UNIVERSIDADE DO ESTADO DO AMAZONAS FUNDAÇÃO DE MEDICINA TROPICAL DO AMAZONAS PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM MEDICINA TROPICAL MESTRADO EM DOENÇAS TROPICAIS E INFECCIOSAS

SELEÇÃO E OTIMIZAÇÃO DE PROTOCOLOS PARA DETECÇÃO DE Histoplasma capsulatum var. capsulatum POR REAÇÃO EM CADEIA DA

POLIMERASE (PCR)

IVANETE DE LIMA SAMPAIO

MANAUS 2010

ii

IVANETE DE LIMA SAMPAIO

SELEÇÃO E OTIMIZAÇÃO DE PROTOCOLOS PARA DETECÇÃO DE Histoplasma capsulatum var. capsulatum POR REAÇÃO EM CADEIA DA

POLIMERASE (PCR)

Dissertação apresentada ao Programa de Pós-Graduação em Medicina Tropical da Universidade do Estado do Amazonas em convênio com a Fundação de Medicina Tropical do Amazonas, para obtenção do título de Mestre em Doenças Tropicais e Infecciosas.

Orientador : Prof. Dr. João Vicente Braga de Souza

MANAUS 2010

iii

FICHA CATALOGRÁFICA

Sampaio, Ivanete de Lima

Seleção e otimização de protocolos para detecção de Histoplasma capsulatum var. capsulatum por reação em cadeia da polimerase. Ivanete de Lima Sampaio. - Manaus, 2010. xiii, 59 fls.

Dissertação de Mestrado - Universidade do Estado do Amazonas. Programa de Pós-graduação em Medicina Tropical.

Título em inglês: Selection and optimization of protocols for detection of Histoplasma capsulatum var capsulatum by polymerase chain reaction.

1.Histoplasmose. 2. PCR 3. Diagnóstico

iv

FOLHA DE JULGAMENTO

SELEÇÃO E OTIMIZAÇÃO DE PROTOCOLOS PARA DETECÇÃO DE Histoplasma capsulatum var. capsulatum POR REAÇÃO EM CADEIA DA

POLIMERASE (PCR)

IVANETE DE LIMA SAMPAIO

“Esta Dissertação foi julgada adequada para obtenção do Título de Mestre em Doenças Tropicais e Infecciosas, aprovada em sua forma final pelo Programa de Pós-Graduação em Medicina Tropical da Universidade do Estado do Amazonas em convênio com a Fundação de Medicina Tropical do Amazonas”.

Banca Julgadora:

______________________________________

João Vicente Braga de Souza Dr. Presidente

______________________________________

Aya Sadahiro Dra. Membro

______________________________________

Cíntia Mara da Costa Oliveira Dra. Membro

v

Ao meu irmão Ercílio de Lima Sampaio ( in memorian).

Dedico

vi

AGRADECIMENTOS

Agradeço a Deus e seu filho Jesus Cristo, por demonstrar tamanho amor por mim

através do milagre da vida, por estar ao meu lado nos momentos bons e ruins, por

ser tão bom comigo e com todos que eu amo, por ter me dado chances de trilhar

caminhos com tanta luz, sorte, oportunidades e, principalmente, por ter semeado

esses caminhos com pessoas tão especiais.

Minha mãe Maria, pelo amor incondicional, tudo que sou devo a você.

Adrian, por todo amor, carinho, compreensão e dedicação, você é um anjo bom na

minha vida.

Ao meu querido mestre e amigo, Dr. João Vicente, pela constante orientação,

competência, paciência, persistência e companheirismo, por cada um de seus

ensinamentos brilhantes, por todo esse período de convivência e, principalmente,

por ter acreditado em mim. Agradeço por cada momento, desde o mais difícil ao

mais descontraído, por nunca ter me abandonado durante esta caminhada. Por fazer

parte da minha história para meu crescimento pessoal e profissional. Aqui,

demonstro toda minha gratidão, admiração, respeito e sincero afeto.

Dra. Érica Souza, pelo apoio, amizade e compreensão, pelos momentos que

abdicou da companhia de seu esposo Dr. João Vicente, para que fosse possível a

realização deste trabalho, pelo apoio logístico na compra do material, pela

oportunidade de desfrutar da convivência e amizade da família Souza... Obrigada.

Erick Andrei, com sua colaboração carinho e dedicação tornou mais fácil a

realização deste trabalho.

Mirlane, pela colaboração em diversas fases deste trabalho com sugestões e

conhecimentos, pela amizade e apoio nas horas de necessidade

Ana Karla, pelas horas de trabalho e companheirismo no Laboratório do Instituto de

Pesquisas da Amazônia.

vii

Rayka, pelo apoio e compreensão, pelas palavras de consolo e encorajamento nos

momentos mais difíceis, por tudo que passamos juntas desde que Deus me

presenteou com sua amizade.

As funcionárias do Laboratório de Micologia da Fundação de Medicina Tropical do

Amazonas, Antonieta, Telma e Luiza pelo apoio e colaboração.

A Bioquímica Carla Silvana, por permitir o uso das linhagens dependências e

equipamentos do Laboratório de Micologia da Fundação de Medicina Tropical do

Amazonas.

Ao Bioquímico Mauricio Ogusku, por suas colocações brilhantes, sugestões e

colaboração no decorrer deste trabalho

Dra. Aya Sadahiro, por toda sua competência, amizade, palavras de apoio,

colaboração e sugestões.

Samira, doutoranda do Instituto de Pesquisas da Amazônia por estar sempre

disposta a ajudar.

Eliane e Ana Cristina, pela colaboração em todos nos momentos de necessidade no

Laboratório de Micologia do Instituto de Pesquisas da Amazônia.

Senhores Francisco, Raimundo e Rosalvo auxiliares do laboratório de

Micobacteriologia do Instituto Nacional de Pesquisas da Amazônia

Aos Colegas citopatologistas do Laboratório Municipal de Citopatologia Prof.

Sebastião Ferreira Marinho: Ana Lúcia, Antônio, Ileinisa, Lilia Célia, Alisson, Bruno,

Márcia, Rita, Ruth. Aos técnicos James e Samantha, e especialmente ao Diretor

Edson Gomes pela compreensão e colaboração para que a realização deste

trabalho fosse possível.

Todos os amigos e colegas, farmacêuticos, bioquímicos, médicos, biólogos e

enfermeiros com quem dividi horas de estudos, descontração e amizade na

graduação, especialização e mestrado.

viii

Fundação de Medicina Tropical do Amazonas, ao Departamento de Bacteriologia na

pessoa da Bioquímica Rossicleia Lins Monte. Departamento de Virologia na pessoa

da Dra. Cíntia Oliveira, Michele e Márcia pela oportunidade, pela acolhida nos

laboratórios e empréstimo de equipamentos, que muito contribuíram para o

desenvolvimento desta pesquisa.

Corpo docente do Curso de Pós Graduação em Medicina Tropical da Universidade

do Estado do Amazonas, especialmente á Dra. Graça Barbosa por todos os

ensinamentos e sugestões.

Funcionários da secretária do Programa de Pós Graduação em Medicina Tropical da

Universidade do Estado do Amazonas, Marcos, Conceição, Bruno e Rayssa.

CNPq, SUFRAMA, CAPES, FMURAKI e FAPEAM pelo apoio financeiro.

Todas as pessoas que direta ou indiretamente contribuíram para o desenvolvimento

e conclusão deste trabalho.

ix

RESUMO

O diagnóstico laboratorial da Histoplasmose apresenta problemas de

sensibilidade, especificidade e tempo de execução. Por este motivo, o presente

estudo teve como objetivo selecionar e otimizar três protocolos para detecção de

Histoplasma capsulatum var. capsulatum pela reação em cadeia da polimerase

(PCR). Foram avaliadas três metodos de extração de DNA e três métodos de PCR.

O método de extração de DNA que demonstrou as melhores razões de pureza foi o

que utilizou membranas de sílica (QIAamp Tissue and Blood- (Qiagen) e o método

de amplificação que demonstrou a maior capacidade de detecção foi o que tinha

como gene alvo “a proteína de 100 kDa”. A PCR selecionada teve a concentração

dos seus reagentes otimizada e foi determinada sua co-positividade e co-

negatividade frente a amostras de sangue inoculadas com células de H. capsulatum.

A otimização da concentração dos componentes da PCR demonstrou que a reação

suportou variações significativas na concentração destes e o ensaio para

determinação da co-positividade e co-negatividade demonstrou que a PCR

apresentou capacidade de detecção maior de H. capsulatum (10 pg de DNA) do que

a cultura.

Palavras chave: Histoplasma capsulatum, Histoplasmose, Diagnóstico, PCR

x

ABSTRACT

The conventional diagnosis of Histoplasmosis presents problems of sensitivity,

specificity and runtime. For that reason, the aim of this work was to select and

optimize methods for detection of Histoplasma capsulatum var. capsulatum by

polymerase chain reaction (PCR). Three methods of DNA extraction and three

methods of PCR were evaluated. The method of DNA extraction that presented the

best purity ratio was the methodology that used the silica membrane (QIAamp Blood

and Tissue-(Qiagen) and the amplification method that used the “protein of 100 kDa”

as target gene presented the best detection capacity. The selected PCR had the

concentration of its components optimized and it was determined its sensitivity and

specificity using samples of blood with H. capsulatum cells. The optimization of PCR

components demonstrated that the present reaction supported significant variations

in the components concentration and the assay that was used for the determination

sensitivity and specificity showed that PCR was better detection of H. capsulatum (10

pg of DNA) than cultures.

Key words: Histoplasma capsulatum, Histoplasmosis, Diagnose, PCR

xi

LISTA DE FIGURAS

Figura 1 Fluxograma das atividades da dissertação...................................................... 12

Figura 1A Produtos de amplificação de H. capsulatum obtidos pelas metodologias

descritas por Bialek , Guedes e Bracca..........................................................

