UNIVERSIDADE DE SÃO PAULO ESCOLA DE ENGENHARIA DE...

UNIVERSIDADE DE SÃO PAULO

ESCOLA DE ENGENHARIA DE LORENA

Bruno Augusto Moreira Ribeiro

Síntese de nanocompósitos híbridos luminescentes

biocompatíveis

Lorena

2013

BRUNO AUGUSTO MOREIRA RIBEIRO

Síntese de nanocompósitos híbridos luminescentes biocompatíveis

Trabalho de conclusão de curso apresentado à Escola de Engenharia de Lorena da Universidade de São Paulo para obtenção do título Engenheiro Químico.

Orientador: Prof. Dr. Domingos Sávio Giordani

Lorena, 2013

Dedico este trabalho ao meu pai Sidnei,

minha mãe Ivete, minha irmã Ana Paula

e toda a minha família.

Agradecimentos

Ao Prof. Dr. José Paulo Sequeira Farina e ao Prof. Dr. Carlos Miguel

Calisto Baleizão pela oportunidade de realizar este trabalho no Centro

Química-Física Molecular (CQFM) em Lisboa, Portugal. Pela ótima orientação

recebida, paciência, ensinamentos, amizade e apoio para realização deste

projeto.

A todos os membros do CQFM pela oportunidade de convivência durante

a execução deste trabalho, tornando o ambiente bastante agradável. Em

principal a Sofia Martins e André Costa pela boa amizade, boa vontade,

ensinamentos, dicas valiosas e boas orientações, facilitando a execução deste

trabalho.

Ao Prof. Dr. Amilton Martins dos Santos pelos ensinamentos que levarei

para o resto da minha vida, pela confiança, paciência, amizade e orientações

que foram fundamentais para o meu crescimento profissional.

Ao Prof. Dr. Domingos Savío Giordani pela atenção e orientação deste

trabalho.

Aos meus pais Ivete e Sidnei, a minha irmã Ana Paula e toda a minha

família.

À Gizelda e a Simone que sempre me ajudaram com muita boa vontade e

amizade no LabPol.

Aos meus amigos no LabPol., pela amizade e boa vontade. Em especial

ao Rafael Caetano Jardim Pinto da Silva pela orientação, paciência e

ensinamento, que foram fundamentais na minha carreira.

"Imaginação é mais importante do que

conhecimento" (Albert Einstein)

"Para que tanta afobação? O futuro

sempre chega a uma velocidade

constante de 60 minutos por hora"

(Albert Einstein)

Resumo

Este projeto tem como objetivo a síntese de nanopartículas híbridas

luminescentes tipo núcleo-casca (“core-shell”), com núcleo de sílica e casca

polimérica. A superfície das partículas de sílica, obtidas pelo processo sol-gel,

foi modificada com um agente de transferência de cadeia, posteriormente

usado para sintetizar a casca polimérica pelo método de polimerização

radicalar controlada por Transferência Reversível de Cadeia por Adição-

Fragmentação (RAFT). Utilizou-se um copolímero biocompatível e

termossensível (“smart polymer”), formado a partir dos monômeros oligo(etileno

glicol)metacrilato (OEGMA) e 2-(2’metoxi-etoxi)etil-metacrilato (MEO2-MA). Foi

feita a incorporação de um corante fluorescente de elevado rendimento

quântico, derivado do perilenodiimida contendo dois grupos trietoxisilano (PDI),

na sílica (núcleo), permitindo a utilização destas partículas em técnicas de

imagem avançada, especificamente utilizando microscopia de varredura a

laser;

A caracterização das nanopartículas ao longo do processo de preparação

foi feito utilizando as técnicas de espalhamento dinâmico de luz (DLS), análise

de rasto de nanopartículas (Nanoparticle Tracking Analysis, NTA), microscopia

eletrônica de transmissão (TEM), microscopia eletrônica de varredura (SEM),

microscopia de força atômica (AFM), ressonância magnética nuclear (NMR),

determinação do potencial zeta (ZP).

Obteve-se sucesso na síntese da sílica contendo o PDI, com diâmetro de

partícula (DP) médio de 189nm. Sucesso na modificação da superfície da sílica

com APTES, obtendo um grau de enxerto de 2 moléculas de APTES por nm2

de sílica. Sucesso na síntese do agente RAFT, obtendo um produto de elevada

pureza. Sucesso no acoplamento do agente RAFT na superfície da sílica,

obtendo 0,0445mMol de agente RAFT por grama de sílica. Sucesso na síntese

dos nanocompósitos híbridos, observando a variação do DP com a variação da

temperatura.

Lista de Figuras

Figura 1 - Relação de área superficial/volume para diversas geometrias de

nanocarga . ........................................................................................................ 18

Figura 2 - Esquema simplificado da síntese da partícula de sílica. ................... 20

Figura 3 - Esquema da modificação da superfície da sílica com agente silano.

........................................................................................................................... 21

Figura 4 - Representação dos possíveis mecanismos de nucleação de uma

polimerização em emulsão na presença de partículas inorgânicas modificadas

com moléculas reativas ..................................................................................... 22

Figura 5 - Influência do tamanho da cadeia de PEG na LCST do polímero. ..... 26

Figura 6 - Esquema da síntese SiO2 / PMPTS a partir da superfície da sílica via

polimerização ATRP .......................................................................................... 28

Figura 7 - Síntese do copolímero sensível à temperatura na superfície da sílica.

........................................................................................................................... 29

Figura 8 - Resultado da fluorescência liberada pelos nanocontentor em pH

ácido e básico. ................................................................................................... 30

Figura 9 - Esquema da modificação da superfície da sílica. ............................. 36

Figura 10 - Esquema da reação com Fmoc-Gh-Oh. ......................................... 38

Figura 11 - Esquema da quantificação de grupos aminas na superfície da

partícula. ............................................................................................................ 39

Figura 12 - Esquema da síntese do agente RAFT. ........................................... 40

Figura 13 - Síntese da sílica-RAFT. .................................................................. 41

Figura 14 - Imagens de TEM (A), SEM (B) e AFM (C) com distribuição de

tamanho das nanopartículas de sílica, a partir das contagens pelas imagens do

TEM. .................................................................................................................. 46

Figura 15 - Espectro de emissão das partículas fluorescentes. ........................ 47

Figura 16 - Quantificação dos grupas aminas. .................................................. 48

Figura 17 - Espectro de RMN 1H do agente RAFT. ........................................... 49

Figura 18 - Resultados obtidos na calibração do RAFT em dioxano. ............... 50

Figura 19 - Espectro das partículas modificas com o agente RAFT. ................ 51

Figura 20 - Síntese do polímero na superfície das nanopartículas. .................. 53

Figura 21 - Imagens de TEM (A) e SEM (B) com distribuição de tamanho das

nanopartículas de sílica com polímero. ............................................................. 54

Figura 22 - Variação do Dp em função da temperatura através da técnica de

Espalhamento de Luz Dinâmico. ....................................................................... 55

Figura 23 - Imagens de TEM (A) e SEM (B) com distribuição de tamanho das

nanopartículas de sílica com polímero. ............................................................. 57

Figura 24 - Variação do Dp em função da temperatura através da técnica de

Espalhamento de Luz Dinâmico. ....................................................................... 58

Lista de Tabelas

Tabela 1 - Principais tipos de agente RAFT tiocarbonílicos. ............................. 31

Tabela 2 - Condições experimentais utilizadas nas polimerizações em solução

........................................................................................................................... 42

Tabela 3 - Potencial Zeta. .................................................................................. 48

Tabela 4 - Potencial Zeta ................................................................................... 52


Tabela 6 - Resultado obtido pela análise do GPC ............................................. 56


Tabela 8 - Resultado obtido pela análise do GPC ............................................. 59

Glossário

AFM............................Microscopia de Força Atômica

AIBN...........................2,2′-Azobis(2-metilpropilnitrila)

APTES........................3-aminopropiltrietoxisilano

ATRP...........................Polimerização Radicalar por Transferência de Átomo

CMC............................Compósitos de matriz cerâmica

CMM............................Compósitos de matriz metálica

CMP.............................Compósitos de matriz polimérica

CRP..............................Polimerizações radicalares controladas

CTA..............................Agente de Transferência de Cadeia

DIPEA...........................N,N-diisopropil-etilamina

DLS...............................Espalhamento de Luz Dinâmico

EDC..............................N-etil-N’-(3-dimetilaminopropil)carbodiimida

GPC..............................Cromatografia de Permeação em Gel

LCST.............................Temperatura Crítica Inferior de Solubilidade

MAPMA..........................2 - (N-metil-N-(4-piridil) amino) de metacrilato de etila

MEO2-MA...................... 2-(2’Metoxi-Etoxi)etil Metacrilato

MPTS..............................γ-metacriloxi-propil-trimetoxi silano

MPS................................Metacril-oxi-propil trimetoxisilano

Mn...................................Massa molar numérica média

Mw..................................Massa molar ponderada

NMP................................Polimerizações mediadas por nitróxidos

NMP.................................N-metil-2-pirrolidona

OEGMA...........................Oligo (Etileno glicol) Metacrilato

PEG.................................Poli(Etileno Glicol)

