UNIVERSIDADE DO VALE DO PARAÍBA INSTITUTO DE PESQUISA E DESENVOLVIMENTO

Vanessa dos Santos Silva

AVALIAÇÃO DA FREQUÊNCIA DE NECROSE E APOPTOSE CELULAR EM DOSES LASER E LED NA REGIÃO ESPECTRAL DO INFRAVERMELHO –

ESTUDO IN VITRO

São José dos Campos, SP.

2009

Vanessa dos Santos Silva

AVALIAÇÃO DA FREQUÊNCIA DE NECROSE E APOPTOSE CELULAR EM DOSES LASER E LED NA REGIÃO ESPECTRAL DO INFRAVERMELHO –

ESTUDO IN VITRO

Dissertação apresentada no Programa de Pós-graduação em Engenharia Biomédica, como complementação dos créditos necessários para obtenção do título de Mestre em Engenharia Biomédica.

Orientadoras: Profª. Drª. Renata Amadei Nicolau

Profª. Drª. Cristina Pacheco Soares

São José dos Campos, SP

2009

S584a

Silva, Vanessa dos SantosAvaliação da freqUência de necrose e apoptose celular em doses laser e LED na regÍãoespectral do infravermelho - estudo in vitra I Vanessa dos Santos Silva; Orientadores:Profa. Dra. Renata Amadei Nicolau, Profa. Dra. Cristina Pacheco $oares . * Sâo Jo6é dosCampos,2009.

1 disco laser: color

Dissertação apresentada ao Programa de Pós-Graduação em Engenharia Biomédica doInstituto de Pesquisa e Desenvolvimenb da Universidade Vale do Paraíba, 2009.

L Apoptose 2. Lasers 3.Diodos emissor de Luz 4. l. Nicolau, Renata Amadei, orient. llSoares, Cristina Pacheco, orient. lltTÍtulo

CDU:62:61

Autorizo exclusivamente para fins acadêmicos e científicos a reprodução total ou

parcial dessa tese, por processos fotocopiadores ou transrnissão eletrônica, desde

quê citadâ a fonte.

Assinatura do aluno:

Data: 11 de Dezembro de 2009

VANESSA DOS SANTOS SILVA

66AVALTAÇÃo oa nnreunNcrA DE NECRoSE E APoPToSE cELULAR EM DosEs

LASER E LED Na nrcrÃo EspECTRAL Do TNFRAvERMELHo - EsruDo rN vrfRo"

Dissertação aprovada como requisito parcial à obtenção do grau de Mestre em Engenharia

Biomédica, do Programa de Pós-Graduação em Engeúaria Biomédica, do Instituto de Pesquisa

e Desenrrolvimento da Universidade clo \/ale do Paraíba, São Jose dos Campos, SP, pela seguinte

bança examinadora:

Prof.

Prof.

Prof.

Prof.

Dra. JULIANA FERREIRA (UNIVAP) { t-t-0^a-

Dra. RENATA AMADEI NICOLAU ( AP)

DTa. CRISTINA PACHECO SOARES IVAP)

DTa. TATIANA DE: SOUSA DA CUNHA (UNIFESP)

Prof. Dra. SandraMana Fonseca da Costa

Diretor do IP&D - UniVap

São José dos Campos, 1l de dezembro de 2009.

AGRADECIMENTOS

A Deus que me deu forças durante toda esta caminhada e que sempre me guiou

através dos melhores caminhos;

Às minhas orientadoras, pessoas especiais com as quais tive o privilégio de

conviver, Dra. Renata Amadei Nicolau e Dra. Cristina Pacheco Soares por toda

dedicação, apoio, incentivo, confiança e carinho que sempre recebi de ambas. Sem

elas, nada seria possível.

Aos integrantes do Laboratório de Biologia Celular, que me apresentaram ao mundo

do “micro”, que sempre demonstraram paciência ao me ensinarem as rotinas do

laboratório, por toda amizade e espírito de equipe e cooperação.

Às colegas de pós-graduação Maira, Inglid e Elisângela pela amizade, bom humor e

pelos momentos compartilhados ao longo desta jornada.

À Ivone, Neusa, Vanessa e Valéria pela cordialidade com a qual sempre me

receberam.

À bibliotecária Rúbia por sua simpatia, dedicação e auxílio.

À CAPES pela bolsa de estudos que possibilitou a realização de todo este trabalho.

Agradecimento à empresa REIMERS & JANSSEN GmbH Alemanha, Medical –

Laser – Technology e ao Dr. Ernesto H.E.Nickel pela concessão do laser utilizado

no presente estudo (PHYSIOLASER Olympic).

"O poder nasce do querer. Sempre que o homem aplicar a veemência e perseverante energia de sua alma a um fim, vencerá os obstáculos, e, se não

atingir o alvo fará, pelo menos, coisas admiráveis."

Dale Carnegie

AVALIAÇÃO DA FREQUÊNCIA DE NECROSE E APOPTOSE CELULAR EM

DOSES LASER E LED NA REGIÃO ESPECTRAL DO INFRAVERMELHO –

ESTUDO IN VITRO

RESUMO

Necrose e apoptose podem ser desencadeados por estímulos diversos, sendo possível sua diferenciação e mensuração por alterações específicas ocorridas nos compartimentos celulares. Considerando que a radiação pode ser um agente iniciador destes processos, propusemos neste estudo, a avaliação de diversas doses laser e LED no infravermelho próximo quanto a frequência de indução de necrose e apoptose, uma vez que grau de indução ainda é controverso, não havendo doses definidas ou propostas para a constituição de uma janela terapêutica que possa ser empregada para a fototerapia de baixa potência. A linhagem celular CHO-K1 foi submetida à irradiação com laser (830 nm) e LED (945 ± 20 nm), ambos com potência de 24 mW, área de contato de 1 cm2, nas fluências de 10 a 50 J/cm². Em seguida as células foram coradas com solução contendo laranja de acridina e brometo de etídio, sendo então avaliadas através de microscopia de fluorescência, na qual foram diferenciadas células viáveis, apoptóticas e necróticas. Todas as medidas foram realizadas em triplicata, imediatamente e 24 horas após a irradiação. A frequência de necrose, avaliada imediatamente após a irradiação demonstrou-se significante principalmente para os grupos LED (40 e 50 J/cm²) em relação aos grupos irradiados com menores fluências (laser e LED 10 e 20 J/cm²). Após 24 horas, o grupo LED 40 J/cm² também foi superior significativamente em relação ao controle e doses inferiores (laser 10, 20 e 30 J/cm²; LED 10 e 20 J/cm²). A diminuição da frequência de apoptose ocorreu no grupo laser nas doses de 10, 40 e 50 J/cm² em relação ao grupo controle, sendo também notório após o emprego da irradiação LED com dose de 40 J/cm². Após 24 horas de irradiação, as células apresentaram frequência de apoptoses superiores ao grupo controle nas doses laser de 10 e 30 J/cm², sendo que no grupo irradiado por LED, as frequências permaneceram inferiores ao controle somente na densidade de energia de 40 J/cm². A radiação infravermelha coerente (laser) ou não coerente (LED) promoveu aumento freqüência de necrose celular em altas densidades de energia, caracterizando-se como terapia dose dependente com caráter inibitório.

Palavras-chave: Laser. LED. Morte celular.

EVALUATION OF LASER AND INFRARED LED DOSES ON THE FREQUENCY OF

CELLULAR NECROSIS AND APOPTOSIS – STUDY IN VITRO

ABSTRACT

Necrosis and apoptosis can be initiated by diverse stimulus. They can be differentiated by measuring specific alterations in the cellular compartments. Taking into consideration that the radiation can be an initiating agent of these processes, we propose, in this study, the evaluation of different doses of laser and infrared LED near the frequency induction of necrosis and apoptosis, once the degree of induction is still controversial and not having definite or proposed doses for the constitution of a therapeutic window that may be used in low-power phototherapy. Cell lineage CHO-K1 was submitted to 830 nm laser irradiation and 945 ± 20 nm LED with a 24 mW power for each group, contact area of 1 cm2 and fluency from 10 to 50 J/cm². Then, the cells were colored with a solution containing acridine orange and ethidium bromide and evaluated by fluorescence microscopy, differentiating apoptosis and necrosis viable cells. All measures were performed in triplicate and 24 hours immediately after irradiation. The frequency of necrosis, which was evaluated immediately after the irradiation, demonstrated significance for the LED groups (40 to 50 J/cm²) in relation to irradiated groups with less solubility (laser and LED 10 to 20 J/cm²). After 24 hours, the LED group 40 J/cm² was also significant in relation to the control and lower doses (laser 10, 20 and 30 J/cm²; LED 10 and 20 J/cm²). The decrease of apoptosis frequency occurred in the laser group with doses at 10, 40 and 50 J/cm² in relation to the control group. It was also observed the use of LED irradiation with a dose at 40 J/cm². After 24 hours of irradiation, the cells presented a higher apoptosis frequency in the control group with laser doses at 10 and 30 J/cm² while in the irradiated group by LED, a lower frequency was observed in the control and only for the energy density at 40 J/cm². The coherent infrared radiation (laser) or incoherent (LED) promoted a frequent increase of cell necrosis in a high energy density, characterized as a dose-dependent inhibition therapy.

Keywords: Laser. LED. Cell Death.

LISTA DE FIGURAS

Figura 1 – Diferenças morfológicas da apoptose e necrose ..........................................15

Figura 2 – Fotomicrografia de célula necrótica. A. Microscopia eletrônica de transmissão (EDINGER; THOMPSON, 2004). B. Microscopia de fluorescência. ......16

Figura 3 – Fotomicrografia de célula apoptótica. A. Microscopia eletrônica de transmissão (EDINGER; THOMPSON, 2004). B. Microscopia de fluorescência. ......18

Figura 4 – Estrutura do LED : diodo semicondutor (1), fio conector (2), refletor côncavo (3),lente (4), ânodo (5) e cátodo (6)....................................................................23

Figura 5 – Esquema de irradiação da placas (poços hachurados). ..............................29

Figura 6 – Esquema de irradiação dos poços com lamínula..........................................29

Figura 7 - Classificação morfológica das células: A – célula normal (cromatina organizada), B – célula apoptótica (cromatina altamente condensada ou fragmentada) e C – célula em necrose (cromatina organizada)....................................31

Figura 8 – Morfologia celular do grupo controle (células que não sofreram irradiação), com presença de células normais (cabeça de seta), células necróticas (seta) e células apoptóticas (asterisco). Fotomicrografia de fluorescência de células coradas por Brometo de Etídio e Laranja de Acridina. Aumento de 40x. ....................32

Figura 9 – Análise imediata da morfologia celular após irradiação das células com diferentes densidades de energia de Laser ou LED: A – 10 J/cm², B - 20 J/cm², C - 30 J/cm², D - 40 J/cm² e E - 50 J/cm². Fotomicrografia de fluorescência de células coradas por Brometo de Etídio e Laranja de Acridina. Aumento de 40x. Células normais (cabeça de seta), células necróticas (seta) e células apoptóticas (asterisco)...................................................................................................................................................33

Figura 10 – Freqüência de necrose (%) imediatamente após irradiação com laser ou LED com diferentes densidades de energia (10 J/cm², 20 J/cm², 30 J/cm², 40 J/cm² e 50 J/cm²). Linha pontilhada representa valor médio controle. Dados expressos em média e desvio padrão..........................................................................................................34

Figura 11 – Freqüência de apoptose (%) imediatamente após irradiação com laser ou LED com diferentes densidades de energia (10 J/cm², 20 J/cm², 30 J/cm², 40 J/cm² e 50 J/cm²). Linha pontilhada representa valor médio controle. Dados expressos em média e desvio padrão................................................................................36

Figura 12 – Análise da morfologia celular após 24 horas da irradiação com diferentes densidades de energia: A – 10 J/cm², B - 20 J/cm², C - 30 J/cm², D - 40 J/cm² e E - 50 J/cm². Fotomicrografia de fluorescência de células coradas por Brometo de Etídio e Laranja de Acridina. Aumento de 40x. Células normais (cabeça de seta), células necróticas (seta) e células apoptóticas (asterisco). .........................................................38

