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FACULDADE DE CINCIAS FARMACUTICAS DE RIBEIRO PRETOFACULDADE DE CINCIAS FARMACUTICAS DE RIBEIRO PRETOFACULDADE DE CINCIAS FARMACUTICAS DE RIBEIRO PRETOFACULDADE DE CINCIAS FARMACUTICAS DE RIBEIRO PRETO

Estudo do efeito modulatrio de derivados de 3Estudo do efeito modulatrio de derivados de 3Estudo do efeito modulatrio de derivados de 3Estudo do efeito modulatrio de derivados de 3----fenilcumarinafenilcumarinafenilcumarinafenilcumarina

nas funes de neutrfilos estimulados por imunocomplexosnas funes de neutrfilos estimulados por imunocomplexosnas funes de neutrfilos estimulados por imunocomplexosnas funes de neutrfilos estimulados por imunocomplexos

e anlise da relao estruturae anlise da relao estruturae anlise da relao estruturae anlise da relao estrutura----atividadeatividadeatividadeatividade....

Luciana Mariko KabeyaLuciana Mariko KabeyaLuciana Mariko KabeyaLuciana Mariko Kabeya

Ribeiro PretoRibeiro PretoRibeiro PretoRibeiro Preto

2006200620062006

LUCIANA MARIKO KABEYLUCIANA MARIKO KABEYLUCIANA MARIKO KABEYLUCIANA MARIKO KABEYAAAA

Estudo do efeito modulatrio de derivados de 3-fenilcumarina

nas funes de neutrfilos estimulados por imunocomplexos

e anlise da relao estrutura-atividade.

Tese apresentada ao Programa de Ps-Graduao em

Cincias Farmacuticas da Faculdade de Cincias

Farmacuticas de Ribeiro Preto, Universidade de So

Paulo, para obteno do ttulo de Doutor em Cincias

Farmacuticas.

rea de Concentrao:rea de Concentrao:rea de Concentrao:rea de Concentrao: Produtos Naturais e Sintticos

Orientadora:Orientadora:Orientadora:Orientadora: Profa. Dra. Yara Maria Lucisano Valim

Ribeiro PretoRibeiro PretoRibeiro PretoRibeiro Preto

2006200620062006

AUTORIZO A REPRODUO E DIVULGAO TOTAL OU PARCIAL DESTE

TRABALHO, POR QUALQUER MEIO CONVENCIONAL OU ELETRNICO, PARA FINS

DE ESTUDO E PESQUISA, DESDE QUE CITADA A FONTE.

FICHA CATALOGRFICAFICHA CATALOGRFICAFICHA CATALOGRFICAFICHA CATALOGRFICA

Kabeya, Luciana Mariko

Estudo do efeito modulatrio de derivados de 3-fenilcumarina

nas funes de neutrfilos estimulados por imunocomplexos e

anlise da relao estrutura-atividade. Ribeiro Preto, 2006.

192 p.: il.; 30cm

Tese de Doutorado, apresentada ao Programa de Ps-

Graduao em Cincias Farmacuticas (rea de concentrao:

Produtos Naturais e Sintticos) da Faculdade de Cincias

Farmacuticas de Ribeiro Preto/USP.

Orientadora: Lucisano-Valim, Yara Maria.

1. Neutrfilos. 2. Imunocomplexos. 3. Cumarinas. 4. Relao

estrutura-atividade. 5. Antioxidantes.

FOLHA DE APROVAOFOLHA DE APROVAOFOLHA DE APROVAOFOLHA DE APROVAO

Autora:Autora:Autora:Autora: Luciana Mariko Kabeya

Ttulo:Ttulo:Ttulo:Ttulo: Estudo do efeito modulatrio de derivados de 3-fenilcumarina nas funes de

neutrfilos estimulados por imunocomplexos e anlise da relao estrutura-atividade.

Tese apresentada ao Programa de Ps-Graduao em

Cincias Farmacuticas da Faculdade de Cincias

Farmacuticas de Ribeiro Preto, Universidade de So

Paulo, para obteno do ttulo de Doutor em Cincias

Farmacuticas.

rea de Concentrao:rea de Concentrao:rea de Concentrao:rea de Concentrao: Produtos Naturais e Sintticos

Banca ExaminadoraBanca ExaminadoraBanca ExaminadoraBanca Examinadora

Prof(a). Dr(a)._______________________________________________________________________

Instituio________________________________Assinatura:________________________________

Prof(a). Dr(a)._______________________________________________________________________


Prof(a). Dr(a)._______________________________________________________________________


Prof(a). Dr(a)._______________________________________________________________________


Prof(a). Dr(a)._______________________________________________________________________


Aprovado pela Comisso Julgadora em: _______/_______/_______.

Agradecimentos

Tempo Certo

De uma coisa podemos ter certeza: De nada adianta querer apressar as coisas;

tudo vem a seu tempo, dentro do prazo que lhe foi previsto, mas a natureza humana no muito paciente.

Temos pressa em tudo, a acontecem os atropelos do destino, aquela situao que voc mesmo provoca

por pura ansiedade de no aguardar o Tempo Certo. Mas algum poderia dizer: qual esse Tempo Certo?

Bom, basta observar os sinais... Quando alguma coisa est para acontecer ou chegar at sua vida,

pequenas manifestaes do cotidiano enviaro sinais indicando o caminho certo.

Pode ser a palavra de um amigo, um texto lido, uma observao qualquer;

mas com certeza, o sincronismo se encarregar de colocar voc no lugar certo, na hora certa, no momento certo,

diante da situao ou da pessoa certa. Basta voc acreditar que nada acontece por acaso.

Tente observar melhor o que est a sua volta. Com certeza alguns desses sinais j esto por perto,

e voc nem os notou ainda. Lembre-se que o universo sempre conspira a seu favor,

quando voc possui um objetivo claro e uma disponibilidade de crescimento interior.

(Paulo Coelho)

A Deus

Por Sua infinita bondade, que tem me concedido amparo nas lutas do dia-a-dia. Pelos inmeros companheiros de jornada que tem colocado em meu caminho, que parecem surgir por acaso , como mensageiros de Suas

palavras de afeto, conforto, incentivo e esperana. Por Seus eternos ensinamentos de Amor, Paz e Sabedoria, que tm sido essenciais em

minha caminhada evolutiva.

A benignidade do Senhor grande para conosco, e a Sua verdade dura para sempre(Salmo 117: 2)

Aos meus pais, Akiko e Natio, e aos meus irmos, Adriana e Rogrio

Em meio a tantas palavras existentes no Universo, no h uma sequer capaz de expressar a minha imensa gratido a vocs. Pelo imenso apoio

moral e espiritual, que foram imprescindveis para que eu pudesse chegar at aqui. Pelo constante incentivo e pelos ensinamentos de cada dia, to valiosos para que eu me torne um ser humano melhor e capaz de trilhar os caminhos da Verdade. Acima de tudo, pelo infinito sentimento de amor que nos une,

por alm da eternidade, que tem sido a grande razo de minha felicidade interior.

Quando os ensinamentos do Mestre vibram entre quatro paredes

de um templo domstico, os pequeninos sacrifcios tecem a felicidade comum. (Chico Xavier)

Profa. Dra. Yara Maria Lucisano Valim

Pela preciosa amizade, pela compreenso e pelo respeito s minhas dificuldades. Por todo o apoio, que sempre foi muito alm do profissional, e

essencial para o meu crescimento pessoal. Pelo exemplo de carter e de conduta tica que prima pelo respeito ao Ser Humano como filho de

Deus. Pela sensibilidade especial, que nos ensina a olhar para alm do que as aparncias podem nos mostrar.

" No basta ensinar ao homem uma especialidade, porque tornar-se- uma mquina utilizvel, mas no uma personalidade.

necessrio que adquira um sentimento, um senso prtico do que belo, do que moralmente correto. Deve aprender a compreender as motivaes dos homens,

suas quimeras e suas angstias, para determinar com exatido seu lugar em relao a seus prximos e a sua comunidade."

(Albert Einstein)

Ao Conselho Nacional de Desenvolvimento Cientfico e Tecnolgico

(CNPq), pelo auxlio financeiro concedido para a realizao deste

trabalho (processo 140462/2003-1).

Andria C. K. K. Takara, pela amizade incondicional e eterna, pela constante presena com palavras de carinho, apoio e incentivo, e pelos inmeros momentos de alegria compartilhados. Ana Carolina F. Motta, pela preciosa amizade, pela solidariedade e pelas sbias e iluminadas palavras de apoio nos mais diversos momentos. Renata Takeara, pela grande amizade sincera, construda ao longo de muitos anos, por pequenos momentos de convvio. Lilian S. C. Bernardes, pela amizade preciosa, pelas palavras de conforto e esperana, e pelo incentivo constante. Helosa D.C. Francescato, pela solidariedade, compreenso e incentivo em minha jornada profissional. Gyselle C. Baccan, pela amizade e pelas reflexes, que me ajudaram a enxergar a vida por outros ngulos. oRicardo L.M. Sousa, pela amizade, pela pacincia em ouvir e pelas sbias palavras de incentivo. Ao Eduardo Ricci Junior, pela amizade preciosa, pelos momentos de riso compartilhados e pelo apoio constante. Aos amigos do Batura, pela acolhida afetuosa, pelo apoio e companheirismo, e pelos iluminados ensinamentos e reflexes.

Aos companheiros de jornada do Laboratrio de Bioqumica da FCFRP-USP : Alexandre Kanashiro, pela amizade preciosa, pelo apoio constante e muitas vezes silencioso, pelos momentos de reflexo filosfica, e pelo grande exemplo de solidariedade. Denise P.S. Leito, pela amizade incondicional e sincera, pelas palavras afetuosas de conforto, e pelo imprescindvel apoio nos momentos mais difceis da caminhada evolutiva. Adriana B.P. Paschoalato, pela amizade sincera, pelo apoio e cooperao, e pelo belo exemplo de humildade, solidariedade e bom humor. Livia M.C.S. Ambrosio, pela amizade verdadeira, generosidade e companheirismo, e pelos inesquecveis momentos de reflexo filosfica. Mirian R. Moreira, pela amizade, pelo incentivo constante, e pelos inmeros momentos de aprendizado e crescimento compartilhados. Ana Paula L. Librandi, pela amizade, pelo apoio constante e pelas reflexes, que tanto contriburam para o meu aprendizado. Elisa M.S. Russo-Carbolante, pela amizade, pela pacincia em ouvir, e pela sinceridade em suas palavras de conforto e incentivo. Cleni M.M.Marzocchi-Machado, pela amizade, pela cooperao, e pela valiosa contribuio para o meu aprendizado. Fbio E. Mingatto, pela amizade, pela prontido em ajudar e cooperar nos mais diversos momentos, e pelos inmeros ensinamentos profissionais e pessoais.

