UNIVERSIDADE DE SÃO PAULO - USP · antifúngicos azólicos e também encontra-se envolvida na...

UNIVERSIDADE DE SÃO PAULO

FACULDADE DE CIÊNCIAS FARMACÊUTICAS

Programa de Pós-Graduação em Tecnologia Bioquímico-Farmacêutica

Área de Tecnologia Químico-Farmacêutica

Estudos de identificação de possíveis alvos para

nitro-compostos azometínicos ou oxadiazolínicos com

atividade antifúngica e anti-T. cruzi

Ieda Yuriko Sonehara

Tese para obtenção do grau de

DOUTOR

Orientador:

Prof. Assoc. Leoberto Costa Tavares

SÃO PAULO

2009


Estudos de identificação de possíveis alvos para

nitro-compostos azometínicos ou oxadiazolínicos com

atividade antifúngica e anti-T. cruzi

Comissão Julgadora da

Tese para obtenção do grau de Doutor

Prof. Assoc. Leoberto Costa Tavares orientador/presidente

_______________________________ 1o. examinador

_______________________________ 2o. examinador

_______________________________ 3o. examinador

_______________________________ 4o. examinador

São Paulo, __________ de 2009.

A Meus PaisA Meus PaisA Meus PaisA Meus Pais

AGRADECIMENTOS

Ao Programa de Pós-Graduação em Tecnologia Bioquímico-Farmacêutica da

Faculdade de Ciências Farmacêuticas da Universidade de São Paulo, pela

oportunidade e apoio na realização do presente trabalho.

Ao Professor Leoberto Costa Tavares, pela orientação deste trabalho, constante

apoio, incentivo e confiança, além da preciosa amizade e valiosos conselhos ao

longo destes anos de convivência.

Ao Dr. Ferran Sanz e ao Dr. Jordi Mestres, do Research Unit on Biomedical

Informatics do Institut Municipal d’Investigació Mèdica e Universitat Pompeu Fabra

(GRIB/IMIM/UPF), e colegas do Chemogenomics Laboratory/GRIB, pela

oportunidade oferecida, solicitude e meses de agradável convivência durante bolsa-

sandwich em Barcelona, Espanha.

Ao colega e amigo Salomão Dória Jorge, sempre presente e solícito, pelas

discussões e sugestões, por compartilhar seus conhecimentos e pelo auxílio

inestimável na realização deste trabalho.

À Maria das Graças Baptista Santos e Fanny Palace-Berl pela amizade, constante

troca de informações e auxílio e solicitude na preparação e realização dos ensaios

biológicos.

Aos colegas Alex de Oliveira, Fávero Paula e Marina Ishii, pelo auxílio constante,

horas de conversas, e pela convivência e companheirismo.

Ao amigos e colegas do curso de Ciências Farmacêuticas da Faculdade de

Medicina do ABC, em especial José Chisté Jr., Maria Lucila Teves e Hugo de

Alencar Isabel, e aos coordenadores Dra. Registila Beltrame e Marcelo Guimarães,

pelo apoio e compreensão durante estes anos, sem os quais não teria sido possível

dedicar as horas necessárias para a realização deste trabalho.

Aos amigos Victoria Bauld, Law Wilson, Erik Heeren e Gilberto Marques, pelas

longas conversas e apoio constantes.

Ao Jorge e Elaine, da Secretaria de Pós-Graduação, e Mirian e Elza, da Secretaria

do Departamento de Tecnologia Bioquímico-Farmacêutica, pela atenção e

solicitude.

Ao CNPq, pela bolsa de estudos no país (processo 142954/2006-3), apoio

financeiro e bolsa-sandwich (processo 201508/2007-9), sem os quais não teria sido

possível a realização deste trabalho.

A todos aqueles que de alguma forma, direta ou indiretamente, contríbuíram para a

realização deste trabalho.

i

SUMÁRIO

RESUMO.................................................................................................................................. 1

ABSTRACT.............................................................................................................................. 2

1. INTRODUÇÃO................................................................................................................. 3

2. FUNDAMENTAÇÃO BIBLIOGRÁFICA.......................................................................... 8

2.1. MÉTODOS DE PLANEJAMENTO DE FÁRMACOS AUXILIADOS POR

COMPUTADOR, CADD................................................................................................... 9

2.1.1 ANÁLISE DAS RELAÇÕES QUANTITATIVAS ENTRE ESTRUTURA

TRIDIMENSIONAL E ATIVIDADE, QSAR 3D............................................................... 15

2.2. 14α-DESMETILASE (CYP51): ESTRUTURA E FUNÇÃO ........................................... 26

2.2.1 CARACTERÍSTICAS DE COMPOSTOS INIBIDORES DE CYP51 ................. 38

3. OBJETIVOS .................................................................................................................. 44

4. EXPERIMENTAL........................................................................................................... 47

4.1. CÁLCULO DE DESCRITORES TOPOLÓGICOS......................................................... 49

4.2. ESTUDOS DE IDENTIFICAÇÃO DE POSSÍVEIS ALVOS POR COMPARAÇÃO DE

PERFIS MOLECULARES, VIRTUAL PROFILING........................................................ 53

4.3. CARACTERIZAÇÃO DA CAVIDADE CATALÍTICA DE CYP51.................................... 54

4.3.1 ESTUDOS DE INTERAÇÃO BASEADOS EM CARACTERÍSTICAS DAS

SUPERFÍCIES CATALÍTICAS DE PROTEÍNAS........................................................... 56

4.4. ESTUDOS DE ANCORAMENTO DO LIGANTE, DOCKING ........................................ 57

4.5. ANÁLISE DE PERFIL DE SOLUBILIDADE................................................................... 58

4.6. SÍNTESE........................................................................................................................ 59

4.7. DETERMINAÇÃO DE ATIVIDADE BIOLÓGICA........................................................... 60

4.7.1 ATIVIDADE ANTIFÚNGICA ............................................................................. 60

4.7.2 ATIVIDADE ANTI-T. CRUZI ............................................................................. 64

5. RESULTADOS E DISCUSSÃO .................................................................................... 66

6. CONCLUSÕES............................................................................................................ 108

7. PERSPECTIVAS FUTURAS....................................................................................... 111

8. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS........................................................................... 113

ANEXOS .............................................................................................................................. 131

ii

LISTA DE FIGURAS

Figura 1. Interrelação entre disciplinas relacionadas ao planejamento de fármacos in silico............................................................................................ 9

Figura 2. Métodos de QSAR ........................................................................ 10

Figura 3. Determinação de distância interatômica entre pares de átomos.. 14

Figura 4. Fluxo de trabalho para CoMFA. .................................................... 17

Figura 5. Processo de validação cruzada por leave-N-out........................... 23

Figura 6. Algumas reações catalizadas por enzimas da família P450. ........ 28

Figura 7. Dobramento comum de P450 mamífero ....................................... 29

Figura 8. Conservação de sequência primária em P450 ............................. 30

Figura 9. Reação da CYP51. ....................................................................... 32

Figura 10. Identidade da sequência de aminoácidos em 71 sequências da família CYP51. ............................................................................................. 32

Figura 11. Estrutura de CYP51 de M. tuberculosis em representação de Richardson. .................................................................................................. 36

Figura 12. Estruturas de alguns fármacos antifúngicos imidazólicos e triazólicos ..................................................................................................... 39

Figura 13. Interação de fluconazol no sítio catalítico de CYP51 de M.

tuberculosis. ................................................................................................. 43

Figura 14. Estrutura química geral das séries estudadas ............................ 48

Figura 15. Procedimento para cálculo de SHED.......................................... 52

Figura 16. Cavidade catalítica de CYP51 de Mycobacterium tuberculosis com CPTs em representação de superfície ................................................. 56

Figura 17. Síntese dos compostos azometínicos e oxadiazolínicos ............ 60

Figura 18. Inibição de crescimento* de formas epimastigotas de T. cruzi, cepa Y, em presença de compostos das séries azometínica e oxadiazolínica70

Figura 19. Equivalência dos átomos no sistema utilizado pelo programa Sybyl ............................................................................................................ 71

Figura 20. Estruturas dos antifúngicos azólicos selecionados para estudo . 72

Figura 21. Estruturas de compostos anti-T. cruzi ......................................... 72

iii

Figura 22. Perfis SHED das séries estudadas ............................................. 76

Figura 23. Estruturas de compostos responsáveis pelas anotações para alvos identificados em virtual profiling .......................................................... 77

Figura 24. Orientação de interação sugerida para COX-2 ........................... 78

Figura 25. Superposição de estruturas de análogo ao celecoxib (verde) e composto OxaS-CF3 (R) (azul) em orientação sugerida para interação com COX-2 .......................................................................................................... 79

Figura 26. Perfis SHED de compostos azometínicos selecionados............. 80

Figura 27. Perfis SHED de compostos oxadiazolínicos selecionados. ........ 81

Figura 28. Representação de CYP51 de M. tuberculosis............................. 83

Figura 29. Características doadoras de ligações de hidrogênio................... 85

Figura 30. Cavidade catalítica de CYP51..................................................... 88

Figura 31. Orientação de interação sugerida do composto OxaS-Cl (R) com CYP51.......................................................................................................... 89

Figura 32. Fragmentos presentes nos compostos das séries azometínica e oxadiazolínica, com os CPTs associados quando em interação com diversas proteínas*..................................................................................................... 89

Figura 33. Resultados de análise de PLS-DA ilustrando os escores das duas primeiras componentes principais para conjunto de 8 compostos*.............. 92

Figura 34. Resultados de análise de PLS-DA de conjunto de 8 compostos*: pesos............................................................................................................ 93

Figura 35. Resultados de análise de PLS-DA ilustrando os escores das duas primeiras componentes principais para conjunto de 13 compostos*............ 94

Figura 36. Resultados de análise de PLS-DA de conjunto de 13 compostos*: pesos............................................................................................................ 95

Figura 37. Perfil de descritores Volsurf para composto oxadiazolínico AzoO-CH3............................................................................................................... 96

Figura 38. Perfil de descritores Volsurf para composto oxadiazolínico OxaS-CH3 (R)......................................................................................................... 97

Figura 39. Perfil de descritores Volsurf para composto oxadiazolínico OxaS-OC4H8 (R)..................................................................................................... 98

iv

Figura 40. Mapas de contorno representando propriedades hidrofílicas (azul, sonda OH2) e lipofílicas (verde, sonda DRY) de compostos oxadiazolínicos.100

Figura 41. Volumes de contorno de compostos tiofilidênicos..................... 101

Figura 42. Orientação das conformações de interação de compostos antifúngicos em CYP51 de Cryptococcus neoformans. ............................. 102

Figura 43. Mapas de contorno representando propriedades hidrofílicas (azul, sonda OH2) e lipofílicas (verde, sonda DRY) do composto azometínico AzoO-CH3, obtidas com o programa Volsurf. ............................................. 102

Figura 44. Ligação de derivado 2-aminotetralínico no sítio ativo de CYP51 de C. albicans. ................................................................................................ 103

Figura 45. Interação de lanosterol (roxo) e fluconazol (verde) no sítio ativo de CYP51 de M. tuberculosis.......................................................................... 104

Figura 46. Fragmentos extraídos de banco de dados e respectivas regiões de CYP51 com possibilidade de interação................................................. 105

Figura 47. Proposição de características necessárias para interação de compostos oxadiazolínicos com sítio catalítico de CYP51......................... 107

v

LISTA DE TABELAS

Tabela 1. Alguns tipos de átomos utilizados pelo programa Sybyl .............. 49

Tabela 2. Alguns tipos de átomos utilizados pelo programa Sybyl e respectivas características farmacofóricas................................................... 50

Tabela 3. Proteínas selecionadas para estudo de docking .......................... 57

Tabela 4. Parâmetros de minimização utilizados no programa Sybyl 8.0 .... 58

Tabela 5. Concentração inibitória mínima, MIC, frente à cepa 537Y de C.

albicans ........................................................................................................ 67

Tabela 6. Concentração inibitória mínima, MIC, frente a cepa 537Y de C.

albicans, convertidas em potência. .............................................................. 68

Tabela 7. Inibição de crescimento de formas epimastigotas de T. cruzi, cepa Y, em presença de compostos das séries azometínica e oxadiazolínica..... 69

Tabela 8. Perfis SHED de compostos azometínicos.................................... 73

Tabela 9. Perfis SHED de compostos oxadiazolínicos ................................ 74

Tabela 10. Perfis SHED de compostos antifúngicos e anti-T.cruzi selecionados ................................................................................................ 75

Tabela 11. Resultados principais de virtual profiling .................................... 77

Tabela 12. Alguns descritores utizados pelo programa Volsurf ................... 90

vi

LISTA DE TERMOS* E ABREVIAÇÕES UTILIZADOS

AMINOÁCIDOS:

Alanina Ala A Asparagina Asn N Cisteína Cys C Prolina Pro P Ácido aspártico Asp D Glutamina Gln Q Ácido glutâmico Glu E Arginina Arg R Fenilalanina Phe F Serina Ser S Glicina Gly G Treonina Thr T Histidina His H Valina Val V Isoleucina Ile I Triptofano Trp W Lisina Lys L Tirosina Tyr Y Metionina Met M

CADD: Planejamento de Fármacos Auxiliado por Computador (Computer-

Aided Drug Design)

CoMFA: Análise Comparativa de Campos Moleculares (Comparative

Molecular Field Analysis)

CPT: Ponto Crítico (Critical Point)

Docking: exploração de possíveis modos de interação entre ligante e

biomacromolécula-alvo (estudos de ancoramento)

GRIND: Descritores Independentes de Grade (Grid Independent Descriptors)

In silico: métodos de estudo baseados em computador

LBDD: Planejamento de Fármacos Baseado Em Ligante (ligand-based drug

design)

MIF: Campos de Interação Moleculares (Molecular Interaction Fields)

MIC: Concentração Inibitória Mínima (Minimal Inhibitory Concentration)

PC: Componente Principal (Principal Component)

PCA: Análise de Componentes Principais (Principal Component Analysis)

PLS: Mínimos Quadrados Parciais (Partial Least Squares)

PLS-DA: Análise de Discriminante por Mínimos Quadrados Parciais (Partial

Least Squares Discriminant Analysis)

vii

QSAR 3D: Relações Quantitativas Tridimensionais Estrutura-Atividade

(Tridimensional Quantitative Struture-Activity Relationships)

PDB: Banco de Dados de Proteínas Brookhaven (Brookhaven Protein Data

Bank)

RMN: Ressonância Magnética Nuclear

SAR: Relações Estrutura-Atividade (Structure-Activity Relationships)

Scaffold: padrão molecular ou estrutura comum presente em compostos

químicos

SBDD: Planejamento de Fármacos Baseado em Estrutura (Structure-based

drug design)

SHED: Descritores de Entropia de Shannon (Shannon Entropy Descriptors)

Virtual profiling: procedimento de comparação de perfis moleculares para

identificação de possíveis alvos de compostos bioativos

WOMBAT™: World of Molecular Bioactivity™, banco de dados de estruturas

químicas

*Baseados em: SANT’ANNA, C.M.R. Glossário de termos usados no planejamento de fármacos (recomendações da IUPAC para 1997). Quim. Nova, São Paulo, v.25, n.3, p.505-512, 2002.

FBT/FCF/USP


1

RESUMO

Este trabalho teve como objetivo a verificação de possíveis alvos para

compostos 5-nitro-heterocílicos de estrutura azometínica e oxadiazolínica

com bioatividade dual antifúngica e anti-T. cruzi. Os compostos estudados

pertencem a quatro séries intimamente relacionadas, a saber: Série AzoO:

5-nitro-2-furfurilideno benzidrazidas 4-substituídas; Série AzoS: 5-nitro-2-

tiofilideno benzidrazidas 4-substituídas; Série OxaO: 3-acetil-oxadiazolina

2,5-furfurilideno benzidrazidas 4-substituídas e Série OxaS: 3-acetil-

oxadiazolina 2,5-tiofilideno benzidrazidas 4-substituídas.

A determinação de atividade biológica demonstrou ação antifúngica

de alguns dos compostos contra Candida albicans, ATCC 537Y, com maior

atividade do composto OxaS-CH3 (MIC 3,28 µg/mL). Foi também

demonstrada, pelo grupo de trabalho, ação inibitória de crescimento de

formas epimastigotas de Trypanosoma cruzi, cepa Y.

A análise de resultados de virtual profiling apontou entre os possíveis

alvos as enzimas CYP19A (aromatase) e CYP3A4, que apresentam também

interação com compostos azólicos de ação antifúngica cujo alvo é CYP51

(14α-desmetilase). A inibição desta enzima é responsável pela ação de

antifúngicos azólicos e também encontra-se envolvida na ação anti-T. cruzi

de compostos azólicos, e foi portanto investigada como possível alvo

responsável pela ação dual dos compostos estudados.

A caracterização da cavidade catalítica de CYP51, tanto em termos

de descritores de propriedades físico-químicas como de características

estéricas, aliada a estudos de docking, confirmou a possibilidade de

interação da série oxadiazolínica com a CYP51 em orientação semelhante à

dos antifúngicos azólicos. A série azometínica não possui conformação

adequada para a interação da forma proposta, não excluindo porém a

possibilidade de interação no sítio catalítico de forma diferente à dos

compostos oxadiazolínicos. Os resultados apresentam-se coerentes com a

maior atividade antifúngica detectada em compostos pertencentes à série

oxadiazolínica.

FBT/FCF/USP


2

ABSTRACT

This study had as objective the identification of potential targets for 5-

nitro-heterocyclic compounds with azomethynic or oxadiazolynic structures

presenting dual antifungal and anti-T. cruzi bioactivity. The studied

compounds belong to four closely related series: AzoO series: 4-substituted

5-nitro-2-furfurylidene benzhydrazides; AzoS Series: 4-substituted 5-nitro-2-

thiophylidene benzhydrazides; OxaO Series: 4-substituted 3-acetyl-

oxadiazolyne 2,5-furfurylidene benzhydrazides; and OxaS Series:

4-substituted 3-acetyl-oxadiazolyne 2,5-thiophilydene benzhydrazides.

The compounds showed antifungal activity against Candida albicans,

ATCC 537Y strain, with highest activity presented by the compound

OxaS-CH3 (MIC 3,28 µg/mL). It was also demonstrated that the compounds

present a growth inhibition action on epimastigote forms of Trypanosoma

cruzi, Y strain.

Analysis of virtual profiling results pointed among the possible targets

the P450 enzymes CYP19A (aromatase) and CYP3A4, which also interact

with azole antifungal compounds whose target is CYP51 (14α-demethylase).

The inhibition of this enzyme is responsible for the antifungal and anti-T. cruzi

activity of azole compounds, and was thus investigated as a possible target

responsible for the dual action of the studied compounds.

Characterization studies of CYP51 catalytic cavity considering not only

physicochemical properties descriptors but also steric characteristics, allied

to docking studies, confirmed the possibility of interaction of compounds from

the oxadiazolynic series with CYP51, in an orientation similar to that of azole

antifungals. The azomethynic series do not present an adequate

conformation for the interaction as proposed; however, the interaction of

compounds in a different way from that of oxadiazolynic compounds cannot

be excluded. The results are also coherent with the higher antifungal activity

detected in compounds from the oxadiazolinic series.

FBT/FCF/USP


3

1. INTRODUÇÃO

FBT/FCF/USP


4

Nos últimos anos houve aumento significativo na ocorrência de

infecções fúngicas graves devido, principalmente, ao aumento da população

suscetível. Fungos são, caracteristicamente, patógenos oportunistas, tendo

como alvo pacientes cujo sistema imunológico é incapaz de fazer frente a seu

ataque; assim, avanços na medicina tais como procedimentos de transplante

e regimes intensivos de quimioterapia acabaram por levar ao aumento no

número de pessoas expostas à infecção fúngica na medida em que tais

procedimentos tornaram-se mais comuns e/ou acessíveis, causando aumento

da população imunodeprimida [CHIH-CHENG et al, 2008]. Ao mesmo tempo,

a melhoria no acesso e qualidade do atendimento médico, aliado a um efetivo

controle da maioria das infecções bacterianas, resulta em aumento de

sobrevida em pacientes críticos, tendo como resultado um maior risco de

ocorrência de infecções fúngicas oportunistas [HOF, 2008; RICHARDSON,

LASS-FLÖRL, 2008]. A síndrome de imunodeficiência adquirida, (Acquired

Immunodeficiency Syndrome, AIDS), também possui papel importante nos

índices de morbidade e mortalidade relacionados à infecções fúngicas; em

países subdesenvolvidos ou em desenvolvimento apresentando epidemias de

AIDS, estas infecções ainda são uma importante causa de morbidade e

mortalidade [HOF, 2008].

Atualmente, apesar do aumento no número de fármacos antifúngicos

disponíveis no mercado, fatores como toxicidade, biodisponibilidade variável,

interações medicamentosas e surgimento de resistência aos diferentes

antifúngicos continuam a limitar as opções de tratamento; determinando a

necessidade constante de busca de novos compostos com atividade

antifúngica, visando à disponibilização de fármacos mais eficazes, com menor

toxicidade, maior espectro de ação e com menor tendência a causar

resistência [PASQUALOTTO, DENNING, 2008].

Em relação ao desenvolvimento de novos antifúngicos, compostos com

atividade potencial podem ser descobertos através do uso de diversos

instrumentos, seja pelos tradicionais métodos de triagem ou pela aplicação de

novas técnicas baseadas em genômica. O uso de diversas metodologias de

modificação e modelagem molecular permite o desenvolvimento de derivados

FBT/FCF/USP


5

e análogos de compostos já conhecidos, proporcionando um melhor

entendimento dos alvos e mecanismos de ação envolvidos tanto na

patogênese como na atividade antifúngica. Desta forma, é facilitado o

desenvolvimento de fármacos mais específicos, com menor toxicidade e com

melhores perspectivas em relação ao problema de desenvolvimento de

resistência fúngica [CHAPMAN, SULLIVAN, CLEARY, 2008].

A enzima 14α-desmetilase, CYP51, pertencente ao complexo do

citocromo P450, é um dos alvos da terapia antifúngica. A CYP51, parte do

caminho biossintético de esteróis, é considerada a enzima do complexo P450

mais conservada entre os reinos, estando presente em micro-organismos,

plantas e animais [LEPESHEVA, WATERMAN, 2007; LEPESHEVA et al,

2008; DEBELJAK, FINK, ROZMAN, 2003]. Os compostos azólicos, classe a

qual pertencem os antifúngicos fluconazol e cetoconazol, entre outros, atuam

inibindo a ação desta enzima através de interação com o átomo de ferro do

grupo prostético heme presente no sítio catalítico da enzima [SHENG et al,

2009; SHENG et al, 2006; JI et al, 2000]. Entre os micro-organismos, esta

enzima é considerada como alvo de interesse no desenvolvimento de novos

compostos antifúngicos, anti-T. cruzi e tuberculostáticos [LEPESHEVA et al,

2008; LEPESHEVA et al, 2007; MATSUURA et al, 2005; BUCKNER et al,

2003; VANDEN BOSSCHE, KOYMANS, 1998].