Figura 13 – Freqüência de necrose (%) 24 horas após irradiação com laser ou LED com diferentes densidades de energia (10 J/cm², 20 J/cm², 30 J/cm², 40 J/cm² e 50 J/cm²). Linha pontilhada representa valor médio controle. Dados expressos em média e desvio padrão..........................................................................................................39

Figura 14 – Freqüência de apoptose (%) 24 horas após irradiação com laser ou LED com diferentes densidades de energia (10 J/cm², 20 J/cm², 30 J/cm², 40 J/cm² e 50 J/cm²). Linha pontilhada representa valor médio controle. Dados expressos em média e desvio padrão..........................................................................................................40

LISTA DE TABELAS

Tabela 1 – Parâmetros de irradiação para o laser e o LED. ..........................................30

Tabela 2 – Freqüência de necrose (%) imediatamente após a irradiação com laser ou LED em relação ao grupo controle................................................................................35

Tabela 3 - Freqüência de apoptose (%) imediatamente após a irradiação com laser ou LED em relação ao grupo controle................................................................................36

Tabela 4 - Freqüência de necrose (%) avaliada 24horas após a irradiação com laser ou LED em relação ao grupo controle................................................................................40

Tabela 5 - Freqüência de apoptose (%) avaliada 24 horas após a irradiação com laser ou LED em relação ao grupo controle......................................................................41

LISTA DE ABREVIATURAS E SÍMBOLOS

Apaf-1 - Apoptotic Protease Activating Factor-1 (fator 1 ativador de proteases

apoptóticas)

ATP - Adenosina Trifosfato

Ca+ - Cálcio

cm - Centímetros

DNA - Ácido Desoxirribonucléico

EROS - Espécies reativas de oxigênio

GaAs - Arsenieto de Gálio

HAM - Mistura de nutrientes Ham’s (Ham's nutrient mixtures)

J/cm² - Joules por centímetro quadrado

LED - Light Emitting Diode (diodo emissor de luz)

mL - Mililitros

mm - Milímetros

mW - Miliwatts

NADH - Nicotinamida Adenina Dinucleotídeo

nm - Nanômetros

PBS - Solução Salina Tamponada (phosphate buffered saline)

RNA - Ácido Ribonucléico (ribonucleic acid)

rpm - Rotações por Minuto

UV - Ultra-Violeta

°C - Graus Celsius

µl - Microlitro

SUMÁRIO

1 INTRODUÇÃO.....................................................................................................................12 2 REVISÃO DE LITERATURA .............................................................................................14

2.1 Mecanismos de morte celular ...................................................................................14 2.1.1 Necrose ....................................................................................................................15 2.1.2 Apoptose..................................................................................................................16 2.1.3 O papel da mitocôndria nos processos de morte celular .........................................18

2.2 Laser .............................................................................................................................20 2.3 LEDs – DIODOS EMISSORES DE LUZ .................................................................22 2.4 Radiação Infravermelha .............................................................................................24

3 OBJETIVOS..........................................................................................................................26 4 MATERIAL E MÉTODOS...................................................................................................27

4.1 Linhagem celular .........................................................................................................27 4.2 Meio de Cultura ...........................................................................................................27 4.3 Crescimento e manutenção da cultura de Células ................................................27 4.4 Irradiação......................................................................................................................28 4.5 Microscopia de Fluorescência...................................................................................30

5 RESULTADOS .....................................................................................................................32 6 DISCUSSÃO.........................................................................................................................42 7 CONCLUSÃO.......................................................................................................................46 REFERÊNCIAS .......................................................................................................................47 APÊNDICE B – Análise Estatística da Necrose imediata grupos laser vs LED......................55 APÊNDICE C – Análise Estatística da apoptose imediata grupos laser vs LED.....................61 APÊNDICE D – Análise Estatística da Necrose 24h nos grupos laser vs LED.......................63 APÊNDICE E – Análise Estatística da apoptose 24h dos grupos laser vs LED. .....................69

12

1 INTRODUÇÃO

Com o controle cada vez mais rigoroso em relação ao uso de animais de

laboratório, há a necessidade de desenvolver e padronizar testes in vitro que

possam detectar a toxicidade de dispositivos para uso em seres humanos. Embora

os métodos in vitro não substituam os métodos in vivo, constituem uma etapa inicial

de uma investigação científica, apresentando vantagens em relação aos in vivo tais

como poder limitar o número de variáveis experimentais, obter dados significativos

mais facilmente além do período de teste ser, em muitos casos, mais curto. Além

disso, fornecem um montante significante de informações, e podem ser conduzidos

em condições controladas, sendo que os resultados obtidos no teste in vitro podem

ser indicativos para os efeitos observados in vivo (ROGERO et al., 2003; RIBEIRO;

MARQUES; SALVADORI, 2006).

Skinner, Gage e Wilce (1996) através de pesquisa utilizando aplicação de

laser GaAs pulsado, em diferentes densidades de energia, em culturas de

fibroblásticas de embriões humanos, observaram um aumento significativo nos

níveis de colágeno nas células irradiadas. Adicionalmente, ainda dentro da esfera de

estudos bioquímicos, outros autores indicaram um aumento em DNA e síntese ATP

in vitro (SKINNER; GAGE; WILCE, 1996; PUGLIESE et al., 2003).

Estudos sobre proliferação celular evidenciam cerca de 50% da radiação

infravermelha é absorvida por cromóforos mitocondriais, incluindo o citocromo c-

oxidase, considerado o fotorreceptor primário da célula (DESMET et al., 2006).

Karu (2003) relatou através de seus estudos que a radiação infravermelha

absorvida nas moléculas da cadeia respiratória das mitocôndrias (tais como o

citocromo c-oxidase), levam a um aumento do metabolismo celular. Segundo

Carnevalli et al. (2003), este aumento da produção de ATP mitocrondrial observado

após a irradiação induz reações que interferem no metabolismo celular, sendo que o

efeito biomodulatório da terapia laser de baixa potência ocorre através da ativação

da produção de ATP e aumento da mitose devido ao processo de excitação da

respiração celular e porfirinas endógenas.

Dinant et al. (2007) investigaram a indução de dano local em DNA em cultura

de células através da microscopia confocal utilizando laseres de diferentes

comprimentos de onda: 800 nm, 405 nm e 266 nm, e observaram uma ampla

13

resposta de mecanismos de reparo celulares e alteração da interação cinética entre

as proteínas.

Dentre os danos que podem ocorrer, é possível mencionar os mecanismos de

morte celular em dois principais tipos: necrose e apoptose, ambos desencadeados

por agressões intracelulares ou extracelulares. O processo de necrose ocorre

principalmente devido às perturbações externas e não fisiológicas, enquanto que o

processo de apoptose pode ocorrer através de via extrínseca (citoplasmática) ou

intrínseca, também denominada via mitocondrial (PAROLIN; REASON, 2001;

AMARANTE-MENDES, 2003; GRIVICICH; REGNER; ROCHA, 2007).

Sendo que os mecanismos de morte celular podem ser iniciados por diversos

estímulos diferentes, a radiação pode ser considerada um agente iniciador deste

processo. O grau de indução, no entanto, ainda é controverso, não havendo doses

definidas ou propostas para a constituição de uma janela terapêutica que possa ser

empregada para a fototerapia de baixa potência (laser e LED) (COOMBE et al.,

2001; MIRZAIE – JONIANI et al., 2002; SONEWENND; NICOLAU, 2007).

14

2 REVISÃO DE LITERATURA

2.1 Mecanismos de morte celular

O desenvolvimento e a manutenção dos organismos multicelulares dependem

de uma interação entre as células que o constituem. A perda irreversível das

atividades integradas da célula com consequente incapacidade de manutenção de

seus mecanismos de homeostasia é um fenômeno denominado morte celular

(FABRIS, 1992; GRIVICICH; REGNER; ROCHA, 2007).

Durante muito tempo, a morte celular foi considerada um processo passivo de

caráter degenerativo, que ocorre em situações de lesão celular, infecção e ausência

de fatores de crescimento, e que teria como conseqüência, alteração da integridade

da membrana plasmática, aumento do seu volume e perda das suas funções

metabólicas celulares. Entretanto, nem todos os eventos de morte celular são

processos passivos, pois os organismos multicelulares são capazes de induzir a

morte celular programada como resposta a estímulos intracelulares ou extracelulares

(GRIVICICH; REGNER; ROCHA, 2007).

A morte celular ocorre em decorrência a agressões a célula, que podem ser

nutricionais, genéticos, físicos, químicos ou biológicos. Essa injúria perturba o

equilíbrio homeostático e a célula pode reagir de diferentes modos, dependendo da

combinação entre o tempo, a dose e a intensidade de atuação do agente agressor

(FABRIS, 1992).

Necrose e apoptose, os principais processos de morte celular, são

desencadeados por estímulos diversos, sendo possível sua diferenciação, e

conseqüente mensuração, por alterações específicas ocorridas no nível dos

compartimentos celulares (SPENCER NETTO; FERRAZ, 2001; EDINGER;

THOMPSON, 2004).

O estudo dos mecanismos de morte programada ganhou importância em

muitos aspectos da biologia, incluindo estudos do desenvolvimento embrionário,

patogênese e a resposta à terapias celulares. A detecção da apoptose,

consequentemente, tornou-se crucial para esses estudos, variando desde

observações de alterações morfológicas que diferenciam as células apoptóticas de

15

necróticas até conhecimento dos fatores bioquímicos e genéticos que levam a este

processo (BARRETT et al., 2001).

A microscopia é uma das mais precisas e mais utilizadas ferramentas para

avaliação da morte celular, pois permite a identificação das características clássicas

através da morfologia celular (DOONAN; COTTER, 2008).

Figura 1 – Diferenças morfológicas da apoptose e necrose Fonte: Grivicich; Regner e Rocha, (2007).

2.1.1 Necrose

A necrose, geralmente mediada por estímulos externos agressivos e não

fisiológicos, é um tipo de morte na qual as células sofrem uma injúria que resulta,

morfologicamente, por aumento de volume citoplasmático e mitocondrial, que

resultam na perda abrupta da integridade da membrana plasmática (citólise) e à

16

alteração de seus gradientes eletroquímicos. Ocorre liberação do conteúdo

intracelular, este último, responsável pela resposta inflamatória deste processo

(BONINI; MOURA; FRANCO, 2000; PAROLIN; REASON, 2001; SPENCER NETTO;

FERRAZ, 2001; ANAZETTI; MELO, 2007).

Através da microscopia de fluorescência é possível observar, nas células que

sofreram necrose, alterações na morfologia nuclear (sem condensação da

cromatina) e formação de fragmentos de DNA (ácido desoxirribonucléico)

(DOONAN; COTTER, 2008).

Figura 2 – Fotomicrografia de célula necrótica. A. Microscopia eletrônica de transmissão (EDINGER; THOMPSON, 2004). B. Microscopia de fluorescência.

A necrose celular pode ocorrer devido à atuação de enzimas da própria célula

(autólise) ou em conseqüência à ação de enzimas extracelulares provenientes de

macrófagos e leucócitos que aportam ao local da morte celular (heterólise). Resulta

de uma alteração bioenergética que leva a depleção do ATP (adenosina trifosfato) a

níveis incompatíveis com a sobrevivência celular e pode ser desencadeada por

diversos fatores, tais como deficiências no aporte nutricional, respiratório ou

circulatório, ação de agentes físicos (calor, frio, radiações), agentes químicos

(substâncias tóxicas) ou agentes biológicos (FABRIS, 1992; ORTEGA-CAMARILLO

et al., 2001; EDINGER; THOMPSON, 2004).

2.1.2 Apoptose

A B

17

O termo apoptose ou “morte celular programada” foi inicialmente descrita em

1972 por Kerr, Wyllie e Currie para caracterizar um determinado aspecto morfológico

de morte celular, desta forma, métodos que avaliam características morfológicas

para determinação da presença de células apoptóticas ainda são amplamente

utilizadas para estudos (DOONAN; COTTER, 2008).

