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UNIVERSIDADE DO VALE DO ITAJAÍ
PHILIPE COSTA
AVALIAÇÃO DA ATIVIDADE DO EXTRATO DOS FRUTOS DE
Rapanea ferruginea E DOS COMPOSTOS ISOLADOS ÁCIDO
MIRSINÓICO A E TRIGLICERÍDEO SOBRE A MEMÓRIA DE ANIMAIS
NORMAIS E COM ALZHEIMER INDUZIDO
Itajaí - 2011
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UNIVERSIDADE DO VALE DO ITAJAÍ
PROGRAMA DE MESTRADO ACADÊMICO EM CIÊNCIAS
FARMACÊUTICAS
ÁREA DE CONCENTRAÇÃO EM PRODUTOS NATURAIS E
SUBSTÂNCIAS SINTÉTICAS BIOATIVAS
PHILIPE COSTA
AVALIAÇÃO DA ATIVIDADE DO EXTRATO DOS FRUTOS DE
Rapanea ferruginea E DOS COMPOSTOS ISOLADOS ÁCIDO
MIRSINÓICO A E TRIGLICERÍDEO SOBRE A MEMÓRIA DE ANIMAIS
NORMAIS E COM ALZHEIMER INDUZIDO
Dissertação submetida ao Programa de Mestrado Acadêmico em Ciências Farmacêuticas, da Universidade do Vale do Itajaí, como parte dos requisitos para a obtenção do grau de Mestre em Ciências Farmacêuticas. Orientador: Profa. Dra. Márcia M. de Souza Co-orientador: Profa. Dra. Angela Malheiros
Itajaí, Maio de 2011.
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FICHA CATALOGRÁFICA
C823a
Costa, Philipe, 1984- Avaliação da atividade do extrato dos frutos de Rapanea ferruginea e dos compostos isolados ácido mirsinóico A e triglicerídeo sobre a memória de animais normais e com Alzheimer induzido [manuscrito] / Philipe Costa. – 2011. 133 f. : il. Color. Cópia de computador (Printout(s)). Dissertação (mestrado) – Universidade do Vale do Itajaí, Programa de Mestrado Acadêmico em Ciências Farmacêuticas, 2011. “Orientadora: Profª. Drª. Márcia M. de Souza ”. “Co-orientadora: Profª. Drª. Angela Malheiros
Bibliografia: f. 114-132.
1. Alzheimer, doença de. 2. Memória. 3. Enzimas. I. Souza, Márcia M. de. II. Malheiros, Angela. III. Título.
CDU: 616.831
Claudia Bittencourt Berlim – CRB 14/964
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AVALIAÇÃO DA ATIVIDADE DO EXTRATO DOS FRUTOS DE
Rapanea ferruginea E DOS COMPOSTOS ISOLADOS ÁCIDO
MIRSINÓICO A E TRIGLICERÍDEO SOBRE A MEMÓRIA DE ANIMAIS
NORMAIS E COM ALZHEIMER INDUZIDO.
PHILIPE COSTA
‘Esta Dissertação foi julgada adequada para obtenção do Título de Mestre em Ciências Farmacêuticas, Área de Concentração Produtos Naturais e Substâncias Bioativas e aprovada em sua forma final pelo Programa de Mestrado em Ciências
Farmacêuticas da Universidade do Vale do Itajaí.’
____________________________________ Márcia Maria de Souza, Doutora
Orientadora __________________________________________________________
Tânia Mari Bellé Bresolin, Doutora Coordenador do Programa Mestrado em Ciências Farmacêuticas
Apresentado perante a Banca Examinadora composta pelos Professores:
______________________________________
Doutora Márcia Maria de Souza (UNIVALI) Presidente
______________________________________
Doutora Angela Malheiros Co-orientadora
______________________________________
Doutor Sérgio Faloni de Andrade (UNIVALI) Membro
______________________________________
Doutor Claudio da Cunha (UFPR) Membro
Itajaí (SC), 27 de Maio de 2011.
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Aos meus pais, Mário e Inês, que acreditaram no meu sonho
e me incentivaram a seguir adiante; e, a Janaína pela
compreensão e amor em todos os momentos.
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AGRADECIMENTOS
Esta dissertação é fruto de muito trabalho, pesquisa e dedicação. Muitas
pessoas participaram desta conquista, e, graças a sua ajuda, conquistei os
resultados aqui expostos;
Primeiramente gostaria de agradecer às minhas orientadoras, Márcia Maria
de Souza, pelo carinho e dedicação em todos os momentos; Angela Malheiros,
pelos ensinamentos e ajuda com a bolsa de estudos e Cristiane Bürger, que mesmo
não sendo oficialmente orientadora, me auxiliou como qual. Aprendi com vocês
muito mais do que se encontra aqui exposto;
Muitas amizades foram feitas durante o Mestrado. Quero deixar aqui
registrado a participação dos meus amigos Luiz Carlos Klein Júnior, José Roberto
Santin, Aline Debrassi, Thaisa Baccarin, Alessandro Silveira, Marivane Lemos,
Isabel Machado, Juliana Paula de Souza e Nicole Meira. Também aos meus mestres
e amigos Sérgio Faloni de Andrade, Clóvis Antonio Rodrigues e Rivaldo Niero;
Vários alunos da graduação me ajudaram durante os experimentos. Em
especial a Bruna Tridapalli, que realizou os ensaios bioquímicos; Stefany Andrade
Serrão, Carla Jane Weber, Taise Quevedo e Ana Elisa, que me auxiliaram com os
experimentos farmacológicos; e, Bruna Silva e Fellippe Wolff, que ajudaram com o
isolamento dos compostos;
Aos funcionários da UNIVALI, Maria Angélica Teixeira de Azevedo, pela sua
dedicação com os laboratórios e animais que utilizei durante os experimentos; e,
Pedro Pablo Perez Netto, pela determinação e análise dos espectros de RMN;
Agradeço ainda a bolsa de estudos cedida pelo Instituto Nacional de Ciência
e Tecnologia para a Inovação Farmacêutica (INCT-IF) e Coordenação de
Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior (CAPES), por intermédio de Ivan da
Rocha Pitta, e, o auxílio financeiro, concedido pelo meu tio Ademar Felisky, no início
de meus estudos.
Meus sinceros agradecimentos a todos vocês.
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“A mente que se abre a uma nova idéia jamais
voltará ao seu tamanho original”.
Albert Einstain
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AVALIAÇÃO DA ATIVIDADE DO EXTRATO DOS FRUTOS DA
Rapanea ferruginea E DOS COMPOSTOS ISOLADOS ÁCIDO
MIRSINÓICO A E TRIGLICERÍDEO SOBRE A MEMÓRIA DE ANIMAIS
NORMAIS E COM ALZHEIMER INDUZIDO.
Philipe Costa Maio/2011
Orientador: Márcia Maria de Souza, Doutora. Co-orientador: Angela Malheiros, Doutora Área de Concentração: Ciências Farmacêuticas Número de Páginas: 133
A Doença de Alzheimer (DA) é uma patologia neurodegenerativa que implica na destruição neuronal, acarretando em perda de tecido cerebral e levando o paciente à demência. Esta patologia ainda não possui cura e o tratamento existente apenas diminui os sintomas de falta de memória. Compostos de origem natural vêm sendo avaliados por diversos pesquisadores visando o tratamento desta patologia. Este trabalho proporcionou um estudo farmacológico de um extrato diclorometano da Rapanea ferruginea (ERF) e seus compostos isolados ácido mirsinóico A (AMA) e um triglicerídeo (TGL), ainda não identificado, sobre a memória de animais normais e com DA induzida por estreptozotocina (STZ). O ERF foi fracionado por cromatografia em coluna e resultou na purificação dos compostos AMA e TGL, os quais foram identificados por ressonância magnética nuclear (RMN). O ERF também foi avaliado por RMN e constatou-se predominância dos dois compostos no extrato. Para a indução da DA, camundongos fêmeas (25-35g) receberam infusão intraventricular (ICV) de STZ (2,5 mg/mL - 0,2uL) em duas aplicações com latência de 48h entre elas. Após a indução da DA os animais foram tratados com ERF (50, 150 e 300 mg/kg – v.o.), AMA (5, 15 e 30 mg/kg – v.o.), TGL (5, 15 e 30 mg/kg – v.o.), veículo ou galantamina (0,5 mg/kg – v.o.). A memória foi avaliada através do teste da esquiva inibitória. Também foram verificados os efeitos dos tratamentos nos testes complementares do Open Field (OF) e labirinto em cruz elevado (LCE). Após os ensaios farmacológicos os animais foram sacrificados por método de guilhotina e, os cérebros foram retirados para a realização de avaliação bioquímica das enzimas antioxidantes. A determinação dos efeitos do ERF sobre a memória dos animais normais demonstrou que este extrato apresenta ação facilitadora para todas as etapas (aquisição, consolidação e evocação) da memória. Em animais com DA o tratamento com ERF (50, 150 e 300 mg/kg) produziu facilitação da consolidação da memória dos animais (125,0; 145,0 e 180,0 s respectivamente) de forma semelhante ao fármaco galantamina (133,0 s). O tratamento dos animais com TGL produziu uma melhora na cognição, sendo a menor dose (5mg/kg) a mais eficiente (165,0 s). Um perfil farmacológico semelhante ao ERF foi observado com AMA. Animais tratados com AMA (15 e 30 mg/kg) também tiveram facilitação (140,0 s; 143,5 s respectivamente) da consolidação da memória na esquiva inibitória. Quando avaliados no OF e LCE os resultados demonstraram que o ERF e o AMA não
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produziram alterações comportamentais relacionadas à ansiedade e à locomoção. Entretanto, TGL na dose de 30 mg/kg de produziu um efeito ansiogênico aumentando a permanência e a freqüência de entradas no braço fechado, além do aumento no número de rearings. Os ensaios bioquímicos caracterizaram um aumento na atividade das enzimas SOD, CAT, GPx e GR no córtex cerebral dos animais com DA tratados com o TGL na dose de 5 mg/kg, sugerindo que o efeito neuroprotetor do TGL possa ser mediado pelo aumento da atividade das enzimas do sistema antioxidante. O nível de peroxidação lipídica caracterizado pelo ensaio do MDA reduziu, confirmando ainda que o TGL protege o tecido cerebral dos animais da degradação lipídica causada pela STZ. Os ensaios bioquímicos realizados com o tecido cerebral dos animais tratados com o AMA reveralaram que este composto não apresenta atividade sobre as enzimas antioxidantes SOD, CAT, GPx e GR. De modo geral, pode-se constatar que a melhora da cognição verificada nos animais tratados com o ERF pode estar relacionada com a atividade farmacológica que os compostos isolados AMA e TGL apresentaram. Palavras-chave: Rapanea ferruginea. Doença de Alzheimer, Memória. Ácido mirsinóico A. Triglicerídeo. Enzimas antioxidantes.
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EVALUATION OF ACTIVITY OF Rapanea ferruginea FRUIT
EXTRACT AND THE ISOLATED COMPOUNDS MIRSINOIC ACID A
AND TRIGLYCERIDE ON THE MEMORY OF NORMAL ANIMALS
AND WITH ALZHEIMER'S INDUCED
Philipe Costa
April/2011
Advisor: Márcia Maria de Souza, Doctor Co-advisor: Angela Malheiros, Doctor Area of Concentration: Pharmaceutical Sciences Number of Pages: 133
Alzheimer's disease (AD) is a neurodegenerative disorder that involves neuronal damage, resulting in loss of brain tissue and leading to dementia. This disease has no cure, and the only existing treatment involves reducing the symptoms of memory loss. Natural compounds have been tested by many researchers with the aim of treating this condition. This work provides a pharmacological study of a dichloromethane extract of Rapanea ferruginea (ERF) and its isolated compounds mirsinoic acid A (AMA) and an unidentified triglyceride (TGL), on the memory of normal mice, and mice with streptozotocin-induced DA (STZ). The ERF was fractionated by column chromatography, resulting in the purification of AMA and TGL, which were identified by nuclear magnetic resonance (NMR). The ERF was also evaluated by NMR, and a predominance of the two compounds was found in the extract. For the induction of AD, female mice (25-35g) received an intraventricular infusion (ICV) of STZ (2.5 mg/mL - 0.2 uL) in two applications with latency of 48 hours between them. After induction of DA, the animals were treated with ERF (50, 150 and 300 mg / kg - po), AMA (5, 15 and 30 mg / kg - po), TGL (5, 15 and 30 mg / kg - vo ), vehicle or galantamine (0.5 mg / kg - po). The memory was assessed using the inhibitory avoidance test. Were also verified the effects of the treatments in the Open Field (OF) and elevated plus maze (EPM) tests. After the pharmacological tests, the animals were sacrificed by the guillotine method, and the brains were removed for biochemical evaluation of the antioxidant enzymes. The determination of the effects of ERF on memory in normal animals demonstrated that this extract has facilitating action for all stages (acquisition, consolidation and evocation) of memory. In animals with DA, treatment with ERF (50, 150 and 300 mg/kg) produced facilitation of memory consolidation in the animals (125.0, 145.0 and 180.0 respectively) similar to the drug galantamine (133.0 s). Treatment of animals with TGL produced an improvement in cognition in these animals, the lower dose (5 mg / kg) being the most efficient (165.0 s). The AMA produced a similar pharmacological profile to ERF. Animals treated with AMA (15 and 30 mg / kg) also had facilitation (140.0 s, 143.5 s respectively) of memory consolidation in inhibitory avoidance. When evaluated in the OF and EPM, the results showed that the ERF and the AMA did not produce behavioral changes related to anxiety and
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locomotion. However, TGL at a dose of 30 mg/kg produced an anxiogenic effect, increasing the persistence and frequency of entries into the closed arm, and also increased the number of rearings. Biochemical assays characterized the increase in activity of SOD, CAT, GPx and GR in the cerebral cortex of AD animals treated with TGL at a dose of 5 mg/kg, suggesting that the neuroprotective effect may be mediated by TGL, increasing the enzymatic activity of the antioxidant system. The level of lipid peroxidation, characterized by the reduced malondialdehyde assay, also confirmed that TGL protects the animal’s brain tissue from lipid degradation caused by STZ. Biochemical experiments performed with brain tissue from animals treated with the AMA revealed that this compound apparently has no activity on the antioxidant enzymes SOD, CAT, GPx and GR. In general, in is observed that the improvement in cognition observed in animals treated with ERF may be related to the pharmacological activity of the isolated compounds TGL and AMA.
Key words: Rapanea ferruginea. Alzheimer’s disease. Memory. Mirsinoic acid A. Triglyceride. Antioxidant enzymes.
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LISTA DE FIGURAS
Figura 1 Fotografia de uma lâmina do córtex cerebral sob observação microscópica demonstrando neurônios e a localização de uma placa amilóide.................................................................................................25
Figura 2 Fotografia de uma lâmina do córtex cerebral sob observação microscópica demonstrando neurônios e a localização das alterações neurofibrilares de TAU..........................................................................27
Figura 3 Fotografia da Rapanea ferruginea evidenciando a altura da árvore e os galhos com frutos..................................................................................34
Figura 4 Fórmula estrutural do (a) ácido graxo, (b) glicerol e (c) triglicerídeos. Sendo R uma cadeia hidrocarbônica com número de carbonos e de insaturações diferentes para cada ácido graxo. A numeração 1,2 e 3 refere-se à posição de cada ácido graxo no triglicerídeo......................40
Figura 5 Fotografia demonstrando a avaliação da memória no teste da esquiva inibitória.................................................................................................50
Figura 6 Fotografia demonstrando a avaliação da ansiedade no modelo do labirinto em cruz elevado......................................................................51
Figura 7 Fotografia demonstrando a avaliação da capacidade locomotora através do modelo do Open Field. .......................................................52
Figura 8 Indução de DA através do modelo farmacológico da STZ para avaliação da memória...........................................................................53
Figura 9 Espectro de RMN 1H (CDCl3, 300 MHz) do Sfr3a.................................61
Figura 10 Representação estrutural da molécula de um triglicerídeo demonstrando a numeração relacionada aos carbonos relacionados no espectro de RMN..................................................................................62
Figura 11 a) Espectro de RMN 13C (b) Espectro de RMN 13C/DEPT da Sfr3a (CDCl3, 75,5 MHz).................................................................................63
Figura 12 Representação da estrutura molecular do ácido mirsinóico A..............64
Figura 13 Espectro de RMN 1H (CDCl3, 300 MHz) do Sfr7b................................65
Figura 14 a) Espectro de RMN13C. b) Espectro de RMN13C/DEPT da Sfr7b (CDCl3, 75,5 MHz).................................................................................66
Figura 15 Espectro de RMN 1H (CDCl3, 300 MHz) do ERF..................................68
Figura 16 Espectro de RMN13C (CDCl3, 75,5 MHz) do ERF.................................69
Figura 17 Efeito da administração do ERF (50, 150 e 300 mg/kg) 1 hora antes do treino (A – aquisição), imediatamente após o treino (B – consolidação)
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e 1 hora antes do teste (C – evocação), sobre a latência de descida dos ratos da plataforma nas sessões treino e teste na tarefa da esquiva inibitória. Os dados são apresentados como mediana ± intervalo interquartil. n = 8-10 para cada grupo. Asteriscos indicam diferença significativa quando comparados ao grupo controle: * (p<0,05); ** (p<0,01); *** (p<0,001)..........................................................................73
Figura 18 Efeito da administração do ERF (50, 150 e 300 mg/kg; v.o.) e Galantamina (0,5 mg/kg; v.o.) sobre memória dos ratos com DA induzida por STZ (2,5mg/mL - 0,2uL) nas sessões treino e teste na tarefa da esquiva inibitória. Os dados são apresentados como mediana ± intervalo interquartil. n = 8- 10 para cada grupo. Asteriscos indicam diferença significativa quando comparados ao grupo controle: * (p<0,05); ** (p<0,01); *** (p<0,001).......................................................76
Figura 19 Efeito da administração do triglicerídeo (5, 15 e 30 mg/kg e Galantamina (0,5 mg/kg) sobre a memória dos animais nas sessões treino e teste na tarefa da esquiva inibitória. Os dados são apresentados como mediana ± intervalo interquartil. n = 8-10 para cada grupo. Asteriscos indicam diferença significativa quando comparados ao grupo controle: *** (p<0,001)............................................................78
Figura 20 Efeito da administração do AMA (5, 15 e 30 mg/kg; v.o.) e Galantamina (0,5 mg/kg; v.o.) sobre a latência de descida dos ratos da plataforma nas sessões treino e teste na tarefa da esquiva inibitória. Os dados são apresentados como mediana ± intervalo interquartil. n = 8-10 para cada grupo. Asteriscos indicam diferença significativa quando comparados ao grupo controle: ** (p<0,01); *** (p<0,001)........................................81
Figura 21 Determinação dos efeitos do tratamento com o TGL (5, 15 e 30 mg/kg) sobre a atividade da SOD do córtex cerebral dos animais com DA induzida por STZ. Grupo controle representa animais com DA e tratados com NaCl 0,9% e grupo Naive animais normais sem DA. Os dados são apresentados como SEM ± EPM. n = 6-8 para cada grupo. Asteriscos indicam diferença significativa quando comparados ao grupo controle: ** (p<0,01)..............................................................................83
Figura 22 Determinação dos efeitos do tratamento com o TGL (5, 15 e 30 mg/kg) sobre a atividade da CAT do córtex cerebral dos animais com DA induzida por STZ. Grupo controle representa animais com DA e tratados com NaCl 0,9% e grupo Naive animais normais sem DA. Os dados são apresentados como SEM ± EPM. n = 6-8 para cada grupo. Asteriscos indicam diferença significativa quando comparados ao grupo controle: ** (p<0,01)..............................................................................84
Figura 23 Determinação dos efeitos do tratamento com o TGL (5, 15 e 30 mg/kg) sobre a atividade da GPx do córtex cerebral dos animais com DA induzida por STZ. Grupo controle representa animais com DA e tratados com NaCl 0,9% e grupo Naive animais normais sem DA. Os dados são apresentados como SEM ± EPM. n = 6-8 para cada grupo.