A doença de Chagas, causada pelo Trypanosoma cruzi, protozoário

flagelado pertencente à ordem Kinetoplastida, família Trypanosomatidae, é

parte do grupo das chamadas doenças negligenciadas, com estimativa de 10

a 20 milhões de pessoas afetadas, tornando-a uma das doenças parasíticas

de maior importância nas Américas [REITHINGER et al, 2009; MONCAYO,

ORTIZ YANINE, 2006]. Esta infecção é a causa mais comum de

cardiomiopatia nas Américas Central e do Sul e é a principal responsável por

mortes devido a causas cardiovasculares em áreas onde a doença é

endêmica. Em indivíduos imunodeficientes, a doença de Chagas pode ser

reativada após alcançar o estágio crônico, com um grande número de

FBT/FCF/USP


6

parasitas sendo encontrados no sangue e tecidos e levando frequentemente à

meningoencefalite severa, potencialmente fatal [REITHINGER et al, 2009].

O ciclo de vida do T. cruzi alterna hospedeiros vertebrados e insetos,

com diferentes etapas de desenvolvimento ocorrendo em cada hospedeiro

[DEVELOUS et al, 2009; MANOEL-CARNEIRO, SILVA, 2007]. A transmissão

por vetores ocorre somente nas Américas, porém a doença vem se

propagando no mundo devido à migração, estando presente nos Estados

Unidos, Europa e Japão [BERN, MONTGOMERY 2009; MILEI et al, 2009].

A eliminação da doença de Chagas implica em tratamento efetivo de

milhões de pessoas infectadas pelo T. cruzi no continente americano, assim

como em áreas não-endêmicas. Atualmente, os únicos fármacos disponíveis

para o tratamento desta doença são o nifurtimox e o benznidazol, geralmente

aceitos como eficazes no tratamento da fase aguda e crônica inicial. No

entanto, seu uso na fase crônica é ainda alvo de controvérsias e ambos os

fármacos apresentam efeitos adversos severos devido à sua toxicidade

[REITHINGER et al, 2009; JANNIN, VILLA, 2007]. O nifurtimox foi retirado do

mercado em vários países da América do Sul, sendo atualmente produzido e

utilizado principalmente na América Central [COURA, 2009]. Embora existam

avanços em estudos pré-clínicos, há mais de uma década não ocorre a

introdução de novos candidatos a fármacos em fases de estudo clínico

[REITHINGER et al, 2009].

É perceptível a necessidade da introdução de novos fármacos, tanto

antifúngicos como aqueles com ação anti-T. cruzi, de maior seletividade e

potência, menor toxicidade e capazes de atuar em casos de infecções por

micro-organismos resistentes. No caso específico da doença de Chagas, é

premente a descoberta de novos compostos que possuam menor toxicidade e

também ação na fase crônica da doença. Dentro deste cenário, compostos

nitro-heterocíclicos como os derivados 5-nitrofurfurilidênicos e 5-

nitrotiofilidênicos tem despertado grande interesse na comunidade científica

preocupada com a introdução de novos fármacos eficazes no tratamento de

FBT/FCF/USP


7

doenças infecciosas [AGUIRRE et al, 2004; CARVALHO et al, 2004;

STEWART et al, 2004].

Os compostos nitrofurânicos têm sido utilizados desde a década de 40

para o tratamento de infecções, sendo os primeiros fármacos nitro-

heterocíclicos introduzidos em quimioterapia. Estudos realizados por Dodd e

colaboradores em 1944 resultaram na descoberta do nitrofural, 5-nitro-2-

furaldeído-semicarbazona, primeiro composto 5-nitrofurânico a ser utilizado

como fármaco. A síntese e ensaio de vários compostos análogos mostrou que

a maioria apresentava amplo espectro de ação, agindo não apenas sobre

bactérias, mas também sobre protozoários. Atualmente, os derivados

5-nitrofurânicos utilizados na prática médica, humana e veterinária, são

compostos sintéticos que se caracterizam estruturalmente pela presença de

anel furânico substituído na posição 5 pelo grupo nitro, sendo esta a

subestrutura mínima necessária para a atividade antimicrobiana ou

antiparasitária destes compostos [BEALE, 2004].

Sabendo-se que a atividade de um fármaco é função de interações

físico-químicas estabelecidas entre a estrutura molecular do fármaco e seu

receptor no sistema biológico e que alterações na estrutura química do

fármaco levam a modificações das propriedades físico-químicas e, por

extensão, da atividade biológica [WATERBEEMD, ROSE, 2008; TAVARES,

2004], é possível trabalhar com variações na estrutura molecular de

derivados 5-nitro-heterocíclicos, a fim de identificar análogos com melhor

atividade intrínseca e/ou melhor perfil farmacológico. Desta forma, com

interesse na otimização do perfil farmacológico de compostos 5-nitro-

heterocíclicos, análogos à nifuroxazida, 5-nitro-2-furfurilideno

4-hidroxibenzidrazida, sintetizados anteriormente e com atividade

antibacteriana e anti-T. cruzi relatadas [PAULA et al, 2009; ALMEIDA, 2009;

MASUNARI, TAVARES, 2007; MASUNARI, TAVARES, 2006; TAVARES et al,

1999; TAVARES, PENNA, AMARAL, 1997; TAVARES, 1993], foram

selecionados para estudo quanto à atividade antifúngica e determinação dos

possíveis alvos no sistema biológico.

FBT/FCF/USP


8

2. FUNDAMENTAÇÃO

BIBLIOGRÁFICA

FBT/FCF/USP


9

2.1. MÉTODOS DE PLANEJAMENTO DE FÁRMACOS AUXILIADOS POR

COMPUTADOR, CADD

O planejamento de fármacos auxiliados por computador, CADD,

envolve disciplinas cujos limites encontram-se diluídos e frequentemente

sobrepostos [LANGER, BRYANT, 2008] (Figura 1). Entre os campos de

estudo diretamente relacionadas ao planejamento de fármacos, a modelagem

molecular utiliza um conjunto de ferramentas computacionais para a

construção, edição e visualização tridimensional de moléculas, com cálculo de

propriedades relevantes e compreensão de sua importância na interação com

biomacromoléculas-alvo. Um segundo campo envolve o estudo das relações

quantitativas entre estrutura química e atividade biológica (Quantitative

Structure-Activity Relationships, QSAR), buscando a obtenção de modelos

que permitam a previsão de propriedades relacionadas aos fármacos, com

uso de descritores frequentemente calculados por métodos de modelagem

molecular; além disso, no caso específico de QSAR 3D, a análise

conformacional de moléculas, técnica relacionada ao campo de modelagem

molecular, é uma etapa crítica uma vez que a conformação das moléculas

envolvidas é importante para o estudo da interação de ligantes com

biomacromolécula-alvo.

Figura 1. Interrelação entre disciplinas relacionadas ao planejamento de fármacos in silico

FBT/FCF/USP


10

O QSAR procura determinar a capacidade de uma molécula para

interagir com um alvo macromolecular no organismo, representada por

modelos matemáticos relacionando à características estruturais mais

importantes de um composto químico, representadas por variáveis que

descrevem alterações estruturais (descritores moleculares), com sua

respectiva influência sobre a atividade biológica (Figura 2).

Figura 2. Métodos de QSAR

Utilizam propriedades físico-químicas e dados de atividade biológica na construção de modelos capazes de aumentar a informação e compreensão existentes acerca de compostos bioativos, além da previsão de propriedades físico-químicas e de bioatividade [adaptado de WATERBEEMD, ROSE, 2008]

A quimioinformática, por sua vez, é responsável pela codificação de

compostos químicos, permitindo seu armazenamento e busca em banco de

dados; através do uso de critérios de busca como descritores calculados por

métodos de modelagem molecular ou descritores de QSAR, sendo possível a

recuperação de informações para posterior análise.

A caracterização tridimensional dos alvos e o entendimento do

mecanismo de ação são considerados essenciais para o desenvolvimento de

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11

novos fármacos, tornando possível o planejamento de compostos baseados

na estrutura do alvo biológico (structure-based drug design, SBDD).

Interações fortes e seletivas entre fármaco e biomacromolécula-alvo

dependem de complementaridade estrutural e físico-química, tornando

necessária e de grande importância a existência de informações confiáveis

sobre a estrutura das moléculas. Além disso, a determinação da estrutura

tridimensional de proteínas permite o entendimento de sua reatividade

química possibilitando, desta forma, o planejamento de ligantes

potencialmente eficazes. Técnicas computacionais permitem o descobrimento

de novos compostos-líderes baseados na recuperação de informações

detalhadas sobre o biorreceptor através de busca em banco de dados com

possibilidade de geração de estruturas químicas favoráveis à interação com o

mesmo. É comum a seleção de compostos baseada na complementaridade

estrutural com biorreceptores cujos ligantes são conhecidos, através de

técnicas de ancoramento (docking) visando à identificação de substâncias

com atividade semelhante a estes ligantes. É também possível o

planejamento de um ligante baseado nas características conhecidas do sítio-

alvo, no chamado planejamento de novo [RUGE, KORTING, BORELLI, 2005].

As metodologias in silico permitem também o planejamento de

fármacos baseados na estrutura de ligantes conhecidos (ligand-based drug

design, LBDD). Modelos de pequenas moléculas podem ser definidos com o

auxílio de técnicas envolvendo mecânica molecular, dinâmica molecular,

mecânica quântica e análise conformacional, enquanto propriedades

estruturais e físico-químicas de compostos ativos e inativos, além de relações

estrutura-atividade, podem ser utilizadas para caracterizar topograficamente

as enzimas, no procedimento conhecido como mapeamento de biorreceptores

ou identificação de farmacóforos. Em outro exemplo, modelos obtidos com

aplicação de técnicas de comparação de campos moleculares ou índices de

similaridade molecular de diferentes ligantes podem ser utilizados no

mapeamento das propriedades de receptores desconhecidos, na construção

de hipóteses de interação ligante-receptor, na otimização de estruturas-

protótipo, no planejamento de novos compostos ativos e na previsão de

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12

atividades biológicas [EKINS, MESTRES, TESTA, 2007; RUGE, KORTING,

BORELLI, 2005; MESTRES, 2004].

Para uma navegação eficiente no espaço dos ligantes (espaço químico)

com objetivo de identificação de possíveis compostos-líderes na busca de

novos fármacos é necessária a descrição dos compostos usando

propriedades adequadas (descritores) e, em seguida, a utilização de uma

equação-mestre para medir a distância entre dois compostos (similaridade

métrica). Descritores podem ser uni-, bi-, tri-, ou quadridimensionais; os mais

simples e de maior facilidade de cálculo são os descritores unidimensionais,

que descrevem propriedades globais (peso molecular, contagem de ligações e

átomos, por exemplo) que podem ser derivadas a partir da fórmula química.

Estes descritores são capazes de refletir de forma adequada o tamanho,

forma e lipofilicidade das moléculas. Por outro lado, a maior parte dos

descritores de ligantes são bidimensionais, ou seja, descritores topológicos

onde a tabela de conectividade (lista de átomos e ligações) codifica as

propriedades de átomos e ligações ao mesmo tempo. O exemplo mais

simples deste tipo de descritor é a representação 2-D da estrutura química,

que permite a busca, em uma biblioteca de ligantes, de compostos partilhando

um padrão bidimensional (fragmento, subestrutura) em particular. Os modelos

derivados com a aplicação destes descritores são habitualmente referidos

como QSAR-2D, metodologia reconhecidamente capaz de predizer

propriedades físico-químicas e estimar quantitativamente diversos efeitos

biológicos. Contrastando com os descritores bidimensionais, descritores

tridimensionais codificam propriedades relacionadas à conformação

(coordenadas atômicas, farmacóforos 3-D, campos, potenciais, espectro), e

geralmente necessitam de um alinhamento comum entre as moléculas para

permitir a comparação no mesmo espaço cartesiano, e de uma amostragem

do espaço conformacional ocupado pelas moléculas individuais. Modelos

utilizando estes descritores são conhecidos como modelos de QSAR-3D

[EKINS, MESTRES, TESTA, 2007; ROGNAN, 2007; ENGEL, 2006;

MESTRES, 2004].

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13

Com a finalidade de se evitar algumas das limitações características

dos estudos de QSAR 3D, notadamente os problemas de determinação de

conformação ativa e alinhamento adequado entre as moléculas, foi

desenvolvido o QSAR 4D, que faz uso dos conceitos da Teoria de Ensembles

da termodinâmica [LARANJEIRAS, CHIAPPIN, 2008; CRAMER, 2004]. Nesta

técnica, o conjunto total de possíveis conformações de uma molécula

(ensemble conformacional) é gerado por dinâmica molecular e utilizado para

gerar perfis que fornecem a base para a escolha de descritores e elaboração

de modelos. A quarta dimensão de uma análise de QSAR 4D é a “dimensão”

da amostragem de ensemble [HOPFINGER et al, 1997]. Os descritores

quadridimensionais, utilizados em QSAR 4D, incorporam desta forma a

variedade espacial das moléculas ao representar cada composto em

diferentes conformações, orientações, tautômeros, estereoisômeros ou

estados de protonação, com o modo de interação real ou conformação

bioativa identificada através do uso de algoritmos próprios [LILL, 2007].

Os descritores bidimensionais mais comuns utilizados na

caracterização de moléculas são as “impressões digitais” (fingerprints)

topológicas, que codificam a presença de fragmentos subestruturais em

compostos químicos [STANTON, 2008; EKINS, MESTRES, TESTA, 2007;

ESTRADA, URIARTE, 2001]. Em contraste com estes, existem os descritores

baseados na representação espacial das estruturas de moléculas; um

exemplo são os descritores baseados na superposição flexível de moléculas

sobre uma ou mais conformações bioativas de um ligante de referência.

Dentro da classe de descritores topológicos, o uso de distribuições de pares

de características centrados no átomo (atom-centered feature pairs) tem-se

mostrado eficaz em várias aplicações [EKINS, MESTRES, TESTA, 2007;

GREGORI-PUIGJANÉ, MESTRES, 2006; NETTLES et al, 2006; SCHNEIDER

et al, 1999; WILLETT, 1998].

Pares de átomos são subestruturas dentro de uma estrutura química,

consistindo de dois átomos, diferentes de H e não necessariamente

conectados entre si, e sua separação interatômica. Esta separação é medida

como a menor distância, expressa em número de ligações, conectando ambos

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14

os átomos do par escolhido (Figura 3) [GREGORI-PUIGJANÉ, MESTRES,

2006; WILLETT, 1998; CARHART, 1985]. A codificação computacional dos

descritores baseados em pares de átomos tenta capturar sua distribuição

geral em uma molécula armazenando a ocorrência das características

centradas nos pares de átomos a diferentes distâncias, seja em nível

topológico ou geométrico, formando uma representação molecular por

fingerprint compartimentalizado (binned fingerprint) [GREGORI-PUIGJANÉ,

MESTRES, 2006].

Deve-se lembrar que funções baseadas em descritores de pares de

átomos em nível geométrico requerem coordenadas tridimensionais e, desta

forma, fornecem representações dependentes da conformação da molécula; a

transformação de coordenadas atômicas bidimensionais em tridimensionais

tem a potencialidade de gerar múltiplos confôrmeros de cada molécula, sendo

que nem todas são adequadas à interação com o alvo. Por outro lado,

descritores de pares de átomos em nível topológico podem não capturar todas

as informações essenciais presentes quando se utilizam coordenadas

tridimensionais [EKINS, MESTRES, TESTA, 2007; WILLETT, 1998;

SHERIDAN et al, 1996].

distância entre par de carbonos carbonílicos = 3 distância entre par de carbonos -CO-CH2CO = 2

Figura 3. Determinação de distância interatômica entre pares de átomos

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15

2.1.1 Análise das Relações Quantitativas entre Estrutura Tridimensional e

Atividade, QSAR 3D

O QSAR tradicional, também chamado de QSAR 2D ou Análise de

Hansch [TAVARES, 2004; DEBNATH, 2001], é capaz de prever de forma

precisa a potência de compostos adicionais aos estudados inicialmente,

identificando, através das propriedades físico-químicas, quais variações

estruturais influenciam de forma mais importante as propriedades biológicas

analisadas [LANGER, BRYANT, 2008; TAVARES, 2004; DEBNATH, 2001].

Esta técnica, no entanto, apresenta limitações pelo fato de permitir aplicação

somente a conjuntos de moléculas que possuam um núcleo estrutural comum

e, principalmente, por não considerar o equilíbrio conformacional ou a

estrutura tridimensional, conhecidos fatores críticos para a interação com

biomacromoléculas e, portanto, para a determinação de atividade biológica

[LANGER, BRYANT, 2008; CRUCIANI, CAROSATI, CLEMENTI, 2003].

O QSAR 3D, por outro lado, pode ser considerado uma relação de

QSAR na qual os descritores moleculares possuem natureza tridimensional,

sendo geralmente calculados com auxílio de técnicas de modelagem

molecular. A premissa inicial deste método considera que as características

mais importantes na determinação da atividade de compostos bioativos são

forma, tamanho e propriedades eletrônicas. De modo análogo ao QSAR

tradicional ou Análise de Hansch, no QSAR 3D diversos compostos são

estudados simultaneamente em um modelo de regressão, com o objetivo de

identificar quais características moleculares influenciam de modo significativo

a resposta biológica de uma série de compostos [BLOCK, 2004; CRUCIANI,

CAROSATI, CLEMENTI, 2003].

O maior impulso no campo do QSAR 3D ocorreu com a introdução, por

Cramer, Patterson e Bunce em 1988, da técnica de Análise Comparativa de

Campos Moleculares (Comparative Molecular Field Analysis), CoMFA,

baseada em estudos anteriores desenvolvidos por Goodford [1985]. Esta

técnica, assim como ocorre em grande número das metodologias de QSAR

3D, analisa superfícies tridimensionais que representam a distribuição de

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16

propriedades físico-químicas no espaço ao redor de uma molécula; a

informação extraída deste estudo é alimentada em um protocolo de regressão

multivariada com a finalidade de obter correlações entre as características

físico-químicas e a atividade biológica desempenhada pelos compostos

estudados [BARBANY et al, 2004; CRAMER, PATTERSON, BUNCE, 1988]. O

resultado de uma análise de QSAR 3D é tipicamente apresentado como

mapas de contorno superpostos a uma molécula representativa da série de

compostos estudada, permitindo a fácil visualização das regiões do espaço

onde determinadas características físico-químicas, como por exemplo

hidrofilicidade, lipofilicidade, ou potencial elestrostático, podem ser

importantes para a interação com o receptor.

Os campos de interação molecular (Molecular Interaction Fields, MIF),

também chamados potenciais de interação molecular (Molecular Interaction

Potentials, MIP), identificam regiões onde determinados grupos químicos

podem interagir favoravelmente e são propriedades moleculares que

representam as energias de interação entre os compostos de interesse e

sondas químicas (probes) que fazem o papel de fragmentos moleculares

importantes para o reconhecimento inter-molecular. Além da aplicação em

estudos de QSAR 3D, os campos de interação molecular podem ser utilizados

em SBDD, docking de biomacromoléculas, e previsão de propriedades

farmacocinéticas [LANGER, BRYANT, 2008; SIPPL , 2002; CRUCIANI,

PASTOR, GUBA, 2000; CRUCIANI et al, 2000; CRAMER, PATTERSON,

BUNCE, 1988].

Para a determinação de MIF, os compostos em estudo são alinhados

em uma grade (grid) tridimensional virtual, com as energias de interação

composto-sonda sendo calculadas nos vértices da grade e representadas

como superfícies isopotenciais [BARBANY et al, 2004; PASTOR et al, 2004;

RODRIGO et al, 2002]. Métodos de regressão multivariada, como por exemplo

Análise de Componentes Principais (Principal Component Analysis, PCA) e

Mínimos Quadrados Parciais (Partial Least Squares, PLS), relacionam a

atividade biológica de séries de compostos com descritores baseados em MIF

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17

e são obtidos com a utilização de programas computacionais como CoMFA

[CRAMER, PATTERSON, BUNCE, 1988], GRID/GOLPE [PASTOR et al,

2000], Volsurf [CRUCIANI, PASTOR, GUBA, 2000; CRUCIANI et al, 2000] e

ALMOND [PASTOR et al, 2000] (Figura 4).

Figura 4. Fluxo de trabalho para CoMFA.

[LANGER, BRYANT, 2008]

A maior dificuldade apresentada na aplicação de métodos de QSAR 3D

dependentes de alinhamento, como CoMFA e similares, é a necessidade da

determinação da orientação espacial relativa dos ligantes, que representa

diferenças nas geometrias de ligação entre o composto e seu sítio de ligação.

Esta análise é reconhecidamente uma das etapas mais complexas e

demoradas de uma análise de campos moleculares, e determina seu sucesso

[PASTOR et al, 2000; CRAMER, PATTERSON, BUNCE, 1988]. Descritores

independentes da posição e orientação das estruturas moleculares no espaço,

como GRIND (GRid-INdependend Descriptors) [PASTOR et al, 2000], utilizado

pelo ALMOND, e os descritores utilizados pelo Volsurf foram desenvolvidos

para permitir estas análises sem a necessidade de alinhamento de moléculas.

A não-dependência do alinhamento de estruturas permite seu uso em outros

campos além do QSAR 3D, como, por exemplo, a pesquisa tridimensional,

identificação de farmacóforos e relações estrutura-metabolismo [FONTAINE et

al, 2003; PASTOR et al, 2000]. Outros descritores que procuram aproximar os

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18

métodos dependentes de alinhamento com os independentes têm sido

desenvolvidos, como é o caso de Anchor-GRIND [FONTAINE et al, 2005].

Um estudo de QSAR 3D, tipicamente CoMFA, compreende as

seguintes etapas [LANGER, BRYANT, 2008; DEBNATH, 2001]:

1. Seleção de conjunto de treinamento e conjunto de avaliação;

2. Construção tridimensional dos ligantes;

3. Alinhamento e superposição moleculares;

4. Cálculos dos descritores de campo molecular tridimensionais;

5. Geração de modelo utilizando métodos de regressão multivariada;

6. Validação cruzada do modelo (métodos de leave-one-out e leave-N-out);

7. Previsão.

A qualidade e confiabilidade de um modelo de QSAR 3D são

dependentes da análise cuidadosa de cada etapa do estudo, em especial a

determinação de conformação e superposição moleculares e os cálculos de

descritores, capazes de influenciar significativamente os resultados, mesmo

quando um mesmo conjunto inicial de compostos é utilizado na geração do

modelo [LANGER, BRYANT, 2008; DEBNATH, 2001; KLEBE, ABRAHAM,

1993]. Além disso, assim como nos métodos de QSAR tradicionais, deve-se

considerar cuidadosamente a qualidade dos resultados de atividade biológica;

idealmente, estes devem ter sido obtidos no mesmo laboratório e em

condições de ensaio idênticas, e os resultados devem abranger pelo menos

três ordens de magnitude em potência. Todos os compostos testados devem

ter o mesmo mecanismo de interação com o alvo e sua estrutura

tridimensional deve ser bem definida. Compostos nos quais a estereoquímica

é desconhecida devem ser excluídos dos estudos [LANGER, BRYANT, 2008].

