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UNIVERSIDADE DE LISBOA FACULDADE DE MEDICINA NUTRIÇÃO E GENES EM DOENÇAS INTESTINAISCatarina Sousa Guerreiro Doutoramento em Ciências e Tecnologias da Saúde 2011

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UNIVERSIDADE DE LISBOA

FACULDADE DE MEDICINA

“NUTRIÇÃO E GENES EM DOENÇAS INTESTINAIS”

Catarina Sousa Guerreiro

Doutoramento em Ciências e Tecnologias da Saúde

2011

UNIVERSIDADE DE LISBOA

FACULDADE DE MEDICINA

“NUTRIÇÃO E GENES EM DOENÇAS INTESTINAIS”

Catarina Sousa Guerreiro

Tese orientada pela Professora Doutora Maria Ermelinda da Silva Mendes de Assis Camilo

Doutoramento em Ciências da Saúde

Especialidade em Nutrição

Todas as afirmações efectuadas no presente documento são da exclusiva

responsabilidade da sua autora, não cabendo qualquer responsabilidade à Faculdade de

Medicina de Lisboa pelos conteúdos nele apresentados.

Nutrição e Genes em Doenças Intestinais

IV

A impressão desta dissertação foi aprovada pelo Conselho

Científico da Faculdade de Medicina de Lisboa em reunião de 18 de

Janeiro de 2011

Nutrição e Genes em Doenças Intestinais

V

A presente Tese de Doutoramento foi realizada com base nas seguintes publicações:

Catarina S Guerreiro, Marília Cravo, Miguel Brito, Pedro M Vidal, Paulo O Fidalgo, e Carlos N Leitão.

The D1822V APC polymorphism interacts with fat, calcium, and fiber intakes in modulating the risk of

colorectal cancer in Portuguese persons.

American Journal of Clinical Nutrition 2007; 85(6):1592-97.

Catarina Sousa Guerreiro, Bruno Carmona, Susana Gonçalves, Elisabete Carolino, Paulo Fidalgo,

Miguel Brito, Carlos Nobre Leitão, e Marília Cravo.

Risk of colorectal cancer associated with the 677 polymorphism in 5, 10- methylenetetrahydrofolate

reductase in Portuguese patients depends on the intake of methyl-donor nutrients.

American Journal of Clinical Nutrition 2008; 88(5):1413-18.

Catarina Sousa Guerreiro, Marília Cravo, Ana Raimundo Costa, Ana Miranda, Lourdes Tavares, Paula

Moura-Santos, Pedro Marques Vidal, e Carlos Nobre Leitão.

A comprehensive approach to evaluate nutritional status in Crohn‟s patients in the era of biologic

therapy: a case-control study.

American Journal of Gastroenterology 2007;102(11):2551-56.

Catarina Sousa Guerreiro, Paula Ferreira, Lourdes Tavares, Paula Moura-Santos, Manuela Neves,

Miguel Brito, e Marília Cravo.

Fatty acids, IL-6 and TNF-α polymorphisms: An example of nutrigenetics in Crohn‟s disease.

American Journal of Gastroenterology 2009;104(9):2241-49.

Nutrição e Genes em Doenças Intestinais

VI

Nutrição e Genes em Doenças Intestinais

VII

ÍNDICE

LISTA DE ABREVIATURAS ..................................................................................................... IX

RESUMO ...................................................................................................................................... XI

SUMMARY .................................................................................................................................. XV

CAPÍTULO 1

I) Fundamentação Teórica

1. Nutrição ........................................................................................................................... 3

2. Genes .............................................................................................................................. 4

3. Nutrigenética ................................................................................................................... 5

4. Cancro do Cólon e Recto

4.1. Factores Ambientais .............................................................................................. 6

4.2. Factores Genéticos .............................................................................................. 11

4.3. Nutrigenética no Cancro do Cólon e Recto ......................................................... 12

5. Doença de Crohn

5.1. Factores Ambientais ............................................................................................ 14

5.2. Factores Genéticos .............................................................................................. 17

5.3. Nutrição, Genes e Doença de Crohn ................................................................... 17

5.3.1. Nutrição e Doença de Crohn......................................................................... 18

5.3.2. Polimorfismos genéticos e influência no fenótipo da Doença de Crohn ...... 20

5.3.3. Nutrigenética no desenvolvimento da Doença de Crohn ............................. 20

6. Referências Bibliográficas ............................................................................................. 22

II) Objectivos .............................................................................................................................. 37

CAPÍTULO 2

I) Cancro do Cólon e Recto

Estudo 1 ............................................................................................................................ 40

O polimorfismo D1822V APC interage com a ingestão de gordura, cálcio e fibra na

modulação do risco de Cancro Colo Rectal em indivíduos portugueses

Estudo 2 ............................................................................................................................ 54

O risco de Cancro Colo Rectal associado ao polimorfismo C677T na 5,10

metilenotetrahidrofolato reductase depende, em doentes portugueses, da ingestão de

nutrientes dadores de grupos metilo.

II) Doença de Crohn

Estudo 3 ............................................................................................................................ 67

Uma abordagem global na avaliação do estado nutricional de Doentes de Crohn na era da

terapia biológica: um estudo caso-controlo

Nutrição e Genes em Doenças Intestinais

VIII

Estudo 4 ............................................................................................................................ 81

Ácidos gordos e polimorfismos da IL6 e TNFα: um exemplo de nutrigenética na Doença de

Crohn

CAPÍTULO 3

I) Discussão ................................................................................................................................ 99

II) Considerações Finais ........................................................................................................ 102

III) Referências Bibliográficas .............................................................................................. 104

AGRADECIMENTOS ............................................................................................................... XIX

ANEXOS ...................................................................................................................................... XX

Nutrição e Genes em Doenças Intestinais

IX

LISTA DE ABREVIATURAS

DNA Ácido desoxirribonucleico

AA Ácido araquidónico

AGPI Ácidos gordos polinsaturados

APC Adenomatous Polyposis Coli

BIA Bioimpedância

CARD Caspase recruitment domain

CCR Cancro do cólon e recto

CDAI Crohns‟ disease activity index

Cox2 Ciclo-oxigenase 2

DRI Dietary Reference Intake

DC Doença de Crohn

DHA Docosahexaenóico

DII Doença inflamátoria intestinal

EPA Eicosapentaenóico

EUA Estados Unidos da América

F Feminino

IHB Índice Harvy-Bradshaw

IC Intervalo de confiança

IL Interleucina

IMC Índice de massa corporal

IPOLFG Instituto Português Oncologia Lisboa, Francisco Gentil

LT Linfotoxina

M Masculino

%MG Percentagem de massa gorda

%MLG Percentagem de massa livre de gordura

MTHF Metilenotetrahidrofolato

MTHFR Metilenotetrahidrofolato reductase

MTR Metionina sintase

NOD Nucleotide-binding oligomerization

OR Odds ratio

PCT Prega tricipital

PG Prostaglandinas

PCR Reacção em cadeia polimerase

QFA Questionário de frequência alimentar

RR Risco relativo

SGA Avaliação subjectiva global

SHMT Serina hidroximetiltransferase

SPSS Statistical package for social sciences

TBA Tecido branco adiposo

TNF Factor de necrose tumoral

USDA Departamento de agricultura dos Estados Unidos

Nutrição e Genes em Doenças Intestinais

X

Nutrição e Genes em Doenças Intestinais

XI

RESUMO

A nutrição é um dos principais factores modificáveis das doenças crónicas. Para além da sua

indispensável função como veículo de nutrientes para o organismo, desempenha também um efeito

fisiológico primordial ao ser parte integrante de muitas reacções ao nível celular. É sabido que por

um lado os nutrientes podem alterar a expressão e transcrição genética condicionando mecanismos

envolvidos na doença, e por outro podem também influenciar a predisposição para certas patologias

como resultado da variabilidade genética individual. Este último aspecto poderá justificar respostas

diferentes a estímulos nutricionais idênticos frequentemente detectadas em estudos que avaliam a

relação entre dieta e doença.

No cancro do cólon e recto (CCR) e na doença de Crohn (DC), duas patologias que afectam o

tracto gastrintestinal influenciando a relação individuo/dieta e consequente metabolização dos

nutrientes, muita atenção é dada ao estado nutricional dos indivíduos. São vários os estudos que

avaliam não só a importância dos nutrientes/alimentos no risco de doença, como também no

comportamento e actividade da mesma. Apesar dos inúmeros estudos, os seus resultados são

muitas vezes discordantes em ambas as doenças; nalguns, determinados nutrientes parecem ser

ou protectores ou promotores, ao passo que noutros esse efeito já não se observa. A hipótese em

questão parece poder estar relacionada com a heterogeneidade genética das populações em

estudo.

O conjunto dos quatro estudos que compõem esta tese pretende explorar a influência de

variáveis nutricionais e genéticas no desenvolvimento de duas doenças intestinais, em concreto o

CCR e a DC. Os estudos pretendem dar a conhecer de forma mais pormenorizada o padrão e

estado nutricional de duas populações distintas. Foram igualmente estudados alguns exemplos de

nutrigenética: a) foi estimado o risco de CCR associado à interacção entre a ingestão de

determinados nutrientes e polimorfismos de genes de susceptibilidade, e de metilação do ácido

desoxirribonucleico (DNA); b) no caso da DC, uma doença inflamatória, avaliou-se o efeito da

interacção entre os polimorfismos em genes que codificam as citocinas pró e anti-inflamatórias e o

tipo de gordura da dieta, também esta com influência no perfil inflamatório.

A presente tese divide-se em quatro capítulos.

O CAPÍTULO 1 consiste numa introdução geral, onde são expostos conceitos genéricos sobre

nutrição, genes e nutrigenética. É ainda apresentada uma revisão da literatura sobre estas

temáticas aplicadas ao CCR e à DC.

O CAPÍTULO 2 apresenta como temática central aspectos de nutrição e genes no CCR. O

estudo 1 é um estudo caso-controlo que incluiu 196 doentes com CCR e 200 indivíduos saudáveis.

Um dos objectivos deste estudo foi avaliar o padrão alimentar e sua influência no risco de CCR. Foi

avaliado o consumo dietético dos doentes (fase pré diagnóstico) e dos controlos, de forma a estimar

Nutrição e Genes em Doenças Intestinais

XII

o risco de CCR associado à ingestão de nutrientes. Do vasto número de nutrientes analisados,

foram identificados como nutrientes protectores: a fibra, o cálcio, a vitamina C e os carotenos.

Verificámos que as quantidades necessárias para conferir protecção coincidiam ou estavam muito

próximas das Dietary Reference Intakes (DRI) estabelecidas pela National Academy of Sciencies,

reforçando a importância da ingestão das doses mínimas necessárias de nutrientes, sem qualquer

necessidade acrescida. Por oposição, o único factor nutricional a apresentar-se como deletério para

o risco de CCR foi o álcool. Ainda no que respeita ao estado nutricional detectámos que, segundo o

índice de massa corporal (IMC), mais de 50% dos doentes com CCR apresentavam excesso de

peso/obesidade e apenas 5% apresentava baixo peso. Ainda no estudo 1 foi avaliado o risco de

CCR associado à presença de um polimorfismo no gene APC, importante supressor tumoral; como

factor isolado, o polimorfismo D1822V APC não influenciou o risco de CCR. É sabido que o CCR

resulta de uma interacção entre factores genéticos e ambientais, pelo que fomos estudar se

determinados nutrientes teriam um efeito divergente no risco de CCR associado ao perfil genético

do polimorfismo em questão. Observámos que o efeito protector conferido pela dieta rica em cálcio

e em fibra era mais evidente nos indivíduos portadores do genótipo com o alelo mutado; por outro

lado, constatámos também que, de forma a minimizar o risco de CCR os indivíduos com genótipo

wildtype deveriam consumir uma dieta com reduzido teor de colesterol.

O estudo 2 que também integra este capítulo é igualmente um estudo caso-controlo, envolvendo

doentes com CCR e indivíduos saudáveis. Neste estudo foi avaliada a influência individual e

conjunta de factores nutricionais (folato, vitamina B6 ou B12, aminoácidos e álcool) e factores

genéticos como os polimorfismos dos genes metilenotetrahidrofolato reductase (MTHFR), metionina

sintase (MTR), e serina hidroximetiltransferase (SHMT), todos implicados no ciclo de metilação e

síntese de DNA. Dos polimorfismos estudados, o localizado no codão 677 do gene da MTHFR foi o

único a revelar resultados estatisticamente significativos; a presença do polimorfismo de forma

isolada foi associada a um aumento significativo no risco de CCR, e quando estudado em

interacção com factores dietéticos verificámos que a sua presença se tornava especialmente

deletéria nos indivíduos com reduzido consumo de folato. Foi assim novamente verificado um

exemplo de nutrigenética associado ao CCR.

O CAPÍTULO 3 desta tese incluiu dois estudos (estudos 3 e 4) os quais abordaram as

temáticas: nutrição e genes na DC.

O estudo 3, um estudo caso-controlo que incluiu 78 doentes com DC com reduzida actividade e

80 controlos saudáveis, pretendeu avaliar o estado nutricional desta população. Os nossos

resultados mostraram que apenas menos do que 5% da nossa população tinha baixo peso, e

maioritariamente apresentava um IMC médio próximo do excesso ponderal, apesar de uma

marcada depleção na massa livre de gordura. A ingestão energética e a ingestão média diária

ajustada de glícidos, gordura monoinsaturada, fibra, cálcio, e vitaminas C, D, E e K eram

significativamente inferiores nos doentes. Verificámos ainda a frequente exclusão de alimentos

como o leite, vegetais, frutos ou cereais, que estava directamente associada à diminuição da

ingestão de micronutrientes.

Nutrição e Genes em Doenças Intestinais

XIII

Com a realização do estudo 4, que incluiu 99 doentes com DC, pretendemos estudar a

influência de variáveis genéticas e nutricionais na actividade da DC. No que respeita às variáveis

nutricionais avaliámos o consumo dos diferentes tipos de gordura, com potencial influência no

estado inflamatório do indivíduo. Relativamente à componente genética, estudámos polimorfismos

localizados em genes que codificam a produção de citocinas pró e anti inflamatórias: interleucina

(IL) 1, factor de necrose tumoral alfa (TNFα), linfotoxina alfa (LTα) e IL6. Questionámos de que

forma a presença destes polimorfismos e o consumo de gordura poderiam influenciar a resposta

inflamatória e com isso modificar a actividade da DC. Os resultados revelaram que, mesmo

isoladamente, o elevado consumo de gordura total, saturada, monoinsaturada, ou o genótipo

homozigótico para a variante 857 do TNFα se associavam a doença mais activa. No entanto a

presença desta variante era especialmente deletéria para os indivíduos que apresentavam um

elevado consumo de gordura total, monoinsaturada, saturada, um elevado ratio n-6:n-3 ou uma

dieta pobre em ácidos gordos polinsaturados n-3. Também o elevado consumo de gordura total ou

monoinsaturada era especialmente deletério nos indivíduos portadores da variante 174 do gene da

IL6. Verificou-se assim haver um sinergismo entre os polimorfismos e ingestão de gordura pela

observação do efeito deletério/promotor de um consumo elevado/baixo de gordura associado aos

polimorfismos de citocinas.

Por fim o CAPÍTULO 4 consiste na discussão dos resultados dos estudos contemplados; e

também uma reflexão sobre dúvidas e questões relacionadas com a temática da nutrigenética.

Destaca-se a importância da prática de uma dieta saudável, equilibrada, da manutenção do

peso corporal adequado e da prática de exercício físico regular em situações de CCR e de DC. Na

abordagem à nutrigenética, os nossos resultados parecem revelar a importância dos factores

nutricionais em indivíduos geneticamente susceptíveis, fazendo crer que nalguns subgrupos da

população (geneticamente susceptíveis) a nutrição pode assumir um papel preponderante no risco

de doença.

Palavras-chave: Nutrição, polimorfismos genéticos, cancro do cólon e recto, doença de Crohn.

Nutrição e Genes em Doenças Intestinais

XIV

Nutrição e Genes em Doenças Intestinais

XV

SUMMARY

Nutrition is a major modifiable factor for chronic diseases. In addition to its important role as a

nutrients‟ source to the human body; being an integral part of many cellular reactions, nutrition also

plays an important physiological effect. It is known that nutrients may change the expression and

gene transcription which influence mechanisms involved in disease; on the other hand they may also

influence the predisposition to certain diseases as a result of individual genetic variability. The latter

may explain different responses to identical stimuli often detected in studies aimed at evaluating the

relationship between diet and disease.

In colorectal cancer and Crohn's disease, two conditions affecting the gastrointestinal tract hence

likely to influence the relation between subjects and diet and subsequent nutrient metabolism, much

attention is paid to individual nutritional status. Several studies not only assess the significance of

nutrients/foods in disease risk, but also in its behavior and activity. Despite the numerous studies in

both diseases, results are often contradictory. In some, certain nutrients present themselves as

protectors or promoters, whilst this effect is no longer observed in others. The hypothesis to be

studied may derive from the potential relationship with the genetic heterogeneity of the populations

under study.

The four papers included in this thesis aim at exploring the influence of genetic and nutritional

variables in the development of two intestinal diseases, specifically colorectal cancer and Crohn's

disease. The studies illustrate a detailed pattern and nutritional status of two distinct populations. We

also studied some examples of nutrigenetics: a) the risk of colorectal cancer was estimated

depending on the interaction between the intake of certain nutrients and polymorphisms of

susceptibility genes and ADN methylation; b) in the inflammatory Crohn's disease, the interaction

between polymorphisms in genes encoding pro and anti-inflammatory cytokines and the type of

dietary fat, also known as modulatory of inflammatory status, were evaluated.

The present thesis is divided into four chapters.

CHAPTER 1 is a general introduction where common concepts about nutrition, genes and

nutrigenetics are exposed. It also presents a review of the literature on these topics applied to

colorectal cancer and Crohn's disease.

CHAPTER 2 is centered on nutrition, genes and colorectal cancer. Study 1 is a case-control

study involving 196 patients with colorectal cancer and 200 healthy individuals. One objective of this

study was to evaluate the dietary pattern and its influence on colorectal cancer risk. The dietary

intake of patients (pre diagnosis) and controls was evaluated in order to estimate the risk of

colorectal cancer associated with nutrient intake. From the vast number of analyzed nutrients some

were identified as protective: fiber, calcium, vitamin C and carotenoids. We found that the doses

Nutrição e Genes em Doenças Intestinais

XVI

required for protection coincided or were very close, to the Dietary Reference Intakes established by

the National Academy of Sciences, highlighting the importance of the minimum required nutrient

intake, without any increased need. By contrast, alcohol was the only nutritional factor identified as

deleterious for colorectal cancer risk. Moreover, with regard to nutritional status, according to body

mass index (BMI), we observed that over 50% of the population were overweight/obese and only 5%

presented low body weight. In this study we also evaluated the risk of colorectal cancer associated

with the presence of a polymorphism in the APC gene, an important tumor suppressor; we found that

the D1822V APC polymorphism per se did not influence colorectal cancer risk. It is known that

colorectal cancer results from an interaction between genetic and environmental factors, so we also

studied whether the intake of particular nutrients would have a dissimilar effect on colorectal cancer

risk depending on the profile of the above genetic polymorphism. We found that the protective effect

conferred by a diet rich in calcium and fiber was more obvious in individuals carrying the genotype

with the mutant allele; what's more, the holders of wildtype genotype should consume a diet low in

cholesterol to minimize the risk of colorectal cancer.

Also part of this chapter, study 2 is a case control study involving patients with colorectal cancer

and healthy subjects. This study evaluated the individual and combined influence of nutritional

factors (folate, vitamins B6 and B12, aminoacids and alcohol), and genetic factors such as

polymorphisms of genes MTHFR, MTR, SHMT, all implicated in the methylation and synthesis of the

DNA cycle. Among the studied polymorphisms, the one located in the 677 codon of MTHFR gene

was the only which showed statistically significant results; the effect of the polymorphism per se was

associated with a significant increase in colorectal cancer risk, and when analyzed in interaction with

dietary factors its presence became especially deleterious in individuals with low intake of folate.

Thus, we verified again an example of nutrigenetics associated with colorectal cancer.

CHAPTER 3 included two studies (studies 3 and 4) which addressed the topics: nutrition and

genes in Crohn's disease.

