UNIVERSIDADE DE PASSO FUNDO INSTITUTO DE CIÊNCIAS...

UNIVERSIDADE DE PASSO FUNDO INSTITUTO DE CIÊNCIAS BIOLÓGICAS

PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM CIÊNCIAS AMBIENTAIS

Citogenética de espécies de anfíbios (Anura) das Bacias Hidrográficas Taquari-Antas e Apauê Inhandava, RS e atividade antimicrobiana da

secreção da pele de Rhinella henseli (Anura, Bufonidae)

Natália Cristine Ficanha

Passo Fundo

2018

Natália Cristine Ficanha

Citogenética de espécies de anfíbios (Anura) das Bacias Hidrográficas Taquari-Antas e Apauê Inhandava, RS e atividade antimicrobiana da secreção da pele de Rhinella

henseli (Anura, Bufonidae)

Dissertação apresentada ao Programa de Pós-Graduação em Ciências Ambientais do Instituto de Ciências Biológicas da Universidade de Passo Fundo, como requisito parcial para obtenção de título de Mestre em Ciências Ambientais.

Orientadora:

Profa. Dra. Carmen Sílvia Busin

Coorientadora:

Profa. Dra. Andréa Michel Sobottka

Passo Fundo

2018

ATA DE DEFESA DE DISSERTAÇÃO

DEDICATÓRIA

À minha família

AGRADECIMENTOS

A todos aqueles que, de alguma forma contribuíram para a realização desse

trabalho, o meu imenso muito obrigada! Em especial, gostaria de agradecer:

- À minha orientadora e amiga, professora Dra. Carmen Sílvia Busin, pela

oportunidade que me ofereceu de encarar essa etapa trabalhando nesta área, para mim

tão desafiadora, e ao mesmo tempo encantadora. Obrigada pelo exemplo de grande

profissional que és, sempre trabalhando com seriedade, e muita competência. Serei

sempre grata pela confiança depositada, pelas tantas conversas, orientações, cafés, e

principalmente pela paciência que teve comigo no decorrer desses dois anos.

- Às professoras Dras. Andréa Michel Sobottka e Fabiana Tonial, por

embarcarem conosco no desafio de trabalhar com anfíbios, bem como por todos os

momentos de aprendizado.

- Às amigas e colegas de laboratório Audren Piassetta, Jessica de Camargo

Favaretto, Julia Vanini, Sara Schmitz Nhoato, Mariana Doering e Ana Vitória Lucion

Didoné, por toda a ajuda prestada, e por toda a dedicação que sempre mostraram. Sou

muito grata de ter dividido com vocês essa vivência. Obrigada pelas risadas, pelas

conversas sérias e produtivas, pelos desabafos e pelo apoio de sempre.

- À toda a equipe do Laboratório de Herpetologia, em especial a professora Dra.

Noeli Zanella, aos estagiários, ao colega Rodrigo Barbosa Fontana e a colega e grande

amiga Juciela Cicheleiro, que auxiliaram com as coletas e identificação dos animais

aqui analisados. Também ao nosso “motorista particular” Élinton Rezende, o qual não

mediu esforços para nos auxiliar em qualquer situação.

- Agradeço também a todo corpo docente do Programa de Pós-Graduação em

Ciências Ambientais, pelos ensinamentos prestados.

- Aos funcionários da secretaria do Instituto de Ciências Biológicas,

especialmente à secretária Dionice Ozelame, por toda ajuda prestada, sempre com muita

dedicação, competência e eficiência, além de todo o carinho que sempre teve por nós.

Também à funcionária Sirlei pelo empréstimo frequente de materiais.

- Aos colegas de turma, pela amizade, em especial à minha grande amiga

Vanessa por todo o apoio nas horas felizes, e também nas mais difíceis e angustiantes.

Com certeza uma amizade que levarei para a vida toda. Também agradeço em especial

aos amigos Luís Eduardo, Thuani, Felipe, e a grande amiga Juciela.

- À minha irmã Nicoli, por toda ajuda prestada nos finais de semana em que

passávamos medindo cromossomos, e também por toda a amizade e carinho.

- Ao meu namorado Fernando, que mais do que namorado, foi meu melhor

amigo, ajudante, psicólogo, motorista, cozinheiro, entre tantas outras funções. Só tenho

a agradecer por todo o amor, carinho e compreensão que teve comigo.

- À minha família, principalmente aos meus pais Carlos e Silvane, que muitas

vezes em meio a tantas dificuldades, se mantiveram firmes, para que eu também

pudesse me manter. Sou eternamente grata pelo apoio e incentivo.

- Agradeço também a CAPES, pelo apoio fincaneiro prestado para a realização

desse trabalho.

E ao

EPÍGRAFE

“Um coelho branco é tirado de dentro de uma cartola. E porque se trata de um coelho muito grande, este

truque leva bilhões de anos para acontecer. Todas as crianças nascem bem na ponta dos finos pêlos do coelho.

Por isso elas se encantam com esse truque de mágica! Mas à medida que envelhecem, elas vão afundando

lentamente para a base dos pelos do coelho. E ficam por lá. Tão confortáveis que jamais ousarão subir de volta

para a ponta dos pêlos, Somente os filósofos ousam retomar essa jornada perigosa rumo aos limites da

linguagem e da existência. Alguns deles escorregam e despencam no caminho, mas outros se agarram com

força aos pêlos do coelho e lá do alto gritam para serem ouvidos pelos que ficaram ali embaixo, acomodados na

pelagem macia do coelho, refestelando-se com boa comida e bebida.

— Senhoras e senhores — gritam eles —, estamos flutuando pelo espaço!

Mas ninguém ali presta atenção no que gritam os filósofos.

— Puxa, mas que gente mais barulhenta! — dizem.

E continuam a conversar: será que você poderia me passar a manteiga? Qual a cotação das ações hoje? Qual o

preço do tomate? Você ouviu dizer que a Lady Di está grávida de novo?”

Jostein Gaarder - O Mundo de Sofia .

“Os seres humanos podem ansiar pela certeza absoluta, podem aspirar e alcançá-la; podem fingir que a

atingiram. Mas a história da ciência – de longe o mais bem-sucedido conhecimento acessível aos humanos –

ensina que o máximo que podemos esperar é um aperfeiçoamento sucessivo de nosso entendimento, um

aprendizado por meio dos nossos erros, uma abordagem assintótica do Universo, mas com a condição de que a

certeza absoluta sempre nos escapará.”

