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UNIVERSIDADE ESTADUAL DE CAMPINAS
INSTITUTO DE QUÍMICA
DANIELA KUBOTA
DESENVOLVIMENTO E CARACTERIZAÇÃO DE FORMULAÇÕES DO FÁRMACO
IMUNOSSUPRESSOR CICLOSPORINA A, EM NANOEMULSÃO
CAMPINAS
2016
DANIELA KUBOTA
DESENVOLVIMENTO E CARACTERIZAÇÃO DE FORMULAÇÕES DO FÁRMACO
IMUNOSSUPRESSOR CICLOSPORINA A, EM NANOEMULSÃO.
ORIENTADOR: PROF. Dr. FRANCISCO BENEDITO TEIXEIRA PESSINE
ESTE EXEMPLAR CORRESPONDE À VERSÃO FINAL DA TESE DEFENDIDA PELA
ALUNA DANIELA KUBOTA, E ORIENTADA PELO PROF. DR. FRANCISCO BENEDITO
TEIXEIRA PESSINE.
CAMPINAS
2016
Tese de Doutorado apresentada ao Instituto de
Química da Universidade Estadual de Campinas,
como parte dos requisitos exigidos para obtenção
do título de Doutora em Ciências.
BANCA EXAMINADORA
Prof. Dr. Francisco Benedito Teixeira Pessine (Orientador)
Profa. Dra. Iara de Fátima Gimenez (CCET –UFS)
Prof. Dr. Leonardo Fernandes Fraceto (UNESP - Sorocaba)
Profa. Dra. Márcia Miguel Castro Ferreira (IQ- UNICAMP)
Prof. Dr. René Alfonso Nome Silva (IQ - UNICAMP)
A ata da defesa com as respectivas assinaturas dos membros encontra-se no
processo de vida acadêmica do(a) aluno(a).
Este exemplar corresponde à redação final da Tese de
doutorado defendida pela aluna DANIELA KUBOTA,
aprovada pela Comissão Julgadora em 29 de março de
2016
Dedicatória
A meus pais, Vera Lúcia e Armando.
Houve um tempo em que se fazia ciência a partir de quatro elementos: água, terra,
fogo e ar. Naquele tempo não se sabia que é possível fazer qualquer coisa com
apenas dois: vontade e imaginação
(Oktar, 2003)
AGRADECIMENTOS
Primeiramente à minha família, por me apoiar sempre e pelo carinho
incondicional em todos os momentos. A todos os meus amigos que estiveram
presentes nessa fase de tantas mudanças na minha vida.
Ao meu orientador, Prof. Dr. Francisco B.T.Pessine, a quem tenho imensa
admiração pela pessoa que pude conhecer nesse curto período. Obrigada por todos
os conselhos e auxílios. Sempre terei um grande carinho por esse Sr.
Aos meus queridos companheiros de laboratório: Ana Cláudia, Andreza,
Caio, Daniel, Francieli, Letícia, Luciana, Marcelo, Milene e Viviane por todas as
explicações, discussões e risadas. Em especial as minhas amigas Letícia e Milene
que sempre estiveram dispostas a me ajudar e auxiliar nos momentos de sufoco.
Vocês estiveram comigo do início ao fim.
Ao Prof. Dr. Nélson E. Durán por autorizar a utilização do equipamento
para medidas de Espalhamento Dinâmico de Luz ao longo de todo o trabalho.
À Profa. Dra. Míriam Dupas Hubinger FEA-Unicamp por autorizar a
utilização do equipamento para medidas de medidas de Espalhamento de Luz
durante o trabalho e à Dra. Vanessa pela gentileza com que sempre me atendeu.
Ao Dr. Ricardo Pereira por auxiliar nas análises de cromatografia líquida,
a Daniel Razzo pelo auxílio na obtenção das imagens através da Microscopia
Eletrônica de Varredura, aos técnicos do laboratório de ensino: Daniel, Divino e
Mírian. Aos demais funcionários do Instituto de Química.
Aos professores que fizeram parte da minha vida acadêmica, pessoas a
quem pude me inspirar e admirar e conseguir chegar até aqui. Espero inspirar outras
pessoas assim como vocês o fizeram comigo.
À banca examinadora pela gentileza de terem aceitado o convite.
À CAPES pela bolsa concedida.
RESUMO
Nanoemulsões consistem de uma fina dispersão de óleo em água, com diâmetro de
gotículas entre 50 e 600 nm. O objetivo desta pesquisa foi encapsular o fármaco
imunossupressor ciclosporina A (CsA) utilizando a nanoemulsão (NE) como sistema
carreador. Primeiramente foram realizados testes preliminares onde foram avaliados:
ordem de adição da fase orgânica e fase contínua, tipo de solvente e concentração
do triglicerídeo de cadeia média (TCM) e tensoativos. A partir desses testes ficou
definido que a fase orgânica seria vertida na fase contínua e que os solventes etanol
e etanol+acetona seriam utilizados. As NE foram preparadas pelos métodos de alta
energia de emulsificação (sonicador com ponteira), e pelo método de baixa energia
de emulsificação (emulsificação espontânea). Para o primeiro foram obtidas NE com
diâmetro médio na faixa 66,2±2,1nm a 130±7,9nm. Já para o segundo foi observado
diâmetros médios entre 197,7±9,5nm a 456,7±39,3nm. Para avaliar a influência do
tipo de óleo e tensoativos sobre o diâmetro de gotícula (φ), índice de polidispersão e
potencial Zeta, foi empregado um delineamento fatorial 22 para ambos os métodos.
Para o de alta energia de emulsificação os tensoativos mais adequados foram
Tween®20 e Lipoid®SL80-3 e o óleo o TCM na proporção de 1:1 ou 1:2 (m:m) de
tensoativo e óleo. Para o de baixa energia de emulsificação os tensoativos mais
adequados foram Tween®80 e Lipoid®SL80-3, sendo o óleo uma mistura de ácido
oleico e triglicerídeo de cadeia média na proporção de 1:1 (m:m). Após a definição
das formulações, para ambos os métodos, foram incorporados o glicerol, α-tocoferol
e o ajuste do pH foi feito com o objetivo de manter a integridade físico-química das
NE para uso parenteral. Também foi estudada adição 5% e 12% (m:m) de fármaco à
NE em relação à quantidade de óleo, sendo que 5% de CsA foi incorporado na
formulação obtida pelo método de alta energia de emulsificação (F1,F2 e F6) e 5 e
12% no método de baixa energia de emulsificação (ES9 e ES10) . Além disso, foram
realizados ensaios de estabilidade coloidal 4 °C, 25 °C e 45 °C, durante um período
de 30 dias, sendo observado que quando armazenadas a 4 °C, o processo de
Ostwald “ripening” foi retardado para ambos os métodos. Em seguida, a formulação
considerada mais promissora, em ambas as metodologias, foi submetida a um novo
teste de estabilidade por um período maior a 4ºC. As formulações obtidas por alta
energia de emulsificação permaneceram estáveis por um período de 210 dias,
enquanto as obtidas por baixa energia de emulsificação por 90 dias. O estudo de
eficiência de encapsulação (EE)% foi feito para as formulações F1, F2 e F6, sendo
encontrado ≈90%. Já as formulações ES9 e ES10 EE% foi de ≈65%. Diante dos
resultados apresentados, as formulações obtidas com o sonicador foram julgadas as
mais promissoras, frente às produzidas por emulsificação espontânea, visando à
produção de NE parenterais, sendo o melhor resultado para a F1 com diâmetro
médio de 71,08nm inicialmente e um crescimento ≈15% do seu diâmetro inicial após
210 dias de ensaio a 4ºC.
ABSTRACT
Nanoemulsion consists of a fine dispersion of oil in water with droplets of diameter
ranging from 50 to 600 nm. The objective of this research was to encapsulate the
drug immunosuppressant cyclosporin A nanoemulsion (NE) using as a carrier
system. First preliminary tests were realized they evaluated: order of addition of the
organic phase and continuous phase, solvent and concentration of medium-chain
triglycerides (MCT) and surfactants. From these tests it was determined that the
organic phase should to be added into the continuous phase and the solvent ethanol
+ acetone and ethanol would be used. The NE were prepared by high energy
emulsification methods (sonicator), and the method of low energy emulsification
(spontaneous emulsification). For the first were obtained nanoemulsion with average
droplets diameter ranging from 66.2 ± 2,1nm to 7,9nm ± 130. As for the second were
observed average doplets diameters between 197.7± 9,5nm the 456,7±39,3nm. To
evaluate the influence of the type of oil and surfactants on the droplet diameter (φ),
polydispersity index and Zeta potential, it was used a factorial design 22 for both
methods. For high energy emulsification most suitable surfactants Tween® 20 and
was Lipoid®SL80-3 oil and MCT in a ratio of 1: 1 or 1: 2 (w:w) of oil and surfactant.
For the of low energy emulsification the surfactants was Tween®80 and Lipoid®SL80-
3, the oil was a mixture of oleic acid and medium chain triglyceride in a ratio of 1: 1
(w: w) and the ratio the oil and the surfactant was 1:08 (w:w). After setting the
formulations for both methods were incorporated glycerol, α-tocopherol and was
made pH adjustment in order to maintain the physical and chemical integrity of the
NE for parenteral use. It was also studied adding 5% and 12% (w:w) drug at NE
relative to amount of oil, and 5% of CsA was incorporated into the formulation
obtained by high energy method of emulsification (F1, F2 and F6 ) and 5 to 12% in
the low energy method of emulsification (ES9 and ES10). Also, colloidal stability tests
were performed at 4 °C, 25 °C and 45 °C, for a period of 30 days been observed that
when stored at 4 °C, the process of Ostwald "ripening" was delayed for both
methods. After this first step of the stability test, the formulation considered the most
promising for both methodologies, it was subjected to a further stability test by a
longer period at 4 °C. The formulations obtained by high energy emulsification
method remained stable for a period of 210 days, and formulations obtained by the
method of low energy emulsification for 90 days. The study encapsulation efficiency
(EE).was performed to formulations F1, F2 and F6 encapsulation efficiency was
≈90%. Already ES9 and ES10 formulations EE was ≈65%. On the results presented,
the formulations obtained with the sonicator the most promising were judged,
compared to those produced by spontaneous emulsification, aiming at the production
of NE parenterals. The best result for F1 with an average diameter of 71,08nm
initially and ≈15% growth of its initial diameter after 210 days of testing at 4 °C.
Lista de Ilustrações
Figura 1. Emulsão: (a) água/óleo (a); (b) óleo/água (b) (adaptado de SARTORI
et al, 2010)...........................................................................................................
28
Figura 2. Estrutura química de fosfolipídios presentes nas lecitinas (adaptado
de WASHINGTON, 1996)....................................................................................
32
Figura 3. Estrutura química de Tween 80 e de Pluronic F68 (adaptado de
SIGMA ALDRICH®)..............................................................................................
33
Figura 4. Dispositivos usados na preparação das nanoemulsões usando alta
energia.................................................................................................................
35
Figura 5. Formação de nanoemulsões por emulsificação espontânea
(adaptado de McCLEMENTS, 2011)....................................................................
36
Figura 6. Representação esquemática do potencial Zeta (adaptado de
MALVERN, 2015).................................................................................................
38
Figura 7. Tipos de instabilidades que ocorrem em emulsões: separação
gravitacional, floculação, coalescência e Ostwald "ripening" (adaptado de
McClements, 2011)..............................................................................................
41
Figura 8. Ostwald "ripening"................................................................................. 42
Figura 9. Energia potencial em função da distância entre gotículas (adaptado
de DALTIN, 2011)................................................................................................
44
Figura 10. Tipos de estabilização de coloides: estérica e eletrostática............... 45
Figura 11. Estrutura química de Ciclosporina A (adaptado de BRUXEL et al,
2012)....................................................................................................................
48
Figura 12. Representação esquemática da preparação de NE pela técnica da
emulsificação espontânea....................................................................................
52
Figura 13. Representação esquemática da preparação de nanoemulsões pelo
método de alta energia de emulsificação usando sonicador com ponteira..........
53
Figura 14. Esquema da preparação das amostras para determinar o
percentual de Eficiência de Encapsulação de CsA nas NE.................................
70
Figura 15. (a) Mistura dos tensoativos P - F68 e Lipoid® S100; S100-3 e SL80-
3...........................................................................................................................
81
Figura 16. Mistura de tensoativos T20 e Lipoid® S100; S100-3 e SL80-
3...........................................................................................................................
82
Figura 17. Variação temporal do: a) diâmetro médio; b) IPD; c) potencial Zeta,
durante 30 dias. Amostras F1 e F2, com e sem evaporação do
solvente................................................................................................................
92
Figura 18. Variação temporal do: a) diâmetro médio; b) IPD; c) potencial Zeta
durante 30 dias. Amostras F6 e F7, com e sem evaporação do solvente...........
93
Figura 19. Variação temporal do: a) diâmetro médio; b) IPD; c) potencial Zeta,
durante 120 dias. Amostras F1, F2, F6 e F7, com evaporação do solvente........
95
Figura 20. Variação temporal do: a) diâmetro médio; b) IPD; c) potencial Zeta,
durante 30 dias. Amostras F2 e F6, a 4°C e 25°C...............................................
98
Figura 21. Distribuição do diâmetro médio obtida via espalhamento dinâmico
de luz. Amostras F2 e F6, a 4°C, após 30 dias....................................................
99
Figura 22. Variação temporal do: a) diâmetro médio; b) IPD, nos dias 1; 15;
30. Amostra F2 com CsA (adicionado antes ou depois da emulsificação) e
sem CsA.............................................................................................................
100
Figura 23. Variação temporal do: a) diâmetro médio; b) IPD, nos dias 1; 15;
30. Amostra F6 com CsA (adicionado antes ou depois da emulsificação) e
sem CsA.............................................................................................................
101
Figura 24. Variação temporal do: a) diâmetro médio; b) IPD, durante 30 dias.
Amostras F2 e F6, com CsA (adicionado antes ou depois da emulsificação)...
103
Figura 25. Variação temporal do: a) diâmetro médio; b) IPD, durante 120
dias. Amostras F2 e F6, com e sem glicerol e pH ajustado entre 6,5 e 7,0.......
105
Figura 26. a) Diâmetro médio; b) IPD, nos dias 1 e 120. Amostras F2 e F6,
com e sem glicerol e pH ajustado entre 6,5 e 7,0..............................................
106
Figura 27. Variação temporal do: a) diâmetro médio; b) IPD, durante 120
dias. Amostras F2 e F6, com e sem glicerol e pH ajustado entre 6,0 a 6,88.....
107
Figura 28. a) Diâmetro médio; b) IPD, nos dias 1 e 120. Amostras F2 e F6,
com e sem glicerol e pH ajustado entre 6,0 a 6,88............................................
108
Figura 29. Distribuição do diâmetro. Amostras F2 e F6 a 25°C, após 120
dias....................................................................................................................
110
Figura 30. Variação temporal do: a) diâmetro; b) IPD, durante 30 dias.
Amostra F2 a 4°C, 25°C e 45°C.........................................................................
112
Figura 31. Variação temporal do: a) diâmetro; b) IPD, durante 30 dias.
Amostra F19 a 4°C, 25°C e 45°C.......................................................................
113
Figura 32. Variação temporal do: a) diâmetro; b) IPD, durante 30 dias.
Amostra F27 a 4°C, 25°C e 45°C.......................................................................
114
Figura 33. Variação temporal do: a) diâmetro; b) IPD, durante 30 dias.
Amostra F6 a 4°C, 25°C e 45°C.........................................................................
115
Figura 34. Variação temporal do: a) diâmetro; b) IPD, durante 30 dias.
Amostra F20 a 4°C, 25°C e 45°C.......................................................................
116
Figura 35. Variação temporal do: a) diâmetro; b) IPD, durante 30 dias.
Amostra F28 a 4°C, 25°C e 45°C.......................................................................
117
Figura 36. Variação temporal do: a) diâmetro; b) IPD, durante 30 dias.
Amostra F29 a 4°C, 25°C, 45°C.........................................................................
119
Figura 37. Variação temporal do: a) diâmetro; b) IPD, durante 30 dias.
Amostra F30 a 4°C, 25°C, 45°C.........................................................................
120
Figura 38. Variação temporal do: a) diâmetro; b) IPD, durante 30 dias.
Amostra F31 a 4°C, 25°C, 45°C.........................................................................
121
Figura 39. Variação temporal do: a) diâmetro; b) IPD, durante 30 dias.
Amostra F32 a 4°C, 25°C, 45°C.........................................................................
122
Figura 40. Variação temporal do: a) diâmetro; b) IPD, durante 30 dias.
Amostra F33 a 4°C, 25°C, 45°C.........................................................................
123
Figura 41. Variação temporal do: a) diâmetro; b) IPD, durante 30 dias.
Amostra F34 a 4°C, 25°C, 45°C.........................................................................
124
Figura 42. Variação temporal do: a) diâmetro; b) IPD, durante 30 dias.
Amostra F35 a 4°C, 25°C, 45°C.........................................................................
125
Figura 43. Variação temporal do: a) diâmetro; b) IPD, durante 30 dias.
Amostra F36 a 4°C, 25°C, 45°C.........................................................................
126
Figura 44. Variação temporal do: a) diâmetro; b) IPD, durante 30 dias.
Amostra F37 a 4°C, 25°C, 45°C.........................................................................
127
Figura 45. Distribuição do diâmetro. Amostra F35 a 4°C................................... 128
Figura 46. Distribuição de tamanho. Amostra F36 a 4°C................................... 128
Figura 47. Variação temporal do: a) diâmetro; b) IPD, durante 30 dias.
Amostras F1, F2 e F6 com 5% (m:m) de CsA...................................................
130
Figura 48. Variação temporal do a) diâmetro; b) IPD, durante 30 dias.
Amostras F1, F2 e F6 com 12% (m:m) de CsA.................................................
131
Figura 49. Variação temporal do: a) diâmetro; b) IPD, durante 30 dias.
Amostra F1 com 10% de α-tocoferol..................................................................
133
Figura 50. Variação temporal do: a) diâmetro; b) IPD, durante 30 dias.
Amostra F2 com 10% de α-tocoferol..................................................................
134
Figura 51. Variação temporal do: a) diâmetro; b) IPD, durante 30 dias.
Amostra F6 com 10% de α-tocoferol..................................................................
135
Figura 52. Variação temporal do: a) diâmetro; b) IPD, durante 30 dias.
Amostra F1 com 30% de α-tocoferol..................................................................
136
Figura 53. Variação temporal do: a) diâmetro; b) IPD, durante 30 dias.
Amostra F2, com 30% de α-tocoferol.................................................................
137
Figura 54. Variação temporal do: a) diâmetro; b) IPD, durante 30 dias.
Amostra F6, com 30% de α-tocoferol, a 4°C......................................................
138
Figura 55. Variação temporal do: a) diâmetro; b) IPD, durante 210 dias.
Amostras F1, F2 e F6, com 10% de α-tocoferol, a 4°C.....................................
140
Figura 56. Variação temporal do: a) diâmetro; b) IPD, durante 15 dias.
Amostras ES1, ES2, ES3, ES4, ES5 e ES6, a 25°C.........................................
142
Figura 57. Variação temporal do: a) diâmetro; b) IPD, durante 15 dias.
Amostras ES7, ES8, ES9, ES10 e PL, a 4°C....................................................
144
Figura 58 Variação temporal do: a) diâmetro; b) IPD, durante 15 dias.
Amostras ES7, ES8, ES9, ES10 e PL, a 25°C..................................................
145
Figura 59. Variação temporal do: a) diâmetro; b) IPD, durante 15 dias.
Amostras ES7, ES8, ES9, ES10 e PL, a 45°C..................................................
146
Figura 60. Variação temporal do: a) diâmetro; b) IPD, durante 15 dias.
Amostras ES11, ES12, ES13, ES14 e PL, a 4°C..............................................
149
Figura 61. Variação temporal do: a) diâmetro; b) IPD, durante 15 dias.
Amostras ES11, ES12, ES13, ES14 e PL, a 25°C............................................
150
Figura 62. Variação temporal do: a) diâmetro; b) IPD, durante 15 dias.
Amostras ES11, ES12, ES13, ES14 e PL, a 45°C............................................
151
Figura 63 Variação temporal do: a) diâmetro; b) IPD, durante 15 dias.
Amostras ES9, ES10, ES13 e ES14 com ácido oleico, a 4°C...........................
155
Figura 64. Variação temporal do: a) diâmetro; b) IPD, durante 15 dias.
Amostras ES9, ES10, ES13 e ES14 com ácido oleico, a 25°C.........................
156
Figura 65. Variação temporal do: a) diâmetro; b) IPD, durante 15 dias.
Amostras ES9, ES10, ES13 e ES14 com ácido oleico, a 45°C.........................
131
Figura 66. Variação temporal do: a) diâmetro; b) IPD, durante 15 dias.
Amostras ES9 e ES10 com 12% de CsA, a 4°C................................................
133
Figura 67. Variação temporal do: a) diâmetro; b) IPD, durante 90 dias.
Amostras ES9 (5% de CsA) e ES10 (12% de CsA), a 4°C................................
135
Figura 68. Distribuição do diâmetro médio de ES9 e ES10............................... 137
Figura 69. Curva de calibração da CsA obtida após análise das soluções
padrões do fármaco por CLAE...........................................................................
138
Figura 70. Cromatograma com o perfil do pico de absorção da ciclosporina A. 138
Figura 71. Micrografia dos cristais de ciclosporina A: a) CsA com um
aumento de 10000 vezes e b) CsA com um aumento de 4500 vezes...............
140
Figura 72. Micrografia das membranas de PVDF de 0,45µm: a) com aumento
de 200 vezes e b) com aumento de 2000 vezes...............................................
140
Figura 73. Micrografia da amostra F6 em membranas de PVDF de 0,45µm:
a) com aumento de 2000 vezes e b) com aumento de 500 vezes....................
141
Figura 74. Micrografia da amostra ES9 em membranas de PVDF de 0,45µm:
a) com aumento de 2000 vezes e b) com aumento de 500 vezes....................
141
Lista de tabelas
Tabela 1. Aplicações de tensoativos de acordo com o valor do BHL................ 46
Tabela 2. Composição das NE com Lipoid® 75S e Pluronic® F68 como
tensoativos..........................................................................................................
56
Tabela 3. Níveis relacionados ao tempo de sonicação e potência de
ultrassom para cada ensaio do planejamento experimental 22 com ponto
central (Plan.1)...................................................................................................
57
Tabela 4. Níveis relacionados ao tempo de sonicação e potência do
ultrassom para cada ensaio do planejamento experimental 22 com ponto
central (Plan. 2)..................................................................................................
57
Tabela 5. Valores de BHL dos tensoativos........................................................ 58
Tabela 6. Composição das NE seguindo os valores de BHL da mistura........... 58
Tabela 7. Níveis relacionados ao tempo de sonicação e potência do
ultrassom para cada ensaio do planejamento experimental 22 com ponto
central, para os tensoativos SL80-3 e T20.........................................................
58
Tabela 8. Níveis relacionados ao tempo e velocidade do dispersor para cada
ensaio do planejamento experimental 22 (Plan. 1).............................................
59
Tabela 9. Níveis relacionados ao tempo e velocidade do dispersor para cada
ensaio do planejamento 22 (Plan 2)....................................................................
61
Tabela 10. Composição das NE com etanol...................................................... 61
Tabela 11. Composição das NE com acetona:etanol (1:1) (v:v)........................ 62
Tabela 12. Composições das NE com e sem glicerol........................................ 63
Tabela 13. Composições das NE para o teste de estabilidade térmica............. 64
Tabela 14. Composições das NE produzidas mediante emulsificação
espontânea.........................................................................................................
65
Tabela 15. Níveis do planejamento para NE produzidas em etanol.................. 66
Tabela 16. Níveis do planejamento para NE produzidas em acetona e etanol. 67
Tabela 17. Composição das NE produzidas por emulsificação espontânea
com diferentes tensoativos não iônicos..............................................................
68
Tabela 18. Diâmetro médio, IPD e potencial Zeta.............................................. 73
Tabela 19. Diâmetro médio, IPD e potencial Zeta (formulações P1 e P2 com e
sem evaporação do solvente), nos dias 1 e 15..................................................
74
Tabela 20. Aspecto visual das NE e valores de BHL da mistura de
tensoativos..........................................................................................................
75
Tabela 21. Diâmetro médio, IPD e potencial Zeta (Plan 1)................................ 76
Tabela 22. Diâmetro médio, IPD e potencial Zeta (Plan 2)................................ 77
Tabela 23. Efeito do tipo de tensoativo não iônico na estabilidade das NE e
BHL da mistura de tensoativos...........................................................................
79
Tabela 24. Diâmetro médio, IPD e potencial Zeta de NE produzidas com
tensoativos T20/L80-3........................................................................................
83
Tabela 25. Diâmetro médio, IPD e potencial Zeta............................................. 85
Tabela 26. Diâmetro médio, IPD e potencial Zeta de NE produzidas com
Turrax (4000 rpm e 5 min)..................................................................................
86
Tabela 27. Diâmetro médio, IPD e potencial Zeta de NE produzidas com
Turrax 5000 rpm e 5 min....................................................................................
87
Tabela 28. Diâmetro médio, IPD e potencial Zeta (Plan 1)................................ 88
Tabela 29. Diâmetro médio, IPD e potencial Zeta (Plan 2)................................ 88
Tabela 30. Diâmetro médio, IPD e potencial Zeta.............................................. 89
Tabela 31. Diâmetro médio, IPD e potencial Zeta para NE com etanol, após 1
dia.......................................................................................................................
90
Tabela 32. Diâmetro médio, IPD e potencial Zeta para NE com
acetona/etanol (50:50, v:v), após 1 dia..............................................................
90
Tabela 33. Variação temporal do pH de F2 e F6, com e sem glicerol, a 4°C e
25°C....................................................................................................................
111
Tabela 34. Variação temporal do pH das amostras F1, F2 e F6, a 25°C.......... 139
Tabela 35. Resultados de NE produzidas em etanol por emulsificação
espontânea 1dia 25°C........................................................................................
147
Tabela 36. Resultados de NE produzidas na mistura acetona:etanol por
emulsificação espontânea 1dia a 25°C..............................................................
152
Tabela 37. Resultados de NE produzidas com ácido oleico.............................. 158
Tabela 38. Variação temporal do pH de ES9 (5%CsA) e ES10 (12%CsA), em
4°C por 90 dias..................................................................................................