25

Figura 2 A Influência das concentrações dos reagentes nos produtos PCR obtidos nos

experimentos de otimização.............................................................................

25

Figura 3 A Produtos de PCR obtidos na detecção das diferentes concentrações de

células H. capsulatum em sangue...................................................................

26

LISTA DETABELAS

Tabela 1 Protocolos de PCR investigados...................................................................... 16

Tabela 1 A Concentração e razão de pureza do DNA de H. capsulatum obtido pelos

métodos de extração avaliados........................................................................

24

Tabela 2 A Resultados da PCR e da hemocultura frente às diferentes amostras............. 26

Tabela 3 A Co positividade e co negatividade da PCR com a hemocultura ...................... 27

xii

LISTA DE ABREVIATURAS

Aids - Aquired immune deficiency syndrome (Síndrome da Imunodeficiência

Adquirida)

CTAB - Brometo de cetiltrimetilamônio

DNA - Ácido desoxirribonucléico

dNTP - Desoxirribonucleotídeos trifosfatados

EDTA - Ácido etileno diamino tetracético

HE - Hematoxilina-Eosina

HIV - Human Imunodeficience Virus (Vírus da Imunodeficiência Humana)

ITS - Internal Transcribed Spacer (Espaço de Transcrição Interna)

Kb - Quilo base (1000 pares de bases)

kDa - Quilo dalton

pb - Pares de bases

PCR- Reação em Cadeia da Polimerase

rDNA - DNA ribossomal

RNA - Ácido ribonucleico

RNAse -Ribonuclease

RPM - Rotações por minuto

Tris - Tris-(hidroximetil)-aminometano

Μm - Micrômetro

var - Variedade

xiii

SUMÀRIO

1 Introdução....................................................................................................... 1

1.1 O fungo Histoplasma capsulatum var. capsulatum ....................................... 1

1.2 Diagnóstico convencional da Histoplasmose................................................. 4

1.3 Diagnóstico molecular: técnicas baseadas na Reação de Cadeia da Polimerase

(PCR)............................................................................................

5

1.4 Comparação entre o diagnóstico convencional e o diagnóstico molecular..... 8

2.0 Objetivos........................................................................................................... 10

2.1 Geral................................................................................................................. 10

2.2 Específicos........................................................................................................ 10

3.0 Material e Métodos........................................................................................... 11

3.1 Avaliação da metodologia de extração de DNA ............................................. 13

3.2 Seleção de protocolo de PCR......................................................................... 15

3.3 Otimização dos reagentes da PCR.................................................................. 17

3.4 Determinação da co-positividade e co-negatividade da reação de PCR........ 18

4.0 Resultados: Artigo - Seleção e otimização de métodos para detecção de

Histoplasma capsulatum var. capsulatum por reação em cadeia da

polimerase(PCR)..........................................................................................................

19

5.0 Conclusões...................................................................................................... 33

6.0 Referências Bibliográficas................................................................................ 34

7.0 Anexos............................................................................................................. 43

1

1. INTRODUÇÃO 1.1 O fungo Histoplasma capsulatum var. capsulatum

Ecologicamente o Histoplasma capsulatum é um fungo termodimórfico,

saprobionte, encontrado de forma ubíqua na natureza, disseminado pelo solo e

poeira ricos em nitrogênio e ambientes contaminados por excrementos de

aves, morcegos e outros mamíferos infectados 22. Desde seu isolamento, por

Darling em 1906, o H. capsulatum tem sido documentado como o agente

etiológico da histoplasmose e sua forma teleomórfica é denominada

Ajellomyces capsulatus43, 45,53. Taxonomicamente, o H. capsulatum, é um

Eucarioto, do reino Fungi, encontra-se na divisão (filo) Ascomycota, subdivisão

(subfilo) Ascomycotina, classe Ascomycetes, ordem Onygenales, família

Onygenaceae, gênero Histoplasma (Ajellomyces), espécie Histoplasma

capsulatum; sendo que esta apresenta três variedades: H. capsulatum var.

capsulatum, H. capsulatum var. duboisii e H. capsulatum var. farciminosum 37,55. Tais variedades do fungo são evolutivamente, ecologicamente e

biologicamente diferentes, e cada uma responsável por uma forma da doença,

43,45. Na natureza e em cultivo a temperatura ambiente apresenta-se em sua

forma filamentosa, de hifas delicadas, hialinas, septadas e ramificadas, que

carreiam macro-conídios tuberculados, de 8 a14mm de diâmetro, e micro-

conídios, com diâmetros de 2 a 5 mm, representam a forma infectante do

fungo26. Em cultivo a 37 ͦ C e nos tecidos do homem e de animais infectados

apresentam-se na forma parasitária como elementos leveduriformes

unibrotantes2, 64.

O fungo infecta os humanos e outros mamíferos quando é inalado na

forma de conídios ou fragmentos de hifas em suspensão no ar21 A infecção

primária conhecida como primo infecção ocorre no pulmão. Durante a primo

infecção, o fungo modifica sua morfologia filamentosa para leveduriforme, que

invade e multiplica-se dentro de macrófagos66 35. Atividades e ocupações que

envolvem a exposição a dejetos de aves e de morcegos aumentam o risco de

infecção22, 25.

A histoplasmose é uma micose profunda causada pelo Histoplasma

capsulatum var. capsulatum. A doença ganhou renovada importância, dada sua

2

maior freqüência e por seu comportamento oportunista em paciente

imunodeprimidos tais como pacientes com Aids. É um problema de saúde

pública mundial devido ao seu caráter de endemia que foi estabelecido com a

Aids. A partir de 1985, a ocorrência de infecção disseminada por H. capsulatum

em indivíduos com sorologia positiva para o vírus da imunodeficiência humana

(HIV) é considerada como um critério maior no diagnóstico da Aids11. Segundo

dados do Ministério da Saúde, no período de 1980-2000, 0,7% dos pacientes

com Aids e idade > 13 anos apresentavam histoplasmose disseminada no

momento da notificação do caso de Aids4.

A histoplasmose é endêmica no meio-oeste dos Estados Unidos e na

América Latina45 53 61. Entre 1981 e 1998, 56 casos de histoplasmose

disseminada haviam sido descritos no Hospital Cayenne (Guiana Francesa). A

partir de 1998, o número de pacientes aumentou a cada ano. Em 2004, 21

novos casos foram diagnosticados, neste mesmo hospital 42. É uma das micoses sistêmicas mais freqüentes no Brasil, com alta

prevalência em nossa população, principalmente no Rio Grande do Sul,

Sudeste e Norte22.

A maioria das infecções são sub-clínicas sendo freqüentemente

limitadas pela resposta imunológica do hospedeiro. No entanto, em 5% dos

casos, falhas no sistema imunológico podem permitir o desenvolvimento da

infecção pulmonar (aguda ou crônica) ou disseminada37. Indivíduos

imunocomprometidos, particularmente os com Aids avançada, são acometidos

pela histoplasmose disseminada66.

As manifestações clínicas podem ser didaticamente classificadas como:

1) assintomáticas; 2) pulmonar aguda; 3) pulmonar crônica e 4) disseminada60.

A forma assintomática compreende aproximadamente 90-95% dos

casos de histoplasmose e nesses pacientes não é observada nenhuma

sintomatologia clínica. O único dado observado está relacionado a uma reação

positiva do teste intradérmico à histoplasmose. Apesar desses pacientes não

revelarem nenhuma sintomatologia clínica, em 1/3 dos casos podem ser

observados focos de calcificação nos pulmões e em órgãos componentes do

3

sistema retículo-endotelial, como baço e gânglios linfáticos. Esses pacientes

são a prova da cura espontânea da histoplasmose17.

Entretanto, 5% dos pacientes que entram em contato, por via

respiratória, com a forma infectante do H. capsulatum, desenvolvem uma

primo infecção com sintomatologia, que em muitos casos lembra um processo

gripal causado pelo vírus da influenza. Dessa forma, podem ser observados

suores noturnos, tosse, febre, perda de peso, eritema multiforme e eritema

nodoso. Esses sinais e sintomas podem ser mais ou menos intensos, na

dependência do inoculo aspirado pelo paciente e na sua habilidade

imunológica, culminando na maioria dos casos em cura espontânea64.

Em alguns pacientes, entretanto, a cura espontânea não ocorre, e

observa-se então uma persistência da tosse, perda de peso, expectoração

muco purulenta com laivos de sangue, hemoptise, dispnéia de esforço, e febre

baixa ao entardecer. Este quadro clínico, caracterizado como a forma crônica

da histoplasmose pulmonar, reflete uma cópia fiel da tuberculose pulmonar.

Acredita-se que os pacientes que evoluem para essa forma possuem, em sua

maioria, problemas no parênquima pulmonar, problema esse que de uma forma

ou outra interfere com a resposta imune do hospedeiro43.

A histoplasmose disseminada é mais comumente observada em

pacientes com Aids, crianças na primeira infância (< 2 anos) ou, ainda,

pessoas com outras formas de imunossupressão, como linfomas e leucemias.

A reativação de conídios inalados previamente é o principal precursor da

doença em sua forma disseminada30. O fungo multiplica-se dentro dos

macrófagos. Estas células cheias de leveduras permeiam a medula óssea,

baço, fígado e pulmão. A mortalidade nos imunossuprimidos chega a 90 %,

sendo observada entre outros sintomas, febre, perda de peso, hepatomegalia,

esplenomegalia, enterite, lesões na pele, meningite, corneoretinite34, 41,57. A

doença é fulminante devido a várias conseqüências, entre elas: insuficiência

respiratória, hemorragias gastrointestinais, e uma síndrome que lembra sepse

bacteriana com choque, insuficiência hepática, renal e coagulação intravascular

disseminada, são descrita em 10 a 20% dos pacientes com Aids e

histoplasmose64. De elevada letalidade, esta síndrome parece representar uma

manifestação tardia da histoplasmose, em casos nos quais a confirmação do

4

diagnóstico é demorada e o inicio do tratamento postergado, sem tratamento, a

forma disseminada é 100% fatal60.

