UNIVERSIDADE ESTADUAL DE CAMPINAS FACULDADE DE...
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UNIVERSIDADE ESTADUAL DE CAMPINAS FACULDADE DE ODONTOLOGIA DE PIRACICABA EZEQUIEL GABRIELLI ANÁLISE DO CONTEÚDO INFECCIOSO/ENDOTÓXICO DE CANAIS RADICULARES DE DENTES COM INFECÇÕES ENDODÔNTICAS SINTOMÁTICAS E ASSINTOMÁTICAS. Piracicaba 2019
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UNIVERSIDADE ESTADUAL DE CAMPINAS
FACULDADE DE ODONTOLOGIA DE PIRACICABA
EZEQUIEL GABRIELLI
ANÁLISE DO CONTEÚDO INFECCIOSO/ENDOTÓXICO DE CANAIS
RADICULARES DE DENTES COM INFECÇÕES ENDODÔNTICAS
SINTOMÁTICAS E ASSINTOMÁTICAS.
Piracicaba
2019
EZEQUIEL GABRIELLI
ANÁLISE DO CONTEÚDO INFECCIOSO/ENDOTÓXICO DE CANAIS
RADICULARES DE DENTES COM INFECÇÕES ENDODÔNTICAS
SINTOMÁTICAS E ASSINTOMÁTICAS.
ORIENTADORA: Professora Dra. Brenda Paula Figueiredo de Almeida Gomes
Piracicaba
2019
Dissertação apresentada à Faculdade de
Odontologia de Piracicaba da Universidade Estadual
de Campinas como parte dos requisitos exigidos para
a obtenção do título de Mestre em Clínica
Odontológica, na área de Endodontia.
ESTE EXEMPLAR CORRESPONDE À
VERSÃO FINAL DA DISSERTAÇÃO
DEFENDIDA PELO ALUNO EZEQUIEL
GABRIELLI E ORIENTADA PELA PROFA.
DRA. BRENDA PAULA FIGUEIREDO DE
ALMEIDA GOMES.
DEDICATÓRIAS
À Deus, sem ele em meu coração nada disso seria possível. O Senhor
sempre me guiou pelos melhores caminhos e esteve presente em todos os
momentos desta jornada.
Dedico este trabalho a meu pai Lauri Gabrielli e a minha mãe Elisete Santin
Gabrielli. O apoio de vocês sempre foi fundamental para que eu seguisse o meu
sonho. Vocês são os meus maiores exemplos de que com trabalho, humildade e
dignidade o sucesso é alcançado. Vocês são a minha vida! Muito obrigado por todo
carinho e motivação para que eu concluísse esta etapa!
À minha namorada, Andressa Welter, por sempre estar ao meu lado me
apoiando em minhas escolhas. Você me ajudou a compreender melhor a vida e as
pessoas tornando os dias longe de casa e de todos mais fáceis. Muito obrigado pelo
companheirismo, carinho e dedicação comigo!
À toda família Santin e família Gabrielli, vocês todos foram essenciais para
esta conquista. A cada visita, a alegria de todos me contagiava de tal forma a
renovar as minhas energias para prosseguir esta jornada. Mesmo eu estando longe
vocês sempre estiveram presentes no meu cotidiano amenizando as saudades e
vibrando as minhas conquistas!
À minha orientadora Profa. Dra. Brenda Paula Figueiredo de Almeida
Gomes, por despertar em mim o interesse pela pesquisa com seus inúmeros
exemplos de competência. Agradeço por confiar em meu potencial e me orientar
estimulando meu crescimento profissional e pessoal. Este período foi muito
importante em minha vida e a senhora sempre esteve presente incentivando e
oportunizando a realização da minha caminhada.
AGRADECIMENTOS
À direção da Faculdade de Odontologia de Piracicaba, da Universidade
Estadual de Campinas, na pessoa do seu diretor, o Prof. Dr. Francisco Haiter Neto.
À Fundação de Amparo a Pesquisa do Estado de São Paulo (FAPESP)
pela concessão da bolsa de mestrado, processo nº 2017/18459-0.
O presente trabalho foi realizado com apoio da Coordenação de
Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior – Brasil (CAPES) - Código de
Financiamento 001.
À Profa. Dra. Karina Gonzales Silvério Ruiz, coordenadora do Programa
de Pós-Graduação da FOP/UNICAMP e ao Prof. Dr. Valentim Adelino Ricardo
Barão, coordenador do curso de Pós-Graduação em Clínica Odontológica.
Aos professores da área de Endodontia, Profa. Dra. Adriana de Jesus
Soares, Prof. Dr. Alexandre Augusto Zaia, Profa. Dra. Brenda Paula Figueiredo
de Almeida Gomes, Prof. Dr Caio Cezar Randi Ferraz, Prof. Dr. José Flávio
Affonso de Almeida e Profa. Dra. Marina Angélica Marciano.
Aos professores da Universidade de Passo Fundo Prof. Dr. Matheus Albino
Souza e Prof Dr. Doglas Cecchin pela amizade e encorajamento para seguir na
carreira docente.
Ao meu amigo Augusto Rodrigues Lima, você sempre se mostrou
disponível desde que eu cheguei à FOP/UNICAMP. Muito obrigado por toda ajuda
desprendida durante estes anos e por sempre me servir de exemplo de caráter e
conduta.
Ao meu amigo Maicon Ricardo Zieberg Passini. Pessoa de personalidade
incrível, humilde e sempre disposto a ajudar. Muito obrigado pela ajuda rotineira no
laboratório.
À Ana Cristina Godoy, sempre com sua felicidade contagiante e disposta a
ver todos bem. Você foi uma pessoa sensacional, muito obrigado pela companhia de
sempre tornando nossos dias mais agradáveis.
Aos meus amigos da minha terra Arthur Leonardo Weber e Lauter Eston
Pelepenko Teixeira. Nossa amizade é muito importante para mim. Com nosso
companheirismo tornamos os dias longe de casa mais agradáveis e engraçados.
Espero sempre retribuir essa amizade.
Aos funcionários Maria Helídia Neves Pereira e Janaína Leite.
Aos funcionários da Coordenação de Pós-Graduação, Ana Paula Carone
Gonzales, Leandro Vigano e Érica Alessandra Pinho Sinhoreti. Vocês todos são
sinônimos de competência, sempre disponíveis para solucionar problemas
encontrados no decorrer desse caminho da melhor forma possível. Muito obrigado
por toda ajuda.
A minha banca de qualificação, Dra. Débora Campanella Bastos, Dra.
Janaína Sardi e Prof. Dr. José Flavio Affonso de Almeida pelas incontestáveis
considerações a fim de construirmos melhorias neste trabalho.
Aos meus colegas de mestrado, Emelly de Aveiro, Fernanda Yukari
Takara, Jéssica Jeuken Teixeira, Lauter Eston Pelepenko Teixeira, Lidiane
Mendes Louzada, Natália Siqueira Lobo, Pabla Secchi, Ricardo Honda e Vito
Madio Chiarelli Neto.
Aos colegas de doutorado, Aline Cristine Gomes, Ana Carolina Correia
Neto, Maria Cristina Carvalho, Augusto Rodrigues Lima, Bruna Milaré, Felipe
Nogueira Anacleto, Daniel Rodrigo Herrera, Rodrigo Vasconscelos, Bruna
Ueno, Eloá Cristina Bícego, Rafaela Casadei Chapola, Diogo da Silva,
Jaqueline Lazzari, Andrea Cardoso Pereira, Priscila Amanda Francisco, Marina
Prado e Flávia Saavedra.
Aos pacientes que participaram da minha pesquisa, muito obrigado pela
confiança. Vocês são essenciais para a concretização deste projeto.
A todos que participaram direta ou indiretamente, contribuindo para
realização deste trabalho.
“O ponto de partida para qualquer conquista é o desejo.”
Napoleon Hill
RESUMO
O interior de canais radiculares com a presença de tecido pulpar necrótico
estabelece um nicho ecológico complexo e adequado para o desenvolvimento de
infecções endodônticas polimicrobianas. Além disso, é importante observar o seu
potencial inflamatório através dos níveis de fatores de virulência como o ácido
lipopolissacarídeo (LPS) e ácido lipoteicoico (LTA). O objetivo deste estudo foi
investigar a presença de microrganismos específicos em canais radiculares, e
avaliar os níveis de LPS e LTA nos casos de dentes necrosados sintomáticos com
abscesso associado (GI) e também canais radiculares de dentes necrosados
assintomáticos (GII) durante as etapas do tratamento endodôntico. Vinte pacientes
com necessidade de intervenção endodôntica foram selecionados apresentando ou
não sintomatologia dolorosa. Amostras microbiológicas, de LPS e de LTA foram
coletadas em diferentes fases do tratamento endodôntico: antes do preparo químico-
mecânico (PQM), após PQM, e após medicação intracanal (MIC), de 20 canais
radiculares e também do abscesso apical agudo. O método de cultura foi empregado
para avaliar eficácia do PQM e da MIC na redução da carga microbiana. Nested-
PCR foi realizado para investigar espécies específicas de microrganismos nas
diferentes fases do tratamento endodôntico. Níveis de LPS foram mensurados pelo
teste Limulus Amebocyte Lysate (LAL). Enzyme-Linked Immunosorbent Assay foi
empregado para quantificação de LTA. Todos os dados foram tabulados e analisados
por diferentes testes estatísticos. Os níveis de endotoxinas foram mais altos em GI
do que em GII (p<0,05). O PQM foi efetivo na redução da carga microbiana em
ambos os grupos (p<0,05). No GII houve redução significativa de LTA após PQM
(p<0,05), já no GI a redução foi significativa somente após MIC (p<0,05). No GI
houve redução de LPS após PQM (p<0,05), já no GII a redução somente foi
significativa após MIC (p<0,05). Enterococcus faecalis e Fusobacterium nucleatum
foram espécies frequentemente detectadas em casos de infecção primária. Os
níveis de LPS foram maiores nos casos sintomáticos, estando associados com a
presença de dor espontânea. Concluiu-se que diferentes espécies são detectadas
em todas as etapas do tratamento endodôntico. O PQM é capaz de reduzir a carga
microbiana, entretanto não do LTA, cujos níveis permanecem elevados mesmo após
a MIC.
PALAVRAS-CHAVES: microrganismos, ácido lipopolissacarídeo, ácido lipoteicoico,
endodontia, necrose pulpar, abscesso, Nested-PCR.
ABSTRACT
The interior of root canals with the presence of necrotic pulp tissue establishes a
complex and adequate ecological niche for the development of polymicrobial
endodontic infections. In addition, it is fundamentally important to observe its
inflammatory potential through levels of virulence factors such as lipopolysaccharide
(LPS) and lipoteichoic acid (LTA). The objective of this study was to investigate the
presence of specific microorganisms in root canals, and to evaluate the levels of LPS
and LTA in cases of symptomatic necrotic teeth with associated abscess (GI) and in
root canals of asymptomatic necrotic teeth (GII) during the endodontic treatment
(ET). Twenty patients requiring endodontic intervention were selected with or without
pain symptomatology. Microbiological, LPS and LTA samples were collected in
different phases of endodontic treatment: before the chemical-mechanical
preparation (CMP), after CMP, and after intracanal medication (ICM), 20 root canals
and acute apical abscess. Culture method was used to evaluate the effectiveness of
CMP and ICM in reducing microbial load. Nested-PCR was performed to investigate
specific species of microorganisms in the different phases of endodontic treatment.
Levels of LPS were measured by the Limulus Amebocyte Lysate (LAL) test. Enzyme-
Linked Immunosorbent Assay was used for quantification of LTA. All data were
tabulated and analyzed by different statistical tests. Endotoxin levels were higher in
GI than in GII (p <0.05). CMP was effective in reducing the microbial load in both
groups (p <0.05). In GII there was a significant reduction of LTA after CMP (p <0.05),
whereas in GI the reduction was significant only after MIC (p <0.05). In GI, there was
a reduction of LPS after CMP (p <0.05). In GII, the reduction was only significant
after ICM (p <0.05). Enterococcus faecalis and Fusobacterium nucleatum were highly
detected in cases of primary infection. LPS is present in higher levels in symptomatic
cases and is associated with the presence of spontaneous pain. It was concluded
that different species are detected in all stages of endodontic treatment. CMP is able
to reduce microbial load, but not LTA, whose levels remain high even after ICM.
KEY WORDS: microorganisms, lipopolysaccharide acid, lipoteicoic acid, endodontia,
pulp necrosis, abscess, Nested-PCR.
SUMÁRIO
1 INTRODUÇÃO 15
2 REVISÃO DA LITERATURA 18
Microbiota da Infecção Endodôntica Primária Sintomática e
Assintomática 18
Método de Cultura Microbiana na Endodontia 23
Método de Nested-PCR na Endodontia 25
Quantificação dos níveis de Ácido Lipopolissacarídeo (LPS) na Endodontia 27
Quantificação dos níveis de Ácido Lipoteicoico (LTA) na Endodontia 30
3 PROPOSIÇÃO 33
Objetivo Geral 33
Objetivos Específicos 33
4 MATERIAL E MÉTODOS 34
5 RESULTADOS 50
Sinais e Sintomas Clínicos Apresentados pelos Pacientes dos Grupos
Sintomáticos e Assintomáticos 50
Quantificação de UFC, LPS e LTA em Pacientes dos Grupos Sintomáticos e
Assintomáticos nas Diferentes Fases do Tratamento Endodôntico 57
Análises das Frequências e Porcentagens de Detecção de Microrganismos
através do Nested-PCR 64
6 DISCUSSÃO 83
7 CONCLUSÃO 88
REFERÊNCIAS 89
APÊNDICES 101
APÊNDICE 1 - Termo de Consentimento Livre e Esclarecido 101
65
APÊNDICE 2 - Quadros das Bactérias Detectadas pelo Nested-PCR em
Casos Sintomáticos e Assintomático 105 00
ANEXOS 112
ANEXO 1 - Verificação de Originalidade e Prevenção de Plágio 112
ANEXO 2 - Certificado do Comitê de Ética em Pesquisa da FOP-UNICAMP 113
15
1 INTRODUÇÃO
O interior de canais radiculares com a presença de tecido pulpar necrótico
estabelece um nicho ecológico complexo e adequado para o desenvolvimento de
infecções endodônticas polimicrobianas, além disso, estas fontes de microrganismos
são capazes de se propagarem, e assim contaminar os tecidos periapicais
(Sundqvist, 1992; Montagner et al., 2012). A periodontite apical é uma destas
infecções dos tecidos periapicais caracterizada por ser uma alta agressão e
originada por bactérias que se deslocam via forame apical para a superfície externa
radicular do elemento dentário. O resultado a este ataque microbiano é uma
inflamação localizada na extremidade radicular de um dente, assim esta resposta
ocasionada por bactérias e seus subprodutos pode manifestar-se de diferentes
formas, incluindo o desenvolvimento de um abscesso apical agudo (AAA) (Siqueira
& Rôças, 2013; Sousa et al., 2014a).
O AAA é clinicamente identificado pela presença de dor à percussão e
dor/sensibilidade à palpação, apresenta aumento de volume com potencial de
difusão para os seios e outros espaços faciais da cabeça e pescoço, com eventuais
consequências letais. Quando a resposta inflamatória não consegue eliminar o
agente agressor ou reduzir a intensidade desta injúria, ocorre uma exacerbação
caracterizada por uma inflamação purulenta, isto ocorre devido à presença de
bactérias altamente virulentas associadas à infecção (Rôças et al., 2001; Robertson
& Smith, 2009; Nóbrega et al., 2016).
O aspecto microbiológico das infecções endodônticas primárias é um
cenário polimicrobiano dominado por espécies anaeróbias estritas (Gomes et al.,
2015; Siqueira et al., 2001). Alguns estudos já realizados para identificação
bacteriana presente em AAA relatam os gêneros Prevotella, Streptococcus e
Porphyromonas como os mais encontrados nestas lesões (Khemaleelakul et al.,
2002; Siqueira et al., 2001; Nóbrega et al., 2016; Rajaram et al., 2016).
A utilização de testes de cultura microbiana favoreceu a compreensão do
processo infeccioso nos canais radiculares necrosados durante um longo período,
através da identificação bacteriana, e avaliação da suscetibilidade aos
16
procedimentos endodônticos (Peters et al., 2002; Vianna et al., 2008). Entretanto,
algumas limitações importantes da cultura dificultam a análise abrangente da
microbiota presente nos casos de AAA. Sugere-se que esta limitação se deva ao
conhecimento do predomínio de espécies anaeróbias estritas nestas lesões (Gomes
et al., 1996a; Peters et al., 2002; Sousa et al., 2003). Assim para fins de pesquisa e
cultua dos canais radiculares e abscessos tornam-se extremamente sensíveis, pois
estes procedimentos requerem critérios que favoreçam a sobrevivência destes
microrganismos desde o momento da sua coleta e transporte até o cultivo dos
mesmos (Petti et al., 2005; Roças & Siqueira, 2013). Contudo, o teste de unidades
formadoras de colônias (UFC) é um método confiável para avaliar o potencial de
descontaminação de agentes antimicrobianos utilizados na terapia endodôntica
(Vianna et al., 2008).
Os métodos moleculares para detecção específica de espécies bacterianas
são progressivamente mais aceitos e utilizados na endodontia. Além do que, estes
servem como alternativa aos fatores que podem inviabilizar a identificação fenotípica
de microrganismos pelos métodos de cultura tradicionais (Song, 2005, Shahi et al.,
2018).
A reação em cadeia da polimerase (PCR) é um método molecular que
apresenta diversas vantagens como: alta sensibilidade, precisão, análise rápida,
reprodutibilidade, controle de qualidade e contaminação mínima (Schochetman et
al., 1988). Permitindo algumas variações em sua metodologia a fim de propiciar
resultados com detecções de espécies bacterianas mais específicas, como exemplo
a reação de Nested-PCR (Shahi et al., 2018).
A técnica de Nested-PCR é uma variação do PCR com grande
especificidade e sensibilidade, fundamentalmente por meio da utilização de dois
primers em reações distintas. Este duplo conjunto de primers utilizado
sequencialmente reduzem a ligação não específica em produtos devido à
amplificação de sítios de ligação de primers inesperados (Song, 2005; Gomes et al.,
2007; Shahi et al., 2018)
Além da grande importância referente ao conhecimento da microbiota que
compõem as lesões endodônticas é de fundamental relevância observar o seu
17
potencial inflamatório nos tecidos pulpares e perirradiculares. O ácido
lipopolissacarídeo (LPS) ou também denominado de endotoxina, é uma molécula
que compõem a membrana externa de bactérias gram-negativas
predominantemente envolvidas nas infecções dos canais radiculares (Cardoso et al.,
2015).
