UNIVERSIDADE DO VALE DO ITAJAÍsiaibib01.univali.br/pdf/Camile Cecconi Cechinel Zanchett.pdf · 1...

1

UNIVERSIDADE DO VALE DO ITAJAÍ

CAMILE CECCONI CECHINEL ZANCHETT

AVALIAÇÃO DOS EFEITOS DAS FRAÇÕES RICAS EM FLAVONOIDES DAS FOLHAS DE Bauhinia forficata E Campomanesia reitziana NA MUCOSITE INTESTINAL

INDUZIDA PELO QUIMIOTERÁPICO IRINOTECANO EM CAMUNDONGOS

Itajaí (SC) 2017

3

UNIVERSIDADE DO VALE DO ITAJAÍ PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM CIÊNCIAS

FARMACÊUTICAS ÁREA DE CONCENTRAÇÃO EM PRODUTOS NATURAIS E

SUBSTÂNCIAS SINTÉTICAS BIOATIVAS


AVALIAÇÃO DOS EFEITOS DAS FRAÇÕES RICAS EM FLAVONOIDES DAS FOLHAS DE Bauhinia forficata E Campomanesia reitziana NA MUCOSITE INTESTINAL


Dissertação submetida ao Programa de Mestrado acadêmico em Ciências Farmacêuticas, da Universidade do Vale do Itajaí como parte dos requisitos para a obtenção do grau de Mestre em Ciências Farmacêuticas. Orientador: Prof. Dr. Sérgio Faloni de Andrade Coorientadora: Profª Drª Luisa Mota da Silva

Itajaí (SC) Março de 2017

4

FICHA CATALOGRÁFICA

Z15a

Zanchett, Camile Cecconi Cechinel Avaliação dos efeitos das frações ricas em flavonoides das folhas de Bauhinia forticata e Campomanesia reitziana na mucosite intestinal induzida pelo quimioterápico irinotecano em camundongos [manuscrito] / Camile Cecconi Cechinel Zanchett. – 2017. 132 f. : il. ; 30 cm

Cópia de computador (Printout(s)). Dissertação (Mestrado em Ciências Farmacêuticas) – Universidade do Vale do Itajaí, Pró-reitoria de Pesquisa. Pós-graduação, Extensão e Cultura, 2017. “Orientador: Prof. Dr. Sérgio Faloni de Andrade, coorientadora: Profª. Dar. Luísa Mota da Silva”. Bibliografia: f. 110-130.

1. Produtos naturais. 2. Substâncias sintéticas bioéticas. 3. Flavonoides. 4. Fitoterapia. I. Universidade do Vale do Itajaí. II. Título.

CDU: 615.32 Cristina Martins Viana – CRB 14/966

7

AVALIAÇÃO DOS EFEITOS DAS FRAÇÕES RICAS EM FLAVONOIDES DAS FOLHAS DE Bauhinia forficata E Campomanezia reitziana NA MUCOSITE INTESTINAL



Março/2017

Orientador: Prof. Sérgio Faloni de Andrade, Dr. Coorientadora: Profª Luisa Mota da Silva, Drª Área de concentração: Produtos Naturais e Substâncias Sintéticas Bioativas Número de Páginas: 132 A mucosite é definida como uma reação inflamatória complexa, ainda sem tratamento satisfatório, ocorrendo no trato gastrointestinal de pacientes submetidos ao uso de quimioterápicos ou radioterápicos. Alguns constituintes químicos de plantas medicinais, como os flavonoides, têm sido investigados pelo seu potencial anti-inflamatório e antioxidante. Neste estudo, objetivou-se avaliar os efeitos das frações ricas em flavonoides das folhas de Bauhinia forficata e Campomanesia reitiziana em camundongos com mucosite intestinal induzida por irinotecano. Desta forma, as frações de acetato de etila e butanol de B. forficata (FAEB-BF) e a fração acetato de etila de C. reitziana (FAE-CR) foram utilizadas. Primeiramente foi realizado o teste de motilidade intestinal com o uso do marcador vermelho de fenol. A mucosite intestinal foi induzida por irinotecano (75 mg/kg, i.p.) e os animais tratados oralmente com veículo (Vei: água/ 1% tween), FAEB-BF (100 mg/kg) FAE-CR (100 mg/kg) ou loperamida (Lop: 10 mg/kg, o controle positivo). O duodeno, cólon, baço e fígado foram coletados e pesados, no duodeno e cólon foi determinado a atividade de mieloperoxidase (MPO), e os níveis de glutationa reduzida (GSH) e de fator de necrose tumoral-α (TNF-α). Camundongos C57BL/6 fêmeas foram utilizadas para indução de melanoma no flanco direito com administração subcutânea de 2×105 células de melanoma B16F10. A citotoxicidade da FAEB-BF, da kaempferitrina, do irinotecano e da FAEB-BF na presença do irinotecano foram avaliadas em células epiteliais de intestino delgado IEC-6, em diferentes concentrações (1, 3, 10 e 30, 100 µg/mL ou 10, 30 100 µM/mll). Os dados obtidos foram analisados com o auxílio do software Graph Pad Prism®, versão 5.0. Os resultados demonstraram que a menor dose efetiva que reduziu a motilidade intestinal dos animais foi de 100 mg/kg, portanto foi a dose utilizada para as posteriores metodologias. Na mucosite intestinal, os animais tratados com

8

FAEB-BF tiveram redução do grau de diarreia e atenuação da perda de peso, enquanto os tratados com FAE-CR não apresentaramredução na diarreia induzida pelo irinotecano. O peso do baço foi menor em todos os grupos tratados com irinotecano e o tratamento com as frações não reverteu esse parâmetro. Entretanto, a redução de peso do fígado só foi verificada nos animais tratados com veículo ou loperamida. Como a FAE-CR não atenuou a diarreia, principal manifestação da mucosite intestinal, deu-se continuidade às demais análises apenas com a FAEB-BF. Os animais tratados com a FAEB-BF e expostos ao irinotecano não apresentaram redução no peso do fígado ou duodeno em contraste ao grupo tratado com veículo. A análise qualitativa histológica demonstrou dano tecidual nos animais tratados com veículo e atenuação desse efeito nos tratados com FAEB-BF. Os níveis de GSH no duodeno dos animais tratados com FAEB-BF foi maior em relação aos animais tratados com veículo, enquanto que os níveis de TNF- α e da atividade da enzima MPO foram reduzidos pela administração de FAEB-BF. Os efeitos benéficos da FAEB-BF na mucosite intestinal induzida por irinotecano também foi confirmado histologicamente. Em relação à avaliação antitumoral, observou-se que a FAEB-BF não interferiu na ação antineoplásica do irinotecano, e somente a administração de FAEB-BF também exerceu efeito antitumoral per se. Em relação à citotoxicidade, a fração e o flavonoide majoritário isolado kaempferitrina não apresentaram redução da viabilidade celular em células IEC-6. Já o irinotecano reduziu significativamente a viabilidade celular, efeito que não foi revertido pela FAEB-BF quando administrada concomitantemente, porém, tanto a FAEB-BF como a kaempferitrina apresentaram efeito citoprotetor quando administradas 24 h antes do irinotecano, nas concentrações testadas. Dessa forma, sugere-se que a B. forficata apresentou papel importante na redução dos sinais da mucosite intestinal em camundongos, reduziu o principal que é a diarreia, reverteu a diminuição da atividade exploratória, assim como parâmetros oxidativos e inflamatórios. Os grupos que receberam C. reitziana e loperamida não apresentaram melhora nos parâmetros avaliados, sendo iguais ao grupo que recebeu apenas quimioterápico. Palavras-chave: Fitoterapia. Flavonoides. Mucosite. Bauhinia.

9

EVALUATION OF THE EFFECTS OF FLAVONOID-RICH FRACTIONS OF Bauhinia forficata AND Campomanezia

reitziana LEAVES IN INTESTINAL MUCOSITIS INDUCED BY IRINOTECAN CHEMOTHERAPY IN MICE

Supervisor: Prof. Sérgio Faloni de Andrade, Dr. Co-Supervisor: Prof. Luisa Mota da Silva, Dr. Area of concentration: Natural Products and Bioactive Synthetic Substances Number of Pages: 132

ABSTRACT

Mucositis, for which there is still no satisfactory treatment, is defined as a complex inflammatory reaction that occurs in the gastrointestinal tract of patients submitted to chemotherapeutic or radiotherapeutic agents as treatment for cancer. Some chemical constituents of medicinal plants, such as flavonoids, have been investigated for their anti-inflammatory and antioxidant potential. The aim of this study was to evaluate the effects of the flavonoid rich fractions of the leaves of Bauhinia forficata and Campomanesia reitiziana in mice with intestinal mucositis induced by irinotecan. For this purpose, ethyl acetate and butanol fractions of B. forficata (FAEB-BF) and ethyl acetate fraction of C. reitziana (FAE-CR) were used. First, the intestinal motility test was performed using red phenol as marker. Intestinal mucositis was induced by irinotecan (75 mg/kg, i.p.) and animals were treated v.o. with vehicle (Vei: water/1% tween), FAEB-BF (100 mg/kg) FAE-CR (100 mg/kg) and loperamide (Lop: 10 mg/kg, positive control). The duodenum, colon, spleen and liver were collected and weighed, and the duodenum and colon were stored at -80ºC for subsequent determinations of myeloperoxidase (MPO), reduced glutathione (GSH) and tumor necrosis factor-α (TNF-α) levels. Female C57BL/6 mice were used for melanoma induction on the right flank by subcutaneous administration of 2×105 B16F10 cells. The cytotoxicity of FAEB-BF, kaempferitrin, irinotecan and FAEB-BF in the presence of irinotecan were evaluated in epithelial cells of IEC-6 small intestine, at different concentrations (1, 3, 10 and 30, 100 µg/mL or 10, 30 100 µM/mll). The data were analyzed using the software program Graph Pad Prism®, version 5.0. It was observed that the lowest effective dose that reduced the intestinal motility of animals was 100 mg/kg, therefore this dose was used for the subsequent experiments. In the intestinal mucositis model, animals treated with FAEB-BF had an improvement in diarrhea score and attenuation of weight loss, while animals treated with FAE-CR had no amelioration in this parameter. Spleen weight was lower in all the irinotecan-treated animals and treatment with the fractions did not reverse this parameter. However, a reduction in liver weight was only seen in the animals treated with vehicle or loperamide. As FAE-CR did not attenuate diarrhea, the main manifestation of intestinal mucositis, the subsequent experiments were only carried out with FAEB-BF. Animals treated

10

with FAEB-BF and exposed to irinotecan showed no reduction in liver or duodenal weight, in contrast to the vehicle treated group. Qualitative histological analysis demonstrated tissue damage in the vehicle treated animals and attenuation of this effect in the FAEB-BF treated animals. The GSH levels were higher in the duodenum of FAEB-BF compared to the other groups, whereas the levels of TNF-α and MPO enzyme activity were reduced by administration of FAEB-BF. The beneficial effects of FAEB-BF on intestinal mucositis irinotecan-induced were also confirmed histologically. In the antitumoral evaluation, it was observed that the FAEB-BF did not interfere in the antineoplastic effect of irinotecan, and that only the administration of FAEB-BF also exerted antitumor effect per se. In relation to cytotoxicity, the fraction and isolated major flavonoid kaempferitrin did not present reduction of cell viability in IEC-6 cells. Irinotecan significantly reduced cell viability, an effect that was not reversed by FAEB-BF when administered simultaneously, although pre-treatment (24 h) with FAEB-BF and kaempferitrin exerted cytoprotector effects against irinotecan cytotoxicity at the concentrations tested. It is therefore suggested that B. forficata plays an important role in reducing the signs of intestinal mucositis in mice, particularly diarrhea, and reversed the decrease in exploratory activity, as well as the oxidative and inflammatory parameters. The groups that received C. reitziana and loperamide did not show any improvement in the evaluated parameters, being equal to the group that received only chemotherapy.

Keywords: Phytotherapy. Flavonoids. Mucositis. Bauhinia.

11

“Dedico esse trabalho ao meu marido e à

minha famíl ia, que me apoiaram em cada

etapa e me auxiliaram de todas as formas para

que fosse possível realizar esse sonho”

13

AGRADECIMENTOS

A Deus, pelo dom da vida e pelo amor incondicional, por me permitir a realização desse sonho e por estar comigo em todos os momentos, cuidando de cada detalhe da minha vida de forma surpreendente. Ao meu marido, Guilherme, pelo incentivo e apoio ao longo desse período, pelo amor, paciência e estímulo a cada dia. Obrigada por alegrar meus dias e me auxiliar. Aos meus pais, Valdir e Lenita, por sempre me incentivarem e por me ensinarem o amor aos estudos e ao mundo da pesquisa. Vocês foram imprescindíveis por me encorajarem e por mais essa realização. Obrigada pelo amor, incentivo e por acreditarem em mim. Ao meu pai, por ser mais do que pai, e também ser uma inspiração de pesquisador e professor, obrigada por mostrar como fazer ciência com paixão e por se doar de tal forma pela mesma. Obrigada por ser também um professor e por me mostrar o mundo incrível da busca por novas descobertas. À minha irmã, Milene, minha grande amiga e companheira em todos os momentos, obrigada por todos os momentos compartilhados e por ser tão especial, pelo carinho, paciência e amor sempre. Ao meu primo e também irmão, Andrey, por estar sempre presente, me apoiando em cada novo desafio. Á minha avó, Bilmar, por todo o amor, mimos, bolos, incentivo e apoio ao longo da minha vida. Ao meu avô Emílio, que partiu recentemente, mas que sempre nos alegrou, e que tinha orgulho dos passos que segui.

14

Aos meus avós que também já partiram Valdir e Amélia, pelo amor, apoio e carinho, por todos os momentos compartilhados e memórias que ficaram. Muitas saudades... Agradeço ao meu orientador, Prof. Sérgio Faloni de Andrade, por aceitar me orientar e confiar em mim, obrigada por todos os ensinamentos e por acompanhar de perto e de forma ativa todos os desafios e o desenvolvimento desse trabalho. Agradeço também à minha coorientadora, Prof.ª Luisa Mota da Silva, que desde o início foi muito solícita, pela ideia e vontade de realizar esse projeto e por ter confiado em mim para esse trabalho. Obrigada por ensinar com tanto amor a farmacologia. Agradeço a todo o nosso grupo de pesquisa Gastro/Cardio, por terem me acolhido, me ensinado e por compartilharem tantos momentos comigo, todos foram especiais e importantes. Agradeço também a Prof.ª Adriana Campos, por estar sempre pronta a me ajudar e ensinar sobre as análises fitoquímicas, e por ser também uma amiga, obrigada! Obrigada aos técnicos e todo o pessoal dos laboratórios de Síntese, Fitoquímica, Instrumentação Analítica, Farmacologia in vitro e Farmacologia in vivo, nós não fazemos nada sozinhos, e a companhia, ajuda e apoio de vocês foram muito importantes! Muito obrigada!!

15

“Que tudo o que vocês fizerem seja feito com amor"

1 Coríntios 16.14

17

LISTA DE FIGURAS

Figura 1. Foto ilustrativa dos galhos (A) e folha (B) da espécie B.

forficata............................................................................................................ 34

Figura 2. Foto ilustrativa da espécie C. reitziana........................................ 36 Figura 3. Anatomia do intestino humano....................................................... 38 Figura 4. Estrutura química do quimioterápico irinotecano.............................. 44 Figura 5. Metabolização do irinotecano..................................................... 45

Figura 6. Fluxograma da obtenção das frações das folhas de B. forficata,

coletadas em abril de 2015 em Itajaí-SC....................................................... 52

Figura 7. Fluxograma da obtenção das frações das folhas de C. reitziana

coletada em abril/2015 em Itajaí-SC............................................................ 53

Figura 8. Fluxograma de obtenção do extrato e frações das folhas de B.

forficata para o isolamento da kaempferitrina................................................. 55

Figura 9. Fluxograma de obtenção dos compostos puros das folhas de B.

forficata........................................................................................................

56

Figura 10. Método utilizado para avaliação da motilidade intestinal em camundongos normais...................................................................................

58

Figura 11. Métodos utilizados para obtenção da padronização da indução da mucosite intestinal.................................................................................

59

Figura 12. Método utilizado no pré-tratamento e indução de mucosite intestinal........................................................................................................

61

Figura 13. Fluxograma da metodologia utilizada para induzir o melanoma nos animais.................................................................................................

66

Figura 14. Estrutura molecular dos flavonoides kaempferitrina (1) e miricitrina (2)..................................................................................................

69

Figura 15. Análise sazonal por CLAE das amostras de B.

forficata.......................................................................................................... 72

Figura 16. Análise por CLAE de árvores de B. forficata de diferentes idades...........................................................................................................

73

Figura 17. Curva de calibração da kaempferitrina obtida por CLAE em metanol na faixa de concentração de 5 a 100 µg/mL................................

74

Figura 18. Avaliação do efeito da FAEB-BF na motilidade intestinal de camundongos normais...................................................................................

76

Figura 19. Avaliação do efeito da FAE-CR na motilidade intestinal de

18

camundongos normais.................................................................................... 77 Figura 20. Avaliação do efeito das frações FAEB-BF (A) e FAE-CR (B) na perda de peso corporal dos animais durante os 14 dias de experimento...................................................................................................

78

Figura 21. Avaliação do efeito das frações FAEB-BF e FAE-CR no grau de diarreia dos animais, no último dia do experimento.................................

79

Figura 22. Efeito das frações FAEB-BF (A) e FAE-CR (B) no peso relativo do baço dos animais com mucosite intestinal induzida por irinotecano....................................................................................................

80

Figura 23. Efeito das frações FAEB-BF (A) e FAE-CR (B) no peso relativo do fígado dos animais com mucosite intestinal induzida por irinotecano....................................................................................................

81

Figura 24. Efeito da fração FAEB-BF no peso do duodeno seco dos animais com mucosite intestinal induzida por irinotecano......................

82

Figura 25. Efeito da fração FAEB-BF no peso do cólon seco dos animais com mucosite intestinal induzida por irinotecano....................................

83

Figura 26. Avaliação do efeito da FAEB-BF no peso úmido – seco do duodeno (A) e cólon (B) dos animais com mucosite intestinal induzida por irinotecano.......................................................................................................

84

Figura 27. Imagens representativas do efeito dos diferentes tratamentos nos danos histológicos induzidos por irinotecano no duodeno de camundongos..............................................................................................

85

Figura 28. Imagens representativas do efeito dos diferentes tratamentos na integridade da camada de muco (corado pelo ácido periódico de Schiff - PAS).............................................................................................................

86

Figura 29. Imagens representativas do efeito dos diferentes tratamentos na integridade das células caliciformes (corados pela técnica de Alcian Blue, pH 2,5)...................................................................................................

87

Figura 30. Avaliação do efeito da FAEB-BF na Glutationa reduzida (GSH) nos tecidos do duodeno (A) e cólon (B) dos animais com mucosite intestinal induzida por irinotecano................................................................

88

Figura 31. Avaliação do efeito da FAEB-BF na atividade de Mieloperoxidase (MPO) no duodeno (A) e cólon (B) de animais com mucosite intestinal induzida por irinotecano..................................................

89

Figura 32. Avaliação do efeito da FAEB-BF no TNF-α no duodeno (A) e cólon (B) de animais com mucosite intestinal induzida por irinotecano....................................................................................................

90

19

Figura 33. Avaliação do efeito da FAEB-BF no Teste Campo Aberto (number of crossings e rearings) nos animais com mucosite intestinal induzida por irinotecano..................................................................................

91

Figura 34. Crescimento tumoral em percentual em relação ao primeiro dia de tratamento do tumor............................................................................

93

Figura 35. Efeito da FAEB-BF no peso (A) e volume (B) de animais com tumor induzido por células de melanoma B16F10..........................................................................................................

94

Figura 36. Avaliação do efeito da FAEB-BF (A) e do flavonoide isolado kaempferitrina (B) em diferentes concentrações na viabilidade celular de células epiteliais de intestino delgado IEC-6.............................................

95

Figura 37. Avaliação do efeito do irinotecano (A) e da FAEB-BF na presença de irinotecano (B e C) em diferentes concentrações na viabilidade celular de células epiteliais de intestino delgado IEC-6.....................................................................................................................

96

Figura 38. Avaliação do efeito preventivo de citoproteção da FAEB-BF (A e B) e da kaempferitrina (C e D), em relação ao efeito citotóxico do irinotecano, em diferentes concentrações na viabilidade celular de células epiteliais de intestino delgado IEC-6.........................................................

97

20

LISTA DE TABELAS

Tabela 1. Volumes da solução padrão a 1 mg/mL de Kaempferitrina para obter as concentrações de 5-100 µg/mL, utilizando como solvente metanol......................................................................................

57

Tabela 2. Percentuais de rendimento dos EMB da B. forficata, folhas frescas....................................................................................................

72

Tabela 3. Valores de fenois totais e flavonoides presentes na FAEB-BF............................................................................................................

73

Tabela 4. Quantificação de kaempferitrina nos extratos e fração das folhas de B. forficata.................................................................................

75

Tabela 5. Translocação bacteriana no baço e fígado dos animais no 14º dia....................................................................................

92

21

LISTA DE ABREVIATURAS

5-FU – 5-Fluorouracil AE – Acetato de Etila AGCC – Ácido Graxo de Cadeia Curta Bcl-2 – Célula-B de Linfoma 2 BCRJ – Banco de Células do Rio de Janeiro B16F10 - Células de Melanoma Murino BUT – Butanol CACO-2 – Células Epiteliais de Cólon-Adenocarcinoma Colorretal CC – Cromatografia em Coluna CCD – Cromatografia em Camada Delgada CHCl3 – Clorofórmio CLAE – Cromatografia Líquida de Alta Eficiência CONCEA – Conselho Nacional de Controle de Experimentação Animal DII – Doença Inflamatória Intestinal DMEM – Dulbecco’s Modified Eagle’s Medium DMSO – Dimetilsulfóxido DTNB – 5,5’-Ditiobis 2-Ácido Nitrobenzoico EM – Extrato Metanólico EMB – Extrato Metanólico Bruto EPM – Erro Padrão da Média EQ – Equivalentes de Quercetina FDA – Food and Drug Administration FO-1 – Linhagem Celular de Melanoma GLPs - Glucagon-like Peptídeo GSH – Glutationa HTAB – Brometo de Hexadeciltrimetilamonio IEC-6 – Células Epiteliais de Intestino Delgado IL-1 – Interleucina 1 IL-6 – Interleucina 6 IMC – Índice de Massa Corporal i.p. – Intraperitoneal MeOH – Metanol MPO – Mieloperoxidase MTT – Metil-Tiazolil Tetrazolium

MTX – Metotrexato

22

Na2CO2 – Carbonato de Sódio NIQFAR – Núcleo de Investigações Químico-Farmacêuticas NFkB – Fração de Transcrição Nuclear Kappa b p53 – Gene Supressor de Tumor SBF – Soro Bovino Fetal SII – Síndrome do Intestino Irritável TAE – Equivalentes de Ácido Tânico TJ - Tigh Junctions TMB – Tetrametilbenzidina TNF-α – Fator de Necrose Tumoral α Tr – Tempo de Retenção UNIVALI – Universidade do Vale do Itajaí UV – Ultra violeta v.o. – Via Oral

23

SUMÁRIO

1 INTRODUÇÃO…………………………………............................................ 25 2 OBJETIVOS.............................................................................................. 29 2.1 Objetivo Geral....................................................................................... 29 2.2 Objetivos Específicos........................................................................... 29 3 REVISÃO DA LITERATURA..................................................................... 31 3.1 Plantas medicinais................................................................................ 31 3.2 Bauhinia forficata.................................................................................. 33 3.3 Campomanesia reitiziana.................................................................... 35 3.4 Fisiologia gastrointestina.................................................................... 37 3.5 Mucosite intestinal........................................................................... 43

3.6 Possíveis tratamentos para mucosite intestinal induzida por quimioterápico..................................................................................

48

4 MATERIAIS E MÉTODOS......................................................................... 50 4.1 Fármacos, reagentes e solventes........................................................ 50 4.2 Preparo do material vegetal................................................................. 50

4.2.1 Coleta do material................................................................................ 50

4.3 Obtenção dos extratos e frações....................................................... 51 4.4 Análise fitoquímica preliminar.......................................................... 53 4.5 Análise fitoquímica da Bauhinia forficata.......................................... 54 4.5.1 Fenóis e flavonoides totais................................................................. 54

4.5.2 Isolamento e identificação da Kaempferitrina...................................... 55

4.5.3 Análise em Cromatografia líquida de alta eficiência – CLAE............... 56

4.5.4. Linearidade......................................................................................... 57

4.5.4.1 Limite de quantificação (LQ) e detecção (LD).................................. 57

4.6 Animais................................................................................................. 58 4.7 Avaliação da motilidade intestinal em camundongos normais........ 58 4.8 Indução da mucosite intestinal por irinotecano em camundongos 59 4.8.1 Padronização do método..................................................................... 59

4.8.2 Avaliação dos efeitos das frações na mucosite intestinal induzida

por irinotecano..............................................................................................

61

4.9 Parâmetros avaliados na mucosite intestinal................................... 62 4.9.1 Ganho de peso e peso dos órgãos..................................................... 62

4.9.2 Avaliação do grau da diarreia apresentada......................................... 62

4.9.3 Análise histológica............................................................................... 63

4.9.4 Análise histoquímica............................................................................ 63

24

4.9.5 Ensaio da atividade de mieloperoxidase (MPO) no duodeno e cólon. 63

4.9.6 Dosagem de TNF-α nos tecidos de duodeno e cólon dos animais..... 64

4.9.7 Ensaio de Glutationa reduzida (GSH) no duodeno e cólon dos

animais..........................................................................................................

64

4.9.8 Avaliação de comportamento exploratório por Teste Campo Aberto

em camundongos com mucosite intestinal..................................................

65

4.9.9 Avaliação da translocação bacteriana baço e fígado........................... 65

4.10 Avaliação antitumoral e de citotoxicidade....................................... 65 4.10.1 Cultura das células de melanoma.................................................... 65

4.10.2 Avaliação antitumoral em modelo de tumor no flanco in vivo............ 66

4.10.3 Avaliação de viabilidade celular e citotoxicidade - MTT (metil-

tiazolil tetrazolium).......................................................................................

67

4.11 Análise estatística............................................................................. 68 5 RESULTADOS......................................................................................... 69 5.1 Análise fitoquímica preliminar............................................................. 69

5.2 Análise fitoquímica da Bauhinia forficata.......................................... 70 5.3 Linearidade, LQ e LD............................................................................ 74

5.3.1 Quantificação da Kaempferitrina......................................................... 74

5.4 Avaliação farmacológica das frações............................................... 76 5.4.1 Avaliação da motilidade intestinal........................................................ 76

5.4.2 Avaliação dos efeitos das frações ricas em flavonoides na mucosite

intestinal........................................................................................................