A apoptose é considerada um mecanismo essencial para a manutenção da

homeostase em organismos multicelulares. As cascatas de transdução de sinal que

ativam a apoptose estão presentes em todas as células e são mantidos em um

estado inativo em condições normais. O programa apoptótico pode ser ativado por

uma variedade de estímulos exógenos, tais como a ligação de moléculas a

receptores de membrana, ação de agentes quimioterápicos, radiação ionizante,

danos no DNA, choque térmico, deprivação de fatores de crescimento, baixa

quantidade de nutrientes e níveis aumentados de espécies reativas do oxigênio

(BARAK; GOLDKORN; MORSE, 2005; GRIVICICH; REGNER; ROCHA, 2007).

De um modo geral, a apoptose é um fenômeno no qual ocorre uma retração

da célula, que causa perda da aderência com a matriz extracelular e células

vizinhas. As organelas celulares mantêm a sua morfologia, com exceção, em alguns

casos, das mitocôndrias, que podem apresentar ruptura da membrana externa. A

cromatina sofre condensação e se concentra junto à membrana nuclear, que se

mantém intacta. Em seguida, a membrana celular forma prolongamentos (blebs) e o

núcleo se desintegra em fragmentos envoltos pela membrana nuclear e os

prolongamentos da membrana celular aumentam de número e tamanho e rompem,

originando estruturas contendo o conteúdo celular. É a formação destes corpos

apoptóticos que impedem o extravasamento de material citoplasmático para o meio

extracelular, não ocorrendo, portanto, resposta inflamatória (BONINI; MOURA;

FRANCO, 2000; GRIVICICH; REGNER; ROCHA, 2007).

Um dos aspectos que distingue a apoptose da necrose é a preservação da

integridade da membrana plasmática que evita a liberação dos constituintes

celulares para o meio extracelular (PAROLIN; REASON, 2001).

Desta forma, visto através de microscopia de fluorescência, é possível

observar os núcleos apoptóticos menores que os núcleos normais, com cromatina

condensada e fragmentação nuclear. Em seus estudos, Doonan e Cotter (2008)

concluíram que a caracterização da morte celular por apoptose é irrefutável quando

as características morfológicas são atendidas.

18

Figura 3 – Fotomicrografia de célula apoptótica. A. Microscopia eletrônica de transmissão (EDINGER; THOMPSON, 2004). B. Microscopia de fluorescência.

A ativação da apoptose pode ser iniciada de duas diferentes maneiras: pela

via extrínseca (citoplasmática) ou pela via intrínseca (mitocondrial), esta última,

desencadeada por “sinais de estresse” provenientes do interior da própria célula

(AMARANTE-MENDES, 2003; GRIVICICH; REGNER; ROCHA, 2007).

2.1.3 O papel da mitocôndria nos processos de morte celular

A mitocôndria, organela fundamental para manutenção das funções celulares

vitais, também desempenha um papel-chave nas vias de morte celular (BERNARDI

et al., 1999).

A mitocôndria participa da manutenção de funções celulares vitais, tais como

respiração celular e síntese de ATP, modulação do estado redox da célula,

regulação osmótica, controle do pH, homeostasia do cálcio no citosol e sinalização

intracelular. Paradoxalmente, a mitocôndria guarda no espaço intermembranoso

substâncias capazes de deflagrar o processo de morte celular, entre as quais figura

o citocromo-c (PAROLIN; REASON, 2001).

Os citocromos são proteínas transportadoras de elétrons que fazem parte da

membrana interna da mitocôndria, classificados em a, b e c segundo o espectro de

absorção que apresentam. Ao contrário dos outros citocromos, que são proteínas

A B

19

integradas, o citocromo-c é uma proteína periférica relativamente pequena

(MARZZOCO; TORRES, 1999).

O sinal apoptótico leva à liberação do citocromo-c, que quando liberado da

mitocôndria se associa a duas proteínas presentes no citosol — a apaf-1 (Fator 1

Ativador de Proteases Apoptóticas - Apoptotic Protease Activating Factor-1 ) e a pró-

caspase-9 ¾ e na presença de ATP, ativa a caspase-9. A caspase-9, por sua vez,

ativa as pró-caspases-3 e 7, que executam o processo de apoptose (LAWEN, 2003).

A presença da caspase-3, no entanto, marca o início da apoptose, uma vez que

trata-se de uma protease que atua como efetora da fragmentação celular. A

caspase-3 pode amplificar a cascata de proteólise pela ativação da caspase-8

(protease reguladora e iniciadora) e pela clivagem das proteínas anti-apoptóticas

que, normalmente, garantem a integridade da membrana mitocondrial (PAROLIN;

REASON, 2001).

As caspases hidrolisam ligações peptídicas específicas em proteínas-alvo,

que após hidrólise deste tipo de ligação contribuem para o processo de morte celular

por ganho ou perda de sua atividade (DEVLIN, 2007).

Outro fator a ser considerado mediante a atuação da mitocôndria no processo

de morte celular é a concentração de cálcio (Ca) presente no interior da célula. O

excesso de Ca no interior celular possui caráter tóxico, sendo associado a uma

consequente necrose devido a um desarranjo da integridade célula que decorre de

diferentes tipos de lesão (RIMESSI et al., 2008).

As mitocôndrias possuem poros de transição de permeabilidade mitocondrial,

que se abrem quando esta organela é exposta a altas concentrações de cálcio,

especialmente quando associada à depleção de nucleotídeos adenina estresse

oxidativo. As principais consequências da sua abertura são: o desacoplamento da

fosforilação oxidativa, a perda de íons e pequenas moléculas da matriz mitocondrial

e extenso aumento de volume da mitocôndria (HALESTRAP et al., 2000).

A abertura deste poro de permeabilidade causa, simultaneamente, ativação

das caspases (potencialmente levando à apoptose) e depleção de ATP

(potencialmente causando necrose). Dessa forma, a disputa entre a ativação das

caspases e a depleção de ATP irá orientar a morte celular, seja por apoptose, seja

por necrose (PAROLIN; REASON, 2001).

A disputa pode ser vencida pelas caspases quando estas são diretamente

ativadas pelos receptores da superfície celular e quando o poro de permeabilidade

20

se abre em apenas algumas mitocôndrias, permitindo que as demais sintetizem

ATP. Nestas circunstâncias, a célula entra no processo de apoptose. Por outro lado,

se o poro de permeabilidade é aberto rapidamente e a célula não pode obter energia

suficiente a partir da glicólise anaeróbia, a depleção do ATP impede que a apoptose

de instale (processo ativo que requer energia) e a célula morre por necrose

(PAROLIN; REASON, 2001).

2.2 Laser

Em 1917, Albert Einstein estabeleceu as bases teóricas do laser (Light

Amplification by Stimulated Emission of Radiation) no artigo Zur Quantentheorie der

Strahlung. Essa emissão posteriormente foi dividida em alta-potência (laseres com

potencial destrutivo) e baixa potência (sem potencial destrutivo) (ROCHA JÚNIOR et

al., 2007).

A luz laser pode ser definida como uma luz amplificada, produzida por

radiação eletromagnética que se manifesta como luz monocromática. Para se

produzida, a luz laser necessita de átomos, constituídos por um núcleo central, que

está carregado positivamente rodeado por elétrons negativamente carregados que

se movem em torno do núcleo em trajetórias circulares; neste movimento rotacional,

há emissão de energia, que é liberada sob a forma de emissão de partículas ou

pacotes de ondas luminosas denominadas fótons. Esse fenômeno recebe o nome

de emissão estimulada da luz (GENOVESE, 2000; ROCHA, 2004; ROCHA JÚNIOR

et al., 2007).

A resposta biológica inicial para a irradiação é a absorção da energia do fóton

pelo tecido-alvo. Cromóforos endógenos ou exógenos são os fotorreceptores

primários, sendo a absorção de energia pela água e moléculas biológicas pode ser

seguida de alterações fotoquímicas ou de temperatura teciduais (BRONDON;

STADLER; LANZAFAME, 2005).

A diferença entre os vários tipos de laser deve-se a seus respectivos

comprimentos de onda e parâmetros terapêuticos empregados, ou seja, fluência,

irradiância, forma de emissão contínua ou pulsada, entre outros (ROCHA JÚNIOR et

al., 2007).

21

De acordo com Fukuda, Malfatti (2008), dentre os aspectos mais relevantes, e

mais divergentes, na aplicação da terapia laser de baixa intensidade pode-se citar a

dose, definida como a quantidade de radiação oferecida ao tecido (Joules por

centímetro quadrado). Embora a dosimetria seja definida de acordo com o quadro

clínico apresentado pelo paciente, a maioria dos autores afirma que a energia a

depositar em um tecido por unidade de superfície deve situar-se entre 1 e 6 J/cm2.

Segundo Genovese (2000), neste intervalo de dosimetria é possível obter efeito

antiinflamatório, antiálgico, regenerativo e circulatório. Acredita-se que não se deve

ultrapassar uma densidade de energia de 12 J/cm2, sob risco de um efeito inibidor

(BRUGNERA; PINHEIRO, 1998).

Recentemente, a utilização da laserterapia de baixa potência vem ganhando

considerável reconhecimento e suas possíveis aplicações clínicas, como modalidade

terapêutica, em lesões de tecidos moles e mineralizados, têm sido amplamente

estudadas. Estudos in vitro e in vivo têm demonstrado que o tratamento com laser

altera positivamente as propriedades eletrofisiológicas do tecido irradiado,

acelerando reações bioquímicas, ativação fibroblástica, síntese de colágeno,

neovascularização, aumentando a atividade fagocitária de leucócitos e inibindo a

proliferação bacteriana em culturas celulares (COUTINHO et al., 2007; OLIVEIRA et

al., 2008).

Os efeitos da utilização do laser de baixa potência a níveis celulares e

moleculares têm sido demonstrados em vários estudos. A radiação laser afeta a

cadeia respiratória da mitocôndria devido à mudança de potencial elétrico das

membranas celulares e, consequentemente, sua permeabilidade seletiva para íons

sódio, potássio e cálcio, ou devido ao aumento da atividade de certas enzimas como

citocromo-c oxidase e ATP (KOUTNÁ; JANISCH; VESELSKÁ, 2003).

A luz absorvida por cromóforos produz efeitos fotofísicos e fotoquímicos, que

juntos ou isolados, aumentam a estimulação celular ao nível da membrana

mitocondrial, acarretando um aumento do potencial de membrana e gradiente iônico.

Essas alterações resultam em alta atividade de NADH (nicotinamida adenina

dinucleotídeo), que resulta no aumento da produção de ATP, RNA (ácido

ribonucléico) e síntese de protéica da mitocôndria (WERNECK et al., 2005).

22

2.3 LEDs – DIODOS EMISSORES DE LUZ

Embora o fenômeno da eletroluminescência tenha sido descoberto por Henry

Round em 1907, a geração de luz através do mecanismo LED (diodos emissores de

luz) foi descoberta por Oleg Vladimirovich Losev. Em meados de 1920, Losev

observou inicialmente a emissão de luz através do óxido de zinco e diodos de cristal

de carboneto de silício utilizando receptores de rádio quando a corrente passava

sobre eles. Seu primeiro artigo sobre diodos emissores de carboneto de silício foi

publicado em 1927, mas somente em 1929 publicou detalhadamente seus

resultados com espectro LED, quando estabeleceu a corrente limiar para emissão de

luz através de um ponto de contato entre um arame metálico e um cristal de

carboneto de silício, e registrou o espectro da luz. Em seus 16 artigos publicados

entre 1924 e 1930 forneceu um estudo abrangente sobre o LED e delineou as suas

aplicações. Seguiram-se depois disso, 43 publicações em jornais de pesquisa

britânicos, russos e alemães, além de 16 patentes (ZHELUDEV, 2007; ALBEANU et

al., 2008).

Losev utilizou a teoria quântica de Einstein para explicar a ação do LED, e

denominou esse processo de emissão de “efeito fotoelétrico inverso” (ZHELUDEV,

2007).

Os LEDs são pequenos dispositivos que emitem uma banda estreita da

radiação eletromagnética nos limites do UV aos comprimentos de onda visíveis e

infravermelhos, gerados através de um semicondutor. Quando a corrente é

alimentada por um semicondutor (geralmente de cristal siliconado), elétrons livres

são gerados, mas também uma fenda, formada quando um átomo lança um elétron

de sua camada. Este átomo pode roubar outro elétron para sua camada, que por

sua vez pode roubar um elétron da camada seguinte. As fendas movem-se pelo

cristal na direção oposta aos elétrons. Se um elétron choca-se com uma fenda, é

gerada recombinação energética, que é entregue diretamente sob a forma de um

fóton (PONTINEN, 1992; DOVER; ARNDT; HILL, 2003).