Celma G. Duarte, pela amizade mpar, pelas palavras de apoio, incentivo e esperana, e pelos inmeros momentos de riso compartilhados. Viviane K.S. Kawata, pela amizade, pela solidariedade e prontido em ajudar. As ps-graduandas Celene M.O.S. Alves, Daiani C.O. Andrade e Fabiana S. Paula, pela amizade e por ressaltarem a importncia do esprito de cooperao para o crescimento de um grupo de pesquisa. Os estagirios Andrea S.G. Figueiredo, Joel G. Souza e Tatiana S. Marasca, que imprimem uma alegria mpar ao grupo de pesquisa, pela amizade e imprescindvel cooperao. Os ps-graduandos Accio A. Pigoso, Anaisa F.C. Helena, Cssio B. Pontes, Czar R. Pestana, Cludia S. Bitencourt, Clayton S. Freitas, Daniel J. Dorta, Fernando A.M. Souza, Laura M. Valdevite, Mateus F. Leite, Tiago Rodrigues, Wagner R. Sousa, pela agradvel convivncia. Os estagirios Ana Lcia C. Cunha, Ana Paula S. Oliveira, Carlos Eduardo Pulici, Cludia M. Siqueira, Daniela G. Pantalena, Edson L.N. Rios, Elaine A. Kauvauti, Jennifer M.C. Yokoya, Larissa D. Figueiredo, Lus Eduardo F.A. Silva, Marina Biagioni, Slvia A. Cardoso, Tas N. Chrysostomo, pela agradvel convivncia.

Aos funcionrios do Laboratrio de Bioqumica da FCFRP-USP : Maria Regina de P. Raphaloski, pela amizade sincera, pelo apoio constante e incondicional, pelas inesquecveis palavras de incentivo e esperana, e pelos inmeros momentos de reflexo filosfica. Ana Elisa C.S. Azzolini, pela amizade, pela prontido em ajudar, pela imprescindvel cooperao para a realizao deste trabalho, pelos diversos momentos de crescimento e aprendizado pessoal e profissional compartilhados, e pelos agradveis momentos de convivncia. Ana Cristina M. Polizelo, pela amizade, pelo apoio e auxlio constantes, e pelos agradveis momentos de convivncia e aprendizado. Ieda M.R. Prado, pela amizade, pelo apoio muitas vezes silencioso, e pelos agradveis momentos de convivncia e aprendizado. Nadir Mazzucato, pela amizade sincera, pelo carinho maternal e apoio espiritual, demonstrado em pequenas e singelas atitudes. Alcides S. Pereira, pela amizade, pelos momentos de aprendizado proporcionados, e pela importante colaborao para a realizao deste trabalho. Aos Professores: Dra. Ana Isabel de Assis Pandochi, Dra. Carem Gledes Vargas Recchia, Dr. Carlos Curti e Dr. Augusto Csar Cropanese Sapdaro, pelos ensinamentos acadmicos e lies de vida transmitidos, pela agradvel convivncia, e pelos momentos de riso e de reflexo compartilhados. Ao Prof. Dr. Srgio A. Uyemura, do laboratrio de Bioqumica Clnica da FCFRP-USP, pela amizade e cooperao, pelos diversos esclarecimentos prestados, e pela prontido em ajudar.

Aos ps-graduandos do Laboratrio de Bioqumica Clnica da FCFRP-USP : Flvia Martinello, Frederico M. Soriani, Sheila Maria Soares, Taisa Magnani, Valria G. Tudella eVicente P. Martins, pela agradvel convivncia e pela prontido em ajudar. Profa. Dra. Mnica T. Pupo, do Laboratrio de Qumica Farmacutica da FCFRP-USP, pelo fornecimento das 3-fenilcumarinas, pelo imprescindvel auxlio e orientao durante o desenvolvimento deste trabalho. Ao Prof. Dr. Carlos A. Oliveira, da Universidade Federal de Uberlndia, pela amizade, pela cooperao nas anlises de microscopia eletrnica, pela prontido em ajudar, e pelas frutferas discusses no decorrer do trabalho. Ao Prof. Dr. Carlos H.T.P. Silva, do Laboratrio de Qumica Farmacutica da FCFRP-USP, pela valiosa contribuio nos estudos de modelagem molecular. Ao Prof. Dr. Bernardo Mantovani, e aos tcnicos Silvana C. Silva e Jos Antnio da Silva, do Laboratrio de Bioqumica da FMRP-USP, pela preciosa cooperao e pelas importantes discusses sobre os ensaios biolgicos. Profa. Dra. Ivone de Carvalho, do Laboratrio de Qumica Farmacutica da FCFRP-USP, pela importante contribuio na elaborao deste trabalho. Profa. Dra. Lcia H. Faccioli, do Laboratrio de Imunologia da FCFRP-USP, pelos diversos esclarecimentos prestados, e pela importante contribuio no desenvolvimento deste trabalho.

Ao Prof. Dr. Joo Luis C. Lopes, do Laboratrio de Qumica Orgnica da FCFRPUSP, pela amizade, pelos inmeros esclarecimentos prestados, e pela constante cooperao. Ao Prof. Dr. Antnio Cardozo dos Santos, do Laboratrio de Toxicologia da FCFRP-USP, pela agradvel convivncia e por estar sempre aberto a esclarecimentos dos mais diversos tipos. Aos Funcionrios da FCFRP-USP Cludia C. Macedo, Cssio L. Rodrigues e Sonia A.C. Dreossi, pela prontido em ajudar e pela agradvel convivncia. s Funcionrias da Seo de Ps-Graduao da FCFRP-USP Ana Lcia T. Barbosa, Eleni A. Passos e Rosana F.L.S. Florncio, pela pacincia e pela imprescindvel assistncia durante o desenvolvimento deste trabalho. Aos Funcionrios do Biotrio da FCFRP-USP e do Biotrio Central do Campus de Ribeiro Preto, pelo cuidado no tratamento dos animais. Aos Funcionrios da Biblioteca Central do Campus de Ribeiro Preto da Universidade de So Paulo, pela simpatia, pela ateno e pela prontido em ajudar.

A todos aqueles que, embora no citados, contriburam de alguma forma para a realizao deste trabalho.

Resumo

KABEYA, L.M. Estudo do efeito modulatrio de derivados de 3Estudo do efeito modulatrio de derivados de 3Estudo do efeito modulatrio de derivados de 3Estudo do efeito modulatrio de derivados de 3----fenilcumarina nas funes fenilcumarina nas funes fenilcumarina nas funes fenilcumarina nas funes

de neutrfilos estimulados por imude neutrfilos estimulados por imude neutrfilos estimulados por imude neutrfilos estimulados por imunocomplexos e anlise da relao estruturanocomplexos e anlise da relao estruturanocomplexos e anlise da relao estruturanocomplexos e anlise da relao estrutura----atividade. atividade. atividade. atividade.

2006. 192f. Tese (Doutorado) Faculdade de Cincias Farmacuticas de Ribeiro Preto,

Universidade de So Paulo, Ribeiro Preto, 2006.

A formao de complexos antgeno-anticorpo ou imunocomplexos (ICs) na

circulao e sua eliminao faz parte dos mecanismos de defesa imune humoral do ser

humano. Em algumas patologias, como lupus eritematoso sistmico, artrite reumatide e

vasculite auto-imune, ocorre um desequilbrio nesse processo, que leva deposio dos

ICs nos tecidos e ao desencadeamento de uma reao inflamatria. Esta, por sua vez,

envolve o recrutamento e ativao de neutrfilos, que tm importante participao na

patognese dessas doenas.

A ativao dos neutrfilos pelos ICs, via receptores para a poro Fc de IgG

(FcR) e receptores de complemento (CR), desencadeia diversas funes efetoras, tais

como fagocitose, desgranulao e o metabolismo oxidativo, com a produo de espcies

reativas de oxignio (EROs). Estas funes esto envolvidas na digesto dos ICs, na

morte de microorganismos, e na regulao do processo inflamatrio. Entretanto, nas

doenas mediadas por ICs, os neutrfilos ativados liberam grandes quantidades de

enzimas e EROs para o meio extracelular, contribuindo para a leso dos tecidos do

hospedeiro e a amplificao do processo inflamatrio.

Neste trabalho foi avaliado o efeito modulatrio de vinte derivados de 3-

fenilcumarina nas funes de neutrfilos estimulados por ICs de ovalbumina (OVA) e IgG

anti-OVA. Alm disso, foi feita a investigao mecanismos de ao dessas substncias e

a anlise da relao estrutura-atividade.

O metabolismo oxidativo dos neutrfilos ativados por ICs foi medido por ensaio

de quimioluminescncia dependente de lucigenina ou de luminol (QLlucPMN e QLlumPMN,

respectivamente). Observou-se que as 3-fenilcumarinas contendo o grupo substituinte

3,4-metilenodioxi e o grupo substituinte 6,7-orto-diidroxi (C13C13C13C13) ou 6,7-orto-diacetoxi

(C13aC13aC13aC13a), bem como a 3-fenilcumarina 6,7,3,4-tetraacetoxilada (C24aC24aC24aC24a), apresentaram

atividade inibitria maior que a quercetina (QUERQUERQUERQUER) sobre a QLlucPMN e a QLlumPMN. Para

as demais substncias avaliadas, que foram to ou menos ativas que a QUERQUERQUERQUER, as

caractersticas estruturais relacionadas inibio da QLlucPMN foram um pouco

diferentes daquelas relacionadas inibio da QLlumPMN. Alm disso, as 3-

fenilcumarinas estudadas e a QUERQUERQUERQUER no apresentaram efeito txico sobre os neutrfilos,

avaliado pela liberao de lactato desidrogenase e pelo ensaio de excluso ao corante

Azul de Tripan, nas condies empregadas.

Para as trs 3-fenilcumarinas que apresentaram maior efeito inibitrio sobre o

metabolismo oxidativo dos neutrfilos (C13C13C13C13, C13aC13aC13aC13a e C24aC24aC24aC24a), o aumento do tempo de pr-

tratamento levou a uma tendncia de reduo do efeito inibitrio da substncia C24aC24aC24aC24a,

mas no influenciou na atividade biolgica das substncias C13C13C13C13 e C13aC13aC13aC13a. Essas trs

substncias no interferiram na capacidade fagoctica das clulas, avaliada por

microscopia eletrnica de transmisso.

Para todas as 3-fenilcumarinas foi avaliada tambm a capacidade antioxidante

frente ao radical livre 2,2-difenil-1-picril-hidrazil e o efeito inibitrio dessas

substncias sobre a quimioluminescncia produzida pela reao horseradish

peroxidase-H2O2-luminol (QLHRP). Foi observado que a QUERQUERQUERQUER e as 3-fenilcumarinas

contendo o grupo substituinte orto-diidroxi (C13C13C13C13, C23C23C23C23, C24C24C24C24) tiveram atividade

antioxidante e inibiram a QLHRP, mas suas anlogas acetoxiladas (C13aC13aC13aC13a, C23aC23aC23aC23a, C24aC24aC24aC24a),

bem como as demais substncias avaliadas, foram significativamente menos ativas

nesses modelos experimentais no celulares.

O conjunto de resultados deste trabalho sugere que as atividades biolgicas das

3-fenilcumarinas estudadas foram dependentes de suas estruturas qumicas, e pequenas

modificaes nestas podem levar a alteraes significativas na magnitude de seus

efeitos biolgicos. Alm disso, tanto a lipofilicidade das substncias quanto a sua

capacidade antioxidante parecem ser relevantes para a modulao eficiente do

metabolismo oxidativo dos neutrfilos e da conseqente leso tecidual.

PalavrPalavrPalavrPalavrasasasas----chave:chave:chave:chave: neutrfilos, imunocomplexos, cumarinas, relao estrutura-atividade,

antioxidantes.