PDI...................................Bis(propil)trietoxisilano perilenodiimida

PNIPAM......................... Poli(N-isopropilacrilamida)

PyBOP............................(Benzotriazo-1-il-oxi)-tripirrolidona-fosfonil-hexafluoro-fosfato

RAFT.............................Transferência Reversível de Cadeia por Adição-Fragmentação

SEM...............................Microscopia Eletrônica por Varredura

TEGMMA.......................Metacrilato de methoxytri (etileno glicol)

TEM...............................Microscopia eletrônica de transmissão

TEOS.............................Tetraetoxisilano

THF................................Tetrahidrofurano

UCST.............................Temperatura crítica superior de solubilização

ZP..................................Potencial Zeta

Sumário

1. Introdução ........................................................................................... 15

2. Revisão bibliográfica .......................................................................... 17

2.1. Compósitos .................................................................................. 17

2.2. Nanocompósitos .......................................................................... 17

2.3. Nanocompósitos de matriz polimérica ......................................... 19

2.4. Modificação da superfície da sílica .............................................. 20

2.5. Polímeros sensíveis a estímulos ................................................. 22

2.6. Polímeros sensíveis à variação de pH ......................................... 23

2.7. Polímeros sensíveis à variação de temperatura .......................... 24

2.8. Modificação da superfície da sílica com agentes controladores de

cadeia 27

2.9. Polimerização via RAFT .............................................................. 30

3. Objetivo .............................................................................................. 34

4. Materiais e Métodos ........................................................................... 34

4.1. Reagentes .................................................................................... 34

4.2. Metodologias ................................................................................ 35

Síntese das nanopartículas de sílica ..................................... 35 4.2.1.

Modificação da superfície da sílica ....................................... 36 4.2.2.

Quantificação dos grupos aminas na superfície das 4.2.3.

nanopartículas de sílica .............................................................................. 37

Síntese do agente de transferência de cadeia ...................... 39 4.2.4.

Síntese da sílica-RAFT ......................................................... 40 4.2.5.

Polimerização em redispersão .............................................. 41 4.2.6.

Clivagem do polímero enxertado na superfície da sílica para a 4.2.7.

caracterização por Cromatografia de Permeação em Gel (GPC) .............. 42

4.3. Caracterização dos materiais ...................................................... 42

5. Resultados e Discussões ................................................................... 45

5.1. Síntese das nanopartículas de sílica ........................................... 45

5.2. Síntese da sílica-APTES .............................................................. 47

5.3. Síntese do agente de transferência de cadeia, agente RAFT ..... 49

5.4. Síntese da sílica-RAFT ................................................................ 50

5.5. Polimerização em redispersão via RAFT ..................................... 53

6. Conclusões ......................................................................................... 59

7. Dificuldades encontradas durante o projeto ....................................... 60

8. Evolução do projeto ............................................................................ 60

15

1. Introdução

Atualmente o estudo em biopolímeros sensíveis a estímulos vêm

chamando a atenção dos pesquisadores devido ao seu grande potencial na

aplicação em nanotecnologia e biomedicina. Nesse contexto biopolímeros

sensíveis à temperatura se destacam por apresentarem características

extremamente úteis para aplicação em biomedicina, separação biológica,

superfície bioativas e “ drug delivery” [1].

Polímeros termossensíveis são macromoléculas que sofrem mudanças

de fase, de um estado solúvel para insolúvel, dependendo do gradiente de

temperatura da solução aquosa. Os polímeros que precipitam com o

aquecimento da solução aquosa a uma temperatura superior a LCST

(Temperatura Crítica Inferior de Solubilização), ou seja, o aumento da

temperatura da solução aquosa acima da LCST causa transição do estado em

que as cadeias se encontram hidratadas para um estado em que as cadeias se

encontram na forma de aglomerados. O mesmo efeito é observado quando os

polímeros precipitam com o arrefecimento da solução aquosa, assim pode-se

dizer que a solução está a uma temperatura superior a UCST (Temperatura

Crítica Superior de Solubilização).

Nos últimos anos pesquisadores vêm priorizarando a síntese de

biopolímeros termossensíveis à base de PEGs como Poli((Oligoetileno glicol)

Metacrilato) ou Poli((Oligoetileno glicol) Acrilato). Esses biopolímeros

apresentam propriedades químicas desejáveis que os tornam extremamente

úteis para aplicações biológicas e farmacêuticas, com um grande potencial no

ramo da nanotecnologia, com o objetivo principal na liberação controlada de

fármacos.

16

Através da nanotecnologia, pesquisadores sintetizaram nanocompósitos

“core-shell”, constituídos por um núcleo inorgânico e uma casca polimérica.

Esses nanocompósitos apresentam uma grande aplicação na área biomédica,

por apresentarem um mecanismo de abertura e fechamento, através de

estímulos, em nanopartículas inorgânicas porosas.

Porém, é de extrema importância sintetizar a casca polimérica utilizando

um mecanismo de polimerização radicalar controlada, pois sem o controle da

polimerização a resposta a estímulos torna-se bastante prejudicada. Neste

contexto, a Polimerização Radicalar por Transferência de Átomo (ATRP)

ganhou destaque. Entretanto, não existe na literatura nanocompósitos

fluorescentes à base de PEGs, utilizando um mecanismo de polimerização

radicalar controlada por Transferência Reversível de Cadeia por Adição-

Fragmentação (RAFT).

Portanto, este projeto teve como objetivo a síntese da sílica coloidal

fluorescente recoberta com biopolímero a base de PEGs, utilizando o

mecanismo de polimerização radicalar controlada por Transferência Reversível

de Cadeia por Adição-Fragmentação, de forma a criar um mecanismo de

liberação de fármaco e monitoramento das nanopartículas na célula.

17

2. Revisão bibliográfica

2.1. Compósitos

Materiais compósitos podem ser definidos como materiais formados de

dois ou mais constituintes com distintas composições químicas, estruturas e

propriedades e que estão separados por uma interface. Estes materiais, por

sua vez, exibem as propriedades de ambas as fases que os constituem, de tal

maneira que se obtém uma melhor combinação de suas propriedades [2].

Os materiais compósitos são geralmente formados por duas fases; a

primeira fase é conhecida como matriz, a qual deve ser contínua. A segunda

fase, a qual é chamada de fase dispersa ou simplesmente carga. Assim os

diferentes tipos de compósitos podem ser classificados em três classes

principais, agrupados de acordo com a natureza da matriz: compósitos de

matriz cerâmica (CMC), compósitos de matriz metálica (CMM) e compósitos de

matriz polimérica (CMP) [3].

2.2. Nanocompósitos

São considerados nanocompósitos os materiais híbridos que apresentam

uma das fases contendo pelo menos uma de suas dimensões em escala

nanométrica, na ordem de 1 a 100 nm. Os nanocompósitos representam uma

nova classe de materiais, podendo ser polímeros, cerâmicos ou metais.

Atualmente, o interesse em nanotecnologia engloba diversas áreas e

encontra diversas aplicações, como nanobiotecnologia, nanoeletrônicos e

materiais nanoestruturados, dos quais os nanocompósitos representam uma

parcela significativa.

18

Podem-se distinguir três tipos de nanocompósitos, dependendo de

quantas dimensões dos objetos dispersos estão na escala nanométrica,

conforme ilustrado na Figura 1.

Figura 1 - Relação de área superficial/volume para diversas geometrias de nanocarga [4].

Quando as três dimensões estão na ordem de nanômetros, trata-se de

nanocargas isodimensionais que podem ser obtidas através da polimerização

promovida diretamente das superfícies das partículas de sílica [5], podendo

nestas nanocargas serem incluídos também grupamentos semicondutores [6],

entre outros [7].

Se apenas duas dimensões se encontram na escala nanométrica e a

terceira possui dimensão maior, formando uma estrutura alongada, os mesmos

são chamados de nanotubos ou nanofilamentos, como por exemplo, os

nanotubos de carbono [8], os nanotubos de gadolínio [9], os filamentos de

celulose [10] ou ainda, imogolita sintética [11]. Estes tipos de materiais vêm sendo

estudados extensivamente como nanocargas de reforço e permitem a obtenção

de novos materiais com propriedades diferenciadas.

Por fim, o terceiro tipo de nanocarga é caracterizado por possuir apenas

uma dimensão na escala nanométrica. Neste caso, a carga apresenta-se na

19

forma de folha com espessura de um a poucos nanômetros, enquanto que sua

largura e comprimento podem possuir até centenas de nanômetros. Um

exemplo deste tipo de nanocompósito são os nanocompósitos do tipo polímero-

silicatos lamelares.