As endotoxinas estabelecem uma rede importante na reação inflamatória
(Martinho et al., 2012), interagindo com células do sistema imunológico dos tecidos
periapicais durante sua multiplicação e/ou morte celular, consequentemente ocorre a
estimulação e liberação de mediadores químicos responsáveis pela reabsorção
óssea e incitação de dor (Gomes et al., 2009; Martinho et al., 2010; Nakamura et al.,
2017).
Alguns estudos já determinaram a presença de bactérias gram-positivas em
infecções primárias (Gomes et al., 1994a; Sousa et al., 2003; Gomes et al., 2004),
tornando fundamental a realização de estudos com intuito de investigar fatores de
virulência associados à este grupo bacteriano, como por exemplo a presença do
ácido lipoteicóico (LTA). Além de estar envolvido na patogenicidade destes
microrganismos gram-positivos, o LTA é considerado um importante agente
etiológico, responsável pela indução da resposta inflamatória e dano nos tecidos
periapicais (Kayaoglu & Orstavik, 2004). O LTA favorece a adesão bacteriana e
consequentemente a viabilização na formação de biofilmes bacterianos, como
resultado favorecendo a resistência a desinfetantes e antibióticos utilizados na
terapia endodôntica (Ginsburg, 2002; Fabretti et al., 2006; Baik et al, 2008a).
Diante disso, revendo a literatura, é possível observar que são escassos os
estudos que comparam simultanemante a identificação de uma microbiota específica
em dentes com periodontite apical sintomática e assintomática. Também,
atualmente, não há nenhum estudo na literatura que quantifique os níveis de LTA em
infecção primária. E ainda, os poucos estudos que determinam as concentrações de
LPS em casos de infecção primária não são comparando dois grupos conjuntamente
como o presente trabalho determinou.
18
2 REVISÃO DA LITERATURA
2.1 Microbiota da Infecção Endodôntica Primária Sintomática e
Assintomática
A microbiota oral é composta por mais de setecentas espécies bacterianas já
reconhecidas como habitantes da cavidade oral em condições saudáveis. O
conhecimento da natureza da microbiota endodôntica depende basicamente da
identificação de microrganismos presentes no sistema de canais radiculares (Jung et
al., 2000; Gomes et al ., 2004).
Em um estudo primário, conduzido por Kakehashi et al. (1965) os autores
objetivaram observar alterações patológicas no tecido pulpar em duas situações
distintas. Para este experimento, dentes de ratos germ-free e ratos convencionais
foram expostos à cavidade oral. Logo foi possível observar a presença de necrose
pulpar completa associada à granulomas e a formação de abscessos apicais nos
ratos convencionais apresentando uma micromicrobiota oral. Em contrapartida, não
foram encontradas polpas necrosadas, granulomas ou abscessos apicais nos
animais germ-free. A partir deste estudo foi concluído que microrganismos e seus
subprodutos são fatores etiológicos da doença endodôntica. Mesmo diante de
impactações severas de alimentos, a presença ou ausência de infecção bacteriana
foi o fator determinante na cicatrização das polpas expostas.
Fabricius et al. (1982) contaminaram dentes de macacos por meio da
exposição do tecido pulpar à cavidade oral com objetivo de avaliar a microbiota
presente nos canais radiculares em diferentes períodos: 7, 90, 180 e 1060 dias. Os
resultados deste trabalho mostraram que a microbiota presente nos canais sofreu
alterações quantitativas e qualitativas nos diferentes períodos. Foi possível observar
a predominância de microrganismos facultativos na porção coronária nos períodos
iniciais. Logo, com o transcorrer dos intervalos entre as coletas a proporção de
colonização de microrganismos anaeróbios aumentou, chegando a 50% de
anaeróbios estritos no final dos 1060 dias. Também foi possível verificar a
predominância de microrganismos fastidiosos na região mais crítica anatomicamente
destes dentes, a região apical.
19
A quantidade de microrganismos identificação no interior de canais
radiculares é menor quando comparada a microbiota oral (Swimberghe et al., 2018).
Em um estudo realizado por Siqueira & Rôças (2009) foram catalogadas as espécies
bacterianas identificadas fenotipicamente através de métodos de cultura e por meio
de testes moleculares. Com isso, os autores apuraram cerca de 460 diferentes
espécies encontradas no interior dos canais radiculares de diferentes tipos de
infecção endodôntica. Os filos com maior quantidade de espécies foram Firmicutes,
Bacteroidetes, Actinobactérias e Proteobactérias respectivamente.
A colonização no ambiente do canal radicular e a seleção biológica dos
microrganismos são respaldadas por alguns fatores que favorecem este processo.
Fatores como ambiente anaeróbico, interações de sinergismo e antagonismos entre
bactérias e a disponibilidade de nutrientes podem determinar a composição da
microbiota (Nair, 1987; Ricucci & Siqueira, 2010; Swimberghe et al., 2018).
O aspecto microbiológico das infecções endodônticas primárias é um
cenário polimicrobiano dominado principalmente por espécies anaeróbias estritas.
Este ambiente é passível de variações de acordo com as vias de acesso dos
microrganismos ao tecido pulpar (Gomes et al., 1994a; Siqueira et al., 2001; Gomes
et al., 2015;).
A colonização bacteriana no interior de canais radiculares infectados é
arquitetonicamente distinta. As bactérias podem ser encontradas na forma
planctônica, ou seja, suspensas no lúmen do canal radicular úmido, ou na forma de
agregados bacterianos aderidos à parede do canal radicular, também denominada
de biofilmes (Nair, 1987). Além disso, bactérias de diferentes morfologias como
cocos, bastonetes e formas filamentosas podem penetrar em graus variados de
profundidade em túbulos dentinários, podendo chegar próximo a 300 µm (Sen et al.,
1995; Siqueira et al., 2002).
A periodontite apical é uma doença inflamatória e infecciosa que afeta os
tecidos periapicais de um elemento dentário, podendo ser manifestada clinicamente
de forma sintomática ou assintomática (Gomes & Herrera, 2018).
A periodontite apical assintomática é definida por um distúrbio inflamatório
crônico dos tecidos perirradiculares (Nair, 2006). Logo, acredita-se que em casos
20
assintomáticos a infecção está geralmente restrita ao canal radicular. As bactérias
envolvidas diretamente na patogenicidade da doença são aquelas localizadas na
porção apical do sistema de canal radicular e que nestes casos possivelmente uma
infecção extrarradicular está ausente (Ricucci & Siqueira, 2010; Rôças & Siqueira,
2018). Clinicamente os sinais e sintomas são praticamente ausentes, podendo ser
relatado alguns episódios prévios de dor e/ou sensibilidade. Ao exame radiográfico
estes dentes estão associados à presença de lesões radiolúcidas localizadas no
periápice ou então lateralmente quando presente ramificações do sistema de canais
radiculares. Esta é uma condição patológica que poderá ser exclusivamente
diagnosticada entre granuloma, cisto ou então a própria periodontite apical
assintomática/crônica. Histopatologicamente consiste na presença de um tecido
granulomatoso com infiltrado inflamatório de células, fibroblastos e cápsula fibrosa
bem desenvolvida. (Alptekin et al., 2005; Salina-Muñoz et al., 2017; Braz-Silva et al.,
2018).
A periodontite apical sintomática acontece no interior de uma região
periapical em decorrência de uma agressão microbiológica ou física. Dentes com
periodontite apical sintomática estão correlacionados a uma alta sensibilidade aos
testes de percussão e palpação (Nair, 2000; Siqueira & Rôças, 2009).
Radiograficamente podem ou não estar associados a áreas radiolúcidas localizadas
na região periapical (Márton & Kiss, 2000). A alta agressão microbiológica ao tecido
pulpar viabiliza o deslocamento de bactérias via forame apical para a superfície
radicular externa do elemento dentário. A forma mais comumente encontrada
clinicamente nos pacientes em decorrência desta migração bacteriana aos tecidos
periapicais é o desenvolvimento do AAA (Montagner et al., 2012).
Clinicamente o AAA é identificado pela presença de dor à percussão e
dor/sensibilidade à palpação. Além disso, é evidente o aumento de volume na região
associada ao elemento dentário afetado pela infecção, com potencial de difusão
para os seios e outros espaços faciais da cabeça e pescoço, com eventuais
consequências letais (Currie & Ho, 1993). Quando a resposta inflamatória não
consegue eliminar o agente agressor ou reduzir a intensidade desta injúria, ocorre
uma exacerbação caracterizada por uma inflamação purulenta, isto ocorre devido à
presença de bactérias altamente virulentas associadas à infecção (Siqueira &
Rôças, 2001; Robertson & Smith, 2009; Nóbrega et al., 2016).
21
Em 2001, Rôças et al. pesquisaram a presença das bactérias
Porphyromonas gingivalis, Tannerella forsythia e Treponema denticola, componentes
do complexo vermelho de Socransky em casos de AAA. Através da execução de
PCR do gene 16S rRNA os autores observaram a presença de no mínimo uma
espécie bacteriana em cada amostra. Treponema denticola foi a espécie mais
prevalente, sendo detectada em 5/10 casos, seguido da Porphyromonas gingivalis
4/10 e Tannerella forsythia 1/10. Sendo assim, mesmo estes patógenos sendo
reconhecidos como componentes da microbiota oral e até mesmo associado a
doenças periodontais foi possível reconhecer a ocorrência destes em infecções do
canal radicular, exercendo um processo na patogênese das doenças
perirradiculares.
Espécies bacterianas com morfologia de vibriões ou também denominadas
de espiroquetas pertencem ao gênero Treponema (Dewhirst et al., 2000). A
investigação das espécies que compõem este gênero nas infecções endodônticas é
muito importante devido a sua patogenicidade já relatada por alguns estudos
anteriores e a facilidade que estes microrganismos possuem na sua locomoção do
interior do canal radicular para os tecidos perirradiculares decorrente de sua
morfologia (Rôças et al., 2003; Siqueira & Rôças, 2003; Foschi et al., 2005;
Montagner et al., 2010).
Em 2015, Leite et al. realizaram a primeira revisão sistemática com objetivo
de avaliar a presença de espécies do gênero Treponema em infecções
endodônticas. Para isso, foram incluídos cinquenta e um estudos nesta revisão,
apresentando diferentes metodologias moleculares para identificação destas
bactérias. Os autores observaram que a prevalência de Treponema foi 41,5% em
infecções endodônticas primárias e casos de AAA. Possibilitando assim a conclusão
que estes achados sugerem que as espécies de Treponema são importantes
patógenos endodônticos, particularmente em casos de infecção primária.
George et al. (2016) demonstraram a prevalência de diferentes espécies
bacterianas presentes em casos de AAA em 18 pacientes. Por meio de uma
amplificação inicial do DNA microbiano através da técnica de PCR seguida da
marcação do DNA por meio de microarranjos microbianos (280 espécies) foi possível
22
identificar uma maior prevalência de espécies bacterianas como a Fusobacterium
nucleatum, Parvimonas micra e Porphyromonas endodontalis.
Por meio da técnica de clonagem e sequenciamento, Nóbrega et al. (2016)
avaliaram a microbiota presente em 10 casos de pacientes que apresentaram
periodontite apical sintomática associada ao AAA. Os autores encontraram uma taxa
média de espécies bacterianas por canal de 15, variando entre 11 a 21
microrganismos. Prevotella spp., Fusobacterium nucleatum, Filifactor alocis e
Peptostreptococcus stomatis foram as espécies bacterianas mais frequentemente
detectadas. Com relação à prevalência dos filos identificados, os filos Firmicutes,
Bacteroidetes e Proteobactéria foram respectivamente os mais apresentados. Com
isso, foi possível reafirmar a alta diversidade bacteriana que a infecção endodôntica
primária aguda apresenta. Além disso, a larga variabilidade interdividual foi
constatada pelos autores, destacando a presença de maior quantidade de bactérias
gram-negativas anaeróbias.
Siqueira & Rôças (2004) avaliaram a presença de Dialister pneumosintes e
Filifactor alocis por meio de PCR multiplex 16S rDNA direcionado à detecção dessas
espécies em infecções endodônticas primárias. Amostras foram coletadas em casos
de lesões periapicais e pacientes assintomáticos e também de casos sintomáticos
com AAA associado. A bactéria Dialister pneumosintes foi detectada em um total de
11 amostras, sendo 7 em casos assintomáticos e 4 em abscessos. Filifactor alocis
foi identificada em um total de 9 amostras, 6 assintomáticos e 3 em abscessos. 6
amostras compartilharam as duas espécies bacterianas, sendo 3 assintomáticos e 3
abscessos. Portanto, os autores concluíram que estas duas espécies fazem parte da
microbiota presente em infecções endodônticas primárias, podendo participar da
patogênese das lesões perirradiculares.
Em 2006, Gomes e colaboradores investigaram a presença de Enterococcus
faecalis em infecções endodônticas por meio de métodos de cultura e molecular. Um
total se 100 pacientes participaram do estudo, alocados em dois grupos diferentes.
Sendo, 50 pacientes com necrose pulpar (infecção primaria) e outros 50 pacientes
com tratamento endodôntico prévio insatisfatório associado a imagens radiolúcidas
no periápice (infecção secundária). Enterococcus faecalis foi identificado através da
cultura em 23/100 casos, e em 79/100 através do PCR. Nas amostras de infecção
23
primária o Enterococcus faecalis foi identificado em 4% das 50 amostras por meio da
cultura e em 76% das 50 amostras por meio do PCR. Nos casos de infecção
secundária foi detectado em 42% e 82% na cultura e PCR respectivamente.
Portanto, Enterococcus faecalis foi detectado com frequência em dentes com polpa
necrosada como também em dentes com insucesso da terapia endodôntica prévia.
2.2 Método de Cultura Microbiana na Endodontia
De acordo com Dahlén (2002) os métodos de cultura microbiana são
considerados padrão ouro para avaliação da microbiota componente das infecções
odontogênicas agudas. Atualmente inúmeras técnicas foram relatadas na literatura
para identificação de microrganismos. Entretanto, nenhuma técnica demonstra
capacidade de isolamento e identificação de todos os microrganismos presentes no
interior de canais radiculares (Socransky et al., 1963).
Para o crescimento de microrganismos em métodos de cultura é necessário
a presença de células viáveis e ainda, para sua identificação fenotípica, a cultura
deverá ser obrigatoriamente positiva. Logo, a concentração de microrganismos
deve ser suficientemente elevada para viabilizar o crescimento dos mesmos nos
meios de cultura (Munson et al., 2002; Peters et al., 2002; Vianna et al., 2004).
Sunqvist (1976) utilizou métodos de cultura em anaerobiose. O objetivo foi
avaliar a microbiota de 32 dentes traumatizados, com coroas íntegras, no entanto
compatíveis com diagnóstico de necrose pulpar. A seleção criteriosa dos indivíduos
participantes do estudo permitiu a exclusão de fatores que viabilizassem a
contaminação das amostras. Microrganismos anaeróbios estritos foram isolados em
90% dos casos, valor estes nunca obtidos empregando técnicas de cultura de
bactérias anaeróbios estritas/fastidiosas.
Munson e colaboradores em 2002 avaliaram simultaneamente técnicas de
cultura microbiana e moleculares para investigar a microbiota de canais radiculares
com polpa necrótica associada a presença de AAA. Com isso, os autores
determinaram uma média de 20,2 espécies detectadas por métodos moleculares,
24
em contrapartida a média de microrganismos isolados por métodos de cultura foi de
12,6.
Em 2008, Vianna e colaboradores selecionaram 24 dentes para quantificar o
número total de bactérias em diferentes momentos do tratamento endodôntico. Os
autores realizaram coletas iniciais em canais infectados, após preparo químico-
mecânico (PQM) com clorexidina gel (CHX) 2% e após 7 dias de medicação
intracanal (MIC) para avaliar possíveis alterações microbianas. Técnicas de cultura
anaeróbia e aeróbia foram empregadas para determinar a comunidade microbiana
através da contagem UFCs. Os resultados das culturas em meio ágar demonstraram
uma média de redução bacteriana de 99,96% de microrganismos entre a coleta
inicial e após PQM e também uma diferença não significativa entre após o PQM e 7
dias de MIC. Portanto os autores concluíram o efeito benéfico da preparação
químico-mecânica suplementada pelo uso de uma substância auxiliar antibacteriana
foi possível de reduzir em grande parte os microrganismos presentes no canal
radicular principal.
Martinho e colaboradores (2014) conduziram um estudo com objetivo de
avaliar a eficácia de descontaminação intracanal utilizando sistemas alternativos de
instrumentação. Para isso 48 canais radiculares foram selecionados e divididos em
diferentes grupos de acordo com o instrumento a ser utilizado na terapia
endodôntica: WaveOne, Reciproc ProTaper e Mtwo, cada grupo contendo n = 12. A
substância química auxiliar utilizada foi hipoclorito de sódio (NaOCl) a 2,5%, e
técnica de cultura em meio ágar foi empregada para determinar a contagem de UFC.
Para análise duas coletas foram estabelecidas pelos autores, previamente a
qualquer tratamento químico-mecânico no canal radicular e subsequente ao
tratamento aplicado. Todas as amostras iniciais dos canais radiculares apresentaram
crescimento bacteriano. Todos os sistemas de instrumentação do canal radicular,
reciprocantes de lima única ou sistemas rotatórios foram eficientes na redução de
bactérias cultiváveis (WaveOne (99,45%) e Reciproc (99,93%), (ProTaper (99,85%)
e Mtwo (99,41%). Além disso, a análise de cultura não revelou diferenças na
redução da carga microbiana (p>0,05). Concluindo assim que ambos os sistemas
mostraram eficácia semelhante na redução de bactérias cultiváveis de canais
radiculares infectados, mas ressaltando a ausência de esterilidade do sistema de
canais analisados.
25
A contagem de UFC é método bastante confiável para avaliar o potencial de
agentes antimicrobianos e ainda viabilizar a avaliação da susceptibilidade dos
procedimentos endodônticos por meio de técnicas baseadas em cultura (Gomes et
al., 1996). Para tanto, o crescimento de alguns patógenos orais pode ser
subestimado pelas técnicas baseadas em procedimentos de cultura microbiana
devido a requisitos extremos para permitir seu crescimento, a exemplo bactérias
anaeróbias estritas como as espiroquetas. (Gomes et al., 1994a; Siqueira & Rôças,
2005, Vianna et al., 2005).