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Asteriscos indicam diferença significativa quando comparados ao grupo controle: ** (p<0,01)..............................................................................85
Figura 24 Determinação dos efeitos do tratamento com o TGL (5, 15 e 30 mg/kg) sobre a atividade da GR do córtex cerebral dos animais com DA induzida por STZ. Grupo controle representa animais com DA e tratados com NaCl 0,9% e grupo Naive animais normais sem DA. Os dados são apresentados como SEM ± EPM. n = 6-8 para cada grupo. Asteriscos indicam diferença significativa quando comparados ao grupo controle: ** (p<0,01)..............................................................................86
Figura 25 Determinação dos níveis de TBARS nos grupos de animais tratados com DA induzida por STZ e tratados com TGL (5, 15 e 30 mg/kg), grupos de animais controle negativo e grupo de animais Naive. Os dados são apresentados como SEM ± EPM. n = 6-8 para cada grupo. Asteriscos indicam diferença significativa quando comparados ao grupo controle: ** (p<0,01)..............................................................................87
Figura 26 Determinação dos efeitos do tratamento com o AMA (5, 15 e 30 mg/kg) sobre a atividade da SOD do córtex cerebral dos animais com DA induzida por STZ. Grupo controle representa animais com DA e tratados com NaCl 0,9% e grupo Naive animais normais sem DA. Os dados são apresentados como SEM ± EPM. n = 6-8 para cada grupo.....................................................................................................88
Figura 27 Determinação dos efeitos do tratamento com o AMA (5, 15 e 30 mg/kg)
sobre a atividade da CAT do córtex cerebral dos animais com DA induzida por STZ. Grupo controle representa animais com DA e tratados com NaCl 0,9% e grupo Naive animais normais sem DA. Os dados são apresentados como SEM ± EPM. n = 6-8 para cada grupo.....................................................................................................89
Figura 28 Determinação dos efeitos do tratamento com o AMA (5, 15 e 30 mg/kg)
sobre a atividade da GPx do córtex cerebral dos camundongos com DA induzida por STZ. Grupo controle representa animais com DA e tratados com NaCl 0,9% e grupo Naive animais normais sem DA. Os dados são apresentados como SEM ± EPM. n = 6-8 para cada grupo.....................................................................................................90
Figura 29 Determinação dos efeitos do tratamento com o AMA (5, 15 e 30 mg/kg)
sobre a atividade da GR do córtex cerebral dos camundongos com DA induzida por STZ. Grupo controle representa animais com DA e tratados com NaCl 0,9% e grupo Naive animais normais sem DA. Os dados são apresentados como SEM ± EPM. n = 6-8 para cada grupo.....................................................................................................91
Figura 30 Determinação dos níveis de TBARS nos grupos de camundongos
tratados com DA induzida por STZ e tratados com AMA (5, 15 e 30 mg/kg), grupos de animais controle negativo e grupo de animais Naive. Os dados são apresentados como SEM ± EPM. n = 6-8 para cada grupo.....................................................................................................92
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LISTA DE TABELAS
Tabela 1 Gradiente de eluição da CC1 no fracionamento do extrato diclorometano da R. ferruginea......................................................................................45
Tabela 2 Reunião das frações obtidas na CC1.....................................................46
Tabela 3 Gradiente de eluição da CC2 no fracionamento da FR3........................46
Tabela 4 Reunião das frações obtidas na CC2.....................................................47
Tabela 5 Gradiente de eluição da CC3 no fracionamento da FR4....................... 47
Tabela 6 Reunião das frações obtidas na CC3.....................................................48
Tabela 7 Valores de deslocamento químico (δ=ppm) de RMN 1H obtidos para o Sfr3a e comparação com os dados da literatura para o triglicerídeo.............................................................................................62
Tabela 8 Valores de deslocamento químico (δ=ppm) de RMN 1H e 13C obtidos para o Sfr7b e comparação com os dados da literatura para o AMA........................................................................................................67
Tabela 9 Valores de deslocamento químico (δ=ppm) de RMN 1H obtidos para o ERF e comparação com os dados dos compostos isolados AMA e TGL.........................................................................................................69
Tabela 10 Valores de deslocamento químico (δ=ppm) de RMN 1H obtidos para o ERF e comparação com os dados dos compostos isolados AMA e TGL.........................................................................................................70
Tabela 11 Efeito da administração do ERF (50, 150 e 300 mg/kg; v.o.) sobre o comportamento dos ratos no modelo do Open Field. Os dados são apresentados como média ± EPM. n = 10 para cada grupo..................74
Tabela 12 Efeito da administração do ERF (50, 150 e 300 mg/kg; v.o.) sobre o comportamento dos ratos no modelo do labirinto em cruz elevado. Os dados são apresentados como média ± EPM. n = 10 para cada grupo......................................................................................................74
Tabela 13 Efeito da administração do ERF (50, 150 e 300 mg/kg; v.o.) e Galantamina (0,5 mg/kg; v.o.) sobre o comportamento dos ratos no modelo do Open Field. Os dados são apresentados como média ± EPM. n = 10 para cada grupo..........................................................................76
Tabela 14 Efeito da administração do ERF (50, 150 e 300 mg/kg; v.o.) sobre o comportamento dos ratos no modelo do LCE. Os dados são apresentados como média ± EPM. n = 10 para cada grupo..................77
Tabela 15 Efeito da administração do triglicerídeo (5, 15 e 30 mg/kg) sobre o
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comportamento dos camundongos no modelo do Open Field. Os dados são apresentados como média ± EPM. n=10 para cada grupo. Asteriscos indicam diferença significativa quando comparados ao grupo controle: ** (p<0,01)................................................................................79
Tabela 16 Efeito da administração do triglicerídeo (5, 15 e 30 mg/kg) sobre o comportamento dos camundongos no modelo do labirinto em cruz elevado. Os dados são apresentados como média ± EPM. n = 10 para cada grupo. Asteriscos indicam diferença significativa quando comparados ao grupo controle: * (p<0,05); *** (p<0,001)......................79
Tabela 17 Efeito da administração do AMA (5, 15 e 30 mg/kg; v.o.) sobre o comportamento dos camundongos no modelo do Open Field. Os dados são apresentados como média ± EPM. n = 10 para cada grupo......................................................................................................81
Tabela 18 Efeito da administração do AMA (5, 15 e 30 mg/kg; v.o.) sobre o comportamento dos camundongos no modelo do labirinto em cruz elevado. Os dados são apresentados como média ± EPM. n = 10 para cada grupo..............................................................................................82
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LISTA DE ABREVIATURAS
ACh – Acetilcolina
AChE – Acetilcolinesterase
AChT - Acetiltransferase
AcOEt – Acetato de etila
AINES – Antiinflamatórios não-esteroidais
AMA – Ácido mirsinóico A
AMB – Ácido mirsinóico B
APP – Proteína precursora amilóide
ATP – Adenosina tri-fosfato
Aβ – Beta amilóide
BChE – Butirilcolinesterase
CAT – Catalase
CC – Cromatografia em coluna
CCD – Cromatografia em camada delgada
ChAT - Acetiltransferase
CoA – Coenzima A
DA – Doença de Alzheimer
D-Gal – D-Galactose
DHA – Ácido docosahexanóico
DM – Diclorometano
ERF – Extrato diclorometano de Rapanea ferruginea
EROs – Espécies reativas de oxigênio
GPx – Glutationa peroxidase
GR – Glutationa redutase
Hex – Hexano
ICV – Intracerebroventricular
IR – Receptor de insulina
LCE – Labirinto em cruz elevado
MDA - Malondialdeído
MDL – Memória de longa duração
MeOH – Metanol
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OF – Open Field
RMN ¹H – Ressonância magnética nuclear de hidrogênio
RMN ¹³C – Ressonância magnética nuclear de carbono-13
SNC – Sistema Nervoso Central
SOD – Superóxido dismutase
STZ – Estreptozotocina
TAU – Proteína TAU
TBARS – Ácido Tiobarbitúrico
TGL - Triglicerídeo
TMS – Tetrametilsilano
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SUMÁRIO
1 INTRODUÇÃO........................................................................................................21
2 OBJETIVOS............................................................................................................23
2.1 Objetivo Geral.....................................................................................................23
2.2 Objetivos Especificos........................................................................................23
3 REVISÃO DA LITERATURA..................................................................................24
3.1 Doença de Alzheimer.........................................................................................24
3.1.1 Conceito............................................................................................................24
3.1.2 Epidemiologia....................................................................................................25
3.1.3 Distúrbios neuroquímicos..................................................................................25
3.1.4 Sintomas da Doença de Alzheimer...................................................................28
3.1.5 Estresse oxidativo e Alzheimer.........................................................................29
3.1.6 Processos inflamatórios e Alzheimer................................................................30
3.1.7 Tratamento........................................................................................................31
3.1.8 Modelos farmacológicos para o estudo do Alzheimer.......................................33
3.3 Aspectos gerais sobre plantas medicinais......................................................35
3.4 Gênero Rapanea e Rapanea ferruginea...........................................................37
3.5 Lipídios e doença de Alzheimer........................................................................39
4 MATERIAIS E MÉTODOS......................................................................................43
4.1 Material: ..............................................................................................................43
4.1.1 Material Vegetal: ...............................................................................................43
4.1.2 Material e Reagentes: ......................................................................................43
4.1.3 Equipamentos: ..................................................................................................44
4.2 Métodos ..............................................................................................................45
4.2.1 Obtenção do extrato..........................................................................................45
4.2.2 Fracionamento cromatográfico do extrato.........................................................45
4.3 Ensaios farmacológicos....................................................................................49
4.3.1 Animais..............................................................................................................49
4.3.2 Tratamentos......................................................................................................49
4.3.3 Modelo de avaliação da memória – teste da esquiva inibitória.........................49
4.3.4 Modelo de ansiedade - teste do labirinto em cruz elevado...............................50
4.3.5 Modelo de deambulação - teste do Open Field................................................51
20
4.3.6 Indução do Alzheimer pelo modelo da Estreptozotocina..................................52
4.3.7 Avaliação da memória de animais normais tratados com o ERF......................53
4.3.8 Determinação da memória dos animais com Alzheimer induzido por
estreptozotocina e tratados com o ERF.....................................................................54
4.3.9 Determinação da memória dos animais com Alzheimer induzido por STZ e
tratados com o TGL....................................................................................................54
4.3.10 Avaliação da memória dos animais com Alzheimer induzido por
estreptozotocina e tratados com o AMA.....................................................................54
4.4 Análises bioquímicas “in vitro”........................................................................55
4.4.1 Preparação das amostras do tecido cerebral....................................................56
4.4.2 Medida dos sistemas e produtos oxidativos......................................................56
4.5 Análise Estatística..............................................................................................57
5 RESULTADOS........................................................................................................59
5.1 Obtenção e rendimento do ERF, Sfr3a e Sfr7b................................................59
5.2 Identificação das substâncias isoladas e análise do ERF.............................59
5.2.1 Identificação da substância Sfr3a......................................................................59
5.2.2 Identificação da substância Sfr7b......................................................................64
5.2.3 Análise do ERF por RMN..................................................................................67
5.3 Ensaios farmacológicos....................................................................................71
5.3.1 Atividade do ERF sobre a memória de animais normais..................................71
5.3.2 Ação do ERF sobre a memória, deambulação e ansiedade de animais com
Alzheimer induzido por Estreptozotocina...................................................................75
5.3.3 Atividade do TGL sobre a memória, deambulação e ansiedade de animais com
Alzheimer induzido por Estreptozotocina...................................................................77
5.3.4 Efeito do AMA sobre a memória, deambulação e ansiedade de animais com
Alzheimer induzido por Estreptozotocina...................................................................80
5.4 Medidas de sistemas e produtos oxidativos...................................................80
5.4.1 Efeito do TGL sobre a atividade da Superóxido Dismutase..............................82
5.4.2 Ação do TGL sobre a atividade da Catalase.....................................................83
5.4.3 Efeito do TGL sobre a atividade da Glutationa Peroxidase..............................84
5.4.4 Ação do TGL sobre a atividade da Glutationa Redutase..................................85
5.4.5 Efeito do TGL sobre os níveis de Malondialdeído.............................................86
5.4.6 Efeito do AMA sobre a atividade da Superóxido Dismutase.............................87
21
5.4.7 Ação do AMA sobre a atividade da Catalase....................................................88
5.4.8 Efeito do AMA sobre a atividade da Glutationa Peroxidase..............................89
5.4.9 Ação do AMA sobre a atividade da Glutationa Redutase................................90.
5.4.10 Efeito do AMA sobre os níveis de Malondealdeido.........................................91
6 DISCUSSÃO...........................................................................................................93
7. CONCLUSÕES....................................................................................................113
REFERÊNCIAS........................................................................................................114
ANEXO 1..................................................................................................................133
22
1 INTRODUÇÃO
O Mal de Alzheimer ou Doença de Alzheimer (DA) é uma desordem
neurodegenerativa caracterizada pela irreversível e progressiva perda de memória,
diminuição do desempenho nas atividades diárias, fala e percepção visual, seguida
pela completa demência (KOEDAM; PIJNEBUR; DEEG, 2008).
Geralmente, a primeira estrutura cerebral atingida pela DA é o hipocampo,
que por sua vez, é uma estrutura chave do Sistema Nervoso Central (SNC) nos
processos de memória. Posteriormente, a progressão da doença afeta as outras
estruturas cerebrais levando aos sintomas da demência (MIMURA, 2008).
A deposição da proteína beta-amilóide (Aβ) em diversas áreas do tecido
cerebral é assumida como o início da cascata patológica da doença, que resulta na
perda e disfunção sináptica, além da morte cerebral (CHUANG, 2010).
Na DA ocorrem distúrbios bioquímicos diversos decorrentes da formação
das placas senis pelos agregados da proteína Aβ. Estas alterações provocam
disfunções na homeostasia do cálcio, resposta inflamatória neuronal, estresse
oxidativo com conseqüente aumento de radicais livres. Estas ações interferem nos
fatores de transcrição nuclear e ocasionam a apoptose, levando a danos sinápticos
e neurotoxicidade, que induzem a DA (KELLY; FERREIRA, 2006).
A acetilcolina (ACh) é um importante neurotransmissor do SNC e sistemas
periféricos, responsável por grande parte das transmissões colinérgicas no
organismo. Diversos estudos demonstram que a deficiência do funcionamento do
sistema colinérgico está ligada à perturbação da memória, e, uma vez que na DA
ocorre destruição dos neurônios colinérgicos, ocorrem os sintomas patológicos
relatados (ABREU-VILLAÇA; FIGUEIRA; MANHÃES, 2010).
Alguns medicamentos aprovados para o tratamento da DA são inibidores da
acetilcolinesterase (AChE), como a tacrina, rivastigmina, donepezil e galantamina.
Sendo a AChE a enzima responsável pela hidrólise de acetilcolina, os
medicamentos utilizados para o tratamento dos sintomas da DA produzem um
aumento na memória através da inibição da enzima, aumentando os níveis cerebrais
de ACh (FORLENZA, 2005).
Mais de 35.000 espécies de plantas medicinais já foram estudadas pela
comunidade científica, além de mais de 4000 compostos de origem natural, entre
23
eles flavonóides, terpenos e alcalóides (MANACH et al., 2004). Como exemplo,
pode-se citar a galantamina, uma substância de origem natural que é utilizada no
tratamento da DA desde 2000. Este composto, que é um alcalóide fenantrênico,
demonstra que as substâncias oriundas de plantas medicinais são fundamentais na
pesquisa de novos fármacos na terapêutica da DA (BARREIRO, 2009).
Em contrapartida, verifica-se uma busca cada vez maior da população, em
grande maioria os idosos, a terapias alternativas como as plantas e os produtos
naturais (SANTOS et al., 2007)
A Rapanea ferruginea (Myrsinaceae) é uma planta medicinal cujas
propriedades terapêuticas vêm sendo largamente estudas, possuindo atividades
antinociceptiva (GALVAN, 2007), antiinflamatória (ANTONIALLI, 2008) e anti-
hiperglicemiante (MONTEIRO et al., 2007) relatadas. Além disso, alguns compostos
dela isolados, como os ácidos mirsinóicos A e B, apresentam ação
anticolinesterásica “in vitro” o que impulsiona estudos de ação sobre a DA (GAZONI,
2009; FILLIPIN, 2010).
Em virtude disto, a R. ferruginea apresenta-se como uma espécie candidata
à realização de estudos para investigação de potencial terapêutico frente à DA, uma
vez que apresenta características farmacológicas relevantes ao tratamento e
estagnação da patologia. Neste sentido, o presente trabalho direciona esforços para
contribuir com a avaliação do potencial terapêutico da Rapanea ferruginea.
24
2 OBJETIVOS
2.1 Objetivo Geral:
Avaliar os efeitos de um extrato diclorometano de frutos da Rapanea
ferruginea (ERF) e seus compostos isolados sobre a memória de animais normais e
animais com doença de Alzheimer induzida por estreptozotocina (STZ).
2.2 Objetivos Específicos:
a) preparar um extrato de frutos secos da Rapanea ferruginea através de
maceração com diclorometano;
b) fracionar o ERF por cromatografia em coluna visando obter compostos
purificados
c) identificar os compostos isolados por RMN ¹H e ¹³C;
d) avaliar o perfil fitoquímico do ERF por RMN
e) analisar os efeitos do ERF sobre as etapas (aquisição, consolidação e
evocação) da memória de animais normais;
f) avaliar os efeitos do ERF e dos compostos TGL e AMA em animais com
Alzheimer induzido por STZ
g) averiguar se os efeitos do ERF e dos compostos TGL e AMA podem ser
influenciados pela ansiedade através do modelo do labirinto em cruz elevado;
h) investigar se os efeitos do ERF e dos compostos TGL e AMA podem sofrer
interferência pela capacidade locomotora através do modelo do Open Field;
i) determinar os efeitos do TGL sobre as enzimas antioxidantes superóxido
dismutas, catalase, glutationa peroxidase e glutationa redutase de tecido
cerebral;
j) avaliar o nível de peroxidação lipídica em tecido cerebral através do teste do
malondialdeído, na presença do TGL
k) determinar os efeitos do AMA sobre as enzimas antioxidantes SOD e CAT
25
3 REVISÃO DA LITERATURA
3.1 Doença de Alzheimer
3.1.1 Conceito
A DA foi descrita inicialmente pelo médico alemão, Alois Alzheimer em 1906.
Alzheimer definiu a doença como uma patologia neurológica, qualificada como uma
demência, onde se destacavam os sintomas de déficit de memória, alterações de
comportamento e incapacidade para atividades rotineiras. Alzheimer ainda
evidenciou características anatomopatológicas como o acúmulo de placas senis e de
emaranhados neurofibrilares, além da perda neuronal (FRATIGLIONI; WINBLAD;
STRAUSS, 2007).
Segundo o DSM-IV-TR (2008), os transtornos de demência caracterizam-se
pelo desenvolvimento de múltiplos déficits cognitivos (incluindo comprometimento da
memória) devido aos efeitos fisiológicos diretos de uma condição médica geral, aos
efeitos persistentes de uma substância ou de múltiplas etiologias, como efeitos
combinados de doença cerebrovascular e DA (
A DA é a forma mais comum de demência. A demência é caracterizada pelo
declínio progressivo e global das funções cognitivas, na ausência de um
comprometimento agudo do estado de consciência, e que seja suficientemente
importante para interferir nas atividades sociais e ocupacionais do indivíduo
(ABREU, FORLENZA; BARROS, 2005). É a demência mais comum entre os idosos,
com apresentação clínica e patológica bem definidas, afetando indivíduos com idade
a partir de 65 anos (PLASSMAN et al., 2007).
Por fim, a DA está relacionada com condições neurodegenerativas
caracterizadas pela progressiva disfunção cerebral ocorrendo em uma seqüência
biológica distinguida por falha sináptica e injúria e morte neuronal (BUTTERFIELD,
2004).
26
3.1.2 Epidemiologia
A DA afeta mais de 37 milhões de pessoas em todo o mundo. As despesas
por detrás desta doença são altas, chegando a ter um gasto estimado direto e
indireto de 100 bilhões de dólares no tratamento de pacientes, apenas nos Estados
Unidos (RAFII; AUSEN, 2009).
Esta patologia é a quarta maior causa de morte em idosos com mais de 65
anos. Estima-se que o número de pessoas com algum tipo de demência ou
Alzheimer no mundo deve praticamente dobrar em 20 anos. Estudos indicam que
em 2030, devem ser 65,7 milhões, e em 2050, a previsão é de 115,4 milhões de
pacientes (SCORER, 2001; PIMENTEL, 2010).
Estimativas demonstram que a população de idosos no Brasil é de
aproximadamente 15 milhões de pessoas e a prevalência de doentes com demência
aproxima-se de 1,1 milhão. Cerca de 7% da população brasileira com mais de 65
anos são acometidos pela DA. O Ministério da Saúde aponta que os gastos com
esta patologia chegam a R$ 129 milhões apenas em medicamentos. (BRASIL,
2010).
Estudos realizadas pela Academia Brasileira de Neurologia revelaram que as
mortes relacionadas a DA registraram um aumento superior a 500% no Brasil,
quando avalia-se o período entre 1999 e 2008. Estes dados, associados com o
aumento da expectativa de vida da população brasileira indicam que a cada ano o
número de portadores da DA tende a subir no Brasil, assim como em todo o mundo
(PIMENTEL, 2010).
3.1.3 Distúrbios neuroquímicos
A DA é uma neuropatologia caracterizada por uma perda de neurônios
colinérgicos inicialmente na região do hipocampo, seguida pela diminuição da
memória, até a progressão para a completa demência (AKAISHI et al., 2008).
A cascata de eventos que caracteriza a DA é originada pela clivagem errônea
da proteína precursora amilóide (APP), que é uma proteína de membrana expressa
27
por muitas células, inclusive os neurônios do SNC. A APP é processada pelas β e γ
secretases, que ao realizarem a clivagem proteolítica da mesma originam peptídeos
beta-amilóides (Aβ) 1-40 e 1-42, os quais resultam na formação de depósitos
extracelulares amorfos denominados placas senis. Estas placas acarretam em
neurotoxicidade, inflamação, diminuição das sinapses e apoptose (Figura 1)
(HAASS; STROOPER, 1999; SELKOE, 2001).
O peptídeo Aβ1-42 é a forma mais tóxica dentre os derivados da clivagem da
APP devido a um resíduo metionina na posição 35, o qual, quando oxidado gera a
metionina sulfóxido, que é responsável por modular o estresse oxidativo. O peptídeo
Aβ1-40 é um fragmento mais curto, porém menos estável que o Aβ1-42, o que torna
sua produção reduzida em relação ao outro peptídeo (BUTTERFIELD; BOYD-
KIMBALL, 2005; MURRAY; SINDONI; AXELSEN, 2005).
Figura 1: Fotografia de uma lâmina do córtex cerebral sob observação microscópica demonstrando neurônios e a localização de uma placa amilóide Fonte: http://anatpat.unicamp.br/bineualzheimer.html
Os mecanismos responsáveis pela neurotoxicidade das Aβ são complexos,
mas parecem envolver um desequilíbrio na homeostase intracelular do cálcio e
potássio, indução de estresse oxidativo e ativação do processo de morte celular.
28
Além disso, transtornos da transmissão da acetilcolina e acetiltransferases ocorrem
freqüentemente nos indivíduos afetados (HAASS, 2004; MATTSON, 2004)
Outro fator no estágio bioquímico, responsável pelos eventos da DA, são os
emaranhados neurofibrilares intraneuronais, compreendidos por filamentos de uma
forma fosforilada da proteína TAU (Figura 2). A TAU é um constituinte normal dos
neurônios, estando associada aos microtúbulos, e, na DA a mesma sofre
fosforilação sendo depositada dentro das células como filamentos helicoidais
pareados. No momento em que as células morrem, estes filamentos se agregam na
forma de emaranhados extracelulares que, somados às placas senis contribuem
para os eventos patológicos da DA (BUTTERFIELD, 2004).
Figura 2: Fotografia de uma lâmina do córtex cerebral sob observação microscópica demonstrando neurônios e a localização das alterações neurofibrilares de TAU Fonte: http://anatpat.unicamp.br/bineualzheimer.html
29
Entretanto, verifica-se ainda que diversos fatores ambientais e genéticos
convergem para a susceptibilidade de desenvolver a DA. Observa-se que a baixa
escolaridade, traumatismo craniano, sexo feminino, depressão, diabetes melittus,
hipertensão arterial, fumo, hiperinsulinemia, inatividade física, fibrilação arterial, dieta
rica em gorduras e alterações genéticas, apresentadas nos cromossomos 21, 14, 19
e 12, são fatores de risco que interagem entre si durante toda a vida dos pacientes e
qualifica-os a desenvolver a DA (MEDEIROS, 2007).
3.1.4 Sintomas da Doença de Alzheimer
A fase inicial da DA é descrita por muitos pesquisadores como uma
diminuição suave da cognição. Esta fase é intermediária entre o estado normal do
indivíduo e a etapa avançada da DA. Pacientes neste estado inicial apresentam um
declínio na cognição, porém, nenhum sinal de demência. As atividades de vivência
diárias não são afetadas, entretanto ocorrem brandas perdas de memória (MORRIS
et al., 2001; MORRIS, 2005).
Posteriormente iniciam-se dificuldades discretas de memória, perda de
interesse e apatia. O prejuízo de memória aumenta gradualmente, e aparecem
déficits de outras capacidades cognitivas, como julgamento, raciocínio abstrato,
cálculos e habilidades visuo-espaciais (RINWA et al., 2010).
Nos estágios intermediários da doença surge a afasia, que afeta a fluência e
começa como uma dificuldade para nomear objetos ou escolher a palavra certa para
expressar uma idéia. Essa afasia é progressiva em muitos pacientes, especialmente
naqueles com doença de início precoce, levando a perda total da seqüência lógica
da fala (KAPCZINSKI; QUEVEDO; IZQUIERDO, 2004).
A progressão da doença torna o paciente completamente dependente das
pessoas que tomam conta dele. A linguagem fica reduzida a simples falas ou
palavras e nos estágios finais da doença os pacientes apresentam grande alteração
do ciclo sono/vigília, tendem a perambular e tornar-se episodicamente agitados e
irritáveis. As tarefas diárias ficam comprometidas devido à apatia, cansaço e
depressão, o que leva à perda da mobilidade e até mesmo de atender a suas
30
necessidades pessoais, como vestir-se, alimentar-se e cuidar da higiene (CADDEL;
CLARE, 2010).
Devido a diversas complicações, inúmeras patologias oportunistas acabam
por levar o paciente a óbito. Todas essas manifestações são temporais e ocorrem
com a progressão da doença sendo resultados da neurodegeneração progressiva do
SNC (FORLENZA, 2005).
3.1.5 Estresse oxidativo e Alzheimer
Diversos estudos demonstram que déficits de memória são conseqüência de
desequilíbrios entre espécies reativas de oxigênio (EROs) e a capacidade
antioxidante disponível no cérebro. Além disso, o acúmulo de proteínas oxidadas no
cérebro potencializa a neurodegeneração e diminui as funções cognitivas (AMES,
2006; CORBETTA; PATEL; SHULMAN, 2008).
O estresse oxidativo tem sido avaliado como uma das vias cruciais na
patogênese de diversas doenças, incluindo desordens neurodegenerativas, câncer e
isquemia (LI; MA; LIU, 2007). Uma vez que os neurônios são particularmente
suscetíveis a EROs, o estresse oxidativo é apontado como uma das fontes das
várias alterações patológicas que ocorrem na DA, pois as macromoléculas
biológicas oxidadas levam a distúrbios homeostásicos que podem resultar na morte
celular (GLADE, 2010).
Todos os tecidos do organismo são vulneráveis a danos oxidativos devido a
alta utilização de oxigênio, aumento dos níveis de ácidos graxos poliinsaturados e
alta transmissão de íons metálicos. Uma vez que o tecido cerebral tem relativamente
baixos índices de antioxidantes, este é altamente suscetível a danos oxidativos
causados pela reação do óxido nítrico com compostos oxigenados, que gera
espécies altamente reativas (ALTIERI, 2008).
A deterioração cumulativa e agravada das mitocôndrias desempenha um
papel importante no processo de envelhecimento e é uma característica central do
declínio nas habilidades de funcionamento cognitivo, que é comumente associado
com o avançar da idade (MURPHY, 2009). As mitocôndrias desempenham um papel
essencial na geração de energia, o que as torna alvos extremamente suscetíveis a
31
oxidantes biológicos exógenos e endógenos. Estima-se que 2 a 3% do oxigênio
consumido pelas mitocôndrias é convertido em superóxido (PRYDE; HIRST, 2011).
Quando a taxa de entrada de elétrons na cadeia respiratória excede a
capacidade limite, podem ocorrer reações que sobrecarreguem a capacidade
de extinção dos radicais livres, servindo de gatilho para uma produção exacerbada
de EROs (KING; SHARPLEY; HIRST, 2009).
Visto isto, observa-se diversas linhas de pesquisa que buscam aumentar o
arsenal antioxidante a nível cerebral visando uma longevidade cognitiva, impedindo
que patologias neurodegenetarivas como a DA venham a afetar cérebros mais
sucetíveis, como é o caso dos idosos (GLADE, 2010).
3.1.6 Processos inflamatórios e Alzheimer
As células microgliais, que possuem um elevado poder fagocitório,
representam uma variedade dos macrófagos que atuam na defesa do sistema
nervoso. Pacientes com DA exibem ativação substancial da microglia nas áreas
afetadas de seus cérebros, com a infiltração microglial bem localizada e infiltrada em
torno das placas amilóides (MEDEIROS, 2007).