2.3. Nanocompósitos de matriz polimérica

Atualmente vem crescendo o interesse na síntese de nanocompósitos

caracterizado por partículas inorgânicas dispersas em uma matriz polimérica. A

incorporação de cargas inorgânicas em polímeros origina materiais com maior

resistência mecânica, maior estabilidade térmica ou com propriedades ópticas,

magnéticas ou elétricas superiores, ou seja, combinam as vantagens dos

materiais inorgânicos, como a sua rigidez e estabilidade térmica, com as

vantagens dos materiais orgânicos, como a sua flexibilidade [12].

Entretanto, a incorporação de partículas muito pequenas em polímeros

não leva necessariamente a um forte aumento da resistência. De fato,

partículas muito finamente divididas tendem a aglomerar e são extremamente

difíceis de dispersar [13]. Além disso, a incorporação de inclusões micrométricas

leva a uma perda de transparência devido ao espalhamento de luz [14]. A falta

de afinidade entre a nanocarga inorgânica e o polímero causa aglomeração do

mineral na matriz polimérica. Portanto, modificações na superfície da carga

facilitam a compatibilidade para que se obtenha uma boa dispersão e se

obtenha propriedades físicas superiores.

20

2.4. Modificação da superfície da sílica

As nanoesferas de sílica foram sintetizados pela primeira vez na década

de 60, por Stöber et al. [15]. Stöber reportou um método para preparar partículas

de sílica perfeitamente esféricas e monodispersas com qualidade suficiente

para condensar matrizes perfeitamente ordenadas. A principal vantagem deste

método é a síntese de partículas com tamanho controlado. Estas

nanopartículas são formadas através de hidrólise e condensação de um alquil

silicato em uma solução alcoólica na presença de amônia, sendo que a amônia

é utilizada como catalisador [15]. A Figura 2 apresenta um esquema simplificado

da síntese da partícula de sílica através da hidrólise e condensação do

Tetraetoxisilano (TEOS) pelo método de Stöber.

Figura 2 - Esquema simplificado da síntese da partícula de sílica.

Entretanto o crescente interesse em materiais híbridos gerou a

necessidade da modificação química da superfície das partículas de sílica,

visando melhorar as interações intermoleculares, facilitando a compatibilidade

entre as partículas de sílica (inorgânico) e o polímero (orgânico).

21

Os grupos hidroxílicos na superfície das partículas de sílica podem ser

facilmente adaptados com compostos orgânicos ou polímeros, desde que

sejam funcionalizados com agentes de acoplamento adequados. A superfície

da sílica pode ser modificada com alquiltrialcoxisilanos (agente de acoplamento

silano), possibilitando a interação entre a sílica e o polímero. A Figura 3 ilustra

um esquema da modificação da superfície da sílica.

Figura 3 - Esquema da modificação da superfície da sílica com agente silano.

Bourgeat-Lami et al. [16] encapsularam nanopartículas de sílica

previamente modificadas com agente de acoplamento silano, metacril-oxi-propil

trimetoxisilano (MPS), via polimerização em emulsão na presença dos

monômeros: estireno, acrilato de n-butila e metacrilato de butila, em meio

aquoso/alcoólico. As partículas de sílica foram todas cobertas pelos polímeros,

indicando o sucesso desta técnica de encapsulação. Eles mostraram que o

sucesso na encapsulação depende do tamanho e da concentração da sílica.

O mesmo grupo também investigou a influência do grau de enxertia de

MPS e da natureza do surfatante sobre a cinética de polimerização e sobre a

morfologia das partículas, via polimerização em emulsão. Foi demonstrado que

variando a densidade de ligações duplas reativas, ou seja, o grau de

concentração do agente de acoplamento silano (MPS) na superfície das

OHOH

OHOH

OHOH

HOHO

HO

HO

HOHO

SiO2

X

SiX

X

R+ Solvente

OHO

OO

OO

HOHOO

HO

OO

SiO2 SiR

X: -OC2H5, -OCH3, Cl

R: -COOH, -Br, -Cl, -I, -NH2, -SH, -OH, -NCO, etc.

22

partículas de sílica ou a natureza do surfatante, diferentes morfologias podem

ser obtidas [16], como ilustra a Figura 4.

Figura 4 - Representação dos possíveis mecanismos de nucleação de uma polimerização em emulsão na presença de partículas inorgânicas modificadas com moléculas reativas - (adaptado de Bourgeat-Lami e

Lansalot [16])

Quando se aumenta o grau de enxertia do agente de acoplamento silano

na superfície da sílica, permite-se a encapsulação na nanocarga, devido a uma

captura eficiente de radicas. Quando o grau de enxertia é baixo, as cadeias

poliméricas se formam em domínios separados devido à presença de grupos

silanóis que não reagiram.

2.5. Polímeros sensíveis a estímulos

Polímeros sensíveis a estímulos são materiais que respondem a

pequenas alterações do meio, tais como temperatura, pH, força iônica, entre

outros, causando uma mudanças drásticas em suas propriedades químicas ou

físicas. Essas respostas são manifestadas como mudança de forma,

características de superfície, solubilidade, etc. A temperatura e o pH são os

estímulos mais utilizados nos sistemas constituídos por esses polímeros,

devido a grande importância para aplicações biomédicas [17].

Partícula de Sílica funcionalizada com MPS

Polimerização em Emulsão

23

Os polímeros sensíveis a estímulos utilizados em aplicações biomédicas

apresentam grupos funcionais em suas macrocadeias capazes de formar

interações com outras moléculas. Macromoléculas hidrossolúveis funcionais

incluem polímeros com várias arquiteturas que podem ser eletricamente

carregadas ou possuir grupos capazes de formar pontes de hidrogênio com

outras substâncias, levando a interações físicas reversíveis.

As propriedades dos polímeros sensíveis a estímulos, em geral, tais como

solubilidade, viscosidade, transparência e condutividade, podem ser

controladas modificando-se a estrutura e organização das cadeias poliméricas.

Tal característica permite a utilização destes polímeros como agentes de

liberação controlada de princípios ativos, entre outras aplicações [18].

2.6. Polímeros sensíveis à variação de pH

Polímeros sensíveis ao pH são materiais capazes de variar suas

dimensões, sofrendo colapso ou intumescimento, devido às alterações no pH

do meio no qual se encontram. Este comportamento é atribuído a determinados

grupos funcionais presentes nestes materiais. Basicamente, estes polímeros

podem ser classificados em macromoléculas que apresentam grupos ácidos, (-

COOH, -SO3H) ou que apresentam grupamentos básicos (-NH2) [19].

Os polímeros sensíveis ao pH encontram aplicações potenciais em

sistemas de transporte e liberação controlada de drogas. O pH fisiológico varia

entre 1,2 e 7,4, sendo que o estômago, por exemplo, possui pH igual a 1,2,

enquanto o pH do intestino é de 7,4. Dessa forma, polímeros sensíveis ao pH

possuem particular relevância na liberação controlada de fármaco ou peptídeos

em regiões específicas do trato gastrointestinal, por exemplo. A liberação pode

24

igualmente ser feita por meio de pequenas mudanças de pH em tecidos com

doenças patológicas, tal como os tumores [20].

2.7. Polímeros sensíveis à variação de temperatura

Polímeros termossensíveis são materiais capazes de alterar alguma de

suas propriedades em função de uma alteração na temperatura do meio. Estes

materiais, quando se encontram em solução, variam determinadas

propriedades físicas em resposta à alteração da temperatura do meio no qual

se encontram. Em certa temperatura tais materiais exibem uma transição de

fases que resulta em mudanças na conformação, solubilidade e balanço

hidrofóbico-hidrofílico.

Polímeros termossensíveis podem exibir características hidrofóbicas

acima de certo valor de temperatura, isto é, sua solubilidade diminui e abaixo

deste valor, denominado temperatura crítica inferior de solubilização ou “lower

critical solution temperature” (LCST), as interações entre as macro-cadeias e a

água se tornam dominantes, levando à solubilização do polímero. Por outro

lado, existem macromoléculas que se tornam solúveis sob aquecimento,

apresentando assim a chamada UCST (temperatura crítica superior de

solubilização ou “upper critical solution temperature”). Os conceitos de LCST e

UCST não são restritos a sistemas que apresentam solventes aquosos, mas

somente estes são adequados para aplicações biomédicas [21].

Diversos polímeros são conhecidos por possuírem propriedades

termossensíveis, porém o mais estudado é o Poli(N-isopropilacrilamida),

PNIPAM. Entretanto, a maioria dos trabalhos descreve a utilização do PNIPAM

somente para aplicações in vitro. A perda de grupos amidas com a hidrólise

25

das macromoléculas limita o uso deste polímero para aplicações in vivo, devido

à ausência de biocompatibilidade [22].