Além disso, vale ressaltar que a ampla diversidade bacteriana e a contagem
de bactérias normalmente é sub-representativa pela análise de cultura. Também a
cultura microbiana negativa não indica esterilidade do canal, visto que cerca de 50%
das espécies bacterianas são passíveis de cultivo. O meio de cultura sem a
presença de bactérias cultivadas pode representar o resultado das limitações dos
procedimentos de amostragem, das técnicas de cultura e da presença de bactérias
que ainda não foram cultivadas. Ainda, resultados negativos podem significar que
populações bacterianas cultiváveis apresentaram níveis abaixo dos considerados
capazes de detecção por métodos de cultura. (Gomes et al., 1994b; Zambon &
Harastzthy, 1995; Rolph et al., 2001; Gomes et al., 2004; Gomes et al., 2005).
2.3 Método de Nested-PCR em Endodontia
Os métodos moleculares são técnicas alternativas que melhoraram a
identificação de diversas espécies bactérias anteriormente sequer cultivadas.
Geralmente as técnicas moleculares incluem um PCR, e a partir deste são
determinadas suas variações como exemplo a técnica de Nested- PCR. (Shahi et
al., 2018). No entanto, algo comumente encontrado nas diferentes metodologias
empregadas na Endodontia é a identificação bacteriana baseada no gene 16S
rRNA, sendo esta uma região de DNA bacteriano presente em todos os
microrganismos, muito específica e preservada para cada espécie (Gomes &
Herrera, 2018).
26
A aplicação de métodos moleculares conjuntamente a métodos de cultura
possibilitou a melhor compreensão da infecção/microbiota endodôntica, além de
alguns testes moleculares superarem algumas limitações das técnicas de cultura
microbiana (Aw, 2016).
A técnica de Nested-PCR é uma variação bastante sensível e específica do
PCR, que envolve a utilização de dois conjuntos de primers em reações distintas
(Song, 2005; Montagner et al., 2010). A primeira reação de PCR utiliza um conjunto
de primers com objetivo de amplificar o gene 16S rRNA a partir do DNA extraído dos
patógenos das amostras clínicas (Song, 2005). O produto resultante da reação
primária é submetido a uma segunda reação de PCR. Através da utilização de um
primer de uma espécie bacteriana específica, a reação permitirá o anelamento do
DNA a uma sequência compreendida no interior do primeiro amplicon (Singht et a.,
2006).
A técnica de Nested-PCR apresenta benefícios como uma maior
especificidade e sensibilidade quando comparado ao método de PCR tradicional
(Song, 2005). A reação reduz a ligação não específica em produtos devido a
amplificação de sítios de ligação de primers inesperados (Prakash et al., 2005).
Estas vantagens podem ser justificadas devido ao maior número de ciclos aos quais
as amostras são submetidas, como também a restrição de sequências aos às quais
os primers da reação secundária podem se anelar (Siqueira & Rôças, 2005).
Em 2010, Montagner e colaboradores encontraram uma alta incidência de
espécies de Treponema em amostras de canais radiculares sintomáticos e em AAA
associados, por meio da técnica de Nested-PCR. Para este resultado amostras
pareadas dos dois sítios investigados foram coletadas de 20 indivíduos. A detecção
destes microrganismos foi realizada por meio da técnica de Nested-PCR, realizando
o ensaio de PCR aninhada com primers espécie-específicos para o gene 16S rDNA.
Com isso os autores encontraram uma alta incidência de Treponema socranskii (CR,
17/20; AAA, 15/20), Treponema denticola (CR, 8/20; AAA, 11/20); Treponema
medium (CR, 6/20; AAA, 9/20); e Treponema amylovorum (CR, 5/20; AAA, 9/20),
indicando serem importantes patógenos da infecção endodôntica.
27
Lacević et al. (2009) objetivaram avaliar a ocorrência de Tannerella forsythia
em pacientes com infecções endodônticas primárias agudas e crônicas. Por meio de
amostras clínicas coletadas de 40 pacientes, a técnica empregada para detecção
desta espécie bacteriana foi a reação de Nested-PCR, A primeira amplificação foi
utilizada primers universais para detecção da sequência de 16S rDNA, logo, o
produto da primeira reação foi utilizado então para constituir a segunda reação, esta
com um fragmento específico da Tannerella forsythia. Os autores encontraram a
presença da bactéria em 12/27 pacientes crônicos e 5/13 agudos, gerando uma
frequência geral de 42,5% das amostras.
Entre as desvantagens deste método é a possibilidade de contaminação do
local de trabalho com o DNA amplificado durante a manipulação do produto da
primeira reação dificultando a interpretação dos resultados, além de resultados
falsos positivos, dificuldade na falha do desenho de primers (Singh et al., 2006).
2.4 Quantificação dos níveis de Ácido Lipopolissacarídeo (LPS) na
Endodontia
O ácido lipopolissacarídeo (LPS) ou também denominado de endotoxina é
um constituinte da membrana celular externa de exclusivamente das bactérias gram-
negativas. Esta molécula apresenta constituição hidrofóbica com componentes
polissacarídeos, lipídios complexos contendo ácidos graxos e proteínas. Representa
a principal característica antigênica deste grupo bacteriano com ampla repercussão
microbiológica e imunológica (Westphal, 1975; Fabricius, 1982; Rietschel & Brade,
1992).
Estruturalmente a molécula de LPS é constituída por três porções
denominadas de lipídeo A (porção mais interna da molécula), um núcleo externo e o
antígeno O (porção mais externa da molécula). A porção que compreende o lipídeo A
exerce com soberania as atividades endotóxicas do LPS (Jain & Darveau, 2000;
Dixon & Darveau, 2005). A estrutura química do lipídeo A é composta de ácidos
graxos com 15 a 17 átomos de carbono, ligados a duas moléculas de glicosaminas,
nestas, dois radicais fosfatos são ligados e um resíduo proteico permanece unido
28
aos radicais de fosfato. De acordo com estudos anteriores a posição dos radicais de
fosfato parece determinar o potencial inflamatório do LPS. Ainda, é a partir desta
estrutura que o LPS é reconhecido, o lipídeo A é responsável pela ativação de
diferentes vias de sinalização intracelular através do estabelecimento de ligações
adequadas com os receptores (Munson et al., 2002; To et al., 2015; Gomes &
Herrera, 2018). A porção polissacarídica é um potente antígeno responsável pela
estimulação de anticorpos mesmo em concentrações submicrométricas (Elin & Wolff,
1976).
De grande repercussão clínica, a endotoxina estabelece uma rede
importante na reação inflamatória, podendo interagir com células do sistema
imunológico presente nos tecidos periapicais e induzindo a reabsorção óssea neste
ambiente (Hong et al., 2004; Martinho et al., 2012). Além disso, alguns estudos já
demonstraram sua correlação positiva com sinais e sintomas presentes em
pacientes, sendo capaz de incitar a dor por meio da estimulação de liberação de
bradicinina (Farber, 1988) da ativação do fator Hageman, ou também pelas
propriedades neurotóxicas quando atuam sob os terminais nervosos pré-sinápticos.
Possui diversas atividades biológicas como a indução de febre, citotoxicidade,
coagulação sanguínea e fibrinólise (Gomes et al., 2009; Martinho et al., 2010;
Nakamura et al., 2017).
Para a viabilidade de bactérias gram-negativas a estrutura
lipopolissacarídica é essencial. Segundo estudos de Carrof & Karibian (2003) e
Darveau e colaboradores (2004) aproximadamente 75% da estrutura bacteriana é
composta por esta molécula que terá função induzir o crescimento celular, diminuir a
permeabilidade, manter a integridade estrutural e estabilidade da membrana,
consequentemente mantendo a proteção contra danos externos.
A eliminação do LPS durante a terapia endodôntica é necessária para a
determinação de sucesso do tratamento. No entanto, endotoxinas são termicamente
estáveis, ou seja, os processos habituais de esterilização são ineficazes para a sua
destruição. Para degradação química é necessária à utilização de ácidos ou bases
fortes. Especificamente durante a terapia endodôntica estudos parecem demonstrar
que os íons hidroxila presentes na pasta de hidróxido de cálcio podem hidrolisar o
LPS, degradando o lipídio A e neutralizando o efeito residual (Marinho et al., 2018).
29
Em 2008, Martinho e colaboradores realizaram um estudo com objetivo de
quantificar os níveis de endotoxinas no interior de canais radiculares com
periodontite apical. Para isso, 24 pacientes foram selecionados, todos tiveram
amostras coletadas em dois momentos clínicos S1 – antes e S2 – após PQM do
canal radicular com NaOCl 2,5%. Para análise das concentrações de endotoxinas o
ensaio lisado de amebócitos Limulus (LAL) foi utilizado. As amostras iniciais tiveram
a presença de endotoxinas em 100%, com uma concentração média de 139 U/ml.
Níveis mais altos de LPS foram encontrados em pacientes com sintomatologia
clínica (P <0,05). Em S2, significativa redução de endotoxinas foi encontrada, uma
média de 59,99%. Esta descoberta indicou que o hipoclorito de sódio a 2,5% foi
moderadamente eficaz contra endotoxinas do canal radicular, e ainda mostrou uma
associação estatisticamente significante entre os níveis altos de endotoxinas e
sintomatologia clínica.
Com objetivo de avaliar a eficácia de diferentes substâncias, Gomes et al.
(2009) testaram a capacidade do NaOCl 2,5% e da CHX gel 2% na eliminação de
lipopolissacarídeos em dentes com periodontite apical. Cinquenta e quatro pacientes
foram selecionados e alocados em diferentes grupos de acordo com a substância
utilizada na terapia endodôntica: GI – NaOCl 2,5%; GII – CHX 2%. Amostras foram
coletadas do interior do canal radicular antes e após o preparo químico-mecânico. O
ensaio de LAL foi utilizado para determinação da concentração de unidades de
endotoxinas. Em 100% das amostras iniciais investigadas as endotoxinas estiveram
presentes, caracterizando 272 U/ml no GI, e 152,46 no GII apresentando uma
redução final para 86 EU/mL no GI e 85 U/ml no GII. Com isso os autores
concluíram que o NaOCl 2,5% e a CHX 2% não são eficazes na eliminação de
endotoxinas em canais radiculares infectados.
Recentemente, Marinho et al. (2018), investigaram a influência de algumas
substâncias químicas auxiliares e do hidróxido de cálcio [Ca(OH)2] na eliminação de
LPS e lipídio A além de sua capacidade funcional na ativação do receptor TLR4.
Fusobacterium nucleatum foram expostas a agentes antimicrobianos da seguinte
maneira: substância química auxiliar: NaOCl 5,25%, 2,5% e 1%, CHX 2% em gel e
solução, e 17% de ácido etilenodiaminotetracético (EDTA); MIC: pasta de Ca(OH)2
por diferentes períodos de tempo (1h, 24h, 14 dias e 30 dias); combinação de
substâncias: NaOCl 2,5% durante 1h seguido de EDTA (3 min) e Ca(OH)2 por 7
30
dias, CHX 2% durante 1h seguido de EDTA (3 min) e Ca(OH)2 por 7 dias, e solução
salina como controle negativo. As amostras coletadas foram submetidas ao
isolamento de LPS e purificação de lipídios A. A mensuração de lipídio A foi avaliada
por meio de espectrofotometria de massa de tempo por ionização a laser assistida
por matriz, enquanto as bandas de LPS por separação e coloração de prata. A
ativação do receptor Toll-Like 4 (TLR4) determinou as atividades da função do LPS.
Com isso os autores puderam concluir que a solução de NaOCl A 5,25% e Ca(OH)2
a partir das 24h foram capazes de induzir a perda de lipídios A como também a
ausência de detecção de bandas de LPS, diminuindo a atividade imunoestimuladora
através do TLR4.
2.5 Quantificação dos níveis de Ácido Lipoteicoico (LTA) na Endodontia
O ácido lipoteicoico (LTA) é um fator de virulência que compõem a parede
celular de bactérias gram-positivas. Sua presença em infecções endodônticas
mesmo em baixas concentrações, é capaz de estimular a resposta inata do sistema
de defesa do hospedeiro (Wang et al., 1997). Estruturalmente o LTA é anfifílico
formado pela ligação de 1,3-poliglicerofosfatos e ácidos graxos (Wicken & Knox,
1975).
O LTA está associado à capacidade de cepas bacterianas gram-positivas
manifestarem resistência a medicamentos utilizados durante a terapia endodôntica.
Também desempenha importante condição na colonização bacteriana, viabilizando a
formação de biofilmes estruturados e consequentemente propiciando a resistência
bacteriana a antibióticos ou desinfetantes. Por meio de porção lipídica presente no
LTA é possível despontar uma ligação da molécula à hidroxiapatita provendo
atividade absortiva a esta estrutura. Os mediadores inflamatórios podem ser
liberados decorrentes do estimulo originado do LTA em leucócitos, monócitos e
macrófagos. (Ciardi et al., 1977; Signoretto et al., 2000; Ginsburg, 2002; Zhao et al.,
2014).
Baik e colaboradores em 2008 conduziram um experimento objetivando
avaliar a capacidade do hidróxido de cálcio na inativação do LTA presente no
31
Enterococcus faecalis resultando na perda ou diminuição das respostas
inflamatórias. Mediante ensaio imunoenzimático o experimento demonstrou que o
uso hidróxido de cálcio na eliminação de Enterococcus faecalis foi mais efetivo
quando comparado a quantidade de bactérias eliminadas por meio da liberação do
fator de necrose tumoral (TNF- α) por meio de uma linhagem de macrófagos. O pré-
tratamento com hidróxido de cálcio revogou a capacidade do LTA induzir a liberação
do TNF-α. Além disso, o LTA não foi capaz de estimular o recepetor Toll-Like 2
(TRL2). Desta maneira os resultados obtidos com este estudo sugerem que o
hidróxido de cálcio é capaz de remover o efeito residual de Enterococcus faecalis
resultando na atenuação das respostas inflamatórias.
Hong et al. (2016) avaliaram a capacidade do NaOCl atenuar a resposta
inflamatória do LTA do fator de virulência de Enterococcus faecalis (EfLTA). Assim o
EfLTA foi tratado com NaOCl em diversas concentrações e períodos de tempo. A
linhagem celular de macrófagos RAW 264.7 foi tratada com interferon gama seguido
de tratamento com EfLTA intacto ou então tratado com NaOCl a fim de verificar a
indutibilidade de mediadores inflamatórios tais como: óxido nítrico, proteína induzida
por interferão e proteína inflamatória sintetizada por macrófagos. Os resultados
demonstraram que o EfLTA tratado com NaOCl teve menor indução de óxido nítrico,
e proteínas induzidas por interferon e macrófagos em comparação com o EfLTA
intacto. Concluindo que o NaOCl modifica a porção glicolipídica do EfLTA levando à
produção reduzida de mediadores inflamatórios.
Barbosa-Ribeiro et al. (2016) conduziram um ensaio clínico com objetivo de
quantificar os níveis de LTA nas diferentes fases do retratamento endodôntico em
dentes com periodontite apical pós-tratamento. Vinte canais radiculares infectados
foram divididos em grupos distintos de acordo com a substância química auxiliar
utilizada na terapia sendo: GI – CHX gel 2%, e GII – NaOCl 6%. As amostras dos
canais radiculares foram coletadas em diferentes momentos sendo antes (S1) e
após (S2) o PQM e após 30 dias de MIC com Ca(OH)2 e CHX 2%. Os níveis de LTA
foram mensurados por meio de ensaio imunoenzimático. O LTA esteve presente em
todas as amostras iniciais (574,0 ± 94,7). Logo a redução de LTA após preparo
químico-mecânico foi de 24,8%, enquanto (P <0,05), enquanto o nível de redução
após o período de MIC foi de 38,6% (P <0,05). O PQM com CHX 2% gel foi mais
efetivo (P <0,05) na redução de LTA (26,9%) do que comparado ao grupo tratado
32
com NaOCl 6% (22,6%). Além disso, a MIC mostrou uma redução de 43,2% no
grupo CHX e 36,2% no grupo NaOCl (P> 0,05). Portanto é evidente a necessidade
de mais estudos para investigar os níveis residuais de LTA aceitáveis em canais
radiculares infectados.
33
3 PROPOSIÇÃO
Diante disto, os objetivos desta pesquisa foram:
3.1 Objetivo Geral
Investigar a presença de microrganismos específicos e avaliar os níveis
de LPS e LTA nos canais radiculares de dentes necrosados sintomáticos com
abscesso associado a tais canais e nos canais radiculares de dentes necrosados
assintomáticos durante as etapas do tratamento endodôntico.
3.2 Objetivos Específicos
1. Correlacionar achados microbiológicos e fatores de virulência
bacteriana com sinais e sintomas clínicos, nos casos sintomáticos e assintomáticos
2. Avaliar o efeito do preparo químico-mecânico e da medicação
intracanal na redução da carga microbiana e dos níveis de LPS e LTA.
3. Determinar correlações positivas e negativas entre as bactérias
detectadas pela técnica de Nested-PCR.
34
4 MATERIAL E MÉTODOS
Alguns métodos utilizados neste estudo foram descritos previamente por
(Gomes et al.,1994a, 1994b, 1996b, 2004, 2011, 2015; Martinho & Gomes 2008;
Montagner et al., 2012; Sousa et al., 2013, 2014).
4.1 Autorização para Realização da Pesquisa
Este trabalho foi submetido e aprovado pelo Comitê de Ética em Pesquisa
da Faculdade de Odontologia de Piracicaba (FOP/UNICAMP) – Anexo I seguindo os
padrões estabelecidos pela Resolução 466/12 do Conselho Nacional de Saúde.
Para a participação deste estudo, todos os pacientes assinaram um termo de
consentimento livre e esclarecido (TCLE) conforme as normas vigentes no referido
Comitê de Ética em Pesquisa envolvendo seres humanos – Apêndice I.
4.2 Seleção dos Participantes da Pesquisa
Foram selecionados pacientes com necessidade de intervenção endodôntica
devido a presença de necrose do tecido pulpar e presença de lesão periapical que
não apresentavam sintomatologia dolorosa espontânea (n=10) e pacientes com
sintomatologia dolorosa e presença de abscesso apical agudo associado (n=10)
totalizando 20 pacientes.
4.3 Grupos Experimentais
GI: Necrose pulpar com sintomatologia dolorosa e abscesso apical
agudo associado (n=10).