Componentes do sistema complemento mostram-se desregulados nas placas
neuríticas e emaranhados neurofibrilares. Diversos fatores demonstram que este
processo inflamatório não é meramente um subproduto da cascata patológica,
podendo efetivamente contribuir para a progressão da doença, possibilitando até
mesmo a inicialização da DA (MEYER-LUEHMANN et al., 2008).
Diversos estudos demonstram que danos neuronais progressivos estão
associados à doença, podendo ser conseqüência de reações inflamatórias locais no
SNC. Neste sentido, tem sido proposto que uma fagocitose ineficiente dos peptídeos
Aβ por parte da microglia, e que a conseqüente hiperativação celular, liberação de
mediadores inflamatórios e fatores neurotóxicos contribuiriam de maneira decisiva
no processo neurodegenerativo verificado na DA (LUCIN; WYSS-CORAY, 2009).
Estudos epidemiológicos tem reportado uma substancial diminuição de risco
de desenvolver DA após utilização prolongada de antiinflamatórios não-esteroidais
(AINES). Os AINES têm causado redução da ativação da microglia e uma
32
diminuição no depósito de Aβ em cultura de cérebro de animais. Além disso, estes
estudos sugerem ações sobre as γ-secretases pela seletiva redução do Aβ42.
Associado aos AINES verifica-se ainda a utilização de substâncias antioxidantes,
que seriam capazes de reduzir a prevalência da DA e melhorar os sintomas
inflamatórios de pacientes acometidos por esta patologia (VLAD et al., 2008)
3.1.7 Tratamento
A DA é atualmente tratada utilizando-se agentes que restituem o nível de
transmissão colinérgica no cérebro, através da inibição das duas maiores enzimas
de clivagem de ACh, a acetilcolinesterase (AChE) e a butirilcolinesterase (BChE)
(LOIZZO et al., 2008), além da redução da transmissão glutamatérgica, que em
níveis elevados torna-se tóxica (ARRIETA, 2006).
O tratamento baseado na hipótese colinérgica da disfunção cognitiva postula
que o declínio cognitivo experimentado pelos pacientes com DA resulta da
deficiência do neurotransmissor ACh na transmissão colinérgica
(SONKUASARE;KAUL; RAMARAO, 2005; MENICHINI et al., 2009).
Os fármacos anticolinesterásicos aprovados pela Food and Drug
Administration (FDA) nos Estados Unidos para o tratamento da DA são a tacrina,
donepezil, e galantamina (inibidores reversíveis da enzima, respectivamente de
duração curta, intermediária e longa), e a rivastigmina (inibidor irreversível).
Entretanto, todos estes têm limitações clínicas quanto ao seu uso, isso devido tanto
aos seus respectivos tempos de meia-vida, quanto aos seus efeitos colaterais
indesejáveis (SONKUASARE; RAMARAO, 2004; FORLENZA, 2005).
Todavia, estes fármacos apresentam uma terapêutica paliativa e limitada,
porque apenas melhoram os déficits de memória no estágio inicial da doença, uma
vez que não interrompem o processo neurodegenerativo (EPIS et al., 2010).
Outros fatores relevantes são as respostas positivas ao tratamento, que
dependem da integridade dos neurônios pré-sinápticos, além da série de efeitos
colaterais e/ou adversos provenientes do aumento dos níveis de ACh nos sistemas
periféricos e centrais, tais como: distúrbios gastro-intestinais (vômitos, náuseas,
cólicas abdominais , diarréia e anorexia), hipotensão, bradicardia, dores de cabeça
câimbras e disfunção hepática. Para alguns pacientes, os efeitos adversos e/ou
33
colaterais são tão intensos que levam a não adesão ao tratamento (HAKE, 2001;
SONKUASARE; KAUL; RAMARAO, 2005).
Determinadas pesquisas levaram a constatação de que uma alta estimulação
excitatória causava danos cerebrais aos pacientes comprometidos pela DA. Em
virtude disso, o FDA aprovou a utilização da Memantina em 2003 (ARRIETA, 2006).
A memantina é o primeiro fármaco desta uma nova classe de medicamentos
que está sendo recomendada para os estágios moderado a grave da DA. Trata-se
de um fármaco antagonista, não-competitivo do receptor N-metil-D-aspartato
(NMDA), que bloqueia os efeitos patológicos dos níveis elevados de glutamato
(DOODY et al., 2007).
O glutamato é o principal neurotransmissor excitatório do cérebro. Constata-
se que uma alta estimulação glutamatérgica pode resultar em prejuízo neuronal,
levando a morte de neurônios e prejudicando ainda mais o quadro geral do paciente
comprometido com a DA. Este fenômeno é denominado excitotoxicidade (CASTILLO
et al., 2010).
Em função da evolução da patologia, a cognição e a funcionalidade do SNC
acabam ficando cada vez mais comprometidos. Assim sendo, diversos distúrbios
comportamentais acabam por atingir cerca de 90% dos pacientes com DA
(SERENIKI; VITAL, 2008).
É comum a estes pacientes a ocorrência de estados de agitação psicomotora,
vagância, agressividade, ansiedade e alucinações, o que determinam muitas vezes
a institucionalização dos mesmos. Verifica-se ainda uma alta incidência de
depressão, inapetência, insônia e irritabilidade que acabam por complicar ainda mais
o tratamento do doente e a convivência com os familiares (BIERMAN et al., 2009).
O tratamento da DA é bastante complexo, uma vez que a esta patologia afeta
o SNC de maneira bastante degenerativa. Diversos medicamentos são utilizados e
associados para auxiliar o tratamento da DA. Além dos anticolinesterásicos, que
tratam apenas falta de memória, são empregados medicamentos como os
antipsicóticos, ansiolíticos e antidepressivos que tem por propósito ajudar a melhorar
o quadro geral dos pacientes (PAULO; YASSUDA, 2010).
Em virtude do exposto acima, verifica-se que a DA ainda é uma patologia que
não apresenta cura e apresenta um tratamento bastante complexo e ineficiente em
relação a neurodegeneração. Sendo assim, diversos estudos continuam sendo
34
realizados no sentido de buscar novos compostos com mais efetividade do que os
existentes e/ou apresentando menos efeitos colaterais (CHUANG, 2010).
3.1.8 Modelos farmacológicos para o estudo do Alzheimer
As inovações na compreensão dos mecanismos patofisiológicos relacionados
à DA estão sendo descritos em função de diversos modelos animais, que têm
contribuído consideravelmente para estes avanços. Graças aos modelos animais é
possível realizar a avaliação de eventuais drogas com potencial terapêutico, não
apenas de aliviar a demência associada com a DA, mas de modificar o processo da
doença (VAN; DE DEYN, 2006).
A DA é uma patologia neurodegenerativa ligada ao metabolismo energético.
Por este motivo o estresse oxidativo tem ganhado bastante importância nas últimas
décadas, pois diversas teorias demonstram que distúrbios cognitivos, como a DA,
têm sido caracterizados por danos celulares relacionados às EROs (FIGUEIREDO et
al., 2008).
Modelos farmacológicos que nos permitem mimetizar situações que ocorrem
em pacientes com DA são essenciais para o estudo de substâncias com efeitos
sobre esta patologia (WEI et al., 2005).
A cascata da neurodegeneração na DA está associada com estresse
oxidativo, disfunção mitocondrial, diminuição do metabolismo energético e ativação
das sinalizações das vias de apoptose celular (LESTER-COLL et al., 2006). Portanto
a investigação de drogas com potencial sobre a DA necessita de modelos que
possam induzir modificações neurológicas semelhantes as que ocorrem na patologia
(ANNAHÁZI et al., 2007).
Estudos recentes têm demonstrado que a administração contínua de injeções
de D-Galactose (D-Gal), em roedores, tem a ação de produzir radicais livres.
Subseqüentemente a D-Gal leva a uma redução na expressão de proteínas,
deterioração do aprendizado e funções da memória, associados com a diminuição
do sistema colinérgico no córtex cerebral (HUA et al., 2007; LEI et al., 2008)
A D-Gal é um açúcar redutor e pode ser metabolizado em concentrações
normais. Entretanto, em altos níveis, pode reagir com aminas livres e aminoácidos,
35
em proteínas e peptídeos “in vivo”, levando à formação de produtos finais de
glicação avançada, finalmente resultando em estresse oxidativo e acarretando em
danos semelhantes aos encontrados na DA (ZHANG et al., 2005; WEI et al., 2005;
LU et al., 2007).
A administração intracerebroventricular (ICV) de estreptozotocina (STZ) é
outro modelo farmacológico que tem sido descrito como uma metodologia
apropriada para causar DA esporádica, uma vez que proporciona uma progressiva
deterioração da memória e redução da glicose e metabolismo energético cerebral
(AWASTHI et al., 2010).
Os danos relacionados à STZ abrangem a inibição da síntese de ATP e
acetil CoA, que resulta numa deficiência do sistema colinérgico. Associado a estas
ações verifica-se também uma redução da atividade das acetiltransferases (AChT)
no hipocampo e um aumento na ação das AChE no cérebro de ratos (GEROZISSIS,
2008).
A STZ causa severas anormalidades nas vias metabólicas controladas pelos
receptores de insulina (IR). Os IR têm sido implicados na regulação da alimentação,
controle do peso e reprodução. Diversos estudos têm demonstrado relação entre
estes receptores e a DA, uma vez que o hipocampo e o córtex cerebral contém uma
alta densidade destes receptores (ZHAO et al., 2004).
A dessensibilização do IR têm sido proposta como a causa da redução do
metabolismo energético e síntese de acetil CoA, com resultados na deficiência
colinérgica. A deterioração dos IR está associada com a patogênese do
envelhecimento do cérebro e desordens neurodegenerativas, como a DA
(AGRAWAL et al., 2009).
Por fim, o decréscimo na sinalização da insulina causada pela administração
ICV de STZ resulta em injúria oxidativa, hiperfosforilação da proteína TAU e
precursores de proteína β-amilóide, o que sugere uma neurodegeneração
relacionada com a DA (PINTON et al., 2010).
Outras metodologias ainda vêm sendo aplicadas para estudar os processos
relacionados ao desenvolvimento e progressão da DA. Recentemente a
administração ICV de peptídeos Aβ (1-40 e 1-42), em camundongos, tem ganhado
destaque em diversas publicações devido à capacidade de assemelhar-se a
patogenia da DA (MCLARNON; RYU, 2008).
36
Estes prejuízos cognitivos têm sido documentados tanto em camundongos
geneticamente modificados, que apresentem uma expressão aumentada de APP,
quanto em roedores após a administração central aguda ou crônica dos fragmentos
Aβ 1-40 ou Aβ 1-42 (PREDIGER et al., 2007).
Numerosos animais knockout’s e trangênicos têm sido desenvolvidos para
explorar aspectos característicos da DA, visando avaliar avanços terapêuticos
particulares. A supressão de genes que codificam proteínas envolvidas na
patogênese, tem ajudado a antecipar os efeitos de novas moléculas desenhadas
para regular estas proteínas (EPIS et al., 2010).
A primeira geração desses animais, foi desenvolvida utilizando avanços na
tecnologia de DNA complementar, visando à expressão da APP humana em
cromossomos artificiais de leveduras (LAMB et al., 1993). Já a segunda geração
desses animais trangênicos possibilitou a criação de mutações nas presenilinas-1.
Ao cruzar estes animais com os animais com maior expressão de APP foi possível
criar camundongos com dupla alteração (BORCHELT et al., 1994, SAURA et al.,
2004).
Estudos mais recentes idealizaram uma terceira geração de animais
especiais, com três mutações, os quais são denominados 3xTg-AD. Estes
camundongos trangênicos expressam alterações nas presenilinas-1, APP e MAPT,
que são alterações nas proteínas TAU, o que possibilita a formação de novelos
neurofibrilares (ODDO et al., 2003; BALLATORE et al., 2007).
3.3 Aspectos gerais sobre plantas medicinais
As plantas medicinais vêm sendo utilizadas desde os primórdios da
humanidade, fazendo parte da evolução da medicina e cultura de diversas
populações. Muitos são os exemplos da utilização de ervas e plantas medicinais
pela cultura oriental, além dos diversos exemplos presentes em nosso país
(CECHINEL-FILHO, 2001; BARREIRO; BOLZANI, 2009).
O apelo para o tratamento com produtos naturais é muito bem aceito pela
população, principalmente a idosa, fato que fez com que o Sistema Único de Saúde
37
(SUS) adotasse essa prática, como o Programa Nacional de Plantas Medicinais e
Fitoterápicos, visando a utilização de diversas plantas medicinais, para o tratamento
de inúmeras afecções (FUNARI; FERRO, 2006).
A Organização Mundial da Saúde estima que atualmente mais de 1/3 da
população mundial, ainda não tem acesso regular aos medicamentos essenciais e
para tratamento de variadas afecções recorre à medicina tradicional. Esta situação
ocorre principalmente em países menos desenvolvidos. Portanto, a própria OMS
reconhece e estimula a utilização e o desenvolvimento das plantas e produtos
naturais para alívio de doenças (WHO, 2003).
O Brasil por sua vez tem uma flora extremamente rica e muito pouco
explorada. Estima-se que das 200 mil espécies vegetais existentes, 10 mil são
medicinais. Verifica-se que o Brasil concentra aproximadamente um terço das
espécies vegetais existentes no planeta, fato que nos proporciona uma fonte
bastante rica para o desenvolvimento de novos fitoterápicos e fitofármacos (CRAGG;
NEWMAN, 2009).
O mercado farmacêutico mundial cresce exponencialmente a cada ano.
Grande parte disso deve-se à pesquisa e desenvolvimento de medicamentos
fitoterápicos. Este setor movimenta cerca de 22 bilhões de dólares por ano, sendo
os valores dessas movimentações no mercado brasileiro correspondentes a cerca
de 160 milhões de dólares. Enquanto a venda de medicamentos sintéticos cresce
em torno de 4% ao ano, os fitoterápicos alcançam cerca de 15%. Estes valores
refletem o que a população mundial busca: medicamentos com menos efeitos
colaterais, mais baratos e mais eficazes, aliados à crença popular dos efeitos
benéficos da utilização de produtos naturais (CARVALHO et al. 2008).
Trevisan e Macedo (2003), realizaram um screening com diversas plantas
visando a avaliação do potencial anticolinesterásico de seus extratos. Foram
estudados 58 extratos de 30 espécies de diversos gêneros vegetais, através de
avaliação bioautográfica dos extratos sobre a atividade enzimática. Nestas análises
os autores consideraram resultados de inibição maior ou igual a 50% como critério
de seleção para o fracionamento químico. A partir do trabalho de triagem, Paulilinia
cupana (guaraná), Amburana cearensis (cumaru) e Lippia sidoides foram as
espécies que demonstraram melhores resultados, inibindo de 65 à 100% a atividade
enzimática nos ensaios realizados (TREVISAN; MACEDO, 2003)
38
Diversos estudos comprovam a ação de compostos naturais e extratos de
inúmeras plantas sobre a DA. Um exemplo é a quercetina, que apresenta-se como
um ótimo composto para auxiliar o tratamento da DA. Bhutada e colaboradores
(2010), verificaram a ação deste flavonóide em animais com DA induzida por
estreptozotocina (STZ) e verificaram que a quercetina preservou a memória dos
animais.
Determinados compostos polifenólicos, como os flavonóides Kaempferol,
Morina e Miricetina foram estudados, apresentando ação antioxidante e, portanto,
protetora do SNC em modelos de indução de DA (ONO et al., 2006; ANEKONDA et
al., 2006).
A Curcumina, um composto isolado da Curcuma longa reduz o acúmulo de Aβ
no cérebro de ratos transgênicos. Outros estudos demonstram que neste mesmo
modelo, um extrato de Ginkgo biloba previne o declínio da cognição espacial
(STACKMAN et al., 2003; YANG et al., 2005). Sharma e Gupta (2002)
demonstraram que o Resverastrol, um composto polifenólico presente na semente
de uvas e no vinho tinto é capaz de prevenir o déficit cognitivo de ratos, no modelo
de indução da DA por STZ.
A Huperizina A, um alcalóide extraído da Huperzia serrata, e o extrato de
Camellia sinensis (popularmente conhecida como chá verde) aumentaram a
concentração de acetilcolina em encéfalo de camundongos, através da inibição da
acetilcolinesterase, resultando em uma ampliação da memória (LIANG; TANG, 2004;
KIM et al., 2004).
3.4 Gênero Rapanea e Rapanea ferruginea
A Rapanea ferruginea é uma espécie pertencente à família Myrsinaceae, a
qual possui cerca de 40 gêneros e 1400 espécies. Dentre essas, em território
brasileiro foram detectados 8 gêneros e cerca de 70 espécies (SOUZA, 2005). O
gênero Rapanea apresenta árvores de porte médio, sendo a R. ferruginea
caracterizada como uma árvore com até 12 m de altura e 50 cm de diâmetro. Os
frutos são utilizados como alimentação da fauna silvestre, em especial inúmeras
39
espécies de pássaros, além dos seres humanos utilizarem como condimento em
vinagre (LORENZI,1992; LORENZI, 2000).
A Rapanea ferruginea (Figura 3) é uma espécie pantropical, encontrada na
América do Sul entre os países Bolívia, México, Argentina, Paraguai, Uruguai e no
Brasil. Encontra-se esta espécie principalmente nos estados litorâneos, dentre eles:
Bahia, Espírito Santo, Rio de Janeiro, Minas Gerais, São Paulo, Paraná, Rio Grande
do Sul e em Santa Catarina (LORENZI, 2000).
Figura 3: Fotografia da Rapanea ferruginea evidenciando a altura da árvore e os galhos com frutos Fonte: GAZONI (2009)
Esta espécie apresenta outra sinonímia científica, Myrsine coriacea e é
conhecida popularmente como “coporoquinha”, “canela-azeitona”, “canela-azeitona”,
“azeitona-do-mato”, “copororocaçu”, “capororoca-vermelha”, “pororoca” e
“capororoca-mirim” (SANCHOTENE, 1985; CARVALHO, 1994).
Diversas espécies de Rapanea apresentam derivados do ácido benzóico
prenilado, os quais apresentam-se como os componentes majoritários do
metabolismo secundário destas espécies. Já foram identificados os compostos ácido
mirsinóico A, B, C, D, E e F em diferentes espécies do gênero Rapanea (JANUÁRIO
et al., 1991; HIROTA et al., 2002)
Estudos conduzidos por pesquisadores do Núcleo de Investigações Químico
Farmacêuticas (NIQFAR) da Universidade do Vale do Itajaí demonstraram que
extratos das cascas da R. ferruginea apresentam atividade antinociceptiva,
juntamente com o ácido mirisinóico B (AMB) por meio da interação com os sistemas
adrenérgico, colinérgico, oxidanitérgico e parcialmente com o sistema
serotoninérgico (HESS et al., 2010). Observa-se ainda a ação antinociceptiva do
40
AMB na dor neuropática causada pela constrição parcial do nervo ciático em
camundongos (ANTONIALLI, 2008), e na dor neuropática diabética (GALVAN,
2007).
Outros estudos demonstram a atividade antiinflamatória do AMB administrado
oralmente, em modelo de dor inflamatória induzida por carragenina (ANTONIALLI,
2008) e potencial anti-hiperglicemiante em animais diabéticos induzido com aloxano,
onde o extrato da R. ferruginea e o AMB diminuem a glicose plasmática em jejum
(MATTOS, 2006; MONTEIRO et al., 2007)
O ácido mirsinóico A (AMA), isolado por Gazoni (2009), apresentou atividade
anticolinesterásica em estudo bioautográfico realizada através de placas
cromatográficas. Estes resultados subsidiaram a avaliação deste composto em
ensaios “in vitro” utilizando a metodologia de Ellman (1961), em tecido cerebral de
ratos. Os resultados indicaram uma atividade do AMA na inibição da enzima AChE
nas estruturas cerebrais: cerebelo, córtex, estriado, hipocampo e em cérebro total de
ratos (FILLIPIN, 2010).
A avaliação da atividade anticolineterásica do AMA, “in-vitro”, subsidiam a
continuidade dos testes e a avaliação do potencial deste composto em modelos “in
vivo”, onde as condições dependem de todo o metabolismo e barreiras fisiológicas
dos animais.
3.5 Lipídios e doença de Alzheimer
Os lipídios de origem vegetal são misturas de tri, di, e monogliceróis,
esteróis, glicolipídios, fosfolipídios e ácidos graxos livres. Os triglicerídeos (Figura 4)
são ésteres formados a partir do glicerol e ácidos graxos (MOTA; SILVA;
GONÇALVES, 2009).
A metabolização dos triglicerídeos ocorre através do processo digestivo,
realizado por atividade enzimática através de lipases, acarretando na liberação de
ácidos graxos, processo que ocorre através da hidrólise dos ésteres destas
moléculas (FRANCO, 2007).
41
Figura 4: Fórmula estrutural do (a) ácido graxo, (b) glicerol e (c) triglicerídeos. Sendo R uma cadeia hidrocarbônica com número de carbonos e de insaturações diferentes para cada ácido graxo. A numeração 1,2 e 3 refere-se à posição de cada ácido graxo no triglicerídeo. Fonte: COLZATO e colaboradores (2009).
Comparativamente, os óleos de origem vegetal possuem os níveis mais
elevados de ésteres de ácidos graxos poliinstaturados que os de origem animal.
Estes produtos são indispensáveis para diversos processos metabólicos, e, muitos
deles não podem ser sintetizados pelo nosso organismo, devendo ser encontrados
na alimentação (NOVELLO; PRANCESCHINI; QUINTILIANO, 2008).
Os componentes lipídicos, especialmente os ácidos graxos, estão presentes
nas mais diversas formas de vida, desempenhando importantes funções na estrutura
das membranas celulares e nos processos metabólicos (YEHUDA et al., 2002).
Os ácidos graxos poliinsaturados têm sido alvo de inúmeros estudos nas
últimas décadas. Destaca-se a importância da sua ingestão na fase gestacional
(HORNSTRA, 2000), nos primeiros meses após o nascimento (UAUY, 2001), na
terceira idade (ALBERTAZZI; COUPLAND, 2002) e em diversas doenças,
principalmente degenerativas, como é o caso da DA, Parkinson e esclerose
amiotrófica (SUMIYOSHI et al., 2008).
Muitos destes ácidos graxos são denominados essenciais, pois os animais
não conseguem sintetizá-los. Estes compostos encontram-se principalmente na
composição das células vegetais, sendo sua presença imprescindível na dieta,
especialmente, em se tratando dos ácidos linoléico e o linolênico, que são
precursores de diversos outros ácidos graxos (MARTIN et al., 2006).
Os ácidos graxos poliinsaturados abrangem as famílias de ácidos graxos
ômega-3 (n-3), ômega-6 (n-6) e ômega-9 (n-9), e desempenham importantes
funções no desenvolvimento e funcionamento do cérebro e da retina (MARTIN et al.,
2006).
42
Cerca de 70% do peso seco da bainha de mielina é de lipídeos, dentre eles
esfingolipídios, cerebrosídeos, sulfatídios e esfingomielinas. Um dos ácidos graxos
mais comuns dentre os esfingolipídeos é o ácido nervônico, que é o componente
majoritário dos cerebrosídeos e sulfatídeos da bainha de mielina (SANDHOFF,
2010).
Patologias como a adrenoleucodistrofia apresentam uma progressiva
desmielinização dos tecidos cerebrais centrais e periféricos, além de uma
insuficiência do córtex adrenal, sendo caracterizadas pela presença de ácidos
graxos de cadeias longas, como os ácidos hexacosanóico e tetracosanóico em
diferentes fluidos e tecidos biológicos. A presença destes ácidos graxos é
caracterizada pela ineficiência da defesa antioxidante do organismo na proteção dos
tecidos (DEON et al., 2007).
Estudos com administração dietética de ácido docosahexanóico (22:6 n-3) em
ratos com DA induzida pela infusão do peptídeo Aβ (1-40), demonstraram que este
ácido graxo possibilitou um aumento na cognição dos animais no modelo de
avaliação da memória do labirinto radial de 8 braços. O aprendizado e número de
erros foram diminuídos significativamente, quando comparados os animais normais
e com DA induzida, que receberam a administração prolongada do ácido
docosahexanóico (DHA), com os animais com DA sem a administração do DHA
(HASHIMOTO et al., 2005).
Astarita e colaboradores (2010) investigaram a taxa do DHA no fígado de
pacientes portadores da DA e verificaram uma concentração reduzida deste ácido
graxo poliinsaturado. O DHA é precursor de diversos ácidos graxos essenciais para
o funcionamento dos neurônios, entre eles o ácido tetracosanóico, um esfingolipídeo
formador da bainha de mielina dos neurônios.