Abstract

KABEYA, L.M. Study of the modulatory effect of 3Study of the modulatory effect of 3Study of the modulatory effect of 3Study of the modulatory effect of 3----phenylcoumarin derivatives in the phenylcoumarin derivatives in the phenylcoumarin derivatives in the phenylcoumarin derivatives in the

immune compleximmune compleximmune compleximmune complex----stimulated neutrophil functiostimulated neutrophil functiostimulated neutrophil functiostimulated neutrophil functions and analysis of the structurens and analysis of the structurens and analysis of the structurens and analysis of the structure----activity activity activity activity

relationship.relationship.relationship.relationship. 2006. 192f. Thesis (Doctoral) Faculdade de Cincias Farmacuticas de

Ribeiro Preto, Universidade de So Paulo, Ribeiro Preto, 2006.

Formation and clearance of circulating antigen-antibody complexes or immune

complexes (ICs) take part in the humoral immune defense mechanisms. In some

diseases, as systemic lupus erythematosus, rheumatoid arthritis and auto-immune

vasculitis, an imbalance of this process occurs, leading to the ICs deposition within

tissues and triggering an inflammatory reaction. The last one involves the recruitment

and activation of neutrophils, which have an important role in the pathogenesis of such

diseases.

Neutrophil activation by ICs, via receptors for the Fc portion of IgG (FcR) and

complement receptors (CR), triggers a sort of effector functions, such phagocytosis,

degranulation and the oxidative metabolism, which produces reactive oxygen species

(ROS). These functions are involved in the ICs digestion, microbial killing and the

inflammatory process regulation. However, the activated neutrophils release large

amounts of enzymes and ROS to the extracellular milieu, contributing to the tissue

damage and amplification of the inflammatory process in the IC-mediated diseases.

In this work, we evaluated the modulatory effect of twenty 3-phenylcoumarin

derivatives in the neutrophil functions stimulated by ICs of ovalbumin (OVA) and IgG

anti-OVA. In addition, the mechanisms of action of these compounds were investigated,

and the structure-activity relationship was analyzed.

The IC-activated neutrophil oxidative metabolism was measured by lucigenin-

or luminol-dependent chemiluminescence assay (CLlucPMN and CLlumPMN, respectively).

It was observed that the 3-phenylcoumarins bearing a 3,4-methylenodioxy and the

6,7-orto-dihydroxy (C13C13C13C13) or the 6,7-orto-diacetoxy (C13aC13aC13aC13a) group, as well as the

6,7,3,4-tetraacetoxylated 3-phenylcoumarin (C24aC24aC24aC24a), inhibited CLlucPMN and CLlumPMN

more than quercetin (QUERQUERQUERQUER). Regarding the other evaluated compounds, whose

inhibitory effects were similar to or lower than QUERQUERQUERQUER, the structural features related to

the CLlucPMN inhibition were different from those related to the CLlumPMN inhibition.

Moreover, the studied 3-phenylcoumarins and QUERQUERQUERQUER had no toxic effects on

neutrophils, as evaluated by lactate dehydrogenase release and Trypan Blue exclusion,

under the assessed conditions.

With respect to the three 3-phenylcoumarins that had the highest inhibitory

effects on the neutrophil oxidative metabolism (C13C13C13C13, C13aC13aC13aC13a and C24aC24aC24aC24a), the increase of

the cell pre-treatment period showed a tendency to decrease the inhibitory ability of

compound C24aC24aC24aC24a, but did not influence the biological activity of compounds C13C13C13C13 and

C13aC13aC13aC13a. These three compounds did not interfere in the neutrophil phagocytic ability, as

evaluated by transmission electron microscopy.

The antioxidant activity against the 2,2-diphenyl-1-picrylhydrazyl free radical

and the inhibitory effect in the chemiluminescence generated by the horseradish

peroxidase-H2O2-luminol reaction (CLHRP) were evaluated for all 3-phenylcoumarins. It

was found that QUERQUERQUERQUER and those 3-phenylcoumarins bearing the orto-dihydroxy group

(C13C13C13C13, C23C23C23C23, C24C24C24C24) had antioxidant activity and inhibited the CLHRP. However, their

acetoxylated analogues (C13aC13aC13aC13a, CCCC23a23a23a23a, C24aC24aC24aC24a) and the other evaluated compounds were

significantly less active on these cell-free experimental models.

Taken together, the results of the present work suggest that the biological

activities of the 3-phenylcounarins here investigated were dependent on their chemical

structures, and small changes on the molecule can lead to significant changes on the

magnitude of their biological effects. Moreover, both lipophilicity and antioxidant

capacity of these compounds seem to be relevant to an efficient modulation of the

neutrophil functions and the consequent tissue damage.

Key words:Key words:Key words:Key words: neutrophils, immune complexes, coumarins, structure-activity relationship,

antioxidants.

Lista de abreviaturas

ANCA anticorpos citoplasmticos anti-neutrfilo

ANOVA anlise de varincia

ATP trifosfato de adenosina

BPI protena promotora de permeabilidade bacteriana

C3b, C3bi, C5a fragmentos de ativao do sistema complemento

CD cluster de diferenciao

CI50 concentrao que inibe 50% da resposta biolgica

CoA coenzima A

c.p.m. ftons contados por minuto (counted photons per minute)

CR receptor de complemento

CR1, CR3 receptores de complemento tipo 1 e 3

CR50 concentrao que promove 50% de reduo do DPPH

DAF fator acelerador de decaimento

DCFH diclorofluorescena

DCFH-DA diacetato de diclorodiidrofluorescena

DEAE dietilaminoetil

DMSO dimetilsulfxido

DP desvio padro

DPPH 2,2-difenil-1-picrilhidrazil

EGFR receptor para fator de crescimento epidrmico

EROs espcies reativas de oxignio

F(ab)2 fragmentos de ligao ao antgeno da molcula de anticorpo

Fc fragmento cristalizvel da molcula de anticorpo

FcR receptore para poro Fc de IgG

FcRIIA, FcRIIIB isoformas de receptores FcR

gp91phox glicoprotena de 91 KDa componente do complexo da NADPH

oxidase

G-CSF fator estimulante de colnia de granulcito

GRO produto gnico relacionado a crescimento

GTP trifosfato de guanosina

hCAP-18 peptdeo catinico antimicrobiano 18 humano

HRP horseradish peroxidase

IC imunocomplexo

IC F(ab)2-OVA imunocomplexo de OVA e fragmento F(ab)2 de IgG anti-OVA

IC F(ab)2-OVA-SC imunocomplexo de OVA e fragmento F(ab)2 de IgG anti-OVA,

opsonizado com soro de coelho

IC IgG-OVA imunocomplexo de OVA e IgG anti-OVA

IC IgG-OVA-SC imunocomplexo de OVA e IgG anti-OVA, opsonizado com soro

de coelho

ICAM molcula de adeso intracelular

IFN- interferon gamma

IgG imunoglobulina da classe G

IL interleucina

IP-10 protena 10 indutvel pelo interferon gamma

I-TAC quimioatraente de clulas T indutvel pelo interferon gamma

LDH lactato desidrogenase

LTB4 leucotrieno tipo B4

MCP-1 protena quimioatraente de moncitos

MIG monocina indutvel pelo interferon gamma

MIP-1, MIP-1 protena inflamatria de macrfagos tipo 1 e 1

M.M. massa molecular

MMP8, MMP9, MMP25

metaloproteinase de matriz tipo 8, 9 e 25

MPO mieloperoxidase

NADH nicotinamida adenina dinucleotdeo (forma reduzida)

NADPH nicotinamida adenina dinucleotdeo fosfato (forma reduzida)

NCF fator citoslico de neutrfilo

n-fMLP n-formil-metionil-leucil-fenilalanina

OVA ovalbumina

p22phox, p40phox,

p47phox, p67phox

protenas de 22, 40, 47 e 67 KDa, componentes do complexo

da NADPH oxidase

PAR-4 receptor do tipo 4 ativado por protease

PBS soluo salina tamponada com fosfato

PECAM-1 molcula de adeso endotlio-plaquetrio tipo 1

phox oxidase de fagcito (phagocyte oxidase)

PMA acetato de miristoilforbol

p/v peso/volume

QLHRP quimioluminescncia produzida pela reao HRP-H2O2-luminol

QLlucPMN quimioluminescncia dependente de lucigenina

QLlumPMN quimioluminescncia dependente de luminol

QUER quercetina

RF fator de retardamento

SC soro de coelho

S/D sem diluir; no diludo

SDS dodecil sulfato de sdio

SLPI inibidor de protease secretria de leuccitos

SOD superxido dismutase

TGF- fator de transformao e crescimento tipo alfa

TNF- fator de necrose tumoral tipo alfa

VEGF fator de crescimento do endotlio vascular

v/v volume/volume

Ziops zimosan opsonizado

Sumrio

1. INTRODUO............................................................................................................................. 29

1.1. Neutrfilos ........................................................................................................................... 30

1.1.1. Caractersticas morfolgicas .................................................................................... 30

1.1.2. Funes fisiolgicas .................................................................................................. 32

1.1.2.1. Participao na resposta inflamatria.......................................................... 32

1.1.2.2. Produo de mediadores inflamatrios........................................................ 34

1.1.2.3. Desgranulao .............................................................................................. 36

1.1.2.4. Fagocitose .................................................................................................... 41

1.1.2.5. Produo de espcies reativas de oxignio (EROs).................................... 44

1.2. Doenas mediadas por imunocomplexos (ICs) ................................................................... 50

1.2.1. Aspectos fisiopatolgicos ......................................................................................... 50

1.2.2. Participao de neutrfilos........................................................................................ 54

1.3. Cumarinas ............................................................................................................................ 56

1.3.1. Biognese e ocorrncia............................................................................................. 56

1.3.2. Atividades biolgicas................................................................................................. 58

1.4. 3 Fenilcumarinas............................................................................................................... 61

1.5. Flavonides.......................................................................................................................... 63

1.5.1. Biognese e ocorrncia............................................................................................. 63

1.5.2. Quercetina ................................................................................................................. 64

1.6. Desenvolvimento de frmacos a partir de produtos naturais ............................................ 66

2. OBJETIVOS................................................................................................................................. 68

3. MATERIAL E MTODOS............................................................................................................ 70

3.1. Abordagem experimental .................................................................................................... 71

3.2. Sustncias estudadas........................................................................................................... 72

3.2.1. 3 Fenilcumarinas .................................................................................................... 72

3.2.2. Quercetina ................................................................................................................. 75

3.2.3. Avaliao da solubilidade das 3 fenilcumarinas em meio aquoso......................... 75

3.3. Animais................................................................................................................................. 77

3.4. Isolamento de neutrfilos .................................................................................................... 77

3.5. Obteno de soro normal..................................................................................................... 78

3.6. Obteno, purificao e caracterizao da preparao de IgG total

rica em IgG anti OVA.........................................................................................................

78

3.6.1. Obteno do soro imune rico em IgG anti OVA..................................................... 79

3.6.2. Purificao do soro imune para obteno de IgG total ............................................ 79

3.6.3. Caracterizao da preparao de IgG total rica em IgG anti OVA........................ 82

3.6.3.1. Anlise eletrofortica da frao IgG total do soro imune ........................... 82

3.6.3.2. Determinao do ponto de equivalncia da reao

antgeno anticorpo .....................................................................................

