UNIVERSIDADE DO ESTADO DO AMAZONAS FUNDAÇÃO DE MEDICINA TROPICAL DO AMAZONAS

PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM MEDICINA TROPICAL MESTRADO EM DOENÇAS TROPICAIS E INFECCIOSAS

CARACTERIZAÇÃO MOLECULAR DO VÍRUS DA HEPATITE B (VHB) EM PORTADORES DE ÁREA ENDÊMICA NA AMAZÔNIA OCIDENTAL BRASILEIRA

ÁDILA LILIANE BARROS DIAS

MANAUS 2009

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ÁDILA LILIANE BARROS DIAS

CARACTERIZAÇÃO MOLECULAR DO VÍRUS DA HEPATITE B (VHB) EM PORTADORES DE ÁREA ENDÊMICA NA AMAZÔNIA OCIDENTAL BRASILEIRA

Dissertação apresentada ao Programa de Pós-Graduação em Medicina Tropical da Universidade do Estado do Amazonas em Convênio com a Fundação de Medicina Tropical do Amazonas, para obtenção do grau de Mestre em Doenças Tropicais e Infecciosas.

Orientador: Prof. Dr Wornei Silva Miranda Braga Co-Orientadora: Profa. Dra. Cintia Mara Costa de Oliveira

MANAUS 2009

FICHA CATALOGRÁFICA

Dias, Ádila Liliane Barros Dias

Caracterização molecular do vírus da Hepatite B (VHB) em portadores de área endêmica na Amazônia Ocidental Brasileira. Ádila Liliane Barros Dias. - Manaus, 2009. ix, 53f.

Dissertação de Mestrado – Universidade do Estado do Amazonas. Fundação de Medicina Tropical. Programa de Pós-graduação em Medicina Tropical.

Título em inglês: Characterization of the hepatitis B Virus in patients from an endemic area of the West Brazilian Amazon.

1. VHB. 2. Genótipos. 3. Epidemiologia. 4. Amazônia. 5. Brasil.

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FOLHA DE JULGAMENTO

CARACTERIZAÇÃO MOLECULAR DO VHB EM AMOSTRAS DE

PORTADORES DO MUNICÍPIO DE LÁBREA

ÁDILA LILIANE BARROS DIAS “Esta Dissertação foi julgada adequada para obtenção do Título de Mestre em Doenças Tropicais e Infecciosas, aprovada em sua forma final pelo Programa de Pós-Graduação em Medicina Tropical da Universidade do Estado do Amazonas em convênio com a Fundação de Medicina Tropical do Amazonas”.

Banca Julgadora:

_______________________________ Prof. Wornei Silva Miranda Braga, Dr

Presidente

________________________________ Profª. Maria Paula Gomes Mourão, Dra

Membro

_____________________________ Prof. Cristóvão Alves da Costa, Dr

Membro

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AGRADECIMENTOS

A Deus por ter me dado forças para conseguir chegar até o final.

Ao meu esposo, Vanderson Sampaio, pelo apoio incondicional, pela

compreensão e pelo companheirismo. Ao meu filho, Gabriel Sampaio, que mesmo

pequeno e sem ter conhecimento me motivou e me vivificou com cada sorriso.

Aos meus pais, Lacy Dias e José Antônio Dias que puderam me proporcionar

uma base educacional, necessária para ter chegado aqui.

As minhas irmãs, Luanna Dias e Letícia Dias, pelo incentivo mesmo a

distância.

Ao meu orientador, Dr. Wornei Braga, pela oportunidade e confiança dada a

minha pessoa me proporcionando a chance de poder realizar este trabalho.

A Márcia Castilho e a Dra. Cintia Mara, por terem me ensinado e me ajudado

com as técnicas de Biologia Molecular, pela amizade e pelo apoio.

Ao Dr. Henrique que me auxiliou nos momentos de dúvidas e desesperos.

Aos colegas de laboratório pela ajuda, amizade e pelos momentos de

descontração.

Aos meus amigos de mestrado, em especial, Belisa Magalhães, Gisely

Cardoso, Laylah Magalhães, Suzane Prestes e Marly Marques, pela amizade,

carinho, companheirismo e pelo apoio.

Aos professores e a equipe da coordenação do Curso de Mestrado em

Doenças Tropicais e Infecciosas, da Universidade do Estado do Amazonas e

Fundação de Medicina Tropical do Amazonas, uma pós-graduação que a cada ano vem se aprimorando.

As instituições de fomento, CNPq e FAPEAM, as quais proporcionaram a

realização deste trabalho.

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RESUMO

A infecção pelo vírus da hepatite B (VHB) é um importante problema de saúde pública no mundo. O VHB é classificado em oito genótipos diferentes, A-H, com distinta distribuição geográfica. No Brasil os genótipos mais freqüentes são o A, D e F. Objetivo deste estudo foi caracterizar os genótipos do VHB em região endêmica de infecção pelos vírus das hepatites B e Delta na Amazônia Ocidental Brasileira. Foram analisadas 86 amostras soro reativas para o HBsAg de indivíduos indígenas e não-indígenas, obtidas de inquéritos sorológicos realizados no município de Lábrea, Estado do Amazonas. Das 86 amostras soro reativas 39 foram VHB-DNA positivas pela semi-“nested” PCR. Os genótipos foram estabelecidos pelo seqüenciamento da região do gene S amplificado. Foram obtidas 20 seqüências, classificada em três genótipos A, D e F. Sendo o genótipo A o mais freqüente (60%), seguido do D (35%) e F(5%). O perfil de distribuição dos genótipos encontrados reflete o padrão de ocupação histórica da região.

Palavra-chave: VHB, genótipos, epidemiologia, Amazônia, Brasil.

v

ABSTRACT

Hepatitis B virus (HBV) infection is an important public health problem in the world. HBV is classified into eight genotypes, varying from A to H, with distinct geographical distribution. In Brazil, the most frequent genotypes are A, D and F. The purpose of this study, was to characterize the genotypes of HBV in a hepatitis B and Delta endemic area in the Western Brazilian Amazon. We analyzed 86 serum samples reactive for HBsAg of indigenous and non-indigenous, obtained from serological surveys conducted in the Lábrea municipality, Western State of Amazonas. From the 86 reactive serum samples, 39 were HBV-DNA positive by semi-nested PCR. Genotypes were established by sequencing the S gene region amplified. We obtained 20 sequences, classified into three genotypes A, D and F. The genotype A was the most frequent (60%), followed by D (35%) and F (5%). The distribution profile of the genotypes found reflect the pattern of historical occupation of the region. Keyword: HBV genotypes, epidemiology, Amazon, Brazil.

vi

LISTA DE FIGURAS

Figura 1: Prevalência da VHB no mundo......................................................... Figura 2: Mapa mostrando a distribuição da hepatite B no Brasil.................... Figura 3: Partículas virais do VHB................................................................... Figura 4: Desenho esquemático do genoma do VHB...................................... Figura 5: Esquema da replicação do vírus da hepatite nos hepatócitos......... Figura 6: Esquema da replicação do vírus da hepatite nos hepatócitos......... Figura 7: Figura 5: Mapa do município de Lábrea........................................... Figura 1: Mapa da área de estudo................................................................... Figura 2: Árvore filogenética............................................................................

2 2 5 6 9 10 13 23 26

vii

LISTA DE ABREVIATURAS, SÍMBOLOS E UNIDADES DE MEDIDA

µl – Micro litros AgAu – Antígeno Austrália AgHBe – Antígeno e AgHBs - Antígeno de superfície da hepatite B Anti- HAV – Anticorpos totais contra vírus da hepatite A Anti- HD – Anticorpos totais contra vírus da hepatite D Anti-HBc – Anticorpo contra antígeno do core do vírus Anti-HBe – Anticorpo contra antígeno e Anti-HBs – Anticorpo contra o antígeno de superfície da hepatite B Anti-HCV – Anticorpo contra o vírus da hepatite C cccDNA – Ácido desoxirribonucléico circular covalente fechado DNA - Ácido desoxirribonucléico dNTP – Desoxirribonucléico Trifosfato ELISA – Enzyme Linked Immunosorbente Assay FMTAM – Fundação de Medicina Tropical do Amazonas HBx – Proteína X IgG – Imuniglobulina G IgM – Imuniglobulina M mM – Mil imolar Nm - Nanômetro Nt - Nucleotídeos ºC – Graus Celsius OMS - Organização mundial de saúde pb – Pares de base PCR – Reação em cadeia de polimerase Pmol – pico moles Primer F – Iniciador senso Primer R – Iniciador anti-senso RNA – Ácido ribonucléico Rpm – Rotações por minuto TBE – Tampão Tris HCL, EDTA, e ácido bórico UI/μl – unidade internacional por micro litros UV – Raios ultra violeta VHB - Vírus da hepatite B VHC – Vírus da hepatite C VHD – Vírus da hepatite Delta