162
Tabela 39. Determinação de EE(%) a 4°C......................................................... 165
Lista de Siglas e Abreviaturas
φ: Diâmetro médio
ζ: – Potencial Zeta
®: - Marca registrada
A/O: Água em Óleo
BHL: – Balanço Hidrofílico Lipofílico
CLAE: Cromatografia líquida de alta eficiência
col.: Colaboradores
CsA: Ciclosporina A
DLS: Espalhamento Dinâmico de Luz (Dynamic Light Scattering)
EE: Eficiência de encapsulação
FO: Fase orgânica
FA: Fase aquosa
HCL: Ácido clorídrico
IPD: Índice de polidispersidade
L-S100: Lipoid® S100
L-S100-3: Lipoid® S100-3
L-SL80-3: Lipoid® SL80-3
L-S75: Lipoid® S 75
MEV: Microscopia eletrônica de varredura
M1: Metodologia 1
M2: Metodologia 2
M3: Metodologia 3
mg: Miligrama
min.: Minuto
mL: Mililitro
m:m: Relação massa por massa
m:v: Relação massa por volume
NaOH: Hidróxido de sódio
NE: Nanoemulsão
nm: Nanômetro
O/A: Óleo em Água
PCS: Espectroscopia de Correlação de Fótons (Photon Correlation Spectroscopy)
P-F68: Pluronic® F68
pH: Potencial Hidrogeniônico
Plan.1: Planejamento 1
Plan.2: Planejamento 2
PVDF: Polivinilideno
Ps: Potência do sonicador
rpm: Rotação por minuto
S1: Metodologia 1, adotada no processo de emulsificação espontânea
S2: Metodologia 2, adotada no processo de emulsificação espontânea
T+TCM: Tensoativos mais triglicerídeo de cadeia média
T20: Polisorbato 20
T80: Polisorbato 80
TCM: Triglicerídeos de cadeia média
TCL: Triglicerídeos de cadeia longa
ts: Tempo de sonicação
UV/Vis: Ultravioleta-Visível
µg: Micrograma
U.A.: Unidade de Absorbância
v:v: Relação volume por volume
W: Watt
SUMÁRIO
I. INTRODUÇÃO 27
1.1. Emulsões parenterais.................................................................................. 27
1.2. Nanoemulsões para uso parenteral............................................................ 29
1.3. Composição e seleção de excipientes para nanoemulsões....................... 30
a) Óleos....................................................................................................... 30
b) Tensoativos............................................................................................. 31
Lecitinas............................................................................... 31
Tensoativos não iônicos....................................................... 32
Aditivos................................................................................. 33
1.4. Métodos de preparação.............................................................................. 33
a) Alta Energia............................................................................................. 34
Homogeneizadores ultrassônicos........................................ 34
b) Baixa energia........................................................................................... 35
Emulsificação espontânea.................................................... 36
1.5. Caracterização física de nanoemulsões..................................................... 37
a) Espectroscopia de correlação de fótons.................................................. 37
b) Potencial Zeta.......................................................................................... 38
c) pH............................................................................................................ 40
1.6. Fatores que interferem na estabilização..................................................... 40
1.6.1. Instabilidade e mecanismos de fragmentação......................................... 41
a) Separação gravitacional.......................................................................... 41
b) Floculação e coalescência....................................................................... 42
c) Ostwald "ripening"................................................................................... 42
1.6.2. Estabilidade de nanoemulsões................................................................ 43
Tipos de interação entre as gotículas................................... 43
1.6.3. Seleção de tensoativos............................................................................ 45
Balanço hidrofílico lipofílico (BHL)........................................ 45
Cálculo de BHL da mistura de tensoativos........................... 46
1.7. Otimização do processo de obtenção de nanoemulsões........................... 47
1.8. Ciclosporina A (CsA)................................................................................... 47
II. OBJETIVOS 49
2.1 Geral................................................................................................... 49
2.2 Específicos.......................................................................................... 49
III. PARTE EXPERIMENTAL 50
3.1 Reagentes e equipamentos....................................................................... 50
3.1.1 Equipamentos............................................................................................ 50
3.1.2 Reagentes............................................................................................... 50
3.2 Procedimentos......................................................................................... 51
3.2.1 Métodos de preparação das nanoemulsões 51
3.2.1.1 Método de baixa energia de emulsificação (técnica de emulsificação
espontânea Bouchemal e col., 2004).................................................................
51
3.2.1.2 Método de alta energia de emulsificação, usando sonicador de
ponteira..........................................................................................................
52
3.3 Planejamentos fatoriais usados no desenvolvimento das nanoemulsões... 53
3.3.1 Planejamentos fatoriais 22......................................................................... 54
Formulações iniciais............................................................. 55
3.3.2 Preparação de NE utilizando Poloxamer 188 (Pluronic®F68) e lecitina
de soja (Lipoid®S75) como tensoativos..............................................................
55
3.3.2.1 Influência da ordem de adição da FO e FA e do tipo de solvente......... 55
3.3.2.2 Influência da concentração de tensoativos e TCM................................ 56
3.3.3 Preparação de NE usando sonicador com ponteira................................. 56
3.3.3.1 Influência do tempo de sonicação e potência do ultrassom.................. 56
3.4 Influência dos diferentes tensoativos na estabilidade das NE................ 58
3.4.1 Balanço Hidrofílico-Lipofílico (BHL)......................................................... 58
3.5 Otimização das NE obtidas pelo método de alta energia....................... 59
3.5.1 NE produzidas com lecitina SL80-3 e T 20 como tensoativos................ 59
3.5.2 Testes utilizando agitador magnético e UltraTurrax na pré-emulsão........ 59
3.5.2.1 Agitação magnética................................................................................ 60
3.5.2.2Homogeneizador UltraTurrax, com dispersor de policarbonato
(PC/PEEK-S25D-10G-KS).................................................................................
60
3.5.3 NE produzidas com homogeneizador Ultra-Turrax, com dispersor de
aço inox..............................................................................................................
60
3.5.3.1NE γ-2 e δ-2............................................................................................ 61
3.6 Influência da proporção de TCM:tensoativos e tipo de solvente................ 61
3.7 Influência da temperatura de armazenamento........................................... 61
3.8 Influência do método de incorporação do fármaco na NE......................... 62
3.9 Influência do pH e glicerol.......................................................................... 62
3.10 Estabilidade térmica................................................................................... 63
3.10.1 Influência do aumento da fase aquosa................................................... 64
3.11 Influência da incorporação de 5% ou 12% de CsA.................................... 64
3.12 Influência da incorporação de α-tocoferol.................................................. 64
3.13 NE obtidas mediante emulsificação espontânea....................................... 65
3.13.1 Influência da proporção TCM:tensoativos e tipo de solvente................. 65
3.13.2 Influência do tipo de tensoativo............................................................... 65
3.13.2.1 NE produzidas em etanol..................................................................... 65
3.13.2.2 NE produzidas em mistura de acetona e etanol.................................. 66
3.13.3 Influência da incorporação de 5 ou 12% de CsA.................................... 67
3.13.4 Influência da adição do ácido oleico....................................................... 67
3.14 Caracterização das NE......................................................................... 68
3.14.1 Determinação do pH............................................................................... 68
3.14.2 Obtenção do diâmetro médio das gotículas (φ, Z average) e índice de
polidispersão (IPD).............................................................................................
68
3.14.3 Obtenção do potencial Zeta (ζ mV)......................................................... 69
3.15 Determinação da quantidade de CsA presente nas NE.......................... 69
3.15.1 Condições experimentais........................................................................ 69
3.15.2 Curva analítica........................................................................................ 69
3.15.3 Eficiência de enscapsulação (EE)......................................................... 69
3.15.4 Microscopia eletrônica de varredura....................................................... 70
IV RESULTADOS E DISCUSSÃO 72
4. Preparação de NE com Poloxamer 188 (Pluronic® F68) e lecitina de soja
(Lipoid®S75).......................................................................................................
72
4.1 Influência da ordem de adição da fase orgânica (FO) e aquosa (FA) e do
tipo de solvente..................................................................................................
72
4.2 Influência da concentração de tensoativos e de TCM................................. 73
4.3 Preparação de NE usando sonicador com ponteira.................................... 75
4.3.1 Influência do tepo de sonicação e potência do ultrassom........................ 75
4.4 Influência do tipo de tensoativo na estabilidade das NE........................... 78
4.4.1 Balanço Hidrofílico-Lipofílico (BHL).......................................................... 78
4.5 Otimização da NE com SL80-3 e T20 como tensoativos produzidas pelo
método de alta energia......................................................................................
83
4.6 Influência da pré-emulsão nas propriedades da NE sonicada.................... 84
4.6.1 Agitação magnética................................................................................... 85
4.6.2Homogeneizador UltraTurrax, com dispersor de policarbonato
(PC/PEEK-S25D-10G-KS).................................................................................
85
4.6.3 NE produzidas com homogeneizador Ultra-Turrax, com dispersor de
aço inox..............................................................................................................
88
4.7 Influência da concentração de tensoativos................................................ 89
4.8 Influência da temperatura de armazenamento........................................... 96
4.9 Influência do método de incorporação da CsA na NE............................... 99
4.10 Influência do pH e de glicerol..................................................................... 104
4.11 Estabilidade térmica................................................................................... 111
4.11.1 Influência do aumento da fase aquosa................................................... 118
4.12 Influência da incorporação de 5% ou 12% de CsA.................................... 129
4.13 Influência da incorporação de α-tocoferol.................................................. 132
4.14 NE obtidas mediante emulsificação espontânea....................................... 141
4.14.1 Influência da proporção óleo :tensoativo................................................. 141
4.15 Influência do tipo de tensoativo................................................................. 143
4.15.1 NE produzidas em etanol ....................................................................... 144
4.15.2 NE produzidas em mistura de acetona:etanol........................................ 148
4.16 Influência da adição do ácido oleico.......................................................... 153
4.17 Influência da incorporação de 12% de CsA............................................... 158
4.18 Estudo de estabilidade das NE obtidas por emulsificação espontânea..... 160
4.19 Determinação da quantidade de CsA presente nas NE............................ 163
4.19.1 Curva de calibração para a CsA............................................................. 163
4.19.2 Determinação da eficiência de encapsulação......................................... 165
4.19.3 Microscopia Eletrônica de Varredura.................................................... 165
V. CONCLUSÃO 168
VI. SUGESTÕES PARA TRABALHOS FUTUROS 169
VII. REFERÊNCIAS 170
27
l. INTRODUÇÃO
O desenvolvimento de formulações farmacêuticas eficazes tem sido cada
vez mais pesquisado, pois estima-se que 70% dos fármacos altamente promissores
apresentam duas características que dificultam sua administração: alta massa molar
e elevada lipofilicidade. A baixa solubilidade de fármacos em água representa
grande limitação, pois reduz consideravelmente sua biodisponibilidade (KECK &
MULLER, 2006; SHAFIQ-un-NABI e col., 2007; GAO e col., 2008).
Com o propósito de aumentar a solubilidade desses fármacos e diminuir
possíveis efeitos colaterais, diversas estratégias têm sido estudadas, como adição
de tensoativos, de solventes orgânicos ou de tampões, uso de sistemas carreadores
como complexos de inclusão com ciclodextrinas, lipossomas, nanopartículas,
emulsões lipídicas, micro e nano dispersões, entre outras (YOUNG e col., 2003;
BRUXEL e col., 2012). No entanto, alguns desses sistemas apresentam restrições
quanto à biocompatibilidade, podem sofrer degradação (YOUNG e col., 2003;
BRUXEL e col., 2012), etc. Neste contexto, sistemas nanoparticulados lipídicos têm
se mostrado interessantes por apresentar várias vantagens, abordadas a seguir
(SILA e col., 2008).
1.1. Emulsões parenterais
Tradicionalmente, emulsões lipídicas são usadas para dispensar
fármacos pouco solúveis em água. Também são usadas como suprimento de
energia, especialmente em neonatos, em termos de ácidos graxos essenciais e
triglicérides. Um exemplo é o composto Intralipid®, primeira emulsão parenteral,
comercializada desde 1960, usada como fonte de calorias para pacientes
impossibilitados de se alimentar por via entérica (FLORENCE & ATWOOD, 2003).
Outro grande interesse no uso de emulsões lipídicas é a possibilidade de
melhorar a biodisponibilidade de fármacos com baixa solubilidade em água (JOSHI
& MULLER, 2009). Por exemplo, griseofulvina, um antifúngico, apresenta melhor
absorção oral quando em emulsão, pois esta possibilita aumento de sua
solubilidade. Outro exemplo é o uso do Intralipid® como veículo de fármacos
lipofílicos para uso intravenoso. Há também as emulsões Diazemuls® (Diazepam) e
28
Diprivan® (Propofol), são usadas como alternativa à solubilização desses fármacos
em sistemas micelares não iônicos (FLORENCE & ATWOOD, 2003; SILA-on, 2008;
JOSHI & MULLER, 2009; PRAKASH-U & THIAGARAJAN, 2011).
Shadkhan (1997) e Egito (2003) também relataram a utilização de
emulsões lipídicas como Intralipid® e Luprofudin® para infusão parenteral visando
redução da toxicidade de Anfotericina B, devido à baixa biodisponibilidade deste
fármaco.
Sistemas lipídicos permitem o aumento da biodisponibilidade de fármacos
lipofílicos, mas, além disso, tem vantagem de serem não tóxicos, pois fazem parte
de sua composição lipídios similares aos fisiológicos (HEURTAULT e col., 2003).
Em geral, emulsões lipídicas são sistemas heterogêneos onde um líquido
(fase interna) é disperso em outro (fase contínua) sob a forma de pequenas
gotículas. Para reduzir a tensão na interface entre esses dois líquidos imiscíveis, há
necessidade de um terceiro componente, o tensoativo, que também forma uma
barreira capaz de evitar coalescência das gotículas (FLOYD, 1999). Emulsões nas
quais a fase contínua é aquosa e a interna oleosa são conhecidas como emulsões
óleo em água (O/A) (Fig. 1b). Em caso oposto a emulsão é denominada água em
óleo (A/O) (Fig. 1a) (GERSHKOVICH e col., 2008).
Figura 1. Emulsão: (a) água/óleo; (b) óleo/água (adaptado de SARTORI e col.,
2010).
29
Para ser considerada uma emulsão eficaz e segura para infusão
parenteral, além das características já citadas, outros requisitos também são
necessários, como estabilidade físico-química e biológica, prolongado tempo na
circulação, ser biodegradável e ter diâmetro reduzido de gotículas. Este último
merece atenção especial, pois é fator crítico durante o desenvolvimento dessas
emulsões. Partículas >5µm são clinicamente inaceitáveis, pois podem causar efeitos
colaterais, como embolia pulmonar. Assim, é aconselhável que o diâmetro de
emulsões parenterais variarem entre 50nm à 1µm (JUMMA & MULLER, 1998;
FLODY, 1999; GERSHKOVICH e col., 2008).
1.2. Nanoemulsões para uso parenteral
Nanoemulsões constituem dispersão de óleo em água e apresentam
diâmetro de gotícula entre 50 e 600 nm (BOUCHEMAL col., 2004; TADROS e col.,
2004; SOLANS e col., 2005). São sistemas termodinamicamente instáveis, pois tem,
espontaneamente, tendência em separar fases, mas cineticamente estáveis
(GUTIÉRREZ e col., 2008; ANTON & VANDAMME, 2011). Esses sistemas possuem
algumas vantagens, como aumento da estabilidade, prevenindo cremeação,
floculação e coalescência, o fenômeno denominado Ostwald "ripening", que sozinho
governa o processo de desestabilização. Ainda se pode citar que o aumento da área
superficial das gotículas, devido à redução do diâmetro, aumenta a capacidade de
solubilizar grande quantidade de fármacos hidrofóbicos ou mesmo aqueles que não
são solúveis em alguns triglicerídeos ou em soluções com tensoativos
(CONSTANTINIDES e col., 2008; KOURNIATIS e col., 2010; ANTON &
VANDAMME, 2011).
As propriedades físico-químicas de nanoemulsões são influenciadas
pelas condições de emulsificação e pela composição (quali e quantitativa) das
formulações (BENITA & LEVY, 1993; MARTINI e col., 2007). A seleção mais
adequada dos excipientes usados na formulação depende do tipo de aplicação da
nanoemulsão. No caso de nanoemulsões para uso parenteral a seleção dos
componentes da formulação é importante, como será visto a seguir.
30
1.3. Composição e seleção de excipientes para nanoemulsões
Excipientes utilizados na preparação de nanoemulsões devem ser
biodegradáveis e bicompatíveis, prevenindo contra possíveis efeitos tóxicos e
irritantes. Geralmente estão presentes na formulação de nanoemulsões de três a
cinco componentes que formam a fase aquosa, a oleosa e a interface (BENITA &
LEVY, 1993; FLOYD, 1999; MAGALHÃES, 2000).
a) Óleos
Óleos utilizados para aplicações parenterais devem ser purificados para
remover compostos capazes de causar possíveis efeitos adversos. Podem ser de
origem vegetal ou semi-sintética, constituídos de triglicerídeos de cadeia média
(TCM) e longa (TCL). TCM têm vantagem de ser cerca de 100 vezes mais solúveis
em água que TCL, reduzindo efeitos colaterais quando a emulsão é injetada.
(BENITA & LEVY, 1993; FLOYD, 1999; FRONZA e col., 2004; TIWARI & AMIJI,
2007).
A escolha do óleo a ser empregado depende, primeiramente, da
solubilidade do fármaco a ser veiculado e das propriedades físico-químicas deste na
formulação (BOUCHEMAL e col., 2004; FRONZA e col., 2004). Por exemplo, óleos
com viscosidade elevada dificultam a preparação de nanoemulsões em
homogeneizadores de alta pressão, pois limitam a ruptura das gotículas, resultando
nanoemulsões com gotículas de diâmetros inadequados (McCLEMENTS & RAO,
2011).
Os principais óleos utilizados para esta finalidade são de soja, milho,
algodão, rícino, amendoim, gergelim, TCM, coco, esqualeno e oleato de etila
(BENITA & LEVY, 1993; JUMMA & MULLER, 1998; TIWARI & AMIJI, 2007), sendo
também empregadas misturas de TCM e TCL. Um exemplo é a emulsão
Lipofundin®, formada por mistura de 10% de TCM e 20% de TCL (em massa) que
torna essa emulsão uma fonte de energia facilmente metabolizável, devido à maior
solubilidade de TCM em meio aquoso. Nos estudos realizados por KELMANN.
(2007) formulações que continham misturas de óleo de rícino (TCL) com TCM
solubilizaram maior quantidade de carbamazepina, comparadas com as formulações
sem TCM.
31
b) Tensoativos
A presença de tensoativo na nanoemulsão aumenta a estabilidade em
longo prazo. Por isso a escolha do tensoativo (ou mistura de tensoativos) apropriado
é importante para obter nanoemulsões estáveis. Moléculas de tensoativos são
anfifílicas, pois apresentam uma região apolar (hidrofóbica) e outra polar (hidrofílica),
possibilitando adsorção na superfície das gotas de óleo, facilitando a dispersão em
meio aquoso e evitando agregação (FLORENCE & ATWOOD, 2003; DALTIN, 2011;
McCLEMENTS & RAO, 2011).
Há grande variedade de tensoativos, mas um número restrito é aprovado
para uso parenteral em humanos. Os mais empregados são lecitinas (fosfolipídios),
copolímeros em bloco de polioxietileno e polioxiproprileno (Poloxamer®) e
monooleato de sorbitano etoxilado (Tween®) (BENITA & LEVY, 1993; JUMMA &
MULLER, 1998; FLOYD, 1999; BRUXEL e col., 2012).
Lecitinas
Os tensoativos mais utilizados na preparação de emulsões para uso
parenteral são as lecitinas (Fig. 2), pois apresentam grande biocompatibilidade, são
biodegradáveis e tem elevada pureza (BRUXEL e col., 2012). Podem ser de origem
animal (gema de ovo) ou vegetal (soja), sendo constituídas por mistura de
fosfolipídios, onde a fosfatidilcolina e a fosfatidiletanolamina são neutras em pH 7 e a
fosfatidilserina e o ácido fosfatídico são negativas em pH 7. Embora estes 2 últimos
estejam presentes em pequena quantidade (2-5%, em massa) são suficientes para
conferir carga na superfície das gotículas (-40 a -60 mV), estabilizando a emulsão
(BENITA & LEVY, 1993; WASHINGTON, 1996; BRUXEL e col., 2012).
32
Figura 2. Estrutura química de fosfolipídios presentes nas lecitinas (adaptado de
WASHINGTON, 1996).
Tensoativos não iônicos
Tensoativos não iônicos, sintéticos, também são utilizados em
nanoemulsões, formam uma barreira estérica na interface, impedindo agregação das
gotículas, estabilizando o sistema. Os principais tensoativos não iônicos são os
derivados do polioxietileno e polioxiproprileno (Poloxâmer® 188 ou Pluronic® F68) e
os polioxietileno-sorbitanos (Tween®80 e 20) (FLOYD,1999; BRUXEL e col.,2012).
No estudo realizado por Bouchemal e col. (2004) para uma metodologia de
emulsificação espontânea, o uso do Pluronic® F68 associado com lecitina de soja
não hidrogenada estabilizou e reduz o diâmetro das gotículas, quando comparado
com sistemas com Tweens®. Já o estudo realizado por PRABHAKAR (2013),
também para uma metodologia de emulsificação espontânea, demonstrou que um
aumento da quantidade de Tween® 80 na formulação das nanoemulsões, reduziu o
diâmetro das gotículas de 237,0 ± 5,08 nm (sem adição do tensoativo) para 196,0 ±
3,54 nm (com adição de 1% m:v do tensoativo). A polidispersidade também foi
alterada de 0,245 ± 0,01 (sem tensoativo) para 0,068 ± 0,03 (com adição de 1% m:v
33
do tensoativo). Pode-se perceber que o uso desse tipo de tensoativo poderá
beneficiar ou não no diâmetro médio das gotículas, isso irá depender da
concentração e dos outros constituintes presentes na emulsão.
Figura 3. Estrutura química de Tween® 80 e de Pluronic® F68 (adaptado de SIGMA
ALDRICH®).
Aditivos
Aditivos são adicionados à formulação com objetivo de ajustar a
tonicidade e o pH. Glicerol (2% em massa) é utilizado como agente isotônico na
dispersão (MARTINI e col., 2007). Soluções aquosas de HCl e de NaOH são usadas
para ajustar o pH (6–8). Esse intervalo de pH é justificado pela compatibilidade
fisiológica e para prevenir hidrólise, indesejável, de fosfolipídios, do TCM e TCL. O
decréscimo do pH pode sugerir a presença de ácidos graxos livres provenientes da
hidrólise, indicando instabilidade (BENITA & LEVY, 1993; FLOYD, 1999;
HEURTAULT e col., 2003; FRONZA e col., 2004; BRUXEL e col., 2012).
1.4. Métodos de preparação
Nanoemulsões não se formam de maneira espontânea. É necessário o
aporte de energia mecânica, sendo usados métodos que envolvem energia baixa e
alta.
34
a) Alta Energia
Neste caso a amostra é processada em equipamentos capazes de
deformar e romper as gotículas, mediante aplicação de elevada força de
cisalhamento. Estes equipamentos compreendem homogeneizadores de alta
pressão, microfluidizadores, sonicadores e dispersores com alto grau de
cisalhamento (UltraTurrax®) (Fig. 4). Neste caso o experimentador tem um controle
maior sobre o diâmetro das gotículas (KOURNIATIS e col., 2010; LOVELYN &
ATTAMA, 2011). Existe, ainda, a tecnologia denominada SolEmuls® que consiste na
combinação do fármaco com emulsão já disponível no mercado, como o Intralipid®.
Mediante agitação em alta velocidade, combinada com ultrassom, forma-se uma
dispersão híbrida de gotículas de óleo e partículas de fármaco (BRUXEL e col.,
2012).
Homogeneizadores ultrassônicos
Empregam ultrassom gerando forças intensas, necessárias para romper
as gotas de óleo. Este sonicador contém um cristal de quartzo piezoelétrico que
expande e contrai em resposta à aplicação de um campo elétrico alternado. Estas
expansões/contrações são transferidas a uma ponteira de uma liga de titânio, imersa
na emulsão, gerando ondas sonoras que provocam cavitação produzindo
microbolhas que colapsam liberando enorme quantidade de energia, rompendo as
gotículas (PÉREZ e col.,2009; DALTIN, 2011; McCLEMENTS & RAO, 2011).
Para que a homogeneização seja eficiente e uniforme é importante
garantir que a emulsão fique tempo suficiente no sonicador. O tipo e a quantidade de
tensoativo presente também são parâmetros que influenciam a homogeneização. É
importante ressaltar que o sonicador deve ser usado com cautela, pois pode ocorrer
degradação de alguns componentes presentes na nanoemulsão, devido à alta
energia aplicada (McCLEMENTS & RAO; 2011).
35
Figura 4. Dispositivos usados na preparação das nanoemulsões usando alta
energia.
b) Baixa energia
A estratégia com emprego de baixa energia requer o entendimento do
comportamento das fases e as propriedades físico-químicas dos constituintes para
formar gotículas. Neste tipo de método estão compreendidos: emulsificação
espontânea, a transição de fases causada por alteração da composição e a
transição de fases causada pela temperatura (ANTON & VANDAMME, 2011;
LOVELYN & ATTAMA, 2011; KOROLEVA & YURTOV, 2012). Na transição de fases
a nanoemulsão é obtida alterando os parâmetros (temperatura e composição) que
afetam o balanço hidrofílico–lipofílico (IZQUIERDO e col., 2005; MORAIS e col.,
36
2006). Na emulsificação espontânea a nanoemulsão é formada pela difusão rápida
do solvente orgânico. Esta última tem recebido mais atenção, pois é facilmente feita
no laboratório, não requer equipamentos sofisticados, não usa altas temperaturas e
leva a formulações com tamanho reduzido de partículas (KELMANN e col., 2007;
ANTON & VANDAMME, 2011). Como esta foi uma das técnicas usadas nos
experimentos desta Tese, um esclarecimento mais detalhado será descrito a seguir.
Emulsificação espontânea
Neste caso o fármaco lipofílico é dissolvido em um solvente orgânico
juntamente com o óleo que constitui a fase interna e o tensoativo lipofílico. A fase
dispersante é formada pela água e pelo segundo tensoativo de natureza hidrofílica.
A fase orgânica é vertida, lentamente, sobre a fase aquosa, sob agitação mecânica
constante e em temperatura ambiente (Fig. 5). O solvente orgânico é removido por
evaporação à pressão reduzida (LOVELYN & ATTAMA, 2011; KOROLEVA &
YURTOV, 2012). Acredita-se que neste caso ocorram instabilidades na interface,
induzidas pela rápida difusão do solvente orgânico, reduzindo a tensão superficial e
resultando na dispersão e formação das gotículas. A dispersão ocorre, pois o
decréscimo da tensão superficial aumenta espontaneamente a área superficial na
interface (KELMANN e col., 2007; KOROLEVA & YURTOV, 2012).
Figura 5. Formação de nanoemulsões por emulsificação espontânea (adaptado de
McCLEMENTS, 2011).
