UNIVERSIDADE ESTADUAL DE CAMPINAS FACULDADE DE...
Transcript of UNIVERSIDADE ESTADUAL DE CAMPINAS FACULDADE DE...
UNIVERSIDADE ESTADUAL DE CAMPINAS
FACULDADE DE CIÊNCIAS MÉDICAS
KARINA COLOMBERA PERES
ESTUDO DO PAPEL DE TGF-β1 NO CARCINOMA DIFERENCIADO DA TIREOIDE
CAMPINAS
2018
KARINA COLOMBERA PERES
ESTUDO DO PAPEL DE TGF-β1 NO CARCINOMA DIFERENCIADO DA TIREOIDE
Dissertação apresentada à Faculdade de Ciências Médicas da
Universidade Estadual de Campinas como parte dos requisitos exigidos
para a obtenção do título de Mestra em Ciências, área de concentração
em Clínica Médica.
ORIENTADOR: LAURA STERIAN
COORIENTADOR: NATASSIA ELENA BUFALO
ESTE EXEMPLAR CORRESPONDE À VERSÃO
FINAL DA DISSERTAÇÃO DEFENDIDA PELA
ALUNA KARINA COLOMBERA PERES, E ORIENTADO PELA
PROFA. DRA. LAURA STERIAN.
CAMPINAS
2018
Peres, Karina Colombera, 1992-
P415 Estudo do papel de TGF-β no carcinoma diferenciado da tireoide /
Karina Colombera Peres. – Campinas, SP : [s.n.], 2018.
Orientador: Laura Sterian Ward.
Coorientador: Natassia Elena Bufalo.
Dissertação (mestrado) – Universidade Estadual de Campinas, Faculdade
de Ciências Médicas.
1. Neoplasias da glândula tireoide. 2. Marcadores moleculares. 3. Fator de
crescimento transformador beta1. I. Ward, Laura Sterian, 1956-. II. Bufalo,
Natassia Elena, 1981-. III. Universidade Estadual de Campinas. Faculdade de
Ciências Médicas. IV. Título.
Agência(s) de fomento e nº(s) de processo(s): FAPESP, 2015/19117-0
Ficha catalográfica
Universidade Estadual de Campinas
Biblioteca da Faculdade de Ciências Médicas
Maristella Soares dos Santos - CRB 8/8402
Informações para Biblioteca Digital
Título em outro idioma: Study of TGF-β in the differentiated thyroid carcinoma
Palavras-chave em inglês: Thyroid gland neoplasms Molecular markers
Transforming growth factor beta1
Área de concentração: Clínica Médica
Titulação: Mestra em Ciências
Banca examinadora:
Laura Sterian Ward [Orientador]
Murilo Vieira Geraldo
Glaucia Maria Ferreira da Silva Mazeto
Data de defesa: 12-01-2018
Programa de Pós-Graduação: Clínica Médica
BANCA EXAMINADORA DA DEFESA DE MESTRADO
KARINA COLOMBERA PERES
ORIENTADOR: LAURA STERIAN
COORIENTADOR: NATASSIA ELENA BUFALO
MEMBROS:
1. PROFA. DRA. LAURA STERIAN
2. PROF. DR. MURILO VIEIRA GERALDO
3. PROFA. DRA. GLAUCIA MARIA FERREIRA DA SILVA MAZETO
Programa de Pós-Graduação em Clínica Médica da Faculdade de Ciências Médicas
da Universidade Estadual de Campinas.
A ata de defesa com as respectivas assinaturas dos membros da banca examinadora
encontra-se no processo de vida acadêmica do aluno.
Data: 12/01/2018
Dedico esta dissertação à minha família: Ana Lucia, Nivaldo, Luís Fernando e Davi.
Obrigada por compartilharem comigo esta jornada.
AGRADECIMENTOS
À Deus e Nossa Senhora da Aparecida. Obrigada por guiarem meus passos e por todas
as graças alcançadas.
À minha orientadora, Dra. Laura, obrigada por ter me acolhido em sua família
científica. Sou grata por tudo o que me ensinou e me ensina. É um exemplo de mulher e
pesquisadora para todos nós do Gemoca.
À minha coorientadora, Dra. Natássia, não tenho palavras para agradecer a companhia,
o suporte, os puxões de orelha... Obrigada por sempre cuidar de mim e pela sua amizade!
À minha mãe, Ana Lucia, maior exemplo de vida e amor! Obrigada por ter me apoiado
em todas as minhas escolhas. Obrigada pelo colo, pelos abraços, pelos beijos, pelos
conselhos... Obrigada por ser minha mãe! Eu te amo além dessa vida.
Ao meu pai, Nivaldo, meu exemplo de caráter. Obrigada por cuidar tão bem de nossa
família, por não negar esforços para nos fazer feliz. Você é meu super herói. Eu te amo!
Aos meus irmãos, Luís Fernando e Davi, meus meninos! Obrigada por viverem
comigo essa jornada chamada vida. Estarei ao lado de vocês para sempre. Amo muito vocês!
À minha família em geral, em especial tia Fernanda, tio Junior, Débora, tia Solange e
tio Zé, pelo carinho que têm comigo e pela minha família. Amo vocês!
Às minhas companheiras e amigas do Gemoca e do corredor (rs), Ana Paula,
Elisângela, Helen, Jacqueline, Larissa, e Viviane, obrigada pelas risadas, pelo carinho, pelo
companheirismo... Levo vocês no meu coração para sempre!
Aos amigos que fiz no Gemoca e que hoje brilham em outros lugares, Ana Beatriz,
Angélica, Fernando, Laís, Mariana, Marjory, Murilo e Raquel, obrigada por essa amizade ter
se estendido além do laboratório. Sou grata por tudo o que aprendi com vocês dentro e fora do
Gemoca.
Aos amigos que a vida me presenteou, Beatriz, Caio, Carks, Castelluber, Eduardo,
Jaqueline, Lívia, Pamela, Ramon e Vinícius, obrigada pelo companheirismo de todos esses
anos, pelas risadas intermináveis, pela torcida. Amizade para o resto da vida! Amo vocês!
Aos colegas do Laboratório de Investigação em Patologia, Dr. José Vassalo, Carol e
Paulinho, obrigada pelas portas estarem sempre abertas para nós do Gemoca e pela ajuda nas
imunoistoquímicas.
À Dra. Icléia Barreto, patologista do Departamento de Anatomia Patológica do
HC/UNICAMP, que chegou e acrescentou tanto ao nosso grupo de pesquisa. Obrigada pela
ajuda na leitura das lâminas, obrigada por ensinar tanto!
Ao Dr. Valdemar Maximo, do Instituto de Patologia Molecular e Imunologia
(Ipatimup) da Universidade do Porto (Portugal), que em tão pouco tempo me ensinou tanto.
Obrigada pela ajuda na leitura com as lâminas e por todas as histórias sobre Portugal.
Saudades, professor!
Aos colegas vizinhos do Laboratório de Genética Molecular, Citogenética, Hepatites e
Zebrafish, obrigada pelas trocas de conhecimento e pelos socorros ao longo desses dois anos.
À comissão de Pós-Graduação em Clínica Médica, pelos serviços prestados ao longo
desses dois anos de mestrado e pelo auxílio financeiro para que esses dados pudessem ser
apresentados em congressos científicos.
Aos pacientes que doando um pouco de si contribuem infinitamente para a pesquisa e
avanço do nosso país.
À Fundação de Amparo a Pesquisa do Estado de São Paulo (FAPESP), pelo auxílio
financeiro (bolsa de mestrado, processo 2015/19117-0) fundamental para a realização desse
projeto.
RESUMO
Nódulos tireoidianos são frequentemente identificados na prática clínica, apresentando
significativo aumento nas últimas décadas. O diagnóstico do CDT através da análise
citológica pela PAAF, apesar de apresentar alta acurácia, possui deficiências: de 15-20% das
amostras submetidas à análise citológica são classificadas como insatisfatórias/não
diagnósticas ou lesões de significado indeterminado levando o paciente a uma tireoidectomia
para esclarecer o diagnóstico. O fator de transformação do crescimento-β (TGF-β) é uma
citocina multifuncional que atua em diferentes e importantes funções biológicas e na
regulação do sistema imune. Sua sinalização ocorre através de dois receptores
transmembrana: o receptor tipo I (TβRI) e o receptor tipo II (TβRII). Diversos estudos têm
reportado a perturbação ou perda da sinalização de TGF-β1 e seus receptores no câncer, assim
como polimorfismos nestes genes são frequentemente investigados e associados a diversas
patologias. O objetivo deste trabalho foi investigar a utilidade dos genes TGFB1, TGFBR1 e
TGFBR2 como marcadores de diagnóstico e/ou prognóstico em pacientes com nódulos
tireoidianos, buscando correlacionar os resultados com características clínico-patológicas.
Para investigação dos polimorfismos de TGFB1 (rs1800469, rs1800472, rs11466321,
rs2241716, rs8110090), TGFBR1 (rs10512263, rs7850895) e TGFBR2 (rs2228048) foram
avaliados 339 pacientes com nódulos malignos e benignos da tireoide pela técnica de Taqman
SNP Genotyping e 141 amostras de tecidos normais, malignos e benignos para expressão de
RNAm dos genes supracitados por PCR quantitativa. Os polimorfismos, rs1800469 e
rs1800472, do gene TGFB1 demonstraram correlação do genótipo alterado com
características de agressividade do tumor como ausência de cápsula e metástase linfonodal ao
diagnóstico, respectivamente. O polimorfismo rs10512263 do gene TGFBR1 demonstrou
associação do genótipo alterado com ausência de invasão. A expressão gênica de TGFB1 foi
maior em tecidos malignos, assim como TGFBR1, mas não TGFBR2. Em conclusão, nossos
dados demonstram que a expressão gênica de TGFB1 pode ser uma ferramenta útil para
auxiliar no diagnóstico de nódulos benignos da tireoide e polimorfismos do gene TGFB1 e de
seu receptor TGFBR1, mas não de TGFBR2, podem auxiliar no prognóstico de pacientes com
CDT.
Palavras-chave: Neoplasias da glândula tireoide, marcadores moleculares, fator de
crescimento transformador beta 1.
ABSTRACT
Thyroid nodules are often identified in clinical practice, presenting a higher increase in the
last decades. Despite the high accuracy, the diagnosis of DTC through FNAC analysis shows
deficiencies: 15-20% of samples submitted to cytological analysis are classified as
unsatisfactory/non-diagnostic samples or lesions of undetermined significance, leading the
patient to a thyroidectomy to clarify the diagnosis. The transforming growth factor-β (TGF-β)
is a multifunctional cytokine acting on different characteristics and biological functions and
on the regulation of the immune system. Its signaling occurs through two transmembrane
receptors: type I receptor (TβRI) and type II receptor (TβRII). Several studies have reported a
disturbance or loss of TGF-β1 signaling and its receptors in cancer, as well polymorphisms in
these genes are investigated and associated with several pathologies. The aim of this work is
to investigate the utility of TGFB1, TGFBR1 and TGFBR2 genes as diagnostic and/or
prognostic markers in patients with thyroid nodules, pursuing to correlate these results with
clinical-pathological characteristics. For investigation of TGFB1 (rs1800469, rs1800472,
rs11466321, rs2241716, rs8110090), TGFBR1 (rs10512263, rs7850895) and TGFBR2
polymorphisms (rs2228048) we investigated 339 patients with malignant and benign thyroid
nodules by Taqman SNP Genotyping technique and 141 normal, malignant and benign tissue
samples were evaluated for the mRNA expression of the same genes above by qPCR. Two
polymorphisms, rs1800469 and rs1800472, of the TGFB1 gene demonstrated a correlation of
the polymorphic genotype with tumor aggressiveness characteristics such as absence of
capsule and absence of lymph node metastasis at diagnosis, respectively. The rs10512263
polymorphism of the TGFBR1 gene demonstrated association of the polymorphic genotype
with absence of invasion. The gene expression of TGFB1 was increased in malignant tissues,
as well as TGFBR1, but not TGFBR2. In conclusion, our data demonstrate that TGFB1 gene
expression may be a useful tool to aid diagnosis of benign thyroid nodules and
polymorphisms of the TGFB1 and its TGFBR1 receptor, but not TGFBR2, may help in the
prognosis of DTC patients.
Key-words: thyroid neoplasms, molecular biology, transforming growth factor beta 1.
LISTA DE ILUSTRAÇÕES
Figura 1. Taxas brutas de incidência, estimadas para 2016, das localizações primárias (exceto
pelo não melanoma), em mulheres, no Brasil ......................................................................... 23
Figura 2. Taxas brutas de incidência, estimadas para 2016, das localizações primárias (exceto
pelo não melanoma), em homens, no Brasil ............................................................................ 24
Figura 3. Representação da sinalização celular de TGF-β1 de maneira independente e
dependente das proteínas SMADs ........................................................................................... 28
Figura 4. Estrutura do gene TGFB1 e localização dos polimorfismos rs1800469, rs8110090,
rs11466321, rs2241716 e rs180072 analisados. Modificado de Cebinelli e colaboradores ....
................................................................................................................................................. 29
Figura 5. Estrutura do gene TGFBR1 e localização dos polimorfismos (rs10512263 e
rs7850890) analisados ............................................................................................................. 30
Figura 6. Estrutura do gene TGFBR2 e localização do polimorfismo (rs2228048) analisado
................................................................................................................................................. 30
Figura 7. Indivíduo homozigoto selvagem: amplificação apenas da sonda com alelo selvagem
................................................................................................................................................. 38
Figura 8. Indivíduo heterozigoto polimórfico: amplificação da sonda com alelo selvagem e
alelo polimórfico ..................................................................................................................... 38
Figura 9. Indivíduo homozigoto polimórfico: amplificação apenas da sonda com alelo
polimórfico .............................................................................................................................. 39
Figura 10. Estratificação dos indivíduos de acordo com a amplificação: o losango representa
indivíduos homozigotos selvagens, o triângulo indivíduos heterozigotos polimórficos e o
círculo indivíduos homozigotos polimórficos ......................................................................... 39
Figura 11. Distribuição genotípica do polimorfismo rs1800469 em nódulos tireoidianos
benignos e malignos ................................................................................................................ 43
Figura 12. Frequência genotípica do polimorfismo rs1800469 em nódulos tireoidianos com e
sem cápsula .............................................................................................................................. 44
Figura 13. Frequência genotípica do polimorfismo rs1800472 em nódulos tireoidianos
benignos e malignos ................................................................................................................ 46
Figura 14. Frequência genotípica do polimorfismo rs1800472 em CPVF comparados a bócio,
mPT e CPC .............................................................................................................................. 48
Figura 15. Frequência genotípica do polimorfismo rs1800472 em nódulos tireoidianos com e
sem metástase ao diagnóstico .................................................................................................. 48
Figura 16. Frequência genotípica do polimorfismo rs11466321 em nódulos tireoidianos
benignos e malignos ................................................................................................................ 50
Figura 17. Frequência genotípica do polimorfismo rs2241716 em nódulos tireoidianos
benignos e malignos ................................................................................................................ 52
Figura 18. Frequência genotípica do polimorfismo rs8110090 em nódulos tireoidianos
benignos e malignos ................................................................................................................ 55
Figura 19. Frequência genotípica do polimorfismo rs10512263 em nódulos tireoidianos
benignos e malignos ................................................................................................................ 57
Figura 20. Frequência genotípica do polimorfismo rs10512263 em nódulos tireoidianos com
e sem invasão ........................................................................................................................... 59
Figura 21. Frequência genotípica do polimorfismo rs7850895 em nódulos tireoidianos
benignos e malignos ................................................................................................................ 60
Figura 22. Frequência genotípica do polimorfismo rs2228048 em nódulos tireoidianos
benignos e malignos ................................................................................................................ 63
Figura 23. Box plot com as médias de RNAm (UA) do gene TGFB1 em nódulos benignos e
malignos e tecido normal tireoidiano e valor de p (teste de Mann-Whitney) ......................... 66
Figura 24. Curva ROC apresentando pontos de especificidade e sensibilidade da expressão de
RNAm do gene TGFB1 em nódulos tireoidianos benignos e malignos .................................. 66
Figura 25. Box plot com as média de RNAm (UA) do gene TGFB1 entre os tipos
histológicos de nódulos tireoidianos........................................................................................ 67
Figura 26. Gráfico de correlação negativa entre tamanho de tumor e expressão de RNAm do
gene TGFB1 em tumores tireoidianos benignos e malignos: tumores menores em cm
expressam maiores quantidades de RNAm (correlação de Spearman) ................................... 68
Figura 27. Box plot com as médias de RNAm (UA) do gene TGFBR1 em nódulos benignos e
malignos e tecido normal tireoidiano e valor de p (teste de Mann-Whitney) ......................... 69
Figura 28. Curva ROC apresentando pontos de especificidade e sensibilidade da expressão de
RNAm do gene TGFBR1 em nódulos tireoidianos benignos e malignos ............................... 70
Figura 29. Box plot com as média de RNAm (UA) do gene TGFBR1 entre os tipos
histológicos de nódulos tireoidianos........................................................................................ 70
Figura 30. Box plot com as média de RNAm (UA) do gene TGFBR2 em nódulos benignos e
malignos e tecido normal tireoidiano e valor de p (teste de Mann-Whitney) ......................... 72
Figura 31. Box plot com as média de RNAm (UA) do gene TGFBR2 entre os tipos
histológicos de nódulos tireoidianos........................................................................................ 73
LISTA DE TABELAS
Tabela 1. Sistema Bethesda para relatar interpretações de PAAF de tiroide: risco de
malignidade e conduta clínica recomendada (Adaptado de Ali SZ, Cibas ES) ...................... 25
Tabela 2. Comparação de valores de sensibilidade, especificidade, valor preditivo negativo
(VPN), VPP e custo final ao paciente de plataformas e sistemas disponíveis para auxiliar na
identificação de nódulos indeterminados ................................................................................ 27
Tabela 3. Características clínicas e anatomopatológicas dos 339 pacientes com nódulos
tireoidianos benignos e malignos avaliados para presença ou ausência de polimorfismos nos
genes TGFB1, TGFBR1 e TGFBR2. Os dados estão expressos em número absoluto e
porcentagem............................................................................................................................. 35
Tabela 4. Características clínicas e anatomopatológicas dos 127 pacientes com nódulos
tireoidianos benignos e malignos avaliados para expressão de RNAm dos genes TGFB1,
TGFBR1 e TGFBR2. Os dados estão expressos em número absoluto e porcentagem ............ 36
Tabela 5. Relação dos polimorfismos estudados dos genes TGFB1, TGFBR1 e TGFBR2 ...
................................................................................................................................................. 37
Tabela 6. Relação de ensaios para análise de expressão gênica dos genes TGFB1, TGFBR1 e
TGFBR2 ................................................................................................................................... 40
Tabela 7. Distribuição genotípica do polimorfismo rs1800469 em nódulos tireoidianos
benignos e malignos de acordo com o tipo histológico ........................................................... 43
Tabela 8. Valor de p (Teste exato de Fisher) para as comparações entre tipos histológicos de
nódulos tireoidianos para o polimorfismo rs1800469 ............................................................. 44
Tabela 9. Distribuição genotípica do polimorfismo rs1800469 de acordo com as
características clínicas e anatomopatológicas dos nódulos tireoidianos malignos analisados
................................................................................................................................................. 45
Tabela 10. Distribuição genotípica do polimorfismo rs1800472 em nódulos tireoidianos
benignos e malignos e de acordo com o tipo histológico ........................................................ 47
Tabela 11. Valor de p (Teste exato de Fisher) para as comparações entre tipos histológicos de
nódulos tireoidianos para o polimorfismo rs1800472 ............................................................. 47
Tabela 12. Distribuição genotípica do polimorfismo rs1800472 de acordo com as
características clínicas e anatomopatológicas dos nódulos tireoidianos malignos analisados
................................................................................................................................................. 49
Tabela 13. Distribuição genotípica do polimorfismo rs11466321 em nódulos tireoidianos
benignos e malignos de acordo com o tipo histológico ........................................................... 50
Tabela 14. Valor de p (Teste exato de Fisher) para as comparações entre tipos histológicos de
nódulos tireoidianos para o polimorfismo rs11466321 ........................................................... 51
Tabela 15. Distribuição genotípica do polimorfismo rs11466321 de acordo com as
características clínicas e anatomopatológicas dos nódulos tireoidianos malignos analisados
................................................................................................................................................. 51
Tabela 16. Distribuição genotípica do polimorfismo rs2241716 em nódulos tireoidianos
benignos e malignos e de acordo com o tipo histológico ........................................................ 53
Tabela 17. Valor de p (Teste exato de Fisher) para as comparações entre tipos histológicos de
nódulos tireoidianos para o polimorfismo rs2241716 ............................................................. 53
Tabela 18. Distribuição genotípica do polimorfismo rs2241716 de acordo com as
características clínicas e anatomopatológicas dos nódulos tireoidianos malignos analisados
................................................................................................................................................. 54
Tabela 19. Distribuição genotípica do polimorfismo rs8110090 em nódulos tireoidianos
benignos e malignos de acordo com o tipo histológico ........................................................... 55
Tabela 20. Comparações entre tipos histológicos de nódulos tireoidianos para o polimorfismo
rs8110090 ................................................................................................................................ 56
Tabela 21. Distribuição genotípica do polimorfismo rs8110090 de acordo com as
características clínicas e anatomopatológicas dos nódulos tireoidianos malignos analisados
................................................................................................................................................. 56
Tabela 22. Distribuição genotípica do polimorfismo rs10512263 em nódulos tireoidianos
benignos e malignos de acordo com o tipo histológico ........................................................... 58
Tabela 23. Valor de p (Teste exato de Fisher) para as comparações entre tipos histológicos de
nódulos tireoidianos para o polimorfismo rs10512263 ........................................................... 58
Tabela 24. Distribuição genotípica do polimorfismo rs10512263 de acordo com as
características clínicas e anatomopatológicas dos nódulos tireoidianos malignos analisados.