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SUMÁRIO

1 INTRODUÇÃO ....................................................................................................... 1.1 Considerações gerais.......................................................................................... 1.2 Hepatite B na Amazonia ..................................................................................... 1.3 Vírus da Hepatite B (VHB)................................................................................... 1.3.1 Replicação do VHB........................................................................................... 1.3.2 Marcadores sorológicos................................................................................... 1.3.3 Subtipos do VHB............................................................................................... 1.3.4 Genótipos do VHB............................................................................................ 2 OBJETIVO.............................................................................................................. 2.1 Objetivo Geral...................................................................................................... 2.2 Objetivo Especifico.............................................................................................. 3 MATERIAL E MÉTODOS...................................................................................... 3.1 Modelo de estudo................................................................................................ 3.2 Local de estudo.................................................................................................... 3.4 Amostras.............................................................................................................. 3.5 Extração de DNA................................................................................................. 3.6 Amplificação do gene S por PCR........................................................................ 3.7 Eletroforese dos produtos de PCR...................................................................... 3.8 Purificação dos produtos de PCR........................................................................ 3.8.1 Determinação do genótipo VHB....................................................................... 3.8.1.1 Reação de seqüenciamento.......................................................................... 3.8.2 Analise dos questionários................................................................................. 3.8.3 Análise prévia das seqüências......................................................................... 3.8.4 Edição e alinhamento das amostras................................................................

3.8.5 Análise filogenética.......................................................................................... 4 RESULTADOS....................................................................................................... 5 CONCLUSÃO......................................................................................................... 6 REFERÊNCIA BIBLIOGRAFICA........................................................................... 7 ANEXO...................................................................................................................

7.1 Certificado de Aprovação no Comitê de Ética e Pesquisa.................................. 7.1.1 Hepatites virais no município de Lábrea: O impacto na saúde pública............

7.1.2 Febre Negra de Lábrea: O papel das populações indígenas na epidemiologia da hepatite B e Delta.......................................................................... 7.2 Termo de consentimento livre esclarecido.......................................................... 7.3 Questionários...................................................................................................... 7.3.1 Questionário de investigação epidemiológica de doença icterohemorrágica em populações indígenas........................................................................................

1 1 3 4 7 7 8 9 12 12 12 13 13 13 14 15 15 16 17 17 17 18 19 19 19 20 33 34 38 38 38 39 40 41 41

ix

7.3.2 Questionário do projeto “Hepatites virais no município de Lábrea: “O impacto na Saúde Pública”........................................................................................

43

1

1 INTRODUÇÃO 1.1 Considerações gerais

A hepatite viral aguda é uma doença antiga, porém acredita-se que o primeiro

surto de hepatite B tenha ocorrido a cerca de 100 anos, na Alemanha (Cruz et

al.,2000). É definida como uma infecção hepática causada por um grupo de vírus

hepatotrópicos que são denominados A, B, C, D e E (Cruz et al., 2000; Acosta,

2000).

A hepatite B representa uma das infecções mais presentes no mundo,

considerando que muitos indivíduos infectados são assintomáticos e que as

infecções sintomáticas são insuficientemente notificadas, a freqüência da hepatite B

é, certamente, ainda subestimada. Dados epidemiológicos da Organização Mundial

de Saúde (OMS) demonstram que cerca de dois bilhões de pessoas possuem

evidências sorológicas de infecção pelo vírus da hepatite B (VHB), apesar de já

existir uma vacina eficaz há cerca de vinte anos. Destes, cerca de 350 milhões são

portadores crônicos, que apresentam grande risco de morte por cirrose ou

hepatocarcinoma e constituem um reservatório de indivíduos infectados (Sharma et

al., 2005) por serem portadores do vírus em replicação (Ganem & Prince, 2004).

No mundo, o índice de prevalência de infecção pelo VHB divide as áreas

geográficas em três categorias distintas: alta endemicidade (> 8%); média

endemicidade (2 – 8%) e baixa endemicidade (< 2%) (Figura 1). Nas áreas que

correspondem à região de alta endemicidade o índice de portadores do VHB alcança

5% a 20%, e na maioria dessas áreas a aquisição da infecção ocorre, sobretudo na

fase precoce da vida, muitas vezes por transmissão vertical. Nas áreas de média

endemicidade o índice de portadores varia de 1% – 5% e nas áreas de baixa

endemicidade encontra-se abaixo de 0,1%. Nessas áreas a transmissão sexual

assume uma importância significativa (Silva, 2004).

No Brasil, o Ministério da Saúde estima que pelo menos 15% da população já

foi contaminada com VHB, sendo que os casos crônicos correspondem a cerca de

1% da população brasileira (Ministerio da Saude 2002). Alguns estudos do final da

2

década de 80 e início de 90 sugeriram uma tendência crescente do VHB em direção

à região Norte. Assim, considerava-se que ocorriam três padrões de distribuição da

hepatite B: alta endemicidade, com prevalência superior a 7%, presente na região

Amazônica, alguns locais do Espírito Santo e oeste de Santa Catarina;

endemicidade intermediária, com prevalência entre 2 e 7%, nas regiões Nordeste,

Centro-Oeste e Sudeste e baixa endemicidade, com prevalência abaixo de 2% na

região Sul do país (Ministério da Saúde, 2007; Souto et al., 1999) (Figura 2).

Figura 1: Prevalência do vírus da hepatite B no mundo. Fonte: http://www.cdc.gov/search. do?q=hepatitis+b

Figura 2: Mapa mostrando a distribuição da hepatite B no Brasil (Souto et al., 1999)

3

De modo geral, a taxa de letalidade dos pacientes hospitalizados é de 0,8 a

2%, podendo aumentar nos indivíduos com mais de 40 anos de idade e ser maior

nos casos associados ao vírus da hepatite D. No Brasil, a taxa de mortalidade por

hepatite B é de 0,6 por 100 000 habitantes (Dutra e Haas, 1999).

O VHB é o mais versátil dos vírus hepatotrópicos e pode causar:

hepatite aguda; hepatite crônica; cirrose hepática; hepatite fulminante com necrose

hepática e portadores assintomáticos. E ainda desempenha um papel importante no

desenvolvimento do carcinoma hepatocelular (Acosta, 2000). O risco de desenvolver

doença aguda ictérica aumenta com a idade do paciente, inversamente à

possibilidade de cronificação. Quando os recém-nascidos entram em contato com os

vírus B há 90% de chance de se tornarem cronicamente infectados; quando a

infecção ocorre aos cinco anos, a possibilidade cai para 30-50%, sendo a taxa

reduzida para 5-10% se a infecção ocorre em adultos (Gust e Crowe, 1986 ;CDC,

1991).

1.2 Hepatite B na Amazônia

A prevalência do VHB no Brasil varia principalmente de acordo com as

características demográficas e sócio-econômicas da população, sendo a região

Norte a que apresenta maior endemicidade. A Amazônia Ocidental brasileira é

considera uma região de alta prevalência para o VHB. Nessa região, os grupos de

risco para VHB serão definidos, fundamentalmente, pelo comportamento individual e

social: profissionais da área da saúde, homossexuais masculinos, usuários de

drogas intravenosas, prostitutas, pacientes em hemodiálise. Uma grande parte da

população é infectada ainda nos primeiros meses de vida ou durante a infância

(Ferreira e Silveira, 2004).

Estudo realizado no Brasil mostrou que 21,4% da população de uma

comunidade do Amazonas possui anticorpos anti-HBc, mostrando uma alta taxa de

prevalência do VHB nesta região (Clements et al., 2000). Braga e colaboradores

(2005) em estudo de soroprevelência da infeccção pelo VHB e pelo plasmódio em

Lábrea mostraram que 49,9% da população em estudo apresentou contado com

4

VHB (anti- HBc total isolado) e Aquino et. al., (2008) identificaram em seu estudo, no

Estado do Pará, uma prevalência de 37,7% para anti-HBc na amostra estudada .

Algumas comunidades indígenas do estado do Amazonas também apresentam

alta prevalência dos marcadores sorológicos do VHB, sendo que essa prevalência

geralmente varia de acordo com fatores que incluem condições econômicas e o

isolamento geográfico do grupo (Bensabath et al., 1987). Braga et.al.,(2001)

estudando o VHB em grupos indígenas encontraram um taxa de prevalência de

infecção passada, indivíduos anti-HBc total reativo, de 54,5%, variando entre os

grupos e aldeias visitadas, de 19,7% entre os Jamamadi a 78,6% entre os Kanamari.