1.2 Diagnóstico convencional da histoplasmose

O diagnóstico convencional da histoplasmose é baseado na detecção de

antígenos, testes sorológicos, microscopia direta e cultura53.

A pesquisa de antígenos de Histoplasma em urina ou soro através de

radioimunoensaio, ou métodos enzimáticos possui variada sensibilidade

dependendo do tempo de desenvolvimento da infecção, dos sítios acometidos

e do estado clínico do acometido24. A sensibilidade do teste de detecção de

antígenos de Histoplasma é de 95% na urina, e 86% no soro de pacientes com

Aids e histoplasmose disseminada 65,66, no entanto, variam entre 20 a 81 % em

pacientes não-imunocomprometidos com histoplasmose pulmonar24, 63,67,

reações cruzadas com outros fungos patogênicos podem ocorrer30 46.

Testes sorológicos como imunodifusão e fixação do complemento

podem ser úteis. Na imunodifusão, a presença de banda de preciptina H

relacionada com infecção ativa, é vista ocasionalmente, enquanto a banda M

pode manter-se presente por anos 25,26. Falsos negativos ocorrem em 20 a

50% dos pacientes imunocomprometidos que não são capazes de produzir

anticorpos de resposta27, 65,66. Falsos positivos têm sido observados em

pacientes com outras micoses disseminadas como a Paracoccidiodomicose50.

Testes sorológicos de precipitação para detectar anticorpos contra antígenos

específicos (como o antígeno M) podem ser utilizados na identificação da

infecção29,32,47,69,70,71. No entanto, estes têm apresentado as mesmas

dificuldades já descritas68,36.

A análise microscópica direta de material biológico é muito difícil, pode

ser útil desde que: 1) a amostra seja adequada, 2) o observador possua

experiência e 3) os corantes histoquímicos/citológicos sejam adequados.

Infelizmente, H. capsulatum pode ser confundido devido a sua semelhança

morfológica com as espécies de Cândida e Sporothrix schenckii. Colorações

como May-Grunwald-Giemsa e Hematoxilina Eosina revelam células

leveduriformes ovais fagocitadas por histiócitos2. Outras colorações podem ser

utilizadas, no entanto os achados micro morfológicos são ainda menos

5

específicos. A sensibilidade da técnica gira em torno de 50%. Técnicas de

imunoistoquímica têm sido utilizadas e avaliadas. No entanto, elas apresentam

a baixa sensibilidade da microscopia convencional e a falta de especificidade

da utilização de anticorpos35.

Outro método convencional e bem difundido é a cultura, considerada o

padrão ouro para detecção do H. capsulatum. O fungo pode ser cultivado a

partir de sangue, medula óssea, biópsias, secreções respiratórias e lesões da

pele. Mieloculturas e hemoculturas são positivas entre 70% a 90% dos casos,

enquanto que, em culturas de material do trato respiratório a sensibilidade é

menor (50-70%)17, 36, 37, 43, 73. Infelizmente, a consistente identificação da cultura

do fungo demora de duas a seis semanas. Devido à existência de fungos que

mimetiza a fase filamentosa do Histoplasma capsulatum, existe a necessidade

de testes confirmatórios como, testes para detecção de exoantígenos e

conversão micélio-levedura induzidos pela temperatura14, 28, 55. Este tempo

necessário para identificação do fungo representa um considerável atraso no

diagnóstico e terapia. Outro problema é a manipulação das culturas em

laboratório. As culturas de H. capsulatum apresentam risco para os

laboratoristas, exigindo grande preocupação com a biossegurança. Os

procedimentos de diagnósticos são numerosos e bem descritos, no entanto,

suas deficiências justificam novas pesquisas68.

1.3 Diagnóstico molecular: técnicas baseadas na Reação de Cadeia da Polimerase (PCR)

O desenvolvimento da técnica da Reação em Cadeia da Polimerase

(PCR) na década de 80 revolucionou a análise baseada em ácidos nucléicos,

permitindo a amplificação “in vitro” de seqüências específicas de DNA44.

Protocolos baseados em PCR têm sido descritos para o estudo de uma

variedade de fungos clinicamente importantes incluindo Cryptococcus

neoformans, espécies de Aspergillus, espécies de Cândida e H. capsulatum31.

Eles podem ser especialmente úteis em laboratórios inadequados para

realização de culturas ou com inexperiência no isolamento de H. capsulatum e

apresentam potencial para ser uma metodologia definitiva de diagnóstico

devido a sua velocidade, sensibilidade e especificidade51.

6

Numerosos métodos moleculares têm sido desenvolvidos para identificar

rapidamente fungos isolados e cultivados em meio sólido40 59, e diretamente de

hemoculturas6 13 58. Os alvos moleculares para a amplificação e detecção pelo

PCR são usualmente regiões conservadas com informação filogenética como

os genes do RNAr. RNA genes são também alvo de seqüenciamento para

identificação dos fungos 15 28 33 49.

A PCR simples com primers específicos para H. capsulatum é bem

descrita. Culturas deste fungo podem ser identificadas com alta especificidade

pelo uso desta metodologia39 42. No entanto, a detecção de H. capsulatum em

amostras biológicas é uma tarefa difícil devido à baixa concentração e

qualidade do DNA fúngico extraído de tecidos 9. Por outro lado, a PCR seguida

de seqüenciamento, além de sofrer os mesmos problemas de sensibilidade que

a PCR simples é uma técnica de difícil execução em rotina laboratorial, devido

à necessidade de pessoal qualificado40 54.

Várias pesquisas foram realizadas com genes que possuem uma única

cópia no genoma ou ainda com genes ribossomais. O ensaio da PCR tendo

como alvo genes do RNAr demonstrou sensibilidade. No entanto, a natureza

conservada dos genes do RNAr, comum a outros microorganismos causa

amplificações não específicas, levando os pesquisadores a buscarem novos

alvos para amplificação. Os trabalhos a seguir apresentam a evolução

cronológica destes estudos48 62 8.

Reid e colaboradores 52 detectaram pequenos números de esporos de

H. capsulatum em solo utilizando PCR, tendo como alvo a região ITS 5·8S do

RNAr. Os resultados sugeriram que o método pode ser aplicado em locais

conhecidamente contaminados por aves e morcegos.

Bialek e colaboradores5 realizaram um trabalho que pode ser

considerado como pioneiro e de referência para os demais. Eles realizaram

uma PCR tendo como alvo uma pequena subunidade do RNAr 18s e avaliaram

a infecção em cobaias. Os resultados promissores deste trabalho estimularam

uma seqüência de outros.

O próximo passo foi utilizar regiões de genes mais específicos de H.

capsulatum a fim de aumentar a especificidade das reações. Bialek e

colaboradores5 desenvolveram uma PCR tendo como alvo genes codificadores

de uma proteína de 100 KDa. Esta proteína é específica e essencial para a

7

sobrevivência de H. capsulatum em células humanas. O estudo demonstrou

uma maior especificidade desta região alvo quando comparada com as

reações que utilizaram a região 18S do RNAr como alvo para detecção da

espécie em 100 amostras biológicas.

Guedes e colaboradores27 desenharam quatro seqüências de

oligonucleotídeos para serem utilizados na PCR para detecção de Histoplasma

capsulatum var capsulatum. Estas utilizam como alvo o antígeno M. Produtos

de PCR de 111 e 279 bp foram amplificados com os primers denominados de

Msp1F-Msp1R e Msp2F-Msp2R, respectivamente. A PCR identificou

corretamente todas as 31 linhagens de H. capsulatum isoladas de humanos,

animais e solo. A especificidade dos primers foi confirmada pela ausência de

amplificação de produto genômico de Paracoccidiodes brasiliensis, Cândida

spp., Sporothrix schenckii, Cryptococcus neoformans, Blastomyces

dermatitidis, Coccidioides immitis, Aspergillus niger e Aspergillus fumigatus.

Bracca e colaboradores3 desenvolveram uma PCR para o diagnóstico

da histoplasmose utilizando como alvo o gene do antígeno H do H. capsulatum.

O ensaio demonstrou-se sensível e específico. Foi capaz de detectar material

correspondente a menos de 10 células leveduriformes sem apresentar reação

cruzada com o DNA de fungos e bactérias patógenas (Aspergillus flavus,

Aspergillus fumigatus, Aspergillus niger, Geotrichum sp., Cryptococcus

neoformans, Cândida albicans, Trichosporon sp., P. brasiliensis, Nocardia

asteroides, Staphylococcus aureus, Pseudomonas aeruginosa, Klebsiella sp.,

Streptococcus pneumoniae, Mycobacterium bovis, e M. tuberculosis).

Maubon e colaboradores42 avaliaram a PCR utilizando a metodologia

descrita por Bialek e colaboradores5 em 40 amostras de pacientes com

suspeita de histoplasmose disseminada. Todas as amostras com reação de

PCR positivas também tiveram culturas positivas. A PCR permitiu a obtenção

do resultado final em 48 horas, enquanto a microscopia permitiu a detecção

imediata do microrganismo somente em 38% dos pacientes. Os demais

pacientes tiveram que esperar, em média, 28 dias para o diagnóstico definitivo

da cultura. Este resultado veloz implicou na diminuição dos custos de

hospitalização, em um número menor de exames invasivos e, eventualmente,

em tratamentos incorretos. Quando foi avaliada a especificidade, a reação

amplificou apenas o DNA de H. capsulatum.

