UNIVERSIDADE DE SÃO PAULO INSTITUTO DE QUÍMICASão Paulo, São Paulo. Nesse trabalho são...

UNIVERSIDADE DE SÃO PAULO INSTITUTO DE QUÍMICA

Programa de Pós-Graduação em Química

Thiago Regis Longo Cesar da Paixão

Fabricação e Utilização de Microeletrodos para Determinações Amperométricas em Micro-

Ambientes

São Paulo Data do Depósito na SPG:

31/08/2007


Fabricação e Utilização de Microeletrodos para Determinações Amperométricas em Micro-

Ambientes

Tese apresentada ao Instituto de Química da

Universidade de São Paulo para obtenção do

Título de Doutor em Química (Química

Analítica)

Orientador: Prof. Dr. Mauro Bertotti

São Paulo 2007


Fabricação e Utilização de Microeletrodos para Determinações Amperométricas

em Micro-Ambientes.

Tese apresentada ao Instituto de Química da

Universidade de São Paulo para obtenção do

Título de Doutor em Química (Química

Analítica)

Aprovado em: ____________

Banca Examinadora Prof. Dr. __________________________________________________________

Instituição: ________________________________________________________

Assinatura: ________________________________________________________

Prof. Dr. __________________________________________________________

Instituição: ________________________________________________________

Assinatura: ________________________________________________________

Prof. Dr. __________________________________________________________

Instituição: ________________________________________________________

Assinatura: ________________________________________________________

Prof. Dr. __________________________________________________________

Instituição: ________________________________________________________

Assinatura: ________________________________________________________

Prof. Dr. __________________________________________________________

Instituição: ________________________________________________________

Assinatura: ________________________________________________________

Aos meus pais Silvia e Romeu, meus avós Ida, Miguel, Celina (In Memorian) e José, meus irmãos Victor e Beatriz e à minha eterna

companheira Juliana

Pela oportunidade de ter uma família tão especial

Dedico

Ao meu orientador Mauro Bertotti

Pela orientação, paciência, amizade e participação efetiva na minha formação

Dedico

AGRADECIMENTO(S)

Ao Prof. Dr. Lúcio Angnes, pela amizade, pela rica contribuição, principalmente no

exame de qualificação e pelos ensinamentos oferecidos durante a pós-graduação e o

desenvolver deste trabalho.

Ao Prof. Roberto Tokoro, pela amizade, convívio e conhecimentos transmitidos durante

o desenvolver deste trabalho.

Ao Prof. Dr. Pedro Vitoriano de Oliveira, pela amizade e pelos ensinamentos

oferecidos.

À Prof. Dra. Silvia Helena Pires Serrano, pela amizade, por ter contribuído aceitando

participar do Exame de qualificação e pelos ensinamentos oferecidos.

À Prof. Dra. Marisa Helena Gennari de Medeiros pela amizade e por abrir as portas de

seu laboratório e permitiu que realizássemos trabalhos em conjunto.

À Prof. Dra. Bettina Malnic, por permitir a utilização e o uso de seu laboratório de

pesquisa para contribuir a este trabalho.

À Prof. Dra. Elisabeth de Oliveira, pela amizade e convivência durante o desenvolver

deste trabalho.

Ao Prof. Dr. Fábio Rodrigo Piovezani Rocha, pela amizade, convivência e conversas

durante o desenvolver deste trabalho.

À Prof. Dra. Denise Freitas Siqueira Petri, por permitir a utilização e o uso de seu

laboratório de pesquisa para contribuir a este trabalho.

Aos demais docentes da Área de Química Analítica do IQ-USP, pela amizade e pelos

ensinamentos oferecidos.

A todos os docentes do IQ-USP pela sólida formação científica, que me permitiu

ingressar no programa de Pós-Graduação.

Aos técnicos Cristina, Nivaldo, Renato, Fernando, Vinícius e Roberto pelos constantes

auxílios.

Às funcionárias Lúcia e Luciana que sempre foram muito prestativas.

A todos os funcionários da Seção de Graduação, de Pós-Graduação e Assistência

Acadêmica, pela forma eficaz com que realizaram os seus trabalhos.

Aos amigos e ex-colegas (Alexandra, Audrei, Dennys, Fernanda, José Roberto, Luis,

Tiago, Vânia, Maiara e Denise) do Laboratório de Sensores Eletroquímicos e Métodos

Eletroanalíticos, pela amizade e pelos bons momentos.

Aos novos amigos e ingressantes (Juan e Roselyn) do Laboratório de Sensores

Eletroquímicos e Métodos Eletroanalíticos, sejam bem-vindos.

Aos amigos do LEEAA especialmente Cassiana, Paulo, Angerson, Danielle, Alexandre,

pela amizade e pelos bons momentos.

Ao meu segundo irmão, e eterno amigo, Rodrigo A. A. Munõz, pela amizade desde os

tempos de graduação.

Aos colegas e ex-colegas da pós-graduação pelas conversas e constantes ajudas (Renato,

Eduardo, Dosil, Camila, Lívea e Márcia).

À minha família, pela paciência, convivência, amizade e pela ajuda para que meus

sonhos pudessem ser realizados.

À Juliana, minha eterna companheira, pela paciência, apoio e carinho durante todos os

momentos desde que nos conhecemos.

Ao Goonies, o mais novo membro da família e fiel companheiro.

A todos que de alguma forma colaboraram no desenvolvimento deste trabalho.

À FAPESP (03/13757-0), CNPq, CAPES e Pró-Reitoria de Pós Graduação da USP pelo

suporte financeiro.

Muito Obrigado.

RESUMO

Paixão, T.R.L.C. Fabricação e Utilização de Microeletrodos para Determinações Amperométricas em Micro-Ambientes. 2007. 208p. Tese (Doutorado) - Programa de Pós-Graduação em Química (Química Analítica). Instituto de Química, Universidade de São Paulo, São Paulo.

Nesse trabalho são apresentados resultados sobre o desenvolvimento de

microeletrodos por desgaste eletroquímico de microfibras de dimensões da ordem de

100 µm de diferentes materiais (platina, ouro e fibra de carbono) visando à utilização

em micro-ambientes. Na grande maioria dos casos esse processo foi realizado utilizando

transformadores AC. Arranjo de microeletrodos construídos a partir de técnicas

litográficas também foram construídos.

A aplicabilidade de microeletrodos de Pt construídos por desgaste eletroquímico

foi avaliada para monitorar a concentração “in-situ” de ácido ascórbico em diferentes

frutas. O sensor foi capaz de avaliar a distribuição espacial da concentração de ácido

ascórbico "in-situ" em laranjas. A partir desses resultados, mapas para a concentração

de ácido ascórbico foram construídos. A correlação entre o estado de maturação e a

concentração de ácido ascorbico também foi observada a partir das medições realizadas

e concentrações maiores foram encontradas em frutas mais maduras. O arranjo de

microeletrodos foi utilizado para avaliar a concentração de iodato em amostra de sal de

cozinha utilizado pequenos volumes de amostra (500 µL).

Verificada a possibilidade de fabricação de microeletrodos de diferentes

geometrias e dimensões, estudos visando ao monitoramento e à detecção de DNA e

ácido ascórbico foram efetuados. Superfícies eletródicas modificadas com filmes de

óxido de rutênio hexacianoferrato (RuOHCF) foram utilizadas para a detecção

amperométrica de 2’-deoxiguanosina (dG) e ácido ascórbico por análise por injeção em

fluxo (FIA). O método para detecção de dG apresentou um resposta linear de 3,8 a 252

µmol L-1, com um limite de detecção de 94 nmol L-1. Aplicações em amostras de DNA

também foram realizadas, e os resultados para determinação da dG concordaram com os

obtidos pelo método padrão (HPLC). Estudos sobre o processo eletrocatalítico de

oxidação da dG em meio ácido em filmes de RuOHCF foram investigados utilizando

eletrodo rotativo.

Sobre esse mesma superfície modificada, o processo eletrocatalítico permitiu a

determinação de ácido ascórbico em pH = 6,9 a 0,0 V vs Ag/AgCl em FIA, com um

limite de detecção de 2,2 µmol L-1. Estudos sobre o processo eletrocatalítico de

oxidação do ácido ascórbico também foram avaliados com eletrodo rotativo. O método

foi aplicado para a determinação de ácido ascórbico em urina, obtendo-se bons valores

de recuperação (96 – 104 %). Microeletrodos contendo filmes eletrodepositados de

RuOHCF foram utilizados para monitorar o consumo de ácido ascórbico em 3

diferentes tipos de células neuronais (SH-SY5Y, células transfectadas com SOD

humana e mutante típica da doença de Esclerose Lateral Amiotrófica (ALS)). Os

resultados do consumo de ácido ascórbico para essas células estão de acordo com os

níveis de estresse oxidativo induzido pela SOD mutante. Experimentos visando a

aplicabilidade de microeletrodos inseridos em células também foram efetuados.

Palavras-chave: microeletrodos, micro-ambientes, eletrodos modificados, DNA e

ácido ascórbico.

ABSTRACT

Paixão, T.R.L.C. Development of Microelectrodes for Amperometric Detection in Microenvironments. 2007. 208p. PhD Thesis - Graduate Program in Chemistry. Instituto de Química, Universidade de São Paulo, São Paulo.

Results on the development of microelectrodes fabricated by electrochemical

etching using fibers of different materials (platinum, gold and carbon fiber) and

dimensions (starting from 100 µm) for the application in micronenvironments are

presented. In almost all cases this procedure was carried out using AC transformer.

Array of microelectrodes were also fabricated by using litographic techniques.

The applicability of Pt microelectrodes fabricated by electrochemical etching

was evaluated in the in-situ monitoring of the ascorbic acid concentration in different

fruits. The sensor allowed spatial distribution of ascorbic acid concentration in oranges

to be found and concentration maps were constructed. A correlation between the

ripening stage and the ascorbic acid concentration was also observed from

electrochemical measurements, the ascorbic acid content being higher in mature fruits.

Studies on the detection of species involved in the oxidative stress process, such

as DNA and ascorbic acid, were also performed. Ruthenium oxide hexacyanoferrate

(RuOHCF) modified electrode surfaces were used as amperometric detectors for 2'-

deoxyguanosine (dG) and ascorbic acid determinations in FIA apparatus. The method

exhibited a linear response range to 2’-deoxyguanosine from 3.8 to 252 µmol L-1 dG

with detection limit of 94 nmol L-1. Applications in DNA samples were examined, and

the results for determination of 2'-deoxyguanosine were in good agreement with those

obtained by HPLC analysis. The dG electrocatalytic oxidation at a RuOHCF glassy

carbon (GC) modified electrode was investigated in acid medium by using rotating disc

electrode (RDE) voltammetry.

On this modified surface, the electrocatalytic process allowed the determination

of ascorbic acid to be performed at 0.0 V and pH = 6.9 with a limit of detection of 2.2

µmol L-1 in a flow injection configuration. The usefulness of the method was

demonstrated by an addition-recovery experiment with urine samples and the recovered

values were in the 96 to 104 % range. Investigations on the mechanism of the

electrocatalytic oxidation of ascorbic acid was also investigated at pH = 6.9 by using

RDE voltammetry. The RuOHCF carbon fiber modified microelectrode was used to

monitor the ascorbate uptake by control SH-SY5Y cells, and cells transfected with wild-

type Cu,Zn-Superoxide Dismutase (SOD) or with a mutant SOD (SOD G93A) typical

of familial Amyotrophic Lateral Sclerosis (ALS). Data on the rate of ascorbate uptake

by these cells were in agreement with the level of oxidative stress induced by the mutant

SOD. Attemps to use the microelectrodes inside single cells were also performed.

Keywords: microelectrode, microenvironments, modified electrode, DNA e ascorbic

acid.

LISTA DE ABREVIATURAS E SIGLAS κ: coeficiente de partição do substrato entre o filme e a solução

σ: desvio padrão

Γ: excesso superficial

ω: velocidade de rotação

ν: viscosidade cinemática

A: adenina

a: área

AC: do inglês, “Alternating Current”

ALS: do inglês, “Amyotrophic Lateral Sclerosis”

b0: concentração dos sítios eletrocatalíticos no filme

c ou cs: concentração do analito ou substrato

C: citosina

CoHCF: cobalto hexacianoferrato

D: coeficiente de difusão

dA: 2’ - desoxiadenosina

dC: 2’ - desoxicitidina

DC: do inglês, “Direct Current”

Dct: coeficiente de transporte de carga no filme

dG: 2’ - desoxiguanosina

dh-DNA: DNA dupla hélice

DMEM: do inglês, “Dulbecco's Modified Eagle's Medium”

DNA: do inglês, “Deoxyribonucleic Acid”

DSP: coeficiente de difusão do substrato no filme

dT: 2’ - desoxitimidina

E1/2: potencial de meia onda

ECS: eletrodo de calomelano saturado

Ep,a: potencial de pico anódico

Ep,c: potencial de pico catódico

EROs : espécies reativas de oxigênio

F: constante de Faraday

FeHCF: azul da Prússia ou ferro hexacianoferrato

fs-DNA: DNA fita simples

G: guanina

GC: do inglês, “Gas Chromatography”

GSH: glutationa reduzida

HOPGE: do inglês, “highly oriented pyrolytic graphite”

HPLC: do inglês, “High Performance Liquid Chromatography”

Ic: corrente capacitiva

Ik: corrente catalítica

IL: corrente limite

InHCF: índio hexacianoferrato

Ip: corrente de pico

IR: queda ôhmica

ITO: do inglês, “indium tin oxide”

jL: densidade da corrente limite

k: constante cinética do processo eletroquímico

k’ME: constante de velocidade do processo eletroquímico

L: espessura do filme

MEA: do inglês, “Microelectrode Array”

MEM: do inglês, “Minimum Essential Medium”

MHCF: metal hexacianoferrato

n : número de elétrons

PDDA: do inglês, “poly(diallydimethylammonium chloride)”

PDMA: do inglês, “polymer of N,N-dimethylaniline”

Q: carga

r : raio

RMS: do inglês, “root mean square”

RuHCF: rutênio hexacianoferrato

RuOHCF : óxido de rutênio hexacianoferrato

S: sensibilidade

SECM: do inglês, “Scanning Electrochemical Microscopy”

SFB: soro fetal bovino

SOD: Cu,Zn-superóxido dismutase

STM: do inglês, “Scanning Tunneling Microscopy”

T: temperatura

t: tempo

v: velocidade de varredura

LISTA DE FIGURAS

Figura 1 – Geometria de microeletrodos e arranjo de microeletrodos usualmente

empregadas na literatura: microdisco (a), microanel (b), arranjo de microdiscos (c),

microbanda (d), microcilíndrico (e), microesfera (f), microhemisfério (g) e arranjo

interdigitado (h). ............................................................................................................... 1

Figura 2 – Estrutura das bases nitrogenadas do DNA. ................................................... 14

Figura 3 – Representação das estruturas moleculares de um nucleosídeo (A) e

nucleotídeo (B). .............................................................................................................. 14

Figura 4 – Representação esquemática de alguns processos de danos no DNA. O painel

a mostra a estrutura da 2’-desoxiguanosina no DNA. .................................................... 18

Figura 5 – Esquema da célula eletroquímica utilizada para o desgaste eletroquímico.

Eletrodos de grafite (A), Fibra de platina (B), Solução para a corrosão: CaCl2 saturada

(C) e solução não condutora: CCl4 (D)........................................................................... 35

Figura 6 – Esquema da célula eletroquímica utilizada para o desgaste eletroquímico das

fibras de Au (d = 100 µm). Fibra de ouro (A) e Eletrodo de platina (B). Solução para a

corrosão: HCl 4 mol L-1.................................................................................................. 36

Figura 7 – Esquema do processo de fabricação dos microeletrodos após desgaste

eletroquímico: (A) fibra com ponta afiada, (B) imersão da fibra no plastificante e (C)

processo de secagem do plastificante de borracha. ........................................................ 37

Figura 8 – Visão Lateral da matriz de microeletrodos. .................................................. 38

Figura 9 – “Design” completo do MEA (A), região central com 100 microeletrodos (B)

e “zoom” de 9 microeletrodos (C).................................................................................. 39

Figura 10 – Esquema da célula eletroquímica: eletrodo de referência (a), solução de

trabalho (b) e MEA (c). .................................................................................................. 40

Figura 11 – “Layout” e imagem do microeletrodo integrado......................................... 41

Figura 12 – Representação esquemática da célula de fluxo utilizada nos experimentos

em FIA: Eletrodo de Trabalho (A), Referência (B) e Auxiliar (Aço inox) (C).............. 44

Figura 13 – Micromanipulador utilizado nos experimentos utilizando os fibroblastos. 51

Figura 14 – Esquema do processo de desgaste eletroquímico da fibra de platina em

função do tempo (t). Pt4+ = ● e Cl- = o. .......................................................................... 53

Figura 15 – Sinal amperométrico registrado durante desgaste eletroquímico de fibra de

platina de diâmetro igual a 100 μm. Freqüência alternada de 60 Hz e potencial eficaz 5

V. Em (A) ocorreu o rompimento da fibra. ................................................................... 53

Figura 16 – As duas extremidades de uma fibra de platina que sofreu o processo de

corrosão. Extremidade superior (A) e extremidade inferior (B). Potencial eficaz

utilizado = 5 V. ............................................................................................................... 55

Figura 17 – Microscopia eletrônica de varredura da fibra de platina que sofreu um

processo de desgaste eletroquímico utilizando-se um transformador de potencial eficaz

de 5 V. ............................................................................................................................ 56

Figura 18 – Microscopia eletrônica de varredura da fibra de platina que sofreu um

processo de desgaste eletroquímico utilizando-se um transformador de potencial eficaz

de 10 V. .......................................................................................................................... 57

Figura 19 – Amperograma registrado durante o processo de desgaste eletroquímico da

fibra de ouro de diâmetro igual a 100 μm. Diferença de potencial entre os eletrodos =

1,7 V e solução para corrosão = HCl 4 mol L-1.............................................................. 59

Figura 20 – Microscopia eletrônica de varredura da fibra de ouro após processo de

desgaste eletroquímico. .................................................................................................. 59

Figura 21 – Fibra de platina desgastada eletroquimicamente antes (A) e após (B) a

selagem com plastificante de borracha........................................................................... 60

Figura 22 – Voltamogramas cíclicos registrados em solução de K4Fe(CN)6 20 mol L-1 +

KCl 0,1 mol L-1. A e B referem-se a dois diferentes microeletrodos de platina (A) e ouro

(B) fabricados pelo processo de desgaste eletroquímico. Velocidade de varredura: 50

mV s-1. ............................................................................................................................ 61

Figura 23 – Voltamogramas cíclicos registrados em solução de K3Fe(CN)6 20 mmol L-1

+ KCl 0,1 mol L-1. Microeletrodo de Pt 1 sem (A) e com (B) pré-tratamento (Como

descrito na parte experimental) e microeletrodo de platina 2 (C) após pré-tratamento.

Velocidade de varredura: 50 mV s-1. .............................................................................. 62

Figura 24 – Voltamogramas cíclicos registrados em solução de K3Fe(CN)6 12,5 mmol

L-1 + KCl 0,1 mol L-1. Velocidade de varredura: 50 mV s-1. Microeletrodo de fibra de

carbono. .......................................................................................................................... 63


+ KCl 0,1 mol L-1, utilizando 2 microeletrodos de Pt de áreas diferentes. Registros

realizados com (⎯⎯) e (- - -) sem o referência integrado. Em (- - -) utilizou-se

Ag/AgCl saturado como eletrodo de referência. Velocidade de varredura: 50 mV s-1. . 64

Figura 26 – Microscopia eletrônica de varredura do eletrodo integrado e ampliação da

ponta do eletrodo. ........................................................................................................... 65

Figura 27 – Microscopia eletrônica de varredura do dispositivo no qual a disposição do

eletrodo de ficou mais próxima da ponta do microeletrodo. .......................................... 66

Figura 28 – Voltamogramas cíclicos registrados durante o processo de isolamento da

microfibra de platina. Velocidade de varredura: 50 mV s-1. Solução: Fenol 0,1 mol L-1 +

NaOH 1 mol L-1. Número de ciclos: 50. Na Figura estão representados os ciclos de 1 a

15 e o quinqüagésimo ciclo. ........................................................................................... 68


+ KCl 0,1 mol L-1, utilizando microeletrodo recoberto com a camada polimérica.

Velocidade de varredura: 50 mV s-1. .............................................................................. 69

Figura 30 – Imagem antes (A) e após (B) a polarização dos microeletrodos em -1,5 V vs

Ag/AgCl. Eletrólito suporte: H2SO4 1 mol L-1. .............................................................. 71

Figura 31 – Voltamogramas registrados em solução contendo Fe(CN)63- 1 mmol L-1 +

KCl 1 mol L-1 de 2 microeletrodos interconectados (a). Os voltamogramas (b e c)

representam, cada, 25 microeletrodos interconectados. O voltamograma (d) foi

registrado com um grupo de 50 microeletrodos. Velocidade de varredura de 50 mV s-1.

........................................................................................................................................ 72

Figura 32 – Voltamogramas registrados em solução contendo 10 mmol L-1 de ácido

ascórbico. Eletrólito suporte: NaOH 0,1 mol L-1 (A), tampão fosfato pH = 7,0 (B),

Tampão Ac-/HAc pH = 5,6 (C) e HCl 0,01 mol L-1 (D). Microeletrodos de platina e

velocidade de varredura igual a 50 mV s-1. .................................................................... 74

Figura 33 – Voltamogramas consecutivos registrados em solução de HCl 0,01 mol L-1 +

10 mmol L-1 de ácido ascórbico em dois diferentes eletrodos de platina: microeletrodos

(A, B) e macroeletrodos (C,D): 1º Ciclo (A,C) e 2º Ciclo (B,D). .................................. 75

Figura 34 – Voltamogramas lineares obtidos utilizando-se microeletrodo de platina a 50

mV s-1: suco de laranja antes (A) e após (B) 30 minutos da adição de cubos de pepino

(B). A Curva C foi obtida em tampão fosfato, pH = 7. .................................................. 76

Figura 35 – Voltamograma registrado “in-situ” em uma laranja utilizando microeletrodo

de platina. Velocidade de varredura: 50 mV s-1. Imagem da posição do eletrodo na

laranja na foto acima....................................................................................................... 79

Figura 36 – Representação bidimensional da corrente limite em voltamogramas

registrados a 50 mV s-1 com microeletrodos de platina em função da posição do sensor

na escala XY representada. A e B representam os gráficos bidimensionais para a fruta

não madura e madura, respectivamente.......................................................................... 82

Figura 37 – Representação bidimensional da corrente limite em voltamogramas

registrados a 50 mV s-1 com microeletrodos de platina em função da posição do sensor

na escala XZ representada. A e B representam os gráficos bidimensionais para a fruta

não madura e madura, respectivamente.......................................................................... 83

Figura 38 – Voltamogramas lineares registrados “in-situ” em uma goiaba: no centro (A)

e próximo à casca (B). Microeletrodo utilizado: platina e velocidade de varredura de 50

mV s-1. ............................................................................................................................ 85

Figura 39 – Sinais amperométricos registrados pela injeção de 5 μL de amostra de

iodato 1 mmol L-1 à solução de trabalho (200 μL) colocada sobre o MEA (I- 100 mmol

L-1 + H2SO4 1 mmol L-1. Alíquotas foram injetadas em duas diferentes regiões: região

periférica (a) e na região central (b). No quadro apresenta-se a curva de calibração

obtida usando as correntes de estado estacionário.......................................................... 88

Figura 40 – Voltamogramas de pulso diferencial registrados em tampão fosfato (d) na

presença de guanina 0,2 mmol L-1 + dG 0,5 mmol L-1 (a), dGMP 0,5 mmol L-1 (b), dG

0,5 mmol L-1 (c). Pré-tratamento da superfície em +1,4 V por 180 s, antes dos registros

voltamétricos. Amplitude do pulso: 50 mV, largura do pulso: 50 ms e velocidade de

varredura 25 mV s-1. Eletrodo: Carbono vítreo. ............................................................. 89

Figura 41 – Reação do cloroacetaldeído com a dG e voltamogramas de pulso diferencial

registrados em tampão fosfato pH = 7,2 (a) contendo dG 0,4 mmol L-1 (b) e dG 0,4

mmol L-1 + cloroacetaldeído 60 mmol L-1 (c). Monitorou-se o progresso da reação após

19 horas (d) de incubação com cloroacetaldeído a 37ºC. Pré-tratamento da superfície do

eletrodo em +1,4 V por 180 s, antes dos registros voltamétricos. Amplitude do pulso: 50

mV, largura do pulso: 50 ms e velocidade de varredura 25 mV s-1. Eletrodo: Carbono

vítreo............................................................................................................................... 91

Figura 42 – Voltamogramas de pulso diferencial registrados para adições sucessivas de

eteno aduto em tampão fosfato pH = 7,2. Pré-tratamento da superfície em +1,4 V por

180 s, antes dos registros voltamétricos. Amplitude do pulso: 50 mV, largura do pulso:

50 ms e velocidade de varredura 25 mV s-1. Eletrodo: Carbono vítreo.......................... 92

Figura 43 – Reação paralela que pode ocorrer na formação do etenoaduto na célula. .. 94

Figura 44 – Voltamogramas cíclicos registrados durante o processo de modificação da

superfície de carbono vítreo com CoHCF em solução contendo K3Fe(CN)6 1,0 mmol L-1

+ CoCl2 1 mmol L-1 + NaCl 0,5 mol L-1. Velocidade de varredura: 100 mV s-1. Área do

eletrodo: 0,0707 cm2. Número de ciclos: 15. ................................................................. 96

Figura 45 – Verificação da estabilidade do filme de CoHCF em NaCl 0,5 mol L-1.

Velocidade de varredura: 100 mV s-1. Área do eletrodo: 0,0707 cm2............................ 97


superfície de carbono vítreo com InHCF em solução contendo InCl3 1 mmol L-1 +

K3Fe(CN)6 1 mmol L-1 + NaCl 0,5 mol L-1 + HCl 0,01 mol L-1. Velocidade de

varredura: 100 mV s-1. Área do eletrodo: 0,0707 cm2. Número de ciclos: 25. .............. 98

Figura 47 – Verificação da estabilidade do filme de InHCF em NaCl 0,5 mol L-1 + HCl

0,01 mol L-1. Velocidade de varredura: 100 mV s-1. Área do eletrodo: 0,0707 cm2...... 99


superfície de carbono vítreo com RuHCF em solução contendo RuCl3 1 mmol L-1 +

K3Fe(CN)6 1 mmol L-1 + NaCl 0,5 mol L-1 + HCl 0,05 mol L-1. Velocidade de

varredura: 100 mV s-1. Área do eletrodo: 0,0707 cm2. Número de ciclos: 60. ............ 100

Figura 49 – Verificação da estabilidade do filme de RuHCF em NaCl 0,5 mol L-1 + HCl

0,05 mol L-1. Velocidade de varredura: 100 mV s-1. Área do eletrodo: 0,0707 cm2.... 101

Figura 50 – Voltamogramas cíclicos registrados em carbono vítreo (A), e eletrodos

contendo filmes de CoHCF (B), RuHCF (C) e InHCF (D) na presença (−−−) e ausência

(- - -) de 1 mmol L-1 de dG. Velocidade de varredura: 100 mV s-1. Eletrólito suporte: ver

respectiva modificação para cada eletrodo. Modificação realizada utilizando 15 ciclos.

...................................................................................................................................... 102

Figure 51 – Imagens de microscopia eletrônica de varredura da superfície do carbono

vítreo (A) e modificada com o filme de RuHCF. Espectros utilizando espectroscopia de

difração de raio-X para uma superfície modificada com filmes de RuHCF (Γ = 7,80 x

10-9 mol cm-2)(- - -) e FeHCF (Γ = 2,21 x 10-8 mol cm-2)(⎯). .................................... 104

Figura 52 – Voltamogramas cíclicos do eletrodo modificado com filme de RuOHCF em

diferentes velocidades de varredura em eletrólito suporte 0,5 mol L-1 NaNO3 + 0,01 mol

L-1 HCl. Área do eletrodo: 0,0707 cm2. O valor do potencial utilizado para obtenção do

gráfico de Ip contra v foi 0,93 V. .................................................................................. 105

Figura 53 – Estudos cronoamperométricos para o eletrodo modificado com RuOHCF

em diferentes valores de Γ: 1,81 (a), 4,47 (b) e 7,80 mol cm-2 (c). Degrau de potencial

de 0,0 a 1,2 V em solução contendo NaNO3 0,5 mol L-1 + HCl 0,05 mol L-1. A linha

tracejada corresponde à regressão linear dos dados coletados na região de tempos

curtos. ........................................................................................................................... 106

Figura 54 – Voltamogramas hidrodinâmicos em solução contendo dG 1 mmol L-1 +

NaNO3 0,5 mol L-1 + HCl 0,05 mol L-1, utilizando eletrodo rotativo de carbono vítreo

modificado com RuOHCF (Γ = 8,12 x 10-10 mol cm2) a diferentes velocidades de

rotação: 100 (A), 400 (B), 900 (C), 1600 (D) e 2500 (E). Velocidade de varredura: 20

mV s-1. O quadro inserido na figura representa o gráfico de Koutecký-Levich para

correntes medidas em diferentes potenciais, obtidos a partir do registro voltamétrico em

potenciais: 1,15, 1,18, 1,20 e 1,25 V. ........................................................................... 109







diferentes potenciais: 1,15, 1,18, 1,20 e 1,25 V. .......................................................... 110






















Figura 59 – Gráfico de IL vs ω1/2 em solução contendo dG 1 mmol L-1 + NaNO3 0,5 mol

L-1 + HCl 0,05 mol L-1 utilizando eletrodo rotativo de carbono vítreo modificado com

RuOHCF a diferentes velocidades de rotação utilizando diferentes valores de excesso

superficial: 8,12 x 10-10, 9,55 x 10-10, 10,3 x 10-10, 11,9 x 10-10, 16,8 x 10-10 mol cm2 .

Velocidade de varredura: 20 mV s-1. ............................................................................ 114

Figura 60 – Dependência de log k’ME em função do log Γ para processo de oxidação da

dG em filmes de RuOHCF. Condições experimentais: 1mmol L-1 de dG, eletrólito

suporte: NaNO3 0,5 mol L-1 + HCl 0,05 mol L-1. Excesso superficial variando de 9,55 a

16,8 x 10-10 mol cm-2. ................................................................................................... 117

Figura 61 – Dependência dos valores de corrente, do termo cinético, medidos em ω-1/2 =

0 em função do excesso superficial. Condições experimentais descritas na Figura 58.118

Figura 62 – Voltamogramas cíclicos registrados em eletrólito suporte antes (- - -) e após

(⎯⎯) adição de dG (concentração final em solução = 2 mmol L-1) utilizando eletrodo

de carbono vítreo (A) e eletrodo de carbono vítreo modificado com FeHCF (B) (Γ =

2,21 x 10-8 mol cm-2). Velocidade de varredura: 100 mV s-1. Eletrólito suporte: NaNO3

0,5 mol L-1 + HCl 0,05 mol L-1. ................................................................................... 119

Figura 63 – Voltamogramas hidrodinâmicos para injeções de solução de dG 252 μmol

L-1 em eletrodo de carbono vítreo (▲) e modificado com filme de RuOHCF (■). Vazão:

0,55 mL min-1, volume de amostra: 60 μL e solução carregadora: NaNO3 0,5 mol L-1 +

HCl 0,05 mol L-1........................................................................................................... 122

Figura 64 – Influência da vazão (A, 0,26 (a), 0,55 (b), 0,70 (c), 1,1 (d), 1,6 (e) e 2,0 (f)

mL min-1) e volume de amostra (B, 50 (a), 100 (b), 150 (c), 200 (d), 250 (e) µL) para

repetidas injeções de dG 252 μmol L-1 utilizando eletrodo modificado com filme de

RuOHCF. Em (A) utilizou-se alça de 100 μL e em (B) vazão de 0,50 mL min-1. Solução

carregadora: NaNO3 0,5 mol L-1 + HCl 0,05 mol L-1. E = 1,1 V. ................................ 123

Figura 65 – Sinais amperométricos para repetidas injeções de dG 38,5 μmol L-1

utilizando eletrodo modificado com filme de RuOHCF. Solução carregadora: NaNO3

0,5 mol L-1 + HCl 0,05 mol L-1. Vazão: 1,6 mL min-1 e volume de amostra: 100 μL. E =

1,1 V. ............................................................................................................................ 124

Figura 66 – Sinais de corrente de pico para injeções de solução de dG com as seguintes

concentrações: 3,85 (a), 19,3 (b), 38,5 (c), 96,3 (d) e 252 (e) μmol L-1 e duas amostras

de DNA (s1 e s2). O quadro inserido na figura mostra a dependência da corrente de pico

medida em função da concentração de dG. Solução carregadora: NaNO3 0,5 mol L-1 +

HCl 0,05 mol L-1. E = 1,1 V. ........................................................................................ 126

Figura 67 – Dependência da sensibilidade do eletrodo modificado com o tempo.

Velocidade do fluxo: 1,6 mL min-1, volume de amostra: 100 μL, solução carregadora:

NaNO3 0,5 mol L-1 + HCl 0,05 mol L-1. E = 1,1 V. ..................................................... 127

Figura 68 – Comparação dos resultados obtidos pelos métodos proposto e HPLC para

análise de dG em 17 amostras de DNA. As linhas tracejadas representam o limite de 95

% de confiança. ............................................................................................................ 128

Figura 69 – Sexagésimo voltamograma cíclico registrado no processo de modificação

do eletrodo com o filme RuOHCF (A). Em (B) estão mostrados o último ciclo do

processo de verificação da estabilidade (a) e adições sucessivas de ácido ascórbico (b-f)

(concentração final de 0,990 (b), 1,96 (c), 2,91 (d), 3,85 (e) e 4,76 mmol L-1(f)). Em (C)

está mostrado o registro voltamétrico realizado em uma solução contendo 4,76 mmoL

L-1 de ácido ascórbico. Velocidade de varredura: 100 mV s-1. Eletrólito suporte: NaNO3

0,5 mol L-1 + HCl 0,05 mol L-1. ................................................................................... 131

Figura 70 – Primeiro (⎯⎯) e sexagésimo (- - -) voltamograma cíclico registrado em

tampão fosfato pH = 6,9 contendo RuCl3 1 mmol L-1 + Fe(CN)63- 1mmol L-1 usando

eletrodo de carbono vítreo. Velocidade de varredura: 100 mV s-1. .............................. 133

Figura 71 – Voltamogramas cíclicos registrados utilizando eletrodo modificado de

RuOHCF na ausência (a) e presença de ácido ascórbico (b-f) (concentração final de

0,990 (b), 1,96 (c), 2,91 (d), 3,85 (e) e 4,76 mmol L-1 (f)) e utilizando eletrodo limpo de

carbono vítreo em solução contendo 4,76 mol L-1 de ácido ascórbico (- - -). Eletrólito

suporte: Tampão fosfato pH = 6,9. Velocidade de varredura: 100 mV s-1. Γ = 5,30 x 10-9

mol cm-2........................................................................................................................ 134

Figura 72 – Voltamogramas hidrodinâmicos (A) registrados em tampão fosfato pH =

6,9 (a) e ácido ascórbico (b-f) 1 mmol L-1 usando eletrodo modificado de RuOHCF (Γ =

2,79 x 10-9 mol cm-2) em diferentes velocidades de rotação: 0 (a), 100 (b), 400 (c), 900

(d), 1600 (e) e 2500 (f). Em B estão representados os gráficos de Levich para diferentes

valores de concentração de ácido ascórbico em solução tampão pH 6,9 : 1 (-), 2 (-), 3 (-

), 4 (-) e 5 mmol L-1(-). Velocidade de varredura: 20 mV s-1. ...................................... 136

Figura 73 – Gráficos de Koutecký-Levich para os valores de corrente registrados na

Figura 16B. Mesmas condições experimentais da Figura 72. ...................................... 137

Figura 74 – Dependência do log k’ME contra log cs. Condições experimentais da Figura

72. ................................................................................................................................. 138

Figura 75 – Dependência do log k’ME contra log Γ. Os valores de excesso superficial

utilizado nos experimentos foram: 2,61, 7,82, 14,7 e 24,7 x 10-10 mol cm-2, demais

condições vide Figura 16. Concentração de ácido ascórbico: 1 mmol L-1. .................. 140

Figura 76 – Voltamograma hidrodinâmico para injeções de solução de ácido ascórbico 1

mmol L-1 em eletrodo de carbono vítreo modificado com filme de RuOHCF. Vazão: 1,6

mL min-1, volume de amostra: 100 μL e solução carregadora: Tampão fosfato pH 6,9. Γ

= 5,22 x 10-9 mol cm-2................................................................................................... 143

Figura 77 – Influência da vazão (A) e volume de amostra (B) para repetidas injeções de

ácido ascórbico 1 mmol L-1 utilizando eletrodo modificado com filme de RuOHCF. Em

(A) utilizou-se alça de 100 μL e os seguintes valores de vazão: 0,26 (a), 0,70 (b), 1,1

(c), 1,6 (d), 2,0 (e), 2,5 (f), 2,6 (g) mL min-1. Em (B) a vazão utilizada foi 2,0 mL min-1

e as alças: 100 (a), 150 (b), 200 (c) e 250 (d) μL. Variou-se a solução carregadora:

NaNO3 0,5 mol L-1 + HCl 0,05 mol L-1. E = 1,1 V. Γ = 5,22 x 10-9 mol cm-2. ............ 145

Figura 78 – Sinais amperométricos registrados utilizando eletrodo modificado de

RuOHCF (Γ = 5,22 x 10-9 mol cm-2) para injeções de solução de ácido ascórbico: 50 (a),

100 (b), 200 (c), 500 (d) e 1000 (e) μmol L-1. Solução carregadora: tampão fosfato pH

6,9. E = 0,0 (A) e 0,4 (B) V. Inserida em cada uma das figuras está a curva de

calibração para cada potencial de trabalho. .................................................................. 147

Figura 79 – Corrente de pico obtidas para repetidas injeções de ácido ascórbico 1 mmol

L-1 utilizando eletrodo modificado com filme de RuOHCF. Solução carregadora:

NaNO3 0,5 mol L-1 + HCl 0,05 mol L-1. Vazão: 2,0 mL min-1 e volume de amostra: 150

μL. E = 0 V. Γ = 5,22 x 10-9 mol cm-2.......................................................................... 149

Figura 80 – Sinais amperométricos para repetidas injeções de ácido ascórbico 1 mmol

L-1 + glicose 2 mmol L-1 (a), ácido ascórbico 1 mmol L-1 + nitrito 2 mmol L-1 (b), ácido

ascórbico 1 mmol L-1 + ácido úrico 2 mmol L-1 (c) e ácido ascórbico 1 mmol L-1 (d)

utilizando eletrodo modificado com filme de RuOHCF. Solução carregadora: tampão

fosfato pH = 6,9. Vazão: 2,0 mL min-1 e volume de amostra: 150 μL. E = 0 V. Γ = 5,22

x 10-9 mol cm-2.............................................................................................................. 150

Figura 81 – Sinais amperométricos registrados utilizando eletrodo modificado de

RuOHCF (Γ = 5,22 x 10-9 mol cm-2) para injeções de solução de ácido ascórbico: 50 (a),

100 (b), 200 (c), 500 (d) e 1000 (e) μmol L-1 e duas amostras de urina (s1 e s2). Solução

carregadora: tampão fosfato pH 6,9. Vazão: 2,0 mL min-1 e volume de amostra: 150 μL.

E = 0,0. ......................................................................................................................... 151

Figura 82 – Voltamogramas cíclicos registrados durante o processo de modificação (A)

com RuOHCF da superfície de fibra carbono (r = 14,5 m) em solução contendo RuCl3 1

mmol L-1 + K3Fe(CN)6 1 mmol L-1 + NaNO3 0,5 mol L-1 + HCl 0,05 mol L-1 e

verificação da estabilidade (B) em solução contendo NaNO3 0,5 mol L-1 + HCl 0,05 mol

L-1. Velocidade de varredura: 100 mV s-1. Em C o voltamograma do eletrodo em

tampão fosfato (pH = 6,9). Γ = 2,0 x 10-8 mol cm-2. .................................................... 155

Figura 83 – Voltamogramas registrados com microeletrodo de fibra de carbono (r = 2,3

μm) modificado com filme de RuOHCF em solução de tampão fosfato pH = 6,9 antes e

após a adição de ácido ascórbico na faixa de 0,60 a 11 mmol L-1. O quadro inserido na

figura mostra as curvas de calibração obtidas em duas diferentes regiões das curvas

voltamétricas: 0,0 (A) e 0,2 (B) V. Velocidade de varredura: 100 mV s-1................... 157

Figura 84 – Voltamogramas registrados com microeletrodo de fibra de carbono (r =

14,5 μm) modificado com filme de RuOHCF em MEM (A) e tampão fosfato pH = 6,9

(B). Velocidade de varredura: 100 mV s-1. Γ = 2,0 x 10-8 mol cm-2. ........................... 158

Figura 85 – Sinais amperométricos (A) obtidos utilizando microeletrodo de fibra de

carbono (r = 14,5 μm) modificado com filme de RuOHCF para injeções de glutaniona

(a) (concentração final de 0,5 mmol L-1) e ácido ascórbico (b-f) (concentração final

igual a 0,082 (b), 0,16 (c), 0,24 (d), 0,40 (e), 0,55 (f), 0,69 (g) mmol L-1) em MEM.

Sinais amperométricos (B) obtidos utilizando microeletrodo modificado com RuOHCF

para injeção de 100 μL de MEM concentrado (h)em tampão fosfato (6 mL). O painel C

representa a curva de calibração para adições sucessivas de ácido ascórbico em MEM. E

= 0,0 V vs Ag/AgCl. Experimentos sob agitação com barra magnética. Γ = 2,0 x 10-8

mol cm-2........................................................................................................................ 159

Figura 86 – Sensibilidade do microeletrodo de fibra de carbono (r = 14,5 μm)

modificado com filme de RuOHCF para curvas de calibração construídas na faixa de

0,5 – 1,5 mmol L-1 em meio MEM durante 120 horas. E = 0,0 V vs Ag/AgCl.