35
Ausência de resposta aos testes de sensibilidade pulpar (teste térmico ao
frio). Dor espontânea no momento do atendimento e dor à palpação e percussão
além da presença de edema e ponto de flutuação.
GII: necrose pulpar e lesão periapical sem sintomatologia espontânea
(n=10).
Ausência de resposta aos testes de sensibilidade pulpar (teste térmico ao
frio). Os dentes apresentavam evidência radiográfica de lesão periapical.
4.4 Critérios de Inclusão, Exclusão e Aspectos Clínicos e Radiográficos
Critérios de inclusão: dentes necrosados, com sintomatologia dolorosa e
abscesso apical agudo associado e dentes necrosados, assintomáticos com necrose
pulpar e lesão periapical visível radiograficamente.
Critérios de exclusão: pacientes com antibioticoterapia prévia nos últimos
três meses, canais expostos a cavidade oral, casos em que o isolamento absoluto
não foi possível de ser instalado, casos com doença periodontal avançada,
pacientes jovens com histórico de traumatismos dentais, dentes com rizogênese
incompleta, dentes com a presença de curativos de demora na câmara pulpar e de
tratamentos endodônticos anteriores.
Aspectos clínicos e radiográficos: para cada paciente foram anotados:
idade, sexo, estado pulpar, profundidade da bolsa periodontal, mobilidade dental,
presença de edema dos tecidos periodontais, história de medicação e os achados
radiográficos. Foram anotados os aspectos físicos do canal durante a coleta da
amostra, tais como canal seco, presença de exsudado purulento e/ou hemorrágico.
Os aspectos clínicos do dente envolvido, tais como presenças ou não de cáries e
restaurações também foram avaliadas.
36
4.5 Procedimentos Endodônticos
O atendimento aos pacientes foi realizado na Clínica de Pós-Graduação da
FOP-UNICAMP.
4.5.1 Coleta das Amostras
Foram coletadas amostras iniciais dos canais radiculares assim como do
exsudato periapical associado, aos casos de abscessos periapicais, amostras dos
canais radiculares após preparo químico-mecânico, e após medicação intracanal.
Todos os procedimentos de coleta das amostras foram realizados por apenas um
operador.
4.5.2 Coleta dos Abscessos
Inicialmente foi realizada anestesia local por bloqueio regional e desinfecção
da mucosa oral adjacente ao dente com digluconato de clorexidina 2% e
neutralização da região com uma solução de tween 80 + lecitina de soja. Após, o
exsudato do abscesso apical foi coletado através de aspiração utilizando uma
seringa estéril. A punção foi realizada no momento que precede a execução do
tratamento do abscesso, que constitui na realização de uma incisão com lâmina de
bisturi, divulsão dos tecidos e ordenha manual da coleção purulenta.
Em um criotubo estéril e apirogênico a secreção purulenta foi depositada.
Um cone de papel estéril e apirogênico foi imerso na secreção durante 60 segundos
e posteriormente transferido para um tubo de ensaio estéril e apirogênico para
posterior análises (LTA/LPS). Uma alíquota de 100 µL do exsudato foi transferida
para um microtubo estéril contendo 1,0 mL de Tris Buffer para posterior
37
processamento molecular, outra alíquota de 100 µL para um microtubo previamente
esterilizado, contendo 1,0 mL do meio de transporte pré-reduzido VMGA III (cultura).
4.5.3 Coleta dos Canais Radiculares
Inicialmente o dente envolvido recebeu polimento coronário com pedra-
pomes e isolado com lençol de borracha (isolamento absoluto). A seguir, foi
realizado o vedamento da interface coroa/lençol com cianocrilato (Super Bonder;
Loctite, São Paulo, SP, Brasil) e TopDam (FGM, Joinville, SC, Brasil), para evitar
infiltração de saliva. A antissepsia do campo operatório (superfície externa da
coroa, grampo, lençol de borracha e arco) foi realizada com swabs estéreis
umedecidos primeiramente em H2O2 a 30% e depois em NaOCl 5,25% por 30
segundos cada, subsequentemente neutralizado com solução estéril de tiossulfato
de sódio a 5% (Möller, 1966).
A fase de acesso coronário foi realizada em duas etapas operatórias. A água
proveniente do equipo é cessada, sendo a irrigação realizada manualmente com
solução salina estéril. Foram utilizadas brocas de alta rotação diamantadas estéreis.
Na primeira etapa operatória foi realizada a remoção dos contaminantes coronários
(restaurações, tecido cariado). Na segunda etapa, na fase de confecção da cavidade
de acesso, uma nova broca estéril foi utilizada. Após a confecção da cavidade de
acesso, uma nova desinfecção do campo operatório foi realizada. Prosseguindo,
com o completo acesso ao canal radicular com uma nova broca esférica diamantada
estéril.
Para coleta de fatores de virulência como LTA e LPS foi introduzido um cone
de papel estéril e apirogênico no interior dos canais radiculares. Após 60 segundos,
o cone foi armazenado em tubos de ensaio estéreis e apirogênicos para ensaios
imunoenzimáticos.
Para a coleta microbiológica, cinco cones de papel absorvente, um de cada
vez, foram introduzidos no interior dos canais, permanecendo 60 segundos cada.
Três destes cones foram transferidos para tubos do tipo eppendorfs previamente
38
esterilizados, contendo 1,0 mL do meio de transporte pré-reduzido VMGA III (cultura)
e dois foram transferidos para um tubo contendo 300 µL de Tris Buffer, o qual foi
congelado em freezer -20°C para análise molecular, como descrito por Gomes et al.
2011. Quando o canal se encontrava seco, o mesmo era inundado com água
destilada estéril para prosseguimento das coletas.
4.5.4 Primeira Sessão e Coletas Iniciais
Uma vez realizada a coleta inicial como descrito anteriormente, o preparo da
entrada dos canais foi complementado com a realização dos desgastes
compensatórios, utilizando a broca diamantada #3082. Foi realizada a exploração do
canal com lima K#10 antes da instrumentação com limas de NiTi do sistema
Reciproc (VDW, Munich, Alemanha). A instrumentação foi realizada seguindo a
sequência recomendada inicialmente com a Lima R25. Nos casos de canais mais
amplos foram utilizadas as outras limas do sistema (R40 ou R50). A introdução do
instrumento foi feita por terços (coronário, médio e apical) até atingir o comprimento
real de trabalho, com movimentos leves, inserindo e removendo a lima do canal
radicular, evitando sempre qualquer força no sentido apical. Durante o PQM, e a
cada 3 movimentos de entrada e saída (picking motion), os canais foram
preenchidos com clorexidina gel 2% (Endogel, Itapetininga, SP, Brasil). A irrigação foi
realizada com 5 mL de água destilada estéril e apirogênica a cada avanço de 3 mm.
4.5.5 Coleta Intermediária após Preparo Químico-Mecânico
Após a finalização do preparo químico mecânico, os canais foram irrigados
com 5 mL de água destilada estéril e apirogênica e 5 mL de solução tween 80 +
lecitina de soja a, (neutralizante específico da clorexidina) por 60 segundos, e então
uma nova coleta de endotoxina e microbiológica foi realizada seguindo os mesmos
critérios descritos nos tópicos anteriores. Após o término das coletas, os canais
foram preenchidos com medicação intracanal composta por hidróxido de cálcio e
39
clorexidina 2% gel. Posteriormente as cavidades de acesso foram restauradas
com resina composta.
4.5.6 Segunda Sessão e Coleta Final
Após 30 dias da instrumentação inicial, a medicação intracanal foi removida
utilizando água destilada estéril apirogênica e novas coletas foram realizadas. A
seguir, os dentes foram re-instrumentados, secos e obturados. Na embocadura
do canal radicular foi colocado um plug de aproximadamente 2 mm de Coltosol
(Coltene Holding, Altstätten, Suíça), e os dentes restaurados com resina composta.
4.6 Procedimentos Laboratoriais
4.6.1 Cultura Microbiana
No interior da cabine de anaerobiose, logo após procedimento de coleta, os
microtubos contendo VMGA III e o material coletado foram agitados durante 60
segundos no agitador (MA 162 – Marconi, São Paulo, Brasil) para facilitar a
dispersão dos microrganismos. Após, foram realizadas diluições seriadas a 1/10,
1/100, 1/1000, 1/10000, 1/100000 utilizando Fastidious Anaerobe Broth – FAB (Lab
M, Bury, Inglaterra). Alíquotas de 50 µL da amostra não diluída e de cada diluiçao
foram plaqueadas em placas pré-produzidas contendo Fastidious Anaerobe Agar –
FAA (Lab M, Bury, Inglaterra) acrescidas de 5% de sangue de carneiro desfibrinado
+ hemina (1mg/L) (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, EUA) + menadiona (1mg/L)
(Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, EUA) eposteriormente incubadas em câmara de
anaerobiose a 37°C numa atmosfera de 10% H2, 10% CO2 e 80% N2 até 14 dias
para permitir a detecção de microrganismos de crescimento lento.
Após o período de incubação, cada placa foi examinada em lupa
estereoscópica (Lambda Let 2, Atto, Instruments, CO, Hong Kong) em aumento de 3
40
vezes. As unidades formadoras de colônias (UFC/mL) foram contadas. Para a
obtenção do número de UFCs presentes na amostra por mL (amostra inicial) foi
necessário multiplicar por 200.000 ou 20.000.000 o número de UFCs observadas na
contagem das placas, dependendo da diluição realizada. A escolha da placa para
contagem de UFCs estava relacionada à possibilidade de contar de forma individual
o número de UFCs presentes, geralmente visualizado nas diluições 10-4 ou 10-6. Ou
seja, quando a diluição 10-4 foi escolhida, o valor correspondente a essa diluição é
10.000 vezes menor que o inicial (1,0 mL). A alíquota plaqueada foi de 50 μL, ou
seja, 20 vezes menor que 1,0 mL. Portanto o fator de multiplicação do número de
UFCs obtido seria 200.000. Entretanto, quando a diluição 10-6 foi escolhida, o valor
correspondente a essa diluição é 1.000.000 vezes menor que o inicial (1,0 mL). A
alíquota plaqueada foi de 50 μL, ou seja, 20 vezes menor que 1,0 mL. Portanto o
fator de multiplicação do número de UFCs obtido seria 20.000.000.
4.6.2 Extração de DNA
Para a execução da técnica de Nested-PCR foi necessária a extração do
DNA microbiano contido nas amostras coletadas dos canais radiculares e abscessos
periapicais.
Empregou-se o conjunto para extração de DNA de amostras contendo
microrganismos e tecidos QIAamp DNA Micro Kit (QIAGEN, Valencia, Califórnia,
EUA) de acordo com as recomendações do fabricante. Previamente 300 µL das
amostras contidas nos microtubos com solução de Tris Buffer foram alocados em um
novo microtubo. Estes foram centrifugados a 8000 rpm durante 5 minutos. Logo o
sobrenadante foi removido permanecendo as células bacterianas.
De acordo com instruções do fabricante, em cada amostra, foram
adicionados 180 µL do tampão ATL e 20 µL da solução de Proteinase K. Em seguida
os tubos foram agitados por 1 minuto e incubados em banho de água a 56°C, por 30
minutos. Adicionou-se então 200 µL do tampão AL, procedeu-se nova agitação por 1
minuto e os tubos foram expostos à temperatura de 70°C por 10 minutos em banho
de água.
41
Para a remoção de impurezas e constituintes lipídicos, adicionou-se 200 µL
de etanol. Todo o conteúdo do tubo foi transferido para as colunas de purificação
contendo microfiltro de sílica, fornecidas pelo fabricante. As colunas foram
centrifugadas a 8000 rpm em ultracentrífugas por 1 minuto. O conteúdo líquido no
tubo de coleta da parte inferior da coluna foi removido. Este conteúdo correspondia a
debris celulares microbianos e componentes do meio de transporte VMGA III. O DNA
microbiano permaneceu aderido ao filtro de sílica para lavagens adicionais com
tampões. Adicionou-se 500 µL da solução de lavagem AW1, e executou-se
centrifugação a 8000 rpm, por 1 minuto. O tampão de lavagem AW2 foi adicionado à
parte superior do filtro e o mesmo foi novamente centrifugado (13000 rpm, 3
minutos). A eluição do DNA do microfiltro foi obtida através da adição de 100 µL do
tampão AE, que foi mantido em contato com o mesmo por 3 minutos, antes da
centrifugação final a 8000 rpm, por 1 minuto, quando se obteve o DNA microbiano
purificado.
Após extração, as leituras das concentrações de DNA presentes nas
amostras coletadas dos canais radiculares e abscessos foram realizadas a 260 nm
através de espectrofotometria (Nanodrop 2000; Thermo Scientific, Wilmington, DE,
EUA).
4.6.3 Técnica de Nested-PCR
A técnica de Nested-PCR foi empregada para a detecção das espécies
Actinomyces naeslundii, Agregatibacter actinomycetemcomitans, Dialister
pneumosintes, Enterococcus faecalis, Filifactor alocis, Fusobacterium nucleatum,
Gemella morbilorum, Parvimonas micra, Porphyromonas endodontalis,
Porphyromonas gingivalis, Prevotella intermedia, Prevotella nigrescens, Prevotella
tannerae, Streptococcus sobrinus e Tannerela forsythia, nas amostras provenientes
de canais radiculares e abscessos periapicais de acordo com o descrito por
Berber (2009). As condições da reação de PCR bem como a sequências de
nucleotídeos empregadas nas reações de amplificação foram descritas previamente
por Willis et al. (1999).
42
A primeira reação empregou o primer universal direcionado à amplificação
do gene 16S rRNA em sua totalidade, sendo inespecífico para uma determinada
espécie bacteriana. As reações de PCR serão processadas na quantidade total de
50 μL para cada amostra contendo 5 μL de tampão para reação de PCR (10x
Reaction Buffer, Invitrogen, São Paulo, São Paulo, Brasil); 5μL de uma mistura de
deoxiribonucleotídeos fosfatados (2mM) (dNTPs, Invitrogen, São Paulo, São Paulo,
Brasil); 6 μL de solução de cloreto de magnésio (25 mM) (MgCl2, Invitrogen, São
Paulo, São Paulo, Brasil); 1,25 μL de uma solução 100 μM de Primer Forward - 785
(20 mM) (Invitrogen, São Paulo, São Paulo, Brasil); 1,25 μL de uma solução 100 μM
de Primer Reverse – L422 (20 mM) (Invitrogen, São Paulo, São Paulo, Brasil); 29,3
μL de água ultrapura livre de DNAase e RNAase; 0,25 μL da enzima Taq DNA
Polimerase (Taq Platinum, Invitrogen, São Paulo, São Paulo, Brasil) e 2 μL de DNA
extraído da amostra coletada do canal radicular.
Logo para a segunda reação as mesmas foram processadas na quantidade
total de 25 μL para cada amostra empregou-se 1,5 µL do produto da reação anterior
e os primers específicos para cada espécie, que continham sequências de
nucleotídeos presentes no fragmento anteriormente amplificado. Para ambas as
etapas, o volume total da reação foi de 25 µL contendo 2,5 µL de tampão para
reação de PCR (10x Reaction Buffer, (Invitrogen, São Paulo, São Paulo, Brasil); 0,5
µL de uma mistura de desoxiribonucleotídeos fosfatados (dNTPs, (Invitrogen, São
Paulo, São Paulo, Brasil); 1,25 µL de solução de cloreto de magnésio (MgCl2
(Invitrogen, São Paulo, São Paulo, Brasil); 0,75 µL de uma solução 100 µM de
Primer Forward (Invitrogen, São Paulo, São Paulo, Brasil); 0,75 µL de uma solução
100 µM de Primer Reverse (Invitrogen, São Paulo, São Paulo, Brasil); 17,625 µL de
água ultrapura livre de DNAase e RNAase; 0,125 µL da enzima Taq DNA
Polimerase (Taq Platinum, Invitrogen, São Paulo, São Paulo, Brasil) e 1µL da
amostra clínica (produto da primeira reação).
As temperaturas e os tempos empregados na reação de PCR foram:
desnaturação inicial (97°C, 1 minuto); 26 ciclos, compreendendo a etapas de
desnaturação (97°C, 45 segundos), anelamento (temperatura específica para cada
conjunto de primer) e alongamento (72°C, 1 minuto); e, extensão final (72°C, 4
minutos).
43
A Tabela 1 demonstra a sequência dos primers utilizados, as temperaturas
de anelamento, e o comprimento do fragmento gerado após a reação de Nested-
PCR.
Amplicons resultantes do PCR foram analisados em gel eletroforético de
agarose 1% (Invitrogen, São Paulo, São Paulo, Brasil) em tampão Tris-Borato EDTA
(pH 8,0). Para isso, uma solução de EZ-vision (Invitrogen, São Paulo, São Paulo,
Brasil) e Loading Buffer (Invitrogen, São Paulo, São Paulo, Brasil) foi preparada e
na proporção 7:3 respectivamente e diluída individualmente com cada produto
resultante da segunda reação do Nested-PCR. Logo, em cada gel foi incluso um
padrão de peso molecular de 100 bp - DNA Ladder (Invitrogen, São Paulo, São
Paulo, Brasil). Após o término de cada corrida (100 volts durante 60 minutos) as
bandas foram observadas por meio do transiluminador de luz ultravioleta
identificando como positiva ou negativa a presença de determinada bactéria.
44
Tabela 1 - Microrganismos investigados através da técnica de Nested-PCR, suas sequências de nucleotídeos, fragmento para detecção
e temperatura de anelamento.
Microrganismos Sequências Fragmento (bp) Anelamento (°C)
Universal 16S ribosomal DNA AGA GTT TGA TCC TGG CTC AG ACG GCT ACC TTG TTA CGA CTT
1505 55
Actinomyces naeslundii CTG CTG CTG ACA TCG CC GCT CG TA TCC GCT CGC GCC ACC TCT CGT TA
144 62
Agregatibacter actinomycetemcomitans
GAA CCTTAC CTACTCTTG ACA TCC GAA TGC AGC ACC TGT CTC AAA GC
600 55
Dialister pneumosintes TTC TAA GCA TCG CAT GGT GC GAT TTCGCT TCT CTT TGT TG
590 55
Enterococcus faecalis GTT TAT GCC GCA TGG CAT AAG AG
CCG TCA GGG GAC GTT CAG 310 60
Filifactor alocis AAA CCC ATC TCT GAG TTC TTC TTC
ATG CCA ACT TGA CGT TAA AT 594 60
Fusobacterium nucleatum ATT GTG GCT AAA AAT TAT AGT T ACC CTC ACT TTG AGG ATT ATA G
1000 55
Gemella morbilorum CGAGAGTCAGCCAACCTCATA
CCTTATGAAGCACTGAGTGTATTC 192 55
Parvimonas micra AGA GTT TGA ATC CTG CAG
ATA TCA TGC GAT TCT GTG GTC TC 207 60
45
*** Sundqvist et al., 1998; Doan et al., 2000; Eguchi et al., 2003; Montagner et al., 2010; 2012; Gomes et al., 2013; Ambrosio et al.,
2018.
