UNIVERSIDADE ESTADUAL DE CAMPINAS FACULDADE DE...

UNIVERSIDADE ESTADUAL DE CAMPINAS

FACULDADE DE CIÊNCIAS MÉDICAS

JHONATHAN ANGEL ARAUJO FERNÁNDEZ

IDENTIFICAÇÃO E CARACTERIZAÇÃO DOS GENES ASSOCIADOS COM A SÍNDROME DE USHER

CAMPINAS

2017


IDENTIFICAÇÃO E CARACTERIZAÇÃO DOS GENES ASSOCIADOS COM A SÍNDROME DE USHER

Dissertação apresentada ao Programa de Pós-Graduação em Ciências Médicas da Faculdade de Ciências Médicas da Universidade Estadual de Campinas como requisito exigidos para a obtenção do título de Mestre em Ciências Médicas, Área de Concentração Genética Médica.

ORIENTADOR: EDI LÚCIA SARTORATO

ESTE EXEMPLAR CORRESPONDE À VERSÃO

FINAL DA DISSERTAÇÃO DEFENDIDA PELO

ALUNO JHONATHAN ANGEL ARAUJO FERNÁNDEZ, ORIENTADO PELA

PROF. DRA. EDI LÚCIA SARTORATO.

CAMPINAS

2017

BANCA EXAMINADORA DA DEFESA DE MESTRADO


ORIENTADOR: EDI LÚCIA SARTORATO

MEMBROS:

1. PROF. DRA. EDI LÚCIA SARTORATO

2. PROF. DRA. CARMEN SILVIA BERTUZZO

3. PROF. DR. NIRO KASAHARA

Programa de Pós-Graduação em Ciências Médicas da Faculdade de Ciências

Médicas da Universidade Estadual de Campinas.

A ata de defesa com as respectivas assinaturas dos membros da banca

examinadora encontra-se no processo de vida acadêmica do aluno.

Data: DATA DA DEFESA 26/07/2017

A mí adorada mamá Paula Elizabeth,

que día a día me demuestra su

inmenso amor y que sin ella, nada de

esto sería posible.

AGRADECIMENTOS

À Professora Dra. Edi Lúcia Sartorato pela oportunidade, orientação, apoio, confiança e

aprendizado que me deu desde o momento que cheguei ao Brasil.

À Dra. Sueli Matilde da Silva Costa a quem tenho muito carinho por tudo que me ajudou

e ensinou tanto profissional como pessoalmente. Muito obrigado pelo carinho e amizade.

Às Professoras Dra. Monica de Cássia Alves de Paula, Dra. Mara Sanchez Guaragna e a

Dra. Andréa Trevas Maciel Guerra pela contribuição no exame de qualificação.

Aos Professores Dra. Carmen Silvia Bertuzzo, Dr. Niro Kasahara, Dr. Marcelo Lima

Ribeiro e Dra. Mara Sanchez Guaragna por terem aceitado participar como membros da

banca examinadora da dissertação de mestrado.

Às Professora Dra. Maricilda Palandi de Mello e Dra. Mônica Barbosa de Melo por

sempre estarem prontas a ajudar com suas sugestões, contribuindo na realização da tese.

Ao Professor Dr. José Paulo Cabral de Vasconcellos, a médica oftalmologista Ana

Carolina Carneiro, a médica otorrinolaringologista Raquel Andrade Lauria, a Raissa

Franchi e Regiane que ajudaram na avaliação clínica e coleta das amostras dos pacientes.

A todos os colegas do Laboratório de Genética Molecular Humana I, II e III, do Centro

de Biologia Molecular e Engenharia Genética (CBMEG), da UNICAMP que de alguma

forma contribuíram e me ajudaram na realização da dissertação: Fábio, Priscila Zonzini,

Ana Letícia, Carolina Svidnicki, Nathy Zocal, Lilian, Nathy Gavioli, Priscila Jacob,

Nadya, Carol Conti, Pamela, Helena, Paulo Miranda, Emerson, Rogério, Paulo Svidnicki,

Mirta, Gabriela, Bruno, Pedro, Alessandra Staffocker, Marcela, Débora, Taciane e Zélo.

Tem sido muito bom trabalhar com vocês.

Aos pacientes, familiares e a todos os colaboradores envolvidos, pois com certeza sem

eles este trabalho não poderia ser realizado.

Às agências financiadoras CNPq e FAPESP, pela bolsa de estudo e pelo financiamento

do projeto.

A minha avó Sadith Navarro Hidalgo, a minha família e a minha namorada Alina, pelo

apoio em todo momento.

A meus padrinhos Milka Velásquez e Juan de Dios por todo o apoio demostrado em todo

momento.

A todos que de alguma forma, direta ou indiretamente, contribuíram para a concretização

deste trabalho.

RESUMO

A síndrome de Usher (USH) é a forma mais comum de surdez e cegueira hereditária,

apresentando uma prevalência de 1 para 6.000 - 25.000 pessoas e uma taxa de portadores

de 1 a cada 100 pessoas. Clinicamente podem-se distinguir três subtipos de acordo com

a gravidade da perda auditiva, presença ou ausência de disfunção vestibular e a idade do

início da retinose pigmentosa. Os mecanismos moleculares envolvendo a síndrome de

Usher ainda não são completamente conhecidos e a ausência de estudos moleculares na

população brasileira apontam para a importância da investigação dessa condição que

acomete os indivíduos com muitos prejuízos em sua qualidade de vida. Por outro lado,

considerando a alta heterogeneidade genética da doença, um estudo molecular

aprofundado pode revelar genes causais adicionais ainda não identificados. Dessa forma,

o projeto teve como objetivo buscar variantes causadoras da síndrome de Usher. Entre as

técnicas usadas para o rastreamento foram realizados o sequenciamento de exoma e painel

de captura de genes. Dessa forma, estudou-se 11 famílias com pelo menos um indivíduo

com manifestação clínica da síndrome de Usher: oito pela técnica de sequenciamento de

exoma, uma por meio de painel de captura e duas foram apenas rastreadas variantes em

alguns exons do gene USH2A. Se encontraram 13 variantes, 11 no gene USH2A

(p.Y1123H; p.C3267R; p.N405Ifs*3; p.S1369L; p.E4034*; p.N443Mfs*18; p.F1732S;

p.S2981=fs*61; p.L4406P; p.C638*; p.M3271Sfs*30) e duas no gene CDH23

(p.A2637P; p.E2520K). Entre as alterações encontradas, a p.N443Mfs*18 foi a mais

frequente. A pesquisa de alterações moleculares em uma amostra de pacientes brasileiros,

com diagnóstico clínico de Síndrome de Usher, permitiu a elucidação da causa genética

em oito das 11 famílias estudadas, contribuindo dessa forma, para um diagnóstico mais

preciso e aconselhamento genético adequado. Além disso, os resultados obtidos no

presente estudo podem indicar as mutações mais frequentes presentes na nossa população,

permitindo otimizar testes de diagnóstico molecular para a triagem da perda auditiva em

indivíduos com suspeita de Usher para melhor prognóstico, tratamento e aconselhamento

genético. O diagnóstico genético de forma precoce possibilita reabilitação no caso da

perda auditiva e o preparo para o impacto físico e emocional decorrente da perda visual.

Palavras chaves: síndrome de Usher. exoma. retinose pigmentar.

ABSTRACT

Usher syndrome (USH) is the most common form of deafness and hereditary blindness,

with a prevalence of 1 to 6,000 - 25,000 people and a carrier rate of 1 in 100 people.

Clinically, three subtypes can be distinguished according to severity of hearing loss,

presence or absence of vestibular dysfunction, and age of onset of retinitis pigmentosa.

The molecular mechanisms involving Usher syndrome are still not fully understood and

the absence of molecular studies in the Brazilian population points to the importance of

investigating this condition that affects individuals with many impairments in their

quality of life. Therefore, considering the high genetic heterogeneity of the disease, an in-

depth molecular study may reveal additional unidentified causal genes. Thus, the purpose

of the project was to search for variants that caused Usher syndrome. Among the

approaches used for the screening were the whole exome sequencing and the gene capture

panel. Thus, 11 families were studied with at least one individual with clinical

manifestation of Usher syndrome: eight by the whole exome sequencing, one by capture

panel and two were only screened variants in some exons of the USH2A gene. We found

13 variants, 11 in USH2A gene (p.Y1123H; p.C3267R; p.N405Ifs*3; p.S1369L;

p.E4034*; p.N443Mfs*18; p.F1732S; p.S2981=fs*61; p.L4406P; p.C638*;

p.M3271Sfs*30) and two into CDH23 gene (p.A2637P; p.E2520K). Among the

alterations found, the most frequent was p.N443Mfs*18. The investigation of molecular

alterations in a sample of Brazilian patients with a clinical diagnosis of Usher Syndrome

allowed the elucidation of the genetic cause in seven of the 11 families studied, thus

contributing to a more accurate diagnosis and adequate genetic counseling. In addition,

the results obtained in the present study may indicate the most frequent mutations present

in our population, allowing the optimization of molecular diagnostic tests for hearing loss

screening in individuals with suspected Usher for better prognosis, treatment and genetic

counseling. Early genetic diagnosis enables rehabilitation in cases of hearing loss and

preparation for physical and emotional impact resulting from visual loss.

Keywords: Usher syndrome, exome, retinitis pigmentosa

LISTA DE ILUSTRAÇÕES

Figura 1: Esquema do sistema auditivo, evidenciando as principais partes da orelha

(Modificado de: Oticon Medical < http://www.oticonmedical.com/portuguese/cochlear-

implants/your-treatment/how-cochlear-implants-work/how-cochlear-implants-

work.aspx>) .................................................................................................................... 18

Figura 2: Ilustração esquemática da cóclea. Destaque para o esquema detalhado do órgão

de Corti e micrografia dos estereocílios das células ciliadas (Modificado de: “The inner

ear”, capítulo “The Auditory System” do livro “Neuroscience”, editado por Purvest et al.