37
1.5. Caracterização física de nanoemulsões
a) Espectroscopia de correlação de fótons
Várias técnicas podem ser usadas para determinar o diâmetro médio (φ) e
a distribuição de tamanho das gotículas. Entretanto, a mais utilizada é a
espectroscopia de correlação de fótons (Photon Correlation Spectroscopy–PCS),
também conhecido como espalhamento dinâmico de luz (Dynamic Light Scattering–
DLS) (HUNTER, 1996).
O princípio desta técnica está em calcular o valor do coeficiente de
difusão a partir das flutuações da intensidade da luz espalhada, causadas pelo
movimento Browniano. Partículas, quando em suspensão, apresentam movimento
Browniano e, dependendo da velocidade de difusão das partículas, ocorre variação
da intensidade da luz espalhada. A velocidade de difusão depende do diâmetro das
partículas, quanto menor o diâmetro, mais rapidamente elas se movem (HUNTER,
1996; JOSHI e col., 2008; CARDOSO, 2012). O diâmetro hidrodinâmico da partícula
(dH) pode ser determinado usando a relação de Stokes-Einstein (equação 1)
(MALVERN, 2012).
D =
(1)
onde k é a constante de Boltzmann, T é a temperatura absoluta, η a viscosidade do
solvente, RH
o raio hidrodinâmico e D o coeficiente de difusão.
No caso de nanoemulsões para uso parenteral o diâmetro médio das
gotículas e a distribuição de tamanhos são características importantes a serem
determinadas. O diâmetro deve ser compatível com o diâmetro dos vasos
sanguíneos. Gotículas com φ superior a 5 µm são clinicamente inaceitáveis, pois
podem causar embolia (BENITA & LEVY, 1993, FLOYD,1999).
O monitoramento temporal do diâmetro das gotículas também permite
verificar a estabilidade das nanoemulsões. Fenômenos como floculação,
coalescência, cremeação e separação de fases são indicativos de emulsões
instáveis (FLOYD, 1999; SCHAFFAZICK e col., 2003; BRUXEL e col., 2012).
38
b) Potencial Zeta
O potencial Zeta (ζ) é uma propriedade física de partículas em suspensão,
sendo utilizado para prever e controlar a estabilidade de emulsões (DALTIN, 2011;
MALVERN, 2015). O entendimento sobre o potencial Zeta depende do
conhecimento sobre a dupla camada elétrica. Grande parte de materiais particulados
adquirem carga elétrica superficial quando em contato com um líquido polar. Essa
carga influencia a distribuição espacial dos íons que estão próximos à superfície da
partícula, atraindo íons de carga oposta e repelindo íons de mesma carga. Isto faz
com que aumente a concentração de íons nessa região, sendo formada uma dupla
camada elétrica. Esta é constituída de uma região interna (camada de Stern), onde
os íons estão fortemente ligados à superfície, e uma região externa (camada difusa),
onde a distribuição de íons é determinada pelo equilíbrio entre as forças
eletrostáticas e o movimento térmico. O potencial Zeta é a medida do potencial
elétrico localizado no plano de cisalhamento (localizado entre a camada de Stern e
camada difusa). Sua medida é obtida a partir de fenômenos decorrentes da
movimentação das partículas em relação ao meio em que estão dispersas,
provocando o rompimento da dupla camada elétrica, no plano de cisalhamento (Fig.
6) (MORRISON & ROSS, 2002; DALTIN, 2011; MALVERN, 2015).
Figura 6. Representação esquemática do potencial Zeta (adaptado de DALTIN,
2011).
39
A técnica mais utilizada para determinação do potencial Zeta é a
eletroforese. Por meio dela determina-se a mobilidade eletroforética das partículas
no plano de cisalhamento. Ela é obtida da seguinte maneira: quando um campo
elétrico é aplicado, partículas carregadas são atraídas para o eletrodo de carga
oposta. A velocidade com que partícula se move sob ação de um campo elétrico
aplicado é a mobilidade eletroforética. Ela é convertida em potencial Zeta através da
equação de Henry.
UE =
( 2)
onde UE é a mobilidade eletroforética, ζ o potencial Zeta, ε a constante dielétrica, η a
viscosidade e f(κa) a função de Henry. Como o potencial Zeta comumente é medido
em meio aquoso, com uma concentração moderada de eletrólitos, f(κa) é 1,5 e se
refere à aproximação de Smoluchowski (HUNTER, 1996; DALTIN, 2011; MALVERN,
2015).
A magnitude do potencial Zeta pode indicar se um sistema é estável ou
não. Se as gotículas em suspensão tiverem valor (positivo ou negativo) alto do
potencial Zeta, as forças repulsivas superam as de London que atraem as gotículas
entre si e o sistema se mantém estável. Caso o valor de ζ seja pequeno, em modulo,
as forças de London superam as forças repulsivas e o sistema pode coalescer. Em
geral, é requerido que o potencial Zeta tenha um valor mínimo de 30 mV (em
módulo) para que o sistema se mantenha estável (DALTIN, 2011; MALVERN, 2015).
Desta forma, a estabilidade do sistema vai depender do balanço entre as
forças de atração (forças de van der Waals) e as de repulsão (proporcionadas pela
dupla camada elétrica). Se houver predomínio das forças de atração, as gotículas
irão se aproximar e o sistema irá coalescer. Caso o predomínio seja das forças de
repulsão as gotículas permanecerão cineticamente independentes e a emulsão será
estável (BENITA & LEVY, 1993; FRONZA e col., 2004; DALTIN, 2011; BRUXEL e
col., 2012).
A estabilização eletrostática pode ser promovida pela adsorção de
tensoativos iônicos à superfície das gotículas (BENITA & LEVY,1993; DALTIN, 2011;
MALVERN, 2015). No caso de nanoemulsões isto pode ser feito com lecitinas.
40
Fosfolipídios são componentes majoritários das lecitinas e são eles, na forma
ionizada (fosfatidilserina e o ácido fosfatídico em pH 7), que conferem à superfície
das gotículas alto valor do potencial Zeta (-40 a -60 mV) (WASHINGTON, 1996;
FLOYD, 1999; BRUXEL e col., 2012), estabilizando a nanoemulsão. Contudo, é
importante ressaltar que sistemas estabilizados com fosfolipídios podem ter o
potencial Zeta reduzido em meio ácido, pois as formas ionizadas desses fosfolipídios
só estão presentes em pH 7. Assim, a adição de aditivos que mantenham o pH da
nanoemulsão em aproximadamente 7 é necessária para manter a estabilidade das
nanoemulsões (FRONZA e col., 2004; KELMANN, 2006).
É importante destacar que o potencial Zeta reflete a estabilização
mediante forças eletrostáticas. Outro tipo de estabilização também pode acontecer:
a estabilização estérica, devido à adsorção de moléculas grandes de tensoativo à
superfície das gotículas, impedindo a agregação do sistema (SHAW, 1975;
WASHINGTON, 1996; DALTIN, 2011). A presença desse tipo de tensoativo nas
formulações de nanoemulsões pode reduzir os valores do potencial Zeta
(MARCATO e col., 2009), indicando, a princípio, nanoemulsões instáveis. Mas o tipo
de estabilidade observada para estes sistemas não é a de repulsão e sim a estérica.
c) pH
Nanoemulsões são física e quimicamente mais estáveis em pH 6,5 - 8,0.
Esses valores estão relacionados à taxa de hidrólise dos triglicerídeos e fosfolipídios
que, ao dissociar, formam ácidos graxos. A presença desses ácidos reduz o pH das
formulações, sendo empregados como indicadores de estabilidade em diferentes
condições de temperatura e armazenamento (FRONZA e col.,2006). O pH também é
indicativo de aplicabilidade para uso de nanoemulsões para administração
parenteral.
1.6. Fatores que interferem na estabilização
1.6.1. Instabilidade e mecanismos de fragmentação
Assim como as emulsões, nanoemulsões também são sistemas
metaestáveis e mostram tendência em separar fases ao longo do tempo, através de
diferentes mecanismos físico-químicos, incluindo a separação gravitacional,
41
floculação, coalescência, Ostwald "ripening" e degradação química (DALTIN, 2011;
McCLEMENTS & RAO; 2011).
a) Separação gravitacional
É a instabilidade mais frequente em emulsões e pode ocorrer de duas
formas: sedimentação e cremeação (Fig. 7), dependendo da diferença entre as
densidades das fases interna e contínua. Na cremeação as gotículas possuem
densidade menor que a da fase contínua e a emulsão se concentra acima do líquido.
Na sedimentação ocorre o contrário e a emulsão se concentra abaixo do líquido
(DALTIN, 2011; McCLEMENTS & RAO, 2011). A velocidade de
cremeação/sedimentação foi estudada por Stokes, que deduziu a equação para
cálculo da mesma, considerando gotículas esféricas em uma fase contínua:
Ʋ=
(3)
onde Ʋ é a velocidade de cremeação/sedimentação, r o raio da gotícula (sem
considerar a camada de tensoativo e solvatação da água), g a aceleração da
gravidade, Δρ a diferença de densidade entre as fases interna e contínua e η a
viscosidade da fase contínua.
Figura 7. Tipos de instabilidades que ocorrem em emulsões: separação
gravitacional, floculação, coalescência e Ostwald "ripening" (adaptado de
McCLEMENTS, 2011)
42
b) Floculação e coalescência
Nanoemulsões são mais estáveis que emulsões, pois tem menor
tendência em agregar devido à influência do pequeno diâmetro das gotículas.
Quando gotículas se aproximam ocorrem colisões, dependendo das forças de
atração e repulsão entre elas e da natureza da superfície, isso pode resultar em
agregação permanente ou não. Floculação e coalescência (Fig. 7) são fenômenos
onde há associação das gotículas. No primeiro as gotas se agrupam em flocos,
sendo o processo reversível (Fig. 7) e no segundo as gotículas se unem formando
gotas maiores e o processo é irreversível, desestabilizando o sistema inicial
(FLORENCE & ATWOOD, 2003; DALTIN, 2011; McCLEMENTS & RAO, 2011).
c) Ostwald "ripening"
Neste fenômeno (Fig. 8) o diâmetro médio das gotículas aumenta ao
longo do tempo. Ele ocorre, pois gotículas pequenas tem grande área superficial,
alta pressão interna e dissolvem no meio. Essas moléculas resultantes depositam na
superfície das gotículas maiores, a qual tem pressão interna menor, aumentando de
tamanho (DALTIN, 2011; McCLEMENTS & RAO, 2011). O principal fator
responsável pelo Ostwald "ripening" é a solubilidade da fase oleosa (interna) na fase
contínua (externa). Se a fase interna for solúvel na contínua ocorrerá este fenômeno.
Ele dificilmente acontece em nanoemulsões preparadas com óleos pouco solúveis
na fase contínua e para evitá-lo pode-se adicionar moléculas apolares, insolúveis em
água, como os TLC's. Efeito similar é obtido com mistura de lipídios (DALTIN, 2011;
McCLEMENTS & RAO, 2011).
Figura 8. Ostwald "ripening".
43
1.6.2. Estabilidade de nanoemulsões
Tipos de interação entre as gotículas
Há cinco tipos de interações entre gotículas de nanoemulsões: 1) van der
Waals; (2) eletrostática; (3) estéricas (que dependem da geometria e conformação
das moléculas na interface das gotículas); 4) hidrofóbicas; 5) hidratação
(FLORENCE & ATWOOD, 2003; McCLEMENTS & RAO, 2011). Elas são
importantes para a compreensão dos processos que levam à estabilidade e
instabilidade das nanoemulsões.
As interações eletrostáticas de repulsão e de atração de van der Waals
foram estudadas por Deryagin e Landau e por Verwey e Overbeek, originando a
teoria DLVO da estabilidade coloidal (FLORENCE & ATWOOD, 2003).
As interações de van der Waals são sempre atrativas, seja em água ou
em outro solvente. Elas dependem da natureza da gotícula, da distância entre elas e
do meio em que se encontram. Estas interações podem ser reduzidas pela repulsão
eletrostática (FLORENCE & ATWOOD, 2003; DALTIN, 2011).
A repulsão eletrostática ocorre entre as duplas camadas elétricas de
gotículas recobertas com tensoativos iônicos com mesma carga (Fig. 10). Ela
depende da distância entre as gotículas, do valor da carga total ou da densidade da
carga superficial das gotículas. Quanto maior o número de cargas na superfície de
cada gotícula, maior a barreira energética a ser vencida para coalescência e, assim,
maior a estabilidade da nanoemulsão (DALTIN, 2011).
A teoria DLVO propõe que a estabilidade de partículas em solução
depende do balanço entre as energias potenciais de repulsão (VR) e de atração (V
A)
(FLORENCE & ATWOOD, 2003; DALTIN, 2011; MALVERN, 2015):
VT = VA + VR (4)
A Figura 9 mostra gráficos das energias mencionadas, em função da
distância entre as gotículas.
44
Figura 9. Energia potencial em função da distância entre gotículas
(adaptado de DALTIN, 2011).
Se as gotículas colidirem com energia suficiente para superar as
barreiras, as forças de atração serão suficientemente intensas para mantê-las
irreversivelmente unidas. Mas se as forças de repulsão forem suficientemente
elevadas isso não ocorrerá e o sistema coloidal manter-se-á estável (MORRISON &
ROSS, 2002; FLORENCE & ATWOOD, 2003; MALVERN, 2015).
Na distância correspondente ao mínimo secundário existe fraca adesão
entre as gotículas, ocorrendo floculação, fenômeno reversível. Neste caso os
agregados podem ser re-dispersos via agitação vigorosa. Na distância
correspondente ao mínimo primário ocorre coalescência, fenômeno irreversível
(FLORENCE & ATWOOD, 2003; DALTIN, 2011).
Outro tipo de interação é a estérica, que envolve uso de tensoativos não
iônicos ou de polímeros que são adsorvidos à superfície das gotículas (Fig. 10),
constituindo uma barreira física. As cadeias longas dessas macromoléculas
impedem, estericamente, aproximação mútua das gotículas, reduzindo ou impedindo
coalescência (FLORENCE & ATWOOD, 2003; DALTIN, 2011).
45
Figura 10. Tipos de estabilização de coloides: estérica e eletrostática.
1.6.3. Seleção de tensoativos
Balanço hidrofílico lipofílico (BHL)
Geralmente misturas de tensoativos formam sistemas mais estáveis que
tensoativos individuais. Possivelmente isso ocorre devido a formação de uma
película estabilizadora mais rígida. Apesar de todo o conhecimento acumulado sobre
teoria da estabilidade de coloides, na prática a seleção do par de tensoativos usados
nas formulações é feita de modo empírico, conforme proposta por Griffin (1949),
mediante o cálculo do parâmetro BHL dos tensoativos em solução. (FLORENCE &
ATWOOD, 2003; DALTIN, 2011).
BHL é um número adimensional, com valor entre 1 e 50. Tensoativos com
46
pequenos valores de BHL tendem formar emulsões água/óleo e com grandes
valores tendem formar emulsões óleo/água (DALTIN, 2011).
Tabela 1. Aplicações de tensoativos de acordo com o valor do BHL
Aplicação BHL
Emulsionante de água em óleo 3-6
Umectante 7-9
Emulsionante de óleo em água 8-14
Detergente 9-13
Solubilizante 10-13
Dispersante de sólido em água Acima de 12
Adaptado de DALTIN, 2011
Cálculo de BHL da mistura de tensoativos
O valor de BHL para mistura de tensoativos A (hidrofílico) e B (lipofílico)
pode ser calculado usando a fração da massa correspondente ao tensoativo usado,
seguindo a equação 5:
BHL(mistura) = BHLA X 0,01A + BHLB X 0,01B (5)
A% + B% = 100% (6)
A escolha adequada da mistura de tensoativos pode ser feita preparando
uma série de emulsões contendo tensoativos com valores diferentes de BHL. Sabe-
se que a mistura de tensoativos com valores grandes e pequenos de BHL geram
emulsões mais estáveis. Experimentalmente, o valor ótimo de BHL está relacionado
à não ocorrência de separação de fases e cremeação. O valor de BHL pode ser
determinado por DLS, onde é observado o diâmetro médio das gotículas, que é
mínimo (FLORENCE & ATWOOD, 2003).
É importante ressaltar que o cálculo de BHL não é completamente
correto, pois a solubilidade de tensoativos depende da temperatura. Por exemplo, o
valor de BHL de tensoativos não iônicos diminui com aumento da temperatura
(FLORENCE & ATWOOD, 2003; DALTIN, 2011). Outra desvantagem é a possível
47
alteração da solubilidade. Como o BHL mede o balanço da solubilidade em óleo e
água das moléculas do tensoativo, qualquer alteração no sistema pode afetar a
solubilidade. Em tensoativos não iônicos o aumento da temperatura reduz sua
solubilidade em água, por isso o BHL diminui. O inverso ocorre com tensoativos
iônicos (DALTIN, 2011).
O sistema também não considera a influência da concentração de
tensoativo. Altas concentrações podem provocar alterações reológicas, como
aumento da viscosidade (DALTIN, 2011).
1.7. Otimização do processo de obtenção de nanoemulsões
As características físico-químicas e as propriedades de nanoemulsões
são afetadas pela composição da formulação e pelas variáveis de preparação,
relacionadas à agitação ou emulsificação. As principais características a serem
otimizadas são a polidispersidade, o diâmetro e o potencial Zeta, indicativo da
estabilidade da formulação. Assim, foram feitos planejamentos fatoriais 22 para
identificar a melhor composição e parâmetros de preparação (GUTIÉRREZ e col.,
2008).
1.8. Ciclosporina A (CsA)
Ciclosporinas fazem parte de um grupo de oligopeptídeos cíclicos com
atividade imunossupressora, são pouco solúveis em água (0,04 mg/mL a 25 ºC), o
que dificulta a preparação de fórmulas injetáveis que contenham quantidade
terapêuticamente suficiente do fármaco. Na tentativa de solucionar a baixa
solubilidade aquosa de CsA, solventes orgânicos, como etanol e polioxietileno
(Cremophors), potencialmente tóxicos, são usados em suas formulações (PARIKH e
col., 1997).
Além de ser utilizada em pacientes submetidos a transplantes alogênicos
de órgãos, CsA também é indicada no tratamento de psoríase (LOPES, 2005),
dermatite atópica, olhos secos (em colírios), diabetes mellitus 1, etc. Neste último
caso, o tratamento se torna mais eficaz em crianças (BOUGNÈRES col., 1990),
desde que em doses elevadas, o que limita seu uso devido à toxicidade (PARIKH
col., 1997). Em estudo recente, visando diminuir a dose de CsA esta foi administrada
concomitantemente com metotrexato, sendo possível induzir remissão da diabetes
48
mellitus 1 (SOBEL e col., 2010).
Figura. 11. Estrutura química de Ciclosporina A (adaptado de BRUXEL e col., 2012).
49
II. OBJETIVOS
2.1 Geral
Desenvolver e caracterizar nanoemulsões contendo o fármaco
ciclosporina A, para administração parenteral.
2.2 Específicos
Desenvolver nanoemulsões pelo método de baixa energia de
emulsificação, usando a técnica de emulsificação espontânea;
Desenvolver nanoemulsões pelo método de alta energia de emulsificação,
usando sonicador com ponteira;
Verificar a influência de diferentes tensoativos e óleos utilizados nas
nanoemulsões e a quantidade de cada um, nas propriedades das
nanoemulsões;
Caracterizar as nanoemulsões quanto à distribuição do diâmetro das
gotículas, índice de polidispersidade e estabilidade;
Determinar a eficiência de encapsulação, teor de carregamento e perfil de
liberação da ciclosporina A, nas nanoemulsões;
Determinar as melhores condições para armazenagem das formulações.
50
III. PARTE EXPERIMENTAL
3.1. Reagentes e equipamentos
3.1.1 Equipamentos
Agitadores magnéticos IKA®, modelo Topolino.
Calorímetro diferencial DSC TA Instruments, modelo 2910.
Centrífuga Eppendorf®, modelo 5418.
Centrífuga Excelsa II Fanem®, modelo 206BL.
Cromatógrafo HPLC Agilent®, modelo
Difratômetro de Raios-X Shimadzu, modelo XRD7000
Estufa Binder FED240, com controle digital.
Evaporador rotatório Buchi® - Rotavapor®, modelo R-100
Microscópio eletrônico de varredura JEOL, modelo JSM 6360
pHmetro de bancada digital, Micronal®, modelo B474
Ultrassonicador de ponteira Branson Sonic Power Co., modelo Sonifier® B12
Homogeneizador Ultra-Turrax® IKA®, modelo T25, com elemento dispersor de aço
inox (S75N-25F) e elemento dispersor de policarbonato (PC/PEEK – S25D-10G-KS)
ZetaSizer Malvern® Instruments, modelo 300HS NanoZS
3.1.2 Reagentes
Ácido oleico (Synth®)
Acetona PA(Synth®)
Acetonitrila para HPLC (Tedia®)
Água deionizada (deionizador MilliQ® com membrana 0,22µm)
Alfa-tocoferol (Sigma-Aldrich®)
Ciclosporina A (Sigma-Aldrich®)
Etanol PA (Synth®)
Glicerol (Synth®)
Hidróxido de sódio (Vetec®)
Lecitina hidrogenada de soja SL80-3 (80% de fosfatidilcolina), lecitinas S100-3 (90%
de fosfatidilcolina e aglomerados) e S-PC-3 (98% de fosfatidilcolina) (Lipoid®)
51
Lecitinas de soja S75 (70% de fosfatidilcolina) e 100 (90% fosfatidilcolina e
aglomerados) (Lipoid®)
Metanol para HPLC (Tedia®)
Poloxamer 188/Pluronic® F68 (Sigma-Aldrich®)
Polisorbato 80 (TMAZ80)
Polisorbato 20 (TMAZ20)
Triglicerídeo de cadeia média Myritol® 318PH (Cognis-BASF®), com 95% de ácido
cáprico/caprílico
3.2 Procedimentos
3.2.1 Métodos de preparação das nanoemulsões
3.2.1.1 Método de baixa energia de emulsificação (técnica de emulsificação
espontânea BOUCHEMAL e col., 2004)
A técnica consistiu de três etapas. Na primeira foram preparadas duas
misturas, uma chamada de fase orgânica (FO) composta por um solvente miscível
em água, óleo, fármaco e tensoativo lipofílico (lecitina de soja) e outra, a fase
aquosa (FA) composta do tensoativo hidrofílico (não iônico), água e, se necessário,
algum adjuvante. Na segunda, a FO foi aquecida a 53°C até solubilização completa
da lecitina e adicionada lentamente à FA, sob agitação constante (600 rpm), usando
agitador mecânico, à temperatura ambiente, por 30 min. Após a nanoemulsão (NE)
formada, esta ficou em repouso por 15min . Na terceira etapa, a evaporação do
solvente foi realizada sob pressão reduzida. Finalmente foi feito o ajuste do pH entre
6,5 e 8,0, se necessário, com solução aquosa de NaOH 0,1M. Posteriormente as
amostras foram centrifugadas por 20 min, à 3200 rpm e estocadas em temperatura
adequada. A Figura 12 ilustra este método de preparação.
As quantidades exatas de cada componente presente na NE bem como
as condições experimentais estão na Tabela 2.
52
Figura 12. Representação esquemática da preparação de NE pela técnica da
emulsificação espontânea.
3.2.1.2 Método de alta energia de emulsificação, usando sonicador de ponteira
Foram também preparadas misturas FO e FA, ambas aquecidas
aproximadamente a 53°C. A FO foi lentamente vertida sob a FA, sob agitação
constante, utilizando agitador magnético (600 rpm) ou homogeneizador Ultra-Turrax®
com dispersor de policarbonato (PC/PEEK-S25D-10G-KS) por um período de tempo
e velocidade de rotação determinados. A temperatura foi mantida entre 53 e 63°C.
Em seguida, a mistura foi resfriada até temperatura ambiente; após 30 min esta
primeira emulsão foi colocada em banho com água a 10°C e homogeneizada
utilizando sonicador de alta potência. O tempo de sonicação e a percentagem de
potência utilizada foram determinados e estão descritas nos itens a seguir. Após ser
sonicada a amostra foi centrifugada por 20 min(3200 rpm), para eliminar partículas
de titânio desprendidas da ponteira. A evaporação do solvente foi feita sob pressão
reduzida e o pH final foi ajustado entre 6,5 e 8,0, se necessário, com solução aquosa
de NaOH 0,1 M. As NE foram estocadas em temperatura adequada. A Figura 13
ilustra este método de preparação.
1 - Aquecimento FO 53°C
2 – Adicionar B em A
lentamente. 4 – NE resfriar por 30 min
em temperatura ambiente
5 – Evaporação
do solvente
3 – Agitação mecânica em
temperatura ambiente
53
As quantidades de cada componente presente na NE e as condições
experimentais serão descritas nos próximos itens.
Figura 13. Representação esquemática da preparação de nanoemulsões pelo
método de alta energia de emulsificação usando sonicador com ponteira.
3.3 Planejamentos fatoriais usados no desenvolvimento das
nanoemulsões
Para obter nanoemulsões com diâmetro médio (φ) de gotículas, índice de
polidispersidade (IPD) e potencial Zeta (ζ) adequado, foram usados planejamentos
fatoriais 22 com triplicata no ponto central. Primeiramente foram estudadas as
condições experimentais do sonicador ou dos agitadores. Em seguida, foram feitos
planejamentos com diversos tipos de lecitina e tensoativos não iônicos.
2 – Adicionar B em A
lentamente
3 – Agitação com Turrax® ou mecânica a 53 – 63°C
4 – Solução resfriada a
10°C por 30 min
5 – Ultrassom banho a
10°C
1 - Aquecimento FO e FA
53°C
6 – Evaporação do solvente
54
3.3.1 Planejamentos fatoriais 22
Planejamentos experimentais são de grande utilidade em investigações
de formulações preliminares, pois com eles é possível verificar se determinados
fatores influenciam ou não nas respostas. São simples de serem executados,
podendo ser ampliados para planejamentos mais complexos. Na prática,
planejamentos fatoriais permitem realizar todas as combinações entre os níveis dos
fatores, possibilitando análise ampla para otimização das formulações. A principal
vantagem desses planejamentos é utilizar número reduzido de experimentos.
Para o desenvolvimento das nanoemulsões parenterais com CsA foram
empregados planejamentos fatoriais de dois níveis, com triplicata no ponto central. O
objetivo foi encontrar os melhores valores de φ, IPD e ζ que sejam aceitáveis para
nanoemulsões parenterais.
A modelagem inicial foi realizada supondo que as respostas fossem
ajustáveis a um modelo linear, dado pela equação 7:
ŷ = b0 + b1 x1 + b2 x2 (7)
onde b0, b1 e b2 são os estimadores dos parâmetros do modelo e x1 e x2 os fatores
codificados.