A taxa de portadores do AgHBs encontrada (9,7%) confirma o caráter endêmico da

infecção pelo VHB na população estudada.

Um estudo realizado na Amazônia ocidental brasileira revelou uma significativa

correlação entre anti-HBc e o nível de atividade sexual (de Paula, 2001). Em outro

estudo, o uso medicação injetável foi identificado como o principal fator de exposição

prévia ao VHB (Cabezas et al., 1994). Contudo os principais mecanismos de

propagação da hepatite B na Amazônia ainda não foram totalmente identificados e

podem envolver fatores que são altamente específicos para a região (Leon et al.,

1999).

1.3 Vírus da Hepatite B (VHB)

A pedra fundamental para a história da hepatite B foi a descoberta acidental do

antígeno Austrália (AgAu) por Blumerg e colaboradores em 1965. A partir deste

achado novos estudos foram realizados a fim de elucidar tal partícula. No inicio

acreditava-se que AgAu tinha uma relação com a leucemia, mas em 1967, Blumerg

e colaboradores, sugeriram pela primeira vez que a alta freqüência do AgAu no soro

de pacientes com hepatite aguda poderia estar relacionada com um suposto “vírus”

introduzido entre humanos por transfusões de sangue (Fonseca, 2006).

O VHB é um vírus resistente, capaz de suportar extremos de temperatura e

umidade (Chisari, 2000) sobrevive até uma semana fora do corpo humano, no

plasma, a vida média do VHB varia de um a três dias, enquanto nos hepatócitos a

5

vida média varia de 10 a 100 dias (Fonseca, 2007). O sangue e os líquidos corporais

são os principais veículos de transmissão, podendo transmitir o vírus por transfusão

de sangue e hemoderivados, transplantes de órgãos e hemodiálise. O vírus também

pode ser disseminado pelo contato com secreções do corpo, como sêmen, saliva,

suor, lágrima e leite de mama (CDC, 2007).

O VHB pertence à família Hepadnaviridae, uma família de vírus de DNA que

causa hepatite em múltiplas espécies de animais, e ao gênero Orthohepadnavirus.

Os hepadnavirus infectam preferencialmente os hepatócitos. O VHB completo,

também chamado de partícula de Dane, é formado por uma partícula de DNA, é

envelopado e com 42 nm de diâmetro (Figura 3) (Moreno et al., 2004; Pinho, 1995).

Além da partícula Dane, existem dois outros tipos de partículas virais não

infecciosas, que podem ser encontradas na circulação. Umas esféricas de pequeno

diâmetro (20 nm) e outras de forma tubulares (22 nm de largura e 150 nm de

comprimento), ambas constituídas exclusivamente pelo antígeno de superfície

(Figura 3) (Carneiro de Moura, 1997).

Figura 3: Partículas virais do VHB. Fonte:http://pathmicro.med.sc.edu/virol/hepatitis-

virus.htm

6

O genoma do VHB é uma cadeia circular incompleta de DNA de dupla hélice,

que possui 3.200 nucleotídeos (Figura 4). Apresenta quatro regiões abertas para

leitura: S, C, P e X. O gene S, incluindo a região pré-S1, pré-S2 e a região S,

codifica proteínas do antígeno de superfície encontradas no envelope viral. O Gene

C, constituído pela região pré-C, é responsável por codificar os polipeptídios que

constituem o nucleocapsídeo viral, antígeno core da hepatite B (AgHBc) e o

antígeno e (AgHBe). O Gene P codifica a polimerase viral e o gene X codifica a proteína X (HBx), que é um potente ativador de transcrição (Moreno et al., 2004;

Silva, 2004).

A proteína X é imprescindível para replicação e disseminação in vivo do VHB,

ela atua como um transativador transcricional dos genes virais e uma variedade de

genes do hospedeiro. A modulação pela HBx de transcrição gênica afeta a

replicação viral e a função dos pontos de verificação do ciclo celular do hepatócito. A

HBx está relacionada com a patogenia do hepatocarcinoma em pacientes infectados

com VHB (Chisari, 2000).

Figura 4: Desenho esquemático do genoma do VHB. (Beck & Nassal, 2007)

7

1.3.1 Replicação do VHB

Embora não se conheça com exatidão os mecanismos deste processo, a

replicação começa com a união do vírus a membrana do hepatócito através da

proteína Pré-S1. O Envelope da partícula viral se funde com a membrana celular e é

liberado no citoplasma o nucleocapsídeo (core), que se dirige ao núcleo (Figura 5).

Dentro do núcleo da célula se completa a síntese da cadeia positiva (incompleta) do

DNA viral, de tal forma que o genoma do VHB se converte em uma cadeia fechada

de DNA com ligações covalentes superespiraladas (cccDNA). Este cccDNA servi

como base para transcrição do RNA viral (Ganem et al, 2001).

O RNA viral (pré-genômico), por sua vez, constitui o molde para a síntese de

uma das cadeias da molécula de DNA (cadeia -) pela atividade enzimática da

transcriptase reversa (polimerase do vírus), a qual ao mesmo tempo em que copia o

RNA em DNA, o vai removendo através da atividade RNAse H que também possui.

A digestão do RNA não é completa e o oligoribonucleótido terminal, que inclui a

seqüência repetida DR1 é translocado e emparelhado com a região DH2 perto do

terminal 5’ da mesma cadeia negativa (-) onde atua como iniciador da síntese da

cadeia positiva (+). Quando parte (50 a 70%) desta cadeia está sintetizada,

presume-se que uma alteração alostérica do complexo tenha lugar e que esta

determine a posição do invólucro do antígeno de superfície e a exportação da

partícula para o exterior da célula (Raney e Mclachlan,1991).

Posteriormente, as progênies virais adquirem o envoltório, a partir das

membranas intracelulares (retículo endoplasmático e o complexo de Golgi), quando

então os virions podem retornar ao núcleo celular para continuar o processo de

replicação genômica ou podem ser secretados (Huovila et al., 1992).

1.3.2 Marcadores sorológicos

Na investigação da hepatite B podem ser utilizados os seguintes marcadores :

8

• O HBsAg aparece antes do início dos sintomas. Chega ao máximo

durante doença franca e a seguir declina para níveis indetectáveis em 3

a 6 meses;

• O HBeAg, VHB-DNA e DNA polimerase aparecem no soro logo depois

do HBsAg, e todos significam replicação viral ativa;

• A IgM anti-HBc torna-se detectável no soro um pouco antes do início dos

sintomas, concomitante ao início da elevação das aminotransferases

séricas. Ao correr dos meses, o anticorpo IgM é substituído por IgG anti-

HBc;

• O anti-HBe é detectável logo depois do desaparecimento do HBeAg,

significando que a infecção aguda chegou ao máximo e a doença está

regredindo;

• A IgG anti-HBs não se eleva até que a doença aguda tenha acabado e

em geral não é detectável durante algumas semanas a vários meses

depois do desaparecimento de HBsAg. O anti-HBS pode persistir por

toda vida, conferindo proteção (Veronesi, 2005).

1.3.3 Subtipos do VHB Através de análises sorológicas, as cepas de VHB foram divididas em nove

subtipos baseados nos antígenos de superfície apresentados, (HBsAg) designados

da seguinte forma: ayw1, ayw2, ayw3, ayw4, ayr, adw2, adw4q-, adrq+ e adrq-

(Bancroft, 1972; Okamoto et al., 1988). As variações d/y e w/r, que garantem a

variabilidade entre os subtipos, apresentam sua base molecular em substituições do

tipo Lys/Arg nos resíduos 122 e 160 no gene S, respectivamente (Okamoto, 1987).

Atualmente, a classificação em subtipos tem caído em desuso, sendo utilizada a

classificação em genótipos (Kidd-Ljunggren, 2002).