2001). .............................................................................................................................. 20

Figura 3:Ilustração de um corte longitudinal do olho humano evidenciando suas

principais estruturas (Espirito Santo et al. 2010). ........................................................... 23

Figura 4:Ilustração de um corte longitudinal da retina, evidenciando suas principais

estruturas (http://otcjosealves.blogspot.com.br/2010_11_01_archive.html) .................. 23

Figura 5: Representação esquemática da estrutura da Miosina VIIa e sua interação com

as proteínas associadas com a síndrome de Usher tipo I (Figura modificada-Ahmed et

al.,2003). ......................................................................................................................... 29

Figura 6: Representação esquemática da proteína usherina, nbc3 e gpr98. (Modificado de

Reiners et al. 2005). ........................................................................................................ 31

Figura 7: Fluxograma de investigação dos indivíduos que fizeram parte do estudo ...... 36

Figura 8: Heredograma família 1 mostrando o genótipo dos indivíduos analisado. N: alelo

normal (wild type). ......................................................................................................... 59

Figura 9: Resultados do sequenciamento do exon 17 e 62 do gene USH2A. A)

Eletroferograma da variante c.3367T>C – p.Y1123H. B) Eletroferograma da variante

c.12100G>T – p.E4034*. ............................................................................................... 60

Figura 10: Heredograma família 2 mostrando o genótipo dos indivíduos analisado. N:

alelo normal (wild type). ................................................................................................ 61


Eletroferograma da variante c.5195T>C – p.F1732S. B) Eletroferograma da variante

c.1312_1327dupTGTCTTCAGCTTTCCA – p.N443Mfs*18. ...................................... 61



Figura 13: Resultado do sequenciamento do exon 7 do gene USH2A. A) Eletroferograma

da variante c.1312_1327dupTGTCTTCAGCTTTCCA – p.N443Mfs*18 em

heterozigose. B) Eletroferograma da variante c.1312_1327dupTGTCTTCAGCTTTCCA

– p.N443Mfs*18 em homozigose. .................................................................................. 63

Figura 14: Heredograma da família 4 mostrando o genótipo dos indivíduos analisados. N:



Eletroferograma da variante c.4106C>T – p.S1369L. B) Eletroferograma da variante

c.9811delT – p.M3271Sfs*30. ....................................................................................... 65

Figura 16: Heredograma da família 5 mostrando o genótipo dos indivíduos analisados.

........................................................................................................................................ 66

Figura 17: Eletroferograma da variante c.1312_1327dupTGTCTTCAGCTTTCCA –

p.N443Mfs*18 em heterozigose. .................................................................................... 66



Figura 19: Resultado do sequenciamento do exon 7 do gene USH2A. A) Eletroferograma

da variante c.1312_1327dupTGTCTTCAGCTTTCCA – p.N443Mfs*18 em

heterozigose. B) Eletroferograma da variante c.1312_1327dupTGTCTTCAGCTTTCCA

– p.N443Mfs*18 em homozigose. .................................................................................. 68




Eletroferograma da variante c.8943_8944delTC – p.S2981=fs*61. B) Eletroferograma da

variante c.9799T>C – p. C3276R. .................................................................................. 69




Eletroferograma da variante c.1914delC – p. C638X. B) Eletroferograma da variante

c.1321T>C – p. L4406P. ................................................................................................ 71



Figura 25: Resultados do sequenciamento da família 9 do gene USH2A. A)

Eletroferograma da variante c.1214delA – p.N405Ifs*3. B) Eletroferograma da variante

c.1312_1327dupTGTCTTCAGCTTTCCA – p.N443Mfs*18. ...................................... 74

Figura 26: Heredograma da família 10. .......................................................................... 74

Figura 27: Heredograma da família 11 mostrando o genótipo dos indivíduos analisados.

N: alelo normal (wild type). ........................................................................................... 75

Figura 28: Resultado do sequenciamento da família 11 do gene CDH23. A:

Eletroferograma da variante c.7558G>A – p.E2520K . B: Eletroferograma da variante

c.7909G>C – p.A2637P. ................................................................................................ 76

Figura 29: Representação esquemática das variantes identificadas no gene USH2A, gene

responsável pela síndrome de Usher tipo 2A. .................................................................77

Figura 30: Representação esquemática das variantes localizadas no gene CDH23,

responsável pela síndrome de Usher tipo 1D. Ambas as variantes estão sendo descritas

pela primeira vez neste estudo. ....................................................................................... 77

LISTA DE TABELAS

Tabela 1: Características clínicas dos diferentes tipos de síndrome de Usher. ............. 26

Tabela 2: Principais loci e respectivos genes associados a síndrome de Usher. ........... 27

Tabela 3: Sequências dos primers das variantes encontradas no sequenciamento

massivo e no painel de captura. ...................................................................................... 48

Tabela 4: Programa para amplificação das variantes encontradas no sequenciamento de

nova geração. .................................................................................................................. 49

Tabela 5: Dados clínicos dos indivíduos estudados. ..................................................... 52

Tabela 6: Resultados obtidos no rastreamento das principais alterações moleculares

associadas à perda auditiva não sindrômica. .................................................................. 53

Tabela 7: Variantes encontradas no sequenciamento de exoma e painel de captura,

possíveis responsáveis pela síndrome de Usher. ............................................................ 55

Tabela 8: Algoritmos de predição da variante p.F1732S no gene USH2A. .................. 62

Tabela 9: Algoritmos de predição da variante p.C3267R no gene USH2A................... 70

Tabela 10: Algoritmos de predição da variante p.L4406P no gene USH2A. ................ 72

LISTA DE ABREVIATURAS E SÍMBOLOS

µg Micrograma

µL Microlitro

ATP Adenosina trifosfato

BAM Binary Alignment/Map

BCVA Medição de Acuidade Visual Corrigida

BERA Potencial Evocado Auditivo do Tronco Encefálico

BWA Alinhador Burrows-Wheeler

CCE Células ciliadas externas

CCI Células ciliadas internas

CSV Comma-separated values

Cx Conexina

dbSNP Banco de dados dos Polimorfismo de nucleotídeo único

DFNB23 Locus de surdez não sindrômica autossômica recessiva -23

DNA Ácido Desoxirribonucleico

dNTP Desoxinucleotídeo trifosfato

Domínio PDZ Domínio PSD95/DIgA/Z0-1

EDTA Ácido etilenodiamino tetra-acético

FN3 Domínio Fibronectina tipo 3

g gramas/gravidade

GATK Genome Analysis Toolkit

GRCh38 Genoma de referência 38

HC Hospital das clínicas

HCl Ácido clorídrico

HSP Hard Shell Plate, placa de PCR

kb Kilo base

LRT The likelihood ratio test

M Massa molar

mL Mililitro

mM Milimolar

Motivo IQ Motivo isoleucina-glutamina

ng Nanograma

NGS Sequenciamento de nova geração

oC Grau célsius

pb Par de bases

PCR Reação em cadeia da polimerase

pH Potencial de Hidrogênio

rpm Rotações por minuto

SAM Sequence Alignment/Map

SIFT Sorting Intolerant from Tolerant

SNP Polimorfismo de nucleotídeo único

Taq Thermus aquaticus (enzima polimerase)

TE Tris-EDTA

U Unidade

USH Síndrome de Usher

USH1 Síndrome de Usher tipo 1



VCF Variant Call Format

VEMP Potencial Evocado Miogênico Vestibular

VF Teste de campo visual

WES Sequenciamento completo do exoma

SUMÁRIO

1. INTRODUÇÃO .......................................................................................................... 18

1.1. Sistema auditivo. ................................................................................................. 18

1.1.1. Mecanismo de audição. ........................................................................................ 21

1.2. Sistema Visual. ........................................................................................................ 21

1.2.1. Mecanismo de visão. ............................................................................................ 24

1.3. Síndrome de Usher. ................................................................................................. 25

1.3.1. Classificação clínica da síndrome de Usher. ........................................................ 25

1.3.2. Aspectos genéticos da síndrome de Usher. .......................................................... 26

1.3.2.1. Genes envolvidos na síndrome de Usher tipo I. ................................................ 28

1.3.2.2. Genes envolvidos na síndrome de Usher tipo II. ............................................... 30

1.3.2.3. Genes envolvidos na síndrome de Usher tipo III e Usher atípico. .................... 31

1.4. Estratégias de investigação genética........................................................................ 32

2. OBJETIVOS ............................................................................................................... 34

2.1. Objetivo Geral. ........................................................................................................ 34

2.2. Objetivo Específico. ................................................................................................ 34

3. MATERIAL E MÉTODOS ........................................................................................ 35

3.1. Casuística. ................................................................................................................ 35

3.1.1. Critérios de inclusão. ............................................................................................ 36

3.2. Estudo Genético. ...................................................................................................... 37

3.2.1. Extração do DNA genômico de sangue periférico. .............................................. 37

3.2.2. Sequenciamento massivo. ..................................................................................... 38

3.2.2.1. Rastreamento de mutações utilizando painel de captura. .................................. 38

3.2.2.2. Rastreamento de mutações por meio de sequenciamento de exoma. ................ 38

3.2.2.2.1. Preparo das bibliotecas para o sequenciamento do exoma. ............................ 38

3.2.2.2.1.2. Protocolo para o preparo das bibliotecas de exoma. ................................... 39

3.2.2.2.2. Controle de qualidade das bibliotecas de exoma. ........................................... 45

3.2.2.2.3. Sequenciamento do exoma. ............................................................................ 45

3.2.3. Análise bioinformática. ........................................................................................ 45

3.2.4. Filtragem de variantes potencialmente patogênicas. ............................................ 47

3.2.5. Validação e segregação na família das variantes potencialmente patogênicas por

meio do sequenciamento de Sanger................................................................................ 47

3.3. Analise da frequência de novas alterações em um grupo de indivíduos controle. .. 50

4. RESULTADOS .......................................................................................................... 51

4.1. Principais alterações moleculares associadas à perda auditiva. .............................. 53

4.2. Sequenciamento de exoma e painel de captura. ...................................................... 54

4.2.1. Família 1. .............................................................................................................. 59

4.2.2. Família 2. .............................................................................................................. 60

4.2.3. Família 3. .............................................................................................................. 62