É neste contexto que os Poli(etileno glicol) e seus derivados como,

Poli((Oligoetileno glicol) Metacrilato) ou Poli((Oligoetileno glicol) Acrilato)

ganharam atenção dos pesquisadores, por possuírem propriedades químicas

desejáveis que os tornam especialmente úteis para aplicações biológicas e

farmacêuticas. Os Poli(OEG-MA) podem ser usados para modificar diversos

materiais biológicos como, superfície de nanopartículas de polímero/proteína

biconjugadas (peptídeos, RNA, etc), conferindo propriedades anti-incrustantes,

melhorando a circulação sanguínea [23].

Os polímeros à base de OEG-MA apresentam diferentes LCSTs

dependendo do comprimento da cadeia lateral de PEG, em caso de

homopolímero, ou dependente da composição da cadeia polimérica, em caso

de copolímero. Lutz et al.[24] investigaram a influência do tamanho da cadeia

lateral de PEG na LCST. Observou-se que houve um aumento da LCST com o

aumento da cadeia lateral de PEG. O Poli(MEO2-MA) apresentou uma LCST

de 29°C, o Poli(MEO3-MA) apresentou uma LCST de 39°C, já o Poli(OEG-MA)

com massa molar de 475 g/mol (repetições de etileno glicol de 8-9) apresentou

uma LCST de 90°C, como representado na Figura 5.

26

Figura 5 - Influência do tamanho da cadeia de PEG na LCST do polímero.

Já Luzon et al.[25] sintetizaram, pela primeira vez, nanocompósitos

híbridos constituídos por um núcleo de nanopartículas de ouro e uma casca de

copolímero a base de PEGs, via polimerização RAFT. Foi demostrado que as

nanopartículas apresentaram um comportamento termossensível ajustável,

com variações de LCST entre 15°C-90°C, dependente da composição da

cadeia polimérica. As nanopartículas também apresentaram uma superfície

anti-incrustante com características hidrofílico-hidrofóbica controláveis,

proveniente da composição do copolímero. Essa nanoestrutura exclusiva

apresenta um grande potencial para aplicação em biomedicina.

27

2.8. Modificação da superfície da sílica com agentes controladores de

cadeia

Na última década, as técnicas de polimerizações radicalares controladas

(CRPs) ou “controlled/living free-radical polymerization” têm sido o foco de

intensa pesquisa, devido a sua versatilidade e ao enorme potencial em suas

aplicações. Com estes novos mecanismos é possível controlar a massa molar

e a distribuição de massas molares dos polímeros, além de possibilitar a

síntese de novos materiais poliméricos com arquiteturas moleculares

complexas. Os mecanismos de polimerização que mais se destacam desse

contexto são a Polimerização Radicalar por Transferência de Átomo (ATRP),

polimerização por Transferência Reversível de Cadeia por Adição-

Fragmentação (RAFT) e polimerizações mediadas por nitróxidos (NMP). Com o

surgimento desses mecanismos foi possível controlar o crescimento da cadeia

polimérica na superfície das partículas de sílica, previamente modificadas.

Wu el al. [26] reportaram a modificação da superfície das partículas de sílica

com 3-aminopropiltrietoxisilano (APTES), seguida de uma reação para

“ancorar” um pré-iniciador à base de brometo na superfície da partícula. O

objetivo foi realizar uma polimerização via ATRP, utilizando o monômero γ-

metacriloxi-propil-trimetoxi silano (MPTS), como ilustra o esquema da Figura 6.

28

Figura 6 - Esquema da síntese SiO2 / PMPTS a partir da superfície da sílica via polimerização ATRP (adaptado de Wu et al. [26])

O grupo conseguiu obter com sucesso o nanocompósito híbrido com uma

distribuição de massa molar controlada, apresentando Mw/Mn=1,31. O grupo

também observou que as propriedades hidrofóbicas das nanopartículas

híbridas tornaram-se intensas em relação ao polímero puro [26].

Já o grupo de Jiang [27] estudou a influência nas nanopartículas de sílica

na LCST de um copolímero, sensível à temperatura, constituído por metacrilato

de methoxytri (etileno glicol) (TEGMMA) e 2 - (N-metil-N-(4-piridil) amino) de

metacrilato de etila (MAPMA), poli(TEGMMA-co-MAPMA), via polimerização

ATRP. Os resultados mostraram que as transições térmicas começaram a uma

temperatura inferior e estenderam-se por um período de tempo maior em

relação ao polímero puro. A superfície da sílica foi modificada com um iniciador

à base de brometo, em seguida foi feita a polimerização a partir da superfície

da sílica, via ATRP. A Figura 7 ilustra o esquema da síntese do nanocompósito

[27].

29

Figura 7 - Síntese do copolímero sensível à temperatura na superfície da sílica (adaptado de Jiang [27]).

Hong, Li e Pan [28] apresentaram um trabalho pioneiro na síntese de

nanocompósitos. O grupo utilizou partículas de sílica mesoporosas, com

superfície modificada com agente RAFT. Eles também utilizaram um corante,

com características fluorescentes, presentes no interior dos poros das

nanopartículas. Depois se realizou a polimerização do ácido acrílico na

superfície da partícula.

O objetivo foi criar um “nanocontainer” capaz de liberar um corante em

condição de variação de pH, pois o poli(ácido acrílico) é um polímero sensível a

pH. Quando o meio se encontra em condições alcalinas (pH>7) as cadeias

poliméricas do poli(ácido acrílico) ficam hidratadas. Porém, se o meio estiver

em condições ácidas (pH<7) as cadeias poliméricas ficam colapsadas. Essas

condições criam uma abertura ou fechamento dos poros, para a liberação do

corante, como ilustra a Figura 8. O mesmo mecanismo pode ser utilizado para

a liberação controlada de fármacos, que é o grande foco dos pesquisadores na

atualidade.

30

Figura 8 - Resultado da fluorescência liberada pelos nanocontentor em pH ácido e básico (adaptado de Hong, Li e Pan [28]).

2.9. Polimerização via RAFT

A técnica RAFT apresenta vantagens com relação às demais técnicas de

polimerização radicalar controlada devido ao fato de ser compatível com um

extenso número de monômeros, grupos funcionais e técnicas de polimerização

(massa, solução, suspensão, emulsão e miniemulsão) [29].

Um agente de transferência de cadeia típico é constituído do grupo

funcional [RSC(Z)=S], sendo (Z) um grupo estabilizante, e (R), um grupo de

saída. Os grupos estabilizantes e de saída irão influenciar no grau de controle

da polimerização e na cinética da reação.

A eficiência de cada agente RAFT utilizado depende de uma série de

fatores, destacando o tipo de monômero que está sendo polimerizado, a

capacidade de reiniciação do grupo de saída (R) e a reatividade da dupla

ligação entre enxofre (S) e carbono (C), determinada pelo grupo estabilizante

utilizado (Z) [29], conforme apresentado na Tabela 1.

31 Tabela 1 - Principais tipos de agente RAFT tiocarbonílicos.

Na polimerização controlada via RAFT a iniciação ocorre da mesma

maneira que em uma polimerização radicalar convencional: inicialmente, ocorre

a decomposição do iniciador, gerando radicais que irão incorporar unidades do

monômero, formando radicais oligoméricos, iniciando a polimerização:

I 2 R *

R * + M Pm *

Nos primeiros estágios da polimerização, os radicais oligoméricos

gerados no processo de iniciação (Pm*) se adicionam à dupla ligação carbono-

enxofre do agente de transferência (1) dando origem a um radical intermediário

(2) que, logo em seguida, sofrerá decomposição originando um composto

tiocarbonílico polimérico (3) e a um novo radical (R*). Esta primeira etapa do

processo é denominada pré-equilíbrio:

Pm*+

Kp

Monômero

S S R

Z

(1)

Kadd

K -add

S S R

Z

Pm

(2)

KB

K-B

S S

Z

Pm + R*

(3)

32

em que kadd e k-β são as constantes de adição para a formação do radical

intermediário e k-add e kβ são as constantes de fragmentação do radical

intermediário.

A reação deste radical com outras moléculas de monômero dará origem a

um novo radical propagante (Pn *):

R * + M Pn *

Um rápido equilíbrio, conhecido como equilíbrio principal, é então

estabelecido entre as espécies propagantes ativas (Pn * e Pm*) e os

compostos tiocarbonílicos poliméricos dormentes (3 e 5), fornecendo igual

probabilidade para o crescimento de todas as cadeias poliméricas permitindo,

desta maneira, a obtenção de cadeias poliméricas com estreita distribuição de

massas moleculares e aumento linear da massa molar com a conversão do

monômero:

A etapa de terminação ocorre da mesma maneira que uma polimerização

radicalar convencional: a cadeia propagante é desativada sem a formação de

um novo centro ativo, terminando, assim, o crescimento da macromolécula:

Pn * + Pm * "polímero morto"

Em uma polimerização radicalar controlada via RAFT, deve-se escolher

adequadamente a relação [agente RAFT]/[iniciador] pois ela é fator

determinante para a eficiência desse método de polimerização.