8

1.4 Comparação entre o diagnóstico convencional e o diagnóstico molecular

O diagnóstico molecular baseado na PCR não é utilizado rotineiramente

em laboratórios de patologia e micologia. Alguns laboratórios desenvolveram

protocolos próprios para detecção de toxoplasmose, leishmaniose e malária.

No entanto, estes não são amplamente utilizados. Em micologia médica

existem poucos protocolos bem conhecidos para diagnóstico. Um estudo

recente utilizando PCR em Tempo Real acoplada a extração automatizada de

DNA de sítios de Aspergilose mostrou baixa sensibilidade em relação à

detecção de antígenos em soro por ELISA16. O DNA de Pneumocystis jiroveci

demonstrou ser adequadamente detectado por um método utilizando PCR

recentemente descrito, no entanto, este protocolo ainda não se difundiu19.

Ensaios de PCR multiplex têm sido desenvolvidos para identificação de fungos

patogênicos oriundos de culturas, no entanto, estudos mais amplos ainda não

têm sido realizados para provar a aplicabilidade destes métodos em amostras

clínicas40. Recentemente um ensaio de PCR em Tempo Real foi descrito para

detectar com adequada sensibilidade e especificidade C. albicans em soro e

urina com a possibilidade de quantificar e controlar a evolução da doença

durante a terapia1.

Maubon e colaboradores42 têm sido pioneiros na utilização da Nested-

PCR para a detecção de fungemias na rotina laboratorial. De uma forma geral,

a maioria dos protocolos de PCR ainda não é satisfatória para o diagnóstico de

rotina em laboratórios de micologia 7.

Alguns trabalhos têm sido realizados comparando as técnicas

convencionais com metodologias baseadas em PCR. Entre estes, deve-se citar

o trabalho pioneiro realizado por Bialek e colaboradores5 O objetivo deste

estudo foi comparar a PCR com os métodos de coloração-exame direto a fim

de apresentar alternativas para a detecção de histoplasmose em tecido. PCR

foi a mais sensível das 5 metodologias aplicadas para detectar H. capsulatum

nas biopsias parafinadas de ratos infectados experimentalmente. Outro

trabalho que deve ser citado foi realizado por Bracca e colaboradores3. Estes

avaliaram a PCR (usando como alvo os genes do antígeno H) comparando-a

9

aos resultados obtidos de cultura e exames diretos. Quatro das 24 amostras de

sangue foram consideradas positivas na PCR, sendo que, duas destas

amostras tinham sido consideradas negativas pela cultura e exame direto. Uma

perfeita relação foi observada entre as três metodologias em quatro biopsias de

pele obtidas de pacientes com HIV e manifestações cutâneas.

Devido o exposto, a PCR é considerada uma ferramenta útil para o

diagnóstico da histoplasmose.

10

2. OBJETIVOS

2.1 Geral

Selecionar e otimizar protocolos para detecção de Histoplasma

capsulatum var. capsulatum por Reação em Cadeia da Polimerase (PCR).

2.2 Específicos

• Avaliar qual é a metodologia mais adequada para extração do DNA do

fungo H. capsulatum var. capsulatum. • Determinar entre as regiões de genes descritas na literatura ( Antígeno

H, Antígeno M e Proteína de 100 KDa), qual a mais sensível para a detecção

de H. capsulatum var capsulatum por PCR.

• Definir quais as condições ótimas para a reação de PCR . • Avaliar a co-positividade e co-negatividade da PCR em relação á

detecção pelo padrão ouro (cultura).

11

3. MATERIAL E MÉTODOS

Os procedimentos experimentais desta dissertação foram divididos em quatro

itens que serão descritos a seguir:

Avaliação da metodologia de extração. Três metodologias de extração para

obtenção do DNA de H.capsulatum var. capsulatum foram avaliadas. Para

definir a metodologia mais adequada os parâmetros de concentração e

qualidade do DNA extraído foram utilizados.

Seleção de metodologia de PCR. Foram avaliadas três metodologias de

reação de PCR. Foi considerada a mais apropriada a reação que gerou

produtos de PCR com as menores concentrações de DNA

Otimização das condições para a realização da PCR. A metodologia de

PCR selecionada como a mais sensível na detecção do DNA de H. capsulatum

var. capsulatum foi otimizada a fim de determinar as condições ideais para

visualização em eletroforese.

Determinação da co-positividade e co-negatividade entre PCR e Hemocultura. A metodologia de extração selecionada, e a reação de PCR

selecionada e otimizada foram utilizadas frente a amostras contaminadas

experimentalmente para determinar a co-positividade e co-negatividade entre

PCR e Hemocultura na detecção de H. capsulatum. A Figura 1 apresenta o

fluxograma das atividades da dissertação.

12

.

Ava

liaçã

o da

Met

odol

ogia

ex

traç

ão d

e D

NA

Se

leçã

o de

met

odol

ogia

de

PCR

O

timiz

ação

da

PCR

C

o-po

sitiv

idad

e e

Co-

nega

tivid

ade

PC

R /

Hem

ocul

tura

.

Extração Fenol-Cloroformio

Extração Precipitação por Sais

Extração Membrana de Sílica

Proteina 100 kDa (Bialek cols; 2002)

Quantificação do DNA 260/280nm

Micélio (90mg)

DNA diluído (25; 0,5; 1x10-1; 2x10– 3; 4x10-5; 8x10-8 ng)

Antígeno M (Guedes cols;

Antígeno H (Bracca cols; 2003)

PCR

DNA (50 ng)

MgCl2 (0,5; 1,18; 1,84; 2,5; 3,16; 3,82 e 4,5 mM)

dNTPs (50; 100; 150; 200 ; 250; 300 e 350 µM)

Primers HcIII e HcIV (0,1; 0,4; 0,7; 1,0; 1,3;1,6 e 1,9 µM)

Taq DNA polimerase (0,5; 0,84; 0,7;1,0;1,3;1,6;1,9 U/reação )

Temperatura de hibridização (56; 59; 62; 65; 68; 71oC)

Eletroforese

Eletroforese

Amostras de sangue contendo ou não células leveduriformes de H. capsulatum

(7x106, 7x105, 7x104, 7x103 e 7x102 células/mL)

Hemocultura

PCR selecionada

Resultados

Co-positividade

13

3.1 Avaliação da metodologia de extração de DNA

Três metodologias de extração de DNA foram comparadas: a) extração

baseada na utilização de membrana de sílica (Kit QIAamp Tissue and Blood,

Qiagen, Hilden, Germany), b) extração baseada na utilização de precipitação

por sais (Kit MasterPure™ DNA Purification Kit for Blood Version II, Epicentre-

USA) e c) extração de DNA por fracionamento por polaridade em Fenol-

Clorofórmio (Sambrook e Russel 56).

Amostras Foram utilizados neste estudo os isolados de H. capsulatum FMTAM

3242, FMTAM 3417 e FMTAM 3378, provenientes da coleção de fungos do

Laboratório de Micologia da Fundação de Medicina Tropical do Amazonas –

FMTAM. Estes vinham sendo conservados por repique contínuo há

aproximadamente seis meses, e foram reativados60. Os fungos foram repicados

em meios de cultura Agar Sabouraud, Agar Infusão de Cérebro/Coração e Agar

Mycosel e incubados a temperatura ambiente (obtenção da fase filamentosa)

em estufa a 37°C (obtenção da fase leveduriforme).

O presente estudo foi parte integrante das atividades de investigação

científica do projeto intitulado “Aspectos referentes à

implantação/implementação, na Fundação de Medicina Tropical do Amazonas,

de Diagnóstico Molecular para identificação de agentes causadores de

fungemias em pacientes com AIDS”. A utilização das culturas esteve em

conformidade com os preceitos da ética em pesquisa envolvendo seres

humanos (CNS 196/96) e complementares. Sendo que este projeto foi

aprovado no comitê de ética em pesquisa (CEP) da FMTAM (folha de rosto FR-

128939/2007).

Metodologia que utilizou membrana de sílica (QIAamp Tissue and Blood – Qiagen) A metodologia foi realizada como descrita pelo fabricante. Biomassa de

H. capsulatum (90 mg) foi retirada dos meios de cultura e adicionada em

Co-negatividade

Figura 1- Fluxograma das atividades da dissertação

14

microtubos (1,5 mL) contendo 180 μL de tampão ATL (Tissue Lysis Buffer) e 20

μL de proteinase K (20 mg/mL). A mistura foi incubada por 30 minutos a 56 oC

e o micélio residual macerado até se obter uma massa homogênea. Foi

adicionado 200 μL de tampão AL (Lysis Buffer) e incubado a 70 oC durante 10

minutos. Após adição de 200 μL de etanol a mistura foi transferida para um

microtubo contendo a coluna de sílica. O conjunto foi centrifugado a 8.000 G

por um minuto e a coluna foi lavada com 500 µL das soluções AW1 (8.000 G

por 1 min) e AW2 (12.000 g por 3 min). O DNA foi eluído pela adição de 100 μL

de tampão AE (Elution buffer).

Extração baseada na utilização de precipitação por sais (MasterPure™ DNA Purification Kit for Blood Version II, Epicentre-USA) A metodologia foi realizada como descrito pelo fabricante. Biomassa de

H. capsulatum (90 mg) foi incubada (30 minutos a 56 oC) em um microtubo

(1,5 mL) contendo 300 μL de Tissue and Cell Lysis Solution e 20 μL de

Proteinase K. Em seguida, a mistura foi macerada até apresentar-se

homogênea. Após 5 minutos em gelo, foram adicionados 175 μL de MPC

(Protein Precipitation Reagent) e centrifugado por 10 minutos a 12000 G. O

sobrenadante foi transferido para um microtubo (1,5 mL) contendo 500 μL de

isopropanol. O pellet de DNA, obtido após centrifugação (12 000 G por 10

minutos, 4oC ), foi lavado com 500 μL de etanol (70%), seco a temperatura

ambiente e solubilizado em 100 μL de Tampão TE (Tris-HCl [pH 8,0], 1 mM

EDTA).