Tabela 1 - Microrganismos investigados através da técnica de Nested-PCR, suas sequências de nucleotídeos, fragmento para detecção
e temperatura de anelamento.
Microrganismos Sequências Fragmento (bp) Anelamento (ºC)
Porphyromonas endodontalis GCT GCA GCT CAA CTG TAG TC CCG CTT CAT GTC ACC ATG TC
672 58
Porphyromonas gingivalis AGG CAG CTT GCC TAG AGT CGG ACT GTT AGC AAC TAC CGA TGT
404 58
Prevotella intermedia TTT GTT GGG GAG TAA AGC GGG TCA ACA TCT CTG TAT CCT GCG T
575 58
Prevotella nigrescens ATG AAA CAA AGG TTT TCC GGT AAG CCC ACG TCT CTG TGG GCT GCG A
804 58
Prevotella tannerae CTT AGC TTG CTA AGT ATG CCG
CAG CTG ACT TAT ACT CCC G 550 55
Streptococcus sobrinus GATGATTTGGCTCAGGATCAATCCTC
ACTGAGCCAGTAGTAGACTTGGCAACT 328 60
Tannerela forsythia TGC TTC AGT AGT TAT ACC T
TGC TTC AGT GTC AGT TAT ACC T 641 56
Treponema denticola TAA TAC CGA ATG TGC TCA TTT ACA T
TCA AAG AAG CAT TCC CTC TTC TTC TTA 316 60
Treponema socranskii GAT CAC TGT ATA CGG AAG GTA GAC A
TAC ACT TAT TCC TCG GAC AG 288 56
46
4.6.4 Teste Limulus Amebocyte Lysate (LAL) Pyrogent-5000 para
Quantificação dos níveis de Ácido Lipopolissacarídeo
Para a realização do teste LAL Pyrogent-5000 (Lonza, Walkersville, MD,
EUA), todos os materiais foram apirogenizados, seguindo o protocolo de calor seco
(estufa) a 250°C por um período de 30 minutos. Outros materiais já se apresentaram
apirogênicos e esterilizados oriundos de fábrica (Lonza, Walkersville, MD, EUA).
Pyrogent-5000 é um ensaio cinético quantitativo para detecção de
endotoxina de bactéria gram-negativa. Esse teste utilizou uma preparação de Lisado
do Amebócito Limulus (LAL), em combinação com um incubador fotométrico e um
software apropriado, para detecção fotométrica da endotoxina. Uma amostra é
misturada com o reagente LAL reconstituído, colocada em um fotômetro e
monitorada automaticamente até o desenvolvimento de uma aparência de turvação
(densidade ótica). O tempo necessário antes da aparição da turvação (tempo de
reação) é inversamente proporcional à quantidade de endotoxina presente. A
concentração de endotoxina em amostras desconhecidas pode ser calculada a partir
de uma curva-padrão.
Para o cálculo da concentração de endotoxina em amostras desconhecidas
foi estabelecida uma curva-padrão com quantidades conhecidas de endotoxina
(Escherichia coli). Esta foi preparada utilizando soluções com concentrações 0,01
EU/mL, 0,10 EU/mL, 1 EU/mL, 10 EU/mL, 100 EU/mL como descrito na Tabela 2.
47
Tabela 2. Diluição da solução de endotoxina de Escherichia coli para a determinação
da curva padrão.
Tubos
apirogênicos
Concentração
de endotoxina
(EU/mL)
Volume de
água reagente
LAL
Volume de solução de
endotoxina adicionado à
água apirogênica
1 10 0,9 mL 0,1 mL de 100 EU/mL
solução
2 1 0,9 mL 0,1 mL de 10 EU/mL solução
3 0,10 0,9 mL 0,1 mL de 1 EU/mL solução
4 0,01 0,9 mL 0,1 mL de 0,10 EU/mL
solução
Os valores da absorbância das soluções de endotoxina previamente
preparadas foram espectrofotometricamente medidos a 340 nm no leitor Biotek (ELX
808, Winooski, VT, EUA). A absorbância a 340 nm foi linear com os intervalos de
concentração usados. A linearidade da curva padrão dentro do intervalo de
concentração foi usada para determinar os valores de endotoxina. A
reprodutibilidade pode ser verificada pela comparação das diferentes curvas.
Foi impresso um esboço com o posicionamento da água apirogênica, da
curva padrão, das amostras e do controle positivo do produto (PPC) na microplaca
de 96 poços (Corning Costar Corporation, Cambridge, MA, EUA). Em seguida, foi
dispensado cuidadosamente no interior dos poços da microplaca: 100 µL das
amostras e 100 µL dos controles positivos das mesmas, ambas em duplicata. Nas
amostras controles foram dispensados 10 µL da endotoxina na concentração de 10
EU/mL, evitando formação de bolha. Após o preenchimento das amostras e dos
respectivos controles previamente contaminados com Escherichia coli, foi
dispensado cuidadosamente no interior dos poços da microplaca: 100 µL de água
apirogênica (branco), padrões de endotoxina (100 µL da concentração de 0,01
EU/mL; 0,1 EU/mL; 1 EU/mL; 10 EU/mL e 100 EU/mL). A placa foi pré-incubada por
48
≥ 10 minutos a 37°C+1 °C, no leitor Biotek. Próximo ao final do período de pré-
incubação, cada frasco de reagente Pyrogent-5000 foi reconstituído com 5,2 mL de
tampão de reconstituição Pyrogent-5000. Após isso, foi dispensado rapidamente 100
µL do reagente reconstituído de Pyrogent-5000 dentro de todos os poços da
microplaca, iniciando pela primeira coluna (A1-H1) e procedendo em sequência até a
última coluna utilizada. Com a tampa da microplaca removida foi iniciada a leitura.
Para realizar o calculo das quantidades de endotoxinas o leitor de
microplacas foi monitorado na absorbância de 340 nm de cada poço da microplaca.
Usando a leitura de absorbância inicial de cada orifício como seu próprio branco, o
leitor determinou o tempo necessário para que a absorbância aumente a 0,03
unidades. Este tempo é denominado tempo de reação. O software WinKQCL (Lonza,
Walkersville, MD, EUA) executou automaticamente uma correlação linear log/log do
tempo de reação de cada padrão com a concentração de endotoxina
correspondente. Os parâmetros da curva padrão foram impressos no relatório. Se
amostras apresentassem um valor absoluto do coeficiente de correlação (r) for
0,980, um modelo polinomial pode ser usado para construir uma curva padrão e,
assim, predizer as concentrações de endotoxina das amostras de teste.
4.6.5 Enzyme-Linked Immunosorbent Assay (ELISA) para Quantificação dos
Níveis de Ácido Lipoteicoico
Para a quantificação do ácido lipoteicóico (LTA) nas coletas do interior do
canal radicular e abscessos foi utilizado o ensaio Enzyme-Linked Immunosorbent
Assay (ELISA). As amostras foram individualmente diluídas em 600 µl de solução
tampão (PBS - phosphate buffered saline) contendo 0,1% de solução Tween 20 e 1
µL de coquetel de inibidores de protease (Sigma-Aldrich Inc., St. Louis, MO, USA).
Os tubos foram agitados por 30 minutos e centrifugados a 10000 rpm por 5 minutos.
Kit laboratorial específico foi utilizado para quantificação de LTA. Todos os reagentes
foram levados à temperatura ambiente e a solução diluente foi adicionada em cada
poço contendo o anticorpo monoclonal específico contra o biomarcador de LTA a ser
quantificado. Os padrões e amostras foram adicionados aos poços, permitindo a
49
ligação do LTA ao anticorpo imobilizado. Após um período de incubação especifico
(2 horas) os poços foram lavados com solução tampão e um segundo anticorpo
policlonal específico e conjugado a fosfatase alcalina foi adicionado. As placas foram
novamente incubadas (1 hora) e lavadas. Foi adicionado em todos os poços o
substrato (NADPH), que inicia a reação colorimétrica catalisada pela fosfatase
alcalina, seguido de incubação e adição da solução amplificadora da reação
colorimétrica. Após novo período de incubação (15 minutos), a solução de parada foi
adicionada. O desenvolvimento e a intensidade da cor foram quantificados utilizando
um leitor de placas para ELISA de acordo com a curva padrão preparada com os
padrões fornecidos no kit pelo fabricante.
4.7 Análise Estatística
A comparação entre os grupos quanto a idade foi realizada pelo teste t de
Student e quanto às características, sinais e sintomas clínicos pelo teste Exato de
Fisher.
Após análise exploratória os dados de UFC, LTA e LPS foram analisados
pelos testes não paramétricos de Friedman para a comparação entre os locais e
momentos das coletas, e de Mann Whitney para as comparações entre o grupo
sintomático e assintomático.
Para correlacionar os resultados de UFC, LTA e LPS o teste de Spearman foi
aplicado entre os dados obtidos.
Os resultados de Nested-PCR foram analisados pelo teste Exato de Fisher
para os grupos e McNemar para os locais e momentos das coletas.
Todas as análises foram realizadas no programa R Core Team – 2018 (R
Foundation for Statistical Computing, Vienna, Áustria) com nível de significância de
5%.
50
5 RESULTADOS
5.1 Sinais e Sintomas Clínicos Apresentados pelos Pacientes dos Grupos
Sintomáticos e Assintomáticos
As características clínicas dos pacientes com necessidade de intervenção
endodôntica de dentes associados ao abscesso apical agudo (casos sintomáticos) e
dentes associados a lesão periapical visível radiograficamente (casos
assintomáticos) que participaram do estudo estão apresentados na Tabela 3.
Os pacientes do grupo assintomático não relataram sintomatologia dolorosa
(10/10). Ao teste de sensibilidade térmica e palpação nenhum dos pacientes relatou
sensibilidade (0/10). Ao teste de percussão vertical, dois pacientes relataram
desconforto (0/10). Os dentes apresentavam-se cariados (1/10) ou restaurados
(9/10). Dez canais radiculares apresentavam presença de exsudato em seu interior
(10/10), nenhum caso apresentou presença de secreção purulenta (0/10) ou sangue
(0/10).
Os pacientes do grupo sintomático relataram presença de sintomatologia
dolorosa (10/10). Ao teste de sensibilidade térmica ao frio nenhum dos pacientes
relatou sensibilidade no dente em questão. Ao teste de percussão todos pacientes
relataram desconforto (10/10). Ao teste de palpação nove pacientes relataram
desconforto na região periapical (9/10). Os dentes apresentavam-se cariados (5/10),
restaurados (4/10) ou com prótese (1/10). Um canal radicular apresentou exsudato
em seu interior (1/10), seis canais apresentaram secreção purulenta (6/10) e três
com secreção purulenta e sangue (3/10).
51
Tabela 3. Idade, dente avaliado, sinais e sintomas clínicos dos pacientes sintomáticos e assintomáticos.
Variável Grupo
p-valor Sintomático Assintomático
Idade Média (desvio padrão) Média (desvio padrão)
37,00 (13,95) 42,80 (12,65) 0,3430
Frequência (%) Frequência (%)
ASA I Não 0 (0,0%) 0 (0,0%)
- Sim 10 (100,0%) 10 (100,0%)
Dente
11 1 (10,0%) 0 (0,0%)
0,2863
12 2 (20,0%) 2 (20,0%)
16 1 (10,0%) 0 (0,0%)
21 0 (0,0%) 1 (10,0%)
22 0 (0,0%) 2 (20,0%)
24 0 (0,0%) 1 (10,0%)
25 1 (10,0%) 2 (20,0%)
26 2 (20,0%) 0 (0,0%)
34 1 (10,0%) 0 (0,0%)
44 0 (0,0%) 1 (10,0%)
45 0 (0,0%) 1 (10,0%)
46 2 (20,0%) 0 (0,0%)
52
Tabela 3. Idade, dente avaliado, sinais e sintomas clínicos dos pacientes sintomáticos e assintomáticos.
Variável Grupo
p-valor Sintomático Assintomático
Cariados Não 5 (50,0%) 9 (90,0%) 0,1409
Sim 5 (50,0%) 1 (10,0%)
Restaurados Não 6 (60,0%) 1 (10,0%) 0,0573
Sim 4 (40,0%) 9 (90,0%)
Próteses Não 9 (90,0%) 10 (100,0%) 1,000
Sim 1 (10,0%) 0 (0,0%)
Dor à Percussão Vertical Não 0 (0,0%) 8 (80,0%)
0,0007 Sim 10 (100,0%) 2 (20,0%)
Dor à Percussão Horizontal Não 5 (50,0%) 10 (100,0%)
0,0325 Sim 5 (50,0%) 0 (0,0%)
Dor a Palpação Não 1 (10,0%) 10 (100,0%)
0,0001 Sim 9 (90,0%) 0 (0,0%)
Dor Espontânea Não 0 (0,0%) 10 (100,0%)
<0,0001 Sim 10 (100,0%) 0 (0,0%)
Edema Localizado Não 4 (40,0%) 10 (100,0%)
0,0108 Sim 6 (60,0%) 0 (0,0%)
Edema Difuso Não 6 (60,0%) 10 (100,0%)
0,2105 Sim 4 (30,0%) 0 (0,0%)
53
Tabela 3. Idade, dente avaliado, sinais e sintomas clínicos dos pacientes sintomáticos e assintomáticos.
Variável Grupo
p-valor Sintomático Assintomático
Teste Térmico Negativo Não 0 (0,0%) 0 (0,0%)
- Sim 10 (100,0%) 10 (100,0%)
Exsudato no RC Não 9 (90,0%) 0 (0,0%)
0,0001 Sim 1 (10,0%) 10 (100,0%)
Pus no RC Não 4 (40,0%) 10 (100,0%)
0,0108 Sim 6 (60,0%) 0 (0,0%)
Pus e Sangue no RC Não 7 (70,0%) 10 (100,0%)
0,2105 Sim 3 (30,0%) 0 (0,0%)
Abscesso Submucoso Não 0 (0,0%)
- - Sim 10 (100,0%)
Lesão Periapical Não 9 (90,0%) 0 (0,0%)
0,0001 Sim 1 (10,0%) 10 (100,0%)
Sem Lesão ou ≤ 2 mm
Lesão > 2 mm
9 (90,0%) 7 (70,0%) 0,5820
1 (10,0%) 3 (30,0%)
54
Não houve diferença significativa entre os grupos quanto idade, estado de
saúde saudável, dente tratado, cárie, prótese, edema difuso, aspecto do interior do
canal radicular com sangue e pus e presença de lesão maior que 2 mm (p>0,05). O
nível de significância para a variável “restaurado” ficou próximo ao limiar (p=0,0573),
sendo restaurado em 40,0% do grupo sintomático e 90,0% no assintomático.
Observou-se ainda que todos os participantes do grupo sintomático e 20,0% dos
assintomáticos apresentavam percussão vertical (p<0,05), Figura 1. Também
50,0% dos sintomáticos apresentavam percussão horizontal (p<0,05), Figura 2.
Entre os sintomáticos 90,0% tinham dor na palpação e todos tinham dor espontânea
(p<0,05), Figura 3. Ainda, 60,0% do grupo sintomático tinham edema localizado
(p<0,05), Figura 4. Todos os participantes do grupo assintomático e 10% do grupo
sintomático apresentavam exsudato no interior do canal radicular (p<0,05), Figura 5.
Quanto a presença de pus no interior do canal radicular também houve diferença
significativa entre os grupos, sendo que 60,0% do grupo sintomático apresentavam,
Figura 6. Lesão periapical foi observada em 10% dos sintomáticos e 100,0% dos
assintomáticos (p<0,05), Figura 7. A maioria das lesões periapical observadas eram
inferiores ou iguais a 2 mm.
Figura 1. Frequência (%) de pacientes com percussão vertical positiva em função do
grupo.
55
Figura 2. Frequência (%) de pacientes com percussão horizontal positiva em função
do grupo.
Figura 3. Frequência (%) de pacientes com dor a palpação e dor espontânea em
função do grupo.
Figura 4. Frequência (%) de pacientes com edema localizado em função do grupo.
56
Figura 5. Frequência (%) de pacientes com exsudato no interior do canal em função
do grupo.
Figura 6. Frequência (%) de pacientes com a presença de secreção purulenta no
interior do canal radicular em função do grupo.
Figura 7. Frequência (%) de pacientes com lesão periapical em função do grupo.
57
5.2 Quantificação de UFC, LPS e LTA em Pacientes dos Grupos
Sintomáticos e Assintomáticos nas Diferentes Fases do Tratamento
Endodôntico
Na Tabela 4 e Figura 8, Figura 9 e Figura 10 são apresentadas os
resultados de unidades formadoras de colônia (UFC), quantificação de ácido
lipoteicóico (LTA) e quantificação de ácido lipopolissacarídeo (LPS).
58
Tabela 4. Mediana (valor mínimo e máximo) de unidades formadoras de colônia (UFC), quantificação dos níveis de ácido lipoteicóico (LTA) e
de ácido lipopolissacarídeo (LPS) em função do grupo e local/tempo.
Variável Grupo Abscesso Interior do canal radicular p-valor
Exsudato Antes do PQM Após o PQM Após a MIC
UFC
X 104
Sintomático 361,50 (1,57-8300,00) A 64,5 (2,89-9300,00) A 0,00 (0,00-0,0015) B 0,00 (0,00-0,0004) B <0,0001
Assintomático - 50,7 (0,0038-63000,00) A 0,00 (0,00-0,0007) B 0,00 (0,00-0,0005) B
p-valor 0,5967 0,7337 0,9097
LTA
Sintomático 0,57 (0,45-1,00) A 0,50 (0,34-,89) AB 0,43 (0,23-0,63) BC 0,24 (0,11-0,45) C <0,0001
Assintomático - 0,70 (0,47-0,92) A 0,45 (0,40-0,72) B 0,27 (0,18-0,46) B 0,0001
p-valor 0,0640 0,2730 0,2899
LPS
Sintomático 120,00 (26,20-393,00) A 132,50 (25,60-287,00) A 0,02 (0,01-0,59) B 0,01 (0,01-3,17) B <0,0001
Assintomático - 25,85 (0,20-79,80) A 0,12 (0,04-0,50) AB 0,01 (0,01-0,10) B 0,0003
p-valor 0,0025 0,0757 0,4963
Medianas seguidas letras distintas na horizontal diferem entre si (p≤0,05)
59
Figura 8. Box plot de unidades formadoras de colônia (UFC) x 104 em função do grupo e local/tempo.