Study 3, a case control study that included 78 patients with mildly active Crohn's disease and 80

healthy controls, aimed at assessing nutritional status. Our results showed that underweight was

found in less than 5% of the evaluated population, whose overall mean BMI almost reached

overweight values, despite the marked depletion in fat-free mass. Energy intake and adjusted mean

daily intake of glicids, monounsaturated fat, fibre, calcium and vitamins C, D, E and K were

significantly lower. Furthermore we did verify frequent foods‟ exclusion, such as milk, vegetables,

fruits or cereals, which was directly associated with a decreased intake of micronutrients.

Study 4 that included 99 patients with Crohn´s disease aimed at studying the influence of genetic

and nutritional variables in the activity of Crohn's disease. In what concerns nutritional variables we

assessed the consumption of different types of fat, due to their potential influence in individual

inflammatory status. Regarding the genetic component, we studied polymorphisms located in genes

that encode pro and anti inflammatory cytokine production: interleukin 1 (IL1), tumor necrosis factor

alpha (TNFα), lymphotoxin alpha (LTα) and IL6. We hypothesized whether the presence of these

Nutrição e Genes em Doenças Intestinais

XVII

polymorphisms and fat consumption might influence the inflammatory response and thereby modify

DC activity. Results showed that, even on their own, high intake of total fat, saturated,

monounsaturated, or the genotype homozygous for the variant 857 of TNFα were associated with a

more active disease. However, the presence of this variant was especially harmful for individuals

with a high intake of total fat, monounsaturated, saturated, a high n-6:n-3 ratio or a diet low in

polyunsaturated fatty acids n-3. High intakes of total or monounsaturated fat were also particularly

deleterious in patients with the variant 174 of the IL6 gene. A synergy between the polymorphism

and intake of fat was thus revealed due to the observation of a deleterious/promoter effect of a

high/low consumption of fat associated with cytokine polymorphisms.

Finally CHAPTER 4 outlines a global discussion of the results obtained in the original studies; it

also addresses some reflections and thoughts about nutrigenetics.

This work highlights the importance of a healthy and balanced diet, the maintenance of an

adequate body weight and of a regular physical exercise practice in cases of CRC and CD. In what

concerns nutrigenetics, our results seem to show the importance of nutritional factors in genetically

susceptible individuals, further suggesting that in some population subgroups (genetically

susceptible) nutrition may play a leading role in the risk of disease.

Key-words: Nutrition, genetic polymorphisms, colorectal cancer, Crohn‟s disease.

Nutrição e Genes em Doenças Intestinais

XVIII

Nutrição e Genes em Doenças Intestinais

1

CAPÍTULO 1

Nutrição e Genes em Doenças Intestinais

2

Nutrição e Genes em Doenças Intestinais

3

I) FUNDAMENTAÇÃO TEÓRICA

1. NUTRIÇÃO

Desde Hipócrates que a nutrição é considerada um elemento essencial à vida humana.

Actualmente, a nutrição é reconhecida como um vasto campo de conhecimentos integrados

abrangendo um conjunto de conhecimentos relacionados com o metabolismo de nutrientes

com importante papel na promoção da saúde e prevenção da doença; na fisiopatologia de

várias doenças muito frequentes quer por excesso quer por défice de nutrientes; na

terapêutica da doença ao actuar como terapêutica nutricional e por fim como veículo de

nutrientes isolados que podem actuar como agentes preventivos ou terapêuticos (1).

Nos últimos 10.000 anos, desde o paleolítico até aos dias de hoje, registou-se uma

profunda alteração no padrão e comportamento alimentar dos indivíduos (2). Recentemente,

com a expansão da industrialização, a urbanização e a globalização económica ocorridas na

segunda metade do século XX, primeiro nos países desenvolvidos e mais recentemente nos

países em desenvolvimento, foram muitas as mudanças no padrão alimentar e estilos de vida

com impacto significativo na saúde e estado nutricional das populações (3). Alimentos e

produtos alimentares tradicionalmente produzidos e comercializados num contexto local

passaram a abranger um mercado mais global proporcionando uma maior oferta e

diversificação no consumo alimentar. Se por um lado passou a existir uma maior

disponibilidade e acesso a alimentos facilitando a diversidade alimentar, por outro emergiram

padrões alimentares e estilos de vida pouco saudáveis, acompanhados por uma taxa

crescente de doença crónicas (3). Observou-se um aumento no consumo de alimentos

altamente energéticos, ricos em gordura, especialmente saturada e pobre em hidratos de

carbono complexos, acompanhado por um declínio no dispêndio de energia associado a um

estilo de vida sedentário, onde é dada primazia aos transportes motorizados e à eliminação

progressiva de actividades fisicamente exigentes no local de trabalho e nos tempos de lazer

(4,5).

A nutrição é actualmente considerada um dos principais factores determinantes

modificáveis das doenças crónicas, com evidência científica a suportar a ideia de que

alterações na dieta têm fortes implicações, positivas e/ou negativas, na saúde de cada

indivíduo durante todo o seu ciclo de vida (3,6). À luz do conhecimento actual a nutrição já

não é apenas estudada na sua perspectiva clássica, na qual é considerada como um veículo

major de nutrientes que suprem as necessidades nutricionais do indivíduo (2,7). Actualmente

o moderno conceito de nutrição é suportado pelo facto de alguns alimentos e/ou ingredientes,

para além do seu papel nutritivo, apresentarem também um efeito fisiológico benéfico para o

organismo (2). Este tipo de nutrientes/alimentos são designados de funcionais e incluem entre

outros os ácidos gordos polinsaturados (AGPI) n-3, cujas fontes são alimentos como os

peixes gordos (ex. salmão, sardinha), sementes ou frutos oleaginosos. Também os polifenóis,

a fibra ou os fitoesteróis são nutrientes cuja relação com a doença tem vindo a ser

amplamente estudada com o intuito da optimização do estado físico e mental do indivíduo

(2,8). As recomendações nutricionais para o alcance de um óptimo estado de saúde são

Nutrição e Genes em Doenças Intestinais

4

desde há muito publicadas por entidades de referência como a Organização Mundial de

Saúde (9) ou o Departamento de agricultura dos Estados Unidos (USDA) (10). É no entanto

interessante observar que a recomendação de consumo de determinados

alimentos/nutrientes específicos (funcionais), faz cada vez mais parte integrante das

recomendações para tratamento de determinadas patologias (11). Constata-se assim que a

nutrição de hoje apresenta um importante papel não só na promoção da saúde mas também

na prevenção e tratamento da doença (3,6).

2. GENES

Estima-se que o genoma humano possua entre 25.000-40.000 genes (12,13). Os genes

são segmentos de cadeias de DNA, compostos por uma sequência de bases nucleótidicas

(adenina, timidina, guanina, e citosina) que codificam a informação que permite a síntese de

proteínas necessárias ao funcionamento do organismo humano. Cada conjunto de três bases

que compõem a cadeia de DNA vai caracterizar um aminoácido a ser incorporado numa

proteína. As proteínas codificadas por genes executam várias funções celulares, incluindo o

metabolismo de nutrientes, fármacos ou toxinas (14). Na última década, com o mapeamento

do genoma humano foram reconhecidas mais de 1000 mutações responsáveis por doenças

humanas e foram identificadas mais de 3 milhões de alterações nas bases da sequência do

DNA (13). Estas variações são designadas de polimorfismos que, na maioria das vezes, não

provocam alterações significativas na estrutura, actividade ou expressão das proteínas

(12,15); porém, na presença de determinados estímulos ambientais, nomeadamente

nutricionais, poderão aumentar a susceptibilidade ou protecção a determinadas doenças (15).

A determinação da sequência do genoma humano veio facilitar o estudo da relação entre

inúmeras variantes de genes polimórficos presentes nas populações humanas e seu impacto

na patogénese de diversas patologias (13,16,17). A interpretação e detecção de mutações

genéticas, com elevada penetrância, determinantes para o desenvolvimento das doenças

monogénicas, como a fenilcetonúria ou fibrose quística, são bem conhecidas. A sua

incidência no genoma humano é contudo reduzida quando comparada com a incidência de

variações alélicas, causadoras de polimorfismos que contribuem de forma muito reduzida

para o risco de desenvolver doença (18). No desenvolvimento de doenças poligénicas, o

efeito destes polimorfismos é muitas vezes difícil de avaliar. Nestas doenças a constituição

genética individual, definida por uma combinação única de variantes de milhares de genes

polimórficos que regem vias metabólicas e sistemas regulatórios, interage com inúmeras

influências ambientais, tornando-se difícil prever de que forma estas interacções irão

condicionar a expressão do genótipo, e consequentemente um fenótipo indicador de um

estado de saúde e/ou doença (19). É cada vez mais consensual que a interacção entre os

genes e a interacção entre genes e ambiente podem alterar as associações dos

polimorfismos e o processo da própria doença (20). Por este motivo a investigação actual

neste âmbito centra-se na a) caracterização dos genes representados pelos 3 biliões de

nucleótidos que compõem a cadeia de DNA; b) identificação das proteínas codificadas por

cada um dos genes e compreensão da sua função (proteómica); c) associação das variações

genéticas com determinadas doenças específicas; d) compreensão do modo como genes,

Nutrição e Genes em Doenças Intestinais

5

proteínas e factores ambientais interagem de forma a causar disfunção fisiológica que resulta

em doença; e e) identificação de metabolitos que serão úteis na monitorização da progressão

da doença (metabolómica) (21).

3. NUTRIGENÉTICA

No século XXI, é um importante campo de investigação a compreensão da relação entre a

nutrição e a genética, que procura atingir conhecimentos que permitam o desenvolvimento de

recomendações/guidelines que promovam a saúde e previnam a doença (22). As actuais

guidelines dietéticas não têm em consideração as eventuais diferenças genéticas individuais

na resposta ao padrão alimentar, o que poderá afectar a nível individual a eficácia dessas

recomendações (23,24). São ainda pouco claros os mecanismos responsáveis pelas

diferenças individuais na resposta à dieta (24). Actualmente sabe-se que: 1) o padrão

alimentar ou nutrientes específicos poderão influenciar o risco de doença ao alterar processos

envolvidos no início, progressão ou gravidade da doença; 2) os nutrientes poderão influenciar

o genoma humano de forma directa ou indirecta, influenciando assim a sua expressão; 3) os

efeitos da dieta na saúde estão dependentes do equilíbrio entre estado de saúde e/ou doença

e a susceptibilidade genética individual (23,25,26). Estes pressupostos têm motivado a

investigação quanto à forma como a dieta influencia a relação entre a saúde e a doença: se

porque altera a expressão genética individual, ou se porque influencia a predisposição para

certas patologias como resultado da variabilidade genética dos indivíduos (20,23,27). No

campo da genética nutricional, destacam-se dois novos conceitos, a nutrigenómica e a

nutrigenética (28). A nutrigenómica baseia-se no estudo de como os nutrientes podem alterar

a expressão génica do indivíduo, nomeadamente ao nível do genoma, proteoma e

metaboloma, ao passo que a nutrigenética se baseia na identificação, classificação e

caracterização de variações genéticas humanas que alteram o metabolismo e utilização de

nutrientes, levando à compreensão de como a susceptibilidade genética influencia a resposta

à dieta (22, 25, 28).

A aplicação da nutrigenética possibilita a análise de variações individuais nos genes com

implicações no metabolismo dos nutrientes, criando a expectativa de ser possível a

personalização da dieta consoante a identidade genética individual do consumidor (29). Este

conceito baseado na susceptibilidade genética, por oposição ao determinismo genético, leva

à possibilidade de identificar indivíduos com vias metabólicas menos eficientes, pelo que as

suas recomendações nutricionais têm de ser mais individualizadas (21,30). No âmbito da

saúde pública, com a aplicação da nutrigenética, poderá ser possível desenvolver guidelines

nutricionais baseadas em informação genética ou optimizar medidas de intervenção

comunitária, como por ex. fortificação ou suplementação de nutrientes em determinadas

populações; no contexto clínico poderá ser possível individualizar, com base na

susceptibilidade genética, a terapêutica nutricional em função da doença (31). Acresce que

dado o grau de personalização aplicado na nutrigenética, esta poderá promover uma

motivação extra na adesão à terapêutica nutricional (32). Contudo, apesar da evidência actual

revelar que a relação dieta-genes é um campo promissor, os resultados não são ainda

suficientes para se dar início a recomendações nutricionais personalizadas. Só com o avanço

Nutrição e Genes em Doenças Intestinais

6

do conhecimento desta interacção em diferentes contextos clínicos poderá ser possível

perceber e conhecer de forma mais precisa a resposta do indivíduo à dieta, e com isso

realizar um aconselhamento nutricional personalizado, baseado no perfil e susceptibilidade

genética de cada indivíduo (25,33,34).

4. CANCRO DO CÓLON E RECTO

O cancro do cólon e recto (CCR) é um dos tumores mais prevalentes da sociedade de

hoje, em particular nos países desenvolvidos (35-37). À escala mundial, este tumor

representa a terceira maior causa de morte por cancro nos homens e a segunda nas

mulheres (37). Em estatísticas de 2008, o CCR é responsável nos Estados Unidos da

América (EUA) por 9% das mortes por cancro e por 12% na Europa (38). Em Portugal, as

estatísticas indicam que o CCR é o tipo de tumor mais frequente em localizações comuns aos

dois sexos (1 em cada 6 tumores malignos diagnosticados), sendo o segundo cancro com

maior incidência em ambos os géneros (38). A taxa de mortalidade associada a este tumor é

elevada, contribui para 15% do total da mortalidade oncológica em Portugal, traduzindo-se

por aproximadamente 8 mortes/100 000 habitantes/ano (38,39); de notar que a mortalidade

por CCR aumentou cerca de 80% nas duas últimas décadas do século XX (40). O CCR

constitui em Portugal um grave e premente problema de saúde pública (41).

Sabe-se hoje que a origem do CCR é multifactorial, estando reconhecida na sua

etiopatogénese a complexa interacção entre factores ambientais e susceptibilidade genética

(42,43).

4.1. FACTORES AMBIENTAIS

Também designados de factores modificáveis, os factores ambientais implicados no CCR,

referem-se à composição corporal, exercício físico e padrão alimentar (44,45).

Composição Corporal

Segundo dados revelados pelo relatório dos World Cancer Research Fund/American

Institute for Cancer Research, há suficiente evidência epidemiológica para afirmar que a

obesidade é um factor de risco para o CCR (44). A metanálise, realizada por Moghaddam e

colaboradores, que incluiu 70.000 indivíduos oriundos de 18 estudos de coorte realizados nos

continentes Europeu, Americano e Asiático, revelou que indivíduos obesos (IMC superior a

30kg/m2) apresentavam um aumento de aproximadamente 20% no risco de CCR (RR =1,19;

IC 95%: 1,11-1,29) quando comparados com indivíduos normoponderais (46). Resultados

semelhantes foram obtidos por Marques Vidal e colaboradores, numa metanálise de 11

estudos de coorte através da qual se verificou um aumento de 50% no risco de CCR nos

indivíduos obesos (RR=1,50; IC 95%:1,30-1,73) (47). Os mecanismos deste aumento de risco

associado à obesidade não são claros, mas presume-se que o CCR e o excesso de massa

gorda estejam interligados por mecanismos de inflamação crónica associados à obesidade

com reflexos na mucosa cólica (48). Com o aumento do número de adipócitos verifica-se

maior libertação de adipocitocinas, onde se inclui a leptina e a adiponectina, e citocinas pró-

inflamatórias como o TNFα e a IL6 (49,50). Os elevados níveis destas citocinas estão

Nutrição e Genes em Doenças Intestinais

7

associados ao aumento da resistência à insulina, com maior quantidade de insulina circulante

e diminuição da tolerância à glicose (51). Estudos experimentais em animais revelam que a

insulina promove a hiperproliferação das células do cólon (50) diminuindo também a apoptose

(52). Também a presença de leptina elevada parece promover a mitose celular e diminuir a

apoptose das células epiteliais (53). Acresce que um ambiente inflamatório pode induzir a

activação do factor de transcrição NFKβ e aumentar a expressão da óxido nítrico sintase e

Cox-2, mecanismos associados à supressão da apoptose (54). Colectivamente, estes

diferentes fenómenos surgem como mecanismos explicativos da associação entre obesidade

e CCR (55).

Actividade física

Foi avaliada a relação entre a prática de actividade física e risco de CCR em vários

estudos coorte (56-59). Segundo a literatura, a actividade física parece ter um maior efeito

protector no cancro do cólon (44,59) do que noutros tipos de cancro (60); não existindo

evidência de que a actividade física seja protectora para o desenvolvimento de tumores ao

nível do recto (56,59,61). Num estudo prospectivo multicêntrico, realizado em vários países

Europeus que incluiu 413.000 participantes, Friedenreich e colaboradores observaram

redução do risco de cancro do cólon em cerca de 20% nos indivíduos mais activos (59).

Huxley e colaboradores observaram a mesma tendência numa recente metanálise de 27

estudos coorte que incluiu 27.482 indivíduos e também verificou uma redução do risco nos

indivíduos mais activos (45). Os mecanismos que conferem protecção pela prática da

actividade física parecem estar relacionados com: a) aceleração do trânsito intestinal,

diminuindo o tempo de exposição da mucosa a potenciais carcinogéneos, b) melhoria da

resistência à insulina, c) diminuição da massa gorda corporal, d) melhoria no rácio das

prostaglandinas F e E2, com consequente aumento da F (estimuladora da motilidade intestinal

e inibidora da proliferação celular da mucosa cólica), e diminuição da E2 (promotora da

proliferação celular) (60,62).

Padrão Alimentar

É reconhecido que a nutrição tem um papel importante na prevenção deste tipo de tumor;

nos países industrializados é geralmente aceite que mais de 50% dos CCR são atribuídos a

causas alimentares (45,63,64). Com a informação do mais recente relatório dos World Cancer

Research Fund/American Institute for Cancer Research, tornaram-se conhecidas diversas

associações, com maior ou menor grau de evidência, entre alimentos/nutrientes e o risco de

CCR (44).

No que respeita aos alimentos, o elevado consumo de carne vermelha, carne processada

e bebidas alcoólicas encontra-se significativamente associado a um maior risco de CCR;

alimentos como o alho e o leite parecem revelar uma tendência protectora no risco de CCR

(44). No que diz respeito aos nutrientes, aqueles que provavelmente desempenham um papel

mais evidente na protecção para o CCR são a fibra e o cálcio. Quanto ao folato, vitamina D,

selénio, verifica-se uma ligeira tendência de efeito protector; e uma ligeira tendência de efeito

Nutrição e Genes em Doenças Intestinais

8

promotor para o ferro, açúcares e gordura animal, sem forte grau de evidência associado

(44).

Um dos objectos em análise neste trabalho foi o estudo da relação entre nutrientes e CCR,

que a seguir será sucintamente explanado.

Fibra

Existem muitos estudos caso-controlo que assinalam o efeito protector deste nutriente no

risco de CCR (64,65); contudo um elevado número de estudos coorte de grandes dimensões,

realizados nos EUA e Europa, não demonstraram de forma conclusiva o efeito protector da

fibra (66-71). Os possíveis efeitos benéficos deste nutriente prendem-se com: o aumento do

volume fecal associado a uma maior diluição de potenciais carcinogéneos; com a aceleração

do trânsito intestinal e menor tempo de contacto entre possíveis carcinogéneos e a mucosa

intestinal; e também com o aumento da fermentação bacteriana dando origem aos ácidos

gordos de cadeia curta: acetato, propionato e butirato (72). Sabe-se que o butirato é a

primeira fonte de energia para o epitélio do cólon, estimulando o seu crescimento; inibe ainda

o crescimento das células tumorais promovendo também a apoptose celular (73). Apesar da

inconsistência de resultados são várias as entidades, como a American Gastroenterological

Association, World Health Organization e o National Cancer Institute, que recomendam um

consumo diário de fibra que atinja 30-35g/dia (74).

Cálcio

Segundo os World Cancer Research Fund/American Institute for Cancer Research,

também a ingestão de cálcio poderá ter um papel protector no desenvolvimento do CCR (44).