4.2.4. Família 4. .............................................................................................................. 64

4.2.5. Família 5. .............................................................................................................. 65

4.2.6. Família 6. .............................................................................................................. 66

4.2.7. Família 7. .............................................................................................................. 68

4.2.8. Família 8. .............................................................................................................. 70

4.2.9. Família 9. .............................................................................................................. 72

4.2.10. Família 10. .......................................................................................................... 74

4.2.11. Família 11. .......................................................................................................... 75

4.3. Rastreamento das variantes novas no banco de dados BIPMed. ............................. 76

4.4. Representação esquemática das variantes encontradas no gene USH2A e CDH23.76

5. DISCUSSÃO. ............................................................................................................. 78

6. CONCLUSÕES .......................................................................................................... 83

7. REFERÊNCIAS ......................................................................................................... 84

8. ANEXOS .................................................................................................................... 91

8.1. Termo de Consentimento Livre é Esclarecido. ....................................................... 91

8.2. Aprovação do comitê de ética. ................................................................................ 97

18

1. INTRODUÇÃO

1.1. Sistema auditivo.

O sistema auditivo é um dos mais complexos e sofisticados mecanismos de

transdução existentes na natureza. Ele é responsável por captar as diferentes ondas

sonoras e dar início ao processo de percepção e interpretação do som. Uma mistura de

ondas sonoras é constantemente gerada no ambiente e alcança nossas orelhas. Esta

coleção de sons contém um amplo espectro de tons altos e baixos em uma variedade de

intensidades. A orelha é um órgão capaz de decifrar precisamente as diferentes

frequências e intensidades, enquanto ao mesmo tempo transfere as informações coletadas

para o cérebro e nos permite categorizar cada som e identificar sua distância relativa e

direção (Dror & Avraham, 2009). O sistema auditivo é composto pela orelha externo,

médio e interno (figura 1). A orelha externa compreende o pavilhão e o canal auditivo

externo (meato acústico). O pavilhão é uma estrutura constituída por um esqueleto

fibrocartilagíneo recoberto por pele e com uma face interna e outra externa, destinadas a

recolher as ondas sonoras. O conduto auditivo externo é um canal de cerca de dois

centímetros de comprimento e é o encarregado de levar as ondas sonoras a orelha média

(Purves et al. 2001; Moussalle et al. 1997).

Figura 1: Esquema do sistema auditivo, evidenciando as principais partes da orelha

(Modificado de: Oticon Medical < http://www.oticonmedical.com/portuguese/cochlear-

implants/your-treatment/how-cochlear-implants-work/how-cochlear-implants-

work.aspx>)

19

Já a orelha média interior do osso temporal e composto pela membrana timpânica e três

pequenos ossos (martelo, bigorna e estribo), os quais coletam as vibrações e as transmitem

para a orelha interna, através da janela oval (Moussalle et al. 1997). A orelha interna está

localizado no interior do osso temporal e é composto pela cóclea (responsável pela

audição), vestíbulo e canais semicirculares (que controlam o equilíbrio e orientação

espacial) (Purves et al. 2001). A cóclea (figura 2) é um tubo helicoide com cerca de duas

voltas e meia. Sua base localiza-se sobre a extremidade lateral do meato acústico interno

(Moussalle et al. 1997). A cóclea é dividida em três compartimentos preenchidos por

fluídos: as escalas médias, vestibulares e timpânica. A escala média é uma cavidade cheia

de endolinfa, localizada entre a escala vestibular e timpânica, cavidades preenchidas por

perilinfa (Dror & Avraham, 2009). A perilinfa apresenta alta concentração de sódio e

baixa concentração de potássio, enquanto a composição da endolinfa se assemelha a dos

fluídos intracelulares, com baixa concentração de sódio e alta concentração de potássio.

A escala média é separada da escala vestibular pela membrana de Reissner, e da escala

timpânica pela membrana basilar (Moller, 2006). Na escala média está localizada o órgão

de Corti, ou órgão espiral, que é a principal estrutura sensível ao som, contêm as células

sensoriais do sistema auditivo, as células ciliadas, nomeado dessa forma pelo conjunto de

estereocílios que saem das suas superfícies apicais. Cada indivíduo possui cerca de 15.000

– 20.000 células ciliadas, organizadas em três linhas de células ciliadas externas (CCEs)

e uma linha de células ciliadas internas (CCIs). As células ciliadas externas recebem e

amplificam o som produzindo vibrações, enquanto as células ciliadas internas convertem

os sinais mecânicos amplificados em respostas elétricas (LeMausier e Gillespie 2005).

Tanto na cóclea como no sistema vestibular, as células ciliadas são neurônios que

possuem uma estrutura mecanossensível especializada (estereocílios), os quais

respondem ao som, ao movimento ou à gravidade movimentando-se em direção ao

estereocílio mais longo, o que induz a abertura de canais iônicos na ponta dos estereocílios

mais curtos. O fluxo de cátions leva a alterações de potencial de membrana, convertendo

dessa forma os estímulos mecânicos em respostas elétricas, processo conhecido como

transdução mecanoelétrica (LeMausier et al. 2005; Gillespie e Muller, 2009; Vollrath et

al. 2007).

20

Figura 2: Ilustração esquemática da cóclea. Destaque para o esquema detalhado do órgão

de Corti e micrografia dos estereocílios das células ciliadas (Modificado de: “The inner

ear”, capítulo “The Auditory System” do livro “Neuroscience”, editado por Purvest et al.

2001).

21

1.1.1. Mecanismo de audição.

O mecanismo da audição consiste na transformação das ondas sonoras em

impulsos nervosos. O som entra pela orelha externa, onde o pavilhão, que tem a função

de tubo coletor, capta e canaliza as ondas acústicas até a membrana timpânica. Na

membrana timpânica as ondas de compressão e descompressão alternadas do ar provocam

o deslocamento do tímpano para trás e para frente. Logo, o tímpano vibra com a mesma

frequência da onda e dessa forma transforma as vibrações sonoras em vibrações

mecânicas que são transmitidas para os ossículos (martelo, bigorna e estribo). As

vibrações passam primeiro pelo martelo, que ao entrar em vibração aciona a bigorna e

este finalmente faz o estribo vibrar. Após serem ampliadas, as vibrações alcançam a

orelha interna, onde os movimentos da janela oval são transmitidos para a rampa

timpânica e em seguida para a membrana de Reissner, sendo então traduzidos em

movimentos da endolinfa, consequentemente, da membrana tectória sobre as células

sensoriais do órgão de Corti. Simultaneamente, a vibração da membrana basilar faz com

que as células ciliares do órgão de Corti se agitem para frente e para trás; isso flexiona os

cílios nos pontos de contato com a membrana tectória. A flexão dos cílios excita as células

sensoriais e gera impulsos nas pequenas terminações nervosas filamentares da cóclea que

enlaçam essas células. Esses impulsos são então transmitidos através do nervo coclear até

os centros auditivos do tronco encefálico e córtex cerebral. (Alberts et al. 1989;

Casanova, 1997).

1.2. Sistema Visual.

O sistema visual responsável pela visão é de grande importância para a interação do

ser humano. É um sistema altamente sofisticado e de grande complexidade que graças

aos órgãos que o integram permitem a percepção das imagens e transformá-las em

impulsos elétricos que são enviados, através do nervo óptico, ao cérebro (Dantas, 1995)

O olho (figura 3), órgão responsável pela visão no ser humano é constituído de uma

série de estruturas, sendo dividido em três camadas dispostas concentricamente:

A camada externa, formada pela esclera ou esclerótica e a córnea. A esclerótica é a

camada externa do bulbo ocular (parte branco do olho) a qual tem a função de proteger

as camadas internas mais delicadas. A córnea é um tecido transparente que cobre a pupila

22

e a íris. A córnea em conjunto com o cristalino tem a função de focar a luz através da

pupila para a retina, como se fosse uma lente fixa (Dantas, 1995; Wasley, 2004).

A camada média ou túnica vascular (úvea) está constituída pela coroide, pela íris e

processos ciliares. A coroide situada entre a esclerótica e a retina, é uma estrutura

pigmentada e esses pigmentos absorvem a luz que chega à retina, evitando assim sua

reflexão. Também tem uma rede de vasos sanguíneos que proporcionam a retina de

oxigênio e nutrientes. A íris é um fino tecido que apresenta um orifício em seu centro,

chamado de pupila, cuja função é controlar a quantidade de luz que entra no olho. Em um

ambiente com muita luz, ocorre a miose (diminuição do diâmetro da pupila), ao passo

que, com pouca luz, ocorre a midríase (aumento do diâmetro da pupila) (Dantas, 1995)

A camada interna ou túnica nervosa, constituída pela retina, se comunica com o

cérebro pelo nervo óptico. A retina (figura 4) é uma evaginação multicamada do sistema

nervoso central que consiste em camadas alternadas de neurônios e sinapses. A luz passa

por todas as camadas da retina antes de ser absorvida por fotopigmentos localizados

dentro dos segmentos externos dos fotorreceptores. Os fotorreceptores convertem a luz

em um sinal neuroquímico que é passado para os neurônios de segunda ordem, chamados

células bipolares. As células bipolares comunicam-se, por sua vez, com as células

amácrinas e as células ganglionares. As células ganglionares definem a resolução

retiniana das imagens, as quais são percebidas pelo sistema nervoso central e

desempenham um importante papel no seu comportamento (Fletcher et al. 2011; Collin,

2008). Assim, a via retiniana constituída por fotorreceptores, células bipolares e células

ganglionares desempenha um papel importante no processamento visual dentro da retina.

Doenças da retina, estão associadas com a perda da função ou a morte de uma ou mais

classes de neurônios da via retiniana. A deficiência visual pode surgir da perda de

fotorreceptores, defeitos na transmissão sináptica entre fotorreceptores e células bipolares

ou perda de células ganglionares (Wasley, 2004).

23

Figura 3:Ilustração de um corte longitudinal do olho humano evidenciando suas

principais estruturas (Espirito Santo et al. 2010).