9

Figura 5: Esquema da replicação do VHB nos hepatócitos. Fonte: https://www1.qiagen.com/Geneglobe/PathwayView.aspx? pathwayID=217

1.3.4 Genótipos do VHB

Tomando-se como base diferenças genéticas, o VHB foi classificado em oito genótipos distintos que variam de A a H. Uma análise do genoma completo de um

grupo em relação a outro demonstra diferenças de até 8%. É notável ainda que os

oito grupos de genótipos demonstram um padrão de dispersão geográfica ao redor

do mundo (Norder et al, 1993 e 1994). O genótipo A encontra-se disperso pelo

mundo, sendo o predominante na Europa, América do Norte, África e Índia. Os

genótipos B e C predominam no Leste e Sudeste da Ásia e Austrália. O genótipo D é

principalmente encontrado no Oriente Médio e países do Mediterrâneo. O genótipo E

parece ser predominante no oeste africano, enquanto o genótipo G foi caracterizado

nos Estados Unidos, México e França e os genótipos F e H são encontrados

exclusivamente nas Américas Central e do Sul (Campos et al, 2005 e Weber, 2006).

10

Alguns genótipos foram subdivididos em subclasses: sub-genótipos com

origens geográficas diferentes. O genótipo A, por exemplo, é subdividido em três

grupos: Sub-genótipos A1, A2 e A3, com origens em África/Ásia, Europa/América do

Norte e Camarões, respectivamente (Bowyer et al, 1997 e Kurbanov et al, 2005).

No Brasil, já foi relatada a existência de variabilidade de prevalência em

diferentes regiões. Na região amazônica brasileira, representada pela região norte e

parte da região nordeste, por exemplo, nota-se uma taxa de infecção endêmica,

contrastando com a baixa prevalência encontrada na região sul (Figura 6). Tal

distribuição é diferente da encontrada nos demais países da América Latina, com

maior prevalência dos genótipos A, D e F entre os portadores (Gaspar et al, 1987;

Souto, 1999; Mello et al., 2007).

Figura 6: Mapa da distribuição dos genótipos no Brasil (Mello et al., 2007).

Algumas alterações na estrutura genética dos genótipos do VHB podem

resultar em diferentes níveis de patogenicidade, sendo relacionadas com maior ou

11

menor risco de desenvolvimento de hepatocarcinoma ou cirrose no fígado. Além das

diferenças citadas, a heterogeneidade dos genótipos da hepatite B parece estar

relacionada com diferenças na evolução clínica da infecção e na resposta ao

tratamento antiviral (Roncato et al, 2008).

12

2 OBJETIVO 2.1 Geral Seqüenciar e analisar o gene S do vírus da hepatite B (VHB) e identificar os

diferentes genótipos obtidos de indivíduos procedentes do município de Lábrea do

Estado do Amazonas.

2.2 Especifico

• Obter a seqüência parcial do gene S, que expressa o antígeno de

superfície, de diferentes amostras de indivíduos infectados pelo VHB;

• Caracterizar os genótipos do VHB obtidos;

• Identificar o genótipo predominante em indivíduos indígenas e não

indígenas;

13

3 MATERIAL E MÉTODOS 3.1 Modelo de estudo Estudo descritivo com caracterização da biologia molecular do VHB em

indivíduos positivos para o antígeno HBsAg da região Amazônica Ocidental

Brasileira.

3.2 Local de estudo

O município de Lábrea (Figura 7) está localizado na região sudoeste do Estado

do Amazonas, no vale do Rio Purus é uma área hiper endêmica do VHB e VHD. É

uma região ainda quase que despovoada sendo sua densidade demográfica de 0,4

habitantes por quilômetro quadrado.

Figura 7: Mapa do Estado do Amazonas em destaque o município de Lábrea Fonte: http://www.manausonline.com/ municípios_detalha. asp?id_mun=35)

3.3 Obtenção de amostras

O presente projeto está associado a dois projetos de maior amplitude

designados: “Hepatites virais no município de Lábrea: O impacto na saúde pública”,

(aprovado pelo comitê de ética da FMTAM – processo Nº 2957/2003-FMTAM)

(Anexo 6.4.1), que tem como objetivo geral, determinar a prevalência de marcadores

sorológicos de infecção presente e passada do vírus da hepatite B (VHB), vírus da

hepatite C (VHC), vírus da hepatite Delta (VHD) e vírus da hepatite A, na zona rural

do município de Lábrea (rio Purus), quatorze anos após a introdução da vacina

http://www.manausonline.com/

14

contra hepatite B na região; “Febre Negra de Lábrea: O papel das populações

indígenas na epidemiologia da hepatite B e Delta” (aprovado pelo comitê de ética da

FMTAM – processo Nº 2090/2005-FMTAM) (Anexo 6.4.2), que tem como objetivo

geral estudar a biologia molecular dos vírus das hepatites B e Delta, em populações

indígenas do município de Lábrea, Amazônia ocidental brasileira.

As pessoas, ao serem visitadas, foram convidadas a participar do estudo em

questão. Ao concordarem participar do estudo, foram lhes esclarecidos os objetivos

do trabalho, riscos associados ao estudo, benefícios e confidencialidade dos

registros. Em seguida o participante assinou o Termo de Consentimento Livre e

Esclarecido (Anexo 6.2), e com ajuda do pesquisador responsável, foi preenchido

um questionário individual (Anexo 6.3).

De cada paciente foi colhido, à vácuo, dois frascos de sangue total com EDTA

(2 x 5 ml - Vacutainer BD / Becton Dickinson UK Ltda.) e posteriormente

centrifugados a 2.000 rpm. O plasma foi separado e as amostras foram identificadas

com o número de registro , e imediatamente armazenadas a temperatura de -20ºC.

O transporte para Manaus foi realizado por via aérea, em containeres

acondicionados em recipiente térmicos, mantidos a baixa temperatura.

3.4 Amostras

As amostras selecionadas para realização deste trabalho foram coletadas

durante a realização de inquéritos sorológicos realizado no município de Lábrea/AM

entre fevereiro 2006 e julho 2008. Tais amostras foram submetidas testadas

marcadores sorológicos de infecção pelo VHB (HBsAg, anti-HBc total, anti- HBc IgM,

HBeAg, anti-HBe), anticorpos contra o vírus da hepatite A (anti-HAV total), da

hepatite C (anti-HCV), da hepatite Delta (anti-HD total). Tais experimentos foram

feitos utilizando-se testes imunoenzimáticos em fase sólida (ELISA)

(BIOMÉRIEUX/ORGANO TÉCNICA DIASORIN PROCESSO AUTOMATIZADO

ETMAX 33), de acordo com o manual do fabricante. De 1500 amostras obtidas nos

inquéritos e submetidas à análise citada, 86, foram positivas para o marcador HBsAg

e são objeto de análise do presente estudo. Desta amostra (86), 31 pertencem a

indígenas e 55 a não indígenas.

15

3.5 Extração de DNA Foram utilizadas algumas estratégias de extração, a fim de se obter o melhor

resultado da técnica. Primeiramente o DNA viral foi extraído a partir das amostras de

soro utilizando o Qiamp DNA Blood Mini Kit (Qiagen Sciences, Maryland, USA), de

acordo com os procedimentos recomendados pelo fabricante.

Utilizando-se o mesmo Kit, Qiamp DNA Blood Mini Kit (Qiagen Sciences,

Maryland, USA), foi realizado um gradiente de extração. Utilizou-se duas amostras,

as quais foram colocadas em proteínase K e tampão AL por 30 minutos, 1 hora e 1

hora e 30 minutos, a fim de se verificar o melhor tempo de digestão. As amostras de

DNA extraídas foram mantidas a temperatura de -70ºC até o momento de sua

utilização.

3.6 Amplificação do gene S por PCR

Para a amplificação do gene S do VHB, utilizou-se a técnica semi-“nested”

PCR, utilizando na primeira reação os primers 783 e 2821 (Oliveira, 2007) (Tabela

1), que originou um produto de 1200pb. Nesta primeira reação foi utilizado um mix

de PCR de volume de 50 µl descritos a seguir:

- 5,0 µl de tampão 10x PCR

- 1,0 µl de amostra, 2,0 µl de mix dNTP (10mM)

- 2,0 µl de MgCl2 (50mM)

- 2,0 µl de iniciador senso (783) (10pmol)

- 2,0 µl de iniciador anti-senso (2821) (10pmol)

- 0,4 µl de Platinum taq DNA polimerase (5U/µl)

- 36 µl de água MiliQ

Na reação de semi-“nested” foi utilizado os primers 783 e P1 (Oliveira et al.,

2008), originando um produto de 680 pb. O volume final da reação de semi-“nested”

também foi de 50 µl, nesta reação foi utilizado 1,0 µl do produto amplificado na

primeira reação e o volume do restante dos reagentes foi similar ao da primeira.