77

5.5 Avaliação antitumoral........................................................................... 92 5.5.1 Avaliação antitumoral em modelo de melanoma no flanco de

camundongos..............................................................................................

92

5.5.2 Avaliação de viabilidade celular e citotoxicidade................................. 95

DISCUSSÃO................................................................................................ 98 CONSIDERAÇÕES FINAIS........................................................................ 103 REFERÊNCIAS............................................................................................ 110

25

1 INTRODUÇÃO

Existem diversas estratégias para o tratamento do câncer, entre elas, destacam-se a quimioterapia, radioterapia e cirurgia, mas infelizmente essas terapias acabam gerando efeitos adversos em grande parte dos pacientes (SONG et al., 2016). Entre os efeitos adversos da quimioterapia e radioterapia, a mucosite intestinal é um dos maiores problemas na prática clínica, sendo definida como uma reação inflamatória complexa, que ocorre nas membranas mucosas do trato gastrointestinal em pacientes em tratamento de câncer. Afeta no mínimo 40% dos pacientes e pode ser classificada como mucosite oral e gastrointestinal. A lesão gastrointestinal compromete a função do intestino e consequentemente o estado nutricional e a qualidade de vida do paciente (KUIKEN; RINGS; TISSING, 2015; KATO et al., 2015; BASTOS et al., 2014).

A mucosite alimentar é um dos efeitos adversos mais comuns do tratamento antineoplásico. Essa lesão ocorre na mucosa, podendo se estender em todo o trato digestivo, da boca ao ânus (KEEFE et al., 2007). Os sinais e os sintomas podem variar desde dor abdominal, anorexia, perda de apetite, diarreia, náuseas e vômitos, até lesões ulcerativas graves, o que pode comprometer a nutrição e a ingestão hídrica do paciente (KELNER; CASTRO, 2007; REINKE et al., 2015; SANTOS-FILHO et al., 2014).

O irinotecano é um quimioterápico muito utilizado, principalmente para tratar o câncer colorretal, mas seu uso causa prejuízos na junção celular, ocasionando disfunção da barreira mucosa intestinal, diarreia e mucosite intestinal (WARDILL et al., 2014). O irinotecano pode causar mucosite intestinal de grau severo em 10-25% dos pacientes que o utilizam. Essa associação de diarreia e mucosite com irinotecano já foi demonstrado em ensaios clínicos, confirmado na prática clínica e em modelos animais (RIBEIRO et al., 2016). O irinotecano interage com a enzima topoisomerase I, importante no processo de multiplicação das células, quando essa enzima sofre bloqueio, gera um erro no funcionamento nas células tumorais, o que as leva à morte celular e justifica o efeito antineoplásico do fármaco (ANVISA, 2013).

26

Apesar da mucosite intestinal estar sendo estudada há mais de 30 anos, ainda não há uma intervenção clínica farmacológica bem sucedida para prevenir e tratar esse efeito adverso (SANTOS-FILHO, 2014). Porém alguns produtos à base de plantas com atividade anti-inflamatória e antioxidante têm-se mostrado promissores no tratamento da mucosite, como a semente de uva (CHEAH et al., 2014), proantocianidina (GULGUN et al., 2010), acteosídeo (REINKE et al., 2015), Curcuma longa L. (cúrcuma) (SANTOS-FILHO et al., 2014), Bidens pilosa L. (picão-preto) (BASTOS et al., 2014), arabinoxilana do trigo (SONG et al., 2016), canabinoides (ABALO et al., 2016), extrato aquoso de ruibarbo (BAJIC et al., 2016) e uma preparação de plantas chamada Bu-Zhong-Yi-Qi, composta por Astragalus membranaceus

(astragálus) (Fisch.), Bge.var. mongholicus (Bge.), Glycyrrhiza

uralensis Fisch, Codonopsis pilosula (Fisch.), Angelica sinensis (Oliv.) Diels, Citrus reticulate (tangerina), Cimicifuga heracleifolia Kom. (cimifuga), Bupleurum chinense DC. e Atractylodes macrocephala Koidz (GOU et al., 2016).

O descobrimento de novas terapias farmacológicas para o tratamento da mucosite intestinal é importante, e nesse sentido, as plantas medicinais são promissoras no tratamento de diversas patologias. O estudo para melhor compreender os mecanismos moleculares, composição e compostos bioativos presentes nas plantas, é essencial para o desenvolvimento de medicamentos derivados de plantas medicinais e descobrimento de novos fitoagentes (APAYA et al., 2016).

Dentre os compostos presentes no reino vegetal, os flavonoides compõem uma classe de polifenois amplamente encontrados nas plantas, presentes em alimentos e bebidas, que possuem diversas atividades biológicas comprovadas, como agentes antioxidantes e anti-inflamatórios, e que tem seu consumo relacionado com muitos benefícios como redução da mortalidade por doenças vasculares e câncer (RICE-EVANS, 2001; MUSCHIETTI; MARTINO, 2014; IVEY et al., 2015).

Algumas plantas estudadas pelo Núcleo de Investigações Químico-Farmacêuticas (NIQFAR) da Univali apresentam considerável quantidade de flavonoides em sua composição, destacando-se a Bauhinia forficata e a Campomanesia reitziana, que foram objetos do

27

presente estudo (CECHINEL-FILHO, 2009; NESELLO et al., 2016). Como a mucosite intestinal é uma condição inflamatória e flavonoides são potentes antioxidantes e anti-inflamatórios, foi verificada a hipótese de que as frações ricas em flavonoides de Bauhinia forficata (folhas) e Campomanesia reitziana (folhas) possam prevenir e atenuar a mucosite intestinal.

Diante do exposto, e da falta de tratamentos eficazes para combater a mucosite intestinal, esse trabalho investigou os efeitos das frações ricas em flavonoides das espécies vegetais selecionadas em animais com mucosite intestinal induzida pelo quimioterápico irinotecano.

29

2 OBJETIVOS

2.1 Objetivo Geral Avaliar os efeitos das frações ricas em flavonoides (acetato de etila e

butanol) das folhas frescas das espécies B. forficata e C. reitziana em camundongos com mucosite intestinal induzida pelo quimioterápico irinotecano. 2.2 Objetivos Específicos

1. Obter as frações ricas em flavonoides das plantas selecionadas

por meio de processos fitoquímicos convencionais (extração com solventes e cromatografia);

2. Analisar o perfil de flavonoides das frações mais promissoras

usando flavonoides padrões já isolados pelo grupo, e técnicas cromatográficas (CCD, CLAE);

3. Realizar análise sazonal da B. forficata e análise de idade;

4. Realizar o isolamento e quantificação do flavonoide kaempferitrina

no extrato e frações de B. forficata; 5. Padronizar a metodologia de mucosite intestinal em nosso grupo

de pesquisa; 6. Avaliar o efeito das frações em diferentes doses no modelo de

motilidade intestinal; 7. Testar as frações na melhor dose estabelecida, em animais com

mucosite intestinal induzida por irinotecano;

8. Avaliar os parâmetros de perda de peso ao longo do experimento de mucosite intestinal, peso dos órgãos e grau de diarreia;

30

9. Avaliar histologicamente o efeito das frações na mucosite intestinal;

10. Avaliar parâmetros inflamatórios e oxidativos no duodeno e cólon

de animais tratados com irinotecano;

11. Avaliar os efeitos da FAEB-BF no comportamento exploratório e locomoção por teste campo aberto em camundongos com mucosite intestinal;

12. Avaliar se ocorreu translocação bacteriana do intestino para o

baço e fígado dos animais;

13. Avaliar se a fração rica em flavonoides de B. forficata interfere no efeito antitumoral do quimioterápico irinotecano;

14. Avaliar se a fração rica em flavonoides de B. forficata e do flavonoide majoritário isolado, kaempferitrina, exercem citotoxicidade em células intestinais de linhagem normal (IEC-6) e também o efeito citoprotetor da FAEB-BF contra o efeito citotóxico do irinotecano nessas células.

31

3 REVISÃO DA LITERATURA

3.1 Plantas medicinais

Desde a antiguidade os homens têm estudado e analisado os produtos naturais ao seu redor, sendo que até o século XX, as plantas constituíam a maior fonte terapêutica que existia (MARSTON; HOSTETTMANN, 2009). Os produtos naturais têm originado diversos compostos para a descoberta de novos medicamentos.

Até os dias atuais, aproximadamente 80% da população ainda confia na medicina tradicional a base de plantas para o cuidado primário à saúde (CRAGG; NEWMAM, 2014). O uso de plantas no tratamento e cura de morbidades é muito antigo, e em regiões mais pobres do Brasil, são comercializadas em feiras livres, mercados e quintais residenciais Muitas vezes, o uso de plantas medicinais é a única opção de comunidades e alguns grupos (MACIEL; PINTO; VEIGA-JUNIOR, 2002).

Bolzani et al. (2014), afirmam que dentro da biodiversidade, há uma vasta diversidade de substâncias naturais com estruturas peculiares, sendo uma das maiores fontes de moléculas com potencial para a química medicinal e desenvolvimento de novos fármacos. Há cerca de 100 milhões de diferentes espécies no mundo (flora, fauna e micro-organismos), porém, apenas 2 milhões são conhecidas. Essas espécies juntas mantém a estabilidade dos ecossistemas, criando as bases para a nossa sobrevivência. O Brasil abriga a maior biodiversidade do mundo, com mais de 20% do número total de espécies da Terra, tornando-o o principal país entre os 17 com maior biodiversidade (BRASIL, 2016).

De acordo com Harvey, Edrada-Ebel e Quinn (2015), foram registrados até a atualidade, 200.000 metabólitos secundários de plantas, sendo 170.000 estruturas únicas, e cerca de 15% das intervenções clínicas utilizam plantas como medicamentos. Apesar desses dados, é provável que muitas espécies de plantas ainda não tenham sido investigadas sistematicamente com foco na descoberta de novos medicamentos. Mesmo o uso delas na medicina tradicional, ainda precisa ser melhor explorada. As pesquisas sobre plantas medicinais envolvem etapas como a investigação da medicina tradicional e popular, acompanhada de isolamento, purificação e caracterização dos princípios ativos, seguindo várias etapas até chegar na promissora descoberta

32

de novos medicamentos fitoterápicos (MACIEL; PINTO; VEIGA-JUNIOR, 2002; CECHINEL FILHO, 2015).

Segundo Newman e Cragg (2016), cerca de 60% dos medicamentos disponíveis na atualidade são provenientes de alguma forma de produtos naturais. Em 2008, o mercado mundial de medicamentos de origem vegetal era de 19,5 bilhões de dólares, estimando um crescimento de 600% nos anos seguintes (MCCHESNEY et al., 2012). Cechinel-Filho (2015), afirma que a palavra inovação tem sido tema de uma série de indústrias brasileiras, os laboratórios têm investido na pesquisa e no desenvolvimento de novos agentes medicinais, com ênfase em fitoterápicos, por serem mais “fáceis” quando comparados aos produtos sintéticos. Porém as etapas são muitas até o produto final, além de possuir alto custo, o que dificulta o processo.

Estima-se que no Brasil, apenas cerca de 5-10% das plantas existentes foram, ou estão sendo estudadas cientificamente, com o intuito de comprovar sua eficácia terapêutica (CECHINEL-FILHO, 2015). Os produtos naturais têm papel vital nas indústrias farmacêuticas, por apresentarem uma diversidade de atividades biológicas como antimicrobiana, antitumoral, antihepatotóxico, etc. Além de produzir uma grande quantidade de cuidados à saúde, também estão presentes em alimentos nutracêuticos, edulcorante e aditivos alimentares (KUPPUSAMY et al., 2015).

Apesar do uso e busca por medicamentos fitoterápicos por parte da população brasileira, apenas o Acheflan®, produzido do óleo da planta

Cordia verbenácea, foi completamente desenvolvido no país, e está entre os 19 fitoterápicos mais vendidos no Brasil, o que revela que mesmo com o enorme potencial e vastas riquezas naturais, o alinhamento entre a academia, governo e indústrias, e o investimento em novas e relevantes descobertas que venham a se tornar medicamentos precisam ser aperfeiçoados e aumentados (CECHINEL-ZANCHETT, 2016; DUTRA et al., 2016).

33

3.2 Bauhinia forficata

O gênero Bauhinia Plum. ex Linnaeus, foi “denominado” por Linnaeus, em homenagem aos irmãos Jean Bauhin (1541- 1613) e Gaspard Bauhin (1550-1624), que foram médicos e botânicos suíços. Possui mais de 250-300 espécies espalhados na América, África, Ásia e Oceania. A maior quantidade de espécies está no continente americano, sendo mais diversa na região Amazônica no Peru e Brasil.

As espécies do gênero Bauhinia (Leguminosae) são usadas na medicina tradicional para tratar diversas patologias, principalmente diabetes mellitus. Alguns estudos têm demonstrado atividades promissoras desse gênero, entre essas atividades, antifúngica, antimicrobiana, analgésica e anti-inflamatória (SILVA; CECHINEL-FILHO, 2002).

A espécie Bauhinia forficata, conhecida popularmente por “pata de vaca”, “unha de vaca” ou “mororó”, é nativa da América do Sul, e possui propriedades medicinais como diurética, antidiarreica, tônica e hipoglicêmica (REMPEL; PÉRICO; STROHSCHOEN, 2010). No Brasil são encontradas duas variações de Bauhinia forficata, sendo estas a Bauhinia

forficata Link varo ptstvpetete (Burch. ex Benth.) Wund no Cerrado e Pantanal, e a Bauhinia forficata Link subsp. pruínosa (Vog.) Fortunato et Wunderlin, que ocorre na Argentina, Bolívia, Paraguai, Uruguai e no Sul do Brasil (CARVALHO, 2003).

É a espécie do gênero mais estudada como medicinal, com dados de ensaios farmacológicos do início do século XX, indicando o potencial hipoglicemiante. Ela é conhecida entre a comunidade rural, como pata de vaca verdadeira (JULIANE, 1929; SILVA, CECHINEL, 2002).

A literatura também têm demonstrado potencial farmacológico dessa espécie como coadjuvante no tratamento de diabetes, e uma expressante atividade antioxidante (BATISTA et al., 2013).

Seu nome popular é devido às suas folhas possuírem aspecto bilobada, sendo encontrada na vegetação da Caatinga no Brasil, Florestas no estado do Paraná e Amazônia. O extrato aquoso das folhas das espécies de Bauhinia é utilizado na medicina popular brasileira como antidiabética, sendo a forma mais comum de preparo por meio de infusão com água (COELHO-FERREIRA, 2009; SILVA et al., 2012; BOLSON et al., 2015).

34

B. forficata (Figura 1) é uma das espécies mais comercializadas em feiras livres no Brasil, e não têm demonstrado toxicidade ou interações medicamentosas (LEITÃO et al., 2014). É uma das plantas mais efetivas e comumente estudada em relação à diabetes e suas complicações. O principal responsável pelo seu potencial antidiabético, é a kaempferitrina, flavonoide majoritário presente em suas folhas (JORGE et al., 2004).

Figura 1. Foto ilustrativa dos galhos (A) e folha (B) da espécie B. forficata.

Fonte: o autor.

Os principais constituintes fitoquímicos desse gênero, são os

flavonoides, porém, algumas outras substâncias já foram identificadas, como alcaloides, estilbenos, terpenos e esteroides (SILVA; CECHINEL-FILHO, 2002). Diversos compostos já foram isolados da B. forficata, como o kaempferol, e derivados glicosilados de quercetina, destacando-se o principal flavonoide kaempferitrina, o qual é relatado como responsável pelos efeitos farmacológicos da espécie (BATISTA et al., 2013), e encontrado em maior quantidade nas folhas (ZHAO et al., 2014). Como os flavonoides são as substâncias encontradas em maior quantidade, essa espécie possui uma atividade antioxidante significativa (MICELI et al., 2016).

Estudos recentes têm demonstrado que a B. forficata possui efeito antimutagênico (DÜSMAN et al., 2013), anti-ulcerogênico (MAZZEO et al., 2015), antimicrobiano (PEREIRA et al., 2014; BEZERRA et al., 2015),

A B

35

hipocolesterolêmico (MARIÁNGEL; MONSERRAT, 2016; MARIÁNGEL et al., 2015) e também hepatoprotetor (SALGUEIRO et al, 2016). Heller et al. (2013), estudaram os efeitos hipoglicemiantes, nutricionais e hipotensivos do chá de B. forficata em 54 indivíduos durante oito meses, e observaram que o grupo que consumiu o chá obteve redução da pressão arterial e redução de peso e do Índice de Massa Corporal (IMC), em comparação com o grupo controle. Em adição, Zaccaron et al. (2014) também avaliaram os efeitos da infusão de B.

forficata em pacientes com diabetes tipo II, por seis meses e observaram redução das concentrações de glicose sanguínea.

Ecker et al. (2015) avaliaram os efeitos do extrato aquoso das folhas in vitro, em parâmetros mitrocondriais e oxidativos, e verificaram que em doses elevadas (400 mcg/mL), causou danos mitocondriais, indicando que dependendo da dose utilizada, pode trazer malefícios.

Ressalta-se que os estudos sobre a toxicidade de B. forficata são escassos, e os poucos já realizados, são apenas in vitro, não tendo sido realizados ainda em animais ou humanos. Em virtude da B. forficata possuir perfil fitoquímico majoritário de flavonoides nas folhas, e pelo potencial antioxidante e anti-inflamatório dessa classe, bem como, por essa espécie possuir indicação popular como antidiarreica, além de ser uma planta previamente estudada pelo Núcleo de Investigações Químico-Farmacêuticas (NIQFAR)/UNIVALI, foi escolhida para avaliar o possível efeito protetor no pré-tratamento da mucosite intestinal.

3.3 Campomanesia reitiziana

A Campomanesia reiziana, conhecida popularmente como gabiroba ou guabiroba, pertence à família Myrtaceae, uma das famílias mais ricas em espécies nas restingas brasileiras, que compreende aproximadamente 130 gêneros e mais de 5.670 espécies. No Brasil, estima-se que há mais de 920 espécies espalhadas em 24 gêneros. Essa família está presente em diversos biomas brasileiros, mas é encontrada principalmente na Mata Atlântica e restingas da região Nordeste. Dentre eles, encontram-se o gênero Eugenia, sendo o mais diverso, além de Myrcia, Myrciaria, Campomanesia e Psidium (LOURENÇO; BARBOSA, 2012).

36

A procura e consumo por frutos nativos têm aumentado no Brasil, mas ainda assim, muitas espécies, como a gabiroba, ainda não têm sido exploradas comercialmente em grande escala (LIMA et al., 2016). Geleias e polpas de gabiroba podem ser encontrados para comercialização, porém, esse nome popular também é atribuído a outras espécies do gênero, como a C. xanthocarpa ou C. lineatifolia. Dessa forma, não são necessariamente produtos à base da C. reitziana (SANTOS et al., 2013).

O gênero Campomanesia tem como característica espécies de arbustos ou árvores, com folhas com nervura marginal não evidente. Os frutos campomanesioídeos, são globosos ou ovados, com cálice persistente e sementes. É encontrado do norte da Argentina, até Trinidad, e da costa do Brasil até os Andes, Peru, Equador e Colômbia. No Brasil, atualmente, já foram citadas 31 espécies, entre elas, a Campomanesia

reitziana (LOURENÇO; BARBOSA, 2012). Figura 2. Foto ilustrativa da espécie C. reitziana.

Fonte: o autor. São escassos os estudos na literatura com a espécie C. reitiziana

(Figura 2), porém, espécies do mesmo gênero têm sido estudadas recentemente, e demonstrado boas atividades biológicas (LESCANO et al., 2016; ESPÍNDOLA et al., 2016; MARTELLO et al., 2016; DA SILVA et al., 2016).

37

A Campomanesia adamantium, encontrada no Cerrado brasileiro, por exemplo, é usada tradicionalmente para tratar problemas inflamatórios, febre, diarreia, hipercolesterolemia e reumatismo (LESCANO et al., 2016). Suas raízes apresentam potencial hipocolesterolêmico, atuando na prevenção de doenças cardiovasculares (ESPÍNDOLA et al., 2016). Suas folhas e flores também apresentam atividade mutagênica, dessa forma, seu uso deve ser feito com precaução (MARTELLO et al., 2016). Outra espécie do mesmo gênero, a Campomanesia xanthocarpa é usada popularmente também contra febre, diabetes e hipercolesterolemia, e apresenta atividade anti-inflamatória, sem apresentar toxicidade aguda (DA SILVA et al., 2016). A C. reitiziana é uma espécie nativa e endêmica do Brasil e suas folhas são popularmente utilizadas para tratar a diarreia, leucorréia e cistite. Possui na sua composição flavonoides, entre eles, a isoquercitrina (ROSÁRIO-NETO et al., 2012). Nesello et al. (2016) observaram efeito analgésico do fruto em modelos animais, além da presença de chalconas na análise fitoquímica dos mesmos.

Rosário-Neto et al. (2012), observaram efeitos da gabiroba na redução da gordura visceral e glicemia de camundongos, além da presença de flavonoides nas folhas.

A espécie C. reitziana foi escolhida para o presente estudo, por possuir flavonoides nas suas folhas, além de ser uma planta utilizada popularmente para o tratamento de diarreia, e já ter sido estudada anteriormente pelo NIQFAR. 3.4 Fisiologia gastrointestinal O trato gastrointestinal é definido como um longo tubo que se inicia na boca e termina no ânus. É importante, pois por meio dele é realizado o suprimento de água, eletrólitos e nutrientes. Dessa forma, o alimento se movimenta ao longo desse trato digestivo, e passa por diversas modificações até ser digerido, absorvido e utilizado pelo organismo. No intestino, órgãos glandulares como o pâncreas estão ligados por ductos ao intestino, o que possibilita a drenagem das secreções para o interior, misturando-se ao conteúdo intestinal e auxiliando a etapa de digestão, para então ser absorvido (HALL, GUYTON, 2012; BARRET, 2015).

38

O intestino delgado é o principal responsável pela digestão e absorção de nutrientes no trato gastrointestinal. Anatomicamente nos humanos, é dividido em duodeno, jejuno e íleo (Figura 3). A maior parte da absorção ocorre no duodeno e na primeira parte do jejuno, através de difusão passiva, difusão facilitada, transporte ativo e convecção através do movimento da água através de membranas celulares. Já o intestino grosso, é dividido em ceco, cólon ascendente, cólon transverso e cólon descendente, cólon sigmoide, reto e canal anal (DESSESSO, JACOBSON, 2001).

No intestino grosso ocorre a absorção de água, eletrólitos, substâncias que não foram absorvidas no íleo, mas possuem propriedades favoráveis para absorção, e substâncias formadas pelo metabolismo das bactérias. Ressalta-se que grande parte do processamento de nutrientes nessa parte final do intestino é devido às bactérias (DESSESSO, JACOBSON, 2001). Figura 3. Anatomia do trato gastrointestinal.

Fonte: Adaptado de http://www.restoreyourfreedom.com.au/bowel-control/anatomy/anatomy-of-the-gut/index.htm

Além da diferença fisiológica entre duodeno e cólon, a colonização

de microorganismos também é diferente nessas duas porções do intestino. O duodeno, possui uma quantidade inferior, cerca de 101 a 103 unidades formadoras de colônia por ml, enquanto no cólon esses valores chegam a aproximadamente 1012 (SANDER et al., 2007).

39

A parede intestinal possui camadas da parte externa à interna, sendo estas a mucosa, submucosa, muscular e serosa. As diferentes camadas compostas pelo músculo liso executam as funções motoras necessárias. Através do epitélio intestinal, ocorre a captação seletiva de nutrientes, eletrólitos e água, e a rejeição de substâncias nocivas. Essa superfície do epitélio intestinal é amplificada por possuir estruturas denominadas vilosidades, as quais aumentam a superfície de contato para a absorção dos nutrientes (HALL, GUYTON, 2012; BARRET, 2015).

As células do epitélio intestinal se renovam a cada três dias, se originam nas células tronco encontradas no revestimento intestinal na base das criptas do intestino. Abaixo do epitélio, está a membrana basal que reveste uma camada de tecido conectivo frouxo denominado lâmina própria, repleta de terminações nervosas e vasos sanguíneos, além de células imunes e inflamatórias responsáveis pela proteção e controle fisiológico. O epitélio e a lâmina própria compõem a túnica mucosa (BARRET, 2015).

Além do papel de digestão e absorção, a barreira intestinal é a camada de proteção mais importante em relação ao ambiente externo. O principal papel da barreira intestinal é a regulação da absorção dos nutrientes, eletrólitos e água, do lúmen intestinal até a circulação, e a proteção contra a entrada de patógenos e substâncias tóxicas. Ainda, o controle da troca de moléculas entre ambiente e hospedeiro, influencia no equilíbrio da tolerância e imunidade. Pela ótica estrutural, essas funções são preservadas por fatores como a camada de muco e pela monocamada de células epiteliais interligadas pelas “tight junctions”, que são estruturas proteicas complexas transmembranares. Essas proteínas se ligam à membrana plasmática oposta, propiciando uma ligação mecânica entre células epiteliais e surgindo assim uma ligação mecânica entre as células epiteliais criando uma barreira de difusão paracelular de fluidos e solutos (KELLY et al., 2015).

A barreira intestinal é essencial na prevenção de penetração de antígenos no lúmen, e as “tigh junctions” (TJ) são componentes importantes dessa barreira, que controla a passagem de íons e moléculas do lado apical e basolateral da membrana plasmática. A regulação da função das TJ são fundamentais para diversos processos fisiológicos, e sua ruptura altera drasticamente a permeabilidade, podendo ocorrer estados patológicos. As TJ são compostas por proteínas transmenbranosas, como membros da família claudina, ocludina,

40

tetraspanina, e proteínas citoplasmáticas, como as da zônula de oclusão (ZO-1) (GONZÁLES-MARISCAL et al., 2003; NAKAO et al., 2012).

Essa barreira pode ser parcialmente quebrada em diferentes circunstâncias, que podem ocasionar doenças autoimunes ou inflamatórias. Lesões teciduais podem ocorrer caso haja translocação do conteúdo luminal do intestino para a mucosa. Quando ocorre algum rompimento nessa barreira, lesões locais ou sistêmicas podem ocorrer, levando a diversas morbidades, entre elas, doenças inflamatórias intestinais, hepáticas e síndromes inflamatórias sistêmicas no pulmão, coração e cérebro (CÉSAR MACHADO; SILVA, 2016).