Experimentos sob agitação com barra magnética. Γ = 2,0 x 10-8 mol cm-2. ................ 161

Figura 87 – Sinais amperométricos registrados utilizando microeletrodo de fibra de

carbono (r = 14,5 μm) modificado com filme de RuOHCF no meio de cultura contendo

0,5 mmol L-1 de glutationa + 0,2 mmol L-1 de ácido ascórbico sem e com as células. E =

0,0 V vs Ag/AgCl. Experimentos realizados sem agitação magnética. Γ = 2,0 x 10-8 mol

cm-2. .............................................................................................................................. 162

Figura 88 – Imagem obtida do fibroblasto utilizando microscópio invertido. ............. 164

Figura 89 – Imagem obtida utilizando microscópio invertido durante o processo de

formação dos fungos..................................................................................................... 165

Figura 90 – Imagem e registro voltamétrico no fibroblasto utilizando a técnica de pulso

diferencial. Amplitude do pulso: 50 mV, largura do pulso: 70 ms e velocidade de

varredura: 5 mV s. Eletrodo: Microeletrodo de Platina................................................ 166

LISTA DE TABELAS

Tabela 1 – Procedimentos para desgaste eletroquímico de fibras de carbono. ................ 7

Tabela 2 – Trabalhos reportados na literatura para determinação de ácido ascórbico. .. 28

Tabela 3 – Composição do plastificante de borracha (PlastiFilm, QUIMATEC®). Fonte:

http://www.quimatic.com.br/fispqs/fispq_plast_film.pdf................................................ 37

Tabela 4 - Valores de adição e recuperação usando três diferentes sucos de laranja..... 77

Tabela 5 – Medidas de resistência, E1/2 e IL em diferentes posições do microeletrodo e

do eletrodo de referência inseridos na laranja. ............................................................... 80

Tabela 6 – Valores de corrente limite e concentração obtidos com o microeletrodo de Pt

em diferentes frutas. ....................................................................................................... 86

Tabela 7 – Valores de Dct1/2, b0 e Dct para diferentes valores de Γ e L (Espessura,

medida por elipsometria). ............................................................................................. 107

Tabela 8 – Equações que definem a constante de velocidade de processos heterogêneos

para eletrodos modificados, k’ME e ordem de k’ME contra L (ou Γ) e concentração

(Albery e Hillman, 1984; Ciszewski e Milczarek, 1999; Vilas-Boas, Pereira et al.,

2002)............................................................................................................................. 116

Tabela 9 – Valores de limite de detecção para determinação de dG na literatura........ 129

Tabela 10 – Valores de concentração encontrado em 4 diferentes amostras de urina

utilizando o método proposto ....................................................................................... 152

SUMÁRIO

1. INTRODUÇÃO.................................................................................................................... 1

1.1. MICROELETRODOS............................................................................................................ 1

1.1.1. DEFINIÇÃO ....................................................................................................................... 1

1.1.2. MICROELETRODOS VOLTADOS PARA DETECÇÃO EM MICROAMBIENTES ......................... 9

1.2. ÁCIDOS NUCLEICOS ......................................................................................................... 13

1.2.1. DANOS NO DNA............................................................................................................. 16

1.3. ESCLEROSE LATERAL AMIOTRÓFICA (ALS) ................................................................ 22

1.4. ÁCIDO ASCÓRBICO.......................................................................................................... 25

1.4.1. ÁCIDO ASCÓRBICO EM NEURÔNIOS ............................................................................... 29

2. OBJETIVO......................................................................................................................... 31

3. PARTE EXPERIMENTAL .............................................................................................. 32

3.1. REAGENTES...................................................................................................................... 32

3.2. INSTRUMENTAÇÃO .......................................................................................................... 33

3.3. PROCESSO DE FABRICAÇÃO DOS MICROELETRODOS.................................................... 34

3.3.1. DESGASTE ELETROQUÍMICO........................................................................................... 34

3.3.2. FABRICAÇÃO DA MATRIZ DE MICROELETRODOS (MEA, MICROELECTRODE ARRAY)

UTILIZANDO LITOGRAFIA. ........................................................................................................... 37

3.3.3. CONSTRUÇÃO DO MICROELETRODO INTEGRADO........................................................... 40

3.3.4. CONSTRUÇÃO DO MICROELETRODO: ISOLAMENTO COM POLÍMERO NÃO CONDUTOR... 41

3.4. PROCEDIMENTO DE POLIMENTO POTENCIODINÂMICO ................................................ 41

3.5. MODIFICAÇÃO DA SUPERFÍCIE DOS ELETRODOS COM FILMES DE

HEXACIANOFERRATOS (HCF)................................................................................................... 42

3.6. CÉLULA DE PARA ANÁLISE POR INJEÇÃO EM FLUXO .................................................... 43

3.7. AMOSTRAS DE DIFERENTES FRUTAS .............................................................................. 44

3.8. TRATAMENTO ENZIMÁTICO ........................................................................................... 45

3.9. PREPARAÇÃO DAS AMOSTRAS DE DNA.......................................................................... 45

3.10. PREPARAÇÃO DAS AMOSTRAS DE URINA...................................................................... 46

3.11. MÉTODO COULOMÉTRICO ............................................................................................ 46

3.12. MÉTODO CROMATOGRÁFICO ....................................................................................... 47

3.13. MICROSCOPIA ELETRÔNICA DE VARREDURA ............................................................. 47

3.14. ELIPSOMETRIA............................................................................................................... 48

3.15. CULTURA DE NEUROBLASTOMAS HUMANOS ............................................................... 48

3.16. AVALIAÇÃO DO CONSUMO DE ASCORBATO PELAS CÉLULAS SH-SY5Y UTILIZANDO

MICROELETRODO MODIFICADO COM FILME DE ÓXIDO DE RUTÊNIO HEXACIANOFERRATO 49

3.17. MEDIDAS ELETROQUÍMICAS EM UMA ÚNICA CÉLULA ................................................ 50

4. RESULTADOS E DISCUSSÃO....................................................................................... 52

4.1. FABRICAÇÃO E CARACTERIZAÇÃO DOS MICROELETRODOS ........................................ 52

4.1.1. MICROELETRODOS FABRICADOS POR DESGASTE ELETROQUÍMICO ............................... 52

4.1.2. MICROELETRODOS FABRICADOS UTILIZANDO TÉCNICA LITOGRÁFICA ......................... 70

4.2. UTILIZAÇÃO DOS SENSORES FABRICADOS ..................................................................... 73

4.2.1. MONITORAMENTO “IN-SITU” DE ÁCIDO ASCÓRBICO EM FRUTAS .................................. 73

4.2.2. QUANTIFICAÇÃO DE IODATO EM SAL UTILIZANDO MATRIZ DE MICROELETRODOS (MEA)

86

4.3. ESTUDO DO COMPORTAMENTO ELETROQUÍMICO DE CONSTITUINTES DO DNA ........ 89

4.4. MODIFICAÇÃO DA SUPERFÍCIE DO ELETRODO .............................................................. 95

4.5. ESTUDO DAS PROPRIEDADES ELETROQUÍMICAS DO FILME DE RUHCF .................... 103

4.6. ESTUDO DA OXIDAÇÃO ELETROCATALÍTICA DA DG NA SUPERFÍCIE DO ELETRODO

MODIFICADO DE RUOHCF...................................................................................................... 108

4.7. OTIMIZAÇÃO E UTILIZAÇÃO DO ELETRODO MODIFICADO COM RUOHCF PARA

DETECÇÃO DE DG EM FLUXO EM AMOSTRAS HIDROLISADAS DE DNA. ............................... 121

4.8. ESTUDO DA OXIDAÇÃO ELETROCATALÍTICA DE ÁCIDO ASCÓRBICO NA SUPERFÍCIE DO

ELETRODO MODIFICADO DE RUOHCF .................................................................................. 130

4.9. OTIMIZAÇÃO DOS PARÂMETROS ANALÍTICOS EM FLUXO PARA DETECÇÃO DE ÁCIDO

ASCÓRBICO EM MEIO NEUTRO UTILIZANDO O ELETRODO MODIFICADO COM RUOHCF .. 142

4.10. DESENVOLVIMENTO DE METODOLOGIA PARA A DETERMINAÇÃO DE ASCORBATO EM

MEIO DE MEM E GLUTATIONA UTILIZANDO MICROELETRODO MODIFICADO COM FILME DE

ÓXIDO DE RUTÊNIO HEXACIANOFERRATO ............................................................................. 153

4.11. DETERMINAÇÃO DO CONSUMO DE ASCORBATO PELAS CÉLULAS SH-SY5Y

UTILIZANDO MICROELETRODO MODIFICADO COM FILME DE ÓXIDO DE RUTÊNIO

HEXACIANOFERRATO .............................................................................................................. 161

4.12. ESTUDOS EM CÉLULAS ÚNICAS ................................................................................... 163

5. CONCLUSÃO.................................................................................................................. 167

6. PERSPECTIVAS FUTURAS ......................................................................................... 170

7. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS........................................................................... 171

Introdução 1

1. Introdução

1.1. Microeletrodos

1.1.1. Definição

Microeletrodos, muitas vezes chamados de ultramicroeletrodos, são sensores

químicos com dimensões micrométricas ou sub-micrométricas (Stulik, Amatore et al.,

2000). A Figura 1 mostra diferentes tipos de geometrias de microeletrodos e arranjos de

microeletrodos utilizados. Combinações de algumas dessas configurações para

fabricação de arranjo de microeletrodos também são encontradas na literatura.

(a) (b) (c) (d)

(e) (f) (g) (h)

Figura 1 – Geometria de microeletrodos e arranjo de microeletrodos usualmente empregadas na literatura: microdisco (a), microanel (b), arranjo de microdiscos (c), microbanda (d), microcilíndrico (e), microesfera (f), microhemisfério (g) e arranjo interdigitado (h).

Na definição do termo “microeletrodo”, não somente fatores como tamanho e

forma da superfície eletródica devem ser levados em consideração mas, adicionalmente,

parâmetros temporais da técnica eletroanalítica empregada que governam a espessura da

camada de difusão (Stulik, Amatore et al., 2000). Eletrodos de tamanho convencional (r

Introdução 2

= 10-4 m) podem, sob certas condições experimentais, responder como microeletrodo.

Entretando, para que esse comportamento seja mantido em outras condições

experimentais é necessário que o eletrodo apresente tamanho substancialmente menor (r

= 10-6 m) (Stulik, Amatore et al., 2000). Dessa forma, a definição de microeletrodo

como eletrodo de tamanho micrométrico é arbitrária. Nesse sentido, a definição de

microeletrodo pode ser mais abrangente (Stulik, Amatore et al., 2000) e referir-se a

qualquer eletrodo cujas dimensões, dentro de uma dada condição experimental, sejam

comparáveis ou menor que a camada de difusão, δ. Sob essas condições, um perfil de

estado estacionário ou pseudo estado estacionário (microeletrodos cilíndricos) é obtido.

Eletrodos com essa característica descrita acima apresentam um comportamento

eletroquímico diferenciado, com voltamogramas apresentando um perfil sigmoidal

referente ao estado estacionário. A obtenção do estado estacionário deve-se

predominantemente ao transporte de massa diferenciado nessas superfícies eletródicas,

em que prevalece a difusão radial.

No estado estacionário, a superfície do microeletrodo é envolvida por uma

camada de difusão hemisférica. Com isso, a resposta para a alteração de um valor de

potencial, de um valor onde j = 0, para um valor onde o processo eletroquímico é

controlado por difusão, pode ser descrito para um microeletrodo de disco por:

rnFDc

tcnFDjL ππ

42/12/1

2/1

+= (1)

onde, jL é definido como densidade de corrente no estado estacionário, n número de

elétrons, F constante de Faraday, D coeficiente de difusão da espécie eletroativa, c

concentração da espécie eletroativa no seio da solução, t tempo após a alteração para o

potencial onde o processo eletroquímico é governado por difusão e r raio do

microeletrodo. O primeiro termo da equação é idêntico ao definido para um degrau de

potencial para eletrodos de tamanho convencional, entretanto, o segundo termo é o que

Introdução 3

define a condição de estado estacionário. Nota-se pela análise da equação 1 que o

primeiro termo é dominante em tempos curtos, e o segundo em tempos longos. Além

disso, existe um meio termo, com relação ao tempo, onde a equação deve ser utilizada

na sua forma completa. Vale salientar que essas condições de contorno na equação 1 são

dependetes do raio do microeletrodo. Dessa forma, na condição de estado estacionário a

equação é descrita por:

rnFDcjL π

4= (2)

e a corrente como:

nFDcrI L 4= (3)

onde IL é definido como corrente no estado estacionário.

Uma vez definido o conceito de microeletrodos, é necessário entender as

vantagens que nos últimos vinte anos têm atraído tanto interesse de pesquisadores na

área de eletroanalítica para esse tipo de eletrodo. São elas (Adams, 1976; Wightman,

1981; Hepel e Osteryoung, 1982; Ewing, Bigelow et al., 1983; Bond, Fleischmann et

al., 1984a; b; Howell e Wightman, 1984b; a; Ghoroghchian, Sarfarazi et al., 1986;

White e Jorgenson, 1986; White, Stclaire et al., 1986; Baranski, 1987; Wightman e

Wipf, 1989; Stulik, Amatore et al., 2000):

- A corrente de estado estacionário para processos faradaicos é obtida em um curto

espaço de tempo;

- A razão corrente faradaica/corrente capacitiva, IF/IC, é aumentada, uma vez que a

corrente capacitiva decai proporcionalmente com a área do eletrodo, enquanto que a

corrente faradaica é proporcional aos parâmetros dimensionais do eletrodo;

- Baixa sensibilidade à queda ôhmica, IR, possibilitando estudos eletroquímicos de

sistemas redox em solventes com elevada resistência ou na ausência de eletrólito

Introdução 4

suporte (devido aos baixos valores de corrente medidos com microeletrodos, o produto

IR é desprezível para um amplo intervalo de valores de resistência);

- O potencial aplicado pode ser variado rapidamente, porque a corrente capacitiva é

minimizada;

- A razão sinal/ruído em condições de estado estacionário é melhorada quanto

comparada com eletrodos de tamanho convencional;

- Aumento do transporte de massa da espécie eletroativa para a superfície do eletrodo e,

conseqüentemente, pouca interferência de efeitos hidrodinâmicos sobre o sinal de

corrente;

- O pequeno tamanho dos eletrodos pode propiciar a sua utilização para a exploração de

domínios microscópicos (pequenos volumes de amostra).

Inicialmente as pesquisas sobre microeletrodos (Wightman, 1988) foram focadas

no desenvolvimento de métodos para construção de eletrodos de diferentes geometrias e

tamanhos. Hoje em dia (Wightman, 2006) esses métodos são relativamente bem

conhecidos, embora o interesse por novos métodos de fabricação ainda seja grande. A

fabricação de eletrodos micrométricos pode ser feita simplesmente selando microfibras

de carbono, ou outro metais (Au e Pt), dentro de um isolante apropriado (por exemplo,

vidro); alternativamente, técnicas litográficas (Kittlesen, White et al., 1984; White,

Kittlesen et al., 1984; Sanderson e Anderson, 1985; Thormann, Vandenbosch et al.,

1985; Bard, Crayston et al., 1986; Chidsey, Feldman et al., 1986; Fosdick, Anderson et

al., 1986; Hepel e Osteryoung, 1986) podem ser utilizadas para a fabricação desses

microeletrodos para utilização em medidas de microscopia de forca atômica (Dobson,

Weaver et al., 2005), por exemplo. Métodos para a fabricação de eletrodos com

dimensões submicrométricas são menos comuns que aqueles devotados para eletrodos

micrométricos (Wightman, 2006), embora nos últimos anos esse tipo de fabricação

Introdução 5

tenha recebido mais atenção da comunidade científica (Powell, Woods et al., 2005;

Wang, Chen et al., 2005; Hermans e Wightman, 2006).

Uma das técnicas empregadas para a fabricação de eletrodos submicrométricos

de platina envolve o uso de fibras “Wollaston” (do inglês), que são fibras de platina

recobertas por uma camada de prata para aumentar o diâmetro e propiciar uma maior

facilidade de manipulação. Bond e colaboradores (Bond, Fleischmann et al., 1984a)

utilizaram fibras “Wollaston” encapsuladas em vidro por aquecimento, após remoção

da prata eletroquimicamente. A partir deste método, estes autores conseguiram fabricar

eletrodos de disco de platina da ordem de 0,5 μm. Contudo, o número de tentativas para

se obter um eletrodo desta magnitude foi muito alto. Eletrodos da ordem de 40Å foram

reportados na literatura (Sacharoff, Westervelt et al., 1985) utilizando-se o processo

descrito por Bond e colaboradores (Bond, Fleischmann et al., 1984a).

Itaya e colaboradores (Itaya, Abe et al., 1987) descreveram um processo para a

fabricação de microeletrodos submicrométricos baseado no afinamento eletroquímico

de fibras de platina comerciais utilizando mistura dos sais NaNO3 e NaCl (4:1) fundidos

e desgaste eletroquímico utilizando potencial AC (1-50 Hz, 2,5 V, tamanho final da

fibra menor que 100 nm), aplicado com a utilização de um potenciostato. Essa técnica

foi utilizada para a preparação de pontas de prova para STM (do inglês, “Scanning

Tunneling Microscopy”) (Muller e Tsong, 1969) e para o monitoramento do potencial

extracelular de células isoladas (Merrill e Ainswort.A, 1972). Outras soluções utilizadas

para a fabricação de pontas de prova para STM e/ou fabricação de microeletrodos de

platina são reportadas na literatura, como por exemplo: solução saturada de

CaCl2:H2O:HCl concentrado (Liu, Fan et al., 1986), solução saturada de nitrito (Slevin,

Gray et al., 1999; Conyers e White, 2000), ou utilização de um sistema bifásico de

CaCl2:H2O:HCl concentrado + CCl4 (Song, Pryds et al., 1993) ou tricloro acetato

Introdução 6

(Sorensen, Hvid et al., 1999). Após a obtenção destas microestruturas, um processo de

isolamento das mesmas é necessário. O processo de isolamento das fibras mais

comumente encontrado na literatura emprega resina epóxi (Sorensen, Hvid et al., 1999),

ou ainda, eletropolimerização a partir de monômeros como o alilfenol ou oxifenileno

(Meister e Potje-Kamloth, 1998).

Procedimentos para fabricação de eletrodos submicrométricos de outros

materiais como por exemplo, fibra de carbono, também são reportados na literatura.

Chen e Kucernak (Chen e Kucernak, 2002) utilizaram fibras de carbono com tamanho

inicial de 3,6 µm e desgaste eletroquímico utilizando potencial AC em solução de

NaOH 0,1 mol L-1. Os autores obtiveram, a partir desse processo, microeletrodos com

raio efetivo da ordem de 1 nm (entende-se por raio efetivo a soma do raio do

microeletrodo mais a espessura do isolante, que nesse caso consistiu em tinta

eletroforética). Vale salientar que esse valor é um dos menores reportados até o

momento. Outros métodos utilizando diferentes soluções para o desgaste eletroquímico

(Tabela 1) também foram citados na literatura.

Introdução 7

Tabela 1 – Procedimentos para desgaste eletroquímico de fibras de carbono.

Autores Soluções utilizadas no

desgaste

Condições experimentais

Chen e Kucernak (Chen e

Kucernak, 2002) e

Schulte e colaboradores

(Schulte e Chow, 1998) e

Wang e colaboradores

(Wang, Chen et al., 2005)

NaOH 0,01 mol L-1 50 Hz, 1 – 5,5 Vp-p

Zhang e colaboradores

(Zhang, Zhang et al.,

1996)

- Fluxo de íons argônio

Ewing e colaboradores

(Powell, Woods et al.,

2005)

- Chama de acetileno

Huang e colaboradores

(Huang, Pang et al., 2001)

- Chama de

butano/propano

Meulemans e

colaboradores

(Meulemans, Poulain et

al., 1986)

Solução saturada de nitrito

e TWEEN 40

50 Hz, 2 – 6 V

Armstrongjames e

colaboradores

(Armstrongjames, Fox et

al., 1980)

0,9 % de NaCl 10 Hz, 0,3 – 1,5 mA

Wipf e colaboradores (El-

Giar e Wipf, 2006)

K2Cr2O7 0,5 mmol L-1/

H2SO4 5 mol L-1

60 Hz, 3,0 – 25 Vrms

Entretanto, vale destacar que em muitos desses trabalhos utilizam-se técnicas de

custo elevado, como a litografia, geradores de função para aplicação do potencial AC e

fluxo de íons de argônio. Esse fato, somado a dificuldades na fabricação (manipulação

Introdução 8

das fibras de pequenos tamanhos) e selagem das microfibras dificulta a larga utilização

de microeletrodos na área de eletroanalítica.

Outra desvantagem da utilização dos microeletrodos diz respeito ao fato de que

as correntes obtidas durante os processos eletroquímicos são muito baixas. Desta forma,

para a medição da corrente são necessários equipamentos que possuam alta precisão.

Nos últimos anos, entretanto, circuitos que possuem elevada sensibilidade podem ser

construídos com facilidade, o que faz com que essa desvantagem não se torne um

grande empecilho para a utilização deste tipo de eletrodo. Outro recurso para a obtenção

de valores de corrente maiores utilizando microeletrodos pode ser utilizado, como por

exemplo, no caso de eletrodos que possuem pelo menos uma das dimensões na faixa

micrométrica (e as outras macrométricas), como é o caso de eletrodos de microbandas

ou microcilindros (Weisshaar, Tallman et al., 1981; Caudill, Howell et al., 1982;

Kittlesen, White et al., 1984; Sleszynski, Osteryoung et al., 1984; White, Kittlesen et

al., 1984; Sanderson e Anderson, 1985; Thormann, Vandenbosch et al., 1985; Bard,

Crayston et al., 1986; Belal e Anderson, 1986; Chidsey, Feldman et al., 1986; Fosdick,

Anderson et al., 1986; Hepel e Osteryoung, 1986). Estes eletrodos apresentam algumas

das vantagens dos eletrodos de tamanho macroscópico, como por exemplo, alta

corrente, mas, além disso, apresentam o comportamento sigmoidal obtido com

microeletrodos. A magnificação dos sinais de corrente pode ser também obtida

utilizando um arranjo de microeletrodos (Thormann, Vandenbosch et al., 1985; Bard,

Crayston et al., 1986; Chidsey, Feldman et al., 1986; Fosdick, Anderson et al., 1986;

Shea e Bard, 1987), ver Figura 1.

Visto que métodos para a fabricação de microeletrodos constituem-se em etapa

aparentemente bem resolvida para alguns grupos de pesquisa, as atenções nessa área

Introdução 9

voltaram-se para o uso dos microeletrodos na exploração de domínios microscópicos,

especialmente sistemas biológicos, células únicas e/ou tecidos intactos.

1.1.2. Microeletrodos voltados para detecção em microambientes

O transporte de íons e moléculas é essencial para a manutenção da homeostease1

em sistemas biológicos. O pequeno tamanho dos microeletrodos permite medir o fluxo

em sítios específicos desde células únicas até tecidos intactos. Uma das primeiras

moléculas estudadas foi o O2. Oxigênio molecular pode ser monitorado por meio de

redução utilizando o eletrodo de Clark (Clark, Wolf et al., 1953). A miniaturização

deste dispositivo permite o monitoramento do fluxo de O2 com alta resolução espacial

(Sosna, Denuault et al., 2007). Essa técnica foi utilizada em suspensões de Escherichia

coli para examinar o efeito de íons Ag+ na respiração das bactérias (Holt e Bard, 2005).

Nesse estudo, os pesquisadores constataram que inicialmente os íons Ag+ aumentam as

taxas de respiração por desacoplarem a cadeia respiratória. Essas medidas foram

realizadas em meio extracelular.

Quando células estão sob estresse oxidativo, o fluxo de vários compostos se

ajusta para minimizar essa condição (Wightman, 2006). Por exemplo, menadiona é

tóxica para hepatócitos (células responsáveis pelas funções biológicas do fígado) uma

vez que, dentro das células, este composto regenera espécies reativas de oxigênio

(Mauzeroll, Bard et al., 2004).

Nas células, menadiona é metabolizada para o conjugado metadiona-S-

glutationa, que é removido da célula pela bomba dependente da adenosina-trifosfatase.

Essa bomba mediadora responsável pela remoção da metadiona-S-glutationa foi 1 Homeostease é a propriedade de um sistema aberto, em especial seres vivos, de regular o seu ambiente interno de modo a manter uma condição estável, mediante múltiplos ajustes de equilíbrio dinâmico controlados por mecanismos de regulação interrelacionados

Introdução 10

detectada em células unitárias e em colônias confluentes de células utilizando

microeletrodos acoplados a SECM (do inglês, “Scanning Electrochemical

Microscopy”). Danos oxidativos causam um aumento da geração de derivados de

superóxido e óxido nítrico, e essas espécies foram individualmente monitoradas em

células únicas com eletrodos de fibra de carbono platinizadas (Arbault, Sojic et al.,

2004). A formação de espécies reativas geradas por fibroblastos normais sob estresse

oxidativo é consideravelmente diferente do medido em fibroblastos cancerígenos. A

geração tardia de grandes quantidades de O2- e H2O2 e menores quantidades de NO• e

ONOO foi observada em comparação com fibroblastos normais.

Microeletrodos podem ser utilizados também para medições em tecidos intactos,

como, por exemplo, para fornecer informações sobre a liberação de drogas. Campos

elétricos aplicados através da pele podem afetar o transporte de drogas por dois

motivos: eles induzem o fluxo eletroosmótico para propelir espécies neutras e

carregadas, e induzem o transporte de massa iontoforético2 para modular o fluxo de

espécies carregadas. SECM foi utilizada para medir essas taxas de transporte na pele de

ratos sem pêlos (Bath, Scott et al., 2000; Bath, White et al., 2000).

SECM também foi utilizada para examinar o fluxo de O2 em diferentes

localizações na cartilagem bovina (Gonsalves, Barker et al., 2000). O microeletrodo foi

colocado a ~1 µm da superfície da amostra de cartilagem e imerso em solução. A

topografia da cartilagem foi examinada pelo monitoramento da oxidação do Ru(CN)64- ,

adicionado propositalmente como indicador à solução. O mapa topográfico da

cartilagem revelou depressões com diâmetros de 15 a 25 µm, atribuídas a condrócitos

(células presentes no tecido cartilaginoso), pois a distribuição era similar à observada

por força atômica e microscopia óptica. Experimentos para avaliar o fluxo de oxigênio 2 A iontoforese é a introdução de radicais químicos nos técidos, através de um campo elétrico ,produzido por uma corrente unidirencional. Durante essa introdução ocorrerá repulsão e atração iônica de acordo com a polaridade de cada eletrodo e assim sua interação com a membrana biológica.

Introdução 11

dessas áreas descritas anteriormente também foram realizados utilizando um

microeletrodo, como descrito anteriormente. As regiões com mais permeabilidade para

oxigênio foram localizadas, justamente, sobre a região celular.

Neurônios e outras células comunicam-se umas com as outras por meio da

secreção de pequenas moléculas. Essas moléculas são secretadas pelo mecanismo de

exocitose, segundo o qual uma célula eucariótica libera substâncias para o fluido

extracelular. Medidas com microeletrodos possibilitaram a evidência química direta do

processo de exocitose. Uma vez que o tamanho das fibras de carbono é similar ao

tamanho de muitas células, elas acabam sendo ferramentas interessantes para examinar

os eventos de secreção de compostos na superfície das células (Travis e Wightman,

1998). Utilizando-se um micromanipulador acoplado a um microscópio, o eletrodo pode

ser colocado em contato direto com a célula estudada para o monitoramento desses

compostos secretados. Adicionalmente, o microeletrodo é polarizado em um potencial

fixo e a corrente é monitorada ao longo do tempo. Com isso, qualquer mensageiro

químico com características eletroativas (dopamina, epinefrina, norepinefrina, 5-

hidrotriptofano e histamina) pode ser detectado a partir desse arranjo experimental.

Peptídeos contendo triptofano ou resíduos de tirosina são eletroativos, assim como o

óxido nítrico. Alternativamente, a modificação deliberada da superfície eletródica com

filmes de óxido de rutênio foi utilizada para a detecção amperométrica desses peptídeos

(Kennedy, Lan et al., 1996). Devido à detecção das moléculas secretadas ser realizada

em um espaço microscópico entre o eletrodo e a célula, todo material secretado é

oxidado, possibilitando uma análise quantitativa do número de moléculas secretadas por

vesícula (Wightman, Jankowski et al., 1991). Um método alternativo para promover a

identificação das espécies citadas anteriormente foi proposto utilizando voltametria

cíclica (Troyer e Wightman, 2002).

Introdução 12

Wightman e colaboradores (Cahill e Wightman, 1995) utilizam fibras de

carbono eletroquimicamente tratadas (utilizando um procedimento eletroquímico3

descrito por Gonon e colaboradores (Gonon, Fombarlet et al., 1981)) e não tratadas

próximas à membrana celular para estudar a secreção de ascorbato e catecolaminas em

células bovinas. O eletrodo modificado foi utilizado para a detecção de ascorbato a

+0,05 V vs ECS e o eletrodo não modificado para a detecção simultânea das

catecolaminas e do ascorbato a +0,65 V vs ECS.

Medidas invasivas, que visam acessar o interior das células, muitas vezes

utilizam-se da técnica de “patch-clamp” (Mosharov, Gong et al., 2003). “Patch-clamp”

é uma técnica eletrofisiológica utilizada para estudar canais iônicos em células. Essa

técnica consiste na inserção de uma pipeta de vidro no interior do ambiente celular e

aspiração do conteúdo intracelular para dentro da pipeta, permitindo estudos sobre o

transporte de íons pelos canais. Mosharov e colaboradores (Mosharov, Gong et al.,

2003) acoplaram dentro da pipeta, utilizada nas medidas de “patch-clamp”, um

microeletrodo para estudar os níveis citoplasmáticos dos mensageiros celulares.

Medidas intracelulares em célula neuronal de lesma do mar (Meulemans,

Poulain et al., 1986) (Aplysia californica), da ordem de 150 – 300 µm, foram realizadas

com eletrodos de fibra de carbono (0,5 – 2 µm). Esse microeletrodo foi utilizado para

monitorar a penetração de metronidazol (antibiótico), antipirina e ácido ascórbico em

função do tempo através da membrana celular. Microeletrodos de platina (Meulemans,

Poulain et al., 1987) também foram utilizados em células neuronais de lesma do mar

para estudar a penetração de serotonina pela membrana citoplasmática. Microeletrodos

de carbono (Chien, Wallingford et al., 1990), na forma de anel, construídos pela pirólise

3 Utilizou-se uma onda triangular (70 Hz) de 0 - 3 V, que foi aplicada por 7 s, seguida de polarização a +1,5 V por 7 s. Por final polarizou-se o sistema a 0 V por 30 minutos. Todo esse tratamento foi realizado em tampão fosfato

Introdução 13

do metano dentro de capilares de sílica, foram utilizados para avaliar o conteúdo

citoplasmático de células gigantes da espécie Planorbis corneus (Caracol).

1.2. Ácidos nucleicos

A partir da descoberta da eletroatividade dos ácidos nucléicos em 1960 (Palecek,

1960), surgiu o interesse da comunidade científica em aplicar técnicas eletroanalíticas

para o monitoramento desses compostos (Wang, Bollo et al., 1999). O campo de

pesquisa relativo à análise de ácidos nucléicos abre novas possibilidades para pesquisas

em eletroquímica, como por exemplo, a detecção de danos no DNA causados pela

interação com agentes químicos e físicos existentes no ambiente.

Em sua constituição o DNA apresenta subunidades que são os

desorribonucleotídeos. Um nucleotídeo consiste em uma base nitrogenada, uma ose e

um ou mais grupamentos fosfato. A ose em um desoxirribonucleotídeo é a

desoxirribose. As bases nitrogenadas podem ser divididas em derivados de purina e

pirimidina (Stryer, 1996). As purinas no DNA são a adenina (A) e a guanina (G), e as

pirimidinas são: a timina (T) e a citosina (C), Figura 2.

Introdução 14

N

N

NH

N

NH2

Adenina

N

NH

NH

N

NH2

O

Guanina

N

NH

NH2

O

Citosina

NH

NH

O

O

CH3

Timina

Figura 2 – Estrutura das bases nitrogenadas do DNA.

Um nucleosídeo (Figura 3A) consiste em uma purina ou pirimidina ligada a uma

ose. As quatro unidades nucleosídicas no DNA são chamadas desoxiadenosina (dA),

desoxiguanosina (dG), desoxitimidina (dT) e desoxicitidina (dC). A fosforilação dos

nucleosídeos leva à formação dos nucleotídeos (Figura 3B) e a ligação das

desoxirriboses pelos grupos fosfatos leva à formação do DNA (Stryer, 1996).

NOOH

OH

N

NHN

NH2

O

(A)

NOO

OH

OHOH

OP N

NHN

NH2

O

(B)

Figura 3 – Representação das estruturas moleculares de um nucleosídeo (A) e nucleotídeo (B).

Introdução 15

Na literatura são reportados estudos sobre o comportamento eletroquímico dos

monômeros que constituem os ácidos nucléicos em diferentes superfícies eletródicas

como grafite (Elving e Smith, 1960; Smith e Elving, 1962), ouro (Pang, Qi et al., 1995),

fibra de carbono (Brett, Brett et al., 1994), nanotubos de carbono (Wang, Kawde et al.,

2003; Wu, Fei et al., 2003), diamante dopado com boro (Prado, Flechsig et al., 2002),

grafite pirolítico (Wang, Palecek et al., 1996), pasta de carbono (Wang, Cai et al., 1995;

Wang, Chicharro et al., 1996; Wang, Rivas et al., 1996; Wang, Cai et al., 1997; Wang,

Fernandes et al., 1998) e óxido de irídio (Armistead e Thorp, 2001). Esses estudos

mostram que somente as bases nitrogenadas purínicas podem ser oxidadas sobre a

superfície do eletrodo de grafite. Estudos posteriores realizados por Dryhurst (Dryhurst,

1971; 1972) investigando a eletroatividade desses compostos ligados à ose

(desoxirribose) mostraram que seus nucleosídeos (dA e dG) são oxidados em potenciais

mais positivos do que as bases livres, demonstrando assim que a ligação da ose com a

base acarreta em um aumento de estabilidade do composto. Já o DNA desnaturado

apresenta dois picos de oxidação bem definidos e relacionados com a oxidação da

guanina e adenina, respectivamente, mais especificamente, a dG e dA (De-Los-Santos-

Alvarez, Lobo-Castanon et al., 2004). Dessa forma, se resíduos de guanina e adenina de

um ácido nucléico estiverem presentes em um mistura com DNA pode-se distinguir em

um experimento voltamétrico entre as bases livres e as ligadas ao DNA. O DNA nativo

(dupla hélice, dh-DNA) apresenta picos de oxidação menores do que o DNA

desnaturado (fita simples, fs-DNA) (Brabec e Dryhurst, 1978). Uma vez que as bases

nitrogenadas do DNA estão escondidas dentro da dupla hélice, a aproximação das

mesmas da superfície do eletrodo é dificultada. Além disso, na literatura vêm sendo

reportados resultados que indicam estreita relação entre a melhora do sinal analítico

com a adsorção e aumento da rugosidade da superfície eletródica (Brett, Brett et al.,

Introdução 16

1994; Cai, Rivas et al., 1996; Pang, Zhang et al., 1996; De-Los-Santos-Alvarez, Lobo-

Castanon et al., 2004).

Ácidos nucléicos são fortemente adsorvidos em eletrodos de grafite pirolítico e

pasta de carbono e, mais fracamente, em carbono vítreo (Pang, Zhang et al., 1996) e

grafite pirolítico com alta orientação (Brown, Allison et al., 1991; Cai, Rivas et al.,

1996) (do inglês, “highly oriented pyrolytic graphite” (HOPGE)). A eficiência de

adsorção pode ser aumentada evaporando-se sobre a superfície do eletrodo uma solução

contendo os ácidos nucléicos (Pang, Zhang et al., 1996) ou aplicando-se um potencial

positivo à superfície do eletrodo durante o processo de adsorção para ocorrer uma

atração eletrostática do DNA com a superfície do eletrodo (Brown, Allison et al., 1991;

Brett, Brett et al., 1994). Pré-tratamentos oxidativos da superfície eletródica aumentam

o caráter hidrofílico da mesma e, também, facilitam o processo de adsorção (Brown,

Allison et al., 1991; Brett, Brett et al., 1994; Pang, Zhang et al., 1996; Wang, Ju et al.,

2001).

Até o presente momento os sensores de DNA estão sendo desenvolvidos com o

intuito de se obter sensores para detecção do estado de hibridização do DNA e para a

detecção de danos no DNA (Palecek, 2002). Sendo essa tese voltada para a detecção de

lesões no DNA, os métodos de detecção do estado de hibridização não serão aqui

abordados.

1.2.1. Danos no DNA

Danos no DNA participam de rotas críticas na mutagenese, carcinogenese e no

envelhecimento (Marnett, 2000). Os eventos químicos que resultam em danos no DNA

são: hidrólise, oxidação e ataque eletrofílico. Essas reações ocorrem devido à exposição

Introdução 17

do DNA a agentes químicos e físicos do ambiente, como por exemplo, espécies

presentes em alimentos, ou podem ser causadas por processos metabólicos endógenos

(Marnett, 2000). A Figura 4 representa alguns dos possíveis danos no DNA.

Introdução 18

Figura 4 – Representação esquemática de alguns processos de danos no DNA. O painel a mostra a estrutura da 2’-desoxiguanosina no DNA.

Introdução 19

Dois diferentes métodos para detecção de danos no DNA vêm sendo reportados

na literatura (Palecek e Fojta, 2001; Fojta, 2002). Um deles está baseado na hidrólise do

DNA, e posterior separação cromatográfica por HPLC (Dizdaroglu, Jaruga et al., 2002)

(do inglês, “high-pressure liquid cromatography”), cromatografia gasosa (Dizdaroglu,

Jaruga et al., 2002) (GC, do inglês, “gas cromatography”), ou eletroforese capilar (Le,

Xing et al., 1998). A lesão é detectada “on-line” por diferentes métodos, como

espectrometria de massa (Dizdaroglu, Jaruga et al., 2002; Loureiro, Marques et al.,

2002), eletroquímico (Tarun e Rusling, 2005), fluorescência (Rogers, Apostol et al.,

2001) e radioativo (Phillips, Farmer et al., 2000).

O outro método preserva o DNA intacto, e o dano é investigado por técnicas de

imunoensaio, sedimentação, eletroforese em gel, ressonância plasmônica (Ciolkowski,

Fang et al., 2000), microbalança de cristal de quartzo (Wang, Jiang et al., 1999; Pope,

Allen et al., 2001) ou eletroquímicas. De modo geral, esses procedimentos estão

baseados na imobilização do DNA intacto na superfície do eletrodo (Mugweru e

Rusling, 2002). A reação do composto carcinogênico com o DNA imobilizado pode

romper a estrutura da dupla hélice, deixando os sítios de guanina mais acessíveis para a

oxidação. Dessa forma, um aumento do sinal de corrente causado pela oxidação dos

sítios de guanina é observado em comparação com a resposta antes da exposição do

eletrodo modificado ao agente carcinogênico. Em geral, esse tipo de dispositivo é

utilizado para avaliar agentes carcinogênicos ao DNA.

A voltametria de adsorção sobre eletrodos de mercúrio é uma das técnicas

utilizadas para a detecção de danos no DNA oriundos de ácidos fortes (Jelen, Fojta et

al., 1997), agentes metilantes (Jelen, Tomschik et al., 1997) e radicais hidroxil (Fojta e

Palecek, 1997; Fojta, Stankova et al., 1998). Danos no DNA solubilizado causados por

radiação ionizante também foram detectados utilizando eletrodo de mercúrio e

Introdução 20

voltametria de adsorção (Sequaris, Valenta et al., 1982; Sequaris e Valenta, 1987) e

cronoamperometria com DNA adsorvido sobre a superfície de carbono (Wang, Cai et

al., 1997). Ionômeros “Eastman” e Nafion® foram utilizados na fabricação de filmes de

dh-DNA sobre a superfície de grafite para detecção direta de danos no DNA (Mbindyo,

Zhou et al., 2000; Rusling, Zhou et al., 2000). Picos de oxidação apareceram após

exposição do filme incubado com óxido de estireno, que forma um aduto covalente com

a guanina e adenina. Contudo, a oxidação direta de DNA sobre a superfície eletródica

apresenta sinais analíticos não muito pronunciados para o processo de oxidação do dh-

DNA, como relatado anteriormente. Dessa forma, métodos envolvendo a modificação

deliberada da superfície eletródica podem aumentar a sensibilidade para guanina (ou

compostos derivados na mesma).

A oxidação eletrocatalítica utilizando metal de transição propício aumenta

significativamente o sinal analítico para a detecção do processo de oxidação do DNA

(Thorp, 1998). Thorp e colaboradores (Thorp, 1998) mostraram que um dos processos

mais efetivos para o processo de oxidação do DNA é a catálise utilizando Ru(bpy)32+, o

qual oxida, especificamente, sítios de guanina presentes no DNA, segundo o mecanismo

abaixo:

Ru(bpy)32+ Ru(bpy)3

3+ + e- (4)

Ru(bpy)33+ + DNA(guanina) → Ru(bpy)3

2+ + DNA(guaninaox) (5)

Ciclicamente Ru(bpy)33+ volta a Ru(bpy)3

2+ por uma etapa rápida (eq. 5),

propiciando uma corrente catalítica que resulta em um grande aumento de sinal quando

comparado àquele referente ao DNA na superfície do eletrodo limpo.

Mais recentemente, métodos baseados na oxidação eletrocatalítica da guanina

têm recebido muita atenção para a detecção de danos no DNA. Zhou e Rusling (Zhou e

Rusling, 2001) demonstraram as propriedades eletrocatalíticas do Ru(bpy)32+ na

Introdução 21

mediação do processo de oxidação da guanina sobre a superfície de grafite pirolítico

como um indicador de dano causado por óxido de estireno. Para isso, os autores

utilizaram um sensor construído alternando camadas de PDDA (do inglês,

“poly(diallydimethylammonium chloride)”) e dh-DNA. Utilizando esse procedimento,

foi possível detectar 0,1 % de dano nas bases do DNA. Napier and Thorp (Napier e

Thorp, 1997) modificaram a superfície de um ITO (do inglês, “indium tin oxide”) com

uma monocamada de ácido 1,12-dodecanodicarboxilíco, na qual o DNA é ligado via

carbodiimida. Na presença de Ru(bpy)32+ em solução pode-se então monitorar os danos

no DNA que foi exposto ao agente mutagênico. Pacey e colaboradores (Pacey, Puckett

et al., 2005) utilizaram um sensor construído eletrostaticamente camada por camada

utilizando Ru(II) terpiridina (carga positiva) e dh-DNA (carga negativa) para o

monitoramento de danos no DNA utilizando óxido de estireno. Wang e colaboradores

(Wang, Jiang et al., 2001) combiraram oxidação eletroquímica e análise em fluxo no

desenvolvimento de uma metodologia para análises rápidas de avaliação de danos no

DNA. O eletrodo utilizado foi carbono vítreo modificado com polipirrol.