Figura 4:Ilustração de um corte longitudinal da retina, evidenciando suas principais

estruturas (http://otcjosealves.blogspot.com.br/2010_11_01_archive.html)

24

1.2.1. Mecanismo de visão.

A luz proveniente do ambiente externo, estímulo fundamental para a sensação que

compreendemos como visão, atravessa um longo trajeto com início no olho humano até

o córtex cerebral. A luz é, inicialmente, recebida pelas estruturas anteriores do olho: filme

lacrimal, córnea e humor aquoso. Todas elas apresentam-se como componentes ópticos

capazes de provocar convergência (processo de refração) de raios luminosos e em

conjunto com a íris, estas determinam proteção das estruturas oculares internas pela

capacidade de não absorverem determinados comprimentos de onda, como os raios

ultravioletas. A luz, então, segue através da pupila, estrutura capaz de ajustar a luz

penetrante por estímulo nervoso (simpático e parassimpático), até chegar ao cristalino. O

cristalino, uma lente convergente, ajusta os feixes luminosos para um ponto focal

localizado na retina, a fóvea. A retina é composta por dez camadas celulares e em sua

porção externa encontra-se mais de cem milhões de fotorreceptores (cones e bastonetes).

A luz absorvida produz mudanças estruturais em seus pigmentos, transformando o

estímulo luminoso em estímulo nervoso. Cones e bastonetes possuem funções diferentes

no sistema visual. Os bastonetes são usados para visão de baixa intensidade de luz, por

outro lado, os cones são células utilizadas em intensidade de luz mais altas e para visão

de cores e oferecem, portanto, maior acuidade visual. Elas estão distribuídas de forma

mais concentradas na retina central, espacialmente na fóvea e apresentam 3 tipos de

pigmentos com diferente sensibilidade às diferentes frequências que compõem à luz

branca. A partir daí os impulsos eletroquímicos são transmitidos para as células bipolares

e então para as células ganglionares cujos axônios, aproximadamente 1.200.000,

compõem o nervo óptico. O nervo óptico, se encarrega de levar esses impulsos ao corpo

geniculado lateral e, então córtex cerebral, na região occipital. É no córtex que ocorre o

processamento das imagens recebidas pelos olhos, de modo que a imagem antes invertida

seja processada da forma correta. O cérebro então após processar os impulsos recebidos,

os transforma em imagem com riquezas de detalhes. Portanto, embora os olhos sejam

essências para a visão, quaisquer danos aos nervos ópticos também resulta em

comprometimento da visão (Braddick & Atkinson, 2011; Wasley, 2004; Fletcher et al.

2011; Collin, 2008).

25

1.3. Síndrome de Usher.

Até o momento mais de 400 síndromes com a perda de audição como um dos

sintomas já foram descritas na literatura. Elas incluem um vasto conjunto de doenças

hereditárias em que a perda auditiva está associada a diversos distúrbios dos sistemas

musculoesquelético, cardiovascular, urogenital, nervoso, endócrino, digestivo ou

sistemas tegumentares. Cerca de 40 dessas síndromes incluem uma doença ocular. Uma

delas é a Síndrome de Usher (USH) (Gorlin et al. 1995).

A síndrome de Usher é uma doença autossômica recessiva caracterizada pela perda

auditiva, parcial ou total, diminuição progressiva da visão decorrente da degeneração das

células fotorreceptoras da retina, os cones e bastonetes, denominada retinose pigmentar e

ocasionalmente problemas vestibulares. Foi descrita pela primeira vez pelo

oftalmologista escocês Charles Usher, sendo a principal causa genética de surdez e

cegueira com uma prevalência entre 1 para 6.000 - 25.000 pessoas e uma taxa de

portadores de 1 a cada 100 pessoas (Kimberling et al. 2010; Denise e Xue, 2010; Bonnet

et al. 2016; Boughman et al.1983), em indivíduos entre 30 a 40 anos a frequência é de 1

a cada 10.000 (Hope et al.1997) e é responsável por aproximadamente 50% dos

indivíduos que apresentam surdez e cegueira (Vernon, 1969).

1.3.1. Classificação clínica da síndrome de Usher.

A Síndrome de Usher é clínica e geneticamente heterogênea. São conhecidas três

formas clínicas da Síndrome de Usher, baseando-se na gravidade da deficiência auditiva,

a presença ou ausência de disfunção vestibular e a idade de início da retinose pigmentosa

associada com o déficit visual (tabela 1). A síndrome de Usher tipo I (USH1) é a forma

mais grave. Caracteriza-se por uma surdez severa a profunda, presença de disfunção

vestibular e degeneração da retina a qual inicia-se na infância com a perda da visão

noturna, diminuição do campo visual e eventualmente, com perda da acuidade visual, que

rapidamente progride à cegueira. USH1 representa cerda de 35 -40% dos casos da

síndrome de Usher (Nájera et al.2005; Kremer et al. 2006; Petit, 2001). A síndrome de

Usher tipo II (USH2) é a forma mais comum da doença representando de 59 – 85% dos

casos. Os pacientes apresentam perda auditiva moderada a severa, ausência de disfunção

vestibular e o início da retinose pigmentar ocorre geralmente na puberdade ou quando

adulto (Ahmed et al.2003; Reiners e Wolfrum, 2006). A síndrome de Usher tipo III

26

(USH3) é a menos frequente representando apenas 3% dos casos na população mundial

(Millan et al. 2011), exceto na Finlândia onde os casos de USH3 representam cerca de

40% dos casos (Cohen et al. 2007; Ness et al. 2003; Joenssu et al. 2001). Pacientes com

USH3 possuem perda auditiva profunda e adquirida de forma progressiva, disfunção

vestibular e início da retinose pigmentar variável (Ness et al. 2003; Pakarinen et al.1995).

Tabela 1: Características clínicas dos diferentes tipos de síndrome de Usher.

Manifestação clínica Usher Tipo 1 Usher Tipo 2 Usher Tipo 3

Perda auditiva Severa -

Profunda Moderada – Severa Profunda

Função vestibular Alterada Normal Variável

Retinose pigmentar Antes da

puberdade

Durante ou depois

da puberdade Variável

1.3.2. Aspectos genéticos da síndrome de Usher.

Atualmente, dezesseis loci foram associados com a síndrome de Usher: oito

associados com o tipo 1, quatro com o tipo 2, dois com o tipo 3 e dois ainda não foram

especificados (tabela 2) (Keats e Corey, 1999; Khateb et al. 2014). Destes loci, catorze

genes foram caracterizados: seis em USH1, quatro em USH2 e dois em USH3 e dois em

tipos de Usher não especificados.

27

Tabela 2: Principais loci e respectivos genes associados a síndrome de Usher.

Tipo Locus Cromossomo Gene Proteína Frequência Função da proteína

USH1

USH1B 11q13.5 MYO7A miosina VIIa 29 – 82% do tipo 1 Motor celular

USH1C 11q15.1 USH1C harmonina 7 – 12.5% do tipo 1 Exerce função de suporte

USH1D 10q21-q22 CDH23 caderina 23 10- 35% do tipo 1 Adesão celular

USH1E 21q21 n/d n/d desconhecido desconhecido

USH1F 10q11.2-q21 PCDH15 protocaderina 15 11% do tipo 1 Adesão celular

USH1G 17q24-25 USH1G sans 7% do tipo 1 Exerce função de suporte

USH1H 15q22-q23 n/d n/d desconhecido desconhecido

USH1J 15q25.1 CBI2 cbi2 0 - 2 % do tipo 1 desconhecido

USH2

USH2A 1q41 USH2A usherina ≤75% do tipo 2 Matriz e adesão celular

USH2B 3p23-24.2 SLC4A7 nbc3 rara co-transporte de íons

USH2C 5q14.3-21.3 GPR98 gpr98 rara Receptor acoplado a proteína G

e adesão celular

USH2D 9q32 DFNB31 whirlin rara Exerce função de suporte

USH3 USH3A 3q21-25 CLRN1 clarin-1 40% dos casos em famílias

da Finlândia Adesão celular

USH3B 5q31.3 HARS n/d rara desconhecida

n/d 10q24.31 PDZD7 pdzd7 rara Exerce função de suporte

n/d 20q11.22 CEP250 cep250 rara desconhecida

28

1.3.2.1. Genes envolvidos na síndrome de Usher tipo I.

O gene MYO7A que codifica a proteína miosina VIIa foi o primeiro a ser

identificado, e pelo menos metade dos casos de USH1 conhecidos são devido a mutações

nesse gene (Astuto et al. 2000). As miosinas são proteínas que hidrolisam o trifosfato de

adenosina (ATP) e utilizam esta energia para movimentar-se ao longo dos filamentos da

actina. A miosina VIIa apresenta os 3 domínios típicos das miosinas: o domínio motor ou

cabeça, que possui um sítio de ligação para o ATP (atividade ATPásica) e outro para

ligação com a actina; o domínio regulador, composto por sete repetições consecutivas do

motivo IQ que liga cadeias leves ou calmodulina, e a cauda, que serve como âncora e

posiciona o domínio motor para que ele consiga interagir com a actina. A miosina VIIa

se expressa tanto na cóclea como na retina, também em outras células como dos testículos,

pulmões e rins (Weil et al. 1995).

As proteínas codificadas pelos genes USH1C, CDH23, PCDH15, USH1G são

respectivamente a harmonina, caderina 23, protocaderina 15 e sans; todas elas interagem

entre elas e com a miosina VIIa para formar uma unidade funcional necessária para o

transporte e adesão (figura 5). A harmonina contém 3 domínios PDZ implicados na

organização de proteínas complexas, sendo componentes essenciais da unidade funcional

das proteínas USH1 (Verpy et al. 2000; Bitner—lindzicz et al. 2000). Pesquisas

realizadas por Verpy et al. 2000 e Ahmed et al. 2003, sugerem que a proteína harmonina

desempenha um importante papel no desenvolvimento e manutenção dos estereocílios

(projeções celulares especializadas, ricas em actina). Os estereocílios se flexionam em

resposta a ondas sonoras. Este movimento de flexão é fundamental para converter ondas

sonoras em impulsos nervosos, um processo essencial para a audição normal. Na orelha

interna, complexos de proteínas organizadas por harmonina provavelmente agem como

conectores que ligam estereocílios em um feixe (Verpy et al. 2000; Ahmed et al. 2003).