No intestino há trilhões de bactérias de cerca de 1000 espécies diferentes, sendo que alguns micróbios exercem papel importante na imunidade, por meio da interação com células intestinais ou dendríticas do hospedeiro, e também por meio de mecanismos indiretos que dependem do metabolismo bacteriano (FILYK; OSBORNE, 2016).

A microbiota está localizada principalmente no trato gastrointestinal, especialmente no cólon, o qual é primariamente anaeróbico, e é um ambiente nutricionalmente fecundo para a colonização microbiana intestinal. Esses microorganismos vivem de forma coexistente com o hospedeiro e formam um conjunto com grande número de bactérias, vírus e organismos eucariotos unicelulares (TANG et al., 2017).

A exposição do intestino a diversos micróbios, em conjunto com o sistema imune intestinal são responsáveis por distinguir as bactérias comensais de bactérias patogênicas. A colonização acontece no início da vida, e fatores como a idade da mãe, tipo de parto (normal ou cesariana), tratamento com antibióticos, alimentação (leite materno ou fórmulas) influenciam essa composição. Por exemplo, crianças que nasceram de cesariana apresentam uma quantidade inferior de Bifidobacteria e Bacteroides, e um aumento da população de Clostridium

difficile (HODZIC et al., 2017). A microbiota intestinal exerce função multifuncional, com interações

que vão além do papel fisiológico na digestão de alimentos. Constitui e participa da regulação da barreira mucosa intestinal, controle da absorção de nutrientes e metabolismo, auxílio na maturação de tecidos imunológicos e prevenção da propagação de microorganismos patogênicos (TANG et al., 2017). As bactérias presentes nas superfícies mucosas estão em contato direto com o epitélio intestinal e influenciam de forma acentuada

41

na modulação do tecido linfóide associado ao trato gastrointestinal (GALT), afetando a barreira intestinal na defesa a patógenos e também o sistema imune do hospedeiro (COPPO, 2017).

Estima-se que existam cerca de 3,3 milhões de diferentes genes na microbiota intestinal, sendo 150 vezes mais do que o genoma humano. Cerca de 90% dos filos presentes na maior parte da população, são Firmicutes e Bacteroidetes, sendo o restante composto por Actinobacterias (família Bifidobacteriaceae) e Proteobacterias (família Enterobacteriaceae). As principais integrantes dos Firmicutes são as classes Bacilli, Clostridia e Molicutes e dos Bacteroidetes são as Bacteroides, Flavobacteria e Sphingobacterias (MORAES et al., 2014).

As respostas imunes a antígenos específicos ao longo da mucosa são iniciadas por meio do tecido linfoide associado à mucosa (MALT), que compreendem o sistema imune da mucosa e que pode funcionar de forma independente ao sistema imune sistêmico (CESTA, 2006). Segundo Coppo (2017), o MALT pode ser encontrado em áreas de indução do tecido linfoepitelial organizado, incluindo o tecido linfóide associado à via oral (O-MALT) e tecido linfóide associado ao trato gastrointestinal (GALT).

A microbiota exerce papel preponderante na manutenção da homeostase imunológica no GALT, tendo efeitos sobre células imunológicas competentes, e afetando não apenas a mucosa intestinal, mas a resposta imune sistêmica também. Uma microbiota alterada leva à disbiose, fator fundamental em condições inflamatórias intestinais imuno mediadas. As modificações na microbiota intestinal na primeira infância é crítica para o desenvolvimento futuro de doenças, e o aumento da permeabilidade intestinal pode levar à doença celíaca e outras condições aparentemente não relacionadas incluindo obesidade, diabetes, Alzheimer, e em doenças auto imunes como artrite reumatoide e lúpus eritematoso sistêmico (QUIGLEY, 2017; COPPO, 2017).

A disbiose intestinal leva ao aumento da proliferação de bactérias que produzem citocinas pró-inflamatórias, estando estas relacionadas inclusive com o surgimento de tumores intestinais. A microbiota intestinal pode ser modificada através da ingestão de probióticos, fibras prebióticas e polifenois (HÅKANSSON et al., 2012).

Adultos podem ter variações na proporção das bactérias devido a fatores ambientais ou patologias. Ao longo do envelhecimento, por exemplo, há diminuição na população de Bacteroides, Bifidobacteria e

42

menor produção de ácidos graxos de cadeia curta (AGCC). Essas alterações parecem estar relacionadas a perda de paladar, olfato e menor ingestão alimentar (MORAES et al., 2014).

No sistema gastrointestinal as células enteroendócrinas são responsáveis pela secreção de hormônios em resposta a estímulos alimentares. Essas células desempenham também papel na promoção da imunidade da mucosa, exercendo atividade na manutenção da homeostase intestinal em relação à colonização bacteriana. Os AGCC derivados da microbiota intestinal ativam receptores de células L, influenciando no metabolismo energético e no funcionamento da barreira intestinal através da secreção de GLP-1 e GLP-2. Além da interação entre sistema endócrino e imune, há também a participação do sistema neuroendócrino no intestino (HODZIC et al., 2017).

Quando o intestino está inflamado, os mediadores inflamatórios liberados podem perturbar as populações bacterianas, ressalta-se que o eixo intestino-cérebro é bidirecional, e por isso, o estresse pode gerar alterações na fisiologia intestinal, função imune e composição da microbiota (QUIGLEY, 2017).

Estudos também sugerem que a ligação entre intestino e sistema nervoso central (eixo intestino-cérebro), influencia o comportamento, a saúde psicológica e bem estar geral (LOPES; KUSSMANN, 2011). A microbiota intestinal pode exercer influência no comportamento alimentar e no sistema nervoso central, através do sistema endocanabinoide por meio da interação com peptídeos estimulados por bactérias, influenciando a regulação central do apetite, saciedade e permeabilidade intestinal (MORAES et al., 2014).

O eixo cérebro-intestino funciona por duas vias, o cérebro exerce influência na microbiota intestinal e leva a alterações na função epitelial, produção de mucinas, função de células endócrinas, motilidade e respostas imunes. Já o intestino, influencia o cérebro e o comportamento por meio da ativação de circuitos aferentes até o cérebro, ativação de respostas imunes na mucosa e produção de metabólitos que influenciam de forma direta o SNC (QUIGLEY, 2017).

A microbiota intestinal pode exercer influência no comportamento alimentar e no sistema nervoso central, através do sistema endocanabinoide por meio da interação com peptídeos estimulados por

43

bactérias, influenciando a regulação central do apetite, saciedade e permeabilidade intestinal (MORAES et al., 2014). 3.5 Mucosite intestinal

Segundo Vassem, Barboza e Silva (2013), a quimioterapia é um dos

tratamentos mais utilizados em casos de neoplasias, sendo um tratamento intenso e agressivo para o corpo, pois além de atingir as células neoplásicas, também agride outras estruturas normais, como a medula óssea e o trato gastrointestinal, podendo levar a efeitos adversos como náuseas, vômitos, mielosupressão, aplasia medular, entre outros.

O uso de terapias quimioterápicas, incluindo o irinotecano, é necessária para o tratamento eficaz e seguro de pacientes com câncer. Porém seu uso pode levar a alterações intestinais desagradáveis, como a mucosite intestinal, com sintomas que incluem diarreia, dor abdominal e náuseas (GIFONI, 2012). O irinotecano (Figura 4) é muito utilizado no tratamento de câncer colorretal, porém, como este uso está associado ao aparecimento de mucosite intestinal, muitas vezes acaba por limitar o tratamento. A mucosite intestinal, concomitantemente com a diarreia grave são efeitos adversos frequentes nesses pacientes. No entanto, o manejo clínico destes efeitos secundários ainda é parcialmente ineficaz (MELO, 2014).

44

Figura 4. Estrutura química do quimioterápico irinotecano.

O irinotecano é um derivado semi-sintético da camptotecina, que é um

alcaloide extraído de vegetais como, por exemplo, a espécie Camptotheca

acuminata, mas que também pode ser sintetizado quimicamente (PFIZER, 2014).

A descoberta da camptotecina, assim como do taxol, ambos agentes antineoplásicos, foram descobertos pelo mesmo grupo de pesquisa, o qual em 1966 relatou o isolamento da camptotecina a partir da árvore chinesa C. acuminata. Após 20 anos, apenas um mecanismo de ação havia sido identificado, a inibição da topoisomerase I no DNA, porém, devido a sua baixa solubilidade, a substância não se mostrou apropriada para o desenvolvimento farmacêutico. Porém, após intensos estudos, surgiu a primeira geração de fármacos análogos da camptotecina, como o irinotecano, solúvel em água, o qual foi aprovado pelo "Food and Drug Administration" (FDA) dos EUA, em 1996, e é comercializado desde então para o tratamento de câncer de cólon e ovário (VIEGAS-JÚNIOR et al., 2006).

No fígado (Figura 5), a enzima CYP3A4 atua sobre o irinotecano, gerando dois compostos que são inativos, o APC (7-etil-10-[4-N-(5-ácido aminopentoico)-1-piperidino]- carboniloxicamptotecina) e o NPC (7-etil-10-(4-amino-1-piperidino)- carboniloxicamptotecina). O NPC é metabolizado pela enzima carboxilesterase (CE), no metabólito ativo e tóxico SN-38 (7-etil-10-hidroxicamptotecina). O SN-38 é depurado no fígado por meio do polipeptídeo A1 da família da uridina difosfato glicosiltransferase 1

45

(UGT1A1), sendo convertido no metabólito não-tóxico SN-38 glicuronídeo (SN-38G), que não possui atividade biológica. O irinotecano, SN-38 e SN-38G são excretados na bile e chegam no intestino delgado, onde o irinotecano é clivado pela CE intestinal, formando novamente o SN-38. Devido aos microorganismos presentes no intestino, o SN-38G pode sofrer desconjugação por bactérias produtoras de β-glucuronidase, sendo reativada e transformada novamente em SN-38, causando a mucosite intestinal (WONG, 2013; STRINGER, 2013; TORKAMANI, 2015).

Figura 5. Metabolização do irinotecano. Legenda: SN-38: 7-etil-10-hidroxicamptotecina - metabólito ativo e tóxico; SN-38

glicuronídeo; UGT1A1: uridina difosfato glicosiltransferase 1; CE-hep: enzima carboxilesterase hepática; CPT-11: ; CYP3A4: enzima CYP3A4; NPC: 7-etil-10-(4-amino-1-piperidino)- carboniloxicamptotecina; APC: 7-etil-10-[4-N-(5-ácido aminopentoico)-1-piperidino]- carboniloxicamptotecina; CE-int: enzima carboxilesterase intestinal.

Fonte: Wong, 2013. A mucosite acomete pelo menos 40% dos pacientes com câncer em

tratamento, em todas as fases da vida, afetando cerca de 500 mil pacientes anualmente em uma esfera global. Todo o trato gastrointestinal pode ser

46

afetado (da boca ao ânus), levando a sinais e sintomas como ulcerações, dor abdominal, náuseas e vômitos, inchaço, diarreia, constipação e perda de peso (ARAÚJO et al., 2015). Pode inclusive ser fatal, especialmente no uso de irinotecano, mas geralmente para aliviar os sintomas opta-se por reduzir a dose do quimioterápico (BOWEN et al., 2006).

Ainda, o irinotecano pode induzir a translocação bacteriana, a qual é definida como a passagem de bactérias e endotoxinas do intestino, para linfonodos mesentéricos e órgãos como fígado e baço, podendo levar à sepse. Ele danifica as proteínas que formam as TJ, em especial, a claudina-1 e ocludina, o que pode levar a desordens na barreira epitelial intestinal e translocação bacteriana. Nakao et al. observaram translocação nos linfonodos mesentéricos e baço de 80% dos animais tratados com irinotecano (NAKAO et al., 2012).

Historicamente, pensava-se que a mucosite era um fenômeno epitelial decorrente do efeito tóxico de agentes quimioterápicos citotóxicos sobre células basais do epitélio do trato gastrointestinal, porém, estudos mostram que esse desenvolvimento é complexo e envolve várias vias moleculares, nos diversos compartimentos da mucosa. O desenvolvimento da mucosite envolve cinco fases (Quadro 1) (LOGAN et al., 2007; SONIS et al., 2004; SULTANI et al., 2012).

Quadro 1. Fases da mucosite intestinal.

Fases Processo

1ª Iniciação

2ª Regulação positiva e

geração de mensagem

3ª Sinalização e amplificação

4ª Ulceração e inflamação

5ª Fase de cura

47

Os quimioterápicos geram regulação positiva dos genes de resposta ao estresse, incluindo o NFkB, que regulam a produção de citocinas pró-infamatórias, como a Interleucina-1 β (IL-1 β), Interleucina–6 (IL-6), e o fator de necrose tumoral-α (TNF-α). Essas citocinas pró-inflamatórias são as responsáveis por dar início à inflamação em resposta à lesões ocasionadas em células e tecidos (SULTANI et al., 2012). A mucosite intestinal é consequência do tratamento citotóxico através de vários mecanismos, dentre eles a indução da morte celular das células das criptas (apoptose) e citostase. O controle molecular dessas ações ao longo do trato gastrintestinal ainda não foi totalmente elucidado (BOWEN et al., 2006). Gifoni (2012) avaliou 25 pacientes com câncer colorretal em tratamento com fluorouracil e irinotecano, e constatou que a maioria deles não conseguiu completar as quatro doses semanais programadas para o primeiro ciclo do tratamento, devido à toxicidade apresentada, tanto nos parâmetros hematológicos, como clínicos, com fortes efeitos adversos como dor abdominal, diarreia, náuseas, vômitos e mucosite oral. Quando a mucosite atinge o estado grave, pode tornar necessária a alteração ou até a interrupção do tratamento quimioterápico, o que leva o paciente a ter sérias consequências na resposta tumoral e sobrevida, aumentando o risco de infecções (KELNER; CASTRO, 2007).

3.6 Possíveis tratamentos para mucosite intestinal induzida por quimioterápico

Ainda hoje, infelizmente, nenhum medicamento foi encontrado para manejar satisfatoriamente a mucosite intestinal, sendo necessária a continuidade de estudos nessa área (KISSOW, 2015). Algumas terapias são utilizadas atualmente, apesar de não serem satisfatoriamente efetivas, com o intuito de aliviar os sintomas e com isto atenuar o quadro do paciente. A literatura descreve o uso e suplementação de imunomoduladores e probióticos, conforme descritos a seguir. Os probióticos são micróbios vivos que trazem benefícios à saúde, sendo mais comumente utilizadas as espécies de Lactobacillus e Bifidobactérias. Eles ajudam a microbiota intestinal naturalmente presente no organismo e são usadas como suplementos, estando entre suas atividades, a melhora da diarreia, melhora da disbiose, dos transtornos gastrointestinais e

48

extraintestinais, incluindo a doença inflamatória intestinal (DII) e a síndrome do intestino irritável (SII) (WGO, 2011). Segundo Justino et al. (2015), o Lactobacillus acidophilus é muito utilizado para tratar distúrbios gastrointestinais na clínica, e em camundongos com mucosite intestinal induzidos pelo quimioterápico 5-fluoracil (5-FU), gerou melhora nos aspectos funcionais e inflamatórios intestinais, com a melhora na relação da altura das vilosidades das criptas, redução do trânsito gástrico e intestinal e reversão das alterações de oxidação causadas pelo 5-FU. Atualmente, o interesse por nutrientes imunomoduladores e probióticos para tratar a mucosite intestinal tem aumentado, pois estes auxiliam na regulação de respostas imunes e inflamatórias, atuando na restauração da barreira intestinal. Além dos probióticos já citados, imunomoduladores como os aminoácidos glutamina, argigina, triptofano, e citrulina, ácidos graxos de cadeia curta e ômega-3, também são bastante utilizados (ANDRADE et al., 2015). Araújo et al. (2015), realizaram um estudo para avaliar os efeitos do olmesartan em ratos com mucosite intestinal induzida por metotrexato (MTX), e observaram que o mesmo exerceu atividade anti-inflamatória, reduzindo ulcerações, vasodilatação, infiltrado inflamatório, áreas hemorrágicas e a quantidade de mieloperoxidase. Arslan et al. (2016) observaram que o pré-tratamento com nimesulida protegeu o intestino delgado em relação aos efeitos tóxicos do MTX em ratos, indicando que possivelmente a co-administração de nimesulida pode prevenir a mucosite intestinal. Kolli et al. (2013) avaliaram o efeito protetor da melatonina, um inibidor de estresse nitro-oxidativo, no desenvolvimento da mucosite em ratos pré-tratados, sendo o MTX o quimioterápico utilizado para a indução. Foi constatado efeito protetor, observado na preservação da morfologia, redução de danos nas vilosidades e criptas. Ainda, a relação vilosidades/cripta foi praticamente restaurada, e a melatonina protegeu o intestino delgado dos danos e atenuou o estresse nitrosativo. De acordo com Kissow (2015), os peptídeos semelhantes ao glucagon (GLPs) têm demonstrado potencial terapêutico em relação à mucosite intestinal, sendo importante a ativação dos seus receptores após a lesão, para que ocorra a restauração tecidual intestinal. Destaca ainda, que pacientes diabéticos (tipo 2) e obesos possuem a secreção desses hormônios prejudicada, e que elucidar o papel destes hormônios pode levar à identificação de fatores de risco da mucosite e uma terapia preventiva alternativa para estes pacientes.

49

Reinke et al. (2015) avaliaram os efeitos do acteosídeo, uma substância herbal, derivada de espécies de plantas do gênero Scrophularia em ratos com mucosite intestinal induzida por MTX. Essa substancia natural se mostrou promissora, pois reduziu a gravidade das alterações histológicas em 75, 78, e 88% no duodeno, jejuno e íleo, respectivamente. O extrato aquoso de Ruibarbo (Rheum spp.), utilizado na medicina tradicional asiática para distúrbios gastrointestinais como diarreia e inflamação, apresentou melhora da integridade da mucosa e reduziu a inflamação no íleo, em animais com mucosite intestinal induzida por 5-FU (BAJIC et al., 2016). Abalo et al. (2016) observaram que o tratamento via oral com canabinoides atenuou a diarreia em ratos com mucosite intestinal induzida com 5-FU. Al-Asmari et al. (2016), avaliaram os efeitos do pré-tratamento de vitamina E na mucosite intestinal induzida por 5-FU em ratos, e observaram que a suplementação com vitamina E inibiu a mucosite por modular o estresse oxidativo. Todavia, são escassos os estudos de modelo de mucosite intestinal utilizando o irinotecano como agende indutor, devido ao custo e agressividade dos sinais que podem levar ao óbito dos animais em muitos casos. Porém, alguns estudos recentes trazem alguns resultados promissores. Por exemplo, De Alencar et al. (2017) avaliaram a proteína de látex obtida da espécie Calotropis procera na prevenção da mucosite intestinal e diarreia induzida por irinotecano, e observaram melhora dos sinais, bem como redução nos parâmetros inflamatórios e oxidativos. Alvarenga et al. (2016) observaram que administração do agonista do receptor TRPA1, carvacrol, atuou reduzindo os parâmetros inflamatórios, estrutura do tecido do intestino delgado, e de parâmetros clínicos como sobrevivência, variação de peso, leucograma e contagem de bactérias no sangue. Algumas outras plantas e compostos isolados, tem-se destacado como potenciais agentes na terapêutica dessa manifestação citotóxica, entre elas, a semente de uva (CHEAH et al., 2014), a proantocianidina (GULGUN et al., 2010), a Curcuma longa L. (cúrcuma) (SANTOS-FILHO et al., 2014), a Bidens

pilosa L. (picão-preto) (BASTOS et al., 2014), chás tradicionais chineses (GOU et al., 2016), entre outros.

Com a falta de estudos conclusivos e medicamentos efetivos para a mucosite intestinal, a utilização de imunomoduladores (aminoácidos e ômega 3), como coadjuvantes na prática clínica tem sido muito usada, pois melhoram

50

o desconforto dos pacientes, evitam possíveis complicações, como síndrome de resposta inflamatória sistêmica, bacteremia e sepse. Além disso, essa utilização pode ainda contribuir para uma redução dos custos hospitalares devido às hospitalizações prolongadas (ANDRADE et al., 2015).

4 MATERIAIS E MÉTODOS

4.1 Fármacos, reagentes e solventes Irinotecano (CPT-11, Camptosar®, Pfizer), loperamida (Imosec® da Janssen) e atropina (Sigma). Todos os outros reagentes e solventes foram de grau analítico.

4.2 Preparo do material vegetal 4.2.1 Coleta do material

A coleta das folhas frescas das espécies B. forficata e C. reitiziana foi realizada no município de Itajaí, no bairro Ressacada, em abril de 2015. Foram retirados galhos contendo as folhas, que posteriormente foram picadas e pesadas. Posteriormente, foram realizadas outras coletas nos meses de setembro/2015, dezembro/2015 e fevereiro/2016 das folhas de B. forficata para análise sazonal das quatro estações do ano. Também foi realizada a coleta em setembro/2015 de folhas de uma árvore de aproximadamente um ano de idade da espécie B. forficata, que se encontrava ao lado da árvore na qual foi realizada a análise sazonal, para comparação de idade.

As duas espécies utilizadas no presente estudo foram identificadas. O grupo do NIQFAR iniciou os estudos com a B. forficata há muitos anos e naquela oportunidade a planta foi identificada pelo Dr. Haroldo Cavalcante de Lima, do jardim Botânico-Rio de Janeiro. Uma exsicata encontra-se depositada no Herbário Barbosa Rodrigues de Itajaí, Santa Catarina, sob o código V.C. Filho 013. A planta para uso neste estudo foi autenticada pelo técnico do Curso de Farmácia, Eng. Renê Ferreira.

51

A espécie C. reitiziana foi identificada pelo Dr. Oscar B. Iza (Departamento de Botânica da Universidade de Vale do Itajaí). Um comprovante de amostra foi depositado no Herbário Barbosa Rodrigues em Itajaí, Santa Catarina, sob número de exsicata V.C. Filho 95. 4.3 Obtenção dos extratos e frações

Os estudos fitoquímicos indicados nos itens 4.3 e 4.4 contaram com o apoio e supervisão/execução dos professores Valdir Cechinel Filho (Programa de Pós Graduação em Ciências Farmacêuticas) e Adriana Campos (Curso de Nutrição) da UNIVALI e acompanhamento da autora. As análises de CLAE foram realizadas pela técnica da Central de Análises do Curso de Farmácia da UNIVALI, Clarissa de Medeiros Amorim Krueger.

O material fresco e picado das plantas (folhas) em estudo foi submetido a um processo de maceração com metanol (MeOH), a frio, por um período de uma semana. Após, o solvente foi removido por destilação em evaporador rotatório sob pressão reduzida, para obtenção do respectivo extrato metanólico bruto. Este extrato foi então particionado com os seguintes solventes de polaridade crescente: clorofórmio (CHCl3), acetato de etila (AE) e butanol (BUT), conforme metodologia previamente descrita (MALHEIROS et al., 2010).

Na Figura 6 está o fluxograma da primeira coleta da B. forficata, realizada em abril de 2015, no qual a fração acetato de etila e butanol (FAEB-BF) foi utilizada nos testes farmacológicos.

52

Figura 6. Fluxograma da obtenção das frações das folhas de B. forficata,

coletadas em abril de 2015 em Itajaí-SC.

Em relação à outra espécie estudada, C. reitiziana, o fluxograma da coleta

está descrito na Figura 7. A fração acetato de etila (FAE-CR) foi utilizada nas análises farmacológicas.

53

Figura 7. Fluxograma da obtenção das frações das folhas de C. reitziana

coletada em abril/2015 em Itajaí-SC.

4.4 Análise fitoquímica preliminar

Considerando o interesse nas frações contendo flavonoides, as frações acetato de etila e butanol das duas plantas foram analisadas por cromatografia em camada delgada (CCD) e eluídas com gradiente CHCl3/MeOH (70:30) e reveladas com cloreto férrico, reativo específico para flavonoides (UGAZ, 1994).

As frações acetato de etila e butanol da B. forficata apresentarem perfil fitoquímico similar, justificando a união das duas frações para a realização das demais análises fitoquímicas e dos testes farmacológicos.

54

4.5 Análise fitoquímica da Bauhinia forficata

Após “screening” farmacológico das frações, aquelas que apresentaram resultados mais promissores, no caso, a fração acetato de etila + butanol da

B. forficata, foi submetida a procedimentos cromatográficos usuais, como cromatografia em coluna (CC) e cromatografia líquida de alta eficiência (CLAE), usando padrões de flavonoides previamente isolados da planta como a kaempferitrina, kaempferol e quercetina.

4.5.1 Fenóis e flavonoides totais Para avaliar os fenóis totais foi utilizado o método descrito por (ARNOUS,

2001), os quais foram determinados utilizando o reagente de Folin – Ciocalteau diluído 1:10; carbonato de sódio à 7,5 % e FAEB-BF à 3mg/mL. As concentrações utilizadas foram: 200, 150, 100 e 50 µg/mL. Uma solução com concentração de 0,6 mg/mL foi feita com a FAEB-BF, em seguida foi adicionado 0,5 mL desta solução em um tudo contendo 0,5 mL de água destila. Logo após adicionamos 2,5 mL da solução de Folin – Ciocalteau e 2 mL da solução a 20% de Na2CO3. Os tubos foram incubados a 45 °C durante 15 min.

Em seguida, foram plaqueados 200 µg de cada amostra em duplicata em placa de 96 poços e a absorbância foi lida a 765 nm utilizando um espectrofotômetro. A concentração total de polifenois foi calculada a partir de uma curva de calibração, utilizando o ácido tânico como um padrão. Os resulados foram expressos em equivalentes de ácido tânico (TAE) em µg/mL.

Para determinar o teor de flavonoides totais nas amostras foi utilizado o método de Meda et al. (2005), adaptado para determinação de flavonoides em plantas com a solução cloreto de alumínio a 2 % em metanol. As concentrações utilizadas foram: 200, 150, 100 e 50 µg/mL.

Após, foi adicionado 500 µg de solução a 2% de AlCl3 em metanol em cada eppendorf, e 200 µg em duplicata foram plaqueados em placa de 96 poços. Tendo como branco 100 µL da solução extrativa com 1,9 mL de metanol. A leitura da absorbância foi realizada após 10 minutos em 425 nm. O teor de flavonoides foi determinado por interpolação da absorbância das amostras na curva analítica construída com os padrões de quercetina e expressa como µg/mL de EQ (Equivalente em Quercetina).

55

4.5.2 Isolamento e identificação da Kaempferitrina

Para isolamento do composto majoritário da B. forficata, a kaempferitrina, foi realizada uma nova coleta das folhas (1310 g) em fevereiro de 2016, e novos processos de maceração e partição líquido-líquido foram realizados como demonstrado na Figura 8. Figura 8. Fluxograma de obtenção do extrato e frações das folhas de B.

forficata para o isolamento da kaempferitrina.