Este relatório atribui uma forte evidência para esta associação, sobretudo fundamentada em

estudos essencialmente experimentais em humanos com recurso à suplementação em cálcio

(44); mantém-se a dúvida se o cálcio de origem alimentar terá os mesmos efeitos protectores

(75).

O papel protector do cálcio no CCR parece associar-se à prevenção primária deste tumor,

ao reduzir o risco de desenvolvimento do tumor numa fase anterior à alteração neoplásica

(76). São muitos os mecanismos que poderão explicar esta associação protectora. In vitro,

este nutriente forma sabões cálcicos insolúveis ao reagir com os ácidos gordos ionizados e

com ácidos biliares, reduzindo os efeitos nefastos destes compostos (77,78). Está igualmente

descrito que a presença de cálcio poderá também influenciar a actividade proliferativa da

mucosa cólica (79). Apesar destes mecanismos teoricamente protectores, alguns estudos

prospectivos da década de noventa não demonstraram protecção por parte do cálcio no

aparecimento de adenomas (80,81). Contudo, foram recentemente publicados estudos

prospectivos (82-84) e uma meta-análise (85) que revelaram uma relação inversa entre

consumo de cálcio e CCR. Assim, dos resultados até agora publicados, destaca-se a

recomendação para evitar o baixo consumo de cálcio (valores inferiores às DRI: 1000mg/dia)

com o objectivo de minimizar o risco de CCR (86).

Nutrição e Genes em Doenças Intestinais

9

Vitamina D

O consumo de vitamina D apresenta-se como possível protector de CCR por estar

intimamente associada ao metabolismo do cálcio (75). Estudos experimentais in vitro com

células humanas sugerem que esta vitamina induz a diferenciação celular e inibe a

proliferação; ou por efeito directo, ao induzir alterações na expressão de genes envolvidos no

controlo da proliferação celular (87) ou por potenciar a absorção de cálcio (88,89). Embora

com resultados ainda pouco claros, a associação inversa entre CCR e consumo de vitamina

D tem sido confirmada em alguns estudos prospectivos de coorte (83,90,91) e também em

estudos caso-controlo (92,93). Da metanalise realizada por Gorham e colaboradores que

analisou 18 estudos observacionais, destaca-se que o consumo diário de 1000 UI de vitamina

D poderá conferir uma redução de 50% no risco de CCR (94).

Folato

Segundo os World Cancer Research/American Institute for Cancer Research os alimentos

ricos em folato têm um papel pouco claro na protecção do CCR (44). A eventual protecção

desta vitamina é pela primeira vez referida por Freudenheim e colaboradores (95) ao

observarem que uma dieta com baixos níveis de folato e metionina e elevado teor de álcool

estava associada a um aumento no risco de CCR. Vários foram os estudos posteriores a

sugerir que a deficiente ingestão de folatos aumenta o risco de CCR (96-99). O folato é obtido

na dieta através do consumo de leguminosas, vegetais, frutos oleaginosos ou cereais. O

mecanismo através do qual esta vitamina pode influenciar o processo de carcinogénese

parece estar relacionado com o seu envolvimento tanto na síntese como na metilação do

DNA (100,101). O folato circula no sangue sob a forma de 5-metiltetrahidrofolato (5-MTHF),

fonte de grupos metilo necessários à síntese de nucleótidos fundamentais para a síntese e

reparação do DNA. Actua também como dador de grupos metilo para a remetilação da

homocisteína em metionina, que posteriormente será metabolizada em S-adenosilmetionina,

dador universal de grupos metilo, fundamentais para a metilação da citosina na molécula de

DNA (102). A deficiência de folato promove e acelera o processo de carcinogénese por alterar

estes processos. Com uma reduzida ingestão desta vitamina, fica alterada a síntese de

precursores de DNA e incompletos os mecanismos de reparação do DNA. Na presença de

uma dieta pobre em folatos, a molécula de uracilo que habitualmente não se encontra

presente na cadeia de DNA, é nela incorporada em vez da timidina resultando em quebras na

cadeia de DNA (103). Acresce que níveis alterados de metilação da citosina conduzem a

hipometilação do DNA promovendo a sobreexpressão de vários genes, incluindo oncogenes

que conduzem à desregulação na proliferação celular (103,104). A hipometilação conduz

também a quebras na cadeia de DNA, originando mutações que contribuem para a expressão

alterada de genes envolvidos na carcinogénese colorectal como é o caso do gene APC (105).

Na recente metanálise de Kim e colaboradores (106), a protecção conferida pelo consumo de

folato só foi observada para consumos superiores a 409µg/dia, valor semelhante à DRI

(400µg/dia) estabelecida pela National Academy of Sciencies (107).

Nutrição e Genes em Doenças Intestinais

10

Selénio

Os estudos que avaliam a associação entre o consumo dietético de selénio e CCR são

essencialmente de caso-controlo (108-112). Apesar de nem sempre significativos os seus

resultados revelam, na sua grande maioria, uma diminuição no risco de CCR associado a um

maior consumo de selénio (109,111,112). Os mecanismos anticarcinogénicos que suportam

estes resultados estão associados à indução da apoptose (113), ao papel antioxidante e anti-

inflamatório do selénio, como constituinte das enzimas glutatião peroxidase e selenoproteina

P, com extrema importância na diminuição do stress oxidativo (114).

Ferro

O ferro poderá promover a carcinogénese colo-rectal ao gerar radicais livres que danificam

o DNA, devido às suas características pro-oxidantes (115,116). Estudos epidemiológicos

revelam evidência de associações positivas entre CCR e elevadas reservas de ferro no

organismo (117-119). O efeito nefasto do ferro surge associado ao ferro heme (120) que

revelou em estudos experimentais em animais: a) ter propriedades citotóxicas e

hiperproliferativas ao nível da mucosa do cólon (121), b) induzir a peroxidação de gorduras

com consequente efeito dos lipoperóxidos na carcinogénese, e c) promover a activação das

aminas heterocíclicas (122) e de compostos nitrogenados (120), ambos potentes mutagéneos

e carcinogéneos.

Gordura animal

Quase há 4 décadas, Ernest Wynder relacionou o aumento da mortalidade por cancro do

cólon aos países com maior consumo de gordura per capita (123). Mais tarde, seis estudos

prospectivos estudaram a relação entre gordura animal e CCR (67,124-128); três revelaram

um aumento de risco associado ao elevado consumo de gordura animal (67,125,128). Os

mecanismos teóricos propostos para esta associação foram estudados em modelos animais e

relacionam-se com o facto de dietas ricas em gordura animal determinarem uma maior

excreção de ácidos biliares que parecem actuar como promotores da tumorogénese ao

causarem danos nas membranas celulares (129). Apesar de descritos os mecanismos

biológicos que associam o risco de CCR ao consumo de gordura animal, segundo os World

Cancer Research Fund/American Institute for Cancer Research Report não há ainda

evidência científica suficiente a suportar esta ideia (44). A recente metanálise de Alexander e

colaboradores, que incluiu resultados de estudos prospectivos e de estudos caso-controlo,

suporta esta mesma ideia, ao observarem uma falta de associação significativa entre o

consumo de gordura animal e o CCR (RR:1,15 IC95%=0,93-1,42) (130).

Açúcares

Os açúcares foram dos primeiros nutrientes a ser identificados como eventuais

potenciadores da carcinogénese colo-rectal (131), ao poderem provocar um aumento da

resposta glicémica com consequente aumento da produção de insulina, que pode actuar

como factor de crescimento e promover a carcinogénese (132). Os resultados de estudos

publicados têm-se revelado muito divergentes; alguns estudos recentes contrariam a hipótese

Nutrição e Genes em Doenças Intestinais

11

de que uma dieta com elevada carga glicémica influencie o risco de CCR (133-135),

contrapondo com outros estudos coorte ou caso-controlo que revelam uma relação positiva

entre dieta com elevada carga glicémica e CCR (136-138). A disparidade de resultados torna

inconsistente a relação entre açúcares e CCR (44).

Álcool

Por ser um antagonista do metabolismo do folato, o álcool surge classicamente

referenciado como promotor da carcinogénese colo-rectal (95,98,139); são vários os

mecanismos que apoiam essa eventual relação: a) diminuição da absorção de folato e

vitamina B6 com consequentes alterações no seu metabolismo resultando numa diminuição

da síntese de grupos metilo (140), b) redução da actividade da metionina sintetase,

diminuindo os níveis de S-adenosilmetionina (141,142), c) produção por oxidação do

acetaldeído, metabolito carcinogénico (143,144) d) diminuição da síntese hepática do

glutatião, via transulfuração da homocísteina, aumentando assim a susceptibilidade à

actividade peroxidativa (145,146), e) inibição da actividade da enzima DNA metilase

responsável pela transferência de grupos metilo para o DNA (139). A evidência obtida através

de estudos coorte e caso-controlo revela que um consumo regular, de longa duração e

superior a 30g de etanol/dia poderá aumentar o risco de CCR nos homens e provavelmente

nas mulheres (44).

4.2. FACTORES GENÉTICOS

Na etiopatogénese do CCR também se encontram implicados factores genéticos (42,147).

São reconhecidas 3 formas de doença: as formas esporádicas, os síndromas hereditários e

as formas familiares (147). Cerca de 70% de todos os CCRs correspondem a formas

esporádicas da doença que seguem a via supressora da carcinogénese, conforme hipótese

formulada por Fearon e Vogelstein na década de 80 (105). Esta via caracteriza-se pela

acumulação de mutações e perdas alélicas em diversos genes supressores tumorais, entre

os quais se destaca a inactivação do gene Adenomatous Polyposis Coli (APC) (105).

Os restantes 30% têm uma forte componente hereditária (147); dentro destes, 5%

resultam de mutações com elevada penetrância em alguns genes específicos. A presença

destas mutações conduz ao desenvolvimento de dois síndromas distintos: a polipose

adenomatosa familiar e o carcinoma hereditário do cólon não associado a polipose (50). O

primeiro caracteriza-se por um excesso de adenomas ao longo de todo o cólon; a causa

deste síndroma reside numa mutação germinal no gene APC (148). Ao contrário da polipose

adenomatosa familiar, o carcinoma do cólon hereditário não associado a polipose, também

designado por síndrome de Lynch, não tem uma expressão fenotípica característica e o seu

desenvolvimento resulta de mutações germinais nos genes de reparação do DNA (149,150).

A acumulação destas mutações resulta de um sistema de reparação inactivado, e esta via de

carcinogénese designa-se por via mutadora da carcinogénese (151). Os restantes 25%

correspondem a formas familiares de CCR cujos mecanismos se encontram pouco

esclarecidos, tanto do ponto de vista clínico como do ponto de vista molecular (152,153).

Neste contexto, o risco de desenvolver CCR em indivíduos sem história familiar de CCR e

Nutrição e Genes em Doenças Intestinais

12

com idade superior a 50 anos é de 5-6%. Este número aumenta para 20% quando existe

história de CCR num parente em 1º ou 2º grau e atinge 80-100% nos indivíduos detentores

de um dos síndromas antes referidos (154).

4.3. NUTRIGENÉTICA NO CCR

É hoje reconhecido que a dieta pode influenciar a expressão génica e que também o

património genético de cada indivíduo pode ser responsável por respostas diferentes a

estímulos nutricionais idênticos (23,155,156). No caso do CCR estão descritos polimorfismos

em genes de susceptibilidade como o gene APC, ou em genes essenciais para a metilação

do DNA como o da Metilenotetrahidrofolato Reductase (MTHFR) que, em interacção com

alguns nutrientes, parecem influenciar o risco de CCR (157).

Exemplo do ciclo do folato

No que respeita às aplicações da nutrigenética no CCR, aquela que mais consenso obtém

está relacionada com o folato e polimorfismos no gene MTHFR, ambos fundamentais no ciclo

de metilação e síntese de DNA (Figura 1). Este gene codifica uma enzima fundamental no

metabolismo do ácido fólico e metionina (100,158); trata-se de uma enzima termolábil cuja

actuação tem como substrato o 5,10-MTHF, e como produto o 5-MTHF, a forma activa de

folato no plasma. Este último composto é um dador fundamental de grupos metilo que, em

presença de vitamina B12 como co-factor, permite a metilação da homocisteína em metionina.

A metionina é precursora da S-adenosilmetionina, fornecedora universal dos grupos metilo

para a maioria das reacções de transmetilação, incluindo a metilação do DNA (100,158).

Também o substrato desta enzima, 5,10-MTHF, desempenha um importante papel na síntese

de DNA, uma vez que é um co-factor para a síntese de novo dos nucleótidos, permitindo uma

conversão equilibrada da desoxiuridilato em timidilato, pela acção da timidilato sintetase

(100,158).

Figura 1. Ciclo do ácido fólico e metionina. Adaptado de (158).

Nutrição e Genes em Doenças Intestinais

13

Estudos recentes revelam que o polimorfismo C677T MTHFR pode modular o risco de

CCR dependendo dos níveis de folato (159-161). Descrito em 1995, este é o polimorfismo

mais frequentemente estudado e o que parece ter maior influência na actividade da enzima.

O polimorfismo consiste numa substituição da base citosina por uma timidina no codão 677,

que se traduz por uma substituição do aminoácido valina por alanina (GCC→GTC) (162).

Este polimorfismo determina que a actividade desta enzima esteja reduzida a 30% em

indivíduos homozigóticos para o polimorfismo (TT) quando comparados com indivíduos sem o

alelo mutado (CC). A redução da actividade desta enzima tem efeitos nos níveis de folato

sérico, com consequente aumento da homocisteína sérica bem como um aumento dos níveis

de 5,10-MTHF (162). É sabido que os indivíduos com o genótipo homozigótico para a variante

(TT) apresentam uma redução de 40-50% no risco de CCR por comparação com os wild type

(CC) (163). No entanto a protecção conferida por esse genótipo homozigótico só foi

observada maioritariamente em indivíduos com níveis de folato adequados; naqueles com

reduzida ingestão de folato ou elevado consumo de álcool, foi abolido o efeito protector

conferido pelo genótipo MTHFR 677TT (164,165).

Exemplo do gene Adenomatosus Polyposis Coli

Outro exemplo de nutrigenética no CCR está relacionado com um polimorfismo localizado

no gene supressor tumoral APC, cuja inactivação é determinante para a iniciação do

processo de carcinogénese colo-rectal (105). Este polimorfismo consiste numa substituição

da base adenina por uma timidina no codão 1822 e caracteriza-se pela substituição do

aminoácido aspartato pelo aminoácido valina (GAC→GTC) (166).

Até à data a influência dos hábitos alimentares e da variante deste gene no

desenvolvimento do CCR foi avaliada em apenas dois estudos (167,168). O primeiro, um

estudo caso-controlo realizado numa população americana, revelou que indivíduos

homozigóticos para o polimorfismo (TT) na presença de uma dieta pobre em gordura,

apresentavam menor risco de cancro do cólon quando comparado com os heterozigóticos ou

indivíduos sem a variante (OR:0,2 IC95%=0,1-0,5). Concluiu-se assim que o genótipo

homozigótico para o alelo mutado parece ter um efeito protector, mas apenas quando a dieta

é pobre em gordura (167). No segundo estudo, também caso controlo, mas realizado numa

população europeia, não foram observadas diferenças significativas no risco de CCR

consoante o genótipo do polimorfismo D1822V APC. Observaram também que não existia

qualquer interacção entre o genótipo e ingestão dietética (teor de gordura) e CCR (168).

5. DOENÇA DE CROHN

A doença de Crohn (DC) é uma doença inflamatória do trato gastrintestinal que

actualmente afecta milhões de indivíduos em todo o mundo (169). Foi inicialmente

considerada uma doença de países desenvolvidos, como os do norte da Europa ou da

América do Norte, mas recentemente tem-se verificado um aumento da taxa de incidência e

prevalência de forma mais generalizada (170-172). Este aumento de incidência e prevalência

tem vindo a crescer paralelamente ao desenvolvimento sócio-económico das populações e

adaptação a um estilo de vida ”industrializado” (173-175).

Nutrição e Genes em Doenças Intestinais

14

Nos EUA está descrita uma prevalência de DC de 4 a 50 casos por cada 10.000

habitantes, afectando na mesma proporção homens e mulheres (174,176). Na Europa, a

tendência é semelhante no que respeita ao género, e actualmente a prevalência é de 10 a 40

casos por cada 10.000 habitantes (177). Em Portugal, são escassos os dados publicados; um

estudo prospectivo multicêntrico realizado em 2005 registou 2491 doentes com DC em

Portugal (178), inferindo-se uma prevalência estimada de 6 casos por cada 10.000 habitantes

(179).

Embora ainda hoje se desconheça com clareza a sequência de eventos que

desencadeiam a DC, é aceite que contribuam para este processo interacções entre factores

genéticos, ambientais e imunológicos (174). A DC é descrita por muitos como o resultado de

uma alteração do sistema imunológico ao nível da mucosa intestinal, desencadeada por um

determinado factor que, em indivíduos geneticamente predispostos, promove uma longa e

inapropriada resposta inflamatória (174). Estes factores podem ter origem endógena, como os

presentes na microflora entérica, mas também exógena, onde se incluem factores ambientais,

nomeadamente os hábitos tabágicos, a actividade física ou a dieta (180).

5.1. FACTORES AMBIENTAIS

Hábitos tabágicos

A importância dos hábitos tabágicos no risco de desenvolver DC foi descrita pela primeira

vez por Sommerville e colaboradores num estudo caso controlo, no qual se verificou um risco

aumentado de desenvolver DC nos fumadores quando comparados com não fumadores

(182). Vários estudos caso-controlo (183-187) e duas metanálises (188,189) publicadas com

17 anos de intervalo, mostraram resultados semelhantes aos obtidos por Sommerville e

colaboradores. Os mecanismos associados ao consumo de tabaco e DC são ainda pouco

conhecidos mas parecem estar associados a: a) os macrófagos dos fumadores apresentarem

deficiência na capacidade para destruir bactérias intracelulares (190), b) a nicotina/tabaco

poder alterar a motilidade do musculo liso intestinal bem como diminuir a permeabilidade

celular (191), c) aumento dos radicais livres e capacidade antioxidante diminuída (192,193),

d) aumento da produção de monóxido de carbono que pode alterar a capacidade de

vasodilatação, resultando em isquémia, ulceração e fibrose (194).

Para além de ser reconhecida a sua importância como factor promotor de DC, o tabaco

apresenta também consequências no comportamento da própria doença (193). Binreebach e

colaboradores num artigo de revisão sobre o efeito do tabaco na DC descrevem uma

associação entre o consumo de tabaco, gravidade da doença, aumento da necessidade de

corticoterapia e terapia imunosupressora, menor taxa de resposta à terapêutica biológica (ex.

anticorpo monoclonal TNFα), maior incidência de fístulas e abcessos, e maior factor de risco

de osteoporose em mulheres (192).

Por ser um factor deletério, nomeadamente para a DC, aconselha-se a cessação tabágica

nos doentes com DC (193).

Nutrição e Genes em Doenças Intestinais

15

Actividade Física

Alguns estudos avaliaram a influência da prática de exercício físico no risco de

desenvolver DC. Em 1990, o primeiro revelou uma menor taxa de DC nos indivíduos com

maior prática de actividade física por comparação com os que realizavam menor actividade

nas tarefas diárias (195). Mais tarde um estudo caso-controlo realizado na Suécia veio

comprovar essa mesma ideia: uma redução de 40-60% no risco de DC com a prática de

actividade física diária/semanal (196). Apesar da associação revelada entre a prática de

actividade física e um menor risco de DC, o reduzido número de estudos e a sua fraca

qualidade, não permitem concluir acerca do papel protector da actividade física para a DC

(197).

No entanto, por ser uma doença com manifestações extra intestinais como a osteoporose,

nas quais é recomendada a prática de exercício físico com intensidade ligeira a moderada,

será útil o aconselhamento personalizado da prática de exercício em indivíduos com DC

(197).

Padrão Alimentar

As variações geográficas na incidência da DC e o seu aumento nas últimas décadas,

sugerem que entre os factores ambientais também a dieta possa ter influencia na patogénese

da DC (198). Com base no aumento da incidência de DC e na prática de novos padrões

alimentares em determinadas populações, nos últimos anos muitos estudos têm tentado

esclarecer o papel do padrão alimentar (199,200). Um maior consumo de açúcares, maior

consumo de gordura saturada, polinsaturada e trans surgem várias vezes referenciados como

promotores de DC (175,181,199-202).