Carl Sagan – O mundo assombrado pelos demônios.

RESUMO

A grande uniformidade morfológica dos anuros os torna o grupo mais facilmente diagnosticável entre os vertebrados e, em função dessa pouca diversificação de formas, os estudos baseados apenas em morfologia são, muitas vezes, de difícil interpretação taxonômica. Atualmente outras abordagens estão sendo utilizadas na identificação destes animais, como por exemplo, a vocalização, o sequenciamento de genes e o estudo dos cromossomos que, somados aos estudos de morfologia, facilitam a correta identificação das espécies. Nas Bacias Hidrográficas Taquari-Antas e Apauê Inhandava, RS, os trabalhos sobre a anurofauna local são ainda incipientes e quando eles acontecem, são decorrentes, na sua maioria, de análises de morfologia externa. Outro aspecto relevante no grupo dos anuros se relaciona à atividade antimicrobiana das secreções produzidas em sua pele. Esta tem sido uma área de grande interesse farmacológico, pois pode representar uma nova perspectiva terapêutica. Tratando-se de uma proposta que abrange duas diferentes abordagens, objetivamos: (1) caracterizar citogeneticamente as espécies ocorrentes nas duas bacias, comparando os resultados entre si e com os de outros locais de ocorrência, verificando a correta identificação das espécies e (2), avaliar a atividade antimicrobiana das secreções da pele de Rhinella henseli, testando sua ação sobre as bactérias Staphylococcus aureus, Escherichia coli e o fungo Candida albicans. Neste estudo, foram caracterizadas citogeneticamente, por meio da coloração convencional (Giemsa) e diferencial dos cromossomos (Bandamento C e AgNOR) as espécies: Aplastodiscus perviridis, Leptodactylus latrans, Leptodactylus mystacinus, Physalaemus cuvieri, Physalaemus aff. gracilis, Boana faber, Leptodactylus plaumanni, Odontophrynus americanus, Melanophryniscus devincenzii, Rhinella henseli e Rhinella icterica. Para a análise da atividade antimicrobiana, a obtenção da secreção de R. henseli foi por meio de injeção subcutânea de epinefrina, testada pela técnica de bioautografia. Nossos resultados verificaram que as espécies que foram comparadas citogeneticamente entre si e com as de outros locais de ocorrência, por meio de estudos já realizados por outros autores, não apresentaram diferenças relevantes nas características cromossômicas espécie-específicas das populações, não sendo verificada nenhuma evidência de alteração citogenética, concluindo assim, que as bacias hidrográficas não representaram, até o momento, barreiras geográficas capazes de isolar as populações. Através do estudo antimicrobiano, verificamos que em R. henseli a secreção extraída da sua pele apresenta atividade antimicrobiana contra a levedura C. albicans, sendo este o primeiro estudo da ação antimicrobiana neste bufonídeo.

Palavras-chave: 1. Anurofauna. 2. Análises cromossômicas. 3. Identificação de espécies. . 4. Ação antimicrobiana. 5. Ação antifúngica.

Aç

ABSTRACT

The great morphological uniformity of the anurans makes them the most easily diagnosable among it may represent a new therapeutic perspective. The objective of this proposal is to: (1) characterize the cygenogenetic species in the two basins, comparing the results with each other and with those of other sites of occurrence, verifying the correct identification of the species and (2), to evaluate the antimicrobial activity of Rhinella henseli skin secretions, testing its action on the bacteria Staphylococcus aureus, Escherichia coli and the fungus Candida albicans. In this study, the species: Aplastodiscus perviridis, Leptodactylus latrans, Leptodactylus mystacinus, Physalaemus cuvieri, Physalaemus aff. gracilis, Boana faber, Leptodactylus plaumanni, Odontophrynus americanus, Melanophryniscus devincenzii, Rhinella henseli and Rhinella icterica were cytogenetically characterized by conventional staining (Giemsa) and differential chromosomes (Bandamento C and AgNOR). For the analysis of the antimicrobial activity, the secretion of R. henseli was obtained by subcutaneous injection of epinephrine, tested by the technique of bioautography. Our results verified that the species that were cytogenetically compared to each other and to those of other sites of occurrence, through studies already performed by other authors, did not present significant differences in the species-specific chromosome characteristics of the populations, and no evidence of cytogenetic alteration, thus concluding that the river basins did not represent, so far, geographical barriers capable of isolating populations. Through the antimicrobial study, we observed that in R. henseli the secretion extracted from its skin shows antimicrobial activity against yeast C. albicans, being this the first study of the antimicrobial action in this bufo.

Key words: 1. Anura wildlife. 2. Chromosomal analysis. 3. Identification of species.

4. Antimicrobial action. 5. Antifungical action.

LISTA DE FIGURAS

INTRODUÇÃO Figura 1 - Mapa da distribuição das Bacias Hidrográficas do Rio Grande do Sul.. ....... 26 CAPÍTULO I Figura 1 - Karyotypes of five species of the Rhinella margaritifera and Rhinella marina groups from Brazil based on Giemsa staining ................................................................ 66 Figura 2 - Karyotypes of five species of the Rhinella margaritifera and Rhinella marina groups from Brazil stained by Ag-NOR method ............................................................ 67

LISTA DE TABELAS

CAPÍTULO I Tabela 1 - Number of Rhinella specimens analyzed and their localities in Brazil. ........ 64 Tabela 2 - Detailed cytogenetic data available for species of the Rhinella genus.......... 65

LISTA DE SIGLAS E ABREVIATURAS

2n: número diploide de cromossomos

AgNOR: Técnica de impregnação pela prata das regiões organizadoras de nucléolo

CS: Constrição Secundária

DNA: Ácido desoxirribonecleico

FLONA: Floresta Nacional

HC: heterocromatina centromérica

HI: heterocromatina intersticial

HP: heterocromatina pericentromérica

HT: heterocromatina telomérica

int: região intersticial do cromossomo

M: cromossomos metacêntricos

NORs: Regiões Organizadoras de Nucléolo

p: braço curto do cromossomo

PC: Posição do Centrômero

per: região pericentromérica do cromossomo

q: braço longo do cromossomo

rRNA: Ácido ribonucleico ribossomal.

SISBIO: Sistema de Autorização e Informação em Biodiversidade.

SM: cromossomo submetacêntrico

ST: cromossomo subtelocêntrico

st: região subterminal do cromossomo

ter: região terminal do cromossomo

U010: Bacia Hidrográfica Rios Apuaê – Inhandava.