Metodologia de fracionamento por polaridade (Extração Fenol-Clorofórmio) A metodologia de extração Fenol-Clorofórmio foi realizada a partir de

uma modificação na metodologia descrita por Sambrook e Russel 56. Biomassa

de H. capsulatum (90 mg) foi transferida para um microtubo (1,5 mL) contendo

300 μL de tampão CTAB e 90 mg de pérolas de vidro (0,45 mm). O micélio foi

macerado até obtenção de uma mistura homogênea. Tampão CTAB (200 μL)

foi acrescentado à mistura e, em seguida, incubada a 65°C por 10 minutos.

15

Uma mistura de fenol:clorofórmio:álcool isoamílico (25:24:1) foi adicionada (500

μL), as fases formadas foram homogeneizadas (agitador magnético por 5

minutos) e, em seguida, separadas por centrifugação (7 minutos, 10000 G,

15°C). A fase superior foi transferida para outro microtubo (1,5 mL) contendo

clorofórmio (500 μL) e foi repetido o processo de homogeneização e separação

das fases. Por fim, a fase superior foi transferida para outro microtubo (1,5 mL)

contendo álcool isopropílico (500 μL) e o DNA foi precipitado por centrifugação

(7 minutos, 10000 G, 15°C). O “pellet” de DNA foi lavado com 500 μL de etanol

(70%), após secar a temperatura ambiente foi solubilizado em 100 μl de

Tampão TE (Tris-HCl [pH 8,0], 1 mM EDTA).

Quantificação do DNA A concentração do DNA genômico foi verificada através de leitura em

espectrofotômetro GE (GeneQuant) no comprimento de onda de 260 nm,

assumiu-se que uma unidade de absorbância correspondeu a 50 µg/ml de

DNA38. Foram realizadas também leituras em comprimento de onda 280 nm, e

calculada a razão entre as absobâncias 260/280 para determinação do grau de

pureza do DNA. O protocolo que extraiu a maior quantidade de DNA, com a

maior pureza, foi considerado o mais adequado.

3.2 Seleção de protocolo de PCR

O DNA, obtido com o protocolo de extração que mostrou melhor

desempenho quanto à concentração e grau de pureza, foi utilizado a fim de

determinar qual a região gênica mais adequada para a detecção de DNA do H.

capsulatum var capsulatum. A amostra foi diluída nas concentrações (25; 0,5;

1x10-1; 2x10– 3; 4x10-5; 8x10-8 ng) e submetida à amplificação usando os três

protocolos de PCR descritos na Tabela 1. O protocolo que produziu banda

visível em gel de eletroforese com a menor concentração de DNA foi

considerado o mais adequado.

16

Tabela 1- Protocolos de PCR investigados Autor/Região alvo Condições da reação

Bialek cols 5

Proteina de 100

KDa

Primers: HcIII ((5-GAG ATC TAG TCG CGG CCA GGT TCA-3)

HcIV (5-AGG AGA GAA CTG TAT CGG TGG CTT G-3 ) Tamanho do produto: 210 -bp

[DNTP´s]: 100 µM

[Taq]: 1,5 U

[MgCl2]: 2,5 mM

[Primers]: 1 µM

[Amplificação]: 94°C por 5 min; 35 vezes 94°C por 30 s, 65°C por 30 s e 72°C

por 1 min e uma extensão final de 72°C for 5 min.

Bracca cols 3

Antígeno H

Primers: Hc2 (5-GCGGGGTTGGCTCTGCTCT-3)

Hc3 (5-TTGGAAACCCCGGGCTTG-3)

Tamanho do produto: 439-bp

[DNTP´s]: 200 µM

[Taq]: 1U

[MgCl2]: 2 mM

[Primers]: 0.4 µM

[Amplificação]: 96°C for 6 min; 35 cycles of 94°C for 1 min, 59°C por 1min, e

72°C por 1 min, extensão final de 72°C por 10 min.

Guedes27

Antígeno M

Primers: Msp2F (CGG GCC GCG TTT AAC AGC GCC)

Msp2R (ACC AGC GGC CAT AAG GAC GTC)

Tamanho do produto: 279-bp

[DNTP´s]: 200 μM

[Taq]: 2,5 U

[MgCl2]: 1,5 mM

[Primers]: 20 pmol

[Amplificação]: 95°C por 5 min, 35 ciclos de 1 min a 95°C, 1 min a 70°C e 1

min a 72°C seguidos de uma extensão final de 72°C por 5 min.

17

Eletroforese

A eletroforese foi realizada como descrita por Bialek5. Os produtos de

PCR foram corados (SYBR™ Safe DNA, Invitrogen-USA) e submetidos à

eletroforese em gel de agarose 1,5 % (preparado em tampão Tris-Bórico-

EDTA, 0,1 M Tris, 0,09 M ácido bórico, 0,001 M EDTA, pH 8.4). A eletroforese

foi conduzida a 120 V por 60 min. O marcador O'RangeRuler™50bp DNA

Ladder (Fermentas) foi utilizado para determinação do tamanho dos produtos

de PCR. As bandas foram visualizadas em transluminador de luz Azul Safe

Imager™ Invitrogen.

3.3 Otimização dos reagentes da PCR O protocolo descrito por Bialek e cols5, selecionada no item anterior foi

otimizada de forma univariada. Os componentes e concentrações avaliados

são apresentados a seguir: 1) MgCl2 (0,5; 1,18; 1,84; 2,5; 3,16; 3,82 e 4,5 mM);

2) dNTPs (50; 100; 150; 200 ; 250; 300 e 350 µM); 3) Primers HcIII e HcIV (0,1;

0,4; 0,7; 1,0; 1,3;1,6 e 1,9 µM); 4) Taq DNA polimerase (0,5; 0,84; 0,7 ; 1,0 ;

1,3, 1,6; e 1,9 U/reação ) e 5) temperatura de hibridização (56; 59; 62; 65; 68

e 71 oC). Foram utilizados 5 μL do DNA molde (50 ng) para cada reação de

volume total de 25 μL.

3.4 Determinação da co-positividadee co-negatividade da reação de PCR.

Amostras Foram utilizadas trinta alíquotas de 1,0 ml de sangue periférico de um

doador saudável. Quinze destas foram contaminadas por concentrações

conhecidas de células leveduriformes de H. capsulatum (7x106, 7x105, 7x104,

7x103 e 7x102 células/mL) originadas de três isolados diferentes (FMT3417,

FMT3378 e FMT3342). Todas as amostras foram submetidas à detecção de H.

capsulatum por PCR (metodologias selecionadas e otimizadas nos itens

anteriormente descritos) e por hemocultura.

18

Hemocultura As amostras foram processadas de modo convencional como descrito

por Sidrim cols60. Inicialmente, as trinta alíquotas de 1,0 mL de sangue foram

transferidos para frasco de hemocultura contendo 5,0 mL de caldo de Infusão

de cérebro e coração. Após 15 dias de incubação (25oC), 200 µL da

hemocultura foi transferido para tubos contendo meios Ágar Sabouraud, Ágar

Infusão de Cérebro/Coração e Ágar Micosel. As culturas desenvolvidas foram

caracterizadas fenotipicamente37.

Determinação da co-positividade e co-negatividade da técnica A comparação entre o diagnóstico convencional e o diagnóstico

molecular foi feita como descrito por Bialek cols5. A cultura foi considerada

positiva quando foi observada pelo menos uma colônia com características

morfológicas típicas de H. capsulatum. A PCR foi considerada positiva quando

foi observado um produto do tamanho esperado em eletroforese.

Diante dos resultados da PCR e das Hemoculturas (padrão ouro) foi

calculada a co positividade e co negatividade da metodologia proposta.

Co-positividade= VP / (VP + FN) x 100

Co-negatividade = VN / (FP + VN) x 100

Valor Preditivo Positivo = VP / (VP + FP) x 100

Valor Preditivo Negativo = VN / (FN + VN) x 100

Onde:

(VP) = Resultado Verdadeiro Positivo, quando o teste é positivo e o indivíduo

tem a doença

(FP) = Resultado Falso Positivo, quando o teste é positivo e o indivíduo não

tem a doença.

(FN) = Resultado Falso Negativo, quando o teste é negativo e o indivíduo tem

a doença.

(VN = Resultado Verdadeiro Negativo, quando o teste é negativo e o indivíduo

não tem a doença.

19

4.2 ARTIGO 2- Seleção e otimização de protocolos para detecção de Histoplasma capsulatum var. capsulatum por reação em cadeia da polimerase (PCR)

Referência SAMPAIO, Ivanete de Lima; SANTOS, Mirlane Silva dos; FREIRE, Ana Karla

Lima; OGUSKU, Mauricio Morishi; SOUZA, João Vicente Braga de. Seleção e

otimização de protocolos para detecção de Histoplasma capsulatum var.

capsulatum por reação em cadeia da polimerase (PCR) Revista

iberoamericana de Micologia, v. xx, p. xx-xx, xxxx.

Artigo:

20

21

22

5.0 CONCLUSÕES

• O método de extração de DNA que demonstrou as melhores razões de

pureza foi o que utilizou membranas de sílica.

• O método de amplificação que demonstrou a maior capacidade de

detecção foi o que tinha como gene alvo “a proteína de 100 KDa”.

• A otimização da concentração dos componentes da PCR demonstrou

que a reação suportou variações significativas na concentração destes.