Tabela 25. Distribuição genotípica do polimorfismo rs7850895 em nódulos tireoidianos
benignos e malignos de acordo com o tipo histológico ........................................................... 61
Tabela 26. Valor de p (Teste exato de Fisher) para as comparações entre tipos histológicos de
nódulos tireoidianos para o polimorfismo rs7850895 ............................................................. 61
Tabela 27. Distribuição genotípica do polimorfismo rs7850895 de acordo com as
características clínicas e anatomopatológicas dos nódulos tireoidianos malignos analisados
................................................................................................................................................. 62
Tabela 28. Distribuição genotípica do polimorfismo rs2228048 em nódulos tireoidianos
benignos e malignos de acordo com o tipo histológico ........................................................... 63
Tabela 29. Comparações entre tipos histológicos de nódulos tireoidianos para o polimorfismo
rs2228048 ................................................................................................................................ 64
Tabela 30. Distribuição genotípica do polimorfismo rs2228048 de acordo com as
características clínicas e anatomopatológicas dos nódulos tireoidianos analisados ................ 64
Tabela 31. Médias de expressão do RNAm do gene TGFB1 e características
anatomopatológicas exibidas pelos nódulos malignos avaliados ............................................ 68
Tabela 32. Médias de RNAm do gene TGFBR1 entre as características anatomopatológicas
exibidas pelos nódulos malignos avaliados. ............................................................................ 71
Tabela 33. Médias de RNAm do gene TGFBR2 entre as características anatomopatológicas
exibidas pelos nódulos avaliados ............................................................................................. 73
LISTA DE ABREVIATURAS E SIGLAS
µL Microlitros
3’UTR Região 3’ não transcrita
A Adenina
AF Adenoma folicular
Akt Proteína quinase B
ATA do inglês, American Thyroid Association
AVC Acidente vascular cerebral
BM Bócio multinodular
BMT Bócio multinodular tóxico
BRAF do inglês, B-Raf proto-oncogene, serine/threonine kinase
BST2 do inglês, Bone marrow stromal antigen 2
C Citosina
CAT Carcinoma anaplásico da tireoide
cDNA DNA complementar
CDT Carcinoma diferenciado da tireoide
CFT Carcinoma folicular da tireoide
CMT Carcinoma medular da tireoide
co-SMAD do inglês, Commom-mediator SMAD
CPD Carcinoma pouco diferenciado
CPT Carcinoma papilífero da tireoide
CPVF Carcinoma papilífero de variante folicular
CT Câncer de tireoide
Ct do inglês, Threshold cycle
CTGF do inglês, Connective tissue growth factor
CXCL1 Quimiocina C-X-C motif ligand 1
CXCL12 Quimiocina C-X-C motif ligand 12
CXCL5 Quimiocina C-X-C motif ligand 5
DG Doença de Graves
DNA Ácido desoxirribonucleico
DP Desvio padrão
DPOC Doença pulmonar obstrutiva crônica
EDTA Ácido etilenodiamino tetra-acético
EMT Transição epitelial mesequimal
ERK Extracellular signal-regulated kinases
EUA Estados Unidos da América
FCM Faculdade de Ciências Médicas
G Guanina
GAPDH do inglês, Glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase
GEMOCA Laboratório de Genética Molecular do Câncer
HIF1A Fator de hipóxia induzido-1A
HRAS do inglês, HRAS proto-oncogene, GTPase
IC95% Intervalo de confiança de 95%
Ile Aminoácido isoleucina
IMC Índice de Massa Corporal
INCA Instituto Nacional do Câncer
KRAS do inglês, KRAS proto-oncogene, GTPase
LAP Peptídeo associado de latência
LIP Laboratório de Investigação em Patologia
LTBP Proteína de ligação latente do TGF-β
MAP do inglês, Mitogen-activated protein
MAPK do inglês, Mitogen-activated protein kinase
MEK do inglês, Mitogen-activated protein kinase kinase
MMP Metaloproteases de matriz
mPT Microcarcinoma papilífero da tireoide
n Número
NEM Neoplasia Endócrina Múltipla
ng Nanograma
NIFPT do inglês, Noninvasive Follicular Thyroid Neoplasm with Papillary-Like
Nuclear Features
NIS Transportador de sódio iodeto
NK Célula Natural Killer
NRAS do inglês, NRAS proto-oncogene, GTPase
OR do inglês, Odds Ratio
PAAF Punção aspirativa por agulha fina
PAX8 do inglês, Paired box 8
PBS do inglês, Phosphate-buffered saline
PCR Reação em cadeia da polimerase
PDGFB do inglês, Platelet derived growth factor subunit-β
PDM Porcentagem de densidade mamográfica
PI3K do inglês, Phosphoinositide 3-kinase
PPARγ do inglês, Peroxisome proliferator activated receptor-γ
RAF do inglês, erine/threonine kinase family
RET do inglês, Tyrosine-protein kinase receptor
RNA Ácido ribonucleico
RNAm Ácido ribonucleico mensageiro
ROC Curvas de Características de Operação do Receptor
R-SMAD do inglês, receptor-regulated SMAD
SAS do inglês, Statistical Analysis System
SNP do inglês, Single Nucleotide Polymorphism
T Timina
Tre Aminoácido treonina
Tg Tireoglobulina
TGFB1 Gene fator de transformação do crescimento-β1
TGFBR1 Gene do receptor tipo I do fator de transformação do crescimento-β1
TGFBR2 Gene do receptor tipo II do fator de transformação do crescimento-β1
TGF-β1 Proteína/citocina fator de transformação do crescimento-β1
TMA Tissue Micro Array
TNM Sistema TNM de Classificação dos Tumores Malignos
TPO Tiroperoxidase
TSH Hormônio tireoestimulante
TSH-R Receptor do hormônio tireoestimulante
TTF1 do inglês, Transcription termination factor 1
TβRI Proteína do receptor tipo I do fator de transformação do crescimento-β1
TβRII Proteína do receptor tipo II do fator de transformação do crescimento-β1
UA Unidade arbitrária
UNICAMP Universidade Estadual de Campinas
VEGF Fator de crescimento endotelial vascular
VPN Valor preditivo negativo
VPP Valor preditivo positivo
LISTA DE SÍMBOLOS
µ Micro
β Beta
™ do inglês, Trademark
® Marca registrada
γ Gama
± Mais ou menos
% Porcentagem
< Menor que
> Maior que
= Igual, igual a
+ Soma de
SUMÁRIO
1. INTRODUÇÃO .................................................................................................................................22
2. OBJETIVOS ......................................................................................................................................33
2.1 Objetivo geral ...............................................................................................................................33
2.2 Objetivos específicos ....................................................................................................................33
2.2.1 Investigação de polimorfismos dos genes TGFB1, TGFBR1 e TGFBR2 ..............................33
2.2.2 Expressão de RNAm dos genes TGFB1, TGFBR1, e TGFBR2 .............................................33
3. METODOLOGIA ..............................................................................................................................34
3.1 Casuística .....................................................................................................................................34
3.2 Análise dos polimorfismos ...........................................................................................................36
3.3 Análise da expressão de RNAm ....................................................................................................40
3.3.1 Transcrição reversa ..............................................................................................................40
3.3.1 PCR-RT – Quantificação Relativa ........................................................................................40
3.4 Análise estatística .........................................................................................................................41
4. RESULTADOS ..................................................................................................................................42
4.1 Polimorfismos ..............................................................................................................................42
4.1.1 Gene TGFB1 .............................................................................................................................42
4.1.1.1 rs1800469 ...........................................................................................................................42
4.1.1.2 rs1800472 ...........................................................................................................................45
4.1.1.3 rs11466321 .........................................................................................................................49
4.1.1.4 rs2241716 ...........................................................................................................................52
4.1.1.5 rs8110090 ...........................................................................................................................54
4.1.2 Gene TGFBR1 ...........................................................................................................................57
4.1.2.1 rs10512263 .........................................................................................................................57
4.1.2.2 rs7850895 ...........................................................................................................................60
4.1.3 Gene TGFBR2 ...........................................................................................................................62
4.1.3.1 rs2228048 ...........................................................................................................................62
4.2 Expressão gênica .........................................................................................................................65
4.2.1 Expressão de TGFB1 ............................................................................................................65
4.2.2 Expressão de TGFBR1 ..........................................................................................................69
4.2.3 Expressão de TGFBR2 ..........................................................................................................71
5. DISCUSSÃO ......................................................................................................................................74
6. RESUMO DOS ACHADOS ..............................................................................................................82
7. CONCLUSÃO ...................................................................................................................................83
8. REFERÊNCIAS .................................................................................................................................84
22
1. INTRODUÇÃO
Nódulos tireoidianos são frequentemente identificados na prática clínica,
apresentando significante aumento de incidência nas últimas décadas, em grande parte
devido ao crescente uso de técnicas de diagnóstico por imagem (1, 2). Embora mais de
90% das lesões sejam pequenas, não palpáveis e benignas, não se tornando jamais
tumores clinicamente significativos, alguns pacientes apresentam lesões malignas, que
se beneficiariam do diagnóstico precoce (3-5). Nos Estados Unidos o câncer de tireoide
(CT) é o quinto mais comum em mulheres, com estimativa anual de 62 mil casos (6).
No Brasil, estimativas de 2016 do Instituto Nacional do Câncer (INCA) colocavam o
CT na 8ª posição entre os cânceres mais frequentes em mulheres (figura 1) e em 14ª
posição no sexo masculino (figura 2) (7). O CT é sabidamente 2-4 vezes mais incidente
em mulheres (8), com média de idade de 45 e 50 anos (9).
Figura 1. Taxas brutas de incidência, estimadas para 2016, das localizações
primárias (exceto pelo não melanoma), em mulheres, no Brasil (7).
23
Figura 2. Taxas brutas de incidência, estimadas para 2016, das localizações
primárias (exceto pelo não melanoma), em homens, no Brasil (7).
O carcinoma diferenciado da tireoide (CDT) representa mais de 95% dos
nódulos malignos derivados do epitélio folicular. O carcinoma papilífero da tireoide
(CPT) do tipo clássico ou outras variantes (folicular, células altas, esclerosante difusa,
colunar) representam mais de 80% do CDT, com maior incidência em mulheres em
idade média de 45 anos, apresentando excelente prognóstico e taxa de sobrevida em 10
anos acima de 95% (10, 11); no entanto, 20-50% dos pacientes com CPT apresentam
metástase linfonodal cervical (12, 13). O carcinoma folicular da tireoide (CFT)
representa 10% ou menos dos carcinomas diferenciados, sendo os pacientes
diagnosticados em idade avançada, geralmente em estadios mais avançados e piores tem
taxas de sobrevida (14).
Ao longo dos anos, diversas variantes microscópicas do CPT tem sido descritas.
O maior acesso da população ao sistema de saúde, o aumento do número de exames de
imagem e o grande avanço tecnológico que tem aumentado significativamente a
sensibilidade de exames como a ultrassonografia cervical, vem tornando o
microcarcinoma papílifero (mPT) uma das variantes mais comuns do CPT. Esses
tumores, menores que 1 cm, são encontrados em mais de 10% da população norte-
americana apresentando excelente prognóstico sem necessidade de intervenção cirúrgica
(15-17). Outra variante de baixo risco é a variante folicular encapsulada do CPT,
recentemente renomeada para NIFTP (18), do inglês Noninvasive Follicular Thyroid
24
Neoplasm with Papillary-Like Nuclear Features. Na ausência de invasão capsular ou
vascular estes são tumores indolentes com baixo risco de metástase local ou à distância
(19-21).
Por outro lado, o carcinoma anaplásico de tireoide (CAT) é uma forma agressiva
do CT e representa um desafio clínico e terapêutico devido à raridade da doença (<1%)
(22) e do seu alto índice de mortalidade (23, 24). É mais frequente em mulheres acima
dos 50 anos (22) e cerca de metade dos pacientes com CAT apresentam CDT anterior
ou coexistente, frequentemente associados à perda da proteína TP53 (25). Pacientes
com CAT geralmente apresentam invasão local generalizada e alta frequência de
metástases à distância nos pulmões, pleura, osso e cérebro (26). Também não se pode
deixar de mencionar o CDT que se torna pouco responsivo à terapia clássica, ou seja, os
tumores de tireoide que perdem diferenciação celular e que vem sendo descritos em
proporção estável ou talvez mesmo crescente (2).
O carcinoma medular da tireoide (CMT), embora faça parte do espectro do CT e
seja de diagnóstico diferencial obrigatório, é um tumor diferente do CDT; deriva-se das
células C neuroendócrinas e representa menos de 5% das neoplasias tireoidianas (27).
Oitenta por cento dos casos de CMT são esporádicos, observados em pacientes com
idade entre 60 e 70 anos, apresentando metástases linfonodais em metade dos pacientes
e metástase à distância em 10-20% dos casos (28); o restante dos pacientes possuem
síndromes tumorais hereditárias como Neoplasia Endócrina Múltipla (NEM) tipo 2 A
ou B, ou o carcinoma medular familiar (29). Todas as formas familiares da doença são
herdadas de forma autossômica dominante, com mutações no proto-oncogene RET,
detectável em 98% dos membros da família afetados (30, 31).
Entre os nódulos benignos, a lesão mais comum é o bócio, que consiste do
aumento da glândula tireoidiana, podendo ser endêmico, quando em áreas deficientes de
iodo, ou esporádico. Também são relativamente frequentes os adenomas foliculares
(AF) lesões de origem epitelial, bem encapsuladas, que não apresentam invasão de
tecidos adjacentes ou metástases (32).
O diagnóstico do CDT é dado através da análise citológica obtida pela punção
aspirativa por agulha fina (PAAF) guiada por ultrassom. A amostra é classificada de
acordo com as categorias do sistema Bethesda, recentemente modificado para
incorporar, entre outras novidades, o diagnóstico de NIFPT (Tabela 1). Apesar de
25
apresentar alta acurácia (95%) (33), em torno de 14% (34) dessas amostras são
classificadas na categoria IV (suspeito para neoplasia folicular), com taxa de risco de
malignidade de até 40%, ou V (suspeito para malignidade), onde a taxa de risco pode
chegar a 75% e o manejo clínico indicado, em ambas as categorias, é a cirurgia,
segundo último consenso da American Thyroid Association (ATA) (35). Após análise
histológica, apenas 25% desses nódulos, anteriormente classificados em categoria IV,
são, de fato, malignos (33, 36). De 15-20% das amostras submetidas à análise citológica
são classificadas como amostras insatisfatórias ou não diagnósticas (categoria I) ou
lesões de significado indeterminado (categoria III) e então os pacientes são orientados a
realizar um novo exame ou a fazer uma tireoidectomia para esclarecer o diagnóstico
(37).
Tabela 1. Sistema Bethesda para relatar interpretações de PAAF de tiroide: risco
de malignidade e conduta clínica recomendada (Adaptado de Ali SZ, Cibas ES). (38,
39)).
Categoria
diagnóstica
Risco de
malignidade –
NIFTP ≠ CA
Risco de
malignidade –
NIFTP = CA
Conduta clínica
(I) Não diagnóstico
ou insatisfatório
5-10% 5-10% Repetir PAAF
(II) Benigno
0-3% 0-3%
Acompanhamento
clínico
(III) Atipias de
significado
indeterminado ou
Lesão folicular de
significado
indeterminado
6-18% ~10-30%
Repetir PAAF, teste
molecular, ou
lobectomia
(IV) Suspeito para
neoplasia folicular
10-40% 25-40% Teste molecular,
lobectomia
(V) Suspeito para
malignidade
45-60% 50-75% Tireoidectomia ou
lobectomia
(VI) Maligno
94-96% 97-99%
Tireoidectomia ou
lobectomia
26
Apesar do número de mutações encontradas no CDT ser baixo, comparados a
outros tipos de tumor, essas mutações são frequentemente associadas ao seu fenótipo e
podem ser úteis no diagnóstico de nódulos indeterminados. Já existem alguns
marcadores moleculares bem estabelecidos para o CDT e que podem auxiliar no seu
diagnóstico e/ou prognóstico.
A mutação BRAF V600E está presente em 40-50% dos CPT e relacionada com
fenótipo mais agressivo da doença (40, 41). Essa mutação acarreta o aumento da
atividade da BRAF quinase, uma serina/treonina codificada pelo gene BRAF e
pertencente à via da MAPK (RAS–RAF–MEK–ERK–MAP) importante na mediação da
resposta celular a fatores de crescimento (42). Ainda no CPT, o rearranjo cromossômico
RET/PTC1 está frequentemente associado ao tipo clássico e metástases linfonodais,
enquanto que RET/PTC3 é mais comum em CPT de variante sólida (43-45). O gene
RET codifica um receptor transmembrana tirosina quinase envolvido na transdução de
sinal intracelular (46) e sua ativação estimula vias, como MAPK e PI3K, que promovem
o crescimento, proliferação, sobrevivência e diferenciação celular (47).
Em lesões foliculares o rearranjo mais frequente é o PAX8/PPARγ (48-50). É
descrito em 30-40% dos CFT (51, 52), 38% dos CPT de variante folicular (CPVF) (52)
e tem sido associado com multifocalidade e invasão vascular (49, 53). A detecção do
rearranjo em lesões foliculares na PAAF não indica por si só malignidade, já que
também é observado em AF (2-13%) (51, 52), mas sugere que a presença de invasão
vascular e/ou capsular deve ser explorada (48). Também são indicadores de prognóstico
em lesões foliculares mutações em genes da família RAS; os genes HRAS, KRAS e
NRAS estão envolvidos na proliferação, sobrevivência e apoptose celular e participam
de vias importantes para a carcinogênese tireoide como RAS/Raf/MEK/ERK e
PI3K/Akt (54, 55). Estudos recentes demonstram que mutações de RAS não são
suficientes para a modificação da conduta clínica dos nódulos tireoidianos
indeterminados (56), porém essas mutações têm-se mostrado importantes para NIFTPs.
Paulson et al (57) mostraram que mais de 50% de sua casuística com mutações nos
genes RAS eram NIFPTs e sugerem que uma lobectomia deva ser considerada como
abordagem cirúrgica para nódulos indeterminados pela PAAF e que apresentem
positividade para mutação RAS. Descrito mais recentemente, mutações no gene TERT
estão frequentemente associadas com CFT e CPVF e relacionadas a formas agressivas
27
da doença (58, 59). Combinadas com mutações como BRAF V600E aumentam as
chances de recorrência (60).