16

Tabela 1. Seqüência dos primers utilizados nas reações de PCR

Nome Seqüência Quantidade Posição no genoma do

VHB 2821 5’-GGG TCA CCA TAT TCT TGG GAA CA-3’ 23nt 2821-2150 783 5’-CTC ACG ATG CTG TAC AGA CTT-3’ 21nt 783-762 P1 5’-GC CTC TCA CAT CTC GTC AAT-3’ 20nt 104-123

Em todas as reações foram utilizadas uma amostra controle positivo de DNA

VHB (plasma humano com carga viral a 1.000.000.000 UI/μl de VHB) e uma de

controle negativo, na qual havia todos os reagentes com água MiliQ no lugar da

amostra.

As amplificações foram realizadas em termociclador Eppendorfe Mastercycler

Gradiente. Para ambas as amplificações foi utilizado 35 ciclos com a seguinte

programação.

94°C--------------------por 5 minutos

94°C--------------------por 30 segundos

52,6°C-----------------por 2 minutos

72°C--------------------por 30 segundos

72°C--------------------por 7 minutos

4°C---------------------∞

3.7 Eletroforese dos produtos de PCR

Os produtos da amplificação da segunda reação foram visualizados em gel de

agarose a 1,5% corados em brometo de etídeo (1,0 µl/ml). Foram aplicados no gel

5,0 µl de produto de PCR misturados com 3,0 µl de tampão de amostra TBE 5X.

Como padrão de peso molecular utilizou-se o padrão Ladder de 100pb (Fermentas

Life Sciences). Para migração das amostras em gel, na cuba de eletroforese, foi

aplicada uma voltagem de 80 volts por 40 a 50 minutos. Após a migração

eletroforética as amostras foram analisadas em transiluminador UV 302 nm Bio

Agency e fotografadas utilizando o equipamento Canon Powershot S315.

35 ciclos

17

3.8 Purificação dos produtos de PCR Após a revelação do gel as amostras que apresentaram a quantidade de pares

de bases esperados na reação de semi -“nested” (680 pb), foram purificadas para

serem seqüenciadas.

Para purificação das amostras utilizou-se o Kit Wizard SV Gel and PCR Clean-

Up System (Promega), conforme as instruções do fabricante para purificação de

produto de PCR. Foi utilizado 40 µl de produto de PCR que foram eluídos 25 µl de

água MiliQ.

Após a purificação misturou-se 2,0 µl de produto de PCR purificado com 2,0 µl

de tampão de amostra TBE 5X e 2,0 µl de mass ladder com 2,0 µl de tampão TBE

5X. Dessa mistura aplicou-se 2,0 µl em gel de agarose 1,5%.

3.8.1 Determinação do genótipo VHB 3.8.1.1 Reação de seqüenciamento

As reações de seqüenciamento foram realizadas em placas de 96 poços. Foi

realizado seqüenciamento apenas das amostras que amplificaram na reação de

semi-“nested”. O Kit utilizado para o seqüenciamento foi o “Big Dye Terminator 3.1

Cycle Sequencing Kit” .

Foram realizadas duas reações de seqüenciamento para cada amostra, uma

para o primer forward e outra para o reverse. Na reação de seqüenciamento foi

utilizado um mix de volume de 20 µl, para cada primer, descritos a seguir:

- 5,0 µl Mix de Big Dye

- 2,5 µl de primer F ou R (5pmol/µl)

- 0,5 a 3,0 µl de produto de PCR purificado

- Água miliQ para completar o volume da reação

18

A reação de seqüenciamento foi processada em 30 ciclos nas condições a

seguir:

96°C--------------------por 1 minuto

96°C--------------------por 20 segundos

55°C--------------------por 20 segundos

60°C--------------------por 3 minutos

4°C---------------------∞

3.8.1.2 Precipitação do produto da reação de sequenciamento

Foi adicionado aos 20 μl de produto da reação de seqüenciamento 80 μl de

Isopropanol 75%, a placa foi selada e incubada a temperatura ambiente por 15

minutos. Após a incubação a placa foi centrifugada por 45 minutos a 4000rpm,

descartou-se o sobrenadante e adicionou-se em cada amostra 200μl de etanol 70%,

a placa foi selada e centrifugada por 10 minutos a 4000rpm. O sobrenadante foi

descartado e adicionaram-se novamente 200μl de etanol 70%, a placa foi selada e

centrifugada por 10 minutos a 4000rpm. Deixou-se secar o pellet a temperatura

ambiente e protegido de luz. Adicionou-se em cada amostra 10 μl de Formamida Hi-

Di, a placa foi selada e vortexada, posteriormente foi dado um pulso na centrifuga. A

placa foi aplicada no termociclador a 95°C por 3 minutos para desnaturação,

posteriormente a placa foi colocada em banho de gelo por 2 minutos e foi aplicado

na placa um pulso, para eliminação das bolhas. Por fim as amostras fora submetidas

a seqüenciamento, utilizado o seqüenciador automático 3130 XL Genetic Analyzer

Applied Biosystems.

3.8.2 Analise dos questionários

Os dados dos questionários foram consolidados e armazenados em um banco

de dados no programa Excel 2007 (Microsoft Office). Destes dados foram analisados

aspectos socioeconômicos e epidemiológicos da população estudada.

19

3.8.3 Análise prévia das seqüências

As seqüência obtidas neste trabalho foram submetidas a analise pela

ferramenta BLAST do GenBank, banco de dados internacional, para confirmação do

tipo viral.

3.8.4 Edição e alinhamento das amostras Para confirmação do tipo viral, as seqüência obtidas foram submetidas a

análise pela ferramenta BLAST do GenBank. Posteriormente as seqüências foram

analisadas no programa BioEdit versão 7.0.9.0 (06/27/07) (Hall, 1999), aonde foram

alinhadas e editadas quando necessário. Para o alinhamento foram utilizadas 30

seqüências armazenadas no GenBank, que continham os oito genótipos.

3.8.5 Análise filogenética

Para identificação dos genótipos, foi realizada uma análise filogenética

comparando os diferentes genótipos do VHB obtidos com os já conhecidos e

depositados no GenBank. As análises filogenéticas e de evolução molecular foram

realizadas utilizando o programa MEGA versão 4.0.2 (Tamura, 2007).

Na construção das árvores filogenética aplicou-se o modelo de Neighbor-

Joining (NJ). O nível de confiança foi obtido usando o método não paramétrico

bootstrap baseado em 1000 réplicas (uma réplica é igual a uma comparação). A

classificação genotípica foi realizada mediante análise de similaridade das

sequencias obtidas no estudo e sequencias correspondentes aos genótipos de A a

H obtidas no GenBank. As sequencias externas estão classificasa com seus

respctivos números de acesso no banco de genes seguido da classificação

genotípica de cada um.

20

4 RESULTADOS Os resultados serão apresentados na forma de artigo, que será enviado para

revista Acta Tropica.

Caracterização molecular do vírus da hepatite B em população autóctone e

população endógena do município de Lábrea, na Amazônia ocidental brasileira

Dias ALBa, Oliveira CMCb, Castilho MCb, Silva MSPc, Braga WSMb

a. Universidade do Estado do Amazonas

b. Gerência de Virologia, Fundação de Medicina Tropical do Amazonas.

Manaus, AM, Brasil

c. Secretaria Municipal da Saúde de Lábrea.

Resumo

A infecção pelo vírus da hepatite B (VHB) é um importante problema de saúde

pública no mundo. O VHB é classificado em oito genótipos diferentes, A-H, com

distinta distribuição geográfica. No Brasil os genótipos mais freqüentes são o A, D e

F. Objetivo deste estudo foi caracterizar os genótipos do VHB em região endêmica

de infecção pelos vírus das hepatites B e Delta na Amazônia Ocidental Brasileira.

Foram analisadas 86 amostras soro reativas para o HBsAg de indivíduos indígenas

e não-indígenas, obtidas de inquéritos sorológicos realizados no município de

Lábrea, Estado do Amazonas. Das 86 amostras soro reativas 39 foram VHB-DNA

positivas pela semi-“nested” PCR. Os genótipos foram estabelecidos pelo

seqüenciamento da região do gene S amplificado. Foram obtidas 20 seqüências,

classificada em três genótipos A, D e F. Sendo o genótipo A o mais freqüente (60%),

seguido do D (35%) e F(5%). O perfil de distribuição dos genótipos encontrados

reflete o padrão de ocupação histórica da região.

Palavras-chave: VHB, genótipos, epidemiologia, Amazônia, Brasil.

21

1 Introdução

A hepatite B representa uma das infecções virais mais prevalentes no mundo.

Estima-se que cerca de dois bilhões de pessoas possuem evidências sorológicas de

infecção pelo vírus da hepatite B (VHB). Destes, 350 milhões são portadores

crônicos, que apresentam risco elevado de morte por cirrose ou carcinoma

hepatocelular (Sharma et al. 2005).