Fisicamente os LEDs são configurados em pequenos chips ou unidos a

pequenas lâmpadas (normalmente 3-5 mm no diâmetro). Uma vez unidos, LEDs

geram luz de potência baixa, na ordem de milliwatt. Para aplicações médicas, muitos

LEDs podem ser colocados em conjunto para gerar coletivamente densidades altas

23

de energia, embora realizado à custa da vida operacional reduzida. O poder e as

necessidades de manutenção são mínimos, e uma lâmpada típica pode ter uma vida

de trabalho de não menos que 100000 horas (DOVER; ARNDT; HILL, 2003).

Figura 4 – Estrutura do LED: diodo semicondutor (1), fio conector (2), refletor côncavo (3), lente (4), ânodo (5) e cátodo (6) FONTE: Gorelik et al. (2008).

O mecanismo da ação de LEDs na terapia não-ablativa não é inteiramente

elucidado devido à novidade da aplicação. Contudo, a utilização do LED representa

uma recente e não-invasiva intervenção terapêutica para o tratamento de feridas,

infecções e isquemias (DOVER; ARNDT; HILL, 2003; QUEIROZ et al., 2008).

Investigações preliminares do mecanismo sugerem que LEDs possam instigar

a regulação fibroblástica e remodelamento colágeno. Os achados de pesquisa

permanecem especulativos, mas uma característica promissora de LEDs comparado

com os laseres é que os efeitos no tecido são realizados sem preceder o dano

térmico ou eritema visível e edema (DOVER; ARNDT; HILL, 2003).

Atualmente os LEDs estão sendo introduzidos comercialmente como uma

alternativa para as terapias que utilizam laser de baixa potência, embora apresentem

ausência de coerência e uma banda maior de comprimento de onda, quando

comparados a laseres. Estas diferenças ópticas podem não representar ausência de

efeito biológico quando empregada terapia com LED, pois a coerência da luz é

perdida nos primeiros extratos teciduais e as respostas biológicas são determinadas

24

pela absorção dos fótons pelos tecidos, independentemente de sua fonte de

emissão (RIGAU, 1996; QUEIROZ et al., 2008).

Segundo Karu (2003) tanto a luz coerente quanto a não coerente possuem a

capacidade de produzir mesma resposta biológica em tecidos, desde que estejam

ajustados nos mesmos parâmetros (comprimento de onda, dosagem e intensidade).

2.4 Radiação Infravermelha O comprimento de onda é uma das características mais importantes na

terapia laser de baixa potência, uma vez que determina quais fotorreceptores

celulares irão interagir. A região espectral do infravermelho é dividida de acordo com

o comprimento de onda em sub-regiões denominadas infravermelho próximo (800-

1500 nm), médio (1500-5600 nm) e longo (5600-10000 nm). A profundidade de

penetração na pele e tecidos subcutâneos apresentam caráter crescente com o

aumento do comprimento de onda. Comprimentos de onda curtos, como no

infravermelho próximo, atingem o tecido subcutâneo sem aumentar acentuadamente

a temperatura superficial da pele, enquanto no infravermelho longo a radiação é

totalmente absorvida nas camadas epidérmica, provocando aumento da

temperatura, este fato se deve pela alta absorção destes comprimentos de onda

pela água presente nos tecidos (SCHIEKE; SCHROEDER; KRUTMANN, 2003;

ARRUDA et al., 2007).

A radiação infravermelha apresenta um grande poder de penetração nos

tecidos, embora nessa essa região do espectro eletromagnético ela não seja mais

visível, possuindo menor energia, mas grande capacidade de gerar efeitos térmicos.

Os componentes dos tecidos biológicos têm a capacidade de absorver a energia

luminosa transformando-a em energia útil para a célula principalmente em situações

de estresse celular, sendo cromóforos mitocondriais os componentes de absorção

da radiação infravermelha (KARU, 1999; RIGAU, 1996; KOUTNÁ; JANISCH;

VESELSKÁ, 2003).

Thawer e Houghton (1999) realizaram uma pesquisa com radiação

infravermelha em membros de ratos em estágio de formação mantidos in vitro. Ao

14º dia, quando os dedos estavam em fase de separação nos membros dianteiros, e

25

em desenvolvimentos nos membros traseiros, os animais foram eutanasiados e os

membros mantidos em sistemas orgânicos de cultura para crescimento. Estes foram

irradiados diariamente por 60 segundos com laser de GaAs (904 nm), durante um

período de 3 a 5 dias. Resultados demonstraram que a radiação com baixa

densidade de energia de 0,23 J/cm2 e 1,37 J/cm2 afetaram, de forma

significativamente inibitória, o crescimento e desenvolvimento dos membros fetais

em sistemas de cultura orgânica, pois constatou-se nos mesmos o aumento do

número de células dérmicas e espessura de fibras colágenas.

Segundo Schieke, Schroeder e Krutmann (2003) a radiação infravermelha

(760 nm), em torno de 75 J/cm2, devido a mecanismos moleculares ainda

desconhecidos, parece estar envolvida em fotoenvelhecimento e, potencialmente,

também em processos de fotocarcinogênese. No entanto, em contraste com efeitos

potencialmente prejudiciais, a radiação infravermelha também poderia ter efeitos

benéficos na pele humana, conferindo-lhe proteção contra a citotoxicidade induzida

pela radiação.

Mendez et al. (2004) observou a influência da dose e comprimento de onda

no reparo tecidual em feridas cutâneas de ratos com radiação laser 830 nm e 685

nm, em doses de 20J/cm² e 50 J/cm². Os resultados obtidos evidenciaram que os

grupos irradiados com o laser infravermelho, na dose 50 J/cm² apresentou aumento

significativo na produção de colágeno quando comparado com o grupo controle e ao

grupo irradiado com 20 J/cm².

26

3 OBJETIVOS

O presente estudo tem como objetivo avaliar a frequência de apoptose e

necrose após diferentes doses de laser e LED operando na região espectral do

infravermelho próximo em cultura celular.

27

4 MATERIAL E MÉTODOS

4.1 Linhagem celular

A linhagem celular utilizada para realização dos experimentos foi de CHO -K1

(ovário de hamster chinês) gentilmente cedida pela Profa. Dra. Ilce Mara de Syllos

Cólus.

4.2 Meio de Cultura

As células foram mantidas em meio HAM F-12, para uso das células o meio

foi suplementado com 10% de soro fetal bovino mediante ausência de antibiótico.

4.3 Crescimento e manutenção da cultura de Células

Para propagação das células, as mesmas foram incubadas por 3 minutos com

2 mL de tripsina a 0,005%, o conteúdo das células em suspensão foi retirado e

distribuído em garrafas de cultura de 25 cm2 e adicionado meio HAM F-12 com 10%

de soro fetal bovino afim de completar 3 mL. As garrafas foram incubadas em estufa

com controle automático de temperatura 37ºC e pressão 95% de O2 e CO2 à 5%

(CARNEVALLI et al.,2003).

O crescimento celular foi devidamente acompanhado por meio de observação

em microscópio invertido Olympus CK4. As células foram cultivadas e quando da

formação de uma monocamada confluente realizou-se a tripsinização.

Para realização da tripsinização e plaqueamento celular foi removido o meio

das garrafas, e as células foram lavadas com PBS (3 mL) e receberam adição

tripsina (2 mL) até cobrir as células. A seguir foi acrescentado meio de cultura para

desprender as células. A suspensão celular foi transferida para tubo de 15 mL, o

28

qual foi centrifugado (FANEM Baby1) por 5 min com velocidade de 2500 rpm. Após

sedimentação foi desprezado o sobrenadante, sem agitar as células. Foi colocado 1

mL de meio de cultura no tubo de 15 mL e realizada a ressuspensão do sedimento.

Em um eppendorf contendo 90 µL de azul de Trypan foram adicionados 10 µL de

células com meio. As células foram homogeneizadas e contadas em câmara de

Neubauer. Foram adicionadas 5 x 105 células por poço em placas de cultura de 24

poços (TPP®) contendo lamínula estéreis. O volume total de células e meio de

cultura por poço totalizavam 200 µL por poço. Todas as células permaneceram

cerca de 18 horas para aderência nas lamínulas, após este período foi efetuada a

irradiação.

4.4 Irradiação

O laser (830 nm, RJ-laser Alemanha, PHYSIOLASER Olympic) e o LED (945

± 20 nm, protótipo) empregados no estudo, foram submetidos à medida de potência

média (Melles Griot-Broadband Power / Energy - Meter 13PE M001), previamente

aos experimentos. Antes do procedimento de irradiação das células, foram

realizados testes de transmissão da radiação (laser e LED) através da placa acrílica

contendo uma lamínula de vidro, utilizando diferentes quantidades de meio de

cultura. Foram realizadas medidas em triplicata com acrílico e lamínula, e em

seguida acrescentando-se a cada mensuração 50 µL de meio de cultura, visando

verificar qual o volume poderia ser utilizado sem interferência nas doses

experimentais. Considerando que o acrílico das placas e a lamínula filtram 20% da

radiação, e que o meio HAM-F12 podem alterar a potência a partir de 300 µL,

empregou-se uma potência de saída de 30 mW dos equipamentos (24 mW de

potência transmitida para o meio) e 200 µL de meio de cultura.

As células foram irradiadas em poços alternados para que a dose utilizada

não tivesse interferência sobre outros poços (Figura 6 e 7).

29

Figura 5 – Esquema de irradiação da placas (poços hachurados).

A irradiação foi feita através de contato direto com a porção inferior dos poços

(figura 7),

1,862cm² / Área de contato = 1cm² Placa 24 poços

Figura 6 – Esquema de irradiação dos poços com lamínula.

As culturas inicialmente irradiadas ao abrigo de luz, em triplicata, com laser e

com LED, ambos com potência de 24 mW (0,024 W), área de contato de 1 cm2, raio

de 0,5 cm, frequência de 150.000 Hz para o laser (BAHR: 3) e contínua para o LED,

densidade de potência de 0,024 W/cm2. Foram empregadas diferentes densidades

de energia (potência x tempo / área), energias (potência x tempo) e tempos

experimentais (tabela 1).

lamínula

Potência saída = 30 mW

Potência transmitida = 24 mW

30

Tabela 1 – Parâmetros de irradiação para o laser e o LED.

Densidade de Energia (J/cm²)

Energia (J)

Tempo (segundos)

10 7,20 300 20 15,84 660 30 43,20 960 40 29,52 1230 50 38,88 1620

Cada dose foi analisada em triplicata imediatamente e 24 horas após a

irradiação.

4.5 Microscopia de Fluorescência

Para a microscopia de fluorescência foram empregados os corantes de

laranja de acridine e brometo de etídio. Os corantes laranja de acridina e brometo

de etídio, utilizados na proporção 1:1, são capazes de diferenciar morfologicamente

necrose de apoptose celular. O laranja de acridina ao se intercalar com o DNA

produz a coloração verde e o brometo de etídio penetra somente nas células mortas,

corando-as de vermelho (McGAHON et al., 1995; POERSCH et al., 2007).

Neste experimento foi acrescentado 1 µL de solução laranja de acridina /

brometo de etídio, em 25 µL por poço. Imediatamente após a coloração, a lamínula

era retirada e colocada sobre lâmina para análise por meio de microscopia de

fluorescência. Para análise foi utilizado o filtro de excitação em aproximadamente

560 nm e emissão 590 nm do microscópio de fluorescência (Leica). As lâminas

foram fotografadas em objetiva 40x com sistema fotográfico Leica MPS-30 (JEON et

al., 2002; RIBBLE et al., 2005).

Foram contabilizadas 100 células por lamínula, sendo estas consideradas

normais quando coradas em verde, em apoptose quando coradas em alaranjado e

em necrose quando coradas em vermelho (figura 7).

31

A B C

Figura 7 - Classificação morfológica das células: A – célula normal (cromatina organizada), B – célula apoptótica (cromatina altamente condensada ou fragmentada) e C – célula em necrose (cromatina organizada).