Em uma análise típica de QSAR 3D é necessário o alinhamento dos

compostos de acordo com sua orientação quando ligados ao alvo, ou seja, em

sua conformação bioativa, com a superposição de todas as estruturas

tridimensionais servindo como entrada de dados (input) para os cálculos de

campo molecular. No entanto, diversos fatores colaboram para que esta

situação ideal não seja a mais frequentemente encontrada. Em primeiro lugar,

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19

mesmo que a estrutura do sítio de ligação do alvo seja conhecida, diferentes

ligantes podem interagir em diferentes orientações, sendo necessária uma

escolha que seja representativa da orientação de ligação. E, em segundo

lugar, se a estrutura do alvo não é conhecida, é necessário trabalhar com uma

orientação hipotética do ligante, com a superposição sendo realizada de

acordo com a hipótese considerada.

Deve-se lembrar que na maioria dos casos, tanto a conformação

bioativa de um composto como seu modo de ligação ao alvo não são

conhecidas. Além disso, uma desvantagem dos descritores moleculares

tridimensionais que deve ser considerada é sua sensibilidade à posição e

orientação das estruturas moleculares no espaço, resultando em diferentes

modelos gerados para um mesmo conjunto de dados em orientações

diferentes [LANGER, BRYANT, 2008]. Quando os ligantes são flexíveis a

superposição torna-se bastante complexa e, em muitos casos, completamente

subjetiva.

Uma vez que nenhum programa estatístico é capaz de detectar um mal

alinhamento, a validação do modelo de forma independente da qualidade de

superposição dos compostos é inviável; a única validação possível neste caso

é a interpretação do modelo ligada a uma análise cuidadosa dos resultados

experimentais [LANGER, BRYANT, 2008]. É compreensível, assim, o esforço

no desenvolvimento de métodos que permitam a obtenção de descritores

moleculares tridimensionais independentes de alinhamento.

Campos moleculares são definidos como sendo a área de influência de

uma determinada propriedade molecular sobre o espaço que circunda a

molécula, espaço este definido por uma grade de pontos tridimensional de

resolução conhecida, dependente do usuário, e que circunda todos os

compostos, superpostos, da série estudada [LANGER, BRYANT, 2008;

CRAMER, PATTERSON, BUNCE, 1988]. Existem várias propriedades de uma

molécula que podem ser medidas como campos, sendo as mais comuns as

propriedades estéricas e eletrostáticas [LANGER, BRYANT, 2008; CRUCIANI

et al, 2000].

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20

Para a determinação dos campos moleculares, sondas químicas

adequadas percorrem os pontos da grade virtual determinada ao redor das

moléculas; as energias de interação entre sonda e a molécula são medidas

em cada um destes nodos, produzindo ao final uma matriz de valores de

energia de interação. A função mais simples que é utilizada em campos de

força para representar a combinação das energias de dispersão e repulsão

define o potencial de Lennard-Jones (U):

612)(

AB

AB

AB

ABAB

r

b

r

arU −=

onde a e b são constantes específicas aos átomos A e B, separados por uma

distância r [CRAMER, 2004].

O potencial eletrostático molecular (Molecular Electrostatic Potential,

MEP) permite calcular o grau de atração ou repulsão entre carga pontual

unitária e molécula, sendo particularmente útil quando visualizada em

superfícies ou regiões do espaço, pois fornece informações sobre a

polaridade local. Para uma posição r, o MEP pode ser calculado por

[CRAMER, 2004]:

∑ ∫ Ψ−

Ψ−−

=núcleo

k k

kMEP drr

rrr

rr

ZrV ')'(

|'|

1)'(

||)(

onde Zk representa a carga nuclear no átomo k e Ψ é o operador

Hamiltoniano.

Os átomos ou fragmentos utilizados como sondas são aqueles típicos

de serem encontrados em uma molécula de fármaco; átomos tipicamente

utilizados são C, H, N e O. Fragmentos são comumente C=O, CO2-, NH, entre

outros [LANGER, BRYANT, 2008]. De acordo com o procedimento

computacional utilizado e da natureza da sonda, o campo de energias de

interação obtido pode representar, entre outros, campos estéricos ou

eletrostáticos, interações hidrofóbicas ou densidades eletrônicas. Estes

campos podem ser utilizados como descritores pontuais tanto da estrutura

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21

molecular tridimensional como do comportamento físico-químico da molécula,

uma vez que a maioria das propriedades relacionadas a interações

moleculares podem ser representadas por MIF. De forma geral, não se pode

dizer que existe um conjunto de descritores ideal para a obtenção de um

QSAR 3D; a escolha do conjunto a ser utilizado depende principalmente do

objetivo do estudo.

A etapa final de toda análise de QSAR 3D consiste em uma validação

estatística completa [LANGER, BRYANT, 2008], de forma a avaliar a

significância do modelo e, portanto, sua habilidade em prever atividades

biológicas de novos compostos. No entanto, análises de correlação clássicas

tais como métodos de regressão linear múltipla não são adequados em casos

de matrizes de dados não-simétricas contendo mais variáveis do que dados

observados, como é o caso dos modelos de QSAR 3D, em que existem

centenas de descritores de campos moleculares em relação ao número de

valores de atividade biológica. A validação estatística destes modelos utiliza

ferramentas não-clássicas, como PLS e PCA, que permitem a redução de

complexidade e simplificação de dados.

PCA não considera diretamente a atividade biológica, e condensa a

informação total contida nas variáveis descritivas em duas matrizes menores

em que descritores correlacionados encontram-se agrupados em uma nova

variável, chamada de componente principal. As componentes principais não

são correlacionadas e representam combinações lineares dos descritores

originais, sendo definidas em ordem decrescente da quantidade de variância

que são capazes de explicar. PLS permite a otimização das componentes

principais para descrever a relação entre descritores e atividades, através da

definição de variáveis latentes [FERREIRA, 2002; FERREIRA, MONTANARI,

GAUDIO, 2002].

O método mais comum de validação é o chamado método de validação

cruzada leave-one-out (LOO), em que um objeto é retirado do conjunto de

dados a cada vez, e previsto pelo modelo gerado em sua ausência. Após

aplicação para todos os compostos, são obtidos os parâmetros estatísticos

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22

para validação do modelo, coeficiente de correlação de validação cruzada q2 e

desvio-padrão do erro de previsão (standard deviation of error of prediction,

SDEP), que são considerados os melhores critérios de robustez e capacidade

preditiva do modelo (Figura 5). Uma variação deste método que permite a

obtenção de modelo mais robusto é a validação cruzada por leave-N-out,

onde de 20 a 30% dos objetos é retirado do conjunto de dados, devendo ser

prevista pelo modelo gerado [LANGER, BRYANT, 2008].

Deve-se lembrar que métodos de validação cruzada avaliam um

modelo pela sua capacidade preditiva e, portanto, podem levar à exclusão de

compostos que trazem informações de SAR úteis, mas que não contribuem

para a capacidade preditiva do modelo em geral [CRAMER, WENDT, 2007].

Isto pode ocorrer, por exemplo, caso um único composto possua atividade

biológica desejável devido a características também únicas; ao ser retirado do

modelo durante a análise, não é capaz de ser previsto pelo modelo gerado,

levando a um valor de q2 artificialmente diminuído e influenciando as

conclusões sobre a existência de QSAR significante. Este composto único

pode, no entanto, representar um potencial composto-líder se adequadamente

tratado.

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Figura 5. Processo de validação cruzada por leave-N-out. *SDEP = desvio-padrão do erro de previsão (Standard Deviation of Error of Prediction) [Adaptado de BLOCK, 2004]

A. Técnicas de QSAR 3D independentes de alinhamento

Com o objetivo de se evitar os problemas causados por erros durante o

procedimento de alinhamento das moléculas novos métodos para cálculo de

descritores derivados de MIFs foram desenvolvidos, sendo o GRIND e o

Volsurf os mais conhecidos.

Uma molécula pode ser caracterizada em termos de seu potencial de

formar ligações polares, hidrofóbicas, eletrostáticas e de hidrogênio no espaço

tridimensional. O Volsurf [CRUCIANI, PASTOR, GUBA, 2000] é um

procedimento computacional capaz de converter o tamanho e a distribuição

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24

espacial dos contornos destas interações moleculares em descritores

bidimensionais de significado químico claro, sem necessidade de alinhamento

das moléculas. A idéia básica é a compressão de informação presente nos

mapas tridimensionais em alguns poucos descritores numéricos

bidimensionais, facilitando o entendimento e interpretação.

Os descritores Volsurf, por codificarem propriedades físico-químicas,

são planejados especialmente para a otimização in silico de propriedades

farmacocinéticas, que são por sua vez ligadas a propriedades físico-químicas.

A metodologia utilizada pelo Volsurf, apesar de ter sido desenvolvida com foco

em relações estrutura-propriedade (Quantitative Structure-Property

Relationthips, QSPR), pode ser também aplicada a relações estrutura-

atividade e estudos de diversidade molecular baseados em propriedades da

superfície molecular [CRUCIANI, PASTOR, GUBA, 2000].

No procedimento básico, campos de interação determinados com

sonda aquosa (OH2) e hidrofóbica (DRY) são calculados para todas as

moléculas do conjunto de dados. Os descritores moleculares obtidos referem-

se a tamanho e forma moleculares, tamanho e forma de regiões hidrofílicas e

hidrofóbicas, momentos anfifílicos e parâmetros de empacotamento crítico,

entre outros.

Os descritores GRIND [PASTOR et al, 2000], utilizados no programa

ALMOND, são também derivados diretamente de MIF. Com o uso de

diferentes sondas é possível determinar um conjunto de regiões em um

ligante em que grupos de um receptor em potencial apresentam a

possibilidade de interação favorável; estas posições constituem o chamado

sítio receptor virtual (Virtual Receptor Site, VRS), que define um sítio

complementar ideal para um composto químico e representa sua habilidade

potencial de interação com uma biomacromolécula. O conjunto de variáveis

representando a relação espacial entre regiões relevantes do VRS define o

GRIND.

Uma variação do GRIND é o chamado Anchor-GRIND [FONTAINE et

al, 2005], uma aplicação particular para casos onde há pelo menos um ponto

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25

na estrutura comum dos compostos que pode ser considerado comum a todos

os elementos da série estudada, por razões químicas ou biológicas. Este

ponto comum é então utilizado como ponto de referência na determinação dos

descritores, resultando em uma descrição espacial mais precisa das regiões

MIF. Uma restrição existente desta aproximação, no entanto, é a necessidade

de uma estrutura química básica em comum para toda a série.

As características mais importantes do GRIND são sua independência

de alinhamento, rapidez de cálculo e relevância na descrição de propriedades

biológicas. A maior limitação desta metodologia é a sensibilidade à

conformação das estruturas, um problema comum nas análises de QSAR 3D;

idealmente o VRS deve ser obtido a partir da conformação bioativa do ligante,

com as sondas representando grupos químicos presentes no sítio ativo.

B. Vantagens e desvantagens dos métodos de QSAR 3D

Os métodos de QSAR 3D apresentam facilidade de visualização de

resultados finais, pois as interações favoráveis e desfavoráveis são

representadas graficamente por contornos tridimensionais ao redor de

molécula representativa da série estudada. Enquanto o QSAR tradicional não

sugere diretamente quais novos compostos podem apresentar atividade

biológica favorável, a análise das áreas onde são detectadas interações

favoráveis e desfavoráveis no QSAR 3D permite o planejamento de novas

estruturas [PATRICK, 2009].

Ao contrário dos métodos tradicionais, no QSAR 3D não existe

restrição quanto à presença de substituintes incomuns ou grau de similaridade

estrutural dentro da série de compostos a ser analisada, pois os descritores

são calculados individualmente por programas computacionais específicos; no

entanto, as moléculas devem necessariamente possuir o mesmo farmacóforo

e o mesmo mecanismo de interação com o receptor [PATRICK, 2009;

LANGER, BRYANT, 2008].

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26

Existem alguns problemas potenciais que estão intrinsecamente ligados

às metodologias de QSAR 3D; o maior deles sem dúvida envolve a

necessidade de conhecimento da conformação ativa dos compostos

estudados e, em métodos como CoMFA, o fato de ser imprescindível o

alinhamento e superposição corretos das moléculas para obtenção de um

modelo válido. Relacionado a estes dois fatores, existe também a

necessidade de similaridade na interação com o receptor, ou seja, os

compostos devem interagir com o receptor em orientação semelhante

[PATRICK, 2009; LANGER, BRYANT, 2008].

Outra desvantagem dos métodos de QSAR 3D é a limitação no

tamanho do conjunto de moléculas estudadas, não maior que algumas

centenas de compostos, impedindo seu uso em aplicações de ensaios

robotizados em grande escala, high-throughput screening, HTS, que permitem

o estudo de centenas de compostos em um período de tempo mínimo

[LANGER, BRYANT, 2008]. No entanto, Cramer e Wendt [2007]

mencionaram, em estudo recente, o uso de protocolos de alinhamento por

topômeros na obtenção de QSAR 3D que possibilita a triagem de bancos de

dados; neste tipo de protocolo, o estado conformacional inicial das moléculas

é ignorado e o alinhamento ocorre através de regras que determinam valores

de valência e geometria de anéis, com posterior padronização de torções e

quiralidade. Este tipo de protocolo considera a molécula localmente, sem

considerar presença de outros ligantes similares ou interação com cavidade

de bioreceptores.

2.2. 14α-DESMETILASE (CYP51): ESTRUTURA E FUNÇÃO

A família do citocromo P450 (CYP), existente em todos os reinos

biológicos, compreende várias enzimas contendo grupo prostético heme, cuja

função primária é a oxidação de diversos substratos hidrofóbicos. Suas

funções principais são o metabolismo de compostos exógenos em preparação

para a sua excreção, e biossíntese de moléculas sinalizadoras essenciais na

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27

homeostase e desenvolvimento dos organismos. Em mamíferos, as enzimas

do complexo P450 metabolizam fármacos e xenobióticos e estão envolvidas

na biossíntese de compostos de baixo peso molecular que atuam como

reguladores em diferentes processos no organismo [BROWN, REISFELD,

MAYENO, 2008; LAMB, WATERMAN, KELLY, 2007; OTYEPKA et al, 2007;

MESTRES, 2005; ANZENBACHER, ANZENBACHEROVÁ, 2001].

O mecanismo de ação do P450 é uma cascata complexa envolvendo

interação com outras proteínas durante o processo redox, utilizando NAD(P)H

como fonte de elétrons. As proteínas mais frequentemente envolvidas na

reação são, em eucariotas, citocromo P450 redutase e, em procariotas,

ferredoxina/ferredoxina redutase. Entre as reações enzimáticas básicas

catalizadas por CYPs encontram-se C-hidroxilação, oxigenação e

dealquilação de heteroátomos, formação de epóxido e migração de grupos.

Reações mais complexas incluem oxigenação de cloro, dealogenação

aromática, formação de dímeros, migração oxidativa de grupos arílicos e

fusão, contração, e formação de anéis [BROWN, REISFELD, MAYENO, 2008;

LAMB et al, 2007; OTYEPKA et al, 2007; DENISOV et al, 2005] (Figura 6).

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28

Figura 6. Algumas reações catalizadas por enzimas da família P450.

Extraído de LAMB et al, 2007.

Em todos os CYPs, um grupo prostético heme é ligado à proteína

através da interação do átomo de ferro em seu estado férrico com um ânion

tiolato formado pelo átomo de enxofre de uma cisteína proximal

absolutamente conservada, encontrando-se inserido entre as α-hélices I distal

e L proximal. Este ligante tiolato origina a absorbância de Soret característica

em 450 nm. A sequência primária das enzimas do complexo P450 é

diversificada, fato compreensível ao considerar-se que esta superfamília de

enzimas necessita acomodar uma grande variedade de substratos de

diferentes características tridimensionais. Embora a identidade de sequência

entre as enzimas P450 seja menor que 20%, o dobramento como um todo

permaneceu inalterado através de toda a evolução, assim como um núcleo

estrutural ligado ao grupo heme. A Figura 7 mostra o dobramento comum

encontrado em CYPs, constituído principalmente de α-hélices de arquitetura

ortogonal segundo a classificação CATH [ORENGO et al, 1997], com o

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29

segmento F/G (α-hélice F, alça F/G e α-hélice G) perpendicular à α-hélice I

altamente conservada em região muito próxima ao grupo heme. A α-hélice I

possui uma curvatura na região próxima ao grupo heme e estende-se através

de toda a estrutura do CYP [ANZENBACHER et al, 2008; OTYEPA et al,

2007; MESTRES, 2005].

Figura 7. Dobramento comum de P450 mamífero CYP2C9, código pdb 1og2 (resolução 2,6 Å), representado em cartoon. Heme em representação CPK [ANZENBACHER et al, 2008],

As regiões mais conservadas nas CYPs de mamíferos são α-hélice E,

porção C-terminal da α-hélice I, α-hélices J e K, folhas β6-1 e β1-3, α-hélices

K’ e K”, bolso cisteínico, α-hélice L, e folha β3-2 [OTYEPA et al, 2007;

MESTRES, 2005] (Figura 8). Existe ainda semelhança estrutural entre P450s

de mamíferos e micro-organismos, diferindo em detalhes que são

responsáveis por diferentes características de ligação de substrato. A maior

diferença ocorre no posicionamento das α-hélices F e G e da alça F/G, que

formam o teto da cavidade de ligação do substrato em conjunto com a alça

B/C [OTYEPA et al, 2007; PODUST, POULOS, WATERMAN, 2001].

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30

Figura 8. Conservação de sequência primária em P450

Conservação representada em valores de RMSD (desvio quadrático médio, Root Mean Square Deviation) entre estruturas de 9 citocromos P450. Variação representada em escala de cores de vermelho (mínima) a azul (máxima). Representação em cartoon de CYP101 (cód. PDB 1phc, resolução 1,6 Å). Heme em representação palito (vermelho), átomo de ferro central representado como esfera. [MESTRES, 2005].

Os CYPs são considerados de interesse no desenvolvimento de

fármacos tanto por seu papel na metabolização e processos de destoxificação

de substâncias exógenas, como pelo seu potencial como alvos para novos

fármacos quando responsáveis por processos regulatórios no metabolismo.

O combate a infecções causadas por patógenos microbianos tem

encontrado dois problemas principais, a emergência de novas espécies

patogênicas e o crescente desenvolvimento de resistência de micro-

organismos já conhecidos aos quimioterápicos tradicionalmente utilizados. A

identificação de novos alvos é uma necessidade constante dentro da busca

por fármacos quimioterápicos mais eficazes e, embora somente alguns

poucos micro-organismos tenham revelado a presença de genes codificando

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31

CYPs, a importância desta família de enzimas para o metabolismo e

desenvolvimento de organismos leva a um crescente interesse no seu uso

como alvo potencial para fármacos quimioterápicos [LAMB et al, 2007].

Os CYPs catalizam ainda uma grande parte das reações mais

complexas na biossíntese de diversos produtos naturais utilizados na prática

médica, como por exemplo vancomicina, anfotericina B, artemisina e taxol

entre muitos outros. Na maioria dos casos, as enzimas do P450 possuem

papel essencial nos processos oxidativos que levam à biossíntese final destes

compostos. A manipulação genética destes sistemas enzimáticos, por

exemplo através de deleção ou mutação de aminoácidos na sequência

proteica da enzima, pode permitir a obtenção de compostos modificados com

finalidade de melhoria de atividade ou diminuição de toxicidade [LAMB et al,

2007].

Entre os CYPs humanos somente o CYP19A1, aromatase, enzima

envolvida na biosíntese de estrogênio, é um alvo estabelecido. Inibidores de

aromatase são utilizados no tratamento de tumores estrogênio-dependentes.

O CYP5A1, tromboxana sintase, permanece como alvo em potencial para

compostos com atividade anticoagulante. Em micro-organismos, a CYP51,

14α-desmetilase, é alvo de antifúngicos azólicos, além de representar um

possível alvo na terapia anti-T. cruzi e anti-leishmania [LAMB et al, 2007;

LEPESHEVA et al, 2007]. O CYP121 é um alvo válido para compostos

azólicos com potencial atividade frente a micobactérias [LAMB et al, 2007;

SEWARD, et al, 2006; MUNRO et al, 2003].

A CYP51 é parte do caminho biossintético de esteróis, sendo notável

por ser a única da família P450 encontrada em todos os reinos biológicos,

estando presente em mais de 80 organismos entre bactérias, eucariotas

inferiores, plantas, fungos e mamíferos [JACKSON et al, 2008; LEPESHEVA,

WATERMAN, 2007]; além disso, diversas plantas e fungos apresentam

múltiplos genes CYP51, de forma que o número de sequências conhecidas

ultrapassa a 100. A 14α-desmetilase de todos os filos é classificada como

uma única família de P450 devido à manutenção estrita de sua função,

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32

catalisando uma reação regio- e estereoespecífica de remoção oxidativa do

grupo 14α-metil de precursores de esteróis formados a partir da ciclização do

esqualeno-2,3-epóxido (Figura 9). A identidade da sequência total de

aminoácidos na família da CYP51 é de cerca de 30%, variando conforme a

proximidade evolutiva das espécies, sendo em média de 23% – 34% entre os

reinos biológicos [LEPESHEVA, WATERMAN, 2007] (Figura 10)

Figura 9. Reação da CYP51. Grupo 14α-metil oxidado sequencialmente a álcool e aldeído, seguido de remoção de ácido fórmico e introdução de ligação dupla ∆14,15. Lanosterol (L), 24,25-diidrolanosterol (D) e 24-metilenodiidro-lanosterol (M) são substratos fisiológicos de CYP51 de mamíferos e fungos; obtusifoliol (O) é substrato fisiológico de plantas; norlanosterol (N), substrato fisiológico de Trypanosoma brucei. [LEPESHEVA et al, 2006]

Figura 10. Identidade da sequência de aminoácidos em 71 sequências da família CYP51. *número de sequências no alinhamento/porcentagem de identidade [LEPESHEVA, WATERMAN, 2007]

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Desde sua descoberta, a CYP51 de Mycobacterium tuberculosis,

ortólogo solúvel de seus equivalentes eucarióticos ligados à membrana, serve

de modelo de homologia e modelagem tridimensional de interações CYP51-

inibidores em patógenos microbianos [EDDINE et al, 2008]. Este CYP51

procariótico possui, no entanto, estrutura substancialmente diferente das

isoformas eucarióticas, principalmente na região que define o canal de acesso

ao substrato, embora apresente in vitro a atividade específica de 14α-

desmetilase; níveis de esteróis mais baixos que em fungos foram detectados

em M. smegmatis, embora não se saiba ainda qual o papel exato dos esteróis

em procariotas [JACKSON et al, 2000; EDDINE et al, 2008]. Embora

inibidores de CYP51, especificamente azóis, exerçam atividade tóxica sobre

M. tuberculosis, esta atividade não é suficiente ainda para ser de utilidade

terapêutica [JACKSON et al, 2008].