Para análise de guanina em solução, El Maali e Wang (El-Maali e Wang, 2001)

utilizaram um filme insolúvel de um complexo de Ru(II)-tris(2,2’-bipiridina)dicloro. Os

autores obtiveram uma melhora significativa do sinal analítico para o processo de

oxidação dessa base purínica em relação ao sinal do eletrodo limpo na presença de

guanina.

Compostos carcinogênicos, como por exemplo, acetaldeído, podem reagir com o

grupamento amina exocíclico da dG (dG, Figura 4) no DNA formando uma base de

Schiff (Wang, Mcintee et al., 2000) ou ainda outros tipos de adutos como N2-

etildesoxiguanosina e 1,N2-propanodesoxiguanosina (Fang e Vaca, 1997; Matsuda,

Terashima et al., 1999; Hecht, Mcintee et al., 2001; Terashima, Matsuda et al., 2001)

Introdução 22

(Esquema 1). Como conseqüência dessa reação química, ocorre um decréscimo no

número de sítios de guanina na estrutura do DNA. Dessa forma, é possível estudar

danos na estrutura do DNA monitorando a quantidade de sítios de guanina, antes e após

a exposição do DNA a esses agentes carcinogênicos. Até o momento, a quantificação de

base, ou nucleosídeo, é realizada após procedimento de hidrólise seguido por um

método cromatográfico para a separação dos componentes do DNA.

NOOH

OH

N

NHN

NH2

O

CH3NOOH

OH

N

NHN

N

O

CH3

OH

NOOH

OH

N

NN

NH

OO

CH3 H

O

CH3 H

CH3NOOH

OH

N

NHN

NH

O

NaBH4

1,N2 - etildesoxiguanosina

1,N2 - propanodesoxiguanosina

Esquema 1.

1.3. Esclerose Lateral Amiotrófica (ALS)

A degeneração motora chamada Esclerose Lateral Amiotrófica (ALS, do inglês,

“Amyotrophic lateral sclerosis”) é uma doença caracterizada pela degeneração

progressiva dos neurônios motores acarretando atrofia, paralisia e morte. A doença se

inicia pela paralisia de um membro de um lado específico e a morte acaba ocorrendo

por insuficiência respiratória, quando os neurônios responsáveis pelo movimento do

diafragma são atingidos. Uma vez que o início da doença ou os primeiros sintomas são

observados de maneira tardia (entre 50 e 60 anos), o paciente tem de 4 a 10 anos de vida

Introdução 23

após o diagnóstico. A doença atinge mais homens do que mulheres (na proporção de

3:2). Cinco mil novos casos de ALS são diagnosticados por ano nos EUA, e o total

mundial atinge 2,4 casos/100.000 habitantes por ano (Boillee, Vande Velde et al.,

2006). Não há ainda um tratamento efetivo para ALS. Hoje, existe somente um

medicamento aprovado (Riluzol), o qual aumenta a sobrevida do paciente, e diversos

tratamentos paliativos (Carri, Ferri et al., 2003). O uso de células tronco para

regeneração dos neurônios motores também vem sendo estudado na literatura (Silani,

Cova et al., 2004; Boillee, Vande Velde et al., 2006).

Diversos trabalhos na literatura têm demonstrado que a degeneração dos

neurônios motores proveniente da ALS é resultado de mecanismos complexos

envolvendo estresse oxidativo, excitotoxicidade por glutamato, formação de agregados

protéicos (Okado-Matsumoto e Fridovich, 2002), processos neuro-inflamatórios (Carri,

Ferri et al., 2003), disfunções mitocondriais e defeitos no transporte axonal (Boillee,

Vande Velde et al., 2006). Entretanto, ainda é difícil definir o que é causa, conseqüência

ou associação.

O glutamato é o principal neurotransmissor excitatório do sistema nervoso

central. Ele é liberado na fenda sináptica provocando um estímulo no neurônio pós-

sináptico, o qual é cessado pela remoção do glutamato por receptores específicos

(Watkins e Evans, 1981). Um acúmulo anormal de glutamato no fluído cerebro-espinhal

é observado em pacientes, devido à insuficiência na recaptação do glutamato (Rothstein,

Tsai et al., 1990). Esse acúmulo promove estresse oxidativo e ativação das enzimas

líticas que levam à morte celular (Lipton e Rosenberg, 1994). A insuficiência na

recaptação do glutamato ocorre devido a defeitos nas suas proteínas receptoras

(Rothstein, Martin et al., 1992). Estes defeitos podem ter sua origem em fatores

genéticos ou podem ser causados por lesões nas proteínas.

Introdução 24

A participação do estresse oxidativo nos estudos de ALS é evidenciada pela

presença de danos oxidativos em DNA, proteínas e lipídios nos tecidos de pacientes e

animais modelo da doença (Warita, Hayashi et al., 2001). Níveis aumentados de 8-oxo-

7,8-dihidro-2’-desoxiguanosina foram detectados na coluna espinhal de pacientes e no

fluído cérebro-espinhal, assim como 3-nitrotirosina, 4-hidroxinonenal, malondialdeído e

radicais ascorbato (Ferrante, Browne et al., 1997; Bogdanov, Brown et al., 2000; Lee,

Hyun et al., 2001; Warita, Hayashi et al., 2001; Ischiropoulos e Beckman, 2003;

Aguirre, Beal et al., 2005; Ihara, Nobukuni et al., 2005; Barber, Mead et al., 2006;

Mahoney, Kaczor et al., 2006; Tokuda, Ono et al., 2007).

Danos oxidativos em proteínas podem ser a causa e conseqüência do efeito

tóxico às células do glutamato, e podem causar lesões na mitocôndria que também

levam à morte celular por apoptose (morte celular programada) ou necrose (Beretta,

Sala et al., 2003).

Muitos antioxidantes, como a vitamina E, N-acetil cisteína, seleginina e catalase,

trouxeram benefícios aos modelos animais, mas infelizmente não houve sucesso nas

triagens em humanos (Goodall e Morrison, 2006). Outras espécies antioxidantes

(coenzima-Q e porfirinas de manganês (AEOL 10150)), que tiveram sucesso em

modelos animais, estão sendo testadas atualmente em humanos (Barber, Mead et al.,

2006). A ineficiência dos antioxidantes na melhora do quadro clínico de pacientes com

ALS não exclui a participação de espécies reativas de oxigênio (EROs) na patologia.

Estudos sobre a eficiência dos antioxidantes em atravessar a barreira hemato-encefálica

e atingir os neurônios devem ser feitos. Além disso, os resultados positivos com

antioxidantes são visíveis nos modelos animais. Entretanto esse tratamento é iniciado

em estágios iniciais da doença. Em humanos, isto não é possível devido à falta de

biomarcadores específicos para um estágio precoce da doença. O diagnóstico é feito de

Introdução 25

maneira tardia, quando a deficiência motora já é um dos sintomas (nesse estágio, 50 %

de seus neurônios motores do paciente já foram perdidos).

Dentre os casos familiares de ALS, os quais representam 10 % dos casos totais,

defeitos genéticos associados ao gene Sod 1 têm recebido maior atenção. Mutações

pontuais neste gene, o qual codifica a forma citosólica da enzima Cu,Zn-superóxido

dismutase (SOD), estão presentes em cerca de 20 % dos casos de familiares de ALS

(Carri, Ferri et al., 2003). Ainda não se sabe por que a forma mutante desta proteína

abundante e expressa em todos os tecidos é particularmente tóxica para os neurônios

motores, causando ALS. Estudos extensivos forneceram fortes evidências de que um

“ganho de função tóxica”, ao invés da perda da função enzimática normal da enzima, é

a causa da doença. Primeiramente, trata-se de um fenótipo dominante em humanos. A

maioria das formas mutantes apresenta atividade superóxido dismutásica normal.

Animais transgênicos sem o gene Sod 1, também não desenvolvem ALS, enquanto que

animais super expressando formas mutantes de SOD desenvolvem fenótipo muito

similar ao da doença (Goodall e Morrison, 2006). A mutação G93A é a mais estudada,

pois foi utilizada com sucesso na criação de camundongos transgênicos modelo de ALS

em 1994 (Gurney, Pu et al., 1994).

1.4. Ácido Ascórbico

Ácido ascórbico, um dos componentes da vitamina C, é conhecido pelas suas

propriedades redutoras, sendo consumido em ampla escala como agente antioxidante

em comida, bebidas e fármacos. O consumo de ácido ascórbico se faz necessário uma

vez que o fígado dos primatas não possui a enzima gulonolactona oxidase, a qual gera

ácido ascórbico a partir de ácido gulônico em outros animais (King, 1973). Os primatas

Introdução 26

possuem um sistema especial de captação de vitamina C no intestino, que será discutido

na seção 1.4.1.

Sabe-se que o ácido ascórbico também diminui a lesão oxidativa do DNA em

linfócitos de fumantes (Fraga, Motchnik et al., 1991), demonstrando assim a

importância do ácido ascórbico como agente antioxidante. Anormalidades envolvendo

os níveis de ácido ascórbico em fluidos biológicos são reportadas em pacientes

esquizofrênicos (Wilson e Guillan, 1969). Por essas razões, a determinação do ácido

ascórbico em fluidos biológicos para o diagnóstico em análises clínicas e bioquímicas é

de suma importância. Além disso, o monitoramento intracelular de ácido ascórbico

(utilizando como estímulo o aumento extracelular de ácido ascórbico), somado à

detecção de danos no DNA, pode elucidar como o ácido ascórbico age no processo de

inibição ou lesão do DNA.

Diferentes procedimentos e técnicas são reportados na literatura para a

determinação de ácido ascórbico, como por exemplo: cromatografia (Esteve, Farre et

al., 1995), eletroquímica (Strochkova, Turyan et al., 1997), espectrofotometria (Park,

Adams et al., 1972; Keedy e Vadgama, 1991) e titulação (Kumtatt e Leong, 1964).

Entretanto, os métodos eletroanalíticos apresentam vantagens frente aos

espectrofotométricos para determinações em amostras mais complexas devido à maior

seletividade e possibilidade de se trabalhar com amostras coloridas. Com relação aos

métodos cromatográficos, que já apresentam uma seletividade natural, as vantagens da

detecção eletroquímicas são o baixo custo, a simplicidade e o tempo de análise.

Na literatura (Strochkova, Turyan et al., 1997), métodos eletroanalíticos são

utilizados para detecção de ácido ascórbico em amostras complexas, como por exemplo,

urina. Nesse trabalho, os autores reportam a utilização de eletrodo rotativo para

detecção simultânea de ácido úrico e ácido ascórbico em urina. A análise de ácido úrico

Introdução 27

é feita em condições de diluição da amostra maiores que a de ácido ascórbico para

evitar a interferência do ácido ascórbico no processo de quantificação do ácido úrico.

Nessas condições, os autores obtiveram um limite de detecção para ácido ascórbico de 3

μmol L-1.

Muitas amostras apresentam uma composição complexa, o que pode resultar em

uma grande quantidade de substâncias interferentes. Devido a essas possíveis

interferências de matriz, a determinação de ácido ascórbico em condições de potencial

menos drásticas consiste em alternativa vantajosa. Para isso, muitos autores se utilizam

da modificação deliberada da superfície dos eletrodos (Kulys e Dcosta, 1991; Doherty,

Stanley et al., 1995; Li, Hu et al., 1996; Pournaghi-Azar e Razmi-Nerbin, 1998;

Shankaran e Narayanan, 1999; Cai, Xue et al., 2000; Florou, Prodromidis et al., 2000;

Turkusic, Milicevic et al., 2000; Karyakin, 2001; Bradshaw, Prenzler et al., 2002;

Malinauskas, Garjonyte et al., 2004; Roy, Saha et al., 2004; Pauliukaite, Ghica et al.,

2005; Fang, Jiao et al., 2006; Lin e Li, 2006) para diminuir a energia requerida para o

processo de oxidação do ácido ascórbico. Brett e colaboradores (Pauliukaite, Ghica et

al., 2005) utilizaram um filme de cobre hexacianoferrato para a detecção de ácido

ascórbico em diferentes matrizes (vinhos, chás e sucos). Foi observado um máximo de

corrente para o processo de oxidação do ácido ascórbico por volta de +0,4 V vs ECS.

Entretanto, tentando conferir maior seletividade ao sensor os autores sugeriram a

possibilidade de detecção do ácido ascórbico em um potencial de +0,05 V vs ECS, o

que torna a metodologia menos susceptível a possíveis interferências da matriz. Nessas

condições, os autores obtiveram um limite de detecção da ordem de 2,1 μmol L-1.

Outros trabalhos relacionados à determinação de ácido ascórbico em diferentes matrizes

estão mostrados na Tabela 2, assim como as condições de trabalho.

Introdução 28

Tabela 2 – Trabalhos reportados na literatura para determinação de ácido

ascórbico.

Trabalho Eletrodo Amostra Limite de detecção

/ μmol L-1

Potencial de Trabalho

(Pournaghi-Azar e Razmi-Nerbin, 1998)

Al/Níquel hexacianoferrato - - 0,44 V vs ECS

(Cai, Xue et

al., 2000)

GC/ Cobalto Hexacianoferrato

- - 0,6 V vs ECS

(Bradshaw,

Prenzler et al., 2002)

Hg Vinho 3,1 0,2 vs Ag/AgCl (3 M)

(Doherty, Stanley

et al., 1995)

GC/[Osmio(2,2-bipridil)2-(poli-4-

vinilpiridina)10Cl]Cl

- - 0,25 V vs ECS

(Roy, Saha et

al., 2004)

GC/N,N-dimetilanilina Suco - 0,35 V vs Ag/AgCl(sat.)

(Li, Hu et al., 1996)

Cobalto(II) Ftalocianina dopada com iodo

- - Potenciométrico

(Turkusic,

Milicevic et al., 2000)

Tinta de Carbono / MnO2 Fármacos 1,1 0,6 V vs Ag/AgCl(sat)

(Shankaran e

Narayanan, 1999)

GC/Cobre hexacianoferrato Fármacos - 0,2 V vs ECS

(Pauliukaite,

Ghica et al., 2005)

GC/Cobre hexacianoferrato Vinho, Chá e Sucos

2,1 0,05 V vs ECS

(Kulys e Dcosta, 1991)

Eletrodo impresso de grafite modificado com

tetracianoquinodimetano

Suco 23 0,05 V vs Ag/AgCl(sat.)

(Fang, Jiao et

al., 2006)

Monocamada de ferroceno tioglicolato sobre ouro

Urina 0,1 0,2 V vs ECS

Introdução 29

(Lin e Li, 2006)

Monocamada de 5-hidroxitriptofano sobre

carbono vítreo

Urina 4,2 0,17 V ECS

(Strochkova,

Turyan et al., 1997)

Eletrodo Rotativo de GC Urine 3,0 1,81 vs Ag/AgCl(sat.)

(Chen e Zu,

2007)

Pt / flúor-surfactante Urina 1,0 0,2 V vs ECS

(Zare, Nasiriza

deh et al., 2005)

Pasta de carbono modicada com tetrabromo-p-

benzoquinona

- 0,62 0,06 V vs ECS

(Salimi, Mamkhezri et al.,

2006)

Eletrodo de sol-gel carbono/cerâmica

Urina e Sangue

1,7 0,1 V vs ECS

(Khoo e Chen, 2002)

GC/azul de metileno Urina 0,005 0,24 V vs Ag/AgCl(sat.)

(Lin e Jin,

2005)

GC/monocamada de propionilcolina

Urina - 0,02 V vs ECS

(Matos, Augelli et al., 2000)

Arranjo de microeletrodos de ouro

Urina - 0,75 V vs Ag/AgCl(sat.)

1.4.1. Ácido Ascórbico em neurônios

O ascorbato (em pH fisiológico, o ânion monovalente ascorbato prevalece sobre

a forma protonada, ácido ascórbico.) pode atravessar membranas por difusão na forma

de um complexo de sódio. Este mecanismo contribui para boa parte da absorção no

intestino. A forma oxidada do ascorbato, o desidroascorbato é mais lipofílico do que o

ascorbato, permeando membranas com mais facilidade. O desidroascorbato pode ser

absorvido do lúmen intestinal e do sangue, e ser reduzido dentro das células. Ascorbato

e desidroascorbato também são captados por sistemas de transporte ativo. Na maioria

dos tecidos, a afinidade dos transportadores pelo desidroascorbato é maior do que pelo

Introdução 30

ascorbato. O desidroascorbato também é conduzido pelo transportador de glicose

GLUT-1 (Goldenberg e Schweinzer, 1994).

A diferenciação de células tem alguma influência no transporte de ascorbato

devido a mudanças nas atividades metabólicas e na disponibilidade de oxigênio.

Neutrófilos utilizam muito ascorbato para se proteger de conseqüências indesejáveis do

“burst” respiratório, e sua capacidade de acumular ascorbato aumenta muito durante a

ativação (Washko, Wang et al., 1993).

O ácido ascórbico é altamente concentrado em neurônios, o que indica um papel

desta vitamina na função neuronal e proteção antioxidante. Existe um gradiente de

concentração de ascorbato do sangue para os neurônios: 30-60 μM no sangue, 200-400

μM no fluído cerebroespinhal, ~1 mM no cérebro, até 10 mM em neurônios. O

ascorbato desempenha ainda outras diversas funções nos neurônios, como doador de

elétrons para a síntese de norepinefrina, neuromodulador do transporte de glutamato e

dopamina e proteção contra estresse oxidativo (May, Li et al., 2006). O ascorbato pode

ser oxidado por 1 ou 2 elétrons, e neutralizar EROs, incluindo radicais peroxil, hidroxil

e superóxido, oxigênio singlete e peroxinitritro (Halliwell, 1999).

Objetivo 31

2. Objetivo

Os objetivos deste trabalho são:

1) Desenvolver métodos de fabricação de eletrodos micrométricos e

submicrométricos de diferentes materiais;

2) Desenvolver metodologia para detecção de dG, visando o monitoramento de

de danos ao DNA;

3) Desenvolver metodologia para quantificação de ácido ascórbico em fluidos

biológicos;

4) Utilização dos microeletrodos desenvolvidos para monitoramento de ácido

ascórbico em microambientes (cultura de células e células únicas).

Parte Experimental 32

3. Parte Experimental

3.1. Reagentes

Todos os reagentes foram utilizados sem prévia purificação. As soluções de

trabalho foram preparadas pela dissolução dos reagentes sólidos ou diluição de soluções

concentradas com água desionizada, com exceção da guanina, obtida em sistema de

purificação Nanopure Infinity (Barnstead). Soluções de CaCl2, ácido ascórbico, etanol,

isopropanol, glicose, ácido úrico, NaNO2, KI e KIO3, KH2PO4, HCl, NaOH, Fenol,

RuCl3, CoCl2, NaNO3, K4[Fe(CN)]6, K3[Fe(CN)]6, guanina, desoxiguanosina e

desoxiguanosina monofosfato foram preparadas pela dissolução dos respectivos sais em

água desionizada e as soluções de ácidos inorgânicos foram preparadas pela diluição

dos respectivos ácidos concentrados. Todos os reagentes utilizados foram de

procedência Merck (Darmstadt, Alemanha) com exceção da guanina, dG e dGMP, que

foram adquiridos da Sigma (Sigma-Aldrich Chemie GmbH, Steinheim, Alemanha). Nos

experimentos com DNA nativo utilizou-se DNA de timo de bezerro (Sigma-Aldrich

Chemie GmbH, Steinheim, Alemanha).

As soluções de guanina foram preparadas diariamente e dissolvidas em solução

de NaOH 0,1 mol L-1.

Solução padrão de índio(III) foi preparada por pesagem direta do índio metálico

fundido, 99.9%, p.a. fabricado na Alemanha, Dr. Theodor Schuchard & Co. Munchen e

dissolvido facilmente em ácido clorídrico. A solução estoque resultante apresentou CIn3+

= 0,02282 mol L-1 e CH+ = 0,67 mol L-1 (medida realizada utilizando eletrodo de vidro e

pHmetro marca Metrohm, modelo 713).

As soluções de eteno aduto foram preparadas reagindo dG com cloroacetaldeído,

como descrito por Sattsangi e colaboradores (Sattsangi, Leonard et al., 1977), com


algumas modificações. Foram adicionados 300 μL de uma solução de cloroacetaldeido

2 mol L-1 a uma solução contendo 0,04 mmol em 10 mL de tampão fosfato 0,1 mol L-1

(pH = 7,2). Essa mistura foi deixada sobre agitação por 4 dias a 37ºC, e o aduto

resultante foi purificado por HPLC.

3.2. Instrumentação

Foram utilizados um potenciostato portátil (Palmsens BV, Houten) e um

bipotenciostato da Autolab modelo PGSTAT30 (Eco Chimie), conectados a um palmtop

(HP modelo iPAQ) e a microcomputadores, respectivamente. Os experimentos foram

realizados, na grande maioria das vezes, em célula eletroquímica convencional e

sistema de 3 eletrodos. O eletrodo auxiliar utilizado foi um fio de platina e, como

referência, foi utilizado um eletrodo de Ag/AgCl saturado. Como eletrodos de trabalho

utilizaram-se microeletrodos e eletrodos de tamanho convencional, de diferentes

materiais (ouro, platina e carbono vítreo).

Estudos com eletrodo rotativo de carbono vítreo (r = 0,5613 cm) foram

realizados utilizando um sistema rotativo (AFMSRX, Pine Instrument Company)

conectado ao bipotenciostato da Autolab.

Para as centrifugações foram utilizadas as centrífugas refrigeradas, modelos

Centrifuge 5403 da Eppendorf (Hamburg, Alemanha) e Himac CR21E da Hitachi, além

da centrífuga não refrigerada Centrifuge 5415C, também da Eppendorf. As medidas de

absorbância foram feitas em espectrofotômetro modelo 2800 da Ciba-Corning (Sigma)

e os espectros de absorbância foram adquiridos em um espectrofotômetro Hitachi

U3000 (Tokyo, Japão).


As incubações em banho-maria foram feitas em banho modelo 144 da Fanen

(São Paulo, Brasil). As soluções foram autoclavadas em autoclave vertical modelo 415

da Fanem (São Paulo, Brasil). As células foram incubadas em uma estufa de CO2

Napco® modelo 5100 da Precision Scientific (Chicago, EUA) e manipuladas em fluxo

laminar com módulo para esterilização de ar equipado com luz UV da EACI/ENVIRCO

Environmental Air Control (Albuquerque, EUA).

3.3. Processo de fabricação dos microeletrodos

Duas diferentes técnicas foram utilizadas para a microfabricação dos eletrodos

micrométricos: desgaste eletroquímico e técnica litográfica.

3.3.1. Desgaste eletroquímico

O processo de afinamento das fibras de platina (Alfa Aesar) de diâmetro igual a

100 μm foi efetuado por desgaste eletroquímico utilizando um sistema bifásico que

consiste em solução saturada de CaCl2/acetona (1:1 em volume) (3 mL) – CCl4 (3 mL).

Acetona foi utilizada para controlar o tamanho das bolhas, uma vez que solventes

orgânicos solúveis em água provocam uma diminuição do tamanho das bolhas. Desta

maneira pode-se evitar um desgaste irregular da superfície da fibra pela adsorção de

bolhas na sua superfície (Libioulle, Houbion et al., 1995).

Utilizou-se um sistema que consiste em dois eletrodos para o desgaste

eletroquímico, Figura 5, fibra de platina e eletrodos de grafite, obtidos comercialmente.

Dois eletrodos de grafite foram utilizados de maneira a se obter uma distribuição mais

uniforme do potencial aplicado entre os eletrodos de grafite e a fibra de platina,

evitando assim uma corrosão irregular da fibra. Outro procedimento da literatura (Song,


Pryds et al., 1993) utiliza dois eletrodos de platina no processo, ao invés de grafite.

Entretanto, este resulta em perda de material eletródico, de maneira desnecessária,

durante o processo de desgaste da fibra de platina.

A AB

CD

Figura 5 – Esquema da célula eletroquímica utilizada para o desgaste eletroquímico. Eletrodos de grafite (A), Fibra de platina (B), Solução para a corrosão: CaCl2 saturada (C) e solução não condutora: CCl4 (D). Os eletrodos foram conectados a um transformador AC (60 Hz), de potencial

eficaz igual a 5 V, ao invés de programador universal acoplado a um potenciostato-

galvanostato (Itaya, Abe et al., 1987) ou geradores de função. Isto torna o custo muito

baixo pois dispensa-se a utilização de equipamento sofisticado. O final do processo de

corrosão ocorre quando a fibra se rompe na solução de CaCl2/acetona (15-16 minutos

após o inicio do processo), formando-se então duas extremidades “apontadas”. Na seção

de Resultados uma discussão mais detalhada sobre o processo de microfabricação será

efetuada.

Para a corrosão de eletrodos de Au (Alfa Aesar) foi utilizado um sistema de dois

eletrodos (fibras de ouro e platina (Woo, Kang et al., 2003)). Como solução para o

desgaste eletroquímico utilizou-se HCl 4 mol L-1. Aplicou-se uma diferença de

potencial DC entre os eletrodos de 1,7 V. A Figura 6 mostra uma representação

esquemática da célula eletroquímica utilizada.


AB

Figura 6 – Esquema da célula eletroquímica utilizada para o desgaste eletroquímico das fibras de Au (d = 100 µm). Fibra de ouro (A) e Eletrodo de platina (B). Solução para a corrosão: HCl 4 mol L-1.

As fibras de carbono (diâmetro = 10 μm, Thornel) foram desgastadas seguindo

procedimento da literatura (Chen e Kucernak, 2002). Basicamente, utilizou-se o arranjo

experimental da Figura 6, o qual foi conectado a um transformador AC (60 Hz) de

potencial eficaz igual a 5 V. Como solução para a corrosão utilizou-se NaOH 0,01 mol

L-1.

Por fim, todas as fibras produzidas pelo processo de desgaste eletroquímico

foram seladas pela imersão em um plastificante de borracha (PlastiFilm,

QUIMATEC®) e posteriormente deixadas com a ponta para cima até completa

secagem, segundo o esquema abaixo, Figura 7. Na Tabela 3 consta a composição do

plastificante de borracha. Entretanto, vale destacar que os microeletrodos de fibra de

carbono foram selados no vidro, devido à menor resistência mecânica das fibras.

Procedimentos adicionais utilizando filmes polimerizados a partir de fenol também

foram testados.


Tabela 3 – Composição do plastificante de borracha (PlastiFilm, QUIMATEC®).

Fonte: http://www.quimatic.com.br/fispqs/fispq_plast_film.pdf

Nome químico Concentração / %

Borracha Termoplástica 25 – 30

Tolueno 35 – 40

Mistura de Hidrocarbonetos:

Parafínicos, Olefínicos, Naftênicos e

Aromáticos

15 - 20

Pigmento 1,5 - 2

(A) (B) (C)

Figura 7 – Esquema do processo de fabricação dos microeletrodos após desgaste eletroquímico: (A) fibra com ponta afiada, (B) imersão da fibra no plastificante e (C) processo de secagem do plastificante de borracha.

3.3.2. Fabricação da matriz de microeletrodos (MEA, microelectrode array) utilizando litografia.

Este processo de fabricação está baseado em técnicas de litografia e foi realizado

em colaboração com o Laboratório de Microeletrônica da POLI/USP-SP. A Figura 8

apresenta uma visão lateral do dispositivo.


Figura 8 – Visão Lateral da matriz de microeletrodos. O processo de fabricação seguiu as seguintes etapas:

1) Substrato de partida: Silício.

2) Oxidação Térmica do Silício para SiO2, para isolamento total do substrato com as

posteriores superfície metálicas que serão depositadas a seguir.

3) Deposição por “sputtering” de uma camada de 100 nm de Ni/Cr e posteriomente

deposição de camda de 100 nm de Au. A deposição de Ni/Cr se faz necessária para

aumentar a aderência da camada de Au.

4) Construção da máscara ou layout e definição das trilhas metálicas.

5) Deposição do isolante.

6) Aquecimento do isolante por 450ºC por 1 hora para aumentar a resistência química

do isolante.

O design do MEA (do inglês, “microelectrode array”) desenvolvido está

ilustrado na Figura 9. Este contém 100 microeletrodos de ouro, de 20 x 20 μm,

espaçados de 100 μm entre eles, como mostrado na Figura 9A. A Figura 9B mostra o

layout completo do MEA, mostrando a distribuição radial dos contatos elétricos

externos individuais para cada eletrodo. A Figura 9C mostra uma imagem de uma

região do MEA registrada utilizando um microscópico.

IsolanteAu

Ni/Cr SiO2

Si

Microeletrodo


Figura 9 – “Design” completo do MEA (A), região central com 100 microeletrodos (B) e “zoom” de 9 microeletrodos (C).

Os estudos eletroquímicos utilizando o MEA foram realizados usando sistema

de 2 eletrodos. Ag/AgCl saturado foi utilizado como eletrodo de referência e os

microeletrodos de ouro como trabalho. Trabalhou-se com um volume de amostra da


ordem de 50 – 200 μL, colocada na região dos microeletrodos, Figura 9A. O eletrodo de

referência foi posicionado no topo da gota, como mostra a Figura 10.

Figura 10 – Esquema da célula eletroquímica: eletrodo de referência (a), solução de trabalho (b) e MEA (c).

Para a observação da superfície dos microeletrodos foi utilizado microscópio

óptico, Sony CCD-IRIS, modelo SSC-C370 acoplado a microcomputador para

aquisição das imagens.

3.3.3. Construção do microeletrodo integrado

A fibra de platina proveniente do processo de desgaste eletroquímico foi soldada

a um fio de cobre (0,2 mm de diâmetro e 9 cm de comprimento). Em seguida, a fibra foi

submetida ao processo de isolamento utilizando um plastificante de borracha

(PlastiFilm, QUIMATEC®) e deixada na posição vertical para a secagem e exposição

da ponta formada pelo processo de corrosão, durante 1 hora. Em uma etapa seguinte

depositou-se uma camada de cola de prata (Joint Metal Comércio LTDA) sobre a


camada polimérica não-condutora para a fabricação de um eletrodo de referência (quasi-

referência). O “layout” e uma imagem do eletrodo fabricado estão mostrados na figura

11.

Figura 11 – “Layout” e imagem do microeletrodo integrado.

3.3.4. Construção do microeletrodo: isolamento com polímero não condutor

Outra maneira de construção estudada foi o isolamento da fibra utilizando-se

fenol como monômero para formação de uma camada não condutora de polifenol. Para

isolamento da fibra utilizou-se solução de fenol 0,1 mol L-1 e NaOH 1 mol L-1. Os

eletrodos foram polarizados utilizando um programa de potencial de 0 – 1,0 V por 50

ciclos.

3.4. Procedimento de polimento potenciodinâmico

Os eletrodos de platina foram submetidos a um pré-tratamento empregando um

programa de perturbação do potencial com onda quadrada com amplitude de 0,0 a 1,8 V

e freqüência de 50 Hz, durante 3 minutos, em solução de H2SO4 0,05 mol L-1. Os


eletrodos de ouro foram pré-tratados em meio de HCl utilizando potencial DC igual a

1,7 V vs Ag/AgCl.

O valor de capacitância aparente para os microeletrodos foi determinado

segundo procedimento descrito na literatura (Wipf, Michael et al., 1989) e com este

pôde-se obter informação sobre a eficiência do processo de selagem da matriz de

microeletrodos.

3.5. Modificação da superfície dos eletrodos com filmes de

hexacianoferratos (HCF)

Antes da modificação, a superfície dos eletrodos de carbono vítreo foi polida em

Alumina (1 μm, Alfa Aeser, Ward Hill, MA) e, após isso, os eletrodos foram lavados

com água destilada. Uma vez polidos, os eletrodos foram colocados em aparelho de

ultrassom (Thornton, T14) por alguns minutos em água destilada. Os eletrodos foram

então submetidos a um programa de potencial em soluções apropriadas:

CoHCF: CoCl2 1 mmol L-1 + K3Fe(CN)6 1 mmol L-1

+ NaCl 0,5 mol L-1

InHCF: InCl3 1 mmol L-1 + K3Fe(CN)6 1 mmol L-1

+ NaCl 0,5 mol L-1 + 0,01 mol L-1 HCl

RuOHCF: RuCl3 1 mmol L-1 + K3Fe(CN)6 1 mmol L-1


FeHCF: FeCl3 2,5 mmol L-1 + K3Fe(CN)6 2,5 mmol L-1


Após modificação da superfície dos eletrodos, a estabilidade dos filmes foi

verificada em solução contendo somente eletrólito suporte, nas mesmas condições da


modificação. Quando não utilizados os eletrodos foram imersos em eletrólito suporte. O

excesso superficial (Γ) foi determinado medindo-se a carga a partir da área dos registros

voltamétricos, ou melhor, do último voltamograma da verificação da estabilidade

(processo redox do Ru(II)/Ru(III) ou Fe(II)/Fe(III), respectivamente, RuOHCF e

FeHCF).

3.6. Célula de para análise por injeção em fluxo

O sistema em fluxo consistiu em uma bomba peristáltica (Ismatec ISM 828),

uma válvula injetora comutadora e uma célula de acrílico na configuração wall-jet,

Figura 12.


A

B

C

Entrada doFluxo

Saída doFluxo

Figura 12 – Representação esquemática da célula de fluxo utilizada nos experimentos em FIA: Eletrodo de Trabalho (A), Referência (B) e Auxiliar (Aço inox) (C).

3.7. Amostras de diferentes frutas

Laranjas (Citrus sinensis), goiaba branca (Psidium guajava L.) e tomates

(Lycopersion esculentum) foram obtidos em supermercados locais. O grau de maturação

das laranjas foi avaliado pela coloração da casca: verde (não madura) e amarelo

alaranjado (madura). Todas as frutas foram armazenadas a 5 ºC.


3.8. Tratamento Enzimático

Para investigar possíveis interferências de matriz ao se utilizar o método

amperométrico para quantificação de ácido ascórbico no suco de laranja, a degradação

seletiva do ácido ascórbico foi realizada (De Donato, Pedrotti et al., 1999). Pepino

(Cucumbis sativus), é uma fonte natural de ascorbato oxidase. O pepino foi cortado em

pequenos pedaços (a pele foi removida previamente) e aproximadamente 1 g foi

adicionado a 10 mL do suco da laranja. A mistura foi deixada sob agitação magnética

por 15 minutos. Após isso, a solução foi filtrada, e os experimentos foram realizados

como filtrado.

3.9. Preparação das amostras de DNA

Um miligrama de DNA de timo de bezerro foi dissolvido em 1 mL de tampão

fosfato pH 7,4. Realizou-se então a precipitação do DNA adicionando-se um volume

apropriado de tampão HAc/Ac- 3 mol L-1 pH 5 e 1 mL de etanol. Essa suspensão foi

congelada a -20 ºC durante uma noite e centrifugada a 1000 g por 5 minutos a 4 ºC. O

“pellet” resultante foi lavado com 70 % de etanol e dissovido em 1 mL de água.

Adicionou-se ao DNA (200 μg) 4 μL de tampão ácido/acético acetato 1 mol L-1 (pH 5)

e, em seguida, procedeu-se à digestão do DNA adicionando-se 2 unidades da nuclease

P1 a 37 ºC por 30 minutos. 12 μL de tampão Tris/HCl (pH 7,4), 12 μL de tampão

fosfato e 12 unidades da fosfatase alcalina foram adicionados por mais 1 hora a 37 ºC.

O volume final foi ajustado para 200 μL com água. As enzimas foram precipitadas pela

adição de clorofórmio e as soluções resultantes foram utilizadas para a quantificação da


dG. O Esquema 2 mostra uma representação simplificada do procedimento de hidrólise

enzimática, descrito anteriormente.

Esquema 2.

3.10. Preparação das amostras de urina

As amostras de urina foram utilizadas sem tratamento prévio e logo após o

processo de coleta. Coletaram-se amostras de 3 diferentes indivíduos e estas foram

armazenadas em frascos esterilizados de 50 mL. O volume de amostra utilizado variou

de 100 a 500 μL (Volume final após diluição 10 mL).

3.11. Método coulométrico

A exatidão do método proposto para quantificação de ácido ascórbico no suco de

fruta foi avaliada utilizando o método coulométrico com eletrogeração de iodo (Paixão,

Matos et al., 2003). Um coulômetro da Metrohm modelo 211A foi empregado para

gerar o titulante. Um anodo (em forma de espiral) e um catodo (em forma de rede) de


platina foram utilizados no arranjo experimental. A solução de trabalho consistiu em 50

mL de mistura contendo HAc 1 mol L-1/Ac- 0,1 mol L-1 + KI 0,1 mol L-1, pH = 3,7.

Amido foi utilizado como indicador para visualização do ponto final da titulação.

3.12. Método cromatográfico

As análises comparativas por HPLC foram realizadas em um sistema HPLC da

Shimadzu (Shimadzu, Kyoto, Japan). O sistema inclui ainda duas bombas LC-6AD, um

auto injetor (SIL-10AVP), e um dispositivo SPD-M10AVP para leitura da absorbância.

Esse dispositivo é controlado por um comunicador SCL-10AVP e um software CLASS-

VP. Como coluna analítica utilizou-se uma coluna Luna C18 (2) (250 mm x 4,6 mm,

diametro interno: 5 μm) (Phenomenex, Torrance, CA). A eluição foi feita em modo

isocrático, com tampão fosfato 25 mmol L-1 e 8 % de methanol, a uma vazão de 1 mL

min-1 por 45 minutos, e a absorbância foi monitorada em 254 nm. A curva de calibração

foi preparada em uma faixa de dG que compreenderia as concentrações das amostras de

DNA hidrolisada.

3.13. Microscopia eletrônica de Varredura

A morfologia dos filmes de RuOHCF e FeHCF foi avaliada utilizando

microscopia eletrônica de varredura (MEV). Essas medidas foram realizadas utilizando

um microscópio da Cambridge (LEO Stereoscan 440) equipado com um espectrômetro

de energia dispersiva de raio-X, que determina a composição da região avaliada na

MEV. Utilizou-se para essas medidas um placa de carbono vítreo de 1 cm2 (Alfa Aesar,

Massachusetts, EUA).


3.14. Elipsometria

A espessura dos filmes de RuOHCF eletrodepositados sobre a superfície das

placas de carbono vítreo foi determinada por elipsometria. As medidas foram realizadas

utilizando um Elipsômetro (Ratzeburg, Alemanha) conforme procedimento descrito na

literatura (Fujimoto e Petri, 2001). A concentração dos sítios eletrocatalíticos no filme

de RuOHCF foi calculada usando a seguinte fórmula: b0 (mol cm-3) = Γ/L, onde Γ é o

excesso superficial (mol cm-2) e L a espessura do filme (cm) medida por elipsometria.

3.15. Cultura de neuroblastomas humanos

Neuroblastomas humanos (linhagem SH-SY5Y) não transformados e

expressando constitutivamente SOD humana nativa (SH-SY5Y/SOD WT) ou SOD

humana mutante G93A (SH-SY5Y/SOD G93A), foram fornecidos gentilmente pela

Profa. Dra. Maria Teresa Carrì da Universidade de Roma, Itália à Profa. Dra. Marisa

Helena Gennari de Medeiros. A transformação das células SH-SY5Y com SOD humana

nativa ou a mutante G93A foi realizada como descrito na literatura (Carri, Ferri et al.,

2003).

As células foram cultivadas em meio DEMEM / Nutriente HAM F12 (pH 7,4),

enriquecido com 15 % (v/v) de soro fetal bovino (SFB), penicilina (0,04 g/L), sulfato de

estreptomicina (0,1 g/L) e NaHCO3 (3,7 g/L). No meio contendo as células

transformadas adicionou-se ainda geneticina (0,2 g/L) para seleção (o plasmídio

pRc/CMV utilizado para inserir o gene da SOD contém um marcador de resistência à

neomicina, o qual confere resistência à geneticina em células eucarióticas). O meio de


cultura foi filtrado com filtro de 0,2 μm para eliminar fungos e bactérias. As células

foram incubadas em atmosfera de 5 % de CO2 / ar a 37ºC.

No início da cultura celular, a suspensão de células (1 mL) foi descongelada e

centrifugada a 1000 rpm por 2 min. No fluxo laminar estéril, o sobrenadante foi

descartado e o pellet ressuspendido em 1 mL do meio adequado. Após outra

centrifugação, o sobrenadante foi novamente descartado e o pellet ressuspendido em 1

mL de meio. A suspensão de células foi transferida para uma garrafa pequena de cultura

e mais 9 mL de meio foram adicionados.

Para o repique das células, o meio foi aspirado e as células lavadas duas vezes

com 5 mL de PBS-A (NaCl 137 mM; KCl 2,68 mM; KH2PO4 1,47 mM; Na2HPO4 8

mM) autoclavado. Em seguida, as células foram destacadas com 1,5 mL de tripsina 0,05

% (p/v) e após 2 min, 25 mL de meio foi adicionado e a suspensão transferida para uma

garrafa grande. Para o congelamento das células, 1 mL de dimetilsulfóxido (DMSO) foi

adicionado a 10 mL de meio nesta etapa e a suspensão de células foi dividida em 10

vials. Os vials ficaram 30 min no congelador, 24 h no freezer a -80ºC e foram estocados

em nitrogênio líquido.