Estudos reportam que a administração dietética de DHA em animais com DA
induzido está relacionada com uma melhora na cognição, facilitação da memória,
proteção da integridade da membrana lipídica e das funções celulares neuronais
(OSTER; PILLOT, 2010; JICHA; MARKESBERY, 2010)
Um estudo clínico com 402 pacientes demonstrou que a suplementação com
DHA não foi capaz de aumentar a memória, em avaliações cognitivas, além de
reduzir a degeneração cerebral, que foi determinada através de RMN (QUINN et al.,
2010).
43
Evidências sugerem que uma desestabilização das membranas neuronais
pelos oligômeros Aβ, pode ser um dos mecanismos primários para a patogenia da
DA. Vários estudos demonstram que a administração de colesterol e DHA protegem
culturas neuronais da neurotoxicidade dos oligômeros de Aβ (FLORENT-BE´CHAR,
et al., 2009).
Além disso, Hashimoto e colaboradores (2005) demonstraram que a
administração do DHA diminuiu significativamente o nível de peptídeo β-amilóide em
frações de membrana de animais com DA tratados com o DHA, em comparação aos
animais sem o tratamento com o composto. Sabe-se que a membrana plasmática
neuronal é facilmente perturbada pelas proteínas Aβ, sendo essas alterações
fundamentais para a cascata patológica da DA. Por outro lado, tem-se avaliado que
a manutenção da proteção lipídica possibilita uma proteção contra os efeitos
deletérios da DA sobre estas células (WASSALL et al., 2009).
Diversos estudos realizados em todo mundo demonstram que os ácidos
graxos poliinsaturados vêm tornando-se fortes aliados na pesquisa frente a DA.
Pesquisas com novas molécula subsidiam novos estudos (SU, 2010). Sendo assim,
a avaliação de um ácido graxo proveniente da R. ferruginea pode acrescentar a
literatura novos dados sobre o tratamento com ácidos graxo sobre esta patologia.
44
4 MATERIAIS E MÉTODOS
4.1 Material:
4.1.1 Material Vegetal:
As partes aéreas da Rapanea ferruginea foram coletadas no município de
Blumenau, rua Belo Horizonte, estado de Santa Catarina, Brasil, em janeiro de 2009.
O material vegetal foi identificado pelo Prof. Oscar Benigno Iza (UNIVALI) e
uma amostra foi depositada no Herbário Barbosa Rodrigues (Itajaí/SC), sendo
catalogada pelo código HBR52715.
As partes aéreas foram submetidas à secagem em uma sala de secagem
com temperatura e umidade controladas. Após estabilização do material vegetal, o
mesmo foi separado em caule, folhas e frutos. Posteriormente os frutos foram
processados em um moinho de facas, sendo triturados para preparo da solução
extrativa.
4.1.2 Material e Reagentes:
O perfil cromatográfico por CCD dos extratos e compostos puros obtidos foi
realizado com placas de sílica gel 60 GF 254, de 20 µm de espessura, preparados
sobre folhas de alumínio da Merck. Utilizaram-se vários sistemas de eluentes,
dependendo da polaridade das amostras. O revelador químico específico
empregado na CCD foi o anisaldeído sulfúrico (identificação de terpenos e
esteróides).
Foi utilizada como fase estacionária sílica gel 60 (Merck) de granulometria 70-
230 mesh (φ = 0,063-0,20mm). O diâmetro e altura das colunas foram escolhidos de
acordo com a quantidade do material a ser cromatografado. A eluição foi realizada
com solventes orgânicos em ordem crescente de polaridade. Os solventes utilizados
45
foram hexano (Hex), diclorometano (DM), acetato de etila (AcOEt), acetona e
metanol (MeOH) provenientes dos Laboratórios Dinâmica, Quimex ou Vetec. As
frações coletadas foram reunidas conforme as semelhanças de fator de retenção
(Rf) identificadas na CCD.
Para análise de RMN H1 e RMN C13 foi utilizado o clorofórmio deuterado,
proveniente da Cambridge Isotope Laboratories Inc, tendo como referência interna o
tetrametilsilano (TMS) ou o próprio solvente. Os deslocamentos químicos foram
registrados em valores adimensionais δ (ppm).
Para realização dos ensaios farmacológicos utilizou-se solução salina (NaCl
0,9%) para diluições dos compostos e como controle negativo, STZ (MP
Biomedicals) para a indução da DA, Galantamina (Sigma-Aldrich) como fármaco de
referência, xilasina e ketamina (Rhobifarma) para anestesiar os animais.
Os reagentes utilizados nas análise bioquímicas estão descritos ao longo da
metodologia.
4.1.3 Equipamentos:
Para visualização da fluorescência dos compostos rastreados por CCD, foi
utilizada radiação ultravioleta Minerallight (λ = 254 e 366nm), e, os espectros de
RMN 1H e RMN13C foram realizados em espectrômetro BRUKER AC-300F 300 MHz.
Os extratos foram concentrados em rotavapor TECNAL TE-2II com controle
de temperatura, e pesados em balança analítica SHIMADZU LIBROR-AEG-220 e
SHIMADZU LIBROR EB-33OD.
Os experimentos farmacológicos pré-clínicos foram realizados
utilizando-se a esquiva inibitória Insigth, labirinto em cruz elevado de camundongos
e de ratos, e o Open Field de camundongos e de ratos (Insigth).
As análises bioquímicas foram realizadas com auxílio de uma guilhotina,
homogeinizador Potter, sonicador de sonda (Branson) e uma centrífuga de
eppendorf refrigerada.
46
4.2 Métodos
4.2.1 Obtenção do extrato
Os frutos da R. ferruginea (1,2 kg) foram submetidos à maceração com
diclorometano por um período de 5 dias. Após este período o extrato diclorometano
da Rapaena ferruginea (ERF) foi filtrado e concentrado em evaporador rotativo.
4.2.2 Fracionamento cromatográfico do extrato
O ERF (25,0 g) foi submetido à cromatografia em coluna aberta (CC1). O
esquema de eluição utilizado apresenta-se descrito na Tabela 1. Tal gradiente foi
escolhido baseado na observação prévia do comportamento do extrato frente a
diferentes eluições do mesmo em Cromatografia em Camada Delgada (CCD).
Tabela 1: Gradiente de eluição da CC1 no fracionamento do extrato diclorometano da R. ferruginea
Eluente % Volume eluído (mL) Frações obtidas
Hex 100 1500 1-10
Hex/Acetona 95:5 750 11-12
Hex/Acetona 90:10 750 13-14
Hex/Acetona
MeOH
50:50
100
500
500
15
16
Coletaram-se coletadas 16 frações que foram acompanhadas por CCD.
Após verificação do perfil químico, as mesmas foram reunidas de acordo com a
semelhança cromatográfica. A reunião delas está disposta na Tabela 2.
47
Tabela 2: Reunião das frações obtidas na CC1
Frações Nomenclatura
1 FR1
2-6 FR2
7-12 FR3
13-14 FR4
15 FR5
16 FR6
As frações FR3 e FR4 foram selecionadas para purificação cromatográfica
considerando seus rendimentos e perfis cromatográficos.
A CCD da FR3 apresentava 4 manchas quando reveladas com anisaldeído
sulfúrico, das quais, a substância sob Rf 0,5 apresentava-se em quantidade muito
superior às outras.
A purificação cromatográfica da FR3 foi realizada através de cromatografia
em coluna aberta (CC2), e tem seu esquema de eluição descrito na Tabela 3.
Tabela 3: Gradiente de eluição da CC2 no fracionamento da FR3
Eluente % Volume eluído (mL) Frações obtidas
Hex 100 200 1-5
Hex/AcOEt
Hex/AcOEt
95:5
50:50
800
300
6-69
70-77
Foram coletadas 77 frações, as quais após análise sob CCD foram reunidas
de acordo com o perfil cromatográfico das substâncias. A junção das frações deu
origem 4 sub-frações da FR3, as quais estão dispostas na Tabela 4.
48
Tabela 4: Reunião das frações obtidas na CC2
Sub-frações Nomenclatura
1-5 Sfr1a
6-19 Sfr2a
20-60 Sfr3a
61-77 Sfr4a
Observando o perfil cromatográfico das sub-frações obtidas da CC2
verificou-se que a Sfr3a apresentava apenas uma mancha roxa quando avaliada por
CCD sob revelação com anisaldeído sulfúrico. Esta sub-fração, caracterizada como
um óleo levemente amarelado e teve uma alíquota direcionada para a elucidação
estrutural por RMN.
Avaliando o perfil cromatográfico da FR4 foi possível verificar uma grande
concentração de uma substância de coloração roxa, quando revelava-se a CCD com
anisaldeído sulfúrico. Em função disto e do elevado rendimento desta fração,
procedeu-se a separação cromatográfica da mesma. A cromatografia em coluna da
FR4 (CC3) foi realizada utilizando-se o esquema de eluição descrito na Tabela 5.
Tabela 5: Gradiente de eluição da CC3 no fracionamento da FR4.
Eluente % Volume eluído (mL) Frações obtidas
Hex 100 100 0
Hex/AcOEt 99:1 200 1-33
Hex/AcOEt 95:5 200 34-56
Hex/AcOEt 90:10 250 57-73
Hex/AcOEt 85:15 500 74-112
Hex/AcOEt 80:20 200 113-137
Hex/AcOEt 75:25 200 138-149
Hex/AcOEt 70:30 200 150-166
Hex/AcOEt 60:40 100 167-174
Hex/AcOEt 50:50 100 175-181
Hex/AcOEt 25:75 100 182-190
AcOEt 100 200 191-205
MeOH 100 300 206-208
49
Foram obtidas 208 frações, as quais sofreram avaliação do perfil
cromatográfico por CCD. As substâncias foram reunidas de acordo com sua
semelhança química e a junção delas está demonstrada na Tabela 6.
Tabela 6: Reunião das frações obtidas na CC3
Sub-frações Nomenclatura
1-9 Sfr1b
10-37 Sfr2b
38-40 Sfr3b
41-51 Sfr4b
52-62 Sfr5b
63-68 Sfr6b
69-71 Sfr7b
72-79 Sfr8b
80-86 Sfr9b
87-98 Sfr10b
99-119 Sfr11b
120-134 Sfr12b
135-156 Sfr13b
157-194 Sfr14b
195-205 Sfr15b
206-208 Sfr16b
Observando o perfil cromatográfico das sub-frações obtidas da CC3 verificou-
se que a Sfr7b apresentava apenas uma mancha roxa quando avaliada por CCD
sob revelação com anisaldeído sulfúrico.
Esta sub-fração apresentava-se como um óleo claro, levemente amarelado.
Uma alíquota foi separada e destinada para elucidação estrutural a partir da RMN.
50
4.3 Ensaios Farmacológicos
4.3.1 Animais
Para os ensaios farmacológicos “in vivo” foram utilizados ratos albinos (250-
300 g) fêmeas e camundongos Swiss (25-30g) fêmeas obtidos no Biotério Central da
UNIVALI, mantidos a 22-27°C com livre acesso a água e comida, em ciclo
claro/escuro 12:12h exceto durante os ensaios farmacológicos. Os ensaios
farmacológicos foram realizados segundo os aspectos éticos da experimentação
animal, sendo respeitadas as normas preconizadas pelo COBEA (Colégio Brasileiro
de Experimentação Animal). Os experimentos foram aprovados pela Comissão de
Ética em Pesquisa da Universidade do Vale do Itajaí sob Protocolo 300/09 (Anexo
1).
4.3.2 Tratamentos
As doses utilizadas nos experimentos farmacológicos foram obtidas baseadas
na literatura, em testes farmacológicos pilotos, e, em trabalhos anteriores realizados
em nossos laboratórios. A galantamina foi utilizada como controles positivos nos
testes de memória e a doses foi baseada no trabalho de Tanaka e colaboradores
(2009). Solução salina foi utilizada como controle negativo nos experimentos e para
indução de DA por STZ foi utilizado líquor artificial. O líqüor artificial foi preparado
conforme descrito por Berté (2009). A doses de STZ utilizada na indução da DA
foram baseadas nos trabalhos de Pinton e colaboradores (2010).
4.3.3 Modelo de avaliação da memória – teste da esquiva inibitória
A atividade cognitiva dos animais pode ser mensurada através de testes de
esquiva inibitória (Figura 5). A tarefa de esquiva inibitória é um dos modelos mais
utilizados e consiste em inibir a exploração do ambiente pelo animal através da
aplicação de choques de pequena intensidade. O aparelho a ser utilizado é uma
51
caixa medindo 50 cm de comprimento, 25 cm de largura e 25 cm de altura para os
ratos e 30 cm de comprimento, 20 cm de largura e 25 cm de altura para os
camundongos. Parte do chão do aparelho possui grade com barras de bronze, com
1 mm de diâmetro, com espaço de 1 cm. Inicialmente o animal é treinado, e
posteriormente coloca-se o mesmo sobre a plataforma e mede-se o tempo de
latência para a descida. Quando isso ocorre o animal começa a levar choques (0,4
mA) por um período de 2 s e, 24 horas depois são realizados os testes. No teste há
a omissão dos choques e os animais são observados quanto à esquiva do choque.
O aprendizado consiste em o animal não descer da plataforma, sendo utilizado
como parâmetro de aprendizado a latência de descida (IZQUIERDO; MEDINA 1997;
WANG; CHAI; HOLAHAN, 2010).
Figura 5: Fotografia demonstrando a avaliação da memória no teste da esquiva inibitória. Fonte: Autor (2010).
4.3.4 Modelo de ansiedade - teste do labirinto em cruz elevado (LCE)
No teste do labirinto em cruz elevada (LCE), foi avaliada a intensidade do
grau de ansiedade dos animais no momento da exploração do ambiente (Figura 6).
O LCE é constituído de madeira, em forma de cruz grega, com dois braços abertos
(30 x 5 x 0,2 cm), e dois fechados (30 x 5 x 15 cm). Os braços são conectados por
uma área central aberta (5 x 5 cm) e são elevados a uma altura de 45 cm sobre o
52
chão, no caso dos camundongos. O LCE utilizado na avaliação dos ratos possui
dois braços abertos (40 x 10 x 1 cm) e dois braços fechados (40 x 10 x 40 cm), e, é
elevado a uma altura de 50 cm do solo (EMAMGHOREISHI; KHASAKI; AAZAM,
2005).
Os animais foram colocados no centro do LCE voltados para um dos braços
fechados para observação durante 5 minutos. Durante esse tempo, foi registrado
quanto tempo o animal gastou nos braços fechados e abertos, bem como a
freqüência de entradas nos mesmos. As entradas foram definidas quando o animal
esteve com todas as quatro patas no braço visitado (FILE, 1997; RABBANI;
SAJJADI; ZAREI, 2005).
Figura 6: Fotografia demonstrando a avaliação da ansiedade no modelo do labirinto em cruz elevado. Fonte: Autor (2010).
4.3.5 Modelo de deambulação - teste do Open Field
O teste do Open Field (OF) (Figura 7) foi realizado com o intuito de verificar
se o tratamento utilizado não interferiu com a mobilização do animal e
conseqüentemente nos resultados referentes a memória e a ansiedade, uma vez
que os modelos da esquiva inibitória e do LCE exigem o processo de movimentação
do animal tendo o sistema motor influência na resposta emitida
53
Os animais foram transferidos para um aparato de madeira, com um lado de
acrílico transparente e com o assoalho dividido em 9 quadrantes. Durante o período
de 6 minutos cada animal foi observado e o número de cruzamentos entre os
quadrantes bem como o número de posturas de exploração (rearings) foram
contados cumulativamente (RODRIGUES et al., 1996; DE SOUZA et al., 2003).
Figura 7: Fotografia demonstrando a avaliação da locomoção através do modelo do Open Field. Fonte: Autor (2010).
4.3.6 Indução do Alzheimer pelo modelo da Estreptozotocina
Para a indução da DA utilizando o modelo da estreptozotocina (STZ) foram
utilizados 10 grupos de camundongos (n=10). Os procedimentos foram realizados
conforme descrito por Pinton e colaboradores (2010) com algumas modificações
(Figura 8).
Os camundongos, previamente anestesiados Xilazina/Ketamina, sofreram
uma cirurgia para retirada do tecido cutâneo visando a exposição do crânio. Após
este procedimento repousaram por 24 h.
No dia seguinte os animais foram submetidos uma injeção
intracerebroventricular (ICV) de uma solução 2,5 mg/mL de STZ, sendo administrado
um volume de 2,0 µL. O procedimento foi realizado sob anestesia de éter etílico.
54
Após 48 horas da primeira injeção, o método foi repetido com outra administração de
2,0 µL de STZ.
Procedeu-se a injeção utilizando a fissura bregma como referência, sendo o
sítio da injeção 1 mm para a direita ou esquerda do ponto central das fissuras do
crânio, diretamente no ventrículo cerebral. O aparato utilizado para as injeções ICV
consistiu de uma agulha hipodérmica acoplada a uma seringa Hamilton de 5 µL.
Após o período de indução, os animais foram avaliados nos modelos de memória,
deambulação e ansiedade.
Figura 8 – Indução de DA através do modelo farmacológico da STZ para avaliação da memória
4.3.7 Avaliação da memória de animais normais tratados com o ERF
A determinação da memória dos animais normais foi realizada visando
verificar os efeitos do ERF sobre as etapas da memória (aquisição, consolidação e
55
evocação). Os ratos Wistar receberam o ERF nas doses de 50, 150 e 300 mg/kg
(v.o.) e foram submetidos ao teste da esquiva inibitória, conforme o item 4.3.3.
Para avaliação da aquisição, os animais receberam o ERF 1 hora antes do
treino na esquiva inibitória, sendo testados 24 horas após este procedimento. Na
consolidação, o tratamento com o ERF foi realizado imediatamente após o treino na
esquiva, com realização do teste conforme relatado na aquisição. Para a verificação
da atividade do ERF sobre a evocação, os animais foram treinados no equipamento,
e 24 horas após receberam o ERF. Após 1 hora foram testados na esquiva inibitória.
O controle negativo foi tratado apenas com salina (NaCl 0,9%; 0,3 mL/100 g de
peso; v.o.).
4.3.8 Determinação da memória dos animais com Alzheimer induzido por STZ e
tratados com o ERF
Os camundongos com Alzheimer induzindo por STZ, conforme relatado no
item 4.3.6, foram tratados com ERF visando verificar a ação do mesmo sob a etapa
da consolidação da memória, de acordo com o item 4.3.3.
As doses utilizadas foram 50, 150 e 300 mg/kg (v.o.) Como controle positivo
foi utilizado o fármaco referência Galantamina na dose de 0,5 mg/kg (v.o.) (TANAKA
et al., 2009) e o controle negativo recebeu apenas uma solução salina (NaCl 0,9%;
0,1 mL/10 g de peso; v.o.).
No anterior ao teste de memória, os animais receberam novamente o ERF e
controles nas mesmas doses citadas e foram avaliados seqüencialmente na
atividade locomotora, no modelo de deambulação do OF, e ansiedade, através do
modelo LCE, conforme citado nos itens 4.3.5 e 4.3.4 respectivamente.
4.3.9 Determinação da memória dos animais com Alzheimer induzido por STZ e
tratados com o Triglicerídeo
Para avaliação da ação do triglicerídeo sob a consolidação da memória foram
utilizados os camundongos com DA induzida por STZ, conforme descrito no item
4.3.6.
56
Os animais receberam o triglicerídeo nas doses de 5, 15 e 30 mg/kg (v.o.) O
controle positivo foi realizado utilizando o fármaco de referência Galatamina na dose
de 0,5 mg/kg (v.o.) (TANAKA et al., 2009). O controle negativo recebeu somente
uma solução salina (NaCl 0,9%; 0,1 mL/10 g de peso; v.o.).
A determinação dos efeitos do triglicerídeo sob a memória dos camundongos
foi realizada como consta no item 4.3.3. Após 24 horas, os animais foram
submetidos aos testes comportamentais de deambulação e ansiedade, conforme
citado nos itens 4.3.5 e 4.3.4 respectivamente.
4.3.10 Avaliação da memória dos animais com Alzheimer induzido por STZ e
tratados com o AMA
Os efeitos do AMA sobre a consolidação da memória foi determinado com os
animais com DA induzido por STZ conforme demonstra o item 4.3.3.
Os camundongos receberam o AMA nas doses de 5, 15 e 30 mg/kg (v.o.).
Como controle positivo foi selecionado fármaco referência Galantamina na dose 0,5
mg/kg (v.o.) (TANAKA et al., 2009). O controle negativo recebeu apenas uma
solução salina (NaCl 0,9%; 0,1 mL/10 g de peso; v.o.). Após o tratamento com os
compostos, os animais foram avaliados no modelo da esquiva inibitória de acordo
com o item 4.3.3. Conforme descrito anteriormente, também foram analisados os
efeitos do AMA sobre a deambulação e ansiedade 24 horas antes do teste de
memória.
4.4 Análises bioquímicas “in vitro”
Para os testes “in vitro” foram utilizados os camundongos avaliados nos testes
farmacológicos. Após a realização dos estudos “in vivo”, os grupos de animais com
DA induzida e tratados com o TGL e com o AMA foram separados, juntamente com
o controle negativo, e um grupo de animais Naive, os quais representaram animais
normais, sem qualquer indução oxidativa ou cirúrgica.
57
4.4.1 Preparação das amostras de tecido cerebral
Para os estudos bioquímicos, animais foram sacrificados através de
decapitação por guilhotina. Os cérebros foram dissecados e perfundidos com 50mM
(pH 7,4) de tampão fosfato (PBS) em temperatura baixa. Os cérebros foram
homogeneizados em 1% (P/V) de PBS contendo uma mistura de inibidores de
protease a 1200 rpm, utilizando-se um homogenizador Potter. Após, o material
cerebral foi sonicado em 6x/1 min com intervalos de 30 s usando-se sonicador de
sonda Bronson. Os homogeneizados foram divididos em duas frações. Uma foi
centrigugada a 8000 g/10 min para obter o sobrenadante. Alícotas do sobrenadante
foram utilizadas para determinar a atividade das seguintes enzimas: catalase (CAT),
glutationa peroxidase (GPx), glutationa redutase (GR) os níveis de malondialdeído
(MDA), além de proteínas totais. A segunda parte do homogenizado foi centrifugada
a 5000 g/10 min a 4°C, e o sobrenadante foi coletado para determinação da
atividade da enzima superóxido dismutase (SOD) (LU et al., 2007).
4.4.2 Medida de sistemas e produtos oxidativos
4.4.2.1 Determinação da atividade da Superoxido Dismutase (SOD).
A atividade da SOD foi determinada pela inibição da auto-oxidação da
adrenalina medida espectrofotometricamente a 480 nm, de acordo com Bannister e
Clabrese (1987. Para tanto, em cada análise, a 1 mL de tampão glicina foram
adicionados 40 µL da amostra. Após zerar o espectrofotômetro (Shimadzu- UV/Vis
1620), 17 µL de epinefrina foram adicionados e a leitura foi realizada por um período
de 2 minutos (SILVEIRA et al., 2009).
4.4.2.2 Determinação da atividade da Catalase (CAT)
A atividade da CAT foi verificada através do método de Aebi (1984). O meio
de reação consistiu de 0,65 mL de tampão fosfato (50 mM, pH 7,0) e 50 µL de
58
amostra . A reação iniciou-se pela adição de 0,3 mL peróxido de hidrogênio 30 mM.
A decomposição de peróxido de hidrogênio foi monitorada em 240 nm a 25ºC (AEBI,
1984; SILVEIRA et al., 2009).
4.4.2.3 Determinação da atividade da Glutationa Peroxidase (GPx)
A atividade da GPx foi verificada através do método de Paglia e Valentine
(1967), através do consumo de NADPH em 340 nm conforme descrito LU e
colaboradores (2007).
4.4.2.4 Determinação da atividade da Glutationa Redutase (GR)
A atividade da GR foi realizada através do método de Mizumo e Ohta (1986),
onde se verificou a diminuição na absorbância em 340nm do NADPH, conforme
descrito por LU e colaboradores (2007).
4.4.2.5 Determinação dos níveis de Malondialdeido (MDA)
A concentração de MDA foi determinada pelo método de Uchiyama e Mihara
(1978) conforme descrito por Lu e colaboradores (2007). Em um eppendorf foram
pipetados 1000 µL de amostra, acrescidos de 300 µL de ácido tiobarbitúrico (0,67%)
e 4 µL de BHT. A mistura foi incubada em banho-maria a 95ºC durante 10 min, e, em
seguida colocada em banho de gelo por 5 min. Em seguida os eppendorfs foram
centrifugados por 10 min a 3500 rpm. O sobrenadante foi lido em 530 nm em
espectrofotômetro.