A reação catalizada pela CYP51 envolve a remoção da metila na

posição C14 de precursores 14α-metil-esteroidais e ocorre em três etapas,

cada uma necessitando de oxigênio e NADPH, através da conversão do grupo

14α-metil sucessivamente em 14α-carboxiálcool e 14α-carboxialdeído, com

este grupo sendo liberado na última etapa como ácido fórmico, com formação

de uma dupla ∆14.15 no núcleo esteroidal (Figura 9, p. 32) [LEPESHEVA,

WATERMAN, 2007; PODUST, POULOS, WATERMAN, 2001]. Os produtos

14α-desmetilados são intermediários em caminhos biossintéticos, resultando

em colesterol em animais, ergosterol em fungos e diversos esteróis olefinados

e 24-alquilados em plantas, algas e protozoários. Normalmente as reações

ocorrem no retículo endoplasmático, porém existem evidências de que em

kinetoplastídeos a biossíntese de esteróis possa ocorrer na mitocôndria

[LEPESHEVA, WATERMAN, 2007]. Esteróis volumosos como colesterol,

ergosterol e sitosterol (plantas) são componentes da membrana plasmática,

tendo papel estrutural importante na regulação da fluidez e permeabilidade de

membrana, além de modular indiretamente a atividade e distribuição de

proteínas integrais de membrana, incluindo enzimas, canais iônicos e

componentes dos caminhos de transdução de sinais [LEPESHEVA,

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34

WATERMAN, 2007]. Além disso, esteróis servem como precursores de

moléculas bioativas como hormônios esteroidais em mamíferos e hormônios

brassinoesteroidais em plantas. Em mamíferos, a CYP51 também converte

lanosterol em esteróis ativadores de meiose (Meiosis-Activating Sterols, MAS),

precursores de colesterol que modulam o desenvolvimento de céulas

germinativas masculinas e femininas [LEPESHEVA, WATERMAN, 2007;

ZARN, BRÜSCHWEILER, SCHLATTER, 2003]

Além de seu papel na biossíntese de esteróis, a CYP51 também possui

atividade regulatória; em mamíferos um dos intermediários da reação

(derivado 14α-carboxialdeído da desmetilação do lanosterol) regula a

produção de colesterol por atuar como supressor de HMG-CoA redutase (3-

hidróxi-metilglutaril coenzima A redutase). O papel regulatório da CYP51 pode

ser de especial importância em tripanosomatídeos, onde o intermediário

aldeídico do lanosterol pode ser utilizado pelo parasita para alternar o

caminho biossintético da produção de esterol endógeno para o consumo de

precursores exógenos presentes no sangue do hospedeiro mamífero, em

processo energeticamente mais favorável [LEPESHEVA, WATERMAN, 2007].

Ao contrário dos P450s voltados para a metabolização de fármacos,

que são capazes de acomodar uma grande variedade de estruturas, a CYP51

tem uma faixa de especificidade de produto muito estreita. O conjunto de

substratos é limitado aos cinco 14α-metil-esteróis naturais (lanosterol, 24, 25-

diidrolanosterol, 24-metilenodiidro-lanosterol, obtusifoliol e 4β-desmetil-

lanosterol (norlanosterol) (Figura 9, p. 32) [LEPESHEVA, WATERMAN, 2007].

O complexo mecanismo da reação catalizada pela CYP51 sugere que um

arranjo espacial específico do substrato é necessário para assegurar sua

orientação apropriada no sítio catalítico durante as três etapas da catálise, o

que torna necessária certa conservação de aminoácidos apesar da baixa

identidade de sequência nesta família [LEPESHEVA, WATERMAN, 2007].

Estudos indicam que o substrato é estabilizado no sítio ativo

predominantemente através de interações hidrofóbicas e ligações de H, com a

cadeia lateral em C17 do substrato posicionada em um canal hidrofóbico

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35

estreito; ligações de H envolvendo o grupo 3-OH do substrato auxiliam em seu

correto posicionamento no sítio catalítico da enzima [JI et al, 2000].

Sete resíduos de glicina aparentemente são essenciais para assegurar

a flexibilidade conformacional da CYP51, separando elementos secundários

de sua estrutura. A maioria dos demais resíduos conservados nesta enzima

estão aglomerados em seis regiões, que representam as cinco regiões de

reconhecimento de substrato (Substrate Recognition Sites, SRS) e a região ao

redor do resíduo de cisteína que coordena com o grupo heme. Embora a

conservação nesta região de ligação do heme seja geral entre as famílias do

P450, a alta conservação das SRS é uma característica específica de CYP51

[LEPESHEVA, WATERMAN, 2007]. Os resíduos variáveis presentes no sítio

catalítico incluem F78, M79, K97, M99, H101, F255, S252, I323 e V434,

revelando diferenças consideráveis entre os reinos e sugerindo que são

resíduos que contribuem para a especificidade da CYP51 em relação ao

substrato em diferentes espécies [PODUST, POULOS, WATERMAN, 2001].

Estudos da estrutura cristalina de CYP51 de Mycobacterium

tuberculosis [PODUST et al, 2004; PODUST, POULOS, WATERMAN, 2001]

revelaram a presença de uma α-hélice I cuja porção N-terminal afasta-se do

núcleo estrutural da enzima em um ângulo de 145° com a porção C-terminal.

Este afastamento em relação ao grupo heme libera a alça BC de sua

conformação fechada, aumentando o espaço disponível para ligação de

substrato ou inibidores; como consequência do reposicionamento da α-hélice

I, as regiões adjacentes – α-hélices H e G e alças intermediárias – também

exibem diferenças topológicas significativas em relação a outros P450s. A

posição aberta da alça BC forma, em conjunto com a α-hélice I deslocada,

uma abertura de grandes dimensões que conecta a superfície à cavidade

catalítica e ao grupo heme; este canal (canal 1) corre aproximadamente

paralelo ao plano do grupo heme, formando o canal de acesso do substrato

(Figura 11). Este canal de acesso difere daqueles encontrados em outros

P450 (canal 2), que se encontra perpendicular ao plano do grupo heme. O

canal 2 também é aparente na estrutura da CYP51, porém sua entrada na

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superfície encontra-se fechada pela interação entre a α-hélice A’ e a alça FG;

no entanto, a rotação das α-hélices F e G poderia permitir um movimento de

abertura/fechamento da alça FG, abrindo o acesso ao canal 2. Na CYP51, a

abertura do canal por este mecanismo torna necessário o fechamento do

canal 1; este cenário leva a uma imagem dinâmica e sincronizada de catálise

onde enquanto o canal 1 encontra-se aberto, o canal 2 encontra-se fechado.

Esta sincronização poderia possibilitar ao substrato a entrada por um canal,

com o produto saindo por outro. Considerando as etapas de oxidação

múltiplas necessárias na atividade da CYP51, este movimento poderia ser

necessário para o posicionamento de resíduos-chave nas diversas etapas do

caminho catalítico. Acredita-se que o substrato hidrofóbico é reconhecido na

superfície da proteína através de uma região hidrofóbica de resíduos de

aminoácidos adjacente ao canal 1 de acesso de substrato, correspondendo a

resíduos na região N-terminal da α-hélice I na alça BC; após o

reconhecimento, o substrato penetra o canal de acesso e é particionado para

o sítio ativo através de interações hidrofóbicas [SHENG et al, 2009; PODUST,

POULOS, WATERMAN, 2001; JI et al, 2000].

Figura 11. Estrutura de CYP51 de M. tuberculosis em representação de Richardson.

Heme em representação de bolas (vermelho), ligante 4-fenilimidazol em representação CPK (rosa). α-hélice I em verde [PODUST et al, 2001].

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A maioria das mutações identificadas em isolados de C. albicans

resistentes aos antifúngicos azólicos encontram-se distribuídas ao redor das

regiões altamente dinâmicas responsáveis pela movimentação da alça FG e

consequente abertura/fechamento dos canais de acesso 1 e 2 [EDDINE et al,

2008; PODUST et al, 2004], indicando um possível envolvimento direto ou

indireto com a interação de ligantes. No entanto, considerando o alto nível de

conservação dos resíduos envolvidos na interação do substrato com a enzima

dentro de cada filo, e sua importância para o reconhecimento de substrato, é

improvável que ocorram mutações importantes nestes resíduos no que se

refere a resistência a fármacos [PODUST et al, 2004]. Existe, porém, a

possibilidade de mutações em resíduos não envolvidos diretamente na

interação com o substrato, mas que modulam a abertura e o fechamento dos

canais de acesso ao sítio catalítico; desta forma, pode ser possível a

manutenção do canal aberto mesmo com a ligação do inibidor, o que leva a

um estado de baixa afinidade do mesmo e permite seu deslocamento pelo

substrato. Este mecanismo não permite a diminuição da afinidade abaixo de

um valor mínimo definido pela área de interação do inibidor e,

consequentemente, no planejamento de novos fármacos pode-se aumentar o

tamanho da molécula inibidora de forma a permitir que ocupe uma área mais

extensa quando ligado ao sítio catalítico, procurando assim manter a afinidade

com a enzima em níveis adequados para a inibição enzimática efetiva

[PODUST et al, 2004; KELLY et al, 2001; PODUST et al, 2001]. Esta

estratégia foi aplicada no desenvolvimento de antifúngicos como itraconazol e

posaconazol, que possuem estruturas maiores que fluconazol. Existe, no

entanto, limitação na utilidade desta estratégia devido ao próprio tamanho da

região de interação [PODUST et al, 2004].

A importância da CYP51 como possível alvo para fármacos deve-se ao

efeito causado por sua inibição, que leva ao bloqueio da síntese de esteróis,

letal para organismos unicelulares por sua incapacidade de assimilação de

esterol exógeno; a inibição de CYP51 também influencia o crescimento e

processos de desenvolvimento em plantas, e diminui a produção de colesterol

endógeno em animais. Embora inibidores de CYP51 estejam sendo

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estudados como herbicidas e fármacos hipocolesterolêmicos, capazes de

diminuir os níveis de colesterol [KOROSEC et al, 2008; LEPESHEVA,

WATERMAN, 2007], estes compostos são mais comumente utilizados como

fungicidas no tratamento de micoses e na prevenção de infecções em

agricultura. A necessidade de inibidores de CYP51 aumenta continuamente,

devido ao aumento mundial da ocorrência de infecções fúngicas oportunistas

como consequência do aumento de hospedeiros imunodeprimidos (resultado

de infeções por HIV, quimioterapia antineoplásica, transplantes de órgãos e

de medula entre outras causas) e pacientes com infecções primárias como

tuberculose. Um novo aspecto para inibidores de CYP51 é a descoberta de

sua utilidade no tratamento de infecções causadas por Trypanosoma e

Leishmania [EDDINE et al, 2008; LEPESHEVA et al, 2008; LEPESHEVA,

WATERMAN, 2007; ALRAJHI et al, 2002; BERMAN, 1981], doenças

parasitárias negligenciadas que afetam milhões de pessoas na América Latina

[REITHINGER et al, 2009; MONCAYO, ORTIZ YANINE, 2006].

2.2.1 Características de compostos inibidores de CYP51

Os inibidores de CYP51 mais conhecidos são os compostos azólicos

(imidazóis e triazóis) (Figura 12, p. 39). Estes compostos ligam-se à sexta

posição de coordenação do ferro do grupo heme, impedindo assim a ligação e

metabolização do substrato; a especificidade pela CYP51 fúngico está

relacionada aos grupos substituintes ligados ao N1 do grupo azólico [SHENG

et al, 2009; SHENG et al, 2006; JI et al, 2000], que também determinam a

potência através de interações com a apoproteína [LAMB et al, 2000]. Os

compostos azólicos têm papel importante no tratamento de micoses

sistêmicas e superficiais, tendo também apresentado eficácia em modelos de

leishmaniose e doença de Chagas [URBINA et al, 2003; ALRAJHI el al, 2002;

MOLINA et al, 2000; McCABE, REMINGTON, ARAUJO, 1986; BERMAN,

1981].

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39

miconazol fluconazol

cetoconazol voriconazol

itraconazol

pozaconazol

Figura 12. Estruturas de alguns fármacos antifúngicos imidazólicos e triazólicos

Os azóis apresentam menor toxicidade em relação a outros fármacos

antifúngicos e anti-trypanosoma e são de menor custo e mais facilmente

disponíveis, porém apresentam diversas desvantagens. Entre elas destacam-

se que o seu uso a longo prazo pode levar à inibição de outras enzimas do

complexo P450, entre elas várias envolvidas na metabolização de

xenobióticos tais como CYP3A4, CYP2A6, CYP2C9, CYP2C19, CYP2D16 e

CYP2B6 [ITOKAWA et al, 2007; ZHANG, et al, 2002; LAMB et al, 2000],

causando efeitos indesejáveis devido a interações medicamentosas com

outros fármacos metabolizados por estas enzimas. Em relação à inibição da

CYP3A4, parece haver influência das características do grupo N-substituído

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40

na porção imidazólica dos compostos, assim como da lipofilicidade das

cadeias laterais; estas características parecem estender-se a outras enzimas

P450, embora a capacidade inibidora dos compostos dependa das

características tridimensionais do sítio catalítico que pode ou não permitir que

o grupo N-substituinte facilite a coordenação do átomo de nitrogênio do anel

azólico com o grupo heme da enzima [ITOKAWA, YAMAUCHI, CHUMAN,

2009; ITOKAWA et al, 2007; ; ZHANG, et al, 2002; LAMB et al, 2000].

O uso contínuo de antifúngicos azólicos também leva ao surgimento de

resistência, permitindo no patógeno o desenvolvimento de tolerância ao

fármaco. Entre as possíveis causas da resistência, encontram-se mutação na

CYP51 fúngica, aumento na expressão do gene CYP51, e aumento no efluxo

de azóis ou diminuição de permeabilidade [COWEN, 2008; LEPESHEVA,

WATERMAN, 2007; AKINS, 2005]. Uma alternativa para contornar a

resistência a azóis é a inibição da CYP51 por análogos do substrato [EDDINE

et al, 2008; LEPESHEVA et al, 2008; LEPESHEVA, WATERMAN, 2007], idéia

que tem sido explorada na busca por novos agentes hipocolesterolêmicos. Os

análogos ao substrato apresentam como vantagens a especificidade pela

CYP51, melhor permeabilidade celular e maior tempo de meia-vida em

soluções aquosas quando comparadas a diversos azóis; além disso, possuem

baixa probabilidade de causar resistência devido à sua semelhança com

esteróis endógenos. No entanto, estes tipos de inibidores apresentam como

grande problema a própria especificidade da enzima, que reconhece seu

substrato baseado em requisitos bastante rígidos; desta forma, alterações

mínimas na estrutura do esterol podem afetar a qualidade da ligação e a

potência de inibição [LEPESHEVA et al, 2008].

A CYP51 encontra-se presente também nos tripanosomatídeos,

agentes causadores da doença de Chagas (Trypanosoma cruzi) e doença do

sono ou tripanosomíase africana (Trypanosoma brucei). Ambas espécies de

protozoários possuem ciclos de vida complexos que incluem estágios em

insetos e mamíferos, porém diferem quanto aos vetores, hospedeiros

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41

mamíferos preferidos, localização no organismo do hospedeiro e

manifestação sintomática [LEPESHEVA et al, 2008].

Do ponto de vista de planejamento de fármacos, a diferença mais

importante refere-se às necessidades desses parasitas em relação aos

esteróis. O T. cruzi é dependente da biossíntese de esteróis endógenos em

todos os estágios de vida, enquanto que o T. brucei é capaz de assimilar

colesterol de hospedeiros mamíferos durante seu período de vida na corrente

sanguínea. Enquanto que a inibição da CYP51 em T. cruzi causa depleção de

esteróis estruturais e consequente dano às funções de membrana, no T.

brucei a mesma inibição interfere na síntese de esteróis funcionais, ou seja,

aqueles produzidos em níveis hormonais e importantes no desenvolvimento

do parasito e regulação de seu ciclo de vida. Existem também diferenças

entre estas espécies em relação à especificidade por substrato, sendo 24-

metilenodiidrolanosterol substrato para T. cruzi, e esteróis C4-monometilados,

possivelmente 31-norlanosterol, para T. brucei (Figura 9, p.32) [LEPESHEVA

et al, 2008]. Esta especificidade em relação ao substrato relaciona-se com

diferenças em um resíduo filo-específico na α-hélice B’ da CYP51 (F105 em T.

brucei, I105 em T. cruzi) [LEPESHEVA et al, 2006].

Nas enzimas pertencentes à família do citocromo P450, o átomo de

ferro do grupo prostético heme possui em seu estado de repouso uma

molécula de água ligada à sexta posição de coordenação. Na interação do

substrato, ocorre deslocamento desta molécula de água, com alteração de

spin do átomo de ferro seguido por redução, ligação de oxigênio molecular,

nova redução e duas protonações, resultando, ao final, em espécie ativa oxo-

ferro [BALDING et al, 2008; DENISOV et al, 2005; FRIESNER, GUALLAR,

2005]. Os inibidores azólicos ocupam o espaço destinado aos substratos do

citocromo P450, ligando-se diretamente ao grupo heme e tornando-o inativo

em relação a reações com oxigênio. A molécula do azol aproxima-se do grupo

heme, atraída pela da aceitação de uma ligação de H da molécula de água

presente no estado de repouso; a uma distância adequada, a molécula de

água é liberada do grupo heme e é substituída pelo grupo azólico, que desta

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42

forma bloqueia a ligação de oxigênio molecular e inativa o centro heme.

Modelos quânticos de teoria funcional de densidade (Density Functional

Theory, DFT) mostram que o processo é sutil e induzido pela presença de

grupos doadores e aceptores de ligações de H presentes no sítio ativo,

levando à liberação da molécula de água ligada ao grupo heme. Interações

via ligações de H com a molécula de água do estado de repouso ou com a

molécula do inibidor podem levar à maior estabilização do estado de repouso

ou do complexo ligado ao inibidor [BALDING et al, 2008].

A Figura 13 ilustra o modo de interação do fluconazol com o sítio ativo

da CYP51; o anel triazólico posiciona-se perpendicularmente ao plano da

porfirina, permitindo interação de um átomo de N do anel com o átomo de Fe

do grupo heme, enquanto que o grupo difluorofenil direciona-se para o canal

de acesso de substrato 1 (alça BC), com o segundo anel triazólico

apresentando orientação preferida em direção ao canal de acesso de

substrato 2 (alça FG) [SHENG et al, 2009; PODUST, POULOS, WATERMAN,

2001]. O fluconazol também interage com pelo menos três moléculas de água

presentes no sítio ativo [PODUST, POULOS, WATERMAN, 2001], que podem

estar mediando interações entre o grupo hidroxila e o resíduo H320, altamente

conservado na família da CYP51 [SHENG et al, 2009]. Estruturalmente, a

maior diferença entre o fluconazol e outros antifúngicos triazólicos encontra-se

na cadeia lateral ligada ao C3, que permite a formação de ligações

hidrofóbicas adicionais com consequente aumento da afinidade pela enzima

[PODUST et al, 2004], como é o caso de itraconazol e posaconazol em que as

longas cadeias laterais permitem a formação de interações hidrofóbicas e de

van der Waals adicionais no sítio catalítico [SHENG et al, 2009].

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43

Figura 13. Interação de fluconazol no sítio catalítico de CYP51 de M. tuberculosis.

α-hélices representadas em fita. Fluconazol (FLU, verde), grupo heme (vermelho) e resíduos de aminoácidos (cinza) representados em palito. [PODUST, POULOS, WATERMAN, 2001]

Estudos de inibição enzimática mostram que a presença de grupo

aromático volumoso em α ou β em relação ao anel imidazólico é essencial

para uma interação eficiente com a enzima; grupos α-fenílicos são facilmente

deslocados pelo substrato, porém o deslocamento do grupo fenílico para a

posição β resulta em inibidores muito mais potentes, chegando à ação

irreversível [LEPESHEVA et al, 2007].

Existem ainda estudos em que se relatam diferentes modos de

interação de outros compostos inibidores, de características não-azólicas, com

o sítio catalítico da CYP51. Neste caso, interações hidrofóbicas e ligações de

hidrogênio são responsáveis pela interação do inibidor com a enzima, sem

envolvimento do grupo heme [YAO et al, 2007; ZHU et al, 2006; JI et al, 2000].

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44

3. OBJETIVOS

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45

A utilização de forma integrada de ferramentas pertencentes às áreas

de química farmacêutica, quimioinformática e bioinformática permite a

caracterização de cavidades catalíticas de proteínas e a identificação das

propriedades físico-químicas consideradas essenciais para a interação

adequada entre ligante e biomacromolécula-alvo. Por outro lado, permitem

também a identificação de alvos a partir da comparação de estruturas

químicas, com as propriedades físico-químicas associadas, entre ligantes

conhecidos e possíveis alvos; este procedimento de comparação de perfis

moleculares, conhecido como virtual profiling, parte do princípio de que

moléculas semelhantes a ligantes conhecidos de proteínas têm o potencial de

interagir com essa mesma proteína, onde o grau de semelhança é

determinado não somente pela estrutura química, mas também pela

distribuição de características físico-químicas. As ferramentas utilizadas em

estudos in silico incluem também análise de descritores topológicos que

permitem a caracterização de propriedades físico-químicas considerando sua

distribuição espacial em relação à estrutura química de uma dada molécula. O

uso destes descritores permite a determinação do grau de semelhança entre

moléculas ou partes de moléculas (fragmentos moleculares), e encontra-se na

base das metodologias de triagem e de caracterização de sítios catalíticos de

proteínas.

No presente trabalho, propõe-se um estudo das características mais

importantes que possam influenciar a atividade antifúngica e anti-T. cruzi de

nitro-compostos com estrutura azometínica ou oxadiazolínica, com formulação

de hipótese sobre possíveis biomacromoléculas-alvo. Esta identificação de

alvos teve como objetivo principal o fornecimento de bases sólidas para

estudos posteriores das relações entre a estrutura química e a atividade,

principalmente no aspecto quantitativo, proporcionando melhor entendimento

do mecanismo de ação em nível molecular e possibilitando o planejamento

mais eficiente de compostos químicos candidatos a fármacos ou compostos-

líderes para estudos de modificação molecular.