84

3.7. Preparo de fragmentos F(ab)2 a partir de molculas de IgG ntegra............................... 87

3.8. Preparo de ICs .................................................................................................................... 87

3.9. Opsonizao dos ICs ........................................................................................................... 88

3.10. Ensaios em sistemas celulares......................................................................................... 88

3.10.1. Padronizao de ensaio para avaliao da atividade do complexo

enzimtico de NADPH oxidase de neutrfilos .....................................................

88

3.10.2. Avaliao da toxicidade das 3 fenilcumarinas sobre neutrfilos...................... 91

3.10.3. Avaliao da atividade biolgica das 3 fenilcumarinas sobre o metabolismo

oxidativo de neutrfilos estimulados via receptores FcR ..................................

92

3.10.4. Avaliao da atividade biolgica das 3 fenilcumarinas C13C13C13C13, C13aC13aC13aC13a

e C24aC24aC24aC24a sobre o metabolismo oxidativo de neutrfilos estimulados

via receptores FcR, em funo do tempo de pr-tratamento ...........................

96


e C24aC24aC24aC24a sobre o metabolismo oxidativo de neutrfilos estimulados

via receptores FcR e/ou CR................................................................................

96


e C24aC24aC24aC24a sobre a fagocitose de ICs.........................................................................

99

3.11. Ensaios em sistemas no celulares............................................................................... 100

3.11.1. Avaliao da atividade antioxidante das 3 fenilcumarinas

frente ao radical livre DPPH...................................................................................

100

3.11.2. Avaliao da atividade antioxidante das 3 fenilcumarinas empregando

a reao HRPH2O2luminol....................................................................................

101

3.12. Avaliao da interao das 3 fenilcumarinas com a HRP por docking......................... 103

3.13. Anlise dos dados............................................................................................................. 104

4. RESULTADOS............................................................................................................................. 105

4.1. Ensaios em modelos experimentais celulares, empregando neutrfilos de coelho .......... 106

4.1.1. Avaliao da toxicidade das 3 fenilcumarinas sobre neutrfilos .......................... 106

4.1.2. Efeito das 3 fenilcumarinas sobre o metabolismo oxidativo de neutrfilos

estimulados via receptores FcR...............................................................................

108

4.1.2.1. Avaliao preliminar de atividade na concentrao de 50 mol/L.............. 108

4.1.2.2. Avaliao da atividade biolgica em funo da concentrao..................... 112

4.1.2.3. Anlise qualitativa da relao estrutura atividade.................................... 118

4.1.2.3.1. Caractersticas estruturais das 3 fenilcumarinas

relacionadas inibio de QLlucPMN ............................................

118

4.1.2.3.2. Caractersticas estruturais das 3 fenilcumarinas

relacionadas inibio de QLlumPMN ...........................................

122

4.1.3. Efeito das 3 fenilcumarinas C13C13C13C13, C13a C13a C13a C13a e C24a C24a C24a C24a sobre o metabolismo

oxidativo de neutrfilos estimulados via receptores FcR,

em funo do tempo de pr-tratamento...................................................................

125

4.1.4. Efeito das 3 fenilcumarinas C13,C13,C13,C13, C13aC13aC13aC13a e C24aC24aC24aC24a sobre o metabolismo

oxidativo de neutrfilos estimulados via receptores FcR e/ou CR ........................

127

4.1.5. Efeito das 3 fenilcumarinas C13C13C13C13, C13aC13aC13aC13a e C24aC24aC24aC24a sobre a fagocitose

de ICs por neutrfilos, mediada por receptores FcR .............................................

130

4.2. Ensaios em sistemas no celulares.................................................................................. 132

4.2.1. Avaliao da atividade antioxidante das 3 fenilcumarinas frente

ao radical livre DPPH................................................................................................

132

4.2.1.1. Avaliao preliminar de atividade na concentrao de 50 mol/L .............. 132

4.2.1.2. Avaliao da porcentagem de reduo do DPPH em funo da

concentrao das 3 fenilcumarinas............................................................

135

4.2.1.3. Anlise qualitativa da relao estrutura atividade .................................... 137

4.2.2. Avaliao da atividade antioxidante das 3 fenilcumarinas, empregando

a reao HRP H2O2 luminol..................................................................................

138

4.2.2.1. Avaliao preliminar de atividade na concentrao de 50 mol/L .............. 138

4.2.2.2. Atividade biolgica das 3 fenilcumarinas em funo da concentrao..... 141

4.2.2.3. Anlise qualitativa da relao estrutura atividade .................................... 143

4.3. Avaliao da interao entre as 3 fenilcumarinas e a HRP por docking......................... 144

5. DISCUSSO ................................................................................................................................ 147

5.1. Efeito modulatrio das 3 fenilcumarinas nos modelos experimentais celulares............ 148

5.2. Efeito modulatrio das 3 fenilcumarinas nos modelos experimentais no celulares ..... 157

5.3. Consideraes finais............................................................................................................ 162

6. CONCLUSO .............................................................................................................................. 164

REFERNCIAS ................................................................................................................................ 167

ANEXO ............................................................................................................................................ 191

29

1. Introduo

30

1.1. Neutrfilos1.1. Neutrfilos1.1. Neutrfilos1.1. Neutrfilos

1.1.1. Caractersticas morfolgicas1.1.1. Caractersticas morfolgicas1.1.1. Caractersticas morfolgicas1.1.1. Caractersticas morfolgicas

O sangue perifrico constitudo por trs diferentes linhagens celulares:

glbulos brancos ou leuccitos; glbulos vermelhos, eritrcitos ou hemcias;

plaquetas ou trombcitos. Os leuccitos formam o grupo mais heterogneo de

clulas do sangue, tanto do ponto de vista morfolgico quanto fisiolgico, e

desempenham papel de defesa do organismo, sendo que cada subtipo

leucocitrio detm funes bastante especficas e distintas entre si, que, em

conjunto, estruturam o sistema imunolgico (ZAGO; FALCO, 2004).

Os leuccitos so agrupados em mononucleares e polimorfonucleares. Os

primeiros incluem os linfcitos, plasmcitos e os moncitos, cuja caracterstica

peculiar a de possuir um ncleo nico e uniforme. Os ltimos, tambm

chamados de granulcitos pela presena de granulao citoplasmtica, incluem

os neutrfilos, eosinfilos e basfilos e possuem um ncleo multiforme e

segmentado (BAINTON; ULLYOT; FARQUHAR, 1971; JOHNSON; VARANI;

SMOLEN, 1992).

Os leuccitos polimorfonucleares foram descobertos por Paul Erlich,

quando as tcnicas de fixao e colorao celular possibilitaram a identificao

do ncleo lobulado e da presena dos grnulos citoplasmticos (ERLICH;

LAZARUS, 1900 apud BORREGAARD; COWLAND, 1997). Os granulcitos

neutrfilos, ou simplesmente neutrfilos so assim chamados pela sua

tonalidade neutra nas coloraes de Romanowsky, enquanto os eosinfilos

possuem grande avidez pela eosina e os basfilos so facilmente identificados

31

pela presena de grnulos citoplasmticos grandes e de cor escura

(BORREGAARD; COWLAND, 1997).

Os neutrfilos representam cerca de 50 a 70% do total de leuccitos no

sangue perifrico de adultos. Os neutrfilos circulantes so clulas esfricas de

10 a 20 m de dimetro, com ncleo segmentado constitudo de cromatina

purprea escura e densa, com 3 a 5 lbulos interligados por um tnue filamento

de cromatina, muitas vezes invisvel na microscopia convencional. O citoplasma

abundante, contendo fina granulao especfica, a qual formada durante o

processo de maturao da clula (FAURSCHOU; BORREGAARD, 2003; RAVEL,

1997) (Figura 1.1).

Os neutrfilos so produzidos e armazenados na medula ssea, sendo

liberados na sua forma madura para o sangue perifrico, onde tem uma mdia

de vida em circulao bastante curta, de 6 a 7 horas. O local de destruio final

dos neutrfilos no bem conhecido, mas so encontrados na saliva, no trato

gastrointestinal e tambm podem ser removidos da circulao pelo fgado,

pulmes e bao (BAINTON; ULLYOT; FARQUHAR, 1971; JOHNSON; VARANI;

SMOLEN, 1992; FALCO, 2004).

Figura 1.1.Figura 1.1.Figura 1.1.Figura 1.1. Neutrfilo com morfologia caracterstica, apresentando ncleo

multilobulado e granulao citoplasmtica. Adaptado de Lekstrom-Himes e Gallin

(2000).

32

1.1.2. Funes fisiolgicas1.1.2. Funes fisiolgicas1.1.2. Funes fisiolgicas1.1.2. Funes fisiolgicas

1.1.2.1. Participao na resposta inflamatria1.1.2.1. Participao na resposta inflamatria1.1.2.1. Participao na resposta inflamatria1.1.2.1. Participao na resposta inflamatria

A inflamao definida como um processo fisiolgico atravs do qual os

tecidos vascularizados respondem a leses teciduais de diferentes naturezas,

provocadas por traumas, infeces, isquemia ou reaes auto-imunes, atravs

da participao de componentes do sistema imune (SHERDWOOD; TOLUIVER-

KINSKY, 2004). O recrutamento de leuccitos sanguneos para o local da leso

um dos primeiros eventos da resposta inflamatria, sendo mediado por

agentes exgenos como endotoxinas bacterianas e produtos virais, e agentes

endgenos, como citocinas, quimiocinas, mediadores lipdicos e componentes do

sistema complemento (GOUWY et al., 2005).

Dentre os leuccitos, os neutrfilos so os primeiros componentes

celulares do sistema imune que chegam nos stios inflamatrios, sendo, por esta

razo, considerados a primeira linha de defesa do organismo (LEHRER et al.,

1988; QUINN; GAUSS, 2004; HENSON, 2005). Essas clulas desempenham um

papel crtico na defesa do hospedeiro durante a resposta inflamatria aguda em

decorrncia da sua capacidade de envolver e destruir uma variedade de

patgenos que ocasionalmente penetram nas barreiras fsicas do organismo

(ALLEN, 2003; LEE; HARRISON; GRINSTEIN, 2003; QUINN; GAUSS, 2004).

O processo de migrao dos neutrfilos do sangue para os tecidos

envolve uma seqncia de passos conhecidos: contato, rolamento, adeso,

diapedese e quimiotaxia (LEY, 2002). Inicialmente, o processo de rolamento

mediado por molculas da famlia das selectinas, enquanto que o processo de

adeso mediado por molculas de alta afinidade de ligao, como as integrinas

33

(CD11/CD18) presentes nos leuccitos, e as molculas de adeso intracelular

(ICAM) expressas pelas clulas endoteliais. Finalmente, o evento conhecido

como diapedese mediado por molculas de adeso endotlio-plaquetrio do

tipo 1 (PECAM-1) (LIU et al., 2004; ZAGO; FALCO, 2004).