O uso de plataformas, em que se utiliza da combinação de expressão gênica e/ou
busca por mutações, não exclusivamente dos genes supracitados, pode melhorar o valor
preditivo positivo (VPP) e então ser útil para determinar a extensão da cirurgia e
intensidade do tratamento que o paciente deve receber. Grande parte dessas plataformas
apresentam ótimos valores de especificidade e valor preditivo negativo (VPN) e são,
portanto, úteis na exclusão de malignidade (tabela 2). No entanto, ainda possuem
algumas limitações e são de altíssimo custo para o paciente e para o sistema público de
saúde (tabela 3).
Tabela 2. Comparação de valores de sensibilidade, especificidade, valor
preditivo negativo (VPN), VPP e custo final ao paciente de plataformas e sistemas
disponíveis para auxiliar na identificação de nódulos indeterminados.
Sensibilidade Especificidade VPN VPP
Custo
(em dólar)
Seven-gene panel (61) 63% 99% 94% 88% -
ThyroSeq v2®
(62) 91% 92% 97% 77% $3200
Afirma (63) 92% 52% 93% 47% $475-4875
Rosetta microRNA classifier™ (64) 85% 72% 91% 59% $3000
ThyGenX® and ThyraMIR™ (65) 89% 85% 94% 74% $1675-3300
O fator de transformação do crescimento-β (TGF-β) é uma citocina
multifuncional que atua em diferentes e importantes funções biológicas como
replicação, diferenciação, migração celular, apoptose, angiogênese e regulação do
sistema imune (66, 67). Existem três isoformas homólogas (TGF-β1, TGF-β2 e TGF-
β3) em mamíferos, sendo TGF-β1 a mais expressa (67, 68). É uma proteína dimérica
extracelular produzida, principalmente, por células T regulatórias, plaquetas,
macrófagos, neutrófilos, osso, tecidos moles, células renais tubulares e também por
células neoplásicas malignas (69, 70).
TGF-β1 é sintetizado em sua forma precursora; o composto de 390 resíduos
compreende as regiões do peptídeo de sinal N-terminal, a região do peptídeo associado
de latência (LAP) e a região C-terminal que corresponde ao TGF-β1 maduro em si (71,
28
72). Esse complexo latente TGF-β/LAP se encontra ligado a outra proteína conhecida
como proteína de ligação latente do TGF-β (LTBP), e mantém o TGF-β1 em sua forma
inativa impedindo sua interação com seus receptores (73, 74). No ambiente extracelular,
esse complexo latente pode ser clivado por uma série de proteases, como por exemplo,
as metaloproteases de matriz (MMP) 2 e 9, para liberar o TGF-β1 ativo (73).
A sinalização do TGF-β1 (figura 3) acontece através de dois receptores
transmembrana de atividade serina/treonina quinase: o receptor tipo I (TβRI) e o
receptor tipo II (TβRII) (75). O TGF-β1 se liga ao receptor TβRII, e este, por sua vez,
recruta e ativa o receptor TβRI (76). A fosforilação do TβRI leva à fosforilação
downstream subsequente ativando as SMADs, proteínas citoplasmáticas e importantes
fatores de transcrição, que propagam, então, a sinalização até o núcleo (77, 78). No
entanto, a ativação dos receptores do TGF-β1também pode ocorrer por vias conhecidas
como SMAD-independentes, envolvendo vias como MAPK e Akt (79).
Figura 3. Representação da sinalização celular de TGF-β1 de maneira
independente e dependente das proteínas SMADs (80).
O gene TGFB1 está localizado no braço longo do cromossomo 19, posição 13.2,
e é constituído de 7 éxons e 6 longas regiões intrônicas (81). O éxon 1 codifica a região
5’ não transcrita (do inglês 5’UTR), o peptídeo de sinal e parte do LAP que se estende
29
até porção inicial do éxon 5; o restante do éxon 5 ao éxon 7 codifica o TGF-β1 maduro
em si (82, 83). Polimorfismos neste gene são frequentemente investigados e associados
a diversas patologias, porém seu papel no CDT ainda é pouco explorado.
O polimorfismo rs1800469 está localizado na região de regulação negativa 1 do
gene TGFB1, e poderia, assim, afetar a ligação de fatores de transcrição (84). Consiste
na troca de citosina (C) por timina (T), sendo o genótipo alterado (TT) já relacionado
com o aumento de expressão de RNAm (85, 86). Também no gene TGFB1, o
polimorfismo rs1800472 está localizado no éxon 5 e próximo ao sítio de clivagem do
LAP, o que poderia afetar a ativação do TGF-β1 (82). Consiste na troca de C por T, e
apesar de resultar na troca de aminoácidos, treonina [Tre] por uma isoleucina [Ile], não
existem estudos que reportem alterações ou distúrbios na função da proteína na presença
deste polimorfismo (87). Os outros três polimorfismos escolhidos, deste mesmo gene,
estão localizados em regiões intrônicas, que sabemos hoje serem regiões extremamente
importantes do genoma e com importantes funções na regulação do splicing alternativo
e da expressão gênica (88). O polimorfismo rs11466321 está localizado na primeira
região intrônica do gene TGFB1 e consiste na troca de T por C, o polimorfismo
rs2241716 resulta na troca de guanina (G) por adenina (A) e o polimorfismo rs8110090
a troca de A por G (89).
Figura 4. Estrutura do gene TGFB1 e localização dos polimorfismos rs1800469,
rs8110090, rs11466321, rs2241716 e rs180072 analisados. Modificado de Cebinelli e
colaboradores (87).
Os receptores de TGFB1, TGFBR1 (ou ALK5) e TGFBR2, estão localizados nas
regiões cromossômicas 9q22.33 e 3p24.1, respectivamente (90, 91). Foram selecionados
no gene TGFBR1 o polimorfismo rs10512263, um polimorfismo intrônico e resultado
30
da troca de T por C, e o polimorfismo rs7850895, polimorfismo localizado na região 3’
não transcrita (do inglês 3’UTR) do gene e troca de C por T (figura 5). Hipoteticamente,
este último polimorfismo poderia interferir na estabilidade do RNAm e na sua tradução,
pois está localizado numa região de adição da cauda Poli(A); essa cauda de 50 a 250
nucleotídeos adenina é inserida para conferir estabilidade e maior tempo de
disponibilidade ao RNAm (92). O polimorfismo rs228048 está localizado no éxon 3 do
gene TGFBR2 (figura 6) e consiste na troca de C por T, resultando em mutação
sinônima (Asp389Asp) , ou seja, sem mudança de aminoácido (89).
Figura 5. Estrutura do gene TGFBR1 e localização dos polimorfismos
(rs10512263 e rs7850890) analisados.
Figura 6. Estrutura do gene TGFBR2 e localização do polimorfismo
(rs2228048) analisado.
Diversos estudos têm reportado a perturbação ou perda da sinalização de TGF-
β1 e seus receptores no câncer (93, 94). De maneira geral, o TGF-β1 é conhecido por ter
um papel duplo na carcinogênese, agindo tanto na supressão tumoral quanto em sua
progressão. Seu efeito supressor é constantemente observado em células epiteliais
normais e carcinomas em estágio inicial, condizendo com suas funções normais de
inibição da proliferação celular e indução de apoptose. Fatores genéticos e epigenéticos,
não muito bem elucidados, fazem a inversão dessas funções, que juntamente com a
31
imunossupressão e indução da transição epitelial mesenquimal (do inglês EMT)
promovem a progressão tumoral (95, 96). Na tireoide, o TGF-β1 é secretado pelas
células tireodianas, trabalhando para a manutenção e diferenciação da célula tireoidiana
normal, e também reprimindo a expressão de tiroglobulina (Tg) e do transportador de
sódio-iodeto (NIS). Similar ao que acontece em outros tecidos, o aparecimento de
células neoplásicas perturba o funcionamento normal de TGF-β1, estas perdem a
sensibilidade ao fator inibitório da citocina, ajudando, assim, na progressão do tumor
(97-99).
Importante também no sistema imune, TGF-β1 é responsável por suprimir a
atividade citotóxica dos linfócitos T e promover a diferenciação destas em células T
reguladoras, que produzem e secretam TGF-β1, assim como por promover o
recrutamento de células da imunidade inata para sítios de interesse (100). Uma das
funções mais notáveis do TGF-β1 é a diferenciação de macrófagos para o fenótipo M2,
macrófagos de atividade pró-tumorigênica (101). Mais recentemente foi demonstrado
que o mesmo ocorre com outros tipos de células imunológicas: neutrófilos expostos ao
TGF-β1 adquiriam perfil pró-tumorigênico (N2), enquanto que a inibição da sinalização
de TGF-β1 modificava o fenótipo destes para anti-tumorigênico (N1) (102). Em relação
às células natural killers (NK), TGF-β1 inibe sua maturação e portanto, prejudica a
identificação e eliminação de células tumorais por essa população de células em
específico (103). De fato, tumores primários estão frequentemente, e densamente,
infiltrados por células do sistema imune inato e adquirido (104). O recrutamento destas
células pelo TGF-β1 é capaz de modificar o microambiente tumoral e torná-lo
suscetível à progressão do tumor (100).
O receptor TβRII é o primeiro a ser recrutado para auxiliar na sinalização de seu
ligante TGF-β1, sendo essencial para a ativação do outro receptor TβRI (75). O TβRI
ativado propaga o sinal até o núcleo através da fosforilação das SMADs 2 e 3
(conhecidas como receptor-regulated SMADs ou R-SMAD), que interagem com a
SMAD 4 (common-mediator SMAD ou co-SMAD) formando um complexo capaz de
atingir o núcleo e, então, modular a transcrição de genes alvos (75). No câncer, a
ativação do receptor TβRI tem sido relacionado com a angiogênese. Em tecidos
malignos, este receptor induz a expressão de MMP que causam a degradação da matriz
extracelular e então facilita o acesso de citocinas e fatores de crescimento a seus
receptores, como o próprio TGF-β1 e o fator de crescimento endotelial vascular
32
(VEGF), que induzem o aumento da angiogênese e a invasão tumoral (105, 106). No
caso do TβRII, a perda de expressão do gene TGFBR2 está relacionada ao aumento de
expressão e recrutamento de quimiocinas associadas a um pior prognóstico no câncer,
como CXCL1 e CXCL5 (107, 108).
No CDT, a expressão de TGFB1 e seus receptores tem sido investigada ao longo
dos anos, em sua grande maioria, por análises de imunoistoquímica. Trabalhos que
reportam valores de RNAm expressos são mais recentes, mas padecem do número
relativamente pequeno de casos avaliados. Assim, neste trabalho, visamos investigar o
potencial diagnóstico e prognóstico dos genes TGFB1, TGFBR1 e TGFBR2 no CDT,
avaliando polimorfismos presentes nestes genes, assim como os níveis de expressão de
RNAm destes.
33
2. OBJETIVOS
2.1 Objetivo geral
Investigar a utilidade dos genes TGFB1, TGFBR1 e TGFBR2 como marcadores
de diagnóstico e/ou prognóstico em pacientes com nódulos tireoidianos benignos e
malignos, buscando correlacionar os resultados com características clínico-patológicas.
2.2 Objetivos específicos
2.2.1 Investigação de polimorfismos dos genes TGFB1, TGFBR1 e TGFBR2:
- A distribuição genotípica destes é diferente em pacientes com nódulos
malignos ou benignos da tireoide?
- A herança de genótipos específicos destes polimorfismos modifica a
suscetibilidade para nódulos malignos ou benignos da tireoide?
- A herança de genótipos específicos destes polimorfismos se associa com algum
tipo histológico em particular?
- Essa herança se correlaciona com as características clínico-patológicas dos
pacientes?
2.2.2 Expressão de RNAm dos genes TGFB1, TGFBR1, e TGFBR2:
- É diferente entre nódulos malignos e benignos da tireoide, ou entre os tipos
histológicos analisados?
- Essa expressão se correlaciona com as características clinico-patológicas dos
pacientes?
- A herança de genótipos específicos dos polimorfismos estudados modula a
expressão destes genes e se diferenciam entre os nódulos malignos ou benignos da
tireoide?
34
3. METODOLOGIA
3.1 Casuística
Este é um estudo retrospectivo e aprovado pelo Comitê de Ética em Pesquisa da
Faculdade de Ciências Médicas (FCM), da UNICAMP (CAAE:
53581416.3.0000.5404). As amostras utilizadas neste estudo são advindas do
Biorrepositório do Laboratório de Genética Molecular do Câncer (GEMOCA), da
FCM/UNICAMP. Foram utilizadas amostras de DNA e RNA já extraídas de tecido a
fresco ou parafinado.
Todos os pacientes incluídos neste projeto possuem um prontuário no qual
constam, além dos dados de identificação, a idade ao diagnóstico, sexo, uso de
medicamentos, exames realizados (incluindo ultrassom, pesquisa de corpo inteiro com
Iodo131, Raio-X e outros exames de imagem, TSH sérico, medidas de tireoglobulina
[Tg] e biópsia aspirativa) dados clínicos pré-cirúrgicos, dados referentes à cirurgia e
dados do exame anatomopatológico (medida do tumor, tipo histológico, grau de
diferenciação, presença de linfonodos metastáticos).
Para a análise dos polimorfismos foram utilizadas 339 amostras de DNA de
pacientes com nódulos benignos e malignos da tireoide, o tempo de seguimento destes
pacientes foi de 100,3±41,7 meses. Para a análise de expressão do RNAm foram
utilizadas 127 amostras de RNA de pacientes com nódulos benignos e malignos da
tireoide com tempo de seguimento de 100,9±42,9 meses e 14 amostras de tecido normal
contralateral. As características clínicas e anatomopatológicas avaliadas nas casuísticas
de polimorfismo e RNAm estão descritas nas tabelas abaixo (tabela 3 e 4,
respectivamente). Poucos pacientes exibiam dados de evolução, o que invalidou
qualquer análise de seguimento.
35
Tabela 3. Características clínicas e anatomopatológicas dos 339 pacientes com
nódulos tireoidianos benignos e malignos avaliados para presença ou ausência de
polimorfismos nos genes TGFB1, TGFBR1 e TGFBR2. Os dados estão expressos em
número absoluto e porcentagem.
Características clínicas e
anatomopatológicas
n (%)
Benignos
(n= 177)
Malignos
(n= 162)
Bócio
(n=120)
AF
(n=58)
mPT
(n=58)
CPC
(n=88)
CPVF
(n=13)
CAT
(n=03)
Idade em anos (média±DP) 52,0±14,0 43,7±12,9 42,2±11,3 40,0±13,5 50,6±18,4 79,3±1,5
Gênero Feminino 106 (89) 52 (90) 45 (76) 70 (80) 12 (92) 03 (100)
Masculino 13 (11) 06 (10) 13 (23) 18 (20) 01 (08) 00 (00)
Tamanho do tumor em cm
(média±DP) 2,31±1,4 1,80±1,0 0,64±0,2 1,89±1,0 2,20±1,4 3,26±3,2
Tireoidite Ausente 89 (74) 38 (66) 27 (47) 42 (48) 10 (77) 02 (67)
Presente 24 (20) 16 (28) 18 (31) 31 (35) 01 (08) 01 (33)
Multifocalidade Ausente - - 36 (61) 56 (67) 07 (54) 03 (100)
Presente - - 15 (27) 26 (30) 06 (46) 00 (00)
Cápsula Ausente - - 29 (49) 48 (55) 09 (69) 03 (100)
Presente - - 11 (20) 17 (19) 04 (31) 00 (00)
Invasão Ausente - - 40 (69) 45 (51) 10 (77) 01 (33)
Presente - - 15 (25) 30 (34) 03 (23) 02 (67)
Metástase ao
diagnóstico
Ausente - - 38 (66) 45 (51) 11 (85) 01 (33)
Presente - - 08 (14) 25 (28) 02 (16) 02 (67)
36
Tabela 4. Características clínicas e anatomopatológicas dos 127 pacientes com
nódulos tireoidianos benignos e malignos avaliados para expressão de RNAm dos genes
TGFB1, TGFBR1 e TGFBR2. Os dados estão expressos em número absoluto e
porcentagem.
Características clínicas e
anatomopatológicas
n (%)
Benignos
(n= 80)
Malignos
(n= 47)
Bócio
(n=54)
AF
(n=26)
mPT
(n=12)
CPT
(n=35)
Idade em anos (média±DP) 49,6±14,3 42,0±12,0 39,7,2±9,0 36,9±11,6
Gênero Feminino 47 (87) 22 (85) 11 (92) 27 (77)
Masculino 07 (13) 04 (15) 01 (08) 08 (23)
Tamanho do tumor em cm
(média±DP) 2,35±1,47 1,80±1,10 0,67±0,18 1,84±0,83
Tireoidite Ausente 37 (69) 16 (62) 09 (75) 26 (74)
Presente 16 (30) 09 (38) 03 (25) 09 (26)
Multifocalidade Ausente - - 06 (50) 25 (71)
Presente - - 06 (50) 10 (29)
Cápsula Ausente - - 11 (92) 29 (83)
Presente - - 01 (08) 06 (17)
Invasão Ausente - - 08 (67) 17 (49)
Presente - - 04 (33) 18 (51)
Metástase ao
diagnóstico
Ausente - - 10 (83) 22 (63)
Presente - - 02 (17) 13 (37)
3.2 Análise dos polimorfismos
Para a identificação do perfil genético dos pacientes utilizamos a técnica
TaqMan® SNP Genoptyping (Applied Biosystems™) em placas específicas para o
equipamento 7500 Real Time PCR system (Applied Biosystems™, Foster City, EUA).
A técnica de PCR do sistema TaqMan™ (Applied Biosystems™, Foster City, EUA) é
constituída por um par de primers, com uma sonda para cada alelo. Este sistema
apresenta assays já certificados pela empresa, de modo que serão utilizados os
TaqMan® Pre-Designed SNP Genotyping Assays (Applied Biosystems™, Foster City,
EUA).
Os polimorfismos investigados estão relacionados na tabela a seguir (tabela 5), e
foram determinados a partir da revisão de literatura e pelo haplotype tagging, usando o
software HaploView via HapMap (International HapMap Project). Foram escolhidos
37
polimorfismos que apresentavam evidência na literatura e/ou não apresentavam
desequilíbrio de ligação.
Para esta técnica, foi realizada a diluição do DNA em uma concentração igual a
10ng/μL. Para evitar resultados falso-positivos utilizamos água ao invés de DNA como
controle negativo na reação. O volume final utilizado em cada solução foi de 7μl,
contendo 20ng de DNA da amostra, 3,5μl de Taqman™ Genotyping Master Mix
(concentração final 1X), 0,175μl do ensaio (sonda e primers) para a concentração de
40x (concentração final de 1x) e 1,325μl de água milli-Q. Os seguintes ciclos foram
utilizados na PCR: a fase inicial de desnaturação foi de dez minutos a 95°C, seguida por
50 ciclos de 92°C por 15 segundos, 60°C por 90 segundos. O software utilizado para a
análise foi “Sequence Detection Software”, versão 1.3 (Applied Biosystems™, Foster
City, EUA). A amplificação das sondas nos permite classificar os indivíduos como
homozigotos selvagens (figura 7), heterozigotos polimórficos (figura 8) e homozigotos
polimórficos (figura 9), como demonstrado na figura abaixo (figura 10).
Tabela 5. Relação dos polimorfismos estudados dos genes TGFB1, TGFBR1 e
TGFBR2.
Gene Polimorfismo Código Tipo Troca
TGFB1
rs1800469 C___8708473_10 Intron [G/A]
rs1800472 C___8708464_20 Éxon 5 [G/A]
rs11466321 C_175953824_10 Intron [A/G]
rs2241716 C__15873887_10 Intron [C/T]
rs8110090 C__31639699_10 Intron [A/G]
TGFBR1
rs10512263 C___1413398_10 Intron [C/T]
rs7850895 C__29248567_20 3’ UTR [T/C]
TGFBR2 rs2228048 C__16170446_10 Éxon 3 [C/T]
38
Figura 7. Indivíduo homozigoto selvagem: amplificação apenas da sonda com
alelo selvagem.
Figura 8. Indivíduo heterozigoto polimórfico: amplificação da sonda com alelo
selvagem e alelo polimórfico.
39
Figura 9. Indivíduo homozigoto polimórfico: amplificação apenas da sonda com
alelo polimórfico.
Figura 10. Estratificação dos indivíduos de acordo com a amplificação: o
losango representa indivíduos homozigotos selvagens, o triângulo indivíduos
heterozigotos polimórficos e o círculo indivíduos homozigotos polimórficos.