UFPR: Universidade Federal do Paraná.

UFRGS: Universidade Federal do Rio Grande do Sul.

Unicamp: Universidade Estadual de Campinas.

ZUEC: Museu de Zoologia Prof. Dr. Adão José Cardoso.

SUMÁRIO

1 INTRODUÇÃO 15

2 REVISÃO DA LITERATURA 18

2.1 A ordem Anura 18 2.2 Análises citogenéticas em anfíbios anuros 19 2.3 Bacias Hidrográficas Taquari Antas e Apauê Inhandava 23 2.4 Os Anfíbios e as Barreiras Geográficas 26 2.5 Investigação de atividade antimicrobiana em anuros 30

3 PRODUÇÃO CIENTÍFICA I 45

4 CONSIDERAÇÕES FINAIS 68

Introdução

1 INTRODUÇÃO

A Classe Amphibia compreende animais que vivem uma parte de seu ciclo na

água doce e a outra parte na terra. É dividida em três ordens: Anura (rãs, pererecas e

sapos), Caudata (salamandras e tritões) e Gymnophiona, (cecílias ou apodes) (Pough,

Janis & Heiser 2008).

O grupo dos anuros (grego an=sem, uro=cauda), ocorre em todos os

continentes, exceto nas regiões gelificadas dos Polos Norte e Sul e nas ilhas oceânicas

(Frost 2018). A grande uniformidade morfológica dos anuros os torna o grupo mais

facilmente diagnosticável entre os vertebrados. Ao mesmo tempo, e em função dessa

pouca variação morfológica intraespecífica, os estudos baseados em morfologia são,

muitas vezes, de difícil interpretação no que se refere aos aspectos de taxonomia e

filogenia de determinados grupos, visto que, nesses estudos, a existência de

sobreposição de caracteres morfológicos apontados como diagnósticos entre táxons

aparentados, muitas vezes torna difícil a realização de uma eficiente diferenciação,

gerando erros de identificação com tendência a unir várias espécies em uma só (Busin et

al. 2001, Lourenço et al. 2015). Outras abordagens utilizadas para identificação também

são utilizadas, como por exemplo, a vocalização, o sequenciamento de genes, o estudo

dos cromossomos que, somados aos estudos de morfologia externa e interna, e aos

demais estudos, auxiliam a correta identificação das espécies. Nesse contexto, o estudo

citogenético pode ser utilizado como ferramenta capaz de auxiliar os estudos

taxonômicos, filogenéticos e da evolução da anurofauna.

Outro aspecto relevante no grupo dos anuros se relaciona à atividade

antimicrobiana que as secreções produzidas na pele desses animais podem apresentar.

Devido ao sério problema enfrentado atualmente com microrganismos que apresentam

resistência aos medicamentos disponíveis no mercado, a atividade antimicrobiana

dessas secreções tem sido um tema de grande interesse farmacológico e que pode

representar uma nova perspectiva terapêutica, uma vez que os anuros representam um

PPGCiAmb/UPF Introdução

Natália Cristine Ficanha 16

verdadeiro laboratório bioquímico, com o arsenal de toxinas que fabricam (Schwartz et

al. 2007). Portanto, a investigação dessas substâncias é significativa e deve ser

intensificada, pois além dos efeitos antimicrobianos, elas têm apresentado diversos

outros efeitos, como anestésicos e alucinógenos, conforme relatado na revisão de

literatura desta dissertação.

Nas Bacias Hidrográficas, Taquari Antas e Apauê Inhandava, região norte do

estado do Rio Grande do Sul, os trabalhos sobre o conhecimento da anurofauna são

ainda incipientes e quando acontecem, são decorrentes, na sua maioria, de análises da

morfologia externa e da vocalização. Com o objetivo de verificar se as características

cromossômicas espécie-específicas dos anuros das populações das duas bacias

hidrográficas são as mesmas e se as bacias podem estar representado barreiras

geográficas, analisamos citogeneticamente sete espécies de anuros provenientes da

Floresta Nacional de Passo Fundo (FLONA), município de Mato Castelhano, RS

(28º18'59.10"S, 52º11'26.42'O), Bacia Hidrográfica Taquari-Antas: Physalaemus

cuvieri, Physalaemus aff. gracilis, Aplastodiscus perviridis, Boana faber, Rhinella

henseli, R. icterica e Leptodactylus latrans, e nove espécies provenientes do parque

Municipal de Sertão, Sertão, RS (28º02'33.46"S, 52º12'58.56"O), Bacia Hidrográfica

Apauê Inhandava: L. latrans, L. mystacinus, L. plaumanni, P. cuvieri, Physalaemus aff.

gracilis, R. henseli, R. icterica, M. devincenzii e O. americanus. Da espécie R. henseli,

investigamos a atividade antimicrobiana da secreção da pele, testando sua ação contra

as bactérias Staphylococcus aureus e Escherichia coli e contra o fungo Candida

albicans.

No capítulo I, apresentamos o Artigo: “Citogenética de nove espécies de

anfíbios anuros ocorrentes em duas Bacias Hidrográficas do norte do Rio Grande Do

Sul”, que traz as características citogenéticas comparativas das espécies, comparando os

dados citogenéticos obtidos para as populações das duas bacias e com dados das

espécies ocorrentes em outras localidades e analisadas por outros autores.

No capítulo II, o Artigo “Comparative cytogenetics of nine populations of the

Rhinella genus (Anura, Bufonidae) with highlight on their conservative

karyotype”discute dados da localização das Regiões Organizadoras de Nucléolo

PPGCiAmb/UPF Introdução


(NORs) de populações de anuros do gênero Rhinella, e nele contrubuímos com as

análises de R. henseli (primeiro relato citogenético) e R. icterica, populações de Sertão e

de Mato Castelhano. Este artigo já foi aceito pela Revista “Genetics and Molecular

Biology” e foi escrito em parceria com o grupo de Pesquisa em Citogenética e

Mutagênese da Universidade Federal do Paraná (UFPR) e com o Laboratório de

Estudos Cromossômicos da Universidade Estadual de Campinas (Unicamp).

No capítulo III, apresentamos o Artigo “Inibição de Candida albicans pela

secreção da pele de Rhinella henseli (Anura, Bufonidae)“, onde testamos a atividade

antimicrobiana da secreção da pele desse anuro.