33

A concentração de radicais propagantes deverá ser muito menor do que a

concentração de espécies dormentes, com a finalidade de evitar as reações de

terminação, uma vez que estas concorrem com a propagação dos radicais em

crescimento. Essa etapa de propagação é extremamente importante quando se

deseja manter um bom controle da polimerização.

Por isso é utilizada uma pequena quantidade de iniciador e elevadas

razões de [CTA]/[Iniciador]. Por outro lado, razões muito altas conferem

lentidão à reação, podendo comprometer o controle da polimerização. Existe,

portanto, uma condição ótima entre cinética e controle da polimerização,

estabelecida pela razão [CTA]/[Iniciador].

A razão [CTA]/[Iniciador] também influencia na terminação das cadeias

poliméricas com o grupo do agente de transferência (CTA). Quando a razão é

alta, menor é a concentração de iniciador presente no meio, assim menos

radicais serão gerados, diminuindo a probabilidade de terminação com o grupo

pertencente ao CTA. Entretanto, esse valor deve ser próximo ou inferior a 10,

uma vez que a razão [CTA]/[Iniciador] também influencia na cinética de

polimerização [30]. Esse parâmetro é extremamente útil para a realização da

aminólise do grupo trítio ou dítio pertencente ao CTA, formando cadeias com

terminação em SH.

Normalmente pesquisadores utilizam uma razão [CTA]/[Iniciador] próxima

de 5, quando a polimerização chega ao fim, cerca de 90% das cadeias

possuem no final o grupo do agente de transferência (CTA), e os polímeros

podem ser isolados como materiais estáveis e, deste modo, ser utilizados em

novas polimerizações como macro-agentes de transferência de cadeia.

34

3. Objetivo

Este trabalho teve como objetivo sintetizar nanopartículas de sílica/PEGs

pela técnica de polimerização controlada/viva (RAFT). Foram sintetizadas as

nanopartículas de sílica, pelo método de Stöber [15]; o agente RAFT [31] e a

polimerização contendo os monômeros à base de PEGs, Oligo (Etileno glicol)

Metacrilato (OEGMA) e 2-(2’Metoxi-Etoxi)etil Metacrilato (MEO2-MA) [23], para

aplicação em células vivas.

4. Materiais e Métodos

4.1. Reagentes

Etanol absoluto (Panreac, 99,5%); solução de hidróxido de amônia 25%

(Fluka); tetraetoxisilano (TEOS) (Aldrich, 98%); corante bis(propil)trietoxisilano

perilenodiimida bis(propil)trietoxisilano perilenodiimida (PDI), previamente

sintetizado e caracterizado; ácido 3-mercaptopropiónico (Aldrich, 99%);

hidróxido de potássio (Riedel-de Haёn, 85%); dissulfeto de carbono (Aldrich,

99,5%); brometo de benzila (Aldrich, 98%); clorofórmio (Aldrich, 99,5%);

clorofórmio deuterado (Aldrich, 99,8%); ácido clorídrico (Panreac, 37%);

hexano (Aldrich, 98%) previamente destilado; tolueno (Aldrich, 96%)

previamente destilado; 3-aminopropiltrietoxisilano (APTES) (Aldrich, 98%);

etanol (Panreac, 95%) previamente destiado; (benzotriazo-1-il-oxi)-

tripirrolidona-fosfonil-hexafluoro-fosfato (PyBOP) (Aldrich, 98%); N-metil-2-

pirrolidona (NMP) (Aldrich, 99%); N,N-diisopropil-etilamina (DIPEA) (Aldrich,

99%); piperidina (Aldrich, 99%); N-α-Fmoc derivado de amino ácidos (Fmoc-

Gh-OH) (Aldrich, 99,8%); diclorometano (Aldrich, 96%) previamente destilado;

N-etil-N’-(3-dimetilaminopropil)carbodiimida (EDC) (Aldrich, 98%); dioxano

35

(Aldrich, 96%); 2,2′-Azobis(2-metilpropilnitrila) (AIBN) (Aldrich, 99%); Oligo

(Etileno glicol) Metacrilato (OEGMA) (Aldrich, 98%); 2-(2’Metoxi-Etoxi)etil

Metacrilato (MEO2-MA) (Aldrich, 98%); água destilada; tetrahidrofurano HPLC

(THF) (Aldrich, 99%).

4.2. Metodologias

Síntese das nanopartículas de sílica 4.2.1.

As nanopartículas de sílica foram sintetizadas de acordo com o método

de Stöber [15]. Em um frasco de plástico com volume de 150 mL, adicionou-se

86 mL (86% v/v) de etanol absoluto e 6 mL (6% v/v) de solução de hidróxido de

amônio (25% amônia), sob agitação magnética a 300 rpm, durante 10 minutos

a temperatura ambiente. Em seguida adicionou-se lentamente 3 mL (3% v/v)

de TEOS e uma solução contendo 5 mL (5% v/v) de etanol e PDI (0,01% de

moles em relação ao TEOS [32]). Após a adição, elevou-se a temperatura do

banho de óleo a 50°C.

Após 24 horas, as nanopartículas foram submetidas à centrifugação a

10krpm, com duração de 15 minutos, seguidas de redispersões em etanol

destilado. Esse procedimento foi repetido quatro vezes para a remoção do

TEOS residual e a eliminação do hidróxido de amônio, garantindo a sua

máxima pureza.

Em seguida as nanopartículas foram caracterizadas por DLS, ZP, TEM,

AFM, SEM e fluorescência.

36

Modificação da superfície da sílica 4.2.2.

Utilizou-se como reator um tubo de Schlenk equipado com fluxo de

argônio, agitação magnética e condensador de refluxo. Foram adicionados 0,9g

das nanopartículas de sílica previamente secas em vácuo durante 3 horas e

3,2 mL de tolueno seco (razão molar [Tolueno]/[SiO2] igual a dois) a

temperatura ambiente [33].

Em seguida o meio reacional foi levado ao banho de ultrassom durante 15

minutos. Logo após esse período, foram adicionados 0,7 mL de APTES (razão

molar [SiO2]/[APTES] igual a cinco) ao meio reacional. Deixou-se a reação em

refluxo a 120ºC, com agitação de 400rpm na presença de argônio durante 24

horas [33].

Após esse período, as nanopartículas foram submetidas à centrifugação a


destilado. Esse procedimento foi repetido quatro vezes para a máxima

purificação. As nanopartículas modificadas foram caracterizadas por DLS e ZP.

A Figura 9 ilustra o esquema da modificação da superfície da sílica.

Figura 9 - Esquema da modificação da superfície da sílica.

37

Quantificação dos grupos aminas na superfície das 4.2.3.

nanopartículas de sílica

A quantificação dos grupos amina na superfície das nanopartículas foi

feita de acordo com o seguinte procedimento: em um frasco de vidro com

volume de 20 mL foram adicionados 20 mg de sílica-APTES; 93 mg de Fmoc-

Gh-OH; 156 mg de PyBOP (catalisador); 157 uL de DIPEA (ativador do

catalisador); 10 mL NMP (solvente) a temperatura ambiente e sob agitação

magnética a 300rpm durante 12 horas [34], como ilustra o esquema da Figura

10.

38

Figura 10 - Esquema da reação com Fmoc-Gh-Oh.

Após esse período, as nanopartículas foram submetidas à centrifugação a

10krpm, com duração de 15 minutos, seguidas de redispersões em

diclorometano. Esse procedimento foi repetido quatro vezes, e após, as

nanopartículas foram redispersas em 5 mL de NMP.

Em seguida, em um frasco de vidro, contendo um volume de 15 mL,

foram adicionados a redispersão das nanopartículas em NMP, 5 mL de NMP e

3 mL de piperidina. O meio foi mantido a temperatura ambiente sob agitação

magnética a 300 rpm durante 30 minutos.

OH

HNO

O

O

Fmoc-Gh-OH

N

DIPEA

N

N

N

O P

N

NN

PyBOP

N

O

NMP

NH2

SiO2

+ 12 hTemperatura

Ambiente

HN

O

HN

O

O

O

39

Em seguida utilizou-se novamente a centrifugação a 10krpm durante 15

minutos, seguidos de redispersão em NMP, entretanto aferiu-se o

sobrenadante em um balão volumétrico de 20 mL, sendo possível a sua

quantificação. O esquema da quantificação está ilustrado na Figura 11.

Figura 11 - Esquema da quantificação de grupos aminas na superfície da partícula.

Síntese do agente de transferência de cadeia 4.2.4.

Utilizou-se como reator um balão de fundo redondo com duas bocas com

volume de 250 mL, equipado com agitação magnética e condensador de

refluxo. Foram adicionados 10 mL de ácido 3-mercaptopropiónico e 125 mL de

uma solução contendo água e 13g de hidróxido de potássio a temperatura

HN

O

HN

O

O

O

+HN

Piperidina

HNO

H2N

O

+

SiO2

N

O

O

Aferiu-se

QuantificaçãoU.V./Vísivel

40

ambiente. Deixou-se o meio reacional sob agitação magnética a 400 rpm

durante 30 minutos.