O VHB pertence à família Hepadnaviridae, gênero Orthohepadnavirus, é

formado por uma partícula de DNA de dupla hélice circular, onde a fita de polaridade

negativa é completa e a de polaridade positiva é incompleta na extremidade 5’. É

envelopado, com 42 nm de diâmetro e 3.200 nucleotídeos (Okamoto et al, 1988,

Schaefer, 2005). Pode ser classificado quanto ao fenótipo em quatro diferentes

subtipos, que podem ser subdivididos mais tarde de acordo com o determinante

antigênico do antígeno de superfície (HBsAg) em adw (adw2 e adw4), ayw (ayw1-4),

adr (adrq+ e -) e ayr (Bancroft, 1972; Okamoto et al., 1988). E quanto ao genótipo

em oito cepas, que variam de A a H (Kidd-Ljunggren, 2002), suas diferenças

estruturais e funcionais estão associadas a gravidade clinica, falhas no tratamento e

possivelmente interferem na resposta vacinal contra o vírus. Estes genótipos podem

apresentar uma variação de até 8% no seu genoma completo (Norder et al, 2004).

Os diversos genótipos estão distribuídos de forma distinta, o genótipo A

apresenta dispersão universal, sendo o predominante na Europa, América do Norte,

África e Índia. Os genótipos B e C predominam no Leste e Sudeste da Ásia e

Austrália. O genótipo D é principalmente encontrado no Oriente Médio e países do

Mediterrâneo. O genótipo E parece ser predominante no oeste africano, enquanto o

genótipo G foi caracterizado nos Estados Unidos, México e França, o genótipos F é

encontrado principalmente nas Américas Central, do Sul e Alaska, já o genótipo H é

22

exclusivo das Américas Central e Estados Unidos (Norder et al., 2004; Campos et al,

2005 e Weber et al, 2006).

A região Amazônica é caracterizada como uma das regiões do mundo de maior

ocorrência da doença e suas seqüelas (Braga et al., 2001). No Estado do

Amazonas, as calhas dos rios Juruá, Purus e médio Solimões são consideradas as

regiões de maior endemicidade para os vírus das hepatites B (VHB) e Delta (VHD)

(Bensabath & Leão, 2003; Braga et al., 2005). Entre populações indígenas, da

Amazônia ocidental estudos soro epidemiológicos, relatam taxas superiores a 20%

de prevalência de portadores crônicos (Braga et al., 2001; Braga, 2004).

No Brasil, bem como na Amazônia brasileira o genótipo A tem se mostrado o

mais comumente encontrado seguido dos genótipos D e F (Mello et al., 2007). Já em

comunidades indígenas isoladas o genótipo F tem se mostrado o mais prevalente

(Blitz et al., 1998).

Este estudo teve como objetivo caracterizar por análise filogenética os

genótipos do VHB isolados de indivíduos HBsAg reativos de uma área endêmica da

Amazônia Ocidental brasileira. A analise foi obtida a partir de seqüências

nucleotidicas do gene S.

2- Material e métodos

Foi realizado um estudo de epidemiologia molecular com caracterização

genotípica do VHB em indivíduos positivos para o antígeno HBsAg da zona urbana,

rural e comunidades indígenas do município de Lábrea no Estado do Amazonas

(Figura 1).

23

As amostras selecionadas foram coletadas durante a realização de inquéritos

sorológicos para hepatites virais na zona urbana e rural, do município de Lábrea

entre fevereiro de 2006 e julho de 2008.

De 1510 amostras analisadas, 86 foram positivas para o marcador HBsAg e

são objeto de análise do presente estudo. Das 86 amostras, 31 pertencem a

indivíduos de comunidades indígenas e 55 a não-indígenas.

Estes estudos foram aprovados pelo comitê de ética da Fundação de Medicina

Tropical do Amazonas (FMTAM) processo Nº 2957/2003-FMTAM e 2090/2005-

FMTAM.

Figura 6: Mapa da área de estudo.

2.1 Extração de DNA

O DNA viral foi extraído a partir das amostras de soro utilizando o Qiamp DNA

Blood Mini Kit (Qiagen Sciences, Maryland, USA), de acordo com os procedimentos

recomendados pelo fabricante, porém o tempo de digestão com proteinase K e

tampão AL foi de 4 horas.

24

2.2 PCR

A região S do gene de superfície foi amplificada pela semi-“nested” PCR, na a

primeira reação utilizou-se os primers 783 (5’-CTC ACG ATG CTG TAC AGA CTT-

3’), nt 783-762, e 2821(5’-GGG TCA CCA TAT TCT TGG GAA CA-3’), nt 2821-2150

(Oliveira, 2007). Na segunda reação com os primers 783 e P1 (Oliveira et al., 2008),

originando um produto de 1200 e 680 pb respectivamente.

Para a amplificação do DNA foi adicionado 5,0 μl de amostra para primeira

reação e 1,0 μl de produto de PCR para a segunda reação a uma mistura contendo:

5,0 µl de tampão 10x PCR; 2,0 µl de mix dNTP (10mM); 2,0 µl de MgCl2 (50mM); 2,0

µl de cada primer; 0,4 µl de Platinum taq DNA polimerase (5U/µl) (Invitrogen, San

Diego, CA); para um volume final de 50 µl. As condições do ciclo utilizado foram:

inicialmente 94°C por 5 minutos para desnaturação, seguidos de 35 ciclos de 94°C

por 30 segundos, 52,6°C por 2 minutos, 72°C por 30 segundos, e uma extensão final

de 72°C por 7 minutos, em termociclador Eppendorff Mastercycler Gradient.

2.3 Seqüenciamento

As amostras purificadas com Kit Wizard SV Gel and PCR Clean-Up System

(Promega), seqüenciadas com os primers Foroward e reverse utilizando “Big Dye

Terminator 3.1 Cycle Sequencing Kit”, de acordo com o manual do fabricante. As

reações foram realizadas no Genetic Analyzer 3130 XL (Applied Biosystems).

2.3 Analise das seqüências

Para confirmação do tipo viral, as seqüência obtidas foram submetidas a

análise pela ferramenta BLAST do GenBank. Posteriormente as seqüências foram

editadas e alinhadas no programa BioEdit versão 7.0.9.0 (Hall, 1999). No

alinhamento foram utilizadas 30 seqüências obtidas do GenBank, correspondentes

aos que continham os oito genótipos do VHB.

25

2.4 Identificação dos genótipos

Foi realizada uma análise filogenética comparando os diferentes genótipos do

VHB obtidos com 8 seqüências do GenBank. As análises filogenéticas e de evolução

molecular foram realizadas utilizando o programa MEGA versão 4.0.2. (Tamura,

2007) Na construção das árvores filogenética aplicou-se o modelo de Neighbor-

Joining (NJ). O nível de confiança foi obtido usando o método não paramétrico

bootstrap baseado em 1000 réplicas. A classificação genotípica foi realizada

mediante análise de similaridade das seqüências obtidas no estudo e seqüencias

correspondentes aos genótipos de A a H obtidas no GenBank. O grupo externo

utilizado foi o VHB de primatas não humano (número de acesso do GenBank

AF046996).

3 Resultados

O estudo incluiu amostras de 86 indivíduos, 54 (62,80%) do sexo masculino e

32 (37,20%) do sexo feminino, tendo estes uma idade média de 30 anos (1–87).

A análise qualitativa para o VHB-DNA, pela semi-nested PCR, foi positiva em

45,3% (39/86), e 37,5% (21/86) de amostras de portadores co-infectadas pelo VHD.

Durante o procedimento de purificação houve perda de produto de PCR de

17/39 amostras. Sendo 22 amostras submetidas ao seqüenciamento do gene S.

Destas, 20 seqüências foram de boa qualidade, as quais foram comparadas com 8

seqüências obtidas do GenBank.

O genótipo mais freqüentemente foi o genótipo A, encontrado em 60% (12/20)

das seqüências obtidas, seguido do genótipo D 35% (7/20), o genótipo F foi

encontrado em apenas uma amostra 5% (1/20) (Figura 2).

26

Entre as amostras de indígenas, 44,4% (4/9) apresentaram o genótipo A e

55,6% (5/9) o genótipo D. Enquanto que nas amostras de não-indígenas o genótipo

mais freqüente o A com 72,72% (8/11), seguido do genótipo D com 18,18% (2/11) e

genótipo F com 9,1% (1/11).