4.5 Análise Estatística
A análise estatística dos dados da latência de descida da plataforma, no
teste da esquiva inibitória, foi realizada por análise de variância (ANOVA) não
paramétrica de uma via (Kruskal-Wallis). A análise post hoc dos dados foi feita por
59
meio do teste não-paramétrico de comparações múltiplas Dunns. Os resultados
estão apresentados como medianas seguidas dos intervalos interquatil (25-75%).
No teste do OF e LCE os dados foram analisados por análise de variância
(ANOVA) e uma via. A análise post hoc foi feita utilizando o teste de Newman Keuls.
Para os testes “in vitro” foi utilizado ANOVA com o teste de Dunnett como
análise post hoc.
Os dados obtidos são apresentados como médias seguidas pelos
respectivos erro padrão médio (EPM).
Todos os dados foram analisados através do software GrafhPad Prism®,
sendo considerados estatisticamente significantes os valores de p menor do que
0,05 (p<0,05).
60
5 RESULTADOS
5.1 Obtenção e rendimento do ERF, Sfr3a e Sfr7b
Os frutos da Rapanea ferrugina, após secos e processados, sofreram
extração com diclorometano através do processo de maceração para obtenção do
extrato denominado ERF. Em seguida, o ERF foi concentrado em evaporador
rotativo a pressão reduzida e temperatura inferior a 40ºC. Após a completa
eliminação do solvente, o resíduo sólido foi reunido e a massa final foi calculada.
Obteve-se, portanto, um total de 85,25 g de extrato seco, que é equivalente a 7,1%
da massa inicial de material vegetal (1200 g).
O fracionamento do ERF, foi realizado com 25,0 g do extrato através de CC,
resultando em 6 frações. As frações FR3 e FR4 apresentaram um perfil
cromatográfico mais puro e rendimento adequado, sendo selecionadas para
procedimentos cromatográficos posteriores.
A fração FR3 originou a subfração Sfr3a demonstrando uma substância
isolada. A Sfr3a apresentou um rendimento de 560,6 mg, equivalente a 2,24% de
ERF, e, 0,16% em relação ao material vegetal utilizado para a extração. Em seguida
foi encaminhada para determinação da estrutura molecular através de RMN.
A fração FR4, purificada por CC, apresentou uma subfração que revelou uma
substância isolada, a qual recebeu a denominação de Sfr7b. O rendimento calculado
foi de 196,5 mg, equivalente a 0,79% de ERF, e, 0,05% em relação a massa dos
frutos utilizados na extração.
5.2 Identificação das substâncias isoladas e análise do ERF
5.2.1 Identificação da substância Sfr3a
O composto Sfr3a foi isolado por CC de uma fração do extrato diclorometano
dos frutos da R. ferruginea. Este composto apresentou-se como um óleo levemente
amarelado com um odor bastante característico de gordura.
61
A análise do espectro de RMN de 1H do Sfr3a (Figura 9) possibilita a
caracterização deste composto como um lipídio, mais precisamente um triglicerídeo.
A Figura 10 demonstra uma molécula padrão de um triglicerídeo, apontando em sua
estrutura a numeração para facilitar a identificação dos sinais no espectro de RMN 1H. O sinal 1, em 0,88 ppm é referente aos hidrogênios das metilas terminais dos
ácidos graxos, o número 2, em 1,30 ppm é atribuído aos hidrogênios de grupos
metileno das cadeias alifáticas. O sinal número 3, em 1,58 ppm é característico aos
hidrogênios do carbono γ do éster. O sinal 4 em 2,06 ppm está relacionado aos
hidrogênios do carbono β de dupla ligação. O sinal 5, em 2,31 ppm é atribuído aos
hidrogênios do carbono β do éster. O sinal 6 é atribuído aos hidrogênios do carbono
central aos carbonos de duplas ligações, o sinal 7 em 4,17 ppm são referentes aos
hidrogênios ligados ao carbono do glicerol. O sinal 8 está relacionado ao hidrogênio
do carbono α ligado ao oxigênio do éster e finalmente o sinal 9, em 5,36 ppm;
referente aos hidrogênios ligados aos carbonos das duplas ligações.
A Tabela 7 apresenta os sinais encontrados na avaliação espectroscópica
do Sfr3a, juntamente com dados de avaliação de triglicerídeos disponíveis na
literatura.
62
Figura 9: Espectro de RMN 1H (CDCl3, 300 MHz) do Sfr3a.
H
C
C
C
H
H O
H O
H O
CO (CH2)n
CO (CH2)n CH3
CO (CH2)n CH3
(CH2)n CH3
123
4
56
7
89
9992
7
Figura 10: Representação estrutural da molécula de um triglicerídeo demonstrando a numeração relacionada aos carbonos relacionados no espectro de RMN
TMS 1
2
3
4 5
6 7 8
9
63
Tabela 7: Valores de deslocamento químico (δ=ppm) de RMN 1H obtidos para o Sfr3a e comparação com os dados da literatura para o triglicerídeo.
Carbono RMN 1H δ (ppm) Sfr3a
RMN 1H δ (ppm)
GUILLÉN e RUIZ (2001) COLZATO et al. (2008)
Atibuição
1 0,88 0,90 – 0,80 -CH3 2 1,30 1,40 – 1,15 -(CH2)n 3 1,58 1,70 – 1,50 -OCO-CH2-CH2- 4 2,06 2,10 – 1,90 -CH2-CH=CH- 5 2,31 2,35 – 2,20 -OCO-CH2- 6 2,75 2,80 – 2,70 =HC-CH2-CH= 7 4,17 4,32 – 4,10 CH2OCO- 8 5,32 5,26 – 5,20 CHOCO- 9 5,36 5,40 – 5,26 -CH=CH-
O espectro de RMN de 13C/DEPT do composto Sfr3a (Figura 11) apresenta
os sinais dos carbonos metílicos em 14,0 ppm; dos metilênicos na região de 20,0 a
35,0 ppm; o sinal em 62,0 ppm refere-se aos carbonos 7 e o sinal em 68,8 ppm
refere-se ao carbono 8 do glicerol; sinais correspondentes aos carbonos insaturados
encontram-se na região de 127,0 a 130,2 ppm e os sinais dos carbonos das
carboxilas em 172,8 e 173,2 ppm.
Considerando que a técnica de RMN não viabiliza a identificação estrutural
deste tipo de composto, uma vez que os sinais correspondentes as cadeias
carbônicas saturadas dos ácidos graxos podem ter inúmeros carbonos que
aparecerão como o mesmo sinal no espectro de RMN, o composto Sfr3a foi
denominado Triglicerídeo (TGL) neste trabalho. Para uma definição adequada da
molécula do TGL se faz necessário um detector de Massas, que ao fragmentar a
estrutura da molécula torna possível sua identificação.
64
Figura 11: a) Espectro de RMN 13C (b) Espectro de RMN 13C/DEPT da Sfr3a (CDCl3, 75,5 MHz).
Carbonos saturados
Carbonos insaturados
Grupo carboxila
Glicerol
65
5.2.2 Identificação da substância Sfr7b
O composto Sfr7b foi isolado por CC de uma fração do ERF. Esta substância
apresentou-se como um óleo levemente amarelado. Ao realizar-se CCD com
substâncias padrões isoladas da R. ferruginea verificou-se semelhança fitoquímica
por comparação. O Sfr7b apresentou o mesmo Rf e coloração com revelação com
anisaldeído sulfúrico que o ácido mirsinóico A.
Os espectros de RMN 1H e 13C obtidos para o Sfr7b foram comparados com
aqueles obtidos por Gazoni (2009) e constatou-se que este composto tratava-se
realmente do ácido mirsinóico A (Figura 12).
4"
5" 9'
8'
10'
O OH
1234
56
7
1'2'
3'4'
5'6'
7'1"2"
3"
Figura 12: Representação da estrutura molecular do ácido mirsinóico A
66
Figura 13: Espectro de RMN 1H (CDCl3, 300 MHz) do Sfr7b.
No espectro de RMN 1H (Figura 13) observou-se em 7,76 ppm o sinal
correspondente aos hidrogênios aromáticos 2 e 6. Os sinais em 5,32 e 5,08 ppm
correspondem aos hidrogênios olefínicos 2’, 2’’ e 6’. O sinal em 3,38 ppm é atribuído
aos hidrogênios metilênicos 1’ e 1’’. Finalmente, os sinais em 1,78; 1,68 e 1,60 ppm
são referentes os hidrogênios das 5 metilas existentes no AMA.
67
Figura 14: a) Espectro de RMN13C. b) Espectro de RMN13C/DEPT da Sfr7b (CDCl3, 75,5 MHz)
68
No espectro de RMN 13C (Figura 14 a) o sinal em 171,9 ppm é referente ao
carbono da carboxila, já os sinais de 150 a 120 ppm estão relacionados aos
carbonos aromáticos e olefínicos. Os sinais abaixo de 40 ppm referem-se aos
carbonos alifáticos.
A Tabela 8 dispõe os sinais referentes aos espectros de RMN 1H e 13C
relacionados com o AMA. Estão ainda identificados nesta tabela os sinais de RMN 1H e 13C encontrados por Gazoni (2009), para o AMA.
Tabela 8: Valores de deslocamento químico (δ=ppm) de RMN 1H e 13C obtidos para o Sfr7b e comparação com os dados da literatura para o AMA.
Carbono RMN 1H δ (ppm) Sfr7b
RMN 1H δ (ppm)
GAZONI, 2009
RMN 13C δ (ppm) Sfr7b
RMN 13C δ (ppm)
GAZONI, 2009 1 121,1 121,0 2 7,76 7,77 130,4 130,5 3 127,0 127,0 4 158,0 158,0 5 127,0 127,0 6 7,76 7,77 130,4 130,5 1’ 3,40 3,38 29,6 29,7 2’ 5,32 5,32 121,2 121,2 3’ 139,1 139,1 4’ 39,7 39,7 5’ 2,11 2,11 26,4 26,3 6’ 5,08 5,08 123,7 123,8 7’ 132,0 131,8 8’ 1,68 1,69 25,6 25,7 9’ 1,78 1,77 16,2 16,2
10’ 1,60 1,60 17,9 17,7 1’’ 3,40 3,40 29,3 29,3 2’’ 5,32 5,32 121,3 121,4 3’’ 134,9 134,0 4’’ 1,78 1,77 17,9 17,9 5’’ 1,78 1,77 25,7 25,8
COOH 171,9 172,0
5.2.3 Análise do ERF por RMN
O extrato dos frutos obtido com diclorometano apresentou um perfil muito
simples quando avaliado por CCD, com predominância dos dois compostos
isolados, o TGL e AMA. Este extrato foi então submetido a análise espectroscópica
69
de RMN 1H e 13C. Nas Figuras 14 e 15 estão apresentados estes espectros.
Analisando os espectros nota-se que o ERF apresenta um perfil bastante limpo, com
sinais bem predominantes dos compostos isolados.
As Figuras 15 e 16 apresentam os espectros de RMN 1H e 13C do ERF
comparado aos compostos TGL e AMA. As Tabelas 9 e 10 estão apresentado os
sinais correspondentes aos compostos TGL e AMA no ERF.
Figura 15: Espectro de RMN 1H (CDCl3, 300 MHz) comparando o TGL e AMA com o ERF.
Através desta análise de RMN 1H foi possível determinar a proporção entre
os compostos dentro do extrato. Para realizar isso foi necessário selecionar sinais
exclusivos de cada composto no espectro do ERF. Sendo assim, o sinal em 7,75
ppm, com integral de 1,0 refere-se aos hidrogênios H-2 e H-5 do AMA. Já o sinal em
4,30 ppm, com integral de 1,58, refere-se aos hidrogênios H-7 do TGL. Cada sinal
AM
A
TG
L
TGL
AMA
ERF
70
corresponde a dois hidrogênios. Nas integrais para estes dois sinais tem-se 1,5:1 de
TGL para AMA. Então esta é proporção entre estes dois compostos.
Tabela 9: Valores de deslocamento químico (δ=ppm) de RMN 1H obtidos para o ERF e comparação com os dados dos compostos isolados AMA e TGL
RMN 1H Sinal (δ=ppm) AMA Triglicerídeo Atribuição
0,88 x 1 1,30 x 2 1,60 x x 3 1,68 x 4’’ 1,77 x 5’’ 2,04 x x 4 TGL e 5’ AMA 2,32 x 5 2,77 x 6 3,38 x 1’ e 1’’ 4,14 x 7 4,30 x 7 5,10 x 6’ 5,34 x x 2 e 2’’ AMA / 8 e 9 TGL 7,75 x 2
Figura 16: Espectro de RMN 13C (CDCl3, 75,5 MHz) comparando o TGL e AMA com o ERF.
TGL
AMA
ERF
71
Tabela 10: Valores de deslocamento químico (δ=ppm) de RMN 1H obtidos para o ERF e comparação com os dados dos compostos isolados AMA e TGL
RMN 13C Sinal (δ=ppm)
AMA Triglicerídeo Atribuição
14,08 x C.Saturado 1, 2, 3, 4, 6 16,23 x 9’ 17,71 x 10 17,90 x 4’ 22,58 x C.Saturado 1, 2, 3, 4, 6 22,69 x C.Saturado 1, 2, 3, 4, 6 24,70 x C.Saturado 1, 2, 3, 4, 6 24,84 x C.Saturado 1, 2, 3, 4, 6 25,63 x C.Saturado 1, 2, 3, 4, 6 25,69 x 5’ 25,82 x 8’ 26,36 x 5’’ 27,20 x C.Saturado 1, 2, 3, 4, 6 31,53 x C.Saturado 1, 2, 3, 4, 6 31,91 x C.Saturado 1, 2, 3, 4, 6 34,94 x C.Saturado 1, 2, 3, 4, 6 34,03 x C.Saturado 1, 2, 3, 4, 6 34,20 x C.Saturado 1, 2, 3, 4, 6 39,69 x 4’ 62,11 x 7, 8 68,88 x 7, 8
120,92 x 1 121,16 x 2’ 121,33 x 2’’ 123,76 x 6’ 126,95 x 3 127,41 x 5 127,90 x C. Insaturado 9 128,07 x C. Insaturado 9 129,71 x C. Insaturado 9 130,02 x C. Insaturado 9 130,23 x x 2 130,43 x x 6 132,01 x 7’ 139,09 x 3’’ 157,96 x 3 171,57 x COOH AMA 172,89 x COO TGL 173,31 x COO TGL
72
5.3 Ensaios farmacológicos
5.3.1 Atividade do ERF sobre a memória, deambulação e ansiedade dos
animais normais
O ERF foi administrado em ratos visando verificar seu efeito sobre as etapas
da memória de longa duração (MLD), aquisição, consolidação e evocação. Para
tanto utilizou-se o modelo farmacológico da esquiva inibitória. O ERF (50, 150 e 300
mg/kg) foi administrado pré-treino, pós-treino e pré-teste para avaliação da
aquisição, consolidação e evocação respectivamente.
No processo de aquisição (Figura 17 a), verificou-se que o tratamento dos
animais com ERF facilitou a aquisição da memória dos animais quando comparado
com o tratamento com controle negativo (NaCl 0,9%; 0,3 mL/100 g de peso; v.o.). As
latências de descida da sessão teste dos grupos tratados com 150 e 300 mg/kg
foram respectivamente de 180,0 s (134,5 – 180,0 s) e 180,0 s (180,0 – 180,0 s). Os
controle apresentaram uma latência de 29,5 s (10,5 – 29,5 s). A análise estatística
revelou uma diferença significativa entre os grupos. A análise post hoc mostrou que
a administração do ERF nas doses de 150 e 300 mg/kg aumentou a latência de
descida de forma significativa (p<0,001), em relação ao grupo controle.
Na etapa da consolidação (Figura 17 b) observou-se que todas as doses
utilizadas o tratamento com ERF produziu efeito facilitatório da consolidação da
memória dos animais. As latências de descida nas doses utilizadas (50, 150 e 300
mg/kg) foram 180,0 s (28,0 – 180,0 s), 177,5 s (61,0 – 180,0 s) e 180,0 s (180,0 –
180,0 s) respectivamente e, o grupo tratado com veículo apresentou uma latência de
descida de 14,0 s (10,0 – 26,5 s). A análise estatística apontou uma diferença
significativa entre os grupos. A análise post hoc indicou que a administração do ERF
apresentou diferença significativa, sendo nas doses de 50 e 150mg/kg, p<0,01; e na
dose de 300mg/kg, p<0,001.
Os resultados obtidos da evocação estão apresentados na Figura 17 c. Os
resultados demonstraram que o tratamento com o ERF melhorou a evocação da
memória dos animais testados em todas as doses avaliadas. As latências de
descida dos tratamentos (50, 150 e 300 mg/kg) foram de 117,0 s (67,0 – 180,0 s),
73
175,0 s (61,5 – 180,0 s) e 180,0 s (180,0 – 180,0 s) respectivamente. O tratamento
dos animais com veículo revelou uma latência de descida de 16,5 s (10,5 – 42,5 s).
A análise estatística indicou uma diferença significativa entre os grupos. Verificou-se
que o tratamento com o extrato acresceu 163,5 s, ou de 90,8%, na latência de
descida dos animais da plataforma, para a dose de 300 mg/kg. A análise post hoc
indicou que a administração do ERF apresentou diferença significativa em relação
ao controle, sendo na dose de 50 mg/kg, p< 0,05; na dose de 150mg/kg, p<0,01, e
na dose de 300mg/kg, p<0,001.
74
0
50
100
150
200
Salina ERF50 ERF150 ERF300
A****** Treino
Teste
Latê
ncia
de
desc
ida
(s)
0
50
100
150
200
Salina ERF50 ERF150 ERF300
B** ** ***
Latê
ncia
de
desc
ida
(s)
0
50
100
150
200
Salina ERF50 ERF150 ERF300
C* ** ***
Latê
ncia
de
desc
ida
(s)
Figura 17: Efeito da administração do ERF (50, 150 e 300 mg/kg) 1 hora antes do treino (A – aquisição), imediatamente após o treino (B – consolidação) e 1 hora antes do teste (C – evocação), sobre a latência de descida dos ratos da plataforma nas sessões treino e teste na tarefa da esquiva inibitória. Os dados são apresentados como mediana ± intervalo interquartil. n = 8-10 para cada grupo. Asteriscos indicam diferença significativa quando comparados ao grupo controle: * (p<0,05); ** (p<0,01); *** (p<0,001).
75
Na Tabela 11 estão apresentados os resultados obtidos sobre os efeitos do
tratamento com ERF na avaliação da atividade locomotora dos animais, no teste do
OF, após administração do ERF. Os dados obtidos demonstram que a administração
do ERF não alterou a deambulação dos animais, uma vez que não houve alterações
significativas no número de cruzamentos e de rearings dos animais tratados com o
extrato em relação ao grupo controle.
Tabela 11: Efeito da administração do ERF (50, 150 e 300 mg/kg; v.o.) sobre o comportamento dos ratos no modelo do Open Field. Os dados são apresentados como média ± EPM. n = 8-10 para cada grupo.
Tratamentos Cruzamentos Rearings
Salina 103,1 ± 2,5 50,1 ± 3,2
ERF 50 104,7 ± 4,2 49,9 ± 4,0
ERF 150 101,9 ± 6,1 51,5 ± 2,5
ERF 300 106,2 ± 2,9 53,1 ± 2,8
Na Tabela 12 estão representados os resultados obtidos dos animais
tratados com ERF e submetidos ao teste de ansiedade, o LCE. Os resultados
demonstram que não houve diferenças significativas entre os os animais que
receberam o ERF em relação ao grupo controle, em todos os parâmetros
comportamentais observados
Tabela 12: Efeito da administração do ERF (50, 150 e 300 mg/kg; v.o.) sobre o comportamento dos ratos no modelo do labirinto em cruz elevado. Os dados são apresentados como média ± EPM. n = 8-10 para cada grupo.
Tratamentos % Frequência
no Braço Aberto
% Frequência no Braço Fechado
% Tempo no Braço Aberto
% Tempo no Braço
Fechado Salina 41,5 ± 2,5 58,5 ± 2,5 45,7 ± 3,0 54,3 ± 3,0
ERF 50 43,8 ± 1,7 56,2 ± 1,7 44,3 ± 4,6 55,7 ± 4,6
ERF 150 46,7 ± 3,0 53,3 ± 3,0 43,2 ± 4,1 56,8 ± 4,1
ERF 300 42,5 ± 2,0 57,5 ± 2,0 46,0 ± 3,9 54,0 ± 3,9
76
5.3.2 Ação do ERF sobre a memória, deambulação e ansiedade de animais com
Alzheimer induzido por STZ.
A Figura 18 mostra o efeito da administração do ERF (50, 150 e 300 mg/kg)
e o fármaco de referência, Galantamina (0,5 mg/kg), sobre a latência de descida da
plataforma, no processo de conosolidação da memória no teste da esquiva inibitória,
dos animais com Alzheimer induzido pelo modelo da STZ. Os resultados
demonstram que o tratamento dos animais com o ERF significantemente produziu
efeito facilitatório da memória da esquiva inibitória. As latências de descida dos
animais tratados com as doses de 50, 150 e 300 mg/kg de ERF no teste foram 125,5
s (65,0 – 180,0 s); 145,0 s (84,5 – 180 s) e 180,0 s (130,0 – 180 s) respectivamente,
comparados com o grupo controle (10,0 s (6,0 – 19,0 s). Também foi observado
efeito facilitatório com a Galantamina com uma latência de descida de 133,0 s (60,0
– 180 s).
A análise estatística revelou que existe diferença significativa entre os
grupos. O teste post hoc indicou que a dose de 50 mg/kg foi significativa e
apresentou um p<0,05 em relação ao grupo controle. Da mesma maneira, as doses
de 150 e 300 mg/kg apresentaram, respectivamente p<0,01 e p<0,001. O tratamento
com Galantamina também revelou significância em relação ao controle, obtendo
p<0,05. Observou-se ainda que não ocorreu diferença signficativa entre os grupos
tratados com o ERF em relação ao grupos de animais que receberam Galantamina.
77
0
50
100
150
200
Salina Galant.ERF300
ERF150
ERF 50
* ** *** * TreinoTeste
Latê
ncia
de
desc
ida
(s)
Figura 18: Efeito da administração do ERF (pós-treino) (50, 150 e 300 mg/kg; v.o.) e Galantamina (0,5 mg/kg; v.o.) sobre memória dos ratos com DA induzida por STZ (2,5mg/mL - 0,2uL) nas sessões treino e teste na tarefa da esquiva inibitória. Os dados são apresentados como mediana ± intervalo interquartil. n = 8-10 para cada grupo. Asteriscos indicam diferença significativa quando comparados ao grupo controle: * (p<0,05); ** (p<0,01); *** (p<0,001).
A Tabela 13 apresenta os resultados obtidos com animais com DA induzida
por STZ no teste do OF. A análise estatística revelou que a administração do ERF
(50, 150 e 300 mg/kg) e da Galantamina (0,5 mg/kg) não alteram o número de
cruzamentos e de rearings neste experimento, quando comparados com o grupo
que recebeu veículo.
Tabela 13: Efeito da administração do ERF (50, 150 e 300 mg/kg; v.o.) e Galantamina (0,5 mg/kg; v.o.) sobre o comportamento dos ratos no modelo do Open Field. Os dados são apresentados como média ± EPM. n = 8-10 para cada grupo.
Grupo Cruzamentos Rearings
Salina 120,9 ± 3,0 31,1 ± 3,0
ERF 50 134,8 ± 11,7 30,0 ± 4,7
ERF 150 133,0 ± 4,8 37,1 ± 2,0
ERF 300 135,8 ± 2,9 38,9 ± 1,5
Galantamina 120,1 ± 6,3 31,7 ± 3,1
78
Adicionalmente, também foi verificado que os tratamentos com ERF (50, 150
e 300 mg/kg) quando comparado com o veículo não alterou os parâmetros
comportamentais dos animais no LCE, uma vez que a análise estatística não revelou
qualquer diferença significativa entre os grupos testados neste modelo. Os
resultados (Tabela 14) demonstram que o tratamento dos animais com o extrato não
altera o grau de ansiedade dos animais comparados com o controle.
Tabela 14 : Efeito da administração do ERF (50, 150 e 300 mg/kg; v.o.) sobre o comportamento dos ratos no modelo do labirinto em cruz elevado. Os dados são apresentados como média ± EPM. n = 8-10 para cada grupo.
Tratamentos % Frequência
no Braço Aberto
% Frequência no Braço Fechado
% Tempo no Braço Aberto
% Tempo no Braço
Fechado
Salina 47,5 ± 3,0 52,5 ± 3,0 49,4 ± 4,5 50,6 ± 4,5
ERF 50 39,8 ± 4,0 60,2 ± 4,0 40, 5 ± 3,0 59,5 ± 3,0
ERF 150 39,6 ± 2,6 60,4 ± 2,6 40, 2 ± 4,2 59,7 ± 4,2
ERF 300 45,3 ± 2,6 54,7 ± 2,6 52,6 ± 1,6 47,4 ± 1,6
5.3.3 Atividade do Triglicerídeo sobre a memória, deambulação e ansiedade de
animais com Alzheimer induzido por STZ.