Este complexo de proteína ajuda a regular a transmissão de ondas sonoras. A harmonina

também é encontrada em células especializadas chamadas fotorreceptoras. Estas células

detectam e transferem a energia da luz para o tecido sensível à luz na parte de trás do olho

(retina). A função do complexo da proteína harmonina na retina não é bem compreendida,

mas parece ser importante para o desenvolvimento e função de células fotorreceptoras

(Verpy et al. 2000).

29

Figura 5: Representação esquemática da estrutura da Miosina VIIa e sua interação com

as proteínas associadas com a síndrome de Usher tipo I (Figura modificada-Ahmed et

al.,2003).

O gene CDH23, que codifica a proteína caderina 23, se localiza nas extremidades

dos cílios das células ciliadas da cóclea, sendo um componente essencial na ligação entre

as extremidades dos estereocílios. Deleções no gene CDH23 foram encontrados em

pacientes com USH1D (Ahmed et al., 2003). No sistema ocular, a caderina 23 exerce

funções fundamentais na organização das junções sinápticas, justificando as

manifestações oculares da síndrome (Bork et al. 2001). A protocaderina 15 codificada

pelo gene PCDH15 está envolvida na morfogênese e na coesão dos feixes de

estereocílios, promovendo a manutenção, a longo prazo, das ligações laterais entre eles.

As mutações no gene PCDH15 são responsáveis por surdez não sindrômica (DFNB23) e

pela síndrome de Usher em famílias correlacionadas com USH1F (Nájera et al. 2005;

Weil et al. 1995). A proteína sans codificada pelo gene USH1G, regula o tráfego das

outras proteínas até os estereocílios, de modo que o complexo transmembrânico formado

por estas interações asseguram a integridade dos estereocílios. Na retina, sans

provavelmente desempenha um papel na formação e manutenção de células da retina

30

especializadas que detectam a luz e cor (células fotorreceptoras). Pelo menos cinco

mutações no gene USH1G demonstraram causar síndrome de Usher tipo 1G (Nájera et

al. 2005; Weil et al. 1995).). O gene CBI2 transcreve a proteína cbi2 (proteína2 de ligação

ao cálcio e integrina). Este gene foi associado com a síndrome de Usher 1J (USH1J), ele

foi identificado em uma família de Paquistão. CIB2 em ratos é localizado no estereocílio

mecanossensorial das células ciliadas da orelha interna, nas células fotorreceptoras da

retina e células do epitélio pigmentar. Alterações no gene CBI2 diminuem

significativamente as respostas de Ca+2 induzidas pelo ATP (Riazuddin et al. 2012), mas

até o momento não se sabe como isso afeta o funcionamento das células fotorreceptoras

assim como das células ciliadas da orelha interna.

1.3.2.2. Genes envolvidos na síndrome de Usher tipo II.

Na figura 6 se mostra a representação esquemática dos genes envolvidos na

síndrome de Usher tipo II. O gene USH2A codifica a proteína usherina a qual contém um

domínio laminina tipo VI, 10 domínios laminina tipo fator de crescimento epidermal e 35

domínios fibronectina tipo III (FN3). Nas células ciliadas da cóclea, usherina foi

localizada nos estereocílios e na região sináptica. Na retina a usherina foi observada nos

cílios de ligações e nos terminais sinápticos dos cones e bastonetes das células

fotorreceptoras. Nas sinapses dos dois tipos de células sensoriais, acredita-se que a

usherina participa na adesão de membranas pré e pós-sinápticas integrado na rede de

proteínas da síndrome de Usher (Huang et al. 2002; Eudy et al. 1998).

O gene SLC4A7 foi mapeado no cromossomo 3 na região p23-24.2 em uma

família consanguínea da Tunísia (Hmani et al. 1999; Hmani et al. 2002). SLC4A7 codifica

a proteína nbc3 que é um co-transportador de bicarbonato de sódio. Este gene foi sugerido

como um gene candidato para o locus USH2B, já que camundongos sem a presença da

proteína nbc3 (Slc4a7-/-), desenvolvem um fenótipo combinado de surdez-cegueira

semelhante ao observado em pacientes com Usher (Bok et al. 2003). O gene GPR98

responsável pela síndrome de Usher tipo 2C codifica os receptores acoplados à proteína

G (GPR98), que se expressa em humanos em pelo menos 3 isoformas diferentes. Até o

momento só se encontraram mulheres com mutações neste gene (Weston et al. 2004).

31

Figura 6: Representação esquemática da proteína usherina, nbc3 e gpr98. (Modificado

de Reiners et al. 2005).

O gene DFNB31 codifica a proteína whirlin, proteína que exerce a função de

suporte. Whirlin é expressa tanto nas células ciliadas como nas células fotorreceptoras da

retina, adicionalmente, está proteína se liga as proteínas usherina e gpr98. Atualmente só

se encontrou variantes em heterozigose composta em uma família alemã (Ebermann et

al. 2006).

1.3.2.3. Genes envolvidos na síndrome de Usher tipo III e Usher atípico.

A maioria dos casos de USH3 foram descritos na população Finlandesa, na qual

se encontraram mutações no gene CLRN1 (Clarin-1) e HARS (histidil-tRNA sintetase)

(Adato et al. 2002; Joenssu et al. 2001). Além disso, o gene PDZD7 foi recentemente

descoberto de maneira digênica com o gene GPR98, ou seja, mutações em heterozigose

tanto no gene PDZD7 como no GPR98 podem levar a um quadro clínico atípico de

síndrome de Usher (Ebermann et al. 2010). O gene CEP250 foi descrito como um

32

causador de síndrome de Usher atípico em famílias consanguíneas do Irã (Khateb et al.

2014).

1.4. Estratégias de investigação genética.

Pelo menos 14 genes estão relacionados com a síndrome de Usher. Considerando a

grande heterogeneidade genética e o fato de que, a maioria dos genes envolvidos

apresentam um grande número de exons, como por exemplo, os genes MYO7A (49

exons), CDH23 (69 exons), PCDH15 (36 exons) e USH2A (72 exons), o uso de

tecnologias de alto rendimento resultam em um melhor custo-benefício para a detecção

de mutações nesses genes. Dessa forma, a utilização e a abordagem de sequenciamento

do exoma apresenta-se como uma estratégia interessante para o diagnóstico molecular de

doenças com alta heterogeneidade genética como é o caso da síndrome de Usher. Nesse

caso, a identificação de mutações já descritas assim como mutações ainda não

identificadas poderá contribuir para um maior entendimento das causas da síndrome

assim como confirmar o diagnóstico clínico.

O sequenciamento de exoma é uma técnica que permite de maneira seletiva, capturar

e sequenciar regiões codificantes de todo o genoma. A técnica envolve a utilização de

plataformas de sequenciamento de nova geração (NGS) que permite a análise de regiões

codificantes do genoma humano com grande eficácia. Atualmente, o sequenciamento de

exoma oferece 98% de sensibilidade e 99.8% de especificidade, minimizando as chances

de perder qualquer variante (Goh e Choi, 2012).

A estratégia experimental do sequenciamento de exoma pode ser dividida em duas

partes: 1) Preparação das bibliotecas de DNA genômico e hibridização para capturas de

arrays e 2) sequenciamento dos fragmentos alvo eluídos. Quando se possui acesso a

famílias com a doença de interesse, o sequenciamento de exoma pode ser aplicado em

pelo menos dois membros da família afetada e, ao analisar os resultados, qualquer

variante compartilhada pode ser considerada potencialmente causadora da doença;

utilizando-se dados de análise de ligação com foco na região do intervalo de interesse, é

possível reduzir em grande parte o número de variantes a serem consideradas (Clark et

al.2011).

A técnica de sequenciamento de exoma tem sido muito utilizada para diagnóstico

genético e descoberta de novos genes devido a seu baixo custo quando comparado ao

sequenciamento de Sanger (Gonzaga-Jauregui et al. 2012). Suas vantagens práticas

33

permitem que um grande número de pacientes sejam mapeados de forma robusta, o que

é um aspecto crucial na descoberta de mutações na pesquisa em genética humana (Goh e

Choi, 2012).

Avanços significativos utilizando as plataformas de sequenciamento massivo estão

sendo feitos na identificação dos genes da síndrome de Usher. Considerando a

inviabilidade da utilização de técnicas convencionais tanto economicamente como em

termos de tempo para o rastreamento de cada gene, este projeto propôs a utilização da

plataforma Whole Exome Sequencing (Sequenciamento de Exoma) no estudo molecular

da Síndrome de Usher em um grupo de pacientes brasileiros selecionados de acordo com

dados clínicos compatíveis com a doença.

Dessa forma, neste estudo foram rastreados os genes associados à síndrome de Usher

com o intuito de elucidar geneticamente os casos que até o momento eram tratados como

doenças separadas ou que tinham etiologia desconhecida. A prevenção do surgimento da

doença consiste na identificação precoce das famílias de risco e o aconselhamento

genético adequado para a família. As famílias de risco são aqueles casais que já tem um

filho com a doença. Na maioria dos tipos da Síndrome de Usher a identificação correta

da doença não é possível até que apareça a retinose pigmentar em geral em fases tardias

do desenvolvimento. Além disso, a reabilitação da perda auditiva é sempre mais eficaz

quando identificado precocemente, assim como para a orientação ao paciente sobre as

manifestações clínicas da doença e importância do acompanhamento oftalmo-

otorrinolaringológico. Testes genéticos para crianças com perda auditiva neurossensorial,

permitem um diagnóstico preciso, tratamento e prognóstico.

34

2. OBJETIVOS

2.1. Objetivo Geral.

Esclarecer a etiologia genética de indivíduos com diagnóstico clínico de síndrome

de Usher.

2.2. Objetivo Específico.

Rastrear variantes potencialmente patogênicas em genes associados com a

síndrome de Usher.

Estudar a segregação das variantes nas famílias.

Analisar a frequência de novas alterações em um grupo de indivíduos controle.