• O ensaio para determinação da co-positividade e co-negatividade

demonstrou que a PCR selecionada apresentou capacidade de

detecção maior de H. capsulatum var. capsulatum (10 pg de DNA) do

que a cultura.

23

6 REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS

1- Arancia SCA, La Valle R, Cassone A, De Bernardis F 2006 . Use of 65 kDa

mannoprotein gene primers in real time PCR identification of Candida albicans

in biological samples. Molecular and Cellular Probes 20:263– 268.

2- Armstrong D 1989. Problems in the management of opportunistic fungal

infections. Rev Infect Dis 2 : 1591-1599.

3-Bracca A, Tosello ME, Girardini JE, Amigot SL, Serra CGE 2003. Molecular

Detection of Histoplasma capsulatum var. capsulatum in Human. Clinical

Samples. Journal of Clinical Microbiology. 41:1753–55.

4- BRASIL, MINISTÉRIO DA SAÚDE 2000. Boletim epidemiológico - Aids XIII,

nº 1 - Semana Epidemiológica 48/99 a 22/00 - dezembro/1999 a junho/2000.

Brasília,

5- Bialek R, Feucht A, Aepinus C, Just-Nübling G, Robertson VJ, Knobloch J,

Hohle R 2002. Evaluation of Two Nested PCR Assays for Detection of

Histoplasma capsulatum DNA in Human Tissue. Journal of Clinical

Microbiology. May; 40 (5):1644–1647.

6- Borst A, Leverstein-Van Hall MA, Verhoef J, Fluit AC 2001. Detection of

Candida spp. in blood cultures using nucleic acid sequence-based amplification

(NASBA). Diagn Microbiol Infect Dis. 39: 155– 160.

7- Bu R, Sathiapalan RK, Ibrahim MM, Al-Mohsen I, Almodavar E, Gutierrez MI,

Bhatia K 2005. Monochrome LightCycler PCR assay for detection and

quantification of five common species of Candida and Aspergillus. Journal of

Medical Microbiology 54: 243–248.

8- Bubnick M, Smuliaan AG 2007. The MAT1 locus of Histoplasma capsulatum

is responsive in a mating type-specific manner. Eukaryot Cell. 616-621.

9- Buitrago MJ, Gómez-López A, Monzón A, Rodríguez-Tudela JL, Cuenca-

Estrella M 2007. Assessment of a quantitative PCR method for clinical

24

diagnosis of imported histoplasmosis. Enferm Infecc Microbiol Clin. Jan 25

(1):16-22.

10- Centers for Disease Control and Prevention Rep 1981- CDC. Kaposis

sarcoma and pneumocistis pneumonia among homossexual male residents of

New York city and California. MMWR Morb Mortal Wkly 30: 305-308.

11- Centers for Disease Control - Revision of the case definition of acquired

immunodeficiency syndrome for national reporting United States 1985. -MMWR,

34, 373-375

12- Centers for Disease Control and Prevention Rep 2001; - CDC. First report

of AIDS. MMWR Morb Mortal Wkly 50: 429.

13- Chang HC, Leaw SN, Huang AH, Wu TL, Chang TC 2001.Rapid

identification of yeast in positive blood cultures by a multiplex PCR method. J

Clin Microbiol 39:3466–3471.

14- Chemaly RF, Tomford JW, Hall GS, Sholtis M, Procop GW 2001. Rapid

diagnosis of Histoplasma capsulatum endocarditis using the AccuProbe on an

excised valve. Journal of Clinical Microbiology. 39:2640-2641

15- Chen YC, Eisner JD, Kattar MM, Rassoulian-Barrett SL, Lafe K, Bui U,

Limaye AP, Cookson BT 2001 . Polymorphic internal transcribed spacer region

1 DNA sequences identify medically important yeasts. Journal of Clinical

Microbiology. 39:4042- 4051.

16- Costa C, Costa JM, Desterke C, Botterel F, Cordonnier C, Bretagne S

2002. Real-time PCR coupled with automated DNA extraction and detection of

galactomannan antigen in serum by enzyme-linked immunosorbent assay for

diagnosis of invasive aspergillosis. Journal of Clinical Microbiology. 40:2224–

2227.

17- Daar ES, Meyer RD 1992. Medical management of AIDS patients: Bacterial

and fungal infections. Journal of Clinical Microbiology. 76:173-203.

25

18-Duesberg PH 1993. "AIDS- Causes and Consequences". J of Tumor Marker

Oncology 8: 47-61.

19-Durand-Joly I, Chabe M, Soula F, Delhaes L, Camus D, Dei-Cas E 2005.

Molecular diagnosis of Pneumocystis pneumonia. FEMS ScienceDirect - FEMS

Immunology and Medical Microbiology 45:405–410.

20- Durden B, Elewski J 1997.Fungal Infections in HIV-Infected Patients Faith

MS Cutaneous Medicine and Surgery 116, (3) 200-212.

21-Eissenberg LG, Goldman WE 1991. Histoplasma variation and adaptive

strategies for parasitism: new perspectives on histoplasmosis. Clinical

Microbiology Reviews 10 ( 4) :411- 421.

22- Fava SC, Fava Neto C 1998. Epidemiologic survey of histoplasmin and

paracoccidiodin sensitivity in Brazil. Revista do Instituto de Medicina Tropical

de São Paulo 40:155–164.

23- Gallo RC, Popovic M 1984. Frequent detection and isolation of cytopathic

retrovirus (HTLV-III) from patientes with AIDS and a risk for AIDS. Science 224:

500-3.

24- Gomez BJ, Figueroa A, Ortiz H, Ortiza B 2007. Development of a novel

antigen detection test for histoplasmosis. Journal of Clinical Microbiology

35:2618–2622.

25- Goodwin RA, Shapiro JL, Thurman GH, Thurman SS, DesPrez RM 1980.

Disseminated histoplasmosis: clinical and pathologic correlations. Medicine

59:1–33.

26- Goodwin RA, Loyd JE, DesPrez RM 1981. Histoplasmosis in normal hosts.

Medicine 60:231–266.

27- Guedes HL, Guimarães AJ, Muniz Mde, Pizzini CV, Hamilton AJ, Peralta

JM, Deepe GS Jr, Zancopé-Oliveira RM 2003. PCR assay for identification of

histoplasma capsulatum based on the nucleotide sequence of the M antigen.

Journal of Clinical Microbiology 41(2):535-539.

26

28- Hall L, Wohlfiel S, Roberts GD 2003; . Experience with the MicroSeq D2

large subunit ribosomal DNA sequencing kit for identification of commonly

encountered, clinically important yeast species. Journal of Clinical Microbiology

41:5099–5102.

29- Hamilton AJ, Bartholomew MA, Figueroa J, Fenelon LE, Hay RJ 1990.

Evidence that the M antigen of Histoplasma capsulatum var. capsulatum is a

catalase, which exhibits cross-reactivity with other dimorphic fungi. Journal of

Medical and Veterinary Mycology 28:479–485.

30-Hamilton AJ. Bartholomew MA, Hay RJ 1998. Serodiagnosis of

histoplasmosis, paracoccidioidomicosis and penicilliosis marneffei: current

status and future trends. Medical Mycology 36: 351- 364.

31- Hebart H, Löffler J, Meisner C , Serey F, Schmidt D, Böhme A, Martin H,

Engel A , Engel D, Kern WV, Schumacher KL, Einsele H 2000; . Early

detection of Aspergillus infection after allogeneic stem cell transplantation by

polymerase chain reaction screening. The Journal of Infectious Diseases

.181:1713–1719.

32- Heiner DC 1958. Diagnosis of histoplasmosis using precipitin reactions in

agar gel. Pediatrics 22:616–627.

33- Henry T, Iwen PC, Hinrichs SH 2000. Identification of Aspergillus species

using internal transcribed spacer regions 1 and 2. Journal of Clinical

Microbiology 38:1510– 1515

34- Huang CT, McGarry T, Cooper S 1987. Disseminated histoplasmosis in the

acquired immunodeficiency syndrome. Report of five cases from a non-endemic

area. Archives of Internal Medicine 147:1181.

35- Hughes AD, Lorusso GD, Greer DL 2004. Cost-effective method for

identification of dimorphic fungi. Journal of Clinical Microbiology 42:4408–4409.

36- Kahi CJ, Wheat J, Allen SD, Sarosi GA. Gastrointestinal histoplasmosis.

The American Journal of Gastroenterology 2005; 100:220– 231.

27

37-Kwon-Chung KJ, Bennett JE 1992. Medical mycology 464–513. Lea e

Febiger, Philadelphia, Pa.

38- Lehninger, L 2004. Lehninger Principles of Biochemistry. W. H. Freeman &

Co, 4 ed., pp. 1100

39- Lindsley MD, Hurst SF, Igbal NJ, Morrison CJ 2001. Rapid Identification of

Dimorphic and Yeast-Like Fungal Pathogens Using Specific DNA.Probes. J

Clin. Microbiol. Oct: 3505–3511

40- Luo G, Mitchell TG. Rapid identification of pathogenic fungi directly from

cultures by using multiplex PCR. J Clin Microbiol 2002; 40:2860– 65.

41- Macher A, Rodriques M, Kaplan W 1985. Disseminated bilateral

chorioretinitis due to Histoplasma capsulatum in a patient with the acquired

immunodeficiency syndrome. Ophthalmology. Diagnostic Microbiology and

Infectious Disease 92:9.

42- Maubon D, Simon S, Aznar C 2007. Histoplasmosis diagnosis using a

polymerase chain reaction method. Application on human samples in French

Guiana, South America Diagnostic. Microbiology and Infectious Disease 58

:441–444

43- Mandal B 1989. AIDS and fungal infections. Journal of Infection 19:199-

205.