3.16. Avaliação do consumo de ascorbato pelas células SH-SY5Y

utilizando microeletrodo modificado com filme de óxido de rutênio

hexacianoferrato

O consumo de ascorbato pelos 3 tipos celulares - SH-SY5Y, SH-SY5Y (SOD

WT), SH-SY5Y (SOD G93A) – foi acompanhado pelo decaimento da concentração de

ascorbato no meio de cultura por 3 h. Um dia antes das medidas, 106 células foram

plaqueadas em um poço de uma placa de 12 poços, em meio DMEM-HAM F12 com 15


% de SFB. Imediatamente antes das medidas, as células foram lavadas com PBS e

foram adicionados 2 mL de meio MEM (GibcoBRL, New York) incolor sem SFB, com

0,5 mM de glutationa reduzida (GSH) e 0,2 mM de ascorbato. Os experimentos foram

realizados com sistema de 3 eletrodos: fio de platina como eletrodo auxiliar, eletrodo de

Ag/AgCl saturado como eletrodo de referência, e microeletrodo de carbono vítreo (r =

14,5 µm) modificado com filme de óxido de rutênio hexacianoferrato como eletrodo de

trabalho. Os três eletrodos foram mergulhados no meio de cultura sobre as células, à

temperatura ambiente. Para as medidas amperométricas utilizou-se o potenciostato

portátil da PalmSens (Palmsens BV, Houten, Holanda), conectado a um

microcomputador.

3.17. Medidas eletroquímicas em uma única célula

Antes da realização das medidas, o meio foi trocado por tampão fosfato (pH =

7,0). Utilizou-se como microambiente fibroblastos da espécie homonares humanus

linhagem IMR-90. Para visualização dos fibroblastos utilizou-se um microscópio

invertido Diaplot 300 da Nikon (Tokyo, Japão). Para acessar o interior das células com

o microeletrodo, utilizou-se um micromanipulador da Stoelting Co. modelo 55133,

Figura 13.


Figura 13 – Micromanipulador utilizado nos experimentos utilizando os fibroblastos.

Resultados e Discussão 52

4. Resultados e Discussão

4.1. Fabricação e caracterização dos microeletrodos

4.1.1. Microeletrodos fabricados por desgaste eletroquímico

O processo de corrosão do fio de platina é um processo demorado, pois a platina

é um metal nobre. Llopis e colaboradores (Llopis, 1968), em um artigo de revisão,

descrevem que o processo de oxidação anódica da platina em H2SO4 ou NaOH é

praticamente indetectável. Entretanto, em soluções contendo íons Cl- nota-se um

pequeno processo de desgaste da platina. Nesse processo ocorre a formação de íons

complexos de Pt(II)Cl42- ou Pt(II)Cl6

4-. Contudo, quando uma diferença de potencial

maior do que 1 V é aplicada à célula eletroquímica a corrente decai a zero, indicando

uma diminuição na velocidade do processo de corrosão. Isto ocorre devido à passivação

da superfície do eletrodo com formação de uma camada de óxido (Llopis, 1968).

Utilizando um potencial AC, ao contrário de um potencial DC, o processo de

corrosão da platina é então muito mais eficiente. O potencial alternado reverte o

processo de passivação da superfície, pois na fase negativa de potencial a camada de

óxido é dissolvida e, desta maneira, ocorre a limpeza da superfície do eletrodo para que

o mesmo possa ser oxidado na fase positiva de potencial. A Figura 14 mostra um

esquema do processo de corrosão durante a microfabricação do microeletrodo de

platina.


Figura 14 – Esquema do processo de desgaste eletroquímico da fibra de platina em função do tempo (t). Pt4+ = ● e Cl- = o. Durante o processo de microfabricação monitorou-se a corrente AC com o

auxílio de um multímetro conectado em série, Figura 15.

0 4 8 12 1660

80

100

120A

I / m

A (R

MS)

Tempo / min.

Figura 15 – Sinal amperométrico registrado durante desgaste eletroquímico de fibra de platina de diâmetro igual a 100 μm. Freqüência alternada de 60 Hz e potencial eficaz 5 V. Em (A) ocorreu o rompimento da fibra.

t


Nota-se na Figura 15 que inicialmente o processo de corrosão é lento

(aproximadamente 10 minutos). Contudo, assim que iniciado ocorre uma queda da

corrente, indicando a corrosão da fibra. Com o tempo a platina vai sendo consumida até

que ocorra o rompimento da fibra e aparecimento de duas fibras com extremidades

“apontadas”. Diferentes transformadores AC foram usados a fim de avaliar a influência

do potencial sobre o tempo de corrosão e a qualidade da fibra formada. Duas fibras

formadas a partir de um processo de corrosão, utilizando potencial eficaz de 5 V, são

mostradas na Figura 16.


A

B

Figura 16 – As duas extremidades de uma fibra de platina que sofreu o processo de corrosão. Extremidade superior (A) e extremidade inferior (B). Potencial eficaz utilizado = 5 V.

Na Figura 17 é mostrada a microscopia eletrônica de varredura para a

fibra de platina desgastada eletroquimicamente e na Figura 18 é apresentada uma fibra


que sofreu um processo de desgaste eletroquímico utilizando-se um transformador de

potencial eficaz de 10 V.

Figura 17 – Microscopia eletrônica de varredura da fibra de platina que sofreu um processo de desgaste eletroquímico utilizando-se um transformador de potencial eficaz de 5 V.


Figura 18 – Microscopia eletrônica de varredura da fibra de platina que sofreu um processo de desgaste eletroquímico utilizando-se um transformador de potencial eficaz de 10 V. Utilizando-se potenciais mais altos (10 V) o tempo de formação da

microestrutura diminuiu para 6 minutos quando comparado com o valor obtido a 5 V,

que foi de 15 a 16 minutos. Entretanto, nota-se que a estrutura apresentada na Figura 18

é muito mais irregular. Na literatura (Sorensen, Hvid et al., 1999), Andersen em um

comunicado privado sugere um segundo mecanismo que poderia ocorrer a altos valores

de potencial aplicado, acarretando em altas taxas de desgaste eletroquímico. Este

mecanismo está baseado no fato de que em potenciais maiores do que 1,23 V pode

ocorrer a eletrólise da água formando-se oxigênio, quando a fibra de platina atua como

ânodo, e hidrogênio, quando a mesma atua como cátodo. Esse hidrogênio formado no

eletrodo de platina pode difundir-se intersticialmente para o interior do eletrodo de

platina, assim como o oxigênio. Desta maneira, a combinação de oxigênio e hidrogênio


poderia levar à formação de microexplosões, que acarretariam em uma superfície com

mais imperfeições (Figura 18).

Com base nestes estudos preferiu-se utilizar o potencial eficaz de 5 V, uma vez

que este resulta em uma superfície com menos imperfeições quando comparada com a

fabricada com potencial eficaz de 10 V. Imperfeições na superfície causam problemas

de selagem e aumento na corrente capacitiva, levando a uma maior histerese nos

voltamogramas.

Microeletrodos de ouro também foram construídos utilizando a técnica de

desgaste eletroquímico. Diferentemente da platina, fibras de ouro apresentam uma

maior facilidade de corrosão uma vez que estas não apresentam processos de passivação

que influenciam a velocidade de corrosão, não necessitando assim de potencial AC.

Para tanto, utilizou-se uma solução de HCl 4 mol L-1 no processo de desgaste

eletroquímico. Nessas condições ocorre oxidação do ouro de acordo com a equação

química abaixo (Bard, 1975):

Au(s) + 2Cl- AuCl2- + e- Eº= 1,154 V (6)

A voltagem DC utilizada de 1,7 V é suficientemente elevada para que a reação

ocorra. Ao contrário da platina, a fibra de ouro é imersa 2 mm na solução e o final do

processo de desgaste eletroquímico só ocorre quando a corrente registrada for nula,

Figura 19. A Figura 20 mostra uma fibra de ouro fabricada pelo processo descrito

acima.


0 10 20 30 40 50 60 700

10

20

30

I / m

A

Tempo / s

Figura 19 – Amperograma registrado durante o processo de desgaste eletroquímico da fibra de ouro de diâmetro igual a 100 μm. Diferença de potencial entre os eletrodos = 1,7 V e solução para corrosão = HCl 4 mol L-1.

Figura 20 – Microscopia eletrônica de varredura da fibra de ouro após processo de desgaste eletroquímico.


Nota-se na Figura 20 que, como na platina, ocorre um afinamento da fibra.

Posteriormente ao processo de microfabricação dos eletrodos procedeu-se com o

processo de selagem, como descrito na parte experimental. A Figura 21 mostra uma

fibra de platina com a camada isolante (B) e para fins de comparação apresenta-se

também uma foto da fibra antes da etapa de selagem (A). Comparando-se as Figuras

21A e 21B pode-se observar um aumento do diâmetro da fibra na parte superior,

indicando assim o recobrimento dessa região com o plastificante.

(A) (B)

Figura 21 – Fibra de platina desgastada eletroquimicamente antes (A) e após (B) a selagem com plastificante de borracha.


As Figuras 22 e 23 mostram voltamogramas cíclicos registrados em ouro e

platina, respectivamente, após pré-tratamento. Na Figura 23 é mostrado um resultado

sem pré-tratamento para o eletrodo de platina.

0,0 0,2 0,4

0

100

200

300

400

500

B

A

I / n

A

E / V vs Ag/AgCl

Figura 22 – Voltamogramas cíclicos registrados em solução de K4Fe(CN)6 20 mol L-1 + KCl 0,1 mol L-1. A e B referem-se a dois diferentes microeletrodos de platina (A) e ouro (B) fabricados pelo processo de desgaste eletroquímico. Velocidade de varredura: 50 mV s-1.


-0,2 0,0 0,2 0,4 0,6 0,8

C

BA

100 nA

E / V vs Ag/AgCl

Figura 23 – Voltamogramas cíclicos registrados em solução de K3Fe(CN)6 20 mmol L-1 + KCl 0,1 mol L-1. Microeletrodo de Pt 1 sem (A) e com (B) pré-tratamento (Como descrito na parte experimental) e microeletrodo de platina 2 (C) após pré-tratamento. Velocidade de varredura: 50 mV s-1. Nas Figuras 22 e 23 notam-se perfis voltamétricos (sigmoidais) típicos obtidos

utilizando microeletrodos, justificados pela difusão radial do material eletroativo para a

superfície do eletrodo. Em relação ao pré-tratamento, conclui-se que o mesmo é de

fundamental importância para a obtenção de voltamogramas com as características

desejadas.

A Figura 24 mostra o perfil voltamétrico para o microeletrodo de fibra de

carbono. Nesse experimento removeu-se, por polimento, a pequena parte da fibra

exposta após o processo de selagem. Esse procedimento foi utilizado para avaliar o raio

do microeletrodo. O raio obtido a partir da equação 3 e o valor de IL foi de 2,3 μm,

indicando a eficiência do processo de desgaste eletroquímico para a fibra de carbono.


-0,2 0,0 0,2 0,4 0,6-9

-6

-3

0I /

nA

E / V vs Ag/AgCl

Figura 24 – Voltamogramas cíclicos registrados em solução de K3Fe(CN)6 12,5 mmol L-1 + KCl 0,1 mol L-1. Velocidade de varredura: 50 mV s-1. Microeletrodo de fibra de carbono.

Dando continuidade ao processo de fabricação dos microeletrodos para medidas

em ambientes microscópicos, tentou-se integrar um eletrodo quase-referência aos

microeletrodos construídos anteriormente, utilizando o plastificante de borracha e cola

de prata.

Inicialmente registraram-se voltamogramas a fim de comparar a resposta obtida

pelo eletrodo de “referência” proposto com a de um eletrodo de referência comercial,

Figura 25. Comparando os perfis voltamétricos obtidos nenhuma mudança significativa

pôde ser evidenciada no que diz respeito à corrente, observando-se apenas um

deslocamento do potencial de meia-onda (170 mV).

A capacitância aparente dos microeletrodos foi determinada segundo

procedimento descrito na literatura (Wipf, Michael et al., 1989), obtendo-se o valor de 5


μF cm-2. Este baixo valor de capacitância obtido demonstra a eficiência do processo de

selagem do microeletrodo.

-0,2 0,0 0,2 0,4 0,6 0,8

E / V vs Ag/AgCl

100 nA

Figura 25 – Voltamogramas cíclicos registrados em solução de K3Fe(CN)6 20 mmol L-1 + KCl 0,1 mol L-1, utilizando 2 microeletrodos de Pt de áreas diferentes. Registros realizados com (⎯⎯) e (- - -) sem o referência integrado. Em (- - -) utilizou-se Ag/AgCl saturado como eletrodo de referência. Velocidade de varredura: 50 mV s-1.

O tempo de vida do eletrodo foi verificado medindo-se o sinal de corrente para

soluções de K3[Fe(CN)]6 1 mmol L-1, e após 2 semanas não foram observadas mudanças

no valor de corrente limite para o processo de redução do K3[Fe(CN)]6. Medidas

potenciométricas do eletrodo quasi-referência também foram realizadas contra eletrodo

padrão de Ag/AgCl, KCl saturado, e não se constatou alteração significativa do

potencial do eletrodo de referência integrado. Quando não utilizado, o eletrodo foi

armazenado a seco. A repetibilidade das respostas do sensor foi avaliada para 20

medidas de corrente em voltamogramas registrados em uma solução de K3[Fe(CN)6] 1

mmol L-1, obtendo-se um valor de 2,4 % de desvio padrão.

A Figura 26 mostra a microscopia eletrônica de varredura do eletrodo integrado.


Figura 26 – Microscopia eletrônica de varredura do eletrodo integrado e ampliação da ponta do eletrodo. O aparecimento de uma região mais escura na Figura 26, região A, deve-se ao

acúmulo de cargas negativas provenientes do feixe de elétrons, o que indica uma região

não condutora (região recoberta pelo plastificante de borracha). Mais acima dessa região

tem-se uma parte mais clara que representa a camada de prata depositada sobre a

camada do polímero não condutor. Na região ampliada tem-se uma melhor visualização

da ponta do microeletrodo não recoberta pelo plastificante e responsável pela área

eletroativa do microeletrodo de platina. Nota-se que o tamanho do dispositivo, na região

mais próxima da região exposta da platina, é da ordem de 6 µm.

Novas tentativas para construir eletrodos em que o eletrodo de referência ficasse

mais próximo da ponta do microeletrodo foram realizadas. Filmes finos de plastificante

resultam em uma camada porosa do isolante. Com isso, para que a camada de prata

possa ser depositada sem resultar em problemas de curto-circuito entre o eletrodo de

trabalho e o de referência, um maior número de deposições de plastificante é requerido.

Esse aumento do número de deposições do plastificante resultou em um aumento

A

B


significativo do diâmetro do dispositivo, Figura 27, o que acarretaria em maior

dificuldade de introdução no interior de microambientes.

Entretanto, pode-se utilizar o dispositivo com o eletrodo de referência integrado

mais na parte superior, região B (Figura 26), ou ainda sem o eletrodo de referência

integrado (2 eletrodos independentes), sem acarretar em problemas nas medições de

corrente e na inserção do microeletrodo nos microambientes.

Figura 27 – Microscopia eletrônica de varredura do dispositivo no qual a disposição do eletrodo de ficou mais próxima da ponta do microeletrodo.

Devido ao aumento do tamanho deste dispositivo em relação ao apresentado na

Figura 26, novo procedimento foi testado para o isolamento das microfibras fabricadas a

partir do processo de corrosão eletroquímica. Testou-se então o isolamento da

microfibra por eletropolimerização do fenol sobre a superfície eletródica. O mecanismo

que resulta na formação de um polímero não condutor pode ser representado pelo

mecanismo exposto no esquema 3.


OH O-

O

O OH

OH

O

O OHO

OH

O

OH

O O-

O

O OHO

OH

H++

H++

O

n

n

OH

n

e-

Esquema 3.

O mecanismo de formação da camada polimérica é similar ao mecanismo de

formação do polipirrol. Em meio alcalino, o equilíbrio ácido-base do fenol é deslocado

para a formação do fenolato. O fenolato pode ser oxidado na superfície do eletrodo de

platina ao seu respectivo radical. Esse radical é adsorvido na superfície do eletrodo e

reage com o fenol presente na solução para a formação do dímero na forma para ou

orto. Entretanto, somente a forma para dá continuidade à formação do polímero, que


forma um radical ou reage com o radical fenolato. O progresso da etapa de isolamento

da fibra foi monitorado pelos registros voltamétricos, como demonstrado na Figura 28.

0,0 0,3 0,6 0,9

0

30

60

50

15

1

I / μ

A

E / V vs Ag/AgCl

Figura 28 – Voltamogramas cíclicos registrados durante o processo de isolamento da microfibra de platina. Velocidade de varredura: 50 mV s-1. Solução: Fenol 0,1 mol L-1 + NaOH 1 mol L-1. Número de ciclos: 50. Na Figura estão representados os ciclos de 1 a 15 e o quinqüagésimo ciclo.

O pico na região de aproximadamente 0,6 V ocorre somente nos primeiros ciclos

e, à medida que o processo de polimerização ocorre, a superfície da microfibra vai

sendo recoberta por inteiro e o sinal de corrente referente ao processo faradaico da

polimerização do fenol sobre a superfície eletródica diminui. Tipicamente a fibra é

polarizada por 50 ciclos na solução de fenol em meio alcalino.

Para que uma pequena região da superfície eletródica fique exposta para as

futuras medidas eletroquímicas é necessário que a camada isolante seja removida da

ponta do microeletrodo. Para isso, colocou-se a ponta da microfibra recoberta com a

camada do polímero dentro de uma solução contendo HCl 0,1 mol L-1 e polarizou-se a


mesma em -1,0 V. Esse potencial negativo leva à formação de H2, que quebra a camada

do isolante. Nota-se então que a camada do isolante é permeável ao próton, entretanto

espécies grandes são impedidas de alcançar a superfície eletródica. Registros

voltamétricos em solução contendo Ru(NH3)63+ ou Fe(CN)6

3- não resultaram em sinal

de corrente proveniente da redução destas espécies ao se trabalhar com o eletrodo

contendo a camada polimérica isolante. Um voltamograma registrado utilizando-se o

microeletrodo construído a partir desse procedimento (após a remoção de uma parte da

camada isolante) está apresentado na Figura 29.

0,0 0,2 0,4-200

-150

-100

-50

0

50

I / n

A

E / V vs Ag/AgCl

Figura 29 – Voltamogramas cíclicos registrados em solução de K3Fe(CN)6 10 mmol L-1 + KCl 0,1 mol L-1, utilizando microeletrodo recoberto com a camada polimérica. Velocidade de varredura: 50 mV s-1.

Em resumo, pôde-se verificar que microeletrodos da ordem de alguns

micrometros foram construídos utilizando diferentes materiais. Os processos de selagem

não resultaram em um aumento significativo do diâmetro do eletrodo. Aparentemente, o

processo de selagem por polimerização seria o mais adequado para medidas em células

individuais devido ao acréscimo nanométrico da espessura do isolante. Por outro lado,

se somente as pontas dos microeletrodos fossem introduzidas nos microambientes,


todos os procedimentos poderiam ser utilizados, com exceção do eletrodo integrado em

que o eletrodo de referência fica muito próximo da ponta do microeletrodo.

4.1.2. Microeletrodos fabricados utilizando técnica litográfica

Estudos preliminares foram realizados com o intuito de avaliar a conexão

elétrica entre os microeletrodos e os contatos elétricos das terminações das trilhas,

polarizando-se o conjunto de microeletrodos em -1,5 V vs Ag/AgCl em solução de

H2SO4 1 mol L-1. Durante o experimento a superfície dos microeletrodos foi monitorada

utilizando-se um microscópio óptico (descrito na parte experimental). A Figura 30

mostra imagens antes e após a polarização de um conjunto de microeletrodos (Figura 9,

Conjunto de 1-25). Observam-se bolhas de hidrogênio na superfície de 4 microeletrodos

nesse conjunto, indicando assim que os outros microeletrodos possivelmente perderam

ou não apresentam contato elétrico com os contatos externos. Foi observado nas outras

regiões que um grande número de eletrodos estava funcionando perfeitamente. Além

disso, esse procedimento foi utilizado com o intuito de limpeza da superfície dos

microeletrodos, uma vez que o polimento mecânico da superfície dos microeletrodos

não era possível.


A B Figura 30 – Imagem antes (A) e após (B) a polarização dos microeletrodos em -1,5 V vs Ag/AgCl. Eletrólito suporte: H2SO4 1 mol L-1.

A capacitância dos microeletrodos foi determinada (Wipf, Michael et al., 1989)

em uma solução de KCl 1 mol L-1 e o valor obtido foi de 29,7 μF cm-2. Esse valor

relativamente baixo de capacitância indica um bom processo de selagem entre os

eletrodos e a camada do isolante, sendo esse um fator importante na utilização desde

dispositivo para medidas utilizando velocidades de varredura muito altas.

O comportamento eletroquímico dos microeletrodos fabricados foi investigado

em experimentos voltamétricos utilizando solução de K3Fe(CN)6, Figura 31. A resposta

voltamétrica foi registrada a partir de dois microeletrodos interconectados, que foram

escolhidos utilizando-se o experimento da evolução de bolhas de hidrogênio conforme

mostrado na Figura 31. O perfil sigmoidal esperado para eletrodos onde a corrente é

governada por um processo de difusão radial foi observado, Figura 31a. A área

eletroquímica nesse caso foi calculada utilizando a equação 3. Foi considerado que a

corrente responsável pelo processo eletroquímico sobre a superfície dos microeletrodos

é a soma dos valores de corrente obtidos se os eletrodos fossem estudados de maneira

independente, o que é válido caso não ocorra sobreposição das camadas de difusão

individuais de cada microeletrodo. Vale salientar ainda que a equação de corrente limite


utilizada consiste em aproximação já que os microeletrodos utilizados não possuem

geometria circular e sim quadrática. Dessa maneira, utilizando-se o valor do coeficiente

de difusão (Adams, 1969) do Fe(CN)63- igual a 7,6 x 10-6 cm2 s-1, o raio calculado para

os 2 eletrodos interconectados foi de 19 μm, correspondendo em média a 9,5 μm para

cada eletrodo da matriz.

0,0 0,2 0,4 0,6

-16

-12

-8

-4

0

4

d

cb

a

I / n

A

E / V vs Ag/AgCl

0,0 0,2 0,4 0,6

-80

-40

0

I / n

A

E / V vs Ag/AgCl

Figura 31 – Voltamogramas registrados em solução contendo Fe(CN)63- 1 mmol L-1

+ KCl 1 mol L-1 de 2 microeletrodos interconectados (a). Os voltamogramas (b e c) representam, cada, 25 microeletrodos interconectados. O voltamograma (d) foi registrado com um grupo de 50 microeletrodos. Velocidade de varredura de 50 mV s-1. A Figura 31 mostra, também, os voltamogramas apresentados para outros

diferentes conjuntos de microeletrodos interconectados. Os voltamogramas

apresentados na Figura 31b e c foram obtidos utilizando-se diferentes conjuntos de 25

microeletrodos, sendo o perfil sigmoidal dos voltamogramas obtido em ambos os casos.

Comparando-se o valor calculado para os 2 microeletrodos na Figura 31a, chega-se a

um valor de 13 e 15 microeletrodos ativos em b e c, respectivamente. Interconectando


estes conjuntos de 25 microeletrodos entre si um novo voltamograma foi obtido, e a

soma dos valores de corrente limite, desses conjuntos separados, foi o valor obtido para

o conjunto de 50 microeletrodos interconectados. Esta observação indica que os

microeletrodos estão suficientemente separados, evitando assim, qualquer problema de

sobreposição das camadas de difusão individuais.

4.2. Utilização dos sensores fabricados

Uma vez que microeletrodos constituem-se em ferramenta de fundamental

importância para a exploração do domínio microscópico e para a detecção de analitos

em pequenos volumes de amostra, dois diferentes sistemas foram estudados para avaliar

o desempenho dos microeletrodos fabricados.

4.2.1. Monitoramento “in-situ” de ácido ascórbico em frutas

A determinação de vitaminas em frutas e fluidos biológicos geralmente é muito

demorada e os métodos apresentam custos relativamente altos (Varley e Gowenlock,

1976). A vitamina C, ácido ascórbico, pode ser eletroquimicamente oxidada com

relativa facilidade sobre superfícies de platina a ácido desidroascórbico. Com isso,

sensores eletroquímicos podem propiciar informações rápidas e baratas sobre a

quantidade de ácido ascórbico em frutas.

Inicialmente estudou-se o comportamento eletroquímico do ácido ascórbico

sobre a superfície do eletrodo de platina. A Figura 32 mostra voltamogramas cíclicos

registrados em 3 diferentes valores de pH para uma solução 10 mmol L-1 de ácido


ascórbico, utilizando-se microeletrodos de platina construídos a partir do processo de

desgaste eletroquímico e selagem com o plastificante, descrito na parte experimental.

Figura 32 – Voltamogramas registrados em solução contendo 10 mmol L-1 de ácido ascórbico. Eletrólito suporte: NaOH 0,1 mol L-1 (A), tampão fosfato pH = 7,0 (B), Tampão Ac-/HAc pH = 5,6 (C) e HCl 0,01 mol L-1 (D). Microeletrodos de platina e velocidade de varredura igual a 50 mV s-1. Nota-se que o potencial redox para o processo de oxidação anódica do ácido

ascórbico sobre o eletrodo de platina é dependente do pH uma vez que íons H+

participam do processo eletroquímico segundo a equação 7:

(7)

Analisando a equação 7, nota-se que o aumento do pH favorece o processo

anódico e esta conclusão é suportada pelos resultados mostrados na Figura 32. Vale

OHOH

O

OHOH

OOH

OHO

OO

O

+ 2H+ + 2e-


salientar ainda, como mais uma vantagem da utilização dos microeletrodos, a ausência

de problemas de envenenamento da superfície do eletrodo (Araki e Toma, 2002) e isto

pode ser observado ao se comparar voltamogramas sucessivos registrados, Figura 33.

Esse envenenamento é causado pelo produto da oxidação do ácido ascórbico e tem

efeito minimizado empregando-se microeletrodos, possivelmente devido à difusão mais

rápida da espécie gerada na superfície eletródica.

0,4 0,8 1,2

A, B100 nA

0,4 0,8 1,2

DC

E / V vs Ag/AgCl

100 μA

Figura 33 – Voltamogramas consecutivos registrados em solução de HCl 0,01 mol L-1 + 10 mmol L-1 de ácido ascórbico em dois diferentes eletrodos de platina: microeletrodos (A, B) e macroeletrodos (C,D): 1º Ciclo (A,C) e 2º Ciclo (B,D). Estudos com suco de laranja foram realizados a fim de investigar a eventual

presença de interferentes. Para isso, registraram-se voltamogramas cíclicos no suco de

laranja na ausência e na presença da enzima ascorbato oxidase, obtida a partir do pepino

(Figura 34).


0,0 0,2 0,4 0,6 0,8 1,0

0

20

40

60

CB

AI /

nA

E / V vs Ag/AgCl

Figura 34 – Voltamogramas lineares obtidos utilizando-se microeletrodo de platina a 50 mV s-1: suco de laranja antes (A) e após (B) 30 minutos da adição de cubos de pepino (B). A Curva C foi obtida em tampão fosfato, pH = 7. Nota-se em A que anteriormente à adição da enzima, um sinal referente a um

processo de oxidação inicia-se por volta de 0,3 V vs Ag/AgCl (pHlaranja entre 5 e 6),

região em que o ácido ascórbico se oxida nesta faixa de pH, Figura 32C. Em B nota-se a

ausência de processo eletroquímico, uma vez que na presença de ascorbato oxidase o

ácido ascórbico é degradado a ácido desidroascórbico, equação 8. Desta forma, pode-se

dizer que na região de trabalho estudada não existem espécies eletroativas que possam

vir a causar alguma interferência na determinação de ácido ascórbico. Estudos de adição

e recuperação no suco também foram realizados com a finalidade de observar possíveis

efeitos de interferência da matriz, Tabela 4. Valores de recuperação da ordem de 95 a

102% foram obtidos, reforçando assim a possibilidade de detecção de ácido ascórbico

utilizando o sensor proposto e a ausência de interferência de matriz no suco de laranja.


(8)

Tabela 4 - Valores de adição e recuperação usando três diferentes sucos de laranja.

Suco de laranja Ácido Ascórbico

/ mmol L-1

Valores de recuperação

/ %

Adicionado Encontrado

1 1,00 0,98 98

2 1,00 0,95 95

3 1,00 1,02 102

Wang e colaboradores (Wang e Lin, 2000) relataram a existência de pouca

informação sobre a capacidade anti-oxidante de frutas em diferentes estágios de

desenvolvimento. Além disso, esses autores observaram que o aumento do grau de

maturação de alguns frutos, tais como amora, morango e framboesa, aumenta a

capacidade anti-oxidante. Dosunmu e colaboradores (Dosunmu e Johnson, 1995)

verificaram o efeito da estocagem sobre a concentração do ácido ascórbico. Neves e

colaboradores (De Andrade, Diniz et al., 2002) também verificaram influência

semelhante do processo de maturação em 3 diferentes frutas (araçá, acerola e laranja).

Desta forma, a determinação de ácido ascórbico em frutos se mostra relevante pois pode

contribuir para um aproveitamento mais racional dos recursos naturais gerando

benefícios sociais e econômicos. Entretanto, os métodos utilizados para o

O H OH O

OH O H

OOH

OH O

OO

O

+ O 2 + 2 H 2 O ascorbatooxidase

2 2


monitoramento em frutas requerem uma manipulação prévia da amostra e extração do

suco. Métodos “in-situ” e sem destruição da amostra seriam de grande valia para a

avaliação destes parâmetros.

Aproveitando a possibilidade do uso de microeletrodos para minimizar a

manipulação da amostra, decidiu-se monitorar “in-situ” a distribuição de ácido

ascórbico na laranja. Utilizou-se um sistema de 2 eletrodos como descrito na parte

experimental e estes foram inseridos em diferentes regiões da laranja a fim de mapear as

diferenças na concentração de ácido ascórbico. A Figura 35 mostra um voltamograma

registrado “in-situ” na laranja e uma fotografia do conjunto de eletrodos inseridos em

uma das metades da laranja.


0,0 0,2 0,4 0,6 0,8 1,0

0

10

20

30

40

I / n

A

E / V vs Ag/AgCl

Figura 35 – Voltamograma registrado “in-situ” em uma laranja utilizando microeletrodo de platina. Velocidade de varredura: 50 mV s-1. Imagem da posição do eletrodo na laranja na foto acima. Estudos posteriores foram realizados para investigar a influência da queda

ôhmica sobre as medidas voltamétricas. Para isso, experimentos foram realizados

alterando a posição do eletrodo de referência em relação ao microeletrodo de platina. A


resistência entre as diferentes posições da laranja foi medida utilizando-se um

multímetro, e observou-se um aumento da resistência com o aumento da distância entre

os eletrodos, Tabela 5. Entretanto, os valores de corrente limite e E1/2 obtidos pelos

registros voltamétricos confirmaram que alterações na resistência não alteravam

significativamente os valores de IL e E1/2. Esse fato já era esperado, uma vez que os

efeitos de queda ôhmica são reduzidos em microeletrodos. Entretanto, as medidas

realizadas “in-situ” na fruta foram feitas pela inserção do eletrodo de trabalho e

referência bem próximos (1 mm).

Tabela 5 – Medidas de resistência, E1/2 e IL em diferentes posições do

microeletrodo e do eletrodo de referência inseridos na laranja.

Distância entre os eletrodos

na laranja

/ mm

Resistência

/ kΩ

E1/2*

/ mV

IL*

/ nA

1,0 25.2 (431 ± 9) (29,0 ± 0,9) 10,0 37,2 (438 ± 8) (27,5 ± 0,7)

19,0 48,2 (436 ± 8) (28,7 ± 0,8)

33,2 55,6 (437 ± 9) (27,3 ± 0,8)

57,0 76,2 (436 ± 8) (28,0 ± 0,8)

*As medidas foram realizadas em triplicata

Estudo de estabilidade do sensor foi realizado registrando-se 150 voltamogramas

consecutivos na laranja. O desvio padrão calculado para os valores de corrente limite foi

de 3 %, reiterando assim a ausência de eventuais problemas associados ao

envenenamento da superfície eletródica pela matriz.

A análise dos valores de E1/2 dos registros voltamétricos em diferentes laranjas

poderia fornecer informações sobre o estado de maturação da fruta. Valores de E1/2 de

370 mV e 465 mV foram obtidos para uma laranja madura e não madura,


respectivamente. Com o intuito de comparar as medidas, os experimentos foram

realizados inserindo-se o conjunto de eletrodos na mesma posição em ambas as frutas.

Levando em consideração que os valores de E1/2 são dependentes do pH para o processo

de oxidação do ácido ascórbico, pode utilizar os valores de E1/2 da Figura 32 para

converter os valores de potencial em pH. Dessa forma, os valores de pH para a fruta

madura e não madura foram respectivamente 5,9 e 4,7, indicando que a fruta madura é

menos ácida que a não madura.

Os valores de corrente de estado estacionário registrados em diferentes

concentrações de ácido ascórbico apresentaram uma dependência linear com a

concentração da espécie eletroativa na faixa de 1 a 10 mmol L-1 (I/10-7 A = 0,015 +

0,208 C/mmol L-1, coeficiente de correlação = 0,9995). Essa dependência linear da

corrente com a concentração foi utilizada para monitorar a concentração do ácido

ascórbico nas diferentes regiões da fruta.

A Figura 36 mostra a distribuição de ácido ascórbico em laranjas com diferentes

estágios de maturação. As medidas foram realizadas em triplicata e com

aproximadamente 5 mm de profundidade na laranja. O tipo do corte realizado na laranja

está ilustrado na Figura 36. Experimento similar foi realizado em duas outras laranjas,

mas nesses casos mudou-se o tipo do corte (Figura 37). A análise dos resultados das

Figura 36 e 37, leva às seguintes conclusões:


Figura 36 – Representação bidimensional da corrente limite em voltamogramas registrados a 50 mV s-1 com microeletrodos de platina em função da posição do sensor na escala XY representada. A e B representam os gráficos bidimensionais para a fruta não madura e madura, respectivamente.


Figura 37 – Representação bidimensional da corrente limite em voltamogramas registrados a 50 mV s-1 com microeletrodos de platina em função da posição do sensor na escala XZ representada. A e B representam os gráficos bidimensionais para a fruta não madura e madura, respectivamente. 1. Os resultados indicam um decréscimo na concentração de ácido ascórbico da casca

para o centro da fruta. Esta observação vai ao encontro de estudos descritos na literatura

(Paul e Southgate, 1978), os quais demonstram que a concentração de ácido ascórbico

em maçãs e laranjas é maior nas proximidades da casca (Paul e Southgate, 1978). Uma

possível justificativa para explicar esse fenômeno deve-se ao fato de as células mais

jovens, capazes de produzir ácido ascórbico, estarem localizadas próximo da casca

(Bain, 1992). A Figura 37 mostra também que a concentração de ácido ascórbico é

menor próximo do pedúnculo da fruta (parte superior da fruta, Figura 37). Esse


resultado também foi observado em batatas (Han, Kozukue et al., 2004) e laranjas (De

Andrade, Diniz et al., 2002), entretanto, nenhuma justificativa para esse perfil de

concentração foi encontrada.

2. Uma diferença significativa nos valores de concentração de ácido ascórbico é

observada quando se comparam frutas em diferentes estágios de maturação. Na

literatura existe certo desentendimento sobre esse tópico (Davey, Van Montagu et al.,

2000). Entretanto, os resultados das Figura 36 e 37 confirmam uma estreita correlação

entre a quantidade de ácido ascórbico e o estágio de maturação da fruta. Esse resultado

demonstra o potencial deste tipo de sensor para o monitoramento do estágio de

maturação das frutas.

A quantidade de ácido ascórbico em outras frutas também foi avaliada utilizando

o microeletrodo "in-situ" na fruta. Na goiaba, Figura 38, o inverso foi observado com

relação à distribuição de ácido ascórbico no interior da fruta, contudo, até o momento

não foram encontradas informações que pudessem esclarecer esse fenômeno.

Adicionalmente, nota-se que a goiaba apresenta uma maior concentração de ácido

ascórbico que a laranja ao se comparar os valores de corrente entre as duas frutas.

Obviamente estas conclusões preliminares não levam em conta aspectos importantes

como a diferença na difusão do material eletroativo nas duas matrizes. Os resultados

para os valores de corrente limite obtidos em diferentes frutas são reportados na Tabela

6, além dos valores para a concentração de ácido ascórbico. Os maiores valores de

corrente foram encontrados para a goiaba. A partir da curva de calibração apresentada

anteriormente pode-se converter os valores de corrente limite em concentração na

laranja. Para isso, utilizou-se o valor de densidade de uma laranja 11.8ºBrix (Ramos e


Ibarz, 1998) que é 1,044 g cm-3. Esse valor foi necessário para converter os valores de

concentração para mg de ácido ascórbico por 100 g de laranja. Nota-se que os

resultados obtidos estão de acordo com os reportados na literatura (Paul e Southgate,

1978; Haag, Gutierrez et al., 1993).

0,0 0,2 0,4 0,6 0,8 1,0-10

0

10

20

30

40

50

60

70

B

A

I / n

A

E / V vs Ag/AgCl

Figura 38 – Voltamogramas lineares registrados “in-situ” em uma goiaba: no centro (A) e próximo à casca (B). Microeletrodo utilizado: platina e velocidade de varredura de 50 mV s-1.


Tabela 6 – Valores de corrente limite e concentração obtidos com o microeletrodo

de Pt em diferentes frutas.

Fruta Corrente Limite “In-situ”

/ nA

Concentração / mg (100 g)-1

Laranja: 1 2 3 4 5

36,5 31,5 30,2 70,0 22,2

32,3 27,9 26,7 61,9 19,6

Tomate 5,2 - Goiaba 58,5 -

Valores da literatura para concentração de ácido ascórbico em diferentes frutas (Paul e Southgate, 1978; Haag, Gutierrez et al., 1993): Laranja: 30 – 90, tomate: 17 e goiaba: 100 – 430 mg (100 g)-1

Para verificar a exatidão da metodologia, a concentração de ácido ascórbico foi

determinada pelo método proposto e comparada pelo método coulométrico (Paixão,

Matos et al., 2003). Boa concordância entre os resultados obtidos pelo método proposto

(30.9 ± 0.9 mg de ácido ascórbico/ 100 g de suco de laranja) e pelo método

coulométrico (29 ± 1 mg de ácido ascórbico/ 100 g de suco de laranja) foi obtida,

reiterando a possibilidade de utilização do método proposto para o monitoramento de

ácido ascórbico em amostras de laranja.

4.2.2. Quantificação de iodato em sal utilizando matriz de microeletrodos (MEA)

Nosso grupo de pesquisa já havia utilizado microeletrodos para a determinação

de nitrito em amostras de saliva e de águas naturais usando um método indireto baseado

na oxidação química de iodeto em meio ácido e posterior monitoramento eletroquímico

do triiodeto formado (Bertotti e Pletcher, 1997; Mori e Bertotti, 1998). Método

semelhante foi desenvolvido nessa tese para o monitoramento de iodato em amostras de

sal de cozinha. Iodato oxida iodeto, segundo a seguinte reação:


IO3- + 8 I- + 6 H+ 3 I3

- + 3 H2O (9)

A Figura 39 mostra resultados amperométricos da adição de iodato a 200 μL de

solução de iodeto 0,1 mol L-1 na superfície do MEA polarizado a 0 V vs Ag/AgCl.

Durante injeções de soluções de iodato em duas diferentes regiões do MEA, ver Figura

38, nota-se uma mudança no perfil da corrente registrado no experimento. Picos mais

pronunciados são observados quando a injeção é realizada sobre os eletrodos (b),

provavelmente devido a uma maior quantidade de triiodeto disponível na superfície da

matriz de microeletrodos. Contudo, a corrente de estado estacionário é a mesma,

independentemente da posição em que a adição foi feita. Na Figura 39 apresenta-se a

curva analítica obtida, que demonstra a linearidade da resposta do sensor com a

concentração de iodato adicionado.


bb

aa

1 μA

B

A

0,00 0,02 0,04 0,06 0,08 0,10 0,120,0

0,4

0,8

1,2

CIO3- / mmol L-1

- I / μA

Figura 39 – Sinais amperométricos registrados pela injeção de 5 μL de amostra de iodato 1 mmol L-1 à solução de trabalho (200 μL) colocada sobre o MEA (I- 100 mmol L-1 + H2SO4 1 mmol L-1. Alíquotas foram injetadas em duas diferentes regiões: região periférica (a) e na região central (b). No quadro apresenta-se a curva de calibração obtida usando as correntes de estado estacionário.

b

a


O procedimento descrito anteriormente foi utilizado para a quantificação de

iodato em amostras de sal de cozinha, que contêm iodato para combater o

hipotireodismo. Devido à alta quantidade de NaCl na amostra, a curva de calibração foi

preparada na presença de NaCl 3 mol L-1 + KI 0,1 mol L-1. O resultado obtido para uma

amostra de sal comercial foi de (45 ± 3) mg de iodato / kg de sal, o que está de acordo

com a legislação brasileira (40 a 100 mg de iodato / kg de sal).

4.3. Estudo do comportamento eletroquímico de constituintes do DNA

Inicialmente o comportamento eletroquímico da base guanina livre e do

respectivo nucleosídeo e nucleotídeo foram avaliados utilizando eletrodo de carbono

vítreo de tamanho convencional, Figura 40.

0,2 0,4 0,6 0,8 1,0 1,2 1,4

I = 0

I = 0I = 0I = 0 d

cb

a

E / V vs Ag/AgCl

3 μA

Figura 40 – Voltamogramas de pulso diferencial registrados em tampão fosfato (d) na presença de guanina 0,2 mmol L-1 + dG 0,5 mmol L-1 (a), dGMP 0,5 mmol L-1 (b), dG 0,5 mmol L-1 (c). Pré-tratamento da superfície em +1,4 V por 180 s, antes dos registros voltamétricos. Amplitude do pulso: 50 mV, largura do pulso: 50 ms e velocidade de varredura 25 mV s-1. Eletrodo: Carbono vítreo.


Nota-se a partir da Figura 40a que a base livre apresenta um potencial de

oxidação menos positivo (0,63 V) do que o seu respectivo nucleotídeo (Figura 40b) e

nucleosídeo (Figura 40c) (0,86 V). Essa estabilidade deve-se à adição da ose à base livre

(Dryhurst, 1971; 1972). Entretanto, nota-se que a adição de fosfato à dG para formação

da desoxiguanosina-5'-monofosfato (dGMP) não altera o potencial de pico em relação

ao nucleosídeo. O potencial de pré-tratamento de +1,4V foi utilizado para aumentar o

sinal analítico devido à adsorção dos analitos na superfície do eletrodo, como reportado

na literatura (Brett, Brett et al., 1994; Wang, Cai et al., 1998). O sinal de corrente não

aumenta bruscamente após a adição de guanina (Figura 40a) (a partir de 1,0 V) quando

compara-se com os outros 3 voltamogramas. Tal fato se deve à formação de um filme

proveniente da guanina durante o potencial de pré-tratamento aplicado, já reportado na

literatura (Da Silva e Serrano, 2003).