40
3.3 Análise da expressão de RNAm
3.3.1 Transcrição reversa
As amostras de RNA foram quantificadas por espectrofotometria Picodrop
(Picodrop, Hinxton, Reino Unido). E então, para obtenção da fita de cDNA, as amostras
foram submetidas à reação de transcrição reversa utilizando-se o kit High-Capacity
cDNA Reverse Transcription (Applied Biosystems™), de acordo com as orientações do
fabricante.
Foram utilizados para cada amostra: 2μl de Buffer RT 10X, 0,8μl de dNTP Mix
25X (100mM), 2,0μl de Randon Primers RT, 1 μl de MultiScribe™ Reverse
Transcriptase (50 U/μL), 1-2μg do RNA (volume variável de RNA conforme
quantificação) e água para um volume final de 20μl. As amostras foram amplificadas
em termociclador (Applied Biosystems™) com ciclos de 25°C por 10 minutos, 37°C
por 120 minutos, 85°C por 5 minutos. As amostras de cDNA foram diluídas para uma
concentração final de 10ng/µl.
3.3.1 PCR-RT – Quantificação Relativa
A quantificação relativa foi realizada por PCR em tempo real utilizando ensaios
de expressão gênica TaqMan™ com sondas inventariadas (tabela 6).
Tabela 6. Relação de ensaios para análise de expressão gênica dos genes
TGFB1, TGFBR1 e TGFBR2.
Gene Assay
TGFB1 Hs00998133_m1
TGFBR1 Hs00610320_m1
TGFBR2 Hs00234253_m1
As reações foram feitas em triplicata, utilizando para cada reação: 6,0μl de
TaqMan Gene Expression PCR Master Mix (concentração final de 2x), 0,3μl do ensaio
(sonda e primers), 1,7μl de água milli-Q e 4μl de cDNA, totalizando volume final de
12,0 μl. Os seguintes ciclos foram utilizados na PCR: 50°C por 2 minutos, 95°C por 10
minutos, 45 ciclos de 95°C por 15 segundos e 60°C por 1 minuto. Pela análise do Ct no
programa 7500 System SDS Software (Applied Biosystems, Foster City, EUA) e o
41
cálculo 2-ΔΔCt
(109), foram obtidos os valores de fold-change que refletem a expressão
do gene alvo no tecido. Os resultados da expressão de RNAm foram comparados
tomando esta expressão como uma variável quantitativa (medida em Unidades
Arbitrárias – UA).
A quantificação relativa descreve a diferença de expressão do gene alvo no
tecido de interesse em relação ao controle. O GAPDH foi escolhido como gene controle
endógeno e o tecido controle utilizado foi o tecido tireoidiano normal.
3.4 Análise estatística
As análises estatísticas foram realizadas pelos softwares SAS System for
Windows (Statistical Analysis System), versão 9.4 (SAS Institute Inc, 2002-2008, Cary,
NC, USA) e MedCalc® for Windows, versão 17.9.7 (MedCalc Software, 1993-2017,
Ostend, Belgium).
Para descrever o perfil da amostra, segundo as variáveis em estudo, foram feitas
tabelas de frequência das variáveis categóricas com valores de frequência absoluta (n) e
percentual (%), e estatísticas descritivas das variáveis numéricas com valores de média,
desvio padrão, valores mínimo e máximo, e mediana.
Para avaliação da relação entre as variáveis categóricas, a conclusão clínica,
polimorfismos ou expressão gênica foi utilizado o teste Qui-quadrado, e quando
necessário o teste exato de Fisher. Para avaliação da relação entre as variáveis
categóricas e as variáveis numéricas foram utilizados os testes de Mann-Whitney e
Kruskal-Wallis. Para avaliação da relação entre as variáveis numéricas foi utilizado o
coeficiente de correlação Spearman. Para avaliação do potencial diagnóstico da
expressão de RNAm foi utilizado o teste de Curva ROC.
Foi realizado o teste de equilíbrio de Hardy-Weinberg para as amostras de
polimorfismos e todos os polimorfismos analisados estavam em equilíbrio (p>0,05)
O nível de significância adotado para este estudo foi de 5%.
42
4. RESULTADOS
4.1 Polimorfismos
Foi realizada a genotipagem de 339 pacientes com nódulos tireoidianos, sendo
177 casos benignos e 162 malignos. Estes pacientes foram seguidos por uma média de
100,3±41,7 meses. A idade média dos pacientes foi de 45,8±14,6 anos e 85% eram do
sexo feminino.
A média de idade de pacientes com nódulos benignos foi de 49,3±14,1 anos e
dos pacientes com nódulos malignos de 42,4±14,2 anos (p<0,0001). O teste exato de
Fisher mostrou que existe diferença na distribuição de homens e mulheres nos grupos
malignos e benignos (p=0,0228), com um OR de 0.4885 sugerindo que mulheres teriam
menor chance de terem tumores malignos.
Em relação às características anatomopatológicas do tumor, tumores benignos
eram maiores que os tumores malignos (2,12±1,30 versus 1,47±1,15, p<0,0001). A
porcentagem de nódulos malignos associados com tireoidite foi maior que a de benignos
(p=0,0078). Características de agressividade como multifocalidade foi presente em
apenas 29% dos casos, invasão em 31% e metástase ao diagnóstico em 23%, contudo
um terço dos nódulos malignos eram encapsulados.
4.1.1 Gene TGFB1
4.1.1.1 rs1800469
Cerca de 40% dos indivíduos genotipados para o polimorfismo rs1800469 eram
homozigotos selvagens para o genótipo GG, 46% heterozigotos polimórficos (AG) e
14% homozigotos polimórficos (AA). As frequências genotípicas foram similares entre
nódulos malignos e benignos (figura 11), assim como entre os tipos histológicos (tabela
7), não se correlacionando com nenhum tipo histológico analisado (tabela 8).
43
Figura 11. Distribuição genotípica do polimorfismo rs1800469 em nódulos
tireoidianos benignos e malignos (teste exato de Fisher).
Tabela 7. Distribuição genotípica do polimorfismo rs1800469 em nódulos
tireoidianos benignos e malignos de acordo com o tipo histológico.
Tipo histológico
n (%)
Genótipos
GG AG+AA
Benignos
Bócio
(n=118) 46 (39) 72 (61)
AF
(n=58) 26 (45) 32 (55)
Total 72 63
Malignos
mPT
(n=56) 23 (41) 33 (59)
CPC
(n=88) 35 (40) 53 (60)
CPVF
(n=13) 04 (31) 09 (69)
CAT
(n=03) 01 (33) 02 (67)
Total 104 97
0
20
40
60
80
100
Benignos Malignos
41 39
59 61
rs1800469
GG AG+AA
p=0,8239
44
Tabela 8. Valor de p (Teste exato de Fisher) para as comparações entre tipos
histológicos de nódulos tireoidianos para o polimorfismo rs1800469.
Versus CDT CPVF CPC mPT AF Bócio
Bócio 1,0000 0,7653 1,0000 0,8686 0,5153 -
AF 0,5037 0,5359 0,6082 0,7090 -
mPT 0,8648 0,5469 1,0000 -
CPC - 0,7615 -
CPVF - -
CDT -
Legenda: CDT carcinoma diferenciado (CPC+CPVF).
Em relação às características clínicas (tabela 9), foi observada fraca correlação
entre a presença de pelo menos um alelo polimórfico (AG+AA) e o sexo feminino
(p=0,0414). Para características anatomopatológicas, a frequência dos genótipos
alterados foi maior em tumores não encapsulados, onde portadores dos genótipos AG ou
AA possuíam 3 vezes mais chance de terem tumores tireoidianos sem cápsula (OR
3.232, IC95%: 1.366 - 7.647, p=0,0097) (figura 12). Contudo, essa associação não se
repetiu na análise por alelo (A versus G, p=0,0610).
Figura 12. Frequência genotípica do polimorfismo rs1800469 em nódulos
tireoidianos com e sem cápsula (teste exato de Fisher).
0
20
40
60
80
100
Sem cápsula Com cápsula
35
63 65
37
rs1800469
GG AG+AA
p=0,0097
45
Tabela 9. Distribuição genotípica do polimorfismo rs1800469 de acordo com as
características clínicas e anatomopatológicas dos nódulos tireoidianos malignos
analisados.
Características clínicas e
anatomopatológicas
n (%)
Genótipos
Valor de p OR
(IC95%) GG AG+AA
Idade (média±DP) 45,8±14,4 46,1±14,8 0,8731 -
Gênero Feminino 108 (38) 178 (62)
0,0414 1.935
(1.056-3.545) Masculino 27 (54) 23 (46)
Tamanho do tumor em cm
(média±DP) 1,8±1,3 1,8±1,3 0,8071 -
Tireoidite Ausente 86 (42) 120 (58)
0,5224 - Presente 34 (37) 57 (63)
Multifocalidade Ausente 43 (43) 58 (57)
0,2020 - Presente 14 (30) 32 (70)
Cápsula Ausente 31 (35) 58 (65)
0,0097 3.232
1.366 - 7.647 Presente 19 (63) 11 (37)
Invasão Ausente 43 (46) 51 (54)
0,2147 - Presente 17 (33) 33 (66)
Metástase ao
diagnóstico
Ausente 38 (40) 56 (60) 0,8445 -
Presente 16 (43) 21 (57)
Teste exato de Fisher, exceto *teste de Mann-Whitney.
4.1.1.2 rs1800472
Em relação ao polimorfismo rs1800472, 90,3% dos indivíduos analisados eram
homozigotos selvagens (GG) e 9,7% heterozigotos polimórficos (AG); nenhum
indivíduo apresentou o genótipo homozigoto polimórfico AA. Na figura 13 estão
representadas as distribuições destes genótipos entre nódulos benignos e malignos da
tireoide. Novamente, observamos que não há diferenças quanto à distribuição dos
genótipos e o diagnóstico de malignidade ou benignidade do nódulo tireoidiano
(p=0,3605).
A tabela 10 monstra a distribuição genotípica de acordo com o tipo histológico
analisado e a tabela 11 as comparações possíveis entre eles. Foi estatisticamente
significante a comparação entre CPVF e bócio (p=0,0137), a frequência do genótipo
alterado AG no CPVF (38%) foi maior do que no bócio (10%), com OR de 5.521
46
sugerindo que indivíduos com o genótipo alterado AG possuem 5 vezes mais chances
de terem um nódulo maligno do tipo CPT de variante folicular (IC95%: 1.555-19.603).
Também foram interessantes as comparações entre CPVF e mPT (p=0,0022) e CPVF e
CPC (p=0,0048); contudo, devido ao baixo n amostral, estas análises apresentaram
altíssimos valores de intervalo de confiança (OR 16.250, IC95%: 2.683-98.435 e OR
8.542, IC95%: 2.124-34.348, respectivamente) sugerindo tratar-se de dados pouco
confiáveis, talvez relacionados a uma amostragem específica (figura 14).
Figura 13. Frequência genotípica do polimorfismo rs1800472 em nódulos
tireoidianos benignos e malignos (teste exato de Fisher).
0
20
40
60
80
100
Benignos Malignos
89 92
11 8
rs1800472
GG AG
p=0,3605
47
Tabela 10. Distribuição genotípica do polimorfismo rs1800472 em nódulos
tireoidianos benignos e malignos e de acordo com o tipo histológico.
Tipo histológico
n (%)
Genótipos
GG AG
Benignos
Bócio
(n=118) 106 (90) 12 (10)
AF
(n=58) 50 (86) 08 (14)
Total 156 20
Malignos
mPT
(n=58) 56 (97) 02 (03)
CPC
(n=88) 82 (93) 06 (07)
CPVF
(n=13) 08 (62) 05 (38)
CAT
(n=03) 03 (100) 00 (00)
Total 149 13
Tabela 11. Valor de p (Teste exato de Fisher) para as comparações entre tipos
histológicos de nódulos tireoidianos para o polimorfismo rs1800472.
Versus CDT CPVF CPC mPT AF Bócio
Bócio 1,0000 0,0137 0,4623 0,1479 0,4617 -
AF 0,6172 0,0526 0,2497 0,0941 -
mPT 0,2219 0,0022 0,7103 -
CPC - 0,0048 -
CPVF -
CDT -
Legenda: CDT carcinoma diferenciado (CPC+CPVF).
48
Figura 14. Frequência genotípica do polimorfismo rs1800472 em CPVF
comparados a bócio, mPT e CPC (teste exato de Fisher).
Entre as características clínicas e anatomopatológicas (tabela 12), houve uma
fraca correlação entre o genótipo alterado (AG) e a presença de metástase (p=0,0469). O
genótipo AG foi mais frequente em pacientes que apresentaram metástase no momento
do diagnóstico, inferindo ao paciente 3 vezes mais chances de metástase do que
pacientes portadores do genótipo homozigoto selvagem GG (OR 3.461, IC95%: 1.078 -
11.114) (figura 15).
Figura 15. Frequência genotípica do polimorfismo rs1800472 em nódulos
tireoidianos com e sem metástase ao diagnóstico.
0
20
40
60
80
100
CPVF Bócio mPT CPC
62
90 97 93
38
10 3 7
rs1800472
GG AG
0
20
40
60
80
100
Com meta Sem meta
81 94
19 6
rs1800472
GG AG
p=0,0137
p=0,0022
p=0,0048
p=0,0469
49
Tabela 12. Distribuição genotípica do polimorfismo rs1800472 de acordo com
as características clínicas e anatomopatológicas dos nódulos tireoidianos malignos
analisados.
Características clínicas e
anatomopatológicas
n (%)
Genótipos
Valor de p OR
(IC95%) GG AG
Idade (média±DP) 45,7±14,5 48,5±15,2 0,2182* -
Gênero Feminino 260 (91) 27 (09)
0,6091 - Masculino 45 (92) 06 (08)
Tamanho do tumor em cm
(média±DP) 1,78±1,3 1,85±1,0 0,2108* -
Tireoidite Ausente 185 (89) 22 (11)
0,5274 - Presente 84 (92) 07 (08)
Multifocalidade Ausente 96 (94) 06 (06)
0,1956 - Presente 41 (87) 06 (13)
Cápsula Ausente 80 (90) 09 (10)
0,7256 - Presente 30 (94) 02 (06)
Invasão Ausente 89 (93) 07 (07)
0,5454 - Presente 45 (90) 05 (10)
Metástase ao
diagnóstico
Ausente 89 (94) 06 (06) 0,0469
3.461
1.078 - 11.114 Presente 30 (81) 07 (19)
Teste exato de Fisher, exceto *teste de Mann-Whitney.
4.1.1.3 rs11466321
O genótipo selvagem (AA) do polimorfismo rs11466321 foi frequente em 92%
dos indivíduos avaliados, contra 7,4% e 0,60% dos genótipos polimórficos (AG e GG).
Similar aos polimorfismos anteriores, não demonstrou diferença na frequência dos
genótipos entre nódulos benignos e malignos da tireoide (figura 16).
A tabela 13 mostra a distribuição dos genótipos entre os tipos histológicos
avaliados. Mais uma vez, não houve diferenças significativas os tipos histológicos
quanto ao perfil genotípico (tabela 14).
50
Figura 16. Frequência genotípica do polimorfismo rs11466321 em nódulos
tireoidianos benignos e malignos (teste exato de Fisher).
Tabela 13. Distribuição genotípica do polimorfismo rs11466321 em nódulos
tireoidianos benignos e malignos de acordo com o tipo histológico.
Tipo histológico
n (%)
Genótipos
AA AG+GG
Benignos
Bócio
(n=119) 112 (94) 07 (06)
AF
(n=58) 52 (90) 06 (10)
Total 164 13
Malignos
mPT
(n=58) 54 (93) 04 (07)
CPC
(n=88) 80 (91) 08 (09)
CPVF
(n=13) 11 (85) 02 (15)
CAT
(n=03) 03 (100) 00 (00)
Total 148 14
0
20
40
60
80
100
Benignos Malignos
93 91
7 9
rs11466321
AA AG+GG
p=0,6921
51
Tabela 14. Valor de p (Teste exato de Fisher) para as comparações entre tipos
histológicos de nódulos tireoidianos para o polimorfismo rs11466321.
Versus CDT CPVF CPC mPT AF Bócio
Bócio 0,3158 0,2169 0,4238 0,7517 0,3584 -
AF 1,0000 0,6326 0,7828 0,7426 -
mPT 0,5774 0,3015 0,7637 -
CPC - 0,6134 -
CPVF - -
CDT -
Legenda: CDT carcinoma diferenciado (CPC+CPVF).
Em relação às características clínicas e anatomopatológicas do tumor (tabela 15),
novamente, a distribuição dos genótipos AA, AG e GG não foi diferente em relação à
idade ou gênero dos pacientes, nem como ao tamanho do tumor, presença/ausência de
tireoidite, multifocalidade, cápsula, invasão e metástase ao diagnóstico.
Tabela 15. Distribuição genotípica do polimorfismo rs11466321 de acordo com
as características clínicas e anatomopatológicas dos nódulos tireoidianos malignos
analisados (Teste exato de Fisher, exceto *teste de Mann-Whitney).
Características clínicas e
anatomopatológicas
n (%)
Genótipos
Valor de p
AA AG+GG
Idade (média±DP) 46,1±14,7 44,2±12,8 0,4736
Gênero Feminino 267 (93) 21 (07)
0,2671 Masculino 45 (92) 06 (08)
Tamanho do tumor em cm
(média±DP) 1,78±1,3 1,82±0,9 0,2570
Tireoidite Ausente 192 (92) 16 (08)
0,5053 Presente 82 (90) 09 (10)
Multifocalidade Ausente 93 (91) 09 (09)
1,0000 Presente 43 (91) 04 (09)
Cápsula Ausente 82 (92) 07 (08)
0,7231 Presente 29 (91) 03 (09)
Invasão Ausente 90 (94) 06 (06)
0,1345 Presente 43 (86) 07 (14)
Metástase ao
diagnóstico
Ausente 89 (94) 06 (06) 0,2902
Presente 32 (86) 05 (14)
52
4.1.1.4 rs2241716
De forma similar, a frequência genotípica do polimorfismo rs2241716 não foi
diferente entre os nódulos benignos e malignos (figura 17). Em nossa casuística, a
frequência do genótipo selvagem (CC) foi de 94,3% e dos alelos polimórficos (CT e
TT) de 5,1% e 0,60%, respectivamente.
Figura 17. Frequência genotípica do polimorfismo rs2241716 em nódulos
tireoidianos benignos e malignos (teste exato de Fisher).
A distribuição genotípica também não foi diferente entre os tipos histológicos
analisados, como mostra a tabela 16, não se correlacionando com nenhum tipo de
nódulo benigno ou maligno (tabela 17). Considerando as características clínicas e
anatomopatológicas (tabela 18) apresentadas pelos tumores analisados, este
polimorfismo se correlacionou apenas com o gênero dos pacientes (p=0,0492), onde
92% dos indivíduos do sexo masculino eram homozigotos selvagens.
0
20
40
60
80
100
Benignos Malignos
94 95
6 5
rs2241716
CC CT+TT
p=0,6445
53
Tabela 16. Distribuição genotípica do polimorfismo rs2241716 em nódulos
tireoidianos benignos e malignos e de acordo com o tipo histológico.
Tipo histológico
n (%)
Genótipos
CC CT+TT
Benignos
Bócio
(n=119) 111 (93) 08 (07)
AF
(n=58) 55 (95) 03 (05)
Total 166 11
Malignos
mPT
(n=58) 53 (91) 05 (09)
CPC
(n=88) 85 (97) 03 (07)
CPVF
(n=13) 13 (100) 00 (00)
CAT
(n=03) 03 (100) 00 (00)
Total 154 08
Tabela 17. Valor de p (Teste exato de Fisher) para as comparações entre tipos
histológicos de nódulos tireoidianos para o polimorfismo rs2241716.
Versus CDT CPVF CPC mPT AF Bócio
Bócio 0,2323 1,0000 0,3605 0,7602 1,0000 -
AF 0,6691 1,0000 0,6820 0,7167 -
mPT 0,1419 0,5764 0,2655 -
CPC - 1,0000 -
CPVF -
CDT -
Legenda: CDT carcinoma diferenciado (CPC+CPVF).
54
Tabela 18. Distribuição genotípica do polimorfismo rs2241716 de acordo com
as características clínicas e anatomopatológicas dos nódulos tireoidianos malignos
analisados.