Açúcares

Em 1976 dois estudos caso-controlo revelaram um maior risco de DC em indivíduos que

referiam elevado consumo de açúcar (203,204); na década de 80 e 90, vários artigos

revelaram essa mesma tendência (205-207). A explicação para esta associação baseia-se no

facto de o consumo elevado de açúcar poder levar a alterações na flora bacteriana com

consequências deletérias na mucosa intestinal, ou pela reacção a alguns aditivos de

alimentos açucarados ao nível da mucosa (203). Mais recentemente foram publicados outros

estudos caso-controlo com resultados divergentes dos iniciais (201,202).

As limitações metodológicas relacionadas com a recolha retrospectiva de informação

relativa ao consumo de açúcar, justificam diferenças nos resultados dos estudos mais antigos

e os actuais. Os resultados publicados são pois inconsistentes para concluir acerca da

relação entre a DC e o consumo de açúcares (208,209).

Gordura

Nos últimos anos tem sido dado especial destaque ao tipo de gordura da dieta e à sua

relação com patologias com componente inflamatória (210,211). Os ácidos gordos

polinsaturados (AGPI) têm sido alvo de investigação na DC por serem factores nutricionais

com grande influência no estado inflamatório (212). A incapacidade do organismo humano

Nutrição e Genes em Doenças Intestinais

16

para sintetizar os AGPI n-6 e n-3 determina que sejam ácidos gordos essenciais. Estas duas

classes, n-6 e n-3, distinguem-se entre si pela localização da primeira ligação dupla, que

ocorre no terceiro carbono (n-3) ou no sexto carbono (n-6) a contar do grupo metilo da

molécula do ácido gordo (213).

Os AGPI n-6 são o tipo de gordura mais abundante na dieta, em especial no padrão

alimentar dos países industrializados (210). O AGPI n-6, ácido linoleico, encontra-se na

maioria das sementes e óleos vegetais e é o precursor metabólico do ácido araquidónico

(AA). Este último é metabolizado por enzimas e vai agir como substrato para a síntese de

eicosanóides com características pro-inflamatórias, incluindo as series 2 e 4 de

prostaglandinas e leucotrienos. Estas classes de eicosanóides apresentam um vasto número

de efeitos pro-inflamatórios, incluindo indução de febre, aumento da permeabilidade vascular

e vasodilatação, produção de espécies reactivas de oxigénio e produção de citocinas pro-

inflamatórias como a IL6, IL1β e TNFα (214,215). O AGPI n-3, α-linolénico, encontra-se

essencialmente nas sementes de linhaça, de canola e também nas nozes. É o precursor

metabólico para a síntese do ácido eicosapentaenóico (EPA) e do docosahexaenóico (DHA),

que para além de poderem ser obtidos através da conversão do α-linolénico podem também

ser adquiridos através do consumo de peixes gordos, como o salmão ou a sardinha (213).

Dado que a conversão do α-linolénico em EPA e DHA se dá através das mesmas enzimas

que convertem o ácido linoleico em AA, um aumento da ingestão de ácido linoleico vai

contribuir para um ambiente mais pro-inflamatório por inibir a síntese e a incorporação do

EPA e DHA nos fosfolípidos das membranas celulares (216). Os eicosanóides derivados do

EPA e DHA são as prostanglandinas e leucotrienos das séries 3 e 5, que atenuam a resposta

inflamatória por diminuírem a expressão de vários genes envolvidos na inflamação, incluindo

os de codificação de certas moléculas de adesão endotelial, TNFα, IL1 e IL6 (217), Figura 2.

Figura 2. Vias metabólicas dos AGPI n-6 e n-3. Adaptado de (212).

Os ácidos gordos polinsaturados trans, resultantes dos processos de hidrogenação

apresentam pelo menos uma ligação dupla com configuração trans (218). Têm efeitos

deletérios sobejamente estudados (211), no entanto o seu efeito na doença inflamatória

intestinal está ainda muito pouco estudado, existindo apenas a sugestão de que possam

Nutrição e Genes em Doenças Intestinais

17

interferir na dessaturação e elongação dos AGPI n-6 e n-3, alterando assim a

biodisponibilidade de AA, EPA e DHA para as reacções metabólicas necessárias ao

organismo (213). Sugere-se por isso que este tipo de ácidos gordos seja consumido na

quantidade de máxima de 1% do valor energético total da dieta (219).

Dados epidemiológicos revelam a associação entre o consumo de gordura e DC

(220,221). Um exemplo é proveniente da Gronelândia, onde se constatou que os esquimós,

grandes consumidores de AGPI n-3 apresentavam uma baixa prevalência de Doença

Inflamatória do Intestino (DII) (220); o Japão também revelava a mesma tendência. Este país

historicamente apresentava um padrão alimentar rico em pescado (fonte de AGPI n-3 e pobre

em AGPI n-6) e simultaneamente uma das taxas de incidência de DC mais baixas do mundo.

Actualmente, com o crescimento económico passou a adoptar um padrão alimentar cada vez

mais ocidentalizado, com maior consumo de n-6 e menor consumo de n-3, verificando-se

simultaneamente um aumento da incidência de DC (221). Há inclusive alguns estudos

epidemiológicos a atribuir um aumento significativo no risco de DC associado a uma dieta

com elevado ratio n-6:n-3 (201,212). É reconhecida a importância dos n-3 e n-6 na dieta,

sendo recomendada a ingestão de uma dieta com um ratio n-6:n-3 entre valores de 4:1 e 1:1

em detrimento do que se observa actualmente nas dietas ocidentais, 20:1 e 16:1 (213).

Em resumo, embora todos estes nutrientes apresentem um potencial efeito no risco de

DC, o resultado global dos estudos é ainda questionável, não existindo evidência suficiente

que comprove o papel da dieta no risco de DC (169,222).

5.2. FACTORES GENÉTICOS

De todos os genes conhecidos, o NOD2 (nucleotide-binding oligomerization domain-2)

também designado por CARD15 (caspase recruitment domain-15), situado no cromossoma

16, é aquele que tem sido associado de forma mais consistente a um aumento da

susceptibilidade para a DC (223-226). Este gene funciona como um receptor intracelular de

bactérias invasivas, sendo um importante iniciador da resposta imunitária. Estudos

demonstram que três polimorfismos deste gene (R702W, G908R, 1007Fs) estão associados

ao aumento de susceptibilidade para DC (227). Numa recente metanálise europeia onde se

avaliou o efeito dos 3 polimorfismos no risco de desenvolver DC, foi verificado que a presença

de um alelo mutado conferia um risco 2,4 superior de desenvolver DC (IC 95%: 2,76-3,59) e a

presença de 2 alelos aumentava o risco para 17,1 (IC 95%: 10,7-27,2) (228). Os mecanismos

associados a estes polimorfismos não estão completamente esclarecidos mas os seus efeitos

parecem resultar numa deficiência ao combate da invasão microbiana (227,228).

5.3. NUTRIÇÃO, GENES E DOENÇA DE CROHN

Tanto os factores ambientais como os genéticos são importantes na determinação não só

da susceptibilidade à doença, mas também no fenótipo da própria doença de Crohn

(174,229). A relação entre nutrição e DC é complexa pois para além de veículo de nutrientes

que podem influenciar o risco de doença, a nutrição também apresenta um importante papel

Nutrição e Genes em Doenças Intestinais

18

no suporte nutricional de indivíduos desnutridos e poderá mesmo actuar como terapia

primária na doença activa e na manutenção da remissão (180,230).

5.3.1. Nutrição e Doença de Crohn

Estado nutricional

Dependendo da actividade da doença, da sintomatologia associada (dor abdominal,

náuseas, vómitos, anorexia) e da natureza dos parâmetros nutricionais analisados, a

desnutrição calórico proteica é referenciada em 20-85% dos pacientes com DC (231,232).

São vários os mecanismos que podem promover a desnutrição no doente com DC; os de

maior impacto são provavelmente a redução da ingestão, a presença de inflamação e a perda

entérica de nutrientes (230,233). A redução da ingestão surge na consequência de múltiplos

factores: como o receio da alimentação provocar agravamento da sintomatologia (dor

abdominal ou diarreia) ou o inadequado aconselhamento alimentar feito por profissionais de

saúde, que determinam desnecessárias restrições alimentares (180). São ainda factores

agravantes a anorexia secundária ao aumento de citocinas pro-inflamatórias (TNFα, IL6) e de

adipocinas (leptina, adiponectina, resistina) (234,235), e a toma de múltiplos fármacos que

podem conduzir ao aparecimento de náuseas, vómitos, disgeusia e dispepsia (180). A

inflamação da parede intestinal e a eventual presença de fístulas e/ou oclusões intestinais

contribuem igualmente para a diminuição da ingestão e absorção de nutrientes (180). Como

consequência destes factores, a perda de peso surge em aproximadamente 65-75% dos

doentes, especialmente se com doença activa (169). Aqueles que se encontram

hospitalizados apresentam uma maior percentagem de perda de peso (70-80%) quando

comparados com doentes em ambulatório (20-40%) (230). Nos que apresentam períodos

mais prolongados de doença activa verifica-se maior perda de massa muscular, diminuição

da imunidade celular, aumento do risco de infecções e maior dificuldade de cicatrização

(236).

Apesar de todo este cenário sugestivo de desnutrição, há actualmente estudos a revelar

que a prevalência de desnutrição tem vindo a diminuir, especialmente nos doentes em

remissão, chegando a observar-se casos que apresentam peso acima do adequado, embora

com alterações significativas na composição corporal (230). Um estudo prospectivo

multicêntrico de Valentini e colaboradores avaliou o estado nutricional, composição corporal,

e força muscular de indivíduos com DC em remissão clínica. Este estudo revelou que apesar

de uma elevada percentagem (74%) de indivíduos estarem aparentemente bem nutridos,

apresentavam uma diminuição da massa muscular (237). Tem-se vindo a verificar que

mesmo quando os doentes parecem ter um adequado estado nutricional, podem

concomitantemente apresentar uma desnutrição específica em vitaminas e minerais (238).

Estudos recentes revelam que apesar de os doentes referirem uma ingestão adequada em

energia e macronutrientes, observam-se concentrações plasmáticas baixas de várias

vitaminas e minerais (239,240).

Estes resultados revelam assim que a forma de malnutrição nestes doentes, em especial

quando em remissão, tem vindo a sofrer uma evolução desde a desnutrição calórico proteica

Nutrição e Genes em Doenças Intestinais

19

para um estado normoponderal ou de excesso de peso, acompanhado de ingestão dietética

desequilibrada de micronutrientes (230).

Nutrição na terapêutica

Nos doentes com DC o papel da terapia nutricional, incluindo a nutrição artificial, assume-

se como fundamental ao suprir as necessidades em macro e micronutrientes evitando as

consequências das suas carências (176,181). A utilização da nutrição entérica é inclusive

recomendada, nas guidelines de 2006 da Sociedade Europeia de Nutrição Clínica e

Metabolismo, para indivíduos com DC desnutridos com o objectivo de atingir as necessidades

nutricionais (241). Contudo apesar de permitir alcançar as necessidades nutricionais, a

utilização deste tipo de nutrição como forma primária de tratamento em fases agudas da

doença não é recomendada pelas guidelines do American College of Gastroenterology (176),

pois é menos eficaz para a indução da remissão da DC quando comparada com terapêutica

farmaco-cirúrgica (242).

Vários são os autores a estudar e questionar a importância de certos nutrientes,

nomeadamente os ácidos gordos polinsaturados na modulação inflamatória desta doença. Na

década de 90, Beluzzi e colaboradores avaliaram o efeito dos AGPI n-3 na manutenção da

remissão da DC e demonstraram o efeito positivo da toma de suplementos (EPA + DHA) na

manutenção da remissão da doença (OR:0,41; IC 95%: 0,24-0,70) (243). Seguiu-se a

publicação de outros estudos com objectivos semelhantes que apresentaram a mesma

tendência protectora, mas nalguns casos sem forte significado estatístico (244-247). Numa

recente metanálise, Turner e colaboradores (248) concluem que tendo em conta os

resultados e as características, e diferenças das populações estudadas (ex: população adulta

e pediátrica, tipos de ácidos gordos, formas de administração, etc…), não existe suficiente

evidência para recomendar suplementos de AGPI n-3 para manutenção da remissão (248).

O efeito dos AGPI na indução da remissão da doença são ainda mais questionáveis.

Apesar de serem conhecidos os efeitos anti e pro-inflamatórios dos n-3 e n-6, têm sido

obtidos resultados contraditórios (249). Em 2005, Nielsen e colaboradores revelaram num

estudo com suplementação de AGPI em humanos que a suplementação com n-3 poderá ser

benéfica no alcance da remissão da doença, ao contrário do que acontece com a

suplementação com os n-6 (250). Em 2002, Gassul e colaboradores haviam comparado o

efeito de um AGPI n-6 e de um ácido gordo monoinsaturado n-9 na indução da remissão da

DC. Ao contrário do esperado, os indivíduos com doença activa quando alimentados com

nutrição entérica rica em n-6 apresentaram taxas de remissão significativamente superiores à

de uma formulação rica em n-9 (251). Mais recentemente, Remarkers e colaboradores

compararam em modelos animais a suplementação de ácido oleico (n-9), AA (n-6) e EPA

+DHA (n-3) no grau de inflamação dos colonócitos, e também não verificaram níveis mais

elevados de inflamação após a suplementação com AA quando comparado com o ácido

oleico ou o EPA+DHA (252).

São várias as metanálises/revisões a revelar que apesar da ausência de efeitos

secundários na toma destes nutrientes, não há ainda evidência científica suficiente para a

suplementação de n-3 na indução ou manutenção da remissão na DC (248,249,253).

Nutrição e Genes em Doenças Intestinais

20

5.3.2. Polimorfismos genéticos e influência no fenótipo da Doença de Crohn

Alterações genéticas que ocorrem no gene CARD15 são importantes para o risco de DC;

contudo existem estudos que revelam outras associações entre alguns polimorfismos de

genes e o fenótipo da DC, diferentes dos polimorfismos responsáveis pela predisposição para

a doença (254). A DC é caracterizada por um marcado processo inflamatório resultante da

activação de citocinas pro-inflamatórias. Verifica-se uma super produção de citocinas como

as interleucinas IL6, IL8, IL1β e TNFα e simultaneamente uma diminuição de citocinas anti-

inflamatórias como a IL10 (255,267); este desequilíbrio tem consequências na perpetuação

da inflamação da parede intestinal aumentando a duração e intensidade da resposta

inflamatória (255). Assim, vários estudos que avaliaram a importância das citocinas como

marcador da actividade da DC (256,257) sugerem que o desequilíbrio entre as citocinas pró e

anti-inflamatórias parece poder contribuir para a sua patogénese.

Assumindo que de entre os diversos mediadores inflamatórios as citocinas são os mais

importantes, questiona-se se as diferenças nos seus níveis poderão ser resultantes da

presença de polimorfismos genéticos, e de que forma estes poderão ter influência na

resposta inflamatória e com isso influenciar a fisiopatologia da DC (127,258). Alguns estudos

preliminares sugerem a associação entre DC e alterações genéticas no gene codificador do

TNFα (259,260). Este gene localiza-se no cromossoma 6, e parece ser um gene candidato à

relação genótipo-fenótipo na DC (261,262). O TNFα é uma importante citocina pró-

inflamatória que estimula a resposta de fase aguda (263,264); alguns polimorfismos como o

C857T e o G308A localizados no gene codificador do TNFα parecem afectar a sua

expressão. Os estudos publicados na DC revelam que apesar de o mecanismo não estar

ainda completamente clarificado, estes polimorfismos poderão protagonizar um papel

importante na relação genótipo-fenótipo (254,265,266). Outra das citocinas mais

frequentemente estudada na DC é a IL6, cuja expressão se apresenta elevada nestes

doentes, estando os seus níveis circulantes directamente relacionados com a actividade da

doença (267,268). O polimorfismo mais frequentemente estudado é o G174C IL6 descrito por

Fishman e colaboradores, cuja variante leva a uma diminuição da produção da IL6 (269).

5.3.3. Nutrigenética no desenvolvimento da Doença de Crohn

Apesar dos vários estudos que avaliam a dieta como factor de risco para a DC, são

escassos os que pesquisam a potencial interacção entre dieta e genes no comportamento da

DC (229,254).

O estudo de Grimble e colaboradores em 2002 foi pioneiro ao avaliar interacções entre

gordura e polimorfismos genéticos de citocinas; os autores exploraram em indivíduos

saudáveis a hipótese de a presença de polimorfismos nos genes TNFα e TNFβ (ou LTα),

influenciarem a eficácia de óleos de peixe, ricos em EPA e DHA, na supressão da produção

da citocina TNFα (270). Os resultados obtidos confirmaram a hipótese levantada, ao

revelarem que o efeito dos AGPI n-3 na produção de TNFα era influenciado pelas variações

genéticas (polimorfismos) dos genes TNFα e β, assistindo-se assim a um exemplo de

nutrigenética no contexto associado à inflamação. Os autores sugerem a hipótese de existir

Nutrição e Genes em Doenças Intestinais

21

uma marcada heterogeneidade genética das populações, responsável por grande variação na

resposta ao óleo de peixe.

Este estudo serve de base ao trabalho por nós realizado, ao explorar exemplos de

nutrigenética agora numa doença, como a DC.

Concluindo, alguns autores sugerem que a DC seja um bom exemplo, no qual a incidência

e a gravidade da doença possam ser moduladas por recomendações nutricionais de acordo

com o genótipo. Com o conhecimento profundo da patogénese e das implicações das

variações genéticas, o estudo da nutrigenética e nutrigenómica poderá permitir a aplicação de

uma dieta “anti-inflamatória” eficaz na terapêutica nutricional desta doença (271).

Nutrição e Genes em Doenças Intestinais

22

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Nutrição e Genes em Doenças Intestinais

36

Nutrição e Genes em Doenças Intestinais

37

II) OBJECTIVOS

O objectivo geral desta tese foi explorar a influência de variáveis nutricionais e genéticas

no desenvolvimento de doenças intestinais, em concreto no cancro do cólon e recto (CCR) e

na doença de Crohn (DC). Para tal foi avaliado o estado nutricional e o padrão alimentar de

indivíduos portadores dessas patologias, bem como aspectos específicos da susceptibilidade

genética. Foi igualmente estudada de que forma a interacção destas variáveis, nutricionais e

genéticas, pode influenciar o risco de desenvolver doença e a sua actividade.

Para alcançar este objectivo foram desenvolvidos 4 estudos distintos, com grupo de

doentes e grupo controlo, cujos objectivos específicos estão a seguir delineados:

Cancro do Cólon e Recto

Através da análise de uma população com 196 indivíduos CCR e de uma população

controlo, procedeu-se à execução de dois estudos caso controlo distintos que pretenderam

dar resposta às seguintes questões:

1. Qual o estado nutricional e padrão alimentar dos indivíduos com CCR, e qual a influência

que o padrão alimentar pode ter no risco de desenvolver doença?

2. Qual a prevalência dos polimorfismos APC D1822V, MTHFR C677T, MTR A2756G

metionina sintetase e SHMT C1420T nos indivíduos com CCR?

3. Poderá a susceptibilidade genética, causada pela presença dos referidos polimorfismos

influenciar a resposta aos factores nutricionais e com isso afectar o risco de desenvolver

CCR?

Foram estabelecidos os seguintes objectivos:

Estudo 1

Avaliar o estado nutricional e o padrão alimentar de doentes com CCR;

Estudar a prevalência do polimorfismo D1822V situado no gene APC;

Avaliar a influência das variáveis nutricionais e genéticas (polimorfismo D1882V APC)

de forma isolada, e em interacção, no risco de desenvolver CCR.

Estudo 2

Analisar o genótipo de três polimorfismos localizados em genes do ciclo da metilação

e síntese de DNA (MTHFR C677T, MTR A2756G e SHMT C1420T) e sua associação

com o risco de CCR;

Avaliar a influência da interacção de variáveis da ingestão em nutrientes e variáveis

genéticas no risco de CCR.