O DNA apresenta corrente de pico referente ao processo de oxidação da guanina

em potencial semelhante ao do seu respectivo nucleosídeo (De-Los-Santos-Alvarez,

Lobo-Castanon et al., 2004). Dessa forma, os estudos subseqüentes serão realizados

utilizando a dG (desoxiguanosina) como precursor e/ou avaliador do dano no DNA.

Como reportado anteriormente, o ataque do agente mutagênico formado na

peroxidação lipídica ocasiona a adição de dois carbonos no anel da base nitrogenada

(guanina) da dG, ver Figura 41. Esse tipo de ataque pode ser simulado a partir da

incubação da dG com cloroacetaldeído. Assim, avaliou-se o progresso da degradação da

dG com cloroacetaldeído durante o período de 19 horas, Figura 41.


Cl

O

NOOH

OH

N

NHN

NH2

O

NOOH

OH

N

NN

NH

O

OH2

ClH

+

0,4 0,8 1,2 1,6

d

c

ba

E / V vs Ag/AgCl

4 μA

Figura 41 – Reação do cloroacetaldeído com a dG e voltamogramas de pulso diferencial registrados em tampão fosfato pH = 7,2 (a) contendo dG 0,4 mmol L-1 (b) e dG 0,4 mmol L-1 + cloroacetaldeído 60 mmol L-1 (c). Monitorou-se o progresso da reação após 19 horas (d) de incubação com cloroacetaldeído a 37ºC. Pré-tratamento da superfície do eletrodo em +1,4 V por 180 s, antes dos registros voltamétricos. Amplitude do pulso: 50 mV, largura do pulso: 50 ms e velocidade de varredura 25 mV s-1. Eletrodo: Carbono vítreo.

Na Figura 41 pode-se observar que o cloroacetaldeído não é eletroativo na janela

de potencial estudada (comparar curvas b e c), conseqüentemente os compostos

formados durante o período de incubação são provenientes da reação do

cloroacetaldeído com a dG. Após 19 horas de incubação nota-se o desaparecimento do


pico referente ao processo de oxidação da dG sobre a superfície do eletrodo de carbono

vítreo e o aparecimento de um processo faradaico na região de 1,2 V.

Com o intuito de confirmar que o pico em 1,2 V refere-se ao processo de

oxidação do eteno aduto, utilizou-se uma solução padrão de eteno aduto purificada por

HPLC, após o processo de síntese com cloroacetaldeido. A Figura 42 mostra adições

sucessivas de eteno aduto a uma solução de tampão fosfato pH = 7,2.

0,4 0,8 1,2 1,60

4

8

12

16

20

I / μ

A

E / V vs Ag/AgCl

0,0 0,2 0,4 0,6 0,8 1,00

2

4

6

8

I / μ

A

Ceteno / mmol L-1

Figura 42 – Voltamogramas de pulso diferencial registrados para adições sucessivas de eteno aduto em tampão fosfato pH = 7,2. Pré-tratamento da superfície em +1,4 V por 180 s, antes dos registros voltamétricos. Amplitude do pulso: 50 mV, largura do pulso: 50 ms e velocidade de varredura 25 mV s-1. Eletrodo: Carbono vítreo.

A regressão linear da curva de calibração resultou em uma equação da reta cuja

expressão é I/µA = 0,027 + 9,27(C/mmol L-1) e faixa linear até 0,8 mmol L-1. Os limites

de detecção (3σ/S) e quantificação (10σ/S) foram respectivamente 25 e 83 µmol L-1. O

desvio de linearidade pode ser resultante de algum processo de adsorção na superfície

do eletrodo.


Nota-se que a adição de 2 carbonos, para formação do eteno aduto (ver Figura

40), no anel da guanina estabiliza ainda mais a dG, deslocando o potencial de oxidação

da mesma para 1,24 V em relação aos 0,86 V obtidos para a dG. Estes resultados são

concordantes com os obtidos no experimento de incubação da dG com cloroacetaldeido

(Figura 41). Entretanto, estudos sobre a formação de eteno adutos durante a peroxidação

lipídica realizados na literatura (Medeiros, Carvalho et al., 1995; Loureiro, Di Mascio et

al., 2002) mostram a formação de outros compostos, ver esquema 1 e Figura 43. Tal

fato pode inviabilizar a detecção desse tipo de lesão sem algum método de separação

prévia, pois não se sabe se os outros compostos formados são eletroativos nesta faixa de

potencial. Desta forma, uma possível maneira de detectar esse tipo de lesão consiste na

avaliação do sinal da dG, uma vez que este varia com o tempo como mostrado na Figura

41 ou ainda, como reportado na introdução, no caso de dh-DNA, com o monitoramento

do aparecimento dos sítios de guanina na estrutura do DNA.


Figura 43 – Reação paralela que pode ocorrer na formação do etenoaduto na célula.

OH

OH

HO

OCH3+

aduto

1, N2 -eteno - 2' - desoxiguanosina

NOOH

OH

N

NHN

NH2

O

OH

O

NOOH

OH

N

NHN

NH

O R

HOH

O

NOOH

OH

N

NN

NH

O R

NOOH

OH

N

NN

NH

O

OH

OH

NOOH

OH

N

NN

NH

O

CH3

OH

OH

O

NOOH

OH

N

NN

NH

O

CH3

OH2

OH2

O

HR

aduto 2


4.4. Modificação da superfície do eletrodo

Conforme reportado na literatura, o processo eletródico referente à dh-DNA

apresenta sinais faradaicos não muito pronunciados devido à estrutura do DNA.

Necessita-se, portanto, de estratégias para que o sinal seja amplificado. Essa etapa do

tese consistiu na obtenção de uma superfície modificada que apresentasse tais

propriedades eletrocatalíticas. Filmes de metais de transição hexacianoferrato (Koncki,

2002; De Tacconi, Rajeshwar et al., 2003; Ricci e Palleschi, 2005) com a seguinte

composição AhMk[Fe(CN)6]l.mH2O (h,k,l,m = coeficientes estequiométricos, A = metal

alcalino, M = metal de transição) foram testados. Esse tipo de filme vem sendo estudado

por apresentar características interessantes como propriedades eletrocatalíticas,

eletrocrômicas, troca iônica, sensibilidade a íons e fotomagnetismo (Abbaspour e

Mehrgardi, 2004). Entretanto, o estudo das propriedades eletrocatalíticas para o

monitoramento de bases nucleicas, nucleotídeos e nucleosídeos ainda é pouco

observado na literatura (Abbaspour e Mehrgardi, 2004).

Com o intuito de verificar as propriedades eletrocatalíticas de alguns filmes de

metal hexacianoferrato, diferentes tipos de filmes foram depositados em eletrodos de

carbono vítreo e avaliados frente ao processo de oxidação anódica da dG. Foram estes

cobalto, índio e rutênio hexacianoferrato, respectivamente, CoHCF, InHCF e RuHCF.

Inicialmente estudou-se o filme de CoHCF. O filme foi eletrodepositado

utilizando solução contendo CoCl2 e K3Fe(CN)6 em meio contendo 0,5 mol L-1 de

NaCl. A Figura 44 representa os voltamogramas cíclicos registrados durante a formação

do filme de CoHCF.


-0,2 0,0 0,2 0,4 0,6 0,8 1,0

-60

-30

0

30

60

90

I / μ

A

E / V vs Ag/AgCl

Figura 44 – Voltamogramas cíclicos registrados durante o processo de modificação da superfície de carbono vítreo com CoHCF em solução contendo K3Fe(CN)6 1,0 mmol L-1 + CoCl2 1 mmol L-1 + NaCl 0,5 mol L-1. Velocidade de varredura: 100 mV s-1. Área do eletrodo: 0,0707 cm2. Número de ciclos: 15.

Nota-se que a cada ciclo de potencial o sinal de corrente aumenta, indicando a

formação de um filme depositado na superfície do eletrodo. O processo de formação do

filme em eletrólito contendo Na+ pode ser explicado pelas equações abaixo (Abbaspour

e Mehrgardi, 2004):

FeIII(CN)63- + e- FeII(CN)6

4- (10)

Co2+ + FeII(CN)64- + 2Na+ → Na2CoII[FeII(CN)6] (11)

Após o processo de modificação da superfície do eletrodo, a verificação da

estabilidade do filme foi efetuada em eletrólito suporte por mais 15 ciclos, Figura 45.


-0,2 0,0 0,2 0,4 0,6 0,8 1,0

-60

-30

0

30

60

I / μ

A

E / V vs Ag/AgCl

Figura 45 – Verificação da estabilidade do filme de CoHCF em NaCl 0,5 mol L-1. Velocidade de varredura: 100 mV s-1. Área do eletrodo: 0,0707 cm2.

O voltamograma cíclico exibe um pico referente a um processo reversível, com

potencial formal (Eº’ = |Ep,a + Ep,c|/2) igual a 0,44 V, que pode ser atribuído à

transformação entre o Fe(II) e Fe(III) no filme de CoHCF (Gao, Wang et al., 1991; Gao,

Bobacka et al., 1993), ou melhor Na2Co(II)Fe(II)(CN)6/Na2Co(II)Fe(III)(CN)6.

Nota-se uma queda significativa do sinal de corrente quando investigada a

estabilidade do eletrodo modificado, comparado-se o primeiro e o último ciclo dos

experimentos voltamétricos (25%). Cataldi e colaboradores (Cataldi, De Benedetto et

al., 1999) reportam essa falta de estabilidade de filmes de CoHCF e demonstram que

problemas de repetibilidade do sinais analíticos foram encontrados utilizando esse tipo

de modificação da superfície eletródica.

Outro tipo de modificação realizada foi utilizando In3+ como metal de transição

para formação do filme de metal hexacianoferrato (MHCF), Figuras 46 e 47,

respectivamente, modificação e verificação da estabilidade.


0,0 0,2 0,4 0,6 0,8 1,0

-15

0

15

30

I / μ

A

E / V vs Ag/AgCl

Figura 46 – Voltamogramas cíclicos registrados durante o processo de modificação da superfície de carbono vítreo com InHCF em solução contendo InCl3 1 mmol L-1 + K3Fe(CN)6 1 mmol L-1 + NaCl 0,5 mol L-1 + HCl 0,01 mol L-1. Velocidade de varredura: 100 mV s-1. Área do eletrodo: 0,0707 cm2. Número de ciclos: 25.

O processo de formação do filme de InHCF em eletrólito contendo Na+ pode ser

explicado pelas equações abaixo:


4- (12)

In3+ + FeII(CN)64- + Na+ → NaInIII[FeII(CN)6] (13)


0,0 0,2 0,4 0,6 0,8 1,0

-15

0

15

30

I / μ

A

E / V vs Ag/AgCl

Figura 47 – Verificação da estabilidade do filme de InHCF em NaCl 0,5 mol L-1 + HCl 0,01 mol L-1. Velocidade de varredura: 100 mV s-1. Área do eletrodo: 0,0707 cm2.

O voltamograma cíclico exibe um pico referente a um processo reversível, com

potencial formal igual a 0,85 V, devido ao par redox Fe(II)/Fe(III) confinado no filme

de InHCF (Cataldi, De Benedetto et al., 1998).

A estabilidade do filme foi estudada e pode ser observada na Figura 47. Nota-se

uma queda menos significativa (8 %) de sinal de corrente (comparando o primeiro e

últimos ciclos) quando compara-se com os filmes de CoHCF.

Filmes de RuHCF também foram eletrodepositados na superfície do carbono

vítreo, Figura 48. A Figura 49 representa a avaliação da estabilidade do filme.


-0,4 0,0 0,4 0,8 1,2

-120

-80

-40

0

40

80

I / μ

A

E / V vs Ag/AgCl

Figura 48 – Voltamogramas cíclicos registrados durante o processo de modificação da superfície de carbono vítreo com RuHCF em solução contendo RuCl3 1 mmol L-

1 + K3Fe(CN)6 1 mmol L-1 + NaCl 0,5 mol L-1 + HCl 0,05 mol L-1. Velocidade de varredura: 100 mV s-1. Área do eletrodo: 0,0707 cm2. Número de ciclos: 60.

O processo de formação do filme de RuHCF é um pouco diferente dos anteriores

e foi proposto por Chen e colaboradores (Chen, Lu et al., 2005) como sendo:

Ru3+ Ru4+ + e- (14)

Ru4+ + 4OH- → RuIVO2 + 2H2O (15)

RuIVO2 + FeIII(CN)63- + 3H+ → RuIVOH/FeIII(CN)6

3- + H2O (16)


4- (17)

Ru3+ + FeII(CN)64- + Na+ → NaRuIII[FeII(CN)6] (18)


0,0 0,6 1,2

-120

-80

-40

0

40

80

I / μ

A

E / V vs Ag/AgCl

Figura 49 – Verificação da estabilidade do filme de RuHCF em NaCl 0,5 mol L-1 + HCl 0,05 mol L-1. Velocidade de varredura: 100 mV s-1. Área do eletrodo: 0,0707 cm2.

Quatro pares redox podem ser observados no voltamograma, Figura 49, com

potenciais formais de -0,03, 0,83, 0,93 e 1,13 V. Esses processos são atribuídos na

literatura (Chen, Lu et al., 2005) aos seguintes pares redox [Ru(II)-O/Fe(II)-CN/Ru(III)-

O/Fe(II)-CN], [Ru(III)-NC-Fe(II)-CN/ Ru(III)-NC-Fe(III)-CN], [Ru(III)-O/Fe(II)-

CN/Ru(III)-O/Fe(III)-CN] e [Ru(III)-O/Fe(II)-CN/Ru(IV)-O/Fe(II)-CN] (Chen, Lu et

al., 2005).

Dessa forma podem ser propostas as seguintes reações eletródicas do filme de

RuHCF em eletrólito contendo Na+:

Na4RuIIO[FeII(CN)6] Na3RuIIIO[FeII(CN)6] + Na+ + e- (19)

Na2RuIII[FeII(CN)6] NaRuIII[FeIII(CN)6] + Na+ + e- (20)

Na3RuIIIO[FeII(CN)6] Na2RuIII[FeIII(CN)6] + Na+ + e- (21)


Na2RuIII[FeIII(CN)6] NaRuIV[FeIII(CN)6] + Na+ + e- (22)

A estabilidade do filme foi estudada e encontrou-se um valor menor do que 8 %,

valor obtido para eletrodos modificados com filmes de InHCF. Esse aumento de

estabilidade foi reportado por Cataldi e colaboradores após a incorporação de Ru em

filmes de CoHCF e InHCF e foi atribuído à inclusão de espécie Ru-O- na estrutura dos

filmes, conduzindo à formação de compostos binucleares via ligações de oxigênio

(Cataldi e De Benedetto, 1998; Cataldi, De Benedetto et al., 1999).

A Figura 50 mostra os sinais analíticos obtidos na presença e ausência de dG

para cada um dos eletrodos modificados. Todos os filmes foram preparados sob as

mesmas condições de ciclagem e área do eletrodo de carbono vítreo.

Figura 50 – Voltamogramas cíclicos registrados em carbono vítreo (A), e eletrodos contendo filmes de CoHCF (B), RuHCF (C) e InHCF (D) na presença (−−−) e ausência (- - -) de 1 mmol L-1 de dG. Velocidade de varredura: 100 mV s-1. Eletrólito suporte: ver respectiva modificação para cada eletrodo. Modificação realizada utilizando 15 ciclos.


Comparando-se os diferentes tipos de filmes estudados, nota-se que somente o

filme de RuHCF apresenta propriedades eletrocatalíticas para o processo de oxidação da

dG, demonstrando assim a necessidade da existência do rutênio, na estrutura do filme.

Além disso, pode ser observado um aumento significativo do sinal de corrente na

presença de dG, quando comparado com o sinal obtido na superfície limpa do eletrodo

de carbono vítreo. Dessa forma, elegeu-se o filme de RuHCF para os futuros estudos

sobre a dG.

Vale salientar que a utilização desse filme em métodos analíticos foi pouco

explorada e o primeiro trabalho reportando aplicação analítica e procedimento de

fabricação do filme é de 2003 (Shaidarova, Ziganshina et al., 2003). Neste trabalho os

autores reportam metodologia analítica para a quantificação de cisteína, metionina e

cistina. Além disso, somente mais recentemente esse tipo de filme foi estudado (Chen,

Lu et al., 2005) e o comportamento de algumas espécies eletroativas foi reportado

(dopamina, epinefrina, norepinefrina, ácido ascórbico, etanol e isopropanol). Dessa

forma, o estudo do processo de oxidação da dG sobre superfícies recobertas com filmes

de RuHCF torna-se bastante atraente e promissor.

4.5. Estudo das propriedades eletroquímicas do filme de RuHCF

Inicialmente estudos de microscopia e espectrometria de energia dispersiva de

raio-X foram realizados para verificar o morfologia e composição do filme,

respectivamente, Figura 51.


Figure 51 – Imagens de microscopia eletrônica de varredura da superfície do carbono vítreo (A) e modificada com o filme de RuHCF. Espectros utilizando espectroscopia de difração de raio-X para uma superfície modificada com filmes de RuHCF (Γ = 7,80 x 10-9 mol cm-2)(- - -) e FeHCF (Γ = 2,21 x 10-8 mol cm-2)(⎯).

Comparando-se os espectros de difração de raio-X, nota-se no filme de RuHCF a

presença de um pico de oxigênio que não é observado no filme de FeHCF. Dessa forma,

pode-se dizer que o filme de RuHCF apresenta oxigênio em sua composição. Com isso,

o filme de RuHCF passou a ser nomeado como óxido de rutênio(III) hexacianoferrato

(RuOHCF). Cataldi e colocaboradores (Cataldi e De Benedetto, 1998; Cataldi, De

Benedetto et al., 1999) demonstraram que filmes de CoHCF com Ru incorporado

apresentam uma maior estabilidade devido à formação de ligações Ru-O-Fe no filme,

corroborando assim os resultados aqui apresentados.

O efeito da velocidade de varredura no comportamento eletroquímico do filme

de RuOHCF foi estudado conforme mostra-se na Figura 52.

Energia / keV


-0,4 0,0 0,4 0,8 1,2

-80

-60

-40

-20

0

20

40

60

I / μ

A

E / V vs Ag/AgCl

0,00 0,05 0,100

20

40

60

I / μ

A

v / V s-1

Figura 52 – Voltamogramas cíclicos do eletrodo modificado com filme de RuOHCF em diferentes velocidades de varredura em eletrólito suporte 0,5 mol L-1 NaNO3 + 0,01 mol L-1 HCl. Área do eletrodo: 0,0707 cm2. O valor do potencial utilizado para obtenção do gráfico de Ip contra v foi 0,93 V.

A diferença entre os potenciais de pico para todos os quatro processos nas

diferentes velocidades de varredura foi da ordem 11 mV a 50 mV. A Figura 52 mostra

uma relação linear entre a corrente de pico (medida a 0,93 V) e a velocidade de

varredura, ao contrário do que é esperado quando o processo é controlado por difusão

da espécie eletroativa em solução. Esse tipo de comportamento é consistente com o de

eletrodos modificados que apresentam processo redox reversível, indicando assim que a

corrente de pico depende da quantidade de material adsorvido na superfície do eletrodo.

A relação entre a corrente de pico e a velocidade de varredura pode ser expressa pela

seguinte equação (Chen, Lu et al., 2005):

Ip = n2F2vaΓ/4RT (23),


onde Γ, v, a e Ip representam o excesso superficial, a velocidade de varredura, área do

eletrodo e corrente de pico, respectivamente. Estes estudos voltamétricos em diferentes

velocidade de varredura mostraram uma separação entre os picos do par Ru(II)/Ru(III)

próxima de zero, o que indica rápida propagação de carga. Estudos

cronoamperométricos em eletrólito suporte foram realizados para sustentar os resultados

dos estudos voltamétricos. A Figura 53 mostra a relação entre corrente e t-1/2 para filmes

de diferentes espessuras.

Figura 53 – Estudos cronoamperométricos para o eletrodo modificado com RuOHCF em diferentes valores de Γ: 1,81 (a), 4,47 (b) e 7,80 mol cm-2 (c). Degrau de potencial de 0,0 a 1,2 V em solução contendo NaNO3 0,5 mol L-1 + HCl 0,05 mol L-1. A linha tracejada corresponde à regressão linear dos dados coletados na região de tempos curtos.

Para tempos de experimento muito curtos o transporte de carga é proporcional a

(Dctt)1/2 de acordo com o modelo descrito pela equação de Cottrell, conforme

demonstra-se pelo gráfico de I versus t-1/2 na Figura 53. Entretanto, para tempos longos

ocorre um desvio da linearidade provavelmente porque a espessura da camada de


difusão relativa à propagação de elétrons torna-se comparável à do filme, observando-se

um comportamento difusional similar ao de células delgadas (do inglês, “thin-layer

cells”). Para filmes com um excesso superficial de 1,81, 4,47 e 7,80 mol cm-2

encontraram-se valores de Dct que variaram entre 2,7 x 10-11 e 1,9 x 10-11 cm2 s-1,

respectivamente (Tabela 7).

Tabela 7 – Valores de Dct1/2, b0 e Dct para diferentes valores de Γ e L (Espessura,

medida por elipsometria).

Γ x 109

/ mol cm-2

Espessura x

106

/ cm

bo x 103

/ mol cm-3

Dct1/2bo x 109

/ mol cm-2 s-1/2

Dct x 1011

/ cm2 s-1

1,81 3,95 0,458 2,37 2,69

4,47 5,99 0,746 3,89 2,72

7,80 7,17 1,09 4,73 1,89

Equação de Cottrell: 2/12/1

2/10

tDnFAbI ct

t π=

Esse pequeno decréscimo nos valores de Dct com a espessura pode ser explicado

pela dificuldade de compensação de carga pela difusão do contra-íon em filmes mais

espessos. Entretanto, esses resultados demonstram uma clara evidência de que não há

um limitação da etapa cinética devido ao transporte de carga no filme de RuOHCF. De

maneira a obter um resultado numérico que pudesse confirmar esse resultado, utilizou-

se a espessura do filme (calculada por experimentos elipsométricos) e os valores de Dct

da Tabela 7. De posse desses valores e utilizando a equação 24, a qual representa o

tempo para que os centros de Ru(III) incorporados no filme possam ser completamente

oxidados (Hogan e Forster, 1999),


ctDLtπ

2

= (24)

pode-se calcular para, por exemplo, o filme preparado com o excesso superficial de 1,81

x 10-9 mol cm-2, o tempo de 185 ms, demonstrando que o transporte de carga no filme

de RuOHCF é rápido.

4.6. Estudo da Oxidação eletrocatalítica da dG na superfície do eletrodo

modificado de RuOHCF.

Para investigar com mais profundidade o processo de oxidação eletrocatalítica

da dG na superfície do eletrodo modificado de RuOHCF utilizou-se voltametria com

eletrodo rotativo variando-se a velocidade de rotação do eletrodo e a espessura do filme.

A quantidade de material na superfície eletródica foi calculada utilizando a lei de

faraday (Γ = Q/nFa), onde Q representa a carga sobre o registro voltamétrico, C/mol, Γ

o excesso superficial, mol cm2, n o número de elétrons, F a constante de Faraday e a,

área do eletrodo, 0,9898 cm2. As Figura de 54 a 59 representam os estudos realizados

utilizando o eletrodo de rotativo de disco, variando-se a velocidade de rotação e

espessura do filme.


Figura 54 – Voltamogramas hidrodinâmicos em solução contendo dG 1 mmol L-1 + NaNO3 0,5 mol L-1 + HCl 0,05 mol L-1, utilizando eletrodo rotativo de carbono vítreo modificado com RuOHCF (Γ = 8,12 x 10-10 mol cm2) a diferentes velocidades de rotação: 100 (A), 400 (B), 900 (C), 1600 (D) e 2500 (E). Velocidade de varredura: 20 mV s-1. O quadro inserido na figura representa o gráfico de Koutecký-Levich para correntes medidas em diferentes potenciais, obtidos a partir do registro voltamétrico em potenciais: 1,15, 1,18, 1,20 e 1,25 V.


Figura 55 – Voltamogramas hidrodinâmicos em solução contendo dG 1 mmol L-1 + NaNO3 0,5 mol L-1 + HCl 0,05 mol L-1, utilizando eletrodo rotativo de carbono vítreo modificado com RuOHCF (Γ = 9,56 x 10-10 mol cm2) a diferentes velocidades de rotação: 100 (A), 400 (B), 900 (C), 1600 (D) e 2500 (E). Velocidade de varredura: 20 mV s-1. O quadro inserido na figura representa o gráfico de Koutecký-Levich para correntes medidas em diferentes potenciais, obtidos a partir do registro voltamétrico em diferentes potenciais: 1,15, 1,18, 1,20 e 1,25 V.


0 4 8 12 160,0

0,2

0,4

0,6

I / m

A

ω1/2 / (rad s-1)1/2

Figura 59 – Gráfico de IL vs ω1/2 em solução contendo dG 1 mmol L-1 + NaNO3 0,5 mol L-1 + HCl 0,05 mol L-1 utilizando eletrodo rotativo de carbono vítreo modificado com RuOHCF a diferentes velocidades de rotação utilizando diferentes valores de excesso superficial: 8,12 x 10-10, 9,55 x 10-10, 10,3 x 10-10, 11,9 x 10-10, 16,8 x 10-10 mol cm2 . Velocidade de varredura: 20 mV s-1.

Nota-se que com o aumento da velocidade de rotação e da espessura do filme

(Figura 59), o valor de corrente limite para o processo de oxidação da dG na superfície

do eletrodo aumenta. Esse resultado indica que problemas referentes à difusão de

elétrons no filme e do substrato no filme e em solução não são as etapas determinantes

do processo eletródico. A altas velocidades de rotação nota-se um desvio da linearidade

nas diferentes superfícies modificadas, indicando a existência de um problema cinético

acoplado ao processo de transferência eletrônica. Essa etapa determinante do processo

eletródico pode estar relacionada com a reação entre os sítios catalíticos do filme e o

substrato.


A equação de Koutecký-Levich (Bard e Faulkner, 2000) correlaciona a

contribuição dos processos catalítico e difusional na corrente total do processo de

eletrodo, equação 25.

2/16/13/2lim 62,0

1'

11ων ssME cnFaDcnFakI −+= (25)

onde k’ME é constante de velocidade do processo eletroquímico, ((mol L-1)-1 s-1), cs a

concentração do substrato no âmago da solução, mol cm-2 e 0,62nFaD2/3ν-1/6csω1/2 é

dado pela equação de Levich (Bard e Faulkner, 2000). O fato de para todas as

espessuras do filme o gráfico de Koutecký-Levich interceptar o eixo y em um valor

positivo indica que o fator cinético está associado com a reação do material imobilizado

com o substrato. Outra informação que pode ser retirada dos gráficos de Koutecký-

Levich é o fato de a diferentes potenciais dos registros voltamétricos serem obtidas retas

paralelas, indicando que a reação é de primeira ordem para a dG (Pavez, Paez et al.,

2005).

Considerando a teoria de Albery e Hillman (Albery e Hillman, 1984; Ciszewski

e Milczarek, 1999; Vilas-Boas, Pereira et al., 2002), existem 10 casos possíveis para

descrever o processo de mediação em eletrodos modificados, Tabela 8 e esquema 4.

Dessa forma, para investigar como os resultados se adequam a um determinado modelo

é necessário avaliar a ordem (x) do excesso superfícial em relação ao k’ME (k’ME = Γx).

Utilizando os valores de 1/ IL em ω-1/2 = 0, obtidos nos gráficos de Koutecky-Levich e a

equação de Koutecky-Levich representada na equação 25, é possível obter os valores de

k’ME. Com o intuito de investigar o mecanismo do processo eletródico construiu-se um

gráfico de log k’ME em função do excesso superficial, Figura 60.


Tabela 8 – Equações que definem a constante de velocidade de processos

heterogêneos para eletrodos modificados, k’ME e ordem de k’ME contra L (ou Γ) e

concentração (Albery e Hillman, 1984; Ciszewski e Milczarek, 1999; Vilas-Boas,

Pereira et al., 2002).

Caso Expressão para k’ME Ordem de k’ME contra L (ou Γ)

Ordem de k’ME contra cs

Ets LDSPκ -1 0

Ek’E Ek 'κ 0 0

LEts LDSPκ -1 0

LEk

s

cto

ckDbκ

0 -1/2

LRZtets LD

LcbD SP

s

oct κ+ -1 -1

LSte s

oct

LcbD -1 -1

LSk SPoDkbκ 0 0

Ste s

oct

LcbD -1 -1

Sk’ obk ' 0 0

Lk Lkboκ 1 0

As notações definem o local onde a reação ocorre: L, no filme; LE, próximo da interface eletrodo|filme; LS, próximo da interface filme|solução; LRZ, em uma região intermediária do filme; S, na superfície do filme. Os termos em itálico k, k´ e k´E indicam, respectivamente, uma dependência cinética da reação dentro do filme, reação na interface filme|solução, reação na superfície do eletrodo. Os termos subscritos te e ts indicam uma limitação do transporte de carga (ou elétrons) e do substrato, respectivamente. Mais informações ver esquema 4.


Esquema 4. – Modelo e notações para eletrodos modificados. A e B representam

pares redox presentes no filme e Y o analito em solução, que é convertido para Z

após processo eletródico ou processo eletrocatalítico.

-9,05 -9,00 -8,95 -8,90 -8,85 -8,80 -8,75-2,55

-2,50

-2,45

-2,40

-2,35

-2,30

log

(k' M

E / c

m s

-1)

log (Γ / mol cm2)

Figura 60 – Dependência de log k’ME em função do log Γ para processo de oxidação da dG em filmes de RuOHCF. Condições experimentais: 1mmol L-1 de dG, eletrólito suporte: NaNO3 0,5 mol L-1 + HCl 0,05 mol L-1. Excesso superficial variando de 9,55 a 16,8 x 10-10 mol cm-2.

X

Z

X(aq) X

X(aqB +

Z(aq) A +

B

A

X(aq) B +

Z(aq) A +

k k´

Dct

k´E

Filme Solução Eletrodo

DSP e-

e-


O coeficiente angular obtido a partir de gráfico foi de 0,930. Este valor é muito

próximo do valor unitário e condiz com o caso Lk, Tabela 8. De acordo com esse

modelo, a reação ocorre ao longo de todo o filme, indicando uma máxima participação

dos centros catalíticos no processo de mediação e uma livre difusão do substrato no

filme. Conhecido o mecanismo do processo envolvendo a oxidação da dG, pode-se

calcular o valor da constante cinética do processo eletrocatalítico construindo-se um

gráfico de Ik (nFAκkΓcs, κ é o coeficiente de partição do substrato entre o filme e a

solução, usualmente utiliza-se o valor de κ = 1) em função do excesso superficial,

Figura 61.

0 2 4 6 8 10 12 14 160,0

0,2

0,4

0,6

0,8

1,0

I k / m

A

Γ / 10-10 mol cm-2

Figura 61 – Dependência dos valores de corrente, do termo cinético, medidos em ω-

1/2 = 0 em função do excesso superficial. Condições experimentais descritas na Figura 58.

Com o coeficiente angular da Figura 59 e o valor de n = 2 elétrons, calculado a

partir do coeficiente angular dos gráficos de Koutecky-Levich (considerando D = 3,3 x


10-6 cm2 s-1 (Langmaier, Samec et al., 2003) e ν = 0,01 cm2 s-1) pode-se então obter o

valor da constante cinética do processo de oxidação da dG no filme de RuOHCF,

calculado como 3,2 x 103 mol-1 L s-1 .

Para confirmar que a difusão do substrato no filme ocorre sem restrições,

substituiu-se o filme de RuOHCF por um filme de FeHCF, que não apresenta

propriedades eletrocatalíticas para o processo de oxidação da dG. A Figura 62 mostra

voltamogramas para o eletrodo modificado com FeHCF e para o eletrodo de carbono

vítreo na presença e ausência de dG.

-0,8 -0,4 0,0 0,4 0,8 1,2 1,6

B

A

E / V vs Ag/AgCl

Figura 62 – Voltamogramas cíclicos registrados em eletrólito suporte antes (- - -) e após (⎯⎯) adição de dG (concentração final em solução = 2 mmol L-1) utilizando eletrodo de carbono vítreo (A) e eletrodo de carbono vítreo modificado com FeHCF (B) (Γ = 2,21 x 10-8 mol cm-2). Velocidade de varredura: 100 mV s-1. Eletrólito suporte: NaNO3 0,5 mol L-1 + HCl 0,05 mol L-1.

Nota-se que o sinal de corrente obtido no eletrodo limpo para o processo em 1,1

V vs Ag/AgCl é muito próximo do obtido com o eletrodo modificado com FeHCF.

Dessa forma, e considerando que o filme de FeHCF apresenta uma morfologia próxima


ao filme de RuOHCF, pode-se dizer que o substrato difunde livremente no filme de

RuOHCF. Essa informação corrobora os resultados obtidos anteriormente, que indicam

um mecanismo Lk para o processo de mediação do filme de RuOHCF para o processo

de oxidação da dG.

A relação Dctbo/L (3,40 x 10-9 mol cm-2 s-1, para Γ = 1,81 x 10-9 mol cm-2) indica

o fluxo de carga. Esse valor é da mesma ordem de grandeza da relação calculada de

kΓcs (5,80 x 10-9 mol cm-2 s-1, para Γ = 1,81 x 10-9 mol cm-2), que indica o fluxo de

material devido ao processo eletrocatalítico. Caso Dctbo/L << kΓcs, o processo de

mediação ocorre na interface eletrodo|filme. Numa condição oposta, Dctbo/L >> kΓcs, a

reação ocorreria na interface filme|solução. Uma vez que o valor da relação de Dctbo/L é

muito próximo do encontrado pela relação kΓcs, confirma-se mais uma vez que o

processo de mediação ocorre ao longo de todo o filme e utilizando os sítios

eletrocatalíticos da maneira mais eficiente possível.

Levando em consideração que o processo de mediação ocorre ao longo de todo o

filme e considerando que 2 e- estão envolvidos no processo de oxidação da dG a 8-oxo-

desoxiguanosina, pôde-se propor o seguinte mecanismo para o processo de oxidação da

dG, Esquema 5.


NOOH

OH

N

NHN

NH2

OEl

ectro

de

Ru

Ru

III

IV

Filme de RuOHCF

e-

Solução

NOOH

OH

N

NHN

NH2

O

ON

OOH

OH

N

NHNH

NH2

O

ON

OOH

OH

N

NHNH

NH2

O

Perfil de concentração da desoxiguanosina

Con

cent

raçã

o de

deso

xigu

anos

ina

100 %

0 %

Esquema 5.

4.7. Otimização e utilização do eletrodo modificado com RuOHCF para

detecção de dG em fluxo em amostras hidrolisadas de DNA.

A Figura 63 mostra os voltamogramas hidrodinâmicos obtidos em sistema FIA

para injeções de solução de dG polarizando-se o eletrodo de carbono vítreo (▲) e

modificado com RuOHCF (■) em diferentes potenciais. Pode-se observar uma diferença

significativa das correntes comparando-se os sinais obtidos com os 2 eletrodos. A

antecipação do processo de oxidação e o aumento da corrente trabalhando-se com o

eletrodo modificado são atribuídos ao processo eletrocatalítico de oxidação da dG na

superfície modificada, como reportado anteriormente.


0,0 0,4 0,8 1,20

2

4

6

I / μ

A

E / V vs Ag/AgCl

Figura 63 – Voltamogramas hidrodinâmicos para injeções de solução de dG 252 μmol L-1 em eletrodo de carbono vítreo (▲) e modificado com filme de RuOHCF (■). Vazão: 0,55 mL min-1, volume de amostra: 60 μL e solução carregadora: NaNO3 0,5 mol L-1 + HCl 0,05 mol L-1.

A influência da espessura do filme foi investigada utilizando-se eletrodo rotativo

de disco. Os valores de corrente limite para o processo de oxidação da dG trabalhando-

se com filmes de RuOHCF de diferentes espessuras indicaram uma estreita correlação

entre os valores de corrente e a espessura do filme. Dessa forma, em experimentos

posteriores trabalhou-se com eletrodo modificado contendo 45,6 x 10-10 mol cm-2 de

RuOHCF.

A vazão do eletrólito suporte e o volume de amostra injetado também foram

investigados com o intuito de obter-se uma melhor sensibilidade para o método

analítico, respectivamente, Figuras 64A e 64B.


0 400 800 1200 1600

A fe

dc

b

a

Tempo / s

4 μA

0 400 800 1200

Bed

cb

a

Tempo / s

2 μA

Figura 64 – Influência da vazão (A, 0,26 (a), 0,55 (b), 0,70 (c), 1,1 (d), 1,6 (e) e 2,0 (f) mL min-1) e volume de amostra (B, 50 (a), 100 (b), 150 (c), 200 (d), 250 (e) µL) para repetidas injeções de dG 252 μmol L-1 utilizando eletrodo modificado com filme de RuOHCF. Em (A) utilizou-se alça de 100 μL e em (B) vazão de 0,50 mL min-1. Solução carregadora: NaNO3 0,5 mol L-1 + HCl 0,05 mol L-1. E = 1,1 V.


Um aumento do valor de corrente de pico foi obtido com o aumento da vazão até

1,6 mL min-1. A ausência de um aumento contínuo da corrente de pico com a vazão

indica uma limitação cinética associada ao processo de mediação. No que diz respeito

ao volume de amostra, alíquotas que variaram de 50 a 250 μL foram injetadas.

Variações não significativas foram observadas com relação à altura de pico para os

estudos relacionados ao volume da alça de amostragem. Assim sendo, o volume de 100

μL foi escolhido devido a uma pequena melhora na corrente de pico e menor gasto de

solução. Nessas condições experimentais a freqüência analítica encontrada foi de 230

injeções por hora.

A repetibilidade do método foi investigada injetando-se 18 alíquotas de solução

de dG 38,5 μmol L-1, obtendo-se um desvio padrão relativo de 4,0 %, Figura 65.

0 200 400 600 800

2 μA

Tempo / s

Figura 65 – Sinais amperométricos para repetidas injeções de dG 38,5 μmol L-1 utilizando eletrodo modificado com filme de RuOHCF. Solução carregadora: NaNO3 0,5 mol L-1 + HCl 0,05 mol L-1. Vazão: 1,6 mL min-1 e volume de amostra: 100 μL. E = 1,1 V.


Nas condições experimentais otimizadas, calibrou-se o sistema utilizando

soluções padrão de dG numa faixa de 3,85 até 252 μmol L-1. A Figura 66 mostra a

ausência de efeito memória no sistema, que pode ser atribuída ao pequeno volume de

amostra e à configuração do sistema wall-jet. O gráfico da corrente de pico em função

da concentração de dG fornece uma reta com a seguinte equação: (I/μA) = 0,06 + 0,05

(C/μmol L-1) com coeficiente de correlação de 0,9999. Os limites de detecção (3σ/S) e

quantificação (10σ/S) foram estimados em 94 e 313 nmol L-1 (ou 9,4 e 31,3 pmol,

levando em consideração o volume de amostra injetado), respectivamente. Essa pequena

quantidade de dG determinada pelo método proposto sugere a possibilidade da

utilização do eletrodo modificado para detecção de dG em tempo real durante processos

biológicos envolvendo danos do DNA em microambientes, como por exemplo, em

células isoladas.


0 400 800 1200 1600 2000

s2s1ab

c

d

e

d

cb

a

Tempo / s

4 μA

0 50 100 150 200 2500

4

8

120 5 10 15 20 25

n / nmol

I / μ

A

CdG / μmol L-1

Figura 66 – Sinais de corrente de pico para injeções de solução de dG com as seguintes concentrações: 3,85 (a), 19,3 (b), 38,5 (c), 96,3 (d) e 252 (e) μmol L-1 e duas amostras de DNA (s1 e s2). O quadro inserido na figura mostra a dependência da corrente de pico medida em função da concentração de dG. Solução carregadora: NaNO3 0,5 mol L-1 + HCl 0,05 mol L-1. E = 1,1 V.

A estabilidade do eletrodo modificado com RuOHCF foi analisada medindo-se

em diferentes horas, durante 1 dia, a sensibilidade do método, Figura 67. Entre os

experimentos, o eletrodo foi armazenado em eletrólito suporte à temperatura ambiente.


0 1 2 3 20 250,00

0,02

0,04Se

nsib

ilida

de / μA

μm

ol L

-1

Tempo / h

Figura 67 – Dependência da sensibilidade do eletrodo modificado com o tempo. Velocidade do fluxo: 1,6 mL min-1, volume de amostra: 100 μL, solução carregadora: NaNO3 0,5 mol L-1 + HCl 0,05 mol L-1. E = 1,1 V.

Nota-se variação pouco significativa na sensibilidade durante as 3 primeiras

horas de experimento pela análise da Figura 67. Uma diminuição mais significativa foi

observada após 24 horas (15 %), mas este fato não impede o uso do sensor pois um

novo processo de calibração do sistema pode ser efetuado.

Amostras reais de DNA de timo de bezerro obtidas após processo de hidrólise

foram analisadas por FIA e os resultados foram comparados com os obtidos pelo

método padrão (Loureiro, Marques et al., 2002), Figura 68. Os resultados foram

concordantes quando aplicado o método “t-student” com 95 % de confiança,

confirmando a ausência de possíveis espécies interferentes (outros nucleosídeos como

dT, dC e dA).


0 150 300 450 600 7500

150

300

450

600

750

HPL

C / μm

ol L

-1

Amperométrico / μmol L-1

Figura 68 – Comparação dos resultados obtidos pelos métodos proposto e HPLC para análise de dG em 17 amostras de DNA. As linhas tracejadas representam o limite de 95 % de confiança.

A Tabela 9 mostra uma lista de outros métodos descritos na literatura para a

determinação de bases livres, nucleosídeos, nucleotídeos e DNA, assim como as

características analíticas. Nota-se claramente que o limite de detecção do método

proposto é comparável com aqueles reportados nos outros trabalhos. Entretanto, em

muitos destes equipamentos caros ou a necessidade de pré-concentração da dG na

superfície do eletrodo acabam sendo obstáculos quando comparados com o método

proposto. Além disso, alguns métodos apresentados não são susceptíveis para análises

de rotina, devido à dificuldade de acoplamento ao sistema em fluxo. Vale ressaltar ainda

que, como mostrado anteriormente, limites de detecção menores podem ser alcançados

aumentando a quantidade de material imobilizado na superfície do eletrodo.