Em seguida adaptou-se um funil de adição, adicionando-se lentamente,

15 mL de dissulfeto de carbono. Após a adição a mistura foi mantida sob

agitação magnética, a 400 rpm durante 5 horas.

Após esse período, foram adicionados 19,8g de brometo de benzila. A

reação foi mantida sob agitação magnética a 400 rpm e a temperatura de 80°C

durante 12 horas. A Figura 12 ilustra o esquema da síntese do agente RAFT

[35].

Figura 12 - Esquema da síntese do agente RAFT.

O produto obtido foi seco no rota-evaporador, obtendo-se um sólido de

coloração amarela. Após a secagem, o produto foi solubilizado em hexano sob-

refluxo e reprecipitado, sucessivas vezes, até a máxima purificação. O produto

foi caracterizado por RMN 1H.

Síntese da sílica-RAFT 4.2.5.

Em um tubo de Schlenk equipado com agitação magnética, foram

adicionados 0,9 g de sílica-NH2 previamente secas em vácuo durante 3 horas,

41

148 mg de agente RAFT, 101 mg de EDC e 20 mL de diclorometano seco. A

mistura foi mantida sob agitação magnética a 400 rpm a temperatura ambiente

durante 24 horas [33], como ilustra a Figura 13.

Figura 13 - Síntese da sílica-RAFT.

Após 24 horas, as nanopartículas foram submetidas à centrifugação a


destilado. Esse procedimento foi repetido quatro vezes para a máxima

purificação, obtendo um pó com coloração amarela. Em seguida as

nanopartículas foram caracterizadas por U.V./visível, DLS e ZP.

Polimerização em redispersão 4.2.6.

As polimerizações em solução da nanopartículas híbridas foram

realizadas em sistemas do tipo batelada, utilizando-se como reator um tubo de

Schlenk equipado com fluxo de argônio e barra magnética de agitação.

Inicialmente foram preparadas duas soluções: uma contendo etanol, as

nanopartículas de sílica-RAFT e os monômeros MEO2-MA e OEGMA e a outra

composta de etanol e iniciador. As polimerizações foram realizadas com

diferentes composições da cadeia polimérica, como mostra a Tabela 2. As

42

duas soluções foram homogeneizadas separadamente, através de agitação

magnética e ultrassom e então misturadas no reator, sendo que inicialmente o

meio reacional foi “degaseificado” com fluxo de argônio e agitação magnética

por um período de 45 minutos. Em seguida, o balão foi imerso em um banho de

óleo a 70 oC e a reação foi conduzida por um período de 24 horas.

Tabela 2 - Condições experimentais utilizadas nas polimerizações em solução a

Experimentos Composição da cadeia polimérica SNP_1 [OEGMA]0/[MEO2-MA]0 = 10/90 SNP_2 [MEO2-MA]0 = 100%

a Todos os experimentos foram realizados com um volume de 3mL de etanol destilado; com 0,1g de nanopartículas de sílica-RAFT; com quantidade de monômero pré-calculado para obter uma casca

com espessura de 20nm; e uma razão molar [CTA]/[Iniciador] =1/5.

Clivagem do polímero enxertado na superfície da sílica para a 4.2.7.

caracterização por Cromatografia de Permeação em Gel (GPC)

Em uma Placa de Petri de plástico, dissolveu-se 200 mg de sílica com

polímero (aproximadamente 50 mg de polímero puro) em 3 mL de THF. Em

seguida adicionou-se 0,2 mL de HF (49% aquoso). A solução ficou sob

agitação durante a noite a temperatura ambiente. Logo após deixou-se

evaporar a solução de forma natural. Após obter uma fina camada de polímero

seco, adicionou-se THF para injetar no equipamento de GPC [36].

4.3. Caracterização dos materiais

• Ressonância Magnética Nuclear (RMN 1H):

O agente RAFT obtido foi caracterizado utilizando-se a técnica de

Ressonância Magnética Nuclear (RMN 1H) em um equipamento da marca

Bruker Avance II a 300 MHz, com os sinais de próton do tetrametilsilano (TMS)

utilizados como padrão interno. A preparação das amostras foi feita de acordo

com a seguinte metodologia: 10-15 mg de amostra foram dissolvidos em

43

aproximadamente 700 µl de clorofórmio deuterado (CDCl3) e adicionado em um

tubo específico para RMN 1H.

• Cromatografia de Permeação em Gel (GPC):

As cascas dos polímeros foram caracterizadas por cromatografia de

permeação em gel. usando um equipamento da marca Waters 510, com fase

movél em THF. O aparelho é equipado com detector de dispersão da luz de

multi-ângulo (GPC-MALS), com bomba de alta pressão e três colunas

(PhenolgelTM de Phenomenex, com tamanho de poros de 100, 1000 e 10000

Å; temperatura das colunas: 20ºC, ligadas em série e um detector de

espalhamento de luz a laser (miniDAWN-Treos multi-ângulo) da marca Wyatt

Technologies e um detector de índice de refracção da marca Waters 2410 a

30°C.

• Microscopia eletrônica de transmissão (TEM):

As nanopartículas tiveram sua morfologia analisada por microscopia

eletrônica de transmissão (TEM), utilizando um microscópio da marca Hitachi,

modelo H-8100, com filamento de LaB6, e usou-se sempre uma tensão de

aceleração de 100 kV. Este aparelho é equipado com uma câmara KeenView,

da Soft Imaging System, que usa o programa iTEM para adquirir e tratar as

imagens.

As amostras foram diluídas em etanol. Uma gota de cada amostra foi

colocada em cada grelha e quando secaram, colocou-se uma amostra de cada

vez no suporte e este foi inserido no microscópio. Observou-se a amostra e

tiraram-se micrografias da mesma.

44

• Microscópio eletrônico de varredura (SEM):

O FEG-SEM é da marca JEOL, modelo JSM7001F, e tem acoplado um

detector EDS para elementos leves da marca Oxford modelo INCA 250.

A deposição foi feita em um equipamento da marca Quorum

Technologies, modelo Q150T ES. As deposições foram de crômio com

espessura de 15/20 nm.

• Microscopia de força atômica (AFM):

Nanosurf® EasyScan 2 FlexAFM com isolamento de vibração ativa e

estágio de tradução micrômetro.

• Análise de Diâmetro Médio de Partículas por espalhamento de luz

dinâmico (DLS):

As medições do diâmetro médio das nanopartículas foram realizadas pelo

método de espalhamento de luz dinâmico (DLS) realizadas em um

equipamento da marca Brookhaven (BI-200SM goniómetro e BI-9000 AT), um

correlator usando um laser de He-Ne (632,8, 35 mW, modelo 127, Spectra

Physics) e um detector de fotodiodo de avalanche.

As amostras foram diluídas em água destilada, previamente microfiltrada

em filtro de membrana de acetato de celulose com 0,2 µm de porosidade.

• Potencial Zeta (ZP):

As medições do potencial zeta das nanopartículas foram realizadas em

um equipamento Zetasizer Nano ZS, modelo ZEN3601, mediante diluição em

água destilada.

45

• Fluorescência:

O bis(propil)trietoxisilano perilenodiimida (PDI) e as nanopartículas

obtidas foram caracterizadas pela técnica de fluorescência, na qual utilizou-se

o equipamento SPEX Fluorolog F112 com largura da banda de 0,9nm para

excitação e 0,45nm para emissão. O espectro obtido foi realizado a

temperatura ambiente e utilizando células de Quartzo com dimensões da base

de 1cm x 1cm.

• UV/Visível

Os espectros de absorção obtidos foram registrados em um

espectrofotómetro da marca Jasco V-660, com unidade de controle de

temperatura Peltier. Todos os espectros obtidos foram realizados a

temperatura ambiente e utilizando células de Quartzo com dimensões da base

de 1cm x 1cm.

Todos os experimentos e as caracterizações relatados acima foram

realizados no Instituto Superior Técnico em Lisboa, no Centro de Química-

Física Molecular (CQFM).

5. Resultados e Discussões

5.1. Síntese das nanopartículas de sílica

A síntese das nanopartículas de sílica foi feita pelo método de Stöber [15]

na presença de um corante com elevado rendimento quântico (PDI) [32] a 50°C.

As nanopartículas apresentaram uma forma perfeitamente esférica com

diâmetro médio de 189±3nm, a partir das contagens das imagens do TEM,

SEM e AFM, conforme ilustrado na Figura 14.

46

Figura 14 - Imagens de TEM (A), SEM (B) e AFM (C) com distribuição de tamanho das nanopartículas de sílica, a partir das contagens pelas imagens do TEM.

Entretanto, o valor do diâmetro médio obtido no DLS foi de 199±18nm, um

diâmetro médio maior em relação ao encontrado nas imagens de TEM. A

diferença ocorre porque o DLS obtêm valores de diâmetro hidrodinâmico, que

por definição são maiores que o diâmetro seco [32] (diâmetro obtido a partir das

contagens feitas pelas imagens do TEM). Entretanto, pode-se levar em conta o

surgimento de aglomerados que surgem durante a leitura. Portanto, era

esperado que o diâmetro médio obtido pelo DLS fosse maior que o obtido pelas

imagens do TEM.