Características clínicas e
anatomopatológicas
n (%)
Genótipos
Valor de p OR
(IC95%) CC CT+TT
Idade (média±DP) 46,1±14,7 45,1±11,2 0,8349*
Gênero Feminino 275 (86) 13 (14)
0,0492 0.3545
(0.1281-0.9809) Masculino 45 (92) 06 (08)
Tamanho do tumor em cm
(média±DP) 1,80±1,3 1,50±1,3 0,1171*
Tireoidite Ausente 197 (92) 11 (08)
1,0000
Presente 86 (95) 05 (05)
Multifocalidade Ausente 99 (97) 03 (03)
0,3801
Presente 44 (94) 03 (06)
Cápsula Ausente 87 (98) 02 (02)
0,2848
Presente 30 (94) 02 (06)
Invasão Ausente 89 (93) 07 (07)
0,0957
Presente 50 (100) 00 (00)
Metástase ao
diagnóstico
Ausente 92 (97) 03 (03) 1,0000
Presente 36 (97) 01 (03)
Teste exato de Fisher, exceto *teste de Mann-Whitney.
4.1.1.5 rs8110090
A frequência dos genótipos AA (selvagem), AG e GG (polimórficos) do
polimorfismo rs8110090 em nossa casuística foi de 86,6%, 12,6% e 0,86%,
respectivamente. Essa frequência foi similar entre nódulos benignos e malignos, como
demonstrado na figura 18. Entre os tipos histológicos (tabela 19) também não houve
diferença e nenhuma comparação foi estatisticamente significante (tabela 20).
Considerando as características clínicas e anatomopatológicas do tumor (tabela
21), a distribuição genotípica deste polimorfismo foi muito similar entre as variáveis
analisadas.
55
Figura 18. Frequência genotípica do polimorfismo rs8110090 em nódulos
tireoidianos benignos e malignos (teste exato de Fisher).
Tabela 19. Distribuição genotípica do polimorfismo rs8110090 em nódulos
tireoidianos benignos e malignos de acordo com o tipo histológico.
Tipo histológico
n (%)
Genótipos
AA AG+GG
Benignos
Bócio
(n=119) 100 (84) 19 (16)
AF
(n=58) 52 (90) 06 (10)
Total 152 25
Malignos
mPT
(n=58) 49 (84) 09 (16)
CPC
(n=88) 79 (90) 09 (10)
CPVF
(n=13) 12 (92) 01 (08)
CAT
(n=03) 03 (100) 00 (00)
Total 143 19
0
20
40
60
80
100
Benigno Maligno
86 88
14 12
rs8110090
AA AG+GG
p=0,5231
56
Tabela 20. Comparações entre tipos histológicos de nódulos tireoidianos para o
polimorfismo rs8110090.
Versus CDT CPVF CPC mPT AF Bócio
Bócio 0,2313 0,6905 0,3047 1,0000 0,3655 -
AF 1,0000 1,0000 1,0000 0,5813 -
mPT 0,3173 0,6762 0,4413 -
CPC - 1,0000 -
CPVF - -
CDT -
Legenda: CDT carcinoma diferenciado (CPC+CPVF).
Tabela 21. Distribuição genotípica do polimorfismo rs8110090 de acordo com
as características clínicas e anatomopatológicas dos nódulos tireoidianos malignos
analisados.
Características clínicas e
anatomopatológicas
n (%)
Genótipos
Valor de p
AA AG+GG
Idade (média±DP) 46,5±14,4 42,9±15,3 0,1088*
Gênero Feminino 248 (86) 40 (14)
0,3640 Masculino 47 (92) 04 (08)
Tamanho do tumor em cm
(média±DP) 1,75±1,2 2,0±1,3 0,2218*
Tireoidite Ausente 181 (87) 27 (13)
1,0000 Presente 80 (88) 11 (12)
Multifocalidade Ausente 89 (87) 13 (13)
0,5838 Presente 43 (91) 04 (09)
Cápsula Ausente 77 (87) 12 (13)
0,1805 Presente 31 (97) 01 (03)
Invasão Ausente 82 (85) 14 (15)
0,2994 Presente 46 (92) 04 (08)
Metástase ao
diagnóstico
Ausente 81 (85) 14 (15) 0,3950
Presente 34 (92) 03 (08)
Teste exato de Fisher, exceto *teste de Mann-Whitney.
57
4.1.2 Gene TGFBR1
4.1.2.1 rs10512263
Para o polimorfismo rs10512263, o genótipo selvagem (CC) foi presente em
66,7% dos indivíduos genotipados, enquanto que os genótipos polimórficos CT e TT
representaram 11,3% e 22%, respectivamente. Novamente, a frequência genotípica foi
similar entre nódulos benignos e malignos (figura 19), assim como entre os tipos
histológicos (tabela 22), não se associando com nenhum tipo histológico em específico
(tabela 23).
Figura 19. Frequência genotípica do polimorfismo rs10512263 em nódulos
tireoidianos benignos e malignos (teste exato de Fisher).
0
20
40
60
80
Benignos Malignos
69 66
31 33
rs10512263
CC CT+TT
p=0,0173
58
Tabela 22. Distribuição genotípica do polimorfismo rs10512263 em nódulos
tireoidianos benignos e malignos de acordo com o tipo histológico.
Tipo histológico
n (%)
Genótipos
CC CT+TT
Benignos
Bócio
(n=118) 76 (64) 42 (36)
AF
(n=57) 44 (77) 13 (23)
Total 120 55
Malignos
mPT
(n=57) 37 (65) 20 (35)
CPC
(n=87) 57 (65) 30 (35)
CPVF
(n=13) 10 (77) 03 (23)
CAT
(n=03) 02 (67) 01 (33)
Total 106 54
Tabela 23. Valor de p (Teste exato de Fisher) para as comparações entre tipos
histológicos de nódulos tireoidianos para o polimorfismo rs10512263.
Versus CDT CPVF CPC mPT AF Bócio
Bócio 0,7750 0,5409 0,8835 1,0000 0,1175 -
AF 0,2047 1,0000 0,1424 0,2150 -
mPT 0,8612 0,5229 1,0000 -
CPC - 0,5362 -
CPVF -
CDT -
Legenda: CDT carcinoma diferenciado (CPC+CPVF).
Como demonstrado na tabela 24, a frequência de mulheres com o genótipo
alterado (35%) foi maior que a de homens (20%; p=0,0490). Este polimorfismo também
se associou com invasão (figura 20), onde 43% dos nódulos sem invasão possuíam pelo
menos um alelo polimórfico (CT ou TT) contra 22% dos nódulos com invasão capsular,
vascular ou linfática, sugerindo que os genótipos polimórficos confiram um fator
protetor (OR 0.3715, IC95%: 0.1698 - 0.8127, p=0,0173).
59
Figura 20. Frequência genotípica do polimorfismo rs10512263 em nódulos
tireoidianos com e sem invasão (teste exato de Fisher).
Tabela 24. Distribuição genotípica do polimorfismo rs10512263 de acordo com
as características clínicas e anatomopatológicas dos nódulos tireoidianos malignos
analisados.
Características clínicas e
anatomopatológicas
n (%)
Genótipos
Valor de p OR
(IC95%) CC CT+TT
Idade (média±DP) 45,2±14,4 47,5±14,9 0,2268*
Gênero Feminino 186 (65) 99 (35)
0,0490 2.129
1.021 - 4.439 Masculino 40 (80) 10 (20)
Tamanho do tumor em cm
(média±DP) 1,9±1,3 1,6±1,2 0,1507*
Tireoidite Ausente 129 (63) 77 (37)
0,0838
Presente 67 (74) 24 (26)
Multifocalidade Ausente 66 (65) 36 (35)
0,7076
Presente 32 (70) 14 (30)
Cápsula Ausente 58 (65) 31 (35)
0,1345
Presente 15 (48) 16 (52)
Invasão Ausente 54 (57) 41 (43)
0,0173 0.3715
0.1698 - 0.8127 Presente 39 (78) 11 (22)
Metástase ao
diagnóstico
Ausente 56 (60) 38 (40) 0,1652
Presente 27 (73) 10 (27)
Teste exato de Fisher, exceto *teste de Mann-Whitney.
0
20
40
60
80
Sem invasão Com invasão
57
78
43
22
rs10512263
CC CT+TT
p=0,7263
60
4.1.2.2 rs7850895
Mais de 85% dos indivíduos genotipados para o polimorfismo rs7850895 eram
homozigotos selvagens para o genótipo TT, enquanto 14% possuíam o genótipo
alterado CT. Nenhum individuo apresentou o genótipo homozigoto polimórfico CC.
A frequência genotípica deste polimorfismo mais uma vez não foi diferente entre
nódulos malignos e benignos, como demonstrado na figura 21. A distribuição
genotípica entre os tipos histológicos também não apresentou diferenças como podemos
observar nas tabelas 25 e 26.
Figura 21. Frequência genotípica do polimorfismo rs7850895 em nódulos
tireoidianos benignos e malignos (teste exato de Fisher).
0
20
40
60
80
100
Benignos Malignos
85 85
15 15
rs7850895
TT CT
p=1.0000
61
Tabela 25. Distribuição genotípica do polimorfismo rs7850895 em nódulos
tireoidianos benignos e malignos de acordo com o tipo histológico.
Tipo histológico
n (%)
Genótipos
TT CT
Benignos
Bócio
(n=118) 102 (86) 17 (14)
AF
(n=58) 49 (84) 09 (16)
Total 151 26
Malignos
mPT
(n=57) 51 (89) 06 (11)
CPC
(n=88) 72 (82) 16 (18)
CPVF
(n=13) 12 (92) 01 (08)
CAT
(n=03) 02 (67) 01 (33)
Total 137 24
Tabela 26. Valor de p (Teste exato de Fisher) para as comparações entre tipos
histológicos de nódulos tireoidianos para o polimorfismo rs7850895.
Versus CDT CPVF CPC mPT AF Bócio
Bócio 0,7088 1,0000 0,4506 0,6343 0,8241 -
AF 1,0000 0,6762 0,8231 0,5813 -
mPT 0,3513 1,0000 0,2435 -
CPC - 0,6905 -
CPVF - -
CDT -
Legenda: CDT carcinoma diferenciado (CPC+CPVF).
Considerando as características clínicas e anatomopatológicas do tumor, não
foram observadas diferenças na frequência genotípica para média de idade e gênero dos
pacientes, ou tamanho do tumor, presença/ausência de tireoide, multifocalidade,
cápsula, invasão e metástase ao diagnóstico (tabela 27).
62
Tabela 27. Distribuição genotípica do polimorfismo rs7850895 de acordo com
as características clínicas e anatomopatológicas dos nódulos tireoidianos malignos
analisados.
Características clínicas e
anatomopatológicas
n (%)
Genótipos
Valor de p
TT CT+CC
Idade (média±DP) 46,4±14,2 43,7±16,4 0,2345*
Gênero Feminino 245 (85) 43 (15)
1,0000 Masculino 43 (86) 07 (14)
Tamanho do tumor em cm
(média±DP) 1,8±1,3 1,9±1,3 0,3032*
Tireoidite Ausente 179 (86) 29 (14)
0,5964 Presente 76 (84) 15 (16)
Multifocalidade Ausente 87 (85) 15 (15)
0,8067 Presente 38 (86) 08 (14)
Cápsula Ausente 74 (83) 15 (17)
0,3984 Presente 28 (90) 03 (10)
Invasão Ausente 83 (87) 12 (13)
0,4579 Presente 41 (82) 09 (18)
Metástase ao
diagnóstico
Ausente 81 (85) 14 (15) 0,7933
Presente 31 (84) 06 (16)
Teste exato de Fisher, exceto *teste de Mann-Whitney.
4.1.3 Gene TGFBR2
4.1.3.1 rs2228048
No último polimorfismo analisado, 96% dos indivíduos eram homozigotos
selvagens (CC), 4% eram heterozigotos polimórficos (CT) e nenhum indivíduo
apresentou o genótipo homozigoto polimórfico TT. Na figura 22, observamos que a
frequência dos genótipos foi similar entre nódulos benignos e malignos, assim como
entre os tipos histológicos (tabela 28), não havendo nenhuma correlação entre os tipos
histológicos analisados (tabela 29). Para o AF não foi realizado teste estatístico, pois
nenhum dos indivíduos possuía o genótipo alterado e isto poderia influenciar no
resultado do teste.
Com relação às características clínicas e anatomopatológicas do tumor, este
polimorfismo não demonstrou diferenças na distribuição genotípica e, portanto, não se
associou com nenhuma característica analisada.
63
Figura 22. Frequência genotípica do polimorfismo rs2228048 em nódulos
tireoidianos benignos e malignos (teste exato de Fisher).
Tabela 28. Distribuição genotípica do polimorfismo rs2228048 em nódulos
tireoidianos benignos e malignos de acordo com o tipo histológico.
Tipo histológico
n (%)
Genótipos
CC CT
Benignos
Bócio
(n=118) 112 (95) 06 (05)
AF
(n=57) 57 (100) 00 (00)
Total 169 06
Malignos
mPT
(n=57) 55 (96) 02 (04)
CPC
(n=87) 85 (98) 03 (02)
CPVF
(n=13) 11 (85) 02 (15)
CAT
(n=03) 02 (67) 01 (33)
Total 153 08
0
20
40
60
80
100
Benignos Malignos
97 95
3 5
rs2228048
CC CT
p=0,5883
64
Tabela 29. Comparações entre tipos histológicos de nódulos tireoidianos para o
polimorfismo rs2228048.
Versus CDT CPVF CPC mPT AF Bócio
Bócio 1,0000 0,1809 0,7354 1,0000 -- -
AF -- -- -- -- -
mPT 1,0000 0,1543 1,0000 -
CPC - 0,1227 -
CPVF - -
CDT -
Legenda: CDT carcinoma diferenciado (CPC+CPVF). -- n insuficiente para realizar estatística.
Tabela 30. Distribuição genotípica do polimorfismo rs2228048 de acordo com
as características clínicas e anatomopatológicas dos nódulos tireoidianos analisados.
Características clínicas e
anatomopatológicas
n (%)
Genótipos
Valor de p
CC CT
Idade (média±DP) 45,7±14,4 53,2±17,7 0,1333*
Gênero Feminino 274 (96) 12 (04)
1,0000 Masculino 48 (96) 02 (04)
Tamanho do tumor em cm
(média±DP) 1,8±1,2 1,7±1,7 0,4774*
Tireoidite Ausente 199 (96) 07 (04)
0,2281 Presente 85 (93) 06 (07)
Multifocalidade Ausente 97 (95) 05 (05)
1,0000 Presente 44 (96) 02 (04)
Cápsula Ausente 83 (93) 06 (07)
0,6755 Presente 30 (97) 01 (03)
Invasão Ausente 90 (95) 05 (05)
1,0000 Presente 48 (96) 02 (04)
Metástase ao
diagnóstico
Ausente 90 (95) 05 (05) 1,0000
Presente 35 (95) 02 (05)
Teste exato de Fisher, exceto *teste de Mann-Whitney.
65
4.2 Expressão gênica
Para análise da expressão de RNAm dos genes TGFB1, TGFBR1 e TGFBR2
foram selecionadas 141 amostras de tecido tireoidiano, sendo 80 benignos, 47 malignos
e 14 tecidos normais contralaterais. O tempo médio de seguimento desses pacientes foi
de 100,9±42,9 meses e a idade média ao diagnóstico de 43,6±13,7 anos.
A média de idade dos pacientes com nódulos benignos foi maior que dos
nódulos malignos, sendo essa diferença estatisticamente significante (p=0,0002). O sexo
feminino foi predominante tanto no grupo benigno quanto no maligno. Tumores
tireoidianos benignos eram maiores que os tumores malignos (p=0,0087). Tireoidite foi
presente em 31% dos nódulos benignos e apenas 24% dos nódulos malignos. Os
nódulos malignos eram em sua maioria unifocais (70%), não encapsulados (86%), sem
presença de invasão capsular, vascular ou linfática (53%) e sem diagnóstico de
metástase no momento do diagnóstico (67%).
Considerando as características clínicas de acordo com o tipo histológico,
pacientes com bócio eram mais velhos que pacientes com AF (p=0,0091). Entre as
características anatomopatológicas, bócios eram maiores em diâmetro do que AF, e
apenas 30% apresentavam tireoidite. No grupo maligno, como esperado, o CPT tinha
tamanho médio maior que os mPT e apresentavm características de agressividade como
ausência de cápsula em 83% dos casos, invasão em 51% e presença de metástase ao
diagnóstico em 37%.
4.2.1 Expressão de TGFB1
As médias de RNAm do gene TGFB1 (figura 23) foram maiores em nódulos
malignos (2,320±1,410 UA) quando comparados aos benignos (1,080±0,740 UA,
p<0,0001) e ao tecido normal (0,990±0,250 UA, p<0,0001), mas não em tecidos
benignos quando comparados ao tecido normal (p=0,8443).
Para avaliar o potencial diagnóstico do gene TGFB1 foi realizada a curva ROC
com os valores de expressão do RNAm em tecidos benignos e malignos (figura 24).
Com um cut-off de 1,365, a expressão de TGFB1 foi capaz de identificar os nódulos
benignos com uma especificidade de 72%, VPN de 98%, sensibilidade de 77% e VPP
de 13%, dando ao teste uma acurácia de 82% (p<0,0001).
66
Figura 23. Box plot com as médias de RNAm (UA) do gene TGFB1 em nódulos
benignos e malignos e tecido normal tireoidiano e valor de p (teste de Mann-Whitney).
Figura 24. Curva ROC apresentando pontos de especificidade e sensibilidade da
expressão de RNAm do gene TGFB1 em nódulos tireoidianos benignos e malignos.
As médias de RNAm do gene TGFB1 entre os tipos histológicos analisados
estão graficamente apresentadas na figura abaixo. Não foram estatisticamente
significantes as comparações entre bócio e AF (p=0,6587), CPT e mPT (p=0,8453), mas
sim entre CPT e bócio (p<0,0001), CPT e AF (p<0,0001), mPT e bócio (p=0,0015) e
mPT e AF (p=0,0030).
0
20
40
60
80
100
TGFB1
0 20 40 60 80 100
100-Specificity
Se
nsitiv
ityp<0,0001
p=0,8443
1,080±0,740 0,990±0,250 2,320±1,410
Expressão RNAm
TGFB1
p<0,0001
67
Figura 25. Box plot com as média de RNAm (UA) do gene TGFB1 entre os
tipos histológicos de nódulos tireoidianos.
Em relação às características anatomopatológicas dos nódulos, as médias de
RNAm foram discretamente maiores em tumores com tireoidite, multifocais, não
encapsulados, com invasão e sem metástase (tabela 31), contudo essas diferenças não
foram estatisticamente significantes. Por outro lado, a expressão de TGFB1 demonstrou
associação com tamanho do tumor (p=0,0486). A correlação de Spearman mostrou uma
correlação negativa (R= -0,1768), onde quanto maior a expressão de TGFB1 menores
são os tumores tireoidianos (figura 26).
Expressão RNAm
TGFB1
1,110±0,780 1,010±0,680 2,480±1,570 2,270±1,370
68
Tabela 31. Médias de expressão do RNAm do gene TGFB1 e características
anatomopatológicas exibidas pelos nódulos malignos avaliados.
Características
anatomopatológicas
n (%)
Média±DP Valor de p*
Tireoidite Ausente 1,425±1,070
0,0770 Presente 1,830±1,460
Multifocalidade Ausente 2,310±1,500
0,7407 Presente 2,340±1,250
Cápsula Ausente 2,375±1,400
0,3243 Presente 2,020±1,520
Invasão Ausente 2,270±1,145
0,8146 Presente 2,380±1,690
Metástase ao
diagnóstico
Ausente 2,360±1,600 0,7407
Presente 2,230±0,950
*Teste de Mann-Whitney.
Figura 26. Gráfico de correlação negativa entre tamanho de tumor e expressão
de RNAm do gene TGFB1 em tumores tireoidianos benignos e malignos: tumores
menores em cm expressam maiores quantidades de RNAm (correlação de Spearman).
R= -0,1768
69
4.2.2 Expressão de TGFBR1
A média de RNAm do gene TGFBR1 também foi maior em tecidos malignos
quando comparados aos benignos (p=0,0002), mas não quando comparados aos tecidos
normais (p=0,0848); tecidos benignos também não se diferenciaram de normais
(p=0,3839) (figura 27).