Para obtermos os valores de b0 , b1 e b2 foi usada a equação 8:
b = (XtX)-1 Xt y (8)
onde X é a matriz completa com os elementos (matriz com os coeficientes de
contraste +1, -1 ou 0), Xt é a matriz transposta e y o vetor coluna contendo os
diâmetros médios.
55
1 -1 -1
1 +1 -1
1 -1 +1
X = 1 +1 +1
1 0 0
1 0 0
1 0 0
Formulações iniciais
O método escolhido para iniciar os estudos foi o da emulsificação
espontânea (BOUCHEMAL e col., 2004), por ser de execução simples. Os
resultados obtidos nestes estudos serviram de base para o desenvolvimento das NE
produzidas pela metodologia de emulsificação com alta energia e a otimização das
formulações seguintes.
Testes preliminares
Para definir algumas etapas do processo antes de ser realizado o
planejamento experimental, foram realizados testes preliminares como as
formulações iniciais que vão do item 3.3.2 até 3.3.2.2.
3.3.2 Preparação de NE utilizando Poloxamer 188 (Pluronic®F68) e
lecitina de soja (Lipoid®S75) como tensoativos
3.3.2.1 Influência da ordem de adição da FO e FA e do tipo de solvente
NE foram preparadas utilizando a técnica de emulsificação espontânea
descrita no item 2.2.1. A ordem de adição da FO na FA foi testada e dois sistemas
foram propostos. No sistema S1 80 mL da FA (aquosa), contendo 0,136 g de
Poloxamer 188, foram adicionados lentamente à 40 mL da FO (etanol ou mistura de
etanol/acetona (1:1; v:v), com 0,4 g de TCM (Myritol® 318PH) e 0,086 g de lecitina
de soja, aquecida a 53°C até esta solubilizar. No sistema S2 a FO foi adicionada
56
lentamente à FA, mantendo constantes as demais condições. As NE foram feitas em
duplicata, estocadas por 7 dias a 25 °C e analisadas com relação a φ, IPD e ζ.
Poloxamer 188 será abreviado por P-F68 e a lecitina de soja Lipoid®S75
por LS75. Como triglicerídeo de cadeia média utilizado é o Myritol® 318PH este
sempre será representado por TCM.
3.3.2.2 Influência da concentração de tensoativos e TCM
NE foram preparadas utilizando a técnica de emulsificação espontânea
descrita no item 2.2.1. A FO, contendo etanol, lecitina de soja e TCM, foi aquecida a
53°C, até solubilização da lecitina, e adicionada lentamente à FA contendo P-F68,
sob agitação constante em agitador mecânico, à temperatura ambiente. As amostras
P1 e P2 foram estocadas por 15 dias e analisadas quanto à φ, IPD e ζ. Outras
amostras foram estocadas por 24 h e visualizadas quanto à separação de fases. Na
Tabela 2 estão indicadas as composições das NE.
Tabela 2. Composição das NE com L75S e P-F68 como tensoativos
Fase Componentes P1 P2 A1 A2 B1 B2 C1 C2
TCM %(m:v) 0,33 0,33 0,90 0,90 1,25 1,25 1,50 1,50
Orgânica LS75 %(m:v) 0,07 0,11 0,50 0,40 0,75 0,50 0,90 0,60
Etanol %(v:v) 20,0 20,0 19,6 19,6 19,5 19,5 19,4 19,4
Aquosa P-F68 %(m:v) 0,11 0,07 0,40 0,50 0,50 0,75 0,60 0,90
Água %(v:v) 79,5 79,5 78,4 78,4 78 78 77,6 77,6
Total T+TCM (%) 0,5 0,5 2,0 2,0 2,5 2,5 3,0 3,0
T+TCM (soma da massa total de tensoativos + óleo)
3.3.3 Preparação de NE usando sonicador com ponteira
3.3.3.1 Influência do tempo de sonicação e potência do ultrassom
A formulação escolhida para prosseguir nos estudos foi a C2, preparada
pelo método de alta energia de emulsificação (item 2.2.2). A FO, contendo 1,5%
(m:v) de TCM, 0,6% (m:v) de lecitina LS75 e 19,4% (v:v) de etanol, foi aquecida a
53°C. Paralelamente, FA, composta de P-F68, 0,9% (m:v) e 77,6% (v:v) de água, foi
57
aquecida à mesma temperatura. Mantendo esta entre 53 e 63°C, a FO foi
lentamente vertida sobre a FA, sob agitação magnética (600 rpm, 10 min). A mistura
final foi resfriada até temperatura ambiente e sonicada em banho com água a 10°C.
O solvente foi removido sob pressão reduzida e as amostras foram analisadas após
1 dia de estocagem a 25°C. As variáveis e os níveis do planejamento experimental
estão indicados nas Tabelas 3 e 4.
Tabela 3. Níveis relacionados ao tempo de sonicação e potência de ultrassom para
cada ensaio do planejamento experimental 22 com ponto central (Plan.1)
Níveis
Ensaio Tempo
x1
Potência
x2
Tempo
min
Potência
W
A -1 -1 5 200
B +1 -1 10 200
C -1 +1 5 400
D +1 +1 10 400
E1-E2-E3 0 0 7,5 300
Tabela 4. Níveis relacionados ao tempo de sonicação e a potência do ultrassom
para cada ensaio do planejamento experimental 22 com ponto central (Plan. 2)
Níveis
Ensaio Tempo
x1
Potência
x2
Tempo
min
Potência
W
F -1 -1 5 300
G +1 -1 15 300
H -1 +1 5 500
I +1 +1 15 500
J1-J2-J3 0 0 10 400
58
3.4 Influência dos diferentes tensoativos na estabilidade das NE
3.4.1 Balanço Hidrofílico-Lipofílico (BHL)
Foram preparadas NE seguindo a metodologia descrita no item 2.2.1. A
quantidade de tensoativos foi 3% (m:v). Os tensoativos lipofílicos escolhidos foram
as lecitinas de soja Lipoid®S100, Lipoid®S100-3 e Lipoid®SL80-3 e os tensoativos
hidrofílicos Polisorbato 20 (Tween®20) e P-F68. O valor de BHL de cada tensoativo
está na Tabela 5 e a proporção e o valor de BHL de cada mistura estão na Tabela 6.
Os cálculos de BHL da mistura seguiram as equações 5 e 6. As amostras foram
estocadas a 25°C e visualizadas após 1 dia, quanto à separação de fases.
Tabela 5. Valores de BHL dos tensoativos
Tensoativo Valor de BHL
P-F68 29
Polisorbato 20 16
Lecitinas 7
Tabela 6. Composição das NE seguindo os valores de BHL da mistura
Ensaio P-F68
%(m:v)
S100/S100-3/
SL80-3 %(m:v)
T20
%(m:v)
BHL (mistura) com P-F68 BHL (mistura) com T20
1 1,35 0,15 1,35 26,8 15,1
2 1,20 0,30 1,20 24,6 14,2
3 1,05 0,45 1,05 22,4 13,3
4 0,90 0,60 0,90 20,2 12,4
5 0,75 0,75 0,75 18,0 11,5
6 0,60 0,90 0,60 15,8 10,6
7 0,45 1,05 0,45 13,6 9,7
8 0,30 1,20 0,30 11,4 8,8
9 0,15 1,35 0,15 9,2 7,9
P-F68 (Pluronic® F68); S100 (Lipoid
® S100); S100-3 (Lipoid
® S100-3); SL80-3 (Lipoid
® SL80-3)
T20 (Polisorbato 20/Tween 20)
59
3.5 Otimização das NE obtidas pelo método de alta energia
3.5.1 NE produzidas com lecitina SL80-3 e T20 como tensoativos
A formulação 4, com lecitina SL80-3 e T20, foi selecionada para
prosseguir os estudos. NE foram produzidas pelo método de alta energia de
emulsificação (item 2.2.2). A FO, contendo 0,6% (m:v) da lecitina, 3% (m:v) de TCM
e 20% (v:v) de etanol, foi aquecida a 53°C e adicionada à FA com 0,9% (m:v) de T20
e 80% (v:v) de água, aquecida a 53°C, sob agitação magnética por 10 min. As
misturas foram resfriadas até temperatura ambiente e submetidas às condições
experimentais descritas na Tabela 7, em banho com água a 10°C. A remoção do
solvente foi feita à pressão reduzida. As amostras foram estocadas a 25°C. Os
resultados foram analisados quanto à φ, IPD e ζ, após 1 dia.
Tabela 7. Níveis relacionados ao tempo de sonicação e potência do ultrassom para
cada ensaio do planejamento experimental 22 com ponto central, para os tensoativos
SL80-3 e T20
Níveis
Ensaio Tempo
x1
Potência
x2
Tempo
min
Potência
W
L -1 -1 5 200
M +1 -1 10 200
N -1 +1 5 400
O +1 +1 10 400
P1-P2-P3 0 0 7,5 300
3.5.2 Testes utilizando agitador magnético e UltraTurrax na pré-
emulsão
Com objetivo de verificar se a etapa da pré-emulsão influencia no produto
final, foram testados dois tipos de agitação.
60
3.5.2.1 Agitação magnética
NE foram preparadas segundo descrito no item 2.2.2. A FO, contendo
0,6% (m:v) da lecitina SL80-3, 3% (m:v) de TCM e 20% (v:v) de etanol, foi aquecida
a 53°C e adicionada à FA com 0,9% (m:v) de T20 e 80% (v:v) de água e aquecida a
53°C, sob agitação magnética durante 20 min. O ponto central corresponde a manter
os 10 min na pré-emulsão. As misturas foram resfriadas até temperatura ambiente e
submetidas às condições experimentais descritas na Tabela 7, em banho com água
a 10°C. A remoção do solvente foi feita à pressão reduzida. As amostras foram
estocadas a 25°C e os resultados analisados quanto à φ, IPD e ζ, após 1 dia.
3.5.2.2 Homogeneizador UltraTurrax, com dispersor de policarbonato
(PC/PEEK-S25D-10G-KS)
NE foram preparadas segundo descrito no item 2.2.2. A FO, contendo
0,6% (m:v) da lecitina SL80-3, 3% (m:v) de TCM e 20% (v:v) de etanol, foi aquecida
a 53°C e adicionada à FA com 0,9% (m:v) de T20 e 80% (v:v) de água e aquecida a
53°C, sob agitação de 4000 ou 5000 rpm por 5 min. O ponto central manteve os 10
min com agitador magnético. As misturas foram resfriadas até temperatura ambiente
e submetidas às condições experimentais descrita na Tabela 7, em banho com água
a 10°C. A remoção do solvente foi feita sob pressão reduzida. As amostras foram
feitas em duplicata e estocadas a 25°C. Os resultados foram analisados quanto à φ,
IPD e ζ, após 1 dia.
3.5.3 NE produzidas com homogeneizador Ultra-Turrax, com dispersor
de aço inox (S75N-25F)
Foram preparadas duas fases: a FO, contendo 0,6% (m:v) da lecitina
SL80-3, 3% (m:v) de TCM e 20% (v:v) de etanol, foi aquecida a 53°C e adicionada à
FA com 0,9% (m:v) de T20 e 80% (v:v) de água e aquecida a 53°C, sob agitação
constante. O tempo de agitação e a velocidade de rotação do Ultra-Turrax estão
descritos nas Tabelas 8 e 9. A mistura foi resfriada até temperatura ambiente e o
solvente removido à pressão reduzida. As amostras foram feitas em duplicata e
estocadas a 25°C. Os resultados foram analisados quanto à φ, IPD e ζ, após 1 dia.
61
Tabela 8. Níveis relacionados ao tempo e velocidade do dispersor para cada ensaio
do planejamento experimental 22 (Plan 1)
Níveis
Ensaio Tempo
x1
Velocidade
x2
Tempo
min
Velocidade
Rpm
α1 -1 -1 5 3500
β1 +1 -1 10 3500
γ1 -1 +1 5 4500
δ1 +1 +1 10 4500
Tabela 9. Níveis relacionados ao tempo e velocidade do dispersor para cada ensaio
do planejamento 22 (Plan 2)
Níveis
Ensaio Tempo
x1
Velocidade
x2
Tempo
min
Velocidade
Rpm
α2 -1 -1 5 5500
β2 +1 -1 10 5500
γ2 -1 +1 5 6500
δ2 +1 +1 10 6500
3.5.3.1 NE γ2 e δ2
As NE γ2 e δ2, sonicadas por 10 min a potência de 400 W, foram
estocadas a 25°C e analisadas quanto à φ, IPD e ζ, após 1 dia.
3.6 Influência da proporção de TCM:tensoativos e tipo de solvente
Foram preparadas NE como descrito no item 2.2.2, sonicando durante 10
min, a 400 W. As proporções de TCM:tensoativo foram 1:1; 1:2; 1:3 e 1:4% (m:m).
Os solventes usados foram etanol ou mistura de etanol e acetona na proporção de
1:1% (v:v). As NE foram analisadas antes e depois da evaporação do solvente,
quanto à φ, IPD e ζ, a cada 7 dias, durante 30 dias. As composições das NE em
62
etanol e etanol:acetona estão nas Tabelas 10 e 11. As amostras foram feitas em
duplicata.
Tabela 10. Composição das NE com etanol
Ensaio TCM/
Tensoativo
TCM
%(m:v)
L-SL80-3
%(m:v)
T20
%(m:v)
Etanol
%(v:v)
Água
%(v:v)
F1 1:1 5 2 3 18 72
F2 1:2 5 4 6 17 68
F3 1:3 5 6 9 16 64
F4 1:4 5 8 12 15 60
TCM (Myritol® 318PH); L-SL80-3 (Lipoid
®SL80-3); T20 (Polisorbato 20)
Tabela 11. Composição das NE com acetona:etanol (1:1) (v:v)
Ensaio TCM/
Tensoativo
TCM
%(m:v)
L-SL80-3
%(m:v)
T20
%(m:v)
Et/Ac
%(v:v)
Água
%(v:v)
F6 1:1 5 2 3 18 72
F7 1:2 5 4 6 17 68
F8 1:3 5 6 9 16 64
F9 1:4 5 8 12 15 60
TCM (Myritol® 318PH); L-SL80-3 (Lipoid
®SL80-3); T20 (Polisorbato 20)
3.7 Influência da temperatura de armazenamento
Foram feitos ensaios de armazenamento a 4 °C e 25 °C. As amostras F2
e F6 foram feitas em duplicata e verificadas quanto à φ, IPD e ζ a cada 15 dias,
durante 30 dias.
3.8 Influência do método de incorporação do fármaco na NE
NE foram preparadas com 5% (m:m) de CsA em relação à quantidade de
TCM. Duas metodologias foram abordadas; em uma delas o fármaco foi solubilizado
no TCM antes da emulsificação, compondo a fase orgânica, e em outra o fármaco foi
incorporado após emulsificação (com NE já pronta). As amostras foram feitas em
63
duplicata, estocadas a 25°C e analisadas quanto à φ, IPD e ζ, a cada 15 dias,
durante 30 dias.
3.9 Influência do pH e glicerol
NE foram preparadas com 2,25% (m:v) de glicerol. O pH das amostras
variou entre 6,5 e 8,0. Para o ajuste do pH foi usada solução aquosa de NaOH 0,1M.
As amostras foram feitas em duplicata, estocadas a 4 °C e 25 °C e analisadas
quanto à φ, IPD e pH, a cada 30 dias, durante 180 dias. A composição de cada NE
está Tabela 12.
Tabela 12. Composições das NE com e sem glicerol
Fase composição F2-1 F2-2 F6-1 F6-2
TCM %(m:v) 5 5 5 5
orgânica L-SL80-3 %(m:v) 4 4 2 2
Etanol %(v:v) 17 17 9 9
T20 %(m:v) 6 6 3 3
CsA%(m:m)* 5 5 5 5
aquosa Glicerol %(m:v) - 2,25 - 2,25
Água %(v:v) 68 68 72 72
Acetona %(v:v) - - 9 9
TCM (Myritol® 318PH); L-SL80-3 (Lipoid
®SL80-3); T20 (Polisorbato 20)
*em relação à quantidade de óleo
3.10 Estabilidade térmica
NE foram preparadas como descrito no item 2.2.2, usando tempo de
sonicação 10 min e 400 W de potência. As amostras (em duplicata) foram mantidas
a 4 °C, 25 °C e 45 °C. Além da temperatura, também foi estudada a influência do
tipo e quantidade de tensoativo e tipo de solvente na estabilidade da NE. Os
tensoativos usados foram lecitina SL80-3, P-F68, T20 e Polisorbato 80 (Tween®80),
nas quantidades de 1:1 ou 1:2% (m:m). A análise quanto à φ, IPD e pH foi feita a
cada 15 dias, durante 30 dias. Na segunda etapa, com amostras mantidas a 4°C,
64
foram feitas as mesmas análises, a cada 30 dias, durante 120 dias. As formulações
estão na Tabela 13.
Tabela 13. Composições das NE para o teste de estabilidade térmica
Fase composição F2 F6 F19 F20 F27 F28
TCM %(m:v) 5 5 5 5 5 5
orgânica L-SL80-3 %(m:v) 4 2 4 2 4 2
Etanol %(v:v) 17 9 17 9 17 9
T20 %(m:v) 6 3 - - - -
T80 %(m:v) - - 6 3 - -
P-F68 %(m:v) - - - - 6 3
CsA% (m:m)* 5 5 5 5 5 5
aquosa Glicerol %(m:v) 2,25- 2,25 2,25 2,25 2,25 2,25
Água %(v:v) 68 72 68 72 68 72
Acetona %(v:v) - 9 - 9 - 9
* em relação à quantidade de óleo
3.10.1 Influência do aumento da fase aquosa
Este experimento foi feito baseado no item 3.9, mas o volume de água
usado foi 80mL e o do solvente foi 20mL.
3.11 Influência da incorporação de 5% ou 12% de CsA
NE foram preparadas como descrito no item 2.2.2, empregando tempo de
sonicação 10 min e 400W de potência.. Foram incorporados 5 ou 12% (m:m) de
CsA, em relação à quantidade de TCM, nas formulações F1, F2 e F6 (Tabelas 10 e
12). As amostras (em duplicata), foram mantidas a 4 °C, 25 °C e 45 °C e analisadas
a cada 15 dias, durante 30 dias, quanto à φ, IPD e pH.
3.12 Influência da incorporação de α-tocoferol
NE foram preparadas como descrito no item 2.2.2. Foram incorporados 10
e 30% (m:m) de α-tocoferol em relação à quantidade de TCM, nas formulações F1,
F2 e F6. As amostras, em duplicata, foram mantidas a 4 °C, 25 °C e 45 °C e
65
analisadas a cada 7 dias, durante 30 dias, quanto à φ, IPD e pH. Depois o ensaio
prosseguiu por mais 120 dias, determinando φ, IPD e pH a cada 30 dias.
3.13 NE obtidas mediante emulsificação espontânea
Com os resultados descritos nos itens anteriores, outros experimentos
foram feitos usando emulsificação à baixa energia.
3.13.1 Influência da proporção TCM:tensoativos e tipo de solvente
NE foram preparadas utilizando a técnica de emulsificação espontânea,
descrita no item 2.2.1. As proporções de TCM:tensoativo foram 1:0,8 e 1:0,5. A FO,
contendo etanol ou mistura de etanol e acetona (1:1, v:v), lecitina SL80-3 e TCM
318PH foi aquecida a 53°C, até solubilização da lecitina, e adicionada lentamente à
FA composta por água, Polisorbato 20 e glicerol, sob agitação magnética (600 rpm),
à temperatura ambiente. As amostras foram estocadas por 15 dias e analisadas a
cada 7 dias a 25 °C e analisadas quanto à φ, IPD e ζ. Na Tabela 14 estão as
composições das NE.
Tabela 14. Composições das NE produzidas mediante emulsificação espontânea
Fase composição ES1 ES2 ES-3 ES4 ES5 ES6
TCM %(m:v) 0,5 0,5 0,5 0,5 0,5 0,5
orgânica L-SL80-3 %(m:v) 0,13 0,13 0,13 0,13 0,09 0,09
Etanol %(v:v) 33 16,5 33 16,5 33 16,5
T20 %(m:v) 0,25 0,25 0,13 0,13 0,16 0,16
aquosa Glicerol %(m:v) 2,25- 2,25 2,25 2,25 2,25- 2,25
Água %(v:v) 67 67 67 67 67 67
Acetona %(v:v) - 16,5 - 16,5 - 16,5
TCM (Myritol® 318PH); L-SL80-3 (Lipoid
®SL80-3); T20 (Polisorbato 20)
3.13.2 Influência do tipo de tensoativo
3.13.2.1 NE produzidas em etanol
66
A formulação usada neste ensaio foi a ES1. A FO contendo etanol,
lecitina SL80-3 ou PC-3, TCM e CsA 5% (m:m), em relação à quantidade de óleo, foi
aquecida a 53°C, até solubilização da lecitina, e adicionada lentamente à FA (água,
glicerol e Polisorbato 20 ou 80), sob agitação magnética (600 rpm), à temperatura
ambiente. As amostras foram estocadas a 4, 25 e 45°C por 15 dias e analisadas a
cada 7 dias, quanto à φ, IPD, ζ e pH. Na Tabela 15 estão indicados os níveis e os
fatores usados.
Tabela 15. Níveis do planejamento para NE produzidas em etanol
Níveis
Ensaio Polisorbato Lecitina Lecitina
Polisorbato
F7 -1 -1 L-PC-3 T20
F8 +1 -1 L-PC-3 T80
F9 -1 +1 L-SL80-3 T20
F10 +1 +1 L-SL80-3 T80
PL1-PL2 0 0 L-SL80-3 T20
L-PC3 (Lipoid®PC-3); L-SL80-3 (Lipoid
®SL80-3); T20 (Polisorbato 20); T80 (Polisorbato 80); PL sem
CsA
3.13.2.2 NE produzidas em mistura de acetona e etanol
A formulação usada neste ensaio foi a ES2, preparada utilizando
emulsificação espontânea (item 2.2.1). A FO, contendo mistura de acetona/etanol
(1:1) % (v:v), lecitina SL80-3 ou PC-3, TCM 318PH e a CsA 5% (m:v) em relação à
quantidade de TCM, foi aquecida a 53°C, até solubilização da lecitina, e adicionada
lentamente à FA (água, glicerol e Polisorbato 20 ou 80), sob agitação magnética
(600 rpm), à temperatura ambiente. As amostras foram estocadas a 4 °C, 25 °C e 45
°C por 15 dias e analisadas, a cada 7 dias, em relação à φ, IPD, ζ e pH. Na Tabela
16 estão indicados os níveis e os fatores usados.
67
Tabela 16. Níveis do planejamento para NE produzidas em acetona e etanol
Níveis
Ensaio Polisorbato Lecitina Lecitina
Polisorbato
F11 -1 -1 L-PC-3 T20
F12 +1 -1 L-PC-3 T80
F13 -1 +1 L-SL80-3 T20
F14 +1 +1 L-SL80-3 T80
P1-P2 0 0 L-Sl80-3 T20
L-PC (Lipoid®PC-3); L-SL80-3 (Lipoid
®SL80-3); T20 (Polisorbato 20); T80 (Polisorbato 80); P: sem
CsA
3.13.3 Influência da incorporação de 5 ou 12% de CsA
NE foram preparadas como descrito no item 2.2.1, sendo incorporados 5
ou 12% (m:m) de CsA (nas formulações ES1 e ES2), em relação à quantidade de
TCM, conforme indicado nas Tabelas 15 e 16. As amostras, feitas em duplicata e
mantidas a 4 °C, 25 °C e 45 °C, foram analisadas a cada 15 dias, durante 30 dias,
quanto à φ e IPD.
3.13.4 Influência da adição do ácido oleico
NE foram preparadas como descrito no item 2.2.1. As formulações
escolhidas para este ensaio foram F9 e F10 com etanol como solvente e as
formulações F14 e F15 com mistura de acetona/etanol (1:1) (v:v). Para este teste foi
feita mistura entre TCM e ácido oleico (1:1; m:m), sendo o total do óleo de 0,5%
(m:v). Outras duas formulações, descritas na Tabela 16, foram estudadas com
Poloxamer. As amostras foram estocadas a 4 °C, durante 15 dias, analisadas a cada
7 dias quanto à φ e IPD.
68
Tabela 17. Composição das NE produzidas por emulsificação espontânea com
diferentes tensoativos não iônicos
Fase composição F25 F26 F9 F10 F13 F14
TCM %(m/v) 0,25 0,25 0,25 0,25 0,25 0,25
ÁcOleico %(m/v) 0,25 0,25 0,25 0,25 0,25 0,25
orgânica L-SL80-3 %(m/v) 0,13 0,13 0,13 0,13 0,13 0,13
Etanol %(v/v) 16,5 33 33 33 16,5 16,5
CsA %(m/m)* 0,025 0,025 0,025 0,025 0,025 0,025
T20 %(m/v) - - 0,25 - 0,25 -
T80 %(m/v) - - - 0,25 - 0,25
P-F68 %(m/v) 0,25 0,25 - - - -
aquosa Glicerol %(m/v) 2,25 2,25 2,25 2,25 2,25 2,25
Agua %(v/v) 67 67 67 67 67 67
Acetona %(v/v) 16,5 - - - 16,5 16,5
TCM (Myritol® 318PH); L-SL80-3 (Lipoid
®SL80-3); P-F68 (Pluronic
®F68)
3.14 Caracterização das NE
3.14.1 Determinação do pH
O pH de cada amostra foi medido com pHmetro calibrado com tampões
(Synth®) de pH 4 e pH 7, a 25°C.
3.14.2 Obtenção do diâmetro médio das gotículas (φ, Z average) e índice
de polidispersidade (IPD)
O diâmetro médio das NE foi determinado por espectroscopia de
correlação de fótons (PCS) utilizando o equipamento Zetasizer® 300HS (Malvern®
Instruments) a um ângulo fixo de 90° e 25°C. 25 µL de cada amostra foram diluídos
em 1 mL de água deionizada. Os resultados foram fornecidos como diâmetro médio
(avaliado pela intensidade). O valor máximo aceitável para o IPD foi 0,25 (MULLER
et al, 2004).
69
3.14.3 Obtenção do potencial Zeta (ζ)
O potencial Zeta foi determinado por espalhamento dinâmico de luz e
análise da mobilidade eletroforética, usando a lei de Henry. 25 µL de cada amostra
foram diluídos em 1 mL de água deionizada e as medidas realizadas em
equipamento Zetasizer® 300HS, a 25 °C.
3.15 Determinação da quantidade de CsA presente nas NE
3.15.1 Condições experimentais
A quantidade de CsA presente nas amostras foi determinada mediante
cromatografia líquida de alta eficiência (CLAE), em cromatógrafo Agilent®, com
detector de UV/Vis em 210 nm, coluna Zorbax® eclipse plus C18 (150 x 4,6 mm, 5
µm; Agilent®) e volume de injeção 20 µL. A fase móvel foi mistura de acetonitrila,
metanol e água (50:35:15) % (v:v), eluição em modo isocrático, em fluxo de 1
mL/min a 50 °C.