As nanopartículas também apresentaram caráter fluorescente, como se

pode observar no espectro de emissão (excitada a 510nm [32]) na Figura 15.

0%

10%

20%

30%

40%

50%

60%

70%

182 184 186 188 190 192 194 196

Freq

uênc

ia (%

)

DP (nm)

A B

C

47

Figura 15 - Espectro de emissão das partículas fluorescentes.

Obteve-se o mesmo resultado encontrado na literatura [32], mostrando o

sucesso da síntese das nanopartículas na presença do corante PDI. Obteve-se

0,9887g de nanopartículas secas, um valor típico encontrado na literatura.

5.2. Síntese da sílica-APTES

Nesta etapa modificou-se a superfície da sílica com APTES de acordo

com a literatura [33]. Logo após, quantificou-se as aminas da superfície das

nanopartículas de acordo com o procedimento descrito no item 4.2.3.

Utilizaram-se como padrões três soluções com concentrações conhecidas de

Fmoc. A Figura 16 mostra os resultados obtidos.

50000

100000

150000

200000

250000

300000

510 530 550 570 590 610 630 650 670

CP

S/M

icro

Am

ps

Comprimento de onda (nm)

48

Figura 16 - Quantificação dos grupas aminas.

Observou-se que o comprimento de onda onde ocorre a máxima

absorção do Fmoc é a 301nm. A amostra (Sílica-APTES) contendo Fmoc,

proveniente da superfície das nanopartículas de sílica, apresentou uma

absorbância de 0,428 a 301nm, correspondente a uma concentração dos

grupos amina, em sua superfície, de 0,0509mMol/g de sílica, ou seja, um

enxerto de 2 moléculas de APTES em cada nm2 de superfície de sílica.

Também foi estudado o Potencial Zeta das nanopartículas modificadas

com APTES e a Tabela 3 mostra os resultados obtidos.

Tabela 3 - Potencial Zeta.

ZP(mV) SNP -50,83

SNP-APTES 27,4

Pode-se observar que o ZP tornou-se positivo, ou seja, obteve-se a

modificação da superfície da sílica com grupos NH2 (cargas positivas).

0,00000 0,00005 0,00010 0,000150,0

0,2

0,4

0,6

0,8

1,0

1,2

Abs

Conc. (Mol/L)

Y=0,0265+8197,3071.X0

Corr=00,99970

0

0,2

0,4

0,6

0,8

1

1,2

290 295 300 305 310 315 320 A

bsor

bânc

ia

Comprimento de onde (nm)

Padrão-1 Padrão-2 Padrão-3 Sílica-APTES

Comprimento de onda a 301 nm

Experimentos Absorbância Conc.(mol/L) ε

Padrão-1 0,220 2,4242E-05 9,0752E+03

Padrão-2 0,627 7,2000E-05 8,7083E+03

Padrão-3 1,005 1,2000E-04 8,3750E+03

Sílica-APTES 0,428 4,8983E-05

49

5.3. Síntese do agente de transferência de cadeia, agente RAFT

A síntese do agente RAFT foi feita de acordo com a literatura [35],

entretanto modificou-se a purificação solubilizando o produto em hexano sob-

refluxo, durante 3 horas, seguidas de precipitações. Esse procedimento foi

repetido três vezes. A Figura 17 ilustra o espectro de RMN 1H obtido do

produto.

Figura 17 - Espectro de RMN 1H do agente RAFT.

Foi possível obter um produto de elevada pureza, como mostra do

espetro de RMN 1H. O mesmo resultado foi encontrado na literatura [35],

entretanto os autores purificaram o produto por uma coluna cromatografica

utilizando sílica gel (70-230 mesh) como fase estacionária.

Obteve-se 27,6g de um produto sólido de coloração amarela,

apresentando um rendimento próximo de 90%, o mesmo relatado na literatura

[35].

50

5.4. Síntese da sílica-RAFT

Nesta etapa reagiram-se os grupos aminas, na superfície das

nanopartículas da sílica, com o grupo ácido pertencente ao agente RAFT,

como detalhado no item 4.2.5, com o objetivo de modificar a superfície das

partículas com o agente de transferência de cadeia.

Primeiramente realizou-se as medições das soluções padrões contendo o

agente RAFT em dioxano, com concentrações conhecidas. O solvente foi

escolhido de acordo com o índice de refração, pois o dioxano apresenta um

índice de refração próximo ao índice de refração das partículas de sílica. O

objetivo foi de minimizar o “scatterring” causado pelas partículas. A Figura 18

mostra a curva de calibração, os espectros obtidos e as concentrações

utilizadas.

Figura 18 - Resultados obtidos na calibração do RAFT em dioxano.

Obteve-se uma curva de calibração com um ótimo ajuste, apresentando

um Corr de 0,9999. O comprimento de onda onde ocorreu a máxima absorção

0

0,1

0,2

0,3

0,4

0,5

0,6

0,7

0,8

0,9

1

260 280 300 320 340 360

Abs

orbâ

ncia

Comprimento de onde (nm)

Padrão_1

Padrão_2

Padrão_3

Padrão_4

Padrão_5

0,01 0,02 0,03 0,04 0,05 0,06 0,070,0

0,2

0,4

0,6

0,8

1,0

ABS

Concentração (mMol/L)

Y= -0,0027+13,9824.X Corr= 0,9999

Comprimento*de*onda*a*310nm

Experimentos Absorbância Concentração*(mMol/L) ε

Padrão_1 0,229 0,0165 13,9209

Padrão_2 0,239 0,0173 13,8390

Padrão_3 0,567 0,0411 13,7922

Padrão_4 0,722 0,0514 14,0467

Padrão_5 0,858 0,0617 13,9105

51

do agente RAFT é de 310 nm, típico do grupo trítio, apresentado na molécula

do agente RAFT.

Em seguida analisou-se o espectro das partículas de sílica, modificadas

com o agente RAFT, em conjunto com as partículas de sílica pura (SNP), com

o propósito de descontar o efeito do “scattering” das nanopartículas. Ambas as

amostras foram analisadas em dioxano e com a mesma concentração em

relação às partículas. A Figura 19 ilustra os resultados obtidos.

Figura 19 - Espectro das partículas modificas com o agente RAFT.

Observou-se que o espectro das nanopartículas modificadas com RAFT

(sílica-RAFT) apresentou uma absorbância de 0,312 em 310nm. Entretanto

corrigiu-se o valor da absorbância subtraindo o valor da absorbância obtida da

sílica pura (SNP) a 310 nm, causada pelo “scattering” das nanopartículas, de

forma a obter um valor real da concentração de RAFT na superfície das

partículas.

0

0,05

0,1

0,15

0,2

0,25

0,3

0,35

0,4

260 360 460 560 660 760 860

Abso

rbân

cia

Comprimento de onda (nm)

SNPSílica-RAFT

Comprimento de onda a 310nm

Experimentos Absorbância Concentração (mMol/L)

SNP 0,077

Sílica-RAFT 0,312 0,0225

Sílica-RAFT corrigido 0,235 0,0170

52

Dessa forma obteve-se um valor de absorbância corrigido de 0,235 a

310nm, que corresponde a uma concentração de 0,0445mMol de agente RAFT

por grama de sílica, apresentando um rendimento de 87,5% na reação de

acoplamento.

Estudou-se o ZP das nanopartículas modificadas com o agente RAFT. A

Tabela 4 mostra os resultados obtidos.

Tabela 4 - Potencial Zeta

ZP (mV) SNP -50,83

SNP-APTES 27,4 SNP-RAFT -15

Pode-se observar que o ZP das nanopartículas modificadas com agente

RAFT tornou-se negativo novamente, como era esperado. Esse fenômeno

acontece devido ao fato que os grupos ácidos do agente RAFT reagiram com

os grupos NH2 existentes na superfície da sílica. Como a reação de

acoplamento é de elevada conversão, sobrou poucos grupos NH2 “livres” na

superfície. Entretanto, o sinal negativo significa a existência de uma quantidade

maior de OH “livre” na superfície das nanopartículas em relação ao NH2 “livre”,

ou seja, existe grupos de OH que não reagiram com o APTES, uma vez que os

resultados obtidos anteriormente revelam que não foi possível modificar toda a

superfície das nanopartículas com APTES (NH2).

53

5.5. Polimerização em redispersão via RAFT

Nesta etapa realizaram-se as polimerizações na presença das

nanopartículas com a superfície modificada com o agente de transferência de

cadeia (agente RAFT) e dos monômeros MEO2-MA e OEGMA. A Figura 20

ilustra o esquema da síntese do polímero termossensível na superfície das

nanopartículas.

Figura 20 - Síntese do polímero na superfície das nanopartículas.