Uma vez que o ERF produziu efeito facilitatório da memória de animais
normais e com DA induzida, também foi avaliado nos mesmos modelos
farmacológicos, o efeito dos compostos isolados desse extrato.
Os resultados obtidos demonstram que o tratamento dos animais com o
triglicerídeo (5, 15 e 30 mg/kg) induziu um aumento na latência de descida dos
animais avaliados na esquiva inibitória quando comparado ao grupo tratado apenas
com a solução salina.
Entretanto, o efeito foi mais pronunciado com a menor dose utilizada (Figura
19). As latências de descida dos grupos tratados com 5, 15 e 30 mg/kg de
triglicerídeo são respectivamente 165,0 s (85,0 – 180,0 s); 130,0 s (40,0 – 180 s) e
79
76,0 s (62,0 – 175,0 s). Os animais que receberam a Galantamina obtiveram 133,0 s
(60,0 180,0 s) e os tratados com salina 10,0 s (8,5 – 16,0 s)
A análise estatística revelou uma diferença significativa entre os grupos
avaliados. O post hoc demonstrou que o triglicerídeo apresentou diferença
significativa em relação ao controle negativo em todas as doses avaliadas, sendo a
dose de 5 mg/kg p<0,001; e as doses de 15 e 30 mg/kg, p<0,5.
0
50
100
150
200
Salina Galant.TGL 30
TGL 15
TGL 5
*** * ** TreinoTeste
*
Naive
Lat
ên
cia
de
de
scid
a (s
)
Figura 19: Efeito da administração do triglicerídeo (5, 15 e 30 mg/kg) e Galantamina (0,5 mg/kg) sobre a memória dos camundongos nas sessões treino e teste na tarefa da esquiva inibitória. Os dados são apresentados como mediana ± intervalo interquartil. n = 8-10 para cada grupo. Asteriscos indicam diferença significativa quando comparados ao grupo controle: *** (p<0,001).
A análise dos resultados obtidos no teste do OF, descritos na Tabela 15,
revelaram que o tratamento com o triglicerídeo na dose de 30 mg/kg promoveu
alterações nos parâmetros comportamentais (rearings e cruzamentos), aumentando
de forma significativa (p<0,01) os rearings, quando comparados ao grupo controle
80
Tabela 15: Efeito da administração do triglicerídeo (5, 15 e 30 mg/kg) sobre o comportamento dos camundongos no modelo do Open Field. Os dados são apresentados como média ± EPM. n = 8-10 para cada grupo. Asteriscos indicam diferença significativa quando comparados ao grupo controle: ** (p<0,01).
Tratamentos Cruzamentos Rearings
Salina 102,6 ± 4,2 44,7 ± 3,4
TGL 5 127,7 ± 8,3 50,1 ± 4,0
TGL 15 112,7 ± 8,3 43,9 ± 2,7
TGL 30 140,0 ± 10,5 51,6 ± 7,3**
Da mesma maneira, o tratamento com 30 mg/kg do TGL produziu alterações
comportamentais no LCE (Tabela 16). Observou-se uma diminuição da freqüência
de entradas no braço aberto e do tempo de permanência nesse braço, ao mesmo
tempo em que aumentou a freqüência de entradas nos braços fechados e o tempo
de permanência neste braço de forma estatisticamente significante, sugerindo que o
composto possa nessa dose produzir efeito sedativo considerável.
Tabela 16: Efeito da administração do triglicerídeo (5, 15 e 30 mg/kg) sobre o comportamento dos camundongos no modelo do labirinto em cruz elevado. Os dados são apresentados como média ± EPM. n = 8-10 para cada grupo. Asteriscos indicam diferença significativa quando comparados ao grupo controle: * (p<0,05); *** (p<0,001).
Tratamentos % Frequência
no Braço Aberto
% Frequência no Braço Fechado
% Tempo no Braço Aberto
% Tempo no Braço
Fechado Salina 47,5 ± 3,0 52,5 ± 3,0 53,8 ± 4,1 46,2 ± 4,1
TGL 5 43,4 ± 2,1 56,6 ± 2,0 48,7 ± 4,1 51,3 ± 4,0
TGL 15 43,4 ± 2,1 60,1 ± 2,8 42,8 ± 3,0 57,2 ± 3,0
TGL 30 26,3 ± 4,8 * 73,7 ± 4,8 * 34,1 ± 5,9 *** 65,9 ± 5,9 ***
81
5.3.4 Efeito do Ácido Mirsinóico A sobre a memória, deambulação e ansiedade
de animais com Alzheimer induzido por STZ.
Também os efeitos do AMA, isolado de uma fração do ERF, foram testados
sobre a consolidação da memória de camundongos com DA induzido pelo modelo
da STZ (Figura 20).
O tratamento com o AMA (5, 15 e 30 mg/kg) promoveu facilitação da
memória dos animais uma vez que aumentou a latência de descida dos mesmos na
tarefa da esquiva inibitória, quando comparado com o controle negativo. As latências
de descida registradas nas doses de 5, 15 e 30 mg/kg e veículo foram
respectivamente de 51 s (34,5 – 92,0 s), 140,0 s (109,5 – 180,0 s) , 143,5 s (101,0 –
180,0 s) e 17,0 s (15,0 – 24,0 s). Também foi observado que o tratamento dos
animais com a Galantamina produziu efeito facilitador demonstrando uma latência
de 133,0 s (60,0 – 180 s) sobre a memória dos animais avaliados.
A análise estatística demonstrou uma diferença significativa entre os grupos.
O post hoc identificou que o tratamento com o AMA apresentou uma diferença
estatística significativa (p<0,001) para as doses de 15 e 30 mg/kg do AMA e da
Galantamina (p<0,01) em relação ao controle negativo.
82
0
50
100
150
200
Salina Galant.AMA 30
AMA 15
AMA 5
*** *** ** TreinoTeste
Latê
ncia
de
desc
ida
(s)
Figura 20: Efeito da administração do AMA (5, 15 e 30 mg/kg; v.o.) e Galantamina (0,5 mg/kg; v.o.) sobre a latência de descida dos camundongos da plataforma nas sessões treino e teste na tarefa da esquiva inibitória. Os dados são apresentados como mediana ± intervalo interquartil. n = 8-10 para cada grupo. Asteriscos indicam diferença significativa quando comparados ao grupo controle: ** (p<0,01); *** (p<0,001).
A análise estatística dos dados obtidos no OF (Tabela 17) revelou que não
houve diferença estatística significativa nos parâmetros comportamentais registrados
neste experimento. Dessa forma, verifica-se que a administração do AMA não
alterou de modo significativo o número de cruzamentos e e o número de rearings,
provavelmente não alterando também a locomoção destes animais na tarefa da
esquiva.
Tabela 17: Efeito da administração do AMA (5, 15 e 30 mg/kg; v.o.) sobre o comportamento dos camundongos no modelo do Open Field. Os dados são apresentados como média ± EPM. n = 8-10 para cada grupo.
Tratamentos Cruzamentos Rearings
Salina 109,9 ± 8,2 44,7 ± 3,4
AMA 5 119,0 ± 12,6 50,0 ± 3,7
AMA 15 111,2 ± 9,2 52,5 ± 6,1
AMA 30 105,8 ± 7,5 53,2 ± 3,8
83
Com relação aos efeitos do AMA sobre os parâmetros comportamentais
avaliados no LCE, a Tabela 18 nos permite verificar que não foram evidenciadas
quaisquer diferenças estatísticas significativas entre os grupos tratados com AMA
em relação ao controle tratado com solução salina.
Tabela 18: Efeito da administração do AMA (5, 15 e 30 mg/kg; v.o.) sobre o comportamento dos camundongos no modelo do labirinto em cruz elevado. Os dados são apresentados como média ± EPM. n = 8-10 para cada grupo.
Tratamentos % Frequência
no Braço Aberto
% Frequência no Braço Fechado
% Tempo no Braço Aberto
% Tempo no Braço
Fechado Salina 37,1 ± 2,1 62,9 ± 2,1 32,5 ± 1,5 67,53 ± 1,5
AMA 5 42,3 ± 1,4 57,7 ± 1,4 32,9 ± 4,1 67,1 ± 4,1
AMA 15 42,4 ± 3,7 57,6 ± 3,7 42,9 ± 5,0 57,0 ± 5,0
AMA 30 37,7 ± 3,7 62,3 ± 3,7 34,6 ± 4,7 65,4 ± 4,7
5.4 Medidas de sistemas e produtos oxidativos
5.4.1 Efeito do TGL sobre a atividade da superóxido dismutase (SOD)
O tratamento dos animais com o TGL aumentou a atividade desta enzima
antioxidante de modo significativo em relação aos animais controle.
Analisando a Figura 21, é possível verificar que o pré tratamento dos
animais com DA induzidos com TGL nas doses de 5, 15 e 30 mg/kg produziu um
aumento da atividade da SOD em 60%, 40% e 20%, respectivamente quando
comparado com animais tratados com veículo (controle). Pode-se observar também
que a dose de 5 mg/kg foi estatisticamente a mais ativa (p< 0,01), resultando em
uma atividade de 1,62 ± 0,02 µg de O2-·/h/mg de proteína. O grupo Naive, que
caracteriza os animais normais, sem danos oxidativos resultantes da DA, apresentou
um valor de atividade da SOD (1,85 ± 0,04 µg de O2-·/h/mg de proteína) bastante
semelhante ao encontrado para a dose de 5 mg/kg de TGL, o que representa a
efetividade deste tratamento na ativação desta defesa antioxidante do tecido
84
cerebral dos animais. As doses de 15 e 30 mg/kg apresentaram resultados menos
expressivos, porém, ainda significativos em relação ao controle negativo.
0.0
0.5
1.0
1.5
2.0ControleNaiveGlicerídeo
5 15 30
Tratamentos (mg/kg)
****
****
SO
D( µµ µµ
M O
2-./h
/mg
pro
teín
a)
Figura 21: Determinação dos efeitos do tratamento com o TGL (5, 15 e 30 mg/kg) sobre a atividade da SOD do córtex cerebral dos camundongos com DA induzida por STZ. Grupo controle representa animais com DA e tratados com NaCl 0,9% e grupo Naive animais normais sem DA. Os dados são apresentados como SEM ± EPM. n = 6-8 para cada grupo. Asteriscos indicam diferença significativa quando comparados ao grupo controle: ** (p<0,01).
5.4.2 Ação do TGL sobre a atividade da catalase (CAT)
Através da Figura 22, é possível verificar que o tratamento dos animais com
o TGL também aumentou a atividade da CAT de modo bastante pronunciado. Pelos
resultados apresentados percebe-se que as doses de 5 e 15 mg/kg, promoveram
aumento da atividade desta enzima em 37,4% e 9,3%, respectivamente,
apresentando diferenças significativas em relação ao grupo controle negativo, que
contém os animais com DA tratados apenas com salina.
Observa-se ainda que o grupo que recebeu o TGL nas doses de 5 e 15
mg/kg apresentaram uma atividade enzimática de 764,0 ± 6,7 µmol de
H2O2/h/mg/proteína e 608,7 ± 6,2 µmol de H2O2/h/mg de proteína, respectivamente,
e, grupo de animais Naive, 784,5 ± 6,6 µmol de H2O2/h/MG/proteína, ambos
significativamente diferentes do controle (p<0,01), que obteve uma atividade de
557,0 ± 8,0 µmol de H2O2/h/mg/proteína. Estes resultados indicam que o tratamento
com o TGL em animais com DA induzida foi capaz de aumentar a atividade da CAT,
85
de modo a aproximar a atividade desta mesma enzima num grupo de animais sem a
patologia instaurada.
0
200
400
600
800ControleNaiveGlicerídeo
5 15 30
Tratamentos (mg/kg)
**
**
**
Cat
alas
e( µµ µµ
mol
H2O
2/h
/mg
pro
teín
a)
Figura 22: Determinação dos efeitos do tratamento com o TGL (5, 15 e 30 mg/kg) sobre a atividade da CAT do córtex cerebral dos camundongos com DA induzida por STZ. Grupo controle representa animais com DA e tratados com NaCl 0,9% e grupo Naive animais normais sem DA. Os dados são apresentados como SEM ± EPM. n = 6-8 para cada grupo. Asteriscos indicam diferença significativa quando comparados ao grupo controle: ** (p<0,01).
5.4.3 Efeito do TGL sobre a atividade da glutationa peroxidase (GPx)
A Figura 23 demonstra que o tratamento dos animais com o TGL aumentou
a atividade da GPx. No entanto, verifica-se que esse efeito foi obtido somente com a
dose menor utilizada.
Animais tratados com o TGL na dose de 5 mg/kg apresentaram uma
atividade de 30,2 ± 0,8 µM de NAD+/h/MG proteína, representando um aumento de
27,6% na atividade da enzima. Este efeito também foi verificado nos animas Naive
que apresentaram uma atividade de 30,2 ± 0,2 µM de NAD+/h/mg proteína. Ambos
os resultados apresentaram diferença significante de p<0,01; em relação ao grupo
tratado apenas com a solução salina, o qual demonstrou uma atividade de 23,6 ± 0,1
µM de NAD+/h mg proteína.
86
0
5
10
15
20
25
30
35ControleNaiveGlicerídeo
5 15 30
Tratamentos (mg/kg)
** **G
Px
( µµ µµM
NA
D+/h
/mg
pro
teín
a)
Figura 23: Determinação dos efeitos do tratamento com o TGL (5, 15 e 30 mg/kg) sobre a atividade da GPx do córtex cerebral dos camundongos com DA induzida por STZ. Grupo controle representa animais com DA e tratados com NaCl 0,9% e grupo Naive animais normais sem DA. Os dados são apresentados como SEM ± EPM. n = 6-8 para cada grupo. Asteriscos indicam diferença significativa quando comparados ao grupo controle: ** (p<0,01).
5.4.4 Ação do TGL sobre a atividade da glutationa redutase (GR)
A atividade da GR esta representada na Figura 24 e os resultados nos
permitem verificar que o tratamento com o TGL na dose de 5 e 15 mg/kg foram
capazes de aumentar de modo significativo a ação da GR em 24,6% e 4,1%
respectivamente em relação ao controle
As dose de 5 e 15 mg/kg apresentaram atividade de 11,2 ± 0,1 µmol de
NADPH/h/mg/proteína e 9,3 ± 0,06 µmol de NADPH/h/mg/proteína respectivamente,
enquanto o grupo Naive uma atividade de de 11,5 ± 0,1 µmol de NADPH/h/mg
proteína, ambos significativamente diferentes (p<0,01) do controle negativo que
obteve uma atividade de 8,9 ± 0,1 µmol de NADPH/h/mg proteína. Não foram
observados efeitos do TGL sobre a atividade enzimática da GR em animais tratados
com doses de 30 mg/kg de TGL.
87
0123456789
101112
ControleNaiveGlicerídeo
5 15 30
Tratamentos (mg/kg)
**
**
**G
R( µµ µµ
mol
NA
DP
H/
h/m
g p
rote
ína)
Figura 24: Determinação dos efeitos do tratamento com o TGL (5, 15 e 30 mg/kg) sobre a atividade da GR do córtex cerebral dos camundongos com DA induzida por STZ. Grupo controle representa animais com DA e tratados com NaCl 0,9% e grupo Naive animais normais sem DA. Os dados são apresentados como SEM ± EPM. n = 6-8 para cada grupo. Asteriscos indicam diferença significativa quando comparados ao grupo controle: ** (p<0,01).
5.4.5 Efeito do TGL sobre os níveis de Malondealdeido (MDA)
Os resultados deste ensaio permitiram avaliar o grau de peroxidação lipídica
encontrada nas amostras do tecido cerebral dos animais tratados com o TGL,
animais controle negativo e o grupo Naive, correspondentes aos animais normais.
Analisando a Figura 25, é possível observar que o tratamento dos animais
com o TGL reduziu a peroxidação lipídica nas amostras avaliadas. Todas as doses
utilizadas (5, 15 e 30 mg/kg) apresentaram resultados efetivos, protegendo
efetivamente o tecido cerebral dos animais de maneira significativa (p<0,01) em
relação ao controle. Os tratamentos reduziram a peroxidação lipídica em 88,6 ; 54,0
e 18,5% respectivamente.
Este teste indicou que com a dose de 5 mg/kg obteve-se uma concentração
de 0,08 ± 0,001 µm de TBARS, enquanto o grupo Naive 0,07 ± 0,01 µm de TBARS.
Já o controle negativo demonstrou uma concentração de 0,27 ± 0,02 µm de TBARS,
indicando uma alta taxa de peroxidação lipídica.
88
0.0
0.1
0.2
0.3ControleNaiveGlicerídeo
5 15 30
Tratamentos (mg/kg)
**
**
**
**
TB
AR
S (
µµ µµm
)
Figura 25: Determinação dos níveis de TBARS nos grupos de camundongos tratados com DA induzida por STZ e tratados com TGL (5, 15 e 30 mg/kg), grupos de animais controle negativo e grupo de animais Naive. Os dados são apresentados como SEM ± EPM. n = 6-8 para cada grupo. Asteriscos indicam diferença significativa quando comparados ao grupo controle: ** (p<0,01).
5.4.6 Efeito do AMA sobre a atividade da superóxido dismutase (SOD)
A avaliação da atividade da SOD no tecido cerebral dos animais que
receberam o tratamento com o AMA (5, 15 e 30 mg/kg) revelou um aumento na
atividade desta enzima. Observando a Figura 26 é possível verificar que o AMA na
dose de 30 mg/kg caracterizou uma atividade enzimática semelhante aos animais
Naive, grupo sem alterações da DA. Entretanto, as análises estatística não
demonstraram qualquer diferença significativa entre os grupos.
89
0.00
0.01
0.02
0.03
0.04Controle
5 15 30
Tratamentos (mg/kg)
NaiveAMA
SO
D( µµ µµ
M O
2-./h
/mg
pro
teín
a)
Figura 26: Determinação dos efeitos do tratamento com o AMA (5, 15 e 30 mg/kg) sobre a atividade da SOD do córtex cerebral dos camundongos com DA induzida por STZ. Grupo controle representa animais com DA e tratados com NaCl 0,9% e grupo Naive animais normais sem DA. Os dados são apresentados como SEM ± EPM. n = 6-8 para cada grupo.
5.4.7 Ação do AMA sobre a atividade da catalase (CAT)
A Figura 27 apresenta os resultados obtidos na determinação da atividade
enzimática da CAT sobre os animais com DA induzida e tratados com o AMA (5, 15
e 30 mg/kg), além dos animais controle e Naive. Observando os dados obtidos, é
possível verificar que o AMA não apresentou atividade sobre esta enzima, uma vez
que não foi possível vericar um aumento em sua atividade. Análises estatísticas não
caracterizaram qualquer diferença significativa entre os grupos avaliados.
90
0
50
100
150
200
250
300
350ControleNaiveAMA
5 15 30
Tratamentos (mg/kg)
Cat
alas
e( µµ µµ
mol
H2O
2/h
/mg
pro
teín
a)
Figura 27: Determinação dos efeitos do tratamento com o AMA (5, 15 e 30 mg/kg) sobre a atividade da CAT do córtex cerebral dos camungongos com DA induzida por STZ. Grupo controle representa animais com DA e tratados com NaCl 0,9% e grupo Naive animais normais sem DA. Os dados são apresentados como SEM ± EPM. n = 6-8 para cada grupo.
5.4.8 Efeito do AMA sobre a atividade da glutationa peroxidase (GPx)
A Figura 28 apresenta os resultados da avaliação da atividade da enzima
GR, do cérebro dos animais com DA induzida por STZ, e tratados com o AMA (5, 15
e 30 mg/kg). Analisando os dados obtidos é possível verificar que o tratamento com
o composto não alterou a atividade da enzima, uma vez que não verificou-se
diferenças significativas em relação ao grupo controle e Naive.
91
GP
x( µµ µµ
M N
AD
+/h
/mg
pro
teín
a)
0
1
2
3
4
5
6
5 15 30
Tratamentos (mg/kg)
ControleNaiveAMA
Figura 28: Determinação dos efeitos do tratamento com o AMA (5, 15 e 30 mg/kg) sobre a atividade da GPx do córtex cerebral dos camundongos com DA induzida por STZ. Grupo controle representa animais com DA e tratados com NaCl 0,9% e grupo Naive animais normais sem DA. Os dados são apresentados como SEM ± EPM. n = 6-8 para cada grupo.
5.4.9 Ação do AMA sobre a atividade da glutationa redutase (GR)
A Figura 29 demonstra os resultados obtidos na determinação da atividade
da enzima antioxidante GR, do tecido cerebral de animais com DA induzida, e,
tratados com o AMA. Analisando os resultados, é possível verificar que o AMA não
apresenta atividade nesta enzima antioxidante, pois não encontrou-se diferenças
significativas em relação aos animais controle.
92
GR
( µµ µµm
ol
NA
DP
H/
h/m
g p
rote
ína)
0.0
0.5
1.0
1.5
2.0
2.5
5 15 30
Tratamentos (mg/kg)
ControleNaiveAMA
Figura 29: Determinação dos efeitos do tratamento com o AMA (5, 15 e 30 mg/kg) sobre a atividade da GR do córtex cerebral dos camundongos com DA induzida por STZ. Grupo controle representa animais com DA e tratados com NaCl 0,9% e grupo Naive animais normais sem DA. Os dados são apresentados como SEM ± EPM. n = 6-8 para cada grupo.
5.4.10 Efeito do AMA sobre os níveis de Malondealdeido (MDA)
Os resultados da avaliação da peroxidação lipídica (Figura 30) dos animais
com DA induzida, e tratados com o AMA, revelaram que este composto não foi
capaz de proteger os lipídios do tecido cerebral de danos oxidativos, uma vez que os
níveis de TBARS encontram-se significativamente equivalentes aos animais
controle.
93
TB
AR
S (
µµ µµm
)
0.0
0.1
0.2
0.3
0.4
5 15 30
Tratamentos (mg/kg)
ControleNaiveAMA
Figura 30: Determinação dos níveis de TBARS nos grupos de camundongos tratados com DA induzida por STZ e tratados com AMA (5, 15 e 30 mg/kg), grupos de animais controle negativo e grupo de animais Naive. Os dados são apresentados como SEM ± EPM. n = 6-8 para cada grupo.
94
6 DISCUSSÃO
A Rapanea ferruginea é uma planta medicinal pertencente a família
Myrsinaceae e que possui ampla distribuição pelo território brasileiro, bem como
diversas outras regiões da América do Sul. Esta espécie tem sido largamente
estudada por pesquisadores da UNIVALI e têm apresentado efeitos farmacológicos
promissores sobre o SNC (PEREIRA et al., 2004; GALVAN, 2007; ANTONIALLI,
2008; GAZONI, 2009; FILLIPIN, 2010)
A avaliação da R. ferruginea foi realizada através da preparação de um
extrato diclorometano (ERF), e, o isolamento e identificação de substâncias foram
oriundas desta extração, o que possibilitou a realização de testes farmacológicos e
bioquímicos na busca de efeitos anti-Alzheimer.
A extração e isolamento de compostos naturais têm colaborado para o
desenvolvimento de muitos fármacos que vêm sendo empregado no tratamento de
diversas patologias. Um exemplo é o alcalóide Galantamina, isolada da Galanthus
nivalis e de várias espécies da família Amaryllidaceae, que apresenta atividade
anticolinesterásica e é utilizado no tratamento da DA desde 2001 (HEINRICH, 2010).
Para a separação e purificação de compostos do ERF procedeu-se
realização de CC. Esta técnica cromatográfica utiliza uma fase estacionária, sílica
gel, e uma fase móvel, caracterizada por uma mistura de solventes orgânicos. A CC
é uma técnica bastante simples, de baixo custo, pouco material, e, que permite o
isolamento de compostos naturais de extratos e frações complexas (CECHINEL-
FILHO; YUNES, 1998; CAO et al., 2010).
Gazoni (2009) isolou diversas substâncias dos frutos, caules e folhas da R.
ferruginea utilizando esta mesma técnica cromatográfica. Entre estas substâncias
isoladas destacam-se o AMA, encontrado em abundância nos frutos, o AMB,
espinasterol, um ácido graxo de cadeia longa e um álcool graxo de cadeia longa,
que foram encontrados nos caules e folhas.
Este trabalho deu continuidade ao isolamento e identificação de substâncias
oriundas dos frutos. Como demonstrado, foi possível isolar novamente o AMA, além
de um lipídio, caracterizado como um triglicerídeo que foi denominado TGL.