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46

Para tanto, métodos de CADD foram aplicados, com uso de descritores

topológicos como ferramentas para identificação de possíveis biomacro-

moléculas-alvo através de comparação de perfis moleculares com ligantes

anotados para alvos conhecidos, no procedimento conhecido como virtual

profiling. A caracterização físico-química do possível sítio de interação dos

compostos auxiliou na formulação de hipóteses sobre o possível alvo, assim

como estudos de perfis de solubilidade com uso do programa Volsurf.

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47

4. EXPERIMENTAL

FBT/FCF/USP


48

As séries de compostos analisadas encontram-se representadas na

Figura 14. As séries AzoO e AzoS são séries azometínicas, diferindo apenas

no anel contendo o grupo nitro; estas séries foram sintetizadas pelo grupo de

pesquisa do Laboratório de Planejamento e Desenvolvimento de Fármacos,

LPDF, da FCF/USP, sob coordenação do Prof. Leoberto Costa Tavares,

orientador do presente trabalho, seguindo descrição em literatura

[MASUNARI, TAVARES, 2007; MASUNARI, TAVARES, 2006; TAVARES et

al, 1999; TAVARES, PENNA, AMARAL, 1997; TAVARES, 1993]. As séries

OxaO e OxaS são séries oxadiazolínicas, sendo que a série OxaO é apenas

teórica, sem compostos sintetizados no momento. A série OxaS foi sintetizada

também pelo mesmo grupo de pesquisa [ALMEIDA, 2009].

Estabeleceu-se, como regra, que os compostos individuais são

identificados por um código, correspondente à série à qual pertence, seguida

pelo o seu substituinte. Assim, o composto AzoO-OH refere-se ao composto

4-hidroxi-substituído da série AzoO, ou seja, 5-nitro-2-furfurilideno-4-

hidroxibenzidrazida (nifuroxazida).

SÉRIES AZOMETÍNICAS SÉRIES OXADIAZOLÍNICAS

Série AzoO: 5-nitro-2-furfurilideno benzidrazidas 4-substituídas (X=O)

Série AzoS: 5-nitro-2-tiofilideno benzidrazidas 4-substituídas (X=S)

Série OxaO: 3-acetil-oxadiazolina 2,5-furfurilideno benzidrazidas 4-substituídas (X=O)

Série OxaS: 3-acetil-oxadiazolina 2,5-tiofilideno benzidrazidas 4-substituídas (X=S)

substituintes R para todas as séries: -H, -CH3, -C2H5, -OCH3, -OC2H5, -Cl, -Br, -I, -F, -CF3, -COCH3, -NH2, -N(CH3)2, -NO2, -OH (composto AzoO-OH = nifuroxazida)

Figura 14. Estrutura química geral das séries estudadas

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49

4.1. CÁLCULO DE DESCRITORES TOPOLÓGICOS

Com o objetivo de encontrar um equilíbrio entre métodos geométricos

e topológicos para a determinação de fingerprints moleculares, GREGORI-

PUIGJANÉ e MESTRES desenvolveram, em 2006, um conjunto de

descritores baseados no conceito de entropia de Shannon, denominados

Descritores de Entropia de Shannon, SHED (Shannon Entropy Descriptors);

estes descritores representam um meio de se quantificar a variabilidade

demonstrada pelas distribuições topológicas de pares de características

centrados no átomo nas diferentes moléculas.

Para a determinação do SHED, cada átomo de uma estrutura química é

primeiro mapeado para seu equivalente utilizado pelo programa Sybyl (Tripos,

Inc.) [GREGORI-PUIGJANÉ, MESTRES, 2006] (Tabela 1). Em um segundo

passo, determina-se que cada tipo de átomo possui uma ou mais das

seguintes quatro características centradas no átomo: hidrofobicidade (H),

aromaticidade (R), capacidade receptora (A) ou doadora (D) de ligações de

hidrogênio (Tabela 2).

Tabela 1 Alguns tipos de átomos utilizados pelo programa Sybyl

Código Descrição Código Descrição

C.3 carbono sp3 S.3 enxofre sp3

C.2 carbono sp2 S.2 enxofre sp2

C.1 carbono sp S.O enxofre em sulfóxido

C.ar carbono aromático S.O2 enxofre em sulfona

N.3 nitrogênio sp3 F flúor

N.2 nitrogênio sp2 Cl cloro

N.1 nitrogênio sp Br bromo

N.ar nitrogênio aromático I iodo

N.am nitrogênio amínico O.3 oxigênio sp3

N.pl3 nitrogênio trigonal planar O.2 oxigênio sp2

N.4 nitrogênio sp3 carregado

positivamente

O.co2 oxigênio em grupos

carboxilato e fosfato

H hidrogênio P.3 fósforo sp3

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50

Tabela 2 Alguns tipos de átomos utilizados pelo programa

Sybyl e respectivas características farmacofóricas

Extraído de GREGORI-PUIGJANÉ, MESTRES, 2006

É derivado, em seguida, o caminho de menor distância, contado como

número de ligações, entre estas características de pares de átomos; sua

ocorrência em diferentes distâncias é armazenada para criar-se uma

distribuição de pares de características. Para a determinação desta

distribuição é utilizada uma distância máxima de 20 ligações; pares de

características a distâncias maiores são acumuladas no último compartimento.

O conceito de entropia de Shannon é então aplicado para a determinação da

FBT/FCF/USP


51

variabilidade das distribuições dos pares de características; dentro desta

sistemática, a entropia S de uma população P, distribuída em certo número de

compartimentos (representando neste caso as diferentes distâncias) N=20, é

fornecida por

onde ρi e pi são, respectivamente, a probabilidade e a população em cada

compartimento i da distribuição. Os valores de S variam de 0, refletindo a

situação em que a população inteira concentra-se em um único

compartimento, a um valor máximo Smax = ln N, refletindo a situação de uma

população distribuída uniformemente entre todos os compartimentos.

Uma medida mais intuitiva que pode ser relacionada linearmente à

situação de ocupação completamente uniforme é dada pela transformação

dos valores de entropia em valores de entropia projetada, E=eS. Para qualquer

população P > 0, os valores de E variam de 1 (entropia zero, população

totalmente concentrada em um único compartimento) a N (entropia máxima,

população uniformemente distribuída entre todos os compartimentos). No

caso limite em que P=0, considera-se E=0. Este valor E corresponde ao

SHED para o par de características considerado. O conjunto de valores SHED

obtido para os 10 pares de características possíveis constituem o perfil SHED

da molécula. Este perfil SHED é normalmente representado utilizando-se

gráfico em radar, como pode ser visualizado na Figura 22 (p. 76), com os

dados correspondentes na Tabela 8 e Tabela 9 (p. 73 e 74). A Figura 15

esquematiza o procedimento geral para obtenção de perfil SHED.

∑=

−=N

i

iiS1

ln ρρ Ppii /=ρ

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52

Figura 15. Procedimento para cálculo de SHED.

Extraído de GREGORI-PUIGJANÉ, MESTRES, 2006.

O perfil SHED considera implicitamente o tamanho das moléculas,

particularmente em valores SHED correspondentes a pares de características

envolvendo centros hidrofóbicos e aromáticos; à medida em que as moléculas

tornam-se maiores e mais complexas em termos de combinação de

características, a área ocupada por seus perfis SHED tende a se tornar

também maior.

Perfis SHED semelhantes refletem a possibilidade de moléculas

realizarem interações análogas em bolsos semelhantes em seus alvos

respectivos; no entanto, deve-se lembrar que, dependendo do tamanho da

cavidade de ligação da proteína, sua flexibilidade e grau de exposição ao

solvente, ligantes são capazes de interagir em diferentes bolsos, explorar

diferentes interações e apresentar diferentes grupos funcionais expostos ao

solvente. Cada perfil SHED representa uma distribuição particular de

características permitidas em um composto ativo para um determinado alvo.

Ao mesmo tempo, os perfis SHED são capazes de reconhecer a presença de

características semelhantes arranjadas de modo semelhante ao redor de

padrões estruturais (scaffolds) significativamente diferentes, uma habilidade

comumente referida como scaffold hopping.

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53

Os perfis SHED apresentados neste trabalho foram calculados com uso

de script preparado por Gregori-Puigjané e Mestres, durante a vigência de

bolsa-sandwich junto ao Chemogenomics Laboratory (CGL), pertencente ao

Research Unit on Biomedical Informatics (GRIB/IMIM/UPF), Barcelona,

Espanha, durante o ano de 2008.

4.2. ESTUDOS DE IDENTIFICAÇÃO DE POSSÍVEIS ALVOS POR

COMPARAÇÃO DE PERFIS MOLECULARES, VIRTUAL PROFILING

Considerando-se que as principais famílias de alvos podem ser

reconhecidas pelo conjunto das propriedades físico-químicas (massa

molecular, log P, contagem de doadores e receptores de ligações de

hidrogênio) de seus ligantes, pode-se dizer que o uso de descritores mais

específicos pode permitir a previsão de um perfil global do alvo com o qual a

interação de um determinado composto é possível, desde que o alvo a ser

previsto se encontre descrito de forma suficiente por ligantes já identificados.

Esta técnica, conhecida também como target fishing, possui três componentes

básicos, e são eles: 1- conjunto de compostos de referência para o qual

descritores 2-D ou 3-D estejam disponíveis em um banco de dados; 2-

procedimento de triagem; e 3- conjunto de compostos a serem testados para

identificação de novos compostos provavelmente ativos nos mesmos alvos

dos compostos de referência [ROGNAN, 2007].

Neste trabalho, optou-se por utilizar perfis SHED como descritores para

a realização do virtual profiling. Dessa forma, perfis SHED foram calculados

para cada composto das séries e comparados com os perfis SHED de

compostos, anotados para diversos alvos, pesquisados no banco de dados

Wombat™ (World of Molecular Bioactivity) [BALAKIN, 2006; Sunset Molecular

Discovery] versão 2007.1 (datado de 30/11/2007) e filtrados para selecionar

aqueles com atividade inibitória em concentrações não superiores a 10 µM. O

critério de classificação por similaridade foi definido considerando o menor

FBT/FCF/USP


54

valor de todas as distâncias euclidianas calculadas entre os compostos de

referência e os compostos testados.

O protocolo de virtual profiling utilizado no presente trabalho foi

desenvolvido por Gregori-Puigjané e Mestres, e utilizado durante vigência de

bolsa-sandwich junto ao Chemogenomics Laboratory (CGL), pertencente ao

Research Unit on Biomedical Informatics (GRIB/IMIM/UPF), Barcelona,

Espanha, durante o ano de 2008.

4.3. CARACTERIZAÇÃO DA CAVIDADE CATALÍTICA DE CYP51

À medida em que ocorre o avanço da ciência e das técnicas

experimentais, há aumento progressivo no número de proteínas para as quais

se conhece a estrutura, seja por determinação experimental (cristalografia de

raios-X, RMN) ou através de modelos de homologia obtidos por modelagem

comparativa. A disponibilidade destas estruturas abre novas perspectivas no

campo do desenvolvimento de novos fármacos na medida em que revela

possíveis novos alvos terapêuticos. No entanto, são também necessárias

novas ferramentas que permitam o uso destas informações de forma racional

e com o mínimo dispêndio de recursos e tempo. Dentro deste raciocínio é

altamente desejável um método que torne possível prever funções da proteína

diretamente a partir de sua estrutura tridimensional; no entanto, embora a

geometria de uma proteína carregue informações sobre sua função

bioquímica em nível molecular, a função em si não é restrita a um dobramento

particular e não é visível através de sequenciamento. Por outro lado, sabe-se

que padrões de reconhecimento molecular podem encontrar-se preservados

ao longo de cavidades de ligação de proteínas com funções semelhantes,

uma vez que enzimas apresentam alta especificidade em relação ao

substrato, com requisitos bem definidos quanto ao arranjo espacial das

moléculas de substrato. Assim, foram desenvolvidos métodos que permitem a

detecção e extração automáticas de sítios de ligação putativos de proteínas,

com a constituição destes sítios sendo traduzidas em termos de descritores

FBT/FCF/USP


55

moleculares associados a propriedades físico-químicas que podem ser

utilizados para a comparação mútua de diferentes sítios catalíticos [SCHMITT,

KUHN, KLEBE, 2002].

A caracterização do sítio catalítico de CYP51 foi realizada durante

vigência de bolsa-sandwich com uso de metodologia desenvolvida pelo grupo

do Chemogenomics Laboratory, pertencente ao Research Unit on Biomedical

Informatics (GRIB/IMIM/UPF), Barcelona, Espanha, durante o ano de 2008.

As estruturas de CYP51 em resolução abaixo de 2,5 Å foram obtidas

em formato pdb a partir do RCSB Protein Data Bank [KIRCHMAIR et al, 2008;

BERMAN et al, 2002; RCSB Protein Data Bank]. A superposição das

estruturas assim obtidas foi realizada utilizando-se o programa GAPS

(Gaussian-based Alignment of Protein Structures) [MESTRES, 2000]. Na

determinação das características da cavidade catalítica foram usados

protocolos internos do laboratório [JALENCAS, 2008] que se baseiam na

distribuição de características físico-químicas assinaladas para cada átomo.

Assim, a cada átomo diferente de H e pertencente à superfície da cavidade

catalítica da proteína foram associadas determinadas características físico-

químicas, a saber: aromática (R), hidrofóbica (H), doadora (D) e receptora (A)

de ligações de hidrogênio, além de descritores indicando a existência de

carga positiva (P) e negativa (N). Estas características são mapeadas e

representadas graficamente como esferas de diferentes cores. Estes pontos

críticos para interação ligante-proteína (Critical Points, CPTs) representam as

características físico-químicas mais importantes na caracterização da

superfície da cavidade catalítica e suas coordenadas. A Figura 16 ilustra um

resultado de cálculo de CPTs, superpostos à estrutura da proteína.

FBT/FCF/USP


56

Figura 16. Cavidade catalítica de CYP51 de Mycobacterium tuberculosis com CPTs em representação de superfície

H=ciano, R=laranja, A=vermelho, D=azul Fluconazol em verde, grupo heme em rosa escuro. Átomo Fe como esfera laranja. Código de acesso PDB 1ea1 (resolução 2,21 Å).

4.3.1 Estudos de interação baseados em características das superfícies

catalíticas de proteínas

Em uma segunda etapa, a estrutura de uma proteína foi adotada como

referência para a família e sua superfície catalítica mapeada como descrito no

item anterior. Em um processo similar ao virtual profiling, um banco de dados

contendo fragmentos de ligantes de proteínas foi pesquisado para extração

daqueles fragmentos que se ligam a regiões com características presentes na

proteína de referência. Este banco de dados é composto por fragmentos de

ligantes, originalmente co-cristalizados com as respectivas proteínas-alvo, e

os CPTs correspondentes pertencentes à região de interação deste fragmento

na cavidade catalítica da proteína-alvo; desta forma, a triagem detecta CPTs

comuns à proteína de referência e ao fragmento de ligante, extraindo este,

com os CPTs associados, para posterior análise. Esta etapa possibilita a

identificação de regiões dos compostos estudados (séries azometínica e

oxadiazolínica) passíveis de interação com uma biomacromolécula-alvo. Para

ilustração, veja-se a Figura 46 (p. 105).

FBT/FCF/USP


57

Estudo semelhante ao descrito acima, desta vez separando as

estruturas dos compostos considerados em fragmentos, foi realizado com o

objetivo de detectar que tipo de região da proteína, caracterizada pelos CPTs,

é favorável à interação destes fragmentos. Assim, os diferentes fragmentos

pertencentes aos compostos estudados foram extraídos do mesmo banco de

dados citado acima, permitindo a análise de quais CPTs permitem a interação

dos fragmentos com quais regiões típicas de uma proteína-alvo. A Figura 32

(p. 89) ilustra alguns fragmentos moleculares originários dos compostos e a

que tipo de regiões eles podem interagir.

4.4. ESTUDOS DE ANCORAMENTO DO LIGANTE, DOCKING

A escolha dos alvos a serem estudados por docking foi realizada após

análise de perfis SHED dos compostos e estudos preliminares de atividade

biológica. As estruturas de cristalografia de raios-X das biomacromoléculas-

alvo selecionadas foram obtidas do Brookhaven Protein Data Bank

[KIRCHMAIR et al, 2008; BERMAN et al, 2002; RCSB Protein Data Bank],

com códigos de acesso e resoluções indicados na Tabela 3.

Tabela 3 Proteínas selecionadas para estudo de docking

ALVO código PDB

resolução (Å) Descrição da estrutura*

CYP51 1ea1 2,21 14-α-esterol desmetilase associada ao citocromo P450 (CYP51) de Mycobacterium tuberculosis complexado com fluconazol

COX2 1cx2 3,0 ciclo-oxigenase-2 (prostaglandina sintase-2) complexada com inibidor seletivo SC-558.

*estruturas de proteínas obtidas do RCSB Protein Data Bank, conforme código de acesso PDB citado

Os estudos de docking foram realizados pela Chemotargets

(www.chemotargets.com). O processo de docking foi realizado com uso do

FBT/FCF/USP


58

programa AutoDock 3.0 [Scripps Research Institute; SOTRIFFER et al, 2000;

GOODSELL, MORRIS, OLSON, 1996]. A minimização posterior do ligante em

interação com o sítio ativo, mantendo os átomos-alvo estacionários, foi

realizada utilizando o programa Moloc [Gerber Molecular Design] e campo de

força MAB [GERBER, MÜLLER, 1995].

4.5. ANÁLISE DE PERFIL DE SOLUBILIDADE

As análises foram realizados com utilização dos programas Sybyl 8.0

(Tripos, Inc) e Volsurf 4.0 (Molecular Discovery, Ltd), considerando-se quando

pertinente a atividade antifúngica dos compostos estudados.

Os compostos selecionados foram aqueles para os quais foi possível

determinar a concentração inibitória mínima (Minimal Inhibitory Concentration,

MIC) para C. albicans, conforme dados da Tabela 6 (p. 68). As estruturas dos

compostos foram desenhadas no programa Sybyl 8.0, e minimizadas no

mesmo programa com uso de campo de força MMFF94 (Merck Molecular

Force Field) [HALGREN, 1996] e cargas parciais MMFF. Os demais

parâmetros utilizados pelo programa encontram-se na Tabela 4.

Tabela 4 Parâmetros de minimização utilizados no programa Sybyl 8.0

Campo de Força MMFF94 Cargas MMFF

NB cutoff 8 Constante Dielétrica 1,0

Método Powell Otimização inicial / nº de iterações

Simplex /

20 Gradiente de terminação

0,05 kcal/(mol*Å)

Iterações máximas 3000

As atividades biológicas foram introduzidas na forma de potência de

MIC (pMIC = log (1/MIC)), com MIC expresso em concentração molar (M).

FBT/FCF/USP


59

Para os compostos oxadiazolínicos (série OxaS), que possuem centro quiral

porém não tiveram configuração determinada, existem três possibilidades na

presença de mistura de ambos isômeros: atividade idêntica dos isômeros;

presença de um isômero inativo; ou ambos isômeros apresentando atividade,

porém em grau diferente. Seguindo uma opção apresentada por Sheng e

colaboradores [2006], foi considerado como pMIC para cada configuração R/S

um valor equivalente ao dobro daquele determinado experimentalmente,

baseando-se na hipótese de MIC ter sido determinado em mistura de

isômeros apresentando diferentes atividades.

4.6. SÍNTESE

A síntese dos compostos foi realizada pelo grupo de pesquisa do

Laboratório de Pesquisa e Desenvolvimento de Fármacos do Departamento

de Tecnologia Bioquímico-Farmacêutica da Faculdade de Ciências

Farmacêuticas da Universidade de São Paulo, LPDF/FBT/FCF/USP, sob

coordenação do Prof. Leoberto Costa Tavares, orientador de presente

trabalho, dentro da programação de diversos projetos de iniciação científica,

mestrado e doutorado com foco no estudo das atividades biológicas e

análises de QSAR das séries azometínicas e oxadiazolínicas.

A síntese dos compostos foi realizada em quatro etapas. A saber:

esterificação dos ácidos benzóicos 4-substituídos; obtenção das

benzidrazidas a partir dos respectivos benzoatos de metila; obtenção de

bases de Schiff e ciclização da ponte azometínica [ALMEIDA, 2009;

MASUNARI, TAVARES, 2007; MASUNARI, TAVARES, 2006; TAVARES et al,

1999; TAVARES, PENNA, AMARAL, 1997; TAVARES, 1993], conforme

Figura 17.

A identificação estrutural dos compostos e de seus intermediários foi

realizada por meio de análise espectrométrica IV, RMN-1H, RMN-13C, análise

elementar de CHN e faixa de fusão.

FBT/FCF/USP


60

Figura 17. Síntese dos compostos azometínicos e oxadiazolínicos

4.7. DETERMINAÇÃO DE ATIVIDADE BIOLÓGICA

4.7.1 Atividade antifúngica

A. Materiais

• Dimetilsulfóxido PA (Labsynth Produtos Químicos para Laboratórios)

• Meio de cultura RPMI-1640 com L-Glutamina, sem bicarbonato de

sódio (Sigma-Aldrich)

• ácido 3-(N-morfolino)propanosulfônico, MOPS (Sigma-Aldrich)

• Meio de cultura Ágar Sabouraud-dextrose (Fluka)

• solução fisiológica estéril (cloreto de sódio 0,85%)

B. Métodos

A determinação de atividade antifúngica foi realizada no

LPDF/FBT/FCF/USP através da determinação de concentração inibitória

FBT/FCF/USP


61

mínima, MIC (Minimal Inhibitory Concentration), por método de microdiluição

em microplaca de acordo com metodologia padronizada pelo Clinical and

Laboratory Standards Institute (CLSI, anteriormente NCCLS – National

Committee on Clinical Laboratory Standards) [NCCLS M27-A2], utilizando-se

cepa ATCC 537Y de Candida albicans.

A determinação dos valores de MIC envolveu duas fases. Na fase I, a

atividade antifúngica é determinada quantitativamente com uso da técnica de

microdiluição padronizada pelo CLSI [NCCLS M27-A2]. Em uma fase

seguinte, fase II, a sensibilidade do ensaio é aumentada através da adaptação

de metodologia aplicada para determinação de MIC fase II em bactérias

[JORGE et al, 2009].