Uma vez no local da leso, os neutrfilos atuam na defesa do organismo

atravs de mecanismos dependentes de oxignio, que envolvem a produo de

espcies reativas de oxignio (EROs), e de mecanismos independentes de

oxignio, que compreendem a fagocitose, desgranulao, produo de

mediadores anti- e pr-inflamatrios (FAURSCHOU; BORREGAARD, 2003;

QUINN; GAUSS, 2004; SEGAL, 2005). Essas clulas podem ainda atuar como

apresentadoras de antgenos para linfcitos T (POTTER; HARDING, 2001).

Algumas horas aps o influxo de leuccitos para o local da inflamao, o

processo de resoluo natural da inflamao se inicia. De modo geral, este

processo envolve as seguintes etapas: (a) a remoo do estmulo inicial; (b)

decrscimo na produo de mediadores pr-inflamatrios, como prostaglandinas

e leucotrienos, que atraem novos leuccitos para o local da leso; (c) aumento

da produo de mediadores anti-inflamatrios, como as resolvinas e as

protectinas, que induzem a apoptose de neutrfilos, e as lipoxinas, que retardam

a entrada de novos neutrfilos para o stio inflamatrio, reduzem a

permeabilidade vascular e ativam os macrfagos para ingerir e eliminar

neutrfilos apoptticos; (d) remoo das clulas inflamatrias e debris celulares

para permitir o reparo final. Este processo termina com a partida dos

macrfagos via sistema linftico (HENSON, 2005; SERHAN; SAVILL, 2005).

34

Em circunstncias normais, a estrutura e a funo tecidual so

restauradas aps uma resposta inflamatria. Entretanto, se o delicado balano

entre inflamao e resoluo se torna desregulado, a inflamao pode levar ao

desenvolvimento de doenas crnicas como artrite, doena inflamatria

intestinal e asma. Nesses casos, onde a leso geralmente extensa ou

persistente, os tecidos lesados so substitudos por material fibroso, o que pode

ocasionar a perda da funo tecidual (BIASI et al., 2003; HENSON, 2005;

SERHAN; SAVILL, 2005).

1.1.2.2. Produo de mediadores inflamatrios1.1.2.2. Produo de mediadores inflamatrios1.1.2.2. Produo de mediadores inflamatrios1.1.2.2. Produo de mediadores inflamatrios

Os neutrfilos so usualmente conhecidos como a populao de

leuccitos envolvida em respostas inflamatrias agudas, agindo como a primeira

linha de defesa contra microrganismos invasores (QUINN; GAUSS, 2004;

HENSON, 2005). Descobertas recentes, entretanto, tm mostrado que os

neutrfilos sintetizam citocinas e quimiocinas, que desempenham papis

fundamentais na coordenao das respostas do sistema imune, no

desenvolvimento de linfcitos B e T, e na modulao da angiognese (ZLOTNIK;

YOSHIE, 2000; KASAMA et al., 2005; NATHAN, 2006).

Assim como os moncitos, os neutrfilos so capazes de sintetizar e

secretar o fator de crescimento do endotlio vascular (VEGF), citocinas pr-

inflamatrias [fator de necrose tumoral tipo alfa (TNF-), interleucinas (IL) IL-

12, IL-1R, IL-1], e quimiocinas, como IL-8, IP-10 [protena 10 indutvel pelo

interferon gamma (IFN)], GRO (produto gnico relacionado a crescimento),

35

MIG (monocina indutvel pelo IFN), MIP-1 e MIP-1 (protena inflamatria de

macrfagos) (STRIETER et al., 1990; BAZZONI et al., 1991; KASAMA et al.,

1994; GASPERINI et al., 1995; CASSATELLA et al., 1997; SCAPINI et al.,

2000).

A capacidade dos neutrfilos de expressar os genes para I-TAC

(quimioatraente de clulas T indutvel pelo IFN) e MCP-1 (protena

quimioatraente de moncitos tipo 1) foram descritas, mas ainda no h

informao sobre a sua secreo. (GASPERINI et al., 1999; KASAMA et al.,

2005; GOUWY et al., 2005).

Devido ao fato de que estes mediadores so primariamente quimiotticos

para neutrfilos, moncitos, clulas dendrticas imaturas e linfcitos T,

provvel que o neutrfilo desempenhe importante papel no recrutamento de

tipos distintos de leuccitos para o tecido inflamado (SCAPINI et al., 2000;

GOUWY et al., 2005). Por exemplo, os neutrfilos no so apenas os

produtores, mas tambm os alvos primrios para a IL-8, respondendo a este

mediador por quimiotaxia, desgranulao, produo de EROs, aumento da

expresso de molculas de adeso e aderncia aumentada a clulas endoteliais

(WILLEMS et al., 1989; BAGGIOLINI; DEWALD; MOSER, 1994). Alm disso, a

IL-8 tambm fator quimiottico para basfilos e linfcitos T, embora muito

menos potente do que para neutrfilos, e descrito como fator angiognico

(ROLLINS, 1997; HOFFMANN et al., 2002). Em relao a MIP-1 e MIP-1,

estas quimiocinas agem como potentes fatores ativadores e quimiotticos para

moncitos, macrfagos, clulas natural killer, clulas dendrticas imaturas e

clulas T helper 1 (SIVEKE; HAMMAN, 1998; GOUWY et al., 2005).

36

A secreo de citocinas e quimiocinas por neutrfilos ativados, regulada

por citocinas imuno-regulatrias, tais como IFN-, IL-4, IL-10 e IL-13, est

geralmente aumentada durante certas condies patolgicas, como artrite

reumatide, doenas inflamatrias intestinais e infeces micobacterianas

(BILLIAU, 1996; LUSTER, 1998; GOUWY et al., 2005).

1.1.2.3. Desgranulao1.1.2.3. Desgranulao1.1.2.3. Desgranulao1.1.2.3. Desgranulao

H mais de um sculo, o Dr. Eli Metchnikoff observou que neutrfilos

ingeriam partculas bacterianas e que, coincidentemente com o processo de

desgranulao, as bactrias paravam de se dividir (METCHNIKOFF, 1968 apud

LEVY, 2004). Ao longo dos anos seguintes, evidncias cientficas sugeriam que

os leuccitos matavam as bactrias atravs de mecanismos dependentes e

independentes de oxignio.

Na dcada de 1930, foi observado que os neutrfilos sofrem um aumento

no metabolismo respiratrio, evento que foi relacionado com a ativao da

enzima oxidase de fagcitos, hoje conhecida como complexo da NADPH oxidase

(BALDRIDGE; GERARD, 1933; BABIOR, 1999; ROOS; VAN BRUGGEN;

MEISCHL, 2003). Entretanto, uma grande variedade de agentes independentes

de oxignio, com atividade microbicida direta, foi descoberta antes e depois da

identificao dessa enzima. Na dcada de 1930, Alexander Flemming descreveu

a lisozima (HARE, 1983; LEVY, 2004), encontrada em fagcitos. Hirsch (1956) e

Zeya e Spitznagel (1963) examinaram a atividade microbicida de extratos brutos

de neutrfilos e iniciaram a caracterizao de alguns polipeptdeos catinicos

37

antimicrobianos. Com o advento de novas tcnicas cromatogrficas, vrios

grupos nas dcadas de 1970 e 1980 relataram a purificao de novas protenas

e peptdeos antimicrobianos derivados dos grnulos de leuccitos (revisado por

LEVY, 2004).

Os grnulos intracelulares dos neutrfilos so atualmente classificados

em primrios (ou azurfilos), secundrios (ou especficos), tercirios (ou de

gelatinase) e vesculas secretrias. Os diferentes tipos de grnulos

compartilham algumas protenas, como a lisozima, enquanto que outras so

encontradas em apenas um dos tipos de grnulos, servindo como marcadores

especficos, como mieloperoxidase (MPO), lactoferrina, gelatinase e albumina

(BORREGAARD; COWLAND, 1997; GUDMUNDSSON; AGERBERTH, 1999;

MOLLINEDO; BORREGAARD; BOXER, 1999). Os principais componentes de

cada tipo de grnulo so mostrados na Tabela 1.1.

Os componentes dos grnulos esto relacionados fagocitose e morte

intracelular de microrganismos, uma vez que a sua matriz rica em enzimas e

peptdeos com atividade microbicida, e as suas membranas so os principais

reservatrios do flavocitocromo b558 (gp91phox/p22phox), um componente

essencial da NADPH oxidase, e tambm de receptores de membrana dos

neutrfilos (BORREGAARD; COWLAND, 1997; ROOS; VAN BRUGGEN;

MEISCHL, 2003). Conforme a membrana dos grnulos se funde com a

membrana plasmtica, as protenas presentes nas membranas dos grnulos

translocam para a superfcie da membrana plasmtica da clula e fornecem

novos receptores e outras protenas funcionais (BORREGAARD; COWLAND,

1997).

38

Tabela 1.1.Tabela 1.1.Tabela 1.1.Tabela 1.1. Principais componentes dos grnulos dos neutrfilos.(a)

GrnulosGrnulosGrnulosGrnulos

primriosprimriosprimriosprimrios


ssssecundriosecundriosecundriosecundrios


tttterciriosercirioserciriosercirios

VesculasVesculasVesculasVesculas

secretriassecretriassecretriassecretrias

mieloperoxidase lactoferrina gelatinase albumina

defensinas lisozima lisozima tetranectina

lisozima histaminase acetiltrasferase citocromo b558

fosfatase cida colagenase 2microglobulina fosfatase alcalina

glucuronidase heparanase citocromo b558 CR1

esterase hCAP-18 CD11b CD11b

catepsinas citocromo b558 receptor para fMLP receptor para fMLP

elastase CD11b CD14

proteinase-3 receptores para CD16

sialidase TNF- DAF

-manosidase laminina

1-antitripsina vitronectina

CD63 fibronectina

CD68 fMLP

(a) Fontes: Borregaard e Cowland (1997); Gudmundsson e Agerberth (1999); Mollinedo,

Borregaard e Boxer (1999); Zago e Falco (2004). CD: cluster de diferenciao; CR:

receptor de complemento; DAF: fator acelerador de decaimento; fMLP: n-formil-metionil-

leucil-fenilalanina; hCAP-18: peptdeo catinico antimicrobiano 18 humano; TNF-: fator

de necrose tumoral tipo alfa.

O primeiro tipo de grnulo a ser liberado a vescula secretria. Durante

o processo de rolagem do neutrfilo sobre o endotlio, a membrana da vescula

secretria funde-se membrana plasmtica, levando ao aumento da expresso

da 2-integrina Mac-1 (2, CD11b/CD18) na membrana do neutrfilo, o que

contribui para a adeso firme deste clula endotelial (BORREGAARD et al.,

1990). Na seqncia, so liberados os grnulos secundrios e tercirios, que so

ricos em enzimas que degradam estruturas teciduais como laminina, colgeno,

39

proteoglicanas e fibronectina, facilitando o processo de migrao dos

neutrfilos para o local da inflamao. Dentre estas enzimas destacam-se as

metaloproteinases de matriz (MMP8, MMP9 e MMP25), colagenase e gelatinase.

Conforme a concentrao de agentes quimiotticos aumenta, os prximos a

serem liberados so os grnulos primrios, ricos em defensinas e MPO. Esta

ltima converte o H2O2 em potentes agentes antimicrobianos, como HOCl, HOBr

e HOI (HAMPTON; KETTLE; WINTERBOURN, 1998; FAURSCHOU;

BORREGAARD, 2003; NATHAN, 2006).