A análise da curva ROC demonstrou que a expressão de TGFBR1 é capaz de
identificar, mais uma vez, os nódulos benignos com uma especificidade de 85% e VPN
de 97%. Apesar de baixos valores de sensibilidade (47%) e VPP (14%), a acurácia total
do teste foi de 70% (p=0,0001) (figura 28).
As médias de RNAm entre os tipos histológicos estão demonstradas na figura
29. Foram significativas as diferenças entre AF e bócio (p=0,0276), mPT e bócio
(p=0,0027), mPT e AF (p=0,0007), CPT e AF (p=0,0005), mas não entre CPT e bócio
(p=0,0545) e CPT e mPT (p=0,3732).
Figura 27. Box plot com as médias de RNAm (UA) do gene TGFBR1 em
nódulos benignos e malignos e tecido normal tireoidiano e valor de p (teste de Mann-
Whitney).
Expressão RNAm
TGFBR1
p=0,0848
p=0,3839
p=0,0002
0,950±0,690 0,990±0,250 2,400±2,370
70
Figura 28. Curva ROC apresentando pontos de especificidade e sensibilidade da
expressão de RNAm do gene TGFBR1 em nódulos tireoidianos benignos e malignos.
Figura 29. Box plot com as média de RNAm (UA) do gene TGFBR1 entre os
tipos histológicos de nódulos tireoidianos.
0
20
40
60
80
100
TGFBR1
0 20 40 60 80 100
100-Specificity
Se
nsitiv
ity
Expressão RNAm
TGFBR1
1,065±0,700 0,700 ±0,600 2,200 ±1,450 2,450 ±2,630
71
A expressão de TGFBR1 foi discretamente maior em tumores sem tireoidite
concomitante, multifocais, não encapsulados, com invasão e com metástase, contudo,
novamente, não foram estatisticamente significantes (tabela 32). Também não houve
correlação com tamanho do tumor (p=0,1348).
Tabela 32. Médias de RNAm do gene TGFBR1 entre as características
anatomopatológicas exibidas pelos nódulos malignos avaliados.
Características
anatomopatológicas
n (%)
Média±DP Valor de p*
Tireoidite Ausente 1,515±1,770
0,9302 Presente 1,370±1,500
Multifocalidade Ausente 2,115±2,210
0,3680 Presente 2,765±2,670
Cápsula Ausente 2,320±2,250
0,4075 Presente 2,280±3,070
Invasão Ausente 2,010±2,110
0,3516 Presente 2,660±2,600
Metástase ao
diagnóstico
Ausente 1,940±1,990 0,1828
Presente 3,090±2,880
*Teste de Mann-Whitney.
4.2.3 Expressão de TGFBR2
Considerando o gene TGFBR2, a maior expressão foi encontrada em tecidos
normais. Essa expressão foi estatisticamente significante quando comparada a tecidos
benignos (p=0,0002) e malignos (p<0,0001). Não houve diferença estatística
comparando nódulos malignos com benignos (p=0,9741) (figura 30), sendo assim não
foi realizada análise de curva ROC.
72
Figura 30. Box plot com as média de RNAm (UA) do gene TGFBR2 em
nódulos benignos e malignos e tecido normal tireoidiano e valor de p (teste de Mann-
Whitney).
A expressão de TGFBR2 nos tipos histológicos de nódulos tireoidianos é
reportada na figura 31. Foram estatisticamente significantes apenas as comparações
entre AF e bócio (p=0,0003) e mPT e AF (p=0,0055), mas não entre CPT e mPT
(p=0,0811), CPT e AF (p=0,0641), CPT e bócio (p=0,6000) e mPT e bócio (p=0,9934).
As médias de expressão desse gene estavam discretamente aumentadas em
tumores com tireoidite concomitante, unifocais, não encapsulados, sem invasão e sem
metástase ao diagnóstico. No entanto, essa diferença não foi estatisticamente
significante como observado na tabela abaixo (tabela 33). Não houve também
correlação com o tamanho do tumor e a expressão de TGFBR2 (p=0,4098).
Expressão RNAm
TGFBR2
0,620±0,700 0,970±0,260 0,530±0,410
p<0,0001 p=0,0002
p=0,9741
73
Figura 31. Box plot com as média de RNAm (UA) do gene TGFBR2 entre os
tipos histológicos de nódulos tireoidianos.
Tabela 33. Médias de RNAm do gene TGFBR2 entre as características
anatomopatológicas exibidas pelos nódulos avaliados.
Características
anatomopatológicas
n (%)
Média±DP Valor de p*
Tireoidite Ausente 0,560±0,650
0,0784 Presente 0,665±0,515
Multifocalidade Ausente 0,545±0,440
0,9363 Presente 0,500±0,355
Cápsula Ausente 0,560±0,420
0,1886 Presente 0,360±0,265
Invasão Ausente 0,570±0,400
0,1725 Presente 0,480±0,425
Metástase ao
diagnóstico
Ausente 0,540±0,425 0,8731
Presente 0,510±0,380
*Teste de Mann-Whitney.
Expressão RNAm
TGFBR2
0,770±0,800 0,310±0,240 0,640±0,390 0,490±0,410
74
5. DISCUSSÃO
Evidências na literatura tornam o TGF-β1 e seus receptores objetos de grande
interesse para pesquisas em câncer. Este é o primeiro estudo, de nosso conhecimento, a
avaliar a influência de polimorfismos concomitante à expressão gênica e das proteínas
de TGF-β1, TFβRI e TFβRII em tumores da tireoide. Com exceção do polimorfismo
rs1800472, do gene TGFB1, nenhum outro polimorfismo desse gene ou dos genes
TGFBR1 e TGFBR2 foi reportado na literatura no CDT, de nosso conhecimento.
O polimorfismo rs1800469 é o mais investigado do gene TGFB1 e tem sido
relacionado com uma série de patologias e neoplasias. Este polimorfismo está
localizado numa região de regulação negativa do gene, e associado com diferença na
expressão gênica e concentrações plasmática de TGF-β1 na presença do alelo alterado T
(84, 86, 110). Shah e col. lançaram a hipótese de que o alelo T resulta na perda da
regulação negativa, o que elevaria os níveis do RNAm e prejudicaria a ligação de
fatores de transcrição como fator de hipóxia induzido-1A (HIF1A) (85). Os últimos
trabalhos em câncer têm mostrando resultados ainda controversos. Enquanto que no
estudo caso-controle de Yang e col. (111) os genótipos alterados CT e TT demonstraram
diminuir o risco para câncer endometrial (regressão logística CT+TT versus CC
p=0,0093, OR 0.66 IC95%: 0.48-0.90), no trabalho de Wang e col. (112) os autores
demonstraram pela análise univariada que a herança dos genótipos alterados aumentava
em 76% a chance de metástase em pacientes com tumores cerebrais primários (CT+TT
versus CC p=0,04, OR 1.76 IC95%: 1.12-3.15). Nossos dados não demonstram
associação deste polimorfismo com a suscetibilidade aos nódulos tireoidianos malignos
ou benignos, mas parece existir uma relação com características de agressividade da
doença: os genótipos alterados foram mais frequentes em nódulos não encapsulados
(65%) em relação aos nódulos com cápsula (37%), diferença que o teste exato de Fisher
mostrou ser importante (p=0,0097). Além do mais, o OR indica que a chance do
paciente ter um nódulo não encapsulado é 3 vezes maior se possuir genótipos alterados
de rs1800469 (OR 3.232, IC95%: 1.366-7.647). Tumores tireoidianos encapsulados,
como NIFPTs, por exemplo, possuem menos chances de desenvolveram metástases e
são, geralmente, tumores de boa evolução.
Em relação ao polimorfismo rs1800472, os dados na literatura ainda são
controversos. Este polimorfismo está localizado em uma região cromossômica
importante para a ativação do TGF-β1, a apenas 15 aminoácidos de distância do ponto
75
de clivagem do LAP (peptídeo associado de latência), podendo afetar direta ou
indiretamente a conformação desse peptídeo (82). A troca de uma citosina por uma
timina leva também à troca do aminoácido treonina por uma isoleucina na porção 263
do gene TGFB1, contudo não existem evidências de que tais trocas causem alterações
nas concentrações de TGF-β1, por isso, a hipótese corrente é de que este polimorfismo
poderia estar envolvido somente na ativação da proteína (82). Em 2014, esse
polimorfismo foi correlacionado com otoesclerose em população húngara pela análise
de regressão logística (p=0,015) (113), mas já havia sido previamente associado a essa
patologia em outras populações europeias (82) e numa população tunisiana (114). Este
polimorfismo também foi proposto em associação com osteoporose, contudo, um estudo
realizado em larga escala reunindo quase 29 mil amostras de pacientes de 10 centros
europeus diferentes investigou 5 polimorfismos do TGFB1, incluindo rs1800472 e
rs1800469, mas não encontrou evidências da relação dos genótipos desses
polimorfismos, nem de haplótipos, com densidade óssea e risco de fratura (115). Em
câncer, esse polimorfismo já foi investigado em câncer de bexiga, onde a frequência dos
genótipos não foi diferente entre os 1020 pacientes e 1094 indivíduos controle
(p=0,2200), da mesma forma que não se associou com a progressão do tumor ou
recidiva (116). E, entre todos os polimorfismos analisados pelo nosso grupo, este foi o
único que já havia sido anteriormente estudado em tumores tireoidianos; os autores
encontraram risco para nódulos tireoidianos do tipo papilífero na presença do genótipo
alterado (117). Em nossos dados existe uma correlação do genótipo heterozigoto
polimórfico (AG) com o tipo histológico de CPVF, entretanto, devido ao baixo n
amostras desse tipo histológico em particular, os valores de intervalo de confiança
foram muito elevados. Além disso, demonstramos a relação deste polimorfismo com
características de agressividade do tumor: o genótipo AG se correlacionou com a
presença de metástase ao diagnóstico aumentando em mais de 3 vezes o risco do
paciente ter uma metástase (OR 3.461, IC95%: 1.078 - 11.114, p=0,0469).
Encontramos na literatura apenas um estudo com o polimorfismo rs11466321.
Avaliando pacientes com doença pulmonar obstrutiva crônica (DPOC), os autores
encontraram associação deste polimorfismo com o fenótipo da via área (p=0,02,
ajustado para idade, sexo, peso e anos de tabagismo) (118). Mudanças na composição,
conteúdo e organização dos componentes celulares e moleculares das vias aéreas são
definidas como remodelamento das vias aéreas, e essas mudanças podem contribuir
76
diretamente para o estreitamento das vias respiratórias ou prejudicar a contração do
músculo liso das áreas respiratórias (119). Tem-se particular interesse pelo papel de
TGF-β1 em doenças relacionadas à função pulmonar pois células epiteliais brônquicas
geralmente secretam fatores de crescimento, como o TGF-β1, de forma autócrina (120).
Este, por sua vez, induz a proliferação de fibroblastos, aumenta a produção de colágenos
e outras proteínas de matriz extracelular, assim como diminui a degradação deste
colágeno (121), tornando-o importante para doenças como enfisema pulmonar e DPOC.
Em nossa casuística não encontramos diferenças em sua frequência genotípica em
nódulos tireoidianos malignos e benignos, entre os tipos histológicos ou correlação com
dados clínicos e anatomopatológicos dos nódulos analisados.
Outro polimorfismo intrônico analisado foi o rs2241716 que consiste na troca de
uma guanina por uma adenina (84). Wan e col. não constataram diferenças na
frequência genotípica de rs2241716 em portadores de câncer familiar de bexiga e
indivíduos controle na população chinesa (122), achado similar aos nossos em pacientes
com nódulos benignos e malignos da tireoide. Já Lee e col. encontraram associação do
menor alelo T e a porcentagem de densidade mamográfica (PDM), um importante fator
auxiliar de predição ao câncer de mama, em um estudo realizado com mais de 2 mil
mulheres chinesas (123). Mulheres sem filhos e portadoras do alelo alterado T tinham
em média PDM 8,55% maior do que mulheres com o alelo normal (p=0,0003, ajustado
para idade e IMC) (123). Muito provavelmente esse achado se deve ao grande n
amostral do estudo, muito superior ao nosso (n=339) e ao de Wan e col. (n=214). Outros
estudos, também em população asiática, que se propuseram a investigar este
polimorfismo em hipertensos (124) e pacientes com DPOC (125) não reportaram seus
achados, pois o polimorfismo estava em desequilíbrio de ligação na população de
estudo.
O polimorfismo rs8110090, também localizado em região intrônica, consiste na
troca de uma adenina por uma guanina (89). Não existem estudos na literatura que
reportem dados deste polimorfismo em câncer, contudo este já foi estudado em
pacientes com fibrose cística, não demonstrando associações com a variação da função
pulmonar (126), e em pacientes operados para melanoma a fim de investigar o papel do
gene TGFB1 na cicatrização da excisão do tumor (127). A análise multivariada
demonstrou associação deste polimorfismo e o resultado da cicatrização em dois
diferentes momentos, o primeiro avaliando a vascularidade, tamanho e pliabilidade
77
(característica de fragilidade da pele) (p=0,0002) e no segundo momento, com avaliação
adicional da pigmentação (p=0,0002); os autores concluíram que o alelo alterado G
esteve associado com piores resultados de cicatrização (127). Nossos dados
demonstraram baixa frequência do alelo G (0,07) em tumores tireoidianos e, portanto,
não se associou com nenhum parâmetro analisado.
No gene TGFBR1, receptor tipo I de TGF-β1, foram investigados dois
polimorfismos: rs10512263 e rs7850895. Em relação ao rs7850895, encontramos
apenas um estudo que reporta a genotipagem deste polimorfismo em judeus asquenazes
com câncer colorretal, contudo a frequência do heterozigoto polimórfico (única variante
polimórfica encontrada) não diferiu em casos (4,2%) e controles (4,4%) (128). Em
nossa amostra, a frequência do heterozigoto foi maior (15%), mas também não
diferenciou benignos e malignos (p=1,000). Para o polimorfismo rs10512263 Chen e
col. encontraram associação do genótipo heterozigoto em população chinesa com câncer
gástrico sugerindo aumento de suscetibilidade à doença (CT versus CC, regressão
logística ajustada para idade, sexo e tabagismo p=0,033, OR 1.29, IC95%: 1.02–1.62);
essa associação não se repetiu considerando apenas o homozigoto polimórfico (TT
versus CC, p=0,673) ou a soma dos genótipos alterados (CT+TT versus CC, p=0,072)
(129). Em outro estudo com mulheres chinesas de etnia Han, na análise individual a
diferença entre os genótipos de rs10512263 só foi diferente no teste de qui-quadrado
(p=0,0059), mas não na regressão logística no modelo dominante (CT+TT versus CC,
p=0,6240). Autores também realizaram uma análise binária, chamada CART, que
identifica subgrupos de amostras com potencial de risco: mulheres que herdavam os
genótipos alterados de rs10512263 (CT/TT) e o genótipo selvagem do polimorfismo
rs6478974, outro polimorfismo intrônico de TGFBR1, tinham chance 7 vezes maior de
terem câncer endometrial (OR = 7.86, IC95%: 3.42–18.07, p<0,0001) (111). Entretanto,
um grupo de pesquisa do Reino Unido mostrou dados diferentes: o menor alelo T esteve
associado com proteção ao câncer de mama em mulheres britânicas com câncer de
mama (OR 0.87, IC95%: 0.81-0.95, p=0,001) (130). Em nódulos tireoidianos, nossos
dados não demonstram relação deste polimorfismo com suscetibilidade, contudo os
genótipos alterados foram mais frequentes em nódulos sem invasão (43%) quando
comparados ao grupo de nódulos com invasão capsular, vascular ou linfática (22%),
sugerindo também um efeito protetor (OR 0.3715, IC95%: 0.1698 - 0.8127, p=0,0173).
As diferenças desses resultados muito provavelmente se devem ao diferente background
78
genético das populações estudadas. Considerando-se a elevada heterogeneidade da
população brasileira, este dado merece maior investigação pois tem potencial
importância clínica, se comprovado.
O último polimorfismo investigado, rs2228048 do gene TGFBR2, não
demonstrou correlação com nenhum parâmetro avaliado. O genótipo homozigoto
selvagem foi presente em 97 e 95% dos nódulos benignos e malignos, respectivamente.
Ikeda, H. encontrou por sequenciamento direto 29% dos prolactinomas investigados
com substituição de base C por T (131), similar ao estudo de Lim e col. (132) que
encontraram frequência de 28% do alelo alterado T nos controles, mas somente em 25%
entre os casos de pacientes com acidente vascular cerebral (AVC) isquêmico e em
18,5% em pacientes com AVC hemorrágico também pela técnica de sequenciamento
direto. A frequência do alelo T foi maior e estatisticamente significante em pacientes
hemorrágico que em controles (OR 1.70, IC95%: 1.20-2.42, p = 0,003), sendo associado
ao aumento de risco para a doença, mas não comparando o grupo isquêmico e controles
(OR 1.12, IC95%: 0.79−1.59, p=0,53) (132). Este polimorfismo já havia sido
previamente associado à prevalência de doença renal crônica em população japonesa
(133). Não existem, até o momento, estudos que relatem a função deste polimorfismo.
Em diversos tipos celulares o TGF-β1 é responsável pelo controle da
proliferação celular que se dá, principalmente, pelo controle do ciclo celular e pela
indução da morte celular programada através da transcrição de genes pró-apoptóticos
mediada pelas SMADs (134-136). Na tireoide, a sinalização de TGF-β1 controla a
função e diferenciação das células foliculares tireoidianas através da regulação
transcricional de genes como PAX8 e TTF1, fatores de transcrição tireoide específicos,
que por sua vez, controlam a transcrição de genes que codificam moléculas importantes
para o funcionamento da célula tireoidianas como a tireoglobulina (Tg), a tiroperoxidase
(TPO), o transportador de sódio iodeto (NIS) e o receptor do hormônio tireoestimulante
(TSH-R) (137, 138).
Não é novidade dizer que a expressão de TGF-β1 se encontra aumentada em
células malignas. De fato, isso tem sido demonstrado em variados tipos de tumor e
extensamente relacionado com a progressão destes. Os primeiros trabalhos com
avaliação da expressão de TGF-β1 em tecidos tireoidianos datam a década de 90 (139,
140). Em 1999, Kimura e col. evidenciaram, por análise imunoistoquímica, a maior
expressão de TGF-β1 em CDT e bócios comparados ao tecido normal tireoidiano (141)
79
e desde então uma série de dados vêm sendo publicados a fim de melhor delinear o
papel do gene TGFB1 e de seus receptores TGFBR1 e TGFBR2.
Em um estudo piloto, Brace e col. realizaram a quantificação do RNAm de
TGFB1 e TGFB2 por PCRq em 23 amostras de bócios e 24 CPT. As médias de RNAm
foram maiores nos papilíferos do que nos bócios considerando TGFB1 (p<0,0001), mas
não TGFB2 (p=0,4735) (142). Kajdaniuk e col. foram o primeiro grupo a investigar
simultaneamente a expressão de TGFB1 e seus receptores TGFBR1 e TGFBR2 por PCR
em Tempo Real no tecido tireoidiano. Usando 6 CPT, 27 bócios multinodulares
atóxicos (BMA), 22 bócios multinodulares tóxicos (BMT) e 8 tecidos com a doença
autoimune de Graves (DG), os autores encontraram diferenças entre CPT e BM
(p=0,015) e CPT e DG (p=0,001) para o gene TGFB1, sempre com o tecido maligno
apresentando maior expressão do que os benignos, e CPT e BMT (p=0,0118) e CPT e
DG (p=0,0019) para o gene TGFBR2,sendo que para este último, a maior expressão foi
encontrada no tecido benigno (143). Os autores também realizaram a quantificação de
TGFB1 no sangue desses pacientes e concluíram que essa expressão não refletia o
processo patológico que ocorre na glândula (143). Os dados encontrados por nós vão de
encontro aos disponíveis na literatura: encontramos maior expressão de TGFB1 no
tecido neoplásico maligno comparado ao tecido benigno (2,320±1,410 versus
1,080±0,740 UA, p<0,0001) e ao tecido normal (2,320±1,410 versus 0,990±0,250 UA,
p<0,0001), e mostramos com os valores de especificidade (72%) e VPN (98%)
encontrados na curva ROC que este gene pode ser útil para auxiliar na exclusão de
malignidade dos nódulos indeterminados. Demonstramos também, pela correlação de
Spearman, que a expressão de TGFB1 é maior em tumores de menor diâmetro
(p=0,04486, correlação negativa R= -0.1768); de fato, dentre os tipos histológicos
analisados, os mPT foram os que apresentaram as maiores de médias de expressão de
RNAm.