Doença de Crohn

Através da análise de uma população de 99 indivíduos com DC e de uma população

controlo, procedeu-se à execução de dois estudos distintos que pretenderam dar resposta às

seguintes questões:

1. Qual o estado nutricional e padrão alimentar de indivíduos com DC?

Nutrição e Genes em Doenças Intestinais

38

2. Qual a prevalência dos polimorfismos IL1β C3953T e C511T, TNFα C857T e C308A, LTα

A252G e IL6 G174C nos indivíduos com DC? Qual a sua influência no risco de DC?

3. Estará a actividade da doença de Crohn dependente da dieta, dos factores genéticos ou da

interação entre estas variáveis?

Foram estabelecidos os seguintes objectivos:

Estudo 3 (n=78 casos)

Avaliar o estado nutricional e padrão alimentar de doentes com DC.

Estudo 4 (n=99 casos)

Avaliar a influência de factores nutricionais na actividade da doença;

Determinar a incidência de polimorfismos localizados em genes de citocinas pro-

inflamatórias (TNFα C857T, TNFα C308A, LTα A252G, IL6G174C) e anti-

inflamatórias (IL1β C3953T, IL1β C511T), e avaliar a sua relação com o risco e

actividade da doença;

Avaliar a influência da interacção de variáveis da ingestão em nutrientes e variáveis

genéticas na actividade da doença de Crohn.

Nutrição e Genes em Doenças Intestinais

39

CAPÍTULO 2

Nutrição e Genes em Doenças Intestinais

40

Estudo 1

O polimorfismo D1822V APC interage com a ingestão de gordura, cálcio e fibra

na modulação do risco de cancro colo rectal em indivíduos portugueses

Catarina S Guerreiro, Marília L Cravo, Miguel Brito, Pedro M Vidal, Paulo O Fidalgo, e Carlos

N Leitão

The D1822V APC polymorphism interacts with fat, calcium, and fiber intakes in modulating the

risk of colorectal cancer in Portuguese persons.

American Journal of Clinical Nutrition 2007;85(6):1592-7.

Nutrição e Genes em Doenças Intestinais

41

RESUMO

Introdução: O risco de cancro colo rectal (CCR) é influenciado tanto por factores genéticos

como por factores ambientais.

Objectivo: Avaliar a interacção do polimorfismo D1822V do gene APC e a ingestão

nutricional em indivíduos com CCR.

Desenho do estudo: Estudo caso controlo em indivíduos com CCR (n=196) e em 200

voluntários saudáveis, com distribuição semelhante para a idade e género, que foram

avaliados no que respeita ao estado nutricional, estilos de vida e polimorfismo D1822V do

gene APC.

Resultados: Não foram observadas diferenças significativas na ingestão energética e de

macronutrientes. Os casos apresentaram uma ingestão de carotenos, vitaminas C e E, folato

e cálcio significativamente inferior aos controlos (P <0,05). A ingestão de fibra também foi

significativamente inferior nos casos (P = 0,004) relativamente os controlos, enquanto que o

consumo de álcool foi associado a um aumento de duas vezes no risco de CCR. Para além

disso, os casos eram significativamente mais sedentários do que os controlos (P = 0,001). A

variante homozigótica do polimorfismo do gene APC (VV) foi identificada em 4,6% dos

doentes e em 3,5% dos controlos. A avaliação da potencial interacção entre dieta e genótipo

revelou que um consumo elevado de colesterol estava associado a um aumento do risco de

CCR apenas nos indivíduos não portadores do alelo polimorfico (DD) do polimorfismo

D1822V do gene APC (OR: 1,66; IC 95%: 1,00-2,76). Em contraste, o elevado consumo de

fibra e de cálcio estavam particularmente associados a um menor risco de CCR nos doentes

portadores do alelo polimórfico (DV/VV) (OR: 0,50; IC95%: 0,27-0,94 para a fibra e OR =

0,51; IC95%: 0,28-0,93 para o cálcio) quando comparado com indivíduos sem esse alelo.

Conclusão: Estes resultados sugerem uma significativa interacção entre o polimorfismo

D1822V do gene APC e a ingestão de colesterol, cálcio, e fibra no risco de CCR.

Palavras-Chave: Cancro colo rectal, dieta, polimorfismo genético, estilos de vida.

Nutrição e Genes em Doenças Intestinais

42

INTRODUÇÃO

O cancro colo rectal é uma causa major de mortalidade por cancro nos países

industrializados que adoptaram um padrão alimentar ocidentalizado (1). Tanto factores

ambientais como genéticos têm sido implicados na ocorrência de CCR (2). De entre os

factores ambientais, a obesidade, a falta de actividade física, a elevada ingestão de energia, e

uma dieta rica em carne vermelha e pobre em factores protectores como os frutos e vegetais

têm sido consistentemente associados a um maior risco de CCR (3,4).

No entanto, diversos estudos revelam resultados contraditórios no que respeita aos

factores que protegem, ou que promovem o CCR: enquanto a maioria dos estudos caso-

controlo sustentam as associações acima referidas (5), os resultados obtidos nos estudos

prospectivos, de intervenção são menos consistentes. As razões para estas discrepâncias

podem estar relacionadas com viés no relato de informação passada, que ocorrem em

estudos caso-controlo, já que, numa doença como o cancro, a ingestão nutricional num

passado mais distante pode ser mais importante mas mais difícil de recordar (6). Para além

deste facto, na avaliação do risco de cancro, existem complexas interacções dietéticas que

ocorrem não só entre nutrientes, mas também com outras variáveis como: o tabagismo e

hábitos alcoólicos, exercício físico ou composição corporal, que poderão dificultar a análise da

importância de um único nutriente. Na maioria dos estudos analisados na revisão realizada

por Marques Vidal e colaboradores (5), foi verificado que o consumo isolado de frutas ou

vegetais não conferiam nenhuma protecção para o CCR, ao passo que o consumo de ambos

em conjunto se tornava protector.

Acresce ainda que estas associações com a dieta são também complicadas por

interacções com factores genéticos. Esta heterogeneidade genética da população em estudo

poderá explicar o porquê de pessoas diferentes responderem de forma diferente a estímulos

nutricionais semelhantes. Uma diferença na susceptibilidade é geralmente devida à presença

de polimorfismos que consistem em mutações nas bases de DNA. Estes polimorfismos nem

sempre afectam a função da proteína, mas podem ser responsáveis por variabilidades, tais

como aumento de protecção ou susceptibilidade a determinada doença, especialmente em

conjunto com estímulos ambientais, nomeadamente nutricionais (7).

Em relação ao CCR, foi estudado um polimorfismo no gene APC (Adenomatous Polyposis

Coli) que quando correlacionado com factores nutricionais, pode influenciar o risco de CCR.

Este polimorfismo é caracterizado por uma substituição da base adenina por uma timidina no

codão 1822 que resulta na substituição do aspartato por valina (GACGTC) (8). A interacção

entre hábitos alimentares e este polimorfismo no desenvolvimento de CCR, foi avaliada em

dois estudos, mas a análise para correlação nutricional foi restringida à ingestão de gordura

(9,10). O objectivo do presente estudo foi avaliar a interacção entre o polimorfismo D1822V

do gene APC e a ingestão nutricional num grupo de doentes portugueses com CCR.

METODOLOGIA

População

Este é um estudo caso controlo, realizado no Instituto Português de Oncologia de Lisboa

Nutrição e Genes em Doenças Intestinais

43

Francisco Gentil EPE (IPOLFG). O grupo com cancro (isto é, casos) foi composto por 196

indivíduos (104 M, 92 F; média ± DP: 64,2 ± 11,3 anos), com um diagnóstico histológico de

CCR, e o grupo controlo incluiu 200 indivíduos saudáveis, dadores de sangue ou voluntários

recrutados do mesmo IPOLFG, com uma distribuição semelhante por género e idade (106M,

94 F; idade 62,2 ± 12,1 anos) e sem história de cancro em nenhuma localização. Dos casos,

169 dos 196 (86,5%) tinham um diagnóstico recente de CCR, e os restantes 27 (13,5%)

estavam sob tratamento por recidiva da doença. No que diz respeito a terapêuticas prévias,

119 dos 196 (60,7%) não tinham recebido nenhuma forma de tratamento, 28 dos 196 (14,3%)

já tinham sido submetidos a cirurgia, 13 dos 196 (6,6%) tinham sido sujeitos a radioterapia

pélvica, 11 dos 196 (5,6%) tinham sido submetidos a um ou mais ciclos de quimioterapia, e

25 dos 196 (12,8%) tinham sido sujeitos a uma combinação de tratamentos. Segundo a

classificação TNM: 24 dos 178 (13,5%) no estádio I; 64 dos 178 (35,9%) no estádio II, 53 dos

178 (29,8%) no estádio III, e 37 dos 178 (29,8%) no estádio IV.

Todos os indivíduos deram o consentimento informado por escrito. O estudo foi

aprovado pelo Comité Cientifico de Ética do IPOLFG.

Recolha dos dados

A avaliação dietética foi realizada através de um questionário de frequência alimentar

(11), validado para a população portuguesa. Foi pedido aos participantes que se recordassem

dos seus hábitos alimentares no ano anterior ao diagnóstico de CCR (grupo caso) ou no ano

anterior à entrevista (grupo controlo). O tipo e quantidade de alimentos ingeridos foram então

analisados através da versão modificada da base de dados do software FOOD PROCESSOR

(versão 7; Esha Reserach, Inc, Salem, OR) onde estão incluídos alguns itens de alimentos

portugueses, o que permite a quantificação dos diferentes macro e micronutrientes. A

actividade física no ano anterior ao diagnóstico de cancro (casos) ou no ano anterior à

entrevista (controlos) foi avaliada através do questionário de Arrol e colaboradores (12), que

permitiu agrupar os indivíduos em 3 categorias: baixa (0), intermédia (1) e elevada (2). Os

hábitos tabágicos foram avaliados pelo número de cigarros/dia. Para o cálculo do índice de

massa corporal (IMC: em kg/m2) foi utilizada uma balança digital (SECA, Hanover, MD) com

uma precisão de ±0,1kg, e a altura foi obtida através da informação constante no bilhete de

identidade dos participantes.

Processo de Genotipagem

Foram colhidas amostras de sangue total e armazenadas em cartões Cards Kit 3-mm. A

extracção de DNA foi realizada utilizando Generation Capture Card Kit-DNA Purification; DNA

Elution (Gentra Systems Inc, Minneapolis, MN). O polimorfismo GAC/GTC no codão 1822 do

gene APC foi genotipado utilizando Assays-by-Design TaqMan para análise de discriminação

alélica (Applied Biosystems, Foster City, CA). A reacção em cadeia da polimerase (PCR) foi

realizada com mistura de: 4 μl de DNA genómico, 10 μl de Taqman Universal PCR Master

Mix (Applied Biosystems), 1 μl de 20x assay mix e ddH2O até 20 μl de volume final. Foi usado

o seguinte protocolo de amplificação: desnaturação a 95°C durante 10 minutos, seguida de

Nutrição e Genes em Doenças Intestinais

44

40 ciclos de desnaturação a 92°C durante 15 segundos, hibridação e extensão a 60°C

durante 1 min.

Todas as reacções foram realizadas no iCycler iQ Multicolor Real Time PCR Detection

System (Bio-Rad, Hércules, CA). Após PCR, o genótipo de cada amostra foi atribuído

automaticamente pelo software do equipamento, através da medida da fluorescência

especifica de cada alelo. Os indivíduos foram classificados em homozigóticos para a variante,

caso possuíssem ambos os alelos valina e valina (VV), heterozigóticos caso possuíssem o

genotipo aspartato e valina (DV), e por fim homozigóticos wild-type se apresentassem o

genotipo aspartato e aspartato (DD).

Tratamento estatístico

A análise estatística foi realizada utilizando o software SPSS for WINDOWS (versão 12.0;

SPSS Inc, Chicago, IL). Os resultados foram expressos como média ± desvio padrão, como

número (e percentagem) de indivíduos, e como odds ratio (OR) com intervalo de confiança de

95% (IC). A análise bivariada foi realizada utilizando teste t-Student ou teste Mann-Whitney

para variáveis contínuas e o teste qui-quadrado para variáveis categóricas. Regressão

logística múltipla foi usada para pesquisar associações utilizando OR e IC 95%. De forma

breve: a ingestão nutricional foi categorizada em alta ou baixa consoante os valores de

ingestão eram superiores ou inferiores ao valor da mediana e foram criados quatro grupos

independentes em função do APC D1822V e dieta. O risco de desenvolver CCR foi avaliado

através da análise do efeito combinado do genótipo D1822V e dieta, utilizando como

categoria de referência (ie, risco standard) aqueles com baixa ingestão e sem variante do

gene APC. Os restantes 3 grupos diziam respeito aos indivíduos: sem variante e elevado

consumo, com variante (DV ou VV) e baixo consumo, e com variante e elevado consumo. A

relação entre estes grupos e o risco de CCR foi realizada através de regressão logística;

sempre que adequado foi realizado o ajuste tendo em conta algumas outras variáveis. O nível

de significância foi estabelecido para um P <0,05.

RESULTADOS

Estilos de vida, história familiar, peso, e IMC de ambos os grupos em estudo estão

apresentados no Quadro 1.

Nutrição e Genes em Doenças Intestinais

45

Quadro 1

Características da amostra em estudo1

Casos

(n=196)

Controlos

(n=200) P

Actividade Física2

Baixa [n (%)] 106 (54,1) 96 (48,0)

<0,0013

Intermédia [n (%)] 78 (39,8) 66 (33,0)

Elevada [n (%)] 12 (6,1) 38 (19,0)

Fumadores [n (%)] 24 (12,2) 26 (13,0) NS

Cigarros (nº/d) 7,0 ± 12.44 7,9 ± 13,6 NS

Bebedores [n (%)] 127 (64,8) 123 (61,5) NS

Álcool (g/d) 25,2 ± 39,8 19,2 ± 43,4 NS

História familiar de CCR [n (%)]5 45 (23) 16 (8) 0,001

Altura (m) 1,63 ± 0,09 1,64 ± 0,09 NS

Peso (kg) 68,5 ± 13,9 72,3 ± 12,1 0,004

IMC (kg/m2) 25,6 ± 4,2 27,0 ± 3,9 0,01

1CCR, cancro colo rectal. Para actividade física, bebedores, fumadores, e história familiar de CCR, foi utilizado o

teste qui-quadrado para análise estatística; as diferenças no consumo de álcool foram analisadas utilizando o teste Mann-Whitney; e as diferenças na altura, peso, e IMC, entre grupos foram analisadas utilizando o teste t Student.

2 Classificada segundo questionário Arrol e colaboradores (12).

3 A prevalência de actividade física elevada foi significativamente maior nos controlos do que nos casos.

4 Média ± DP (todos estes valores).

5 História familiar de CCR em primeiro ou segundo grau.

No que respeita à actividade física, os casos apresentaram níveis inferiores de actividade

intensa antes do diagnóstico do que após o diagnóstico de cancro, contudo o exercício por si

só não influenciou o risco de CCR (OR: 0,78; IC 95%: 0,53-1,1). Não foram também

observadas diferenças entre os dois grupos no que diz respeito aos hábitos tabágicos.

Relativamente à ingestão de álcool, verificámos que 35,8% dos doentes e 38,5% dos

controlos não consumiram álcool. Entre os participantes (casos e controlos) que referiram ter

consumido álcool, os doentes apresentaram um consumo de álcool significativamente mais

elevado do que os controlos (38,8 g/d comparado com 31,0 g/d; OR: 1,97; IC 95%:1,19-3,26).

A existência de história familiar de CCR em familiares em primeiro ou em segundo grau

também foi mais frequente nos doentes quando comparado com controlos (OR: 3,4; IC 95%:

1,85-6,29). No que respeita ao estado nutricional verificámos que tanto o peso como o IMC

foram significativamente menores nos casos do que nos controlos (Quadro 1).

A ingestão diária de energia e macronutrientes está apresentada no Quadro 2.

Nutrição e Genes em Doenças Intestinais

46

Quadro 2

Consumo diário de macronutrientes1

Casos

(n=196)

Controlos

(n=200)

P2

Energia (kcal) 3113 ± 1178 2938 ± 1015 NS

Proteína (g) 133,5 ± 57,6 130,3 ± 50,4 NS

Glícidos (g) 285,6 ± 86,1 290,0 ± 95 NS

Gordura total (g) 134,0 ± 77,7 130,0 ± 95 NS

Gordura Polinsaturada (g) 21,2 ± 12,1 19,9 ± 9,5 NS

Gordura Monoinsaturada (g) 54,5 ± 28,5 54,5 ± 25,0 NS

Gordura Saturada (g) 47,6 ± 34,4 45,3 ± 30,9 NS

Colesterol total (mg) 507 ± 304,7 460 ± 250,3 NS

Fibra (g) 26,0 ± 9,3 28,9 ± 10,7 0,004

1 Todos os valores referem-se à média ± DP.

2 O teste Mann-Withney foi utilizado para analisar diferenças entre grupos.

Não se observaram diferenças significativas entre grupos no consumo de macronutrientes.

Contudo, verificámos uma ingestão significativamente inferior de fibra nos casos do que nos

controlos; globalmente aqueles que tinham um consumo diário superior à mediana (25,6 g)

apresentaram um OR de 0,58 (IC 95%: 0,4-0,8) para o risco de desenvolver CCR quando

comparados com aqueles que consumiam um valor inferior à mediana.

A ingestão de micronutrientes em ambos os grupos - incluindo a toma de suplementos que

ocorreu em 11 casos e nenhum controlo - está apresentada no Quadro 3.

Quadro 3

Consumo diário de micronutrientes1

Casos

(n = 196)

Controlos

(n = 200)

P2

OR (IC 95%)3

Vitamina A (μg) 944,8 ± 890,0 925,4 ± 644 NS ND

Carotenos (μg) 985,5 ± 59,9 1264,5 ± 1128,3 0,02 0,67 (0,44-0,99)4

Vitamina C (mg) 144,9 ± 60 168,4 ± 74,8 0,001 0,56 (0,38-0,84)4

Vitamina D (μg) 7,01 ± 4,7 7,2 ± 4,7 NS ND

Vitamina E (mg) 10,8 ± 4,4 11,9 ± 5,1 0,03 0,75 (0,5-1,1)

Vitamina K (μg) 4353,8 ± 1363,7 4408,6 ± 1335,7 NS ND

Folato (μg) 401,6 ± 161,9 433,4 ± 162,0 0,02 0,72 (0,49-1,1)

Vitamina B6 (mg) 2,83 ± 1,06 2,85 ± 0,98 NS ND

Vitamina B12 (μg) 14,54 ± 9,05 14,3 ± 8,21 NS ND

Sódio (mg) 3961,9 ± 2847,3 3662,43 ± 2282,3 NS ND

Potássio (mg) 4353,8 ± 1363,7 4408,6 ± 1335,7 NS ND

Magnésio (mg) 416,6 ± 134,9 428,5 ± 131,1 NS ND

Selénio (mg) 144,5 ± 56,3 143,5 ± 53,6 NS ND

Ferro (mg) 22,2 ± 9,8 21,8 ± 8,7 NS ND

Cálcio (mg) 1029,3 ± 410,7 1181,3 ± 626,4 0,01 0,59 (0,49-0,88)4

1 Todos os valores referem-se à média ± DP. OR, odds ratio; ND, não determinado.

2 O teste Mann-Withney foi utilizado para analisar diferenças entre grupos.

3 O OR foi determinado utilizando os valores acima ou abaixo da mediana de ingestão. A categoria referência –

isto é, o risco standard para o cancro colo rectal - foi considerada a combinação do genótipo wild-type e a ingestão

Nutrição e Genes em Doenças Intestinais

47

baixa de vários nutrientes. Os cut offs foram: 873,4µg para carotenos, 147,5mg para vitamina C; 10,3 mg vitamina E, 406,7µg para o folato, e 1029mg cálcio.

4 P<0,05

Observou-se um consumo significativamente menor de carotenos, vitamina C, vitamina E,

folato, e cálcio, no grupo de doentes quando comparado com os controlos. Para estes

micronutrientes foi calculado o risco de CCR, tendo em consideração um consumo superior

ou inferior à mediana.