Revisão da Literatura

2 REVISÃO DA LITERATURA

2.1 A ordem Anura

Caudata, Anura e Gymnophiona são as três ordens da Classe Amphibia (Frost,

2018). A evolução das três ordens está relacionada com a forma de locomoção do

grupo, sendo os anuros a ordem que obteve mais progresso na conquista de terra firme,

devido a sua anatomia basicamente composta por corpo curto, cabeça grande e longos

membros pélvicos que lhes permitem saltar, andar e escalar (Pough et al. 2008).

Contudo, ,o grupo dos anfíbios nunca conquistou por si só a terrestrialidade, por ainda

ser dependente do ambiente aquático (Rossa-Feres et al. 2017).

A América do Sul é o continente que abriga a maior diversidade de anfíbios do

mundo, e o Brasil é o país que possui a mais diversa herpetofauna do planeta, com uma

alta taxa de endemismo (Eterovick et al. 2005). Segundo Segalla et al. (2016),

atualmente, nosso país abriga 1080 espécies de anfíbios, destes, 1039 são de anuros. Em

nível mundial, já são registradas 7.922 espécies de anfíbios, sendo 6.991 anuros (Frost

2018). Os representantes dessa ordem podem ser encontrados por todo o planeta, com

exceção das ilhas oceânicas mais remotas e regiões frias como os Polos Norte e Sul

(Frost 2018).

Para o Rio Grande do Sul, são conhecidas 92 espécies de anfíbios anuros

(Herpetologia UFRGS 2010). Lema & Martins (2011) realizaram um levantamento da

anfibiofauna do estado, relatando, porém, dificuldades na condução do trabalho uma vez

que esta esfera do conhecimento é pouco estudada para o Rio Grande do Sul e

constataram que muitas espécies apresentam taxonomia duvidosa, outras tantas ainda

não descritas e algumas com variações de morfologia a serem consideradas e que

podem resultar na descoberta de novas espécies. Relatam também, que muitos locais são

pouco ou ainda não amostrados. Importante ressaltar também que a existência de grande

variabilidade e sobreposição de caracteres morfológicos apontados como diagnósticos

entre espécies aparentadas, muitas vezes torna difícil a realização de uma eficiente

PPGCiAmb/UPF Revisão da Literatura


diferenciação entre táxons, sendo comum a ocorrência de erros de identificação (Fonte,

2010). Assim sendo, o número de anuros ocorrentes no Estado não é exato, pois a cada

estudo, a descoberta de novas espécies vem aumentando (Kwet & Di-Bernardo 1999,

Kwet 2008, Iop, Santos & Cechin 2016, Bolzan, Saccol & Santos, 2016).

Devido aos poucos estudos, muitas espécies de anfíbios ocorrentes no Bioma

Mata Atlântica, o qual integra as áreas de estudo deste trabalho, foram consideradas

deficientes em dados na última avaliação da lista brasileira das espécies de anfíbios

ameaçadas de extinção, e algumas delas já podem ter sido extintas, ou já podem estar

ameaçadas há muito tempo (Rossa-Feres et al. 2017).

2.2 Análises citogenéticas em anfíbios anuros

Os estudos das características cromossômicas são muito utilizados como

ferramenta para o estudo taxonômico dos anuros, e fornecem caracteres que facilitam a

correta classificação taxonômica e filogenética. Muitas vezes, o estudo dos

cromossomos permite descobrir a formação de novas espécies de anuros que habitam

ambientes irregulares, montanhosos e com recursos hídricos que podem estar atuando

para a formação de barreiras geográficas isolando, assim, populações específicas,

Martino et al. 2002, Medeiros et al. 2003).

Durante algumas décadas, a análise citogenética nos anuros esteve baseada

principalmente em comparações do número e da morfologia cromossômica, além da

localização das constrições secundárias em cariótipos submetidos somente a coloração

convencional (Kasahara, 2009). Tais estudos foram capazes de revelar grupos com

grande homogeneidade nessas características, a exemplo dos bufonídeos (Bogart 1973)

e hilídeos (Anderson 1991) e, por outro lado, grupos bastante variáveis como os

leptodactilídeos (Denaro 1972). Kasahara (2009) relata que a morfologia cromossômica

definida por meio de dados morfométricos iniciou com os trabalhos de Levan, Fredga &

Sandberg em 1964, e que hoje, a mais comum nomenclatura cromossômica utilizada é a

estabelecida por Green & Sessions (1991).



Apenas com a análise de cariótipos corados convencionalmente não é possível

obter dados detalhados suficientes para cada cromossomo do conjunto, uma vez que a

informação disponível é limitada apenas ao tamanho cromossômico e a posição do

centrômero, permitindo apenas a caracterização do número e morfologia cromossômica

(Targueta et al. 2018). Apesar desses estudos baseados apenas em coloração

convencional terem fornecido dados importantes para o esclarecimento dos mecanismos

de evolução cariotípica e das relações filogenéticas em grupos de anuros (Bogart 1973,

Morescalchi 1973), a citogenética comparativa avançou muito com o desenvolvimento e

o emprego das técnicas de bandamento dos cromossomos, principalmente com a

determinação do padrão de heterocromatina do genoma, e da localização das NORs

(Kasahara, 2009).

Em 1928, Heitz foi o primeiro a adotar o termo heterocromatina, a fim de

diferenciar determinadas estruturas, percebendo que a região era altamente condensada.

A heterocromatina pode ser definida basicamente como uma classe específica de

cromatina altamente repetitiva (Kasahara 2009). A coloração das regiões

heterocromáticas dos cromossomos, conseguida por meio da técnica de bandamento C,

ocorre em virtude da amplificação de sequências repetitivas de DNA, produto principal

da heterocromatina (Sumner 1994). Sumner (1972) descreveu uma técnica de

bandamento C simples e rápida, a qual é ainda utilizada, pois consiste em um tratamento

com ácido (ácido clorídrico), um tratamento alcalino (hidróxido de bário saturado),

seguido de um tratamento com solução salina (cloreto e citrato de sódio). O ácido

clorídrico permite a despurinização da molécula de DNA, que quando em tratamento

com o hidróxido de bário resulta em quebras nos sítios apurínicos, o que facilita a

extração do DNA (Kasahara 2009). Schmid et al. (1990), relatam que a extração de

DNA ocorre mais facilmente nas regiões de banda C negativas, portanto, estas sofrem

uma fraca coloração, ao contrário das regiões de banda C positivas, que ficam

fortemente coradas.