Recentemente Eloy e col., a fim de avaliar a relação de TGF-β1 com
agressividade tumoral, propuseram uma divisão dos tumores tireoidianos malignos
como carcinomas bem delimitados, para aqueles sem características infiltrativas e
metástase linfonodal, e carcinomas pobremente delimitados, para os que apresentavam
tais características (infiltração e metástase linfonodal). Usando tal critério, os autores
evidenciaram, por análise imunoistoquímica, que a expressão citoplasmática de TGF-β1
era menor no centro dos carcinomas bem delimitados e essa expressão aumentava à
80
medida que os tumores demonstravam evidências de invasão (144), reforçando a
hipótese de que este gene seja importante para a progressão do tumor e sua
agressividade.
Em relação aos receptores, o TGFBR1 também demonstrou maior expressão de
RNAm nos tecidos malignos em comparação aos benignos, contudo a análise de
potencial diagnóstico revelou uma acurácia não satisfatória (72%). Já para o receptor do
tipo II (TGFBR2) foi evidenciada perda de expressão do RNAm em tecidos malignos e
benignos em relação ao tecido normal. Os dados de literatura apontam para uma
participação da sinalização de TGF-β1, assim como seus receptores e as proteínas
SMADs, nas neoplasias humanas (93, 94). Hachim e col., de fato, constataram menor
expressão de RNAm dos receptores TGFBR1 e TGFBR2 no câncer de mama
comparado ao tecido normal adjacente (no caso de TGFBR1 não obtiveram
significância estatística), assim como na avaliação imunoistoquímica, sendo a expressão
de TβR1 positiva em 100% dos tecidos benignos, mas apenas em 71% dos malignos
com presença de invasão e 66% dos carcinomas in situ e a expressão de TβR2 em
100%, 75% e 67%, respectivamente, nos 3 grupos (145). A diferença entre os resultados
encontrados pelo nosso grupo e o de Hachim e col. (145), considerando o receptor I,
pode ser explicada pelo padrão de expressão da proteína TβR1 que encontramos no
tecido tireoidiano, além do fato do tipo de tecido analisado (mama e tireoide) ter
diferentes particularidades. Nossa análise imunoistoquímica superficial demonstrou
acentuada expressão de TβR1 nos vasos dispostos no tumor tireoidiano e fraca
expressão desta proteína no próprio tecido (dados não demonstrados). Este padrão não
foi reportado em outros estudos, de nosso conhecimento. Lazzereschi e col. já haviam
previamente constatado a diminuição da expressão de RNAm de TGFBR2, pela técnica
de Northern Blot, em tumores malignos da tireoide como CPT, CFT e CAT em relação
à tecidos normais adjacentes e adenomas (146). Essa perda de expressão de TGFBR2 no
epitélio resulta no aumento da expressão de quimiocinas como CXCL1 e CXCL5 e do
gene BST2 (bone marrow stromal antigen 2) e diminuição da expressão de CXCL12 e
genes como PDGFB e CTGF; quimiocinas e genes frequentemente associados com pior
prognóstico em diferentes neoplasias (108).
Apesar de não apresentaram diferenças estatisticamente significantes, notamos
elevada expressão de RNAm de TGFBR1 em nódulos malignos não encapsulados, com
presença de invasão e presença de metástase linfonal. A presença de TGFBR1 tem sido
81
relacionada com o aumento da angiogênese em tumores de mama e pâncreas, e nossa
hipótese é que o mesmo deve acontecer nos tumores tireoidianos, já que a sinalização
ativada de TGF-β1 promove a expressão das metaloproteases de matriz que causam a
degradação da matriz extracelular e, consequentemente, facilita o acesso de fatores de
crescimento como VEGF e TGF-β1, resultando no aumento da angiogênese e invasão
tumoral.
Embora as características de agressividade e progressão tumoral que estreitam a
relação tumor e TGF-β1 não sejam frequentes em nossa casuística, nossos dados
suportam a participação de TGF-β1 e dos receptores TβRI e TβRII no processo
patológico que ocorre na glândula durante a transformação maligna. Evidências na
literatura sugerem que não somente a via do TGF-β1, mas também interações desta via
com células do sistema imune e outras proteínas presentes no microambiente tumoral
modulam o comportamento da célula neoplásica (147).
82
6. RESUMO DOS ACHADOS
O gene TGFB1 demonstrou associação de dois polimorfismos (rs1800469 e
rs1800472) com características de agressividade do tumor como ausência de cápsula e
metástase linfonodal ao diagnóstico e o genótipo alterado. Sua expressão gênica foi
maior em tecidos malignos, demonstrando satisfatório potencial diagnóstico (acurácia
de 82%), assim como tumores de menor diâmetro apresentavam maiores quantidades de
RNAm.
No gene TGFBR1, o polimorfismo rs10512263 demonstrou associação do
genótipo alterado com ausência de invasão. Tumores malignos apresentavam maior
expressão de RNAm.
No gene TGFBR2 foi constatada a perda de expressão de RNAm no tecido
maligno e benigno comparado ao tecido normal.
83
7. CONCLUSÃO
A expressão gênica de TGFB1 pode ser uma ferramenta útil para auxiliar no
diagnóstico de nódulos benignos da tireoide.
Polimorfismos do gene TGFB1 e de seu receptor TGFBR1, mas não de
TGFBR2, podem auxiliar na caracterização de tumores mais ou menos agressivos,
auxiliando na determinação do prognóstico de pacientes com CDT. Contudo, mais
estudos com um maior número amostral e seguimento prolongado dos pacientes são
necessários para confirmar esses dados.
84
8. REFERÊNCIAS
1. Davies L, Ouellette M, Hunter M, Welch HG. The increasing incidence of small
thyroid cancers: where are the cases coming from? Laryngoscope. 2010;120(12):2446-
51.
2. Lim H, Devesa SS, Sosa JA, Check D, Kitahara CM. Trends in Thyroid Cancer
Incidence and Mortality in the United States, 1974-2013. JAMA. 2017;317(13):1338-
48.
3. Papini E, Guglielmi R, Bianchini A, Crescenzi A, Taccogna S, Nardi F, et al.
Risk of malignancy in nonpalpable thyroid nodules: predictive value of ultrasound and
color-Doppler features. J Clin Endocrinol Metab. 2002;87(5):1941-6.
4. Durante C, Costante G, Lucisano G, Bruno R, Meringolo D, Paciaroni A, et al.
The natural history of benign thyroid nodules. JAMA. 2015;313(9):926-35.
5. Cabanillas ME, McFadden DG, Durante C. Thyroid cancer. Lancet.
2016;388(10061):2783-95.
6. Society AC. Cancer Facts & Figures 2015. Atlanta: American Cancer
Society2015.
7. (INCA) INdC. Incidência de Câncer no Brasil. Estimativa 2016. 2016.
8. Parkin DM, Muir CS. Cancer Incidence in Five Continents. Comparability and
quality of data. IARC Sci Publ. 1992(120):45-173.
9. Choi KU, Kim JY, Park DY, Lee CH, Sol MY, Han KT, et al.
Recommendations for the management of cystic thyroid nodules. ANZ J Surg.
2005;75(7):537-41.
10. Hay ID, Thompson GB, Grant CS, Bergstralh EJ, Dvorak CE, Gorman CA, et al.
Papillary thyroid carcinoma managed at the Mayo Clinic during six decades (1940-
1999): temporal trends in initial therapy and long-term outcome in 2444 consecutively
treated patients. World J Surg. 2002;26(8):879-85.
11. Mazzaferri EL, Kloos RT. Clinical review 128: Current approaches to primary
therapy for papillary and follicular thyroid cancer. J Clin Endocrinol Metab.
2001;86(4):1447-63.
12. Han JM, Kim WB, Yim JH, Kim WG, Kim TY, Ryu JS, et al. Long-term
clinical outcome of differentiated thyroid cancer patients with undetectable stimulated
thyroglobulin level one year after initial treatment. Thyroid. 2012;22(8):784-90.
13. Scheumann GF, Gimm O, Wegener G, Hundeshagen H, Dralle H. Prognostic
significance and surgical management of locoregional lymph node metastases in
papillary thyroid cancer. World J Surg. 1994;18(4):559-67; discussion 67-8.
14. DeGroot LJ, Kaplan EL, Shukla MS, Salti G, Straus FH. Morbidity and
mortality in follicular thyroid cancer. J Clin Endocrinol Metab. 1995;80(10):2946-53.
15. Ross DS, Tuttle RM. Observing micopapillary thyroid cancers. Thyroid.
2014;24(1):3-6.
16. Ito Y, Miyauchi A, Kihara M, Higashiyama T, Kobayashi K, Miya A. Patient
age is significantly related to the progression of papillary microcarcinoma of the thyroid
under observation. Thyroid. 2014;24(1):7.
17. Ito Y, Uruno T, Nakano K, Takamura Y, Miya A, Kobayashi K, et al. An
observation trial without surgical treatment in patients with papillary microcarcinoma of
the thyroid. Thyroid. 2003;13:6.
18. Nikiforov YE, Seethala RR, Tallini G, Baloch ZW, Basolo F, Thompson LD, et
al. Nomenclature Revision for Encapsulated Follicular Variant of Papillary Thyroid
Carcinoma: A Paradigm Shift to Reduce Overtreatment of Indolent Tumors. JAMA
Oncol. 2016;2(8):1023-9.
85
19. Baloch ZW, LiVolsi VA. Encapsulated follicular variant of papillary thyroid
carcinoma with bone metastases. Mod Pathol. 2000;13(8):861-5.
20. Hunt JL, Dacic S, Barnes EL, Bures JC. Encapsulated follicular variant of
papillary thyroid carcinoma. Am J Clin Pathol. 2002;118(4):602-3; author reply 5-6.
21. Rivera M, Ricarte-Filho J, Patel S, Tuttle M, Shaha A, Shah JP, et al.
Encapsulated thyroid tumors of follicular cell origin with high grade features (high
mitotic rate/tumor necrosis): a clinicopathologic and molecular study. Hum Pathol.
2010;41(2):172-80.
22. Gilliland FD, Hunt WC, Morris DM, Key CR. Prognostic factors for thyroid
carcinoma. A population-based study of 15,698 cases from the Surveillance,
Epidemiology and End Results (SEER) program 1973-1991. Cancer. 1997;79(3):564-
73.
23. McIver B, Hay ID, Giuffrida DF, Dvorak CE, Grant CS, Thompson GB, et al.
Anaplastic thyroid carcinoma: a 50-year experience at a single institution. Surgery.
2001;130(6):1028-34.
24. Passler C, Scheuba C, Prager G, Kaserer K, Flores JA, Vierhapper H, et al.
Anaplastic (undifferentiated) thyroid carcinoma (ATC). A retrospective analysis.
Langenbecks Arch Surg. 1999;384(3):284-93.
25. Moretti F, Farsetti A, Soddu S, Misiti S, Crescenzi M, Filetti S, et al. p53 re-
expression inhibits proliferation and restores differentiation of human thyroid anaplastic
carcinoma cells. Oncogene. 1997;14(6):729-40.
26. Sherman SI. Anaplastic carcinoma: clinical aspects. In: Wartofsky L, editor.
Thyroid cancer a comprehensive guide to clinical management. Humana, New
Jersey1999.
27. Ball DW, Baylin BB, de Bustros AC. Medullary Thyroid Carcinoma. In:
Braverman LE, Utiger RD, editors. Philadelphia: Lippincott Raven; 1996. p. 946-60.
28. Leboulleux S, Baudin E, Travagli JP, Schlumberger M. Medullary thyroid
carcinoma. Clin Endocrinol (Oxf). 2004;61(3):299-310.
29. Brandi ML, Gagel RF, Angeli A, Bilezikian JP, Beck-Peccoz P, Bordi C, et al.
Guidelines for diagnosis and therapy of MEN type 1 and type 2. J Clin Endocrinol
Metab. 2001;86(12):5658-71.
30. Niccoli-Sire P, Murat A, Rohmer V, Franc S, Chabrier G, Baldet L, et al.
Familial medullary thyroid carcinoma with noncysteine ret mutations: phenotype-
genotype relationship in a large series of patients. J Clin Endocrinol Metab.
2001;86(8):3746-53.
31. Gagel RF, Cote GJ. Pathogenesis of medullary thyroid carcinoma. In: Fagin JA,
editor. Thyroid cancer. Boston: Kluwer Academic Publishers; 1998. p. 85-103.
32. Maciel RMB. Carcinoma diferenciado da tiróide (Papilífero e Folicular):
diagnóstico e conduta. Arquivos Brasileiros de Endocrinologia & Metabologia.
1998;42:299-305.
33. Gharib H, Goellner JR, Johnson DA. Fine-needle aspiration cytology of the
thyroid. A 12-year experience with 11,000 biopsies. Clin Lab Med. 1993;13(3):699-
709.
34. Bongiovanni M, Spitale A, Faquin WC, Mazzucchelli L, Baloch ZW. The
Bethesda System for Reporting Thyroid Cytopathology: a meta-analysis. Acta Cytol.
2012;56(4):333-9.
35. Haugen BR, Alexander EK, Bible KC, Doherty GM, Mandel SJ, Nikiforov YE,
et al. 2015 American Thyroid Association Management Guidelines for Adult Patients
with Thyroid Nodules and Differentiated Thyroid Cancer: The American Thyroid
86
Association Guidelines Task Force on Thyroid Nodules and Differentiated Thyroid
Cancer. Thyroid. 2016;26(1):1-133.
36. Cantara S, Marzocchi C, Pilli T, Cardinale S, Forleo R, Castagna MG, et al.
Molecular Signature of Indeterminate Thyroid Lesions: Current Methods to Improve
Fine Needle Aspiration Cytology (FNAC) Diagnosis. Int J Mol Sci. 2017;18(4).
37. Hamming JF, Goslings BM, van Steenis GJ, van Ravenswaay Claasen H,
Hermans J, van de Velde CJ. The value of fine-needle aspiration biopsy in patients with
nodular thyroid disease divided into groups of suspicion of malignant neoplasms on
clinical grounds. Archives of internal medicine. 1990;150(1):113-6.
38. Cibas ES, Ali SZ. The Bethesda System for Reporting Thyroid Cytopathology.
Thyroid. 2009;19(11):1159-65.
39. Cibas ES, Ali SZ. The 2017 Bethesda System for Reporting Thyroid
Cytopathology. Thyroid. 2017;27(11):1341-6.
40. Basolo F, Torregrossa L, Giannini R, Miccoli M, Lupi C, Sensi E, et al.
Correlation between the BRAF V600E mutation and tumor invasiveness in papillary
thyroid carcinomas smaller than 20 millimeters: analysis of 1060 cases. J Clin
Endocrinol Metab. 2010;95(9):4197-205.
41. O'Neill CJ, Bullock M, Chou A, Sidhu SB, Delbridge LW, Robinson BG, et al.
BRAF(V600E) mutation is associated with an increased risk of nodal recurrence
requiring reoperative surgery in patients with papillary thyroid cancer. Surgery.
2010;148(6):1139-45; discussion 45-6.
42. Davies H, Bignell GR, Cox C, Stephens P, Edkins S, Clegg S, et al. Mutations of
the BRAF gene in human cancer. Nature. 2002;417(6892):949-54.
43. Soares P, Fonseca E, Wynford-Thomas D, Sobrinho-Simoes M. Sporadic ret-
rearranged papillary carcinoma of the thyroid: a subset of slow growing, less aggressive
thyroid neoplasms? J Pathol. 1998;185(1):71-8.
44. Nikiforov YE. RET/PTC rearrangement in thyroid tumors. Endocr Pathol.
2002;13(1):3-16.
45. Mochizuki K, Kondo T, Nakazawa T, Iwashina M, Kawasaki T, Nakamura N, et
al. RET rearrangements and BRAF mutation in undifferentiated thyroid carcinomas
having papillary carcinoma components. Histopathology. 2010;57(3):444-50.
46. Ibanez CF. Structure and physiology of the RET receptor tyrosine kinase. Cold
Spring Harb Perspect Biol. 2013;5(2).
47. Arighi E, Borrello MG, Sariola H. RET tyrosine kinase signaling in
development and cancer. Cytokine Growth Factor Rev. 2005;16(4-5):441-67.
48. Nikiforov YE, Nikiforova MN. Molecular genetics and diagnosis of thyroid
cancer. Nat Rev Endocrinol. 2011;7(10):569-80.
49. Armstrong MJ, Yang H, Yip L, Ohori NP, McCoy KL, Stang MT, et al.
PAX8/PPARgamma rearrangement in thyroid nodules predicts follicular-pattern
carcinomas, in particular the encapsulated follicular variant of papillary carcinoma.
Thyroid. 2014;24(9):1369-74.
50. Soares P, Celestino R, Melo M, Fonseca E, Sobrinho-Simoes M. Prognostic
biomarkers in thyroid cancer. Virchows Arch. 2014;464(3):333-46.
51. Dwight T, Thoppe SR, Foukakis T, Lui WO, Wallin G, Hoog A, et al.
Involvement of the PAX8/peroxisome proliferator-activated receptor gamma
rearrangement in follicular thyroid tumors. J Clin Endocrinol Metab. 2003;88(9):4440-
5.
52. Nikiforova MN, Lynch RA, Biddinger PW, Alexander EK, Dorn GW, 2nd,
Tallini G, et al. RAS point mutations and PAX8-PPAR gamma rearrangement in
87
thyroid tumors: evidence for distinct molecular pathways in thyroid follicular
carcinoma. J Clin Endocrinol Metab. 2003;88(5):2318-26.
53. Sobrinho-Simoes M, Maximo V, Rocha AS, Trovisco V, Castro P, Preto A, et
al. Intragenic mutations in thyroid cancer. Endocrinol Metab Clin North Am.
2008;37(2):333-62, viii.
54. Finney RE, Bishop JM. Predisposition to neoplastic transformation caused by
gene replacement of H-ras1. Science. 1993;260(5113):1524-7.
55. Fagin JA, Matsuo K, Karmakar A, Chen DL, Tang SH, Koeffler HP. High
prevalence of mutations of the p53 gene in poorly differentiated human thyroid
carcinomas. J Clin Invest. 1993;91(1):179-84.
56. Clinkscales W, Ong A, Nguyen S, Harruff EE, Gillespie MB. Diagnostic Value
of RAS Mutations in Indeterminate Thyroid Nodules. Otolaryngol Head Neck Surg.
2017;156(3):472-9.
57. Paulson VA, Shivdasani P, Angell TE, Cibas ES, Krane JF, Lindeman NI, et al.
Noninvasive Follicular Thyroid Neoplasm with Papillary-Like Nuclear Features
Accounts for More Than Half of "Carcinomas" Harboring RAS Mutations. Thyroid.
2017;27(4):506-11.
58. Landa I, Ganly I, Chan TA, Mitsutake N, Matsuse M, Ibrahimpasic T, et al.
Frequent somatic TERT promoter mutations in thyroid cancer: higher prevalence in
advanced forms of the disease. J Clin Endocrinol Metab. 2013;98(9):E1562-6.
59. Melo M, da Rocha AG, Vinagre J, Batista R, Peixoto J, Tavares C, et al. TERT
promoter mutations are a major indicator of poor outcome in differentiated thyroid
carcinomas. J Clin Endocrinol Metab. 2014;99(5):E754-65.
60. Moon S, Song YS, Kim YA, Lim JA, Cho SW, Moon JH, et al. Effects of
Coexistent BRAFV600E and TERT Promoter Mutations on Poor Clinical Outcomes in
Papillary Thyroid Cancer: A Meta-Analysis. Thyroid. 2017;27(5):651-60.
61. Nikiforov YE, Ohori NP, Hodak SP, Carty SE, LeBeau SO, Ferris RL, et al.
Impact of mutational testing on the diagnosis and management of patients with
cytologically indeterminate thyroid nodules: a prospective analysis of 1056 FNA
samples. J Clin Endocrinol Metab. 2011;96(11):3390-7.