Não foram observadas diferenças no que diz respeito à distribuição do genótipo, e ambos

os grupos estavam em equilíbrio Hardy Weinberg. Os homozigóticos para a variante

representavam 4,6% dos casos e 3,5% dos controlos, enquanto os heterozigóticos

representavam 30,1% e 33% dos casos e controlos, respectivamente. No grupo caso, não

foram observadas correlações entre genótipo, género, localização do tumor, estádio da

doença, ou história familiar de CCR. A interacção entre a ingestão de vários macronutrientes

e micronutrientes e genótipo APC está descrita no Quadro 4.

Nutrição e Genes em Doenças Intestinais

48

Quadro 4

Odds ratio (ORs) para cancro colo rectal de acordo com D1822T APC e dieta1

D1822T APC

Casos/controlos OR (IC 95%)2

Ingestão

sem variante

(DD)

com variante

(DV/VV)

sem variante

(DD)

com variante

(DV/VV)

P

para interacção

N

Energia

Elevado

Baixo

54/62 27/37 1,29 (0,78-2,12) 0,90 (0,48-1,68) 0,21

74/65 41/36 1 1,20 (0,67-2,16)

Proteína

Elevado

Baixo

73/59 26/37 1,57 (0,95-2,60) 0,91(0,49-1,71) 0,24

55/68 42/36 1 1,42 (0,79-256)

Glícidos

Elevado

Baixo

69/67 26/35 1,15 (0,70-1,90) 0,91 (0,48-1,71) 0,50

59/60 42/38 1 1,06 (0,59-1,89)

Gordura total

Elevado

Baixo

72/61 23/42 1,37 (0,83-2,27) 0,69 (0,37-1,3) 0,12

56/66 45/31 1 1,59 (0,89-2,88)

Gordura saturada

Elevado

Baixo

72/62 23/41 1,28 (0,78-2,12) 0,67 (0,36-1,26) 0,17

56/65 45/32 1 1,51 (0,84-2,73)

Gord. polinsaturada

Elevado

Baixo

76/63 21/38 1,48 (0,89-2,45) 0,74 (0,38-1,42) 0,14

52/64 47/35 1 1,55 (0,87-2,78)

Gord. monoinsaturada

Elevado

Baixo

72/61 27/38 1,40 (0,85-2,32) 0,89 (0,48-1,66) 0,10

56/66 41/35 1 1,31 (0,73-2,35)

Colesterol total

Elevado

Baixo

77/60 26/35 1,66 (1,00-2,76) 1,00 (0,53-1,89) 0,05

51/67 42/38 1 1,40 (0,78-2,50)

Fibra

Elevado

Baixo

61/73 23/41 0,7 (0,43-1,16) 0,50 (0,27-0,94) 0,03

67/54 45/32 1 1,08 (0,60-1,95)

Álcool

Elevado

Baixo

65/62 35/36 1,14 (0,69-1,88) 1,06(0,58-1,91) 0,96

63/65 33/37 1 0,9 (0,50-1,65)

Folato

Elevado

Baixo

61/66 27/44 0,90 (0,54-1,48) 0,60 (0,33-1,09) 0,13

67/61 41/29 1 1,28 (0,70-2,32)

Vitamina B6

Elevado

Baixo

66/64 26/41 0,99 (0,59-1,62) 0,66 (0,35-1,21) 0,16

62/63 42/32 1 1,23 (0,67-2,24)

Vitamina B12

Elevado

Baixo

72/62 26/38 1,35 (0,82-2,22) 0,85 (0,45-1,58) 0,09

56/65 42/35 1 1,31 (0,73-2,35)

Cálcio

Elevado

Baixo

59/69 26/44 0,74 (0,45-1,21) 0,51 (0,28-0,93) 0,03

69/58 42/29 1 1,21 (0,66-2,20)

1n = 128 casos sem variante; n = 127 controlos sem variante, n = 68 casos com variante, n = 73 casos com

variante.

Nutrição e Genes em Doenças Intestinais

49

2 Os OR foram estimados analisando o efeito combinado do genótipo D1822V e ingestão dietética, utilizando os

valores acima ou abaixo da ingestão mediana de cada nutriente. Os cut offs foram: 2827 Kcal para a energia, 121,1g para as proteínas, 270g para os glícidos, 110,9g para a gordura total, 32,7g para a gordura saturada, 48,3g para a gordura monoinsaturada, 40,4g para a gordura polinsaturada, 25,6g para a fibra, 3,4g/d para o álcool, 12,5μg para a a vitamina B12, 406,7μg para o folato, 12,5 mg para a vitamina B6. A categoria referencia – isto é, o risco standard para o cancro colo rectal - foi considerada a combinação do genótipo wild-type e a ingestão baixa de vários nutrientes.

Para aumentar o poder estatístico, o risco foi determinado agregando os heterozigóticos e a

variante homozigótica por comparação com a categoria de referência de homozigotia para o

alelo wild-type. Foram observadas associações significativas entre genótipo e o consumo de

colesterol (P = 0,05), de fibra (P = 0,03), e de cálcio (P = 0,03). Apenas para os indivíduos

wild-type (DD), um consumo elevado de colesterol foi associado a um risco significativamente

mais elevado de desenvolver CCR (P =0,05); enquanto que o consumo elevado de fibra ou

cálcio diminuía em quase 50% o risco de desenvolver CCR dos indivíduos que apresentavam

alelos polimorficos (DV e VV). Quando os 3 genótipos foram analisados separadamente,

verificaram-se valores algo diferentes de P para a interacção, mas continuou a verificar-se

uma interacção entre genótipo APC e ingestão de gordura, cálcio, e fibra.

DISCUSSÃO

Vários estudos analisaram a relação entre dieta, estilos de vida, caracteristicas genéticas

e a prevalência de CCR, e os resultados obtidos variaram amplamente. O presente estudo

teve como objectivo correlacionar a ingestão nutricional com o polimorfismo D1822V do gene

APC num grupo de indivíduos Portugueses. Apesar desta mutação missense teoricamente

não afectar a função da proteína, poderá resultar em ligeiras alterações de conformação que

poderão interagir com factores ambientais e assim influenciar o risco de desenvolver CCR.

Observámos que a proporção de indivíduos com actividade física intensa era menor nos

casos do que nos controlos. No entanto, contrariamente a estudos anteriores (13,14), não

verificámos que os fumadores tivessem um maior risco de CCR. Este achado poderá estar

relacionado com o facto deste estudo ter uma amostra menor do que os estudos anteriores. A

análise ao consumo de álcool revelou que a ingestão diária> a 28,9g de álcool praticamente

duplicava o risco de CCR. A este respeito, a literatura é algo confusa, uma vez que alguns

estudos revelaram um efeito promotor do consumo de álcool (15), outros não (16), e há ainda

estudos que revelaram um efeito promotor mas apenas para o cancro rectal (17).

Na avaliação do estado nutricional observou-se que os casos apresentavam um IMC

menor que os controlos. Como referido anteriormente, esta avaliação foi realizada após o

diagnóstico da doença, e 40% dos doentes tinham já recebido alguma forma de tratamento

médico ou cirúrgico (ou ambos). É provável por isso que tanto os sintomas relacionados com

o CCR ou com o tratamento (ou ambos) possam ter tido um impacto negativo no estado

nutricional de alguns doentes. Kune e colaboradores (18) relataram resultados semelhantes

aos nossos no que respeita ao IMC: num estudo caso-controlo de grande dimensão,

compreendendo 715 casos e 727 controlos, os autores não observaram que o excesso de

peso corporal fosse um factor do risco para CCR. Isto contrasta com vários estudos

prospectivos, que identificam o IMC elevado como um factor de risco para CCR (19, 20);

nesses estudos, o excesso de peso corporal foi detectado muito tempo antes do diagnóstico

Nutrição e Genes em Doenças Intestinais

50

ou do tratamento (ou ambos) ocorrerem.

Não se observaram diferenças no consumo de macronutrientes, mas algumas foram

identificadas no que respeita à ingestão de micronutrientes. Detectámos que o consumo de

carotenos, vitamina C, vitamina E, folato, cálcio e fibra foi significativamente inferior nos casos

do que nos controlos. O cálculo do OR revelou um significativo efeito protector do consumo

de fibra, cálcio, e carotenos. A maioria dos estudos confirma os nossos resultados no que

respeita ao consumo de cálcio, revelando um efeito protector da ingestão de cálcio na

recorrência de adenomas (21) e no desenvolvimento de CCR (22). Numa meta-análise que

envolveu 10 estudos com o objectivo de avaliar o efeito da ingestão de cálcio no risco de

CCR, Eunyoung e colaboradores (23) observaram que um consumo superior a 1100 mg de

cálcio/dia reduzia o risco de desenvolver CCR em 25% (OR: 0,74; IC 95%: 0,62-0,88). No

presente estudo, observámos uma redução de 40% no risco de desenvolver CCR para

aqueles que consumiam mais do que 1029 mg de cálcio/dia.

O efeito protector dos antioxidantes na carcinogénese colo rectal foi demonstrado em

alguns estudos (24,25), mas nem em todos (26). O mesmo se aplica para o efeito protector

da fibra que foi observado neste estudo: os nossos resultados confirmam a maioria dos

estudos de caso controlo (27,28), mas divergem dos resultados apresentados nos estudos

prospectivos (29-31). Estas discrepâncias podem estar relacionadas com o facto das fontes

alimentares desses nutrientes serem frutos e vegetais, e por isso a análise do efeito de um

único nutriente poder ser ilusória. Esta hipótese é reforçada por uma revisão recente (5), na

qual os autores observaram que o consumo de frutas e vegetais em conjunto exercia um

maior efeito protector do que o consumo isolado de cada um desses alimentos.

Relativamente ao polimorfismo do gene APC, a percentagem de heterozigóticos, wild type,

e homozigóticos para a variante era semelhante entre grupos caso e controlo, dados similares

aos de 2 estudos já publicados (9,10). Este facto permite-nos concluir que o polimorfismo por

si só não modifica o risco de desenvolver CCR. Alguns resultados interessantes foram

observados no que respeita à interacção entre factores nutricionais e genéticos. Que seja do

nosso conhecimento, apenas 2 estudos prévios examinaram a interacção entre este

polimorfismo, nutrição, e risco de CCR (9,10). Slattery e colaboradores (9) observaram que

indivíduos homozigóticos para a variante tinham menor risco se consumissem uma dieta com

reduzido teor de gordura (OR: 0,2; IC 95%: 0,1-0,5). Num outro estudo, Menéndez e

colaboradores (10) não observaram nenhuma interacção entre nutrientes e o alelo

polimórfico. No presente estudo, observámos que uma elevada ingestão de colesterol

resultava num maior risco de desenvolvimento de CCR apenas nos indivíduos homozigóticos

para o alelo wild type (DD). Este efeito promotor não foi observado nos indivíduos com alelo

polimórfico. Além disso, verificámos para os heterozigóticos e homozigóticos com alelo

mutado que o consumo de fibra ou de cálcio era especialmente protector (OR: 0,50; IC 95%:

0,27-0,94; OR: 0,51; IC 95%: 0,28-0,93, respectivamente). Nenhum dos dois estudos

anteriores encontrou alguma interacção significativa com qualquer nutriente para além da

gordura.

Nesta altura apenas podemos especular sobre os possíveis mecanismos pelos quais a

ingestão de gordura, cálcio, ou fibra poderá interagir com o polimorfismo do APC para

Nutrição e Genes em Doenças Intestinais

51

modificar o risco de desenvolver CCR. O APC codifica uma proteína multifuncional apesar da

sua maior função supressora tumoral residir na capacidade de reduzir a expressão da β-

catenina na via de sinalização WNT. Na presença de mutações truncantes do APC, a β-

catenina não pode ser fosforilada; acumula-se no citoplasma, de onde é translocada para o

núcleo, o que permite a activação de genes alvo da via WNT (32). Até à data, só duas

variações missence do gene APC – as variantes I1307K e a E1317Q - foram associadas a um

maior risco de CCR, no entanto esta associação mantém-se controversa (33). Embora as

variantes missence no gene APC não sejam potencialmente patogénicas, até à data nada foi

citado relativamente à variante D1822V. No entanto, não podemos excluir a possibilidade de

a alteração deste aminoácido localizado entre o 4º e 5º domínio de regulação da β-catenina,

poder induzir algumas alterações configuracionais na proteína APC, que poderá determinar

uma redução da expressão da β-catenina ligeiramente menos eficiente. Supõe-se que a

presença desta variante, não seja só por si suficiente para a iniciação do tumor; contudo, na

presença de factores dietéticos promotores de cancro (ex. consumo elevado de gordura),

poderá resultar numa maior produção de diacilglicerol. Elevadas concentrações de

diacilglicerol promovem maior activação da proteína C cinase, que pode aumentar a activação

da via WNT, promovendo assim o crescimento do tumor.

No presente estudo, também mostramos que os portadores do alelo mutado eram os que

mais beneficiavam de uma elevada ingestão de cálcio. É sabido que a proteína APC também

interage com a proteína transmembranar E-caderina, outra molécula de adesão celular (34).

Porque a E-caderina é uma proteína cálcio-dependente, podemos especular que uma

concentração elevada de cálcio pode reforçar as junções intercelulares, e assim inibir a

transformação e o crescimento do tumor maligno. O mesmo foi observado em relação à

ingestão de fibra. Um consumo elevado de fibra resultará numa maior concentração de

butirato. O butirato é considerado a fonte primária de energia para os colonocitos, ao

estimular o normal crescimento celular, e também inibe o desenvolvimento do tumor,

essencialmente por promover a apoptose celular (35). Esses efeitos anti-proliferativos e pro-

apoptóticos do consumo de fibra poderão de alguma forma ser amplificados pelo genótipo do

polimorfismo D1822V.

Com a conclusão do Projecto do Genoma Humano, existem óptimas oportunidades para

investigar o efeito da variação genética do hospedeiro na utilização e metabolismo de

nutrientes. Que seja do nosso conhecimento, este é o primeiro estudo realizado no Sul da

Europa a revelar interacções positivas entre os já conhecidos factores dietéticos promotores e

protectores da carcinogénese colo rectal e um polimorfismo do gene APC. O objectivo major

desta área de investigação será o de criar conhecimentos precisos para sustentar um melhor

aconselhamento ao nível da saúde pública no que respeita à ingestão dietética, uso de

suplementos, e testes genéticos.

Nutrição e Genes em Doenças Intestinais

52

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Nutrição e Genes em Doenças Intestinais

54

Estudo 2

O risco de cancro colo rectal associado ao polimorfismo C677T na 5,10-

metilenotetrahidrofolato reductase depende, em doentes Portugueses, da

ingestão de nutrientes dadores de grupos metilo.

Catarina Sousa Guerreiro, Bruno Carmona, Susana Gonçalves, Elisabete Carolino, Paulo

Fidalgo, Miguel Brito, Carlos Nobre Leitão, e Marília Cravo

Risk of colorectal cancer associated with the 677 polymorphism in 5, 10-

methylenetetrahydrofolate reductase in Portuguese patients depends on the intake of methyl-

donor nutrients.

American Journal of Clinical Nutrition 2008;88(5):1413-8.

Nutrição e Genes em Doenças Intestinais

55

RESUMO

Introdução: Os polimorfismos localizados em genes envolvidos no metabolismo do folato e

alguns nutrientes relacionados com o metabolismo do grupo metilo estão implicados no

cancro colo rectal (CCR).

Objectivo: Investigámos a associação de 3 polimorfismos genéticos MTHFR C677T

(metilenotetrahidrofolato reductase), MTR A2756G (metionina sintase), e SHMT C1420T

(serina hidroximetiltransferase) com a ingestão de nutrientes dadores de grupos metilo no

risco de CCR.

Metodologia: A ingestão de nutrientes dadores de grupos metilo e os 3 polimorfismos foram

estudados em indivíduos com CCR (n=196) e controlos saudáveis (n=200), com distribuição

semelhante para a idade e género.

Resultados: Com excepção para a ingestão de folato, que foi significativamente inferior nos

doentes (P = 0,02), não se observaram diferenças entre os grupos na ingestão de outros

nutrientes dadores de grupos metilo. O elevado consumo de folato (>406,7 µg/dia) foi

associado a um risco significativamente menor de CCR (odds ratio: 0,67; IC 95%: 0,45-0,99).

O polimorfismo MTR A2756G não estava associado ao risco de desenvolver CCR. Em

contraste, a homozigotia para a variante (TT) do MTHFR C677T, apresentou um risco 3 vezes

superior de CCR (IC 95%: 1,3-6,7). Do mesmo modo, a homozigotia para o polimorfismo

SHMT C1420T também revelou um aumento de 2,6 vezes no risco de desenvolver CCR (IC

95%:1,1-5,9). Quando foram estudadas as interacções entre variáveis, o consumo reduzido

de todos os nutrientes dadores de grupos metilo estava associado a um aumento de risco de

CCR nos participantes homozigóticos para o polimorfismo MTHFR C677T, mas apenas foi

observada uma interacção estatisticamente significativa no folato (odds ratio: 14,0; IC 95%:

1,8-108,5). Não se verificou nenhuma associação significativa com os polimorfismos MTR ou

SHMT.

Conclusão: Estes resultados revelam uma associação entre a variante MTHFR C677T e a

ingestão de folato no risco de CCR.

Nutrição e Genes em Doenças Intestinais

56

INTRODUÇÃO

O cancro colo rectal (CCR) é uma patologia complexa que envolve múltiplos factores

genéticos e nutricionais (1). No que se refere aos factores nutricionais, foi demonstrado que o

folato desempenha um papel preventivo na carcinogénese colo rectal, provavelmente pelo

seu envolvimento no processo de metilação e síntese de DNA (2). Outros nutrientes como a

metionina, a vitamina B6, e a vitamina B12, que interagem metabolicamente com o folato neste

processo, também poderão influenciar o risco de CCR (3). Nalguns desses estudos, a

associação inversa observada entre os níveis de folato e o risco de CCR era modificada pelos

polimorfismos genéticos das enzimas envolvidas no metabolismo do folato, em especial na

metilenotetrahidrofolato reductase (MTHFR). A frequente substituição C677T no gene

MTHFR, que converte a alanina em valina, resulta numa enzima termo lábil com reduzida

actividade (4). Vários estudos demonstraram que esta variante (TT) está associada a um

risco diminuído de CCR, mas apenas quando o nível de folato está normal ou elevado. Tal

como descrito por Crott e Mason (4), o polimorfismo da MTHFR é possivelmente o único

polimorfismo genético conhecido que alterna entre ser factor de risco ou protector,

dependendo dos níveis de nutrientes. Para além disso, porque o metabolismo do folato

envolve a interacção de diferentes formas co-enzimáticas da vitamina em múltiplos ciclos,

assim como mecanismos de feedback entre ciclos, é também importante estudar a influência

conjunta que outros polimorfismos de genes envolvidos nestes ciclos possam exercer. A

metionina sintetase requer, como co-factor, a presença de vitamina B12, na forma de

metilcobalamina. Foi descrita uma variante neste gene, A2756G, que resulta na substituição

do aspartato por glicina. São inconsistentes os resultados de estudos na neoplasia colo rectal;

alguns revelam que o genótipo GG está associado a uma diminuição do risco de CCR (5,6),

outros mostram um possível aumento no risco de adenomas colo rectais (7). Nestes estudos

não foram analisadas associações com a dieta. A serina hidroximetiltransferase (SHMT) é

uma enzima dependente da piridoxina (B6). Foi identificado um polimorfismo, o C1420T, que

resulta da substituição do aminoácido leucina por fenilalanina. O significado funcional deste

polimorfismo é ainda desconhecido. Apenas um único estudo avaliou a influência que este

polimorfismo possa ter no risco de CCR, e nenhuma associação foi encontrada. Mais uma

vez, não foi examinada a associação com a ingestão dietética (8). Por isso, o objectivo deste

estudo caso-controlo foi avaliar o papel destes polimorfismos no risco de CCR tanto de forma

isolada ou em associação com a ingestão de nutrientes específicos e outros genótipos.

MÉTODOS E POPULAÇÃO

População em estudo

Os participantes do estudo foram anteriormente descritos (9). De forma resumida, tratou-

se de um estudo caso-controlo, realizado no Instituto Português de Oncologia de Lisboa

Francisco Gentil EPE. Este estudo foi aprovado pelo Comité Cientifico de Ética do Instituto

Português de Oncologia de Lisboa Francisco Gentil EPE, e todos os doentes e controlos

forneceram o seu consentimento informado por escrito para participarem no estudo.