O cálculo para a determinação da porcentagem de células em apoptose e

necrose foi realizado conforme a seguir:

Frequência de células em apoptose (%) = n° total de células em apoptose x 100

n° de células contadas

Frequência de células em apoptose (%) = n° total de células em necrose x 100

n° de células contadas

A B C

32

5 RESULTADOS A morfologia do grupo controle, utilizada como parâmetro de comparação

para com os grupos laser e LED, está demonstrada na figura 8.

Figura 8 – Morfologia celular do grupo controle (células que não sofreram irradiação), com presença de células normais (cabeça de seta), células necróticas (seta) e células apoptóticas (asterisco). Fotomicrografia de fluorescência de células coradas por Brometo de Etídio e Laranja de Acridina. Aumento de 40x.

Observou-se cromatina organizada, integridade de membrana, presença de

pequena freqüência de células necróticas (14,3%) e apoptóticas (12,3%).

Freqüência de necrose e apoptose imediatamente após irradiação

As diferentes respostas celulares, relacionadas aos mecanismos de morte

induzidos imediatamente após a irradiação infravermelha, podem ser observadas na

figura 9.

*

*

33

Figura 9 – Análise imediata da morfologia celular após irradiação das células com diferentes densidades de energia de Laser ou LED: A – 10 J/cm², B - 20 J/cm², C - 30 J/cm², D - 40 J/cm² e E - 50 J/cm². Fotomicrografia de fluorescência de células coradas por Brometo de Etídio e Laranja de Acridina. Aumento de 40x. Células normais (cabeça de seta), células necróticas (seta) e células apoptóticas (asterisco).

**

34

Necrose

A frequência de células em necrose, com análise imediata após a irradiação,

manteve-se menor que o grupo controle nas doses 10 J/cm² e 20 J/cm², sendo que,

doses mais altas acarretaram índices crescentes de células necróticas. A necrose,

no entanto, ocorreu mais expressivamente nas células irradiadas por LED (Apêndice

A, figura 10).

0

20

40

60

80

100

120

10 20 30 40 50Densidade de Energia (J/cm2)

Freq

uênc

ia d

e N

ecro

se (

Laser LED

Figura 10 – Freqüência de necrose (%) imediatamente após irradiação com laser ou LED com diferentes densidades de energia (10 J/cm², 20 J/cm², 30 J/cm², 40 J/cm² e 50 J/cm²). Linha pontilhada representa valor médio controle. Dados expressos em média e desvio padrão.

Na análise intergrupos observou-se diferença significativa (p<0,05) entre os

grupos controle vs LED e laser vs LED (tabela 2).

%

35

Tabela 2 – Freqüência de necrose (%) imediatamente após a irradiação com laser ou LED em relação ao grupo controle.

Frequência de Necrose Imediata DE(J/cm²)

Controle Laser LED p

10 14,3 ± 6,5 vs 5,0 ± 4,0 vs 5,0± 4,5 ns

20 14,3 ± 6,5 vs 5,3 ± 4,9 vs 4,0 ± 2,6 ns

30 14,3 ± 6,5 vs 28,0 ± 21,3 vs 66,0 ±51,2 ns

40 14,3 ± 6,5 vs 10,6 ± 9,0 vs 85,6± 24,8 a,b

50 14,3 ± 6,5 vs 56,3 ± 19,5 vs 84,0± 27,7 a

p<0,05: a - Controle vs LED; b- Laser vs LED. ns – não significante.

A frequência de necrose, avaliada imediatamente após a irradiação, foi

estatisticamente significante (p<0,05) para o grupo LED 40 J/cm² em relação aos

grupos controle e laser 40 J/cm². O grupo LED 50 J/cm² foi significativamente

(p<0,05) superior em relação ao grupo controle e laser 40 J/cm² (tabela 2).

A frequência de necrose, avaliada imediatamente após a irradiação, foi

estatisticamente muito significante (p<0,01) para o grupo LED 40 J/cm² em relação

aos grupos laser 10 J/cm², laser 20 J/cm², LED 10 J/cm² e LED 20 J/cm². O grupo

LED 50 J/cm² apresentou diferença muito significante (p<0,01) em relação aos

grupos laser 10 J/cm², laser 20 J/cm², LED 10 J/cm² e LED 20 J/cm² (tabela 2,

Apêndice B).

Apoptose

Os resultados obtidos demonstram que nas células analisadas

imediatamente, ocorreu uma diminuição expressiva da frequência de apoptose no

grupo laser nas doses de 10, 40 e 50 J/cm² em relação ao grupo controle. A redução

da freqüência de apoptose foi notória após o emprego da irradiação LED com dose

de 40 J/cm². Observou-se que a irradiação com LED, na dose de 30 J/cm², eleva

36

expressivamente a freqüência de apoptose em relação aos demais grupos (figura

11, tabela 3, Apêndice C).

0

20

40

60

80

100

10 20 30 40 50Densidade de Energia (J/cm2)

Freq

uênc

ia d

e A

popt

ose

Laser LED

Figura 11 – Freqüência de apoptose (%) imediatamente após irradiação com laser ou LED com diferentes densidades de energia (10 J/cm², 20 J/cm², 30 J/cm², 40 J/cm² e 50 J/cm²). Linha pontilhada representa valor médio controle. Dados expressos em média e desvio padrão. Tabela 3 - Freqüência de apoptose (%) imediatamente após a irradiação com laser ou LED em relação ao grupo controle.

Frequência de Apoptose Imediata DE(J/cm²)

Controle Laser LED p

10 12,3 ± 5,8 vs 6,0 ± 6,9 vs 11,6 ± 8,0 ns

20 12,3 ± 5,8 vs 11,0 ± 9,1 vs 12,0 ± 4,3 ns

30 12,3 ± 5,8 vs 9,0 ± 6,5 vs 29,0 ± 42,6 ns

40 12,3 ± 5,8 vs 3,3 ± 2,0 vs 2,0 ± 3,4 ns

50 12,3 ± 5,8 vs 1,3 ± 1,5 vs 9,3 ± 16,1 ns

p<0,05: a - Controle vs LED; b- Laser vs LED. ns – não significante.

%

37

Freqüência de necrose e apoptose 24 horas após irradiação

A morfologia das células após 24 horas da irradiação com laser e LED

infravermelho podem ser observadas na figura 10.

38

Figura 12 – Análise da morfologia celular após 24 horas da irradiação com diferentes densidades de energia: A – 10 J/cm², B - 20 J/cm², C - 30 J/cm², D - 40 J/cm² e E - 50 J/cm². Fotomicrografia de fluorescência de células coradas por Brometo de Etídio e Laranja de Acridina. Aumento de 40x. Células normais (cabeça de seta), células necróticas (seta) e células apoptóticas (asterisco).

*

*

39

Necrose

A freqüência de necrose após 24 horas da irradiação permaneceu superior no

grupo LED, a partir de 20 J/cm², em relação ao grupo controle, sendo esta

superioridade significante quando 40 J/cm² (p<0,05). Os grupos irradiados com

laser a partir de 40 J/cm² apresentaram freqüência de necrose expressivamente

superior ao grupo controle (figura 12, tabela 4, Apêndice D).

0

20

40

60

80

100

120

10 20 30 40 50Densidade de Energia (J/cm2)

Freq

uênc

ia d

e N

ecro

se (

Laser LED

Figura 13 – Freqüência de necrose (%) 24 horas após irradiação com laser ou LED com diferentes densidades de energia (10 J/cm², 20 J/cm², 30 J/cm², 40 J/cm² e 50 J/cm²). Linha pontilhada representa valor médio controle. Dados expressos em média e desvio padrão.

A frequência média de ocorrência de necrose após 24horas da irradiação, foi

estatisticamente significante (p<0,05) para o grupo LED 40 J/cm² em relação ao

controle e aos grupos laser 20 J/cm², laser 30 J/cm² e LED 20 J/cm², sendo

estatisticamente muito significante (p<0,01) no grupo LED 40 J/cm² em relação ao

grupo laser 10 J/cm², ao laser 30 J/cm² e ao grupo e LED 10 J/cm². O grupo laser 50

J/cm² foi estaticamente significante em relação ao grupo laser 10 J/cm², laser 30

J/cm² e LED 10 J/cm² (Apêndice C).

%

40

Tabela 4 - Freqüência de necrose (%) avaliada 24horas após a irradiação com laser ou LED em relação ao grupo controle.

Frequência de Necrose – 24 horas DE(J/cm²)

Controle Laser LED p

10 14,3 ± 6,5 vs 5,6 ± 6,6 vs 3,0 ± 1,7 ns

20 14,3 ± 6,5 vs 10,3 ± 5,5 vs 17,3 ± 17,9 ns

30 14,3 ± 6,5 vs 7,0 ± 6,0 vs 28,3 ± 8,5 ns

40 14,3 ± 6,5 vs 48,0 ± 27,8 vs 80,3 ± 34,0 a

50 14,3 ± 6,5 vs 68,3 ± 12,0 vs 51,6 ± 44,4 ns

p<0,05: a - Controle vs LED; b- Laser vs LED. ns – não significante.

Apoptose

Após 24 horas de irradiação, as células apresentaram frequência de

apoptoses superiores ao grupo controle nas doses laser de 10 J/cm² e 30 J/cm²,

sendo que no grupo irradiado por LED, as frequências permaneceram inferiores ao

controle somente na densidade de energia de 40J/cm². Os resultados não foram

considerados estatisticamente significativos (Apêndice E).

0

20

40

60

80

100

10 20 30 40 50Densidade de Energia (J/cm2)

Freq

uênc

ia d

e A

popt

ose

Laser LED

Figura 14 – Freqüência de apoptose (%) 24 horas após irradiação com laser ou LED com diferentes densidades de energia (10 J/cm², 20 J/cm², 30 J/cm², 40 J/cm² e 50 J/cm²). Linha pontilhada representa valor médio controle. Dados expressos em média e desvio padrão.

%

41

Tabela 5 - Freqüência de apoptose (%) avaliada 24 horas após a irradiação com laser ou LED em relação ao grupo controle.

Frequência de Apoptose – 24 horas DE(J/cm²)

Controle Laser LED p

10 12,3 ± 5,8 vs 20,0 ± 1,0 vs 13,6 ± 9,4 ns

20 12,3 ± 5,8 vs 9,0 ± 15,5 vs 18,0 ± 14,1 ns

30 12,3 ± 5,8 vs 20,0± 6,9 vs 13,0 ± 3,6 ns

40 12,3 ± 5,8 vs 1,6 ± 2,0 vs 9,6 ± 16,7 ns

50 12,3 ± 5,8 vs 1,3 ± 1,5 vs 42,3 ± 47,6 ns

p<0,05: a - Controle vs LED; b- Laser vs LED. ns – não significante.

42

6 DISCUSSÃO A linhagem CHO-K1 tem sido utilizada em diversas pesquisas relacionadas à

fototerapia de baixa potência, sendo os fibroblastos células amplamente utilizadas

neste tipo de estudo, pois os efeitos obtidos podem ser considerados relevantes em

diversas patologias (KIMURA et al, 1997; AL-WATBAN; ANDRES, 2000; OEHRING

et al., 2000; CARNEVALLI et al., 2003; PAZOS et al., 2003). A microscopia de

fluorescência é comumente empregada no estudo de culturas de fibroblastos. É um

método que permite a classificação quanto à morfologia celular, podendo ser

utilizado de maneira eficaz para detecção e diferenciação entre necrose e apoptose

celular (HALESTRAP et al., 2000 DOONAN; COTTER, 2008). Estes processos de

morte celular podem ser evidenciados morfologicamente através de corantes

fluorescentes que se intercalem ao DNA, tais como o laranja de acridina e brometo

de etídio (JEON et al., 2002). A distinção de células em necrose ou apoptose pode

ser realizada visto que o laranja de acridina penetra em células vivas intercalando-se

ao DNA, corando a célula de verde, enquanto o brometo de etídio penetra apenas

em células que possuam alteração de membrana (RENVOIZÉ et al., 1998;

KOSMIDER et al., 2004; TAKAHASHI et al., 2004).

Estudos demonstram que a fototerapia de baixa potência promove efeitos

significativos sobre a proliferação de macrófagos, fibroblastos, osteoblastos,

linfócitos, células endoteliais e queranócitos, além de influenciar na respiração

celular, síntese de ATP (AL-WATBAN; ANDRES, 2000; DESMET et al., 2006).