Embora várias espécies de anuros compartilhem similaridade no número e

morfologia cromossômica, é possível haver grandes diferenças na quantidade e na

localização da heterocromatina nos cromossomos, diferenciando espécies (Silva et al.



2000, Busin et al. 2001, Busin et al. 2008, Arruda & Morielle-Versute 2008, Oliveira et

al. 2013), visto que a localização, densidade, quantidade e número de bandas nos

cromossomos pode ser altamente variável, mudando rapidamente conforme a evolução

das espécies, resultado de possíveis rearranjos cromossômicos. A determinação do

padrão heterocromático nos genomas é empregada com sucesso nos anuros e tem

permitido a caracterização e diferenciação de espécies (Busin, Viniprova & Recco-

Pimentel 2001, Veiga-Menoncello, Lima & Recco-Pimentel 2003, Medeiros, Rossa-

Feres & Recco-Pimentel 2003, Busin, et al. 2006, Busin et al. 2008, entre outros),

demonstração de polimorfismos (Lourenço, Garcia & Recco-Pimentel 2003), além do

esclarecimento de possíveis rearranjos cromossômicos envolvidos na evolução de

alguns grupos (Busin et al. 2001).

Segundo Galls & Pardue (1969) e Sumner (1990), as NORs podem ser

caracterizadas como regiões cromossômicas ricas em sequências de guanina e citosina,

as quais são compostas por várias cópias de genes ribossomais, codificadores de

determinados RNAs ribossomais (RNAr) como 18S, 5,8S e 28S, organizados in tandem

e separados por sequências espaçadoras. No cariótipo, as NORs podem aparecer

coincidindo com as constrições secundárias (Henderson et al. 1972), ou podem conter

heterocromatina no mesmo sítio (King 1980, Schmid 1982). A técnica de Howell &

Black (1980) tem sido a mais aceita e utilizada para a detecção e localização das NORs

ativas nos cromossomos. Elaé baseada na afinidade do nitrato de prata com as proteínas

acídicas, impregnando com prata os locais de RNAr dos cromossomos (Kasahara 2009).

Em alguns estudos sobre o número e a localização das NORs, podemos notar um

conservadorismo, visto que muitas vezes o par portador está relacionado às regiões ricas

em heterocromatina (Quinderé et al. 2009, Iizuka, Matsuda, Yamada, Nakazato &

Sessions 2013, Ferro et al., 2018). Porém, o emprego da técnica AgNOR em anfíbios

têm possibilitado a discussão de possíveis relações evolutivas entre espécies (Ruiz,

Soma & Beçak 1981), a caracterização de grupos (Anderson 1991) e a identificação de

possíveis homeologias entre os cariótipos de diferentes espécies (Rosa, Aguiar, Giaretta

& Recco-Pimentel 2003, Busin et al. 2006). Embora, na maioria das vezes os estudos

cariotípicos de anuros, tanto de famílias conservadas, como das mais derivadas,



apresentem apenas um par cromossômico portador das NORs, há casos em que ela está

localizada em mais de um par cromossômico, apresentando NORs adicionais nos

cariótipos (Busin et al. 2006, Quinderé et al. 2009, Cardozo et al. 2011, Peixoto,

Oliveira, Feio & Dergam 2016).

Segundo Kasahara (2009), existem muitos estudos que comprovam que os

resultados das análises citogenéticas são fundamentais para confirmar que indivíduos

pertencentes taxonomicamente a uma mesma espécie, fossem considerados exemplares

de espécies diferentes, ou vice-versa, isso devido às constituições cariotípicas

apresentadas. Exemplos de estudos onde a citogenética foi decisiva para a determinação

de processo de especiação foi o de Busin et al. (2001), separando por meio da

citogenética as espécies de Pseudis minuta e de P. cardosoi, até então consideradas, por

meio da análise de caraterísticas morfológicas, uma única espécie. Por meio da

determinação do padrão heterocromático e da localização das NORs nos cariótipos, os

autores conseguiram também, comprovar como ocorreu o processo de especiação nesse

grupo. Martino & Sinsch (2002), analisando indivíduos de Odontophrynus

americanus e O. cordobae, comprovaram que as duas espécies só podem ser separadas

por meio da citogenética, pois morfologicamente são extremamente semelhantes. Outro

estudo citogenético relevante foi o de Nogueira et al. (2015), cuja hipótese foi de

constatar por meio da caracterização detalhada dos cromossomos que, indivíduos de

Scinax auratus e S. eurydice poderiam estar muito associados a espécie S. alter, devido

a fortes semelhanças em características morfológicas, porém, acabaram descobrindo que

S. auratus compartilhava alguns traços cromossômicos com a maioria das espécies de S.

ruber, e não com a S. alter conforme o esperado. Podemos mencionar, ainda, o trabalho

de Medeiros et al. (2003), onde a citogenética de Dendropsophus nana e D. sanborni,

separa as duas espécies que possuem características morfológicas muito parecidas e por

viverem frequentemente em simpatia, são confundidasentre si. Além de separar as

espécies, nesse trabalho, os autores discutiram também que a morfologia cromossômica

dos cariótipos das duas espécies divergiu com as divulgadas para populações de outras

regiões geográficas e sugeriram tratarem-se ambas, de espécies novas. Targueta et al.

(2018) também relatam que, em alguns casos, a variação cariotípica de algumas



espécies supera a diversificação morfológica, reforçando o uso da citogenética como

ferramenta para a taxonomia.

Por outro lado, algumas vezes, somente o estudo citogenético não consegue

diferenciar espécies, como por exemplo, no estudo de Carvalho et al. (2009), onde

Aplastodiscus cochranae e A. perviridis apresentaram número e morfologia

cromossômicas, localização da NOR e padrão heterocromático idênticos, tornando

difícil uma diferenciação baseada apenas em caracteres citogenéticos, ressaltando assim

a importância de análises adicionais como de morfologia externa e interna,

filogenéticas, de vocalização, sequenciamento de genes, entre outras.

Dessa forma, o estudo citogenético das espécies que habitam as Bacias

Hidrográficas Taquari Antas e Apauê Inhandava é empregado neste estudo como

ferramenta capaz de auxiliar os estudos taxonômicos, filogenéticos e da evolução da

anurofauna local, fornecendo dados que, somados aos de outras naturezas, como de

morfologia e vocalização, contribuirão para a exata identificação dessa anurofauna,

dado que o frágil conhecimento da diversidade de espécies é um dos maiores desafios

para a conservação da biodiversidade (Funk, Caminer & Ron, 2012).