Tabela 9 – Valores de limite de detecção para determinação de dG na literatura.

Composto Técnicas de separação ou acumulação

Sistema de detecção Limite de detecção reportado

Limite de detecção / nmol L-1

ssDNA (El-Maali e Wang,

2001)

- Eletroquímico -GC/TBRuMCPE

24 ppb -

DNA completamente

hidrolisado (guanina)

(Kafil, Cheng et al., 1986)

HPLC Eletroquímico - GC 0,05 pmol* 2,5

Guanina (Abbaspour e Mehrgardi,

2004)

- Eletroquímico -GC/CoHCF

52 ppb 344

Guanina (Abbaspour, Mehrgardi et

al., 2004)

- Eletroquímico -GC/cobalto(II)

ftalocianina

85 ppb 562

Guanina (Huang, Zhang

et al., 2006)

Acumulação (4 min)

Eletroquímico –Eletrodo de pasta de carbono modificado

com Montmorillonita de sódio

20 nmol L-

1 20

Nucleosídeos (Lee, Jung et al.,

2004)

HPLC/GC MS 0,2 nmol mL-1 (LQ)

200 (LQ)

dGMétodo Proposto - Eletroquímico – GC/RuOHCF

94 nmol L-

1 94

Guanina (Wang, Xiao et

al., 2005)

- Eletroquímico -beta-CD/CNT/E

10 ng mL-1 66

Guanina (Yang, Liu et al., 2005)

- Quimioluminescência 1 x 10-7 g/mL

662

*volume de amostra = 20 μL; ssDNA =DNA fita dupla; TBRuMCPE = tris(2,2´-bipiridil)dicloro-rutênio(II); HPLC =

Cromatografia líquida de alta eficiência; CoHCF = cobalto hexacianoferrato; GC= cromatografia a gás; MS =

espectrometria de massa; LQ = limite de quantificação; beta-CD/CNT/E = eletrodo modificado com beta-ciclodextrin

incorporado em nanotubos de carbono.

Outra vantagem da metodologia proposta é o fato de utilizar-se dG como padrão,

ao invés de DNA o qual é utilizado nos ensaios de fluorescência e em outras

metodologias. Padrões confiáveis de DNA são difíceis de serem obtidos, ao contrário de


padrão de dG. Vantagem adicional do procedimento em FIA diz respeito ao tempo de

análise, muito menor do que o observado no caso dos métodos cromatográficos.

Metodologias que utilizam o DNA desnaturado (fita simples) (El-Maali e Wang, 2001)

são mais rápidas, uma vez que não requerem etapa inicial de tratamento do DNA.

Contudo, a finalidade desses procedimentos consiste exclusivamente na quantificação

de DNA e não na quantificação de dG em uma fita simples, como é o caso da

metodologia proposta. Além disso, a utilização de um procedimento de hidrólise brando

não resulta em danos químicos no DNA. Desta forma, erros analíticos durante estudos

de danos ao DNA (danos extras, não causados pelo agente carcinogênico estudado) são

minimizados.

4.8. Estudo da oxidação eletrocatalítica de ácido ascórbico na superfície do

eletrodo modificado de RuOHCF

Chen e colaboradores (Chen, Lu et al., 2005) reportaram na literatura que o

filme de RuOHCF apresenta propriedade eletrocatalítica para alguns compostos, sendo

um deles o ácido ascórbico em pH = 1,5. A Figura 69 mostra os sinais voltamétricos

obtidos para adições sucessivas de ácido ascórbico utilizando o eletrodo modificado

com RuOHCF em eletrólito suporte (NaNO3 0,5 mol L-1 + HCl 0,05 mol L-1). O sinal

voltamétrico obtido após a última adição de ácido ascórbico foi comparado com o

registro voltamétrico obtido utilizando eletrodo de carbono vítreo não modificado.


-0,4 0,0 0,4 0,8 1,2

fe

dcb

a

C

B

A

E / V vs Ag/AgCl

60 μA

Figura 69 – Sexagésimo voltamograma cíclico registrado no processo de modificação do eletrodo com o filme RuOHCF (A). Em (B) estão mostrados o último ciclo do processo de verificação da estabilidade (a) e adições sucessivas de ácido ascórbico (b-f) (concentração final de 0,990 (b), 1,96 (c), 2,91 (d), 3,85 (e) e 4,76 mmol L-1(f)). Em (C) está mostrado o registro voltamétrico realizado em uma solução contendo 4,76 mmoL L-1 de ácido ascórbico. Velocidade de varredura: 100 mV s-1. Eletrólito suporte: NaNO3 0,5 mol L-1 + HCl 0,05 mol L-1. Em A está representado o voltamograma cíclico do último ciclo de potencial do

processo da modificação (Γ = 5,22 x 10-9 mol cm-2). Nota-se na Figura 69A picos bem


definidos referentes aos pares redox Ru(II)/Ru(III), Fe(II)/Fe(III) do ferricianeto de

potássio em solução, Fe(II)/Fe(III) e Ru(III)Ru(IV). Em B, está representado o último

ciclo do processo de verificação da estabilidade (obtido em eletrólito suporte), curva a,

onde se pode observar a ausência do par Fe(II)/Fe(III) do ferricianeto de potássio em

solução. Após a adição de ácido ascórbico no meio, curva b, nota-se o aparecimento de

um processo faradaico por volta de 378 mV vs Ag/AgCl, devido ao processo de

oxidação do ácido ascórbico. Adições sucessivas de ácido ascórbico resultaram em um

aumento linear da corrente de pico com a concentração. A regressão linear dos valores

de corrente de pico com a concentração resulta em uma reta com a seguinte equação,

(I/μA) = 0,45 + 12 (C/mM), coeficiente de correlação = 0,9998.

Comparando-se os voltamogramas para a última adição de ácido ascórbico para

o eletrodo modificado com RuOHCF e para o eletrodo limpo de carbono vítreo,

respectivamente, Figura 69B (curva f) e Figura 69C, nota-se que no eletrodo

modificado, ocorreu uma antecipação do sinal, de aproximadamente 322 mV vs

Ag/AgCl, indicando assim a ocorrência de um efeito eletrocatalítico para o processo de

oxidação do ácido ascórbico na superfície do eletrodo modificado. Trabalhos na

literatura relatam a possibilidade do par [Fe(CN)6]3-/4- catalisar o processo de oxidação

do ácido ascórbico, demonstrando assim a viabilidade desse mecanismo (Roy, Saha et

al., 2005). Chen e colaboradores (Chen, Lu et al., 2005) relataram que o processo de

oxidação do ácido ascórbico em pH 1,5 utilizando eletrodo de RuOHCF é devido ao par

redox [Ru(III)-NC-Fe(II)]/[Ru(III)-NC-Fe(III)] (Potencial formal: 0,57 V vs Ag/AgCl),

sugerindo que a mediação do processo redox é dada pelo par Fe(II)/(III) presente no

filme.

A aplicação do eletrodo modificado para a detecção de ácido ascórbico em

ambientes celulares requer a operação do sensor em meio com pH próximo de 7. Dessa


forma, pensou-se em realizar a modificação da superfície eletródica em pH = 6,9,

Figura 70.

-0,4 0,0 0,4 0,8 1,2

-10

-5

0

5

10

15

20

I / μ

A

E / V vs Ag/AgCl

Figura 70 – Primeiro (⎯⎯) e sexagésimo (- - -) voltamograma cíclico registrado em tampão fosfato pH = 6,9 contendo RuCl3 1 mmol L-1 + Fe(CN)6

3- 1mmol L-1 usando eletrodo de carbono vítreo. Velocidade de varredura: 100 mV s-1.

A partir da Figura 70 pode-se observar que em meio neutro a deposição do filme

na superfície do eletrodo não ocorre, impossibilitando assim a utilização desse tipo de

eletrodo em meio neutro. Pensou-se então em modificar a superfície eletródica em meio

ácido, verificar a estabilidade do eletrodo também nesse mesmo meio, e depois utilizar

o eletrodo modificado em meio neutro.

A Figura 71 mostra voltamogramas cíclicos registrados para adições sucessivas

de ácido ascórbico em tampão fosfato, pH = 6,9, para o eletrodo modificado em meio

ácido conforme procedimento descrito na parte experimental.


-0,4 0,0 0,4 0,8 1,2

0

20

40

60

f

e

d

c

a

bI / μ

A

E / mV vs Ag/AgCl

Figura 71 – Voltamogramas cíclicos registrados utilizando eletrodo modificado de RuOHCF na ausência (a) e presença de ácido ascórbico (b-f) (concentração final de 0,990 (b), 1,96 (c), 2,91 (d), 3,85 (e) e 4,76 mmol L-1 (f)) e utilizando eletrodo limpo de carbono vítreo em solução contendo 4,76 mol L-1 de ácido ascórbico (- - -). Eletrólito suporte: Tampão fosfato pH = 6,9. Velocidade de varredura: 100 mV s-1. Γ = 5,30 x 10-9

mol cm-2.

Nota-se na Figura 71 um deslocamento de 338 mV nos potenciais de pico ao se

comparar os voltamogramos registrados com e sem filme para o processo de oxidação

do ácido ascórbico. As adições sucessivas de ácido ascórbico resultaram em uma reta

com a seguinte equação (I/μA) = 1,0 + 13 (C/mM), coeficiente de correlação = 0,9978.

Vale ressaltar que em ambos os casos, meio ácido e neutro, a sensibilidade do método e

a antecipação do potencial referente à corrente de pico para o eletrodo com e sem

modificação foram semelhantes. Entretanto, em meio neutro a detecção de ácido

ascórbico próximo do potencial de 0 V possibilita o desenvolvimento de uma

metodologia mais imune a interferências oriundas de outras substâncias presentes em

uma amostra real.


Observada a viabilidade de se utilizar o eletrodo de RuOHCF em meio neutro

para a detecção de ácido ascórbico, a próxima etapa envolveu o estudo do mecanismo

de mediação do processo de oxidação do ácido ascórbico sobre a superfície modificada.

Para isso, estudos utilizando eletrodo rotativo de carbono vítreo foram efetuados.

A Figura 72A mostra voltamogramas cíclicos em diferentes velocidades de

rotação utilizando o eletrodo modificado e na Figura 72B são apresentados os valores de

IL em função de w1/2 para diferentes concentrações de ácido ascórbico.


-0,2 -0,1 0,0 0,1 0,2 0,3

0,0

0,1

0,2

0,3

A fedc

b

a

I / m

A

E / V vs Ag/AgCl

0 4 8 12 160,0

0,2

0,4B

I / m

A

ω1/2 / (rad s-1)1/2

Figura 72 – Voltamogramas hidrodinâmicos (A) registrados em tampão fosfato pH = 6,9 (a) e ácido ascórbico (b-f) 1 mmol L-1 usando eletrodo modificado de RuOHCF (Γ = 2,79 x 10-9 mol cm-2) em diferentes velocidades de rotação: 0 (a), 100 (b), 400 (c), 900 (d), 1600 (e) e 2500 (f). Em B estão representados os gráficos de Levich para diferentes valores de concentração de ácido ascórbico em solução tampão pH 6,9 : 1 (-), 2 (-), 3 (-), 4 (-) e 5 mmol L-1(-). Velocidade de varredura: 20 mV s-1. A altas velocidades de rotação nota-se um desvio da linearidade para todas as

concentração de ácido ascórbico, Figura 72B, indicando a existência de um problema


cinético ou de transporte do substrato, no filme, acoplado ao processo de transferência

eletrônica. Para descobrir qual etapa é a determinante da velocidade do processo

eletródico, novamente foi utilizada a teoria de Albery e Hillman (Albery e Hillman,

1984; Ciszewski e Milczarek, 1999; Vilas-Boas, Pereira et al., 2002).

A Figura 73 mostra os gráficos de Koutecký-Levich para os experimentos

realizados em diferentes concentrações de ácido ascórbico, Figura 72B.

0,00 0,05 0,10 0,15 0,20 0,25 0,30 0,350

4000

8000

12000

16000

1 / (

I / A

)

ω-1/2 / (rad s-1)-1/2

Figura 73 – Gráficos de Koutecký-Levich para os valores de corrente registrados na Figura 16B. Mesmas condições experimentais da Figura 72.

A partir dos valores do intercepto em w-1/2 = 0, n = 2 elétrons para o processo de

oxidação do ácido ascórbico (Rueda, Aldaz et al., 1978) e utilizando-se a equação 25, é

possível obter os valores de k’ME. De posse dos valores de k’ME, construiu-se um gráfico

de log k’ME em função de log cs para obter-se a ordem da concentração (cx) em relação

ao k’ME, Figura 74.


-3,0 -2,8 -2,6 -2,4 -2,2

-3,25

-3,20

-3,15

-3,10

log

(k' M

E / c

m s

-1)

log (cs / mol L-1)

Figura 74 – Dependência do log k’ME contra log cs. Condições experimentais da Figura 72.

Na Figura 74 duas regiões distintas podem ser observadas. Na primeira (até 2

mmol L-1 de ácido ascórbico) os valores de k’ME praticamente independem da

concentração de ácido ascórbico (coeficiente angular = -0,02413), enquanto na segunda

parte (acima de 2 mmol L-1 de ácido ascórbico), os valores de k’ME dependem da

concentração. O coeficiente angular encontrado na segunda região foi de -0,3943. De

posse desses valores e utilizando a tabela 8 pôde-se descobrir a expressão para k’ME e o

mecanismo de mediação do processo de oxidação do ácido ascórbico sobre a superfície

modificada de RuOHCF em meio neutro. O valor obtido na segunda parte é muito

próximo da ordem (cx) esperada de -1/2, que segundo a teoria de Albery and Hillman

tem relação com um mecanismo do tipo LEk (ver Tabela 8).

No mecanismo LEk a reação ocorre numa região finita na interface

eletrodo|filme. Nesse tipo de mecanismo a espécie eletroativa difunde-se facilmente


dentro do filme e, portanto, problemas de difusão do material dentro do filme não

consistem em uma das etapas limitantes do processo global. Em baixas concentrações

de ácido ascórbico, k'ME independe dos valores de concentração como mostrado

anteriormente, Figura 74. Com isso, sobram somente 6 casos possíveis para serem

considerados. Esse casos onde k'ME independe da concentração da espécie eletroativa

são: LSk, Lk, Ek´E, Sk´, LEts e Ets. O caso Ek´E foi descartado pois ele está associado a

processo que ocorre diretamente na superfície do eletrodo (ver esquema 4 e Tabela 8)

fato não observado na região de potencial estudada. Para decidir qual dos casos 5

restantes explicam os dados experimentais para o mecanismo de mediação do processo

de oxidação do ácido ascórbico em concentrações menores que 2 mmol L-1, novos

estudos foram realizados. Filmes com diferentes espessuras (2,61 – 24,7 mol cm-2)

foram preparados e, para cada eletrodo modificado com um determinado excesso

superficial, variou-se a velocidade de rotação em uma solução contendo tampão fosfato

pH = 6,9 e ácido ascórbico 1 mmol L-1. Após essa etapa, curvas de Koutecky-Levich

foram construídas e os valores de k'ME foram obtidos como mostrado anteriormente. A

partir dos valores de k'ME e espessura, construiu-se o gráfico de log k'ME em função de

log Γ, Figura 75.


-9,6 -9,4 -9,2 -9,0 -8,8 -8,6-4,0

-3,6

-3,2

-2,8

-2,4

-2,0

log

(k' M

E / c

m s

-1)

log (Γ/ mol cm2)

Figura 75 – Dependência do log k’ME contra log Γ. Os valores de excesso superficial utilizado nos experimentos foram: 2,61, 7,82, 14,7 e 24,7 x 10-10 mol cm-2, demais condições vide Figura 16. Concentração de ácido ascórbico: 1 mmol L-1.

Em baixas concentrações de ácido ascórbico o coeficiente angular da curva

construída na Figura 75 foi de -0,07362, praticamente 0. Dentre os mecanismos

apresentados na Tabela 8, os únicos onde k’ME independe da concentração do substrato

e da espessura do filme são os casos LSk e Sk´, segundo os quais a reação ocorre em

uma zona finita na interface filme|solução e na superfície do filme, respectivamente.

Dessa forma, para baixas concentrações de substrato a transferência de carga excede o

fluxo de substrato ao longo do filme e, com isso, a reação ocorre em região finita da

interface filme|solução ou na superfície do filme. A principio, a distinção entre os dois

possíveis casos poderia ser feita realizando-se experimentos envolvendo a variação de

k´ME em função de b0. Entretanto, para esse tipo de filme b0 depende simultaneamente

de L e Γ e, experimentalmente, não foi possível variar esses dois parâmetros

independentemente.


Supondo que o caso LSk é o que mais se aproxima do mecanismo de mediação

do processo de oxidação do ácido ascórbico, pode-se calcular o valor da constante

cinética do processo de mediação (k) a partir da equação de k’ME descrita, Tabela 8:

SPoME Dkbk κ=' (26)

O valor de k obtido para uma espessura de 2,47 x 10-9 mol cm-2 (b0 = 0,50 x 10-3

mol cm-3) foi de 18 mol-1 L1 s-1. Para isso, considerou-se o valor de 6,8 x 10-8 cm2 s-1

para o coeficiente de difusão do ácido ascórbico no filme. Esse valor foi o encontrado

na literatura para o coeficiente de difusão do ácido ascórbico em um filme de PDMA

(Roy, Saha et al., 2005). Para o cálculo da concentração de sítios eletroativos foi

utilizada a tabela 7 e o valor do excesso superficial acima reportado.

A partir do valor de k e demais valores obtidos a partir da tabela 7, obtiveram-se

os valores das relações Dctbo/L e kΓcs, respectivamente 3,4 x 10-9 e 3,25 x 10-11 mol

cm-2 s-1 (Γ = 1,81 x 10-9). Nota-se que o valor da relação Dctbo/L >> kΓcs, indicando

assim que a reação ocorre próximo ou na interface filme|solução, em concordância com

as premissas associadas aos casos LSk e Sk´. Considerando os dados até aqui obtidos,

um possível mecanismo para o processo eletrocatalítico de oxidação do ácido ascórbico

utilizando o eletrodo de RuOHCF está ilustrado no esquema 6, onde o mediador

consiste em composto contendo Ru(III) como átomo central.


Elet

rodo

Ru

Ru

II

III

Filme RuOHCF

e-

Solução

Perfil de concentração do ascorbato

conc

entra

ção

de

asco

rbat

o

100 %

0 %

O

OHO-

OH O

OHO

OHO-

OH O

OH

O

OO

OH O

OH O

OO

OH O

OH

Esquema 6.

4.9. Otimização dos parâmetros analíticos em fluxo para detecção de ácido

ascórbico em meio neutro utilizando o eletrodo modificado com

RuOHCF

Compreendido o mecanismo do processo eletrocatalítico, estudos foram

efetuados com o intuito de acoplar o eletrodo modificado a sistema de análise por

injeção em fluxo. Inicialmente investigou-se a influência da espessura do filme no sinal

de corrente do ácido ascórbico. Como era de se esperar, devido ao processo de

mediação ocorrer numa região finita na interface filme|solução, ou na superfície do

filme, a espessura do filme pouco altera o sinal de corrente do processo de oxidação do

ácido ascórbico. Entretanto, quando avaliada a faixa linear do sensor, observou-se que

para uma faixa de 1 a 8 mmol L-1 somente o filme de 60 ciclos apresentou uma

linearidade em toda a faixa estudada, possivelmente devido a um melhor recobrimento

da superfície eletródica. Dessa forma, os eletrodos modificados foram preparados

trabalhando-se com 60 ciclos de potencial.


A influência do potencial aplicado na corrente do processo de oxidação do ácido

ascórbico na superfície modificada também foi avaliada, Figura 76.

-0,2 0,0 0,2 0,40

3

6

9

I / μ

A

E / V vs Ag/AgCl

Figura 76 – Voltamograma hidrodinâmico para injeções de solução de ácido ascórbico 1 mmol L-1 em eletrodo de carbono vítreo modificado com filme de RuOHCF. Vazão: 1,6 mL min-1, volume de amostra: 100 μL e solução carregadora: Tampão fosfato pH 6,9. Γ = 5,22 x 10-9

mol cm-2. A partir dos valores de corrente de pico obtidas injetando-se solução de ácido

ascórbico no sistema em fluxo, Figura 76, pode-se notar que o processo de oxidação do

ácido ascórbico na superfície modificada inicia-se a 0 V vs Ag/AgCl. Vale salientar que

estudos anteriores já demonstraram que o aparecimento do sinal de corrente do processo

de oxidação do ácido ascórbico no eletrodo de carbono vítreo só ocorre em potenciais

mais positivos, aproximadamente 300 mV. Essa antecipação do processo de oxidação

do ácido ascórbico deve-se ao processo eletrocatalítico no filme de RuOHCF, apontado

anteriormente. Objetivando obter uma melhor sensibilidade, os estudos a seguir foram

realizados em +0,4 V.


Estudos para investigar a influência da vazão e do volume de amostra na

corrente de pico do processo de oxidação do ácido ascórbico também foram realizados e

os resultados estão mostrados na Figura 77.


0 200 400 600 800

fed

cb

a

Tempo / s

4 μA

0 100 200 300 400

dcba

Tempo / s

4 μA

Figura 77 – Influência da vazão (A) e volume de amostra (B) para repetidas injeções de ácido ascórbico 1 mmol L-1 utilizando eletrodo modificado com filme de RuOHCF. Em (A) utilizou-se alça de 100 μL e os seguintes valores de vazão: 0,26 (a), 0,70 (b), 1,1 (c), 1,6 (d), 2,0 (e), 2,5 (f), 2,6 (g) mL min-1. Em (B) a vazão utilizada foi 2,0 mL min-1 e as alças: 100 (a), 150 (b), 200 (c) e 250 (d) μL. Variou-se a solução carregadora: NaNO3 0,5 mol L-1 + HCl 0,05 mol L-1. E = 1,1 V. Γ = 5,22 x 10-9 mol cm-2.

A

B


Um aumento significativo do valor de corrente de pico foi obtido com o aumento

da vazão até 2,5 mL min-1. A ausência de um aumento contínuo da corrente de pico com

a vazão indica uma limitação cinética associada ao processo de mediação, como

observado anteriormente para a dG sobre o mesmo filme de RuOHCF. Tentando

minimizar problemas de linha base, que têm como conseqüência um aumento nos

limites de detecção (desvios padrão relativo maiores entre as medidas do branco),

utilizou-se o fluxo de 2,0 mL min-1 nos estudos subseqüentes. Com relação ao volume

de amostra, alíquotas que variaram de 100 a 250 μL foram injetadas. Variações não

significativas foram observadas com relação à altura de pico para os estudos sobre o

volume da alça de amostragem. Assim sendo, o volume de 150 μL foi escolhido devido

a uma pequena melhora na corrente de pico e menor gasto de solução. Nessas condições

experimentais a freqüência analítica encontrada foi de 385 injeções por hora.

Como observado anteriormente, o sinal referente ao processo de oxidação do

ácido ascórbico sobre o eletrodo modificado inicia-se em 0 V e medições neste

potencial podem acarretar em melhora na seletividade do sensor, mas com perda de

sensibilidade. Este fato é ilustrado na Figura 78, em que se apresentam duas curvas de

calibração, independentes, polarizando o eletrodo de trabalho em dois diferentes

potenciais, 0 e 0,4 V.


0 200 400 600 800 1000

e

d

cba

Tempo / s

0,4 μA

0 200 400 600 800 10000,0

0,2

0,4

0,6

0,8

AI /

μA

C / μmol L-1

0 200 400

e

dc

b

Tempo / s

4 μA

0 200 400 600 800 10000

4

8

12

B

I / μ

A

C / μmol L-1

Figura 78 – Sinais amperométricos registrados utilizando eletrodo modificado de RuOHCF (Γ = 5,22 x 10-9 mol cm-2) para injeções de solução de ácido ascórbico: 50 (a), 100 (b), 200 (c), 500 (d) e 1000 (e) μmol L-1. Solução carregadora: tampão fosfato pH 6,9. E = 0,0 (A) e 0,4 (B) V. Inserida em cada uma das figuras está a curva de calibração para cada potencial de trabalho.


Nota-se da Figura 78 que os valores de corrente em B são maiores do que os

obtidos em A, respectivamente, 0,4 e 0 V. A regressão linear da corrente de pico para

cada um dos potenciais resultou nas seguintes equações de reta: (I/μA) = 0,0041 + 7,3 x

10-4 (C/μmol L-1), coeficiente de correlação = 0,9999, para um potencial de polarização

de 0 V, e (I/μA) = 0,71 + 0,011 (C/μmol L-1), coeficiente de correlação = 0,9987, para

um potencial de polarização de 0,4 V. Como já era de se esperar, a sensibilidade do

método é comprometida a 0 V, entretanto, a melhora em seletividade é significativa

nesse potencial. O limite de detecção (3σ/S) para cada um dos potenciais utilizados foi

de 2,2 e 0,14 μmol L-1, respectivamente 0 e 0,4 V. Dessa forma, em matrizes mais

complexas e concentrações não tão baixas de ácido ascórbico pode-se então explorar a

seletividade do sensor. Caso a análise requeira uma alta sensibilidade e o analito esteja

contido em uma matriz não muito complexa, pode-se utilizar o potencial de trabalho de

0,4 V. Nessa nova condição (0 V), que prima pela seletividade, a freqüência analítica foi

de 290 injeções por hora (Largura do pico1/2 = 8 s, c = 1000 μmol L-1), menor que a

obtida em 0,4 V (Largura do pico1/2 = 4,5 s, c = 1000 μmol L-1), possivelmente por não

se trabalhar em um valor de potencial onde a velocidade de transferência eletrônica é

máxima. Entretanto, o valor de freqüência analítica obtido ainda é satisfatório para

análises de rotina.

O desvio padrão (N = 10) para injeções consecutivas de ácido ascórbico 130

μmol L-1 foi de 2,0 % indicando uma boa repetibilidade do sensor, Figura 79. O tempo

de vida do eletrodo foi avaliado monitorando-se a sensibilidade do eletrodo para uma

curva de calibração construída de 100 – 1000 μmol L-1 durante o período de 24 horas.

Nesse intervalo, o eletrodo foi armazenado a seco e à temperatura ambiente. Os valores

obtidos para o tempo t = 0 e 24 horas foram, respectivamente, (0,0041 ± 0,0008) e

(0,0040 ± 0,0002) μA μmol-1L. Nota-se que a variação nos valores de sensibilidade é


muito pequena, confirmando assim a boa estabilidade do eletrodo quando armazenado a

seco.

02

46

810

0,00

0,02

0,04

0,06

0,08

0,10

Número da injeção

I / μ

A

Figura 79 – Corrente de pico obtidas para repetidas injeções de ácido ascórbico 1 mmol L-1 utilizando eletrodo modificado com filme de RuOHCF. Solução carregadora: NaNO3 0,5 mol L-1 + HCl 0,05 mol L-1. Vazão: 2,0 mL min-1 e volume de amostra: 150 μL. E = 0 V. Γ = 5,22 x 10-9 mol cm-2.

Comprovada a viabilidade da aplicação do eletrodo modificado em um potencial

de trabalho de 0 V, pensou-se em utilizar o eletrodo modificado para a detecção de

ácido ascórbico em urina.

Da literatura (Massey, 2000; Fang, Jiao et al., 2006), sabe-se que determinados

compostos podem causar interferência na análise de ácido ascórbico em urina. Esses

compostos são: glicose, nitrito e ácido úrico. Com o intuito de avaliar a interferência

desses compostos no sinal de corrente do ácido ascórbico para o sensor proposto


polarizado em 0 V, o interferente + ácido ascórbico (concentração na razão de 2:1)

foram injetados em mistura, Figura 80.

0 100 200 300 400

dcba

Tempo / s

0,2 μA

Figura 80 – Sinais amperométricos para repetidas injeções de ácido ascórbico 1 mmol L-1 + glicose 2 mmol L-1 (a), ácido ascórbico 1 mmol L-1 + nitrito 2 mmol L-1 (b), ácido ascórbico 1 mmol L-1 + ácido úrico 2 mmol L-1 (c) e ácido ascórbico 1 mmol L-1 (d) utilizando eletrodo modificado com filme de RuOHCF. Solução carregadora: tampão fosfato pH = 6,9. Vazão: 2,0 mL min-1 e volume de amostra: 150 μL. E = 0 V. Γ = 5,22 x 10-9 mol cm-2.

Na Figura 80 pode-se notar que glicose, ácido úrico e nitrito não interferem no

sinal de corrente do processo de oxidação do ácido ascórbico em concentração duas

vezes maior.

Injeções consecutivas de padrões e duas amostras de urina foram efetuadas no

sistema em fluxo. Nota-se da Figura 81 a ausência de efeito memória, que pode ser

atribuída novamente à configuração da célula em fluxo e à ausência de envenenamento


da superfície do eletrodo. A tabela 10 mostra os resultados obtidos para 4 amostras de

urina coletadas de 3 diferentes indivíduos.

0 400 800 1200 1600

s2s1 ab

c

d

ee

d

c

ba

Tempo / s

0,3 μA

Figura 81 – Sinais amperométricos registrados utilizando eletrodo modificado de RuOHCF (Γ = 5,22 x 10-9 mol cm-2) para injeções de solução de ácido ascórbico: 50 (a), 100 (b), 200 (c), 500 (d) e 1000 (e) μmol L-1 e duas amostras de urina (s1 e s2). Solução carregadora: tampão fosfato pH 6,9. Vazão: 2,0 mL min-1 e volume de amostra: 150 μL. E = 0,0.


Tabela 10 – Valores de concentração encontrado em 4 diferentes amostras de

urina utilizando o método proposto

Amostra Concentração de

ácido ascórbico*

/ mmol L-1

Ácido

ascórbico

adicionado

/ µmol L-1

Ácido ascórbico

encontrado*

/ mmol L-1

Recuperação

/ %

1 (1,64 ± 0,01) 500 (2,13 ± 0,02) 98

2 (2,1 ± 0,2) 500 (2,6 ± 0,1) 100

3 (3,42 ± 0,07) 500 (3,90 ± 0,05) 96

4 (0,98 ± 0,04) 500 (1,50 ± 0,04) 104

* Medidas realizadas em triplicata.

Na literatura (Kumtatt e Leong, 1964), valores na faixa de 57 – 4100 μmol L-1

são reportados para a concentração de ácido ascórbico na urina e estes limites abrangem

os valores obtidos utilizando o sensor proposto. A larga faixa reportada na literatura

(Sinha, Block et al., 1992) deve-se ao fato de que os níveis de ácido ascórbico nos

fluidos biológicos (sangue, urina) variam em função do estilo de vida da pessoa, à

saturação de ácido ascórbico, capacidade de armazenado do mesmo no organismo,

exercícios físicos, consumo de álcool, doenças, idade e consumo de fármacos. Vale

destacar que o sensor proposto não requer pré-tratamento da amostra de urina, somente

uma diluição da ordem de 12 a 100 para que o valor de concentração se ajuste à faixa

linear da curva de calibração, diferentemente de muitos métodos que utilizam processos

de precipitação de alguns interferentes com acetato de mercúrio e acetato de bário

(Emmerie e Van Eekelen, 1934; Van Eekelen e Emmerie, 1936; Van Eekelen e

Heinemann, 1938).


Os sensores com características mais próximas ao do sensor proposto operam em

potencial de 0,05 V vs ECS (Pauliukaite, Ghica et al., 2005) e 0,05 V vs Ag/AgCl

(Kulys e Dcosta, 1991) e apresentam, respectivamente, limites de detecção de 2,1 e 23

μmol L-1. Com isso, pode-se notar que o sensor proposto apresenta possibilidade de

detecção de ácido ascórbico em potencial mais negativo do que 0,05 V, conferindo

assim uma maior seletividade às determinações e com limite de detecção comparável ao

sensor reportado por Brett e colaboradores (Pauliukaite, Ghica et al., 2005).

A exatidão da metodologia foi testada por adição e recuperação. Às amostras de

urina adicionaram-se alíquotas de ácido ascórbico (concentração final = 500 μmol L-1) e

os valores de recuperação obtidos variaram entre 96 - 104 %, atestando assim a exatidão

do método desenvolvido.

4.10. Desenvolvimento de metodologia para a determinação de ascorbato

em meio de MEM e glutationa utilizando microeletrodo modificado com

filme de óxido de rutênio hexacianoferrato

As células SH-SY5Y são cultivadas em meio de cultura com pH próximo de 7,0,

qual contém os nutrientes necessários para a sobrevivência das mesmas. Estudos iniciais

visando à substituição do meio para tampão fosfato resultaram em problemas de

desprendimento das células que estavam aderidas no fundo do poço. Dessa forma, e

visando não alterar a composição do meio de cultura visto que isso poderia provocar

uma condição não ideal para o sistema celular, pensou-se em desenvolver metodologia

para quantificação do ácido ascórbico em meio de cultura (MEM) e glutationa. O uso da

glutaniona se faz necessário para prevenir a oxidação do ácido ascórbico pelo ar durante

os experimentos.


Um primeiro passo foi verificar o comportamento eletroquímico do

microeletrodo (r = 14,5 μm, fibra de carbono) durante o processo de modificação,

Figura 82.


-0,4 0,0 0,4 0,8 1,2

C

B

A

100 nA

E / V vs Ag/AgCl

Figura 82 – Voltamogramas cíclicos registrados durante o processo de modificação (A) com RuOHCF da superfície de fibra carbono (r = 14,5 m) em solução contendo RuCl3 1 mmol L-1 + K3Fe(CN)6 1 mmol L-1 + NaNO3 0,5 mol L-1 + HCl 0,05 mol L-1 e verificação da estabilidade (B) em solução contendo NaNO3 0,5 mol L-1 + HCl 0,05 mol L-1. Velocidade de varredura: 100 mV s-1. Em C o voltamograma do eletrodo em tampão fosfato (pH = 6,9). Γ = 2,0 x 10-8 mol cm-2.


Durante o processo de modificação da superfície do eletrodo, três processos

redox bem definidos podem ser verificados em 0,0, 0,67 e 0,93 V vs Ag/Cl. A partir dos

voltamogramas registrados em B, pode-se observar uma boa estabilidade do sinal de

corrente para voltamogramas consecutivos obtidos somente em eletrólito suporte. Esse

comportamento indica uma imobilização satisfatória do filme na superfície do

microeletrodo. Comparado com o eletrodo de tamanho convencional, pode-se dizer que

a estabilidade do filme foi maior trabalhando-se com o microeletrodo. O voltamograma

registrado em C mostra o comportamento do microeletrodo modificado em tampão

fosfato e observam-se algumas mudanças no comportamento eletroquímico ao

trabalhar-se com eletrólito contendo fosfato em pH mais elevado.

Visando avaliar as propriedades eletrocatalíticas do microeletrodo modificado

com RuOHCF para o processo de oxidação do ácido ascórbico, registrou-se

voltamogramas consecutivos para injeções de ácido ascórbico na faixa de 0,60 a 11

mmol L-1, Figura 83.


Figura 83 – Voltamogramas registrados com microeletrodo de fibra de carbono (r = 2,3 μm) modificado com filme de RuOHCF em solução de tampão fosfato pH = 6,9 antes e após a adição de ácido ascórbico na faixa de 0,60 a 11 mmol L-1. O quadro inserido na figura mostra as curvas de calibração obtidas em duas diferentes regiões das curvas voltamétricas: 0,0 (A) e 0,2 (B) V. Velocidade de varredura: 100 mV s-1. Nota-se da Figura 83, que o sinal de oxidação para o ácido ascórbico inicia-se

por volta de -0,1 V. O mesmo comportamento eletroquímico foi observado ao se utilizar

o eletrodo de tamanho convencional, Figura 71, indicando assim que o tamanho do

eletrodo não influencia as nas propriedades eletrocatalíticas do filme de RuOHCF para o

processo de oxidação do ácido ascórbico. Além disso, como observado no eletrodo

convencional, é possível trabalhar em duas regiões de potencial, uma mais seletiva e

menos seletiva (A) e outra mais sensível e menos seletiva (B). Dessa forma, a utilização

do microeletrodo para quantificação a de ácido ascórbico a 0,0 V vs Ag/AgCl parece ser

promissora. Entretanto, as medidas no meio celular precisavam ser realizadas em meio


de MEM e glutationa e desta forma, avaliou-se o comportamento do microeletrodo

nesta condição, Figura 84.

-0,4 0,0 0,4 0,8 1,2

0,0

0,2

0,4

B

A

I / μ

A

E / V vs Ag/AgCl

Figura 84 – Voltamogramas registrados com microeletrodo de fibra de carbono (r = 14,5 μm) modificado com filme de RuOHCF em MEM (A) e tampão fosfato pH = 6,9 (B). Velocidade de varredura: 100 mV s-1. Γ = 2,0 x 10-8 mol cm-2.

Os voltamogramas da Figura 84 mostram que por volta de 0,0 V o

comportamento eletroquímico em ambos os meios é semelhante. Entretanto, em

potenciais mais positivos o valor de corrente em meio de cultura foi maior que em

tampão fosfato. Essa observação poderia indicar eventuais problemas de interferência

ao se trabalhar em valores de potencial mais positivos, eventualmente justificativas pela

composição do meio de cultura MEM ((CaCl2, MgSO4, KCl, NaHCO3, NaCl e

NaH2PO4, respectivamente, 1,80, 0,814, 5,33, 26,19, 117,24 e 1,01 mmol L-1),

aminoácidos (21 tipos), vitaminas (10 tipos), ribonucleosídeos, desoxiribonucleosídeos

e outros componentes (d-glicose, ácido lipoíco acid and piruvato de sódio), pH = 7,0 ±


0,5.) Entretanto, sabe-se da literatura que o comportamento dos filmes de metal

hexacianoferrato são muito sensíveis a alterações da força iônica do meio (De Tacconi,

Rajeshwar et al., 2003; Abbaspour e Mehrgardi, 2004). Com isso, pode-se dizer que

dois fatores poderiam justificar o aumento de corrente em potenciais mais positivos: a

alteração da força iônica e a composição do meio de cultura (guanina e dG). Com o

intuito de confirmar a seletividade do sensor a 0,0 V, realizou-se experimento

envolvendo a adição de meio de cultura em tampão fosfato, Figura 85.

0 300 600 900

0.0 0.2 0.4 0.60.0

0.1

0.2

0.3

h

g

f

e

d

c

ba

C

B

A-

+

-

+

0

0

Tempo / s

100 pA

I / n

A

CAA / mM

Figura 85 – Sinais amperométricos (A) obtidos utilizando microeletrodo de fibra de carbono (r = 14,5 μm) modificado com filme de RuOHCF para injeções de glutaniona (a) (concentração final de 0,5 mmol L-1) e ácido ascórbico (b-f) (concentração final igual a 0,082 (b), 0,16 (c), 0,24 (d), 0,40 (e), 0,55 (f), 0,69 (g) mmol L-1) em MEM. Sinais amperométricos (B) obtidos utilizando microeletrodo modificado com RuOHCF para injeção de 100 μL de MEM concentrado (h)em tampão fosfato (6 mL). O painel C representa a curva de calibração para adições sucessivas de ácido ascórbico em MEM. E = 0,0 V vs Ag/AgCl. Experimentos sob agitação com barra magnética. Γ = 2,0 x 10-8 mol cm-2.


Nota-se que a adição de MEM e glutationa não proporciona sinal faradaico,

evidenciando assim a ausência de interferência desses compostos utilizando o

microeletrodo modificado com RuOHCF em 0,0 V. A regressão linear dos valores de

corrente, obtidos a 0,0 V, para adições de ácido ascórbico resultou em um reta com a

seguinte equação (I/nA = 0,00797 + 0,401 (C/mmol L-1)), coeficiente de correlação =

0,9986. O limite de detecção (3σ/S) sob essas condições foi de 25 μmol L-1, mas valores

muito mais baixos podem ser obtidos a 0,2 V. Neurotransmissores são eletroativos

sobre a superfície modificada de RuOHCF (dopamina, epinefrina e norepinefrina, 0,54,

0,60 e 0,61 V, potenciais esses mais positivos do que o potencial de pico do ácido

ascórbico a pH = 1,5 (0,52 V) (Chen, Lu et al., 2005)). Nestas condições, interferência

resultante de eventual presença de neurotransmissores em amostras reais não deve

ocorrer ao se trabalhar em 0,0 V.

A estabilidade do sensor no meio de cultura foi avaliada durante uma semana

monitorando-se a sensibilidade por meio de uma curva de calibração na faixa de 0,5 a

1,5 mmol L-1 de ácido ascórbico, Figura 86. Quando não utilizado, o microeletrodo

modificado foi armazenado a seco e à temperatura ambiente. A sensibilidade do sensor

permaneceu estável durante as primeiras 24 horas. Um decréscimo de 10 % e 40 % foi

observado após 120 e 168 horas, respectivamente. Dessa foram, observa-se que o filme

permanece depositado e retém suas propriedades eletrocatalíticas por um período de 120

horas, evitando um constante processo de recalibração do dispositivo.


0 20 40 60 80 100 1200,0000

0,0001

0,0002

0,0003

0,0004Se

nsib

ilida

de / μA

mm

ol L

-1

Tempo / h

Figura 86 – Sensibilidade do microeletrodo de fibra de carbono (r = 14,5 μm) modificado com filme de RuOHCF para curvas de calibração construídas na faixa de 0,5 – 1,5 mmol L-1 em meio MEM durante 120 horas. E = 0,0 V vs Ag/AgCl. Experimentos sob agitação com barra magnética. Γ = 2,0 x 10-8 mol cm-2.

4.11. Determinação do consumo de ascorbato pelas células SH-SY5Y

utilizando microeletrodo modificado com filme de óxido de rutênio

hexacianoferrato

Verificada a viabilidade de detecção do ácido ascórbico no meio de cultura das

células, iniciaram-se os experimentos para monitorar o consumo de ascorbato por 3

tipos celulares - SH, WT (célula transfectada com SOD humana) e G93A. Adicionaram-

se ao meio de cultura 0,2 mmol L-1 de ascorbato e 0,5 mmol L-1 de glutationa. Os

valores de corrente foram convertidos à concentração de ascorbato no meio de cultura

utilizando a curva de calibração mostrada na seção anterior. A Figura 87 mostra o


decaimento da corrente no meio de cultura para os diferentes experimentos e para um

experimento controle sem as células.