Figura 2: Arvore filogenética do tipo Neighbor-joining VHB-DNA (Gene S)

representando os genótipos encontrados. As seqüencias do estudo referentes

a indígenas estão marcadas com e as de não indígenas com . As

seqüencias do genbank estão com seus respectivos números de acesso.

27

4 Discussão

Os resultados deste estudo contribuem com informações a respeito da

distribuição dos genótipos do VHB no estado do Amazonas, uma vez que estudos

de epidemiologia molecular do VHB na região ainda são raros. Como a distribuição

geográfica dos genótipos do VHB é muito diversificada (Norder et al, 2004), sua

caracterização molecular em uma determinada região pode revelar aspectos da

natureza da origem do vírus na população estudada.

As amostras avaliadas neste estudo revelam uma predominância do genótipo A

e D, enquanto o genótipo F foi encontrado em apenas uma amostra. Estudos sobre

a distribuição dos genótipos do VHB no Brasil e na Amazônia também mostram que

na região Norte do país o genótipo A é mais freqüente, seguido do D e F (Mello,

2007; Ferreira et al., 2006; Moraes et al., 1999; Carrilho et al., 2004). Entretanto,

outros estudos realizados na Amazônia brasileira, mostram o genótipo F como o

segundo mais freqüente (Viana et al., 2005; Victoria et al., 2008; Conde et al., 2004).

Acreditamos que essa diferença deva estar associada ao tipo de amostras

avaliadas que geralmente são oriundas de pacientes com doença crônica

estabelecida ou de pacientes com hepatite fulminante (Paraná et al, 2008; Victoria et

al., 2008), enquanto que as amostras por nós analisadas são de estudo de

prevalência de base populacional que avalia indivíduos assintomáticos.

O estudo de Viana e colaboradores (2005) embora também avaliem uma

amostra de base populacional, foi realizado em região do estado do Acre

sabidamente endêmica do VHB, onde a presença marcante do genótipo F também

está caracterizada como importante.

O genótipo F, na última década foi identificado com maior freqüência em

ameríndios (Blitz et al., 1998), Bertolini e colaboradores (2000) mostra que tal

28

genótipo é freqüente em tribos isoladas da Amazônia que não mantém contato com

brancos. Neste mesmo estudo foi mostrado que o contato de índios com não

indígenas favoreceu a introdução do genótipo A nestas comunidades.

Os primeiros contatos das populações nativas da região do estudo com outros

povos do ocidente e oriente deram-se durante a chamada coleta das “drogas do

sertão” e no final do século 19 durante a exploração de seus extensos seringais

nativos (Ribeiro, 2009; Amazonas, 2009; Schröder, 2002; Schiel, 2005 ). O que pode

justificar a maior freqüência dos genótipos A e D na população indígena estudada.

Moraes e colaboradores (1999), analisando amostras caracterizadas anteriormente

pela técnica de anticorpos monoclonais com primers específicos para o genótipo F,

identificaram o genótipo A como mais freqüente seguidos do D e F, sugerindo que

em outros estudos houve uma super-estimativa do genótipo F, uma vez que usavam

anticorpos monoclonais para identificação de sorotipos.

. O Instituto Oswaldo Cruz (IOC), pioneiro em classificar os genótipos do VHB

que circulam no Brasil, identificou que cerca de 50% dos vírus encontrados no país

são do genótipo A, subtipo africano, possivelmente relacionado à introdução dos

africanos no Brasil pelo comércio escravo (Teles et al., 1999). Além da influência

afro-descendente, a influência da colonização européia e da presença de mascates

de origem libaneses na região Amazônica durante o período da exploração da

borracha (Bastani, 1949 apud Campos, 1987, p.67), justificam a presença marcante

dos genótipos A e D encontrados em nossas amostras.

Embora tenhamos encontrado uma positividade de 45,34% (39/86) do DNA

viral em nossa amostra diferentemente de outros estudos que mostram índices de

positividade superiores como de 76% em estudos realizados por Carrilho et al (2004)

e Chu et al (2003), nossos resultados possivelmente estejam relacionados a elevada

29

presença de indivíduos co-infectados com o VHD (65,11%), o que reprime

espontaneamente o VHB (Kiesslich et al., 2009; Rizzetto, 2009), como também

devido a baixa carga viral em indivíduos co-infectados (Kiesslich et al., 2009), que

compuseram a totalidade de nossa amostragem, bem como a problemas no

manuseio das amostras em trabalho de campo em situações precárias como na

zona rural do município de Lábrea.

É sabido que as formas clínicas da infecção pelo VHB tem estreita relação com

os genótipos. Em áreas endêmicas o genótipo A está associado com hepatite

aguda, o genótipo D está envolvido em sua grande maioria com desenvolvimento de

cirrose hepática e câncer (Thakur et.al., 2002) e o genótipo F nas hepatites

fulminantes (Nakano et al., 2001), podendo este estar também relacionado com

resistência a medicamentos utilizados no tratamento desta infecção. Por isso,

estudos como este são de grande importância para ajudar a estabelecer um perfil

genotípico do VHB na região, mostrando que mesmo em comunidades isoladas da

Amazônia refletem o mesmo padrão de cepas encontrados na Europa, África e

Oriente médio, por meio da ocupação histórica desta região.

Agradecimentos:

A Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado do Amazonas (FAPEAM),

Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico (CNPq) e

Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior (Capes) pelo

suporte financeiro. A Fundação Nacional de Saúde, Distrito Sanitário Indígena do

Médio Purus, pelo apoio na investigação junto as populações indígenas e as

populações das comunidades da zona urbana e rural do Município de Lábrea pela

participação nesse estudo.

30

5 REFERÊNCIAS

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5 CONCLUSÃO

Os resultados obtidos no presente estudo nos permitiram fazer as seguintes

conclusões:

• A análise filogenética mostrou que 20∕86 das amostras analisadas

pertencem aos genótipos A, D e F;

• O genótipo A foi o mais freqüente 60% seguido dos genótipos D 35% e F

5%;

• Em indígenas o genótipo D foi o mais freqüente 55,6% seguido do

genótipo A 44,6%, não encontrados o genótipo F entre as amostras de

indígenas avaliadas;

• O perfil de distribuição dos genótipos encontrados reflete o padrão de

ocupação histórica da região.

34

6 REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS

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7 ANEXOS

7.1 Certificado de Aprovação no Comitê de Ética e Pesquisa

7.1.1 Hepatites virais no município de Lábrea: O impacto na saúde pública

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7.1.2 Febre Negra de Lábrea: O papel das populações indígenas na epidemiologia

da hepatite B e Delta

40

7.2 Termo de consentimento livre esclarecido

TERMO DE CONSENTIMENTO LIVRE E INFORMADO

41

Instituição: Fundação de Medicina Tropical do Amazonas – FMTAM. Orientadores Responsáveis/ Coordenadores: Prof. Dr. Wornei S. M. Braga Investigadora responsável: Prof. Dr. Wornei S. M. Braga Compromisso Assumido O (A) Sr (a)_________________________________________________, aqui denominado(a), participante de investigação da Fundação de Medicina Tropical do Amazonas - FMTAM, está sendo convidado e concorda livremente em participar como voluntário(a) em um estudo com o objetivo de estudar os aspectos clínicos e a biologia do vírus da hepatite B e Delta em populações indígenas do município de Lábrea – Amazonas. Podendo afastar-se do estudo a qualquer momento, sem que este fato lhe venha causar problemas. Os exames e o atendimento médico para o estudo serão gratuitos. O Sr (a) receberá todos os cuidados necessários durante o exame médico e na coleta do sangue. O sangue será unicamente utilizado para este estudo e não será guardado nem servirá para outros fins e/ou outros projetos de pesquisa. O problema de saúde A hepatite B é uma doença muito comum em muitas partes do mundo. A região amazônica é conhecida como uma das regiões de maior ocorrência de hepatite B e Delta, e suas conseqüências, no mundo. No Estado do Amazonas, a região do rio Purus é tida como uma das de maior ocorrência dessa doença, inclusive com uma forma grave, descrita desde o final dos anos sessenta, conhecida como Febre Negra de Lábrea. Como o Sr(a), está sendo convidado a participar deste projeto de pesquisa, antes de assinar este TERMO, deve tirar todas as duvidas, informando-se adequadamente, podendo realizar quaisquer perguntas para seu esclarecimento. Objetivo da Investigação Estudar os aspectos clínicos e a biologia do vírus da hepatite B e Delta em populações indígenas do município de Lábrea – Amazonas, calha do rio Purus. Benefícios A participação é voluntária, e o Sr(a) está sendo convidado a colaborar, no entanto, estará, com certeza contribuindo para o avanço da medicina e conhecimento da hepatite B e Delta, bem como será beneficiado com tratamento clínico caso seja encontrado a presença de doença. Riscos Potenciais Os procedimentos do projeto não colocaram a pessoa que participar em nenhum risco, exceto o desconforto da furada da agulha para a retirada do sangue. O procedimento será realizado com sistema de coleta á vácuo, e a pessoa responsável seguirá todos os procedimentos padrões de segurança evitando acidentes que coloquem em risco de contaminação o voluntário e o membro de nossa equipe. Sigilo dos Dados confidenciais Foi informado do conteúdo deste TERMO DE CONSENTIMENTO LIVRE E INFORMADO, e resolvi participar voluntariamente, depois de ter formulado perguntas e de ter recebido respostas sobre elas. Declaro dar meu consentimento que permanecerá guardado de uma forma confidencial, para pr-oteger minha identidade. Ressarcimento/Indenização: Ao Participar desse projeto, o Sr(a) será assistido, pela Instituição patrocinadora caso ocorra algo referente aos procedimentos do projeto que estará participando. ________________________________ ____________________________ Assinatura do Voluntário ou responsável Assinatura da Testemunha _____________________________________ Data: ____/____/____