Observou-se neste estudo que as células irradiadas com laser, em todas as doses,

apresentaram indícios de proliferação celular superior às irradiadas com LED. Assim,

a grande variação nos resultados estatísticos obtidos após 24 horas pode ter

ocorrido devido ao aumento da mitose nas células viáveis.

A energia absorvida pelas células in vitro, no entanto, é limitada ao meio de

cultura, podendo assim, ocorrerem danos celulares e moleculares caso sejam

ultrapassadas doses-limite, embora este limite ainda não seja bem definido

(MIRZAIE – JONIANI et al., 2002; HOURELD; ABRAHAMSE, 2007).

Segundo Genovese (2000) a faixa de comprimento de onda na qual a

estimulação celular é máxima encontra-se entre 620 e 830 nm, sendo que a

43

aplicação tradicional da fotobiomodulação em modelos experimentais e clínicos

baseia-se na observação de que os efeitos biomodulatórios são geralmente

observados entre as densidades de energia de 1 e 10 J/cm² (BRONDON; STADLER;

LANZAFAME, 2005). Brugnera e Pinheiro (1998) acreditam que a partir de 12 J/cm²

a fototerapia de baixa potência possui efeito inibidor. No presente estudo, observou-

se prováveis efeitos inibitórios imediatos, com geração de necrose celular acima dos

valores normais, após irradiação laser e LED com doses a partir de 30 J/cm². Após

24 horas efeitos inibitórios foram observados com dose menor de LED (20 J/cm2) e

somente com 40 J/cm² de irradiação com laser, provavelmente devido à proliferação

celular. Estes dados enfatizam a importância de um estudo mediato após a

irradiação, visando observar efeitos em médio prazo. Sugere-se que a morte celular

imediatamente após a irradiação com laser a 30 J/cm², foi sobrepujada pela

proliferação de células restante observada após 24 horas. Este fato não ocorreu com

o grupo LED (30 J/cm²), provavelmente pela ausência de estimulação de divisão

celular tão intenso quanto do laser nesta dose. A influência do campo

eletromagnético gerado pela luz coerente (laser) e da freqüência (150.000 Hz) pode

ter influenciado de forma superior ao grupo LED (RUBINOV, 2009).

Pesquisas relacionadas à atuação da mitocôndria sobre os mecanismos de

morte celular evidenciam que esta organela contribui tanto para o processo de

apoptose quanto para a necrose. Em ambos os casos, há uma disfunção

mitocondrial, sendo que, quando há depleção de ATP ocorre morte por necrose

celular (PAROLIN; REASON, 2001; NIEMINEM, 2003).

De acordo com Karu et al. (2001) e Karu; Pyatibrat e Afanasyeva, (2004) o

mecanismo de atuação da terapia laser de baixa potência, em níveis celulares,

baseia-se no aumento do metabolismo oxidativo mitocondrial, causado por uma

excitação dos componentes da cadeia respiratória, fato que também ocorre através

da irradiação com LED’s, conforme descrito por Desmet et al. (2006). Esta excitação

pode causar um estresse oxidativo, consequentemente levando à morte celular

devido ao acúmulo de espécies reativas de oxigênio (EROS). O aumento do nível de

EROS leva à oxidação de lipídios proteínas e ácidos nucléicos, aumentando o

colapso do potencial de membrana mitocondrial interna, que leva a perda da

homeostasia celular interrompendo a síntese de ATP (LUBART et al., 2005;

GRIVICICH; REGNER; ROCHA, 2007).

44

No presente estudo observou-se taxas expressivas de necrose celular após

irradiação (laser e LED no infravermelho próximo) com altas densidades de energia

(acima de 10 J/cm2). Estes resultados podem ter sido decorrentes do acúmulo de

EROS (GRIVICICH; REGNER; ROCHA, 2007) tanto pela irradiação com laser

quanto por LED (ALEXANDRATOU et al., 2002; TAFUR; MILLS, 2008), devido à

intensa excitação de atividade mitocondrial (HAWKINS, ABRAHAMSE; 2005;

DESMET et al., 2006; KARU; PYATIBRAT; AFANASYEVA, 2004). O comprimento

de onda dos equipamentos empregados (laser - 830 nm e LED - 945 ± 20 nm) está

dentro do infravermelho próximo. Estes têm sido aportados como responsáveis por

aumento de atividade celular (SONNEWEND; NICOLAU, 2007; SONNEWENND,

2009).

Hawkins e Abrahamse (2005) supõem que a irradiação laser acelera

formação de um gradiente eletroquímico de prótons na membrana mitocondrial,

fazendo com que mais Ca2+ seja liberado da mitocôndria para o citoplasma

(utilizando a força motriz de prótons). A alta concentração de Ca2+ estimula a

abertura do poro de transição de permeabilidade mitocondrial, conforme relatado por

Bernadi et al. (1999) e Halestrap et al. (2000). Em baixas doses, esse Ca2+ adicional

presente no citoplasma provoca mitose e aumenta a proliferação celular. Em doses

elevadas de irradiação, é liberada maior concentração de Ca2+, causando

hiperatividade da Ca2+ - ATPase (enzima que promove o influxo celular de cálcio),

que esgota as reservas de ATP da célula (HAWKINS; ABRAHAMSE, 2005). Assim,

devido às proteínas intracelulares, a pressão osmótica intramolecular torna-se maior

que a do meio, seguida por um influxo de água e consequente rompimento das

paredes celulares, fato que corrobora com nosso estudo, no qual as células

irradiadas a partir de 30 J/cm² apresentaram frequências crescentes de necrose, nos

grupos (laser e LED). avaliados imediatamente após a irradiação. Os grupos

irradiados com laser e LED (40 J/cm² e 50 J/cm²) apresentaram aumento

significativo de morte celular por necrose em relação aos grupos de menor dose,

sugerindo modificações bioquímicas intracelulares de forma dose dependente. Essa

diferença foi extremamente significativa entre os grupos laser e LED, com

superioridade para a luz não coerente. Provavelmente devido ao maior comprimento

de onda do LED e sua interação com cromóforos endógenos primários tais como

derivados de porfirinas, flavinas, desidrogenases e citocromos (KARU, 1999;

SANTOS et al. 2007). Segundo Lubart et al. (1997) a oscilação de íons cálcio é

45

extremamente modificada mediante radiação com comprimentos de onda da ordem

de 780 nm (infravermelho).

O aumento da liberação de Ca2+ intracelular e o aumento do potencial de

membrana mitocondrial, após a irradiação, também foram constatados por

Alexandratou et al. (2002), que ainda evidenciaram e produção de EROS (espécies

reativas de oxigênio), produzidas como resultado da absorção da luz e consequente

aceleração da atividade da cadeia respiratória. Desta forma é possível inferir sobre o

estímulo de mecanismos concomitantes, responsáveis pela necrose celular. Nos

estudos de Alexandratou et al. (2002) empregaram laser em 647 nm, densidade de

energia de 1,5 mJ/cm², durante 15 segundos, dosimetria inferior a utilizada em nosso

estudo, dessa forma, é possível supor que, em todas as densidades de energia

utilizadas, provavelmente ocorreram as mesmas alterações mitocondriais.

Duan et al. (2003) relataram a diminuição da apoptose em células PC12

utilizando LED (640 ± 15 nm), 0,9 W/cm² e 360 segundos. O mesmo fato pode ser

observado em nossos estudos, embora em diferentes parâmetros, onde a irradiação

dos grupos laser e LED apresentaram diminuição da freqüência de apoptose.

Carnevalli et al. (2003) em seus estudos constataram que a irradiação laser

infravermelha (830 nm, 2 J/cm²) em células CHO-K1 promove efeito excitatório, e

previne a apoptose. No presente estudo não foram observadas modificações

significativas quanto à frequência de apoptose imediatamente e 24 horas após a

irradiação com laser, com doses entre 10 J/cm2 e 50 J/cm2, contudo houve uma

expressiva redução desta frequência de apoptose nos grupos laser 40 J/cm2 e 50

J/cm2 e LED 40 J/cm2. Houve expressivo aumento de apoptose no grupo LED 30

J/cm2 imediatamente após a irradiação e grupo LED 50 J/cm2 24 horas.

46

7 CONCLUSÃO

A irradiação infravermelha através do laser ou LED em baixas doses (até

20J/cm²) reduziu de forma expressiva a frequência de apoptoses em células CHO-

K1, enquanto doses altas (a partir de 30 J/cm²) apresentaram frequências elevadas

de apoptose celular. A necrose foi evidenciada de forma significativa em altas doses

laser e LED, no entanto, após 24 horas, evidenciou-se aumento da proliferação de

células irradiadas com laser.

Sugerimos a realização de outros estudos relacionados aos mecanismos de

morte celular e danos celulares decorrentes da fototerapia, uma vez que esta

constitui uma modalidade de grande relevância clínica, a fim de proporcionar uma

janela terapêutica segura para a irradiação laser e LED.

47

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53

APÊNDICE A – Freqüências médias de necrose e apoptose imediata e após 24horas da irradiação

Frequência imediata de necrose após irradiação com laser

Frequência de Necrose (%) – Imediata Laser Controle 10 J/cm² 20 J/cm² 30 J/cm² 40 J/cm² 50 J/cm² 8 5 3 52 20 70 21 1 2 21 2 65 14 9 11 11 10 34

média 14,33 5,00 5,33 28,00 10,67 56,33 DP 6,51 4,00 4,93 21,38 9,02 19,50

Frequência imediata de necrose após irradiação com LED

Frequência de Necrose (%) – Imediata LED Controle 10 J/cm² 20 J/cm² 30 J/cm² 40 J/cm² 50 J/cm² 8 4 1 7 57 52 21 10 6 100 100 100 14 1 5 91 100 100

média 14,33 5,00 4,00 66,00 85,67 84,00 DP 6,51 4,58 2,65 51,29 24,83 27,71

Frequência de necrose após 24 horas de irradiação com laser

Frequência de Necrose (%) – Após 24horas Laser Controle 10 J/cm² 20 J/cm² 30 J/cm² 40 J/cm² 50 J/cm² 8 0 16 3 35 69 21 4 5 14 29 56 14 13 10 4 80 80

média 14,33 5,67 10,33 7,00 48,00 68,33 DP 6,51 6,66 5,51 6,08 27,87 12,01

Frequência de necrose após 24 horas de irradiação com LED

Frequência de Necrose (%) – Após 24horas LED Controle 10 J/cm² 20 J/cm² 30 J/cm² 40 J/cm² 50 J/cm² 8 2 38 38 100 3 21 2 8 25 41 90 14 5 6 22 100 62

média 14,33 3,00 17,33 28,33 80,33 51,67 DP 6,51 1,73 17,93 8,50 34,06 44,41

54

Frequência imediata de apoptose após irradiação com laser

Frequência de Apoptose (%) – Imediata Laser Controle 10 J/cm² 20 J/cm² 30 J/cm² 40 J/cm² 50 J/cm² 19 2 19 8 4 0 8 2 1 3 1 1 10 14 13 16 5 3

média 12,33 6,00 11,00 9,00 3,33 1,33 DP 5,86 6,93 9,17 6,56 2,08 1,53

Frequência imediata de apoptose após irradiação com LED

Frequência de Apoptose (%) – Imediata LED Controle 10 J/cm² 20 J/cm² 30 J/cm² 40 J/cm² 50 J/cm² 19 11 14 78 6 28 8 20 15 0 0 0 10 4 7 9 0 0

média 12,33 11,67 12,00 29,00 2,00 9,33 DP 5,86 8,02 4,36 42,67 3,46 16,17

Frequência de apoptose após 24horas de irradiação com laser

Frequência de Apoptose (%) – Após 24horas Laser Controle 10 J/cm² 20 J/cm² 30 J/cm² 40 J/cm² 50 J/cm² 19 21 0 16 1 0 8 19 0 28 4 1 10 20 27 16 0 3

média 12,33 20,00 9,00 20,00 1,67 1,33 DP 5,86 1,00 15,59 6,93 2,08 1,53

Frequência de apoptose após 24horas de irradiação com LED

Frequência de Apoptose (%) – Após 24horas LED Controle 10 J/cm² 20 J/cm² 30 J/cm² 40 J/cm² 50 J/cm² 19 21 33 10 0 97 8 17 16 12 29 10 10 3 5 17 0 20

média 12,33 13,67 18,00 13,00 9,67 42,33 DP 5,86 9,45 14,11 3,61 16,74 47,61

55

APÊNDICE B – Análise Estatística da Necrose imediata grupos laser vs LED. 0/05/2009 04:51 PM

NECROSE IMEDIATA

One-way Analysis of Variance (ANOVA)

Source of Degrees of Sum of Mean

variation freedom squares square

---------------------------- ---------- -------- --------

Treatments (between columns) 10 33165 3316.5

Residuals (within columns) 22 10089 458.59

============================ ========== ========

Total 32 43254

F = 7.232

The P value is < 0.0001, considered extremely significant.