Figura 87 – Sinais amperométricos registrados utilizando microeletrodo de fibra de carbono (r = 14,5 μm) modificado com filme de RuOHCF no meio de cultura contendo 0,5 mmol L-1 de glutationa + 0,2 mmol L-1 de ácido ascórbico sem e com as células. E = 0,0 V vs Ag/AgCl. Experimentos realizados sem agitação magnética. Γ = 2,0 x 10-8 mol cm-2.

Visto que o durante os experimentos realizados com o controle não se observou

decaimento do valor de corrente, pode-se concluir que a variação da concentração de

ascorbato no meio de cultura ocorre devido à absorção de ascorbato pelas células, e não

devido à oxidação pelo ar. Sabe-se que as células SH-SY5Y expressam receptores

funcionais de ascorbato (May, Li et al., 2006) e que a incubação das células SH com

ascorbato resulta em um consumo linear por até 1 h, sendo possível observar consumo

por até 18 h de incubação. A absorção de ascorbato atinge um valor máximo (7 mmol


L-1 intracelular) nas incubações com 0,2 mmol L-1 de ascorbato no meio de cultura,

razão pela qual esta concentração foi empregada nos experimentos.

Após 3 h de incubação, as células SH e WT consumiram cerca de 30 % do

ascorbato presente no meio, enquanto as células G93A consumiram cerca de 50 %.

Conclui-se que não houve diferença no consumo de ascorbato entre as células SH e WT,

entretanto, as células G93A consumiram aproximadamente o dobro de ascorbato - a

quantidade de células em cada poço foi normalizada por contagem (106) e dosagem de

proteína após os experimentos.

Sabe-se que o ascorbato é um importante anti-oxidante em neurônios, chegando

a atingir concentrações intracelulares de 10 mmol L-1 (Halliwell, 1999). As células

transfectadas com SOD G93A produzem maior quantidade de espécies reativas de

oxigênio do que as células controle (Beretta, Sala et al., 2003), e apresentam nível de

lesão em DNA e lipoperoxidação aumentados. Estes dados indicam que as células

G93A encontram-se em uma situação de estresse oxidativo, o que explicaria o maior

consumo de ascorbato.

4.12. Estudos em células únicas

Dando início aos primeiros estudos nos ambientes celulares, medições

preliminares foram realizadas utilizando eletrodos de platina com isolamento feito pelo

processo de revestimento com polímero não condutor (fenol).

A Figura 88 mostra o fibroblasto de estudo na qual é introduzido o

microeletrodo. Uma vez que o eletrodo integrado acarretou em aumento significativo do

diâmetro do dispositivo, os estudos realizados a seguir foram feitos utilizando 2

eletrodos: o de trabalho (microeletrodo) e o de referência colocados no meio de cultura.


Figura 88 – Imagem obtida do fibroblasto utilizando microscópio invertido.

O fibroblasto apresenta uma forma triangular e com um tamanho suficiente para

que um dispositivo do tamanho de alguns micrometros possa ser nele inserido no

mesmo.

Problemas iniciais durante a introdução dos microeletrodos nos ambientes

celulares foram encontrados devido à formação de fungos, como pode ser observado na

Figura 89. O eletrodo apresenta tamanho da ordem 1 μm e corresponde à região mais

escura na imagem. Em B nota-se que a formação de fungos causou a quebra do

eletrodo, como mostrado pela região mais escura na parte inferior da Figura 89B. O

problema da formação de fungos foi solucionado pela limpeza do eletrodo

anteriormente às medidas com soluçai de HNO3 concentrado. A Figura 90 mostra o

microeletrodo inserido dentro da região celular e um voltamograma de pulso diferencial

registrado neste microambiente.


(A) (B)

Figura 89 – Imagem obtida utilizando microscópio invertido durante o processo de formação dos fungos.


0,3 0,6 0,9 1,2

0

50

100

I / μ

A

E / V vs Ag/AgCl

Figura 90 – Imagem e registro voltamétrico no fibroblasto utilizando a técnica de pulso diferencial. Amplitude do pulso: 50 mV, largura do pulso: 70 ms e velocidade de varredura: 5 mV s. Eletrodo: Microeletrodo de Platina.

O fibroblasto empregado não tinha sofrido lesão do material genético e serviu

para estudos preliminares. Dos registros voltamétricos podem ser observados 3 picos

principais nas regiões de 0,38, 0,80 e 1,17 V. O pico em 0,80 V pode ser um indicativo

do processo de oxidação da dG na superfície do eletrodo de platina. Estudos futuros

serão realizados com eletrodo modificado com RuOHCF para verificar essa suposição.

Conclusão 167

5. Conclusão

O desenvolvimento de método alternativo para a fabricação de dispositivos de

platina, ouro e fibra de carbono de dimensões estruturalmente microscópicas com base

em processo simples e de baixo custo foi reportado. A construção de eletrodos

estruturalmente pequenos é de fundamental importância uma vez que estes dispositivos

serão a base para o monitoramento de espécies químicas em ambientes celulares, como

por exemplo, DNA e ácido ascórbico. Wightman e colaboradores (Ewing, Bigelow et

al., 1983) indicam que as dimensões desejadas para microeletrodos, quando utilizados

no monitoramento “in-vivo”, devem ser de 20 μm, em concordância com os protótipos

fabricados nessa tese. Os microeletrodos aqui apresentados foram testados de maneira

satisfatória para o monitoramento de ácido ascórbico em laranjas e no ambiente

extracelular de células neuronais.

Matrizes de microeletrodos também foram construídas com o intuito de

possibilitar uma maior gama de dispositivos para o monitoramento celular. A

construção desse tipo de dispositivo torna-se muito útil uma vez que pode-se amplificar

o sinal de corrente sem necessidade de instrumentação apropriada. A quantificação de

iodato em amostras de sal de cozinha a partir de medidas de corrente de estado

estacionário foram obtidas com o MEA. Além disso, a possibilidade de controle

individual de cada eletrodo torna-se um grande atrativo desse tipo de sensor uma vez

que o mesmo pode possibilitar a detecção simultânea de diferentes espécies.

Estudos sobre a eletroatividade do eteno aduto demonstraram resposta em uma

região muito positiva de potencial, tornando-se um problema para a detecção em

microambientes. Dessa forma, optou-se por monitor as lesões do DNA a partir do

monitoramento da dG. Com o intuito de atribuir características mais seletivas e

Conclusão 168

sensíveis ao dispositivo, estudos de modificação da superfície do eletrodo foram

realizados utilizando filmes de hexacianoferratos. De todos os filmes estudados,

somente o filme de RuOHCF demonstrou propriedades eletrocatalíticas para o processo

de oxidação da dG, assim como no caso do ácido ascórbico.

Estudos eletroquímicos foram realizados com o intuito de estudar o processo de

oxidação de ambos os compostos (dG e ácido ascórbico) no eletrodo modificado com

RuOHCF. No caso do processo de oxidação da dG sobre o eletrodo modificado em

meio ácido, o mecanismo encontrado foi do tipo Lk. Neste caso, uma máxima utilização

dos sítios catalíticos do filme é prevista. Já para o processo de oxidação do ácido

ascórbico em pH = 6,9, encontraram-se dois tipos de mecanismos, LEk e LSk (ou Sk´),

respectivamente, para concentrações maiores e menores que 2 mmol L-1.

Comparando-se esses eletrodos modificados com a metodologia utilizando

Ru(bpy)33+ em solução e DNA imobilizado na superfície do eletrodo, o sensor proposto

tem algumas vantagens como a possibilidade de catálise heterogênea. Essa característica

possibilita a detecção “in-situ”, uma vez que a introdução de determinados agentes para

promover a mediação torna-se inviável. Comparado com os eletrodos camada por

camada (catalisador + DNA), o sensor desenvolvido nessa tese viabilizaria

investigações sobre o DNA livre em solução. Adicionalmente, a maior facilidade na

preparação e o baixo custo são aspectos a serem também destacados.

O filme de RuOHCF foi utilizado no desenvolvimento de metodologia analítica

para a quantificação de dG em amostras de DNA hidrolisadas. A melhoria do processo

de transferência eletrônica permitiu um aumento significativo da sensibilidade.

Excelentes parâmetros analíticos foram alcançados usando FIA combinado com

detecção eletroquímica. A ampla faixa linear, baixo limite de detecção (94 nmol L-1),

Conclusão 169

alta freqüência analítica e relativa estabilidade são parâmetros analíticos significativos

para a detecção de dG.

Para a quantificação de ácido ascórbico em pH = 6,9 em sistema FIA, o sensor

foi polarizado em 0,4 V obtendo-se limite de detecção de 140 nmol L-1 nas condições

ótimas de trabalho. Observou-se a possibilidade de detecção de ácido ascórbico em 0 V

com um limite de detecção de 2,2 μmmol L-1, sendo esse suficiente para a quantificação

de ácido ascórbico em amostras reais e com alta seletividade quando comparado com os

outros métodos propostos na literatura (Tabela 2). A viabilidade da metodologia

proposta foi verificada para quantificação de ácido ascórbico em urina.

Em função da aplicabilidade do filme de RuOHCF para a quantificação de ácido

ascórbico em pH = 6,9, microeletrodos de fibra de carbono modificados com RuOHCF

foram utilizados para o monitoramento do consumo de ácido ascórbico em diferentes

células de neuroblastomas. O estudo sobre o consumo de ascorbato pelas células

transfectadas com SOD G93A trouxe evidências de que a SOD mutante induz uma

situação de estresse oxidativo nos neuroblastomas e que o ascorbato é um antioxidante

muito importante no combate do processo de estresse oxidativo.

Perspectivas Futuras 170

6. Perspectivas Futuras

Para o monitoramento amperométrico “in-vivo” de espécies químicas de

interesse em células individuais, alguns obstáculos devem ser ultrapassados. Problemas

relacionados com a inserção de microeletrodos de platina em fibroblastos demonstraram

a necessidade de esterilização em meio fortemente ácido para minimizar a formação de

fungos. No caso dos eletrodos modificados com filmes de RuOHCF, este procedimento

não poderá ser utilizado por causa da possível dissolução do filme. Dessa forma,

estudos futuros devem focalizar procedimentos para esterilização do eletrodo

modificado sem alterar as propriedades eletrocatalíticas do filme de RuOHCF.

Etapa posterior visa à inserção do sensor em ambientes celulares (fibroblastos ou

células neuronais) de maneira a não destruir a membrana celular e não interferir nos

processos bioquímicos. Nessa etapa, estudos utilizando outras configurações de

microeletrodos (disco, cônico) e diferentes modos de inserção no ambiente celular serão

realizados com o intuito de minimizar erros analíticos, como por exemplo,

contaminação da célula e alteração do metabolismo devido à introdução do eletrodo ao

processo de eletrólise.

Referências Bibliográficas 171

7. Referências Bibliográficas

Abbaspour, A. e M. A. Mehrgardi. Electrocatalytic Oxidation of Guanine and DNA on

a Carbon Paste Electrode Modified by Cobalt Hexacyanoferrate Films. Analytical

Chemistry, v.76, n.19, Oct, p.5690-5696. 2004.

Abbaspour, A., M. A. Mehrgardi e R. Kia. Electrocatalytic Oxidation of Guanine and

Ss-DNA at a Cobalt (II) Phthalocyanine Modified Carbon Paste Electrode. Journal of

Electroanalytical Chemistry, v.568, n.1-2, Jul, p.261-266. 2004.

Adams, R. N. Electrochemistry at Solid Electrodes. New York: Marcel Dekker. 1969

______. Probing Brain Chemistry with Electroanalytical Techniques. Analytical

Chemistry, v.48, n.14, p.1126-&. 1976.

Aguirre, N., M. F. Beal, W. R. Matson e M. B. Bogdanov. Increased Oxidative Damage

to DNA in an Animal Model of Amyotrophic Lateral Sclerosis. Free Radical Research,

v.39, n.4, Apr, p.383-388. 2005.

Albery, W. J. e A. R. Hillman. Transport and Kinetics in Modified Electrodes. Journal

of Electroanalytical Chemistry, v.170, n.1-2, p.27-49. 1984.

Araki, K. e H. E. Toma. Chemistry of Supramolecular Systems Containing Porphyrins

and Metal Complexes. Quimica Nova, v.25, n.6A, Nov-Dec, p.962-975. 2002.


Arbault, S., N. Sojic, D. Bruce, C. Amatore, A. Sarasin e M. Vuillaume. Oxidative

Stress in Cancer Prone Xeroderma Pigmentosum Fibroblasts. Real-Time and Single

Cell Monitoring of Superoxide and Nitric Oxide Production with Microelectrodes.

Carcinogenesis, v.25, n.4, Apr, p.509-515. 2004.

Armistead, P. M. e H. H. Thorp. Oxidation Kinetics of Guanine in DNA Molecules

Adsorbed onto Indium Tin Oxide Electrodes. Analytical Chemistry, v.73, n.3, p.558-

564. 2001.

Armstrongjames, M., K. Fox e J. Millar. A Method for Etching the Tips of Carbon-

Fiber Microelectrodes. Journal of Neuroscience Methods, v.2, n.4, p.431-432. 1980.

Bain, J. M. Some Morphological, Anatomical and Physiologicalchanges in the Pear

Fruit (Pyrus Communis Var. Willians Bon Chrétien) During Development and

Following Harvest. Australian Journal of Botany, v.9, p.99-123. 1992.

Baranski, A. S. Rapid Anodic-Stripping Analysis with Ultramicroelectrodes. Analytical

Chemistry, v.59, n.4, Feb, p.662-666. 1987.

Barber, S. C., R. J. Mead e P. J. Shaw. Oxidative Stress in Als: A Mechanism of

Neurodegeneration and a Therapeutic Target. Biochimica Et Biophysica Acta-

Molecular Basis of Disease, v.1762, n.11-12, Nov-Dec, p.1051-1067. 2006.

Bard, A. J. Encyclopedia of Electrochemistry of the Elements. New York: Marcel

Dekker, v.4. 1975


Bard, A. J., J. A. Crayston, G. P. Kittlesen, T. V. Shea e M. S. Wrighton. Digital-

Simulation of the Measured Electrochemical Response of Reversible Redox Couples at

Microelectrode Arrays - Consequences Arising from Closely Spaced

Ultramicroelectrodes. Analytical Chemistry, v.58, n.11, Sep, p.2321-2331. 1986.

Bard, A. J. e L. R. Faulkner. Electrochemistry Methods: Fundamentals and

Applications. New York: John Wiley & Sons. 2000

Bath, B. D., E. R. Scott, J. B. Phipps e H. S. White. Scanning Electrochemical

Microscopy of Iontophoretic Transport in Hairless Mouse Skin. Analysis of the Relative

Contributions of Diffusion, Migration, and Electroosmosis to Transport in Hair

Follicles. Journal of Pharmaceutical Sciences, v.89, n.12, Dec, p.1537-1549. 2000.

Bath, B. D., H. S. White e E. R. Scott. Visualization and Analysis of Electroosmotic

Flow in Hairless Mouse Skin. Pharmaceutical Research, v.17, n.4, Apr, p.471-475.

2000.

Belal, F. e J. L. Anderson. Flow-Injection Determination of Ergonovine Maleate with

Amperometric Detection at the Kel-F-Graphite Composite Electrode. Talanta, v.33, n.5,

May, p.448-450. 1986.

Beretta, S., G. Sala, L. Mattavelli, C. Ceresa, A. Casciati, A. Ferri, M. T. Carri e C.

Ferrarese. Mitochondrial Dysfunction Due to Mutant Copper/Zinc Superoxide


Dismutase Associated with Amyotrophic Lateral Sclerosis Is Reversed by N-

Acetylcysteine. Neurobiology of Disease, v.13, n.3, Aug, p.213-221. 2003.

Bertotti, M. e D. Pletcher. Amperometric Determination of Nitrite Via Reaction with

Iodide Using Microelectrodes. Analytica Chimica Acta, v.337, n.1, Jan, p.49-55. 1997.

Bogdanov, M., R. H. Brown, W. Matson, R. Smart, D. Hayden, H. O'donnell, M. F.

Beal e M. Cudkowicz. Increased Oxidative Damage to DNA in ALS Patients. Free

Radical Biology and Medicine, v.29, n.7, Oct, p.652-658. 2000.

Boillee, S., C. Vande Velde e D. W. Cleveland. ALS: A Disease of Motor Neurons and

Their Nonneuronal Neighbors. Neuron, v.52, n.1, Oct, p.39-59. 2006.

Bond, A. M., M. Fleischmann e J. Robinson. Electrochemistry in Organic-Solvents

without Supporting Electrolyte Using Platinum Microelectrodes. Journal of

Electroanalytical Chemistry, v.168, n.1-2, p.299-312. 1984a.

______. The Use of Platinum Microelectrodes for Electrochemical Investigations in

Low-Temperature Glasses of Non-Aqueous Solvents. Journal of Electroanalytical

Chemistry, v.180, n.1-2, p.257-263. 1984b.

Brabec, V. e G. Dryhurst. Electrochemical Behavior of Natural and Biosynthetic

Polynucleotides at Pyrolytic-Graphite Electrode a New Probe for Studies of

Polynucleotide Structure and Reactions. Journal of Electroanalytical Chemistry, v.89,

n.1, p.161-173. 1978.


Bradshaw, M. P., P. D. Prenzler e G. R. Scollary. Square-Wave Voltammetric

Determination of Hydrogen Peroxide Generated from the Oxidation of Ascorbic Acid in

a Model Wine Base. Electroanalysis, v.14, n.7-8, Apr, p.546-550. 2002.

Brett, C. M. A., A. M. O. Brett e S. H. P. Serrano. On the Adsorption and

Electrochemical Oxidation of DNA at Glassy-Carbon Electrodes. Journal of

Electroanalytical Chemistry, v.366, n.1-2, Mar, p.225-231. 1994.

Brown, G. M., D. P. Allison, R. J. Warmack, K. B. Jacobson, F. W. Larimer, R. P.

Woychik e W. L. Carrier. Electrochemically Induced Adsorption of Radiolabeled DNA

on Gold and HOPG Substrates for STM Investigations. Ultramicroscopy, v.38, n.3-4,

Dec, p.253-264. 1991.

Cahill, P. S. e R. M. Wightman. Simultaneous Amperometric Measurement of

Ascorbate and Catecholamine Secretion from Individual Bovine Adrenal-Medullary

Cells. Analytical Chemistry, v.67, n.15, Aug, p.2599-2605. 1995.

Cai, C. X., K. H. Xue e S. M. Xu. Electrocatalytic Activity of a Cobalt

Hexacyanoferrate Modified Glassy Carbon Electrode toward Ascorbic Acid Oxidation.

Journal of Electroanalytical Chemistry, v.486, n.2, May, p.111-118. 2000.

Cai, X. H., G. Rivas, P. A. M. Farias, H. Shiraishi, J. Wang e E. Palecek. Evaluation of

Different Carbon Electrodes for Adsorptive Stripping Analysis of Nucleic Acids.

Electroanalysis, v.8, n.8-9, Aug-Sep, p.753-758. 1996.


Carri, M. T., A. Ferri, M. Cozzolino, L. Calabrese e G. Rotilio. Neurodegeneration in

Amyotrophic Lateral Sclerosis: The Role of Oxidative Stress and Altered Homeostasis

of Metals. Brain Research Bulletin, v.61, n.4, Aug, p.365-374. 2003.

Cataldi, T. R. I. e G. E. De Benedetto. On the Ability of Ruthenium to Stabilize

Polynuclear Hexacyanometallate Film Electrodes. Journal of Electroanalytical

Chemistry, v.458, n.1-2, Oct, p.149-154. 1998.

Cataldi, T. R. I., G. E. De Benedetto e A. Bianchini. Electrocatalysis and Amperometric

Detection at a Ruthenium-Modified Indium-Hexacyanoferrate Film Electrode.

Electroanalysis, v.10, n.17, Dec, p.1163-1167. 1998.

______. Enhanced Stability and Electrocatalytic Activity of a Ruthenium-Modified

Cobalt-Hexacyanoferrate Film Electrode. Journal of Electroanalytical Chemistry, v.471,

n.1, Aug, p.42-47. 1999.

Caudill, W. L., J. O. Howell e R. M. Wightman. Flow-Rate Independent Amperometric

Cell. Analytical Chemistry, v.54, n.14, p.2532-2535. 1982.

Chen, S. L. e A. Kucernak. Fabrication of Carbon Microelectrodes with an Effective

Radius of 1 nm. Electrochemistry Communications, v.4, n.1, Jan, p.80-85. 2002.

Chen, S. M., M. F. Lu e K. C. Lin. Preparation and Characterization of Ruthenium

Oxide/Hexacyanoferrate and Ruthenium Hexacyanoferrate Mixed Films and Their


Electrocatalytic Properties. Journal of Electroanalytical Chemistry, v.579, n.1, May,

p.163-174. 2005.

Chen, Z. F. e Y. B. Zu. Simultaneous Detection of Ascorbic Acid and Uric Acid Using

a Fluorosurfactant-Modified Platinum Electrode. Journal of Electroanalytical

Chemistry, v.603, n.2, May, p.281-286. 2007.

Chidsey, C. E., B. J. Feldman, C. Lundgren e R. W. Murray. Micrometer-Spaced

Platinum Interdigitated Array Electrode - Fabrication, Theory, and Initial Use.

Analytical Chemistry, v.58, n.3, Mar, p.601-607. 1986.

Chien, J. B., R. A. Wallingford e A. G. Ewing. Estimation of Free Dopamine in the

Cytoplasm of the Giant Dopamine Cell of Planorbis-Corneus by Voltammetry and

Capillary Electrophoresis. Journal of Neurochemistry, v.54, n.2, Feb, p.633-638. 1990.

Ciolkowski, M. L., M. M. Fang e M. E. Lund. A Surface Plasmon Resonance Method

for Detecting Multiple Modes of DNA-Ligand Interactions. Journal of Pharmaceutical

and Biomedical Analysis, v.22, n.6, Jul, p.1037-1045. 2000.

Ciszewski, A. e G. Milczarek. Kinetics of Electrocatalytic Oxidation of Formaldehyde

on a Nickel Porphyrin-Based Glassy Carbon Electrode. Journal of Electroanalytical

Chemistry, v.469, n.1, Jun, p.18-26. 1999.

Clark, L. C., R. Wolf, D. Granger e Z. Taylor. Continuous Recording of Blood Oxygen

Tensions by Polarography. Journal of Applied Physiology, v.6, n.3, p.189-193. 1953.


Conyers, J. L. e H. S. White. Electrochemical Characterization of Electrodes with

Submicrometer Dimensions. Analytical Chemistry, v.72, n.18, Sep, p.4441-4446. 2000.

Da Silva, R. P. e S. H. P. Serrano. Electrochemical Oxidation of Biological Molecules

at Carbon Paste Electrodes Pre-Treated in Guanine Solutions. Journal of Pharmaceutical

and Biomedical Analysis, v.33, n.4, Nov, p.735-744. 2003.

Davey, M. W., M. Van Montagu, D. Inze, M. Sanmartin, A. Kanellis, N. Smirnoff, I. J.

J. Benzie, J. J. Strain, D. Favell e J. Fletcher. Plant L-Ascorbic Acid: Chemistry,

Function, Metabolism, Bioavailability and Effects of Processing. Journal of the Science

of Food and Agriculture, v.80, n.7, May, p.825-860. 2000.

De-Los-Santos-Alvarez, P., M. J. Lobo-Castanon, A. J. Miranda-Ordieres e P. Tunon-

Blanco. Electrochemistry of Nucleic Acids at Solid Electrodes and Its Applications.

Electroanalysis, v.16, n.15, Aug, p.1193-1204. 2004.

De Andrade, R. S. G., M. C. T. Diniz, E. A. Neves e J. A. Nobrega. Determination and

Distribution of Ascorbic Acid in Three Tropical Fruits. Eclética Química, v.27, p.393-

401. 2002.

De Donato, A., J. J. Pedrotti e I. G. R. Gutz. A Batch Injection Analysis System for

Ascorbic Acid Determination Using Amperometric Detection on a Sessile Mercury

Drop Electrode. Electroanalysis, v.11, n.15, Nov, p.1124-1129. 1999.


De Tacconi, N. R., K. Rajeshwar e R. O. Lezna. Metal Hexacyanoferrates:

Electrosynthesis, in Situ Characterization, and Applications. Chemistry of Materials,

v.15, n.16, Aug, p.3046-3062. 2003.

Dizdaroglu, M., P. Jaruga, M. Birincioglu e H. Rodriguez. Free Radical-Induced

Damage to DNA: Mechanisms and Measurement. Free Radical Biology and Medicine,

v.32, n.11, Jun, p.1102-1115. 2002.

Dobson, P. S., J. M. R. Weaver, M. N. Holder, P. R. Unwin e J. V. Macpherson.

Characterization of Batch-Microfabricated Scanning Electrochemical-Atomic Force

Microscopy Probes. Analytical Chemistry, v.77, n.2, Jan, p.424-434. 2005.

Doherty, A. P., M. A. Stanley e J. G. Vos. Electrocatalytic Oxidation of Ascorbic-Acid

at [Osmium(2,2'-Bipyridyl)(2)-(Poly-4-Vinylpyridine)(10)Cl]Cl Modified Electrodes -

Implications for the Development of Biosensors Based on Osmium-Containing Redox

Relays. Analyst, v.120, n.9, Sep, p.2371-2376. 1995.

Dosunmu, M. I. e E. C. Johnson. Chemical Evaluation of the Nutritive-Value and

Changes in Ascorbic-Acid Content During Storage of the Fruit of Bitter Kola (Garcinia-

Kola). Food Chemistry, v.54, n.1, p.67-71. 1995.

Dryhurst, G. Adsorption of Guanine and Guanosine at Pyrolytic Graphite Electrode -

Implications for Determination of Guanine in Presence of Guanosine. Analytica

Chimica Acta, v.57, n.1, p.137-&. 1971.


______. Electrochemical Determination of Adenine and Adenosine - Adsorption of

Adenine and Adenosine at Pyrolytic-Graphite Electrode. Talanta, v.19, n.6, p.769-&.

1972.

El-Giar, E. E. M. e D. O. Wipf. Preparation of Tip-Protected Poly (Oxyphenylene)

Coated Carbon-Fiber Ultramicroelectrodes. Electroanalysis, v.18, n.23, Dec, p.2281-

2289. 2006.

El-Maali, N. A. e J. Wang. Tris(2,2'-Bipyridyl)Dichloro-Ruthenium(II) Modified

Carbon Paste Electrodes for Electrocatalytic Detection of DNA. Sensors and Actuators

B-Chemical, v.76, n.1-3, Jun, p.211-214. 2001.

Elving, P. J. e D. L. Smith. The Graphite Electrode - an Improved Technique for

Voltammetry and Chronopotentiometry. Analytical Chemistry, v.32, n.13, p.1849-1854.

1960.

Emmerie, A. e M. Van Eekelen. The Chemical Determination of Vitamin C with

Removal of Interfering Reducing and Coloured Substances. . Biochemistry Journal,

v.28, p.1153–1154. 1934.

Esteve, M. J., R. Farre, A. Frigola, J. C. Lopez, J. M. Romera, M. Ramirez e A. Gil.

Comparison of Voltammetric and High-Performance Liquid-Chromatographic Methods

for Ascorbic-Acid Determination in Infant Formulas. Food Chemistry, v.52, n.1, p.99-

102. 1995.


Ewing, A. G., J. C. Bigelow e R. M. Wightman. Direct Invivo Monitoring of Dopamine

Released from 2 Striatal Compartments in the Rat. Science, v.221, n.4606, p.169-171.

1983.

Fang, B., S. F. Jiao, M. G. Li e H. S. Tao. Simultaneous Determination of Uric Acid and

Ascorbic Acid at a Ferrocenium-Thioglycollate Modified Electrode. Analytical and

Bioanalytical Chemistry, v.386, n.7-8, Dec, p.2117-2122. 2006.

Fang, J. L. e C. E. Vaca. Detection of DNA Adducts of Acetaldehyde in Peripheral

White Blood Cells of Alcohol Abusers. Carcinogenesis, v.18, n.4, Apr, p.627-632.

1997.

Ferrante, R. J., S. E. Browne, L. A. Shinobu, A. C. Bowling, M. J. Baik, U. Macgarvey,

N. W. Kowall, R. H. Brown e M. F. Beal. Evidence of Increased Oxidative Damage in

Both Sporadic and Familial Amyotrophic Lateral Sclerosis. Journal of Neurochemistry,

v.69, n.5, Nov, p.2064-2074. 1997.

Florou, A. B., M. I. Prodromidis, S. M. Tzouwara-Karayanni e M. I. Karayannis.

Fabrication and Voltammetric Study of Lanthanum 2,6-Dichlorophenolindophenol

Chemically Modified Screen Printed Electrodes. Application for the Determination of

Ascorbic Acid. Analytica Chimica Acta, v.423, n.1, Oct, p.107-114. 2000.

Fojta, M. Electrochemical Sensors for DNA Interactions and Damage. Electroanalysis,

v.14, n.21, Nov, p.1449-1463. 2002.


Fojta, M. e E. Palecek. Supercoiled DNA-Modified Mercury Electrode: A Highly

Sensitive Tool for the Detection of DNA Damage. Analytica Chimica Acta, v.342, n.1,

Apr, p.1-12. 1997.

Fojta, M., V. Stankova, E. Palecek, P. Koscielniak e J. Mitas. A Supercoiled DNA-

Modified Mercury Electrode-Based Biosensor for the Detection of DNA Strand

Cleaving Agents. Talanta, v.46, n.1, May, p.155-161. 1998.

Fosdick, L. E., J. L. Anderson, T. A. Baginski e R. C. Jaeger. Amperometric Response

of Microlithographically Fabricated Microelectrode Array Flow Sensors in a Thin-

Layer Channel. Analytical Chemistry, v.58, n.13, Nov, p.2750-2756. 1986.

Fraga, C. G., P. A. Motchnik, M. K. Shigenaga, H. J. Helbock, R. A. Jacob e B. N.

Ames. Ascorbic-Acid Protects against Endogenous Oxidative DNA Damage in Human

Sperm. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of

America, v.88, n.24, Dec, p.11003-11006. 1991.

Fujimoto, J. e D. F. S. Petri. Adsorption Behavior of Carboxymethylcellulose on

Amino-Terminated Surfaces. Langmuir, v.17, n.1, Jan, p.56-60. 2001.

Gao, Z. Q., J. Bobacka e A. Ivaska. Electrochemical Impedance Spectroscopy of

Cobalt(II)-Hexacyanoferrate Film Modified Electrodes. Electrochimica Acta, v.38, n.2-

3, Feb, p.379-385. 1993.


Gao, Z. Q., G. Q. Wang, P. B. Li e Z. F. Zhao. Electrochemical and Spectroscopic

Studies of Cobalt-Hexacyanoferrate Film Modified Electrodes. Electrochimica Acta,

v.36, n.1, p.147-152. 1991.

Ghoroghchian, J., F. Sarfarazi, T. Dibble, J. Cassidy, J. J. Smith, A. Russell, G.

Dunmore, M. Fleischmann e S. Pons. Electrochemistry in the Gas-Phase - Use of

Ultramicroelectrodes for the Analysis of Electroactive Species in Gas-Mixtures.

Analytical Chemistry, v.58, n.11, Sep, p.2278-2282. 1986.

Goldenberg, H. e E. Schweinzer. Transport of Vitamin-C in Animal and Human-Cells.

Journal of Bioenergetics and Biomembranes, v.26, n.4, Aug, p.359-367. 1994.

Gonon, F. G., C. M. Fombarlet, M. J. Buda e J. F. Pujol. Electrochemical Treatment of

Pyrolytic Carbon-Fiber Electrodes. Analytical Chemistry, v.53, n.9, p.1386-1389. 1981.

Gonsalves, M., A. L. Barker, J. V. Macpherson, P. R. Unwin, D. O'hare e C. P.

Winlove. Scanning Electrochemical Microscopy as a Local Probe of Oxygen

Permeability in Cartilage. Biophysical Journal, v.78, n.3, Mar, p.1578-1588. 2000.

Goodall, E. F. e K. E. Morrison. Amyotrophic Lateral Sclerosis (Motor Neuron

Disease): Proposed Mechanisms and Pathways to Treatment. Expert Reviews in

Molecular Medicine, v.8, n.11, p.1-22. 2006.

Gurney, M. E., H. F. Pu, A. Y. Chiu, M. C. Dalcanto, C. Y. Polchow, D. D. Alexander,

J. Caliendo, A. Hentati, Y. W. Kwon, H. X. Deng, W. J. Chen, P. Zhai, R. L. Sufit e T.


Siddique. Motor-Neuron Degeneration in Mice That Express a Human Cu,Zn

Superoxide-Dismutase Mutation. Science, v.264, n.5166, Jun, p.1772-1775. 1994.

Haag, H. P., L. E. Gutierrez, A. R. Dechien, F. A. A. Mourao Filho e C. S. Moreira. Six

Citrus Cultivars Comparatively Evaluated as to Their Fruit and Leaf Dry Weights and

Nutrient Concentrations. Scientia Agricola, v.50, n.2, p.193-203. 1993.

Halliwell, B. Free Radicals in Biology and Medicine. Oxford: University Press. 1999

Han, J. S., N. Kozukue, K. S. Young, K. R. Lee e M. Friedman. Distribution of

Ascorbic Acid in Potato Tubers and in Home-Processed and Commercial Potato Foods.

Journal of Agricultural and Food Chemistry, v.52, n.21, Oct, p.6516-6521. 2004.

Hecht, S. S., E. J. Mcintee e M. Y. Wang. New DNA Adducts of Crotonaldehyde and

Acetaldehyde. Toxicology, v.166, n.1-2, Sep, p.31-36. 2001.

Hepel, T. e J. Osteryoung. Chronoamperometric Transients at the Stationary Disk

Microelectrode. Journal of Physical Chemistry, v.86, n.8, p.1406-1411. 1982.

______. Electrochemical Characterization of Electrodes with Submicrometer

Dimensions. Journal of the Electrochemical Society, v.133, n.4, Apr, p.752-757. 1986.

Hermans, A. e R. M. Wightman. Conical Tungsten Tips as Substrates for the

Preparation of Ultramicroelectrodes. Langmuir, v.22, n.25, Dec, p.10348-10353. 2006.


Hogan, C. F. e R. J. Forster. Mediated Electron Transfer for Electroanalysis: Transport

and Kinetics in Tin Films of [Ru(Bpy)(2)PVP10] (ClO4)(2). Analytica Chimica Acta,

v.396, n.1, Sep, p.13-21. 1999.

Holt, K. B. e A. J. Bard. Interaction of Silver(I) Ions with the Respiratory Chain of

Escherichia Coli: An Electrochemical and Scanning Electrochemical Microscopy Study

of the Antimicrobial Mechanism of Micromolar Ag. Biochemistry, v.44, n.39, Oct,

p.13214-13223. 2005.

Howell, J. O. e R. M. Wightman. Ultrafast Voltammetry and Voltammetry in Highly

Resistive Solutions with Microvoltammetric Electrodes. Analytical Chemistry, v.56,

n.3, p.524-529. 1984a.

______. Ultrafast Voltammetry of Anthracene and 9,10-Diphenylanthracene. Journal of

Physical Chemistry, v.88, n.18, p.3915-3918. 1984b.

Huang, W., S. Zhang e Y. Wu. Electrochemical Behavior and Detection of Guanine

Using a Sodium Montmorillonite-Modified Carbon Paste Electrode. Russian Journal of

Electrochemistry, v.42, n.2, Feb, p.153-156. 2006.

Huang, W. H., D. W. Pang, H. Tong, Z. L. Wang e J. K. Cheng. A Method for the

Fabrication of Low-Noise Carbon Fiber Nanoelectrodes. Analytical Chemistry, v.73,

n.5, Mar, p.1048-1052. 2001.


Ihara, Y., K. Nobukuni, H. Takata e T. Hayabara. Oxidative Stress and Metal Content in

Blood and Cerebrospinal Fluid of Amyotrophic Lateral Sclerosis Patients with and

without a Cu, Zn-Superoxide Dismutase Mutation. Neurological Research, v.27, n.1,

Jan, p.105-108. 2005.

Ischiropoulos, H. e J. S. Beckman. Oxidative Stress and Nitration in

Neurodegeneration: Cause, Effect, or Association? Journal of Clinical Investigation,

v.111, n.2, Jan, p.163-169. 2003.

Itaya, K., T. Abe e I. Uchida. An Electrochemical Fabrication Method for Platinum

Ultramicro Disk Electrodes. Journal of the Electrochemical Society, v.134, n.5, May,

p.1191-1193. 1987.

Jelen, F., M. Fojta e E. Palecek. Voltammetry of Native Double-Stranded, Denatured

and Degraded DNAs. Journal of Electroanalytical Chemistry, v.427, n.1-2, Apr, p.49-

56. 1997.

Jelen, F., M. Tomschik e E. Palecek. Adsorptive Stripping Square-Wave Voltammetry

of DNA. Journal of Electroanalytical Chemistry, v.423, n.1-2, Feb, p.141-148. 1997.

Kafil, J. B., H. Y. Cheng e T. A. Last. Quantitation of Nucleic-Acids at the Picogram

Level Using High-Performance Liquid-Chromatography with Electrochemical

Detection. Analytical Chemistry, v.58, n.2, p.285-289. 1986.


Karyakin, A. A. Prussian Blue and Its Analogues: Electrochemistry and Analytical

Applications. Electroanalysis, v.13, n.10, Jul, p.813-819. 2001.

Keedy, F. H. e P. Vadgama. Determination of Urate in Undiluted Whole-Blood by

Enzyme Electrode. Biosensors & Bioelectronics, v.6, n.6, p.491-499. 1991.

Kennedy, R. T., H. A. Lan e C. A. Aspinwall. Extracellular pH is Required for Rapid

Release of Insulin from Zn-Insulin Precipitates in Beta-Cell Secretory Vesicles During

Exocytosis. Journal of the American Chemical Society, v.118, n.7, Feb, p.1795-1796.

1996.

Khoo, S. B. e F. Chen. Studies of Sol-Gel Ceramic Film Incorporating Methylene Blue

on Glassy Carbon: An Electrocatalytic System for the Simultaneous Determination of

Ascorbic and Uric Acids. Analytical Chemistry, v.74, n.22, Nov, p.5734-5741. 2002.

King, C. G. The Biological Synthesis of Ascorbic Acid. World Review of Nutrition and

Dietetics, v.18, p.47-59. 1973.

Kittlesen, G. P., H. S. White e M. S. Wrighton. Chemical Derivatization of

Microelectrode Arrays by Oxidation of Pyrrole and N-Methylpyrrole - Fabrication of

Molecule-Based Electronic Devices. Journal of the American Chemical Society, v.106,

n.24, p.7389-7396. 1984.

Koncki, R. Chemical Sensors and Biosensors Based on Prussian Blues. Critical

Reviews in Analytical Chemistry, v.32, n.1, p.79-96. 2002.


Kulys, J. e E. J. Dcosta. Printed Electrochemical Sensor for Ascorbic-Acid

Determination. Analytica Chimica Acta, v.243, n.2, Mar, p.173-178. 1991.

Kumtatt, L. e P. C. Leong. New Method for Determination of Ascorbic Acid in Urine.

Clinical Chemistry, v.10, n.7, p.575-&. 1964.

Langmaier, J., Z. Samec e E. Samcova. Electrochemical Oxidation of 8-Oxo-2'-

Deoxyguanosine on Glassy Carbon, Gold, Platinum and Tin(IV) Oxide Electrodes.

Electroanalysis, v.15, n.19, Oct, p.1555-1560. 2003.

Le, X. C., J. Z. Xing, J. Lee, S. A. Leadon e M. Weinfeld. Inducible Repair of Thymine

Glycol Detected by an Ultrasensitive Assay for DNA Damage. Science, v.280, n.5366,

May, p.1066-1069. 1998.

Lee, M., D. H. Hyun, P. Jenner e B. Halliwell. Effect of Overexpression of Wild-Type

and Mutant Cu/Zn-Superoxide Dismutases on Oxidative Damage and Antioxidant

Defences: Relevance to Down's Syndrome and Familial Amyotrophic Lateral Sclerosis.

Journal of Neurochemistry, v.76, n.4, Feb, p.957-965. 2001.

Lee, S. H., B. H. Jung, S. Y. Kim e B. C. Chung. A Rapid and Sensitive Method for

Quantitation of Nucleosides in Human Urine Using Liquid Chromatography/Mass

Spectrometry with Direct Urine Injection. Rapid Communications in Mass

Spectrometry, v.18, n.9, p.973-977. 2004.


Li, J. Z., M. Hu e R. Q. Yu. Pressed-Pellet Solid Potentiometric Sensor for Ascorbic

Acid Based on Derivatives of Cobalt(II) Phthalocyanine Doped with Iodine. Sensors

and Actuators B-Chemical, v.30, n.1, Jan, p.65-69. 1996.

Libioulle, L., Y. Houbion e J. M. Gilles. Very Sharp Platinum Tips for Scanning-

Tunneling-Microscopy. Review of Scientific Instruments, v.66, n.1, Jan, p.97-100.

1995.

Lin, X. Q. e G. P. Jin. Monolayer Modification of Glassy Carbon Electrode by Using

Propionylcholine for Selective Detection of Uric Acid. Electrochimica Acta, v.50, n.16-

17, May, p.3210-3216. 2005.

Lin, X. Q. e Y. X. Li. Monolayer Covalent Modification of 5-Hydroxytryptophan on

Glassy Carbon Electrodes for Simultaneous Determination of Uric Acid and Ascorbic

Acid. Electrochimica Acta, v.51, n.26, Aug, p.5794-5801. 2006.

Lipton, S. A. e P. A. Rosenberg. Tittle Mechanism of Disease: Excitatory Amino Acids

as a Final Common Pathway for Neurologic Disorders. The New England Journal of

Medicine, v.330, p.613-622. 1994.

Liu, H. Y., F. R. F. Fan, C. W. Lin e A. J. Bard. Scanning Electrochemical and

Tunneling Ultramicroelectrode Microscope for High-Resolution Examination of

Electrode Surfaces in Solution. Journal of the American Chemical Society, v.108, n.13,

Jun, p.3838-3839. 1986.