O grupo de doentes incluiu 196 indivíduos com diagnóstico histológico de CCR [104

Nutrição e Genes em Doenças Intestinais

57

homens, 92 mulheres; idade (média ± desvio padrão): 64,2 ± 11,3 anos)], enquanto o grupo

controlo incluiu 200 indivíduos saudáveis, dadores de sangue ou voluntários recrutados do

mesmo Instituto, com distribuição semelhante por género e idade (106 homens, 94 mulheres;

idade média: 62,2 ± 12,1 anos), e sem história prévia de cancro em nenhuma localização.

Não foi realizada colonoscopia aos controlos para excluir hipótese de CCR, mas nenhum

indivíduo apresentava sintomas nem anemia. Dos casos, 169 dos 196 (86,5%) tinham um

diagnóstico recente de CCR, e os restantes 27 (13,5%) estavam sob tratamento por recidiva

da doença. No que diz respeito a terapêuticas anteriores, 119 dos 196 (60,7%) não tinham

recebido nenhuma forma de tratamento, 28 dos 196 (14,3%) já tinham sido submetidos a

cirurgia, 13 dos 196 (6,6%) tinham sido sujeitos a radioterapia pélvica, 11 dos 196 (5,6%)

tinham sido submetidos a um ou mais ciclos de quimioterapia, e 25 dos 196 (12,8%) tinham

sido sujeitos a uma combinação de tratamentos. Segundo a classificação Tumor – nódulos –

metástases, os estádios eram: estádio I, 24 de 178 (13,5%); estádio II, 64 de 178 (35,9%);

estádio III, 53 de 178 (29,8%); estádio IV, 37 de 178 (20,8%).

Avaliação da ingestão nutricional

Para quantificação da ingestão de folato, vitamina B6, vitamina B12, glicina, metionina,

serina, e álcool, foi utilizado o questionário de frequência alimentar validado para a população

portuguesa (10). Foi solicitado aos participantes que recordassem os seus hábitos

alimentares, no caso dos doentes relativamente ao ano anterior ao diagnóstico de CCR, ou

no caso dos controlos relativamente ao ano anterior à entrevista. Imagens coloridas da

maioria dos itens alimentares, revelando 3 porções diferentes, assim como medidas práticas

de chávenas e colheres foram utilizadas para facilitar a quantificação da ingestão. O tipo e

quantidade de alimentos ingeridos foram então analisados através da versão modificada da

base de dados do SOFTWARE FOOD PROCESSOR, versão 7 (ESHA Research, Inc, Salem,

OR) onde estão incluídos alguns itens de alimentos portugueses, o que permite a

quantificação dos diferentes macro e micronutrientes. Os valores de nutrientes foram

calculados a partir de alimentos e suplementos (11 dos 196 doentes e nenhum dos controlos

tomavam suplementos). A actividade física no ano anterior ao diagnóstico de cancro, nos

doentes, ou no ano anterior à entrevista, nos controlos, foi avaliada através do questionário

de Arroll (11), que permitiu agrupar os indivíduos em 3 níveis diferentes: baixa (0), intermédia

(1) e elevada (2). Os hábitos tabágicos foram avaliados pelo número de cigarros/dia.

Processo de Genotipagem

Foram colhidas amostras de sangue total e armazenadas em cartões Cards Kit 3-mm. A

extracção de DNA foi realizada utilizando Generation Capture Card Kit-DNA Purification, DNA

Elution (Gentra Systems Inc, Minneapolis, MN). O polimorfismo GAC/GTC no codão 677 do

gene MTHFR e o polimorfismo A2756G do gene MTR (5,10-metilenotetrahidrofolato

reductase) foram genotipados utilizando Assays-by-Design TaqMan para análise de

discriminação alélica (Applied Biosystems, Foster City, CA). O polimorfismo C1420T do gene

SHMT foi genotipado com sondas TaqMan desenhadas com o software BEACON DESIGNER

5,0 (Premier Biosoft, Palo Alto, CA). Foram utilizadas sondas para o alelo C

Nutrição e Genes em Doenças Intestinais

58

(CAGAGGGAAGAGAGAGGCGAAGC), para o alelo T

(CAGAGGGAAGAAAGAGGCGAAGC), para o primer forward

(GAAAGAGTTCAAGGAGAGACT), e para o primer reverse (CTCCTTTAGAAGTCAGGCAG).

A reacção em cadeia da polimerase (PCR) foi realizada com a mistura de: 4 μl de DNA

genómico, 10 μl de Taqman Universal PCR Master Mix (Applied Biosystems), 1 μl de 20x

assay mix e ddH2O até perfazer 20 μl de volume final. Foi usado o seguinte protocolo de

amplificação: desnaturação a 95°C durante 10 min, seguida de 40 ciclos de desnaturação a

92°C durante 15 s, e hibridação e extensão a 60°C durante 1 min. Todas as reacções foram

realizadas no iCycler iQ Multicolor Real Time PCR Detection System (Bio-Rad, Hercules, CA).

Após PCR, o genótipo de cada amostra foi atribuído automaticamente pelo software do

equipamento, através da medida da fluorescência específica de cada alelo.

Os indivíduos foram classificados em homozigóticos para a variante se possuíssem 2

alelos mutados, heterozigóticos se possuíssem apenas um alelo mutado, e por fim

homozigóticos wildtype quando não tinham qualquer alelo mutado. Quando analisada a

interacção entre as variáveis genéticas e nutricionais, foi utilizado o valor da mediana para

cada nutriente. Para a maioria dos nutrientes, a percentagem de indivíduos (casos e

controlos) que ingeriu a dose recomendada de ingestão foi superior a 80%, pelo que não

utilizámos os valores da dose recomendada de ingestão mas sim da mediana de consumo.

Métodos estatísticos

A análise estatística foi realizada através do software SPSS versão 15.0 para WINDOWS

(SPSS Inc, Chicago, IL). Os resultados foram expressos como média ± desvio padrão, como

número (e percentagem) de indivíduos, ou como odds ratio (OR) com IC de 95%. A análise

bivariada foi realizada utilizando o teste t de Student ou teste Mann-Whitney para variáveis

contínuas, e o teste qui-quadrado para variáveis categóricas. Foi usada regressão logística

múltipla para avaliar as variáveis relacionadas com o risco de CCR. A significância das

interacções foi calculada através do teste likelihood ratio comparando o modelo de interacção

com outro contendo apenas o efeito de 2 variáveis. O nível de significância foi estabelecido

para um P<0,05.

RESULTADOS

Características da população e estilos de vida

Ambos os grupos eram semelhantes na idade e género. Alguns doentes (23%)

apresentaram história familiar positiva de CCR em primeiro ou segundo grau, contrastando

com apenas 8% da população controlo (P<0,001; OR: 3,4; IC 95%: 1,85-6,29). Não foram

identificadas diferenças nos hábitos tabágicos entre os grupos (P>0,05); mas os doentes,

quando comparados com os controlos, apresentaram um índice de massa corporal

significativamente inferior (em kg/m2: 25,6±4,2 comparado com 27,0±3,9, P=0,01) e eram

significativamente menos activos (P=0,001). Contudo, o exercício de per si não influenciou o

risco de desenvolver CCR (OR: 0,78; IC 95%: 0,53-1,1).

Nutrição e Genes em Doenças Intestinais

59

Avaliação da ingestão nutricional

A ingestão nutricional diária de folato, vitamina B12 e B6, glicina, metionina, serina e álcool

é apresentada no Quadro 1. Não se verificaram diferenças significativas entre casos e

controlos, excepto no consumo de folato que foi significativamente inferior nos doentes

(P=0,02). Analisando o risco associado à ingestão deste nutriente, observámos um risco (OR)

de 0,67 (IC 95%: 0,45-0,99) para os indivíduos com elevada ingestão de folato (> 406,7

µg/dia). O consumo de álcool foi superior nos doentes, mas a diferença não atingiu

significado estatistico, uma vez que 35,2% dos doentes e 38,5% dos controlos não consumia

qualquer tipo de bebida alcoólica. No entanto, se considerarmos apenas os consumidores de

ambos os grupos, observámos que a ingestão média diária era significativamente superior

nos doentes do que nos controlos: 38,8g/d vs 31,0 g/d, respectivamente (OR: 1,97; IC 95%:

1,19-3,26). Ao analisarmos a influência conjunta de 2 ou mais nutrientes na modulação do

risco de CCR, não foi verificada nenhuma interacção entre variáveis, excepto para o elevado

consumo de álcool que em combinação com baixa ingestão de folato, foi associado a um

aumento marginal no risco de desenvolver CCR (OR: 1,47; IC 95%: 0,94-2,30; P=0,08).

Quadro 1

Ingestão nutricional diária dos participantes1

Casos

(n=196)

Controlos

(n=200)

P

OR (IC 95%)2

Vitamina B6 (mg/d) 2,83 ± 1,06

3 2,85 ± 0,98 NS 0,77 (0,50-1,14)

Vitamina B12 (μg/d) 14,5 ± 9,1 14,3 ± 8,23 NS 0,98 (0,66-1,45)

Folato (μg /d) 401,6 ± 161,9 434,3 ± 161,3 0,02 0,67 (0,45-0,99)

Glicina (mg/d) 5,39 ± 2,8 5,10 ± 2,34 NS 1,00 (0,68-1,50)

Metionina (mg/d) 2,85 ± 1,28 2,78 ± 1,13 NS 0,99 (0,67-1,50)

Serina (mg/d) 5,15 ± 2,20 5,14 ± 1,95 NS 0,89 (0,59-1,30)

Álcool (g/d) 25,17 ± 39,8 19,14 ± 43,42 NS 1,08 (0,73-1,61)

1 As diferenças em nutrientes foram determinadas utilizando o teste Mann-Whitney ajustado para idade, sexo e

história familiar de cancro colo rectal. OR, odds ratio. 2O OR foi determinado utilizando valores acima e abaixo do valor da mediana de consumo. Os cut-offs utilizados

foram: vitamina B6, 2,7mg; vitamina B12,12,5µg; folato, 406,7µg; metionina, 2,58mg; serina, 4,86mg; glicina, 4,68mg; e álcool: 3,4g/d.

3 média ± desvio padrão (para todos os valores).

Genótipos dos Polimorfismos

As frequências dos genótipos dos polimorfismos encontram-se descritas no Quadro 2.

Nos controlos, as distribuições dos genótipos encontravam-se em equilíbrio Hardy Weinberg

com excepção para o polimorfismo MTHFR C677T. Nos controlos, as frequências das

variantes alélicas dos genótipos MTHFR C677T, MTR A2756G, e SHMT C1420T foram

respectivamente 31,2%, 16,7%, e 26,5%, e nos casos 32,7%, 15,1% e 28,6%,

respectivamente. O polimorfismo MTR A2756G per si não foi associado a um aumento do

risco de CCR (Quadro 2). Pelo contrário, indivíduos homozigóticos para a variante MTHFR

677 (TT) apresentaram um risco 3 vezes superior de CCR (OR: 3,01; IC 95%: 1,3-6,7). Da

mesma forma, a homozigotia para o polimorfismo SHMT C1420T revelou um risco 2,6 vezes

Nutrição e Genes em Doenças Intestinais

60

superior de desenvolver CCR (IC 95%: 1,1-5,9). Nenhuma das variantes alélicas dos três

polimorfismos foi associada ao risco de CCR.

Analisando apenas o grupo de doentes, não verificámos nenhuma correlação entre o

genótipo e sexo, localização do tumor (cólon ou recto), estadio da doença, ou história familiar

de CCR. Também avaliámos a interacção dos 3 polimorfismos na modulação do risco de

CCR. Para cada género não se observou haver interacção com os genótipos (dados não

apresentados).

Quadro 2

Frequências de genótipos e associações com risco de cancro colo rectal1

1MTHFR, metilenotetrahidrofolato reductase; MTR metionina sintetase; SHMT, serina hIdroxilmetiltransferase;

OR, odds ratio. 2 Calculados com teste de qui-quadrado.

3 O genótipo

wild type/heterozigótico foi a categoria de referência para o cálculo do OR (regressão múltipla). OR

foi ajustado para idade, sexo, e história de cancro colo rectal.

Interacção entre dieta e polimorfismos

A interacção entre a ingestão de vários nutrientes dadores de grupos metilo e álcool, e do

polimorfismo MTHFR C677T é apresentada no Quadro 3. Curiosamente, observámos que

um consumo reduzido de todos os nutrientes dadores de grupos metilo estava associado a

um aumento do risco de desenvolver CCR nos indivíduos TT, mas apenas foi observada uma

interacção significativa para o folato (OR: 14,0; IC 95%: 1,8-108,5). A ingestão de álcool não

mostrou nenhum efeito na modulação do risco. Relativamente aos polimorfismos MTR

A2756G e SHMT C1420T não foram observadas interacções significativas com nenhum dos

nutrientes estudados.

Casos

(n=196)

Controlos

(n=200)

P2

OR (IC 95%)3

% (n) % (n)

MTHFR

CC/CT

TT

Alelo C

Alelo T

86,7 (170)

13,3 (26)

67,3 (264)

32,7 (128)

95,5 (191)

4,5 (9)

68,8 (275)

31,2 (125)

0,002

NS

1

3,01 (1,3-6,7)

1

1,07 (0,79-1,44)

MTR

AA/AG

GG

Alelo A

Alelo G

98,0 (192)

2,0 (4)

84,8 (333)

15,1 (59)

98,0 (196)

20,0 (4)

84,9 (339)

16,7 (67)

NS

NS

1

0,77 (0,18-3,3)

1

0,90 (0,61-1,32)

SHMT

CC/CT

TT

Alelo C

Alelo T

90,0 (177)

10,0 (19)

71,4 (280)

28,6 (112)

95,5 (191)

4,5 (9)

73,5 (294)

26,5 (106)

0,04

NS

1

2,6 (1,1-5,9)

1

1,11 (0,81-1,52)

Nutrição e Genes em Doenças Intestinais

61

Quadro 3

Odds ratio (OR) do cancro colo rectal dependendo do genótipo MTHFR C677T

(metilenotetrahidrofolato reductase) e a dieta1

1A combinação do genótipo wild type/heterozigotico (CC/CT) e baixo consumo foi a categoria de referência para o

cálculo do OR (regressão múltipla). O OR foi ajustado para idade, sexo, história de cancro colo rectal e determinado

utilizando os valores acima ou abaixo do valor mediano de consumo. Os cut-offs foram: vitamina B6, 2,7 mg; vitamina

B12, 12,5µg; folato, 406,7µg; metionina, 2,58mg; serina, 4,86mg; glicina: 4,68mg e álcool: 3,4g/d. 2 OR; IC 95% dentro de parêntesis (para todos os valores).

DISCUSSÃO

O presente estudo caso-controlo avaliou, numa população Portuguesa, o risco de CCR e a

interacção entre a ingestão de folato e de outros nutrientes relacionados com o metabolismo

do grupo metilo, e polimorfismos genéticos de enzimas do ciclo de metabolização do folato.

Um número de estudos epidemiológicos, clínicos, e em animais realizados nas últimas 2

décadas sustentam a ideia de que baixos níveis de folato predispõem à carcinogénese colo

rectal (12). Os mecanismos biológicos associados à depleção de folato e carcinogénese colo

rectal incluem a alteração na síntese de nucleótidos, na metilação do DNA, ou em ambos, já

que o folato é o intermediário principal para a maioria das reacções de metilação no

metabolismo celular (2, 12-15).

Apesar da maioria dos estudos se focarem apenas no folato, existem outros nutrientes,

como vitamina B6 ou a vitamina B12, que são importantes co-enzimas necessárias à

actividade de diferentes enzimas envolvidas nestes ciclos de metilação, como a MTR ou

SHMT, ou certos aminoácidos essenciais e não essenciais que desempenham igualmente

importantes funções no ciclo da metilação do DNA. Por estas razões, no presente estudo

avaliámos a influência destes nutrientes relacionados com o metabolismo do grupo metilo de

forma isolada e também em interacção com as enzimas do ciclo da metabolização do folato,

MTHFR, MTR, e SHMT, no risco de CCR.

MTHFR C677T

P para a interacção

CC/CT

TT

Vitamina B6 Elevado

0,83 (0,55-1,26)

2

1,77 (0,67-4,68)

NS

Baixo 1 7,22 (1,6-32,6)

Vitamina B12 Elevado

1,01 (0,67-1,53)

2,71 (0,9-8,0)

NS

Baixo 1 3,95 (1,2-12,4) Folato

Elevado

0,77 (0,51-1,17)

1,50 (0,59-3,8)

0,05 Baixo 1 14,0 (1,8-108,5)

Glicina Elevado

1,1 (0,7-1,6)

2,0 (0,7-5,3)

NS

Baixo 1 8,2 (1,8-36,9) Metionina

Elevado

1,1 (0,75-1,76)

2,1 (0,8-6,2)

NS Baixo 1 5,9 (1,6-1,3)

Serina Elevado

0,92 (0,6-1,4)

1,79 (0,63-5,14)

NS

Baixo 1 5,7 (1,6-20,4) Álcool

Elevado

1,1 (0,72-1,6)

3,5 (1,1-11,3)

NS Baixo 1 3,2 (1,1-9,5)

Nutrição e Genes em Doenças Intestinais

62

Os nossos dados revelam que, excepto para o folato, nenhum dos outros nutrientes que

analisámos de forma isolada ou conjuntamente, influenciou o risco de CCR. Para o folato,

observámos que uma ingestão superior a 406,7 µg/dia reduzia o risco de CCR em mais de

30% (OR: 0,67; IC 95%: 0,45-0,99). Estes resultados estão de acordo com a maioria dos

estudos epidemiológicos prospectivos publicados (16,17), apesar de recentemente ter sido

levantada a hipótese de um consumo elevado de folato, nos indivíduos possuidores de lesões

premalignas, adenomas colorectais por exemplo, poder na realidade aumentar o risco de

CCR (7,18). Contudo, gostaríamos de destacar que este aumento no risco de CCR é

observado quando são utilizadas doses farmacológicas de ácido fólico (a forma sintética de

folato, com melhor biodisponibilidade) e não com a ingestão de apenas folato dietético. No

que respeita à influência que os polimorfismos exercem no risco de CCR, o polimorfismo

C677T do gene da MTHFR é provavelmente o mais estudado, mas a sua relação com o CCR

mantém-se incerta. A presença desta variante polimórfica (TT) revelou reduzir in vitro a

actividade da enzima a 30% (19), o que pode resultar numa redução significativa da metilação

do DNA nos indivíduos TT em comparação com os indivíduos CC e CT (20).

Contrariamente à maioria dos estudos previamente publicados que revelam uma redução

de 50% no risco de CCR nos indivíduos detentores do genótipo TT, nós observámos que o

genótipo TT estava associado a um aumento no risco CCR (OR: 3,01; IC 95%: 1,3-6,7). No

entanto, uma análise crítica aos estudos anteriormente publicados sugere que o efeito

protector do genótipo TT parece estar fortemente dependente do consumo de folato. Assim,

nos primeiros estudos realizados nos países da América do Norte, Chen e colaboradores (21)

verificaram que o genótipo TT poderia mesmo aumentar o risco de CCR em homens com um

elevado consumo de álcool (OR: 1,56; IC 95%: 0,65-3,81). O álcool é um conhecido

antagonista do metabolismo do folato, e de forma semelhante à depleção de folato, foi

demonstrado que um abuso crónico de álcool resulta numa hipometilação do DNA (22). Num

estudo posterior, Ma e colaboradores (23), revelaram que o genótipo TT conferia um efeito

protector no risco de CCR, mas apenas nos indivíduos com um consumo elevado de folato.

Nos homens com consumo reduzido de folato, o genótipo TT estava na verdade associado a

um aumento do risco de desenvolver CCR (OR: 1,33; IC 95%: 0,34-5,17). Destaca-se que

todos os estudos desde então realizados na América do Norte (que inequivocamente revelam

um efeito protector do genótipo TT) foram efectuados depois da política legislativa de

fortificação dos cereais com ácido fólico. Finalmente, é preciso ter em conta que até 35-50%

dos adultos americanos consomem regularmente suplementos vitamínicos, a maioria dos

quais fornecem 400 μg de ácido fólico por comprimido. Todas as considerações acima

mencionadas, são possíveis explicações para o facto de todos os estudos realizados nos

EUA desde 1998-2000, que examinam o efeito do polimorfismo MTHFR C677T, observarem

um efeito protector do genótipo TT, porque a ingestão de folato era elevada na grande

maioria, se não mesmo em todos os indivíduos (23,24). No estudo publicado por Le

Marchand e colaboradores (25) os autores observaram um consumo total de folato entre 500

e 600 μg/dia, enquanto no presente estudo observámos um consumo perto dos 400μg/dia.