As avaliações espectroscópicas de RMN condizeram com os resultados
encontrados anteriormente por Gazoni (2009), demonstrando realmente que o
95
composto isolado tratava-se do AMA. O TGL, também caracterizado por RMN,
apresentou resultados que foram comparados com a literatura, indicando sinais
caracerísticos do núcleo glicerídico, bem como das cadeias dos ácidos graxos
insaturados acoplados ao núcleo do glicerol (GUILLÉN; RUIZ, 2001; COLZATO et
al. 2008).
Até o presente momento não há relatos científicos do isolamento de um
triglicerídeo dos frutos desta espécie, bem como a caracterização farmacológica
deste composto sobre a DA, o que viabiliza as investigações realizadas com este
composto.
Em virtude do bom rendimento, facilidade em isolar e identificar um
composto, com características de marcador fitoquímico para o ERF, procedeu-se
uma avaliação do fingerprint deste extrato por RMN. Os espectros obtidos
mostraram um perfil bastante simples para o extrato, com predominâncias dos dois
compostos isolados. A avaliação metabolômica de extratos vegetais através de RMN
permitiu analisar a composição química de extratos, bem como identificar a
presença de compostos através da análise dos sinais específicos das substâncias
(HEINRICH, 2008).
Investigações metabolômicas têm permitido aos pesquisadores identificar
diferentes compostos em extratos de maneira rápida e precisa. Liu e colaboradores
(2010) utilizaram esta estratégia espectroscópica para diferenciar fitoquimicamente
extratos das espécies Artemisia afra e Artemisia annua, plantas medicinais utilizadas
no tratamento da Malária.
A análise de substâncias naturais é um domínio tradicional da
espectroscopia de RMN. Aplicações quantitativas estão sendo estudadas e
evoluindo ao longo dos anos. Estas análises vêm sendo cada vez mais procuradas,
porque uma grande quantidade de novos compostos, de interesse farmacêutico
derivam de produtos de origem natural (PAULI; JAKI; LANKIN, 2005).
A avaliação do potencial terapêutico desses compostos é quase sempre
confrontada com uma insuficiência na viabilização de padrões primários de
referência. Outra barreira encontrada é a síntese destes padrões analíticos para
quantificar estas substâncias naturais, que muitas vezes é muito complicada e cara,
ou, não é possível. Para produzir um padrão analítico, os compostos ativos devem
ser isolados de sua fonte natural e purificados ao máximo. Além disso, o
96
procedimento analítico deve ser capaz de detectar o padrão e tornar a análise viável
em relação ao extrato de origem (EISENREICH; BACHER, 2007)
Diversos compostos não podem ser detectados utilizando apenas um
método cromatográfico por diversas razões, entre elas a incapacidade da captação
dos sinais pelos detectores. Por outro lado, muitos compostos não apresentam a
volatilidade necessária para análises em cromatografias gasosas, incapacitando a
utilização desta metodologia (WOLFENDER; NDJOKO; HOSTETTMANN, 2003;
KESTING; HUANG; SORENSEN, 2010). Dessa forma, a caracterização de extratos
de plantas farmacologicamente relevantes com métodos cromatográficos, é
freqüentemente complicada devido a sua composição heterogênea. Por outro lado,
nos espectros de RMN de extratos vegetais, quase todas as moléculas solúveis
podem ser determinadas devido à resposta molecular (MALET-MARTINO;
HOLZGRABE, 2011).
O RMN é um método qualitativo e quantitativo satisfatório que permite a
análise de misturas complexas de extratos naturais além da definição da estrutura
molecular para propósitos cromatográficos, sem qualquer padrão natural
correspondente. Além disso, esta técnica se mostra vantajosa em relação aos
demais métodos químicos analíticos, pois além de requerer pouca preparação e ser
rápido, o espectro resultante permite obter parâmetros e informações de interesse e
de imediata comparação (CABRINI, 2007).
A análise de RMN do ERF possibilitou a identificação dos sinais pertinentes
aos compostos isolados AMA e TGL. Através da identificação destes sinais
exclusivos, foi possível realizar a determinação da integral do mesmo, o que permitiu
a verificação da proporção entre os compostos no ERF. Esta determinação resultou
em uma proporção de 1,5 de TGL para 1,0 de AMA, o que demonstra a
superioridade na concentração do TGL dentro do ERF.
A R. ferruginea têm apresentado diversas atividades farmacológicas
importantes, com propriedades antinociceptiva em modelos de dor aguda, bem
como modelos de dores crônicas. Uma ação aintihipernociceptiva foi obtida com
ácidos benzóico prenilado AMB, obtidos da planta, em modelos de hipernocicepção.
O AMB exibiu propriedade antinociceptiva em modelos de dor aguda em ratos e
camundongos (HESS, 2006), sendo que, o mecanismo de ação dessa propriedade
parece ser mediado pelos sistemas cujo mecanismo de ação envolve interações
com os sistemas L-arginina-óxido nítrico, serotoninérgico, colinérgico, bem como
97
interações com receptores α-adrenérgicos (HESS et al., 2010). Devido aos
excelentes resultados em modelos de dor aguda, o AMB também foi testado em
modelos de dores crônicas, como a dor neuropática induzida por diabetes (GALVAN,
2007), ou agentes flogísticos como a carragenina, substância P, histamina,
adrenalina, capsaicina, dentre outros (ANTONIALLI, 2008). Adicionalmente, uma
ação aintihipernociceptiva foi obtida com o composto em modelos de
hipernocicepção, como o modelo da constrição do nervo ciático em ratos, bem como
a hipernocicepção induzida pelo completo adjuvante de Freund (CFA), carragenina e
Prostaglandina E2 (PGE2) em camundongos (ANTONIALLI, 2009).
Extratos e compostos da planta foram testados frente à atividade da enzima
AChE em ensaios “in vitro” realizados com cérebro total e outras estruturas cerebrais
isoladas de ratos, resultando em efeito anticolinesterásico, sendo estes estudos um
indicativo de uma possível ação sobre a memória, além de efeito anti-Alzheimer
(GAZONNI, 2009; FILLIPIN, 2010).
No presente estudo, num primeiro momento, procurou-se verificar o efeito do
ERF sobre a memória de animais normais na tarefa da esquiva inibitória, avaliando
os efeitos do tratamento sobre as diversas etapas da memória (aquisição,
consolidação e evocação). Izquierdo (2002) define como memória, a capacidade de
um indivíduo (animal ou ser humano) armazenar informações, além de conservar e
evocar aprendizados durante sua existência. Sua modulação permite ao indivíduo a
modificação de determinado comportamento, além da aprendizagem e adaptação ao
meio (IZQUIERDO, 2002).
O processo de memória é dividido em três etapas: a aquisição, que é a
apresentação às informações (no caso do humano), e, tarefa ou comportamento
novo (no caso do animal); a consolidação, que caracteriza a filtração e fixação das
informações ou comportamentos adquiridos, e, a evocação, que é o resgate das
informações ou comportamentos consolidados (BOUTON; MOODY, 2004). Essas
etapas podem ser estudadas através de modelos animais como a esquiva inibitória
(IZQUIERDO, 2002; KORNISIUK et al., 2011), o labirinto de 8 braços (radial maze),
como proposto por Olton e Samuelson (1976) (JANITZKY et al., 2011), labirinto
aquático de Morris (water maze) (BANIK; ANAND, 2011), dentre outros. Ratos e
camundongos são os animais preferenciais para estudo com memória, mas, por
questões éticas, modelos de memória estão sendo padronizados com peixes da
espécie Danio rerio, conhecido como Zebrafisher (BROGLIO et al., 2010), répteis,
98
como a tartaruga Pseudemys nelsoni (DAVIS; BURGHARDT, 2007) e até mesmo
insetos, sobretudo moscas da espécie Drosophila melanogaster (MURAKAMI et al.,
2010). Dos modelos de memória, a esquiva inibitória tem se destacado pela
praticidade e facilidade do experimento em si. Trata-se de um modelo no qual o
animal pode aprender a tarefa com um único treino, diferente, por exemplo, de
modelos como o labirinto aquático de Morris, radial maze e a esquiva ativa, os quais
requerem diversas sessões de treino (LOPEZ et al., 2010). A memória da esquiva
inibitória tem sido exaustivamente estudada por pesquisadores renomados como
Kandel (LI et al., 2009), McGaughe e Roozendaal (BARSEGYAN et al, 2010),
Medina (BONINI et al., 2007), Izquierdo (MYSKIW et al., 2010) dentre outros.
Izquierdo e colaboradores (2008), têm estudado a memória da esquiva inibitória
farmacológica e bioquimicamente nas 4 últimas décadas, reunindo evidências entre
a memória da esquiva inibitória e o processo da potencialização de longa duração
(LTP), um processo de neuroplasticidade cerebral descoberto por Blis e Gardner-
Medwuin (1973), descrito como modelo neurofisiológico de memória (SALE et al.,
2011).
Na tarefa da esquiva inibitória, também denominada esquiva passiva, o
animal é colocado sobre uma plataforma, e, ao descer da plataforma, para explorar
o aparato, recebe um choque elétrico de intensidade variável (dependendo do
protocolo adotado) nas patas. Por conseqüência deste choque, o animal “aprende” a
permanecer na plataforma para evitar o choque, ou seja, ele se esquiva de explorar
o ambiente, inibindo um comportamento natural. Neste tipo de teste, o animal é
apresentado a um estímulo aversivo, em associação a um estímulo inicialmente
neutro do ambiente (FOWLER et al., 2011). Em função disso, o aprendizado se dá
rapidamente, uma vez que, instintivamente, os animais procuram evitar essas
situações aversivas. Dessa forma, a resposta da esquiva é, então, simplesmente
uma resposta de fuga com latência reduzida (WANG; CHAI; HOLAHAN, 2010).
Os estudos dos efeitos de compostos puros ou extratos de plantas sobre as
etapas da memória podem ser realizados, dependendo do protocolo utilizado,
independente do modelo animal escolhido. Dessa forma, todas as etapas da
memória têm sido caracterizadas farmacologicamente e bioquimicamente (OJHA et
al., 2010).
No presente estudo, o tratamento de animais normais com ERF produziu
efeito sobre a memória de ratos, avaliados no modelo da esquiva inibitória,
99
facilitando a memória dos mesmos, independentemente da etapa da memória
avaliada. Em relação aos efeitos observados com o extrato da R. ferruginea, esta
espécie apresenta diversos ácidos benzóicos prenilados como componentes
majoritários (HIROTA et al., 2002; GAZONI, 2009). Os ácidos benzóicos prenilados
(como o AMA) encontrados na espécie estudada possuem característica apolar
podendo facilmente atravessar a barreira hematoencefalica dos animais e atingir
regiões cerebrais importantes no processo de memória. Os efeitos desses
compostos sobre o SNC são pouco explorados farmacologicamente, entretanto, já
foram descritos na literatura efeito antioxidante (YAMAGUCHI et al., 2006) , podendo
tal efeito ser relacionado com os resultados facilitatórios do ERF observados no
presente estudo
A facilitação das etapas da memória (aquisição, consolidação e evocação),
verificadas nos testes da esquiva inibitória realizados, pode também estar
relacionada com a alta concentração destes ácidos benzóicos no extrato utilizado,
uma vez que os mesmos têm apresentado atividade anticolinesterásica em diversos
estudos realizados em nossos laboratórios (GAZONI, 2009; FILLIPIN, 2010).
A inibição das enzimas acetilcolinesterases é atualmente o mecanismo de
ação dos principais medicamentos aprovados para o tratamento da DA (EPIS et al.,
2010). Através da inibição da hidrólise enzimática da ACh pela AChE, este
neurotransmissor tem a possibilidade de estimular os neurônios colinérgicos
remanescentes do hipocampo e córtex cerebral, os quais estão sendo degradados
pela patologia. Este mecanismo possibilita uma transmissão colinérgica mais eficaz
e melhora significativamente os processos de memórias (declarativas e não
declarativas) dos portadores da DA (MENICHINI et al., 2009).
A relação entre a ACh, memória e DA tem sido extensivamente estudada
nos últimos anos (TAYEBATI; AMENTA, 2008). A participação da neurotransmissão
colinérgica no processo de memória, sobretudo na etapa da consolidação já foi
ricamente evidenciada em diversos modelos animais (POWER; VAZDARJANOVA;
MCGAUGH, 2003; PEPEU; GIOVANNINI, 2010) como também em seres humanos
(LANE; POTKIN; ENZ, 2006). A indução de amnésia temporária por escopolamina
(um antagonista dos receptores mucarinicos) em modelos animais, têm sido
bastante utilizada por pesquisadores no screening de substâncias com possíveis
efeitos sobre a DA (KLINKENBERG; BLOKLAND, 2010). Além disso, a
escopolamina também foi usada clinicamente (embora menos freqüentemente do
100
que em anos passados) como um adjuvante aos procedimentos cirúrgicos ou de
obstetrícia para induzir sedação e amnésia pós-procedimento (BUCAFUSCO, 2009).
Os extratos brutos das plantas contêm milhares de substâncias, o que torna
difícil a caracterização do mecanismo de ação exato, pois os compostos podem
estar interagindo entre si e atuando em sinergismo. Porém, os estudos realizados
por Gazoni (2009) e Fillipin (2010), reforçam a ação característica do ERF e do AMA
na inibição das colinesterases em ensaios preliminares.
Assim sendo, é possível conjecturar que a ação verificada nos modelos de
memória para o extrato dos frutos da Rapanea ferruginea em animais normais pode
estar relacionada com esta inibição enzimática. Os resultados apresentados
demonstraram que o ERF facilitou o desenvolvimento da atividade na esquiva
inibitória através, do aumento da cognição dos ratos em todas as doses utilizadas.
Analisando os dados obtidos, é possível verificar que a dose de 150 mg/kg foi capaz
de proporcionar uma inibição da descida da plataforma muito semelhante à dose de
300 mg/kg, onde todos os animais não desceram da plataforma no teste. Dessa
forma, as doses de 150 e 300 mg/kg proporcionaram a manutenção da memória dos
animais de maneira eficiente e significativa. Verificou-se ainda, uma grande
discrepância nas latências de descida entre os animais que receberam o ERF em
relação aos animais normais, que receberam apenas o veículo (solução salina),
demonstrando que os animais agiram de maneira significativamente diferente após o
aprendizado da tarefa. Este fato impulsionou-nos a realizar a avaliação do potencial
do ERF sobre a memória de animais com DA induzido.
Como relatado anteriormente, a DA é atualmente a desordem
neurodegenerativa com maior numero de casos diagnosticados no mundo. A DA é
caracterizada por um progressivo déficit cognitivo, bem como diminuição da memória
(RAFII; AUSEN, 2009). Além disso, a DA é uma patologia que apresenta
anormalidades no metabolismo da glicose, onde ocorre uma redução de sua
utilização, bem como alterações na metabolização do fosfato energético adenosina
trifosfato (ATP). Os distúrbios no metabolismo energético estão intrinsecamente
associados a um aumento de estresse oxidativo, o qual pode ser resultado de
oxidação de biomoléculas, e início de excitotoxicitade neuronal (TOTA et al., 2010).
Considerando que a DA apresenta disfunções oxidativas importantes já
relatadas na literatura (AGOSTINHO; CUNHA; OLIVEIRA, 2010), foi escolhido o
101
modelo da STZ, o qual possibilita a indução de dano oxidativo nos animais, para a
avaliação da atividade do ERF e dos compostos isolados, AMA e TGL.
O modelo farmacológico, utilizado para indução de déficit de memória nos
animais, foi a administração de doses subdiabetogênicas de STZ, através de
administrações ICV em roedores. Esse modelo tem sido bem aceito pela
comunidade científica devido à mimetização de vários aspectos patológicos da DA,
como, progressiva deterioração da memória, redução do metabolismo da glicose e
energia cerebral, indução de estresse oxidativo e promoção de disfunção colinérgica
(AWASTHI, 2010; PINTON et al., 2010). A diminuição da utilização cerebral da
glicose, e, os déficits no metabolismo energético representam anormalidades
encontradas em estágios iniciais de deficiência cognitiva, como é apontado em
diversos casos de DA (JEE et al., 2008).
A administração da STZ possibilita uma dessensibilização dos receptores
neuronais da insulina e redução da atividade das enzimas glicolíticas, causando
redução da energia cerebral, e, levando a uma disfunção cognitiva pela inibição da
síntese de ATP. Além disso, a redução da glicose cerebral a níveis críticos afeta o
sistema colinérgico, pois ocorre um decréscimo na síntese de acetilcolina, devido à
diminuição da concentração de acetil-CoA, que é um derivado de glicose (SHOHAM
et al., 2007; SHARMA; SINGH; SINGH, 2008).
Além disso, a glicose é metabolizada em produtos energéticos, e, é
transformada em fonte de energia para o cérebro. Por este motivo, interrupções no
metabolismo energético afetam criticamente as funções cerebrais, além de síntese
protéica e processos celulares e moleculares básicos (SPITALER et al., 2002).
Ishrat e colaboradores (2006) demonstraram ainda que a administração ICV
de STZ reduz a atividade da acetiltransferase (ChAT) no hipocampo, fator que
acarreta em uma deficiência de transmissão colinérgica, a qual é determinante na
redução da memória dos animais.
No presente estudo, o modelo da STZ foi utilizado conforme descrito por
Pinton e colaboradores (2010). Durante o procedimentos, duas infusões de STZ (2,5
mg/mL – 2 µL) foram administradas, em um intervalo de 48 horas entre cada dose,
para a indução de DA, causando nos animais em estudo uma significante redução
nas latências de descida como verificado nos animais tratados com veículo (NaCl
0,9%), e, testados na esquiva inibitória.
102
O déficit de memória causado pela STZ foi revertido pela administração do
ERF, sendo a ação da dose máxima utilizada, superior ao fármaco de referência
Galantamina. Na literatura, já foram evidenciados efeitos de extratos de plantas
(VEERENDRA; GUPTA, 2003), fitoconstituintes como flavonóides (AWASTHI et al.,
2010), e carotenóides (KHALILI; HAMZEH, 2010), revertendo e/ou prevenindo os
efeitos deletérios da STZ sobre a memoria de animais, da mesma maneira como
observado no estudo em questão.
Neste estudo, a administração de apenas uma dose do ERF foi capaz de
reverter os prejuízos gerados pelos danos energéticos e estresse oxidativo induzidos
pela STZ. Entretanto, Deshmukh e colaboradores (2009), e, Bhutada e
colaboradores (2010), realizando experimentos com a mesma metodologia,
necessitaram de administração prolongada dos compostos vimpocetina e quercetina
para melhora do processo cognitivo dos animais.
A STZ, administrada ICV, no ventrículo cerebral dos animais avaliados, tem
a capacidade de alterar a bioquímica local, destruindo diversos neurônios e
danificando a transmissão colinérgica destes animais (PIAZZA et al., 2011). Este
fato é facilmente verificado quando se analisam os resultados dos animais pré-
tratados com o veículo, os quais não tiveram habilidade cognitiva para realizar a
tarefa aprendida.
Os resultados obtidos nesta avaliação monstraram que a administração do
ERF tem a capacidade de facilitar o aprendizado dos animais com o déficit cognitivo
causado pela indução da DA, caracterizando uma ação farmacológica bastante
significativa. Além disso, como observado nos resultados, a Galantamina, utilizada
como controle positivo, apresentou a atividade esperada, melhorando a memória
dos animais de maneira significativa em relação ao controle negativo. Entretanto, a
ação do ERF equivale-se a ação do fármaco de referência, uma que vez não se
encontrou diferenças estatísticas significativas entre os grupos.
Um dos compostos isolados do ERF avaliados no presente estudo foi o TGL.
A determinação dos efeitos do TGL sobre os déficits de induzida por STZ foi
realizada utilizando-se o modelo da esquiva inibitória. Os resultados encontrados
demonstraram que o TGL foi capaz de facilitar a memória dos animais, e, que o
grupo que recebeu tratamento apenas com o veículo foi incapaz de “recordar” a
tarefa aprendida. Este fato foi verificado através do aumento da latência de descida
dos animais na sessão teste. Entretanto, verificou-se que o desempenho dos
103
animais que receberam a menor dose do TGL (5 mg/kg) foi superior as outras doses
utilizadas (15 e 30 mg/kg).
A busca de agentes capazes de proteger o organismo contra a
amiloidogênese e danos oxidativos é o objetivo das futuras terapias contra a DA. Um
tratamento interessante seria conseguir intervenções relacionadas à dietética.
Corroborando com esta situação, verifica-se a existência de muitos estudos
relacionados com o consumo de ácidos graxos poliinsaturados e DA (HASHIMOTO
et al, 2005; SUMIYOSHI et al., 2008).
Recentemente um estudo farmacológico pré-clínico revelou que uma dieta
rica em gorduras poliinsaturadas e polifenóis, influenciam o processo de
neurogênese. Camundongos tratados com uma dieta rica em ácidos graxos
poliinsaturados e polifenóis apresentaram uma maior proliferação de neurônios no
bulbo olfatório e no hipocampo, regiões cerebrais comumente comprometidas em
doentes que sofrem de DA (VALENTE et al., 2009).
Ao contrário do que se pensava anteriormente, sabe-se que os neurônios
continuam a surgir durante a fase adulta do indivíduo, porém a capacidade de
neurogênese do cérebro é limitada a duas áreas: o bulbo olfatório e o hipocampo
(VALENTE et al., 2009). Segundo Valente e colaboradores (2009), uma dieta rica
em polifenóis e ácidos graxos poliinsaturados, influencia significativamente na
prevenção da DA, e eventualmente contribui com a boa manutenção das funções
cerebrais.
Após metabolização enzimática pelas lipases digestivas, o TGL pode ter
disponibilizado para o organismo dos animais uma determinada concentração de
ácidos graxos poliinsaturados, os quais podem ter influenciado na manutenção da
capacidade cognitiva dos mesmos, facilitando o desenvolvimento da memória
durante os testes.
Nossos resultados corroboram com as hipóteses de Valente e colaboradores
(2009), e Sumiyoshi e colaboradores (2008), demonstrando que uma dieta contendo
ácidos graxos poliinsaturados pode caracterizar um tratamento preventivo contra a
DA. Todavia, os resultados obtidos neste estudo foram adquiridos realizando uma
administração aguda do TGL. Sendo assim, tais resultados, subsidiam novos
experimentos utilizando tratamento crônico sob animais com DA induzida, visando
obter um perfil da administração prologada deste composto sobre a memória dos
mesmos.
104
A formação de EROs tem sido proposta como um distúrbio importante na
morte neuronal em uma variedade de desordens neurodegenerativas, como a DA e
a Doença de Parkinson (SHIBATA; KOBAYASHI, 2008). Sabe-se que os neurônios
são particularmente suscetíveis a danos oxidativos resultantes de EROs nestas
células. Radicais livres oxidam diversas macromoléculas biológicas, causando
distúrbios homeostásicos neuronais e resultando em morte celular (DE IULIIS et al.,
2005).
As células cerebrais são bastante vulneráveis ao estresse oxidativo, devido
a sua alta utilização de oxigênio e a seu conteúdo substancial de ácidos graxos.
Danos oxidativos aos lipídios e proteínas podem promover disfunções funcionais e
estruturais nas membranas celulares, inativando enzimas e levando a morte celular
(RESENDE et al., 2008).
A concentração de EROs é determinada através do balanço entre a taxa de
produção destes elementos, e, a taxa de remoção dos mesmos pelos vários
componentes e enzimas antioxidantes. A quantificação da atividade destes sistemas
enzimáticos pode fornecer uma imagem clara do dano oxidativo (PAL et al., 2011).
A melhora no desempenho dos animais nos testes de memória pode ter
relação com um aumento nas defesas antioxidantes do organismo dos animais
submetidos ao tratamento com o TGL. Para verificação dessa hipótese, realizou-se
a medição da atividade das enzimas antioxidantes superóxido dismutase (SOD),
catalase (CAT), glutationa peroxidase (GPx) e glutationa redutase (GR) no tecido
cerebral destes animais. Além disso, o nível de peroxidação lipídica foi realizado o
teste do malondialdeído (MDA).
A SOD é uma enzima que catalisa a dismutação do superóxido em oxigênio
e peróxido de hidrogênio. Assim sendo, constitui uma importante defesa antioxidante
em quase todas as células do organismo expostas ao oxigênio. A função da SOD é
impedir reações prejudiciais do superóxido aos tecidos do organismo. O superóxido,
formado quando o oxigênio, é reduzido por um elétron e é uma das principais
espécies reativas de oxigênio, pois tem a capacidade de reagir com alvos celulares
sensíveis e críticos (TORSDOTTIR et al., 2010). Além disso, o peróxido de
hidrogênio formado pela ação da SOD é uma espécie oxidativa altamente nociva
para o organismo.