2.3 Bacias Hidrográficas Taquari Antas e Apauê Inhandava

O conceito de Bacia Hidrográfica pode ser compreendido por meio da

concepção de rede hidrográfica e de relevo, visto que é uma área delimitada por um

ponto de elevação que separa o escoamento das águas, mais conhecido como divisor de

águas e é determinado pela topografia (Schiavetti & Camargo, 2002). Uma parcela da

água da chuva que cai sobre o território das Bacias Hidrográficas infiltra para o subsolo

e outra parte escoa pela superfície, escorrendo para o leito dos rios, ocorrendo então a

entrada de água no ciclo hidrológico de cada bacia hidrográfica (Agência Nacional de

Águas [ANA], 2017). As Bacias hidrográficas Taquari-Antas (G040) e Apauê-

Inhandava (U010) possuem entre si uma distância de aproximadamente 30,3 km em



linha reta. A região dessas bacias é rica em divisores de águas, pois estão inseridos

quase no limite de outras bacias como a do Rio Passo Fundo e a do Alto do Jacuí , além

de pertencerem a Regiões Hidrográficas diferentes. Dessa forma, as águas que caem em

cada uma das quatro bacias, escoam para lados distintos até desembocar no oceano.

A Bacia Hidrográfica Taquari-Antas, pertence à Região Hidrográfica do Guaíba,

está localizada no nordeste do Estado do Rio Grande do Sul. Banha 118 municípios que

somam uma população de aproximadamente 1.281.866 milhão de habitantes e esta

inserida numa das regiões de maior importância econômica do estado. Abrange parte

dos campos de cima da serra e região do Vale do Taquari, com predomínio da

agropecuária, e a região colonial da Serra Gaúcha, caracterizada por intensa atividade

industrial. A Bacia tem clima temperado com isoterma anual superior a 18°C. Regiões

ao norte da Bacia possuem altitudes entre 400 e 600 m, enquanto que a região central

possui altitudes inferiores a 400 m (Departamento de Recursos Hídricos da Secretaria de

Estado do Meio Ambiente [DRH/SEMA], 2012). Devido à sua magnitude, esta bacia

possui características físicas e antrópicas diferenciadas: áreas de alto índice de

industrialização, áreas com predomínio de produção primária, zonas intensamente

urbanizadas e riscos de ocorrência de enchentes, entre outras (Fundação Estadual de

Proteção Ambiental Henrique Luiz Roessler, RS [FEPAM], 2016). A captação de água

destina-se a irrigação, ao abastecimento público, a agroindústria e a dessedentação de

animais. Os principais cursos de água são o Rio das Antas, Rio Tainhas, Rio Lageado

Grande, Rio Humatã, Rio Carreiro, Rio Guaporé, Rio Forqueta, Rio Forquetinha e o Rio

Taquari (DRH & SEMA, 2012).

Já, a Bacia Hidrográfica Apauê Inhandava, pertence à Região Hidrográfica do

Uruguai. Situa-se a norte-nordeste do Estado do Rio Grande do Sul, compreendendo 52

municípios, e destes, 38 têm sede na área e cinco possuem menos de 5% dos seus

territórios inseridos na bacia. Abrange a província geomorfológica Planalto Meridional

e uma população estimada em 372.671 habitantes. Os principais corpos de água são os

rios Apuaê, Inhandava, Cerquinha, Pelotas, Arroio Poatã e o Rio Uruguai. O principal

uso de água na bacia se destina ao abastecimento público. A bacia é caracterizada por

clima subtropical, onde a temperatura do mês mais quente é superior a 22°C e clima



temperado, com temperatura do mês mais quente inferior a 22ºC. A altitude da bacia

tem uma variação entre 500 e 1.350m (DRH & SEMA, 2016). Já, a região de coleta dos

animais da nossa pesquisa apresenta altitude aproximada de 650 metros (Tedesco &

Zanella, 2014).



Figura 1. Mapa da distribuição das Bacias Hidrográficas do Rio Grande do Sul. Em destaque as Bacias Hidrográficas Apauê-Inhandava (U010) e Taquari-Antas (G040). = Floresta Nacional de Passo Fundo. = Parque Natural Municipal de Sertão. G040 = Rio Taquari-

Antas. U010 = Rios Apuaê – Inhandava.

2.4 Os Anfíbios e as Barreiras Geográficas

Como várias espécies de anfíbios que ocorrem no Brasil são endêmicas, tendem

a constituir populações pequenas e assim, mais suscetíveis a processos que ameaçam a

sua existência. No trabalho de Pires, Fernandez & Barros (2006), é possível perceber

que alguns processos naturais e antrópicos podem vir a separar populações pequenas e

que o grau de isolamento destas, pode ser considerável quando não possuem uma

estrutura metapopulacional, ou seja, um conjunto de populações locais onde a dispersão



de indivíduos de uma população para outra ainda seja possível. A separação dessas

populações pode levar a processos de extinção ou especiação. No processo de extinção,

quatro fatores podem contribuir independentemente para extinguir populações grandes

ou pequenas: (1) aleatoriedade demográfica, (2) ambiental, (3) genética e (4), as

catástrofes naturais. Já, o processo de isolamento, pode ocorrer por diversos fatores

como fragmentação de hábitats, formação de montanhas, rios, ilhas, entre outros.

Hannah, (2011) discute que as mudanças climáticas, por exemplo, também podem

influenciar populações a uma dispersão, e desse modo, não são somente as barreiras

geográficas físicas que atuam no processo de especiação. Ribeiro, Metzger, Martensen,

Ponzoni & Hirota (2009), mostram, em seu estudo, que o Bioma Mata Atlântica está

gravemente fragmentado o que resta dele encontra-se distribuído em pequenas manchas,

sendo 80% delas formadas por menos de 50 hectares de sua composição original, com

quase metade possuindo atualmente, área menor que 100 hectares, cenário bem

característico da região Norte do estado do Rio Grande do Sul. Em decorrência de fatos

como este, é que a principal ameaça aos anfíbios no Brasil e no mundo vem sendo a

fragmentação, a degradação e a destruição das áreas de ocorrência destes animais

(Silvano & Segalla 2005, Becker, Fonseca, Haddad, Batista & Prado 2007).