35

3. MATERIAL E MÉTODOS

3.1. Casuística.

Foram estudados um total de 44 indivíduos provenientes de 11 famílias não

relacionadas. Sendo que um indivíduo afetado de cada família que apresentavam

manifestações clínicas de síndrome de Usher foram analisados mediante a técnica de

sequenciamento de exoma e sequenciamento por meio de painel de captura.

Esses pacientes foram atendidos nos ambulatórios de Otorrinolaringologia e

Oftalmologia do Hospital das Clínicas da Universidade Estadual de Campinas (HC-

UNICAMP). Os pacientes foram submetidos a testes detalhados como Audiometria

Tonal, Bera, Vemp e exames oftalmológicos, incluindo medições da Acuidade Visual

Corrigida (BCVAs), Biomicrocopia com Lâmpada de Fenda, Fundoscopia, Retinografia

e Teste de Campo Visual (VF). Além dos exames clínicos se realizou o exame de rotina

para as principais mutações relacionadas à perda auditiva de origem genética, sendo estas:

mutações no gene GJB2 (conexina 26), deleções del(GJB6-D13S1830) e del(GBJ6-

D13S1854) no gene GJB6 (conexina 30) e a mutação mitocondrial m.1555A>G no gene

MTRNR1.

Todos os indivíduos incluídos nesta pesquisa tiveram sua participação previamente

autorizada, mediante assinatura do Termo de Consentimento Livre e Esclarecido (anexo

1), após serem informados sobre os objetivos e métodos da pesquisa e esclarecimento

sobre o estudo a ser realizado, podendo ou não aceitar participar da mesma. Este projeto

foi aprovado pelo Comitê de Ética da Faculdade de Ciências Médicas da UNICAMP,

CAAE No 47823914.6.0000.5404 (anexo 2).

A figura 7 ilustra esquematicamente como foi realizado o processo de investigação

dos indivíduos que fizeram parte do estudo.

36

Figura 7: Fluxograma de investigação dos indivíduos que fizeram parte do estudo

3.1.1. Critérios de inclusão.

A seleção dos pacientes seguiu os seguintes critérios de inclusão:

1. Manifestações clínicas consistentes com a síndrome de Usher, tais como perda de

audição, retinose pigmentar e presença ou ausência da função vestibular.

2. Não possuir mutações nas principais causas de surdez de origem genética.

37

3.2. Estudo Genético.

3.2.1. Extração do DNA genômico de sangue periférico.

A extração do DNA genômico foi realizado a partir de leucócitos obtidos de 10 a

15 mL de sangue periférico coletado em tubos Vacutainer contendo EDTA (ácido

etilenodiamino tetra-acético) como anticoagulante. Foi empregado o método de fenol e

clorofórmio, o qual foi padronizado no Laboratório de Genética Molecular Humana do

Centro de Biologia Molecular e Engenharia Genética (CBMEG) da UNICAMP.

Inicialmente, em um tubo tipo Falcon de 50 mL, foram adicionados 35 mL de

Solução A (Triton-X 100 a 1%; MgCl2 5 mM; Sacarose 0,32 M; Tris-HCl 10 mM pH 8,0)

ao sangue coletado, para lise das hemácias. Após ser homogeneizado, o material foi

mantido em gelo por 30 min. Depois, os tubos foram centrifugados a 2.000 rpm, por 15

min, a 4°C. O sobrenadante foi descartado e o precipitado (pellet) foi ressuspendido em

35 mL de Solução A. Este último procedimento foi repetido até a obtenção de um pellet

de coloração clara, livre de hemácias.

Posteriormente, foi adicionado 1 mL da solução B 1X (EDTA 20 mM; NaCl 20

mM; Tris-HCl 20 mM pH 8,0) e 250 μL de solução C (para 1 mL de solução C: 0,5 mL

de solução B 1X, 1 mg de Proteinase K e 0,5 mL de SDS 10%). O material foi incubado

em banho-maria 37°C até o dia seguinte.

Após a incubação, foi iniciada a etapa de purificação do DNA genômico com fenol-

clorofórmio. Foram adicionados 2 mL de TE 1X (Tris-HCl 10 mM, pH 8,0; EDTA 1 mM)

e quantidade suficiente de fenol saturado com Tris-HCl 10 mM pH 8,0 até dobrar o

volume da amostra. Foi realizada a homogeneização por inversão lenta dos tubos durante

5 minutos. Para a separação e recuperação da fase aquosa (sobrenadante), os tubos foram

centrifugados a 2.500 rpm por 15 minutos à temperatura ambiente. O precipitado foi

descartado e o sobrenadante foi passado a um tubo tipo Falcon de 15 mL. O procedimento

foi repetido por duas vezes, primeiro substituindo o fenol por solução de fenol:

clorofórmio: álcool isoamílico (25:24:1) e por último com solução de clorofórmio: álcool

isoamílico (24:1). Para a precipitação do DNA, foi acrescentado 0,1 do volume da

amostra de acetato de sódio 3 M pH 5,5 e 2,5 volumes de etanol absoluto gelado. O DNA

foi capturado com auxílio de uma haste plástica esterilizada e aproximadamente 5 gotas

de etanol 70% foram adicionadas para a retirada do excesso de sal. Após 20 minutos de

secagem, as hastes foram colocadas em tubos eppendorf de 1,5 mL e as amostras foram

ressuspendidas em um volume de 200 μL de TE 1X.

38

3.2.2. Sequenciamento massivo.

3.2.2.1. Rastreamento de mutações utilizando painel de captura.

Em uma das famílias estudadas, foi realizado o estudo molecular mediante a

aplicação do OTO-NGS-Panel, um painel de captura de sequências dirigido a 71 genes

envolvidos com perda auditivas hereditárias e síndrome de Usher para sequenciamento

massivo, desenvolvido no Departamento de Genética do Hospital Ramón y Cajal,

Madri/Espanha.

O HaloPlex™ Target Enrichment System for Illumina Sequencing (Agilent

Technologies, Santa Clara, Estados Unidos) foi utilizado para captura e enriquecimento

das regiões genômicas de interesse, de acordo com protocolo recomendado pelo

fabricante (http://www.genomics.agilent.com>). O painel foi customizado com o

SureDesign Service (Agilent Technologies.

). Foram incluídas sondas para a captura das

regiões exônicas e 50 pb de regiões intrônicas adjacentes, para os 71 genes. O desenho

total do painel assegura uma cobertura de 98,83% da região global de interesse,

compreendendo 499,157 kb.

Após a preparação das amostras, foi realizado o sequenciamento utilizando o

MiSeq Next-Generation Sequencing System (Illumina, San Diego, Estados Unidos)

(corrida paired-end 2×150pb), seguindo o protocolo recomendado pelo fabricante.

3.2.2.2. Rastreamento de mutações por meio de sequenciamento de exoma.

3.2.2.2.1. Preparo das bibliotecas para o sequenciamento do exoma.

Para o preparo das bibliotecas de exoma foi utilizado 5 ng/µL de DNA para

cada indivíduo. As amostras de DNA foram quantificados por meio do equipamento

Qubit 2.0 (Life Technologies, Carlsbad, CA, USA), que realiza a quantificação dos ácidos

nucleicos por meio de método fluorimétrico. As bibliotecas foram preparadas utilizando

o kit Nextera rapid Exome Enrichment Kit® (Illumina, Inc., San Diego, CA, USA)

seguindo o protocolo do fabricante.

39

3.2.2.2.1.2. Protocolo para o preparo das bibliotecas de exoma.

1. Tagmentação:

a. Adicionar 10 µL gDNA a 5 ng/µL em uma MIDI plate.

b. Adicionar 25 µL do Tagment DNA Buffer.

c. Adicionar 15 µL do Tagment DNA Enzime 1.

d. Selar com Microseal B.

e. Vortex a 1.800 rpm por 1 minuto.

f. Centrifugar a 280g por 1 minuto.

g. Microheating a 58 oC por 10 minutos (pré-aquecido).

h. Adicionar 15 µL do Stop Tagment Buffer.

i. Selar com Microseal B.

j. Vortex a 1.800 rpm por 1 minuto.

k. Centrifugar a 280g por 1 minuto.

l. Incubar a temperatura ambiente por 4 minutos.

2. Limpeza do DNA tagmentado:

a. Adicionar 65 µL das Sample Purification Beads.

b. Selar com Microseal B.

c. Vortex a 1.800 rpm por 1minuto.

d. Incubar a temperatura ambiente por 8 minutos.

e. Centrifugar a 280g por 1 minuto.

f. Colocar na estante magnética por 2 minutos.

g. Remover e descartar todo sobrenadante.

h. Manter em estante magnética durante as duas lavagens. i. Adicionar lentamente 200 µL de etanol 80% “fresco” sem perturbar as

beads e esperar 30 segundos.

j. Remover e descartar o etanol.

k. Repetir passos i e j.

l. Deixar na estante magnética a temperatura ambiente por 10 minutos.

m. Retirar da estante magnética.

n. Adicionar 22,5 µL do Resuspension Buffer (não encostar nos beads).

o. Selar com Microseal B.

p. Vortex a 1.800 rpm por 1 minuto.

q. Incubar a temperatura ambiente por 2 minutos.

r. Centrifugar a 280g por 1 minuto.

s. Colocar na estante magnética por 2 minutos.

t. Transferir 20 µL do sobrenadante limpo para placa Hard Shell Plate.

40

3. 1a PCR:

a. Adicionar 5 µL do Index 1.

b. Adicionar 5 µL do Index 2.

c. Adicionar 20 µL do Nextera Library Amplification Mix.

d. Selar com Microseal A.



g. PCR (aproximadamente 21 minutos).