Outra enzima deste sistema, a CAT, é responsável pela conversão do
peróxido de hidrogênio em produtos menos reativos para o organismo. A CAT
105
rapidamente catalisa a decomposição do peróxido de hidrogênio em água e oxigênio
(VLASITS et al., 2010).
Entretanto, a ineficiência na degradação deste composto, provoca a criação
de outros radicais livres. O peróxido de hidrogênio tem a capacidade de produzir um
radical livre extremamente poderoso e tóxico através da reação de Fenton. Ao
reagir-se peróxido de hidrogênio com o íon Ferro (Fe2+) ocorre a produção do radical
livre hidroxila (OH•), que tem uma alta capacidade oxidativa e não possui sistema
enzimático para sua eliminação (MORIWAKI; OSBORNE; PHILLIP, 2008).
Sendo assim, a eliminação de todo o peróxido de hidrogênio formado é
extremamente importante. Para isso, existe outro sistema enzimático que constitui
defesa antioxidante em nosso organismo. Este sistema é constituído pelas enzimas
GPx e GR. A GPx utiliza a glutationa reduzida, que deve ser oxidada para o reduzir
o peróxido de hidrogênio. A GR tem por objetivo final a restauração da glutationa
reduzida com auxílio do NADPH, fornecendo este produto para o funcionamento da
GPx (DRINGEN, 2000; SHANMUGAM et al., 2011).
Outro fator mensurável relacionado a danos oxidativos pode ser investigado
analisando-se o grau de oxidação de lipídios. Este processo, denominado
peroxidação lipídica, ocorre quando radicais livres retiram elétrons dos lipídios das
membranas celulares, desestabilizando-as. A avaliação deste processo pode ser
realizada através da quantificação do produto final desta peroxidação, o MDA. Esta
determinação ocorre através da quantificação de MDA que reage com o ácido
tiobarbitúrico (TBARS). Quanto maior a concentração de TBARS, maior o grau de
destruição de membranas (CATALÁ, 2006).
A administração da STZ nos animais causou alterações na capacidade
cognitiva e antioxidante como avaliado nos resultados. Os danos oxidativos
neuronais, em animais com DA induzida por STZ, são consistentes com trabalhos
anteriores que utilizaram a mesma metodologia (ISHRAT et al., 2006; TAHIROVIC et
al., 2007; ISHRAT et al., 2009a; ISHRAT et al., 2009b)
Ishrat e colaboradores (2009a) realizaram tratamento com Selênio, em
animais que apresentavam DA induzida por STZ, e, verificaram uma melhora na
memória dos mesmos, além de um aumento na atividade antioxidante. Ishrat e
colaboradores (2009 b), também investigaram a ação da Curcumina sobre os déficits
de memoria induzidas pela DA, e, resaltaram que o mecanismo de ação deste
composto estaria relacionado com sua capacidade de inibir o estresse oxidativo.
106
Outro estudo, avaliou ainda, a atividade da vitamina E em animais com DA
induzida por STZ, demonstrando que o tocoferol promove um aumento na atividade
das enzimas antioxidantes SOD e GPx nesses animais (HONG et al., 2004).
Em nossos experimentos, o tratamento dos animais com o TGL promoveu
uma melhora na capacidade antioxidante, como demonstrada no aumento da
atividade das enzimas SOD, CAT, GPx e GR ao nível dos animais Naive, que não
sofreram qualquer alteração oxidativa, uma vez que não foram submetidos aos
efeitos da STZ.
Conforme observado através dos resultados apresentados, a menor dose do
TGL foi a responsável pelo melhor efeito nas avaliações farmacológicas, ação que
manteve a mesma característica nos testes bioquímicos. Dessa maneira, é possível
conjecturar que o TGL exerce um efeito protetor sobre o SNC, facilitando memória
dos animais, através da elevação da eficiência do complexo enzimático antioxidante.
Os resultados indicam ainda, que o efeito neuroprotetor do TGL também pode estar
associado com a redução da peroxidação lipídica, como demonstrado na
quantificação de TBARS no teste do MDA. Uma vez que o TGL protege as células
da peroxidação lipídica, sugere-se então, que este composto apresenta a
capacidade de proteger o tecido cerebral, e, dessa forma impedir a degradação
neuronal, como ocorre na DA (NARCISO-GAYTÁN et al., 2011).
Os resultados deste estudo condizem com o exposto por Awasthi e
colaboradores (2010), que investigaram a ação da curcumina; além de Tota e
colaboradores (2010), em sua avaliação da atividade da quercetina, ambos no
mesmo modelo de indução de DA. Nestes estudos, animais tratados com tais
compostos, tiveram uma redução no nível de TBARS da mesma forma que os
animais tratados com o TGL, demonstrando a proteção que estes compostos
realizam sobre o SNC.
Corroborando para a atuação dos ácidos graxos poliinsaturados nos estudos
de agentes anti-DA, Arnal e colaboradores (2010), avaliaram o potencial terapêutico
do DHA e da luteolina. Os autores verificaram que o tratamento dos animais com
estes compostos resultou em uma redução da peroxidação lipídica, além de em um
aumento da atividade da GPx e GR.
Como demonstrado neste estudo, o TGL em sua menor dose foi capaz de
igualar o nível de peroxidação lipídica dos animais com DA induzida, aos animais
Naive, demonstrando que este composto protegeu o cérebro dos animais.
107
Os ácidos graxos poliinsaturados de cadeia muito longa desempenham
importantes funções no desenvolvimento e funcionamento do cérebro. Alguns destes
ácidos podem ser sintetizados pelo organismo a partir dos ácidos linoléico e α-
linoléico, e, estão por muitas vezes presentes em diversos alimentos consumidos em
nossa dieta (MARTIN et al., 2006).
Os esfingolipídeos são ácidos graxos poliinsaturados e são componentes
majoritários da bainha de mielina. Entre eles encontra-se o ácido tetracosanóico,
também conhecido como ácido nervônico, cuja concentração é a mais elevada entre
estes componentes neuronais. Pacientes afetados pela adrenoleucodistrofia
apresentam uma desmielinização do córtex cerebral, associada a uma acumulação
do ácido tetracosanóico em diferentes fluidos orgânicos (SARGENT; COUPLAND;
WILSON, 1994; DEON et al., 2007). Como conseqüência desta desmielinização, os
pacientes com adrenoleucodistrofia apresentam hiperatividade, diminuição do
desempenho escolar, diminuição da compreensão da comunicação verbal (afasia),
dificuldade na deglutição e alterações no tônus muscular. A deterioração progressiva
do sistema nervoso resulta ainda em paralisia, perda da audição, deficiência visual
ou cegueira, deterioração da escrita e do controle motor fino, resultando ao final em
um estado vegetativo para o paciente (JARDIM et al. 2010).
Tem sido reportado que a perda desses ácidos graxos está associada a uma
destruição neuronal, e, à insuficiência do organismo de repor estes componentes
essenciais, resultando em apoptose das células do tecido cerebral. Assim, a
manutenção das concentrações destes ácidos graxos essenciais acarreta em uma
proteção para o organismo (VARGAS et al., 2004).
Neste contexto, no presente estudo, o tratamento com o TGL realizado com
os animais com DA induzida pode ter restaurado em parte, a comunicação entre
alguns neurônios danificados pelo estresse oxidativo, o que resultou numa melhora
da memória por parte dos animais.
As regiões cerebrais associadas às funções mentais superiores,
particularmente o córtex frontal e o hipocampo, são principalmente comandadas pelo
sistema colinérgico. Estes locais são os mais comprometidos pelas alterações
bioquímicas decorrentes da DA (VIEGAS JUNIOR et al., 2004).
O hipocampo é uma estrutura cerebral relativamente simples, e, é o local de
maior importância nos processos relacionados à memória (IZQUIERDO et al., 2008).
Uma vez que é principalmente no hipocampo que ocorrem os processos
108
neurodegenerativos iniciais, os distúrbios relacionados à falta de memória são os
primeiros sintomas da DA. Desta maneira, compostos que apresentem boa inibição
das colinesterases nas regiões cerebrais envolvidas com a memória, têm grandes
chances de serem candidatos a estudos relacionados à DA (ELDER; GASPERI;
SOSA, 2006).
O AMA vem sendo estudado a algum tempo pelos pesquisadores da
UNIVALI e já apresentava-se como um forte candidato a estudos “in vivo” sobre os
processos de memória, uma vez que avaliações “in vitro” demonstram que este
ácido benzóico é capaz de inibir as colinesterases em diversas estruturas cerebrais;
em especial o hipocampo (GAZONI, 2009; FILIPPIN, 2010).
Filippin (2010) demonstrou que o AMA induz uma inibição significativa da
AChE em cérebro total de 67,8% e no hipocampo de 76,7% (concentração de 44,0
µM). O mesmo estudo evidenciou a concentração inibitória da enzima (IC50, de 36,2
µM para o hipocampo e caracterizou a cinética enzimática do composto como um
mecanismo misto envolvendo a formação de um complexo catalítico enzima-inibidor-
substrato.
Os resultados farmacológicos obtidos no presente estudo demonstraram que
a indução da DA por STZ resultou numa diminuição da cognição dos animais, pois o
grupo controle não conseguiu recordar a tarefa aprendida na esquiva inibitória. O
tratamento com o AMA produziu uma ação farmacológica semelhante ao fármaco
referência utilizado como comparativo, a Galantamina, melhorando a memória dos
animais.
Todavia, as análises bioquímicas realizadas com o tecido cerebral dos
animais após tratamento com o AMA, não revelaram qualquer interação significativa
entre este composto e as enzimas antioxidantes SOD, CAT, GPx e GR. Também
não encontrou-se relação entre o tratamento com o AMA, e proteção do tecido
cerebral contra peroxidação lipídica, visto que não verificou-se redução dos níveis de
TBARS no ensaio do MDA.
Como já descrito anteriormente, uma parte substancial da redução da
memória na DA tem sido atribuída a alterações em vários sistemas de
neurotransmissores, destacando-se o sistema colinérgico. A hipótese colinérgica
para a DA sugere uma redução dos marcadores colinérgicos como a ACh e a ChAT,
e um aumento na atividade da enzima AChE (TERRY JUNIOR; BUCCAFUSCO,
2003).
109
Dessa forma, verifica-se que a AChE é um importante alvo para ação
terapêutica de compostos na DA. Inibidores reversíveis desta enzima têm sido
utilizados como facilitadores cognitivos no tratamento da patologia (LANE et al.,
2006).
Pesquisadores em todo o mundo, buscam novos compostos de origem
natural ou sintética, que produzam uma atividade inibitória sobre a AChE.
Entretanto, tais agentes teriam que possuir efeitos adversos menos significativos do
que os atuais tratamentos disponíveis, que compartilham com esse mesmo
mecanismo de ação (ANEKONDA; REDDY, 2005). Sendo assim, os compostos com
atividade anticolinesterásicas, mas também antioxidantes, podem ser uma
alternativa viável na terapêutica da DA (GOMES et al., 2009).
As características farmacológicas fundamentais para qualquer nova planta
medicinal, a qual os almeja-se tranformar em fitoterápico, com a finalidade de tratar
a DA, é sem dúvida a capacidade de estimulação do complexo enzimático
antioxidante endógeno, além da propriedade de inibir as colinesterases cerebrais.
(GOMES et al., 2009).
Na literatura, ainda encontra-se em maior numero os estudos farmacológicos
com fitoconstituientes e/ou extratos de plantas avaliando principalmente os efeitos
anticolinesterásicos. Papandreou e colaboradores (2010) evidenciaram em estudos
farmacológicos e bioquímicos a ação de um extrato açafrão (Crocus sativus L.),
sobre a memória de ratos idosos. Os resultados deste estudo demonstraram que o
açafrão aumenta a latência na esquiva inibitória, facilitando o aprendizado dos
animais senescentes, e, este comportamento está relacionado à capacidade de
inibição da AChE.
O alcalóide huperizina A é outro exemplo de um composto de origem natural
que possui propriedades anti-DA, devido a inibição da AChE. Estudos de síntese
demonstraram ainda que, modificações estruturais nas quais acrescentavam-se
anéis aromáticos neste alcalóide potencializam a ação do mesmo frente às
colinesterases (YAN et al., 2009).
Vinutha e colaboradores (2007) realizaram um rastreamento em 38 plantas
utilizadas na medicina indiana em busca de extratos capazes de inibir a AChE de
maneira eficiente, em estudo “in vitro”, utilizando a metodologia de Ellmann (1961), e
técnica bioautográfica em CCD. Este estudo evidenciou 6 extratos de plantas com
características que subsidiam novos estudos.
110
Diversas outras espécies vegetais, muitas delas freqüentes em nossa dieta,
estão sendo avaliadas como anti-DA. A Beta vulgaris, popularmente conhecida
como beterraba, utilizada como salada em diversos países no mundo, foi estudada
frente a sua atividade anticolinesterásica. Sacan e Yanardag (2010) demonstraram
que um extrato aquoso da beterraba apresenta ação sobre a AChE e pode ser fonte
de recursos para o tratamento da DA.
Com relação aos nossos estudos, pode-se conjecturar que a facilitação da
memória verificada no teste de memória, realizado na esquiva inibitória em animais
com DA induzida, e, tratados com o AMA, pode estar relacionada principalmente
com a ação anticolinesterásica que este composto apresenta.
Muitos compostos derivados de plantas são alcalóides (como a Galantamina
e a Rivastigmina), os quais são conhecidos por suas características
anticolinesterásicas. Recentemente outras classes de compostos naturais como
terpenóides, sesquiterpenos glicosilados e cumarinas têm sido estudados como
novos agentes inibidores da AChE. Estes novos compostos apresentam menor
toxicidade quando comparados aos alcolóides, e, por isso, representam um avanço
na terapia anti-Alzheimer (DALL´ACQUA et al., 2010).
Outra estratégia encontrada pelos pesquisadores na busca de compostos
anti-DA é o design e a síntese de novas moléculas tomando como base compostos
derivados de produtos naturais. Uma série de compostos flavonolídicos
desenvolvida por Sheng e colaboradores (2010) demonstratam inibição da AChE e
da BChE, sendo alguns compostos mais potentes que a rivastigmina e com maior
inibição enzimática que o donepezil.
Vários estudos, que visam o desenvolvimento de extratos e compostos para
o tratamento da DA, têm sido realizados com plantas que possuem ação
reconhecida sobre o SNC em outras atividades. As espécies Hypericum perforatum,
Hypericum androsaemum e Hypericum undulatum, reconhecidas por suas
propriedades antidepressivas foram avaliadas quanto a ação anticolinesterásica.
Hernandez e colaboradores (2010) demonstram que extratos aquosos das três
espécies apresentaram atividade sobre as colinesterases e ação antioxidante, as
quais foram relacionadas à alta concentração dos compostos como o ácido
clorogênico, hiperosídeo, isoquercetina, quercetina e rutina, presente nas espécies.
Outros estudos “in vitro”, realizados com um extrato metanólico da
Tabernaemontana divaricata, demonstraram que esta espécie, rica em alcalóides,
111
tem uma capacidade de inibir as colinesterases em mais de 90% (INGKANINAN et
al., 2003), sendo usada na medicina popular no tratamento da miastenia gravis
(PRATCHAYASAKUl, et al., 2008). Chattipakorn e colaboradores (2007)
investigaram a ação de um extrato da Tabernaemontana divaricata “in vivo” frente à
inibição da AChE em ratos, e, verificaram que a espécie apresenta uma capacidade
de inibir a enzima de maneira reversível, aumentando a memória do roedores. Além
disso, a planta demonstrou exercer efeito revertendo o déficit cognitivo induzido pelo
peptídeo amilóide (NAKDOOk et al 2010). Além disso, exibe propriedade
antioxidante (JAIN et al, 2010), o que subsidia estudos posteriores para uma melhor
avaliação do extrato e compostos isolados frente a DA.
O fármaco de referência utilizado nos nosssos ensaios, como controle
positivo, foi a galantamina. Este medicamento é comercializado sob nome comercial
de Reminyl®, apresentado em concentrações que variam de 4, 8 e 12 mg, além de
formulações com liberação prolongada. A vantagem da utilização deste
medicamento sobre outros anticolinesterásicos é que, a galantamina é um inibor
reversível e de longa duração da AChE, enquanto, a rivastigmina inibe
irreversivelente a enzima, fator determinante para a potencialização dos efeitos
colaterais indesejáveis (SONKUASARE; KAUL; RAMARAO, 2005).
A avaliação da capacidade exploratória é amplamente utilizada em
pesquisas relacionadas ao comportamento animal, e, num sentido geral, refere-se a
todas as atividades relacionadas à obtenção de informações do ambiente. Os
parâmetros comportamentais avaliados nestes estudos farmacológicos incluem:
avaliação de risco (streach atempt), correr em círculos, cheirar o ambiente (sniffing),
levantar-se nas patas traseiras (rearings), locomover-se, movimentar as vibrissas,
escolher entre ambientes abertos ou fechados, direcionar-se ou esquivar-se de um
estímulo em particular, urinar e defecar no ambiente, dentre outros (SCHIMITT;
HIEMKE, 1998; MONTIGLIO et al., 2010).
Estudos psicológicos de atividade exploratória em animais têm se baseado
na exposição do animal a uma alteração ambiental discreta e localizada, nunca
experimentada antes. É o caso do LCE e do OF, onde o animal reage ao ambiente
de acordo com seus instintos e/ou motivado pela ação de substâncias (CAROLA et
al., 2002; LALONDE; STRAZIELLE, 2008).
No OF, o pressuposto básico envolvido é que, para explorar o ambiente, o
animal precisa locomover-se nele. Dessa forma, a quantidade de movimentos
112
executados passa a ser um indicador de atividade exploratória, a qual é mensurada
através da contagem do número de cruzamentos entre as seções que compõe o
aparato (geralmente com o assoalho dividido em quadrantes), e, o número de
rearings. A redução do número de cruzamentos também pode ser interpretada por
um suposto efeito sobre o sistema motor dos animais, o qual pode ser avaliado
posteriormente, pelo teste do rota-rod (HOLLAND; WELDON, 1986; FUKUSHIRO et
al., 2010).
Etiologicamente o LCE baseia-se na aversão apresentada pelos roedores a
locais abertos ou elevados, apresentando sinais de medo e esquiva quando neles
confinados. O aparato consiste de dois braços abertos e dois fechados, dispostos
em forma de cruz e elevado do chão. Durante o período de exploração no aparato,
os animais percorrem ambos os braços, porém, normalmente os roedores
apresentarão maior freqüência e tempo de permanência nos braços fechados.
Dessa forma, a mensuração de ansiedade é dada preferência e tempo de
exploração dos mesmos nos braços do labirinto (PELLOW et al., 1985; TRENT;
MENARD, 2010).
Uma preocupação importante em tarefas motivadas pelo choque,
particularmente naquelas em que se investiga o efeito de substâncias sobre a
memória, como no caso da esquiva inibitória e ativa, é se o tratamento
farmacológico afeta aspectos motivacionais do aprendizado, como atividade
locomotora, exploratória e aspectos da ansiedade dos animais (ALVARES et al.,
2005). Sendo assim, é comum nesses estudos, o acompanhamento de modelos de
ansiedade e deambulação, como o LCE e OF.
Neste estudo, foram avaliados o comportamento locomotor, exploratório e
sobre a ansiedade dos animais, após a sessão de testes na esquiva inibitória, para
identificar qualquer inaptidão que pudesse influenciar o desempeno dos animais no
teste de memória.
Os resultados da determinação da capacidade exploratória e a aferição do
grau de ansiedade dos animais normais, tratados com o ERF, demonstraram que o
tratamento com o extrato não pareceu afetar o comportamento dos animais. Estes
dados sugerem, portanto, que a capacidade motivacional e locomotora dos animais
não foi alterada, e, o desempenho dos mesmos nos testes de memória não sofreu
interferências. Adicionalmente, a avaliação da capacidade locomotora dos animais
que sofreram a indução de DA por STZ também não apresentou diferenças
113
significativas em relação aos tratamentos realizados com os compostos em estudo.
Os resultados obtidos, demonstram que o efeito da STZ sobre o SNC dos animais
não afeta regiões relacionadas com o controle do sistema motor, tão pouco o
tratamento agudo com o ERF afeta os parâmetros observados.
A determinação da locomoção e ansiedade dos animais que receberam o
AMA indicou que este composto não apresentou qualquer alteração nos resultados.
Isto indica que, os resultados obtidos na esquiva inibitória não apresentam desvios
relacionados a estes fatores.
O comportamento, verificado após o tratamento do TGL, na esquiva
inibitória, não exclusivamente pode ser um reflexo de ansiedade dos animais, no
momento do experimento. A avaliação dos parâmetros comportamentais dos
animais com DA e tratados com o TGL no OF demonstrou que, a dose de 30 mg/kg
pareceu interferir significativamente na ansiedade dos mesmos, diminuindo-a de
forma a aumentar a quantidade de rearings realizada pelo animal em relação ao
controle, (um parâmetro de avaliação da ansiedade). Contraditoriamente,
observando os resultados do LCE, pode-se verificar que o TGL nessa mesma dose
elevou o grau de ansiedade nos animais, pois se constatou uma diminuição na
freqüência de visitas ao braço aberto e um aumento de permanência no braço
fechado. Desta forma, testes mais específicos para verificação dos efeitos do TGL
sobre a ansiedade são necessários para se verificar a hipótese de que efeitos
sedativos e não ansiogênicos possam estar interferindo nos resultados de memória
obtidos com o composto em doses maiores.
Modelos farmacológicos como o OF e o LCE possuem grande importância
na avaliação da ação de compostos sobre a memória, uma vez que através deles é
possível verificar possíveis efeitos adversos dos compostos, como uma atividade
que venha a causar ansiedade, ou, efeitos inespecíficos no SNC, que possam
alterar a capacidade locomotora dos animais (SCHIMITT; HIEMKE, 1998;
MONTIGLIO et al., 2010).
114
7. CONCLUSÕES
A purificação cromatográfica da Rapaenea ferruginea resultou na obtenção
dos compostos isolados AMA e TGL. Análises espectroscópicas demonstraram que
o TGL encontra-se em maior proporção que o AMA, no ERF.
A avaliação farmacológica do ERF demonstrou que este extrato apresenta
atividade sobre a memória de animais normais nas três etapas: aquisição,
consolidação e evocação. Os animais com DA induzida, tratados com ERF, AMA e
TGL, apresentaram aumento na atividade de consolidação da memória.
O ERF facilitou a consolidação da memória dos animais com DA induzida
nas doses de 150 e 300 mg/kg. O AMA aumentou a capacidade cognitiva nas doses
de 15 e 30 mg/kg, com resultados semelhantes ao controle positivo, galantamina,
demonstrando que o AMA pode ter um possível efeito anticolinesterásico “in vivo”.
O TGL apresentou melhor atividade sobre a memória dos animais na menor
dose, facilitando a consolidação do aprendizado na esquiva. A menor dose do TGL
também foi responsável pela maior ativação dos sistemas enzimáticos avaliados,
SOD, CAT, GPx e GR, bem como pela redução da peroxidação lipídica avaliada
através da quantificação de TBARS. Os resultados indicam que o tratamento com o
TGL pode ter protegido o SNC dos animais, o que pode ter facilidado a consolidação
da memória e melhorado o desempenho dos mesmos nos testes farmacológicos. O
AMA, por sua vez, não apresentou atividade sobre as enzimas antioxidantes SOD,
CAT, GPx e GR, demonstrando não interagir nesta via bioquímica, e, também não
impediu a peroxidação lipídica, como avaliado no ensaio do MDA.
As avaliações comportamentais demonstraram que o ERF e o AMA não
apresentam atividade sobre a locomoção e a ansiedade dos animais. Entretanto, o
TGL apresentou alterações na ansiedade e a locomoção dos animais nos testes do
OF e do LCE, o que pode ter influenciado o desempenho dos animais no teste da
esquiva inibitória.
De modo geral, pode-se constatar que a melhora da cognição verificada nos
animais tratados com o ERF pode estar relacionada com a atividade farmacológica
que os compostos isolados AMA e TGL apresentaram.
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ANEXO 1
PARECER CONSUBSTANCIADO PARA USO DE ANIMAIS
COMISSÃO DE ÉTICA EM PESQUISA DA UNIVALI
Título do Projeto: AVALIAÇÃO DA ATIVIDADE DO EXTRATO DOS FRUTOS DA Rapanea ferruginea E DOS COMPOSTOS ISOLADOS ÁCIDO
MIRSINÓICO A E TRIGLICERÍDEO SOBRE A MEMÓRIA DE ANIMAIS NORMAIS E COM ALZHEIMER INDUZIDO
Orientadora: Profa. Dra. Márcia Maria de Souza Acadêmico: Philipe Costa Data do Parecer: 31/07/2009 Cadastro: 300/09