A distribuição das espécies no globo terrestre é definida por diversos processos

ecológicos, como por exemplo, movimentos tectônicos, mudanças bruscas nas

condições climáticas e barreiras (Ficetola, Mazel & Thuiller 2017). Conforme revisão

de Pires et al. (2006), ao longo do tempo os habitats foram transformados em pequenos

pedaços remanescentes, isolados uns dos outros e mergulhados em paisagens de

mosaico alteradas pelo homem. Os autores discutem que essa fragmentação pode ser

dividida conceitualmente em: (1) Redução total da área, onde ocorre uma diminuição da

biodiversidade em curto prazo, afetando populações pequenas ou raras pela perda de

hábitat e (2), pela fragmentação ou divisão do habitat, reduzindo a biodiversidade em

longo prazo, formando ilhas de isolamento geográfico, diminuição ou eliminação de

espécies consideradas colonizadoras, uma vez que os padrões da Teoria da Biogeografia

de Ilhas podem ser aplicados também a ilhas de habitat. O norte do Rio Grande do Sul

apresenta uma paisagem caracterizada pelo uso intensivo dos recursos naturais, uma vez



que as florestas e campos foram substituídos pelas lavouras, chegando próximo do

esgotamento, apresentando atualmente fragmentos pequenos. Dessa forma, alguns

processos naturais, juntamente com ações antrópicas dessa natureza, podem vir a

separar populações pequenas e o grau de isolamento deve ser considerado.

A definição mais compreensível para especiação, apesar de ser muito mais

complexa, é a que explica o termo como a divisão de uma população por barreiras

geográficas, limitando a dispersão espacial dos indivíduos e resultando no impedimento

do livre fluxo gênico entre eles (Queiroz 1998). Para Andrade (2010), esse processo é

considerado impressionante e intrigante para a evolução, pois entender quais são seus

mecanismos ainda é um grande desafio para os pesquisadores, por se tratar de um

processo complexo e acometido por fatores genéticos, ecológicos, ambientais e

comportamentais, os quais podem interagir entre si de maneira incomum. Santos Filho,

Silva & Cabral (2017) ainda ressaltam que a temática da especiação requer atenção

especial ao ser discutida, principalmente por envolver outras áreas do conhecimento

como as da geografia, geologia e climatologia.

Vanzolini (1992) discute que a especiação pode ser vista de diferentes maneiras,

como por exemplo, considerando as mudanças morfológicas de uma determinada

espécie ao decorrer do tempo geológico e compreendendo quais processos naturais

podem estar interferindo nessa transformação, que ocasiona a distinção de uma espécie

em duas ou mais. Conforme Colley & Fischer (2013), tais mecanismos estão fortemente

relacionados às diversas teorias sobre as origens da biodiversidade e, sem dúvidas, as

barreiras geográficas são os fatores primordiais para que o fluxo gênico entre espécies

seja impedido (Santos-Filho et al. 2017).

No caso dos anfíbios, rios e ilhas podem atuar como barreira geográfica sobre

um grande número de espécies. Além das barreiras já conhecidas, outras também estão

sendo estudadas, como é o caso das estradas, que podem atuar como barreira ambiental,

impedindo a movimentação animal de um lado para outro, podendo resultar no

isolamento de espécies, especialmente para pequenos anuros (Jaeger et al. 2005).

Exemplo disso é o estudo de dois anos que Cairo & Zalba (2007) realizaram na

Argentina, onde os autores comprovaram que uma espécie endêmica de



Melanophyniscus estava sendo afetada pela rodovia, pois, dos 76 indivíduos

recapturados nas margens de uma estrada, apenas dois deles haviam conseguido

atravessá-la durante o tempo do estudo. Além disso, Silva & Benmaman (2008), que,

trabalhando com espécies de anuros restritos a regiões de riachos formadores de

diferentes bacias, mostram que estes anuros parecem não alcançar rios maiores, mesmo

tendo conexão com os mesmos. Conforme os autores, os rios maiores estariam atuando

como uma barreira geográfica sobre as populações. Também Castellano, Rosso, Doglio

& Giacoma (1999), constataram que uma população de Bufotes viridis (anteriormente

Bufo viridis), de uma ilha da Itália, possuía indivíduos 30% maiores e duas vezes mais

pesados dos que aqueles que habitavam o continente, vindo a constituir uma espécie

distinta. Além de Wu, Li & Murray (2006), que fizeram um trabalho similar e

constataram que populações de Fejervarya limnocharis (antiga Rana limnochari)

insulares possuíam tamanho corporal significativamente maior quando comparadas

àquelas encontradas no continente, visto que estas possuíam maior disponibilidade de

recursos e barreira geográfica entre as populações.

Santos-Filho et al. (2017) também ressaltam que o isolamento por barreira

geográfica não age por si só no mecanismo de especiação. Segundo os autores,

populações separadas precisam evoluir de forma independente, através da seleção de um

pool gênico diferente e, que se ambas estiverem expostas a condições ambientais

parecidas e que fatores evolutivos não venham a interferir no pool gênico, é bem

provável que a especiação não ocorra. Vale considerar aqui, que alterações

cromossômicas, como rearranjos, ocorrentes nos cariótipos de algumas espécies, podem

representar o principal mecanismo para o curso da especiação, pois contribuem para o

isolamento reprodutivo entre as espécies (Wolfe 2003), em decorrência de que estas

alterações podem diminuir a fertilidade dos híbridos heterozigotos (Rieseberg 2001).



2.5 Investigação de atividade antimicrobiana em anuros

A pele dos anfíbios é adaptada para lhes prestar proteção, respiração cutânea,

osmorregulação, termorregulação e a secreção de substâncias que agem contra

microrganismos e predadores (Conlon, Kolodziejek & Nowotny 2004, Jared et al.

2009). Áreas como a neurociência, embriologia, ecologia, genética e evolução, têm

mostrado grande interesse em estudos com a secreção da pele dos animais desse grupo.

Este interesse se deve, principalmente, em virtude das características peculiares que

apresentam e também pela capacidade de regeneração dos tecidos, crescimento e

diferenciação de suas células epiteliais, entre outras (Lillywhite 2006, Yoshida et al.

2013). Glândulas mucosas e granulosas estão presentes na pele dos anfíbios. As

granulosas são encontradas em tamanho maior e em menor número na região dorsal da

pele e são responsáveis pela produção e armazenamento das secreções (Conlon et al.

