. Current Molecular Pharmacology, 2011. 4(3): p. 167-175.

94. Quehenberger, O., et al., Lipidomics reveals a remarkable diversity of lipids in

human plasma. Journal of Lipid Research, 2010. 51(11): p. 3299-305.

95. Shishehbor, M.H., et al., Systemic elevations of free radical oxidation products

of arachidonic acid are associated with angiographic evidence of coronary artery

disease. Free Radical Biology & Medicine, 2006. 41(11): p. 1678-83.

96. http://www.hmdb.ca/metabolites/HMDB02311 , Acesso em 11/05/2016.

97. Savari, S., et al., Cysteinyl leukotrienes and their receptors: bridging

inflammation and colorectal cancer. World Journal of Gastroenterology, 2014. 20(4):

p. 968-77.

98. Poczobutt, J.M., et al., Eicosanoid profiling in an orthotopic model of lung

cancer progression by mass spectrometry demonstrates selective production of

leukotrienes by inflammatory cells of the microenvironment. PLoS One, 2013. 8(11):

p. e79633.

99. Bortuzzo, C., et al., The effect of leukotrienes B and selected HETEs on the

proliferation of colon cancer cells. Biochimica et Biophysica Acta (BBA) - Lipids and

Lipid Metabolism, 1996. 1300(3): p. 240-246.

100. Kruve, A., et al., Sodium adduct formation efficiency in ESI source. Jounal of

Mass Spectrometry, 2013. 48(6): p. 695-702.

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7 - ANEXOS

Anexo 1. Parecer do comitê de ética

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