Parte da fração acetato de etila e butanol (5 g) foi submetida ao procedimento de CC, tendo como fase estacionária sílica gel 60 (55 g), eluída com gradiente de CHCl3:MeOH em polaridade crescente - 90:10 (100mL), 80:20 (100 mL), 70:30 (200 mL), 50:50 (100 mL). Foram coletadas 30 subfrações de aproximadamente 20 mL cada. As frações foram reunidas conforme perfil semelhante, através de CCD, utilizando CHCl3:MeOH (70:30) como fase móvel. As placas foram reveladas por UV (254nm) e com cloreto férrico. As frações que exibiram o mesmo perfil

56

cromatográfico foram reunidas, sendo que a subfração 10 apresentou um único composto (em fase de elucidação) e a subfração 11-14 foi purificada por CC flash - CHCl3:MeOH (70:30). A partir desta subfração foi obtido o flavonoide kaempferitrina (Figura 9).

Figura 9. Fluxograma de obtenção dos compostos puros das folhas de B.

forficata.

4.5.3 Análise em Cromatografia líquida de alta eficiência – CLAE

As amostras foram diluídas em metanol a 1 mg/mL. Injeções da

amostra: 20 µL. Coluna: Phenomenex® Sinergy 4µm Hydro-RP 80A (150 x 4,60 mm) condicionada a 40°C. Fase móvel: água ultrapura, acetonitrila e metanol - sistema de gradiente de 37 minutos. Começamos com 90% de água 8% de acetonitrila e 2% de metanol. Em 10 minutos 58% água, 40% acetonitrila e 2% metanol. 20 minutos 8% água, 90% acetonitrila e 2% de metanol. 37 minutos retornou ao início.

57

4.5.4. Linearidade

Para avaliação da linearidade do método, uma solução estoque foi

preparada em balão de 50 mL e diluída com metanol para a kaempferitrina na concentração de 100 µg/mL. Esta solução foi então diluída com o mesmo solvente conforme a Tabela 1, de modo a obter soluções padrões na faixa de concentração de 5 a 100 µg/mL de kaempferitrina. Gráficos de concentração versus área foram construídos e os respectivos coeficientes de correlação (r2) e equações da reta foram obtidos pelo método dos mínimos quadrados. As análises foram realizadas em triplicata. Os critérios de aceitação foram: r2≥ 0,99, inclinação e y-intercepto com desvio padrão relativo (DPR) ≤ 20% (BRASIL, 2013).

Tabela 1. Volumes da solução padrão a 1 mg/mL de Kaempferitrina para obter as concentrações de 5-100 µg/mL, utilizando como solvente metanol.

Padrão / nível*

Solução estoque (µL)

Solvente - metanol (µL)

Concentração Kaempferitrina (µg/mL)

1 50 950 5,00

10,00 25,0 50,0 75,0

100,0

2 100 900

3 250 750

4 500 500 5 750 250

6 1000 0 * Triplicata, injetado em duplicata.

4.5.4.1 Limite de quantificação (LQ) e detecção (LD) Estes valores foram calculados a partir do desvio padrão da resposta (σ) e coeficiente angular, e obtidos através da equação da reta no ensaio de linearidade, através das equações:

sLQ

10

sLD

3,3

58

4.6 Animais

Camundongos Swiss machos, pesando entre 25-30 g e camundongos C57BL/6 fêmeas pesando 20-25g, provenientes do Biotério Central da Universidade do Vale do Itajaí (UNIVALI) foram utilizados. Os animais foram mantidos em caixas de polipropileno, em sala com controle de temperatura (25º C), umidade e ciclos controlados de claro/escuro de 12 horas cada, com ração e água ad libitum. Os animais foram eutanasiados por câmara de CO2/O2.

Os experimentos foram específicos para motilidade intestinal, mucosite intestinal e atividade antitumoral, bem como os procedimentos envolvidos (descritos abaixo).

As normas preconizadas pelo CONCEA (Conselho Nacional de Controle de Experimentação Animal) sobre os aspectos éticos da experimentação animal foram respeitadas. Os experimentos foram aprovados pelo Comitê de ética do uso de animais (CEUA) da Universidade do Vale do Itajaí, sob protocolo 08/15 (Anexo 1).

4.7 Avaliação da motilidade intestinal em camundongos Swiss

O trânsito intestinal foi avaliado de acordo com método de Reynell e

Spray (1958) com algumas modificações, conforme descrito na Figura 10.

Figura 10. Método utilizado para avaliação da motilidade intestinal em camundongos.

59

Os camundongos Swiss machos foram submetidos a jejum de 12 h, e o experimento ocorreu na manhã do dia seguinte. Os animais foram distribuídos em grupos (n= 4 a 15) de tratamento, seguindo os passos demonstrados na Figura 10. Após a eutanásia, o intestino delgado foi removido e com uma régua graduada foi mensurado o comprimento total do intestino e a distância percorrida pelo marcador. O trânsito intestinal foi determinado dividindo a distância percorrida pelo vermelho de fenol pelo comprimento total do intestino e multiplicando este valor por 100.

4.8 Indução da mucosite intestinal por irinotecano em camundongos

4.8.1 Padronização do método

Foram realizadas quatro padronizações até ser comprovada a indução

da mucosite intestinal, conforme descrito na Figura 11.

Figura 11. Métodos utilizados para obtenção da padronização da indução da mucosite intestinal.

60

Na primeira indução (método 1) foram utilizados camundongos Swiss machos (n=5), que receberam quatro injeções, primeiramente subcutâneas de Atropina 0,01 mg/kg, e depois de dois minutos, receberam por via intraperitoneal o irinotecano (CPT-11, Camptosar®, Pfizer) na dose de 75 mg/kg, ou salina (5 mL/kg), uma injeção por dia de acordo com protocolo desenvolvido por Ikuno (1995 apud LIMA JÚNIOR, 2008), e a eutanásia ocorreu no 5º dia. A diarreia nas primeiras 24h é inibida pela administração de atropina, que apresenta ação anticolinérgica, e é utilizada por alguns grupos de pesquisa (HETCH, 1998). Porém, quando foi utilizada no presente estudo, acabou influenciando de tal forma que os animais não desenvolviam a mucosite intestinal. Dessa forma, não foram observados os parâmetros para confirmar a indução, especialmente a diarreia. Na segunda indução (método 2), foram utilizados camundongos Balb/c machos (n=5), pois alguns grupos utilizam essa linhagem. Os animais receberam seis injeções, por via intraperitoneal, de irinotecano (CPT-11, Camptosar®, Pfizer) na dose de 75 mg/kg, ou salina (5 mL/kg), uma vez por dia de acordo com protocolo desenvolvido por Ikuno (1995 apud LIMA JÚNIOR, 2008), e a eutanásia foi realizada no 7º dia, mas os animais não desenvolveram diarreia e mucosite intestinal.

Na terceira indução (método 3), foram utilizados camundongos Swiss machos (n=5), que receberam sete injeções, por via intraperitoneal, de irinotecano (CPT-11, Camptosar®, Pfizer) na dose de 75 mg/kg, ou salina (5 mL/kg), uma injeção por dia de acordo com protocolo desenvolvido por Ikuno (1995 apud LIMA JÚNIOR, 2008), e a eutanásia foi realizada no 9º dia. Porém a partir do 5º dia os animais começaram a apresentar os sintomas de indução de mucosite intestinal, mas alguns animais morreram antes do término do experimento.

Dessa forma, optou-se por utilizar duas dosagens na quarta indução (método 4), para avaliar qual teria melhor efeito. Foram utilizados camundongos Swiss machos (n=5), que receberam quatro injeções, por via intraperitoneal, de irinotecano (CPT-11, Camptosar®, Pfizer) na dose de 75 mg/kg e outro grupo na dose de 60 mg/kg, ou salina (5 mL/kg), uma injeção por dia de acordo com protocolo desenvolvido por Ikuno (1995 apud LIMA JÚNIOR, 2008), e a eutanásia foi realizada no 8º dia.

61

Os animais do grupo de 60 mg/kg não desenvolveram a mucosite intestinal, porém os que receberam de 75 mg/kg apresentaram os sintomas, sendo então, definida a metodologia de indução da mucosite intestinal.

4.8.2 Avaliação dos efeitos das frações na mucosite intestinal induzida por

irinotecano

Os animais foram distribuídos em cinco grupos (n= 6 a 11) e a metodologia

que foi utilizada encontra-se descrita na Figura 12.

Figura 12. Método utilizado no pré-tratamento e indução de mucosite intestinal.

O pré-tratamento ocorreu nos primeiros sete dias, com administração por gavagem das frações ou água, uma vez ao dia, pela manhã. Do 8º ao 11º dia, os animais continuaram recebendo via oral as frações, o veículo recebeu água, e o Lop recebeu loperamida 10 mg/kg. No período da tarde, os animais receberam via intraperitoneal irinotecano na dose de 75 mg/kg de peso. Do 12º ao 13º dia os animais continuaram recebendo apenas por via oral as frações ou água, e no 14º dia foi realizada a eutanásia em câmara de CO2/O2.

62

4.9 Parâmetros avaliados na mucosite intestinal 4.9.1 Ganho de peso e peso dos órgãos

Ao longo dos 14 dias de experimento, foi registrado diariamente o peso dos animais, no mesmo horário, para posterior avaliação entre os grupos. No último dia, após a realização da eutanásia, os órgãos foram retirados, limpos em salina gelada e pesados. Após isso, fragmentos do cólon e duodeno foram retirados para análise histológica e histoquímica, e o restante foi congelado a -80º C para posteriores análises. As carcaças dos animais foram acondicionadas em sacos plásticos adequados para descarte de material biológico e incineradas, conforme normas da UNIVALI. Foi calculado o peso relativo de cada órgão pela fórmula: peso relativo = (peso do órgão/peso do animal vivo/100). Foi retirado um fragmento de aproximadamente 1 cm do duodeno e cólon dos animais, os quais foram acondicionados (com identificação do animal e grupo) lado a lado em papel toalha em uma forma de alumínio. Em seguida, foram colocados por aproximadamente 1-2 horas na estufa a 37º C, até que os fragmentos estivessem secos/desidratados. Foi realizada a comparação do peso úmido dos fragmentos (logo após serem retirados dos animais) em relação ao peso seco, como indicativo de edema. 4.9.2 Avaliação do grau da diarreia apresentada

Aos eventos de diarreia foram atribuídos escores no último dia de experimento, no momento anterior à eutanásia, segundo proposta de Kurita et al. (2000), como discutido a seguir: 0=fezes com aspecto normal; 1=fezes levemente alteradas, pouco umedecidas; 2=fezes úmidas com pouca sujidade perianal; 3=fezes úmidas com bastante sujidade perianal. Esse parâmetro é um indicativo de indução da mucosite, tendo em vista a associação do sinal diarreia à mucosite, observada na prática clínica.

63

4.9.3 Análise histológica

Após o experimento de mucosite intestinal, 3 a 4 fragmentos do duodeno foram fixados em solução de ALFAC (álcool 85 %, formol 5 % e ácido acético 5 %), onde ficaram imersos por 24 h e após este período, foram imersos em uma solução de álcool 70 %. Posteriormente, os órgãos foram desidratados em uma série crescente de álcool, diafanizados em xilol, emblocados em parafina e cortados (5 µm de espessura) em micrótomo de maneira semi-seriada. As lâminas foram obtidas segundo esse processo e submetidas à coloração por hematoxilina-eosina para análises morfológicas em microscopia óptica. 4.9.4 Análise histoquímica

Esta análise foi realizada para avaliação da integridade da camada de muco secretado e das células caliciformes no duodeno, segundo Umegaki et al. (2010). Os fragmentos (3 a 4) foram preparados como descritos anteriormente. Uma parte dos blocos de parafina contendo os segmentos teciduais foram seccionados em micrótomo com espessura de 5 µm e uma parte dos cortes histológicos foram corados pela técnica de ácido periódico de Schiff (PAS) para análise da quantidade de muco aderido. Outra parte das lâminas foram submetidas à coloração por Alcian Blue (pH 2,5) para análise da depleção de células caliciformes, segundo protocolo de Myers et al. (2008).

4.9.5 Ensaio da atividade de mieloperoxidase (MPO) no duodeno e cólon

A atividade de mieloperoxidase foi realizada conforme descrito por Bradley et al. (1982), e modificado por Young et al. (1989). Uma porção do duodeno e do cólon, foram coletadas e incubadas em solução de HTAB 0,5% (Brometo de hexadeciltrimetilamonio), na proporção de 50 mg de tecido por mL, e homogeneizada e centrifugada (1500 g/15 min a 4 °C). O precipitado obtido a partir do homogenato foi ressuspendido com 1 mL de tampão fosfato de potássio 0,08 M na presença de 0,5% de hexadeciltrimetilamônio (HTAB). Após agitação em vórtex as amostras foram centrifugadas a 11000 g por 20 minutos a 4 °C. Em placas de 96 poços foram adicionados em duplicatas 30 µL do sobrenadante de cada amostra acrescido de 220 µL de uma solução

64

Mix (100 µL de tampão fosfato 0,08 M, 85 µL de tampão fosfato 0,22 M e 15 µL de H2O2 0,017%).

Posteriormente, a reação foi iniciada com 20 µL de tetrametilbenzidina (TMB - substrato enzimático que resulta em produto colorido), e incubada por 3 minutos a 37 °C. Ao término do tempo reacional, 30 µL de acetato de sódio 1,46 M pH = 3,0 foram adicionados em cada amostra para interromper a reação e, a absorbância foi mensurada em espectrofotômetro a 620 nm. Os resultados foram expressos como unidade de densidade óptica (mD.O /mg de proteína/ 3 minutos).

4.9.6 Dosagem de TNF-α nos tecidos de duodeno e cólon dos animais

Os níveis de TNF-α foram analisados a partir do tecido do duodeno e cólon retirado no dia da eutanásia dos animais, no 14º dia. Para este ensaio, o tecido foi homogeneizado em tampão de fosfato de potássio 200 mM (pH 6,5) e este homogenato foi utilizado para estimar os níveis de TNF de acordo com as instruções do fabricante, utilizando o kit de ELISA da BD Biosciences (Franklin Lakes, NJ, EUA). A absorbância foi medida a 450 e 550 nm e os resultados foram expressos como pg/mL. 4.9.7 Ensaio de Glutationa reduzida (GSH) no duodeno e cólon dos animais

Os níveis de GSH no duodeno e no cólon foram determinados através do método de Sedlak e Lindsay (1968). Em tubos de microcentrífuga foram adicionados 50 µL do homogenato e 40 µL de ácido tricloroacético (ATC) 12%, os tubos foram agitados em vórtex e centrifugados por 15 minutos a 4.000 rpm 4 °C.

Em placa de 96 poços foram acrescidos 10 µL do sobrenadante, 290 µL de tampão TRIS 0,4M (pH 8,9) e 5 µL de solução 3,96 mg/mL de DTNB (5,5’-ditiobis 2-ácido nitrobenzoico) em metanol. Após 15 minutos realizou-se a leitura espectrofotométrica em 420 nm. Os valores individuais foram interpolados numa curva padrão de GSH (0,41 – 3,33 µg) e expressos em µg GSH/g tecido.

65

4.9.8 Avaliação de comportamento exploratório por Teste Campo Aberto em

camundongos com mucosite intestinal

Os animais dos grupos naive, veículo e FAEB-FB foram submetidos ao teste de campo aberto no dia anterior à eutanásia, após período de pré tratamento e indução da mucosite intestinal (13º dia). Os animais foram colocados em uma arena redonda transparente de plástico, com 60 cm de diâmetro e 50 cm de altura, com o piso dividido em 12 quadrantes, com linhas que se cruzam desenhado na superfície, por seis minutos cada um. O número de quadrados atravessados com todas as patas (“cruzamentos”) e quantas vezes levantavam o dorso e as patas da frente (“rearing”), foram contadas numa sessão de seis minutos (QUINTÃO et al., 2005). 4.9.9 Avaliação da translocação bacteriana baço e fígado

O baço e o fígado dos animais foram coletados de maneira asséptica (ambiente foi limpo com álcool, a equipe utilizou luvas, jalecos, máscaras e materiais autoclavados), e um fragmento dos mesmos foi colocado em placas de 24 poços com PBS estéril. Os fragmentos destinados ao exame microbiológico sofreram processo de homogeneização e foram semeados em meio de cultura Agar McConkey para detecção de bactérias Gram-negativos e, Agar-sangue para bactérias Gram-positivos. As amostras foram incubadas a 37º C e examinadas após 24, 48 horas e 7 dias (ALENCAR et al., 2002).

4.10 Avaliação antitumoral e de citotoxicidade 4.10.1 Cultura das células de melanoma

As células de melanoma murino (B16F10) foram adquiridas do Banco de Células do Rio de Janeiro (BCRJ). Estas foram cultivadas em meio Dulbecco’s Modified Eagle’s Medium (DMEM) suplementado com 10 % de Soro bovino fetal (SBF) cultivadas em 5% CO2 com humidade atmosférica de 37º C, em garrafa de 75 cm2 com uma concentração celular de 1x104 até que se formasse uma monocamada (confluência), o que ocorreu em um período de 48 h. Após confluência, as células foram tripsinizadas e levadas para centrifugação onde foi obtida uma concentração de 2x105 após contagem em câmara de Newbauer.

66

4.10.2 Avaliação antitumoral em modelo de tumor no flanco in vivo

O melanoma foi induzido em camundongos C57BL/6 fêmeas (n=6), por meio de administração subcutânea de células de melanoma B16F10 na quantidade de 2×105 no flanco direito dos animais, adaptado de Arifa et al. (2016), conforme apresentado na Figura 13.

Figura 13. Fluxograma da metodologia utilizada para induzir o melanoma nos animais.

Após 15 dias, os animais apresentavam o tumor evidente e estes

foram divididos em quatro grupos. Ao longo dos dias de tratamento, os volumes dos tumores foram mensurados 1x ao dia (largura x altura) com o auxílio de paquímetro digital (mm) e no sétimo dia, foi realizada a eutanásia dos animais. Os tumores foram coletados, medidos com paquímetro digital (largura x altura x profundidade), e pesados para posterior análise entre os grupos.

67

4.10.3 Avaliação de viabilidade celular e citotoxicidade - MTT (metil-tiazolil

tetrazolium)

Os efeitos da FAEB-BF e da kaempferitrina na viabilidade celular e citotoxicidade foram avaliados, assim como do irinotecano, e da FAEB-BF na presença do irinotecano. Células epiteliais de intestino delgado (IEC-6) foram adquiridas do Banco de Células do Rio de Janeiro (BCRJ).

As células IEC-6 foram cultivadas em meio Dulbecco’s Modified Eagle’s Medium (DMEM) suplementado com 10 % de Soro bovino fetal (SBF) e 10 µg/mL de insulina humana. As células foram cultivadas em 5%CO2 com humidade atmosférica de 37º C por 24 horas.

Em seguida, foram plaqueadas em placas de 96 poços, (1x105) em triplicata, nas concentrações de 1, 3, 10 e 30 µg/mL. Metil-tiazolil tetrazolium (MTT) (0,5 mg/mL) foi adicionado nas células, as culturas foram incubadas por 3 horas a 37º C, e a absorbância foi analisada em 570 nm depois da solubilização de cristais de formazan reduzidos com dimetilsulfóxido (DMSO) puro. A porcentagem de viabilidade celular foi calculada na proporção: Abs. Amostra – Abs. Branco/ Abs. Veículo x 100. 4.11 Análise estatística

A análise estatística, foi realizada com o software GraphPad Prism®, versão 5.0, empregando para dados paramétricos, o teste de análise de variância (ANOVA) de uma ou duas vias, quando aplicável. Seguidas pelo pós-teste de Bonferroni. Também foi utilizado Teste t não pareado, quando aplicável.

Para análise de dados não-paramétricos, utilizou-se o teste de Kruskal-Wallis seguido pelo teste de Dunn, baseando-se na continuidade das variáveis em análise. Os resultados foram expressos como média ± E.P.M (variáveis com distribuição normal), sendo as diferenças consideradas estatisticamente significativas quando p<0,05.

69

5 RESULTADOS

5.1 Análise fitoquímica preliminar Considerando o interesse nas frações contendo flavonoides, as

frações acetato de etila e butanol foram analisadas por CCD, eluídas com gradiente CHCl3/MeOH (80:20) e reveladas com cloreto férrico, reativo específico para flavonoides (UGAZ, 1994). Como esperado, tais substâncias foram detectadas nas frações acetato de etila das duas espécies, e também na fração butanol da B. forficata, justificando a união das duas frações (ambas com perfis similares) para a realização dos testes farmacológicos.

Utilizando os flavonoides kaempferitrina (Figura 14 - 1) como padrão da B. forficata (SILVA et al., 2000; CECHINEL FILHO, 2009) e a miricitrina (Figura 14 - 2) como padrão da C. reitiziana (Resultados não publicados obtidos no NIQFAR pela aluna de Pós-doutorado Elisa Brasili), a presença destas substâncias foram confirmadas por CCD.

Figura 14. Estrutura molecular dos flavonoides kaempferitrina (1) e miricitrina (2).

(1)

70

(2)

5.2 Análise fitoquímica da Bauhinia forficata

Visando verificar a presença da kaempferitrina nas diferentes épocas

(sazonalidade) de coleta bem como os rendimentos dos extratos, além de comparar os perfis cromatográficos de uma planta de dez anos de idade, com a qual foi realizada a análise sazonal e farmacologia, em relação à uma planta de um ano, foram obtidos extratos metanólicos da planta de dez anos coletada no inverno, verão, outono e primavera, e da de um ano, no inverno.

Os resultados indicados na Tabela 2 indicam que os rendimentos de extrato (massa seca) da análise sazonal variaram de 4,36 a 5,02 %, não representando variação tão significativa, embora a coleta no verão tenha indicado maior rendimento.

71

Tabela 2. Rendimentos em gramas e percentuais dos EMB da B. forficata, folhas frescas.

Coleta Folhas frescas (g)

Extrato metanólico (g)

Rendimento (%)

1ª coleta – outono (06/04/15)

115,450 5,500 4,76

2ª coleta – inverno (15/09/15)

09,328 0,450 4,82

3ª coleta – primavera (08/12/15)

11,240 0,490 4,36

4ª coleta - verão (18/02/16)

23,500 1,180 5,02

Coleta planta com um ano - inverno

(15/09/15)

04,750 0,074 1,56

A Figura 15 demonstra os perfis por CLAE dos extratos metanólicos

das folhas de B. forficata, sendo A = kaemperitrina (Tr, 12 min), B = EM de B. forficata coleta verão, C = EM de B. forficata coleta primavera, D = EM de B. forficata coleta inverno e E = EM de B. forficata coleta outono.

Como pode ser verificada (Figura 15), a kaempferitrina está presente em maior quantidade nas coletas de verão e primavera. Cabe destacar que apareceram dois picos adicionais, além da kaempferitrina com Tr de 12 minutos (Tr 11 min e Tr 11,5 min), característicos de flavonoides cujas estruturas não foram elucidadas até o presente em função da necessidade de purificação, não sendo o foco do estudo.

72

Figura 15. Análise sazonal por CLAE das amostras de B. forficata.

Verde/A - Kaempferitrina (padrão); Roxo/B-Verão; Rosa/C-Primavera; Azul/D-Inverno; Preto/E-outono.

Folhas novas (idade aproximada de um ano) também foram obtidas, coletadas em setembro/2015, somente a título de comparação para projetos futuros visando a otimização de princípios ativos, gerando rendimento de apenas 1,56% de massa, sendo 3 a 4 vezes menor que o rendimento das coletas realizada na árvore mais velha. Ressalta-se que existe uma discrepância de rendimentos, sugerindo-se, portanto, utilização de folhas de B. forficata com idade mais avançada, capazes de produzir maior quantidade de substâncias de interesse. Isso demonstra a importância da idade da planta na produção de metabólitos secundários, conforme já apregoado por Gobbo-Neto e Lopes, 2007.

Os resultados observados de forma qualitativa por CLAE (Figura 16) em relação à mesma época de coleta, das plantas de diferentes idades, confirmam que ambas possuem a kaempferitrina em sua composição.

Como a C. reitiziana foi utilizada no modelo experimental, mas não apresentou resultados promissores, não foi estudada em maiores detalhes fitoquimicamente.

0.0 5.0 10.0 15.0 20.0 25.0 30.0 35.0 min

0.1

0.2

0.3

0.4

0.5

0.6

0.7

0.8

0.9

1.0

1.1

uV(x1,000,000)

A

B

C D

E

73

Figura 16. Análise por CLAE de árvores de B. forficata de diferentes idades.

Preto/A-Kaempferitrina (padrão); Azu/B- Planta com um ano de idade; Vermelho/C-Planta com 10 anos de idade.

Conforme demonstrado na Tabela 3, foi confirmada a presença de flavonoides e fenóis totais na FAEB-BF.

Tabela 3. Valores de fenóis totais e flavonoides presentes na FAEB-BF.

FAEB-BF E.A.T. ± E.P.M. E.Q. ± E.P.M.

200 µg/mL 249,10 ± 2,96 5,08 ± 0,0

150 µg/mL 199,00 ± 3,68 3,13 ± 0,72

100 µg/mL 154,00 ± 2,24 2,38 ± 0,24

50 µg/mL 84,33 ± 0,04 2,30 ± 0,86

Na Tabela 3 estão dados da análise de fenóis e flavonoides totais da FAEB-BF. Os resultados estão expressos em médias ± E.P.M. (n = 3) de equivalentes de ácido tânico (E.A.T.) em µg/mL ou equivalentes de quercetina em µg/mL (E.Q.).

A B C

74

5.3 Linearidade, LQ e LD As curvas de calibração da kaempferitrina foram obtidas em

metanol e concentração de 5 a 100 µg/mL (Figura 17). A equação da reta foi calculada y = 22716x-23992, com coeficientes de correlação (R2) de 0,9953. Estes resultados indicaram a linearidade do método na faixa de concentração testada.

Figura 17. Curva de calibração da kaempferitrina obtida por CLAE em metanol na faixa de concentração de 5 a 100 µg/mL.

O desvio padrão dos interceptos e a inclinação média das curvas foram de 22741,54 e 21076,73 respectivamente. Os valores calculados de LD e LQ para o método de quantificação da Kaempferitrina neste meio foram de 3,56 µg/mL e 10,78 µg/mL, respectivamente.