60
Figura 9. Box plot de quantificação de ácido lipoteicóico (LTA) em função do grupo e local/tempo.
61
Figura 10. Box plot de quantificação de ácido lipopolissacarídeo (LPS) em função do grupo e local/tempo.
62
Tabela 5. Porcentagem de variação média (desvio padrão) de unidades formadoras de colônia (UFC), quantificação dos níveis
de ácido lipoteicóico (LTA) e de ácido lipopolissacarídeo (LPS) em relação ao tempo anterior, para os dois grupos.
Variável Grupo Interior do canal radicular
Após o PQM Após a MIC
UFC
X 104
Sintomático -99,99% (0,02%) -
Assintomático -99,99% (0,00%) -
LTA Sintomático -22,23% (-17,96%) -39,55% (17.94%)
Assintomático -26,99% (-8,67%) -41,71% (20,67%)
LPS Sintomático -99,81% (0,42%) 3128,20% (10004,08%)
Assintomático -74,01% (78,72%) -59,52% (60,43%)
63
Houve diminuição significativa de UFC após PQM, nos dois grupos
(p<0,05). Na Tabela 5 observa-se que houve diminuição de 99,99% das UFC
após o PQM. Não houve diferença significativa entre os dois grupos quanto a
quantificação de UFC (p>0,05) no interior do canal radicular. Para o grupo
sintomático não houve diferença significativa entre UFC no exsudato do
abscesso e no interior do canal radicular antes do preparo químico (p<0,05),
mas após o preparo houve diminuição significativa (p<0,05). Quanto ao LTA,
houve diminuição significativa no grupo assintomático após o preparo químico
(p<0,05). Já no grupo sintomático observou-se diminuição significativa entre o
tempo após a MIC e antes do PQM (p<0,05). Ainda no grupo sintomático, LTA no
abscesso não diferiu significativamente do interior do canal antes do PQM
(p>0,05). A redução no LTA nos dois grupos em relação ao tempo anterior pode
ser observada na Tabela 5. Quanto ao LPS, antes do preparo químico o grupo
sintomático apresentava valores maiores que o grupo assintomático (p<0,05).
Após o PQM houve redução significativa no grupo sintomático e partir deste não
houve mais diferença significativa entre os dois grupos (p>0,05). O LPS no
abscesso não diferiu significativamente do interior do canal antes do preparo
químico (p>0,05).
Na Tabela 6 podem-se observar os resultados das análises de
correlações entre unidades formadoras de colônia (UFC), quantificação de ácido
lipoteicóico (LTA) e quantificação de ácido lipopolissacarídeo (LPS).
64
Tabela 6. Coeficiente de correlação de Spearman (p-valor) entre unidades formadoras de colônia (UFC), quantificação dos níveis de
ácido lipoteicóico (LTA) e de ácido lipopolissacarídeo (LPS).
Grupo Variável 1 Variável 2 Abscesso Interior do canal radicular
Exsudato Antes do PQM Após o PQM Após a MIC
Sintomático
UFC LTA 0,44 (0,2004) 0,19 (0,6032) -0,42 (0,2208) 0,62 (0,0535)
UFC LPS 0,68 (0,0289) -0,25 (0,4888) 0,25 (0,4922) -0,25 (0,4916)
LTA LPS 0,38 (0,2763) -0,38 (0,2763) -0,42 (0,2266) -0,28 (0,4299)
Assintomat.
UFC LTA - -0,08 (0,8287) 0,18 (0,6230) -0,42 (0,2312)
UFC LPS - -0,10 (0,7770) -0,17 (0,6403) 0,48 (0,1652)
LTA LPS - 0,25 (0,4888) -0,56 (0,0937) -0,03 (0,9240
Ambos
UFC LTA - -0,02 (0,9148) -0,26 (0,2622) 0,13 (0,5714)
UFC LPS - -0,03 (0,8899) 0,05 (0,8298) 0,19 (0,4235)
LTA LPS - -0,34 (0,1388) -0,34 (0,1402) -0,14 (0,5431)
65
No grupo sintomático houve correlação positiva entre UFC e LPS no
abscesso (p<0,05); entre UFC e LTA no interior do canal radicular após a MIC o
p-valor da correlação ficou próximo ao limiar (p=0,0535).
5.3 Análises das Frequências e Porcentagens de Detecção de
Microrganismos através do Nested-PCR
Na Tabela 7 são apresentados as frequências e porcentagens de
microrganismos detectados por meio da técnica de Nested-PCR para os dois
grupos de pacientes analisados.
Na Figura 11 e Figura 12 são apresentados os resultados das espécies-
específicas detectadas pela técnica de Nested-PCR.
Os casos assintomáticos com polpa necrosada e lesão periapical
associada a estas polpas tiveram como microrganismos mais detectados no
interior do canal radicular antes de qualquer intervenção endodôntica:
Enterococcus faecalis (10/10), Fusobacterium nucleatum (9/10), Prevotella
nigrescens (7/10), Prevotella tannerae (5/10) e Parvimonas micra (5/10).
Após o PQM dos canais radiculares, as espécies mais prevalentes
detectadas foram Enterococcus faecalis (10/10) e Fusobacterium nucleatum
(5/10).
Nas amostras após a MIC, a prevalência de espécies bacterianas
mostrou-se semelhante após o PQM, apresentando detecção de Enterococcus
faecalis (10/10) e Fusobacterium nucleatum (4/10). Algumas bactérias que não
haviam sido detecdas nas fases do tratamento endodôntico anterior foram
detectadas em poucos casos após a MIC como a Actinomyces naeslundii,
Agregatibacter actinomycetemcomitans, Dialister pneumosintes.
Os casos sintomáticos com polpa necrosada e AAA associado a estes
elementos dentários apresentaram dezesseis espécies bacterianas identificadas
66
no exsudato desta patologia. A única espécie bacteriana não detectada foi
Treponema socranskii. Entre as espécies bacterianas mais detectadas no
exsudato encontramos: Enterococcus faecalis (10/10), Fusobacterium nucleatum
(10/10), Treponema denticola (8/10), Streptococcus sobrinus (6/10), Prevotella
tannerae (5/10) e Porphyromonas endodontalis (4/10).
Nas amostras destes mesmos pacientes, no entanto coletas no interior
do canal radicular, três espécies bacterianas foram detectadas com maior
frequência: Enterococcus faecalis (10/10), Fusobacterium nucleatum (8/10) e
Parvimonas micra (6/10). Além disso, algumas bactérias que haviam sido
detectadas em baixa prevalência no sítio do AAA não foram detectadas no
interior do canal radicular deste mesmo dente, como as espécies: Actinomyces
naeslundii, Agregatibacter actinomycetemcomitans, Dialister pneumosintes,
Gemella morbilorum, Porphyromonas gingivalis, Prevotella intermédia e a
Prevotella nigrescens.
As amostras coletadas após o PQM apresentaram a mesma prevalência
anterior de detecção para a espécie Enterococcus faecalis (10/10), além deste,
outras duas espécies bacterianas foram detectadas após desinfecção dos
canais radiculares: Fusobacterium nucleatum (7/10) e Fillifactor alocis (1/10). As
demais espécies bacterianas investigadas foram detectadas nesta etapa do
tratamento endodôntico.
Dente as bactérias mais identificadas após MIC encontramos:
Enterococcus faecalis (10/10), Fusobacterium nucleatum (8/10) e Actinomyces
naeslundii (4/10). Três espécies bacterianas apenas não foram identificadas
neste momento: Agregatibacter actinomycetemcomitans, Treponema denticola e
Treponema socranskii.
67
Tabela 7. Frequência e porcentagem de resultado positivo no Nested-PCR (detecção de bactérias específicas) em função
do grupo e local/tempo.
Bactéria Grupo Abscesso Interior do canal radicular
Exsudato Antes do PQM Após o PQM Após a MIC
Anae Sintomático 1 (10,0%) 0 (0,0%) 0 (0,0%) 4 (40,0%)
Assintomático - 0 (0,0%) 0 (0,0%) 1 (10,0%)
p-valor - - - 0,3034
Aact Sintomático 2 (20,0%) 0 (0,0%) 0 (0,0%) 0 (0,0%)
Assintomático - 0 (0,0%) 0 (0,0%) 1 (10,0%)
p-valor - - 1,000
Dpne Sintomático 2 (20,0%) 0 (0,0%) 0 (0,0%) 2 (20,0%)
Assintomático - 0 (0,0%) 0 (0,0%) 1 (10,0%)
p-valor - - 1,000
Efae Sintomático 10 (100,0%) 10 (100,0%) 10 (100,0%) 10 (100,0%)
Assintomático - 10 (100,0%) 10 (100,0%) 10 (100,0%)
p-valor - - - -
Falo Sintomático 2 (20,0%) 1 (10,0%)
2 (20,0%)
1 (10,0%) 2 (20,0%)
Assintomático - 0 (0,0%) 0 (0,0%)
p-valor - 1,000 1,000 0,4737
68
Tabela 7. Frequência e porcentagem de resultado positivo no Nested-PCR (detecção de bactérias específicas) em função
do grupo e local/tempo.
Bactéria Grupo Abscesso Interior do canal radicular
Exsudato Antes do PQM Após o PQM Após a MIC
Fnuc Sintomático 10 (100,0%) 8 (80,0%) 7 (70,0%) 8 (80,0%)
Assintomático - 9 (90,0%) 5 (50,0%) *4 (40,0%)
p-valor - 1,000 0,6499 0,1698
Gmor Sintomático 2 (20,0%) 0 (0,0%) 0 (0,0%) 1 (10,0%)
Assintomático - 0 (0,0%) 1 (10,0%) 0 (0,0%)
p-valor - - 1,000 1,000
Pmic Sintomático 2 (20,0%) $6 (60,0%) 0 (0,0%) *1 (10,0%)
Assintomático - 5 (50,0%) 0 (0,0%) 2 (20,0%)
p-valor - 1,000 - 1,000
Pend Sintomático 4 (40,0%) 3 (30,0%) 0 (0,0%) 1 (10,0%)
Assintomático - 0 (0,0%) 0 (0,0%) 0 (0,0%)
p-valor - 0,2105 - 1,000
Pgin Sintomático 2 (20,0%) 0 (0,0%) 0 (0,0%) 1 (10,0%)
Assintomático - 0 (0,0%) 0 (0,0%) 0 (0,0%)
p-valor - - - 1,000
69
Tabela 7. Frequência e porcentagem de resultado positivo no Nested-PCR (detecção de bactérias específicas) em função
do grupo e local/tempo.
Bactéria Grupo Abscesso Interior do canal radicular
Exsudato Antes do PQM Após o PQM Após a MIC
Pint Sintomático 1 (10,0%) 0 (0,0%) 0 (0,0%) 1 (10,0%)
Assintomático - 1 (10,0%) 0 (0,0%) 0 (0,0%)
p-valor - 1,000 - 1,000
Pnig Sintomático 2 (20,0%) 0 (0,0%) 0 (0,0%) 1 (10,0%)
Assintomático - 7 (70,0%) *1 (10,0%) 0 (0,0%)
p-valor - 0,0031 1,000 1,000
Ptan Sintomático 5 (50,0%) 1 (10,0%) 0 (0,0%) 1 (10,0%)
Assintomático - 5 (50,0%) 0 (0,0%) *1 (10,0%)
p-valor - 0,1409 - 1,000
Ssob Sintomático 6 (60,0%) 2 (20,0%) 0 (0,0%) $1 (10,0%)
Assintomático - 2 (20,0%) 0 (0,0%) 0 (0,0%)
p-valor - 1,000 - 1,000
Tfor Sintomático 3 (30,0%) 1 (10,0%) 0 (0,0%) 1 (10,0%)
Assintomático - 3 (30,0%) 0 (0,0%) 0 (0,0%)
p-valor - 0,5820 - 1,000
Tden Sintomático 8 (80,0%) $1 (10,0%) 0 (0,0%) $1 (10,0%)
Assintomático - 4 (40,0%) 2 (20,0%) 0 (0,0%)
70
Tabela 7. Frequência e porcentagem de resultado positivo no Nested-PCR (detecção de bactérias específicas) em função
do grupo e local/tempo.
Bactéria Grupo Abscesso Interior do canal radicular
Exsudato Antes do PQM Após o PQM Após a MIC
p-valor - 0,3034 0,4737 1,000
Tsoc Sintomático 0 (0,0%) 0 (0,0%) 0 (0,0%) 1 (10,0%)
Assintomático - 4 (40,0%) 3 (30,0%) 0 (0,0%)
p-valor - 0,0867 0,2105 1,000
Legenda: Anae – Actinomyces naeslundii, Aact – Aggregatibacter actinomycetemcomitans, Dpne – Dialister pneumosintes, Efae – Enterococcus
faecalis, Falo – Filifactor alocis, Fnuc – Fusobacterium nucleatum, Gmor – Gemella morbilorum, Pmic – Parvimonas micra, Pend – Porphyromonas
endodontalis, Pgin – Porphyromonas gingivalis, Pint – Prevotella intermedia, Pnig – Prevotella nigrescens, Ptan – Prevotella tannerae, Ssob –
Streptococcus sobrinus, Tfor – Tannerella forsythia, Tden – Treponema denticola, Tsoc – Treponema socranskii.
* Difere do tempo antes do preparo químico (p<0,05). $Difere Exsudato do abscesso (p<0,05).
71
Figura 11. Perfil da comunidade microbiana de canais radiculares antes do PQM, após o
PQM e após 30 dias de MIC dos casos de pacientes assintomáticos apresentando
necrose pulpar associada a presença de lesão periapical visível radiograficamente.
0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10
Actinomyces naeslundii
Aggregatibacter actinomycetemcomitans
Dialister pneumosintes
Enterococcus faecalis
Fillifactor alocis
Fusobacterium nucleatum
Gemella morbilorum
Parvimonas micra
Porphyromonas endodontalis
Porphyromonas gingivallis
Prevotella intermedia
Prevotella nigrescens
Prevotella tannerae
Streptococcus sobrinus
Tannerella forsythia
Treponema denticola
Treponema socranskii
Após a MIC Após o PQM Antes do PQM
72
Figura 12. Perfil da comunidade microbiana do exsudato do abscesso, interior do
canal radicular antes do PQM, após o PQM e após 30 dias de MIC dos casos de
pacientes sintomáticos apresentando necrose pulpar associada ao abscesso apical
agudo.
0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10
Actinomyces naeslundii
Aggregatibacter actinomycetemcomitans
Dialister pneumosintes
Enterococcus faecalis
Fillifactor alocis
Fusobacterium nucleatum
Gemella morbilorum
Parvimonas micra
Porphyromonas endodontalis
Porphyromonas gingivallis
Prevotella intermedia
Prevotella nigrescens
Prevotella tannerae
Streptococcus sobrinus
Tannerella forsythia
Treponema denticola
Treponema socranskii
Após a MIC Após o PQM Antes do PQM Exsudato
73
No grupo sintomático houve diminuição significativa de Parvimonas micra
após a MIC em relação ao tempo antes do PQM (p<0,05). No grupo assintomático
houve diminuição significativa da presença de Prevotella nigrescens após o PQM em
relação ao tempo antes do PQM e de Fusobacterium nucleatum e Prevotella
tannerae após a MIC em relação ao tempo antes do PQM (p<0,05). Observou-se
também no grupo sintomático mais presença de Parvimonas micra no interior do
canal antes do PQM do que no abscesso (p<0,05), mais presença de Streptococcus
sobrinus no abscesso do que no interior do canal após MIC (p<0,05); mais presença
de Treponema denticola no abscesso do que no interior do canal antes do preparo
químico e após a MIC (p<0,05). O grupo assintomático teve maior presença de
Prevotella nigrescens antes do PQM (70,0%) do que o grupo sintomático (p<0,05).
Na Tabela 8 são apresentadas as frequências e porcentagens de resultados
positivos de duas bactérias conjuntamente no mesmo paciente. Observa-se grande
porcentagem de pacientes que apresentaram as bactérias Enterococcus faecalis e
Fusobacterium nucleatum conjuntamente. Observou-se também, no abscesso,
presença conjuntamente das bactérias Fusobacterium nucleatum e Treponema
denticola em 80% dos pacientes, das bactérias Prevotella tannerae e Treponema
denticola em 50% dos pacientes e de Streptococcus sobrinus e Treponema denticola
em 60% dos pacientes.
74
Tabela 8. Frequência e porcentagem de resultados positivos para correlações das duas bactérias no Nested-PCR
(detecção de bactérias específicas) em função do grupo e local/tempo.
Espécie
1
Espécie
2
Abscesso Interior do canal radicular
Exsudato Antes do PQM Após o PQM Após a MIC
Anae
Aact 1 (10,0%) 0 (0,0%) 0 (0,0%) *1 (5,0%)
Dpne 0 (0,0%) 0 (0,0%) 0 (0,0%) 3 (15,0%)
Efae 0 (0,0%) 0 (0,0%) 0 (0,0%) 5 (25,0%)
Falo 0 (0,0%) 0 (0,0%) 0 (0,0%) 1 (5,0%)
Fnuc 1 (10,0%) 0 (0,0%) 0 (0,0%) *4 (20,0%)
Gmo 1 (10,0%) 0 (0,0%) 0 (0,0%) *1 (5,0%)
Pmic 1 (10,0%) 0 (0,0%) 0 (0,0%) 1 (5,0%)
Pend 1 (10,0%) 0 (0,0%) 0 (0,0%) *1 (5,0%)
Pgin 1 (10,0%) 0 (0,0%) 0 (0,0%) *1 (5,0%)
Pint 1 (10,0%) 0 (0,0%) 0 (0,0%) *1 (5,0%)
Pnig 1 (10,0%) 0 (0,0%) 0 (0,0%) *1 (5,0%)
Ptan *1 (10,0%) 0 (0,0%) 0 (0,0%) 2 (10,0%)
Ssob *1 (10,0%) 0 (0,0%) 0 (0,0%) *1 (5,0%)
Tfor 1 (10,0%) 0 (0,0%) 0 (0,0%) *1 (5,0%)
Tden *1 (10,0%) 0 (0,0%) 0 (0,0%) 0 (0,0%)
Tsoc 0 (0,0%) 0 (0,0%) 0 (0,0%) *1 (5,0%)
75
Tabela 8. Frequência e porcentagem de resultados positivos para correlações das duas bactérias no Nested-PCR
(detecção de bactérias específicas) em função do grupo e local/tempo.