2004, Pinto et al. 2009). Quando essas glândulas se dispõem agrupadas, são

denominadas paratóides e, apesar de os anfíbios possuírem glândulas por todo o corpo,

estas são as mais visíveis (Jared et al. 2009).

Pesquisas sobre a composição química dessas secreções, já mostraram resultados

satisfatórios sobre a atividade farmacológica de muitas das substâncias ali encontradas

(Schwartz et al. 2007). Geralmente a secreção apresenta aminas biogênicas, esteróides,

peptídeos e alcalóides em sua composição. Estas substâncias podem possuir efeitos

cardiotóxicos, neurotóxicos (Toledo & Jared 1995), alucinógenos (Pinto et al. 2009),

anestésicos e, principalmente, antimicrobianos (Braga, Silva, Evangelista-Barreto &

Protázio 2015, Yang, Shen, Liu & Kong 2016, Barnhart et al. 2017, Pereira et al. 2018,

entre outros). Se os anfíbios não possuíssem essas glândulas de secreção, ficariam

facilmente expostos a patógenos que os atacariam através da pele, além de que, segundo

Siano et al. (2014), a presença delas também pode fornecer informações taxonômicas e

filogenéticas esclarecedoras para a história evolutiva dos animais.

Estudos recentes mostram que as secreções possuem moléculas antimicrobianas

abundantes, principalmente peptídeos (Gibble, Rollins-Smith & Baera 2008, Lamadrid-



Feris, Coy-Barrera, Franco, Valencia & Arboleda 2015, Ladram & Nicolas 2016,

Conlon et al. 2017), que atuam na imunidade inata do animal, podendo ser encontrados

também em bactérias, fungos, plantas, animais invertebrados e em outros vertebrados

(Mookherjee & Hancock 2007; Siano et al. 2014). Quando oriundos da secreção de

anuros, podem apresentar características inibitórias ao crescimento de bactérias Gram

positivas e principalmente de Gram negativas (Magalhães et al. 2008).

As secreções tegumentares dos anfíbios ainda podem apresentar diversos outros

efeitos, como por exemplo, o estudo de Raghavan, Babu, Rajou & Sai (2010) onde,

além de serem antivirais, alguns peptídeos presentes na secreção de anfíbios como a

Rana tigerina (atual Hoplobatrachus tigerinus), podem apresentar ação anti-

inflamatória e até mesmo antitumoral. Também trabalho recente de Monteiro et al.

(2018), apontou uma inibição completa da infecção do vírus da dengue quando em

contato com um peptídeo sintético derivado da secreção de Boana semilineata (antiga

Hypsiboas semilineatus).

Estudos apontam que fatores como tamanho corporal, sexo e idade, podem ter

influência na quantidade de secreção que fica depositada no tegumento dos sapos

venenosos (Jeckel, Saporito & Grant 2015). Esses sapos são geralmente coloridos e

possuem alcalóides na composição da sua secreção que são obtidos através da dieta

(Saporito, Spande, Garraffo & Donnelly 2009, Hantak et al. 2013, Mina, Ponti,

Woodcraft, Johnson & Saporito 2015, Hovey, Seiter, Johnson & Saporito 2018). Os

antibióticos convencionais tem reduzido sua ação sobre algumas bactérias e o

desenvolvimento de novos antibióticos a partir dos peptídeos encontrados nas secreções

dos anfíbios anuros pode conter o problema dos microrganismos resistentes (Zasloff et

al. 2002).

Candida albicans é um fungo oportunista, que em condições normais, está

presente como um organismo comensal, sem causar malefício ao ser humano (De-Rossi

et al. 2011). Porém, em pessoas com imunodeficiência, a Candida pode causar diversas

infecções, muitas vezes crônicas, além de que a candidíase pode também se manifestar

nos rins, fígado, baço e cérebro (Colombo & Guimarães 2003). Este fungo, assim como



outros microrganismos, vem adquirindo cada vez mais resistência (Vieira & Santos

2017), o que evidencia ainda mais que o estudo da atividade antimicrobiana da secreção

de anfíbios poderá trazer informações farmacológicas importantes na terapêutica atual.



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3 PRODUÇÃO CIENTÍFICA I


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4 CONSIDERAÇÕES FINAIS

Por meio das análises citogenéticas comparativas das populações de anuros da

FLONA, Mato Castelhano, RS e do Parque Natural Municipal de Sertão, Sertão, RS,

não encontramos evidências de processo de evolução cariotípica, possivelmente em

decorrência da proximidade entre as áreas de coleta, sugerindo que as populações não

estejam isoladas geograficamente, permitindo um bom fluxo gênico entre elas. Quando

comparados a outros estudos, nossos resultados não apresentaram diferenças relevantes

nas características cromossômicas espécie-específicas, exceto nas espécies P. cuvieri e

O. americanus. Vale ressaltar, que a maioria das espécies analisadas são generalistas, e,

portanto, se adaptam bem em meio as alterações estruturais decorrentes da

fragmentação, que caracteriza seus habitats, e que os dados citogenéticos se

apresentaram bem conservados, o que comprova que se tratam de espécies ancestrais

A revisão dos dados citogenéticos das espécies do gênero Rhinella, evidencia

que embora o gênero possua uma ampla distribuição, os cariótipos se apresentaram

altamente conservados. O status taxonômico das espécies pertencentes ao grupo

Rhinella margaritifera ainda permanece incerto, o que torna possível a existência de um

complexo de espécies dentro do grupo. Tambémo gênero Rhinella possui alta

frequência de eventos de hibridação e introgressão em áreas de simpatia, portanto,

grupos com um cariótipo uniforme podem refletir a inexistência de mecanismos de

isolamento, contribuindo com hibridação. Nosso estudo pode contribuir na compreensão

dos mecanismos de mudança evolutiva que levaram à diversificação desses sapos.

Na avaliação de atividade antimicrobiana, constatamos que a secreção extraída

das glândulas da pele de R. henseli apresenta atividade antimicrobiana contra o fungo

Candida albicans, levedura que causa diversos processos infecciosos oportunistas. A

diversidade bioquímica em secreções de pele de anfíbios tem potencial para aplicações

farmacêuticas, entretanto, sugerimos a continuidade das análises antimicrobianas, na

espécie, testando outros microorganismo e caracterizando os diferentes componentes

químicos presentes na secreção.


Resumo comparativo das características citogenéticas das espécies de anuros do norte do estado do Rio Grande do Sul

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