Alm da funo microbicida, as enzimas e os peptdeos contidos nos

grnulos de neutrfilos tambm desempenham uma variedade de funes

regulatrias em processos inflamatrios (GUDMUNDSSON; AGERBERTH, 1999;

LEVY, 2004; WIEDOW; MEYER-HOFFERT, 2005). Por exemplo, as

defensinas, pequenas protenas ricas em arginina e cistena, atuam como

fatores quimiotticos e estimuladores da liberao de IL-8 por clulas T,

contribuindo para o recrutamento clulas inflamatrias (YANG et al., 2000;

YANG; CHERTOV; OPPENHEIM, 2001). Essas protenas participam tambm na

fase de resoluo do processo inflamatrio, estimulando a mitognese de

fibroblastos para o reparo tecidual e a apoptose de clulas inflamatrias

(LEHRER; LICHTENSTEIN; GANZ, 1993; ANDREU; RIVAS, 1998).

A proteinase-3, contida nos grnulos primrios, converte os precursores

inativos de TNF-, IL-1 e IL-18 em suas formas ativas (ROBACHE-GALLEA

et al., 1995; SUGAWARA et al., 2001; WIEDOW; MEYER-HOFFERT, 2005).

Alm disso, essa enzima converte o hCAP-18 (peptdeo catinico

antimicrobiano 18 humano), armazenado como pr-forma nos grnulos

40

secundrios dos neutrfilos, em sua forma ativa, o peptdeo linear catinico LL-

37. Esse peptdeo, alm de antimicrobiano, tambm quimioatraente para

neutrfilos, moncitos e clulas T do sangue perifrico humano via interaes

com o receptor para n-fMLP (n-formil-metionil-leucil-fenilalanina),

demonstrou atividade angiognica e parece estar envolvido na cicatrizao de

leses (GUDMUNDSSON; AGERBERTH, 1999; YANG; CHERTOV; OPPENHEIM,

2001; SCOTT et al., 2002; KOCZULLA et al., 2003; LEVY, 2004).

A catepsina G parece cooperar com a trombina na ativao do receptor

tipo 4 ativado por protease (PAR-4), iniciando a agregao plaquetria

(SAMBRANO et al., 2000). A elastase cliva a pro-TGF- (fator de

transformao e crescimento tipo alfa) ligada membrana e libera a sua forma

ativa solvel, que por sua vez, liga-se ao EGFR (receptor para fator de

crescimento epidrmico), estimulando a proliferao celular de queratincitos

(MEYER-HOFFERT; WINGERTSZAHN; WIEDOW, 2004). Alm disso, a elastase

degrada o G-CSF (fator estimulante de colnia de granulcito), regulando a

granulopoiese, e se liga ao receptor de complemento (CR) do tipo 3 (CR3)

revertendo a adeso leucocitria (CAI; WRIGHT, 1996; EL OURIAGHLI, 2003).

A lactoferrina, por meio do seu domnio lactoferricina N-terminal,

aumenta a atividade fagoctica de neutrfilos, aparentemente via mecanismos

opsnicos, e tambm modula a liberao de citocinas, aumenta a liberao de

IL-6 e TNF- por clulas mononucleares de sangue perifrico e inibe a

liberao de IL-1 e IL-2. (ADAMIK et al., 1998; MIYAUCHI et al., 1998;

CACCAVO et al., 2002).

41

1.1.2.4. Fagocitose1.1.2.4. Fagocitose1.1.2.4. Fagocitose1.1.2.4. Fagocitose

Os fagcitos, considerados os principais componentes celulares do

sistema imune inato, desempenham um papel fundamental na defesa do

hospedeiro durante a resposta inflamatria aguda, em decorrncia da sua

capacidade de envolver e destruir uma variedade de patgenos que

ocasionalmente penetram nas barreiras fsicas do organismo (QUINN; GAUSS,

2004). A funo da fagocitose na defesa do hospedeiro foi descoberta por Elie

Metchnikoff no final do sculo dezenove, e est descrita em seu trabalho

publicado em 1883 (BABIOR, 2000a).

A fagocitose pode ser dividida em quatro etapas sucessivas: adeso

entre o neutrfilo e o antgeno, ingesto, desgranulao, digesto do antgeno

ingerido. A fagocitose de partculas, tais como microrganismos e

imunocomplexos, requer a reorganizao do citoesqueleto na regio da

membrana plasmtica que entra em contato com a partcula. A mobilizao dos

filamentos de F-actina nessa regio iniciada por sinais que surgem da

interao de receptores promotores de fagocitose na superfcie da clula com

ligantes na superfcie da partcula (ALLISON; DAVIES; PETRIS, 1971;

GREENBERG, 1995; ADEREN; UNDERHILL, 1999).

A adeso dos neutrfilos aos microrganismos facilitada quando os

ltimos esto recobertos por anticorpos, protenas do sistema complemento ou

outros fatores sricos para os quais o neutrfilo dispe de receptores

especficos, processo denominado opsonizao. Os receptores para opsoninas

melhor caracterizados so os receptores FcRs [receptores para a poro Fc

(fragmento cristalizvel) de imunoglobulina da classe G (IgG)] e os receptores

42

para os componentes C3b e C3bi do sistema complemento, CR1 e CR3,

respectivamente. Os neutrfilos podem tambm interagir diretamente com os

microrganismos, por meio do reconhecimento de determinantes antignicos

expressos na superfcie desses alvos. (GREENBERG, 1995; BROWN, 1995;

LFGREN et al., 1999; TJELLE; LOVDAL; BERG, 2000).

Quando o neutrfilo adere bactria ou outros detritos, os pseudpodos

os envolvem e englobam em vacolos delimitados pelo segmento de membrana

invaginado, denominado fagossomas. O contedo dos grnulos dos neutrfilos

pode ser descarregado no interior dos fagossomas ou para o meio extracelular

(exocitose). Em conjunto com esse processo, ocorre a gerao de EROs, com

grande potencial microbicida (HAMPTON; KETTLE; WINTERBOURN, 1998;

FAURSCHOU; BORREGAARD, 2003).

Dois tipos de receptores FcR so expressos em neutrfilos humanos,

FcRIIA (CD32) e a forma de FcRIII ligada por uma ncora de

glicosilfosfatidilinositol (CD16, FcRIIIB) (LFGREN et al., 1999; RAVETCH;

BOLLAND, 2001; SONDERMANN; KAISER; JACOB, 2001). Embora no possua a

regio transmembrana e a citoplasmtica, a ativao de FcRIIIB em neutrfilos

induz a liberao intracelular de clcio, polimerizao de F-actina e a produo

de EROs (RAVETCH; BOLLAND, 2001). A ligao de FcRIIA leva fosforilao

de tirosinas de diversas protenas, incluindo a fosfolipase C1 e p72syk. Esta

ltima essencial para a fagocitose mediada por Fc em macrfagos e moncitos

(DARON, 1997; LFGREN et al., 1999).

Acreditava-se que a interao devida ao CR no levava ingesto do

eritrcito opsonizado, e que somente a interao da molcula de IgG ligada

43

partcula com o seu stio receptor no neutrfilo era necessria para induzir o

mecanismo de fagocitose (MANTOVANI, 1975). Hoje sabe-se que existem

vrios tipos de receptores CR expressos na membrana dos neutrfilos, com

funes distintas, sendo CR1 e CR3 os mais relevantes quando se refere

fagocitose (SENGELV, 1995).

Os receptores CR3 pertencem famlia das 2 integrinas, consistindo de

3 heterodmeros no-covalentemente ligados (CD11a/CD18, CD11b/CD18,

CD11c/CD18). Todas essas integrinas so expressas em neutrfilos, sendo

CD11b/CD18 a mais abundante (LFGREN et al., 1999). A ativao especfica

de CR3 induz atividade da fosfolipase D, polimerizao de actina e produo

intracelular de EROs. O CR3 interage com FcRIII, acentuando a sinalizao

interna mediada por esses receptores (ZHOU; BROWN, 1994; SENGELV,

1995).

Os receptores CR1 presentes em neutrfilos so responsveis pela

aderncia de partculas revestidas por C3b, sem iniciar a fagocitose. Por outro

lado, a ativao simultnea de CR1 e FcR, por partculas revestidas por C3b e

IgG, leva ao aumento da liberao intracelular de clcio e da fagocitose, quando

comparada a esses eventos mediados apenas por FcR (ERNST; ROSALES;

ZIMMERLI, 1995; KIMBERLY; SALMON; EDBERG, 1995). De modo semelhante,

CR1 e CR3 cooperam no englobamento de eritrcitos revestidos por C3b, onde

CR1 medeia a adeso inicial e CR3 responsvel pela sinalizao celular que

leva fagocitose (SENGELV, 1995).

A ativao de neutrfilos via receptores FcR, em cooperao ou no com

CR promove ainda a desgranulao, a ativao do metabolismo do cido

44

araquidnico, produo de mediadores lipdicos, como o leucotrieno B4, induo

da sntese e liberao de citocinas, a ativao do metabolismo oxidativo, e

aumento da expresso de enzimas envolvidas em processos inflamatrios, como

a ciclooxigenase e a xido ntrico sintase (LUCISANO; MANTOVANI, 1984,

1988; DARON, 1997; ALONSO et al., 1998; MARZOCCHI-MACHADO et al.,

2002; JANCAR; CRESPO, 2005).

1.1.2.5. Produo de espcies reativas de1.1.2.5. Produo de espcies reativas de1.1.2.5. Produo de espcies reativas de1.1.2.5. Produo de espcies reativas de oxignio (EROs) oxignio (EROs) oxignio (EROs) oxignio (EROs)

O processo de fagocitose acompanhado de um conjunto de alteraes

metablicas nas clulas fagocticas, denominado "burst", surto ou exploso

respiratria, metablica ou oxidativa. Essa funo celular caracterizada pelo

aumento do consumo de oxignio e de trifosfato de adenosina (ATP), do

aumento da oxidao da glicose pela via da hexose monofosfato, do transporte

de eltrons e da produo de grande quantidade de EROs (CHEUNG;

ARCHIBALD; ROBINSON, 1983; JOHNSON; VARANI; SMOLEN, 1992; ROSEN et

al., 1995; BABIOR, 1999). Essas EROs so potentes agentes oxidantes que

atuam em conjunto com os constituintes dos grnulos para matar e digerir os

antgenos fagocitados.

A exploso respiratria pode ser desencadeada quando as clulas

fagocticas so estimuladas por ionforos, complexos imunes, partculas

antignicas opsonizadas (zimosan, ltex), acetato de miristoilforbol (PMA) e por

alguns mediadores do processo inflamatrio, como cido araquidnico, TNF-,

n-fMLP, C5a, leucotrieno tipo B4 (LTB4) (BROWN, 1995; SELVACITI et al.,

45

2006). Esse processo inicia-se com a formao do complexo da NADPH

oxidase, que catalisa a produo de radicais superxido (O2-) a partir do O2

dissolvido no meio, sendo, portanto caracterizado pelo aumento do consumo de

O2. O radical superxido produzido ento convertido a H2O2, que, por sua vez,

gera outras EROs (HOCl, 1O2, HO), por meio de reaes qumicas e enzimticas

(BABIOR, 1999). As clulas fagocticas geram as EROs utilizando basicamente

quatro grupos de enzimas: o complexo da NADPH oxidase, a superxido

dismutase (SOD), a MPO e as xido ntrico sintases NOS (HALLIWELL, 1999;

BABIOR, 2000a) (Figura 1.2).