44- Mullis KB 1990. The unusual origin of polimerase chain reaction. Scientific

American April: 36-43.

45- Muniz MM, Pizzini CV, Peralta JM, Reiss E, Zancope RM 2001. Genetic

diversity of Histoplasma capsulatum strains isolated from soil, animals, and

clinical specimens in Rio de Janeiro State, Brazil, by a PCR-based random

amplified polymorphic DNA assay. Journal of Clinical Microbiology 39:4487–

4494.

28

46- Nightingale SD, Parks JM, Pounders SM, Burns DK, Reynolds J,

Hernandez JA 1990. Disseminated histoplasmosis in patients with AIDS.

Southern Medical Journal 83:624–630.

47- Pine LH, Gross G, Bradley JR, George SB, Moss G, Moss CW 1977;.

Procedures for the production and separation of H and M antigens in

histoplasmin: chemical and serological properties of the isolated products.

Mycopathology 61:131–141.

48- Porta AS, Colonna-Romano I, Callebaut AF, Marzullo L, Kobayashi GS,

Maresca B 1999. An homologue of the human 100-kDa protein (p100) is

differentially expressed by Histoplasma capsulatum during infection of murine

macrophages. Biochemical and Biophysical Research Communications 254:

605–613.

49- Pryce TM, Palladino S, Kay ID, Coombs GW 2006. Rapid identification of

fungi by sequencing the ITS1 and ITS2 regions using an automated capillary

electrophoresis system. Medical Mycology 41:369–381.

50- Raman CN, Khardori LA, Von Behren LJ, Wheat, Tewary RP 1990.

Evaluation of an ELISA for the detection of anti-Histoplasma ribosomal and

antihistoplasmin antibodies in histoplasmosis. Journal of Clinical Laboratory

Analysis 4:199–207.

51- Rappleye CA, Eissenberg LG, Goldman WE 2007. Assessment of a

quantitative PCR method for clinical diagnosis of imported histoplasmosis

Enferm Infecc Microbiol Clin. 2007; Jan; 25(1) :16-22.

52- Reid TM, Schafer MP 1999. Direct detection of Histoplasma capsulatum in

soil suspensions by two-stage PCR . Molecular and Cellular Probes 13, 269–

273

53- Rios FA, Restrepo A, Isturiz R 1994. Fungal infection in Latin American

countries. Chicago Journals - Clinical Infectious Diseases 8:129–154.

29

54- Rickerts V, Bialek R, Tintelnot K, Jacobi V, Just-Nübling G. 2003 PCR

assay for identification of histoplasma capsulatum based on the nucleotide

sequence of the M antigen. Journal of Clinical Microbiology Feb ;41(2):535 .

55- Rippon JW 2000. Histoplasmosis In : Rippon JW. Rippon (ed.), Medical

mycology. The W. B. Saunders Co., Philadelphia: 2000; Pa; 381–423

56- Sambrook R, Russel DW. Molecular Cloning: A laboratory manual .3 rd

ed.New York: Cold Spring Harbor Laboratory Press, 3v. 2001.

57- Shaunak S, Cohen J 1991. Clinical management of fungal infections in

patients with AIDS. J Antimicrobio Chemotherapy; A Supll 28: 67-82.

58- Shin JH, Nolte FS, Morrison CJ 1997; . Rapid identification of Candida

species in blood cultures by a clinically useful PCR method. Journal of Clinical

Microbiology 35:1454–1459

59- Shin JH, Nolte FS, Holloway BP, Morrison CJ 1999. Rapid identification of

up to three Candida species in a single reaction tube by a 5V exonuclease

assay using fluorescent DNA probes. Journal of Clinical Microbiology 37:165–

170.

60- Sidrim JJC, Moreira JLB 1999. Fundamentos Clínicos e Laboratoriais da

Micologia Médica. Editora Guanabara Koogan, São Paulo

61- Suarez MA, Fernandez A, Cisneros E, Cisneros D 1992. Reactividad ala

histoplasmina em trabajadores de granjas avícolas em la província de Ciego de

A´ vila, Cuba. Revista do Instituto de Médicina Tropical de São Paulo

34:329–333.

62- Ueda Y, Sano A, Tamura M, Inomata T, Kamei K, Yokovama K, Kishi F, Ito

J, Mikami Y,Minani M,Nishimura K. 2003. Diagnosis of histoplasmosis by

detection of the internal transcribed spacer region of fungal rRNA gene from a

paraffin-embedded skin sample from a dog in Japan. Veterinary Microbiology

Jul 17; 94(3): 219-224.

30

63- Wheat LJ, Kohler R, Teary R 1986. Diagnosis of disseminated

histoplasmosis by detection of Histoplasma capsulatum antigen in serum and

urine specimens. The New England Journal of Medicine 314: 83-88.

64- Wheat LJ, Connolly-Springfield PA, Baker R 1990. Disseminated

histoplasmosis in the acquired immune deficiency syndrome: Clinical findings,

diagnosis and treatment, and review of the literature. Medicine 69:361-374.

65- Wheat LJ 1994. Histoplasmosis: recognition and treatment. Clinical

Infectious Diseases 19:19–27.

66- Wheat LJ, Sarosi G, McKinsey D, Hamill R 2000. Practice guidelines for

the management of patients with histoplasmosis. Clinical Infectious Diseases

30:688–695.

67- Wheat LJ, Garringer T, Brizendine E, Connolly-Stringfield P 2002.

Diagnosis of histoplasmosis by antigen detection based upon experience at the

histoplasmosis reference laboratory. Diagnostic Microbiology and Infectious

Disease 43:29–37.

68- Wheat LJ 2003. Current diagnosis of histoplasmosis. Trends in Microbiology

11: 488- 494.

.69- Zancope´- Oliveira RM, Bragg SL, Hurst SF, Peralta JM, Reiss E 1993.

Evaluation of cation exchange chromatography for the isolation of M

glycoprotein from histoplasmin. Journal of Medical and Veterinary Mycology;

31:29–41

70- Zancope´-Oliveira, RM, Bragg SL, Reiss E, Peralta JM 1994;a.

Immunochemical analysis of the H and M glycoproteins from Histoplasma

capsulatum. Clinical and Diagnostic Laboratory Immunology 1:563–568.

71- Zancope´-Oliveira RM, Bragg SL, Reiss E, Wanke B, Peralta JM 1994;b

Effects of histoplasmin M antigen chemical and enzymatic deglycosylation on

cross-reactivity in the enzyme-linked immunoelectrotransfer blot method.

Clinical and Diagnostic Laboratory Immunology 1:197–207.

31

72- Zancope-Oliveira RM, Reiss E, Lott TJ, Mayer LW, Deepe GS. 1999.

Molecular cloning, characterization, and expression of the M antigen of

Histoplasma capsulatum. Infection and Immunity 67:1947–1953.

73- Zarabi CM, Thomas R, Adesokan A 1992. Diagnosis of systemic

histoplasmosis in patients with AIDS. Southern Medical Journal 85:1171-1175.

32

7. ANEXOS Tabela 1- Protocolos de PCR investigados Autor/Região alvo Condições da reação

Bialek cols 5

Proteina de 100

KDa

Primers: HcIII ((5-GAG ATC TAG TCG CGG CCA GGT TCA-3)

HcIV (5-AGG AGA GAA CTG TAT CGG TGG CTT G-3 ) Tamanho do produto: 210 -bp

[DNTP´s]: 100 µM

[Taq]: 1,5 U

[MgCl2]: 2,5 mM

[Primers]: 1 µM

[Amplificação]: 94°C por 5 min; 35 vezes 94°C por 30 s, 65°C por 30 s e 72°C

por 1 min e uma extensão final de 72°C for 5 min.

Bracca cols 3

Antígeno H

Primers: Hc2 (5-GCGGGGTTGGCTCTGCTCT-3)

Hc3 (5-TTGGAAACCCCGGGCTTG-3)

Tamanho do produto: 439-bp

[DNTP´s]: 200 µM

[Taq]: 1U

[MgCl2]: 2 mM

[Primers]: 0.4 µM

[Amplificação]: 96°C for 6 min; 35 cycles of 94°C for 1 min, 59°C por 1min, e

72°C por 1 min, extensão final de 72°C por 10 min.

Guedes27

Antígeno M

Primers: Msp2F (CGG GCC GCG TTT AAC AGC GCC)

Msp2R (ACC AGC GGC CAT AAG GAC GTC)

Tamanho do produto: 279-bp

[DNTP´s]: 200 μM

[Taq]: 2,5 U

[MgCl2]: 1,5 mM

[Primers]: 20 pmol

[Amplificação]: 95°C por 5 min, 35 ciclos de 1 min a 95°C, 1 min a 70°C e 1

min a 72°C seguidos de uma extensão final de 72°C por 5 min.

33

Tabela 2- Concentração e grau de pureza do DNA de H. capsulatum utilizando diferentes metodologias de extração.

ISOLADO/ MORFOLOGI

A

Membrana de Sílica (QIAGEN)

CTAB + Fenol Clorofórmio (SAMBROOK ET AL 2001

modif.)