Variation among column means is significantly greater than expected

by chance.

Bartlett's test for homogeneity of variances.

ANOVA assumes that all columns come from populations with equal

SDs. The following calculations test that assumption.

Bartlett's test cannot be performed because a sample size is too

small.

56

Tukey-Kramer Multiple Comparisons Test

If the value of q is greater than 5.060 then the P value is less than 0.05.

Mean

Comparison Difference q P value

---------------------------------- - --------------- ------- -----------

CONTROLE vs 10 LA 9.330 0.7546 ns P>0.05

CONTROLE vs 20 LA 9.000 0.7279 ns P>0.05

CONTROLE vs 30 LA -13.670 1.106 ns P>0.05

CONTROLE vs 40 LA 3.660 0.2960 ns P>0.05

CONTROLE vs 50 LA -42.000 3.397 ns P>0.05

CONTROLE vs 10 LED 9.330 0.7546 ns P>0.05

CONTROLE vs 20 LED 10.330 0.8355 ns P>0.05

CONTROLE vs 30 LED -51.670 4.179 ns P>0.05

CONTROLE vs 40 LED -71.340 5.770 * P<0.05

CONTROLE vs 50 LED -69.670 5.635 * P<0.05

10 LA vs 20 LA -0.3300 0.02669 ns P>0.05

10 LA vs 30 LA -23.000 1.860 ns P>0.05

10 LA vs 40 LA -5.670 0.4586 ns P>0.05

10 LA vs 50 LA -51.330 4.152 ns P>0.05

10 LA vs 10 LED 0.000 0.000 ns P>0.05

10 LA vs 20 LED 1.000 0.08088 ns P>0.05

10 LA vs 30 LED -61.000 4.934 ns P>0.05

10 LA vs 40 LED -80.670 6.525 ** P<0.01

10 LA vs 50 LED -79.000 6.390 ** P<0.01

20 LA vs 30 LA -22.670 1.834 ns P>0.05

20 LA vs 40 LA -5.340 0.4319 ns P>0.05

20 LA vs 50 LA -51.000 4.125 ns P>0.05

20 LA vs 10 LED 0.3300 0.02669 ns P>0.05

20 LA vs 20 LED 1.330 0.1076 ns P>0.05

20 LA vs 30 LED -60.670 4.907 ns P>0.05

20 LA vs 40 LED -80.340 6.498 ** P<0.01

20 LA vs 50 LED -78.670 6.363 ** P<0.01

57

30 LA vs 40 LA 17.330 1.402 ns P>0.05

30 LA vs 50 LA -28.330 2.291 ns P>0.05

30 LA vs 10 LED 23.000 1.860 ns P>0.05

30 LA vs 20 LED 24.000 1.941 ns P>0.05

30 LA vs 30 LED -38.000 3.074 ns P>0.05

30 LA vs 40 LED -57.670 4.664 ns P>0.05

30 LA vs 50 LED -56.000 4.529 ns P>0.05

40 LA vs 50 LA -45.660 3.693 ns P>0.05

40 LA vs 10 LED 5.670 0.4586 ns P>0.05

40 LA vs 20 LED 6.670 0.5395 ns P>0.05

40 LA vs 30 LED -55.330 4.475 ns P>0.05

40 LA vs 40 LED -75.000 6.066 * P<0.05

40 LA vs 50 LED -73.330 5.931 * P<0.05

50 LA vs 10 LED 51.330 4.152 ns P>0.05

50 LA vs 20 LED 52.330 4.233 ns P>0.05

50 LA vs 30 LED -9.670 0.7821 ns P>0.05

50 LA vs 40 LED -29.340 2.373 ns P>0.05

50 LA vs 50 LED -27.670 2.238 ns P>0.05

10 LED vs 20 LED 1.000 0.08088 ns P>0.05

10 LED vs 30 LED -61.000 4.934 ns P>0.05

10 LED vs 40 LED -80.670 6.525 ** P<0.01

10 LED vs 50 LED -79.000 6.390 ** P<0.01

20 LED vs 30 LED -62.000 5.015 ns P>0.05

20 LED vs 40 LED -81.670 6.606 ** P<0.01

20 LED vs 50 LED -80.000 6.471 ** P<0.01

30 LED vs 40 LED -19.670 1.591 ns P>0.05

30 LED vs 50 LED -18.000 1.456 ns P>0.05

40 LED vs 50 LED 1.670 0.1351 ns P>0.05

Mean Lower Upper

Difference Difference 95% CI 95% CI

---------------------------------- --------------- ---------- ------------

CONTROLE - 10 LA 9.330 -53.230 71.890

CONTROLE - 20 LA 9.000 -53.560 71.560

58

CONTROLE - 30 LA -13.670 -76.230 48.890

CONTROLE - 40 LA 3.660 -58.900 66.220

CONTROLE - 50 LA -42.000 -104.56 20.560

CONTROLE - 10 LED 9.330 -53.230 71.890

CONTROLE - 20 LED 10.330 -52.230 72.890

CONTROLE - 30 LED -51.670 -114.23 10.890

CONTROLE - 40 LED -71.340 -133.90 -8.780

CONTROLE - 50 LED -69.670 -132.23 -7.110

10 LA - 20 LA -0.3300 -62.890 62.230

10 LA - 30 LA -23.000 -85.560 39.560

10 LA - 40 LA -5.670 -68.230 56.890

10 LA - 50 LA -51.330 -113.89 11.230

10 LA - 10 LED 0.000 -62.560 62.560

10 LA - 20 LED 1.000 -61.560 63.560

10 LA - 30 LED -61.000 -123.56 1.560

10 LA - 40 LED -80.670 -143.23 -18.110

10 LA - 50 LED -79.000 -141.56 -16.440

20 LA - 30 LA -22.670 -85.230 39.890

20 LA - 40 LA -5.340 -67.900 57.220

20 LA - 50 LA -51.000 -113.56 11.560

20 LA - 10 LED 0.3300 -62.230 62.890

20 LA - 20 LED 1.330 -61.230 63.890

20 LA - 30 LED -60.670 -123.23 1.890

20 LA - 40 LED -80.340 -142.90 -17.780

20 LA - 50 LED -78.670 -141.23 -16.110

30 LA - 40 LA 17.330 -45.230 79.890

30 LA - 50 LA -28.330 -90.890 34.230

30 LA - 10 LED 23.000 -39.560 85.560

30 LA - 20 LED 24.000 -38.560 86.560

30 LA - 30 LED -38.000 -100.56 24.560

30 LA - 40 LED -57.670 -120.23 4.890

30 LA - 50 LED -56.000 -118.56 6.560

40 LA - 50 LA -45.660 -108.22 16.900

40 LA - 10 LED 5.670 -56.890 68.230

59

40 LA - 20 LED 6.670 -55.890 69.230

40 LA - 30 LED -55.330 -117.89 7.230

40 LA - 40 LED -75.000 -137.56 -12.440

40 LA - 50 LED -73.330 -135.89 -10.770

50 LA - 10 LED 51.330 -11.230 113.89

50 LA - 20 LED 52.330 -10.230 114.89

50 LA - 30 LED -9.670 -72.230 52.890

50 LA - 40 LED -29.340 -91.900 33.220

50 LA - 50 LED -27.670 -90.230 34.890

10 LED - 20 LED 1.000 -61.560 63.560

10 LED - 30 LED -61.000 -123.56 1.560

10 LED - 40 LED -80.670 -143.23 -18.110

10 LED - 50 LED -79.000 -141.56 -16.440

20 LED - 30 LED -62.000 -124.56 0.5604

20 LED - 40 LED -81.670 -144.23 -19.110

20 LED - 50 LED -80.000 -142.56 -17.440

30 LED - 40 LED -19.670 -82.230 42.890

30 LED - 50 LED -18.000 -80.560 44.560

40 LED - 50 LED 1.670 -60.890 64.230

Summary of Data

Number Standard

of Standard Error of

Group Points Mean Deviation Mean Median

--------------- ------ -------- -------- ---------- -------------

CONTROLE 3 14.330 6.510 3.759 Unknown

10 LA 3 5.000 4.000 2.309 Unknown

20 LA 3 5.330 4.930 2.846 Unknown

30 LA 3 28.000 21.380 12.344 Unknown

40 LA 3 10.670 9.020 5.208 Unknown

50 LA 3 56.330 19.500 11.258 Unknown

10 LED 3 5.000 4.580 2.644 Unknown

60

20 LED 3 4.000 2.650 1.530 Unknown

30 LED 3 66.000 51.290 29.612 Unknown

40 LED 3 85.670 24.830 14.336 Unknown

50 LED 3 84.000 27.710 15.998 Unknown

Lower 95% Upper 95%

Confidence Confidence

Group Minimum Maximum Interval Interval

--------------- -------- -------- ---------- ----------

CONTROLE Unknown Unknown -1.843 30.503

10 LA Unknown Unknown -4.937 14.937

20 LA Unknown Unknown -6.918 17.578

30 LA Unknown Unknown -25.115 81.115

40 LA Unknown Unknown -11.739 33.079

50 LA Unknown Unknown 7.885 104.77

10 LED Unknown Unknown -6.378 16.378

20 LED Unknown Unknown -2.583 10.583

30 LED Unknown Unknown -61.422 193.42

40 LED Unknown Unknown 23.984 147.36

50 LED Unknown Unknown 15.159 152.84

* * *

61

APÊNDICE C – Análise Estatística da apoptose imediata grupos laser vs LED.

10/05/2009 05:30 PM

APOPTOSE IMEDIATA

One-way Analysis of Variance (ANOVA)

Source of Degrees of Sum of Mean

variation freedom squares square

---------------------------- ---------- -------- --------

Treatments (between columns) 10 1723.5 172.35

Residuals (within columns) 22 4787.3 217.60

============================ ========== ========

Total 32 6510.8

F = 0.7920

The P value is 0.6371, considered not significant.

Variation among column means is not significantly greater than expected

by chance.

Bartlett's test for homogeneity of variances.

ANOVA assumes that all columns come from populations with equal

SDs. The following calculations test that assumption.

Bartlett's test cannot be performed because a sample size is too

small.

62

Post tests were not calculated because the P value was greater than 0.05.

Summary of Data

Number Standard

of Standard Error of

Group Points Mean Deviation Mean Median

--------------- ------ -------- --------- -------- -------------

CONTROLE 3 12.330 5.860 3.383 Unknown

10 LA 3 6.000 6.930 4.001 Unknown

20 LA 3 11.000 9.170 5.294 Unknown

30 LA 3 9.000 6.560 3.787 Unknown

40 LA 3 3.330 2.080 1.201 Unknown

50 LA 3 1.330 1.530 0.8833 Unknown

10 LED 3 11.670 8.020 4.630 Unknown

20 LED 3 12.000 4.360 2.517 Unknown

30 LED 3 29.000 42.670 24.636 Unknown

40 LED 3 2.000 3.460 1.998 Unknown

50 LED 3 9.330 16.170 9.336 Unknown

Lower 95% Upper 95%

Confidence Confidence

Group Minimum Maximum Interval Interval

CONTROLE Unknown Unknown -2.228 26.888

10 LA Unknown Unknown -11.216 23.216

20 LA Unknown Unknown -11.781 33.781

30 LA Unknown Unknown -7.297 25.297

40 LA Unknown Unknown -1.837 8.497

50 LA Unknown Unknown -2.471 5.131

10 LED Unknown Unknown -8.254 31.594

20 LED Unknown Unknown 1.168 22.832

30 LED Unknown Unknown -77.007 135.01

40 LED Unknown Unknown -6.596 10.596

50 LED Unknown Unknown -30.842 49.502

63

APÊNDICE D – Análise Estatística da Necrose 24h nos grupos laser vs LED. 10/05/2009 05:07 PM

NECROSE 24h

One-way Analysis of Variance (ANOVA)

Source of Degrees of Sum of Mean

variation freedom squares square

---------------------------- ---------- -------- --------

Treatments (between columns) 10 22320 2232.0

Residuals (within columns) 22 9208.2 418.55

============================ ========== ========

Total 32 31528

F = 5.333

The P value is 0.0005, considered extremely significant.