O aumento do consumo de O2 pelos neutrfilos durante a fagocitose foi

descrito pela primeira vez por Baldridge e Gerard (1933) (BABIOR, 2000a).

Investigaes dos mecanismos bioqumicos envolvidos na fagocitose levaram s

observaes de que o aumento do consumo de O2 e de glicose ocorria na

presena de inibidores da respirao mitocondrial, indicando que este processo

no era devido ao requerimento de energia para o processo de fagocitose

(SBARRA; KARNOVSKY, 1959). Em 1964, Rossi e Zatti demonstraram que o

consumo de O2 durante a exploso respiratria estava relacionado ativao de

uma NADPH oxidase, e Iyer et al. (1961) e Klebanoff (apud BABIOR 2000a)

demonstraram que o O2 extra consumido era utilizado para a produo de EROs.

46

Figura 1.2.Figura 1.2.Figura 1.2.Figura 1.2. Representao simplificada das reaes que ocorrem durante o metaboismo

oxidativo dos neutrfilos. (1): (1): (1): (1): O nion superxido (O2-) produzido pelo complexo

enzimtico da NADPH oxidase. (2):(2):(2):(2): A dismutao do O2- pela SOD produz o H2O2. (3):(3):(3):(3): A

MPO proveniente dos grnulos citoplasmticos catalisa a produo de HOCl e outras

espcies halogenadas a partir do H2O2. (4):(4):(4):(4): As EROs produzidas pelas etapas 1, 2 e 3

so convertidas a outras espcies oxidantes, por meio de diversas reaes qumicas.

(5):(5):(5):(5): As espcies oxidantes e os constituintes dos grnulos que extravasam para o

citosol e/ou para o meio extracelular so inativadas pelos componentes do sistema de

defesa celular e tecidual (alguns deles esto representados em verde). Esquema

adaptado de Klein (1990), Weiss (1989) e Halliwell (1999). Abreviaturas: CATAbreviaturas: CATAbreviaturas: CATAbreviaturas: CAT: catalase;

GPO:GPO:GPO:GPO: glutationa peroxidase; GSH:GSH:GSH:GSH: glutationa reduzida; GSSG:GSSG:GSSG:GSSG: glutationa oxidada; MPOMPOMPOMPO:

mieloperoxidase; SLPI:SLPI:SLPI:SLPI: inibidor de protease secretria de leuccitos; SOD:SOD:SOD:SOD: superxido

dismutase.

FAGOSSOMO

DESGRANULAO

H2O

O2-

SOD

CAT

GPO H2O2 H2O

GSH GSSG

H2O2

Fe2+

HO ONOO-

NO.

SOD

NADPH

NADP+ O2-

O2

HOCl MPO

Cl-

Fe3+

-aminocidos

cloraminas

O2-

NADPH Oxidase

H2O2

Cl- CAT

HOCl

H2O

GSH

GSSG

GPO

MPO

MPO, elastase,

peptdeos, etc.

SLPI

2 - macroglobulina

1 - antitripsina

-caroteno cido ascrbico

ubiquinona

ferritina

CITOSOL

TECIDO

MPO, elastase,

peptdeos, etc.

2222 3333

4444

4444 4444 4444

5555

5555

5555

5555

47

A NADPH oxidase pode ser encontrada em clulas endoteliais (BABIOR,

2000b), em clulas renais (SHIOSE et al., 2001), em fagcitos profissionais

(moncitos, macrfagos, neutrfilos) e em linfcitos B (BABIOR, 1999). O

complexo da NADPH oxidase de fagcitos profissionais composto por cinco

componentes principais: p40phox, p47phox, p67phox, p22phox e gp91 phox (phox =

phagocyte oxidase). Os trs primeiros existem no citosol na forma de um

complexo e os outros dois formam o citocromo b558, localizado na membrana de

vesculas secretrias e de grnulos especficos. As subunidades p47phox e

p67phox so tambm conhecidas como fator citoslico de neutrfilos tipo 1 e 2,

(NCF-1, NCF-2), respectivamente. A atividade da NADPH oxidase depende de

ainda da presena de uma GTPase (Rac 1-2) (BABIOR, 1999; BABIOR, 2000a;

VIGNAIS, 2002; SHEPPARD et al., 2005; SELVACITI et al., 2006).

Seguchi e Kobayashi (2002) descreveram, baseados em anlises de

microscopia eletrnica, que aps estimulao de neutrfilos com n-fMLP, o O2----

gerado inicialmente dentro de um compartimento intracelular especializado

contendo fosfatase alcalina, e no na membrana plasmtica. De acordo com

esses autores, os grnulos geradores de O2---- posteriormente se ligam

membrana plasmtica ou fundem-se entre si, formando estruturas maiores que

eventualmente se associam membrana plasmtica, levando liberao

extracelular de O2----, aumentando a probabilidade de significante oxidao

extrafagossomal.... Karlsson e Dahlgren (2002) sugerem que a ativao da

NADPH ocorre tambm nas membranas dos grnulos, e que ocorre a fuso

intra-citoplasmtica desses grnulos produtores de O2---- com outros tipos de

48

grnulos dos neutrfilos, levando formao de grnulos geradores de outras

EROs, que ento se fundem com a membrana plasmtica ou com o fagossomo.

O papel da NADPH oxidase na defesa do organismo clinicamente

comprovado, uma vez que defeitos nos diferentes genes que codificam suas

subunidades resultam em uma patologia rara conhecida como doena

granulomatosa crnica. Esta doena gentica caracterizada pela reduo da

expectativa de vida decorrente de uma alta incidncia do organismo contra

infeces provocadas por vrias classes de microrganismos, como bactrias e

fungos (WIENTJES; SEGAL, 1995; HEYWORTH; CROSS; CURNUTTE, 2003;

NATHAN, 2006).

Outra enzima importante envolvida no metabolismo oxidativo de

neutrfilos a MPO. Ela catalisa a oxidao de ions haleto (Cl----, Br----, I----) e

tiocianato (SCN----) para cidos hipo-halosos, utilizando H2O2 como substrato. O

HOCl o principal produto, devido elevada concentrao de Cl- nos fluidos

corporais. Alm disso, o HOCl contribui para a produo de radicais HO e de

oxignio singlete (1O2) (MALECH; GALLIN, 1987; McPHAIL; STRUM; LEONE,

1992; ROSEN et al., 1995; BABIOR, 1999; DAHLGREN; KARLSSON, 1999;

PULLAR et al., 2000).

Os cidos hipo-halosos, ou halognios oxidados, podem, por sua vez

reagir com diversas aminas encontradas no sistema biolgico, especialmente

aminocidos e protenas, produzindo mono- e di-cloraminas. As cloraminas

podem ter efeito txico para os microrganismos e para as clulas do

hospedeiro, cuja intensidade depende da sua estrutura e capacidade de

atravessar membranas. As cloraminas derivadas de -aminocidos so

49

susceptveis degradao, gerando aldedos que por si s so txicos (PULLAR

et al., 2000; BABIOR, 2000a).

Alm da conhecida funo microbicida, h vrias evidncias de que os

oxidantes derivados de neutrfilos tambm desempenham outras funes. O

H2O2, HOCl, e algumas cloraminas so pequenas molculas no carregadas que

podem cruzar as membranas e difundir do fagossoma para o espao

extracelular. Alvos potenciais incluem quaisquer clulas nas imediaes dos

neutrfilos ativados, particularmente aquelas s quais eles esto aderidos, assim

como os prprios neutrfilos ativados (HAMPTON; WINTERBOURN, 2002;

NATHAN, 2006).

Por exemplo, as EROs tm sido descritas como mediadores essenciais da

sinalizao para muitos receptores de citocinas e hormnios, tais como aqueles

para insulina, fatores de crescimento derivados de plaquetas, fatores de

crescimento de fibroblastos, angiotensina e TNF- (SWAIN; ROHN; QUINN,

2002; NATHAN, 2003). O mecanismo molecular mais estudado de sinalizao

mediada por EROs a inativao temporria de tirosino fosfatases por oxidao

reversvel de seus grupos sulfidrilas de cistena ativos (HAMPTON;

WINTERBOURN, 2002; OWUOR; KONG, 2002).

As EROs podem tambm contribuir para a liberao de proteases da

matriz de peptidoglicanos nos grnulos, ou seja, ajudam na mobilizao de

proteases de neutrfilos (NATHAN, 2006). Os oxidantes derivados da NADPH

oxidase tm sido propostos como reguladores da apoptose espontnea de

neutrfilos, e como desencadeadores da exposio de fosfatidilserina e

50

eliminao de neutrfilos ativados (KASAHARA et al., 1997; FADEEL et al.,

1998).

O HOCl pode desempenhar um papel fundamental na patofisiologia de

doenas inflamatrias, atuando como mensageiro secundrio na transduo

intracelular de sinais, e tambm induz a produo da citocina TNF- em clulas

mononucleares por vias dependentes de tirosina-quinase (SCHIEVEN; DE FEX;

STEPHENSON, 2002). Alm disso, tem sido demonstrado que a MPO, enzima

produtora do HOCl, est envolvida em um grande nmero de processos

inflamatrios, incluindo ativao e inativao de protenas secretadas pelos

neutrfilos, inativao de toxinas e de mediadores inflamatrios (FORMAN;

THOMAS, 1986; HAMPTON; KETTLE; WINTERBOURN, 1998;

WINTERBOURN; KETTLE, 2000).

1.2. Doenas mediadas por imunocomplexos (ICs)1.2. Doenas mediadas por imunocomplexos (ICs)1.2. Doenas mediadas por imunocomplexos (ICs)1.2. Doenas mediadas por imunocomplexos (ICs)

1.2.1. Asp1.2.1. Asp1.2.1. Asp1.2.1. Aspectos fisiopatolgicosectos fisiopatolgicosectos fisiopatolgicosectos fisiopatolgicos

A interao de substncias estranhas e microrganismos com anticorpos

especficos leva formao de complexos antgeno-anticorpo, os quais so

tambm conhecidos como complexos imunes ou imunocomplexos (ICs). Os

antgenos que compem esses ICs so geralmente provenientes de alimentos,

medicamentos e componentes endgenos (auto-antgenos) (STEENSGAARD;

JOHANSEN, 1980). Este processo constitui parte essencial dos mecanismos de

defesa imune do organismo, sendo geralmente seguido por reaes secundrias,

como ativao do sistema complemento, que capacitam o organismo a

51

neutralizar e eliminar os antgenos citados (SCHIFFERLY; TAYLOR, 1989;

ALONSO et al., 1998).

Em indivduos saudveis, pequenas quantidades de ICs circulantes podem

ser encontrados no soro. Esses ICs circulantes inicialmente levam ao aumento

da fagocitose e remoo do antgeno por macrfago no fgado e no bao. Alm

disso, hemcias que tem receptores CR1/CR3 podem se ligar aos ICs

opsonizados com protenas do sistema complemento e transport-los ao fgado,

onde esses ICs so removidos pelas clulas de Kupfer (HEBERT, 1991;

PASCUAL; SCHIFFERLI, 1992). medida que so formadas quantidades

maiores de ICs, alguns deles se depositam nos leitos vasculares (FERNNDEZ;

JANCAR; CRESPO, 2004).