Para a preparação do meio de cultura, 10,4 g de meio RPMI-1640 em

pó foram dissolvidos em 900 mL de água destilada, acrescentando-se em

seguida 34,53 g de tampão MOPS (ácido 3-(N-morfolino)propanosulfônico),

agitando-se até dissolução. O pH foi ajustado para 7,0 a 25 C utilizando-se

hidróxido de sódio 1M. Completou-se o volume para 1000 mL com água

destilada, e o meio esterilizado por filtração em membrana, sendo

armazenado a 4 °C até o momento da utilização.

Para preparação do inóculo foram escolhidas cinco colônias, com

diâmetro aproximado de 1 mm, de cultura de 24 horas de Candida albicans

em ágar Sabouraud-dextrose inclinado, que foram colhidas com uso de swab

estéril e suspendidas em 5 mL de solução salina estéril 0,85%. A suspensão

foi colocada em agitador de vórtex por 15 segundos e sua densidade celular

ajustada com espectrofotômetro UV/VIS por acréscimo de solução salina

estéril a 0,85% suficiente para obter-se transmitância equivalente a uma

solução-padrão da escala de McFarland 0,5, em comprimento de onda de 530

nm.

A solução de sulfato de bário utilizada como padrão de turbidez

McFarland 0,5 é preparada acrescentando-se 0,5 mL de solução de cloreto de

bário (BaCl2 . 2 H2O) 0,048 mol/L a 99,5 mL de ácido sulfúrico 0,18 mol/L. A

densidade é corrigida utilizando-se espectrofotômetro com via de luz de 1cm e

FBT/FCF/USP


62

cubeta correspondente, com absorbância em 625 nm situando-se entre 0,08 e

0,10. Esta solução foi armazenada ao abrigo da luz e em temperatura

ambiente, sendo agitada vigorosamente em vórtex antes de ser utilizada. A

solução foi substituída a cada três meses após o preparo.

Após ajuste da turbidez, a suspensão de levedura sofreu diluição 1:50

em solução salina estéril 0,85%, seguida por agitação por 15 minutos em

frasco com agitador e pérolas de vidro. Foi realizada diluição 1:20 em meio

RPMI-1640 estéril, seguida por nova agitação por 15 minutos. Esta suspensão

de trabalho fornece inóculo com concentração de 1 x 103 a 5 x 103 unidades

formadoras de colônia (UFC) por mL, confirmadas por contagem de UFC em

placas de ágar Sabouraud-dextrose.

Para cada composto a ser testado na fase I, prepararam-se soluções-

estoque em meio RPMI contendo 20% de DMSO, em concentrações que

variaram de 20 a 30 µg/mL dependendo da solubilidade do composto. Estas

soluções foram obtidas pela diluição 1:9 em DMSO de uma solução-mãe em

DMSO de composto em concentração adequada, seguida por diluição 1:4 em

meio RPMI para fornecer a solução-estoque.

O teste de microdiluição em fase I foi realizado em placas de

microdiluição estéreis, descartáveis, com 96 poços em formato de U.

DispeNsaram-se 100 µL de meio RPMI em todas as colunas exceto a coluna

1. Dispensaram-se a seguir 100 µL da solução-estoque com uso de pipeta

multicanal nos poços das colunas 1, 2, e 11. Procedeu-se à diluição seriada

1:2 da coluna 2 à coluna 10; para tanto, 100 µL foram transferidos da coluna 2

para a coluna 3. Após homogeneização, 100 µL foram novamente transferidos

da coluna 3 para a 4, e assim sucessivamente até a coluna 10, que tem

descartados 100 µL.

Todos os poços exceto aqueles da coluna 11 (controle de esterilidade)

foram inoculados com 100 µL de suspensão de C. albicans, preparada como

descrito acima, sendo a coluna 12 o controle de crescimento. As microplacas

FBT/FCF/USP


63

foram incubadas a 35 °C por 48 horas. Todos os ensaios foram realizados em

triplicata.

Nesta fase, com exceção da coluna 1, as concentrações de DMSO

durante o ensaio foram iguais ou menores que 5%, concentração esta abaixo

do limite de tolerância de 6% determinado através de testes para C. albicans

frente a este solvente.

A leitura considerou a concentração inibitória mínima (MIC) dos

compostos como sendo a menor concentração em que se observou redução

proeminente de crescimento em relação ao controle. Para tanto, os poços de

microdiluição receberam uma pontuação de 0 a 4, de acordo com o

crescimento em comparação com o controle de crescimento, sendo:

0: opticamente claro (inibição completa)

1: crescimento indefinido

2: redução proeminente de crescimento (definido como o valor de MIC)

3: ligeira redução do crescimento

4: nenhuma inibição de crescimento (crescimento equivalente ao

controle)

Uma fase II de ensaios foi realizada com a finalidade de estreitar-se a

faixa de valores MIC obtidos na fase I. Adaptando-se metodologia aplicada

para determinação de MIC fase II em bactérias [JORGE et al, 2009], 1 mL de

soluções-estoque foram preparadas em concentrações de composto

equivalentes ao dobro do valor de MIC determinado na fase I, em meio RPMI

contendo 10% de DMSO. Estas soluções foram obtidas pela diluição 1:9 em

DMSO de uma solução-mãe em DMSO de composto em concentração

adequada, seguida por diluição 1:9 em meio RPMI para fornecer a solução-

estoque.

Distribuíram-se 100 µL da solução-estoque nos poços da coluna 1 da

microplaca. Adicionaram-se 100 µL de meio RPMI 1640 à solução-estoque

inicial, desta forma diluindo-a em 10%. Após homogeneização, 100 µL desta

FBT/FCF/USP


64

nova solução-estoque foram distribuídos na coluna 2 da microplaca.

Procedeu-se a nova diluição de 10% da solução-estoque pela adição de 100

µL de RPMI 1640, com distribuição nos poços da coluna 3. Este procedimento

foi repetido sucessivamente até a coluna 11, que recebeu adicionalmente 100

µL de meio (controle de esterilidade). A coluna 12 recebeu 100 µL de meio

(controle de crescimento). Todos os poços, à exceção daqueles da coluna 11,

foram inoculados com 100 µL de suspensão de C. albicans e incubados a

35 °C por 48 horas. Todos os ensaios foram realizados em triplicata. A leitura

do MIC de fase II seguiu o mesmo procedimento adotado para a fase I.

4.7.2 Atividade anti-T. cruzi

A avaliação da atividade anti-T.cruzi dos compostos foi realizada pelo

grupo de pesquisa, frente a formas epimastigotas de Trypanosoma cruzi, cepa

Y [SILVA E NUSSENSZWEIG, 1953], cultivadas a 28 ºC, em meio LIT (liver

infusion tryptose), suplementado com 10% de soro fetal bovino v/v. Os testes

foram realizados durante a fase log de crescimento parasitário.

Os parasitas na fase logarítmica (cultura parasitária de três dias) foram

inoculados em 50 mL de meio LIT (concentração inicial de 1,0 x 107

parasitas/mL). Os parasitas foram incubados com os compostos

(concentração de 10 µg/mL) diluídos em DMSO (concentraçao final de 1%)

durante 24, 48, 72 e 96 horas [POZAS, 2005]. A viabilidade e o crescimento

parasitário foram verificados em intervalos de 24 horas em Câmara de

Neubauer e espectrofotômetro de UV/VIS (leituras realizadas em 580 nm). A

porcentagem de inibição de crescimento (%IC) foi calculada de acordo com a

seguinte equação:

%IC = {1-[(AP – A0P)/(AC – A0C)]} x 100

onde AP= absorbância em 580nm (A580) da cultura contendo composto em 24,

48, 72 e 96 horas; A0P = A580 da cultura contendo o composto logo após

FBT/FCF/USP


65

adição de inóculo (dia 0); AC = A580 da cultura na ausência de qualquer

composto (controle positivo); A0C = A580 da cultura na ausência de qualquer

composto em 24, 48, 72 e 96 horas [BOIANI et al, 2008; AGUIRRE et al,

2005; ARAN et al, 2005; CERECETTO et al, 1999].

FBT/FCF/USP


66

5. RESULTADOS E DISCUSSÃO

FBT/FCF/USP


67

Estudos de atividade biológica mostraram atividade frente a C. albicans

em compostos das séries azometínica e oxadiazolínica (Tabela 5). Os

compostos da série azometínica contendo anel tiofilidênico (5-nitro-2-

tiofilideno benzidrazidas 4-substituídas) apresentaram problemas de

solubilidade no procedimento para determinação de atividade antifúngica, com

leitura de MIC prejudicada pela precipitação de compostos e foram, por este

motivo, excluídos do estudo. A Tabela 6 traz os resultados de MIC convertidos

para potência.

Tabela 5 Concentração inibitória mínima, MIC, frente à cepa 537Y de C. albicans

SÉRIE AZOMETÍNICA (AzoO) 5-nitro-2-furfurilideno benzidrazidas

4-substituídas

SÉRIE OXADIAZOLÍNICA (OxaS) 3-acetil-oxadiazolina 2,5-tiofilideno

benzidrazidas 4-substituídas

R código MIC (µµµµg/mL) R código MIC (µµµµg/mL)

-Cl AzoO-Cl 7,50 – 7,20 -Cl OxaS-Cl 4,72 – 4,25

-CH3 AzoO-CH3 7,50 – 7,20 -CH3 OxaS-CH3 3,28 – 2,95

-OCH3 AzoO-OCH3 7,50 – 7,20 -OC2H5 OxaS-OC2H5 6,48 – 5,83

-CF3 OxaS-CF3 8,0 – 7,20

-OC4H8 OxaS-OC4H8 7,20 – 6,48

CETOCONAZOL < 0,0293

FLUCONAZOL 0,1172 – 0,0586

FBT/FCF/USP


68

Tabela 6 Concentração inibitória mínima, MIC, frente a cepa 537Y de

C. albicans, convertidas em potência.

COMPOSTO FÓRMULA

MOLECULAR

MASSA

MOLECULAR MIC (M)

pMIC

log (1/MIC )

(M)

AzoO-Cl C12H8ClN3O4 293,66 2,6 x 10-5

4,6

AzoO-CH3 C13H11N3O4 273,07 2,7 x 10-5

4,6

AzoO-OCH3 C13H11N3O5 289,24 2,6 x 10-5

4,6

OxaS-Cl C14H10ClN3O4S 351,76 1,3 x 10-5

4,9

OxaS-CH3 C15H13N3O4S 331,35 9,9 x 10-6

5,0

OxaS-OC2H5 C16H15N3O5S 361,37 1,8 x 10-5

4,7

OxaS-OC4H8 C18H19N3O5S 389,43 1,8 x 10-5

4,7

OxaS-CF3 C15H10F3N3O4S 385,32 2,1 x 10-5

4,7

cetoconazol C26H28Cl2N4O4 531,43 5,7 x 10-8

7,2

fluconazol C13H12F2N6O 306,27 3,3 x 10-7

6,5

Realizam-se testes de sensibilidade para Candida albicans cepa ATCC

537Y ao DMSO, tendo sido determinado que em concentrações de até 5% v/v

deste solvente não há interferência no crescimento em relação ao controle

após incubação por 48 horas. Embora ocorra crescimento em concentrações

de até 6% v/v de DMSO, este é visivelmente menor e ocorre entre 24-48

horas de incubação. Desta forma, em todos os ensaios procurou-se manter a

concentração de DMSO abaixo de 5% v/v para permitir a leitura adequada de

resultados. Nos ensaios de fase I, devido a problemas na solubilidade dos

compostos analisados, a concentração de DMSO nos poços da coluna 1 foi,

em geral, de 10% v/v, sendo, portanto descartada no processo de leitura de

resultados.

Observou-se que não existe diferença estatisticamente significante

entre os valores de MIC determinados para os compostos pertencentes à

série azometínica e tampouco entre os composos OxaS-OC2H5, OxaS-OC4H8,

e OxaS-CF3. No entanto, é possível perceber a diferença de atividade entre as

séries azometínica e oxadiazolínica; considerando-se as diferenças estruturais

entre estas duas séries, os resultados de atividade antifúngica, considerados

FBT/FCF/USP


69

apenas em seu aspecto qualitativo, podem indicar uma diferença de

mecanismo de ação ou modo de interação com a biomacromolécula-alvo.

A Tabela 7 e Figura 18 mostram a atividade inibitória de crescimento de

compostos das séries azometínica e oxadiazolínica sobre formas

epimastigotas de T. cruzi, como determinados pelo grupo de pesquisa do

Laboratório de Desenvolvimento e Planejamento de Fármacos,

FBT/FCF/USP. Observa-se, também neste caso, uma diferença qualitativa

entre as duas séries de compostos.

Tabela 7 Inibição de crescimento de formas epimastigotas de T. cruzi, cepa Y, em presença de compostos das séries azometínica e oxadiazolínica

INIBIÇÃO DE CRESCIMENTO RELATIVO (%)* COMPOSTO

24 horas 48 horas 72 horas 96 horas

AzoS-Cl 100,6 115,1 100,6 100,4

AzoS-CH3 22,8 48,8 55,7 52,4

AzoS-OC2H5 74,7 80,1 68,5 58,1

AzoS-CF3 84,2 94,5 97,3 98,7

OxaS-Cl 25,3 18,3 15,2 11,7

OxaS-CH3 15,7 15,1 20,3 18,5

OxaS-OC2H5 30,7 15,9 12,2 7,7

OxaS-OC4H8 113,8 19,5 21,9 23,9

OxaS-CF3 16,8 20,1 11,4 9,4

benznidazol 33,5 19,6 17,6 12,8

* em relação ao controle positivo (controle de crescimento) Todos compostos em concentração de 10µM

FBT/FCF/USP


70

Figura 18. Inibição de crescimento* de formas epimastigotas de T. cruzi, cepa Y, em presença de compostos das séries azometínica e oxadiazolínica

* em relação ao controle positivo (controle de crescimento). Todos os compostos em concentração de 10µM

Na determinação de perfil SHED das séries estudadas, constatou-se

que devido à metodologia empregada para a determinação destes descritores

não há diferença entre compostos de mesma estrutura que diferem apenas na

presença do anel tiofilidênico ou furfurilidênico, uma vez que os átomos de

oxigênio e enxofre possuem as mesmas propriedades para efeito da

determinação do SHED (Tabela 2, p. 50). Desta forma, para clareza na

apresentação dos resultados, serão consideradas apenas as séries contendo

anel tiofilidênico, ou seja, séries AzoS (compostos azometínicos) e OxaS

(compostos oxadiazolínicos). As conclusões são válidas para as séries

correspondentes em que X=O. A Figura 19 ilustra um exemplo de

equivalência dos átomos das séries estudadas para os tipos de átomos

utilizados pelo programa Sybyl.

FBT/FCF/USP


71

a

b

Figura 19. Equivalência dos átomos no sistema utilizado pelo programa Sybyl

a) AzoO-CH3. b) OxaS-CH3

Foram também calculados perfis SHED de compostos antifúngicos

selecionados (Figura 20) e compostos anti-T. cruzi (Figura 21) com a

finalidade de possibilitar estudos comparativos e formulação de hipóteses

quanto a alvos e mecanismos de ação.

FBT/FCF/USP


72

fluconazol voriconazol

miconazol cetoconazol

itraconazol

Figura 20. Estruturas dos antifúngicos azólicos selecionados para estudo

benznidazol nifurtimox

Figura 21. Estruturas de compostos anti-T. cruzi

A Tabela 8, Tabela 9 e Tabela 10, e as Figura 22 (p.76), Figura 26,

(p. 80) e Figura 27 (p. 81) trazem os perfis SHED para as séries azometínica,

oxadiazolínica, compostos antifúngicos e compostos anti-T. cruzi.

73

Tabela

8

Pe

rfis

SH

ED

de

com

post

os

azo

me

tínic

os

HH

HR

HA

HD

RR

RA

RD

AA

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DD

Azo

S-B

r 4,8

130

5,5

926

5,4

641

2,6

644

5,2

717

5,3

889

3,2

734

1,8

899

1,4

142

0,0

000

Azo

S-C

2H5

5,2

873

5,9

565

5,9

214

3,0

446

5,2

717

5,3

889

3,2

734

1,8

899

1,4

142

0,0

000

Azo

S-C

F3

4,8

130

5,7

830

5,4

341

2,6

644

6,1

504

6,0

090

3,2

132

1,8

899

1,4

142

0,0

000

Azo

S-C

H3

4,8

130

5,5

926

5,4

341

2,6

644

5,2

717

5,3

889

3,2

734

1,8

899

1,4

142

0,0

000

Azo

S-C

l 4,8

130

5,5

926

5,4

341

2,6

644

5,2

717

6,3

889

3,2

734

1,8

899

1,4

142

0,0

000

Azo

S-C

OC

H3

5,2

873

5,9

921

5,9

908

3,0

446

5,9

283

6,2

934

3,4

128

3,2

988

1,2

932

0,0

000

Azo

S-F

4,8

130

5,5

926

5,5

206

2,6

644

5,2

717

5,8

719

3,2

734

2,7

253

1,8

946

0,0

000

Azo

S-H

4,3

959

5,2

676

4,9

486

2,2

969

5,2

717

5,3

889

3,2

734

1,8

899

1,4

142

0,0

000

Azo

S-I

4,8

130

5,5

926

5,4

341

2,6

644

5,2

717

5,3

889

3,2

734

1,8

899

1,4

142

0,0

000

Azo

S-N

(CH

3)2

5,4

821

6,1

646

6,0

818

3,1

506

5,5

801

5,7

694

3,3

877

1,8

899

1,4

142

0,0

000

Azo

S-N

H2

4,3

959

5,3

148

4,9

486

3,8

940

5,5

801

5,7

694

5,6

734

1,8

899

2,2

278

0,5

000

Azo

S-N

O2

4,3

959

5,5

220

5,0

072

2,2

969

6,1

261

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646

1,1

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0,0

000

Azo

S-O

C2H

5 5,7

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622

6,4

101

3,4

358

5,2

717

5,3

889

3,2

734

1,8

899

1,4

142

0,0

000

Azo

S-O

CH

3 5,2

873

5,9

565

5,9

214

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446

5,2

717

5,3

889

3,2

734

1,8

899

1,4

142

0,0

000

Azo

S-O

H

4,3

959

5,2

676

5,0

597

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5,2

717

5,8

719

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734

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2,2

929

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000

As

colu

nas

corr

esp

onde

m

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74

Tabela

9

Pe

rfis

SH

ED

de

com

post

os

oxa

dia

zolín

ico

s

HH

HR

HA

HD

RR

RA

RD

AA

AD

DD

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018

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000

4,8

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5,0

854

0,0

000

0,9

449

0,0

000

0,0

000

Oxa

S-C

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4,7

474

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617

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0,0

000

4,8

379

5,0

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0,0

000

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0,0

000

0,0

000

Oxa

S-C

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000

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449

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000

0,0

000

Oxa

S-C

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638

4,9

348

5,4

018

0,0

000

4,8

379

5,0

854

0,0

000

0,9

449

0,0

000

0,0

000

Oxa

S-C

l 4,3

638

4,9

348

5,4

018

0,0

000

4,8

379

5,0

854

0,0

000

0,9

449

0,0

000

0,0

000

Oxa

S-C

OC

H3

4,7

474

5,3

791

5,8

405

0,0

000

5,5

142

5,9

926

0,0

000

1,3

747

0,0

000

0,0

000

Oxa

S-F

4,9

348

5,4

156

0,0

000

4,8

379

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439

0,0

000

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0,0

000

0,0

000

0,0

000

Oxa

S-H

4,0

057

4,6

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142

0,0

000

4,8

379

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854

0,0

000

0,9

449

0,0

000

0,0

000

Oxa

S-I

4,3

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000

4,8

379

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0,0

000

0,9

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0,0

000

0,0

000

Oxa

S-N

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3)2

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0,0

000

5,1

564

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0,0

000

0,9

449

0,0

000

0,0

000

Oxa

S-N

H2

4,0

057

4,7

640

5,0

142

4,5

000

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564

5,5

057

5,5

456

0,9

449

0,9

449

0,0

000

Oxa

S-N

O2

4,0

057

5,0

581

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678

0,0

000

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000

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000

0,0

000

Oxa

S-O

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5 5,1

431

5,6

236

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0,0

000

4,8

379

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854

0,0

000

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000

0,0

000

Oxa

S-O

CH

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474

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617

5,7

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0,0

000

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0,0

000

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0,0

000

0,0

000

Oxa

S-O

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4,0

057

4,6

443

5,0

766

4,5

000

4,8

379

5,5

439

5,5

456

1,8

899

0,9

449

0,0

000

Oxa

S-O

C4H

8 5,9

413

6,4

207

6,9

489

0,0

00

4,8

379

5,1

085

0,0

000

1,8

899

0,0

000

0,0

000

As

colu

nas

corr

esp

onde

m

aos

pare

s de

cara

cterí

stic

as

consi

dera

dos

na

medid

a

de

dis

tânci

as;

H

=hid

rofo

bic

ida

de,

R=

aro

matic

idade,

D=

capa

cidad

e d

oadora

de

ligaçõ

es

de h

idro

gên

io,

A=

cap

aci

da

de a

cepto

ra d

e li

gaçõ

es

de

hid

rogê

nio

75

Tabela

10

Pe

rfis

SH

ED

de

com

post

os

an

tifú

ngi

cos

e a

nti-T.cruzi

sele

cion

ado

s

HH

HR

HA

HD

RR

RA

RD

AA

AD

DD

ceto

conazo

l 8,3

824

8,7

021

9,3

711

0,0

000

8,4

918

7,0

324

0,0

000

0,5

000

0,0

000

0,0

000

itraco

nazo

l 9,2

324

9,1

346

7,7

751

0,0

000

8,4

538

6,3

690

0,0

000

1,1

906

0,0

000

0,0

000

mic

onazo

l 4,5

551

4,5

305

4,3

361

0,0

000

3,9

545

3,1

506

0,0

000

0,0

000

0,0

000

0,0

000

vorico

nazo

l 4,0

521

4,2

581

4,3

932

2,5

363

3,9

545

4,4

219

2,0

302

4,0

631

1,4

709

0,0

000

fluco

nazo

l 3,9

208

4,1

134

4,2

097

2,5

929

3,5

967

4,1

783

1,7

472

3,3

342

1,3

747

0,0

000

benzn

ida

zol

4,3

954

4,9

537

5,0

674

2,3

912

5,0

525

5,0

960

2,7

374

1,8

899

1,4

142

0,0

000

nifu

rtim

ox

3,6

489

4,5

356

4,1

101

0,0

000

4,9

631

5,2

918

0,0

000

1,8

946

0,0

000

0,0

000

As

colu

nas

corr

esp

on

de

m

aos

pare

s de

cara

cterí

stic

as

consi

dera

dos

na

medid

a

de

dis

tânci

as;

H

=hid

rofo

bic

idad

e,

R=

aro

matic

idade,

D=

capa

cidad

e d

oadora

de

ligaçõ

es

de h

idro

gên

io,

A=

cap

aci

da

de a

cepto

ra d

e li

gaçõ

es

de

hid

rogê

nio

FBT/FCF/USP


76

a b

Figura 22. Perfis SHED das séries estudadas a) compostos azometínicos. b) compostos oxadiazolínicos

Partindo-se da premissa que compostos com perfis SHED

semelhantes possuem capacidade potencial de interação com os mesmos

alvos biológicos [GREGORI-PUIGJANÉ, MESTRES, 2006], optou-se por

analisar os perfis das séries estudadas em comparação a fármacos

antifúngicos e anti-T. cruzi. Os fármacos antifúngicos de estrutura azólica

(imidazóis e triazóis) foram escolhidos devido ao fato de atuarem sobre a

CYP51 [VANDEN BOSSCHE, KOYMANS, 1998], também alvo para

compostos anti-T. cruzi [LEPESHEVA et al, 2007; BUCKNER et al, 2003] e

que poderia explicar a ação dual apresentada pelos compostos das séries

estudadas.