3.15.2 Curva analítica
A curva analítica foi construída com soluções de CsA em acetonitrila, com
a massa variando entre 1,25 e 10 µg. As amostras foram feitas em triplicata.
3.15.3 Eficiência de enscapsulação (EE)
O fármaco encapsulado foi quantificado por CLAE. A eficiência de
encapsulação (EE) foi calculada com a equação 9:
EE(%) =
x100 (9)
onde EE é a eficiência de encapsulação, fencaps é a quantidade de fármaco
encapsulado e ftotal a quantidade de fármaco total na amostra.
Para determinar fencaps primeiramente uma alíquota da NE foi filtrada em
membrana, não estéril, de PVDF, com diâmetro de poro 0,45 µm ((Millex HV-
Milipore®). Desse filtrado foi retirada uma alíquota de 100 µL e diluída em 1 mL de
acetonitrila. Para determinar ftotal 100 µL da NE foram diluídos em 1 mL de
acetonitrila.
70
Todas as soluções preparadas foram feitas em triplicata, filtradas em
membrana de PVDF com poros de diâmetro 0,45 µm (Millex HV-Milipore®) e
injetadas no cromatógrafo. A Figura 14 ilustra o procedimento para determinação da
EE%.
Figura 14. Esquema da preparação das amostras para determinar o percentual de
Eficiência de Encapsulação de CsA nas NE.
3.15.4 Microscopia eletrônica de varredura
A microscopia eletrônica de varredura (MEV) foi utilizada com objetivo de
verificar a presença de fármaco livre na formulação. Após filtração essas membranas
foram secas e colocadas sobre uma fita de carbono no porta amostras. Elas foram
NE
Filtração
PVDF 0,45µm
100µL
Completar com 1mL de
acetonitrila
Centrifugação
14000 rpm por
30 min
Filtração
0,45µm
Determinação de fencaps
1mL
Determinação de ftotal
Completar com 1mL de
acetonitrila
100µL
Análise por CLAE
71
revestidas com ouro, utilizando metalizador MED 20 Coating Systems (Bal-Tec),
operando a 20 mA, 50 mTorr, durante 160 min. Para fins de comparação, amostras
de CsA retidas nas membranas também foram analisadas.
72
IV.RESULTADOS E DISCUSSÃO
4 Preparação de NE com P-F68 e lecitina de soja (Lipoid®S75)
4.1 Influência da ordem de adição da fase orgânica (FO) e aquosa
(FA) e do tipo de solvente
Na obtenção de nanoemulsões via emulsificação espontânea, geralmente
a fase orgânica (óleo, fármaco e tensoativo lipofílico) é vertida na fase aquosa
(tensoativo hidrofílico e água), formando gotículas com φ satisfatório para aplicação
parenteral (YU e col., 1993; BOUCHEMAL e col., 2004; KELMANN e col., 2007).
Schalbart (2010) mostrou que a ordem de adição dos componentes influencia as
propriedades físico-químicas e estabilidade de NE com tetradecano, Tween®60 e
Span®60. Ele fixou a quantidade de tensoativo e de óleo e adotou três metodologias
para produzir NE. Na primeira (M1) a fase aquosa é vertida na orgânica e todos os
tensoativos são dissolvidos no óleo. Na segunda (M2) a fase orgânica é vertida na
aquosa, um dos tensoativos é dissolvido no óleo e o outro em água e na terceira
(M3) todos os constituintes são misturados juntos. O resultado do estudo de
Schalbart demonstrou que para M2, as amostras obtidas não foram estáveis,
havendo separação de fases e as amostras obtidas com M3 foram satisfatórias em
termos do diâmetro médio das gotículas (206±11 nm) e estabilidade (10 meses,
286±32 nm).
Ao longo deste texto, para reduzir a frequência de palavras repetidas, o
diâmetro médio será, em várias ocasiões, substituído pelo símbolo φ, o Índice de
Polidispersidade pela sigla IPD, o potencial Zeta pelo símbolo ζ e o Lipoid® S75 por
LS75.
Nesta Tese foi estudada se a ordem de adição dos componentes altera o
φ, IPD, ζ e a estabilidade (comprovada por separação de fases) das NE. Os
resultados estão na Tabela 18.
73
Tabela 18. Diâmetro médio, IPD e potencial Zeta
S1 (etanol) S2 (etanol) S1 (acetona) S2 (acetona)
φ (nm) 480,8±61,5 139,9±5,4 3979,3±168 149,1±11,4
IPD 0,55±0,02 0,15±0,02 1,0±0,0 0,11±0,02
ζ (mV) -41,2±5,8 -31,3±12,2 -34,9±5,4 -0,8±0,2
A principal característica do solvente usado na emulsificação espontânea
é ser miscível com a fase contínua (água) (BOUCHEMAL e col., 2004), sendo
escolhidos etanol e acetona, na proporção 50:50 (v:v). O solvente influenciou de
modo diferente nas propriedades das NE, dependendo do método S1 ou S2. No S2
as NE ficaram estáveis, não apresentaram agregados e nem separação de fases
durante 7 dias, a 25 °C. Quanto ao φ das gotículas, não houve diferenças
significativas (139,9±5,4 nm em etanol e 149,1 ±11,4 nm em acetona), concordando
com trabalhos de YU e col. (1993), BOUCHEMAL e col. (2004) e KELMANN e col.
(2007).
No método S1 as diferenças foram expressivas para φ (480,8±61,5 nm em
etanol e 3979,3 ±168 nm em acetona) e para a estabilidade (houve separação de
fases), se comparadas com os resultados obtidos no método S2. Isso pode ter
ocorrido porque em S1 a difusão do solvente, possivelmente, foi mais lenta que no S2
(YU e col., 1993; KELMANN e col., 2007).
4.2 Influência da concentração de tensoativos e de TCM
Inicialmente foi avaliado se a remoção do solvente e o tipo de tensoativo
(lipofílico ou hidrofílico, dependendo do valor de BHL) podem afetar as propriedades
das NE (amostras P1 e P2). Depois foram estudados os efeitos causados pelo
aumento da quantidade de tensoativos e de óleo (T+TCM), em relação à de água e
o tipo de tensoativo (amostras A1 a C2).
Os métodos escolhidos para preparar as NE envolvem uso de solvente e
sua retirada pode ocasionar instabilidade ou variação do φ das gotículas. Nas NE
obtidas não foi observada separação de fases ou cremeação, demonstrando serem
estáveis (15 dias, com e sem evaporação do solvente). Contudo, foram notadas
74
mudanças em φ, IPD e ζ (Tabela 19). As formulações obtidas com evaporação do
solvente apresentaram gotículas com diâmetros menores em comparação com as
NE sem evaporação do solvente. Também foi observado que, quanto menos P-F68
for usado na formulação, gotículas com diâmetros menores são obtidas
(BOUCHEMAL e col., 2004).
Tabela 19. Diâmetro médio, IPD e potencial Zeta (formulações P1 e P2 com e sem
evaporação do solvente), nos dias 1 e 15
Com evaporação Sem evaporação
For φ
nm
IPD ζ
mV
φ
nm
IPD ζ
mV
BHL
P1
dia 1
151,9±10,0 0,14±0,02 -14,1±1,6 278,1±20,9 0,27±0,04 -2,8±0,3 20,2
P2
dia 1
150,9±8,6 0,15±0,00 -22,6±5,0 184,6±21,6 0,20±0,04 -1,8±0,5 15,8
P1
dia 15
158,3±2,4 0,13±0,00 -24,6±1,8 226,5±12,9 0,24±0,01 -1,6±0,4 20,2
P2
dia 15
155,8±4,6 0,17±0,00 -25,1±1,8 192,4±10,0 0,15±0,00 -24,2±0,5 15,8
Com os resultados da Tabela 19 pode-se variar de 2% a 3% (m:m) a
quantidade de TCM mais mistura de tensoativos (Tabela 2) (IZQUIERDO e col.,
2005; NABI e col., 2007; AZEEM e col., 2009).
A Tabela 20 mostra que os valores de BHL da mistura de tensoativos
somente foram significativos quando houve aumento da sua quantidade e a de TCM.
Para valores de 0,5% (m:v, TCM+T, amostras P1 e P2) e 2,0% (amostras A1 e A2)
não houve separação de fases. Desta forma, para essas quantidades de tensoativos
mais TCM o valor de BHL pouco influenciou na estabilidade das nanoemulsões. Já
para um valor >2,0% o BHL é importante. Foi observado que para as amostras B1 e
C1 (com menor quantidade de P-F68 e BHL 15,8) ocorreu separação de fases, ao
contrário do observado para as amostras B2 e C2 (BHL 20,2). Alguns estudos
75
relatam que a presença de P-F68 estabiliza melhor as nanoemulsões (LEVY &
BENITA, 1989; BOUCHEMAL e col., 2004; PÉREZ e col., 2009; GÓMEZ e col.,
2014). A formulação escolhida para prosseguir nos estudos foi a C2.
Tabela 20. Aspecto visual das NE e valores de BHL da mistura de tensoativos
For Aspecto visual Separação de fases BHL
A1 leitoso não 16,8
A2 leitoso não 19,2
B1 leitoso separação 2 fases 15,8
B2 leitoso não 20,2
C1 leitoso separação 2 fases 15,8
C2 leitoso não 20,2
4.3 Preparação de NE usando sonicador com ponteira
4.3.1 Influência do tempo de sonicação e potência do ultrassom
Este experimento foi realizado objetivando otimizar a formulação C2. O
sonicador com ponteira foi escolhido por usar pouca quantidade de amostra e ser de
fácil operação. Este aparelho gera ondas mecânicas (frequência 20 kHz, potência
máxima 1000 W) que fragmentam, por cavitação, as gotas (CHANDRAPALA e col.,
2012; GHOSH e col., 2013; TANG e col. 2013, SONOMECHANICS, 2014).
Para obter NE com gotículas de menor diâmetro e maior estabilidade foi
feito planejamento experimental (Plan 1) com dois fatores (tempo de sonicação, tS, e
potência do ultrassom, PS) e dois níveis (tS 5 e 10 min., PS 200 e 400 W) e um ponto
central (tS 7 min, PS 300 W), cujo ensaio foi realizado em triplicata.
Os resultados do Plan 1 (Tabela 21) mostram que o aumento de tS e de
PS reduziu o diâmetro das gotículas. A amostra D apresentou o menor φ (51,77 nm),
com tS 10 min e 400 W, resultado também observado por Tang e col. (2013) e Gosh
e col. (2013).
76
Tabela 21. Diâmetro médio, IPD e potencial Zeta (Plan 1)
amostra tS
x1
PS
x2
φ
nm
IPD ζ
Mv
A -1 -1 117,1 0,434 -8,8
B +1 -1 104,4 0,424 -0,12
C -1 +1 61,56 0,233 -0,696
D +1 +1 51,77 0,245 -0,232
E 0 0 80,45 0,270 -0,229
E 0 0 85,76 0,341 -0,382
E 0 0 86,93 0,323 -0,960
Também foi observado que o fator x2 (PS) exerce maior influência no
diâmetro e IPD como ocorreram nas amostras B e D, que diferem apenas na PS.
A modelagem inicial foi feita ajustando os dados experimentais por um
modelo linear. As respostas analisadas no Plan 1 foram φ e IPD (equações 11 e 12):
φ: ŷ = 84 - 5,72x1 - 27,04x2 (11)
IPD: ŷ = 0,324 + 0,0005x1 - 0,1x2 (12)
Para verificar se os efeitos eram estatisticamente significativos (95% de
confiança) foi obtida a estimativa do erro-padrão, a partir dos três ensaios repetidos
do ponto central. Segundo Barros e col. (2010) um efeito cujo valor absoluto for
superior ao obtido pela equação 13 é considerado significativo.
t2 x s(efeito) (13)
onde t2 é dado pela distribuição "t" de Student e s(efeito) é o desvio padrão do efeito.
Para φ: t2 x s(efeito) = 4,303 x 3,45 = 14,84. Este resultado indica que
apenas PS é significativa , concordando com os dados da Tabela 21.
77
Para IPD: t2 x s(efeito) = 4,303 x 0,04 = 0,17. O resultado indica que os
efeitos não são significativos.
Com objetivo de melhorar os valores de IPD e ζ foi feito novo
planejamento (Plan 2), com os mesmos fatores (tS e PS) e dois níveis (5 e 15 min,
300 e 500 W) e um ponto central (10 min, 400 W). O ensaio foi realizado em
triplicata.
Os resultados (Tabela 22) mostraram que o fator x2 (PS) teve grande
influência nos valores de IPD. As amostras H (IPD 0,042) e I (IPD 0,052)
apresentaram os menores valores de IPD, quando PS estava no nível mais elevado.
Também foi notado que para PS <500 W os valores de IPD foram maiores que 0,200
e para ζ não foram observadas melhorias.
No Plan 1, um aumento no nível de tS e PS reduziu o diâmetro e no Plan 2
foi observado o contrário. Para a amostra I, na qual os fatores estão nos níveis mais
elevados (15 min, 500 W) φ = 172,8 nm. Para o ponto central (10 min, 400 W), o
diâmetro médio foi 66,57 nm, sendo observado que o aumento dos níveis dos
fatores aumentou φ. Segundo Kentish e col. (2008) esse efeito, chamado over-
processing, aumenta o diâmetro das gotas por causa da maior potência das ondas
sonoras, podendo haver coalescência.
Tabela 22. Diâmetro médio, IPD e potencial Zeta (Plan 2)
amostra Tempo
x1
Potência
x2
φ
nm
IPD Ζ
mV
F -1 -1 109,7 0,243 -4,93
G +1 -1 101,4 0,338 -1,92
H -1 +1 180,9 0,042 -5,6
I +1 +1 172,8 0,052 -1,5
J 0 0 61,98 0,363 -1,26
J 0 0 50,8 0,229 -0,02
J 0 0 86,93 0,323 -0,96
78
Por outro lado, pode ter ocorrido instabilidade no filme interfacial formado,
devido à maior potência do ultrassom. É importante saber que a alta energia de
sonicação pode causar decomposição térmica de componentes da amostra
(KOROLEVA & YURTOV, 2012). Não houve separação de fases, mas aumento do
diâmetro das gotículas, causado, possivelmente, por instabilidade no filme
interfacial.
No Plan 2 as respostas analisadas também foram φ e IPD (equações 14 e
15):
φ: ŷ = 109,2 - 4,1x1 +35,65x2 (14)
IPD: ŷ = 0,227 + 0,026x1 - 0,12x2 (15)
Para φ: t2 x s(efeito) = 4,303 x 3,45 = 14,84, apenas a potência é
significativa.
Para IPD: t2 x s(efeito) = 4,303 x 0,04 = 0,17,os efeitos não são
significativos.
Plan 1 favoreceu o φ das gotículas, que são menores, e Plan 2 favoreceu
o IPD, cujos valores são ≈0,200.
Ficou evidente que cada planejamento melhora apenas uma das
respostas e ao tentar melhorar uma delas a outra fica comprometida. Diante disso,
outras estratégias foram adotadas para obter NE adequadas para administração
parenteral.
4.4. Influência do tipo de tensoativo na estabilidade das NE
4.4.1 Balanço Hidrofílico-Lipofílico (BHL)
Este experimento foi realizado com objetivo de investigar o impacto de
outros tensoativos não iônicos na estabilidade das NE. Estas foram obtidas
combinando um tensoativo hidrofílico e outro lipofílico. O valor BHL é utilizado como
referência inicial para seleção de tensoativos adequados à produção de emulsões
estáveis (BOUCHEMAL e col., 2004; MORAIS e col., 2006; SABERI e col., 2013).
79
Segundo Morais e col. (2006) um valor adequado de BHL para uma emulsão deve
ser similar ao requerido para solubilizar o óleo usado na emulsão.
Foram preparadas NE com quantidade fixa de óleo e de tensoativo (1,5%
m:v, para ambos). A quantidade de cada tensoativo está na Tabela 6 e os resultados
deste experimento na Tabela 23.
Tabela 23. Efeito do tipo de tensoativo não iônico na estabilidade das NE e BHL da
mistura de tensoativos
P-F68/
S100
P-F68/
S100-3
P-F68/
SL80-3
T20/
S100
T20/
S100-3
T20/
SL80-3
BHL (mistura)
com F68
BHL (mistura)
com T20
1 SP SP E SP SP E 26,8 15,1
2 SP SP E SP SP E 24,6 14,2
3 SP SP E SP SP E 22,4 13,3
4 SP SP E SP SP E 20,2 12,4
5 SP SP E SP E E 18,0 11,5
6 SP E E E E E 15,8 10,6
7 SP E E E E E 13,6 9,7
8 SP E E E E E 11,4 8,8
9 SP E E SP E E 9,2 7,9
SP: Separa fases; E: Emulsão estável; P-F68 (Pluronic® F68); S100 (Lipoid
® S100); S100-3 (Lipoid
®
S100-3); SL80-3 (Lipoid®
SL80-3); T20(Polisorbato 20)
As amostras foram acompanhadas por 24 h. Os sistemas que continham
lecitinas hidrogenadas (SL80-3 e S100-3) (Fig. 15 a,c; Fig. 16 a,c) apresentaram
maior número de amostras estáveis, sendo que com a lecitina SL80-3 todas as
amostras foram estáveis. Já amostras com lecitina não hidrogenada (Fig. 15 b; Fig.
16 b), a quebra das emulsões foi observada em todas das amostras com P-
F68/S100 e na maioria das amostras com T20/S100, após 2 h. Em virtude disto tais
amostras não são adequadas à finalidade pretendida. Segundo Washington (1996)
lecitinas hidrogenadas tendem produzir emulsões mais estáveis, pois não sofrem
degradação facilmente.
Também foi observado que formulações contendo lecitina acima de
0,75% (m:v) são viscosas e não viáveis para administração parenteral. As amostras
80
com valores BHL diferentes do valor BHL do óleo utilizado (Myritol® 318PH; BHL 10)
apresentaram-se estáveis e instáveis. Isso demonstra que a estabilidade da emulsão
depende muito mais dos tipos de tensoativos usados que do valor de BHL da
mistura de tensoativos. É importante considerar que o BHL é definido apenas para
um único tensoativo a 25°C e não considera suas possíveis interações com água e
óleo presentes no sistema (IZQUIERDO e col., 2005).
A mistura de tensoativos escolhida para prosseguir os estudos foi
T20/SL80-3 (ensaio 4) pois apresentou melhor estabilidade, além de ser menos
viscosa.
81
Figura 15. (a) Mistura dos tensoativos P F68 e LS100; LS100-3 e L-SL80-3.
(a) Mistura dos tensoativos F68/SL80-3
(b) Mistura dos tensoativos F68/S100
(c) Mistura dos tensoativos F68/S100-3
82
Figura 16. Mistura de tensoativos T20 e LS100; LS100-3 e LSL80-3.
Mistura dos tensoativos T20/SL80-3
(b) Mistura dos tensoativos T20/S100
(c) Mistura dos tensoativos T20/S100-3
83
4.5 Otimização da NE com SL80-3 e T20 como tensoativos
produzidas pelo método de alta energia
Foi usado planejamento fatorial análogo ao descrito no item 4.3.1. Os
níveis de cada fator estão na Tabela 7, sendo obtidos φ, IPD e ζ (Tabela 24).
Tabela 24. Diâmetro médio, IPD e potencial Zeta de NE produzidas com tensoativos
T20/L80-3
Tempo
x1
Potência
x2
φ
nm
IPD ζ
mV
L -1 -1 229,2 0,22 -39,1
M +1 -1 195,6 0,23 -42,7
N -1 +1 130,1 0,11 -20,8
O +1 +1 122,8 0,12 -9,9
P 0 0 175,3 0,12 -47,7
P 0 0 154,2 0,15 -31,1
P 0 0 152,1 0,15 -23,3
Como no estudo anterior, o fator x2 (PS) influi mais que x1 (ts) nas respostas,
conforme se observa para as amostras M e O. A mistura de tensoativos T20/SL80-3
aumentou o diâmetro médio das gotículas, concordando com trabalhos de
Bouchemal e col. (2004) e Saberi e col. (2013). No trabalho de Parikh e col. (1997)
foram produzidas NE com ciclosporina A para administração parenteral, contendo
1% (m:m) de T20 e 2% (m:m) de lecitina de ovo sendo obtidas gotículas com φ 129
±27 nm, e a formulação manteve-se estável. Os menores diâmetros médios foram
obtidos para as amostras N e O, com valores próximos aos obtidos por Parikh e col.
(1997).
Também foram observados valores de IPD <0,250 e do potencial Zeta
abaixo de -30 mV, com exceção da amostra O, com potencial Zeta de -9,9 mV. Para
as NE propostas neste estudo os valores de ζ devem ser <-30 mV, o que indica boa
estabilidade para as emulsões (KELMANN e col., 2007). Os resultados (Tabela 24)
84
mostram que as NE com T20/LS80-3 apresentam ζ <-30 mV (amostras L, M e P),
contrário do observado com a mistura P-F68/L-S75, para a qual ζ ≈0 mV. Estes
resultados são devidos à lecitina SL80-3. É conhecido que lecitinas possuem carga
negativa (grupo fosfato), devida principalmente ao ácido fosfatídico (BENITA &
LEVY, 1993; WASHINGTON, 1996; KELMANN e col., 2007). Possivelmente a
lecitina SL80-3 possui quantidade maior de ácido fosfatídico que a lecitina 75S.
Os dados experimentais (Tabela 24) foram ajustados por um modelo
linear (equações 16 a 18).
φ: ŷ = 165,6 - 10,2x1 - 43x2 (16)
IPD: ŷ = 0,157 + 0,005x1 - 0,06x2 (17)
ζ: ŷ = -30,7 + 1,82x1 + 12,78x2 (18)
Na equação 16: t2 x s(efeito) = 4,303 x 12,83 = 55,20. Portanto, nenhum
efeito é significativo.
Para IPD: t2 x s(efeito) = 4,303 x 0,017 = 0,07. Assim de acordo com a
equação 17, os efeitos não são significativos, pois são <0,07. Mas, como
mencionado, a Potência influenciou os valores de IPD.
Para ζ: t2 x s(efeito) = 4,303 x 12,5 = 16,8, sendo que esse valor
demonstra que os efeitos não foram significativos.
Uma solução para este problema seria ajustar os dados da Tabela 24
com outros modelos lineares ou aumentar o número de experimentos para aumentar
o número de graus de liberdade. Isso não foi feito, pois o objetivo deste estudo era
apenas melhorar os valores de IPD e potencial Zeta, o que foi conseguido.
4.6. Influência da pré-emulsão nas propriedades da NE sonicada
Alguns estudos mostram que a pré-emulsificação é passo importante
quando se utiliza ultrassom, pois a fragmentação das gotas requer grande
quantidade de energia (TANG e col., 2013). Assim é necessário preparar uma pré-
emulsão usando homogeneizador antes sonicar as amostras. Além do mais, alguns
85
estudos propõem que a utilização do T20 na formulação das NE pode gerar valores
elevados de IPD (BOUCHEMAL e col., 2004; SABERI e col., 2013).
Com objetivo de reduzir a população de gotículas maiores que 500 nm e
IPD < 0,25 dois tipos de misturadores foram testados na pré-emulsão. Os
experimentos a seguir seguem o mesmo planejamento fatorial descrito no ítem 4.4 e
os níveis de cada fator estão na Tabela 7.
4.6.1 Agitação magnética
Aumento do tempo de agitação de 10 para 20 min, mantendo a velocidade de
rotação em 600 rpm.
Tabela 25. Diâmetro médio, IPD e potencial Zeta
20 min 10 min
Tempo
x1
Potência
x2
φ
nm
IPD ζ
mV
φ
nm
IPD Ζ
mV
Q -1 -1 230,6 0,35 -47,6 229,2 0,22 -39,1
R +1 -1 242,7 0,23 -49,1 195,6 0,23 -42,7
S -1 +1 131,7 0,15 -34,5 130,1 0,11 -20,8
T +1 +1 104,5 0,09 -9,7 122,8 0,12 -9,9
U 0 0 169,9 0,14 -39,3 175,3 0,12 -47,7
U 0 0 176,3 0,16 -44,8 154,2 0,15 -31,1
U 0 0 157,3 0,14 -31,4 152,1 0,15 -23,3
O aumento do tempo de agitação não modificou muito as propriedades
físico-químicas analisadas, apenas houve pequena redução do diâmetro médio e
IPD para amostra T.
4.6.2 Homogeneizador UltraTurrax, com dispersor de policarbonato
(PC/PEEK-S25D-10G-KS)
Nestes experimentos foi utilizado homogeneizador Turrax com alto poder
de cisalhamento. Este equipamento possui um rotor que gira dentro um cilindro
86
provido de fendas (estator), contra o qual o fluido que se deseja emulsionar é
projetado. A energia devida à rotação e o impacto das partículas em alta velocidade
no estator cisalha as gotas, reduzindo seu diâmetro. Geralmente esta emulsão
primária forma gotículas com diâmetro reduzido (ALMEIDA e col., 2008; COSTA,
2009).
Como no planejamento fatorial mencionado no item 4.5, o fator x2
(Potência) tem maior influência que o fator x1 (tempo). Para a amostra W na qual os
dois fatores possuem os níveis mais elevados (+1;+1) são obtidas gotículas menores
(φ 102 nm) (Tabela 26).
O uso do Turrax produz pré-emulsão com menor diâmetro de gotículas
em relação às preparadas com agitador mecânico, conforme se observa para as
amostras V e X (Turrax) e as amostras Q e R (agitador mecânico). As pré-emulsões
preparadas com Turrax, depois de sonicadas, produziram NE com menor φ que as
preparadas com agitador mecânico. Para as amostras Q e W (níveis -1;-1) essas
diferenças foram expressivas, sendo encontrado φ 230 nm para primeira e 201,3 nm
para a segunda e IPD 0,35 para a amostra Q e 0,29 para amostra W. O aumento na
velocidade de rotação de 4000 para 5000 rpm poderia reduzir ainda mais o diâmetro
médio e o IPD, mas isso não ocorreu.
Tabela 26. Diâmetro médio, IPD e potencial Zeta de NE produzidas com Turrax
(4000 rpm e 5 min)
Tempo
x1
Potência
x2
Φ
nm
IPD ζ
mV
V -1 -1 201,3 0,29 -42,2
X +1 -1 214,3 0,17 -44,8
Z -1 +1 151,1 0,21 -38,2
W +1 +1 102,0 0,16 -36,1
Y 0 0 154,4 0,11 -40,4
Y 0 0 161,4 0,15 -41,5
Y 0 0 201,6 0,31 -41,8
87
No segundo ensaio (Tabela 27) era esperado que o aumento na
velocidade de rotação reduzisse φ e IPD, mas isso não ocorreu. O aumento da
velocidade pode dificultar a difusão das moléculas de tensoativo, diminuindo a
quantidade de tensoativo na interface óleo-água e resultando no aumento φ e IPD
(SABERI e col., 2013; TANG e col., 2013).