Espécie
1
Espécie
2
Abscesso Interior do canal radicular
Exsudato Antes do PQM Após o PQM Após a MIC
Aact
Dpne 1 (10,0%) 0 (0,0%) 0 (0,0%) 1 (5,0%)
Efae 2 (20,0%) 0 (0,0%) 0 (0,0%) 1 (5,0%)
Falo 1 (10,0%) 0 (0,0%) 0 (0,0%) 0 (0,0%)
Fnuc 2 (20,0%) 0 (0,0%) 0 (0,0%) *0 (0,0%)
Pmic 2 (20,0%) 0 (0,0%) 0 (0,0%) 0 (0,0%)
Pend 2 (20,0%) 0 (0,0%) 0 (0,0%) 0 (0,0%)
Pgin 2 (20,0%) 0 (0,0%) 0 (0,0%) 0 (0,0%)
Pint 1 (10,0%) 0 (0,0%) 0 (0,0%) 0 (0,0%)
Pnuc 1 (10,0%) 0 (0,0%) 0 (0,0%) 0 (0,0%)
Ptan 1 (10,0%) 0 (0,0%) 0 (0,0%) 1 (5,0%)
Ssob *2 (20,0%) 0 (0,0%) 0 (0,0%) 0 (0,0%)
Tfor 2 (20,0%) 0 (0,0%) 0 (0,0%) 0 (0,0%)
Tden *2 (20,0%) 0 (0,0%) 0 (0,0%) 0 (0,0%)
Tsoc 0 (0,0%) 0 (0,0%) 0 (0,0%) 1 (5,0%)
76
Tabela 8. Frequência e porcentagem de resultados positivos para correlações das duas bactérias no Nested-PCR
(detecção de bactérias específicas) em função do grupo e local/tempo.
Espécie
1
Espécie
2
Abscesso Interior do canal radicular
Exsudato Antes do PQM Após o PQM Após a MIC
Dpne
Efae 2 (20,0%) 0 (0,0%) 0 (0,0%) 3 (15,0%)
Falo 2 (20,0%) 0 (0,0%) 0 (0,0%) 1 (5,0%)
Fnuc 2 (20,0%) 0 (0,0%) 0 (0,0%) *2 (10,0%)
Gmo 1 (10,0%) 0 (0,0%) 0 (0,0%) 1 (5,0%)
Pmic 1 (10,0%) 0 (0,0%) 0 (0,0%) 0 (0,0%)
Pend 2 (20,0%) 0 (0,0%) 0 (0,0%) 1 (5,0%)
Pgin 1 (10,0%) 0 (0,0%) 0 (0,0%) 1 (5,0%)
Pint 0 (0,0%) 0 (0,0%) 0 (0,0%) 1 (5,0%)
Pnig 0 (0,0%) 0 (0,0%) 0 (0,0%) 1 (5,0%)
Ptan 1 (10,0%) 0 (0,0%) 0 (0,0%) 2 (10,0%)
Ssob 1 (10,0%) 0 (0,0%) 0 (0,0%) 1 (5,0%)
Tfor 1 (10,0%) 0 (0,0%) 0 (0,0%) 1 (5,0%)
Tden *2 (20,0%) 0 (0,0%) 0 (0,0%) 0 (0,0%)
Tsoc 0 (0,0%) 0 (0,0%) 0 (0,0%) 1 (5,0%)
77
Tabela 8. Frequência e porcentagem de resultados positivos para correlações das duas bactérias no Nested-PCR
(detecção de bactérias específicas) em função do grupo e local/tempo.
Espécie
1
Espécie
2
Abscesso Interior do canal radicular
Exsudato Antes do PQM Após o PQM Após a MIC
Efae
Falo 2 (20,0%) 0 (0,0%) 1 (5,0%) 2 (10,0%)
Fnuc 10 (100,0%) 17 (85,0%) 12 (60,0%) 12 (60,0%)
Gmo 2 (20,0%) 0 (0,0%) 1 (5,0%) 0 (0,0%)
Pmic 2 (20,0%) 11 (55,0%) 0 (0,0%) 1 (5,0%)
Pend 4 (40,0%) 3 (15,0%) 0 (0,0%) 3 (15,0%)
Pgin 2 (20,0%) 0 (0,0%) 0 (0,0%) 1 (5,0%)
Pint 1 (10,0%) 1 (5,0%) 0 (0,0%) 1 (5,0%)
Pnig 2 (20,0%) 7 (35,0%) 1 (5,0%) 1 (5,0%)
Ptan 5 (50,0%) 6 (30,0%) 0 (0,0%) 1 (5,0%)
Ssob 6 (60,0%) 4 (20,0%) 0 (0,0%) 2 (10,0%)
Tfor 3 (30,0%) 4 (20,0%) 0 (0,0%) 1 (5,0%)
Tden 8 (80,0%) 5 (25,0%) 2 (10,0%) 1 (5,0%)
Tsoc 0 (0,0%) 4 (20,0%) 3 (15,0%) 1 (5,0%)
78
Tabela 8. Frequência e porcentagem de resultados positivos para correlações das duas bactérias no Nested-PCR
(detecção de bactérias específicas) em função do grupo e local/tempo.
Espécie
1
Espécie
2
Abscesso Interior do canal radicular
Exsudato Antes do PQM Após o PQM Após a MIC
Falo
Fnuc 2 (20,0%) *3 (15,0%) *1 (5,0%) *2 (10,0%)
Gmo 1 (10,0%) 0 (0,0%) 0 (0,0%) 1 (5,0%)
Pmic 1 (10,0%) *3 (15,0%) 0 (0,0%) 0 (0,0%)
Pend 2 (20,0%) 0 (0,0%) 0 (0,0%) 1 (5,0%)
Pgin 1 (10,0%) 0 (0,0%) 0 (0,0%) 1 (5,0%)
Pint 0 (0,0%) 1 (5,0%) 0 (0,0%) 1 (5,0%)
Pnig 0 (0,0%) 2 (10,0%) 0 (0,0%) 1 (5,0%)
Ptan 1 (10,0%) 1 (5,0%) 0 (0,0%) 1 (5,0%)
Ssob 1 (10,0%) 0 (0,0%) 0 (0,0%) 1 (5,0%)
Tfor 1 (10,0%) 0 (0,0%) 0 (0,0%) 1 (5,0%)
Tden *2 (20,0%) 0 (0,0%) 0 (0,0%) 0 (0,0%)
Tsoc 0 (0,0%) 1 (5,0%) 0 (0,0%) 0 (0,0%)
79
Tabela 8. Frequência e porcentagem de resultados positivos para correlações das duas bactérias no Nested-PCR
(detecção de bactérias específicas) em função do grupo e local/tempo.
Espécie
1
Espécie
2
Abscesso Interior do canal radicular
Exsudato Antes do PQM Após o PQM Após a MIC
Fnuc
Gmo 2 (20,0%) *10 (50,0%) *0 (0,0%) *1 (5,0%)
Pmic 2 (20,0%) 0 (0,0%) 0 (0,0%) *2 (10,0%)
Pend 4 (40,0%) 0 (0,0%) 0 (0,0%) 0 (0,0%)
Pgin 2 (20,0%) *3 (15,0%) 0 (0,0%) *1 (5,0%)
Pint 1 (10,0%) 0 (0,0%) 0 (0,0%) *1 (5,0%)
Pnig 2 (20,0%) *1 (5,0%) 0 (0,0%) *1 (5,0%)
Ptan 5 (50,0%) *6 (30,0%) 0 (0,0%) *1 (5,0%)
Ssob 6 (60,0%) *3 (15,0%) 0 (0,0%) *1 (5,0%)
Tfor 3 (30,0%) *4 (20,0%) 0 (0,0%) *1 (5,0%)
Tden 8 (80,0%) *4 (20,0%) *1 (5,0%) 0 (0,0%)
Tsoc 0 (0,0%) *4 (20,0%) *1 (5,0%) *0 (0,0%)
Gmo
Pmic 2 (20,0%) 0 (0,0%) 0 (0,0%) 0 (0,0%)
Pend 2 (20,0%) 0 (0,0%) 0 (0,0%) 1 (5,0%)
Pgin 2 (20,0%) 0 (0,0%) 0 (0,0%) 1 (5,0%)
Pint 1 (10,0%) 0 (0,0%) 0 (0,0%) 1 (5,0%)
Pnig 1 (10,0%) 0 (0,0%) 0 (0,0%) 1 (5,0%)
Ptan 1 (10,0%) 0 (0,0%) 0 (0,0%) 1 (5,0%)
Ssob 2 (20,0%) 0 (0,0%) 0 (0,0%) 1 (5,0%)
Tfor 2 (20,0%) 0 (0,0%) 0 (0,0%) 1 (5,0%)
Tden 2 (20,0%) 0 (0,0%) 0 (0,0%) 0 (0,0%)
Tsoc 0 (0,0%) 0 (0,0%) 1 (5,0%) 0 (0,0%)
80
Tabela 8. Frequência e porcentagem de resultados positivos para correlações das duas bactérias no Nested-PCR
(detecção de bactérias específicas) em função do grupo e local/tempo.
Espécie
1
Espécie
2
Abscesso Interior do canal radicular
Exsudato Antes do PQM Após o PQM Após a MIC
Pmic
Pend 2 (20,0%) *3 (15,0%) 0 (0,0%) 0 (0,0%)
Pgin 2 (20,0%) 0 (0,0%) 0 (0,0%) 0 (0,0%)
Pint 1 (10,0%) *1 (5,0%) 0 (0,0%) 0 (0,0%)
Pnig 1 (10,0%) 4 (20,0%) 0 (0,0%) 0 (0,0%)
Ptan 1 (10,0%) *5 (25,0%) 0 (0,0%) 0 (0,0%)
Ssob *2 (20,0%) *1 (5,0%) 0 (0,0%) 0 (0,0%)
Tfor 2 (20,0%) *2 (10,0%) 0 (0,0%) 0 (0,0%)
Tden 2 (20,0%) *3 (15,0%) 0 (0,0%) 0 (0,0%)
Tsoc 0 (0,0%) *2 (10,0%) 0 (0,0%) 0 (0,0%)
Pend
Pgin 2 (20,0%) 0 (0,0%) 0 (0,0%) 1 (5,0%)
Pint 1 (10,0%) 0 (0,0%) 0 (0,0%) 1 (5,0%)
Pnig 2 (20,0%) 0 (0,0%) 0 (0,0%) 1 (5,0%)
Ptan 3 (30,0%) 1 (5,0%) 0 (0,0%) 1 (5,0%)
Ssob 3 (30,0%) 1 (5,0%) 0 (0,0%) 1 (5,0%)
Tfor 3 (30,0%) 1 (5,0%) 0 (0,0%) 1 (5,0%)
Tden *4 (40,0%) 1 (5,0%) 0 (0,0%) 0 (0,0%)
Tsoc 0 (0,0%) 0 (0,0%) 0 (0,0%) 0 (0,0%)
81
Tabela 8. Frequência e porcentagem de resultados positivos para correlações das duas bactérias no Nested-PCR
(detecção de bactérias específicas) em função do grupo e local/tempo.
Espécie
1
Espécie
2
Abscesso Interior do canal radicular
Exsudato Antes do PQM Após o PQM Após a MIC
Pgin
Pint 1 (10,0%) 0 (0,0%) 0 (0,0%) 1 (5,0%)
Pnig 1 (10,0%) 0 (0,0%) 0 (0,0%) 1 (5,0%)
Ptan 1 (10,0%) 0 (0,0%) 0 (0,0%) 1 (5,0%)
Ssob *2 (20,0%) 0 (0,0%) 0 (0,0%) 1 (5,0%)
Tfor 2 (20,0%) 0 (0,0%) 0 (0,0%) 1 (5,0%)
Tden *2 (20,0%) 0 (0,0%) 0 (0,0%) 0 (0,0%)
Tsoc 0 (0,0%) 0 (0,0%) 0 (0,0%) 0 (0,0%)
Pint
Pnig 1 (10,0%) 1 (5,0%) 0 (0,0%) 1 (5,0%)
Ptan *1 (10,0%) *0 (0,0%) 0 (0,0%) 1 (5,0%)
Ssob *1 (10,0%) 0 (0,0%) 0 (0,0%) 1 (5,0%)
Tfor 1 (10,0%) 0 (0,0%) 0 (0,0%) 1 (5,0%)
Tden *1 (10,0%) 0 (0,0%) 0 (0,0%) 0 (0,0%)
Tsoc 0 (0,0%) 1 (5,0%) 0 (0,0%) 0 (0,0%)
Pnig
Ptan 2 (20,0%) 0 (0,0%) 0 (0,0%) 1 (5,0%)
Ssob *2 (20,0%) 2 (10,0%) 0 (0,0%) 0 (0,0%)
Tfor 2 (20,0%) 1 (5,0%) 0 (0,0%) 1 (5,0%)
Tden *2 (20,0%) 2 (10,0%) 0 (0,0%) 1 (5,0%)
Tsoc 0 (0,0%) 2 (10,0%) 0 (0,0%) 0 (0,0%)
Ptan
Ssob 4 (40,0%) 0 (0,0%) 0 (0,0%) 1 (5,0%)
Tfor 2 (20,0%) 1 (5,0%) 0 (0,0%) 1 (5,0%)
Tden 5 (50,0%) 2 (10,0%) 0 (0,0%) 0 (0,0%)
Tsoc 0 (0,0%) 2 (10,0%) 0 (0,0%) 1 (5,0%)
82
Tabela 8. Frequência e porcentagem de resultados positivos para correlações das duas bactérias no Nested-PCR
(detecção de bactérias específicas) em função do grupo e local/tempo.
Espécie
1
Espécie
2
Abscesso Interior do canal radicular
Exsudato Antes do PQM Após o PQM Após a MIC
Ssob
Tfor 3 (30,0%) 1 (5,0%) 0 (0,0%) 1 (5,0%)
Tden 6 (60,0%) 2 (10,0%) 0 (0,0%) 0 (0,0%)
Tsoc 0 (0,0%) 0 (0,0%) 0 (0,0%) 0 (0,0%)
Tfor Tden *3 (30,0%) 2 (10,0%) 0 (0,0%) 0 (0,0%)
Tsoc 0 (0,0%) 1 (5,0%) 0 (0,0%) 0 (0,0%)
Tdent Tsoc 0 (0,0%) 1 (5,0%) 1 (5,0%) 0 (0,0%)
* Resultados discordantes (p<0,05).
Legenda: Anae – Actinomyces naeslundii, Aact – Aggregatibacter actinomycetemcomitans, Dpne – Dialister
pneumosintes, Efae – Enterococcus faecalis, Falo – Filifactor alocis, Fnuc – Fusobacterium nucleatum, Gmor –
Gemella morbilorum, Pmic – Parvimonas micra, Pend – Porphyromonas endodontalis, Pgin – Porphyromonas gingivalis,
Pint – Prevotella intermedia, Pnig – Prevotella nigrescens, Ptan – Prevotella tannerae, Ssob – Streptococcus sobrinus,
Tfor – Tannerella forsythia, Tden – Treponema denticola, Tsoc – Treponema socranskii.
83
6 DISCUSSÃO
O presente estudo demonstra singularidade na detecção de espécies
específicas bacterianas e associação a fatores de virulência como o ácido
lipopolissacarídeo (LPS) e ácido lipoteicóico (LTA) na infecção primária sintomática
e assintomática. É consenso entre estudos anteriores que a infecção primária é
polimicrobiana e com prevalência de microrganismos anaeróbios estritos (Fabricius
et al., 1982; Gomes et al., 1994a; Rôças et al., 2001; Nóbrega et al., 2016). No
entanto, a literatura é extremamente limitada acerca de fatores de virulência nestas
infecções como o ácido lipopolissacarídeo e ácido lipoteicoico.
A metodologia de contabilização de UFCs para avaliação da capacidade de
protocolos de descontaminação no interior dos canais radiculares é amplamente
divulgada na literatura endodôntica (Gomes et al., 1996; Munson et al., 2002; Vianna
et al., 2008; Sousa et al., 2013; Martinho et al., 2014). Este estudo demonstrou que o
protocolo de descontaminação empregando como substância química auxiliar a
clorexidina gel 2% associada à instrumentação mecânica com limas do tipo Reciproc
foi eficiente na redução significava da carga microbiana após o preparo químico
mecânico, em ambos os grupos: sintomáticos e assintomáticos. Estando de acordo
com resultados de estudos in vitro prévios (Martinho et al., 2014; Marinho et al.,
2015). Embora a esterilidade do interior do sistema de canais radiculares não seja
alcançada, aparentemente as baixas concentrações de bactérias remanescentes no
interior dos canais radiculares parecem não ter potencial para perpetuar uma
infecção endodôntica.
Em relação à diminuição das taxas microbiológicas com a utilização da MIC
Ca(OH)2 + CHX 2% durante trinta dias estas não apresentaram diferenças
significantes quando comparadas a etapa anterior (após o PQM), resultados estes
equiparados com estudos de (Barbosa-Ribeiro et al., 2017). Embora poucas culturas
após MIC apresentassem microrganismos viáveis, estatisticamente devido ao
baixíssimo número de UFCs contabilizadas, próximo a zero, é impraticável a
aplicação do teste estatístico.
84
A utilização de testes moleculares na Endodontia favorece a o diagnóstico e
a compreensão da infecção endodôntica e podem complementar resultados obtidos
por testes sub-representativos de cultura. Uma vez que o não crescimento de
colônias bacterianas em placas não significa a esterilidade do canal radicular. Esta
situação possivelmente aconteça devido alguns fatores como, a dificuldade de
crescimento de anaeróbios fastidiosos, baixa quantidade de células bacterianas
viáveis para identificação fenotípica, e características de cultivo inapropriadas para
microrganismos específicos.
A técnica de PCR é uma das metodologias moleculares mais empregadas
atualmente devido a sua ampla divulgação no meio científico. Além disso, as
técnicas de PCR apresentam vantagens como quantificação simples, alta
sensibilidade, precisão, análise rápida, reprodutibilidade, controle de qualidade e
contaminação mínima (Shahriar et al., 2018). Também, para endodontia a técnica de
PCR permite a detecção precisa de restrições de diferentes microrganismos, mesmo
aqueles estritamente anaeróbios, o qual muitas vezes ocorre a morte celular nos
processos de coleta e transporte (Garibyan & Avashia, 2013).