A análise dos resultados de virtual profiling (Tabela 11), que tem como

objetivo identificar possíveis alvos a partir da análise de similaridade

topográfica entre ligantes conhecidos, traz como principais alvos possíveis

para os compostos oxadiazolínicos enzimas pertencentes ao complexo

P450, a saber CYP19A (aromatase), CYP3A4, CYP3A5 e CYP3A7. Sabe-se

que alguns compostos azólicos com atividade antifúngica, atuando sobre

CYP51, também possuem atividade inibitória de CYP19A [CASTELLANO et

al, 2008; TRÖSKEN et al, 2004; ZARN, BRÜSCHWEILER, SCHLATTER,

2003] e CYP3A4 [ITOKAWA et al, 2007; LAMB et al, 2000]. Estes resultados

FBT/FCF/USP


77

corroboram a escolha da CYP51 como possível alvo a ser investigado. A

Figura 23 ilustra os compostos responsáveis pelas principais anotações.

Tabela 11 Resultados principais de virtual profiling

ALVO número de anotações*

distância euclidiana mínima / código do

composto

aromatase (CYP19A) 8 0,1432 / OxaS-H

CYP3A4 5 0,1432 / OxaS-H

CYP3A5 5 0,1432 / OxaS-H

CYP3A7 5 0,1432 / OxaS-H

glutationa dissulfito redutase 7 0,1814 / OxaS-H

prostaglandina endoperóxido sintase (COX-2) 11 0,2069 / OxaS-C2H5

* O número de anotações refere-se ao número de compostos analisados anotados para um determinado alvo

a b c

Figura 23. Estruturas de compostos responsáveis pelas anotações para alvos identificados em virtual profiling

a) Letrozol (inibidor de CYP19A, CYP3A4, CYP3A5, CYP3A7). b) Inibidor de glutationa dissulfito redutase. c) Inibidor de COX.

Além da CYP51, o virtual profiling aponta também a COX-2 (ciclo-

oxigenase 2) como alvo possível para os compostos da série oxadiazolínica;

considerando-se a semelhança estrutural entre esta série e compostos anti-

FBT/FCF/USP


78

inflamatórios seletivos para COX-2, a anotação é compreensível e serve

também como validação para o processo. Estudos de docking indicam a

possibilidade de interação da série oxadiazolínica com COX-2, tanto em

conformação R como S (Figura 24), com Ki esperado, determinado pelo

programa Autodock, variando de 1 a 50 µM.

a b

Figura 24. Orientação de interação sugerida para COX-2 a) OxaS-CF3 (R), Ki Est. = 1 µM b) OxaS-OC2H5 (S), Ki Est. = 1 µM

Estes compostos mostram possibilidade de interação com COX-2 de

forma coerente com a orientação de ligação determinada experimentalmente

do composto SC-558, um composto análogo ao celecoxib (Figura 25) e que

possui IC50 experimental de 9 nM. Deve-se, no entanto, ressaltar que os

compostos oxadiazolínicos não apresentam grupo sulfonamídico ou

equivalente, considerado como essencial nos inibidores seletivos de COX-2

para proporcionar a estabilização do composto enzima-inibidor [MICHAUX,

CHARLIER, 2004; POUPLANA et al, 2002]; desta forma, a hipótese de

interação dos compostos oxadiazolínicos com COX-2 deve ser verificada

através de estudos mais aprofundados. Além disso, estudos de docking

isolados podem ser considerados indicativos de possibilidades a serem

estudadas de forma mais aprofundada, devendo ser validadas, por exemplo,

através de procedimentos de dinâmica molecular.

FBT/FCF/USP


79

Figura 25. Superposição de estruturas de análogo ao celecoxib (verde) e composto OxaS-CF3 (R) (azul) em orientação sugerida para interação com COX-2

Corroborando a validade da suposição de atividade dual inibidora de

COX-2 e CYP51, existem relatos na literatura de atividade anti-inflamatória

variável em compostos antifúngicos azólicos [LIEBEL et al, 2006; KÖFELER

et al, 2000], que apresentam basicamente o mesmo perfil SHED de

compostos oxadiazolínicos.

O virtual profiling apresenta como primeiro alvo anotado para

compostos da série azometínica o Receptor Nuclear 1B (Nuclear Receptor

1B, NR1B), em distância euclidiana de 0,4353 (composto AzoO-OC2H5),

seguido de tromboxana sintase a uma distância euclidiana de 0,4820

(composto AzoO-C2H5). Em ambos os casos, considerou-se que os alvos

anotados não auxiliam na elucidação do possível mecanismo de ação

antifúngica ou anti-T. cruzi, embora seja sugestivo o fato de que estes

compostos não sejam anotados para os mesmos alvos da série

oxadiazolínica.

A comparação de perfis revela a semelhança entre compostos

azometínicos e benznidazol, fármaco anti-T. cruzi (Figura 26b), e entre

compostos oxadiazolínicos e os antifúngicos cetoconazol, itraconazol e

miconazol, e o fármaco anti-T. cruzi nifurtimox (Figura 27). Esta semelhança

permite, em princípio, supor que existam alvos em comum entre estes

FBT/FCF/USP


80

compostos, de forma que os compostos oxadiazolínicos possuem o

potencial de interagir com CYP51. Assim, uma consequência interessante é

a possibilidade de nifurtimox também possuir certa atividade antifúngica,

embora esta hipótese não tenha sido verificada devido à falta de

disponibilidade deste composto para testes. Por outro lado, não existe um

consenso quanto ao mecanismo de ação de benznidazol e nifurtimox, sendo

que as hipóteses consideram em sua maior parte a redução do grupo nitro

gerando espécies reativas que causam dano à célula por estresse oxidativo,

porém sem especificar o mecanismo exato pelo qual esta redução

ocorre [GERPE et al, 2008; KRAUTH-SIEGEL, INHOFF, 2003; MAYA et al,

2003; VIODÉ et al, 1999; MAYA et al, 1997; HENDERSON et al, 1988].

a b

Figura 26. Perfis SHED de compostos azometínicos selecionados a) Comparados a antifúngicos selecionados. b) Comparados ao benznidazol

FBT/FCF/USP


81

a b

Figura 27. Perfis SHED de compostos oxadiazolínicos selecionados. a) Comparados a antifúngicos selecionados. b) Comparados ao nifurtimox

Uma das hipóteses para a ação anti-T. cruzi de derivados

nitrofurânicos, como nifurtimox, é a interferência com a enzima tripanotiona

redutase [IRIBARNE et al, 2007; VEGA-TEIJIDO, CARACELLI, ZUKERMAN-

SCHPECTOR, 2006; MAYA et al, 2003; BLUMENSTIEL et al, 1999], parte

do sistema de proteção do micro-organismo contra o estresse oxidativo. Os

derivados nitrofurânicos possuem a capacidade de atuar como substratos

subversivos desta enzima, produzindo, ao serem metabolizados, espécies

de oxigênio reativo que causam dano celular por estresse oxidativo

[KRAUTH-SIEGEL, INHOFF, 2003; HENDERSON et al, 1988]. Esta hipótese

é coerente com o resultado de virtual profiling para os compostos estudados

(Tabela 11, p.77), que aponta como um possível alvo a glutationa redutase,

enzima humana correspondente à tripanotiona redutase e com a qual possui

40% de homologia de sequência total, compartilhando mecanismo catalítico

e substratos subversivos (inibidores não-competitivos) [IRIBARNE et al,

2007]. Sabendo-se que tanto o nifurtimox como a nifuroxazida, protótipo da

série azometínica, são capazes de inibir, em certo grau, a glutationa

redutase (37% e 85%, respectivamente) e a tripanotiona redutase (62% e

75%) [IRIBARNE et al, 2007], não se pode descartar a possibilidade de que

a inibição desta enzima seja responsável pelo menos em parte pela

FBT/FCF/USP


82

atividade anti-T. cruzi dos compostos estudados, em especial da série

azometínica, levando-se em consideração a ação inibitória relatada para a

nifuroxazida (composto AzoO-OH). Um estudo envolvendo derivados

5-nitrofurânicos e 5-nitrotiofênicos de semicarbazonas mostra também a

possibilidade de interação não-competitiva destes compostos com a

tripanotiona redutase [VEGA-TEIJIDO, CARACELLI, ZUKERMAN-

SCHPECTOR, 2006]. Deve-se lembrar, porém, que o sítio de interação de

substratos subversivos tanto da tripanotiona redutase como da glutationa

redutase possui diferentes resíduos carregados cuja interação com o ligante

é importante, tanto para interação quanto para seletividade [IRIBARNE et al,

2007].

É possível também a existência de um mecanismo de ação dual dos

compostos em sua ação anti-T. cruzi, atuando por estresse oxidativo e

inibição de CYP51, à semelhança de outros compostos que possuem a

capacidade de provocar estresse oxidativo e inibição de outras enzimas no

caminho metabólico da biossíntese de esteróis [GERPE et al, 2008].

Observe-se que, mesmo que o virtual profiling não tenha revelado

anotação importante para a glutationa redutase/tripanotiona redutase em

compostos azometínicos, este procedimento é um instrumento útil porém

dependente de coleta de dados e atualização dos mesmos; o banco de

dados Wombat, utilizado no método aplicado, possui dados capturados de

periódicos selecionados (Journal of Medicinal Chemistry, Bioorganic and

Medicinal Chemistry, Bioorganic and Medicinal Chemistry Letters, European

Journal of Medicinal Chemistry) [Sunset Molecular Discovery, 13/11/2009]

durante determinado período de tempo; a não-anotação para determinados

alvos pode ser apenas um reflexo da cobertura do banco de dados.

Compostos antifúngicos azólicos têm como alvo principal a enzima

CYP51, 14α-desmetilase, pertencente ao complexo do citocromo P450. A

Figura 28 mostra o fluconazol ligado ao sítio ativo de CYP51 de M.

tuberculosis (código de acesso PDB 1ea1, resolução 2,21 Å).

FBT/FCF/USP


83

a b

Figura 28. Representação de CYP51 de M. tuberculosis. a) Representação de superfície. b) Cavidade catalítica (interna) em representação de superfície. código PDB 1ea1 (resolução 2,21 Å). Heme em representação palito rosa escuro com átomo de Fe em esfera laranja. Fluconazol em representação palito, verde

As propriedades hidrofóbicas dos ligantes de CYP51 são

consideradas importantes para a interação com a enzima, uma vez que o

reconhecimento do substrato ocorre através de interações hidrofóbicas com

resíduos adjacentes à entrada do canal de acesso 1. Nos antifúngicos

azólicos, o grupo fenílico dissubstituído interage em canal estreito e

altamente hidrofóbico presente no sítio catalítico da enzima [JI et al, 2000];

naqueles compostos com presença de cadeia lateral longa, caso de

cetoconazol e itraconazol, ocorrem interações hidrofóbicas e de van der

Waals adicionais, possivelmente em direção ao canal de acesso de

substrato 2 [SHENG et al, 2009; SHENG et al, 2006; XIAO et al, 2004; JI et

al, 2000]. A presença de interações adicionais devido à maior extensão da

cadeia lateral presente em alguns compostos inibidores de CYP51 pode

representar uma melhor afinidade à enzima; existem suposições que

atribuem a esta maior afinidade a menor ocorrência de resistência em

presença de mutações em resíduos nas regiões próximas ao grupo heme

[XIAO et al, 2004].

Moléculas menores, como é o caso de fluconazol e voriconazol,

interagem também através de interações hidrofóbicas [SHENG et al, 2009;

FBT/FCF/USP


84

PODUST, POULOS, WATERMAN, 2001]. O grupo hidroxila presente no C2

destas moléculas aparentemente não apresenta interações observáveis com

a enzima, apesar de influenciar significativamente a atividade biológica; uma

possível explicação é a interação através de moléculas de água presentes

no sítio catalítico que fariam o papel de ‘ponte’ entre o inibidor e a enzima

[SHENG et al, 2009; SHENG et al, 2006; JI et al, 2000]. O menor tamanho

da molécula com consequente menor número de pontos de interação com a

enzima é uma das hipóteses para explicar a menor atividade biológica do

fluconazol em relação à itraconazol e à cetoconazol [VANDEN BOSSCHE,

KOYMANS, 1998].

É importante ressaltar que o perfil SHED, ao ser representado

graficamente, também incorpora informação sobre o tamanho relativo dos

compostos, representada pela área ocupada no gráfico de radar [GREGORI-

PUIGJANÉ, MESTRES, 2006]; isso se deve ao fato de que, em moléculas

maiores, as distâncias entre centros apresentando as mesmas

características tendem também a ser maiores. Percebe-se esta diferença ao

se compararem os perfis de miconazol, cetoconazol e itraconazol (Figura

27a), onde o perfil do miconazol indica claramente uma estrutura de

tamanho menor que cetoconazol e itraconazol, de tamanhos equivalentes

(estruturas dos antifúngicos mostradas na Figura 20, p. 72). Esta diferença

deve-se basicamente ao tamanho da cadeia lateral presente nas moléculas

destes últimos compostos. É de se esperar que a interação dos compostos

oxadiazolínicos com a CYP51, caso ocorra, não seja tão eficiente quanto à

de itraconazol e de cetoconazol devido ao menor número de possíveis

pontos de interação em sua estrutura.

A diferente orientação de ligação ao sítio ativo destes dois grupos de

compostos antifúngicos é também aparente na análise de perfis SHED, em

que fluconazol e voriconazol apresentam perfis praticamente iguais e

claramente diferentes de moléculas maiores como itraconazol e cetoconazol.

A maior característica hidrofóbica destes últimos também é visível através da

magnitude dos parâmetros HA/HR/HH (envolvendo distâncias entre pares

FBT/FCF/USP


85

com características hidrofóbicas, aromáticas e receptoras de ligações de

hidrogênio) quando comparados ao de fluconazol e voriconazol. Entre os

compostos antifúngicos azólicos, também pode-se considerar que existem

padrões estruturais diferentes em que apenas um deles apresenta presença

de grupo hidroxila. A presença deste grupo ligado ao carbono assimétrico no

fluconazol e voriconazol resulta em característica doadora de ligações de

hidrogênio não presente nos compostos semelhantes ao cetoconazol. Este

comportamento apresenta um certo paralelo em reação ao padrão estrutural

dos compostos estudados (Figura 20, p. 72 e Figura 29).

Figura 29. Características doadoras de ligações de hidrogênio

A interação de antifúngicos azólicos com CYP51 ocorre com

participação importante de moléculas de água presentes na cavidade

catalítica e que são responsáveis por diversas interações por ligação de H

com a molécula do inibidor. A aproximação da molécula do antifúngico ao

átomo de Fe do grupo heme, ao qual deve-se ligar para exercer ação

inibitória, ocorre com auxílio da molécula de água ligada ao próprio átomo de

Fe em seu estado de repouso, em processo influenciado pela distribuição de

FBT/FCF/USP


86

grupos doadores e receptores de ligações de H no sítio catalítico da enzima

[BALDING et al, 2008]; o fluconazol, além disso, é capaz de interações com

moléculas de água presentes no sítio catalítico, podendo formar ligações de

H entre a hidroxila ligada ao seu carbono assimétrico e moléculas de água

que intermediam a interação com resíduo de histidina altamente conservado

presente no sítio catalítico [SHENG et al, 2009; PODUST, POULOS,

WATERMAN, 2001]. Existe ainda a possibilidade de que a presença de

pontos que tornam possível a formação de ligações de H adicionais

influencie tanto a dinâmica de aproximação da molécula ao grupo heme,

como a qualidade da interação com resíduos presentes na cavidade

catalítica, embora os fatores determinantes da afinidade com o receptor

sejam a capacidade de coordenação com o átomo de Fe do grupo heme e a

presença de grupos hidrofóbicos que permitam a interação com resíduos

lipofílicos presentes no canal de acesso ao substrato [SHENG et al, 2009].

Os compostos azometínicos e oxadiazolínicos diferem

estruturalmente em sua flexibilidade e na presença de regiões que

possibilitam interações por ligações de hidrogênio (Figura 29, p. 85). Os

compostos oxadiazolínicos apresentam estrutura mais rígida e com

presença de grupo acetila, que representa possibilidade de interações por

ligação de hidrogênio na região da carbonila e hidrofóbica através do grupo

metila, confirmada pelos mapas de distribuição de propriedades lipofílicas e

hidrofílicas obtidos pelo programa Volsurf (Figura 40, p.100). Além disso,

existe estudo demonstrando a interação de derivados de 1,3,4-oxadiazol-

2(3H)-onas com CYP51 de Mycobacterium tuberculosis, onde a rigidez do

anel oxadiazolínico proporciona condições para a interação das moléculas

com o átomo de ferro do heme ao mesmo tempo em que preenche a

cavidade catalítica através de duas ligações de hidrogênio mediadas por

moléculas de água envolvendo N4 e O do anel oxadiazolínico [ZAMPIERI et

al, 2009].

Observando-se o perfil SHED da série oxadiazolínica em comparação

com os compostos azólicos (Figura 27a, p. 80), percebe-se que a

FBT/FCF/USP


87

distribuição de regiões hidrofóbicas pode levar ao reconhecimento dos

compostos pela enzima de forma a permitir sua passagem pelo canal de

entrada de substrato, e posterior orientação adequada no sítio catalítico.

Nota-se também que os compostos azometínicos (Figura 26a, p. 80)

possuem menor presença de características aromáticas (parâmetro AA), o

que pode interferir com a formação de interações π-π. Embora exista certa

semelhança de perfis entre os compostos azometínicos e os antifúngicos

fluconazol e voriconazol, não se pode concluir de forma definitiva que as

características topológicas são semelhantes o suficiente para levar a uma

interação com o mesmo receptor.

Por outro lado, a hipótese de interação dos compostos da série

oxadiazolínica com CYP51 é reforçada por estudos relatando a ação anti-T.

cruzi dos compostos antfúngicos azólicos itraconazol, posaconazol,

ravuconazol e albaconazol em modelos animais [GUEDES et al, 2004;

URBINA et al, 2003; MOLINA et al, 2000; McCABE, REMINGTON, ARAUJO,

1986].

O estudo de caracterização da cavidade catalítica de CYP51 usando

os mesmos parâmetros utilizados em SHED, (H, R, A, D) mostra a

distribuição destas características de acordo com os resíduos presentes

delimitando a cavidade catalítica. A Figura 30 traz os resultados superpostos

à cavidade da CYP51 de Mycobacterium tuberculosis com fluconazol co-

cristalizado como ligante (código de acesso PDB 1ea1, resolução 2,21 Å). A

cavidade catalítica encontra-se no interior da proteína (área sombreada na

Figura 30a); a Figura 30b traz os limites da cavidade catalítica (malha em

cinza), com a distribuição dos CPTs em sua superfície.

FBT/FCF/USP


88

a b

Figura 30. Cavidade catalítica de CYP51 a) Cavidade catalítica (interna) de CYP51 em representação de superfície, com fluconazol (representação em palito, verde) ligado (cód. de acesso PDB 1ea1). b) CPTs, com cavidade catalítica delineada em cinza; H=ciano, R=laranja, A=vermelho, D=azul. Heme representado como palitos rosa escuro com átomo de Fe em esfera laranja

Na análise de CPTs, percebe-se a distribuição de características

hidrofóbicas principalmente em direção ao canal 2, com presença de

características doadoras de receptoras de ligações hidrogênio na região de

interação do anel fenílico dissubstituído do fluconazol, correspondente ao

canal 1. Comparativamente, resultados de docking identificaram uma

possível orientação de interação para compostos oxadiazolínicos em

conformação R, com o grupo nitro em coordenação com o átomo de ferro do

grupo heme (Figura 31). O Ki esperado, como determinado pelo programa

Autodock, variou de 15 a 130 nM. No modelo proposto por este docking,

percebe-se que o grupo acetila acomoda-se na região equivalente à

ocupada pelo anel fenílico dissubstituído em antifúngicos azólicos, podendo-

se supor que existam ligações de hidrogênio envolvidas nesta interação do

grupo acetila. O anel fenílico substituído dos compostos oxadiazolínicos, de

acordo com o docking, direciona-se para o canal 2, concordando com a

possibilidade de interação em regiões hidrofóbicas.

FBT/FCF/USP


89

Figura 31. Orientação de interação sugerida do composto OxaS-Cl (R) com CYP51

Ki Est. = 15 nM

A análise de fragmentos realizada na base de dados de ligantes co-

cristralizados com proteínas sugere que o anel tiofilidênico interage em

regiões do receptor com características predominantemente hidrofóbicas,

com anel furfurilidênico apresentando interação também em regiões com

características doadoras ou receptoras de ligações hidrogênio (Figura 32).

a b c

Figura 32. Fragmentos presentes nos compostos das séries azometínica e oxadiazolínica, com os CPTs associados quando em interação com diversas proteínas*

a) fragmento R-C=N-N-R b) fragmento tiofilideno c) fragmento furfurilideno. Todos fragmentos representados em modelo palito. *cores indicam as características físico-químicas mapeadas; H=cinza, R=laranja, A=vermelho, D=azul. Os CPTs de diversas proteínas encontram-se superpostos em cada caso.

FBT/FCF/USP


90

Estudos de perfis de solubilidade foram realizados em um conjunto de

13 compostos das séries azometínicas com anel nitrofurfurilidênico (série

AzoO) e oxadiazolínica com anel nitrotiofilidênico (série OxaS), conforme

Tabela 6 (p.68) com uso do programa Volsurf 4.0. A Tabela 12 apresenta

alguns dos descritores utilizados pelo programa Volsurf.