5.3.1 Quantificação da Kaempferitrina

Após realização da linearidade, foi realizada a quantificação do flavonoide majoritário isolado, kaempferitrina, nos extratos das quatro coletas realizadas, bem como da fração (FAEB-BF), para quantificação de acordo com a sazonalidade (Tabela 4).

75

Observa-se que a presença de kaempferitrina foi mais pronunciada na coleta de fevereiro (verão), seguida pela realizada em dezembro (primavera).

Os resultados permitem inferir que, em que pese o rendimento geral da planta velha ser bem mais pronunciado do que a planta nova, existe uma diferença muito considerável da planta mais jovem em relação à planta mais antiga na produção de kaempferitrina (Tabela 4), sugerindo que esta variável deve ser considerada numa possível preparação de material vegetal a base de kaempferitrina (extrato ou outra formulação) com potencial terapêutico.

Ressalta-se ainda, que apesar das diferenças na concentração de kaempferitrina dependendo da época de coleta, em todas elas há a produção desse flavonoide.

Tabela 4. Quantificação de kaempferitrina nos extratos e fração das folhas de B. forficata.

Amostra Concentração de

Kaempferitrina

1ª coleta – outono (06/04/15) 8,48 µg/mL

2ª coleta – inverno (15/09/15) 16,76 µg/mL

3ª coleta – primavera (08/12/15) 47,18 µg/mL

4ª coleta – verão (18/02/16) 61,39 µg/mL

FAEB-BF (proveniente da 1ª coleta) 40,23 µg/mL

Coleta planta com um ano – inverno (15/09/15)

37,37 µg/mL

76

5.4 Avaliação farmacológica das frações 5.4.1 Avaliação da motilidade intestinal Visto que a diarreia é um dos principais sinais relacionados à mucosite intestinal, foi realizada em forma de triagem, a avaliação da motilidade intestinal das frações das espécies estudadas, em três diferentes doses (30, 100 ou 300 mg/kg), para verificar se a fração acetato de etila e butanol de B. forficata (FAEB-BF) e a fração de acetato de etila de C. reitziana (FAE-CR) não alterariam esse parâmetro, visto que se aumentassem essa manifestação clínica, não seriam interessantes para o modelo estudado.

Observou-se que (Figura 18) a FAEB-BF reduziu significativamente o trânsito intestinal dos animais em 25,57 % (33,97±1,51 %) na dose de 100 mg/kg e 27,11 % (33,27±2,69 %) na dose de 300 mg/kg, em relação ao naive (45,64±2,35 %), assim como o controle positivo (loperamida). Diante disso, foi escolhida a menor dose efetiva, de 100 mg/kg para dar continuidade no modelo de mucosite intestinal.

Figura 18. Avaliação do efeito da FAEB-BF na motilidade intestinal de camundongos normais.

Naive Lop 30 mg/kg 100 mg/kg 300 mg/kg0

20

40

60

*** *

FAEB-BF (v.o.)

Trâ

nsi

to I

nte

stin

al (

%)

Os animais foram tratados por via oral com naive (água/ 1% tween), loperamida (Lop: 10 mg/kg) e Fração acetato de etila e butanol de B. forficata (FAEB-BF) nas doses de 30, 100 e 300 mg/kg. Resultados são apresentados como média ± E.P.M. Análise estatística foi realizada utilizando ANOVA de uma via, seguida por teste de Bonferroni. * p<0,05, ** p<0,01 vs. grupo naive (animal não exposto ao irinotecano) e grupo Lop.

77

As diferentes doses de FAE-CR, também foram testadas (Figura 19), porém, somente a dose de 100 mg/kg apresentou redução significativa da motilidade intestinal, em 53,8 % (25,60±5,24 %) quando comparada ao naive (33,40±5,17 %) e devido a isso, foi escolhida para as demais análises.

Figura 19. Avaliação do efeito da FAE-CR na motilidade intestinal de camundongos normais.

Naive Lop 30 mg/kg 100 mg/kg 300 mg/kg0

20

40

60

80

*

FAE-CR (v.o.)

*

Trâ

nsi

to In

test

inal

(%

)

Os animais foram tratados por via oral com naive (água/ 1% tween), loperamida (Lop: 10 mg/kg) e Fração acetato de etila de C. reitziana (FAE-CR) nas doses de 30, 100 ou 300 mg/kg. Resultados são apresentados como média ± E.P.M. Análise estatística foi realizada utilizando ANOVA de uma via, seguida por teste de Bonferroni. * p<0,05 vs. grupo naive, animal não exposto ao irinotecano.

5.4.2 Avaliação dos efeitos das frações ricas em flavonoides na mucosite

intestinal

Observa-se na Figura 20, a perda de peso dos animais durante os

14 dias do experimento, em relação ao peso seu inicial. Os grupos FAEB-BF e FAE-CR começaram a diferir do veículo a partir do 11º dia de experimento, e apresentaram, no último dia, perda de peso menor, cerca de -13,08 % e -15,55 %, em relação aos animais do grupo veículo, que apresentaram -19,58%. É possível observar que os animais que receberam loperamida, utilizado na prática clínica para tratar os sintomas da mucosite intestinal, tiveram uma perda de peso maior do que o veículo, cerca de -22,65 % no último dia. Apesar de existir essa diferença de perda

78

de peso nos animais, não houve diferença significativa entre os grupos, porém, as frações atenuaram a perda de peso em 6,5 % (FAEB-BF) e 4,03 % (FAE-CR).

Figura 20. Avaliação do efeito das frações FAEB-BF (A) e FAE-CR (B) na variação da massa corporal dos animais durante os 14 dias de experimento.

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14-30

-20

-10

0

10

20

NaiveVeículoFAEB-BF

###

###

###

## ###

###

###

Tempo (dias)

Var

iaçã

o d

a m

assa

corp

ora

l (%

)

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14-30

-20

-10

0

10

20

NaiveVeículoFAE-CR

##

###

###

###

###

###

###

###

Tempo (dias)

Var

iaçã

o d

a m

assa

corp

ora

l (%

)

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14-30

-20

-10

0

10

20

NaiveVeículoLop

###

###

###

###

###

###

###

###

Tempo (dias)

Var

iaçã

o d

a m

assa

corp

ora

l (%

)

A B

C

Animais foram pré-tratados 7 dias naive (água/ 1% tween), veículo (água/ 1 % tween) e FAEB-BF (A) (100 mg/kg v.o.), ou FAE-CR (B) (100 mg/kg v.o.), ou Lop (C) (loperamida 10 mg/kg v.o.) do 8º ao 11º dia receberam o tratamento e os grupos veículo, FAEB-BF, FAE-CR e Lop receberam irinotecano (75 mg/kg, i.p.). O tratamento via oral continuou até o 13º dia. Resultados são apresentados como média ± E.P.M. Análise estatística foi realizada utilizando ANOVA, seguido por teste Bonferroni de duas vias. ## p<0,01, ### p<0,001 vs. grupo naive, animal não exposto ao irinotecano.

79

Em relação ao grau de diarreia apresentado (Figura 21), o grupo veículo apresentou maior grau de diarreia, diferindo estatisticamente do grupo naive, que não apresentou diarreia. O grupo FAEB-BF diferiu do veículo, com uma gravidade menor de diarreia. Figura 21. Avaliação do efeito das frações FAEB-BF e FAE-CR no grau de diarreia dos animais, no último dia do experimento.

Naive Vei FAEB-BF Lop FAE-CR0

1

2

3

4

5

###

*

### ##

Os animais foram tratados com veículo (Vei: água/ 1% tween v.o., irinotecano 75 mg/kg, i.p.), Fração acetato de etila e butanol de B. forficata (FAEB-BF: 100 mg/kg, v.o., irinotecano 75 mg/kg, i.p.), loperamida (Lop: 10 mg/kg, v. o., Irinotecano 75 mg/kg, i.p.), Fração acetato de etila de C. reitziana (FAE-CR: 100 mg/kg, v.o., irinotecano 75 mg/kg, i.p.). Resultados são apresentados como média ± E.P.M. Análise estatística foi realizada utilizando Krustal-Wallis, seguido por Dunns. ## p<0,01 e ### p<0,001 vs. grupo naive (animal não exposto ao irinotecano), * p<0,05 vs. grupo Vei (animal exposto ao irinotecano) e grupo Lop.

Os três grupos experimentais tratados, FAEB-BF (0,2594±0,02 g), FAE-

CR (0,2319±0,4 g) e loperamida (0,1861±0,4 g), tiveram redução significativa de 70,31 %, 73,46 % e 78,7 %, respectivamente, no peso do baço (Figura 22), assim como o veículo que reduziu 76,33 % (0,2068±0,03), em relação ao naive (0,8736±0,20).

80

Figura 22. Efeito das frações FAEB-BF (A) e FAE-CR (B) no peso relativo do baço dos animais com mucosite intestinal induzida por irinotecano.

Naive Vei FAEB-BF0.0

0.5

1.0

1.5

** **

Irinotecano (75 mg/kg, i.p)

Pes

o d

o b

aço

(g

/100

g)

Naive Vei FAE-CR0.0

0.5

1.0

1.5

* *


Pes

o d

o b

aço

(g/

100g

)

Naive Vei Lop0.0

0.5

1.0

1.5

* *


Pes

o d

o b

aço

(g

/100

g)

A B

C

No painel A, animais foram tratados com naive (água/ 1% tween v.o.), veículo (Vei: irinotecano 75 mg/kg, i.p.) e Fração acetato de etila e butanol de B. forficata

(FAEB-BF: 100 mg/kg, v.o., irinotecano 75 mg/kg, i.p.). No painel B, animais foram tratados com naive (água/ 1% tween v.o.), veículo (Vei: irinotecano 75 mg/kg, i.p.) e Fração acetato de etila de C. reitziana (FAE-CR: 100 mg/kg, v.o., irinotecano 75 mg/kg, i.p.).No painel C, animais foram tratados com naive ( água/ 1% tween v.o.), veículo (Vei: irinotecano 75 mg/kg, i.p.) e loperamida (Lop: 10 mg/kg, v.o., irinotecano 75 mg/kg, i.p.). Resultados são apresentados como média ± E.P.M. Análise estatística foi realizada utilizando ANOVA de uma via, seguida por teste de Bonferroni. * p<0,05 e ** p<0,01 vs. grupo naive, animal não exposto ao irinotecano.

81

Em relação ao peso relativo do fígado (Figura 23), no último dia de experimento, observa-se que apenas o veículo (4,41±0,49 g) e o loperamida (4,21±0,42 g) apresentaram uma redução significativa em relação ao naive (5,91±0,28 g), com percentuais de redução de 25,39 % e 28,11 %, respectivamente.

Figura 23. Efeito das frações FAEB-BF (A) e FAE-CR (B) no peso relativo do fígado dos animais com mucosite intestinal induzida por irinotecano.

Naive Vei FAEB-BF0

2

4

6

8

*

A


Pes

o d

o fí

gado

(g

/100

g)

Naive Vei FAE-CR0

2

4

6

8

*

B


Pes

o d

o fí

gad

o (

g/1

00g

))

Naive Vei Lop0

2

4

6

8

**

C


Pes

o d

o f

ígad

o (

g/1

00g

)

No painel A, animais foram tratados com naive (água/ 1% tween v.o.), veículo (Vei: irinotecano 75 mg/kg, i.p.) e Fração acetato de etila e butanol de B. forficata

(FAEB-BF: 100 mg/kg, v.o., irinotecano 75 mg/kg, i.p.). No painel B, animais foram tratados com naive (água/ 1% tween v.o.), veículo (Vei: irinotecano 75 mg/kg, i.p.) e Fração acetato de etila de C. reitziana (FAE-CR: 100 mg/kg, v.o., irinotecano 75 mg/kg, i.p.).No painel C, animais foram tratados com naive (água/ 1% tween v.o.), veículo (Vei: irinotecano 75 mg/kg, i.p.) e loperamida (Lop: 10 mg/kg, v.o., irinotecano 75 mg/kg, i.p.). Resultados são apresentados como média ± E.P.M. Análise estatística foi realizada utilizando ANOVA de uma via, seguida por teste de Bonferroni. * p<0,05 vs. grupo naive, animal não exposto ao irinotecano.

82

Na Figura 24, estão demonstrados os valores do peso do duodeno seco, nos três grupos experimentais, no qual, os animais do grupo veículo apresentaram redução em relação ao FAEB-BF e naive. Já em relação ao cólon (Figura 25), não foi observada diferença estatística significativa para este parâmetro.

Figura 24. Efeito da fração FAEB-BF no peso do duodeno seco dos animais com mucosite intestinal induzida por irinotecano.


0.5

1.0

1.5

**

#


Pes

o d

uo

den

o s

eco

(g

/100

)

Animais foram tratados com naive (água/ 1% tween v.o.), veículo (Vei: irinotecano 75 mg/kg, i.p.) e Fração acetato de etila e butanol de B. forficata (FAEB-BF: 100 mg/kg, v.o., irinotecano 75 mg/kg, i.p.). Resultados são apresentados como média ± E.P.M. Análise estatística foi realizada utilizando ANOVA de uma via, seguida por teste de Bonferroni. ** p<0,01 vs. grupo naive (animal não exposto ao irinotecano) e # p<0,05 vs. Vei, animal exposto ao irinotecano.

83

Figura 25. Efeito da fração FAEB-BF no peso do cólon seco dos animais com mucosite intestinal induzida por irinotecano.


0.5

1.0

1.5


Pes

o c

ólo

n s

eco

(g

/100

)

Animais foram tratados com naive (água/ 1% tween v.o.), veículo (Vei: irinotecano 75 mg/kg, i.p.) e Fração acetato de etila e butanol de B. forficata

(FAEB-BF: 100 mg/kg, v.o., irinotecano 75 mg/kg, i.p.). Resultados são apresentados como média ± E.P.M. Análise estatística foi realizada utilizando ANOVA de uma via, seguida por teste de Bonferroni.

Na Figura 26, estão descritos os dados da avaliação do peso úmido

menos o peso seco em relação ao intestino. No duodeno, observa-se que o veículo (0,0886±0,015) apresentou valores maiores em relação ao naive (0,0536±0,006), com aumento de 65,29 %, e o FAEB-BF (0,0559±0,004) demonstrou valores menores em relação ao veículo, com redução de 36,90 %.

84

Figura 26. Avaliação do efeito da FAEB-BF no peso úmido – seco do duodeno (A) e cólon (B) dos animais com mucosite intestinal induzida por irinotecano.

No painel A estão os dados de edema de duodeno; no painel B os dados de edema de cólon. Animais foram tratados com naive (água/ 1% tween v.o.), veículo (Vei: irinotecano 75 mg/kg, i.p.) e Fração acetato de etila e butanol de B.

forficata (FAEB-BF: 100 mg/kg, v.o., irinotecano 75 mg/kg, i.p.). Resultados são apresentados como média ± E.P.M. Análise estatística foi realizada utilizando ANOVA de uma via, seguida por teste de Bonferroni. # p<0,05 vs. grupo naive

(animal não exposto ao irinotecano), * p<0,05 vs. grupo Vei, animal exposto ao irinotecano.

O dano na mucosa duodenal também foi evidenciado

histologicamente através de mudanças significativas na arquitetura das túnicas duodenais após a indução de mucosite por administração de irinotecano nos animais tratados apenas com veículo, com áreas intensamente erosivas (Figura 27-B). Através das técnicas histoquímicas de PAS (Figura 27-B) e Alcian Blue (pH=2,5, Figura 29-B), as alterações morfológicas induzidas por irinotecano na mucosa duodenal também foram associadas à intensa depleção das células caliciformes (as quais se evidenciam em azul na técnica de Alcian Blue) e pela descontinuidade na camada de muco que recobre o epitélio intestinal (a qual cora-se em rosa na técnica de PAS) em animais tratados com veículo (Figura 28-B).


0.05

0.10

0.15

#

*


A

Pes

o d

uo

den

oú

mid

o-

du

od

eno

sec

o (

g)


0.02

0.04

0.06

0.08


B

Pes

o c

ólo

nú

mid

o -

có

lon

sec

o (

g)

85

Por outro lado, a análise qualitativa das lâminas histológicas demonstrou que o tratamento com a FAEB-BF preservou parcialmente a arquitetura da mucosa, em especial os vilos (Figura 27-D), também preservou as células caliciformes (figura 29-D) e a camada de muco aderido à mucosa. Contudo, uma análise quantitativa dos efeitos protetores nos parâmetros histológicos e histoquímicos ainda necessita ser realizada para melhor evidenciar os efeitos promovidos pela FAEB-BF na mucosite intestinal induzida por irinotecano.

Figura 27. Imagens representativas do efeito dos diferentes tratamentos nos danos histológicos induzidos por irinotecano no duodeno de camundongos.

Secções histológicas coradas pela técnica de H&E de duodeno de camundongos saudáveis (painel A) ou com mucosite induzida por irinotecano e tratados com veículo (água/ 1 % tween v.o., painel B); loperamida (10 mg/kg, v.o., painel C); FAEB-BF (100 mg/kg, v.o., painel D).

86

Figura 28. Imagens representativas do efeito dos diferentes tratamentos na integridade da camada de muco (corado pelo ácido periódico de Schiff - PAS).

Secções histológicas coradas pela técnica de PAS de duodeno de camundongos saudáveis (painel A) ou com mucosite induzida por irinotecano e tratados com veículo (água/ 1 % tween v.o., painel B); loperamida (10 mg/kg, v.o., painel C); FAEB-BF (100 mg/kg, v.o., painel D).

87

Figura 29. Imagens representativas do efeito dos diferentes tratamentos na integridade das células caliciformes (corados pela técnica de Alcian Blue, pH 2,5).

Secções histológicas coradas pela técnica de Alcian Blue de duodeno de camundongos saudáveis (painel A) ou com mucosite induzida por irinotecano e tratados com veículo (água/ 1 % tween v.o., painel B); loperamida (10 mg/kg, v.o., painel C); FAEB-BF (100 mg/kg, v.o., painel D).

88

Observam-se na Figura 30 os valores de glutationa reduzida no tecido duodeno e cólon. Os animais do grupo FAEB-BF (A: 276,6±56,35; B: 158,5±28,16) apresentaram valores mais altos que o veículo tanto no duodeno (111±23,80), com aumento de 149,19 % como no cólon (46,6±4,73), com aumento de 243,03 %. O grupo veículo apresentou valores menores em relação ao grupo naive (166,4±44,21) no cólon. Os animais que receberam a B. forficata tiveram valores iguais aos animais saudáveis no cólon, do grupo naive.

Figura 30. Avaliação do efeito da FAEB-BF na Glutationa reduzida (GSH) nos tecidos do duodeno (A) e cólon (B) dos animais com mucosite intestinal induzida por irinotecano.

Naive Vei FAEB-BF0

100

200

300

400

**


A

GS

H n

o d

uo

den

o (

g/g

tec

ido

)

Naive Vei FAEB-BF0

50

100

150

200

250

#

*


B

GS

H n

o c

ólo

n(

g/g

tec

ido

)

No painel A estão os dados de GSH no duodeno; no painel B os dados de GSH no cólon. Animais foram tratados com naive ( água/ 1% tween v.o.), veículo (Vei: irinotecano 75 mg/kg, i.p.) e Fração acetato de etila e butanol de B. forficata

(FAEB-BF: 100 mg/kg, v.o., irinotecano 75 mg/kg, i.p.). Resultados são apresentados como média ± E.P.M. Análise estatística foi realizada utilizando ANOVA de uma via, seguida por teste de Bonferroni. # p<0,05 vs. grupo naive

(animal não exposto ao irinotecano), * p<0,05 e ** p<0,01 vs. grupo Vei, animal exposto ao irinotecano.

89

Em relação às concentrações de mieloperoxidase (Figura 31), no cólon não foram observadas diferenças entre os grupos. Porém, no duodeno, os animais FAEB-BF (0,0366±0,001) apresentaram valores menores em relação ao veículo (0,0542±0,008), com redução de 32,47 %.

Figura 31. Avaliação do efeito da FAEB-BF na atividade de Mieloperoxidase (MPO) no duodeno (A) e cólon (B) de animais com mucosite intestinal induzida por irinotecano.

Vei FAEB-BF0.00

0.02

0.04

0.06

0.08

***


MP

O d

uo

den

o (

mD

.O/m

g p

rote

ína)

Vei FAEB-BF0.00

0.01

0.02

0.03

0.04


MP

O c

ólo

n(m

D.O

/mg

pro

teín

a)A B

No painel A estão os dados de atividade de mieloperoxidase no duodeno e no B os dados de mieloperoxidase no cólon. Animais foram tratados veículo (Vei: irinotecano 75 mg/kg, i.p.) e Fração acetato de etila e butanol de B. forficata

(FAEB-BF: 100 mg/kg, v.o., irinotecano 75 mg/kg, i.p.). Resultados são apresentados como média ± E.P.M. Análise estatística foi realizada utilizando Teste t. *** p<0,001 vs. grupo Vei, animal exposto ao irinotecano.

Os dados da avaliação de TNF-α no cólon e duodeno dos grupos

experimentais estão demonstrados na Figura 32. Observa-se que no duodeno, o grupo FAEB-BF (285,9±27,79) apresentou valores menores em relação ao veículo (434,3±96,76), com redução percentual de 34,17 %. Enquanto no cólon, não foram observadas diferenças significativas entre os grupos.

90

Figura 32. Avaliação do efeito da FAEB-BF no TNF-α no duodeno (A) e cólon (B) de animais com mucosite intestinal induzida por irinotecano.

Vei FAEB-BF0

200

400

600


*

TN

F-

du

od

eno

(pg

/ mL

)

Vei FAEB-BF0

200

400

600

800

Irinotecano (75 mg/kg, i.p)T

NF

- c

ólo

n(p

g/m

L)

A B

Os dados de TNF- α no duodeno estão no painel A, e do cólon no painel B. Animais foram tratados veículo (Vei: irinotecano 75 mg/kg, i.p.) e Fração acetato de etila e butanol de B. forficata (FAEB-BF: 100 mg/kg, v.o., irinotecano 75 mg/kg, i.p.). Resultados são apresentados como média ± E.P.M. Análise estatística foi realizada utilizando Teste t. * p<0,05 vs. grupo Vei, animal exposto ao irinotecano.

Na Figura 33, estão os dados do teste campo aberto. Observa-se

que os animais do grupo FAEB-BF (153,2±9,43) tiveram o comportamento igual ao naive (143,6±11,64) tanto em relação ao número de cruzamentos, como em relação ao número de vezes que os animais levantaram o corpo (rearing), no qual o naive teve 57,45±3,49 e o grupo FAEB-BF, 52,10±7,25. Enquanto o grupo veículo apresentou redução dos dois parâmetros avaliados, com 55,02 % (68,91±14,31) de redução no número de cruzamentos, e redução de 58,66 % (23,75±5,55) no teste de rearing, em comparação ao naive.

91

Figura 33. Avaliação do efeito da FAEB-BF no Teste Campo Aberto (number of crossings e rearings) nos animais com mucosite intestinal induzida por irinotecano.

Naive Veículo FAEB-BF0

50

100

150

200

###

***


Nu

mb

er o

f cr

oss

ing

s

Naive Veículo FAEB-BF0

20

40

60

80


###

**

Rea

rin

gs

A B

No painel A estão os dados número de cruzamentos e no B os dados de rearing. Animais foram tratados com naive (água/ 1% tween v.o.), veículo (Vei: irinotecano 75 mg/kg, i.p.) e Fração acetato de etila e butanol de B. forficata (FAEB-BF: 100 mg/kg, v.o., irinotecano 75 mg/kg, i.p.). Resultados são apresentados como média ± E.P.M. Análise estatística foi realizada utilizando ANOVA de uma via, seguida por teste de Bonferroni. ### p<0,001 vs. grupo naive (animal não exposto ao irinotecano), ** p<0,01 e *** p<0,001 vs. grupo Vei, animal exposto ao irinotecano.

De acordo com a Tabela 5, observa-se que não houve translocação bacteriana após a indução da mucosite intestinal com o irinotecano, em nenhum dos grupos.

92

Tabela 5. Translocação bacteriana no baço e fígado dos animais no 14º dia.

Baço Fígado

Grupos: Bactérias Gram - Bactérias Gram +

Naive 0/6 0/6

Vei 0/6 0/6

FAEB-BF 0/6 0/6

Os animais foram tratados com veículo (Vei: irinotecano 75 mg/kg, i.p.) e fração acetato de etila e butanol de B. forficata (FAEB-BF: 100 mg/kg, v.o., irinotecano 75 mg/kg, i.p.). 5.5 Avaliação antitumoral 5.5.1 Avaliação antitumoral em modelo de melanoma no flanco de

camundongos

Visando avaliar se os efeitos benéficos e de prevenção da FAEB-BF nos parâmetros avaliados da mucosite intestinal, eram devido ao potencial preventivo, ou se a fração estava interferindo na ação do quimioterápico, foi realizada a avaliação do efeito da fração no crescimento tumoral de animais tratados ou não com irinotecano (75 mg/kg).

Na Figura 34, pode-se observar o crescimento tumoral dos diferentes grupos experimentais, no qual todos os animais apresentavam o tumor no início do tratamento, 15 dias após inoculação das células de melanoma. Observa-se que os grupos Iri e FAEB-BF+Iri tiveram redução do tumor a partir do terceiro dia, enquanto o grupo FAEB-BF teve redução a partir do quarto dia em relação ao veículo, com exceção do sexto dia. Não houve diferença estatística entre os grupos tratados.

93

Figura 34. Crescimento tumoral em percentual em relação ao primeiro dia de tratamento do tumor.

2 3 4 5 6 7

-100

0

100

200

300

VeículoIri (75 mg/kg)FAEB-BF (100 mg/kg) + IriFAEB-BF (100 mg/kg)

***********

** *** *** ***

* * **

***

Tempo (dias)

(75 mg/kg)C

resc

imen

to t

um

ora

l (%

)

Os animais foram tratados com veículo (água/ 1% tween v.o.), irinotecano (Iri: irinotecano 75 mg/kg, i.p.), Fração acetato de etila e butanol de B. forficata + irinotecano (FAEB-BF+Iri: 100 mg/kg, v.o., irinotecano 75 mg/kg, i.p.) e .) e Fração acetato de etila e butanol de B. forficata (FAEB-BF: 100 mg/kg, v.o.). Resultados são apresentados como média ± E.P.M. Análise estatística foi realizada utilizando ANOVA de uma via, seguida por teste de Bonferroni. * p<0,05, ** p<0,01 e *** p<0,001 vs. grupo veículo, animal não exposto ao irinotecano.

94

A Figura 35 apresenta os dados de peso (A) e volume (B) dos tumores dos animais no último dia do experimento. Observa-se que a administração da FAEB-BF concomitante com o quimioterápico irinotecano, não interferiu nem reduziu seu efeito antitumoral. Ainda, a administração da FAEB-BF sozinha, também apresentou efeito antitumoral, reduzindo o tamanho dos tumores.