Primeiramente realizou-se a síntese do copolímero contendo uma razão

molar [MEO2-MA]/[OEGMA] igual a 9, com o objetivo de se obter uma LCST

54

próxima de 39°C [37], que é semelhante à temperatura fisiológica. A morfologia

das nanopartículas foi analisada por TEM e SEM, como ilustra a Figura 21.

Figura 21 - Imagens de TEM (A) e SEM (B) com distribuição de tamanho das nanopartículas de sílica com polímero.

Observou-se uma diferença na morfologia das nanopartículas em relação

às partículas de sílica pura, apresentando uma superfície irregular, o que

sugere uma possível camada fina de polímero. Também se observou uma

variação do diâmetro médio das partículas a partir da contagem pelas imagens

do TEM, aumentando para 226±16nm, ou seja, uma camada média de 19nm

de espessura do polímero.

Em seguida estudou-se a variação do diâmetro das partículas em função

da temperatura, utilizando a técnica de Espalhamento de Luz Dinâmico com

aquecimento de 20°C a 60°C (analisaram-se cinco pontos) e arrefecimento de

60°C a 20°C (analisaram-se três pontos). A Figura 22 mostra os resultados

obtidos.

0%

5%

10%

15%

20%

25%

30%

190 200 210 220 230 240 250

Freq

uênc

ia (%

)

Dp(nm)

A" A"

B"

55

200220240260280300320340360380400

10 20 30 40 50 60

Dp(

nm)

Temperatura (°C)

SNP_1_Aquecimento

SNP_1_Arrefecimento

Figura 22 - Variação do Dp em função da temperatura através da técnica de Espalhamento de Luz Dinâmico.

Os resultados obtidos revelam uma dependência do Dp com temperatura.

Quando o sistema é submetido a um aquecimento o Dp diminui, uma

característica típica dos polímeros à base de PEGs. Observou-se que a partir

de 50°C, as nanopartículas apresentaram um diâmetro de 230±1nm, próxima

do diâmetro encontrado pela contagem das imagens de TEM, indicando que o

polímero, a 50°C, está acima da LCST, ou seja, totalmente colapsado.

Porém, quando o sistema é submetido a um arrefecimento, observa-se

um aumento do Dp, ou seja, as nanopartículas que antes estavam a uma

temperatura superior a LCST (colapsada) passam a estar a uma temperatura

inferior a LCST (cadeias solvatadas), apresentando um aumento do Dp.

Observou-se que no arrefecimento o Dp encontrado a 20°C é menor em

relação ao Dp encontrado durante o aquecimento. A provável causa desta

histerese é que durante o aquecimento, as nanopartículas a 60°C encontram-

se na forma colapsada, existindo interações intercadeias da mesma partícula

(agregação), devido à desidratação da casca. Porém, quando a temperatura

diminui, a casca volta a hidratar, mas as interações intercadeias são mais

fortes e as cadeias não expandem da mesma forma, ou seja, no arrefecimento

56

são formados entrelaçamentos nas cadeias devido ao estado colapsado,

impossibilitando que as partículas voltem ao tamanho original.

Também foi observado o potencial zeta das nanopartículas sem polímero

e com polímeros. A Tabela 5 relata os resultados obtidos.


ZP (mV) SNP -50,83

SNP-RAFT -15 SNP_1 4,95

Notou-se que o potencial zeta das partículas de sílica com polímero

aumentou em relação às partículas de sílica-RAFT, sugerindo a modificação da

superfície das nanopartículas com o polímero.

Em seguida analisou-se a massa molar e a distribuição das massas

molares na casca do polímero através de GPC, utilizando o procedimento

descrito no item 4.2.7..

Tabela 6 - Resultado obtido pela análise do GPC

SNP_1 Mw/Mn 1,23

Mn 2,85.105 g/mol

Observou-se que a distribuição da massa molar (polidispersidade) foi de

1,23, ou seja, conseguiu-se obter uma síntese polimérica de forma controlada.

Lutz e Ann Hoth [37] estudaram a polidispersidade utilizando o mesmo sistema

(condições poliméricas e monômeros) utilizado neste projeto, porém o grupo

utilizou outro mecanismo de polimerização controlada, a ATRP, obtendo um

valor superior ao valor obtido, ou seja, conseguiu-se obter um melhor controle

na polimerização utilizando o mecanismo RAFT.

57

Em seguida, realizou-se a síntese do polímero contendo 100% do

monômero MEO2-MA com o objetivo de se obter uma LCST próxima de 28°C

[37]. A morfologia das nanopartículas foi analisada por TEM e SEM, como ilustra

a Figura 23.

Figura 23 - Imagens de TEM (A) e SEM (B) com distribuição de tamanho das nanopartículas de sílica com polímero.

Pode-se observar novamente que houve uma diferença na morfologia das

nanopartículas, comparadas com a morfologia das partículas de sílica pura, o

que sugere a existência de uma fina camada de polímero em sua superfície.

Também se notou um aumento do Dp, apresentando um valor de 220±10nm,

ou seja, uma camada de 16nm de espessura do polímero.

Em seguida, realizou-se o estudo da variação do Dp em função da

temperatura utilizando a técnica de Espalhamento de Luz Dinâmico com

aquecimento de 20°C a 60°C (analisaram cinco pontos) e um arrefecimento de

60°C a 20°C (analisaram três pontos). A Figura 24 relata os resultados obtidos.

0%5%10%15%20%25%30%35%40%45%

210 220 230 240 250 260

Freq

uênc

ia (%

)

Dp (nm)

A A

B

58

200220240260280300320340360380400

10 20 30 40 50 60

Dp(

nm)

Temperatura (°C)

SNP_2_Aquecimento

SNP_2_Arrefecimento

Figura 24 - Variação do Dp em função da temperatura através da técnica de Espalhamento de Luz Dinâmico.

Novamente os resultados obtidos revelam uma dependência do Dp em

função da temperatura. Quando o sistema é submetido a um aquecimento,

observa-se uma diminuição da Dp e quando o sistema é submetido a um

arrefecimento, observa-se um aumento do Dp, característica típica dos PEGs.

Observou-se também que a partir de 40°C não há variação significativa do Dp,

apresentando um valor médio de 228±2, um valor próximo ao encontrado pelas

contagens das imagens de TEM, o que sugere que a LCST é próxima de 40°C.

Também foi analisado o potencial zeta das nanopartículas. A Tabela 7

mostra os resultados obtidos.


ZP (mV) SNP -50,83

SNP-RAFT -15 SNP_2 -5,95

Observou-se que o potencial zeta das partículas de sílica com polímero

aumentou em relação às partículas de sílica-RAFT, sugerindo a modificação da

superfície das nanopartículas com o polímero.

59

Por fim analisou-se a massa molar e a distribuição das massa molares na

casca do polímero através de GPC, utilizando o procedimento descrito no item

4.2.7.. A Tabela 8 relata os resultados obtidos.

Tabela 8 - Resultado obtido pela análise do GPC

SNP_2 Mw/Mn 1,27

Mn 1,46.105 g/mol

Pose-se observar que novamente conseguiu-se obter um polímero de

forma controlada, porém o valor da polidispersidade foi superior ao obtido

anteriormente. O mesmo resultado fora encontrado na literatura [37], porém os

autores utilizaram outro tipo de mecanismo de controle de polimerização, a

ATRP. Novamente notou-se um melhor controle de polimerização utilizando o

mecanismo RAFT, ou seja, conseguiu-se obter um valor de polidispersidade

inferior ao encontrado na literatura, utilizando o mesmo sistema polimérico

(condições poliméricas e monômeros) utilizado neste projeto.

6. Conclusões

Após analisar os resultados apresentados neste relatório, pode-se

concluir que:

• Obteve-se sucesso na síntese das nanopartículas de sílica pelo método

de Stöber, modificada com um corante de elevado rendimento quântico;

• Notou-se que houve a modificação da superfície das nanopartículas de

sílica com APTES, na qual se substituiu os grupos -OH pelos grupos aminas;

• Obteve-se sucesso na síntese do agente RAFT e um produto de

elevada pureza, memso após a modificação da rota de purificação;

• Sucesso no acoplamento do agente RAFT na superfície da sílica;

60

• Notou-se a existência de uma fina camada polimérica na superfície da

sílica;

• Conseguiu-se obter polímero de forma controlada;

7. Dificuldades encontradas durante o projeto

• Dificuldades em analisar o tamanho das nanopartículas através do

“Nano Tracking Analysis” (NTA), devido a grande quantidade de aglomerados

que surgem durante a análise, uma vez que não foi possível a utilização de

surfatante;

• Dificuldade em analisar a morfologia e o tamanho das nanopartículas de

sílica revestida com polímero através da Microscopia de Força Atômica (AFM)

devido ao “arrastamento” das nanopartículas durante a análise.

8. Evolução do projeto

• Aplicação das nanopartículas com e sem polímero em células vivas e

analisar qual é o tamanho ideal para a sua incorporação;

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