Llopis, J. Corrosion of Platinum Metals and Chemisorption. Catalysis Reviews, v.2, n.2,

p.161-&. 1968.

Loureiro, A. P. M., P. Di Mascio e M. H. G. Medeiros. Exocyclic DNA Adducts:

Implications in Mutagenesis and Carcinogenesis. Quimica Nova, v.25, n.5, Sep-Oct,

p.777-793. 2002.

Loureiro, A. P. M., S. A. Marques, C. C. M. Garcia, P. Di Mascio e M. H. G. Medeiros.

Development of an on-Line Liquid Chromatography-Electrospray Tandem Mass

Spectrometry Assay to Quantitatively Determine 1,N-2-Etheno-2'-Deoxyguanosine in

DNA. Chemical Research in Toxicology, v.15, n.10, Oct, p.1302-1308. 2002.

Mahoney, D. J., J. J. Kaczor, J. Bourgeois, N. Yasuda e M. A. Tarnopolsky. Oxidative

Stress and Antioxidant Enzyme Upregulation in SODI-G93A Mouse Skeletal Muscle.

Muscle & Nerve, v.33, n.6, Jun, p.809-816. 2006.

Malinauskas, A., R. Garjonyte, R. Mazeikiene e I. Jureviciute. Electrochemical

Response of Ascorbic Acid at Conducting and Electrogenerated Polymer Modified

Electrodes for Electroanalytical Applications: A Review. Talanta, v.64, n.1, Sep, p.121-

129. 2004.

Marnett, L. J. Oxyradicals and DNA Damage. Carcinogenesis, v.21, n.3, p.361-370.

2000.


Massey, L. D. Advanced for Medical Laboratory, "Seven Rules for Error-Free

Urinalysis". 2007 2000.

Matos, R. C., M. A. Augelli, C. L. Lago e L. Angnes. Flow Injection Analysis-

Amperometric Determination of Ascorbic and Uric Acids in Urine Using Arrays of

Gold Microelectrodes Modified by Electrodeposition of Palladium. Analytica Chimica

Acta, v.404, n.1, Jan, p.151-157. 2000.

Matsuda, T., I. Terashima, Y. Matsumoto, H. Yabushita, S. Matsui e S. Shibutani.

Effective Utilization of N-2-Ethyl-2'-Deoxyguanosine Triphosphate During DNA

Synthesis Catalyzed by Mammalian Replicative DNA Polymerases. Biochemistry, v.38,

n.3, Jan, p.929-935. 1999.

Mauzeroll, J., A. J. Bard, O. Owhadian e T. J. Monks. Menadione Metabolism to

Thiodione in Hepatoblastorna by Scanning Electrochemical Microscopy. Proceedings of

the National Academy of Sciences of the United States of America, v.101, n.51, Dec,

p.17582-17587. 2004.

May, J. M., L. Y. Li, K. Hayslett e Z. C. Qu. Ascorbate Transport and Recycling by SH-

SY5Y Neuroblastoma Cells: Response to Glutamate Toxicity. Neurochemical Research,

v.31, n.6, Jun, p.785-794. 2006.

Mbindyo, J., L. P. Zhou, Z. Zhang, J. D. Stuart e J. F. Rusling. Detection of Chemically

Induced DNA Damage by Derivative Square Wave Voltammetry. Analytical



Medeiros, M. H. G., V. M. Carvalho, L. P. Farias e A. P. M. Loureiro. DNA Damage

Induced by Secondary Lipid Oxidation Products. Ciência e Cultura, v.47, n.5/6, p.336-

339. 1995.

Meister, V. e K. Potje-Kamloth. In Situ Control of the Electrochemical Gap Height

Modification of a Suspended Gate Field-Effect Transistor by Capacitance-Voltage

Measurement Technique. Sensors and Actuators B-Chemical, v.46, n.3, Mar, p.226-

235. 1998.

Merrill, E. G. e Ainswort.A. Glass-Coated Platinum-Plated Tungsten Microelectrodes.

Medical & Biological Engineering, v.10, n.5, p.662-&. 1972.

Meulemans, A., B. Poulain, G. Baux e L. Tauc. Changes in Serotonin Concentration in

a Living Neuron - a Study by Online Intracellular Voltammetry. Brain Research, v.414,

n.1, Jun, p.158-162. 1987.

Meulemans, A., B. Poulain, G. Baux, L. Tauc e D. Henzel. Micro Carbon Electrode for

Intracellular Voltammetry. Analytical Chemistry, v.58, n.9, Aug, p.2088-2091. 1986.

Mori, V. e M. Bertotti. Amperometric Detection with Microelectrodes in Flow Injection

Analysis: Theoretical Aspects and Application in the Determination of Nitrite in Saliva.

Talanta, v.47, n.3, Nov, p.651-658. 1998.


Mosharov, E. V., L. W. Gong, B. Khanna, D. Sulzer e M. Lindau. Intracellular Patch

Electrochemistry: Regulation of Cytosolic Catecholamines in Chromaffin Cells. Journal

of Neuroscience, v.23, n.13, Jul, p.5835-5845. 2003.

Mugweru, A. e J. F. Rusling. Square Wave Voltammetric Detection of Chemical DNA

Damage with Catalytic Poly(4-Vinylpyridine)-Ru(Bpy)(2)(2+) Films. Analytical

Chemistry, v.74, n.16, p.4044-4049. 2002.

Muller, E. W. e T. T. Tsong. Field Ion Microscopy; Principles and Applications. New

York: American Elsevier Publishing Co. 1969

Napier, M. E. e H. H. Thorp. Modification of Electrodes with Dicarboxylate Self-

Assembled Monolayers for Attachment and Detection of Nucleic Acids. Langmuir,

v.13, n.23, Nov, p.6342-6344. 1997.

Okado-Matsumoto, A. e I. Fridovich. Amyotrophic Lateral Sclerosis: A Proposed

Mechanism. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of

America, v.99, n.13, Jun, p.9010-9014. 2002.

Pacey, G. E., S. D. Puckett, L. Cheng, S. Khatib-Shahidi e J. A. Cox. Detection of DNA

Damaging Agents Using Layer-by-Layer Assembly. Analytica Chimica Acta, v.533,

n.2, Mar, p.135-139. 2005.


Paixão, T. R. L. C., R. C. Matos e M. Bertotti. Development of a Dual-Band

Amperometric Detector for Determination of Ascorbic Acid and Glucose.

Electroanalysis, v.15, n.23-24, Dec, p.1884-1889. 2003.

Palecek, E. Oscillographic Polarography of Highly Polymerized Deoxyribonucleic

Acid. Nature, v.188, n.4751, p.656-657. 1960.

______. Past, Present and Future of Nucleic Acids Electrochemistry. Talanta, v.56, n.5,

Apr, p.809-819. 2002.

Palecek, E. e M. Fojta. Detecting DNA Hybridization and Damage. Analytical

Chemistry, v.73, n.3, p.74A-83A. 2001.

Pang, D. W., Y. P. Qi, Z. L. Wang, J. K. Cheng e J. W. Wang. Electrochemical

Oxidation of DNA at a Gold Microelectrode. Electroanalysis, v.7, n.8, p.774-777. 1995.

Pang, D. W., M. Zhang, Z. L. Wang, Y. P. Qi, J. K. Cheng e Z. Y. Liu. Modification of

Glassy Carbon and Gold Electrodes with DNA. Journal of Electroanalytical Chemistry,

v.403, n.1-2, Feb, p.183-188. 1996.

Park, G., R. N. Adams e W. R. White. Rapid Accurate Electrochemical Method for

Serum Uric-Acid. Analytical Letters, v.5, n.12, p.887-896. 1972.

Paul, A. A. e D. A. T. Southgate. Mccance and Widdowsons's the Composition of

Foods. Amsterdam: Elsevier. 1978


Pauliukaite, R., M. E. Ghica e C. M. A. Brett. A New, Improved Sensor for Ascorbate

Determination at Copper Hexacyanoferrate Modified Carbon Film Electrodes.

Analytical and Bioanalytical Chemistry, v.381, n.4, Feb, p.972-978. 2005.

Pavez, J., M. Paez, A. Ringuede, F. Bedioui e J. H. Zagal. Effect of Film Thickness on

the Electro-Reduction of Molecular Oxygen on Electropolymerized Cobalt Tetra-

Aminophthalocyanine Films. Journal of Solid State Electrochemistry, v.9, n.1, Jan,

p.21-29. 2005.

Phillips, D. H., P. B. Farmer, F. A. Beland, R. G. Nath, M. C. Poirier, M. V. Reddy e K.

W. Turteltaub. Methods of DNA Adduct Determination and Their Application to

Testing Compounds for Genotoxicity. Environmental and Molecular Mutagenesis, v.35,

n.3, p.222-233. 2000.

Pope, L. H., S. Allen, M. C. Davies, C. J. Roberts, S. J. B. Tendler e P. M. Williams.

Probing DNA Duplex Formation and DNA-Drug Interactions by the Quartz Crystal

Microbalance Technique. Langmuir, v.17, n.26, p.8300-8304. 2001.

Pournaghi-Azar, M. H. e H. Razmi-Nerbin. Voltammetric Behaviour and

Electrocatalytic Activity of the Aluminum Electrode Modified with Nickel and Nickel

Hexacyanoferrate Films, Prepared by Electroless Deposition. Journal of

Electroanalytical Chemistry, v.456, n.1-2, Sep, p.83-90. 1998.


Powell, P. R., L. A. Woods e A. G. Ewing. Characterization of Etched Electrochemical

Detection for Electrophoresis in Micron Inner Diameter Capillaries. Journal of

Separation Science, v.28, n.18, Dec, p.2540-2545. 2005.

Prado, C., G. U. Flechsig, P. Grundler, J. S. Foord, F. Marken e R. G. Compton.

Electrochemical Analysis of Nucleic Acids at Boron-Doped Diamond Electrodes.

Analyst, v.127, n.3, p.329-332. 2002.

Ramos, A. M. e A. Ibarz. Density of Juice and Fruit Puree as a Function of Soluble

Solids Content and Temperature. Journal of Food Engineering, v.35, n.1, Jan, p.57-63.

1998.

Ricci, F. e G. Palleschi. Sensor and Biosensor Preparation, Optimisation and

Applications of Prussian Blue Modified Electrodes. Biosensors & Bioelectronics, v.21,

n.3, Sep, p.389-407. 2005.

Rogers, K. R., A. Apostol, S. J. Madsen e C. W. Spencer. Fiber Optic Biosensor for

Detection of DNA Damage. Analytica Chimica Acta, v.444, n.1, Oct, p.51-60. 2001.

Rothstein, J. D., L. J. Martin e R. W. Kuncl. Decreased Glutamate Transport by the

Brain and Spinal-Cord in Amyotrophic-Lateral-Sclerosis. New England Journal of

Medicine, v.326, n.22, May, p.1464-1468. 1992.

Rothstein, J. D., G. C. Tsai, R. W. Kuncl, L. Clawson, D. R. Cornblath, D. B.

Drachman, A. Pestronk, B. L. Stauch e J. T. Coyle. Abnormal Excitatory Amino-Acid-


Metabolism in Amyotrophic-Lateral-Sclerosis. Annals of Neurology, v.28, n.1, Jul,

p.18-25. 1990.

Roy, P. R., M. S. Saha, T. Okajima e T. Ohsaka. Electrooxidation and Amperometric

Detection of Ascorbic Acid at Gc Electrode Modified by Electropolymerization of N,N-

Dimethylaniline. Electroanalysis, v.16, n.4, Mar, p.289-297. 2004.

______. Electrocatalytic Oxidation of Ascorbic Acid by [Fe(CN)(6)](3-/4-) Redox

Couple Electrostatically Trapped in Cationic N,N-Dimethylaniline Polymer Film

Electropolymerized on Diamond Electrode. Electrochimica Acta, v.51, n.21, Jun,

p.4447-4454. 2005.

Rueda, M., A. Aldaz e F. Sanchezburgos. Oxidation of L-Ascorbic-Acid on a Gold

Electrode. Electrochimica Acta, v.23, n.5, p.419-424. 1978.

Rusling, J. F., L. P. Zhou, B. Munge, J. Yang, C. Estavillo e J. B. Schenkman.

Applications of Polyion Films Containing Biomolecules to Sensing Toxicity. Faraday

Discussions, p.77-87. 2000.

Sacharoff, A. C., R. M. Westervelt e J. Bevk. Fabrication of Ultrathin Drawn Pt Wires

by an Extension of the Wollaston Process. Review of Scientific Instruments, v.56, n.7,

p.1344-1346. 1985.


Salimi, A., H. Mamkhezri e R. Hallaj. Simultaneous Determination of Ascorbic Acid,

Uric Acid and Neurotransmitters with a Carbon Ceramic Electrode Prepared by Sol-Gel

Technique. Talanta, v.70, n.4, Nov, p.823-832. 2006.

Sanderson, D. G. e L. B. Anderson. Filar Electrodes - Steady-State Currents and

Spectroelectrochemistry at Twin Interdigitated Electrodes. Analytical Chemistry, v.57,

n.12, p.2388-2393. 1985.

Sattsangi, P. D., N. J. Leonard e C. R. Frihart. 1,N2-Ethenoguanine and N2,3-

Ethenoguanine Synthesis and Comparison of Electronic Spectral Properties of These

Linear and Angular Triheterocycles Related to Y Bases. Journal of Organic Chemistry,

v.42, n.20, p.3292-3296. 1977.

Schulte, A. e R. H. Chow. Cylindrically Etched Carbon-Fiber Microelectrodes for Low-

Noise Amperometric Recording of Cellular Secretion. Analytical Chemistry, v.70, n.5,

Mar, p.985-990. 1998.

Sequaris, J. M. e P. Valenta. AC Voltammetry - a Control Method for the Damage to

DNA Caused Invitro by Alkylating Mutagens. Journal of Electroanalytical Chemistry,

v.227, n.1-2, Jul, p.11-20. 1987.

Sequaris, J. M., P. Valenta e H. W. Nurnberg. A New Electrochemical Approach for the

Invitro Investigation of Damage in Native DNA by Small Gamma-Radiation Doses.

International Journal of Radiation Biology, v.42, n.4, p.407-415. 1982.


Shaidarova, L. G., S. A. Ziganshina, L. N. Tikhonova e G. K. Budnikov.

Electrocatalytic Oxidation and Flow-Injection Determination of Sulfur-Containing

Amino Acids at Graphite Electrodes Modified with a Ruthenium Hexacyanoferrate

Film. Journal of Analytical Chemistry, v.58, n.12, Dec, p.1144-1150. 2003.

Shankaran, D. R. e S. S. Narayanan. Characterization and Application of an Electrode

Modified by Mechanically Immobilized Copper Hexacyanoferrate. Fresenius Journal of

Analytical Chemistry, v.364, n.8, Aug, p.686-689. 1999.

Shea, T. V. e A. J. Bard. Digital-Simulation of Homogeneous Chemical-Reactions

Coupled to Heterogeneous Electron-Transfer and Applications at Platinum Mica

Platinum Ultramicroband Electrodes. Analytical Chemistry, v.59, n.17, Sep, p.2101-

2111. 1987.

Silani, V., L. Cova, M. Corbo, A. Ciammola e E. Polli. Stem-Cell Therapy for

Amyotrophic Lateral Sclerosis. Lancet, v.364, n.9429, Jul, p.200-202. 2004.

Sinha, R., G. Block e P. R. Taylor. Determinants of Plasma Ascorbic-Acid in a Healthy

Male-Population. Cancer Epidemiology Biomarkers & Prevention, v.1, n.4, May-Jun,

p.297-302. 1992.

Sleszynski, N., J. Osteryoung e M. Carter. Arrays of Very Small Voltammetric

Electrodes Based on Reticulated Vitreous Carbon. Analytical Chemistry, v.56, n.2,

p.130-135. 1984.


Slevin, C. J., N. J. Gray, J. V. Macpherson, M. A. Webb e P. R. Unwin. Fabrication and

Characterisation of Nanometre-Sized Platinum Electrodes for Voltammetric Analysis

and Imaging. Electrochemistry Communications, v.1, n.7, Jul, p.282-288. 1999.

Smith, D. L. e P. J. Elving. Analytical Utilization of Polarographic and Voltammetric

Behavior of Purines and Pyrimidines. Analytical Chemistry, v.34, n.8, p.930-&. 1962.

Song, J. P., N. H. Pryds, K. Glejbol, K. A. Morch, A. R. Tholen e L. N. Christensen. A

Development in the Preparation of Sharp Scanning Tunneling Microscopy Tips. Review

of Scientific Instruments, v.64, n.4, Apr, p.900-903. 1993.

Sorensen, A. H., U. Hvid, M. W. Mortensen e K. A. Morch. Preparation of Platinum

Iridium Scanning Probe Microscopy Tips. Review of Scientific Instruments, v.70, n.7,

Jul, p.3059-3067. 1999.

Sosna, M., G. Denuault, R. W. Pascal, R. D. Prien e M. Mowlem. Development of a

Reliable Microelectrode Dissolved Oxygen Sensor. Sensors and Actuators B-Chemical,

v.123, n.1, Apr, p.344-351. 2007.

Strochkova, E. M., Y. I. Turyan, I. Kuselman e A. Shenhar. Simultaneous Voltammetric

Determination of Uric and Ascorbic Acids in Urine. Talanta, v.44, n.10, Oct, p.1923-

1928. 1997.

Stryer, L. Bioquímica. Rio de Janeiro: Guanabara Koogan. 1996


Stulik, K., C. Amatore, K. Holub, V. Marecek e W. Kutner. Microelectrodes.

Definitions, Characterization, and Applications (Technical Report). Pure and Applied

Chemistry, v.72, n.8, Aug, p.1483-1492. 2000.

Tarun, M. e J. F. Rusling. Quantitative Measurement of DNA Adducts Using Neutral

Hydrolysis and LC-MS. Validatilon of Genotoxicity Sensors. Analytical Chemistry,

v.77, n.7, p.2056-2062. 2005.

Terashima, I., T. Matsuda, T. W. Fang, N. Suzuki, J. Kobayashi, K. Kohda e S.

Shibutani. Miscoding Potential of the N-2-Ethyl-2'-Deoxyguanosine DNA Adduct by

the Exonuclease-Free Klenow Fragment of Escherichia Coli DNA Polymerase I.

Biochemistry, v.40, n.13, Apr, p.4106-4114. 2001.

Thormann, W., P. Vandenbosch e A. M. Bond. Voltammetry at Linear Gold and

Platinum Microelectrode Arrays Produced by Lithographic Techniques. Analytical

Chemistry, v.57, n.14, p.2764-2770. 1985.

Thorp, H. H. Cutting out the Middleman: DNA Biosensors Based on Electrochemical

Oxidation. Trends in Biotechnology, v.16, n.3, Mar, p.117-121. 1998.

Tokuda, E., S. I. Ono, K. Ishige, A. Naganuma, Y. Ito e T. Suzuki. Metallothionein

Proteins Expression, Copper and Zinc Concentrations, and Lipid Peroxidation Level in

a Rodent Model for Amyotrophic Lateral Sclerosis. Toxicology, v.229, n.1-2, Jan, p.33-

41. 2007.


Travis, E. R. e R. M. Wightman. Spatio-Temporal Resolution of Exocytosis from

Individual Cells. Annual Review of Biophysics and Biomolecular Structure, v.27, p.77-

103. 1998.

Troyer, K. P. e R. M. Wightman. Temporal Separation of Vesicle Release from Vesicle

Fusion During Exocytosis. Journal of Biological Chemistry, v.277, n.32, Aug, p.29101-

29107. 2002.

Turkusic, E., V. Milicevic, H. Tahmiscija, M. Vehabovic, S. Basic e V. Amidzic.

Amperometric Sensor for L-Ascorbic Acid Determination Based on MnO2 Bulk

Modified Screen Printed Electrode. Fresenius Journal of Analytical Chemistry, v.368,

n.5, Nov, p.466-470. 2000.

Van Eekelen, M. e A. Emmerie. Some Critical Remarks on the Determination of

Ascorbic Acid. Biochemistry Journal, v.30, p.25–27. 1936.

Van Eekelen, M. e M. Heinemann. Critical Remarks on the Determination of Urinary

Excretion of Ascorbic Acid. Journal of Clinical Investigation, v.17, n.3, p.293–299.

1938.

Varley, H. e A. H. Gowenlock. Pratical Clinical Biochemistry. London: Heinemann, v.2

Hormones, Vitamins, Dugs and Poisons. 1976


Vilas-Boas, M., E. M. Pereira, C. Freire e A. R. Hillman. Oxidation of Ferrocene

Derivatives at a Poly[Ni(SaltMe)] Modified Electrode. Journal of Electroanalytical

Chemistry, v.538, Dec, p.47-58. 2002.

Wang, C. Y., Y. J. Chen, F. X. Wang e X. Y. Hu. Fabrication of Nanometer-Sized

Carbon Electrodes by the Controllable Electrochemical Deposition. Electrochimica

Acta, v.50, n.28, Sep, p.5588-5593. 2005.

Wang, H. S., H. X. Ju e H. Y. Chen. Voltammetric Behavior and Detection of DNA at

Electrochemically Pretreated Glassy Carbon Electrode. Electroanalysis, v.13, n.13, Sep,

p.1105-1109. 2001.

Wang, J., S. Bollo, J. L. L. Paz, E. Sahlin e B. Mukherjee. Ultratrace Measurements of

Nucleic Acids by Baseline-Corrected Adsorptive Stripping Square-Wave Voltammetry.

Analytical Chemistry, v.71, n.9, May, p.1910-1913. 1999.

Wang, J., X. H. Cai, J. R. Fernandes, D. H. Grant e M. Ozsoz. Electrochemical

Measurements of Oligonucleotides in the Presence of Chromosomal DNA Using

Membrane-Covered Carbon Electrodes. Analytical Chemistry, v.69, n.19, p.4056-4059.

1997.

______. Carbon Fiber Microelectrodes for Adsorptive Stripping Analysis of Trace

Nucleic Acids. Journal of Electroanalytical Chemistry, v.441, n.1-2, Jan, p.167-172.

1998.


Wang, J., X. H. Cai, J. Y. Wang, C. Jonsson e E. Palecek. Trace Measurements of RNA

by Potentiometric Stripping Analysis at Carbon-Paste Electrodes. Analytical Chemistry,

v.67, n.22, p.4065-4070. 1995.

Wang, J., M. Chicharro, G. Rivas, X. H. Cai, N. Dontha, P. A. M. Farias e H. Shiraishi.

DNA Biosensor for the Detection of Hydrazines. Analytical Chemistry, v.68, n.13,

p.2251-2254. 1996.

Wang, J., J. R. Fernandes e L. T. Kubota. Polishable and Renewable DNA

Hybridization Biosensors. Analytical Chemistry, v.70, n.17, p.3699-3702. 1998.

Wang, J., M. Jiang e A. N. Kawde. Flow Detection of UV Radiation-Induced DNA

Damage at a Polypyrrole-Modified Electrode. Electroanalysis, v.13, n.7, May, p.537-

540. 2001.

Wang, J., M. Jiang e E. Palecek. Real-Time Monitoring of Enzymatic Cleavage of

Nucleic Acids Using a Quartz Crystal Microbalance. Bioelectrochemistry and

Bioenergetics, v.48, n.2, May, p.477-480. 1999.

Wang, J., A. N. Kawde e M. Musameh. Carbon-Nanotube-Modified Glassy Carbon

Electrodes for Amplified Label-Free Electrochemical Detection of DNA Hybridization.

Analyst, v.128, n.7, p.912-916. 2003.


Wang, J., E. Palecek, P. E. Nielsen, G. Rivas, X. H. Cai, H. Shiraishi, N. Dontha, D. B.

Luo e P. A. M. Farias. Peptide Nucleic Acid Probes for Sequence-Specific DNA

Biosensors. Journal of the American Chemical Society, v.118, n.33, p.7667-7670. 1996.

Wang, J., G. Rivas, D. B. Luo, X. H. Cai, F. S. Valera e N. Dontha. DNA-Modified

Electrode for the Detection of Aromatic Amines. Analytical Chemistry, v.68, n.24,

p.4365-4369. 1996.

Wang, M., E. J. Mcintee, G. Cheng, Y. L. Shi, P. W. Villalta e S. S. Hecht.

Identification of DNA Adducts of Acetaldehyde. Chemical Research in Toxicology,

v.13, n.11, Nov, p.1149-1157. 2000.

Wang, S. Y. e H. S. Lin. Antioxidant Activity in Fruits and Leaves of Blackberry,

Raspberry, and Strawberry Varies with Cultivar and Developmental Stage. Journal of

Agricultural and Food Chemistry, v.48, n.2, Feb, p.140-146. 2000.

Wang, Z. H., S. F. Xiao e Y. Chen. Electrocatalytic and Analytical Response of Beta-

Cyclodextrin Incorporated Carbon Nanotubes-Modified Electrodes toward Guanine.

Electroanalysis, v.17, n.22, p.2057-2061. 2005.

Warita, H., T. Hayashi, T. Murakami, Y. Manabe e K. Abe. Oxidative Damage to

Mitochondrial DNA in Spinal Motoneurons of Transgenic Als Mice. Molecular Brain

Research, v.89, n.1-2, Apr, p.147-152. 2001.


Washko, P. W., Y. H. Wang e M. Levine. Ascorbic-Acid Recycling in Human

Neutrophils. Journal of Biological Chemistry, v.268, n.21, Jul, p.15531-15535. 1993.

Watkins, J. C. e R. H. Evans. Excitatory Amino-Acid Transmitters. Annual Review of

Pharmacology and Toxicology, v.21, p.165-204. 1981.

Weisshaar, D. E., D. E. Tallman e J. L. Anderson. Kel-F-Graphite Composite Electrode

as an Electrochemical Detector for Liquid-Chromatography and Application to

Phenolic-Compounds. Analytical Chemistry, v.53, n.12, p.1809-1813. 1981.

White, H. S., G. P. Kittlesen e M. S. Wrighton. Chemical Derivatization of an Array of

3 Gold Microelectrodes with Polypyrrole - Fabrication of a Molecule-Based Transistor.

Journal of the American Chemical Society, v.106, n.18, p.5375-5377. 1984.

White, J. G. e J. W. Jorgenson. Improvements in Scanning Voltammetric Detection for

Open-Tubular Liquid-Chromatography. Analytical Chemistry, v.58, n.14, Dec, p.2992-

2995. 1986.

White, J. G., R. L. Stclaire e J. W. Jorgenson. Scanning on-Column Voltammetric

Detector for Open-Tubular Liquid-Chromatography. Analytical Chemistry, v.58, n.2,

Feb, p.293-298. 1986.

Wightman, R. M. Microvoltammetric Electrodes. Analytical Chemistry, v.53, n.9,

p.1125-&. 1981.


______. Voltammetry with Microscopic Electrodes in New Domains. Science, v.240,

n.4851, Apr, p.415-420. 1988.

______. Probing Cellular Chemistry in Biological Systems with Microelectrodes.

Science, v.311, n.5767, Mar, p.1570-1574. 2006.

Wightman, R. M., J. A. Jankowski, R. T. Kennedy, K. T. Kawagoe, T. J. Schroeder, D.

J. Leszczyszyn, J. A. Near, E. J. Diliberto e O. H. Viveros. Temporally Resolved

Catecholamine Spikes Correspond to Single Vesicle Release from Individual

Chromaffin Cells. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United

States of America, v.88, n.23, Dec, p.10754-10758. 1991.

Wightman, R. M. e D. O. Wipf. Voltammetry at Ultramicroelectrodes. Electroanalytical

Chemistry, v.15, p.267-353. 1989.

Wilson, S. S. e R. A. Guillan. Automated Measurement of Ascorbic Acid in Serum and

Urine. Clinical Chemistry, v.15, n.4, p.282-&. 1969.

Wipf, D. O., A. C. Michael e R. M. Wightman. Microdisk Electrodes. 2. Fast-Scan

Cyclic Voltammetry with Very Small Electrodes. Journal of Electroanalytical

Chemistry, v.269, n.1, Sep, p.15-25. 1989.

Woo, D. H., H. Kang e S. M. Park. Fabrication of Nanoscale Gold Disk Electrodes

Using Ultrashort Pulse Etching. Analytical Chemistry, v.75, n.23, Dec, p.6732-6736.

2003.


Wu, K. B., J. J. Fei, W. Bai e S. S. Hu. Direct Electrochemistry of DNA, Guanine and

Adenine at a Nanostructured Film-Modified Electrode. Analytical and Bioanalytical


Yang, M., R. Liu, D. Y. Hou e Y. Y. Guo. A Novel Flow-Injection Chemiluminescence

System for the Determination of Guanine. Luminescence, v.20, n.4-5, Jul-Oct, p.307-

310. 2005.

Zare, H. R., N. Nasirizadeh e M. M. Ardakani. Electrochemical Properties of a

Tetrabromo-p-Benzoquinone Modified Carbon Paste Electrode. Application to the

Simultaneous Determination of Ascorbic Acid, Dopamine and Uric Acid. Journal of

Electroanalytical Chemistry, v.577, n.1, Mar, p.25-33. 2005.

Zhang, X. J., W. M. Zhang, X. Y. Zhou e B. Ogorevc. Fabrication, Characterization,

and Potential Application of Carbon Fiber Cone Nanometer-Size Electrodes. Analytical


Zhou, L. P. e J. F. Rusling. Detection of Chemically Induced DNA Damage in Layered

Films by Catalytic Square Wave Voltammetry Using Ru(Bpy)(3)(2+). Analytical


Súmula Curricular

SÚMULA CURRICULAR

DADOS PESSOAIS Nome: Thiago Regis Longo Cesar da Paixão

Local e data de nascimento: São Paulo, 14/03/1980

EDUCAÇÃO Colégio Meninópolis, São Paulo, 1997.

Instituto de Química - Universidade de São Paulo, São Paulo, 2002.

Graduação (Bacharel em Química)


Graduação (Bacharel em Química - Opção Industrial)


Graduação (Licenciatura em Química)


Mestrado em Química (Área: Química Analítica)

OCUPAÇÃO Bolsista de Doutorado, FAPESP (03/13757-0), 30/09/2007 PUBLICAÇÕES (Artigos Completos e Resumos em Congressos)

Artigos completos publicados em periódicos

1. PAIXÃO, T. R. L. C.; BERTOTTI, M. Electrocatalytic oxidation of

deoxyguanosine on a glassy carbon electrode modified with a ruthenium oxide

hexacyanoferrate film. Electrochimica Acta, Kidlington, Oxford, v. 52, p. 2181-

2188, 2007.

Súmula Curricular

2. PAIXÃO, T. R. L. C.; CARDOSO, J. L.; BERTOTTI, M. Determination of

nitrate in mineral water and sausage samples by using a renewable in situ copper

modified electrode. Talanta (Oxford), Amsterdam, Netherlands, v. 71, p. 186-

191, 2007.

3. PAIXÃO, T. R. L. C.; CARDOSO, J. L.; BERTOTTI, M. The use of a copper

microelectrode to measure the ethanol content in gasohol samples. Fuel

(Guildford), v. 86, p. 1185-1191, 2007.

4. PEDROSA, V. A.; PAIXÃO, T. R. L. C.; Freire, R. S.; BERTOTTI, M. Studies

on the electrochemical behavior of a cystine self-assembled monolayer modified

electrode using ferrocyanide as a probe. Journal of Electroanalytical Chemistry,

v. 602, p. 149-155, 2007.

5. SALLES, M. O.; PAIXÃO, T. R. L. C.; BERTOTTI, M. Hydrogen peroxide

monitoring in photo-Fenton reactions by using a metal hexacyanoferrate

modified electrode. International Journal of Electrochemical Science, v. 2, p.

248-256, 2007.

6. PAIXÃO, T. R. L. C.; GARCIA, C. C. M.; MEDEIROS, M. H. G.; BERTOTTI,

M. Flow injection amperometric detection of 2'-deoxyguanosine at a ruthenium

oxide hexacyanoferrate modified electrode. Analytical Chemistry (Washington),

v. 79, p. 5392-5398, 2007.

7. PAIXÃO, T. R. L. C.; BERTOTTI, M.; RICHTER, E. M.; BRITO-NETO, J. G.

A. Fabrication of a new generator-collector electrochemical micro-device:

Characterization and applications. Electrochemistry Communications, New

York, NY, v. 8, p. 9-14, 2006.

8. LOWINSOHN, D.; PAIXÃO, T. R. L. C.; LOSMINSKY, L.; BERTOTTI, M.;

RAMIREZ-FERNANDEZ, F. J.; PERES, H. E. M.; FERREIRA, T. L. Design

Súmula Curricular

and fabrication of a microelectrode array for iodate quantification in small

sample volumes. Sensors and Actuators. B, Chemical, Lausanne, Switzerland, v.

113, p. 80-87, 2006.

9. PAIXÃO, T. R. L. C.; PONZIO, E. A.; TORRESI, R. M.; BERTOTTI, M.

EQCM behavior of copper anodes in alkaline medium and characterization of

the electrocatalysis of ethanol oxidation by Cu(III) . Journal of the Brazilian

Chemical Society, São Paulo, Brazil, v. 17, p. 374-381, 2006.

10. PAIXÃO, T. R. L. C.; LOWINSOHN, D.; BERTOTTI, M. Use of an

electrochemically etched platinum microelectrode for ascorbic acid mapping in

oranges. Journal of Agricultural and Food Chemistry, Washington, USA, v. 54,

p. 3072-3077, 2006.

11. PAIXÃO, T. R. L. C.; RICHTER, E. M.; BRITO-NETO, J. G. A.; BERTOTTI,

M. The use of a new twin-electrode thin-layer cell to the study of homogeneous

processes coupled to electrode reactions. Journal of Electroanalytical Chemistry,

Laussane, Switzerland, v. 596, p. 101-108, 2006.

12. PAIXÃO, T. R. L. C.; BERTOTTI, M. Development of a breath alcohol sensor

using a copper electrode in an alkaline medium. Electrochimica Acta, Laussane,

Switzerland, v. 571, p. 101-109, 2004.

13. PAIXÃO, T. R. L. C.; MATOS, R. C.; BERTOTTI, M. Design and

characterisation of a thin-layered dual-band electrochemical cell. Electrochimica

Acta, v. 48, n. 6, p. 691-698, 2003.

14. PAIXÃO, T. R. L. C.; MATOS, R. C.; BERTOTTI, M. Diffusion layer titration

of dipyrone in pharmaceuticals at a dual-band electrochemical cell. Talanta

(Oxford), v. 61, n. 5, p. 725-732, 2003.

Súmula Curricular

15. PAIXÃO, T. R. L. C.; MATOS, R. C.; BERTOTTI, M. Development of a dual-

band amperometric detector for determination of ascorbic acid and glucose.

Electroanalysis (New York), v. 15, n. 23-24, p. 1884-1889, 2003.

16. PAIXÃO, T. R. L. C.; LOSMINSKY, L.; BERTOTTI, M. Use of

electrochemically pretreated glassy carbon electrodes as pH sensors in

potentiometric titrations. Sensors and Actuators. B, Chemical, v. 87, n. 1, p. 41-

46, 2002.

17. PAIXÃO, T. R. L. C.; CORBO, D.; BERTOTTI, M. Amperometric

determination of ethanol in beverages at copper electrodes in alkaline medium.

Analytica Chimica Acta, v. 472, n. 1-2, p. 123-131, 2002.

18. PAIXÃO, T. R. L. C.; ROCHA, J. R. C.; LOSMINSKY, L.; BERTOTTI, M.

Anodic oxidation of nitrite at a molybdenum oxide layer. Electroanalysis (New

York), v. 13, n. 2, p. 155-160, 2001.

Trabalhos completos publicados em anais de congressos

1. PAIXÃO, T. R. L. C.; GARCIA, C. C. M.; MEDEIROS, M. H. G.; BERTOTTI,

M. Otimização dos parâmetros analíticos para a determinação de 2'-

desoxiguanosina em fluxo utilizando eletrodo modificado com RuOHCF. In:

XVI Simpósio Brasileiro de Eletroquímica e Eletroanalítica, 2007, Águas de

Lindóia - SP. XVI Simpósio Brasileiro de Eletroquímica e Eletroanalítica, 2007.

2. PAIXÃO, T. R. L. C.; MEDEIROS, M. H. G. ; BERTOTTI, M. Fabricação de

um eletrodo integrado visando o monitoramento de etenoautos "in-vivo". In: XV

Simpósio Brasileiro de Eletroquímica e Eletroanalítica, 2005, Londrina - PR.

XV Simpósio Brasileiro de Eletroquímica e Eletroanalítica, 2005.

Súmula Curricular

3. PAIXÃO, T. R. L. C.; CARDOSO, J. L.; BERTOTTI, M. Desenvolvimento de

método analítico para quantificação de nitrato utilizando eletrodo de cobre

modificado in-situ. In: XV Simpósio Brasileiro de Eletroquímica e

Eletroanalítica, 2005, Londrina - PR. XV Simpósio Brasileiro de Eletroquímica

e Eletroanalítica, 2005.

4. LOWINSOHN, D. ; PERES, H. E. M.; LOSMINSKY, L.; PAIXÃO, T. R. L. C.;

FERREIRA, T. L.; RAMIREZ-FERNANDEZ, F. J.; BERTOTTI, M. Matriz de

microeletrodos de ouro: caracterização e modificação da superfície por óxidos

de molibdênio. In: XIV Simpósio Brasileiro de Eletroquímica e Eletroanalítica,

2004, Teresópolis - RJ. XIV Simpósio Brasileiro de Eletroquímica e

Eletroanalítica, 2004.

5. PAIXÃO, T. R. L. C.; PONZIO, E. A.; TORRESI, R. M.; BERTOTTI, M.

Estudo eletroquímico do eletrodo de cobre em meio alcalino na presença e

ausência de etanol utilizando microbalança eletroquímica de cristal de quartzo.

In: XIV Simpósio Brasileiro de Eletroquímica e Eletroanalítica, 2004,

Teresópolis - RJ. XIV Simpósio Brasileiro de Eletroquímica e Eletroanalítica,

2004.

6. PAIXÃO, T. R. L. C.; BERTOTTI, M. Desenvolvimento de sensor para

determinação de etanol em gasolina utilizando eletrodo de cobre em meio

alcalino. In: XIV Simpósio Brasileiro de Eletroquímica e Eletroanalítica, 2004,

Teresópolis. XIV Simpósio Brasileiro de Eletroquímica e Eletroanalítica, 2004.

7. PAIXÃO, T. R. L. C.; BERTOTTI, M. Determinação simultânea de ácido

ascórbico e glicose em formulações farmacêuticas utilizando eletrodo de CD

com duas bandas. In: XIII Simpósio Brasileiro de Eletroquímica e

Súmula Curricular

Eletroanalítica, 2002, Araraquara - São Paulo. XIII Simpósio Brasileiro de

Eletroquímica e Eletroanalítica, 2002.

Resumos publicados em anais de congressos

1. PAIXÃO, T. R. L. C.; BERTOTTI, M. Electrocatalytical oxidation of guanine

and guanosine at a ruthenium hexacyanoferrate (RUHCF) film modifed

electrode. In: 57th Annual Meeting of the International Society of

Electrochemistry, 2006, Edinburgh. 57th Annual Meeting of the International

Society of Electrochemistry, 2006.

2. PAIXÃO, T. R. L. C.; JESUS, D. P.; BERTOTTI, M. Fabricação de

microeletrodos de platina por corrosão eletroquímica usando potencial alternado

de transformadores AC. In: 28 Reunião Anual da Sociedade Brasileira de

Química - SBQ, 2005, Poços de Caldas - MG. 28 Reunião Anual da Sociedade

Brasileira de Química - SBQ, 2005.

3. PAIXÃO, T. R. L. C.; LOSMINSKY, L.; BERTOTTI, M. Distribuição e

quantificação de ácido ascórbico in-situ em frutas utilizando microeletrodo de

Pt. In: 13º Encontro Nacional de Química Analítica / 1º Congresso Ibero-

Americano de Química Analítica, 2005, Niterói. 13º Encontro Nacional de

Química Analítica / 1º Congresso Ibero-Americano de Química Analítica, 2005.

4. PAIXÃO, T. R. L. C.; LOWINSOHN, D.; BERTOTTI, M. Comportamento

eletroquímico do lactato em eletrodo de cobre. In: XXXVI Congresso

latinoamericano de Química e 27a Reunião anual da Sociedade Brasileira de

Química, 2004, Salvador, 2004.

Súmula Curricular

5. PAIXÃO, T. R. L. C.; BERTOTTI, M. Anodic oxidation of copper electrodes:

toward the development of a breath alcohol sensor. In: 54th Annual Meeting of

the International Society of Electrochemistry, 2003, São Pedro - São Paulo. 54th

Annual Meeting of the International Society of Electrochemistry, 2003.

6. PAIXÃO, T. R. L. C.; MATOS, R. C.; BERTOTTI, M. Desenvolvimento de

célula em fluxo de camada delgada a partir de CD's graváveis: sistema gerador-

coletor e quantificação de dipirona. In: 26a Reunião Anual da SBQ, 2003, Poços

de Caldas - Minas Gerais, 2003.

7. PAIXÃO, T. R. L. C.; LOWINSOHN, D.; PEREIRA, A. C.; BERTOTTI, M.

Uso de microeletrodos de platina como sensor amperométrico de ácido

ascórbico em frutas. In: 26a Reunião Anual da SBQ., 2003, Poços de Caldas -

MG. 26a Reunião Anual da SBQ, 2003.

8. PAIXÃO, T. R. L. C.; LOSMINSKY, L.; BERTOTTI, M. Utilização de eletrodo

de carbo no vítreo pré-tratado como sensor de pH. In: 25a Reunião Anual da

SBQ, 2002, Poços de Caldas. 25a Reunião Anual da SBQ, 2002.

9. PAIXÃO, T. R. L. C.; LOSMINSKY, L; ROCHA, J. R. C.; BERTOTTI, M.

Oxidação do nitrito em eletrodo modificado: desenvolvimento de método

analítico para determinação em embutidos. In: 23a Reunião Anual da SBQ,

2000, Poços de Caldas. 23a Reunião Anual da SBQ, 2000.

UNIVERSIDADE DE SÃO PAULO INSTITUTO DE QUÍMICASão Paulo, São Paulo. Nesse trabalho são...

Documents

Transcript of UNIVERSIDADE DE SÃO PAULO INSTITUTO DE QUÍMICASão Paulo, São Paulo. Nesse trabalho são...