Figura 35. Efeito da FAEB-BF no peso (A) e volume (B) de animais com tumor induzido por células de melanoma B16F10.

Veículo IRI FAEB-BF + IRI FAEB-BF0

1

2

3

*****

**

Pes

o t

um

or

(g)

Veículo IRI FAEB-BF + IRI FAEB-BF0

1000

2000

3000

4000

5000

****

Vo

lum

e tu

mo

r (m

m3 )

A B

Os animais foram tratados com veículo (água/ 1% tween v.o.), irinotecano (Iri: irinotecano 75 mg/kg, i.p.), Fração acetato de etila e butanol de B. forficata + irinotecano (FAEB-BF+Iri: 100 mg/kg, v.o., irinotecano 75 mg/kg, i.p.) e .) e Fração acetato de etila e butanol de B. forficata (FAEB-BF: 100 mg/kg, v.o.). Resultados são apresentados como média ± E.P.M. Análise estatística foi realizada utilizando ANOVA de uma via, seguida por teste de Bonferroni. * p<0,05, ** p<0,01 e *** p<0,001 vs. grupo veículo, animal não exposto ao irinotecano.

Em relação ao peso do tumor do flanco dos animais (Figura 35-A), observa-se que os grupos Iri, FAEB-BF+Iri e FAEB-BF reduziram o peso em gramas do tumor em 69,6 %, 70 % e 52 %, respectivamente, em comparação ao veículo, com pesos de 0,76±0,16 g; 0,75±0,11 g e 1,20±0,24 g, enquanto o veículo teve como média 2,50±0,29 g.

O volume do tumor (Figura 35-B) no último dia de experimento foi menor nos grupos Iri (1472±392,4 mm3), FAEB-BF+Iri (1343±296,4 mm3) e FAEB-BF (2009±512,4 mm3) em comparação ao veículo

95

(4115±596,9 mm3), com redução de 64,23 %, 67,37 % e 51,18 %, respectivamente. 5.5.2 Avaliação de viabilidade celular e citotoxicidade

Em relação à viabilidade celular e citotoxicidade em células IECs (Figura 26-A), a FAEB-BF não apresentou efeito citotóxico nas concentrações utilizadas, bem como a kaempferitrina (Figura 36-B). Sugere-se que tanto a fração, como o flavonoide isolado, não apresentam riscos de danos celulares no epitélio intestinal.

Figura 36. Avaliação do efeito da FAEB-BF (A) e do flavonoide isolado kaempferitrina (B) em diferentes concentrações na viabilidade celular de células epiteliais de intestino delgado IEC-6.

Basal DMSO 1 3 10 300

50

100

150

***

FAEB-BF (µg/ml)

Via

bili

dad

e ce

lula

r (

%)

Basal DMSO 1 3 10 300

50

100

150

***

Kaempferitrina (µg/ml)

Via

bili

dad

e ce

lula

r (

%)

A B

Basal: apenas meio, dimetilsulfóxido (DMSO: 10 %), A - Fração acetato de etila e butanol de B. forficata (FAEB-BF) e B - Kaempferitrina, nas concentrações de 1, 3, 10 e 30 µg/mL. Análise estatística foi realizada utilizando ANOVA de uma via, seguida por teste de Bonferroni. *** p<0,001 vs. grupo Basal e diferentes doses de FAEB-BF e Kampferitrina.

Observa-se que nas concentrações avaliadas, o irinotecano causa

redução da viabilidade de células IECs (Figura 37-A), e que esse efeito não é revertido pela FAEB-BF nas concentrações avaliadas (Figura 37-B e C), quando administrados concomitantemente.

96

Figura 37. Avaliação do efeito do irinotecano (A) e da FAEB-BF na presença de irinotecano (B e C) em diferentes concentrações na viabilidade celular de células epiteliais de intestino delgado IEC-6.

Basal DMSO 10 30 1000

50

100

150

***

*** *** ***

Irinotecano (µM/mll)

Via

bil

idad

e ce

lula

r (%

)


50

100

150

***

** **

FAEB-BF (µg/ml)+

Irinotecano (30 µM/mll)

Via

bilid

ade

celu

lar

(%)


50

100

150

*** *** ***

***

FAEB-BF (µg/ml)+

Irinotecano (100µM/mll)

Via

bilid

ade

celu

lar

(%)

A B

C

Basal: apenas meio, dimetilsulfóxido (DMSO: 10 %), A - irinotecano nas concentrações de 10, 30 e 100 µM/mll, B - Fração acetato de etila e butanol de B.

forficata (FAEB-BF) nas concentrações 10, 30 e 100 µg/mL e irinotecano 30 µM/mll, C - Fração acetato de etila e butanol de B. forficata (FAEB-BF) nas concentrações 10, 30 e 100 µg/mL e irinotecano 100 µM/mll. Análise estatística foi realizada utilizando ANOVA de uma via, seguida por teste de Bonferroni. ** p<0,01 e *** p<0,001 vs. grupo Basal.

Após a constatação de que quando o tratamento com FAEB-BF foi realizado concomitante ao irinotecano, a fração não apresentou efeito citoprotetor, foi realizada a avaliação dos efeitos da FAEB-BF e do composto isolado kaempferitrina, em células pré-tratadas 24 h com os mesmos, e depois realizada a administração do irinotecano. Observa-se

97

(Figura 38), que o pré-tratamento protegeu as células do efeito citotóxico apresentado pelo irinotecano, da mesma forma como foi observado nos experimentos in vivo. Figura 38. Avaliação do efeito preventivo de citoproteção da FAEB-BF (A e B) e da kaempferitrina (C e D), em relação ao efeito citotóxico do irinotecano, em diferentes concentrações na viabilidade celular de células epiteliais de intestino delgado IEC-6.


50

100

150

FAEB-BF (µg/ml)+


***Via

bilid

ade

celu

lar

(%)


50

100

150

FAEB-BF (µg/ml)+


***

#

Via

bilid

ade

celu

lar

(%)


50

100

150

Kaempferitrina (µg/ml)+


***Via

bilid

ade

celu

lar

(%)


50

100

150

Kaempferitrina (µg/ml)+


***Via

bili

dad

e ce

lula

r (%

)

A B

C D

Basal: apenas meio, dimetilsulfóxido (DMSO: 10 %), A - Fração acetato de etila e butanol de B. forficata (FAEB-BF) nas concentrações 10, 30 e 100 µg/mL e irinotecano 30 µM/mll, B - Fração acetato de etila e butanol de B. forficata (FAEB-BF) nas concentrações 10, 30 e 100 µg/mL e irinotecano 100 µM/mll. C – kaempferitrina nas concentrações 10, 30 e 100 µg/mL e irinotecano 30 µM/mll, D – kaempferitrina nas concentrações 10, 30 e 100 µg/mL e irinotecano 100 µM/mll. Análise estatística foi realizada utilizando ANOVA de uma via, seguida por teste de Bonferroni. * <0,05 vs. Basal, *** p<0,001 vs. grupo Basal e diferentes concentrações de FAEB-BF e kaempferitrina.

98

6 DISCUSSÃO

O epitélio intestinal é composto por células especializadas, as quais formam uma barreira física e bioquímica aos microrganismos comensais. Porém, se ocorre a desregulação da função dessa barreira, pode-se gerar o aumento da permeabilidade por meio da mucosa intestinal, contribuindo para a ativação imunológica local e sistêmica. Quando há permeabilidade intestinal e ativação do sistema imune, podem ocorrer disfunções e processos inflamatórios intestinais (ANDRADE et al., 2015).

Apesar de necessários para o tratamento efetivo de diversos tipos de tumores malignos, os agentes quimioterápicos podem causar uma série de efeitos tóxicos em diferentes sistemas, entre eles, no trato gastrointestinal, promovendo perdas nutricionais, afetando o estado nutricional e o quadro geral de saúde do paciente com câncer. Além da redução de peso gerada pela própria doença, o tratamento acaba agravando esse quadro, devido a fatores como perda de apetite, enjoo, vômito, dor e diarreia (CUPPARI; SCHOR, 2005; OLIVEIRA et al., 2010).

A toxicidade e efeitos adversos causados pela quimioterapia dependem do fármaco utilizado, mas comumente eles agem nas fases de divisão celular, tanto das células tumorais quanto saudáveis, atingindo as células de rápida proliferação, entre elas, as células e tecidos gastrointestinais (NASCIMENTO, 2012). Dessa forma, uma das manifestações mais comuns quando em tratamento antineoplásico, é a mucosite alimentar (RIBEIRO et al., 2016).

A mucosite alimentar é um processo complexo que envolve diversas vias moleculares nas camadas da mucosa, sendo dividida em oral e intestinal, levando a diversos sintomas, entre eles, ulcerações, dores, náuseas, diarreia e perda de peso. Cerca de 40% dos pacientes em tratamento de câncer sofrem desses efeitos adversos, acometendo crianças, adultos e idosos (LOGAN et al., 2007; ARAÚJO et al., 2015).

As manifestações comuns durante o tratamento quimioterápico, em especial a mucosite intestinal e a diarreia, são os principais efeitos adversos na prática clínica, os quais acabam afetando negativamente os resultados terapêuticos e ciclos de tratamento, levando à

99

necessidade de interromper ou reduzir as dosagens administradas (RIBEIRO et al., 2016).

Algumas possíveis estratégias são encontradas na literatura, apesar de escassas e de não serem totalmente efetivas, para atenuar os sintomas e o quadro de mucosite intestinal dos pacientes, entre eles, estão os imunomoduladores, como glutamina, arginina, triptofano, citrulina, vitamina E, ácidos graxos de cadeia curta (AGCC), ômega 3 e probióticos, sendo comumente utilizadas cepas de Lactobacillus e Bifidobactérias.

Por ser um acometimento crítico nos pacientes em tratamento quimio e radioterápico, e por ainda não ter estratégias e terapêutica clínica específica e efetiva, conforme já mencionado, torna-se importante a busca por agentes que possam prevenir e atenuar essa manifestação inflamatória clínica. Recentemente, estudos trazem algumas espécies vegetais e compostos isolados, como a semente de uva e a cúrcuma como opção para tratar, atenuar ou prevenir a mucosite intestinal (WGO, 2011; ANDRADE et al., 2015; JUSTINO et al. 2015; AL-ASMARI et al. 2016; CHEAH et al., 2014; SANTOS-FILHO et al., 2014).

Alguns compostos químicos, como os flavonoides, amplamente encontrados no metabolismo secundário de plantas, são conhecidos por possuírem ação antioxidante e anti-inflamatória, prevenindo e atuando em diversas patologias e modelos experimentais e inflamatórios (PÉREZ-CANO CASTELL, 2016; GOYA et al., 2016)

As espécies B. forficata e C. reitiziana, são plantas medicinais que possuem grande quantidade desses metabólitos em suas folhas, e são utilizadas popularmente como antidiarreicas e para distúrbios gastrointestinais (KREMER et al., 2008; MAZZEO et al., 2015; ROSÁRIO-NETO et al., 2012; NESELLO et al., 2015). Uma vez que a diarreia é o principal sinal da mucosite intestinal (SOARES et al., 2008; WARDILL et al., 2014; MELO, 2014) e com o intuito de contribuir para a validação científica do uso tradicional e avaliar os potenciais terapêuticos dessas espécies, nessa condição clínica de tão difícil tratamento, iniciou-se o estudo por meio da avaliação das frações ricas em flavonoides das espécies acima mencionadas na motilidade intestinal em animais saudáveis.

As doses testadas posteriormente na mucosite intestinal, foram determinadas a partir da avaliação do efeito das frações na motilidade

100

intestinal em três diferentes doses (30, 100 e 300 mg/kg), dando-se continuidade com a menor dose efetiva nesse parâmetro, que foi a de 100 mg/kg. Por conta dos resultados obtidos, deu-se seguimento à pesquisa, a partir da padronização e avaliação dos efeitos farmacológicos das frações ricas em flavonoides, na mucosite intestinal induzida pelo quimioterápico irinotecano em camundongos.

A dismotilidade gastrointestinal encontrada em animais com mucosite intestinal induzida por quimioterápicos, também está relacionada ao processo inflamatório que ocorre no intestino. Isso se dá pelo fato da inflamação intestinal induzir alterações na contratilidade da musculatura lisa, indicando a interação entre motilidade e inflamação (SOARES et al., 2008). O cuidado com esses pacientes em tratamento quimioterápico, e a prevenção ou redução desses efeitos adversos se torna muito importante, pois a desnutrição chega a afetar 50% destes, sendo conhecida como caquexia e tendo como manifestações a atrofia da musculatura e anorexia, comprometendo criticamente a saúde desses pacientes (CUPPARI; SCHOR, 2005; OLIVEIRA et al., 2010). Devido ao que ocorre na prática clínica, um dos parâmetros avaliados no presente trabalho foi o ganho de peso dos diferentes grupos experimentais, durante os dias de pré-tratamento, no qual as frações ricas em flavonoides das espécies utilizadas demonstraram atenuar a perda de peso. Outros estudos corroboram com os dados obtidos nesse experimento, demonstrando a redução do peso dos animais devido à quimioterapia (SHI et al., 2016; RIBEIRO et al., 2016).

A definição de diarreia se dá pelo aumento na frequência de evacuações, fezes molhadas/líquidas e dores abdominais, sendo uma das maiores causas de morte (PROGRESS IN DRUG RESEARCH, 2016). A aceleração da motilidade intestinal e diarreia nos animais pode ser associada à diarreia observada em pacientes em tratamento com quimioterápicos, como o 5-FU e irinotecano (SOARES et al., 2008). Nesse parâmetro, a FAEB-BF foi o único grupo tratado que apresentou redução significativa do grau de diarreia no modelo de mucosite intestinal, sendo que a loperamida, tratamento padrão para diarreia na prática clínica, não obteve efeito.

Apesar de ambos a B. forficata, e a C. reitziana terem indicação popular para combater a diarreia, e mesmo outras espécies sendo

101

usadas tradicionalmente para esse fim, há escassez da comprovação científica do verdadeiro potencial e eficácia dessas plantas, que muitas vezes não passam por testes pré-clínicos e clínicos (MISHRA et al., 2016). Deste modo, o presente trabalho torna-se relevante, pois até o atual momento, não foram encontrados trabalhos avaliando de forma pré-clínica o efeito dessas espécies nesse parâmetro, no qual apenas a B. forficata demonstrou eficácia, conforme atestam os resultados encontrados no presente estudo.

O irinotecano pode ocasionar dois tipos de diarreia, a primeira toxicidade ocorre nas primeiras 24 horas após a administração do fármaco, associada à superestimulação colinérgica, pois o irinotecano mimetiza o efeito da acetilcolina. Essa ação então é mediada por meio da inibição da acetilcolinesterase, por ligação e estimulação direta de receptores muscarínicos. A diarreia tardia, evidenciada no presente estudo, no 14º dia, antes da eutanásia, é um efeito adverso sério do irinotecano, ocorrendo em 20-40% dos pacientes que o utilizam (HETCH, 1998).

Na prática clínica, a loperamida é o medicamento usualmente indicado para o tratamento da diarreia. O cloridrato de loperamida é um antidiarreico sintético de uso oral, que se liga ao receptor opiáceo da parede do intestino. Atua na redução da motilidade intestinal por agir diretamente nas camadas musculares da parede do intestino, inibindo a liberação de acetilcolina e prostaglandinas nos plexos mioentéricos, além de aumentar o tempo de trânsito intestinal, aumentar o tônus do esfíncter anal e atuar também sobre o transporte de água e eletrólitos (ANVISA, 2015). Porém, no presente estudo, a loperamida na dose de 10 mg/kg, conforme descrita na literatura, não demonstrou atenuação na diarreia nos animais com mucosite intestinal.

Entre os compostos fitoquímicos, os flavonoides e taninos são os principais relatados como tendo efeitos na melhora da diarreia. Taninos reduzem a secreção intestinal por meio da desnaturação de proteínas secretoras e inibição da motilidade. Os flavonoides, do mesmo modo, reduzem a motilidade intestinal e a secreção de água e eletrólitos, além do potencial antioxidante que possuem, podendo atuar na supressão de atividades catalíticas de diferentes enzimas envolvidas na síntese de prostaglandinas (BIRRU et al., 2016). Também

102

apresentam atividade antiespasmódica e gastroprotetora (MOTA et al., 2009).

Dessa forma, o efeito antidiarreiro demonstrado pela FAEB-BF possivelmente está associadao à quantidade de flavonoides presentes em sua composição, especialmente à kaempferitrina, considerado o majoritário e ao qual diversos efeitos farmacológicos são atribuídos, como hipoglicemiante, antioxidante e citotóxico (SILVA; CECHINEL-FILHO, 2002; CECHINEL-FILHO, 2009; BATISTA et al., 2013; MICELI et al., 2016).

Os pesos dos órgãos são parâmetros comumente utilizados em estudos para avaliação de toxicidade, pois alterações nesses parâmetros estão relacionados à alteração no funcionamento dos mesmos (SELLERS et al., 2007). Essa avaliação é justificada, pois uma das limitações do uso de quimioterápicos é sua toxicidade em órgãos não afetados com o câncer, como fígado e baço (AIKEMU et al., 2016).

O presente estudo avaliou os valores de peso dos órgãos ao final do experimento, no qual foram analisados os pesos do baço, fígado, duodeno e cólon.

Em relação ao encontrado na pesquisa, os animais tratados com irinotecano apresentaram redução no peso do baço. Esses resultados corroboram com o encontrado na literatura, por exemplo, Cheah et al. (2014) observaram redução de 20% no peso do baço nos grupos que receberam 5-FU, inclusive no grupo tratado com extrato de semente de uva. Já Bajic et al., (2016) avaliaram o extrato aquoso de ruibarbo em ratos com mucosite induzida pelo quimioterápico 5-FU e observaram redução do peso do baço no grupo tratado apenas com 5-FU.

A redução do peso relativo do baço nos animais com mucosite intestinal pode ser justificada pela imunossupressão consequente ao tratamento quimioterápico. O fato da FAEB-BF não interferir nesse parâmetro demonstra que apesar de prevenir e atenuar os sinais da mucosite, não interfere na ação do irinotecano.

O fígado desempenha diversas funções metabólicas e excretoras. É o primeiro local onde os nutrientes ingeridos, fármacos e metabólitos bacterianos são processados, atuando tanto na metabolização de substâncias boas, como na destoxificação de substâncias potencialmente prejudiciais, contribuindo de modo fundamental para a homeostase do corpo (BARRET, 2015).

103

O grupo que recebeu apenas irinotecano demonstrou um valor reduzido para o peso do fígado, assim como o que recebeu irinotecano juntamente com loperamida. Aikemu et al. (2016) também observaram redução no peso relativo do fígado do grupo tratado apenas com 5-FU e dexorrubicina, enquanto os animais tratados com um preparado de ervas medicinais tradicionais chinesas, rica em flavonoides denominada Abnormal Savda Munziq apresentou valores normais.

Neste estudo foi demonstrado que a FAEB-BF e a FAE-CR, protegeram o fígado dos animais em relação à toxicidade do Irinotecano, provavelmente pelo alto poder antioxidante e anti-inflamatório dos flavonoides, pois esse dado corrobora com o encontrado na literatura, nos quais outros modelos demonstraram que flavonoides protegem e atenuam problemas hepáticos em animais (GÓMEZ-ZORITA et al., 2012; WANG et al., 2015).

Em contrapartida, alguns trabalhos com mucosite intestinal, como de Bajic et al. (2016) e Cheah et al. (2014), não observaram diferença no peso desse órgão entre os grupos.

Devido à C. reitiziana não apresentar redução e melhora na diarreia, considerado o principal sinal na mucosite intestinal, a continuidade dos ensaios farmacológicos e fitoquímicos se deram apenas com a espécie B. forficata.

Em relação ao peso do duodeno e do cólon secos dos diferentes grupos, observou-se que no duodeno, o peso foi reduzido no grupo tratado apenas com irinotecano, sendo o mesmo grupo que apresentou edema. Essa diferença encontrada apenas no duodeno, provavelmente é devido ao fato das células das criptas do intestino delgado serem mais sensíveis à toxicidade e apoptose exercidos pelo Irinotecano (RIBEIRO et al., 2016). Observa-se que a FAEB-BF agiu protegendo o duodeno, visto que o peso foi igual ao naive, e não apresentou edema. Já, Cheah et al. (2014) não observaram diferença no peso do duodeno e cólon dos animais tratados com extrato de semente de uva, que pode ser pelo fato de terem usado outro quimioterápico.

Outro parâmetro observado foi a melhora qualitativa na arquitetura histológica do duodeno de animais que receberam a FAEB-BF, sendo possível observar a preservação parcial das células caliciformes, assim como da camada de muco aderida à mucosa. Em

104

contraste, nos animais que receberam irinotecano e foram tratados com veículo, os danos histológicos foram evidentes, com intensa ulceração e redução da altura de vilos e depleção das células caliciformes. Tang et al. (2017) observaram que animais tratados com 5-FU tiveram redução da altura das vilosidades e criptas no íleo, depleção de células caliciformes e infiltrado inflamatório intenso, os quais foram amenizados pela administração de probióticos.

Cheah et al (2014) observaram efeito protetor da semente de uva, que aumentou em 25 % a profundidade das criptas em animais com mucosite induzida por 5-FU. Já Bajic et al. (2016) avaliaram que a administração de 5-FU ocasionou dano no jejuno, reduzindo a espessura da mucosa em 29 %, e que o extrato de ruibarbo testado não exerceu melhora nesse parâmetro.

No presente estudo observaram-se valores aumentados de GSH no duodeno e cólon dos animais tratados com FAEB-BF em relação ao veículo, que demonstrou redução das concentrações de GSH no cólon quando comparado ao naive. A glutationa (GSH) é um tripeptídeo antioxidante hidrossolúvel, que desempenha um papel fundamental na defesa celular do organismo contra o estresse oxidativo (NEMMICHE, 2016). A depleção de GSH foi observada também por Shi et al. (2016) em animais com mucosite induzida pelo metatrexato (MTX), e por Arifa et al., (2016) no íleo de animais com mucosite induzida por irinotecano. Segundo Shi et al., (2016), o dano oxidativo que justifica essa redução, se deu após a ação lesiva da administração de quimioterápicos. Possivelmente o aumento do GSH com a administração da FAEB-BF nesses tecidos, se dá pelo alto teor antioxidante exercido pelos flavonoides. O aumento nas concentrações de GSH reduzida exercido pelo extrato de B. forficata foi anteriormente descrito por Damasceno et al. (2001) em ratas diabéticas prenhas, no tecido hepático.

Gulgun et al., (2010) observaram redução de GSH peroxidase no jejuno demonstrando estresse oxidativo causado por danos no intestino, que foram amenizados pela administração de 100 mg/kg do flavonoide proantocianidina de Vitis vinífera, demonstrando efeito antioxidante e protetor ao estresse oxidativo dessa classe de compostos.

105

Nos marcadores inflamatórios, mieloperoxidase (MPO) e TNF-α, observou-se que a FAEB-BF reduziu significativamente esses valores no duodeno, indicando que exerceu efeito anti-inflamatório. De acordo com Ribeiro et al. (2016), as lesões causadas pelo irinotecano podem ser evidenciadas com base na acumulação de neutrófilos, que é maior no intestino delgado (duodeno), o que sugere que este é mais sensível aos efeitos tóxicos do irinotecano.

Segundo Shi et al. (2016), no tratamento de pacientes com câncer, tanto a quimioterapia, como a própria doença causam o aumento da liberação de citocinas pró-inflamatórias, especialmente TNF-α.

Outros estudos evidenciaram o aumento de citocinas pró-inflamatórias no modelo de mucosite intestinal e papel protetor de espécies vegetais. Por exemplo, a redução (55%) nas concentrações de MPO também foi encontrada por Cheah et al. (2014), com administração da dose de 600 mg/kg do extrato de semente de uva no jejuno e íleo de animais, e por Reinke et al. (2015), no qual o acteosídeo reduziu 60% a mieloperoxidase no duodeno. Shi et al. (2016) observaram que as concentrações de TNF-α ficaram aumentadas no grupo MTX e reduziu no grupo tratado com a raiz de Rehmannia cozida. Os efeitos anti-inflamatórios encontrados no presente estudo, podem ser justificados, pois a kaempferitrina, principal constituinte da FAEB-BF, demonstrou efeitos imunoestimuladores sobre respostas imunitárias em diferentes células (DEL-CARMEN et al., 2013).

A dor abdominal é um dos sintomas da mucosite intestinal, conforme já mencionado anteriormente, podendo debilitar ainda mais os pacientes. Devido a isso, foi realizado o teste campo aberto com os animais, no qual os resultados sugerem que a FAEB-BF reduziu o desconforto abdominal causado pela mucosite, pois os animais tratados apresentaram o mesmo comportamento que os animais saudáveis, tanto em relação ao número de quadrantes (locomoção), quanto de rearing, que é o comportamento exploratório no qual o animal estende seu corpo e patas dianteiras, apoiando-se sobre as traseiras, esticando seu corpo. Por outro lado, animais que receberam apenas o quimioterápico, tiveram redução significativa nesses dois parâmetros.

106

Em adição, Melo et al. (2009) observaram a inibição de nocicepção de 47,3 % após administração de kaempferitrina no modelo de dor abdominal induzida por ácido acético. Ainda, Cassani et al. (2014), administraram quatro diferentes doses de kaempferitrina (1, 5, 10 e 20 mg/kg) em camundongos e realizaram o teste de campo aberto, no qual a maior dose demonstrou aumento no número de cruzamentos, quanto as demais doses tiveram os mesmos efeitos que o controle. Outros derivados glicosilados de kaempferol também apresentaram valores semelhantes. Estudos também demonstraram o efeito do kaempferol na redução da nocicepção (CALDERÓN-MONTAÑO et al., 2011; KIM et al., 2015). Apesar de diferente de outros estudos (BATISTA et al., 2013; SALGUEIRO et al., 2016), não ter sido identificada a presença de kaempferol nas folhas coletadas, após passar pelo intestino, a kaempferitrina é biotransformada e convertida em outros compostos, entre eles, no kaempferol (YANG et al., 2005).

No presente trabalho, não foi encontrada translocação bacteriana no baço e fígado dos animais. Corroborando com o presente trabalho, Yeung et al. (2015) avaliaram o efeito de probióticos em animais com mucosite intestinal, e também não encontraram translocação, porém utilizaram outro quimioterápico, o 5-FU. Já foi demonstrado por Nakao et al. (2012), que o irinotecano induz translocação bacteriana em linfonodos e baço, por causar danos no epitélio da barreira intestinal. Porém, a diferença encontrada no presente trabalho, pode ser justificada pela diferença de espécies e nas doses utilizadas, que foi de 75 mg/kg em camundongos no presente estudo, e 250 mg/kg em ratos no trabalho de Nakao et al. (2012).