Entre as variações das técnicas de PCR, o Nested-PCR é uma técnica
bastante específica e sensível, envolvendo um conjunto de primers em duas reações
distintas (Siqueira & Rôças, 2004). Estas vantagens da técnica de Nested-PCR são
atribuídas ao maior número de ciclos pelas quais as amostras são submetidas,
assim os primers de espécies-específicas podem se anelar com maior facilidade nas
amostras (Montagner et al., 2010). Desta forma, foi observada a necessidade de
aplicação do teste de Nested-PCR para avaliação de microrganismos específicos
nas amostras do presente estudo
Observamos um percentual de detecção do microrganismo Enterococcus
faecalis em 100% dos pacientes sintomáticos e 90% dos pacientes assintomáticos.
Previamente alguns autores já correlacionaram esta espécie microbiana a infecção
primária (Gomes et al., 2006; Jacinto et al., 2007), mesmo que atribuído sua
presença a uma correlação ao insucesso do tratamento endodôntico (Barbosa-
Ribeiro et al., 2016).
85
As altas porcentagens de detecção da bactéria Fusobacterium nucleatum
estão normalmente associadas à presença de sintomatologia dolorosa em pacientes
como anteriormente já relatados (Saito et al., 2006; Nóbrega et al., 2016). Nosso
estudo colabora com tais resultados, visto que a espécie foi detectada em 82,5%
dos casos de necrose pulpar com abscesso agudo apical associado. Ainda, na
secreção purulenta do abscesso apical agudo, Fusobacterium nucleatum foi
encontrada em 100% das amostras. Dado este que esta em concordância com
estudo recente que constatou a presença deste microrganismo em 60% de suas
amostras de secreção por meio de análise de checkerboard DNA-DNA hybridization
(Rôças & Siqueira, 2018). No entanto, apesar desta análise não ser significativa
quando comparado entre grupos devido alta porcentagem (90%) da bactéria em
amostras do grupo sintomático, no grupo assintomático a sua redução entre o
momento antes do PQM e após MIC foi significativa, possivelmente de competência
da MIC. Além disso, observou-se grande quantidade de pacientes que apresentaram
as bactérias Fusobacterium nucleatum e Enterococcus faecalis em conjunto, e
também em concordância a analise estatística.
Em um estudo anterior (Ozbek & Ozbek, 2010) que foi realizada a
quantificação de microrganismos que compõem o complexo vermelho em AAA. A
Treponema denticola foi identificada em 65,6% das amostras. Em contrapartida, no
presente estudo esta mesma espécie bacteriana foi encontrada em 80% das
amostras do exsudato purulento do abscesso, dado colaborativo com estudo
realizado por (Montagner et al., 2010) em que os autores aplicaram a mesma
metodologia que o presente estudo utilizou, e constaram a presença de DNA
bacteriano em 11 amostras de secreção purulenta de 20 em sua totalidade.
Possivelmente estas altas taxas de Treponema denticola nos tecidos periapicais
sejam decorrentes de sua morfologia em espirilo e sua capacidade de motilidade
permitindo a sua invasão nestes tecidos periapicais. Este fundamento é
suplementado pela diferença estatística demonstrada no presente estudo
caracterizando uma maior quantidade de Treponema denticola no abscesso quando
comparado ao interior do canal radicular.
Um importante patógeno gengival e normalmente associado às doenças
endodônticas, Porphyromonas gingivalis, teve sua presença detectada em três
amostras da infecção primária sintomática, resultado este equivalente aos
86
anteriormente publicados (Siqueira et al., 2008). Nas nossas amostras de casos
assintomáticos nenhum resultado foi positivo para presença desta bactéria, em
acordo com um estudo prévio em que apresentou DNA da Porphyromona gingivalis
em apenas 10% das amostras assintomáticas (Pattanshetty et al., 2018).
Entre os grupos, foi resultante positiva a presença de Porphyromonas
endodontalis apenas em casos sintomáticos. Na secreção purulenta, 40% das
amostras foram positivas para esta pesquisa, no interior do canal radicular
associado ao abscesso, 30% das amostras apresentaram compatibilidade com o
primer de Porphyromonas endodontalis colaborando com estudos de infecção
endodôntica primária (Cao et al., 2012; George et al., 2016).
Espécies bacterianas como Agregatibacter actinomycetemcomitans e
Actinomyces naeslundii tiveram seu DNA detectado em uma mínima quantidade de
amostras, próximas a sua nulidade, em discordância com um estudo prévio que
investigou a presença destes microrganismos (Pourhajibagher & Bahador, 2018). No
entanto, neste estudo anterior não houve critérios de inclusão restritos como o do
presente estudo, o que pode ser uma minúcia a ser considerada para presença de
elevadas concentrações destas espécies.
Foi detectada grande quantidade de Parvimonas micra, microrganismo
gram-positivo, de parede espessa e com grande quantidade de peptideoglicanos e
LTA, capazes de influenciar nas reações inflamatórias e aumentar a patogenicidade
de bactérias gram-negativas anaeróbias, principalmente bactérias produtoras de
pigmento negro (Conrads et a., 1997, Gomes et al., 2004).
A quantificação de endotoxinas antes do PQM foi significantemente maior no
grupo de pacientes sintomáticos do que o outro grupo. Níveis iniciais elevados de
endotoxinas em pacientes sintomáticos reforçam estudos anteriores correlacionando
o LPS com sintomatologia clínica (Marinho et al., 2014; Sousa et al., 2014; Cavalli et
al., 2017). O presente estudo contribui com este dado verificando diferenças
estatísticas maiores na presença de dor a percussão horizontal e vertical, à
palpação e sintomatologia espontânea no grupo que apresentou maiores níveis de
endotoxinas.
Ademais, no grupo sintomático a redução deste fator de virulência foi
estatisticamente significante após o PQM. Estes dados parecem apontar para a
87
eficácia do PQM com instrumentação reciprocante empregando limas Reciproc e
cloredixina gel 2% na preparação dos canais radiculares. Denotando similaridade
com estudo prévio que utilizou a mesma SQA (Marinho et al 2015; Duque et al.,
2019). Embora existam controvérsias na literatura a respeito da capacidade de
diferentes SQA eliminarem endotoxinas, vale ressaltar que em estudo prévio foi
demonstrada eliminação de LPS (96.27%) in vitro, através do uso de solução salina
estéril associada à instrumentação. Indicando assim a ação de fluxo e refluxo pelos
irrigantes e instrumentação como determinantes na redução de endotoxinas
(Marinho et al., 2014).
A literatura endodôntica apresenta carência em estudos que quantifiquem os
níveis de LTA, incluindo casos de infecções endodônticas primárias. O LTA
apresentou significativa diminuição o grupo assintomático após PQM, por outro lado
no grupo sintomático essa diferença somente aconteceu após a MIC. Embora
diferenças estatísticas ocorram entre momentos da terapia endodôntica,
percebemos elevados níveis de LTA remanescente no interior do canal radicular.
Hipoteticamente pode-se atribuir altas taxas remanescentes de LTA a sua
capacidade absortiva desempenhada sobre a hidroxiapatita demonstrada
anteriormente (Ciardi et al., 1977). Além de atualmente não haver conhecimento
sobre as posições arquitetônicas de poliglicerofosfatos na interferência da
resistência do LTA às forças mecânicas e/ou químicas na sua remoção, estas
poderiam suspostamente comportar-se semelhantemente às moléculas de LPS,
uma vez que estas apresentam a determinação da sua capacidade de virulência e
resistência à sua remoção de acordo com a posição destas estruturas (Carrof &
Karibian, 2003; Darveau et al., 2004).
Novos trabalhos devem ser realizados para investigar concomitantemente os
níveis de LPS e LTA em infecções primárias sintomáticas e assintomáticas nas
diferentes fases do tratamento endodôntico. Além disso, outras investigações devem
ser realizadas com um número maior de pacientes a fim de confirmar ou não as
associações bacterianas positivas entre espécies bacterinas que compõem a
microbiota de infecções primárias detectadas pelo presente trabalho.
88
7 CONCLUSÃO
Baseado nos resultados obtidos pode-se concluir que:
Enterococcus faecalis e Fusobacterium nucleatum foram as espécies
investigadas com maior prevalência em casos sintomáticos e assintomáticos nas
diferentes fases do tratamento endodôntico.
Endotoxinas estão presentes em maiores quantidades em pacientes
sintomáticos que assintomáticos, e estão correlacionas à presença de dor
espontânea nestes pacientes. Ácido lipoteicoico não apresentou correlação com
sinais e sintomas dos pacientes.
O preparo químico-mecânico empregando clorexidina gel 2% como
substância química auxiliar associada a instrumentação mecânica, é eficiente na
redução da carga microbiana e em casos de infecção primária.Os níveis de
endotoxinas são reduzidos em casos sintomáticos. Em contrapartida, este não foi
eficaz na redução dos níveis de ácido lipoteicoico em casos sintomáticos, mas sim
em casos assintomáticos.
A medicação intracanal a base de hidróxido de cálcio e clorexidina gel 2% é
eficaz na redução dos níveis de ácido lipoteicoico em casos sintomáticos e na
redução de endotoxinas em casos assintomáticos.
Enterococcus faecalis e Fusobacterium nucleatum, Enterococcus faecalis e
Parvimonas micra, Fusobacterium nucleatum e Gemella morbilorum, Fusobacterium
nucleatum e Treponema denticola, Prevotella tannerae e Treponema denticola,
Streptococcus sobrinus e Treponema denticola apresentaram altas porcentagens de
detecção em conjunto nos pacientes.
89
8 REFERÊNCIAS
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101
APÊNDICES
Apêndice 1 - Termo de Consentimento Livre e Esclarecido
102
103
104
105
Apêndice 2 - Quadros das Bactérias Detectadas pelo Nested-PCR em Casos Sintomáticos e Assintomáticos
Quadro 1. Espécies específicas detectadas pelo Nested-PCR nas diferentes fases do tratamento endodôntico em pacientes
sintomáticos.
CASO EXSUDATO ANTES DO PQM APÓS O PQM APÓS A MIC
1 Enterococcus faecalis
Fusobacterium nucleatum
Enterococcus faecalis
Fusobacterium nucleatum
Parvimonas micra
Porphyromonas endodontalis
Streptococcus sobrinus
Tannerella forsythia
Treponema denticola
Enterococcus faecalis
Fusobacterium nucleatum
Enterococcus faecalis
Fusobacterium nucleatum
2 Enterococcus faecalis
Fusobacterium nucleatum Enterococcus faecalis
Enterococcus faecalis
Fusobacterium nucleatum
Actinomyces naeslundii
Enterococcus faecalis
Fusobacterium nucleatum
3
Enterococcus faecalis
Fusobacterium nucleatum
Treponema denticola
Enterococcus faecalis
Fusobacterium nucleatum
Parvimonas micra
Porphyromonas endodontalis
Prevotella tannerae
Enterococcus faecalis Enterococcus faecalis
106
Quadro 1. Espécies específicas detectadas pelo Nested-PCR nas diferentes fases do tratamento endodôntico em pacientes
sintomáticos.
CASO EXSUDATO ANTES DO PQM APÓS O PQM APÓS A MIC
4
Actinomyces naeslundii
Agregatibacter
actinomycetemcomitans
Enterococcus faecalis
Fusobacterium nucleatum
Gemella morbilorum
Parvimonas micra
Porphyromonas endodontalis
Porphyromonas gingivallis
Prevotella intermedia
Prevotella nigrescens
Prevotella tannerae
Streptococcus sobrinus
Tannerella forsythia
Treponema denticola
Enterococcus faecalis
Fusobacterium nucleatum
Parvimonas micra
Porphyromonas endodontalis
Enterococcus faecalis Enterococcus faecalis
5
Dialister pneumosintes
Enterococcus faecalis
Fillifactor alocis
Fusobacterium nucleatum
Porphyromonas endodontalis
Prevotella tannerae
Treponema denticola
Enterococcus faecalis
Fusobacterium nucleatum
Enterococcus faecalis
Fusobacterium nucleatum
Enterococcus faecalis
Fusobacterium nucleatum
107
Quadro 1. Espécies específicas detectadas pelo Nested-PCR nas diferentes fases do tratamento endodôntico em pacientes
sintomáticos.
CASO EXSUDATO ANTES DO PQM APÓS O PQM APÓS A MIC
6
Enterococcus faecalis
Fusobacterium nucleatum
Porphyromonas endodontalis
Prevotella nigrescens
Prevotella tannerae
Streptococcus sobrinus
Tannerella forsythia
Treponema denticola
Enterococcus faecalis
Fusobacterium nucleatum
Enterococcus faecalis
Fusobacterium nucleatum
Enterococcus faecalis
Fillifactor alocis
Fusobacterium nucleatum
7
Enterococcus faecalis
Fusobacterium nucleatum
Prevotella tannerae
Streptococcus sobrinus
Treponema denticola
Enterococcus faecalis
Fusobacterium nucleatum
Streptococcus sobrinus
Enterococcus faecalis
Fillifactor alocis
Fusobacterium nucleatum
Actinomyces naeslundii
Dialister pneumosintes
Enterococcus faecalis
Fusobacterium nucleatum
8
Enterococcus faecalis
Fusobacterium nucleatum
Prevotella tannerae
Streptococcus sobrinus
Treponema denticola
Treponema denticola
Enterococcus faecalis
Fusobacterium nucleatum
Parvimonas micra
Enterococcus faecalis
Fusobacterium nucleatum
Actinomyces naeslundii
Enterococcus faecalis
Fusobacterium nucleatum
Parvimonas micra
108
Quadro 1. Espécies específicas detectadas pelo Nested-PCR nas diferentes fases do tratamento endodôntico em pacientes
sintomáticos.
CASO EXSUDATO ANTES DO PQM APÓS O PQM APÓS A MIC
9
Agregatibacter
actinomycetemcomitans
Dialister pneumosintes
Enterococcus faecalis
Fusobacterium nucleatum
Fusobacterium nucleatum
Gemella morbilorum
Parvimonas micra
Porphyromonas endodontalis
Porphyromonas gingivallis
Streptococcus sobrinus
Tannerella forsythia
Treponema denticola
Enterococcus faecalis
Parvimonas micra Enterococcus faecalis
Actinomyces naeslundii
Dialister pneumosintes
Enterococcus faecalis
Fillifactor alocis
Fusobacterium nucleatum
Gemella morbilorum
Porphyromonas
endodontalis
Porphyromonas gingivallis
Prevotella intermedia
Prevotella nigrescens
Prevotella tannerae
Streptococcus sobrinus
Tannerella forsythia
10
Enterococcus faecalis
Fusobacterium nucleatum
Streptococcus sobrinus
Treponema denticola
Enterococcus faecalis
Fillifactor alocis
Fusobacterium nucleatum
Parvimonas micra
Enterococcus faecalis
Fusobacterium nucleatum
Enterococcus faecalis
Fusobacterium nucleatum
109
Quadro 2. Espécies específicas detectadas pelo Nested-PCR nas diferentes fases do tratamento endodôntico em pacientes
assintomáticos.
CASO ANTES DO PQM APÓS O PQM APÓS A MIC
1
Enterococcus faecalis
Fusobacterium nucleatum
Tannerella forsythia
Treponema socrankii
Enterococcus faecalis Enterococcus faecalis
2
Enterococcus faecalis
Fusobacterium nucleatum
Parvimonas micra
Prevotella nigrescens
Prevotella tannerae
Tannerella forsythia
Enterococcus faecalis
Prevotella nigrescens
Enterococcus faecalis
Fusobacterium nucleatum
3
Enterococcus faecalis
Fusobacterium nucleatum
Tannerella forsythia
Treponema denticola
Enterococcus faecalis
Fusobacterium nucleatum Enterococcus faecalis
4
Enterococcus faecalis
Fillifactor alocis
Fusobacterium nucleatum
Parvimonas micra
Prevotella intermedia
Prevotella nigrescens
Treponema socrankii
Enterococcus faecalis
Gemella morbilorum
Treponema socrankii
Enterococcus faecalis
Fusobacterium nucleatum
110
Quadro 2. Espécies específicas detectadas pelo Nested-PCR nas diferentes fases do tratamento endodôntico em pacientes
assintomáticos.
CASO ANTES DO PQM APÓS O PQM APÓS A MIC
5
Enterococcus faecalis
Fusobacterium nucleatum
Parvimonas micra
Prevotella tannerae
Treponema denticola
Treponema socrankii
Enterococcus faecalis
Treponema denticola
Treponema socrankii
Enterococcus faecalis
Fusobacterium nucleatum
6
Enterococcus faecalis
Fusobacterium nucleatum
Prevotella nigrescens
Prevotella tannerae
Treponema socrankii
Enterococcus faecalis
Fusobacterium nucleatum
Treponema socrankii
Actinomyces naeslundii
Agregatibacter
actinomycetemcomitans
Dialister pneumosintes
Enterococcus faecalis
Treponema socrankii
7
Enterococcus faecalis
Fillifactor alocis
Fusobacterium nucleatum
Parvimonas micra
Prevotella nigrescens
Prevotella tannerae
Enterococcus faecalis
Enterococcus faecalis
Fusobacterium nucleatum
Parvimonas micra
8
Enterococcus faecalis
Prevotella nigrescens
Streptococcus sobrinus
Treponema denticola
Enterococcus faecalis
Fusobacterium nucleatum
Treponema denticola
Enterococcus faecalis
Treponema denticola
111
Quadro 2. Espécies específicas detectadas pelo Nested-PCR nas diferentes fases do tratamento endodôntico em pacientes
assintomáticos.
CASO ANTES DO PQM APÓS O PQM APÓS A MIC
9
Enterococcus faecalis
Fusobacterium nucleatum
Parvimonas micra
Prevotella nigrescens
Prevotella tannerae
Treponema denticola
Enterococcus faecalis
Fusobacterium nucleatum
Enterococcus faecalis
Parvimonas micra
10
Enterococcus faecalis
Fusobacterium nucleatum
Prevotella nigrescens
Streptococcus sobrinus
Enterococcus faecalis Enterococcus faecalis
112
ANEXOS
Anexo 1 - Verificação de Originalidade e Prevenção de Plágio
113
Anexo 2 - Certificado do Comitê de Ética em Pesquisa da FOP-UNICAMP