Precipitaçao de Sais

(EPICENTRE)

DNA (ng/μl) Abs 260/ Abs 280 DNA (ng/μl) Abs 260/ Abs 280 DNA (ng/μl) Abs 260/ Abs 280

3417/Micélio 112 ± 54,1 1,94 ± 0,21 200 ±110,3 2,03± 0,11 246 ± 24,3 1,99 ± 0,02

3417/Levedura 108 ± 48,3 2,01 ± 0,09 197 ± 23,6 1,28± 0,19 146 ± 24,7 1,26 ± 0,28

3378/Micélio 106 ± 33,1 2,09 ± 0,05 163 ± 42,1 1,87± 0,24 133 ±8,9 1,19 ± 0,01

3342/Micélio 95 ± 21,3 2,02 ± 0,02 77 ± 10,3 2,11± 0,40 97± 6,5 1,30 ± 0,13

3342/Levedura 102 ± 3,1 2,02 ± 0,06 138 ± 64,7 1,6± 0,27 109±40,8 1,31 ± 0,04

Tabela 3- Detecção de H. capsulatum var capsulatum pela Reação em Cadeia de Polimerase. Método Amostra contaminada

n=15 Amostra não- contaminada

n=15 Total

PCR positiva 15 3 18 PCR negativa 0 12 12 Total 15 15 30 Tabela 4- Detecção de H. capsulatum var capsulatum pela Cultura Método Amostra contaminada

n=15 Amostra não- contaminada

n=15 Total

Cultura positiva 03 0 03 Cultura negativa 12 15 27 Total 15 15 30 Tabela 5 – Dados comparativos entre os resultados obtidos na detecção do H. capsulatum pela PCR e pela Cultura Método Cultura positiva

n= 15 Cultura negativa

n=15 Total

PCR positiva 03 15 18 PCR negativa 0 12 12 Total 03 27 30

34

Tabela 6—Valores de Co-positividade e Co-negatividade, VPP e VPN para PCR e Cultura utilizando 30 amostras de sangue contaminadas e não contaminadas experimentalmente por leveduras viáveis de H.capsulatum .

Método Co-positividade* %

Co-negatividade** %

VPP %

VPN %

PCR 100 80 83,3 100 Cultura 20 50 100 55,6

*A Co-positividade foi calculada segundo a fórmula: A/ (A+C)x100, sendo A o número de infectados detectados pelo teste e (A+C) o total de doentes.

**A Co-negatividade foi calculada segundo a fórmula: B/ (B+D)x100, sendo B o número de negativos detectados no teste e (B+D) o total de não doentes.

Tabela 7- Resultados da PCR e da hemocultura frente as diferentes amostras

Amostra

Isolado n de células Cultura PCR Amostra

Isolado n de células Cultura PCR 1 0 - - 16 FMT3342 7x104 + + 2 FMT3417 7x106 + + 17 0 - - 3 0 - - 18 FMT3342 7x103 + + 4 FMT3417 7x105 + + 19 0 - - 5 0 - - 20 FMT3342 7x102 - + 6 FMT3417 7x104 + + 21 0 - + 7 0 - - 22 FMT3378 7x106 + + 8 FMT3417 7x103 + + 23 0 - - 9 0 - - 24 FMT3378 7x105 + +

10 FMT3417 7x102 - + 25 0 - - 11 0 - - 26 FMT3378 7x104 + + 12 FMT3342 7x106 + + 27 0 - - 13 0 - + 28 FMT3378 7x103 - + 14 FMT3342 7x105 + + 29 0 - + 15 0 - - 30 FMT3378 7x102 - +

35

A [MgCl2 ] mM 0,5 1,18 1,84 2,5 3,16 3,82 4,5

B [DNTPs] μM

50 100 150 200 250 300 350

C [Primers HcIII e HcIV] μM

0,1 0,4 0,7 1,0 1,3 1,6 1,9

D [Taq Polimerase] UI

0,5 0,84 0,7 1,0 1,3 1,6 1,9

E [Temperatura de anelamento] oC

56 59 62 65 68 71

M

200 pb

Figura 3- Produtos de PCR obtidos utilizando diferentes concentrações de células de H. capsulatum em sangue. (M) Marcador, (1) 7x106, (2) 7x105, (3) 7x104, (4) 7x10, (5) 7x102células/ml de sangue.

Figura 2- Influência das concentrações dos reagentes nos produtos de PCR obtidos nos

experimentos de otimização para o protocolo de Bialek cols, 2002.

36

ARTIGO 1- Diagnóstico Laboratorial da Histoplasmose Disseminada: um desafio para a Tecnologia da Reação de Cadeia de Polimerase?

Referência SOUZA, João Vicente Braga de ; SAMPAIO, Ivanete de Lima; TALHARI, C. ;

TALHARI, S. . Diagnóstico Laboratorial da Histoplasmose Disseminada: um

desafio para a tecnologia da Reação de Cadeia de Polimerase?. NewsLab, v.

91, p. 68-91, 2008.

37

38

39

40

41

42

43

44

45

46

Equipe Científica de Apoio ao Desenvolvimento do Projeto de Dissertação

Nome Formação (Titulação) Instituição de trabalho

Atividadades no projeto

João Vicente Braga de Souza Farmaceutico,Dr. INPA Orientador

Mauricio Morishi Ogusko Bioquimico,Msc. INPA Co-Orientador

Mirlane Silva dos Santos Acadêmica de Biologia UNINORTE Auxilio nas atividades relativas a PCR

Ana Karla Lima Freire Bioquimica. UFAM Auxilio na preparação de meios e reagentes

Érika Simplicio de Souza Engenheira Quimica,Dra. UEA Apoio logístico ,compra de material

Antonieta 2 ° Grau completo FMTAM Auxilio na esterilização dos meios de cultura.

Erick Andrei Sampaio 2° Grau completo INPA Auxilio nas atividades relativas a PCR.

47

Cronograma de Execução Física: INÍCIO: 03/2008 TÉRMINO: 03/ 2010 DURAÇÃO EM MESES = 24 meses

ATIVIDADES MESES 1º. ano mar abr mai jun jul ago set out nov dez jan fev

01 Créditos X X X X X X X X X X X X

02 Revisão Bibliográfica visando atualização das informações sobre o assunto

X X X X X X X X X X

03 Treinamento nas atividades de preparo de meios e reagentes , iniciação na técnica da PCR ,e manutenção das linhagens.

X X X X X X X X X X X

X

ATIVIDADES MESES 2º. ano mar abr mai jun jul ago set out nov dez jan fev

01 Revisão Bibliográfica visando atualização das informações sobre o assunto

X X X X X X X X X X X

02 Elaboração do Projeto X X X X X X X

03 Aula de qualificação X

04 Manutenção da linhagens, experimentos de extração, experimentos de PCR

X X X X X X X X X X X

X

05 Análise dos dados X X X X X X X X X X

06 Apresentação dados parciais X

07 Redação do artigo X X X X X X X X X X X X

08 Defesa da Dissertação X

48

Orçamento detalhado

ITEM QTD Descrição (somente 1 linha para cada item) Valor Unit.R$

Valor Totaldos Bens

R$1 6 Papel (resma) R$ 15,00 R$90,002 6 Tinta para impressora (cartucho) R$ 60,00 R$360,003 4 Agar Sabouraud (500g) R$ 390,00 R$1.560,004 4 Agar Mycosel (500 g) R$ 380,00 R$1.520,005 4 Agar BHI (500 g) R$ 410,00 R$1.640,006 4 Agar Casitose (500 g) R$ 430,00 R$1.720,007 8 Agar RPMI 1640 ( 1000 mL) R$ 300,00 R$2.400,008 4 Agar Niger (500 g) R$ 300,00 R$1.200,009 12 Kits comerciais para extração de DNA (100 reações) R$ 1.800,00 R$21.600,00

10 1 Fenol (250 g) R$ 200,00 R$200,00

11 1 Clorofórmio (1000 mL) R$ 110,00 R$110,0012 1 Isopropanol (1000 mL) R$ 120,00 R$120,0013 2 Etanol (1000 mL) R$ 50,00 R$100,00

14 6 Proteinase K (500 U) R$ 153,00 R$918,0015 6 Lyticase (200 U) R$ 200,00 R$1.200,0016 1 Microesferas de vidro (200 g) R$ 150,00 R$150,0017 1 Tris ((HOCH2)3CNH2 (250 g) R$ 200,00 R$200,0018 1 NaCl (250 g) R$ 30,00 R$30,0019 1 EDTA (250 g) R$ 110,00 R$110,0020 1 Ribonuclease A (500 U) R$ 210,00 R$210,00

21 12 Kits comerciais para reação de PCR (100 reações) R$ 427,00 R$5.124,0022 6 Taq polimerase ( 150 U) R$ 1.100,00 R$6.600,0023 6 Nucleotídeos (100 mM) R$ 300,00 R$1.800,0024 1 MgCl2 (100 g) R$ 150,00 R$150,0025 48 Primers ( 1mL-100 mM) R$ 150,00 R$7.200,0026 6 Agarose (200 g) R$ 593,00 R$3.558,0027 6 Tampão TEB 10x (1000ml) R$ 250,00 R$1.500,0028 6 Tampão TAE 50x (1000 ml) R$ 462,00 R$2.772,00

29 1 Brometo de etídio (1 g) R$ 340,00 R$340,0030 6 Corantes de DNA (1ml) R$ 165,00 R$990,0031 12 Marcadores para eletroforese (200 uL) R$ 302,00 R$3.624,0032 12 KIts comerciais para PCR em Tempo Real (50 reações) R$ 647,00 R$7.764,0033 12 SYBR Green (1g) R$ 230,00 R$2.760,0034 12 Taq-polimerase para PCR em Tempo Real (150 U) R$ 1.400,00 R$16.800,0035 12 Nucleotídeos para PCR em Tempo Real (100 mM) R$ 670,00 R$8.040,0036 3 Kit comercial para extração de DNA de gel de eletroforese (100 reações) R$ 1.100,00 R$3.300,0037 6 Microtubos (0,2; 0,5;1,5 mL) 1000 unid R$ 700,00 R$4.200,0038 6 Ponteiras (0-10, 20-300, 100-1000 uL) 1000 unid R$ 900,00 R$5.400,0039 12 Microplascas (20 unid) R$ 240,00 R$2.880,0040 1 Kit de coloração de Giensa R$ 60,00 R$60,00

Total R$120.300,00