62. Nikiforov YE, Carty SE, Chiosea SI, Coyne C, Duvvuri U, Ferris RL, et al.
Impact of the Multi-Gene ThyroSeq Next-Generation Sequencing Assay on Cancer
Diagnosis in Thyroid Nodules with Atypia of Undetermined Significance/Follicular
Lesion of Undetermined Significance Cytology. Thyroid. 2015;25(11):1217-23.
63. Alexander EK, Kennedy GC, Baloch ZW, Cibas ES, Chudova D, Diggans J, et
al. Preoperative diagnosis of benign thyroid nodules with indeterminate cytology. The
New England journal of medicine. 2012;367(8):705-15.
64. Bar D, Meiri, E., et al. A First-of-its-Kind, microRNA-based Diagnostic Assay
for Accurate Thyroid Nodule Classification. 15th International Thyroid Congress (ITC)
and 85th Annual Meeting of the American Thyroid Association (ATA), Orlando,
Florida. 2015.
65. Labourier E, Beaudenon, A., Wylie, D., Giordano, T.J. . Multi-categorical
testing for miRNA, mRNA and DNA on fine needle aspiration improves the
preoperative diagnosis of thyroid nodules with indeterminate cytology. 97th Meeting
and Expo of the Endocrine Society 2015:SAT-344.
66. Chin D, Boyle GM, Parsons PG, Coman WB. What is transforming growth
factor-beta (TGF-beta)? Br J Plast Surg. 2004;57(3):215-21.
67. Kubiczkova L, Sedlarikova L, Hajek R, Sevcikova S. TGF-beta - an excellent
servant but a bad master. J Transl Med. 2012;10:183.
88
68. Derynck R, Akhurst RJ, Balmain A. TGF-beta signaling in tumor suppression
and cancer progression. Nat Genet. 2001;29(2):117-29.
69. Kehrl JH, Wakefield LM, Roberts AB, Jakowlew S, Alvarez-Mon M, Derynck
R, et al. Production of transforming growth factor beta by human T lymphocytes and its
potential role in the regulation of T cell growth. J Exp Med. 1986;163(5):1037-50.
70. Ge YZ, Wu R, Lu TZ, Jia RP, Li MH, Gao XF, et al. Combined effects of
TGFB1 +869 T/C and +915 G/C polymorphisms on acute rejection risk in solid organ
transplant recipients: a systematic review and meta-analysis. PLoS One.
2014;9(4):e93938.
71. Gentry LE, Nash BW. The pro domain of pre-pro-transforming growth factor
beta 1 when independently expressed is a functional binding protein for the mature
growth factor. Biochemistry. 1990;29(29):6851-7.
72. Poniatowski LA, Wojdasiewicz P, Gasik R, Szukiewicz D. Transforming growth
factor Beta family: insight into the role of growth factors in regulation of fracture
healing biology and potential clinical applications. Mediators of inflammation.
2015;2015:137823.
73. Annes JP, Munger JS, Rifkin DB. Making sense of latent TGFbeta activation.
Journal of cell science. 2003;116(Pt 2):217-24.
74. Zhu HJ, Burgess AW. Regulation of transforming growth factor-beta signaling.
Molecular cell biology research communications : MCBRC. 2001;4(6):321-30.
75. Massague J. TGF-beta signal transduction. Annual review of biochemistry.
1998;67:753-91.
76. Shi Y, Massague J. Mechanisms of TGF-beta signaling from cell membrane to
the nucleus. Cell. 2003;113(6):685-700.
77. Chen YG. Endocytic regulation of TGF-beta signaling. Cell research.
2009;19(1):58-70.
78. Huse M, Muir TW, Xu L, Chen YG, Kuriyan J, Massague J. The TGF beta
receptor activation process: an inhibitor- to substrate-binding switch. Molecular cell.
2001;8(3):671-82.
79. Mu Y, Gudey SK, Landstrom M. Non-Smad signaling pathways. Cell and tissue
research. 2012;347(1):11-20.
80. Akhurst RJ, Hata A. Targeting the TGFbeta signalling pathway in disease.
Nature reviews Drug discovery. 2012;11(10):790-811.
81. Derynck R, Rhee L, Chen EY, Van Tilburg A. Intron-exon structure of the
human transforming growth factor-beta precursor gene. Nucleic acids research.
1987;15(7):3188-9.
82. Thys M, Schrauwen I, Vanderstraeten K, Janssens K, Dieltjens N, Van Den
Bogaert K, et al. The coding polymorphism T263I in TGF-beta1 is associated with
otosclerosis in two independent populations. Human molecular genetics.
2007;16(17):2021-30.
83. Cambien F, Ricard S, Troesch A, Mallet C, Generenaz L, Evans A, et al.
Polymorphisms of the transforming growth factor-beta 1 gene in relation to myocardial
infarction and blood pressure. The Etude Cas-Temoin de l'Infarctus du Myocarde
(ECTIM) Study. Hypertension. 1996;28(5):881-7.
84. Shah R, Rahaman B, Hurley CK, Posch PE. Allelic diversity in the TGFB1
regulatory region: characterization of novel functional single nucleotide
polymorphisms. Human genetics. 2006;119(1-2):61-74.
85. Shah R, Hurley CK, Posch PE. A molecular mechanism for the differential
regulation of TGF-beta1 expression due to the common SNP -509C-T (c. -1347C > T).
Human genetics. 2006;120(4):461-9.
89
86. Guo W, Dong Z, Guo Y, Chen Z, Yang Z, Kuang G. Association of
polymorphisms in transforming growth factor-beta receptors with susceptibility to
gastric cardia adenocarcinoma. Molecular biology reports. 2012;39(4):4301-9.
87. Martelossi Cebinelli GC, Paiva Trugilo K, Badaro Garcia S, Brajao de Oliveira
K. TGF-beta1 functional polymorphisms: a review. European cytokine network.
2016;27(4):81-9.
88. Jo BS, Choi SS. Introns: The Functional Benefits of Introns in Genomes.
Genomics & informatics. 2015;13(4):112-8.
89. NCBI. Database of Single Nucleotide Polymorphisms (SNPs) [cited 2017].
Available from: https://www.ncbi.nlm.nih.gov/snp/.
90. Pasche B, Luo Y, Rao PH, Nimer SD, Dmitrovsky E, Caron P, et al. Type I
transforming growth factor beta receptor maps to 9q22 and exhibits a polymorphism
and a rare variant within a polyalanine tract. Cancer Res. 1998;58(13):2727-32.
91. EMBI-EBI. Esembl Project Cambridge, United Kingdom: European Molecular
Biology Laboratory's European Bioinformatics Institute; 2000 [cited 2017].
92. Pierce BA. Genetics: a conceitural approach 3, editor. New York W.H. Freeman
and Co. ; 2009.
93. Levy L, Hill CS. Alterations in components of the TGF-beta superfamily
signaling pathways in human cancer. Cytokine Growth Factor Rev. 2006;17(1-2):41-58.
94. Bierie B, Moses HL. TGF-beta and cancer. Cytokine Growth Factor Rev.
2006;17(1-2):29-40.
95. Xu J, Lamouille S, Derynck R. TGF-β-induced epithelial to mesenchymal
transition. Cell research. 2009;19:156-72.
96. Dumont N, Arteaga CL. Targeting the TGF beta signaling network in human
neoplasia. Cancer cell. 2003;3(6):531-6.
97. Mincione G, Di Marcantonio MC, Tarantelli C, D'Inzeo S, Nicolussi A, Nardi F,
et al. EGF and TGF-beta1 Effects on Thyroid Function. Journal of thyroid research.
2011;2011:431718.
98. Riesco-Eizaguirre G, Rodriguez I, De la Vieja A, Costamagna E, Carrasco N,
Nistal M, et al. The BRAFV600E oncogene induces transforming growth factor beta
secretion leading to sodium iodide symporter repression and increased malignancy in
thyroid cancer. Cancer Res. 2009;69(21):8317-25.
99. Colletta G, Cirafici AM, Di Carlo A. Dual effect of transforming growth factor
beta on rat thyroid cells: inhibition of thyrotropin-induced proliferation and reduction of
thyroid-specific differentiation markers. Cancer Res. 1989;49(13):3457-62.
100. Bierie B, Moses HL. Transforming growth factor beta (TGF-beta) and
inflammation in cancer. Cytokine Growth Factor Rev. 2010;21(1):49-59.
101. Gong D, Shi W, Yi SJ, Chen H, Groffen J, Heisterkamp N. TGFbeta signaling
plays a critical role in promoting alternative macrophage activation. BMC immunology.
2012;13:31.
102. Fridlender ZG, Sun J, Kim S, Kapoor V, Cheng G, Ling L, et al. Polarization of
tumor-associated neutrophil phenotype by TGF-beta: "N1" versus "N2" TAN. Cancer
cell. 2009;16(3):183-94.
103. Marcoe JP, Lim JR, Schaubert KL, Fodil-Cornu N, Matka M, McCubbrey AL,
et al. TGF-beta is responsible for NK cell immaturity during ontogeny and increased
susceptibility to infection during mouse infancy. Nature immunology. 2012;13(9):843-
50.
104. Jochems C, Schlom J. Tumor-infiltrating immune cells and prognosis: the
potential link between conventional cancer therapy and immunity. Experimental biology
and medicine. 2011;236(5):567-79.
90
105. Safina A, Vandette E, Bakin AV. ALK5 promotes tumor angiogenesis by
upregulating matrix metalloproteinase-9 in tumor cells. Oncogene. 2007;26(17):2407-
22.
106. Schniewind B, Groth S, Sebens Muerkoster S, Sipos B, Schafer H, Kalthoff H,
et al. Dissecting the role of TGF-beta type I receptor/ALK5 in pancreatic ductal
adenocarcinoma: Smad activation is crucial for both the tumor suppressive and
prometastatic function. Oncogene. 2007;26(33):4850-62.
107. Bierie B, Moses HL. Gain or loss of TGFbeta signaling in mammary carcinoma
cells can promote metastasis. Cell cycle. 2009;8(20):3319-27.
108. Bierie B, Chung CH, Parker JS, Stover DG, Cheng N, Chytil A, et al.
Abrogation of TGF-beta signaling enhances chemokine production and correlates with
prognosis in human breast cancer. J Clin Invest. 2009;119(6):1571-82.
109. Livak KJ, Schmittgen TD. Analysis of relative gene expression data using real-
time quantitative PCR and the 2(-Delta Delta C(T)) Method. Methods. 2001;25(4):402-
8.
110. Cao H, Zhou Q, Lan R, Roe OD, Chen X, Chen Y, et al. A functional
polymorphism C-509T in TGFbeta-1 promoter contributes to susceptibility and
prognosis of lone atrial fibrillation in Chinese population. PLoS One.
2014;9(11):e112912.
111. Yang L, Wang YJ, Zheng LY, Jia YM, Chen YL, Chen L, et al. Genetic
Polymorphisms of TGFB1, TGFBR1, SNAI1 and TWIST1 Are Associated with
Endometrial Cancer Susceptibility in Chinese Han Women. PLoS One.
2016;11(5):e0155270.
112. Wang HB, Song WG, Liu HQ, Fang F, Xiao Y. Role of TGFB1 polymorphism
in the development of metastatic brain tumors in non-small cell lung cancer patients.
Genet Mol Res. 2015;14(2):3545-50.
113. Sommen M, Van Camp G, Liktor B, Csomor P, Fransen E, Sziklai I, et al.
Genetic association analysis in a clinically and histologically confirmed otosclerosis
population confirms association with the TGFB1 gene but suggests an association of the
RELN gene with a clinically indistinguishable otosclerosis-like phenotype. Otology &
neurotology : official publication of the American Otological Society, American
Neurotology Society [and] European Academy of Otology and Neurotology.
2014;35(6):1058-64.
114. Khalfallah A, Schrauwen I, Mnejja M, HadjKacem H, Dhouib L, Mosrati MA,
et al. Association of COL1A1 and TGFB1 polymorphisms with otosclerosis in a
Tunisian population. Annals of human genetics. 2011;75(5):598-604.
115. Langdahl BL, Uitterlinden AG, Ralston SH, Trikalinos TA, Balcells S, Brandi
ML, et al. Large-scale analysis of association between polymorphisms in the
transforming growth factor beta 1 gene (TGFB1) and osteoporosis: the GENOMOS
study. Bone. 2008;42(5):969-81.
116. Castillejo A, Rothman N, Murta-Nascimento C, Malats N, Garcia-Closas M,
Gomez-Martinez A, et al. TGFB1 and TGFBR1 polymorphic variants in relationship to
bladder cancer risk and prognosis. International journal of cancer. 2009;124(3):608-13.
117. Sigurdson AJ, Land CE, Bhatti P, Pineda M, Brenner A, Carr Z, et al. Thyroid
nodules, polymorphic variants in DNA repair and RET-related genes, and interaction
with ionizing radiation exposure from nuclear tests in Kazakhstan. Radiation research.
2009;171(1):77-88.
118. Kim WJ, Hoffman E, Reilly J, Hersh C, Demeo D, Washko G, et al. Association
of COPD candidate genes with computed tomography emphysema and airway
phenotypes in severe COPD. The European respiratory journal. 2011;37(1):39-43.
91
119. de Jong PA, Muller NL, Pare PD, Coxson HO. Computed tomographic imaging
of the airways: relationship to structure and function. The European respiratory journal.
2005;26(1):140-52.
120. Sacco O, Romberger D, Rizzino A, Beckmann JD, Rennard SI, Spurzem JR.
Spontaneous production of transforming growth factor-beta 2 by primary cultures of
bronchial epithelial cells. Effects on cell behavior in vitro. J Clin Invest.
1992;90(4):1379-85.
121. Massague J. The transforming growth factor-beta family. Annual review of cell
biology. 1990;6:597-641.
122. Wan PQ, Wu JZ, Huang LY, Wu JL, Wei YH, Ning QY. TGF-beta1
polymorphisms and familial aggregation of liver cancer in Guangxi, China. Genet Mol
Res. 2015;14(3):8147-60.
123. Lee E, Van Den Berg D, Hsu C, Ursin G, Koh WP, Yuan JM, et al. Genetic
variation in transforming growth factor beta 1 and mammographic density in Singapore
Chinese women. Cancer Res. 2013;73(6):1876-82.
124. Yang JF, Shi XP, Zhao D, Deng FM, Zhong H, Wang G, et al. [Association of
the tagging single nucleotide polymorphisms in transforming growth factor beta-1 gene
with hypertension in the Han nationality population in Xinjiang]. Zhonghua xin xue
guan bing za zhi. 2010;38(6):503-9.
125. Ito M, Hanaoka M, Droma Y, Hatayama O, Sato E, Katsuyama Y, et al. The
association of transforming growth factor beta 1 gene polymorphisms with the
emphysema phenotype of COPD in Japanese. Internal medicine. 2008;47(15):1387-94.
126. Bremer LA, Blackman SM, Vanscoy LL, McDougal KE, Bowers A, Naughton
KM, et al. Interaction between a novel TGFB1 haplotype and CFTR genotype is
associated with improved lung function in cystic fibrosis. Human molecular genetics.
2008;17(14):2228-37.
127. Ward SV, Cadby G, Heyworth JS, Fear MW, Wallace HJ, Cole JM, et al.
Association of TGFbeta1 and clinical factors with scar outcome following melanoma
excision. Archives of dermatological research. 2012;304(5):343-51.
128. Segui N, Stevens KN, Guino E, Rozek LS, Moreno VR, Capella G, et al. No
association between germline allele-specific expression of TGFBR1 and colorectal
cancer risk in Caucasian and Ashkenazi populations. British journal of cancer.
2011;104(4):735-40.
129. Chen J, Miao L, Jin G, Ren C, Ke Q, Qian Y, et al. TGFBR1 tagging SNPs and
gastric cancer susceptibility: a two-stage case-control study in Chinese population.
Molecular carcinogenesis. 2014;53(2):109-16.
130. Scollen S, Luccarini C, Baynes C, Driver K, Humphreys MK, Garcia-Closas M,
et al. TGF-beta signaling pathway and breast cancer susceptibility. Cancer
epidemiology, biomarkers & prevention : a publication of the American Association for
Cancer Research, cosponsored by the American Society of Preventive Oncology.
2011;20(6):1112-9.
131. Ikeda H. Mutational analysis of transforming growth factor-beta receptor type II
and Smad3 tumor suppressor genes in prolactinomas. Brain tumor pathology.
2006;23(1):7-12.
132. Lim YH, Jeong YS, Kim SK, Kim DH, Yun DH, Yoo SD, et al. Association
between TGFBR2 gene polymorphism (rs2228048, Asn389Asn) and intracerebral
hemorrhage in Korean population. Immunological investigations. 2011;40(6):569-80.
133. Yoshida T, Kato K, Yokoi K, Oguri M, Watanabe S, Metoki N, et al.
Association of gene polymorphisms with chronic kidney disease in high- or low-risk
92
subjects defined by conventional risk factors. International journal of molecular
medicine. 2009;23(6):785-92.
134. Pei XH, Xiong Y. Biochemical and cellular mechanisms of mammalian CDK
inhibitors: a few unresolved issues. Oncogene. 2005;24(17):2787-95.
135. Siegel PM, Massague J. Cytostatic and apoptotic actions of TGF-beta in
homeostasis and cancer. Nature reviews Cancer. 2003;3(11):807-21.
136. Padua D, Massague J. Roles of TGFbeta in metastasis. Cell research.
2009;19(1):89-102.
137. Costamagna E, Garcia B, Santisteban P. The functional interaction between the
paired domain transcription factor Pax8 and Smad3 is involved in transforming growth
factor-beta repression of the sodium/iodide symporter gene. J Biol Chem.
2004;279(5):3439-46.
138. Nicolussi A, D'Inzeo S, Santulli M, Colletta G, Coppa A. TGF-beta control of
rat thyroid follicular cells differentiation. Molecular and cellular endocrinology.
2003;207(1-2):1-11.
139. Jasani B, Wyllie FS, Wright PA, Lemoine NR, Williams ED, Wynford-Thomas
D. Immunocytochemically detectable TGF-beta associated with malignancy in thyroid
epithelial neoplasia. Growth factors. 1990;2(2-3):149-55.
140. van der Laan BF, Freeman JL, Asa SL. Expression of growth factors and growth
factor receptors in normal and tumorous human thyroid tissues. Thyroid. 1995;5(1):67-
73.
141. Kimura ET, Kopp P, Zbaeren J, Asmis LM, Ruchti C, Maciel RM, et al.
Expression of transforming growth factor beta1, beta2, and beta3 in multinodular
goiters and differentiated thyroid carcinomas: a comparative study. Thyroid.
1999;9(2):119-25.
142. Brace MD, Wang J, Petten M, Bullock MJ, Makki F, Trites J, et al. Differential
expression of transforming growth factor-beta in benign vs. papillary thyroid cancer
nodules; a potential diagnostic tool? Journal of otolaryngology - head & neck surgery =
Le Journal d'oto-rhino-laryngologie et de chirurgie cervico-faciale. 2014;43:22.
143. Kajdaniuk D, Marek A, Marek B, Mazurek U, Fila-Danilow A, Foltyn W, et al.
Transcriptional activity of TGFbeta1 and its receptors genes in thyroid gland.
Endokrynologia Polska. 2016;67(4):375-82.
144. Eloy C, Santos J, Cameselle-Teijeiro J, Soares P, Sobrinho-Simoes M. TGF-
beta/Smad pathway and BRAF mutation play different roles in circumscribed and
infiltrative papillary thyroid carcinoma. Virchows Arch. 2012;460(6):587-600.
145. Hachim IY, Hachim MY, Lopez-Ozuna VM, Ali S, Lebrun JJ. A dual prognostic
role for the TGFbeta receptors in human breast cancer. Hum Pathol. 2016;57:140-51.
146. Lazzereschi D, Ranieri A, Mincione G, Taccogna S, Nardi F, Colletta G. Human
malignant thyroid tumors displayed reduced levels of transforming growth factor beta
receptor type II messenger RNA and protein. Cancer Res. 1997;57(10):2071-6.
147. Pickup M, Novitskiy S, Moses HL. The roles of TGFbeta in the tumour
microenvironment. Nature reviews Cancer. 2013;13(11):788-99.
93
ANEXO