Assinatura do Investigador

7.3 Questionários

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7.3.1 QUESTIONÁRIO DE INVESTIGAÇÃO EPIDEMIOLÓGICA DE DOENÇA ICTEROHEMORRÁGICA EM POPULAÇÕES INDÍGENAS. Número de identificação_________________ ______________________________________________________________ I- IDENTIFICAÇÃO ______________________________________________________________ 1-Nome________________________________________________________ 2-Sexo mas[ ] fem[ ] 3-Qual é a sua data de nascimento? ___/___/___ ou, se não souber, qual a sua idade aproximada? ____anos. 4-Etnia__________________ 5 – Que língua você fala normalmente? ____________________________ 6 -Tem mulher ou marido ? [ ]sim [ ] não 7 - Veio de outra aldeia ? [ ] sim [ ] não, se sim local______________ 8 - Tempo que vive neste local__________________________________ 9 - Razões para mudança__________________________________________ _______________________________________________________________ II-FATORES DE RISCO. ______________________________________________________________ 1-Com que idade arrumou mulher ou marido pela 1ª vez ?____anos, quantas vezes_____ 2-Presença de lesões de pele Sim [ ] Não [ ] Se Sim Tipo de lesão ? [ ] ferimento [ ] ferimentos infectados [ ] picada de inseto [ ] escabiose [ ] micose superficiais [ ] outros, especificar________________________________________ ___________________________________________________________ 3-Tatuagem,escarificações Sim[ ] Não[ ] Se Sim, que material utilizou____________________________ outras pessoas usaram o mesmo material Sim [ ] Não [ ] 4- Orelha furada Sim[ ] Não[ ] Se Sim, que material utilizou___________________________ outras pessoas usara o mesmo material Sim [ ] Não [ ] 5-Alguém na sua família teve hepatite nos últimos 6 meses Sim[ ] Não[ ]. Se sim, quem? [ ]Mãe [ ] Pai [ ] Irmão/ã [ ] Companheiro/a [ ] Filho/a [ ] Outros 6-Dorme junto com outras pessoas Sim [ ] Não [ ]

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7-Utiliza plantas quando está doente? Sim[ ] Não[ ] Se sim, em que formas as usa mais frequentemente ? [ ] Chá [ ] Emplasto [ ] Emulsão [ ] outros, especifique_____________________________________ 8-Passado de ictericia? Sim[ ] Não[ ] 9-Passado de urina escura? Sim[ ] Não[ ] 10-Teve hepatite? Sim[ ] Não[ ]. 11 História de vacina contra hepatite B ? [ ] SIM [ ] NÃO 12- Número de doses: [ ] UMA Data da 1ª DOSE ____/_____/_____ [ ] DUAS Data da 2ª DOSE ____/_____/_____ [ ] TRÊS Data da 3ª DOSE _____/_____/_____ 13- Teve Malária? ( ) SIM ( ) NÃO Se sim, quantas vezes? ___________________ 14 – Teve Tuberculose? ( ) SIM ( ) NÃO 15 – Já foi operado ou tomou sangue? ( ) SIM ( ) NÃO Se sim, especificar ______________________________ Quando? ______________________________________ 16 – Bebe? ( ) SIM ( ) NÃO Se sim, que tipo de bebida? ________________________________ Qual quantidade e freqüência? ______________________________ 17 – Fuma? ( ) SIM ( ) NÃO Se sim, quantos cigarros por dia? ___________________________ 18 – Usa algum outro tipo droga? ( ) ( ) Se sim, especificar ______________________________________ III – CRIANÇAS MENORES DE 5 ANOS. 1 – Nasceu de parto normal? ( ) SIM ( ) NÃO 2 – Nasceu no hospital ou na aldeia? ________________________________ 3 – Quanto pesou? _________ Se não foi pesado, aparentava ser normal ou muito pequeno e magro? __________________ 4 – Mamou no peito? ( ) SIM ( ) NÃO Se sim, quanto tempo? ______________ 5 – Falou com quantos anos? ____________ 6 – Andou com quantos anos? ____________ Observação____________________________________________________ ______________________________________________________________

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______________________________________________________________ ______________________________________________________________ ______________________________________________________________ ______________________________________________________________ ______________________________________________________________ ______________________________________________________________ DATA DA ENTREVISTA ___/___/___

7.3.2 Questionário do projeto “Hepatites virais no município de Lábrea: O impacto na Saúde Pública” FUNDAÇÃO DE MEDICINA TROPICAL DO AMAZONAS GERÊNCIA DE VIROLOGIA Questionário Projeto: Hepatites virais no município de Lábrea: O impacto na Saúde Pública

Nº da Amostra: ____________ Família: ____________________ IDENTIFICAÇÃO 1 – Nome:_____________________________________________________________________ 2 – Parentesco com o responsável pela família: [ ]Esposa(o) [ ]Filho(a) [ ]Pai/Mãe [ ]Irmão(ã) [ ]Enteado(a) [ ]Sobrinho(a) [ ]Neto(a) [ ]Agregado [ ] outro: ____________________ 2 – Endereço: _______________________ Localidade: _________________________________ 3 – Idade: __________________ anos 4 – Data do nascimento:______/_____ /______5 – Sexo: [ ] Masculino [ ] Feminino 6 – Procedência:_________________________ 7 – Tempo em que vive neste local:_____________________________________ 8- Razões para mudança:_________________________________________________________ ______________________________________________________________________________ ASPECTOS SOCIO-ECONÔMICOS 1 – Já freqüentou ou freqüenta escola? [ ] SIM [ ] NÃO Se sim, quantos anos? _____________ 2 – Ocupação principal: _______________________ 3 – No momento você está: [ ] Casado [ ] Junto [ ] Separado/divorciado [ ] Viúvo [ ] Solteiro 4– Com que idade você se casou pela primeira vez? ________ anos. 5- Quantas vezes? _________ 6 – Renda familiar: R$ ________________________ 7 – Quantos cômodos tem a sua casa? _______ cômodos. 8 - Quantos quartos? ____________quartos. 9 - Quantas pessoas vivem na casa?_______ pessoas. 10 - Qual o número de pessoas por quarto?________ pessoas. ______________________________________________________________________________ FATORES DE RISCO ABASTECIMENTO DE ÁGUA TRATAMENTO DA ÁGUA

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[ ] Rio [ ] Poço [ ] Chuva [ ] Serv. Público [ ] Outros____________

[ ] Filtrada [ ] Fervida [ ] Clorada [ ] Não tratada [ ] Outros____________

DESTINO DO LIXO DESTINO DOS DEJETOS INSTALAÇÃO DO SANITÁRIO [ ] Coleta Pública [ ] Queimado [ ] Enterrado [ ] Mata [ ] Rio [ ] Outros__________

[ ] Fossa negra [ ] Mata [ ] Rio [ ] Esgoto público [ ] Outros____________

[ ] Dentro da casa [ ] Fora da casa [ ] Outros____________

1-Fez cirurgia? [ ] SIM [ ] NÃO Se sim, que tipo?____________________________ Onde?____________________ Por quê? _____________________Quando?_____/_____/_____ 2- Recebeu transfusão de sangue? [ ]SIM [ ]NÃO Se, sim, onde?___________________ Quando? _____/_____/_____ 3-Compartilha escov