Vrios fatores determinam se a formao de ICs levar deposio

tecidual e doena. O tamanho dos complexos parece ser importante, sendo que

os menores circulam por perodos maiores e se ligam com menor afinidade s

clulas fagocticas, o que aumenta a probabilidade de deposio nos tecidos

(JARVIS et al., 1995, 1999). Um segundo fator a disfuno do sistema

fagoctico mononuclear, que aumenta a possibilidade de persistncia dos ICs na

circulao. Pode-se citar ainda a capacidade dos ICs de ativar o sistema

complemento e o processo de fagocitose (MARZOCCHI-MACHADO et al.,

1999; MICHELIN et al., 2002; ALVES et al., 2003). Alm disso, a sobrecarga do

sistema fagoctico com grandes quantidades de ICs tambm compromete sua

habilidade de mediar a eliminao dos mesmos da circulao (DAVIES, 1995).

Os anticorpos presentes nos ICs depositados ativam a cascata do sistema

complemento, que leva liberao de fragmentos biologicamente ativos (C3a,

52

C5a). Esses fragmentos desencadeiam uma resposta inflamatria, com o

recrutamento e ativao de leuccitos, predominantemente os neutrfilos, nos

locais de deposio dos ICs (WEDMORE; WILLIAMS, 1981). Os ICs tambm

podem ativar clulas inflamatrias e mastcitos a secretar citocinas e

mediadores vasoativos, o que causa aumento da adeso de leuccitos ao

endotlio, aumento da permeabilidade vascular e aumento da deposio de ICs

nas paredes dos vasos por aumento dos espaos interendoteliais (ALONSO et

al., 1998; JANCAR; CRESPO, 2005).

Os neutrfilos se ligam aos anticorpos dos ICs por meio de seus

receptores FcR, e s opsoninas do sistema complemento por meio de

receptores CR. Essas clulas liberam enzimas lisosomais e metablitos txicos

de oxignio enquanto fagocitam os ICs, e causando a destruio da parede dos

vasos com microhemorragias associadas nos tecidos (WEISS; WARD, 1982;

FERNNDEZ; JANCAR; CRESPO, 2004). As clulas endoteliais incham e

proliferam, as plaquetas se agregam no lmen, e a fibrina depositada dentro e

em volta do vaso, levando ativao da cascata de coagulao. Em fases

posteriores da leso, ocorre a infiltrao de macrfagos e linfcitos (MARRACK;

KAPPLER; KOTZIN, 2001).

De modo semelhante a outros tipos de inflamao, as reaes mediadas

por ICs podem ser benficas ou prejudiciais. Este tipo de inflamao

freqentemente ocorre em conjunto com outros fenmenos mediados por

anticorpos, como opsonizao, durante respostas imunes normais. Por outro

lado, o mecanismo primrio envolvido em vrios tipos de hipersensibilidade. A

reao de Arthus, por exemplo, pode freqentemente ser observada em locais

53

de inoculao subcutnea de antgenos para tratamento de alergia, e tambm

ocorre como resposta a picadas de insetos ou medicamentos injetados. Essas

reaes so geralmente limitadas a edema e infiltrao celular moderada, com

leso vascular de pequena intensidade (SYLVESTRE; RAVETCH, 1994; RAJAN,

2003).

Os locais mais favorveis para deposio dos ICs so os pequenos vasos,

rins e articulaes, uma vez que os capilares dos glomrulos renais e da sinvia

das articulaes so vasos nos quais o plasma ultrafiltrado (para a formao

da urina e do lquido sinovial, respectivamente) atravessando a parede do

capilar em presso hidrosttica elevada. Por esta razo, as manifestaes

clnicas e patolgicas das doenas mediadas por ICs, tambm chamadas de

reaes de hipersensibilidade do tipo III, so vasculite, nefrite e artrite

(SCHIFFERLI; TAYLOR, 1989; JANCAR; CRESPO, 2005).

As doenas associadas com a deposio tecidual de ICs incluem

infeces virais (hepatite B, citomegalovrus) e bacterianas (meningococcus,

streptococcus, staphylococcus); vrias doenas inflamatrias com componentes

auto-imunes, como a artrite reumatide, sndrome de Sjgren, lupus

eritematoso sistmico; reaes de hipersensibilidade a drogas, como

antibiticos, antiinflamatrios no esteroidais e antidepressivos (JANCAR;

CRESPO, 2005).

54

1.2.2. Participao dos neutrfilos1.2.2. Participao dos neutrfilos1.2.2. Participao dos neutrfilos1.2.2. Participao dos neutrfilos

A presena de receptores de membrana das classes FcR e CR nos

neutrfilos confere a essas clulas a propriedade de interagir com ICs e

fagocit-los (ERNST; ROSALES; ZIMMERLI, 1995; LFGREN et al., 1999). Nas

doenas mediadas por ICs, onde geralmente h intensa formao e deposio de

ICs em diversos rgos, como rins e articulaes, as clulas fagocticas no

conseguem englobar a grande massa de IC depositada. Este processo leva

"fagocitose frustrada", onde ocorre liberao macia das diversas proteases dos

grnulos dos neutrfilos e das EROs derivadas do metabolismo oxidativo para o

meio extracelular (SCHIFFERLI; TAYLOR, 1989; WEISS, 1989).

O organismo se protege das leses pelas enzimas lticas liberadas pelos

neutrfilos atravs das anti-proteinases, como a 1-anti-proteinase presente

em abundncia nos pulmes (MALECH; GALLIN, 1987; NATHAN, 2006), e das

EROs atravs de enzimas (SOD, catalase, glutationa peroxidase, DT diaforase),

de protenas quelantes de ferro (lactoferrina, ferritina), e de compostos

antioxidantes (vitamina E, cido ascrbico, -caroteno, cido rico, glutationa,

ubiquinona, ceruloplasmina) (HALLIWELL, 1990; DAVIES, 2000). Os

componentes do sistema de defesa antioxidante podem ser encontrados nos

fluidos biolgicos, nos tecidos e em diferentes compartimentos celulares. O

organismo conta ainda com sistemas de reparo e de remoo de constituintes

celulares danificados (DAVIES, 2000).

Em certas condies como intensa atividade fagoctica e inflamaes

crnicas pode haver aumento da produo de oxidantes e/ou depleo das

defesas antioxidantes, de modo que os mecanismos de defesa so superados e

55

a leso tecidual ocorre. Este desequilbrio conhecido como "estresse

oxidativo" (HALLIWELL, 1990; KEHRER, 1993; DAVIES, 2000; BABIOR,

2000a).

Alm disso, as EROs inativam pelo menos trs das principais anti-

proteases teciduais [1-antitripsina, 2-macroglobulina, SLPI (inibidor de

protease secretria de leuccitos)], favorecendo a atuao deletria das

proteases liberadas pelos neutrfilos sobre os tecidos (WEISS, 1989; NATHAN,

2006). Recentes descobertas indicam que as EROs desempenham ainda um

papel-chave na modulao da ativao de neutrfilos, atravs da regulao

positiva das respostas celulares mediadas por receptores FcR, favorecendo a

amplificao da leso tecidual (PRICOP; SALMON, 2002).

Alm das EROs e das enzimas proteolticas, os peptdeos e protenas

antimicrobianos produzidos por neutrfilos, particularmente a elastase,

catepsina G, proteinase-3, azurocidina e a protena promotora de

permeabilidade bacteriana (BPI), tambm tm sido descritos como alvos de

auto-anticorpos em uma variedade de doenas auto-imunes. A azurocidina e a

proteinase-3 so alvos de anticorpos citoplasmticos anti-neutrfilos (ANCA)

em pacientes com vasculites sistmicas, incluindo a granulomatose de Wegner

(ZHAO; LOCKWOOD, 1996; PENDERGRAFT et al., 2004). Pacientes com fibrose

cstica, doena inflamatria intestinal, vasculite geralmente desenvolvem ANCA

contra BPI. A presena de BPI-ANCA em tais pacientes associada com

elevada atividade de doena inflamatria e leso em rgos (SCHULTZ et al.,

2001; HEERINGA; HUUGEN; TERVAERT, 2005).

56

1.3. Cumarinas1.3. Cumarinas1.3. Cumarinas1.3. Cumarinas

1.3.1. Biognese e ocorrncia 1.3.1. Biognese e ocorrncia 1.3.1. Biognese e ocorrncia 1.3.1. Biognese e ocorrncia

As cumarinas constituem uma classe de metablitos secundrios

produzidos principalmente por plantas, encontrados em diferentes famlias de

Angiospermae como Apiaceae, Rutaceae e Asteraceae (GRAY; WATERMAN,

1978; MURRAY, 1989; RIBEIRO; KAPLAN, 2002). Estruturalmente, as

cumarinas so lactonas do cido orto-hidroxicinmico (2H-1-benzopiran-2-

onas), sendo que a Cumarina (1,2-benzopirona) a representante mais simples

dos compostos dessa classe (GRAY; WATERMAN, 1978) (Figura 1.3).

Figura 1.3.Figura 1.3.Figura 1.3.Figura 1.3. Ncleo fundamental das cumarinas. (KUSTER; ROCHA, 2004).

A palavra cumarina originria do caribenho cumaru, nome popular de

Dipteryx odorata (Aubl.) Willd., Fabaceae. O cumaru, tambm conhecido por

fava-tonka, encontrado no norte do Brasil e suas sementes contm grande

quantidade de cumarina, em torno de 1 a 3%. A maioria das cumarinas

encontradas em plantas derivada biogeneticamente da via metablica do cido

chiqumico (KUSTER; ROCHA, 2004) (Figura 1.4).

As cumarinas simples so encontradas com maior freqncia, enquanto

que as cumarinas com estruturas qumicas mais complexas, como as

furanocumarinas, piranocumarinas, lignocumarinas, bis-cumarinas e tris-

OO

2

36

7

45

8O

O

2

36

7

45

8

57

cumarinas ocorrem em poucas famlias, notadamente as mais primitivas

(RIBEIRO; KAPLAN, 2002; KUSTER; ROCHA, 2004). Alguns derivados de

cumarinas so encontrados em microrganismos, como os agentes

antimicrobianos novobiocina, clorobicina e coumermicina A, produzidos por

Streptomyces spp. (KAWASE et al., 2001), e as aflatoxinas, produzidas por

Aspergillus spp. (PALMGREN; CIEGLER, 1983 apud HOULT; PAY, 1996).

Figura 1.4.Figura 1.4.Figura 1.4.Figura 1.4. Esquema simplificado das vias metablicas envolvidas na biossntese de

cumarinas e flavonides em plantas. CoA: coenzima A. Adaptado de Santos (2004).

glicose

cido chiqumico

fenilalanina

cido cinmico

cumarinas

cido p-hidroxicinmico

acetil-CoA

malonil-CoA

4-cumaroil-CoA

chalconas

flavonides

58

1.3.2. Atividades biolgicas1.3.2. Atividades biolgicas1.3.2. Atividades biolgicas1.3.2. Atividades biolgicas

A Cumarina tem odor adocicado, e comercialmente utilizada como

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