PONTO DE PARADA (até 2 dias a 2 – 8 oC)

4. Limpeza da primeira PCR:

a. Centrifugar a placa a 280g por 1 minuto.

b. Transferir 50 µ para MIDI plate.

c. Adicionar 90 µL das Sample Purification Beads.



f. Incubar a temperatura ambiente por 10 minutos.

g. Centrifugar a 280g por 1 minuto.

h. Retirar selo e colocar na estante magnética por 2 minutos.

i. Cuidadosamente remover e descartar sobrenadante.

j. Manter em estante magnética durante as duas lavagens. k. Adicionar lentamente 200 µL de etanol 80% “fresco” sem perturbar as beads

e esperar 30 segundos.

l. Remover e descartar o etanol.

m. Repetir passos k e l mais uma vez.

n. Deixar na estante magnética a temperatura ambiente por 10 minutos.

o. Retirar da estante magnética

p. Adicionar 27 µL do Resuspension Buffer (não encostar nos beads).

q. Selar com Microseal B.

r. Vortex a 1.800rpm por 1 minuto.

s. Incubar a temperatura ambiente por 2 minutos.

t. Centrifugar a 280g por 1 minuto.

u. Retirar selo e colocar na estante magnética por 2 minutos.

v. Transferir 25 µL do sobrenadante limpo para placa Hard Shell Plate (HSP).

PONTO DE PARADA (até 14 dias a -15 a -25oC)

41

5. 1a hibridização:

1. Centrifugar a placa a 280g por 1 minuto.

2. Fazer pool das bibliotecas: 500 ng de cada biblioteca, máximo de 40 µL.

Volume > 40 µL: concentrador a vácuo (sem aquecimento e drying rate

média – programa 3).

Volume < 40 µL: aumentar volume para 40 µL com Resuspension Buffer.

3. Adicionar em uma HSP: 40 µL do pool das bibliotecas.

4. Adicionar 50 µL de Enrichment Hybridization Buffer.

5. Adicionar 10 µL de Expanded Exome Oligos.

6. Selar com Microseal B.

7. Vortex a 1.200 rpm por 1 minuto.

8. Centrifugar a 280g por 1 minuto.

9. PCR (aproximadamente 2h a 25h30).

6. 1a captura: Ligação:


b. Transferir o volume todo (~100 µL) para uma MIDI plate. c. Adicionar 250 µL das Streptavidin Magnetic Beads. d. Selar com Microseal B.

e. Vortex a 1.200 rpm por 5 minutos.

f. Deixar a temperatura ambiente por 25 minutos.


h. Colocar na estante magnética por 2 minutos.


j. Retirar da estante magnética.

Lavagem: a. Vortex Enrichment Wash Solution.

b. Adicionar 200 µL do Enrichment Wash Solution.

c. Selar com Microseal B.

d. Vortex a 1.800 rpm por 4 minutos.

e. Selar com Microseal B.

f. Microheating a 50 oC por 30 minutos.

g. Imediatamente colocar a placa na estante magnética por 2 minutos.

h. Remover e descartar sobrenadante

i. Repetir passos b até h mais uma vez.

Eluição: a. Fazer mix: 28,5 µL Enrichment Elution Buffer 1 + 1,5 µL 2N NaOH

(total 30 µL).

b. Vortex o mix e adicione 23 µL na placa. c. Selar com Microseal B.

d. Vortex a 1.800 rpm por 2 minutos.

e. Deixar a temperatura ambiente por 2 minutos.

42


g. Colocar na estante magnética por 2 minutos.

h. Transferir 21 µL para uma HSP.

i. Adicionar 4 µL do Elute Target Buffer 2.

j. Selar com Microseal B.

k. Vortex a 1.200 rpm por 1 minuto.

l. Centrifugar a 280g por 1 minuto.


7. 2a hibridização:


b. Adicionar 15 µL do Resuspension Buffer.

c. Adicionar 50 µL de Enrichment Hybridization Buffer.

d. Adicionar 10 µL de Expanded Exome Oligos.

e. Selar com Microseal B.

f. Vortex a 1.200 rpm por 1 minuto.


h. PCR (aproximadamente 16h a 25h30).

Não retirar reação da máquina até estar pronto para começar próximo

passo.

8. 2a captura:

Ligação: k. Centrifugar a placa a 280g por 1 minuto.

l. Transferir o volume todo (~100 µL) para uma MIDI plate. m. Adicionar 250 µL das Streptavidin Magnetic Beads. n. Selar com Microseal B.

o. Vortex a 1.200rpm por 5 minutos.

p. Deixar a temperatura ambiente por 25 minutos.

q. Centrifugar a 280g por 1 minuto.

r. Colocar na estante magnética por 2 minutos.

s. Cuidadosamente remover e descartar sobrenadante.

t. Retirar da estante magnética.

Lavagem: j. Vortex Enrichment Wash Solution.

k. Adicionar 200 µL do Enrichment Wash Solution.

l. Selar com Microseal B.

m. Vortex a 1.800 rpm por 4 minutos.

n. Selar com Microseal B.

o. Microheating a 50 oC por 30 minutos.

p. Imediatamente colocar a placa na estante magnética por 2 minutos.

43

q. Remover e descartar sobrenadante.

r. Repetir passos b até h mais uma vez.

Eluição: m. Fazer mix: 28,5 µL Enrichment Elution Buffer 1 + 1,5 µL 2N NaOH

(total 30 µL).

n. Vortex o mix e adicione 23 µL na placa. o. Selar com Microseal B.

p. Vortex a 1.800 rpm por 2 minutos.

q. Deixar a temperatura ambiente por 2 minutos.


s. Colocar na estante magnética por 2 minutos.

t. Transferir 21 µL para uma HSP.

u. Adicionar 4 µL do Elute Target Buffer 2.

v. Selar com Microseal B.

w. Vortex a 1.200 rpm por 1 minuto.

x. Centrifugar a 280g por 1 minuto.

9. Limpeza da captura:

a. Adicionar 45 µL das Sample Purification Beads.

b. Selar com Microseal B.

c. Vortex a 1.800 rpm por 1 minuto.

d. Deixar a temperatura ambiente por 10 minutos.


f. Colocar na estante magnética por 2 minutos.

g. Remover e descartar todo sobrenadante.

h. Manter em estante magnética durante as duas lavagens. i. Adicionar lentamente 200 µL de etanol 80% “fresco” e esperar 30

segundos.

j. Remover e descartar o etanol.

k. Repetir passos i e j mais uma vez.

l. Deixar na estante magnética a temperatura ambiente por 10 minutos.

m. Retirar da estante magnética,

n. Adicionar 27,5 µL do Resuspension Buffer (não encostar nos beads).

o. Selar com Microseal B.

p. Vortex a 1.800 rpm por 1 minuto.

q. Incubar a temperatura ambiente por 2 minutos.


s. Retirar selo e colocar na estante magnética por 2 minutos.

t. Transferir 25 µL do sobrenadante limpo para placa HSP.


44

10. 2a PCR:

a. Adicionar 5 µL do PCR Primer Cocktail.

b. Adicionar 20 µL do Nextera Enrichment Amplification Mix.

c. Selar com Microseal A.

d. Vortex a 1.200 rpm por 1 minuto.


f. PCR (aproximadamente 16 minutos).

PONTO DE PARADA (até 2 dias a 2-8oC)

11. Limpeza da 2a PCR:


b. Transferir todo conteúdo (50 µL) para MIDI plate.

c. Adicionar 90 µL das Sample Purification Beads.



f. Incubar a temperatura ambiente por 10 minutos.


h. Retirar selo e colocar na estante magnética por 2 minutos.


j. Manter em estante magnética durante as duas lavagens. k. Adicionar lentamente 200 µL de etanol 80% “fresco” e esperar 30

segundos.

l. Remover e descartar o etanol.

m. Repetir passos k e l mais uma vez.

n. Deixar na estante magnética a temperatura ambiente por 10 minutos.

o. Retirar da estante magnética.

p. Adicionar 32 µL do Resuspension Buffer (não encostar nos beads).

q. Selar com Microseal B.

r. Vortex a 1.800 rpm por 1 minuto.

s. Incubar a temperatura ambiente por 2 minutos.

t. Centrifugar a 280g por 1 minuto.

u. Retirar selo e colocar na estante magnética por 2 minutos.

v. Transferir 30 uL do sobrenadante limpo para placa HSP.

w. Selar com Microseal B.


45

3.2.2.2.2. Controle de qualidade das bibliotecas de exoma.

Para avaliação da qualidade das bibliotecas foi realizada a quantificação total

da amostra obtida utilizando-se o equipamento Qubit 2.0 (Life Technologies, Carlsbad,

CA, USA) e também por meio de análise quantitativa e qualitativa dos fragmentos de

ácidos nucleicos das bibliotecas utilizando o Bioanalyzer 2100 (Agilent Technologies,

Santa Clara, CA USA).

3.2.2.2.3. Sequenciamento do exoma.

Para o sequenciamento foi utilizado o equipamento Illumina HiSeqTM 2500

(Illumina, Inc., San Diego, CA, USA) no Laboratório Central de Tecnologias de Alto

Desempenho em Ciências da Vida (LaCTAD). O sequenciamento foi realizado em

2x100pb (paired ends) com cobertura mínima de 100X. Cabe mencionar que somente 1

membro afetado de cada família foi sequenciado por este método.

3.2.3. Análise bioinformática.

A análise de bioinformática foi realizada de acordo com o seguinte pipeline:

1. Para atestar os níveis de qualidade das reads, foi utilizado o FastQC 0.11.2. A qualidade

das bases requerida foi maior do que Q20.

2. Foi realizado o alinhamento utilizando-se o 'BWA' versão 0.7.5a-r405 e seus

argumentos foram utilizados nos valores-padrão. O genoma de referência utilizado foi o

GRCh38. Para que o processamento via GATK fosse realizado de modo adequado, foi

determinada a tag RG (read-group information) utilizando-se a concatenação do número

de série da flowcell juntamente com a lane na qual cada amostra foi corrida (subcampo

ID).

3. O arquivo SAM resultante do alinhamento foi ordenado por coordenada genômica

utilizando a ferramenta Picard (versão 1.124), pois esta é a única ferramenta que gera

arquivos BAM válidos para a ferramenta GATK.

4. O arquivo BAM resultante do passo acima foi indexado também por meio da

ferramenta Picard.

5. A ferramenta Picard também foi utilizada para marcar fragmentos duplicados no

46

arquivo BAM do passo 3, o que resultou em um novo arquivo BAM.