Os menores valores de φ foram os das amostras Z-2 (155,3 nm) e W-2
(144,4 nm), sendo a Potência o fator que mais influenciou nessa resposta e os
maiores para as amostras V-2 e X-2, nas quais a Potência do ultrassom foi menor.
Tabela 27. Diâmetro médio, IPD e potencial Zeta de NE produzidas com Turrax 5000
rpm e 5 min
Tempo
x1
Potência
x2
φ
nm
IPD ζ
mV
V-2 -1 -1 230,6 0,38 -44,6
X-2 +1 -1 197,7 0,32 -41,6
Z-2 -1 +1 155,3 0,25 -28,3
W-2 +1 +1 144,4 0,25 -28,6
Y-2 0 0 179,4 0,23 -39,6
Y-2 0 0 165,5 0,26 -39,7
Y-2 0 0 176,5 0,23 -39,4
Como o objetivo deste experimento foi selecionar a melhor metodologia
de preparo das pré-emulsões, os resultados mostram que velocidade menor (4000
rpm) produz pré-emulsão que, depois de sonicada, favorece a produção de NE com
φ e IPD aceitáveis para administração parenteral.
Este experimento, juntamente com o descrito no item 4.3.1, mostra que
aumento da velocidade de cisalhamento (e/ou potência de sonicação) nem sempre
reduz φ. Com o propósito de investigar como o Turrax afetava φ e IPD das pré-
emulsões, foi feito o experimento a seguir.
88
4.6.3 NE produzidas com homogeneizador Ultra-Turrax, com dispersor
de aço inox (S75N-25F)
No item 4.6.2 foi relatado que preparar pré-emulsão com velocidade de
rotação muito grande aumenta φ e IPD das gotículas. O objetivo deste experimento
foi verificar o limite em que esta velocidade pode influenciar esses parâmetros. Foi
utilizado dispersor de aço inox (com maior poder de cisalhamento) e sem que a pré-
emulsão fosse sonicada. Os planejamentos, fatores e níveis estão nas Tabelas 8 e 9
e os resultados nas Tabelas 28 e 29.
Tabela 28. Diâmetro médio, IPD e potencial Zeta (Plan 1)
Tempo
x1
Velocidade
x2
média φ
nm
média IPD média ζ
mV
α1 -1 -1 376,2±7,3 0,46±0,01 -42,5±1,8
β1 1 -1 370,4±25,9 0,46±0,01 -42,2±1,9
γ1 -1 1 550,1±3,9 0,62±0,01 -45,3±2,6
δ1 1 1 510,4±27,4 0,54±0,01 -45,6±1,0
Tabela 29. Diâmetro médio, IPD e potencial Zeta (Plan 2)
Tempo
x1
Velocidade
x2
média φ
nm
média IPD
média ζ
mV
α2 -1 -1 534,4±45,9 0,52±0,04 -59,3±4,5
β2 1 -1 497,6±0,5 0,49±0,01 -47,6±5,2
γ2 -1 1 1087,6±576,1 0,82±0,25 -58,6±2
δ2 1 1 739,8±51,1 0,68±0,03 -58,5±1,4
No Plan 2 (Tabela 9) foram usadas velocidades de rotação maiores que
no Plan 1 (Tabela 8). Os maiores diâmetros médios das gotículas estão na Tabela
29 e os menores na Tabela 28. Também foi observado que além do fator x2 o x1
influencia φ e IPD, sendo que menor tempo de cisalhamento resulta em diâmetros
89
médios e IPD maiores. No Plan 1, amostras α (376,2±7,3 nm; IPD 0,46±0,01) e γ
(550,1±3,9 nm; IPD 0,62±0,01) e no Plan 2 amostras α-2 (534,4±45,9 nm; IPD
0,52±0,04) e γ2 (1087,6±576,1 nm; IPD 0,82±0,25) comprovam que o aumento na
velocidade de cisalhamento aumenta φ e IPD.
As amostras α e γ foram escolhidas para serem sonicadas (10 min/400 W,
Tabela 30). Apesar da amostra β apresentar melhor resultado que a γ ela foi
descartada, pois os valores dos parâmetros mencionados estavam muito próximos
aos da amostra α.
Tabela 30. Diâmetro médio, IPD e potencial Zeta
φ
nm
IPDI ζ
mV
α3 103,5±3,9 0,09±0,05 -25,4±2,3
γ3 132,6±19,5 0,25±0,01 -11,4±7,0
As amostras α3 e γ3 tiveram os diâmetros médios e IPD de suas gotículas
reduzidos, próximos das amostras Z e W. O uso dispersor de aço inox ou de
policarbonato resultou em NE com φ e IPD similares e que embora a pré-
emulsificação seja importante é o sonicador que define, de fato, o resultado final.
Uma propriedade que foi alterada pelo dispersor de aço foi o potencial
Zeta, que teve seu valor reduzido em relação aos das amostras obtidas com
dispersor de policarbonato.
4.7 Influência da concentração de tensoativos
Este experimento estudou os efeitos que o aumento da concentração dos
tensoativos provoca no diâmetro médio, no IPD e no potencial Zeta das gotículas. As
NE mencionadas no ítem anterior tinham 1,5% (m:v) de tensoativos e quantidade de
óleo fixa em 1,5% (m:v). Como o objetivo era encapsular CsA, julgou-se que seria
melhor aumentar a quantidade de óleo. Esta foi fixada em 5% (m:v) e a massa de
tensoativos variou de acordo com a proporção adotada (Tabelas 10 e 11). Foram
feitos dois conjuntos de experimentos, o primeiro (Tabela 10) tem como solvente
90
etanol e o segundo (Tabela 11) uma mistura de etanol e acetona (50:50, v:v). Os
resultados estão nas Tabelas 31 e 32 e Figuras 18 e 19.
Tabela 31. Diâmetro médio, IPD e potencial Zeta para NE com etanol, após 1 dia
com evaporação sem evaporação
φ
nm
IPD ζ
mV
φ
nm
IPD Ζ
mV
F1 130,6±7,9 0,246±0,040 -11,2±2,2 114,9±11,2 0,281±0,034 -1,6±0,7
F2 113,5±4,2 0,292±0,044 -13,1±2,7 136,8±57,4 0,239±0,020 -33,8±0,8
F3 - - - 206,8±21,6 0,234±0,020 -22,6±1,0
F4 - - - 197,3±91,3 0,227±0,051 -17,1±2,8
F5 - - - - - -
Tabela 32. Diâmetro médio, IPD e potencial Zeta para NE com acetona/etanol
(50:50, v:v), após 1 dia
com evaporação sem evaporação
φ
nm
IPD ζ
mV
φ
nm
IPD Ζ
mV
F6 66,2±2,1 0,19±0,01 -5,1±5 149,5±39,5 0,11±0,02 -23±12,9
F7 73,5±2,6 0,33±0,14 -5,2±1 60,6 ±1,2 0,27±0,03 -3,4±2,6
F8 - - - - - -
F9 - - - - - -
F10 - - - - - -
O aumento da concentração do tensoativos trouxe várias situações
diferentes. Para as amostras com acetona/etanol (Tabela 32) o aumento da
concentração de tensoativos reduziu o diâmetro médio (amostras sem evaporação),
concordando com estudos de Ghosh e col.(2013) e Saberi e col. (2013). Porém, nas
amostras com etanol (Tabela 30) foi observado aumento do φ (amostras sem
evaporação). Segundo Saberi e col. (2013) isso ocorre porque aparece uma fase
91
líquido cristalina altamente viscosa, tornando mais difícil a ruptura na interface óleo-
água.
Visualmente observa-se que a viscosidade aumentou com a concentração
do tensoativo, razão pela qual as formulações F3 (1:3), F4 (1:4), F8 (1:3) e F9(1:4)
foram descartadas. Com aumento da concentração do tensoativo as moléculas de
água solvatam as de tensoativo aumentando a viscosidade da emulsão (GHOSH e
col., 2013), limitando a formação de gotículas (TANG e col., 2013). Isto ocorre nas
amostras sem evaporação (Tabela 31).
As NE foram avaliadas antes e após a retirada do solvente, pois um
aumento da concentração de TCM e tensoativos pode alterar a estabilidade da
interface óleo/água após retirada do solvente. Os resultados mostram, para
avaliação após 1 dia de ensaio, que a retirada dos solventes altera φ, mas de modo
diferente do que foi descrito no ítem 4.2. As amostras foram monitoradas durante 30
dias, sendo notado que as amostras com e sem evaporação seguem a mesma
tendência: há um crescimento menor até 15 dias e a partir daí um crescimento maior
para as amostras da Figura 17a que para as da Figura 18a. Para o IPD, as amostras
com etanol (Fig. 17b) apresentaram valores mais próximos e a retirada do solvente
não influencia IPD. Nas amostras (Fig. 18b), com mistura de acetona e etanol, os
valores de IPD são bem diferentes, evidenciando que a evaporação do solvente
influência esse parâmetro.
92
Figura 17. Variação temporal do: a) diâmetro médio; b) IPD; c) potencial Zeta,
durante 30 dias. Amostras F1 e F2, com e sem evaporação do
solvente.
a
0 5 10 15 20 25 30
50
100
150
200
250
300
F1 eva
F2 eva
F1 n-eva
F2 n-eva
diâ
me
tro
mé
dio
(n
m)
tempo dias
b
0 5 10 15 20 25 30
0,05
0,10
0,15
0,20
0,25
0,30
0,35
0,40
0,45
0,50
F1 eva
F2 eva
F1 n-eva
F2 n-eva
IPD
tempo dias
c
0 5 10 15 20 25 30
-45
-40
-35
-30
-25
-20
-15
-10
-5
0
5
po
ten
cia
l ze
ta (
mV
)
tempo dias
F1 eva
F2 eva
F1 n-eva
F2 n-eva
93
Figura 18. Variação temporal do: a) diâmetro médio; b) IPD; c) potencial Zeta
durante 30 dias. Amostras F6 e F7, com e sem evaporação do solvente.
a
0 5 10 15 20 25 30
60
80
100
120
140
160
180
200
220
240
260
diâm
etro
méd
io (
nm)
tempo dias
F6 eva
F7 eva
F6 n-eva
F7 n-eva
b
0 5 10 15 20 25 30
0,10
0,15
0,20
0,25
0,30
0,35
0,40
0,45
0,50
IPD
tempo dias
F6 eva
F7 eva
F6 n-eva
F7 n-eva
c
0 5 10 15 20 25 30
-45
-40
-35
-30
-25
-20
-15
-10
-5
0
5
10
pote
ncia
l zet
a (m
V)
tempo dias
F6 eva
F7 eva
F6 n-eva
F7 n-eva
94
As amostras foram avaliadas até 120 dias (Fig. 19) após serem
preparadas. Para φ (Fig. 19a) foi notado aumento para F2 e menor aumento para
F6. Para F1 poucas variações foram observadas. A amostra F7 foi descartada, pois
houve quebra da emulsão após 90 dias. Quanto ao IPD (Fig. 19b) resultados
melhores foram obtidos e após 90 dias houve estabilização do mesmo para todas as
amostras. Para o potencial Zeta (Fig. 19c) não houve melhoria como observado nos
experimentos anteriores, embora não tenha ocorrido separação de fases.
95
Figura 19. Variação temporal do: a) diâmetro médio; b) IPD; c) potencial Zeta,
durante 120 dias. Amostras F1, F2, F6 e F7, com evaporação do
solvente.
a
0 20 40 60 80 100 120
50
60
70
80
90
100
110
120
130
140
150
160
170
180
190
200
210
220
230
diâ
me
tro
mé
dio
(n
m)
tempo dias
F6
F7
F1
F2
b
0 20 40 60 80 100 120
0,05
0,10
0,15
0,20
0,25
0,30
0,35
0,40
0,45
0,50
IPD
tempo dias
F6
F7
F1
F2
c
0 20 40 60 80 100 120
-45
-40
-35
-30
-25
-20
-15
-10
-5
0
5
po
ten
cia
l ze
ta (
mV
)
tempo dias
F6
F7
F1
F2
96
4.8 Influência da temperatura de armazenamento
Diante do resultado obtido para φ no item anterior, foi investigada se a
temperatura de armazenamento (25 °C e 4 °C) poderia influenciar temporalmente o
crescimento das gotículas. As formulações escolhidas para este experimento foram
a F2, na qual a quantidade de tensoativo é o dobro da de óleo (TCM:T; 1:2), para a
qual foram obtidos φ maiores, e a F6 com a mesma proporção de tensoativo e óleo
(TCM:T; 1:1), com valores menores de φ.
Na Figura. 20a estão os valores de φ. A temperatura influencia o
crescimento das gotículas e a 4 °C esse fenômeno é menos pronunciado. Os perfis
temporais de crescimento do diâmetro das gotículas são semelhantes,
principalmente o da amostra F2 a 4 °C e 25 °C, mas a 4 °C o crescimento foi
retardado, sendo observado diâmetro de 90 nm no dia 1 e 99,6 nm no dia 30
(crescimento ≈11%). Para a amostra F6 os valores de φ a 25 °C foram similares aos
da amostra F2 a 4 °C, mostrando que para F6 a influência da temperatura é menor
(Fig. 21 a), pois a 4 °C o diâmetro das gotículas foi de 81,1 nm (dia 1) para 91,6 nm
(dia 30 dias), aumentando ≈13% e a 25 °C φ variou de 84,2 nm (dia 1) a 95,6 nm
(dia 30), aumentando ≈14%.
Estes resultados indicam que a emulsão com maior concentração de
tensoativo é menos estável. Vários fenômenos podem estar relacionados com esse
aumento: floculação, coalescência e Ostwald “ripening”. Segundo Saberi e col.
(2013) floculação e coalescência aumentam IPD, mas isto não foi observado (Fig.
21) para as duas formulações. Já Ostwald “ripening” pode ter ocorrido nas
formulações. Em F6, em ambas as temperaturas, as gotículas são inicialmente
menores e aumentam ≈13% (4 °C) e ≈14% (25 °C) após 30 dias. Possivelmente as
diferenças na pressão de Laplace entre as gotículas e a fase contínua provocaram
este aumento. Para a amostra F2 o tensoativo pode estar em excesso originando
micelas que ficam agregadas às gotículas. O fenômeno de Ostwald “ripening” pode
ocorrer ou promover agregação das gotículas, aumentando φ. O aumento da
temperatura favoreceu esse processo para a amostra F2, pois a 25 °C o diâmetro foi
96,5 nm (dia 1) para 115,9 nm (dia 30, crescimento ≈21%) e a 4 °C de 90 nm (dia 1)
para 99,6 nm (dia 30, variação ≈11%).
97
O comportamento de F2 e F6 analisadas neste experimento justifica o
crescimento pronunciado do φ das gotículas de F2 no experimento descrito no item
4.7.
Quanto ao IPD (Fig. 20b) e potencial Zeta (Fig. 20c) não foram
observadas diferenças significativas.
98
Figura 20. Variação temporal do: a) diâmetro médio; b) IPD; c) potencial Zeta,
durante 30 dias. Amostras F2 e F6, a 4°C e 25°C.
c
0 5 10 15 20 25 30
-30
-25
-20
-15
-10
-5
0
5
pote
ncia
l zet
a (m
V)
tempo dias
F2 - 25°C
F6 - 25°C
F2 - 4°C
F6 - 4°C
b
0 5 10 15 20 25 30
0,11
0,12
0,13
0,14
0,15
0,16
0,17
0,18
0,19
0,20
0,21
0,22
0,23
0,24
0,25
0,26
0,27
IPD
tempos dias
F2 - 25°C
F6 - 25°C
F2 - 4°C
F6 - 4°C
a
0 5 10 15 20 25 30
70
80
90
100
110
120
130
diâ
me
tro
mé
dio
(n
m)
tempo dias
F2 - 25°C
F6 - 25°C
F2 - 4°C
F6 - 4°C
99
Figura 21. Distribuição do diâmetro médio obtida via espalhamento dinâmico de luz.
Amostras F2 e F6, a 4°C, após 30 dias.
4.9 Influência do método de incorporação da CsA na NE
O principal objetivo deste projeto foi produzir NE, carregadas com CsA,
com gotículas de menor φ e distribuição de tamanhos a mais estreita possível. Para
investigar o efeito do método de incorporação do fármaco nas propriedades das NE
sonicadas, foram adotados dois métodos. No primeiro, o fármaco foi dissolvido na
fase orgânica antes da emulsificação (F_antes) e, em outro, uma solução
100
concentrada do fármaco foi adicionada diretamente na NE previamente preparada
(F_depois). Os resultados estão nas Figuras. 22, 23 e 24.
Figura 22. Variação temporal do: a) diâmetro médio; b) IPD, nos dias 1; 15; 30.
Amostra F2 com CsA (adicionado antes ou depois da emulsificação) e
sem CsA.
a
b
101
b
Figura 23. Variação temporal do: a) diâmetro médio; b) IPD, nos dias 1; 15; 30.
Amostra F6 com CsA (adicionado antes ou depois da emulsificação) e
sem CsA.
Como pode ser visto nas Figuras 22a e 23a, φ foi alterado pela presença
da CsA. Para F2 preparada pelo método F_antes o φ foi inicialmente menor que o
da NE sem fármaco. Para F6 foi observado pequena diferença entre as NE. Como
a
b
102
no método F_antes toda pré-emulsão, que contém fármaco, é sonicada, duas
situações podem levar à redução do diâmetro. Uma é que o fármaco pode estar
localizado na interface óleo/água, reduzindo a tensão interfacial e o diâmetro das
gotículas (SILA e col., 2008). Outra é que a energia do ultrassom reduziu o diâmetro.
Para F2 (Fig. 22a) a primeira situação pode ter ocorrido e pode ser que parte do
fármaco esteja localizado nas gotículas, pois a amostra F2_antes mostrou o mesmo
crescimento do φ de F2 sem CsA, além dos valores de IPD (Fig. 22b) estarem
próximos. Para F6 (Fig. 23a) a segunda situação é mais provável, pois inicialmente
as gotículas existentes em F6_antes estavam pouco maiores que as de F6 sem CsA
e, ao longo do ensaio, F6_antes não exibiu o mesmo crescimento de diâmetro de F6
sem CsA, sendo os valores de φ de F6_antes maiores.
É importante saber que quando incorporado em emulsão lipidica o
fármaco pode se localizar nas gotículas de óleo, na interface, nas estruturas dos
tensoativos e na fase aquosa e esta localização influencia suas propriedades, devido
às interações de suas moléculas com as demais, afetando inclusive sua
estabilidade (SILA e col., 2008; TANG e col., 2013).
Adicionando CsA após a emulsificação (Fig. 22a; Fig. 23a) verifica-se
aumento considerável do φ ao longo de 30 dias, mostrando que as NE eram
instáveis. Isso ocorre pois esse método envolve a mistura da solução concentrada
do fármaco diretamente na NE, sem emprego de alta energia. Assim, quantidade
menor de moléculas de fármaco pode residir na interface óleo/água (SILA e col.,
2008), havendo quantidade maior de fármaco na emulsão, podendo interagir com
outros componentes, desestabilizando a NE, conforme evidenciado pelo aumento do
IPD (Fig. 22b e 23b).
O método usado na preparação da amostra F_antes é melhor, pois
produz NE mais estáveis, com menores valores de diâmetro que os obtidos para a
amostra F_depois (Fig. 24a), tanto para F2 como para F6. Quanto ao IPD, há pouca
variação ao longo de 30 dias tanto para F2_antes como F6_antes, mas F6_antes
possui valores menores que 0,25 (Fig. 24b).
103
b
Figura 24. Variação temporal do: a) diâmetro médio; b) IPD, durante 30 dias.
Amostras F2 e F6, com CsA (adicionado antes ou depois da
emulsificação).
a
0 5 10 15 20 25 30
0
100
200
300
400
500
600
diâ
me
tro
m
éd
io (
nm
)
tempo (dias)
F2 - antes
F2 - depois
F6 - antes
F6 - depois
b
0 5 10 15 20 25 30
0,0
0,1
0,2
0,3
0,4
0,5
0,6
0,7
IPD
tempo (dias)
F2 - antes
F2 - depois
F6 - antes
F6 - depois
104
4.10 Influência do pH e de glicerol
O uso de aditivos na formulação de emulsões parenterais é necessário
para que o pH e a tonicidade fiquem próximos aos valores fisiológicos (BENITA &
LEVY, 1993). Glicerol é usado como agente isotônico (BENITA & LEVY, 1993;
JUMMA & MULLER, 1998) e o pH é ajustado (entre 6,5 e 8,5) com soluções
aquosas de NaOH ou HCl (BENITA & LEVY, 1993; KELMANN e col., 2007).
Emulsões parenterais tem pH adequado para manter a homeostasia do
organismo e minimizar hidrólise dos TCM, TCL e das lecitinas (BENITA & LEVY,
1993; HANEFELD e col., 2011).
No início dos trabalhos desta Tese, o pH variava entre 3 e 5,8 mas não foi
ajustado, pois havia interesse de encontrar as condições mais adequadas à
obtenção de NE estáveis, com gotículas homogêneas e com diâmetro de gotículas
adequado à administração parenteral.
Uma propriedade afetada pelo pH é o potencial Zeta. Desta forma seria
necessário mensurá-lo, mas devido a resultados inconsistentes ele não foi
analisado. Como o objetivo era mensurar o potencial Zeta para avaliar a estabilidade
do sistema, julgou-se que a estabilidade da emulsão seria por conta dos tensoativos
não iônicos, ao qual promovem a estabilidade por efeito estérico e não por repulsão
(DALTIN, 2012; KOROLEVA e col., 2012).
Nestes experimentos as amostras foram estocadas a 4 °C e 25 °C e
monitoradas após 1 e 120 dias. Os resultados estão nas Figuras 25 a 29.
105
Figura 25. Variação temporal do: a) diâmetro médio; b) IPD, durante 120 dias.
Amostras F2 e F6, com e sem glicerol e pH ajustado entre 6,0 a 6,88
a
0 20 40 60 80 100 120
40
60
80
100
120
140
160
180
diâ
me
tro
mé
dio
(n
m)
tempo (dias)
F2_sem glicerol 4C
F2_glicerol
F6_sem glicerol
F6_glicerol
b
0 20 40 60 80 100 120
0,0
0,1
0,2
0,3
0,4
0,5
0,6
IPD
tempos (dias)
F2_sem glicerol 4C
F2_glicerol
F6_sem glicerol
F6_glicerol
106
Figura 26. a) Diâmetro médio; b) IPD, nos dias 1 e 120. Amostras F2 e F6, com e
sem glicerol e pH ajustado entre 6,0 e 6,88
a
b
107
Figura 27. Variação temporal do: a) diâmetro médio; b) IPD, durante 120 dias.
Amostras F2 e F6, com e sem glicerol e pH ajustado entre 6,0 a 6,88
a
0 20 40 60 80 100 120
40
60
80
100
120
140
160
180
200
diâ
me
tro
mé
dio
(n
m)
tempo (dias)
F2_sem glicerol 25C
F2_glicerol
F6_sem glicerol
F6_glicerol
b
0 20 40 60 80 100 120
0,05
0,10
0,15
0,20
0,25
0,30
0,35
0,40
0,45
0,50
0,55
0,60
IPD
tempo (dias)
F2_sem glicerol 25C
F2_glicerol
F6_sem glicerol
F6_glicerol
108
Figura 28. a) Diâmetro médio; b) IPD, nos dias 1 e 120. Amostras F2 e F6, com e
sem glicerol e pH ajustado entre 6,0 a 6,88
A adição do glicerol pode influenciar φ e IPD. Em estudo realizado por
Saberi e col. (2013), o aumento de 0 a 50% de glicerol em NE com tensoativo não
iônico reduziu o tamanho das gotículas de 140 nm (sem glicerol) para 55 nm (com
a
b
109
glicerol), mas em concentrações de glicerol ≤20% (em massa), o diâmetro aumenta
com a concentração de tensoativo.
As Figuras 25 a 29 mostram a influência do glicerol no φ e IPD. A adição
de glicerol aumentou pouco o diâmetro das gotículas em todas as formulações,
sendo os maiores diâmetros os de F2, com exceção da amostra F6 a 4 °C. Em F2,
com maior concentração de tensoativos, a presença do glicerol retardou o
crescimento das gotículas. Sem glicerol o diâmetro variou de 89,8 nm (dia 1) para
124 nm (dia 120), aumento de ≈40%, e com glicerol variou de 94,4 nm (dia 1) para
118,7 (dia 120), aumento de ≈26% (Fig. 25a). Para F6, com menor concentração de
tensoativo, a presença do glicerol aumentou o diâmetro. Sem glicerol o diâmetro foi
de 87,5 nm (dia 1) para 113 nm (dia 120), variação de ≈30% e, com glicerol, foi de
77,9 nm (dia 1) para 116,6 nm (dia 120), variando ≈50% (Fig. 26a).
Após 120 dias, houve redução do IPD. A 4 °C esta redução foi pequena
(Fig. 26b e 28b), para amostras com e sem glicerol e a 25 °C (dia 120) as diferenças
de IPD foram maiores (amostras com e sem glicerol), sendo que para F6, a 25 °C
(dia 120), com glicerol 0,22 e sem glicerol 0,17 (Fig. 29).
Nas Figuras 25a-b e 27a-b observa-se que o diâmetro das gotículas das
amostras a 25 °C é maior após 90 dias e o IPD após 60 dias. A 4 °C o diâmetro é
mantido depois de 60 dias e o IPD depois de 90 dias.
110
Figura 29. Distribuição do diâmetro. Amostra F6 a 25°C, após 120 dias.
O pH também foi monitorado ao longo de 120 dias (Tabela 33).
111
Tabela 33. Variação temporal do pH de F2 e F6, com e sem glicerol, a 4°C e 25°C
4°C 25°C
1 dia
F2_sem glicerol 6,62±0,02 6,22±0,02
F2_glicerol 6,53±0,03 6,06±0,04
120 dias
F2_sem glicerol 6,24±0,06 5,51±0,04
F2_glicerol 6,30±0,02 5,87±0,06
1 dia
F6_sem glicerol 6,88±-0,02 6,61±0,02
F6_glicerol 6,57±0,01 6,55±0,02
120 dias
F6_sem glicerol 6,41±0,11 5,06±0,09
F6_glicerol 6,00±0,09 5,53±0,08
O pH de uma nanoemulsão é indicativo de sua estabilidade. A redução do
pH indica a presença de ácidos graxos livres gerados na hidrólise dos triglicerídeos.
Daftary e col. (2011) e Bruxel e col. (2012) observaram coalescência de gotículas de
NE quando o pH diminuiu. Na Tabela 32 observa-se redução do pH com o tempo,
sendo que a 25 °C a diminuição foi maior que a 4 °C, para as duas amostras,
independente da presença de glicerol.