Devido ao potencial observado pela administração da FAEB-BF nos modelos experimentais, deu-se continuidade da análise fitoquímica da mesma, na qual observou-se que a coleta realizada e utilizada no presente estudo, outono, é a que possui a menor quantidade de kaempferitrina, e mesmo assim, mostrou efeito promissor de prevenção da citotoxicidade induzida pelo irinotecano.

As melhores estações para obter quantidade superior de kaempferitrina, são verão e primavera, conforme indicam os estudos por CLAE. Esses achados são justificados pelo fato dos flavonoides serem sintetizados pelas folhas como proteção contra a foto-destruição, evitando a danificação dos tecidos internos devido aos raios

107

ultravioletas (UV) (GOBBO-NETO; LOPES 2007), que estão mais intensos nessas estações. Em relação à diferentes idades da árvore, observou-se que a planta com aproximadamente um ano de idade, apresentou uma quantidade maior correspondendo a mais que o dobro da concentração da mesma coleta, da planta com cerca de 10 anos de idade. Ressalta-se que as espécies encontravam-se no mesmo ambiente edafoclimático sugerindo que o principal fator para explicar tal diferença parece ser as transformações biossintéticas inerentes à maturidade do material vegetal.

Após ter-se observado os efeitos positivos e preventivos da FAEB-BF, objetivou-se avaliar se esse efeito protetor ocorreu por interferir no efeito antitumoral exercido pelo irinotecano, e deu-se continuidade ao trabalho para investigar essa questão. No modelo de indução de melanoma, observou-se que a B. forficata não interferiu nessa ação, pois tanto o irinotecano, como ele concomitante com a FAEB-BF apresentaram efeito antitumoral. Os achados corroboram com os de Arifa et al. (2016), que observaram no mesmo modelo, o efeito antitumoral do irinotecano na mesma dose e linhagem de animais testada.

Ainda, observou-se que a FAEB-BF sozinha, também demonstrou atividade antitumoral em animais. Os efeitos citotóxicos da B. forficata já foram relatados em estudos in vitro em células tumorais (SILVA; JASIULIONIS, 2014), células da medula óssea de animais tratados com B. forficata (DÜSMAN et al., 2013), assim como a kaempferitrina também apresenta esta atividade (ALONSO-CASTRO et al., 2013). Até o presente momento e conhecimento dos autores, esse foi o primeiro trabalho que demonstrou o efeito antitumoral in vivo dessa espécie. Miceli et al. (2016) realizaram trabalho recente, no qual testaram o extrato e a fração rica em flavonoides da B. forficata em células Caco 2, porém, não encontraram ação citotóxica nas concentrações testadas (até 50 µg/mL). Porém, em células de melanoma FO-1 os autores observaram redução do crescimento de células cancerígenas na dose de 50 µg/mL.

Por exercer efeito antitumoral, perguntou-se se a fração rica em flavonoides de B. forficata, e seu flavonoide majoritário, a kaempferitrina, poderiam ser citotóxicas em células saudáveis, devido a

108

isso, foi investigada a atividade citotóxica dos mesmos em células epiteliais intestinais, as IECs, e elas demonstraram que são seguras e não causam danos em células saudáveis. Já o irinotecano causou redução da viabilidade celular nas concentrações testadas, efeito que não foi revertido pela administração concomitante da FAEB-BF nas concentrações utilizadas.

7 CONSIDERAÇÕES FINAIS

Em relação à análise fitoquímica, observou-se que o rendimento da espécie B. forficata, espécie que apresentou resultados promissores, foi maior no verão, e que a kaempferitrina é o flavonoide majoritário da fração utilizada no estudo, o qual foi isolado a partir da fração acetato de etila e butanol da B. forficata (FAEB-BF). Através da análise de quantificação, observou-se a kaempferitrina está presente em maior quantidade no extrato do verão seguido pelo da primavera, e também se encontra em maior quantidade na planta de aproximadamente um ano de idade, quando comparada à mesma coleta da planta de aproximadamente 10 anos de idade.

A FAEB-BF reduziu a motilidade intestinal nas doses de 100 e 300 mg/kg. Em relação à mucosite intestinal, observou-se redução da diarreia, não houve alteração no peso do fígado e duodeno, qualitativamente atenuou os danos observados histologicamente, aumentou o GSH no duodeno e cólon, reduziu o TNF-α e a atividade de MPO no duodeno, assim como houve reversão da redução da atividade exploratória.

Em relação à atividade antitumoral, a administração da FAEB-BF não interferiu no efeito antitumoral do irinotecano e apresentou efeito antitumoral in vivo na dose avaliada. Em relação à citotoxicidade em células epiteliais intestinais IEC-6 a FAEB-BF e o flavonoide majoritário isolado, kaempferitrina, não apresentaram redução da viabilidade celular em diferentes concentrações (1 até 30 µg/mL). O irinotecano nas concentrações avaliadas (10, 30 e 100 µM/mll) causou redução da viabilidade celular, o que não foi revertido pela FAEB-BF nas concentrações de 10, 30 e 100 µg/mL.

A espécie Campomanesia reitziana, assim como a loperaminda, não apresentaram os mesmos efeitos de atenuação dos

109

parâmetros avaliados, e dessa forma, não se deu continuidade nas análises.

Dessa forma, conclui-se que a FAEB-BF atenuou a mucosite intestinal em camundongos, reduzindo também parâmetros indicadores de inflamação e oxidativos, enquanto a C. reitiziana não apresentou melhora dos parâmetros avaliados.

110

REFERÊNCIAS ABALO, R.; URANGA, J. A.; PÉREZ-GARCÍA, I.; DE ANDRÉS, R.;

GIRÓN, R.; VERA, G.; LÓPEZ-PÉREZ, A. E.; MARTÍN-FONTELLES, M. I. May cannabinoids prevent the development of chemotherapy-induced diarrhea and intestinal mucositis? Experimental study in the rat. Neurogastroenterol Motil., in press, 2016. AL-ASMARI, A. K.; KHAN, A. Q.; AL-ASMARI S. A.; AL-RAWI, A.; AL-OMANI, S. Alleviation of 5-fluorouracil-induced intestinal mucositis in rats by vitamin E via targeting oxidative stress and inflammatory markers. J Complement Integr Med., v. 13, n. 4, 2016. ALENCAR, S. S. S.; MEDEIROS, A. C.; BRANDT, C. T.; AGUIAR, J. L. A.; ROCHA, K. B. F.; SILVA, M. P. Translocação de bactérias marcadas com TC99 na icterícia obstrutiva em ratos. Acta Cir. Bras., v. 17, n. 1, 2002. ALONSO-CASTRO, A. J.; ORTIZ-SÁNCHEZ, E.; GARCÍA-REGALADO, A.; RUIZ, G.; NÚÑEZ-MARTÍNEZ, J. M.; GONZÁLEZ-SÁNCHEZ, I.; QUINTANAR-JURADO, V.; MORALES-SÁNCHEZ, E.; DOMINGUEZ, F.; LÓPEZ-TOLEDO, G.; CERBÓN, M. A.; GARCÍA-CARRANCÁ, A. Kaempferitrin induces apoptosis via intrinsic pathway in HeLa cells and exerts antitumor effects. J Ethnopharmacol., v. 145, n. 2, p. 476-489, 2013. ALVARENGA, E. M.; SOUZA, L. K.; ARAÚJO, T. S.; NOGUEIRA, K. M.; SOUSA, F. B.; ARAÚJO, A. R.; MARTINS, C. S.; PACÍFICO, D. M.; C BRITO, G. A.; SOUZA, E. P.; SOUSA, D. P.; MEDEIROS, J. V. Carvacrol reduces irinotecan-induced intestinal mucositis through inhibition of inflammation and oxidative damage via TRPA1 receptor activation. Chem Biol Interact., v. 260, p. 129-140, Nov. 2016. AIKEMU, A.; AMAT, N.; YUSUP, A.; SHAN, L.; QI, X.; UPUR, H. Attenuation effect of Abnormal Savda Munziq on liver and heart toxicity caused by chemotherapy in mice. Exp Ther Med., v. 12, p. 384-390, 2016.

111

ANDRADE, M. E.; ARAÚJO, R. S.; DE BARROS, P. A.; SOARES, A. D.; ABRANTES, F. A.; GENEROSO, S. de V.; FERNANDES, S. O.; CARDOSO, V. N. The role of immunomodulators on intestinal barrier homeostasis in experimental models. Clin Nutr., v. 34, n. 6, p. 1080-1087, 2015. ANVISA - AGÊNCIA NACIONAL DE VIGILÂNCIA SANITÁRIA. Intestin (cloridrato de loperamida). 2015. Disponível em:< http://www.anvisa.gov.br/datavisa/fila_bula/frmVisualizarBula.asp?pNuTransacao=12359852016&pIdAnexo=3092398>. Acesso em: 09 nov. 2016. ANVISA - AGÊNCIA NACIONAL DE VIGILÂNCIA SANITÁRIA. Irenax (cloridrato de irinotecano). 2013. Disponível em: <http://www.anvisa.gov.br/datavisa/fila_bula/frmVisualizarBula.asp?pNuTransacao=9545122013&pIdAnexo=1861749>. Acesso em: 26 jan. 2015. APAYA, M. K.; CHANG, M. T.; SHYUR, L. F. Phytomedicine polypharmacology: cancer therapy through modulating the tumor microenvironment and oxylipin dynamics. Pharmacol Ther., v. 162, p. 58-68, 2016. ARAÚJO, A. A.; BORBA, P. B.; SOUZA, F. H. D. NOGUEIRA, A. C.; SALDANHA, T. S.; ARAÚJO, T. E.; SILVA, A. I.; ARAÚJO-JÚNIOR, R. F. In a methotrexate-induced model of intestinal mucositis, olmesartan reduced inflammation and induced enteropathy characterized by severe diarrhea, weight loss, and reduced sucrose activity. Biol. Pharm. Bull., v. 38, p. 746–752, 2015. ARIFA, R. D. N.; PAULA, T. P.; MADEIRA, M. F. M.; LIMA, R. L.; GARCIA, Z. M.; ÁVILA, T. V. PINHO, V.; BARCELOS, L. S.; PINHEIRO, M. V.; LADEIRA, L. O.; KAMBROCK, K.; TEIXEIRA, M. M.; SOUZA, D. G. The reduction of oxidative stress by nanocomposite Fullerol decreases mucositis severity and reverts leukopenia induced by Irinotecan. Pharmacol Res., v. 107, p. 102-110, 2016.

112

ARNOUS, A.; MAKRIS, D. P.; KEFALAS, P. Effect of principal polyphenolic components in relation to antioxidant characteristics of aged red wines. J. Agric. Food Chem., v. 49, n. 12, 2001. ARSLAN, A.; OZCICEK, A.; SULEYMAN, B.; COBAN, T. A.; CIMEN, F. K.; NALKIRAN, H. S.; KUZUCU, M.; ALTUNER, D.; CETIN, N.; SULEYMAN, H. Effects of nimesulide on the small intestine mucositis induced by methotrexate in rats. Exp. Anim., v. 65, n. 4, p. 329–336, 2016. BAJIC, J. E.; EDEN, G. L.; LAMPTON, L. S.; CHEAH, K. Y.; LYMN, K. A.; PEI, J. V.; YOOL, A. J.; HOWARTH, G. S. Rhubarb extract partially improves mucosal integrity in chemotherapy-induced intestinal mucositis Basic Study. World J Gastroenterol., v. 22, n. 37, p. 8322-8333, 2016. BARRETT, K. E. Fisiologia Gastrintestinal. 2 Ed. Porto Alegre: AMGH Editora, 2015. BASTOS, C. C. C. Efeitos da formulação mucoadesiva de Bidens pilosa

L. (Asteraceae) e Curcuma longa L. (Zingiberaceae) no tratamento da

mucosite intestinal. 2014. 80 f. Dissertação (Mestrado em Ciências Farmacêuticas) - Programa de Pós-graduação em Ciências Farmacêuticas, Universidade Federal de Goiás, Goiânia. 2014. BATISTA, P. N.; LYRA, M. A. M.; NETO, P. J. R.; MEDEIROS, M. G. F.; FREITAS, R. M.; NUNES, L. C. C. Systematic review: uses, applications and therapeutic trends of Bauhinia forficata Link. VRI-PM, v. 1, n. 2, p. 64-72, Sept. 2013. BEZERRA, J. D. P.; NASCIMENTO, C. C. F.; BARBOSA, R. N.; SILSA, D. C. V.; SVEDESE, V. M.; SILVA-NOGUEIRA, E. B.; GOMES, B. S.; PAIVA, L. M.;SOUZA-MOTTA, C. M. Endophytic fungi from medicinal plant Bauhinia forficata: Diversity and biotechnological potential. Braz.

Microbiol., v. 46, n. 1, p. 49-57, 2015.

113

BIRRU, E. M.; ASRIE, A. B.; ADINEW, G. M.; TSEGAW, A. Antidiarrheal activity of crude methanolic root extract of Idigofera spicata Forssk. (Fabaceae). BMC Complement Altern Med., v. 16, p. 272, 2016. BOLSON, M.; HEFLER, S. S.; CHAVES, E. I. D.; GASPAROTTO-JUNIOR, A.; CARDOZO-JUNIOR, E. L. Ethno-medicinal study of plants used for treatment of human ailments, with residents of the surrounding region of forest fragments of Paraná, Brazil. J Ethnopharmacol., v. 161, p. 1-10, 2015. BOLZANI, V. S.; FLAUSINO-JÚNIOR, O.; VALLI, M. Biodiversidade Brasileira: uma fonte potencial de agentes terapêuticos ainda inexplorada. In: YUNES, R. A.; CECHINEL-FILHO, V. Química de

Produtos Naturais: novos fármacos e a moderna farmacognosia. 4 ed. Itajaí: Editora Univali, 2014. p. 397-429. BOWEN, J. M.; GIBSON, R. J.; CUMMINS, A. G.; KEEFE, D. M. Intestinal mucositis: the role of the Bcl-2 family, p53 and caspases in chemotherapy-induced damage. Support. Care Cancer, v. 14, n. 7, p. 713-731, July 2006.

BRADLEY, D. A P. P.; PRIEBAT, R. D; ROTHSTEIN, C.; ROTHSTEIN, G. Measurement of cutaneous inflammation: estimation of neutrophil content with an enzyme marker. J. Invest. Dermatol., v. 78, n. 3, p. 206-209, 1982. BRASIL. Agência Nacional de Vigilância Sanitária. RE 899, de 29 de maio de 2003. Determina a publicação do "Guia para validação de métodos analíticos e bioanalíticos. Publicado no D.O.U. - Diário Oficial da União, 02 de junho de 2003.

BRASIL. Ministério do Meio Ambiente. Biodiversidade Brasileira. 2016. Disponível em: < http://www.mma.gov.br/biodiversidade/biodiversidade-brasileira>. Acesso em: 07 mar 2016.

114

CALDERÓN-MONTAÑO, J. M.; PÉREZ-GUERRERO, A.; LÓPEZ-LÁZARO, M. A review on the dietary flavonoid kaempferol. Mini Rev

Med Chem., v. 11, p. 298-344, 2011. CARVALHO, P. E. R. Pata-de-vaca. Circular

Técnica, Brasília: Embrapa Florestas, 2003. p. 1-12. CASSANI, J.; DORANTES-BARRÓN, A. M.; NOVALES, L. M.; REAL, G. A.; ESTRADA-REYES, R. Anti-depressant-like effect of kaempferitrin isolated from Justicia spicigera Schltdl (Acanthaceae) in two behavior models in mice: evidence for the involvement of the serotonergic system. Molecules, v. 19, n. 12, p. 21442-21461, 2014. CECHINEL-FILHO, V. Chemical composition and biological potential of plants from the genus Bauhinia. Phytother Res., v. 23, n. 10, p.1347-54, Oct. 2009. CECHINEL FILHO, V. Medicamentos de origem vegetal: atualidades, desafios e perspectivas. Itajaí: UNIVALI, 2015. 192 p.

CECHINEL-ZANCHETT, C. C. Legislação e controle de qualidade de medicamentos fitoterápicos nos países do Mercosul. Infarma, v. 28, n. 3, p. 123-139, 2016. CÉSAR MACHADO, M. C.; SILVA, F. P. Intestinal barrier dysfunction in human pathology and aging. Curr Pharm Des., v. 22, n. 30, p. 4645-4650, 2016. CHEAH, K. Y.; HOWARTH, G. S.; BASTIAN, S. E. P. Grape seed extract dose-responsively decreases disease severity in a rat model of mucositis; concomitantly enhancing chemotherapeutic effectiveness in colon cancer cells. PLoS One, v. 9, n. 1, 2014. COELHO-FERREIRA, M. Medicinal knowledge and plant utilization in an Amazonian coastal community of Marudá, Pará State (Brazil). J Ethnopharmacol., v. 126, 159-175, 2009.

115

COPPO, R. The gut–kidney axis in IgA nephropathy: role of microbiota and diet on genetic predisposition. Pediatr Nephrol., April 2017. CESTA, M. F. Normal structure, function, and histology of mucosa-associated lymphoid tissue. Toxicol Pathol., v. 35, n. 5, p. 599-608, 2006. CUPPARI, L.; SCHOR, N. Guia de Nutrição: nutrição clínica do adulto. 2. ed., Barueri: Manole, 2005. CRAGG, G. M.; NEWMAN, D. J. Biodiversidade: medicamentos ao longo de milênios. In: YUNES, R. A.; CECHINEL-FILHO, V. Química de

Produtos Naturais: novos fármacos e a moderna farmacognosia. 4 ed. Editora Univali: Itajaí, 2014, p. 58-84. DAMASCENO, D. C.; RUDGE, M. V. C. tratamento de ratas diabéticas prenhes com extrato de Bauhinia forficata (pata-de-vaca): repercussões materno-fetais. Rev. Bras. Ginecol. Obstet., v. 23, n. 2, 2001. DA SILVA, É. R.; SALMAZZO, G. R.; DA SILVA ARRIGO, J.; OLIVEIRA, R. J.; KASSUYA, C. A.; CARDOSO C. A. Anti-inflammatory evaluation and toxicological analysis of Campomanesia

xanthocarpa Berg. Inflammation, v. 39, n. 4, p. 1462-1468, 2016. DE ALENCAR, N. M.; DA SILVEIRA BITENCOURT, F.; DE FIGUEIREDO, I. S.; LUZ, P. B.; LIMA-JÚNIOR, R. C.; ARAGÃO, K. S.; MAGALHÃES, P. J.; DE CASTRO BRITO, G. A.; RIBEIRO, R. A.; DE FREITAS, A. P.; RAMOS, M. V. Side-effects of irinotecan (CPT-11), the clinically used drug for colon cancer therapy, are eliminated in experimental animals treated with latex proteins from Calotropis procera (Apocynaceae). Phytother Res., v. 31, n. 2, p. 312-330, 2017. DEL CARMEN, J. V. M.; JOSABAD, A. C. A.; GARCÍA-CARRANCÁ, A. Kaempferitrin induces immunostimulatory effects in vitro. J

Ethnopharmacol., v. 148, n. 1, p. 337-340, 2013.

DESESSO, J. M., JACOBSON, C. F. Anatomical and physiological parameters affecting gastrointestinal absorption in humans and rats. FCT, v. 39, n. 3, p. 209-228, 2001.

116

DÜSMAN, E.; ALMEIDA, I. V.; COELHO, A. C.; BALBI, T. J.; DÜSMAN-TONIN, L. T.; VICENTINI, V.E. Antimutagenic effect of medicinal plants achillea millefolium and bauhinia forficata in vivo. Evid Based Complement

Alternat Med., v. 2013, p. 1-6, 2013. DUTRA, R. C.; CAMPOS, M. M.; SANTOS, A. R. S.; CALIXTO, J. B. Medicinal plants in Brazil: pharmacological studies, drug discovery, challenges and perspectives. Pharmacol Res., v. 112, p. 4-29, 2016. ECKER, A.; VIEIRA, F. A.; PRESTES, A. S.; SANTOS, M. M.; RAMOS, A.; FERREIRA, F. D.; MACEDO, G. T.; KLIMACZEWSKI, C. V.; SEEGER, R. L.; ROCHA, J. B. T.; BARBOSA, N. B. V. Effect of syzygium cumini and Bauhinia forficat aqueous-leaf extracts on oxidative and mitochondrial parameters in vitro. EXCLI Journal, v. 14, p. 1219-1231, 2015. ESPINDOLA, P. P.; DA ROCHA, P. D. O. S. S.; CAROLLO, C. A.; SCHMITZ, W. O.; PEREIRA, Z. V.; VIEIRA, M. D. O. C.; DOS SANTOS, E. L.; DE PICOLI SOUZA, K. Antioxidant and antihyperlipidemic effects of Campomanesia adamantium O. Berg Root. Oxid Med Cell Longev., v. 2016, p. 1-8, 2016. FILYK, H. A.; OSBORNE, L. C. The Multibiome: The Intestinal Ecosystem's Influence on Immune Homeostasis, Health, and Disease. EBioMedicine, v. 13, p. 46-54, 2016. GIFONI, M. A. C. Mucosite e alterações de permeabilidade intestinal em

pacientes portadores de câncer colorretal metastático tratados com 5-

fluorouracil (5-FU) e irinotecano (CPT-11). 2012. 98f. Tese (Doutorado em Farmacologia) - Programa de Pós-Graduação Interinstitucional – DINTER em Oncologia da Fundação Antônio Prudente em Parceria com a Escola Cearense de Oncologia, Fortaleza. 2012. GOBBO-NETO, L.; LOPES, N. P. Plantas medicinais: fatores de influência no conteúdo de metabólitos secundários. Quim. Nova, v. 30, n. 2, p. 374-381, 2007.

117

GÓMEZ-ZORITA, S.; FERNÁNDEZ-QUINTELA, A.; MACARULLA, M. T.; AGUIRRE, L.; HIJONA, E.; BUJANDA, L.; MILAGRO, F.; MARTÍNEZ, J. A.; PORTILLO, M. P. Resveratrol attenuates steatosis in obese Zucker rats by decreasing fatty acid availability and reducing oxidative stress. Br. J. Nutr., v. 107, n. 2, p. 202-210, 2012. GONZÁLEZ-MARISCAL, L.; BETANZOS, A.; NAVA, P.; JARAMILLO, B. E. Tight junction proteins. Prog. Biophys. Mol. Biol., v. 81, p. 1-44, 2003. GOU, H.; GU, L.; SHANG, B. Z.; XIONG, Y.; WANG, C. Protective effect of Bu-Zhong-Yi-Qi decoction, the water extract of chinese traditional herbal medicine, on 5-fluorouracil-induced intestinal mucositis in mice. Hum Exp

Toxicol., v. 35, n. 12, p. 1243-1251, 2016. GOYA, L.; MARTÍN, M. A.; SARRIÁ, B.; RAMOS, S.; MATEOS, R.; BRAVO, L. Effect of cocoa and its flavonoids on biomarkers of inflammation: studies of cell culture, animals and humans. Nutrients, v. 8, n. 4, p. 212, 2016. GULGUN, M.; ERDEM, O.; OZTAS, E.; KESIK, V.; BALAMTEKIN, N.; VURUCU, S.; KUL, M.; KISMET, E.; KOSEOGLU, V. Proanthocyanidin prevents methotrexate-induced intestinal damage and oxidative stress. Exp

Toxicol Pathol., v. 62, n. 2, p. 109-115, 2010. HÅKANSSON, A.; BRÄNNING, C.; MOLIN, G.; ADAWI, D.; HAGSLÄTT, M. L.; JEPPSSON, B.; NYMAN, M.; AHRNÉ, S. Blueberry husks and probiotics attenuate colorectal inflammation and oncogenesis, and liver injuries in rats exposed to cycling DSS-treatment. PLoS One, v. 7, n. 3, 2012. HALL, J. E; GUYTON, A. C. Guyton & Hall: fundamentos de fisiologia. 12. ed. Rio de Janeiro: Elsevier, 2012. HARVEY, A. L.; EDRADA-EBEL, R. A.; QUINN, R. J. The re-emergence of natural products for drug discovery in the genomics era. Nat. Rev., v. 14, p. 111-129, 2015.

118

HECHT, J. R. Gastrointestinal toxicity or irinotecan. Oncology, v. 12, n. 6, p. 72-78, 1998. HELLER, M.; DAL BOSCO, S. M.; REMPEL, C.; MOREIRA, T. R. Variações metabólicas em indivíduos em utilização de Bauhinia forficata.

ConScientiae Saúde, v. 12, n. 3, p. 419-425., 2013. HODZIC, Z.; BOLOCK, A. M.; GOOD, M. The Role of Mucosal Immunity in the Pathogenesis of Necrotizing Enterocolitis. Front Pediatr., v. 5, n. 40, 2017.

IVEY, K. L.; HODGSON, J. M.; CROFT, K. D.; LEWIS, J. R.; PRINCE, R. L. Flavonoid intake and all-cause mortality. Am. J. Clin. Nutr., n. 101, p. 1012-1020, 2015. JORGE, A. P.; HORSTB, H.; SOUSAB, E.; PIZZOLATTI, M. G.; SILVA, F. R. M. B. Insulinomimetic effects of kaempferitrin on glycaemia and on 14C-glucose uptake in rat soleus muscle. Chem. Biol. Interac., v. 149, 89–96, 2004. JULIANE, C. Ação hipoglicemiante da unha-de-vaca. Rev. Med. Pharm.

Chem. Phys., v. 2, p. 165-169, 1929. JUSTINO, P. F.; MELO, L. F.; NOGUEIRA, A. F.; MORAIS, C. M.; MENDES, W. O.; FRANCO, A. X.; SOUZA, E. P.; RIBEIRO, R. A.; SOUZA, M. H.; SOARES, P. M. Regulatory role of Lactobacillus

acidophilus on inflammation and gastric dysmotility in intestinal mucositis induced by 5-fluorouracil in mice. Cancer. Chemother. Pharmacol., v. 75, n. 3, p. 559-567, Mar. 2015. KATO, S.; HAYASHI, S.; KITAHARA, Y.; NAGASAWA, K.; AONO, H.; SHIBATA, J.; UTSUMI, D.; AMAGASE, K.; KADOWAKI, M. Saireito (TJ-114), a japanese traditional herbal medicine, reduces 5-fluorouracil-induced intestinal mucositis in mice by inhibiting cytokine-mediated apoptosis in intestinal crypt cells. PLoS ONE, v.10, n. 1, p. 1-15, 2015.