No caso dos compostos oxadiazolínicos, a presença de centro quiral

com possibilidade de configuração R ou S dos compostos levou ao uso de

ambas a configurações nos cálculos, uma vez que não se determinou a

configuração real dos compostos testados biologicamente. Partindo-se de

hipótese de que os compostos estão presentes em mistura, a atividade

biológica (em potência) teve seu valor dobrado para efeito de cálculos. Os

resultados da análise de discriminante por método de mínimos quadrados

(Partial Least Squares Discriminant Analysis, PLS-DA) [INDAHL, MARTENS,

NAES, 2007; NOCAIRI et al, 2005] deste conjunto encontram-se na Figura

35 (p.94) e Figura 36 (p. 95).

Tabela 12

Alguns descritores utizados pelo programa Volsurf

DESCRITOR SIGNIFICADO

CW1-CW8 Fator de capacidade (Capacity Factor)

razão entre regiões hidrofílicas e superfície molecular total

D1-D8 Regiões hidrofóbicas distribuiçãodas regiões hidrofóbicas

HL1-HL2 Balanço hidrofílico-lipofílico

razão entre regiões hidrofílicas e regiões hidrofóbicas; descreve qual efeito é dominante na molécula

ID1-ID8 Momento Integy (INTEraction enerGY) hidrofóbico

medida do desequilíbrio entre centro de massa e baricentro da região hidrofóbica

IW1-IW8 Momento Integy (INTEraction enerGY) hidrofílico

medida do desequilíbrio entre centro de massa e baricentro da região hidrofílica

W1-W8 Regiões hidrofílicas distribuição das regiões hidrofílicas

[CRUCIANI et al, 2000]

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91

Realizou-se também análise utilizando-se conjunto de 8 compostos,

considerando-se entre os compostos oxadiazolínicos apenas aqueles em

configuração R. Esta escolha foi baseada nos resultados de docking

indicando a interação com CYP51 somente dos compostos nesta

configuração. Os resultados considerando-se um conjunto de 8 compostos

(3 compostos azometínicos, 5 compostos oxadiazolínicos em configuração

R) são apresentados na Figura 33 (escores) e Figura 34 (pesos).

A comparação de resultados entre este dois conjuntos mostrou que,

em princípio, não há diferença significativa entre eles; em ambos os casos,

as duas primeiras componentes principais (Principal Component, PC)

explicam a maior parte da variabilidade dos dados, 77,3% no conjunto de 8

dados e 84,5% no conjunto de 13 dados. Desta forma, optou-se pela análise

do conjunto com maior número de dados para finalidade de discussão de

resultados.

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92

Figura 33. Resultados de análise de PLS-DA ilustrando os escores das duas primeiras componentes principais para conjunto de 8 compostos*.

*Compostos azometínicos: AzoO-CH3, AzoO-OCH3, AzoO-Cl. Compostos oxadiazolínicos em conformação R: OxaS-CH3, OxaS-OC2H5, OxaS-OC4H8, OxaS-Cl, OxaS-CF3

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Figura 34. Resultados de análise de PLS-DA de conjunto de 8 compostos*: pesos

*Compostos azometínicos: AzoO-CH3, AzoO-OCH3, AzoO-Cl. Compostos oxadiazolínicos em conformação R: OxaS-CH3, OxaS-OC2H5, OxaS-OC4H8, OxaS-Cl, OxaS-CF3

A análise de resultados do conjunto de 13 compostos (3 compostos

azometínicos, 5 compostos oxadiazolínicos em configurações R e S) mostra

que existe uma influência importante das propriedades hidrofóbicas sobre a

atividade biológica na série oxadiazolínica, como pode ser evidenciado

através do gráfico de escores e do gráfico de pesos (loading plot). No gráfico

de escores (Figura 35) são visíveis claramente dois grupos, com duas

componentes principais respondendo por 84% da variabilidade detectada na

atividade biológica.

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Figura 35. Resultados de análise de PLS-DA ilustrando os escores das duas primeiras componentes principais para conjunto de 13 compostos*.

*Compostos azometínicos: AzoO-CH3, AzoO-OCH3, AzoO-Cl. Compostos oxadiazolínicos em conformação R e S: OxaS-CH3, OxaS-OC2H5, OxaS-OC4H8, OxaS-Cl, OxaS-CF3

No gráfico de pesos (Figura 36), é possível visualizar a importância

dos descritores, lembrando que a maior distância em módulo em relação ao

eixo X representa maior influência sobre a atividade. Observa-se que há

concentração de descritores de regiões hidrofóbicas gerados pela sonda

DRY, como por exemplo D1-D8 e ID1-ID8, nos quadrantes superior e

inferior direito, onde se encontram os compostos oxadiazolínicos. A

influência de descritores de regiões hidrofílicas geradas pela sonda OH2,

como por exemplo W1-W8 e Cw1-Cw8, é maior nos quadrantes superior e

inferior esquerdo, onde se encontram os compostos azometínicos no gráfico

de escores.

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95

Figura 36. Resultados de análise de PLS-DA de conjunto de 13 compostos*: pesos

*Compostos azometínicos: AzoO-CH3, AzoO-OCH3, AzoO-Cl. Compostos oxadiazolínicos em conformação R e S: OxaS-CH3, OxaS-OC2H5, OxaS-OC4H8, OxaS-Cl, OxaS-CF3

Uma comparação dos perfis dos composts AzoO-CH3 (Figura 37, p.

96) e OxaS-CH3 (R) (Figura 38, p. 97) permite verificar a diferença entre as

duas séries; é perceptível como os descritores lipofílicos apresentam maior

influência positiva em compostos oxadiazolínicos, enquanto que para os

azometínicos esta influência é negativa. Embora não seja possível uma

análise estatisticamente significante devido ao baixo número de compostos,

as diferenças podem indicar diferentes mecanismos de ação ou modos de

interação com a biomacromolécula-alvo.

A importância dos descritores lipofílicos, com possível influência sobre

a atividade, pode ser confirmada através da comparação dos perfis dos

compostos OxaS-CH3 e OxaS-OC4H8, ambos em configuração R (Figura

38, p. 97, e Figura 39, p. 98).

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96

Figura 37. Perfil de descritores Volsurf para composto oxadiazolínico AzoO-CH3

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97

a Figura 38. Perfil de descritores Volsurf para composto oxadiazolínico OxaS-CH3 (R)

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98

Figura 39. Perfil de descritores Volsurf para composto oxadiazolínico OxaS-OC4H8 (R)

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99

Os resultados de atividade antifúngica (Tabela 6, p. 68) mostram

maior atividade anti-Candida do composto OxaS-CH3, com potência

decrescente nos compostos OxaS-OC2H5 e OxaS-OC4H8. Percebe-se como,

entre OxaS-CH3 e OxaS-OC4H8 (Figura 37 e Figura 39), há uma modificação

na direção da influência de vários parâmetros hidrofóbicos, com aumento da

influência positiva de alguns parâmetros hidrofílicos, evidenciando a

influência de substituinte alcoxílico sobre a atividade analisada, embora de

forma menos acentuada. Considerando-se a natureza hidrofóbica do canal

onde teoricamente estes substituintes acomodar-se-iam em uma interação

com CYP51, é compreensível a maior influência de parâmetros hidrofóbicos

sobre a atividade. A comparação dos mapas de contorno obtidos com uso

das sondas OH2 e DRY (Figura 40) também evidencia este fato, chamando

atenção à sutil diferença na conformação do composto OxaS-OC4H8 (R),

com um ângulo maior entre o anel fenílico substituído e o anel

nitrotiofilidênico que poderia ser suficiente para provocar uma interação

estereoquimicamente menos favorável com o receptor.

Em relação às atividades antifúngicas determinadas para os

compostos oxadiazolínicos (Tabela 6, p. 68), percebe-se que não há

diferença estatística nas potências observadas entre os compostos

OxaS-CH3 e OxaS-Cl; este fato pode ser devido à similaridade de volume e

lipofilicidade entre estes dois grupos substituintes, não afetando de forma

significativa a possível interação com a biomacromolécula-alvo. Da mesma

forma, a similaridade de potência entre OxaS-OC2H5, OxaS-OC4H8 e

OxaS-CF3, apesar das diferenças em relação a caracteristicas eletrônicas,

lipofílicas e estéricas, pode indicar que estas modificações foram realizadas

em regiões que não afetam significativamente a interação com o alvo.

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100

a

b

c

Figura 40. Mapas de contorno representando propriedades hidrofílicas (azul, sonda OH2) e lipofílicas (verde, sonda DRY) de compostos oxadiazolínicos.

a) OxaS-CH3 (R) b) OxaS-OC2H5 (R) c) OxaS-OC4H8 (R). Todas as estruturas representadas em modelo palito. C = cinza, N= azul, O = vermelho, S = amarelo.

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101

Os resultados de atividade antifúngica (Tabela 6, p. 68) também

indicam uma certa atividade anti-Candida para compostos da série

azometínica, embora menor em comparação com a série oxadiazolínica. No

entanto, resultados de docking levam a crer que a ação dos compostos

azometínicos, caso ocorra por ação inibitória de CYP51, não seja devida à

interação com CYP51 na forma proposta uma vez que não foi detectada

orientação da molécula adequada para esta interação.

A comparação dos volumes das estruturas minimizadas com uso do

programa Sybyl 8.0 (parâmetros de minimização apresentados na Tabela 4,

p. 58) mostra as diferenças de orientação e distribuição de volumes entre as

séries azometínica e oxadiazolínica (Figura 41). Comparados com dados

publicados em relação ao docking de fluconazol e itraconazol no sítio ativo

de CYP51 [SHENG et al, 2009] (Figura 42), percebe-se que os compostos

da série oxadiazolínica mostram possuir conformação mais favorável à

interação com a enzima, o que concorda com os resultados de docking que

indicam interação favorável para os compostos oxadiazolínicos em

configuração R (Figura 31, p.89). A comparação da distribuição de regiões

lipofílicas e hidrofílicas como determinado pelo Volsurf 4.0 também evidencia

a diferença na distribuição destas propriedades, como mostra a Figura 43.

a b

Figura 41. Volumes de contorno de compostos tiofilidênicos. a) composto AzoO-Cl. b) composto OxaS-Cl (R)

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102

a b

Figura 42. Orientação das conformações de interação de compostos antifúngicos em CYP51 de Cryptococcus neoformans.

a) Fluconazol. b) Itraconazol. Heme em representação palito rosa. [SHENG et al, 2009]

Figura 43. Mapas de contorno representando propriedades hidrofílicas (azul, sonda OH2) e lipofílicas (verde, sonda DRY) do composto azometínico AzoO-CH3, obtidas com o programa Volsurf.

Composto AzoO-CH3 representado em modelo palito. C= cinza, N = azul, O = vermelho

Não se pode descartar completamente o CYP51 como alvo para a

série de compostos azometínicos, embora a conformação desta série não

seja favorável para a interação com CYP51 da forma descrita para

antifúngos azólicos. Existem estudos demonstrando a possível interação de

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103

compostos não-azólicos com CYP51, porém sem envolver interação com o

átomo de ferro do grupo heme. Neste modelo, interações por ligações de

hidrogênio e hidrofóbicas com a apoproteína são responsáveis pela

manutenção do inibidor na cavidade catalítica da enzima, impedindo assim a

ligação do substrato. A interação proposta é mostrada na Figura 44, onde

existe uma interação por ligação de hidrogênio com resíduo de tirosina

(Y69), com a cadeia lateral hidrofóbica interagindo em canal estreito

hidrofóbico que corresponde ao possível local de interação da cadeia lateral

em C17 no substrato natural de CYP51 [YAO et al, 2007; ZHU et al, 2006; JI

et al, 2000]. A Figura 45 compara a interação de fluconazol com a possível

interação de lanosterol com CYP51.

Figura 44. Ligação de derivado 2-aminotetralínico no sítio ativo de CYP51 de C. albicans.

S1 (amarelo), região hidrofílica. S2 (azul), região hidrofóbica. S3 (rosa), região canal hidrofóbico estreito. S4 (vermelho), região de ligação de hidrogênio. Ligante representado em modelo palito, heme e resíduos em representação de linhas cinza [YAO et al, 2007].

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104

Considerando-se este modo alternativo de interação é possível a

interação da série azometínica com CYP51 através da formação de ligações

de hidrogênio na região do anel nitrofurânico, com interações

predominantemente hidrofóbicas na região do anel fenílico substituído. A

distribuição de regiões hidrofílicas e lipofílicas como determinadas pelo

Volsurf (Figura 43, p. 102) reforça esta possibilidade.

Figura 45. Interação de lanosterol (roxo) e fluconazol (verde) no sítio ativo de CYP51 de M. tuberculosis.

Estruturas em representação de linhas. Grupo heme em preto. α-hélice em representação de fita azul . [Modificado de PODUST et al, 2001]

Outro fator interessante a ser considerado são os resultados da

análise de fragmentos (Figura 46); onde foi detectado um composto,

acenaftenoquinona, que possui parte de sua estrutura química em comum

com a série azometínica e, por análise de características de sua interação

com seu receptor, pôde-se detectar que o anel nitrofurânico, analisado como

dois fragmentos, grupo nitro e anel furânico, poderia interagir com regiões do

sítio catalítico de CYP51 que possuem características doadoras de ligação

H, com fragmento azometínico estando localizado em regiões com

características aromáticas.

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105

a** b**

Figura 46. Fragmentos extraídos de banco de dados e respectivas regiões de CYP51 com possibilidade de interação

a) Três fragmentos da acenaftenoquinona, ligante da proteína de código de acesso PDB 1oay (Imunoglobulina E), comuns à série azometínica, superpostos no sítio catalítico (limites não visíveis) da enzima CYP51 (código PDB 1eae1, resolução 2,21 Å). Porção comum com série azometínica destacada em vermelho na estrutura. b) mesma imagem de A, em superposição aos CPTs da enzima CYP51. ** cores indicam as características físico-químicas mapeadas; H=ciano, R=laranja, A=vermelho, D=azul, P=rosa.

Por outro lado, embora a similaridade topográfica da série

azometínica com os antifúngicos azólicos possa ser questionada existe, sem

dúvida, similaridade significativa com o benznidazol. Embora o mecanismo

de ação deste fármaco não tenha sido elucidado, existe relato de atividade

inibitória sobre CYP51, embora com baixa afinidade [LEPESHEVA et al,

2008]. Uma hipótese é sua ação como inibidor irreversível após redução do

grupo nitro pela citocromo P450 redutase, ligando-se então de forma

covalente à enzima [LEPESHEVA et al, 2008].

A observação dos resultados de inibição de crescimento de T. cruzi

(Tabela 7 e Figura 18) indica atividade inibitória de crescimento menor da

série oxadiazolínica em relação aos compostos azometínicos, resultado este

oposto ao que seria esperado caso a atividade anti-T. cruzi fosse devida

exclusivamente à inibição de CYP51. Este resultado pode indicar uma

diferença no mecanismo de ação entre as duas séries, não se descartando

de imediato a ação inibitória de CYP51 da série oxadiazolínica uma vez que

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106

estes compostos apresentam atividade inibitória de crescimento comparável

ao do benznidazol.

Considerando a hipótese de interação dos compostos da série

oxadiazolínica no sítio ativo de CYP51 seguindo uma orientação similar à

dos compostos antifúngicos azólicos, pode-se concluir que algumas

características estruturais e físico-químicas são necessárias para uma

interação adequada. Em primeiro lugar, é necessária a presença de um

grupo que seja capaz de coordenar-se com o átomo de Fe do grupo heme

de forma semelhante ao nitrogênio básico dos anéis imidazólico e triazólico;

no caso dos compostos oxadiazolínicos, este papel seria assumido pelo

grupo nitro ligado ao anel furfurilidênico ou tiofilidênico. É também

necessário um substituinte lipofílico de volume adequado para interação em

bolso hidrofóbico de tamanho restrito, na posição equivalente ao do anel

fenílico dissubstituído dos antifúngicos azólicos; nos compostos

oxadiazolínicos de configuração R, o grupo 3-acetil apresenta orientação

adequada para a interação com este bolso hidrofóbico. O anel oxadiazolínico

possivelmente mantém a relação de distância adequada entre estes dois

pontos hipotéticos de interação, grupo nitroheterocíclico e grupo acetila, e o

anel fenílico que se posicionaria em direção ao canal de acesso de substrato

2, de característica hidrofóbica. Substituintes adequados na posição 4 do

anel fenílico são possivelmente necessários para assegurar a melhor

interação com a enzima através de interações hidrofóbicas adicionais ao

longo do canal de acesso. A Figura 47 ilustra estas características.

Em relação aos compostos estudados pertencentes à série

oxadiazolínica, seguindo-se a proposição do modo de interação com CYP51

sugere-se para o futuro a síntese e ensaio de atividade antifúngica de

compostos com substituintes lipofílicos de maior volume porém não-

ramificados na posição 4 do anel fenílico, com o objetivo de melhorar a

interação com a enzima através da introdução de pontos adicionais de

interação hidrofóbica.

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107

Figura 47. Proposição de características necessárias para interação de compostos oxadiazolínicos com sítio catalítico de CYP51.

Heme em representação palito rosa, átomo de Fe em esfera laranja. Cavidade catalítica delineada em cinza. Baseado em estrutura de CYP51, código PDB 1ea1 (resolução 2,21 Å).

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108

6. CONCLUSÕES

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• Os compostos das séries azometínica e oxadiazolínica apresentam

atividade antifúngica, com a série oxadiazolínica apresentando maior

atividade. O composto mais ativo entre aqueles testados foi OxaS-

CH3, com MIC entre 3,28 e 2,95 µg/mL.

• A análise de similaridade de perfis topológicos com uso de perfis SHED

indicou semelhança da série oxadiazolínica com compostos

antifúngicos azólicos, cujo sítio de ação é a CYP51.

• Estudos de virtual profiling sugeriram como possíveis alvos para a série

oxadiazolínica as enzimas CYP19 (aromatase), CYP3A4, CYP3A5 e

CYP3A7, enzimas estas que também são inibidas por compostos

azólicos. Estes estudos indicaram ainda possível ação inibitória de

COX-2, corroborados por estudos de docking.

• A distribuição de características físico-químicas na cavidade catalítica

de CYP51 e o perfil de solubilidade de compostos oxadiazolínicos,

obtido com Volsurf, sugerem a possibilidade de interação com o sítio

catalítico da CYP51. Estudos de docking indicam a possibilidade de

interação de compostos oxadiazolinicos em configuração R com este

sítio, com o grupo nitro do anel nitroheterocíclico coordenado ao átomo

de Ferro do grupo heme.

• Os compostos azometínicos não possuem distribuição de propriedades

físico-quimicas ou perfis SHED que indiquem possível interação com

CYP51 na orientação adotada pelos compostos azólicos. É possível

que a interação ocorra em orientação diferente daquela de compostos

azólicos, sem interação de coordenação com o átomo de Ferro do

grupo heme.

• Os compostos oxadiazolínicos são menos ativos em relação a

compostos azometínicos como inibidores de crescimento de formas

epigastigotas de T. cruzi, fato que pode indicar diferentes mecanismos

de ação contra este protozoário. Existe a possibilidade de que os

compostos azometínicos interajam com outro alvo, como por exemplo

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tripanotiona redutase, ou que interfiram com o mecanismo de proteção

do micro-organismo contra estresse oxidativo devido à presença do

grupo nitro.

• Com estes estudos é possível sugerir alguns requisitos estruturais que

dever ser considerados no planejamento de novos análogos e que,

provavelmente, favorecem a atividade desses novos ligantes, de

estrutura oxadiazolínica, frente à CYP51. Assim, sugere-se que no

planejamento destes novos ligantes de CYP51 se considerem as

seguintes características:

o grupo ligado ao anel heterocíclico adequado para interação

com átomo de Ferro do grupo heme;

o substituinte na posição 3 do anel oxadiazolínico com

características hidrofóbicas e restrição de volume, permitindo

interação com bolso hidrofóbico presente na CYP51;

o presença de substituintes hidrofóbicos na posição 4 do anel

fenílico com características estéricas adequadas para a

interação no canal de acesso de substrato 2 de CYP51.

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7. PERSPECTIVAS FUTURAS

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112

O presente estudo traz indicações interessantes sobre o possível

mecanismo de ação dos compostos azometínicos e oxadiazolínicos

estudados. Assim, para etapas futuras, propõe-se:

• Síntese e determinação de atividade biológica de derivados com

substuintes mais lipofílicos na posição 4 do anel fenílico. Sugere-se,

em primeiro lugar, a síntese e ensaio dos compostos OxaS-propil e

OxaS-butil;

• Estudos de inibição enzimática, para confirmação da hipótese proposta

de atividade antifúngica e anti-T. cruzi dos compostos oxadiazolínicos

por inibição de CYP51;

• Estudos de docking validados por dinâmica molecular, possibilitando

um melhor entendimento dos resíduos e tipos de interação envolvidos

na ligação com a biomacromolécula-alvo;

• Estudos de docking e inibição enzimática dos compostos frente a

outras enzimas, como por exemplo tripanotiona redutase, verificando

hipótese alternativa para ação anti-T. cruzi.

• Determinação de possível padrão de substituição na estrutura dos

compostos oxadiazolínicos que possa levar a um melhor perfil de

atividade biológica e à introdução de novo composto-líder ou protótipo

para o desenvolvimento de novos fármacos antifúngicos e anti-T. cruzi.

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113

8. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS

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ANEXOS

UNIVERSIDADE DE SÃO PAULO

Faculdade de Ciências Farmacêuticas Secretaria de Pós-Graduação

Av. Prof. Lineu Prestes, 580, Bloco 13 A - Cidade Universitária - CEP 05508-900 - São Paulo - SP Fone: (11) 3091 3621 - Fax (11) 3091 3141 – e-mail: [email protected]

Informações para os Membros de Bancas Julgadoras de Mestrado/Doutorado

1. O candidato fará uma apresentação oral do seu trabalho, com duração máxima de trinta minutos.

2. Os membros da banca farão a argüição oral. Cada examinador

disporá, no máximo, de trinta minutos para argüir o candidato, exclusivamente sobre o tema do trabalho apresentado, e o candidato disporá de trinta minutos para sua resposta.

2.1 Com a devida anuência das partes (examinador e candidato),

é facultada a argüição na forma de diálogo em até sessenta minutos por examinador.

3. A sessão de defesa será aberta ao público. 4. Terminada a argüição por todos os membros da banca, a

mesma se reunirá reservadamente e expressará na ata (relatório de defesa) a aprovação ou reprovação do candidato, baseando-se no trabalho escrito e na argüição.

4.1 Caso algum membro da banca reprove o candidato, a

Comissão Julgadora deverá emitir um parecer a ser escrito em campo exclusivamente indicado na ata.

4.2 Será considerado aprovado o aluno que obtiver aprovação por unanimidade ou pela maioria da banca.

5. Dúvidas poderão ser esclarecidas junto à Secretaria de Pós-

Graduação: [email protected], (11) 3091 3621.

São Paulo, 18 de março de 2005.

Profa. Dra. Bernadette D. G. M. Franco Presidente da CPG/FCF/USP

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