4.11 Estabilidade térmica
A estabilidade da emulsão depende da rigidez e estabilidade do filme
formado pelo tensoativo sobre a superfície das gotículas. Para estimar a estabilidade
térmica das nanoemulsões, embora em condições distintas das de armazenamento,
foi realizado teste de "stress". Temperaturas elevadas diminuem a viscosidade e a
estabilidade da emulsão, mas temperaturas baixas também têm efeitos adversos
nessa estabilidade. Quando a temperatura é menor que a de transição de fase do
tensoativo, aumenta a rigidez do filme formado por ele, pois o filme está na fase gel,
mais rígida que a líquida cristalina. O resfriamento também diminui a repulsão
112
eletrostática entre as gotículas e o movimento browniano, reduzindo a frequência e
intensidade das colisões entre as gotículas (MULLER, 1990).
Diante dos resultados descritos no item 4.10 foi necessário investigar
outros tensoativos não iônicos para melhorar a estabilidade das NE contendo SL80-
3. Foram usados T80 e o P-F68. O T20 foi adotado como referência. As
temperaturas foram 4 °C, 25 °C e 45 °C e os resultados estão nas Figuras. 30 a 35.
Figura 30. Variação temporal do: a) diâmetro; b) IPD, durante 30 dias. Amostra F2 a
4°C, 25°C e 45°C.
b
0 5 10 15 20 25 30
0,10
0,15
0,20
0,25
0,30
IPD
tempo (dias)
F2_4°C
F2_25°C
F2_45°C
z
a
0 5 10 15 20 25 30
60
65
70
75
80
85
90
95
100
105
diâ
me
tro
mé
dio
(n
m)
tempo (dias)
F2_4°C
F2_25°C
F2_45°C
113
Figura 31. Variação temporal do: a) diâmetro; b) IPD, durante 30 dias. Amostra F19
a 4°C, 25°C e 45°C.
b
0 5 10 15 20 25 30
0,15
0,20
0,25
0,30
0,35
0,40
IPD
tempo (dias)
F19_4°C
F19_25°C
F19_45°C
a
0 5 10 15 20 25 30
60
80
100
120
140
160
diâm
etro
méd
io (
nm)
tempo (dias)
F19_4°C
F19_25°C
F19_45°C
114
Figura 32. Variação temporal do: a) diâmetro; b) IPD, durante 30 dias. Amostra F27
a 4°C, 25°C e 45°C.
a
0 5 10 15 20 25 30
80
100
120
140
160
180
200
220
diâm
etro
méd
io (
nm)
tempo (dias)
F27_4°C
F27_25°C
F27_45°C
b
0 5 10 15 20 25 30
0,08
0,10
0,12
0,14
0,16
0,18
0,20
0,22
0,24
0,26
0,28
0,30
0,32
IPD
tempo (dias)
F27_4°C
F27_25°C
F27_45°C
115
Figura 33. Variação temporal do: a) diâmetro; b) IPD, durante 30 dias. Amostra F6 a
4°C, 25°C e 45°C.
a
0 5 10 15 20 25 30
65
70
75
80
85
90
95
100
105
110
115
diâm
etro
méd
io (
nm)
tempo (dias)
F6_4°C
F6_25°C
F6_45°C
b
0 5 10 15 20 25 30
0,10
0,11
0,12
0,13
0,14
0,15
0,16
0,17
0,18
0,19
0,20
0,21
0,22
0,23
0,24
0,25
0,26
0,27
0,28
0,29
IPD
tempo (dias)
F6_4°C
F6_25°C
F6_45°C
116
a
Figura 34. Variação temporal do: a) diâmetro; b) IPD, durante 30 dias. Amostra F20
a 4°C, 25°C e 45°C.
b
0 5 10 15 20 25 30
0,10
0,15
0,20
0,25
0,30
0,35
0,40
IPD
tempo (dias)
F20_4°C
F20_25°C
F20_45°C
a
0 5 10 15 20 25 30
60
70
80
90
100
110
120
130
140
150
diâ
me
tro
mé
dio
(n
m)
tempo (dias)
F20_4°C
F20_25°C
F20_45°C
117
Figura 35. Variação temporal do: a) diâmetro; b) IPD, durante 30 dias. Amostra F28
a 4°C, 25°C e 45°C.
a
0 5 10 15 20 25 30
90
100
110
120
130
140
150
160
170
diâ
me
tro
mé
dio
(n
m)
tempo (dias)
F28_4°C
F28_25°C
F28_45°C
b
0 5 10 15 20 25 30
0,08
0,10
0,12
0,14
0,16
0,18
0,20
0,22
0,24
0,26
IPD
tempo (dias)
F28_4°C
F28_25°C
F28_45°C
118
Todas as amostras quando expostas a 45 °C ficaram instáveis, havendo
crescimento das gotículas após um mês de armazenamento. Para as formulações
com proporção 1:2 (TCM:T, m:m) de tensoativo, o diâmetro aumentou com a
temperatura de turvação do tensoativo, sendo maior (≈98%) para F27 (com P-F68,
temperatura de turvação ≈100 °C) e menor (≈45%) para F2 (com T20, temperatura
de turvação 76 °C). Para as amostras com proporção 1:1 (TCM:T, m:m) de
tensoativo este aumento não foi observado, mas o crescimento de φ foi menor
(≈50%) para a amostra F28 (com P-F68). Tensoativos não iônicos, quando em
temperatura elevada, sofrem desidratação da cabeça hidrofílica e a agregação é
facilitada, havendo coalescência e instabilidade da amostra, também por causa do
aumento do movimento Browniano (MORAIS e col., 2006; SABERI e col., 2013).
Quanto à influência do tipo de tensoativo na estabilidade da NE foi
verificado que em presença de T80 e P-F68 o crescimento do diâmetro foi maior,
dependendo da concentração do tensoativo. Para as amostras, a 25°C, com maior
concentração (TCM:T, 1:2, m:m) o aumento foi ≈33%, para T80 ≈35% para P-F68.
Para as amostras com menor concentração (TCM:T, 1:1, m:m) o aumento foi ≈22%
para T80 e ≈30% para F68, a 25 °C. Nesta temperatura houve aumento de ≈23%
para F2 e ≈18% para F6, ambas com T20. A formulação F6 foi a que manteve menor
diâmetro e estabilidade e a F2 o menor IPD.
4.11.1 Influência do aumento da fase aquosa
O objetivo deste experimento foi melhorar a estabilidade das NE. Em
estudo realizado por Saberi e col. (2013) foi observado que a diluição prévia do
glicerol antes da emulsificação originou NE mais estáveis. Nesta Tese também foi
feita prévia diluição do glicerol em 3 mL de água. Os resultados estão nas Figuras
37 a 47.
O primeiro conjunto de amostras (Fig. 36-38) foi obtido com as mesmas
proporções de F2 (TCM:T, 1:2, m:m) e solvente etanol, o segundo conjunto (Fig. 39-
41) tem as mesmas proporções que a F6 (TCM:T, 1:1, m:m) e solvente
acetona:etanol (1:1, v:v) e o terceiro conjunto (Fig. 42-44) tem as mesmas
proporções de F1 (TCM:T, 1:1, m:m) e solvente etanol.
119
Figura 36. Variação temporal do: a) diâmetro; b) IPD, durante 30 dias. Amostra F29
a 4°C, 25°C, 45°C.
a
0 5 10 15 20 25 30
40
60
80
100
120
140
160
180
200
220
240
diâ
me
tro
mé
dio
(n
m)
tempo (dias)
F29_4°C
F29_25°C
F29_45°C
b
0 5 10 15 20 25 30
0,00
0,05
0,10
0,15
0,20
0,25
0,30
0,35
0,40
0,45
0,50
0,55
IPD
tempo (dias)
F29_4°C
F29_25°C
F29_45°C
120
Figura 37. Variação temporal do: a) diâmetro; b) IPD, durante 30 dias. Amostra F30
a 4 °C, 25 °C, 45 °C.
a
0 5 10 15 20 25 30
-100
0
100
200
300
400
diâ
me
tro
mé
dio
(n
m)
tempo (dias)
F30_4°C
F30_25°C
F30_45°C
b
0 5 10 15 20 25 30
0,10
0,15
0,20
0,25
0,30
0,35
0,40
0,45
0,50
0,55
0,60
0,65
0,70
0,75
0,80
0,85
0,90
IPD
tempo (dias)
F30_4°C
F30_25°C
F30_45°C
121
Figura 38. Variação temporal do: a) diâmetro; b) IPD, durante 30 dias. Amostra F31
a 4 °C, 25 °C, 45 °C.
a
0 5 10 15 20 25 30
50
100
150
200
250
diâ
me
tro
mé
dio
(n
m)
tempo (dias)
F31_4°C
F31_25°C
F31_45°C
b
0 5 10 15 20 25 30
0,10
0,15
0,20
0,25
0,30
0,35
0,40
IPD
tempo (dias)
F31_4°C
F31_25°C
F31_45°C
122
Figura 39. Variação temporal do: a) diâmetro; b) IPD, durante 30 dias. Amostra F32
a 4 °C, 25 °C, 45 °C.
a
0 5 10 15 20 25 30
30
40
50
60
70
80
90
100
110
120
130
140
150
160
diâ
me
tro
mé
dio
(n
m)
tempo (dias)
F32_4°C
F32_25°C
F32_45°C
b
0 5 10 15 20 25 30
0,05
0,10
0,15
0,20
0,25
0,30
0,35
0,40
0,45
IPD
tempo (dias)
F32_4°C
F32_25°C
F32_45°C
123
Figura 40. Variação temporal do: a) diâmetro; b) IPD, durante 30 dias. Amostra F33
a 4 °C, 25 °C, 45 °C.
b
0 5 10 15 20 25 30
0,06
0,08
0,10
0,12
0,14
0,16
0,18
0,20
0,22
0,24
0,26
0,28
0,30
0,32
0,34
0,36
0,38
0,40
0,42
0,44
IPD
tempo dias
F33_4°C
F33_25°C
F33_45°C
a
0 5 10 15 20 25 30
40
60
80
100
120
140
160
180
200
220
diâ
me
tro
mé
dio
(n
m)
tempo (dias)
F33_4°C
F33_25°C
F33_45°C
124
Figura 41. Variação temporal do: a) diâmetro; b) IPD, durante 30 dias. Amostra F34
a 4 °C, 25 °C, 45 °C.
a
0 5 10 15 20 25 30
60
70
80
90
100
110
120
diâ
me
tro
mé
dio
(n
m)
tempo (dias)
F34_4°C
F34_25°C
F34_45°C
b
0 5 10 15 20 25 30
0,02
0,04
0,06
0,08
0,10
0,12
0,14
0,16
0,18
0,20
0,22
0,24
0,26
0,28
0,30
IPD
tempo (dias)
F34_4°C
F34_25°C
F34_45°C
125
Figura 42. Variação temporal do: a) diâmetro; b) IPD, durante 30 dias. Amostra F35
a 4 °C, 25 °C, 45 °C.
a
0 5 10 15 20 25 30
40
60
80
100
120
140
160
180
200
220
240
diâ
me
tro
mé
dio
(n
m)
tempo (dias)
F35_4°C
F35_25°C
F35_45°C
b
0 5 10 15 20 25 30
0,05
0,10
0,15
0,20
0,25
0,30
0,35
0,40
0,45
0,50
0,55
0,60
IPD
tempo (dias)
F35_4°C
F35_25°C
F35_45°C
126
Figura 43. Variação temporal do: a) diâmetro; b) IPD, durante 30 dias. Amostra F36
a 4 °C, 25 °C, 45 °C.
a
0 5 10 15 20 25 30
40
50
60
70
80
90
100
110
120
130
140
diâ
me
tro
mé
dio
(n
m)
tempo (dias)
F36_4°C
F36_25°C
F36_45°C
b
0 5 10 15 20 25 30
0,10
0,15
0,20
0,25
0,30
0,35
0,40
0,45
0,50
0,55
IPD
tempo (dias)
F36_4°C
F36_25°C
F36_45°C
127
Figura 44. Variação temporal do: a) diâmetro; b) IPD, durante 30 dias. Amostra F37
a 4 °C, 25 °C, 45 °C.
b
0 5 10 15 20 25 30
0,08
0,10
0,12
0,14
0,16
0,18
0,20
0,22
0,24
0,26
0,28
0,30
0,32
0,34
0,36
0,38
0,40
0,42
IPD
tempo (dias)
F37_4°C
F37_25°C
F37_45°C
a
0 5 10 15 20 25 30
80
100
120
140
160
180
200
220
diâ
me
tro
mé
dio
(n
m)
tempo (dias)
F37_4°C
F37_25°C
F37_45°C
128
Para as amostras com P-F68 (F31, F34, F36) o crescimento do diâmetro
foi ≈85% (25 °C) e ≈170% (4 °C). A amostra F29 a 45 °C teve aumento de ≈230% no
diâmetro. As formulações F32, F33, F35 e F36 (com TCM/T (1:1, m:m) tiveram os
menores crescimentos do diâmetro, independente do tipo de solvente. As
formulações com T20 e T80 apresentaram os melhores resultados quando a NE foi
diluída. A distribuição do diâmetro é multimodal (Fig. 45 e 46).
Figura 45. Distribuição do diâmetro. Amostra F35 a 4 °C.
Figura 46. Distribuição do diâmetro. Amostra F36 a 4 °C.
129
4.12 Influência da incorporação de 5% ou 12% de CsA
O objetivo deste estudo foi verificar se uma adição maior de CsA alteraria o
filme interfacial. No item 4.9 foram descritos experimentos incorporando 5% (m:m)
de CsA em relação ao óleo, sem glicerol. Novo teste foi realizado, sendo
incorporados 5 e 12% (m:m) em relação ao óleo. Optou-se por manter T20 como
tensoativo, apesar das gotículas terem apresentado diâmetro maior que aquelas
com T80. Foi usada a mesma metodologia descrita no item 4.9, sendo o fármaco
incorporado antes da emulsificação. Os resultados estão nas Figuras 47 e 48.
130
Figura 47. Variação temporal do: a) diâmetro; b) IPD, durante 30 dias. Amostras F1,
F2 e F6 com 5% (m:m) de CsA.
a
0 5 10 15 20 25 30
65
70
75
80
85
90
95
100
105
110
115
diâ
me
tro
mé
dio
(n
m)
tempo (dias)
F2 %5 CsA
F1
F6
b
0 5 10 15 20 25 30
0,10
0,15
0,20
0,25
0,30
0,35
0,40
0,45
0,50
0,55
0,60
0,65
0,70
IPD
tempo (dias)
F2 5% CsA
F1
F6
131
Figura 48. Variação temporal do: a) diâmetro; b) IPD, durante 30 dias. Amostras F1,
F2 e F6 com 12% (m:m) de CsA.
a
0 5 10 15 20 25 30
50
60
70
80
90
100
110
120
130
140
150
diâ
me
tro
mé
dio
(n
m)
tempo (dias)
F2 12% CsA
F1
F6
b
0 5 10 15 20 25 30
0,2
0,3
0,4
0,5
0,6
0,7
IPD
tempo (dias)
F2 12% CsA
F1
F6
132
Em todas as formulações houve incremento do diâmetro das gotículas,
sendo que adição de 12% de CsA resultou em diâmetro maiores que a de 5%. Além
disso, as nanoemulsões apresentaram distribuição multimodal. A adição de 5% de
CsA produziu NE com IPD (Fig. 47b) melhor que com 12% de CsA (Fig.48b).
Quanto à influência da concentração do tensoativo, as formulações que
tinham a menor concentração produziram NE (amostras F1 e F6) com gotículas
menores, sendo que para F6 a distribuição do diâmetro foi mais regular que para F2.
4.13 Influência da incorporação de α-tocoferol
Devido aos resultados obtidos nos itens 4.10 (relativos ao pH) e 4.1.1
(estabilidade térmica), foi necessário adicionar acetato de α-tocoferol, antioxidante
utilizado em formulações contendo fosfolipídios e óleos vegetais (BENITA & LEVY,
1993; HANEFELD e col., 2011). As moléculas de α-tocoferol podem ficar adsorvidas
na interface óleo-água, diminuindo a tensão interfacial (TEO e col., 2010).
As formulações escolhidas para este estudo foram F1, F2 e F6. F2 foi
mantida, pois apresenta o pior resultado e serve de comparação para as outras
formulações. As formulações F1 e F2 diferem no tipo de solvente empregado e
proporção de óleo:tensoativo. α-tocoferol pode agir como tensoativo e a presença de
diferentes solventes pode alterar suas propriedades. Foram adicionados 10 e 30%
(m:m) de α-tocoferol em relação à quantidade óleo utilizada e monitorados, durante
30 dias, o diâmetro e o IPD das gotículas (Fig. 49-55).
133
Figura 49. Variação temporal do: a) diâmetro; b) IPD, durante 30 dias. Amostra F1
com 10% de α-tocoferol.
a
0 5 10 15 20 25 30
40
50
60
70
80
90
100
110
120
130
140
150
160
diâ
me
tro
mé
dio
(n
m)
tempo (dias)
F1_4°C
F1_25°C
F1_45°C
b
0 5 10 15 20 25 30
0,0
0,1
0,2
0,3
0,4
0,5
0,6
IPD
tempo (dias)
F1_4°C
F1_25°C
F1_45°C
134
Figura 50. Variação temporal do: a) diâmetro; b) IPD, durante 30 dias. Amostra F2
com 10% de α-tocoferol.
a
0 5 10 15 20 25 30
20
40
60
80
100
120
140
160
180
diâ
me
tro
mé
dio
(n
m)
tempo (dias)
F2_4°C
F2_25°C
F2_45°C
b
0 5 10 15 20 25 30
0,0
0,1
0,2
0,3
0,4
0,5
0,6
IPD
tempo (dias)
F2_4°C
F2_25°C
F2_45°C
135
Figura 51. Variação temporal do: a) diâmetro; b) IPD, durante 30 dias. Amostra F6
com 10% de α-tocoferol.
a
0 5 10 15 20 25 30
40
45
50
55
60
65
70
75
80
85
90
95
100
105
110
115
120
diâ
me
tro
mé
dio
(n
m)
tempo (dias)
F6_4°C
F6_25°C
F6_45°C
b
0 5 10 15 20 25 30
0,10
0,15
0,20
0,25
0,30
0,35
0,40
0,45
0,50
IPD
tempo (dias)
F6_4°C
F6_25°C
F6_45°C
136
Figura 52. Variação temporal do: a) diâmetro; b) IPD, durante 30 dias. Amostra F1
com 30% de α-tocoferol.
a
0 5 10 15 20 25 30
70
75
80
85
90
95
100
105
110
diâ
me
tro
mé
dio
(n
m)
tempo (dias)
F1_4°C
F1_25°C
F1_45°C
b
0 5 10 15 20 25 30
0,10
0,15
0,20
0,25
0,30
0,35
0,40
0,45
IPD
tempo (dias)
F1_4°C
F1_25°C
F1_45°C
137
Figura 53. Variação temporal do: a) diâmetro; b) IPD, durante 30 dias. Amostra F2,
com 30% de α-tocoferol.
b
0 5 10 15 20 25 30
0,15
0,20
0,25
0,30
0,35
0,40
0,45
0,50
0,55
0,60
0,65
IPD
tempo (dias)
F2_4°C
F2_25°C
F2_45°C
a
0 5 10 15 20 25 30
35
40
45
50
55
60
65
70
75
80
85
90
95
100
105
diâ
me
tro
mé
dio
(n
m)
tempo (dias)
F2_4°C
F2_25°C
F2_45°C
138
Figura 54. Variação temporal do: a) diâmetro; b) IPD, durante 30 dias. Amostra F6,
com 30% de α-tocoferol, a 4 °C.
a
0 5 10 15 20 25 30
40
45
50
55
60
65
70
75
80
85
90
95
100
105
110
115
120
diâ
me
tro
mé
dio
(n
m)
tempo (dias)
F6_4°C
F6_25°C
F6_45°C
b
0 5 10 15 20 25 30
0,10
0,15
0,20
0,25
0,30
0,35
0,40
0,45
0,50
IPD
tempo (dias)
F6_4°C
F6_25°C
F6_45°C
139
A presença do α-tocoferol inibiu o aumento do diâmetro. Foi observado
aumento de ≈20% para as amostras a 25°C e ≈30% a 35%, a 45 °C os valores
chegaram ≈98%. Para amostras a 4 °C os valores variaram de ≈15 a 22%. Esses
resultados foram obtidos para amostras com 10% e 30% de α-tocoferol. O pH
também foi monitorado e pequenas variações foram observadas (Tabela 34).
Tabela 34. Variação temporal do pH das amostras F1, F2 e F6, a 25 °C
amostra pH 25°C
dia 1 dia 30
10% α-tocoferol
F1 7,23±0,05 6,97±0,05
F2 6,73±-0,02 6,38±0,09
F6 6,64±0,03 5,61±0,1
30% α-tocoferol
F1 6,66±0,03 6,64±0,1
F2 6,50±0,04 5,91±0,3
F6 6,55±0,01 6,01±0,7
140
Figura 55. Variação temporal do: a) diâmetro; b) IPD, durante 210 dias. Amostras
F1, F2 e F6, com 10% de α-tocoferol, a 4 °C.
a
0 50 100 150 200 250
40
50
60
70
80
90
100
110
diâ
me
tro
mé
dio
(n
m)
tempo (dia)
F1 4°C
F2
F6
b
0 50 100 150 200 250
-0,1
0,0
0,1
0,2
0,3
0,4
0,5
0,6
IPD
tempo (dias)
F1 4°C
F2
F6
141
Estes resultados mostram que as gotículas tem crescimento acelerado
até 30 dias e depois pouco variam. Foi observado crescimento de ≈16% para F1,
≈14% para F2 e ≈17% para F6 (Fig. 55a). Os valores de IPD finais foram <0,25 e o
pH ficou entre 6,04 e 6,4.
4.14 NE obtidas mediante emulsificação espontânea
4.14.1 Influência da proporção óleo:tensoativo
Nos primeiros testes a concentração de óleo foi fixada em 5% (m:v) e a
soma dos tensoativos lipofílico e hidrofílico em 5% (m:v) (KELMANN et al., 2007).
Isso permitiria trabalhar com as mesmas concentrações de óleo e tensoativo usadas
nas NE obtidas com o ultrassom. Mas essas concentrações produziram NE instáveis
após 8h. Isso demonstrou que a proporção solvente:óleo não estavam adequadas.
Anton & Vandamme (2009) relatam que para obter nanoemulsões pela metodologia
de emulsificação espontânea, a proporção de solvente em relação ao óleo deve ser
extremamente elevada, por exemplo, deve-se usar uma pequeníssima percentagem
de óleo na fase orgânica antes da mistura. Desta forma, a quantidade de óleo usada
foi 0,5% (m:v), uma quantidade dez vezes menor do que a usada nas NE obtidas
com o ultrassom. Definida a quantidade de óleo estudou-se a influência da
proporção óleo:tensoativos, bem como o tipo de solvente, no diâmetro das gotículas.
Os resultados estão dispostos na Figura. 56.
142
Figura 56. Variação temporal do: a) diâmetro; b) IPD, durante 15 dias. Amostras
ES1, ES2, ES3, ES4, ES5 e ES6, a 25 °C.
a
ES1 ES2 ES3 ES4 ES5 ES6
0
100
200
300
400
500
600
700
800
900
1000
1100
diآm
etr
o m
éd
io (
nm
)
1dia 25°C
15 dias
b
ES1 ES2 ES3 ES4 ES5 ES6
0,0
0,1
0,2
0,3
0,4
0,5
0,6
0,7
0,8
0,9
1,0
1,1
IPD
1 dia 25°C
15 dias
143
A proporção inicial de óleo:tensoativo (dia 1) não demonstrou diferenças
relevantes. A diferença observada foi em relação à proporção entre os tensoativos,
onde as amostras ES5 e ES6 (TCM:T, 1:0,5), que apresentam quantidade menor de
lecitina, produziram NE com diâmetros maiores (478,7±52,8 nm, ES5 dia 1 e
744,1nm ±38,2,ES6, dia 1). Outra diferença observada foi em relação ao tipo de
solvente utilizado; a presença do etanol resultou em NE com diâmetros menores
(ES1 247,1±22,8 nm e ES3 254,0±18,3 nm, dia 1) em comparação com a mistura
etanol/acetona ( 284,5±9,2 nm, ES2 e ES4 299,0±4,0 nm, ES4 dia 1) (Fig. 56a), nas
mesmas proporções de óleo/tensoativo.
Depois de 15 dias as diferenças observadas foram significativas. As
amostras ES4, ES5 e ES6 foram descartadas, pois o diâmetro e o IPD evoluíram
para 1000 nm (Fig. 56a) e IPD de 1,0 (Fig. 56b), o que provocou separação de
fases. Já as outras amostras não apresentaram separação de fases, mas tiveram
crescimento considerável das gotículas, sendo para ES1 ≈26%, ES2 ≈57% e ES3
≈58%, indicando que são instáveis embora não tenha sido observada floculação e
cremeação.
Quanto ao IPD, para as amostras com etanol foram notados inicialmente
valores mais próximos de 0,25 (Fig. 56b), onde para ES1 (0,225 ±0,03) e ES3 (0,21
±0,05) com etanol e ES2 (0,35 ±0) mistura acetona/etanol para 1 dia de ensaio.
Após o término do experimento houve redução para ES1 de ≈6,2% (0,225 para 0,21)
e ES2 de ≈22% (0,35 para 0,27). Para ES3 houve aumento de ≈10,5% (0,21 para
0,23).
As amostras escolhidas para prosseguir os estudos foram a ES1 e a ES2,
apesar de ES2 ter apresentado crescimento de ≈57% para o diâmetro e redução do
IPD, demonstrando que a proporção 1:0,8 (óleo:tensoativo) parece ser adequada.
4.15 Influência do tipo de tensoativo
Devido aos valores de IPD e o crescimento acelerado do diâmetro médio
foram testados novos tensoativos com objetivo de melhorar esses parâmetros. Os
experimentos a seguir investigaram a influência que o tipo de tensoativo usado teria
no diâmetro médio inicial das gotículas e IPD das NE.
144
4.15.1 NE produzidas em etanol
Neste experimento foi utilizada a formulação ES1 como referência, sendo
adicionados 5% (m:m) de CsA, em relação à quantidade de óleo, para as quatro
primeira formulações e com a amostra PL sem CsA. As amostras foram feitas em
duplicata e armazenadas a 4 °C, 25 °C e 45 °C. Os resultados estão nas Figuras 57
a 59 e Tabela 35.