6. O arquivo BAM contendo os fragmentos duplicados marcados foi ordenado utilizando-

se a ferramenta Picard.

7. Todos os arquivos BAM (passos 3 e 5) foram validados para compatibilidade com

GATK por meio do modo STRICT (modo estrito).

8. Foi utilizado o módulo (do GATK) Realigner Target Creator (utilizando o genoma de

referência descrito acima, juntamente com o banco de dados dbSNP (versão 142) para a

determinação de regiões que apresentam evidências a favor de realinhamento local.

9. Empregou-se o módulo Indel Realigner para a execução dos realinhamentos locais.

Para este passo, foi adotado um limiar reduzido de LOD = 0.4 para consideração do

realinhamento. Este passo resulta em um novo BAM (realinhamento).

10. O BAM realinhado foi novamente indexado pelo Picard.

11. Os níveis de qualidade foram então recalibrados utilizando-se o módulo Base

Recalibrator aplicado ao BAM realinhado. Esta recalibração utiliza também as

informações de read-group (Passo 2).

12. Criou-se um novo arquivo BAM (recalibrado) contendo os níveis de qualidade

corrigidos.

13. O BAM recalibrado foi indexado novamente, via Picard.

14. Utilizou-se o módulo Haplotype Caller para a determinação de variantes. O programa

determina regiões do genoma que apresentam evidências de variantes. Um método como

grafos De Buijn é utilizado para a reconstrução de cada uma dessas regiões, identificando

haplótipos prováveis. Cada haplótipo é realinhado à referência. Usando-se métodos

probabilísticos (cadeias de Markov oculta) determina-se qual haplótipo é mais

concordante com os dados para determinar os alelos mais prováveis. Então determinam-

se os genótipos.

15. O resultado dos passos acima é um arquivo VCF que possui SNP/indels não-filtrados.

47

16. Para a anotação das variantes se fez o upload do arquivo VCF no software

ANNOVAR (http://wannovar.usc.edu/) o que gerou um arquivo. CSV com as SNVs

devidamente anotadas.

3.2.4. Filtragem de variantes potencialmente patogênicas.

A filtragem foi realizada seguindo os seguintes critérios:

1. Inicialmente foram selecionados todos os genes já caracterizados como causadores da

síndrome de Usher (tabela 2).

2. Variantes comuns e sinônimas foram excluídas.

3. Variantes não sinônimas foram selecionadas de acordo com as consequências aferidas

pelos algoritmos SIFT, Polyphen-2, LRT, Mutation Taster. As predições resultantes

maioritariamente como danosas e/ou deletérias receberam maior importância na análise.

4. Validação das variantes que provavelmente sejam as causadoras da doença.

5. Análise de segregação na família.

3.2.5. Validação e segregação na família das variantes potencialmente patogênicas

por meio do sequenciamento de Sanger.

Todas as variantes candidatas identificadas, foram confirmadas pela técnica de

sequenciamento de Sanger. Nesta análise foram incluídos todos os indivíduos das 11

famílias, para observação da segregação da alteração em indivíduos afetados.

Para a realização desta análise foram construídos primers (tabela 3) específicos

para cada região no qual estas variantes estão localizadas, com base no banco de dados

Ensembl (http://www.ensembl.org/index.html). Os primers foram desenhados com a

ajuda do software Primer 3 (http://bioinfo.ut.ee/primer3-0.4.0/primer3/). As sequências

foram validadas pela ferramenta PCR in silico do UCSC genome browser

(https://genome.ucsc.edu/cgi-bin/hgPcr) e verificadas quanto a regiões semelhantes pelo

Primer Blast do NCBI (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/tools/primer-blast/).

http://www.ensembl.org/index.htmlhttp://bioinfo.ut.ee/primer3-0.4.0/primer3/http://www.ncbi.nlm.nih.gov/tools/primer-blast/

48

Tabela 3: Sequências dos primers das variantes encontradas no sequenciamento massivo

e no painel de captura.

PRIMERS 5’ 3’ TAMANHO

(pb)

To

anelamento

Gene

Y1123 F -

ACAGACCTGTTACCATATACCAAAT

Y1123 R - GGGAATCTCAGCCTTGGA

500 pb 57 oC USH2A

E4034 F -

GGCCATGAGGTTCAGAGAAT

E4034 R -

GGCATGTCAGGGCTCATCTA

385 pb 56 oC USH2A

F1732 F -

CTCAGTGGCAGACTGTGTCC

F1732 R -

CAAAATGTTTCACAGGACTTCAA

395 pb 59 oC USH2A

N443 F –

TTGCTTTTACCACAGGGCTA

N443 R -

TGCCAAACAATCTGAAAATCA

596 pb 52 oC USH2A

S2981 F-

AACTATCACCACCAGCACCA

S2981 R-

TCTGTCTCAATGGGACTGCTT

574 pb 67 oC USH2A

C3267 F –

AAGTTGCCATGTGTGTATCTGA

C3267 R-

TTGGGAGATTACATTGTTATGTGTT

597 pb 51 oC USH2A

C638 F –

GCACAGTTTGTAACAGGTTCATT

C638 R -

CCATACTCAAAGTTGCACACG

486 pb 51 oC USH2A

N405 F –

TTGCTTTTACCACAGGGCTA

N405 R -

TGCCAAACAATCTGAAAATCA

596 pb 52 oC USH2A

L4406 F –

CTGGATCCCACCAGAACAGT

L4406 R -

TGGCTGTTGCTGGCAGTTA

693 pb 57 oC USH2A

49

E2520 F -

TGCCTGTCCTTCCTCTATCCA

E2520 R -

AGCCAAGTTTCCCCACCTTTA

726 pb 63 oC CDH23

A2637 F -

GGGAGGAGAGAAGAGGGACA

A2637 R - GGGATTGGCTTGGGGAC

521 pb 64 oC CDH23

S1369 F -

GAACATGAGCAAATTCCTATGAGA

S1369 R -

GACATACAAAGAGGGAGGCTTG

599 pb 57 oC USH2A

M3271 F -

AAGTTGCCATGTGTGTATCTGA

M3271 R -

TTGGGAGATTACATTGTTATGTGTT

597 pb 59 oC USH2A

Para um volume de 25 µL de reação foram utilizados: 200 a 500 ng de DNA

genômico, 200 µM de cada desoxinucleotídeos trifosfato (dATP, dCTP, dGTP e dTTP),

20 pmol de cada primer (direto e reverso), 2,5 U de Taq DNA polimerase em tampão de

PCR 10X (Tris-HCl 10mM pH 8,8), 20 mM de MgCl2, completando com água até o

volume final. As amplificações foram realizadas em aparelho termociclador Veriti® 96-

Well Thermal Cycler (Applied Biosystems). As condições da PCR estão resumidas na

tabela 4.

Tabela 4: Programa para amplificação das variantes encontradas no sequenciamento de

nova geração.

Etapa Número de ciclos Temperatura Tempo

1 1 95°C 5 minutos

2 35

95°C 30 segundos

T° anelamento 30 segundos

72°C 45 segundos

3 1 72°C 5 minutos

4 1 12°C ∞

50

3.3. Analise da frequência de novas alterações em um grupo de indivíduos controle.

As variantes confirmadas pela técnica de Sanger e presentes nos indivíduos afetados

(ausentes nos indivíduos não afetados em casos familiares) foram pesquisadas no banco

de dados de exomas BIPMed (http://bipmed.iqm.unicamp.br/genes), atualmente

conformada por 106 indivíduos de origem brasileira.

http://bipmed.iqm.unicamp.br/genes

51

4. RESULTADOS

Foram analisados 11 indivíduos afetados provenientes de 11 famílias (1 de cada

família). Ao todo foram coletados DNA de 44 indivíduos incluindo probandos e

familiares.

Das 11 famílias estudadas, oito foram analisadas por meio do sequenciamento de

exoma; em uma família o rastreamento foi realizado utilizando painel de sequenciamento

em colaboração com o Hospital Ramón y Cajal (Madri – Espanha) e finalmente em 2

famílias (5 e 10) o rastreamento de mutações ficou restrito aos exons 7, 11, 17, 19, 26,

45, 50, 62 e 63 do gene USH2A utilizando sequenciamento de Sanger. Na família 5 o

sequenciamento massivo não foi realizado pela impossibilidade de se obter amostras dos

demais indivíduos da família, e a família 10 foi incluída na casuística na fase final do

trabalho. Para a técnica de sequenciamento massivo, em termos de custo-benefício é

adequado o sequenciamento de pelo menos 6 indivíduos em cada lane de amostras, dessa

forma nos pacientes das famílias 5 e 10 não foi realizado o sequenciamento de exoma. Os

dados clínicos dos 11 pacientes afetados provenientes das 11 famílias encontram-se na

tabela 5. Somente o probando da família 11 apresenta função vestibular alterada.

52

Tabela 5: Dados clínicos dos indivíduos estudados.

Família Paciente Sexo Idade Tipo e Grau de perda auditiva Início da Retinose

pigmentar

Tipo de Síndrome

de Usher

Recorrência

familiar

1 331OT Masculino 47 Perda auditiva bilateral de grau moderado Depois da puberdade USH2A +1 indivíduo

2 01 Feminino 35 Perda auditiva bilateral de grau moderado Depois da puberdade USH2A Sem recorrência

3 02 Masculino 45 Perda auditiva bilateral de grau moderado Depois da puberdade USH2A +1 indivíduo

4 03 Feminino 38 Perda auditiva bilateral de grau moderado Depois da puberdade USH2A +1 indivíduo

5 05 Feminino 58 Perda auditiva bilateral de grau moderado Depois da puberdade USH2A Sem recorrência

6 06 Masculino 53 Perda auditiva bilateral de grau severo Depois da puberdade USH2A +2 indivíduos

7 07 Masculino 59 Perda auditiva bilateral de grau severo Depois da puberdade USH2A +1 indivíduo

8 08 Feminino 59 Perda auditiva bilateral de grau severo Depois da puberdade USH2A +3 indivíduos

9 09 Feminino 58 Perda auditiva bilateral de grau moderado Depois da puberdade USH2A

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