119

KEEFE, D. M.; SCHUBERT, M. M.; ELTING, L. S.; SONIS, S. T.; EPSTEIN, J. B.; RABER-DURLACHER, J. E.; MIGLIORATI, C. A.; MCGUIRE, D. B.; HUTCHINS, R. D.; PETERSON, D. E. Updated clinical practice guidelines for the prevention and treatment of mucositis. Cancer, v. 109, n. 5, p. 820–831, March 2007. KELLY, J. R.; KENNEDY, P. J.; CRYAN, J. F.; DINAN, T. G.; CLARKE, G.; HYLAND, N. P. Breaking down the barriers: the gut microbiome, intestinal permeability and stress-related psychiatric disorders. Front Cell Neurosci.,

v. 9, p. 392, 2015. KELNER, N.; CASTRO, J. F. L. Laser de baixa intensidade no tratamento da mucosite oral induzida pela radioterapia: relato de casos clínicos. Rev.

Bras. Cancerol., v. 53, n. 1, p. 29-33, 2007.

KIM, S. H.; PARK, J. G.; SUNG, G. H.; YANG, S.; YANG, W. S.; KIM, E.; KIM, J. H.; HA, V. T.; KIM, H. G.; YI, Y. S.; KIM, J. H.; BAEK, K. S.; SUNG, N. Y.; LEE, M. N.; KIM, J. H.; CHO, J. Y. Kaempferol, a dietary flavonoid, ameliorates acute inflammatory and nociceptive symptoms in gastritis, pancreatitis, and abdominal pain. Mol Nutr Food Res., v. 59, n. 7, p. 1400-1405, 2015. KISSOW, H. Glucagon-like peptides 1 and 2: intestinal hormones implicated in the pathophysiology of mucositis. Curr. Opin. Support. Palliat.

Care, v. 9, n. 2, p. 196-202, Jun. 2015. KOLLI, V. K.; KANAKASABAPATHY, I.; FAITH, M.; RAMAMOORTHY, H.; ISAAC, B.; NATARAJAN, K.; ABRAHAM, P. A preclinical study on the protective effect of melatonin against methotrexate-induced small intestinal damage: effect mediated by attenuation of nitrosative stress, protein tyrosine nitration, and PARP activation. Cancer Chemother.

Pharmacol., v. 71, n. 5, p. 1209-1218, May 2013. KREMER, D. W.; SILVA-FILHO, J. A utilização da planta medicinal “pata

de vaca”- Bauhinia forficata como complemento do paciente portador de

diabetes mellitus tipo 2. 2008. 82 f. Monografia (Conclusão de Curso) -

120

Curso de Enfermagem, Universidade do Vale do Itajaí – Univali, Biguaçu. 2008. KUIKEN, N. S.; RINGS, E. H.; TISSING, W. J. Risk analysis, diagnosis and management of gastrointestinal mucositis in pediatric cancer patients. Crit.

Rev. Oncol. Hematol., v. 94, n. 1, p. 87-97, Apr. 2015. KUPPUSAMY, P.; YUSOFF, M. M.; PARINE, N. R.; GOVINDAN, N. Evaluation of in-vitro antioxidant and antibacterial properties of Commelina nudiflora L. extracts prepared by different polar solventes. Saudi J Biol Sci., n. 22, p. 293-301, 2015. KURITA, A.; KADO, S.; KANEDA, N.; ONOUE, M.; HASHIMOTO, S.; YOKOKURA, T. Modified irinotecan hydrochloloride (CPT-11) administration schedule improves induction of delayed-onset diarrhea in rats. Cancer Chemother. Pharmacol., v. 46, p. 211-220, 2000. LEITÃO, F.; LEITÃO, S. G.; FONSECA-KRUEL, V. S.; SILVA, I. M.; MARTINS, K. Medicinal plants traded in the open-air markets in the State of Rio de Janeiro, Brazil: an overview on their botanical diversity and toxicological potential. Rev Bras Farmacogn., v. 24, p. 225-247, 2014. LESCANO, C. H.; DE OLIVEIRA, I. P.; ZAMINELLI, T.; BALDIVIA, D. D.; DA SILVA, L. R.; NAPOLITANO, M.; SILVÉRIO, C. B.; LINCOPAN, N.; SANJINEZ-ARGANDOÑA, E. J. Campomanesia adamantium peel extract in antidiarrheal activity: the ability of inhibition of heat-stable enterotoxin by polyphenols. PLoS One., v. 11, n. 10, 2016. LIMA JÚNIOR, R. C. P. Estudo morfofuncional e dos mediadores

inflamatórios envolvidos na patogênese da mucosite intestinal induzida por

Irinotecano (CPT- 11) em camundongos: papel da caspase-1, interleucina-

18 e óxido nítrico. 2008. 200 f. Tese (Doutorado em Farmacologia) - Programa de Pós- Graduação em Farmacologia, Universidade Federal do Ceará, Fortaleza. 2008.

121

LIMA, J. S. S.; CASTRO, J. M. C.; SABINO, L. B. S.; LIMA, A. C. S.; TORRES, L. B. V. Physicochemical properties of gabiroba (Campomanesia

lineatifolia) and myrtle (Blepharocalyx salicifolius ) native to the mountainous region of Ibiapaba-CE, Brazil. Rev. Caatinga, v. 29, n. 3, 2016. LOGAN, R. M.; STRINGER, A. M.; BOWEN, J. M.; YEOH, A. S. J.; GIBSON, R. J.; SONIS, S. T.; KEEFE, D. M. The role of pro-inflammatory cytokines in cancer treatment-induced alimentary tract mucositis: pathobiology, animal models and cytotoxic drugs. Cancer Treat. Rev., v. 33, n. 5, p. 448-460, 2007. LOPES, L. V.; KUSSMANN, M. Proteomics at the interface of psychology, gut physiology and dysfunction: an underexploited approach that deserves expansion. Expert Rev Proteomics., v. 8, n. 5, p. 605-614, 2011. LOURENÇO, A. R. L.; BARBOSA, M. R. V. Myrtaceae em restingas no limite norte de distribuição da Mata Atlântica, Brasil. Rodriguésia, v. 63, n. 2, p. 373-393, 2012. MACIEL; M. A. M.; PINTO, A. C.; VEIGA-JUNIOR, V. F. Plantas medicinais: a necessidade de estudos multidisciplinares. Quim. Nova, v. 25, n. 3, p. 429-438, 2002. MALHEIROS, A.; BITTENCOURT, C. M. S.; NIERO, R.; CECHINEL-FILHO, V. Considerações gerais sobre aspectos químicos e biológicos de plantas medicinais. In: BRESOLIN, T. M. B.; CECHINEL-FILHO, V. Fármacos e Medicamentos, uma Abordagem Multidisciplinar. São Paulo: Santos, 2010. p. 17-44. MARIÁNGEL, C.; AVELLO-LORCA, M. A.; FERNANDES, P.; VILLA, L. Evaluation of the hypoglycemic effect of Bauhinia forficata in patients with

poorly controlled diabetes. 16th International Scientific Congress CNIC'2015. Available in: http://revista.cnic.edu.cu/revistaCB/sites/default/files/articulos/Productos%20Naturales.pdf

122

MARIÁNGEL, C.; MONSERRAT, P. Evaluación del efecto hipoglicemiante de Bauhinia forficata Link en pacientes diabéticos descompensados. 2016. 101 f. Tesis (Magister en Ciencias Farmacéuticas) - Programa de Magister en Ciencias Farmacéuticas, Dirección de Postgrado Facultad de Farmacia, Universidad de Concepción, Concepción, Chile. 2016. MARSTON, A.; HOSTETTMANN, K. Natural products analysis over the last decades. Planta Med., v. 75, p. 672-682, 2009.

MARTELLO, M. D.; DAVID, N.; MATUO, R.; CARVALHO, P. C.; NAVARRO, S. D.; MONREAL, A. C.; CUNHA-LAURA, A. L.; CARDOSO, C. A.; KASSUYA, C. A.; OLIVEIRA, R. J. Campomanesia adamantium extract induces DNA damage, apoptosis, and affects cyclophosphamide metabolism. Genet Mol Res., v. 15, n. 2, 2016. MAZZEO, G. C. C.; SILVA, M. P. O.; GUIMARÃES, L. L.; BRITO, A. R. M. S.; TOMA W. Evaluation of anti-ulcerogenic activity in an Aqueous Extract obtained from Bauhinia forficata leaves. Rev Ciênc Farm Básica Apl., v. 36, n. 1, p. 21-26, 2015. MCCHESNEY, J. D.; COOPER, R.; VOUGHT, K. Phytoterapeutics: intellectual property rights, global market, and global regulatory guidelines. In: CECHINEL-FILHO, V. Plant bioactives and drug discovery: principle,

practice and perspectives. New Jersey: Wiley, 2012. p. 499-527. MEDA, A.; LAMIEN, C. .; ROMITO, M.; MILLOGO, J.; NACUOLMA, O. G. Determination of the total phenolic, flavonoid and proline contents in Burkin Fasan honey as well as their radical scavenging activity. Food Chemistry, v. 91, n. 3, p. 571-577, 2005. MELO, A. T. Efeitos da imunomodulação em animais sobreviventes de

Sepse grave sobre as alterações inflamatórias observadas na mucosite

intestinal induzida por Irinotecano. 2014. 88f. Dissertação (Mestrado em Farmacologia) – Faculdade de Medicina, Universidade Federal do Ceará, Fortaleza. 2014.

123

MELO, G. O.; MALVAR, D. C.; VANDERLINDE, F. A.; ROCHA, F. F.; PIRES, P. A.; COSTA, E. A.; MATOS, L. G.; KAISER, C. R.; COSTA, S. S. Antinociceptive and anti-inflammatory kaempferol glycosides from Sedum

dendroideum. J Ethnopharmacol., v. 124, n. 2, p. 228-232, 2009. MICELI, N.; BUONGIORNO, L. P.; CELI, M. G.; CACCIOLA, F.; DUGO, P.; DONATO, P.; MONDELLO, L.; BONACCORSI, I.; TAVIANO, M. F. Role of the flavonoid-rich fraction in the antioxidant and cytotoxic activitiesof Bauhinia forficata Link. (Fabaceae) leaves extract. Nat Prod Res., v. 30, n. 11, 2016. MISHRA, A.; SETH, A.; MAURYA, S. K. Therapeutic significance and pharmacological activities of antidiarrheal medicinal plants mention in ayurveda: a review. J Intercult Ethnopharmacol., v. 5, n. 3, p. 290-307, 2016. MORAES, A. C. F.; SILVA, I. T.; ALMEIDA-PIPITTO, B.; FERREIRA, S. R. G. Microbiota intestinal e risco cardiometabólico: mecanismos e modulação dietética. Arq Bras Endocrinol Metab., v. 58, n. 4, 2014. MOTA, K. S. L.; DIAS, G. E. N.; PINTO, M. E. F.; LUIS-FERREIRA, A.; SOUZA-BRITO, A. R. M.; HIRUMA-LIMA, C. A.; BARBOSA-FILHO, J. M.; BATISTA, L. M. Flavonoids with gastroprotective activity. Molecules, v. 14, p. 979-1012, 2009.

MUSCHIETTI, L. V.; MARTINO, V. S. Actividades biológicas de los flavonoides naturales. In: YUNES, R. A.; CECHINEL-FILHO, V. (Orgs.) Química de produtos naturais: novos fármacos e a moderna farmacognosia. Itajaí: Univali, 2014. p. 207-249. MYERS, R. B.; FREDENBURGH, J. L.; GRIZZLE, W. E. Carbohydrates. In: BANCROFT, J. D.; GAMBLE, M. (Eds.), Theory and practice of histological

techniques, Churchill Livingstone Elsevier: Philadelphia, USA, 2008. p. 161-186. NAKAO, T.; KURITA, N.; KOMATSU, M.; YOSHIKAWA, K.; IWATA, T.; UTUSNOMIYA, T.; SHIMADA, M. Irinotecan injures tight junction and

124

causes bacterial translocation in rat. J Surg Res., v. 173, n. 2, p. 341-347, 2012. NASCIMENTO, T. G. Neutropenia e qualidade de vida em mulheres com

câncer de mama durante o tratamento quimioterápico. 2012. 76 f. Dissertação (Mestrado em Saúde Pública) - Programa de Pós Graduação em Saúde Pública, Universidade de São Paulo, Ribeirão Preto. 2012. NEMMICHE, S. Oxidative signaling response to cadmium exposure. Toxicol Sci., in press, Nov. 2016. NESELLO, L. A. N. Avaliação fitoquímica e farmacológica de plantas

frutíferas silvestres selecionadas da flora catarinense. 2015. 148 f. Tese (Doutorado em Ciências Farmacêuticas) - Programa de Pós Graduação em Ciências Farmacêuticas, Universidade do Vale do Itajaí, Itajaí. 2015.

NESELLO, L. A.; CAMPOS, A.; WAGNER, T.; FELICIANO, A. S.;DE CAMPOS BUZZI F.; CECHINEL FILHO, V. Chemical composition and antinociceptive potential of Campomanesia reitziana fruits. J Med Food., v. 19, n. 5, p. 518-520, 2016. NEWMAN, D. J.; CRAGG, G. M. Natural Products as Sources of New Drugs from 1981 to 2014. Nat. Prod., v. 79, n. 3, p. 629-661, 2016. OLIVEIRA, H. S. D.; BONETI, R. S.; PIZZATO, A. C. Imunonutrição e o tratamento do câncer. Ciência&Saúde, v. 3, n. 2, p. 59-64, Jul./Dez. 2010. PEREIRA, A.C.S.; RIBEIRO, G.E.; SOUZA, L.C.R.; RUFINO, L.R.A.;CABRAL, I.S.R.; BORIOLLO, M.F.G.; NOGUEIRA,D.A.; OLIVEIRA, N.M.S.; FIORINI, J.E. Atividade biológica do extrato hidroalcoólico de Bauhinia forficata Link sobre Herpetomonas

samuelpessoai (Galvão.) Roitman. Rev. Bras. Pl. Med., Campinas, v.16, n.3, p.585-592, 2014. PÉREZ-CANO, F. J.; CASTELL, M. Flavonoids, inflammation and immune system. Nutrients, v. 8, n. 10, p. 659, 2016.

125

PFIZER. Campostar – cloridrato de irinotecano tri-hidratado. 2014. Disponível em: <http://www.pfizer.com.br/sites/g/files/g10032841/f/product_attachments/Camptosar_PS.pdf>. Acesso em: 07 fev. 2017. PROGRESS IN DRUG RESEARCH. Anti-diarrhoeal Activity. Prog. Drug.

Res., v. 71, p. 129-130, 2016. QUIGLEY, E. M. Gut microbiome as a clinical tool in gastrointestinal disease management: are we there yet? Nat Rev Gastroenterol Hepatol., in press, 2017. QUINTÃO, N. L.; MEDEIROS, R.; SANTOS, A. R.; CAMPOS, M. M.; CALIXTO, J. B. The effects of diacerhein on mechanical allodynia in inflammatory and neuropatic models of nociception in mice. Anesth. Analg., v. 101, p. 1763-1769, 2005.

RICE-EVANS, C. Flavonoid antioxidants. Curr. Med. Chem., v. 8, p. 797-807, 2001. RIBEIRO, R. A.; WANDERLEY, C. W.; WONG, D. V.; MOTA, J. M.; LEITE, C. A.; SOUZA, M. H.; CUNHA, F. Q.; LIMA-JÚNIOR, R. C. Irinotecan- and 5-fluorouracil-induced intestinal mucositis: insights into pathogenesis and therapeutic perspectives. Cancer Chemother Pharmacol. , v. 78, n. 5, p. 881-893, 2016. REINKE, D.; KRITAS, S.; POLYCHRONOPOULOS, P.; SKALTSOUNIS, A. L.; ALIGIANNIS, N.; TRAIN, C. D. Herbal substance, acteoside, alleviates intestinal mucositis in mice. Gastroenterol. Res. Pract., p. 1-9, 2015. REMPEL, E. A.; PÉRICO, E.; STROHSCHOEN, A. A. G. Avaliação do perfil glicêmico de portadores de diabetes mellitus tipo II em UBS que utilizam infusão de folhas de Bauhinia forficata Link. Conscientiae Saúde, v. 9, p. 569-574, 2010.

126

REYNELL, P.C., SPRAY, G.H. Chemical gastroenteritis in the rat. Gastroenterology, v. 34, p. 867–873, 1958. ROSÁRIO-NETO, O.; COUTO, A.G.; BÜRGER, C. Desenvolvimento de

extratos secos de Campomanesia reitziana para avaliação da influência

no ganho de peso corporal, consumo alimentar e parâmetros bioquímicos

em camundongos C57BL/6J. 2012. 79 f. Dissertação (Mestrado em Ciências Farmacêuticas) - Programa de Pós Graduação em Ciências Farmacêuticas, Universidade do Vale do Itajaí – UNIVALI, Itajaí, 2012. SALGUEIRO, A. C. F.; FILMER, V.; SILVA, M. P.; MENDEZ, A. S. L.; ZEMOLIN, A. P. P.; POSSER, T.; FRANCO, J. L.; PUNTEL, R. L.; PUNTEL, G. O. Effects of Bauhinia forficata tea on oxidative stress and liver damage in diabetic mice. Oxid Med Cell Longev., v. 2016, p. 1-9, 2016. SANTOS-FILHO, E. X. Efeitos da formulação mucoadesiva com extrato de

Curcuma longa L. em animais portadores de mucosite intestinal induzida

por 5-fluorouracil. 2014. 90 f. Dissertação (Mestrado em Ciências Farmacêuticas) - Programa de Pós-graduação em Ciências Farmacêuticas, Universidade Federal de Goiás, Goiânia. 2014. SANTOS, M. S.; LIMA, J. J.; PETKOWICZM C. L. O.; CANDIDO, L. M. B. Chemical characterization and evaluation of the antioxidant potential of gabiroba jam (Campomanesia xanthocarpa Berg). Acta Sci. Agron., v. 35, n.1, 2013. SEDLAK, J.; LINDSAY, R. H. Estimation of total, protein-bound, and nonprotein sulfhydryl groups in tissue with Ellman’s reagent. Analyt.

Biochem., v. 25, n. 1, p. 192-205, 1968. SELLERS, R. S.; MORTON, D.; MICHAEL, B.; ROOME, N.; JOHNSON, J. K.; YANO, B. L.; PERRY, R.; SCHAFER, K. regulatory forum society of toxicologic pathology position paper: organ weight recommendations for toxicology studies . Toxicol. Pathol., v. 35, p. 751–755, 2007.

127

SHI, C. J.; WEN, X. S.; GAO, H. F.; LIU, Z. H.; XU, X. K.; LI, L. F.; SHEN, T.; XIAN, C.J. Steamed root of Rehmannia glutinosa Libosch (Plantaginaceae) alleviates methotrexate-induced intestinalmucositis in rats. J. Ethnopharmacol., v. 183, p. 143-150, 2016. SILVA, C. T.; JASIULIONIS, M. G. Relação entre estresse oxidativo, alterações epigenéticas e câncer. Cienc. Cult., v. 66, n.1, p. 38-42, 2014. SILVA, K. L.; BIAVATTI, M. W.; LEITE, S. N.; YUNES, R. A.; DELLE MONACHE, F.; CECHINEL FILHO, V. Phytochemical and pharmacognostic investigation of Bauhinia forficata Link (Leguminosae). Z

Naturforsch., v. 55, 478-480, 2000. SILVA, K. L.; CECHINEL-FILHO, V. Plantas do gênero Bauhinia: composição química e potencial farmacológico. Quím. Nova, v. 25, n. 3, 2002. SILVA, M. I. G.; MELO, C. T. V.; VASCONCELOS, L. F.; CARVALHO, A. M. R.; SOUSA, F. C.F F. Bioactivity and potential therapeutic benefits of some medicinal plants from the Caatinga (semi-arid) vegetation of Northeast Brazil: a review of the literature. Rev. Bras. Farmacogn., v. 22, n. 1, p. 193-207, 2012. SOARES, P. M. G.; MOTA, J. M. S. C.; GOMES, A. S.; OLIVEIRA, R. B.; ASSREUY, A. M. S.; BRITO, G. A. C.; SANTOS, A. A.; RIVEIRO, R. A.; SOUZA, M. H. L. P. Gastrointestinal dysmotility in 5-Fluorouracil-induced intestinal mucositis outlasts inflammatory process resolution. Cancer

Chemother Pharmacol., v. 63, p. 91-98, 2008.

SONIS, S. T.; ELTING, L. S.; KEEFE, D.; PETERSON, D. E.; SCHUBERT, M.; HAUER-JENSEN, M.; BEKELE, B. N.; RABER-DURLACHER, J.; DONNELLY, J. P.; RUBENSTEIN, E. B. perspectives on cancer therapy-induced mucosal injury: pathogenesis, measurement, epidemiology, and consequences for patients. Cancer Treat. Rev., v. 100, n. 9, p. 1995-2025, May 2004. SONG, M.; BAIK, H. W.; HONG, S. G.; SUNG, M. K. Wheat bran arabinoxylan supplementation alleviates 5-fluorouracil induced mucositis

128

and myelosuppression in BALB/c mice. J. Funct. Foods, v. 21, p. 312-320, 2016. STRINGER, A. M. Interaction between host cells and microbes in chemotherapy-induced mucositis. Nutrients, v. 5, n. 5, p. 1488-1499, 2013. SULTANI, M.; STRINGER, A. M.; BOWEN, J. M.; GIBSON, R. J. Anti-inflammatory cytokines: important immunoregulatory factors contributing to chemotherapy-induced gastrointestinal mucositis. Chemother. Res. Pract., p. 1-11, 2012. TANG, Y.; WU, Y.; HUANG, Z.; DONG, W.; DENG, Y.; WANG, F.; LI, M.; YUAN, J. Administration of probiotic mixture DM#1 ameliorated 5-fluorouracil–induced intestinal mucositis and dysbiosis in rats. Nutrition, v. 33, p. 96-104, 2017. TORKAMANI, A. Irinotecan toxicity and UGT1A. Medscape, 2015. Disponível em: <http://emedicine.medscape.com/article/1790367-overview>. Acesso em: 15 nov. 2016. UMEGAKI, E.; YODA, Y.; TOKIOKA, S.; MURANO, M.; HIGUCHI, K. Protective effect of roxatidine against indomethacin-induced small intestinal mucosal injury in rats. J Gastroenterol. Hepatol., v. 25, p. S35-S40, May 2010. UGAZ, O. L. Investigación Fitoquímica. Pontificia. Peru: Universidad Catolica del Peru, 1994. VASSEM, L. M.; BARBOZA, J. D. B.; SILVA, V. R. Análise do perfil hematológico em pacientes neoplásicos submetidos a tratamento quimioterápico de uma clínica oncológica do município de Lages/SC. Rev.

Uniplac, 2013. Disponível em:< http://www.revistauniplac.net/ojs/index.php /uniplac/article/view/440>. Acesso em: 31 jan. 2015. VIEGAS-JÚNIOR, C.; BOLZANI, V. S.; BARREIRO, E. J. Os produtos naturais e a química medicinal moderna. Quím. Nova, v. 29, n. 2, Mar./Apr. 2006.

129

WANG, Y.; LI, J. Y.; HAN, M.; WANG, W. L.; LI, Y. Z. Prevention and treatment effect of total flavonoids in Stellera chamaejasme L. on nonalcoholic fatty liver in rats. Lipids Health Dis., v. 14, n. 85, 2015. WARDILL, H. R.; BOWEN, J. M.; AL-DASOOGI, N.; SULTANI, M.; BATEMAN, E.; STANSBOROUGH, R.; SHIRREN, J.; GIBSON, R.J. Irinotecan disrupts tight junction proteins within the gut : implications for chemotherapy-induced gut toxicity. Cancer Biol. Ther., v. 15, n. 2, p. 236-244, Feb. 2014. WGO - ORGANIZAÇÃO MUNDIAL DE GASTROENTEROLOGIA. Guias Mundiais da WGO. Probióticos e Prebióticos. Outubro, 2011. Disponível em: <http://www.worldgastroenterology.org/assets/export/userfiles/Probiotics_FINAL_pt_2012.pdf>. Acesso em: 26 maio 2015. WONG, D. V. T. Mediação dos receptores TLR2, NOD1, e da proteína

adaptadora MyD88 na modulação da mucosite intestinal induzida pelo

irinotecano. 2013. 198 f. Tese (Doutorado em Farmacologia) – Programa de Pós graduação em Farmacologia, Departamento de Fisiologia e Farmacologia, Universidade Federal do Ceará, Fortaleza. 2013. YANG, X. W.; ZHANG, J. Y.; XU, W.; LI, J.; ZHANG, W. Q. The biotransformation of kaempferitrin by human intestinal flora. Yao Xue Xue

Bao., v. 40, n. 8, p. 717-721, 2005. YEUNG C. H.; CHAN, W. T.; JIANG, C. B.; CHENG, M. L.; LIU, C. Y.; CHANG, S. W.; CHIAU, J. S. C.; LEE, H. C. amelioration of chemotherapy-induced intestinal mucositis by orally administered probiotics in a mouse model. PLoS ONE, v. 10, n. 9, p. 1-16, 2015. YOUNG, J. B. L. M.; KHEIFETS, S. J.; BALLARON, J. M.; YOUNG, J. M. Edema and cell infiltration in the phorbol ester-treated mouse ear are temporally separate and can be differentially modulated by pharmacologic agents. Agents Actions, v. 26, n. 3-4, p. 335–341, 1989.

130

ZACCARON, C.; REMPEL, C.; STROHSCHOEN, A. A. G.; DAL BOSCO, S. M.; MORESCHI, C. Efeito da planta medicinal Bauhinia forficata (Link) nos indivíduos diabéticos tipo 2. ConScientiae Saúde, v. 13, n. 2, p. 171-178, 2014. ZHAO, S.; LI, X.; CHO, D. H.; ARASU, M. V.; AL-DHABI, N. A.; PARK, S. U. Accumulation of kaempferitrin and expression of phenyl-propanoid biosynthetic genes in kenaf (Hibiscus cannabinus). Molecules, v. 19, n. 10, p. 16987-16997, 2014.

131

ANEXO 1 – Parecer CEUA

UNIVERSIDADE DO VALE DO ITAJAÍsiaibib01.univali.br/pdf/Camile Cecconi Cechinel Zanchett.pdf · 1...

Documents

Transcript of UNIVERSIDADE DO VALE DO ITAJAÍsiaibib01.univali.br/pdf/Camile Cecconi Cechinel Zanchett.pdf · 1...