Figura 57. Variação temporal do: a) diâmetro; b) IPD, durante 15 dias. Amostras
ES7, ES8, ES9, ES10 e PL, a 4 °C.
a
ES7 ES8 ES9 ES10 PL
0
50
100
150
200
250
300
350
400
450
500
550
600
650
700
diâ
me
tro
mé
dio
(n
m)
1 dia 4 ؛C
15 dias
b
ES7 ES8 ES9 ES10 PL
0,00
0,05
0,10
0,15
0,20
0,25
0,30
0,35
0,40
IPD
1dia 4 ؛C
15 dias
145
Figura 58. Variação temporal do: a) diâmetro; b) IPD, durante 15 dias. Amostras
ES7, ES8, ES9, ES10 e PL, a 25 °C.
a
ES7 ES8 ES9 ES10 PL
0
200
400
600
800
1000
diâ
me
tro
mé
dio
(n
m)
1dia 25 ؛C
15 dias
b
ES7 ES8 ES9 ES10 PL
0,0
0,2
0,4
0,6
0,8
1,0
IPD
1 dia 25 ؛C
15 dias
146
Figura 59. Variação temporal do: a) diâmetro; b) IPD, durante 15 dias. Amostras
ES7, ES8, ES9, ES10 e PL, a 45 °C
a
ES7 ES8 ES9 ES10 PL
0
200
400
600
800
1000d
iâm
etr
o m
éd
io (
nm
)
1 dia 45 ؛C
15 dias
b
ES7 ES8 ES9 ES10 PL
0,0
0,1
0,2
0,3
0,4
0,5
0,6
0,7
0,8
0,9
1,0
1,1
IPD
1 dia 45 ؛C
15 dias
147
Tabela 35. Diâmetro médio, IPD e potencial Zeta para NE produzidas em etanol por
emulsificação espontânea, após 1dia, a 25 °C
Ensaio polisorbato
x1
lecitina
x2
média φ
nm
média
IPD
ES7 T20 L-PC-3 242,3 ±10,9 0,161±0,05
ES8 T80 L-PC-3 372,5±58,5 0,244±0,02
ES9 T20 L-SL80-3 197,7±9,5 0,155±0,07
ES10 T80 L-SL80-3 215,6±2,5 0,176±0,03
PL T20 L-SL80-3 188,8±13,4 0,194±0,01
Foi notado que o diâmetro inicial possui uma dependência maior ao tipo
de lecitina usada que ao tipo de tensoativo não iônico. Isso pode ser confirmado
quando analisamos as amostras ES7 e ES9 (Tabela 35), onde o mesmo tensoativo
(T20) não iônico é usado, mas com diferentes lecitinas. Para a primeira foi usada a
lecitina L-PC-3 sendo encontrado maior diâmetro (242,3±10,9 nm, dia 1, 25 °C).
Para a amostra ES9, com lecitina L-SL80-3, o diâmetro médio das gotículas foi
197,7±9,5 nm (dia 1, 25 °C). Também é observada pequena diferença entre os
resultados obtidos com os tensoativos não iônicos. Comparando as amostras ES9 e
ES10 (Tabela 35), onde a mesma lecitina estava presente, mas com diferentes
tensoativos não iônicos, foi observado pequeno aumento para ES10 com T80
(215,6±2,5 nm, dia 1, 25 °C) e para ES9, com T20, foi encontrado um diâmetro
médio menor (197,7±9,5 nm, dia 1, 25 °C).
A temperatura de armazenamento também teve efeito significativo em
todas as amostras, como pode ser observado nas Figuras 57a, 58a e 59a. Houve
aumento considerável no diâmetro das gotículas, principalmente para as amostras
com L-PC-3, depois de 15 dias de armazenamento. O diâmetro médio em ES8
aumentou ≈57,2% a 4 °C (262 nm inicialmente para 411,8 nm), ≈170% a 25 °C
(372,5 nm inicialmente para 1000 nm) e ≈173% a 45 °C (267,1 nm inicialmente para
1000 nm). Neste último o valor não é confiável, pois o aparelho somente detecta até
partículas com diâametro até 1000 nm de maneira confiável. Para a amostra ES10
(L-SL80-3) o aumento foi de ≈12% a 4 °C (196,3 nm inicialmente para 219,3 nm),
148
≈23% a 25 °C (215,6 nm inicialmente para 264,7 nm) e ≈125% a 45 °C (238,6 nm
inicialmente para 534,9 nm). Isso demonstra que a L-SL80-3 estabiliza um pouco
mais as NE que L-PC-3, pois T80 estava presente nas duas NE. Também foi notado
que o resfriamento das amostras retarda o crescimento do diâmetro médio e a
elevação de temperatura (45 °C) tem efeito contrário. É importante considerar que o
fenômeno de Ostwald ”ripening” pode ser acelerado pela temperatura, pois o
aumento desta aumenta a solubilidade do óleo na fase aquosa. Assim, a 45 °C,
possivelmente, houve aumento desse fenômeno, resultando em aumento mais
significativo do diâmetro das gotículas.
A distribuição de tamanho foi monomodal para todas as amostras durante
os 15 dias de armazenamento. Percebeu-se, também, que os valores de IPD foram
afetados pela temperatura de armazenamento. A 4 °C as amostras ES7 e ES8
mantiveram IPD em ≈0,300 em 15 dias. Em 25 °C e 45 °C notou-se aumento
considerável ao término do ensaio (IPD 1,0), indicando instabilidade dessas NE
após 15 dias. Para as amostras ES9 (redução de ≈61%), ES10 (redução ≈52%) e PL
(redução ≈12%) uma redução considerável foi notada a 45 °C (Fig. 59b), e em 25 °C
a redução foi ≈25 (Fig. 58b) (ES9 e ES10) e a 4 °C ≈14% (Fig. 57b) (ES9 e ES10).
Outro fator analisado foi a influência do fármaco. Na formulação PL não
havia CsA. Essa amostra apresentou baixo crescimento de diâmetro, ≈16% a 45 °C
e a 4 °C não foi observado crescimento significativo, e as amostras permaneceram
estáveis. Desta forma, a presença do fármaco reduziu a estabilidade das NE, sendo
que, ele pode ter interagido com componentes presentes na NE.
Os resultados deste experimento sugerem que o crescimento do diâmetro
médio é devido ao fenômeno de Ostwald “ripening”, sendo mais pronunciado para as
amostras com lecitina L-PC-3 e a 45 °C. As amostras ES7 e ES8 após 15 dias
revelaram-se extremamente instáveis, ocorrendo separação de fases em 25 °C e 45
°C. Assim, a lecitina L-PC-3 não estabiliza, de modo eficaz, NE produzidas via
emulsificação espontânea.
4.15.2 NE produzidas em mistura de acetona:etanol
Neste experimento foi utilizada a formulação ES2 como referência, sendo
adicionados 5% (m:m) de CsA, em relação à quantidade de óleo, para as quatro
primeira formulações. Somente a amostra PL não contém CsA. As amostras foram
149
feitas em duplicata e armazenadas a 4 °C, 25 °C e 45 °C. Os resultados estão nas
Figuras 60 a 61 e Tabela 36.
Figura 60. Variação temporal do: a) diâmetro; b) IPD, durante 15 dias. Amostras
ES11, ES12, ES13, ES14 e PL, a 4 °C
a
ES11 ES12 ES13 ES14 PL
0
100
200
300
400
500
600
diâ
me
tro
mé
dio
(n
m)
1 dia 4°C
15 dias
b
ES11 ES12 ES13 ES14 PL
0,0
0,1
0,2
0,3
0,4
0,5
0,6
IPD
1 dia 4°C
15 dias
150
Figura 61. Variação temporal do: a) diâmetro; b) IPD, durante 15 dias. Amostras
ES11, ES12, ES13, ES14 e PL, a 25 °C.
a
ES11 ES12 ES13 ES14 PL
0
100
200
300
400
500
600
700
800
900
1000
1100
diâ
me
tro
mé
dio
(n
m)
1 dia 25°C
15 dias
b
ES11 ES12 ES13 ES14 PL
0,00
0,05
0,10
0,15
0,20
0,25
0,30
0,35
0,40
0,45
0,50
0,55
0,60
0,65
0,70
0,75
0,80
IPD
1 dia 25°C
15 dias
151
Figura 62. Variação temporal do: a) diâmetro; b) IPD, durante 15 dias. Amostras
ES11, ES12, ES13, ES14 e PL, a 45 °C.
a
ES11 ES12 ES13 ES14 PL
0
100
200
300
400
500
600
700
800
900
1000
1100
diâ
me
tro
mé
dio
(n
m)
1 dia 45°C
15 dias
b
ES11 ES12 ES13 ES14 PL
0,0
0,1
0,2
0,3
0,4
0,5
0,6
0,7
0,8
0,9
1,0
1,1
IPD
1 dia 45°C
15 dias
152
Tabela 36. Diâmetro médio, IPD e potencial Zeta para NE produzidas na mistura
acetona:etanol, por emulsificação espontânea, após 1 dia, a 25 °C
Ensaio polisorbato
x1
lecitina
x2
média φ
nm
média
IPD
ES11 T20 L-PC-3 456,7± 39,3 0,32± 0,04
ES12 T80 L-PC-3 352,7± 5,8 0,35± 0,01
ES13 T20 L-SL80-3 363,2± 44,3 0,27± 0,07
ES14 T80 L-SL80-3 250,2± 10,2 0,24± 0,01
PL T20 L-SL80-3 177,7± 1,0 0,21± 0,02
A troca de solvente aumentou o diâmetro das gotículas, e os valores de
IPD (Tabela 36). Isso pode ser devido à acetona não solubilizar lecitinas, dificultando
a difusão do solvente e a formação das nanogotas.
Quanto ao tipo de lecitina empregada, assim como no experimento
relatado no item 4.15.1, existe, também, uma dependência maior do diâmetro inicial
com o tipo de lecitina. Analisando as amostras com diferentes lecitinas, mas com
mesmo tensoativo (T20), como a ES11 (L-PC-3) e a ES13 (L-80-3), nota-se que a
primeira tem maior diâmetro de gotas ( 456,7± 39,3 nm; dia 1, 25 °C) e a segunda
diâmetro menor (363,2± 44,3 nm; dia 1, 25 °C). Mas há uma pequena diferença entre
os tensoativos não iônicos: T80 produziu NE com os menores diâmetros ( ES12
352,7± 5,8 nm; dia 1, 25°C; ES14 250,2 ± 10,2 nm; dia 1, 25 °C), diferente dos
resultados citados no item 4.15.1.
A temperatura de armazenamento exerceu efeito significativo nas
amostras ES11 e ES12, onde a lecitina L-PC-3 estava presente. Houve crescimento
das gotículas de ≈122% para ES11 a 45 °C e de ≈111% para ES2 a 45 °C. A 25 °C
o crescimento foi de ≈86% para ES11 e ≈53% para ES12 (Figuras 61a e 62a). Após
os 15 dias essas NE apresentaram separação de fases e apenas a 4 °C (Fig. 60a)
elas se mantiveram-se estáveis. As amostras ES13 e ES14 (L-SL80-3) foram menos
sensíveis às mudanças de temperatura, tanto que o crescimento do diâmetro a 45
°C para ES13 foi de ≈17% (343,7 nm inicialmente para 402 nm) e para ES14 de
153
≈33% (263 nm inicialmente para 350,4 nm), mesmo resultado mostrado no item
4.15.1.
Como podemos notar, a presença da lecitina L-SL80-3 estabiliza um
pouco mais as NE que a L-PC-3, o resfriamento retarda o crescimento e a elevação
da temperatura aumenta o tamanho das gotículas. Como descrito no item 4.15.1 o
fenômeno de Ostwald ”ripening” é acelerado com aumento da temperatura e
retardado em temperaturas mais baixas.
A distribuição de tamanho das gotículas de cada amostra monomodal
durante 15 dias de armazenamento e os valores de IPD foram afetados pela
temperatura de armazenamento e pela mudança do solvente. A troca de solvente
resultou inicialmente num aumento de IPD, sendo observados valores entre 0,25 e
0,5 (ES11, ES12, ES13 e ES14). Assim, como nos experimentos relatados no item
4.15.1, as amostras com a lecitina L-PC-3, mostraram-se instáveis a 25 °C e 45 °C,
pois o IPD evoluiu para 0,7 (ES11) e 1,0 de IPD (ES12), após os 15 dias. Apenas a
4 °C essas formulações ficaram estáveis. Foi observada redução do IPD ao longo do
ensaio para ES13 (redução de ≈15%) e ES14 (redução ≈12%) a 45 °C (Fig. 62b) a
25 °C a redução foi de ≈38% (ES13) e ≈11% (ES14) (Fig. 61b) e 4 °C de ≈1%
(ES13) e ≈30% (ES14) (Fig. 60b).
Outro fator analisado foi à influência do fármaco. Na formulação PL não
havia CsA., essa amostra apresentou crescimento de diâmetro, ≈16% a 45 °C e a 4
°C houve crescimento de ≈4%, isso demonstra que a ausência do fármaco resulta
em amostras mais estáveis, e que sua presença na formulação reduz a estabilidade
das NE.
Os resultados deste experimento também sugerem que o crescimento do
diâmetro das NE é devido ao fenômeno de Ostwald “ripening”, sendo mais
pronunciado para as amostras com lecitina L-PC-3 e a 45 °C. As amostras ES11 e
ES12 após 15 dias ficaram muito instáveis, ocorrendo separação de fases a 25 °C e
a 45 °C. Portanto, a lecitina L-PC-3 não estabiliza, de maneira eficaz, as NE
produzidas mediante emulsificação espontânea
4.16 Influência da adição do ácido oleico
Os resultados citados no item 4.15.1 mostram que etanol produziu
gotículas com diâmetro e IPD menores, embora menos estáveis, pois a 45 °C a
154
média do crescimento do diâmetro das gotículas foi de ≈176%, já para as amostras
do item 4.15.2 foi observado um diâmetro maior, bem como um IPD. A média do
crescimento do diâmetro das gotículas foi de ≈71% a 45°C.
Para tentar solucionar o problema na estabilidade das NE foi adicionado
ácido oleico às formulações. As formulações escolhidas foram ES9, ES10, ES13 e
ES14. Para as duas primeiras o objetivo foi melhorar a estabilidade e para as duas
ultimas, além da estabilidade, conseguir reduzir o diâmetro médio das gotículas e o
IPD.
Segundo Levy e col.(1994) a presença do ácido oleico aumenta as
propriedades mecânicas do filme interfacial devido à existência de interações
intermoleculares entre o fosfolipídio, ácido oleico e P-F68, aumentando a
estabilidade em até 24 meses (LEVY e col., 1991, 1994).
Foi feita mistura entre TCM e ácido oleico (50:50%, m:m) totalizando 0,5%
(m:v) de óleo presente na NE. As formulações foram armazenadas a 4 °C, 25 °C e
45 °C e analisadas por 15 dias. Os resultados estão nas Figuras 63, 64 e 65 e
Tabela 37.
155
Figura 63. Variação temporal do: a) diâmetro; b) IPD, durante 15 dias. Amostras
ES9, ES10, ES13 e ES14 com ácido oleico, a 4 °C.
a
ES9 ES10 ES13 ES14
0
20
40
60
80
100
120
140
160
180
200
220
240
diâ
me
tro
mé
dio
(n
m)
1 dia 4°C
15 dias
b
ES9 ES10 ES13 ES14
0,00
0,02
0,04
0,06
0,08
0,10
0,12
0,14
0,16
0,18
0,20
0,22
IPD
1 dia 4°C
15 dias
156
Figura 64. Variação temporal do: a) diâmetro; b) IPD, durante 15 dias. Amostras
ES9, ES10, ES13 e ES14 com ácido oleico, a 25 °C.
a
ES9 ES10 ES13 ES14
0
20
40
60
80
100
120
140
160
180
200
220
240
diâ
me
tro
mé
dio
(n
m)
1 dia 25°C
15 dias
b
ES9 ES10 ES13 ES14
0,00
0,05
0,10
0,15
0,20
0,25
IPD
I
1 dia 25°C
15 dias
157
Figura 65. Variação temporal do: a) diâmetro; b) IPD, durante 15 dias. Amostras
ES9, ES10, ES13 e ES14 com ácido oleico, a 45 °C.
a
ES9 ES10 ES13 ES14
0
50
100
150
200
250
300
350
400
450
500
550
600
diâ
me
tro
mé
dio
(n
m)
1dia 45°C
15 dias
b
ES9 ES10 ES13 ES14
0,00
0,05
0,10
0,15
0,20
0,25
0,30
0,35
0,40
IPD
1 dia 45°C
15 dias
158
Tabela 37. Diâmetro médio para NE produzidas com ácido oleico
1dia 15dias
Ensaio 4°C 25°C 45°C 4°C 25°C 45°C
ES9 156± 25,3 148,9±6,8 164,9±5,5 163,7±25,0 169,2±1,2 184,4±0,7
ES10 176,6± 18,5 173,5±1,0 184,3±4,5 200,4±6,2 191,7±25,8 224,7±12,0
ES13 174,9± 13,7 179,2±8,0 219,1±18,4 202,8±1,3 208,2±6,2 224,7±10,6
ES14 193,2± 2,8 187,4±8,5 414,4±49,2 229±11,3 214,6±6,1 556,0±2,6
A adição do ácido oleico produziu NE com diâmetros menores,
comparando com as mesmas formulações onde este estava ausente (Tabela 37),
sendo que para formulação ES13 o diâmetro foi 179 nm (dia 1, 25 °C) com o ácido
oleico e 363,2 nm (dia 1, 25 °C) somente com TCM. Possivelmente isso ocorreu,
pois o ácido oleico pode agir como co-tensoativo e reduzir a tensão interfacial e, em
consequência, o tamanho das gotículas é reduzido.
A influência do tempo de armazenamento em diferentes temperaturas
também foi avaliada. Para ES9 o aumento do diâmetro foi ≈5% (4 °C), ≈14% (25 °C)
e ≈12% (45 °C), para ES10 ≈14% (4 °C), ≈10% (25 °C) e ≈21% (45 °C), para ES13
≈16% (4 °C), ≈16% (25 °C) e ≈3% (45 °C) e para ES14 ≈18% (4 °C), ≈14% (25 °C) e
≈34% (45 °C), sendo os aumentos causados pelo fenômeno de Ostwald "ripening".
Quanto ao IPD valores abaixo de 0,23 para as amostras ES9, ES10 e
ES13, mas para ES14 a 45 °C os valores foram acima de 0,3, reduzindo a 0, 26
após 15 dias. As amostras escolhidas para os próximos testes foram a ES9 e ES10,
pois a 4 °C e 25 °C elas apresentaram menor em comparação à ES13 e ES14.
4.17 Influência da incorporação de 12% de CsA
Foi investigado o impacto da adição de concentração maior de fármaco
na estabilidade e diâmetro médio das gotículas. As amostras ES9 e ES10 com CsA
12% (m:m) em relação a quantidade de óleo, foram armazenadas a 4 °C e
analisadas por 30 dias. O resultado está na Figura 66.
159
Figura 66. Variação temporal do: a) diâmetro; b) IPD, durante 15 dias. Amostras ES9
e ES10 com 12% de CsA, a 4 °C.
a
ES9_CsA ES10_CsA
0
50
100
150
200
250
300
350
400
450
500
550
600
650
diâ
me
tro
mé
dio
(n
m)
1 dia 4°C
15dias
30 dias
b
ES9_CsA ES10_CsA
0,00
0,02
0,04
0,06
0,08
0,10
0,12
0,14
0,16
0,18
0,20
0,22
0,24
0,26
0,28
0,30
IPD
1dia 4°C
15 dias
30 dias
160
Como pode ser observado a adição de CsA causou aumento de ≈30%
(em 30 dias) no diâmetro médio das gotículas para ES9 (>300 nm), reduzindo a
estabilidade das NE. Para ES10 a adição do fármaco não produziu NE com
diâmetros maiores que 200 nm, sendo observado aumento de ≈5% ao longo de 30
dias.
Quanto ao IPD (Fig. 66b) para ES9 os valores estavam em ≈0,2, com
pequeno aumento ao longo de 30 dias e para ES10 houve redução dos valores de
IPD ao longo de 30 dias.
4.18 Estudo de estabilidade das NE obtidas por emulsificação
espontânea
As amostras ES9 e ES10 foram armazenadas a 4 °C e avaliadas durante
90 dias quanto ao φ, IPD e pH. Como ES9 era instável com 12% (m:m) de CsA,
adicionou-se a essa formulação 5% (m:m). Para ES10 foram adicionados 12%
(m:m). Os resultados estão na Figura 67 e Tabela 38.
161
Figura 67. Variação temporal do: a) diâmetro; b) IPD, durante 90 dias. Amostras ES9
(5% de CsA) e ES10 (12% de CsA), a 4 °C.
b
0 20 40 60 80 100
0,04
0,06
0,08
0,10
0,12
0,14
0,16
0,18
0,20
0,22
0,24
0,26
0,28
IPD
tempo (dias)
ES9 4°C
ES10
a
0 20 40 60 80 100
130
140
150
160
170
180
190
200
210
220
230
240
diâ
me
tro
mé
dio
(n
m)
tempo (dias)
ES9 4°C
ES10
162
Tabela 38. Variação temporal do pH de ES9 (5% CsA) e ES10 (12% CsA), a 4 °C
por 90 dias.
amostra pH 4°C
1 dia 90 dias
ES9 7,3±0,01 7,2±0,01
ES10 7,2±0,01 7,1±0,01
A formulação ES10 é mais estável que a ES9, pois ao longo de 90 dias o
diâmetro das gotículas de ES10 Figura 67a, para a qual o diâmetro médio inicial foi
173,4±4 nm e após 90 dias de 171,6±1nm. Quanto ao IPD (Fig. 67b) houve uma
redução de ≈18% (de 0,17 para 0,14), demonstrando que esta NE ficou homogênea
nos 90 dias. Apesar de ES9 inicialmente produzir NE com diâmetro de gotícula
menor (160,6±2,4 nm) ao longo do experimento ela foi menos estável que a ES10
(Fig. 67a), sendo que ao final foi encontrado um diâmetro médio de 203,5±31,7 nm,
aumentando ≈27%. A distribuição do diâmetro médio apresentou comportamento
parecido com a de ES10, mas com redução de ≈51% (de 0,20 para 0,1).
Ao término do ensaio, ambas as formulações apresentaram distribuição
bimodal do diâmetro médio (Fig. 68), indicando instabilidade das amostras. A
formulação ES10 foi escolhida para prosseguir nos estudos.
163
Figura 68. Distribuição do diâmetro médio das gotículas das amostras de ES9 e
ES10.
4.19 Determinação da quantidade de CsA presente nas NE
4.19.1 Curva de calibração para a CsA
A curva analítica construída para avaliação da linearidade do método
analítico apresentou coeficiente de correlação de 0,9999 após análise de regressão
linear de cinco pontos (Fig. 69). A equação da reta obtida da análise de regressão
linear foi: y = 93,80 + 1726,62 x e o tempo de retenção médio encontrado foi 7 min
(Fig. 70). A partir da curva de calibração é possível calcular a concentração de CsA
na NE.
164
Figura 69. Curva de calibração da CsA.
Figura 70. Cromatograma da ciclosporina A .
0 2 4 6 8 10 12
2,0x103
4,0x103
6,0x103
8,0x103
1,0x104
1,2x104
1,4x104
1,6x104
1,8x104
Are
a (
mU
A)
Y = 93,80 + 1726,62X
r2= 0,9999
massa de CsA(g)
165
4.19.2 Determinação da eficiência de encapsulação
Após determinar a curva analítica foi obtida a equação da reta que
permite quantificar o teor de CsA nas formulações (Tabela 39).
Tabela 39. Eficiência de Encapsulação (EE%) das formulações a 4 °C
EE(%)
Amostra Dia 1 90 dias
F1 91,55±1,76 89,5±11,59
F2 86,65±10,11 89,45±15,62
F6 99,15±0,21 79,95±0,63
ES9 67,25±0,35 66,67±0,45
ES10 62,00±0,42 61,10±0,84
Observa-se que as nanoemulsões produzidas com ultrassom
apresentaram eficiência de encapsulação maiores que as produzidas por
emulsificação espontânea. Os valores da eficiência de encapsulação (cerca de 80%)
pouco variam ao longo do tempo. Apenas para a amostra F6 houve redução
considerável. Isso indica que, para quase todas as amostras, a maior parte do
fármaco presente está na fase lipídica, podendo estar na superfície ou dentro da
matriz lipídica.
4.19.3 Microscopia Eletrônica de Varredura
Nos experimentos citados no item 4.19.2 as NE foram filtradas em
membranas de PVDF (diâmetro de por 0,45 µm). Essas membranas foram
analisadas por MEV a fim de verificar a presença ou ausência do fármaco (Figuras
71 a 74).
166
Figura 71. Micrografia dos cristais de ciclosporina A: a) CsA, aumento 10000X; b)
CsA; aumento 4500X.
Figura 72. Micrografia das membranas de PVDF: a) aumento 200X; b) aumento
2000X.
167
Figura 73. Micrografia da amostra F6 em membranas de PVDF: a) aumento
2000X;b) aumento 500X.
Figura 74. Micrografia da amostra ES9 em membranas de PVDF: a) aumento 2000X;
b) aumento 500X.
Foi observado para todas as amostras a presença de fármaco nas
membranas
168
V. CONCLUSÃO
Vários fatores contribuem para alteração do diâmetro das gotículas, IPD e
estabilidade das NE
Diferentes tensoativos causam diferentes alterações no tamanho, índice
de polidispersidade e potencial Zeta das gotículas. O cálculo do Balanço Hidrofílico-
Lipofílico serviu como orientação para identificar a proporção de cada
tensoativo na formulação, sendo a mistura T20/L + SL80-3 a melhor.
Outro fator importante foi a concentração total de tensoativos e sua
proporção em relação à de óleo. Inicialmente as formulações F1 e F6, com menor
concentração e proporção 1:1 (T:TCM), foram as mais estáveis, mas a adição de α-
tocoferol e do fármaco tornou-as menos estáveis.
A estabilidade das amostras F1, F2 e F6 foram fortemente afetadas pela
temperatura de armazenamento
Foi possível preparar NE através de metodologias com alta e baixa
energia de emulsificação mas apenas as formulações obtidas mediante sonificação
apresentaram alta eficiência de encapsulação .A formulação, contendo ciclosporina
A, mais adequada para aplicação parenteral foi a F1, mas serão necessários testes
in vitro e in vivo , comparando o desempenho da mesma com a formulação
disponível no mercado.
169
VI. SUGESTÕES PARA TRABALHOS FUTUROS
Os seguintes trabalhos são propostos para dar continuidade ao tema
abordado:
Realização de Microscopia de Transmissão para análise da morfologia das
gotículas;
Realização de ensaios para determinação da eficiência in vitro e in vivo das
formulações de nanoemulsões desenvolvidas;
Encapsular a CsA em sistemas de nanoestruturados.
170
VII. REFERÊNCIAS
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