Variation among column means is significantly greater than expected

by chance.

Bartlett's test for homogeneity of variances.

ANOVA assumes that all columns come from populations with equal

SDs. The following calculations test that assumption.

Bartlett's test cannot be performed because a sample size is too

small.

64

Tukey-Kramer Multiple Comparisons Test

If the value of q is greater than 5.060 then the P value is less than 0.05.

Mean

Comparison Difference q P value

---------------------------------- ---------- --------- ----------

CONTROLE vs 10 LA 8.660 0.7332 ns P>0.05

CONTROLE vs 20 LA 4.000 0.3386 ns P>0.05

CONTROLE vs 30 LA 7.330 0.6206 ns P>0.05

CONTROLE vs 40 LA -33.670 2.851 ns P>0.05

CONTROLE vs 50 LA -54.000 4.572 ns P>0.05

CONTROLE vs 10 LED 11.330 0.9592 ns P>0.05

CONTROLE vs 20 LED -3.000 0.2540 ns P>0.05

CONTROLE vs 30 LED -14.000 1.185 ns P>0.05

CONTROLE vs 40 LED -66.000 5.588 * P<0.05

CONTROLE vs 50 LED -37.340 3.161 ns P>0.05

10 LA vs 20 LA -4.660 0.3945 ns P>0.05

10 LA vs 30 LA -1.330 0.1126 ns P>0.05

10 LA vs 40 LA -42.330 3.584 ns P>0.05

10 LA vs 50 LA -62.660 5.305 * P<0.05

10 LA vs 10 LED 2.670 0.2260 ns P>0.05

10 LA vs 20 LED -11.660 0.9872 ns P>0.05

10 LA vs 30 LED -22.660 1.918 ns P>0.05

10 LA vs 40 LED -74.660 6.321 ** P<0.01

10 LA vs 50 LED -46.000 3.894 ns P>0.05

20 LA vs 30 LA 3.330 0.2819 ns P>0.05

20 LA vs 40 LA -37.670 3.189 ns P>0.05

20 LA vs 50 LA -58.000 4.910 ns P>0.05

20 LA vs 10 LED 7.330 0.6206 ns P>0.05

20 LA vs 20 LED -7.000 0.5926 ns P>0.05

20 LA vs 30 LED -18.000 1.524 ns P>0.05

20 LA vs 40 LED -70.000 5.926 * P<0.05

20 LA vs 50 LED -41.340 3.500 ns P>0.05

65

30 LA vs 40 LA -41.000 3.471 ns P>0.05

30 LA vs 50 LA -61.330 5.192 * P<0.05

30 LA vs 10 LED 4.000 0.3386 ns P>0.05

30 LA vs 20 LED -10.330 0.8746 ns P>0.05

30 LA vs 30 LED -21.330 1.806 ns P>0.05

30 LA vs 40 LED -73.330 6.208 ** P<0.01

30 LA vs 50 LED -44.670 3.782 ns P>0.05

40 LA vs 50 LA -20.330 1.721 ns P>0.05

40 LA vs 10 LED 45.000 3.810 ns P>0.05

40 LA vs 20 LED 30.670 2.597 ns P>0.05

40 LA vs 30 LED 19.670 1.665 ns P>0.05

40 LA vs 40 LED -32.330 2.737 ns P>0.05

40 LA vs 50 LED -3.670 0.3107 ns P>0.05

50 LA vs 10 LED 65.330 5.531 * P<0.05

50 LA vs 20 LED 51.000 4.318 ns P>0.05

50 LA vs 30 LED 40.000 3.386 ns P>0.05

50 LA vs 40 LED -12.000 1.016 ns P>0.05

50 LA vs 50 LED 16.660 1.410 ns P>0.05

10 LED vs 20 LED -14.330 1.213 ns P>0.05

10 LED vs 30 LED -25.330 2.144 ns P>0.05

10 LED vs 40 LED -77.330 6.547 ** P<0.01

10 LED vs 50 LED -48.670 4.120 ns P>0.05

20 LED vs 30 LED -11.000 0.9313 ns P>0.05

20 LED vs 40 LED -63.000 5.334 * P<0.05

20 LED vs 50 LED -34.340 2.907 ns P>0.05

30 LED vs 40 LED -52.000 4.402 ns P>0.05

30 LED vs 50 LED -23.340 1.976 ns P>0.05

40 LED vs 50 LED 28.660 2.426 ns P>0.05

Mean Lower Upper

Difference Difference 95% CI 95% CI

---------------------------------- ---------- ----------- ----------

CONTROLE - 10 LA 8.660 -51.108 68.428

CONTROLE - 20 LA 4.000 -55.768 63.768

66

CONTROLE - 30 LA 7.330 -52.438 67.098

CONTROLE - 40 LA -33.670 -93.438 26.098

CONTROLE - 50 LA -54.000 -113.77 5.768

CONTROLE - 10 LED 11.330 -48.438 71.098

CONTROLE - 20 LED -3.000 -62.768 56.768

CONTROLE - 30 LED -14.000 -73.768 45.768

CONTROLE - 40 LED -66.000 -125.77 -6.232

CONTROLE - 50 LED -37.340 -97.108 22.428

10 LA - 20 LA -4.660 -64.428 55.108

10 LA - 30 LA -1.330 -61.098 58.438

10 LA - 40 LA -42.330 -102.10 17.438

10 LA - 50 LA -62.660 -122.43 -2.892

10 LA - 10 LED 2.670 -57.098 62.438

10 LA - 20 LED -11.660 -71.428 48.108

10 LA - 30 LED -22.660 -82.428 37.108

10 LA - 40 LED -74.660 -134.43 -14.892

10 LA - 50 LED -46.000 -105.77 13.768

20 LA - 30 LA 3.330 -56.438 63.098

20 LA - 40 LA -37.670 -97.438 22.098

20 LA - 50 LA -58.000 -117.77 1.768

20 LA - 10 LED 7.330 -52.438 67.098

20 LA - 20 LED -7.000 -66.768 52.768

20 LA - 30 LED -18.000 -77.768 41.768

20 LA - 40 LED -70.000 -129.77 -10.232

20 LA - 50 LED -41.340 -101.11 18.428

30 LA - 40 LA -41.000 -100.77 18.768

30 LA - 50 LA -61.330 -121.10 -1.562

30 LA - 10 LED 4.000 -55.768 63.768

30 LA - 20 LED -10.330 -70.098 49.438

30 LA - 30 LED -21.330 -81.098 38.438

30 LA - 40 LED -73.330 -133.10 -13.562

30 LA - 50 LED -44.670 -104.44 15.098

40 LA - 50 LA -20.330 -80.098 39.438

40 LA - 10 LED 45.000 -14.768 104.77

67

40 LA - 20 LED 30.670 -29.098 90.438

40 LA - 30 LED 19.670 -40.098 79.438

40 LA - 40 LED -32.330 -92.098 27.438

40 LA - 50 LED -3.670 -63.438 56.098

50 LA - 10 LED 65.330 5.562 125.10

50 LA - 20 LED 51.000 -8.768 110.77

50 LA - 30 LED 40.000 -19.768 99.768

50 LA - 40 LED -12.000 -71.768 47.768

50 LA - 50 LED 16.660 -43.108 76.428

10 LED - 20 LED -14.330 -74.098 45.438

10 LED - 30 LED -25.330 -85.098 34.438

10 LED - 40 LED -77.330 -137.10 -17.562

10 LED - 50 LED -48.670 -108.44 11.098

20 LED - 30 LED -11.000 -70.768 48.768

20 LED - 40 LED -63.000 -122.77 -3.232

20 LED - 50 LED -34.340 -94.108 25.428

30 LED - 40 LED -52.000 -111.77 7.768

30 LED - 50 LED -23.340 -83.108 36.428

40 LED - 50 LED 28.660 -31.108 88.428

Summary of Data

Number Standard

of Standard Error of

Group Points Mean Deviation Mean Median

--------------- ------ -------- --------- -------- -------------

CONTROLE 3 14.330 6.510 3.759 Unknown

10 LA 3 5.670 6.660 3.845 Unknown

20 LA 3 10.330 5.510 3.181 Unknown

30 LA 3 7.000 6.080 3.510 Unknown

40 LA 3 48.000 27.870 16.091 Unknown

50 LA 3 68.330 12.010 6.934 Unknown

10 LED 3 3.000 1.730 0.9988 Unknown

68

20 LED 3 17.330 17.930 10.352 Unknown

30 LED 3 28.330 8.500 4.907 Unknown

40 LED 3 80.330 34.060 19.665 Unknown

50 LED 3 51.670 44.410 25.640 Unknown

Lower 95% Upper 95%

Confidence Confidence

Group Minimum Maximum Interval Interval

--------------- -------- -------- ---------- ----------

CONTROLE Unknown Unknown -1.843 30.503

10 LA Unknown Unknown -10.876 22.216

20 LA Unknown Unknown -3.359 24.019

30 LA Unknown Unknown -8.105 22.105

40 LA Unknown Unknown -21.239 117.24

50 LA Unknown Unknown 38.493 98.167

10 LED Unknown Unknown -1.298 7.298

20 LED Unknown Unknown -27.214 61.874

30 LED Unknown Unknown 7.213 49.447

40 LED Unknown Unknown -4.287 164.95

50 LED Unknown Unknown -58.659 162.00

* * *

69

APÊNDICE E – Análise Estatística da apoptose 24h dos grupos laser vs LED. 10/05/2009 05:45 PM

APOPTOSE 24H

One-way Analysis of Variance (ANOVA)

Source of Degrees of Sum of Mean

variation freedom squares square

---------------------------- ---------- -------- --------

Treatments (between columns) 10 3739.0 373.90

Residuals (within columns) 22 6362.9 289.22

============================ ========== ========

Total 32 10102

F = 1.293

The P value is 0.2935, considered not significant.

Variation among column means is not significantly greater than expected

by chance.

Bartlett's test for homogeneity of variances.

ANOVA assumes that all columns come from populations with equal

SDs. The following calculations test that assumption.

Bartlett's test cannot be performed because a sample size is too

small.

70

Post tests were not calculated because the P value was greater

than 0.05.

Summary of Data

Number Standard

of Standard Error of

Group Points Mean Deviation Mean Median

--------------- ------ -------- --------- -------- -------------

CONTROLE 3 12.330 5.860 3.383 Unknown

10 LA 3 20.000 1.000 0.5774 Unknown

20 LA 3 9.000 15.590 9.001 Unknown

30 LA 3 20.000 6.930 4.001 Unknown

40 LA 3 1.670 2.080 1.201 Unknown

50 LA 3 1.330 1.530 0.8833 Unknown

10 LED 3 13.670 9.450 5.456 Unknown

20 LED 3 18.000 14.110 8.146 Unknown

30 LED 3 13.000 3.610 2.084 Unknown

40 LED 3 9.670 16.740 9.665 Unknown

50 LED 3 42.330 47.610 27.488 Unknown

Lower 95% Upper 95%

Confidence Confidence

Group Minimum Maximum Interval Interval

CONTROLE Unknown Unknown -2.228 26.888

10 LA Unknown Unknown 17.516 22.484

20 LA Unknown Unknown -29.731 47.731

30 LA Unknown Unknown 2.784 37.216

40 LA Unknown Unknown -3.497 6.837

50 LA Unknown Unknown -2.471 5.131

10 LED Unknown Unknown -9.807 37.147

20 LED Unknown Unknown -17.054 53.054

30 LED Unknown Unknown 4.032 21.968

40 LED Unknown Unknown -31.918 51.258

50 LED Unknown Unknown -75.949 160.61