Esta diferença de consumo, poderá ser uma explicação plausível, para a divergência de

resultados obtidos em estudos oriundos da Europa (26-28), México (29), ou mesmo da

Nutrição e Genes em Doenças Intestinais

63

Austrália (30), onde o genótipo TT foi na realidade associado a um risco aumentado de CCR.

A fortificação não foi implementada nem na Europa nem na Austrália; é por isso muito

provável que os níveis de folato sejam substancialmente mais baixos do que em países onde

a fortificação já foi implementada. A sustentar esta hipótese, quando analisámos a interacção

entre a ingestão de folato e o polimorfismo da MTHFR, observámos que um consumo

reduzido de folato era especialmente deletério nos indivíduos TT (OR: 14,0; IC 95%: 1,8-

108,5). A razão para não termos observado um efeito protector do folato nos indivíduos TT,

deve-se provavelmente ao facto de na nossa população o consumo de folato não alcançar os

níveis necessários, para transformar o genótipo TT num factor protector.

No presente estudo avaliámos igualmente o efeito do recentemente descrito polimorfismo

na MTR, o A2756G (31). Tal como nós, Ma e colaboradores (5) e Marchand e colaboradores

(25) observaram que o polimorfismo do MTR não estava associado ao risco de CCR, nem se

verificou interacção significativa com nenhum dos nutrientes dadores de grupos metilo

analisados.

Finalmente, também estudámos o polimorfismo SHMT1 C1420T. Que seja do nosso

conhecimento, existe apenas um estudo até à data que examinou a relação entre o genótipo

do SHMT1 e o risco de CCR, não tendo sido observada qualquer interacção (7).

Recentemente, Van den Donk e colaboradores (32) estudaram a relação entre este

polimorfismo, dieta e adenomas colorectais e concluíram que o polimorfismo SHMT1 C1420T

não desempenhava qualquer papel na carcinogénese colo rectal. Uma das hipóteses para

esta falta de interacção, segundo Chen e colaboradores (8), é que a SHMT2 (outra isoforma

da mesma enzima) poderá também fornecer o grupo carbono necessário para o metabolismo

do folato. Nos nossos dados observámos que este polimorfismo estava associado a um

aumento no risco de desenvolver CCR, no entanto o significado das nossas observações é

limitada dado o reduzido número de indivíduos homozigóticos para a variante (n = 9). Uma

vez que a significado funcional deste polimorfismo não é ainda conhecido, e devido ao

número reduzido de indivíduos homozigóticos, estes resultados necessitam de confirmação.

Em conclusão, o presente estudo demonstra que o polimorfismo MTHFR C677T modifica

o risco de desenvolver CCR dependendo dos níveis de folato consumidos. Que seja do nosso

conhecimento, a influência deste polimorfismo genético nunca foi examinado nos países da

Europa do Sul, onde o consumo de folato, e outros nutrientes dadores de grupos metilo, bem

como o de álcool é certamente diferente dos países do Norte da Europa ou da América. Uma

vez que a politica de fortificação de ácido fólico nunca foi implementada no nosso País, e o

consumo de suplementos vitamínicos não é frequente, é expectável que a nossa população

apresente níveis relativamente baixos de ingestão folato. Esta é uma explicação plausível

para o facto, de na nossa população, o genótipo TT estar associado a um risco aumentado de

desenvolver CCR, particularmente nos indivíduos com baixa ingestão de folato (Quadro 3).

Nutrição e Genes em Doenças Intestinais

64

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Nutrição e Genes em Doenças Intestinais

67

Estudo 3

Uma Abordagem Global na Avaliação do Estado Nutricional de Doentes de

Crohn na Era da Terapia Biológica: Um Estudo Caso-Controlo

Catarina Sousa Guerreiro, Marília Cravo, Ana Raimundo Costa, Ana Miranda, Lourdes

Tavares, Paula Moura-Santos, Pedro Marques-Vidal, e Carlos Nobre Leitão.

A Comprehensive Approach to Evaluate Nutritional Status in Crohn´s Patients in the Era of

Biologic Therapy: A Case- Control Study

American Journal of Gastroenterology 2007;102(11):255-56

Nutrição e Genes em Doenças Intestinais

68

RESUMO

Objectivos: Avaliar o estado nutricional de doentes com doença de Crohn (DC) inactiva ou

ligeira e identificar possíveis causas para potenciais deficiências.

Métodos: Foram avaliados 78 doentes com Crohn e 80 controlos saudáveis no que respeita

ao estado nutricional, ingestão dietética e estilos de vida.

Resultados: Dos 78 doentes com DC, 73 estavam sujeitos a terapia imunomodulatória. O

índice de massa corporal (IMC) era inferior nos doentes quando comparado com o dos

controlos (P=0,006), mas 32% dos doentes e 33,8% dos controlos apresentaram um IMC>

25, em cada grupo 8% e 23,8%, respectivamente, eram obesos (IMC> 30Kg/m2). A massa

livre de gordura estava significativamente reduzida em ambos os géneros (P<0,05), enquanto

a massa gorda estava diminuída apenas nos homens (P=0,01). Nos doentes com DC, a

ingestão energética era significativamente inferior (P <0,0001) e observámos uma ingestão

média diária ajustada significativamente mais baixa de glícidos, gordura monoinsaturada,

fibra, cálcio, e vitaminas C, D, E e K (P<0,05). Dos doentes, 29% havia excluído da dieta

habitual os cereais, 28% o leite, 18% os vegetais, e 11% a fruta. A exclusão de leite resultou

numa ingestão significativamente mais baixa de cálcio e vitamina K (P<0,001) e a exclusão

de vegetais estava associada a uma reduzida ingestão de vitaminas C e E (P<0,05). A

actividade física era significativamente mais baixa nos doentes com DC (P=0,01), e esta falta

de exercício estava inversamente relacionada com o aumento da percentagem de massa

gorda (r = -0,315; P=0,001).

Conclusões: Os resultados demonstram que o tipo de malnutrição mais prevalente nestes

doentes com DC é um excesso de peso corporal, concomitante com uma ingestão dietética

inadequada, nomeadamente de micronutrientes, claramente relacionada com a exclusão de

determinados alimentos da dieta.

Nutrição e Genes em Doenças Intestinais

69

INTRODUÇÃO

A doença inflamatória do intestino (DII) tem sido classicamente associada à desnutrição

(1). As potenciais causas incluem a redução da ingestão alimentar, a malabsorção de

determinados nutrientes, assim como o aumento de perdas através do trato gastrintestinal

(2,3). Além disso, os corticosteróides, frequentemente utilizados no tratamento da DC, podem

contribuir para a deterioração do estado nutricional (4-6).

Muitos dos estudos prévios que referem elevada incidência de desnutrição nos doentes

com DII foram realizados nas décadas de 70 e 80, e focaram maioritariamente doentes

hospitalizados com DC activa grave (7-9). Nestes doentes, a desnutrição era certamente

agravada pelo intenso hipercatabolismo associado à resposta de fase aguda (10), sendo

dada prioridade à síntese proteica. São provavelmente estas as razões pelas quais estudos

recentes, que examinaram o estado nutricional de doentes com DC em remissão, revelaram

uma prevalência de desnutrição substancialmente inferior em relação a estudos anteriores

(11). Contudo, entre os estudos mais recentes existem ainda algumas discrepâncias, alguns

revelam grandes diferenças entre doentes com DII e controlos (12), enquanto outros não (1,

11,13).

Outro aspecto que pode explicar algumas das divergências entre os vários estudos está

relacionado com o facto da terapia da DC se ter alterado dramaticamente nas últimas

décadas. A imunossupressão com azatioprina ou 6-mercaptopurina é actualmente uma

prática comum em doentes cortico-dependentes ou em doentes que apresentem mais de

duas exacerbações por ano (14). Esta prática não só evitará os efeitos deletérios da

inflamação crónica no estado nutricional, como também efeitos derivados do uso crónico de

corticosteróides (15,16). Mais importante, durante a última década a terapia biológica com

anticorpos monoclonais contra TNF-alfa tem sido utilizada com crescente frequência em

doentes com DC, o que pode modificar esse cenário de actividade da doença e desnutrição.

No presente estudo caso-controlo apenas foram incluídos doentes com DC não

hospitalizados com actividade da doença ligeira a moderada. O nosso objectivo foi avaliar o

estado nutricional, incluindo a composição corporal e a ingestão nutricional, e identificar

possíveis causas para potenciais deficiências, incluindo alterações recentes nos hábitos

alimentares.

METODOLOGIA

População

O protocolo do estudo foi aprovado pelos Comités Cientifico de Ética do Instituto

Português de Oncologia Francisco Gentil (IPOFG) e do Hospital Universitário de Santa Maria,

ambos na área de Lisboa. Todos os participantes deram o seu consentimento informado por

escrito antes do início do estudo.

Setenta e oito doentes em ambulatório com um diagnóstico confirmado de DC (47F: 31M,

idade média de 40,4 ± 14,1 anos), seguidos na consulta externa de rotina entre o período de

Setembro de 2004 a Março de 2005, foram solicitados a participar no estudo. O diagnóstico

foi baseado em critérios previamente definidos (17) e a actividade da doença foi avaliada de

acordo com o Índice de Harvey-Bradshaw (IHB) (18), calculado no momento da inclusão do

Nutrição e Genes em Doenças Intestinais

70

doente no estudo. Foram excluídos do presente estudo os doentes com um IHB>5 (N=5). As

características dos doentes com DC encontram-se no Quadro 1. A maior parte dos doentes

estava submetido a terapia com Azatioprina (N=59), ou Metotrexato (N=5) ou Infliximab

(N=12). Destes últimos, 10 doentes encontravam-se também sob terapia com Azatioprina.

Apenas 5 dos 78 doentes estavam medicados unicamente com preparações de 5-ASA.

Nenhum dos doentes incluídos neste estudo estava ou tinha estado sob corticoterapia nos 3

meses anteriores. Nesses 3 meses, todos os doentes tinham mantido um peso corporal

estável.

Oitenta dadores de sangue e voluntários saudáveis recrutados do IPOFG, com distribuição

semelhante no género e idade (39F: 41M, idade média de 41,5 ± 12,6 anos) e sem história

prévia de DII, foram usados como grupo controlo.

Gestantes (N=1) e doentes com pacemakers (N=1) foram excluídos do estudo por

constituírem contra-indicações à realização de análise de bioimpedância eléctrica.

Métodos

Para a avaliação do estado nutricional foram utilizados os seguintes métodos:

a. Composição corporal: A composição corporal foi avaliada através de medidas

antropométricas e bioimpedância eléctrica (BIA). A altura foi medida ao milímetro

utilizando um estadiómetro vertical de parede (SECA®, Hanover, Germany), enquanto o

peso corporal foi medido através de uma balança electrónica de leitura digital (SECA®,

Hanover, Germany), com uma precisão de 0,1 kg. O IMC foi calculado utilizando o peso e

a altura (kg/m2). A prega cutânea tricipital (PCT) foi medida com um lipocalibrador (JAMAR

12 1110J®, Preston, MI). As percentagens de massa gorda (%MG) e de massa livre de

gordura (%MLG) foram determinadas pela utilização de BIA (Bodystat Quadscan

4000®,Tampa, FL, Filadélfia, PA).

b. Avaliação subjectiva global (SGA): Foi utilizado um questionário de SGA para proceder a

uma avaliação qualitativa do estado nutricional (19). Os doentes foram classificados como

bem nutridos (A), moderadamente desnutridos (B) ou gravemente desnutridos (C).

c. Ingestão dietética: A ingestão dietética foi avaliada através da utilização de um questionário

semi-quantitativo de frequência alimentar, validado para a população Portuguesa (20),

constituído por 86 itens alimentares, com 9 possíveis respostas relativamente à frequência

média de consumo (nunca ou menos de 1 vez por mês até 6 ou mais vezes por dia); e

com três hipóteses de resposta quanto à quantidade da porção (menor, igual ou maior que

a porção média). A ingestão dietética foi analisada numa base de dados modificada do

software Food Processor Plus, versão 7 (ESHA Research, Inc, Salem, OR), que inclui

alguns itens de alimentos Portugueses e permite a quantificação dos diferentes macro e

micronutrientes. Aos doentes foi solicitado que descrevessem os seus hábitos alimentares

durante o ano anterior à entrevista. Um total de 33/78 doentes estava a tomar

suplementos vitamínicos: 13 tomavam folato (1mg/3 vezes/semana) e os outros 20

doentes tomavam suplementos multivitamínicos. Estes foram também consideradas no

cálculo da ingestão. Foi também determinada a percentagem de indivíduos que atingiu a

as DRI para os diferentes nutrientes. Os doentes foram também questionados

Nutrição e Genes em Doenças Intestinais

71

relativamente à exclusão específica e sistemática de alimentos após o diagnóstico da

doença. Um alimento foi considerado excluído se o doente negasse a sua ingestão de

forma habitual (menos de 3 vezes/ano).

d. Actividade física: A actividade física foi avaliada através da aplicação do questionário de

Arroll (21), que categorizou os indivíduos em três níveis diferentes de actividade: baixo (0),

intermédio (1) e elevado (2). Para aumentar o poder estatístico e uma vez que a actividade

física não foi avaliada em alguns doentes e controlos, considerámos a actividade física em

dois níveis: sedentários versus intermédio/activo.

Análise estatística

A análise estatística foi realizada utilizando o software SPSS® 12.0 para Windows (SPSS

Inc., Chicago, IL). Os dados foram expressos como média ± desvio padrão e como número de

indivíduos e (percentagem). As comparações de dados quantitativos foram realizadas

utilizando o teste t de Student e análise de variância (ANOVA), e o teste de qui-quadrado foi

usado para comparação de dados categóricos; as relações bivariadas foram avaliadas

através dos testes de correlação de Pearson ou Spearman. A significância estatística foi

estabelecida para um nível de significância P<0,05.

RESULTADOS

O Quadro 2 revela os dados do estado nutricional e da composição corporal dos dois

grupos em estudo.

De acordo com a SGA e o IMC, a desnutrição afectou 5% ou menos dos doentes com DC,

e nenhum dos controlos. Embora o IMC médio tenha sido menor nos doentes com DC

(P=0,01), observámos que mais de 30% dos doentes e controlos tinham excesso de peso

corporal (IMC>25 kg/m2) e que 8% e 24% em cada grupo, respectivamente, foram

considerados obesos (IMC>30 kg/m2).

Nutrição e Genes em Doenças Intestinais

72

Quadro 1. Características dos Doentes com DC*

Anos de doençaז 11,4 ± 8,6

Localização da doença

Íleo % (N)

Cólon % (N)

Íleo + Cólon % (N)

29,7 (22)

14,9 (11)

55,4 (41)

Forma de apresentação

Inflamatória % (N)

Estenosante % (N)

Fistulizante % (N)

28,9 (22)

35,5 (27)

35,5 (27)

Terapêuticas

Corticoterapia prévia % (N)

Metotrexato % (N)

Azatioprina % (N)

Infliximab % (N)

76,6 (59)

6,6 (5)

77,6 (59)

15,6 (12)

Cirurgia prévia % (N) 46,8 (36)

Manifestações extra-intestinais % (N) 33,8 (26)

Hábitos tabágicos % (N) 34,2 (26)

*N=78 doentes

זMédia ± desvio padrão

Os dados relativos à composição corporal foram analisados separadamente por género.

Nos homens observámos que tanto a %MG e a PCT, como a %MLG, foram

significativamente inferiores nos casos, quando comparados com os controlos (Quadro 2).

Pelo contrário, nas mulheres foram observadas diferenças significativas apenas na %MLG,

com os doentes a apresentarem valores mais baixos que os controlos (Quadro 2).

Nutrição e Genes em Doenças Intestinais

73

Quadro 2. Caracterização do Estado Nutricional, Composição Corporal e Actividade Física*

Doentes de Crohn Controlos P

SGA % (N)

A –

B –

C –

94,7 (72)

5,3 (4)

0

100 (80)

0

0

NS

IMC (kg/m2)ť 24,7 ± 4,4 26,8 ± 5,0 0,01

Baixo peso % (N)

Peso normal % (N)

Excesso de peso % (N)

Obesidade % (N)

2,6 (2)

57,3 (43)

32 (24)

8 (6)

1,2 (1)

41,3 (33)

33,8 (27)

23,8 (19)

PCT (mm)2

Homens

Mulheres

17,8 ± 8,5

25,5 ± 8,9

28,0 ± 12,8

27,6 ± 7,5

0,001

NS

BIA

% MG ť

Homens

Mulheres

19,3 ± 6,4

27,8 ± 10,9

25,4 ± 11,2

31,6 ± 7,6

0,01

NS

% MLG ť

Homens

Mulheres

72,7 ± 13,4

61,3 ± 11,5

81,8 ± 15,9

67,3 ± 9,8

0,02

0,01

Actividade física ŧ

Sedentários % (N)

Activos % (N)

60 (30)

40 (20)

33,8 (27)

66,2 (53)

0,003

*N=78 no grupo caso e N=80 no grupo controlo.

ť Média ± desvio padrão. ŧ Apenas 50 doentes com DC foram avaliados relativamente à actividade física. Para o IMC, PCT, %MG, e %MLG, o valor de P resulta do teste t de student. Para a actividade física, o valor de P resulta do teste de qui-quadrado. NS = Não significativo.

Não foram encontradas correlações entre a composição corporal e a localização da doença,

recessões intestinais anteriores, forma de apresentação da doença ou Índice Harvey

Bradshaw. A percentagem de mulheres submetida a corticoterapia durante o ano anterior foi

significativamente mais elevada do que a de homens (P=0,006), e foi observada uma

correlação positiva entre o uso de corticoterapia durante o ano anterior e o aumento da %MG

(r=0,47; P=0,001).

Os níveis de actividade física foram também significativamente mais baixos nos doentes

com DC do que nos controlos (P=0,01), e esta falta de exercício estava também

inversamente associada ao aumento da %MG (r= -0,315; P=0,001).

O estado nutricional foi também avaliado através da avaliação da ingestão dietética. No

Quadro 3 encontra-se descrita a ingestão de macro e micronutrientes dos doentes e dos

controlos. Uma vez que a ingestão energética foi significativamente inferior nos doentes com

DC (P<0,0001), a ingestão de macro e micronutrientes foi ajustada para a ingestão

energética. Em comparação com os controlos, os doentes apresentaram uma ingestão diária

média significativamente inferior de glícidos, gordura monoinsaturada, fibra, cálcio e vitaminas

Nutrição e Genes em Doenças Intestinais

74

C, D, E e K. Não foram encontradas diferenças significativas relativamente à ingestão de

proteína, gordura total e polinsaturada, e ratio de ácidos gordos n-6/n-3.

Quadro 3. Ingestão Média Diária de Macro e Micronutrientes

Doentes de Crohn Controlos P

Energia (kcal/d)

Proteínas (g/d)

Glícidos (g/d)

Gordura total (g/d)

Gordura saturada (g/d)

Gordura monoinsaturada (g/d)

Gordura polinsaturada (g/d)

Fibra (g/d)

Açúcares simples (g/d)

Cálcio (mg/d)

Selénio (mg/d)

Vitamina A (µg/d)

Vitamina C (mg/d)

Vitamina D (µg/d)

Vitamina E (mg/d)

Vitamina K (µg/d)

Ácidos gordos n-3 (g/d)

Ácidos gordos n-6 (g/d)

Ácidos gordos n-9 (g/d)

Ratio n-6/n-3

2225 ± 693

97,0 ± 36,1

279,1 ± 106,6

81,6 ± 28

26,4 ± 10,5

35,9 ± 13,0

12,6 ± 5,2

21,0 ± 10,5

127,8 ± 65,9

885 ± 401,6

143,5 ± 59,9

645,5 ± 739,3

107,8 ± 79,9

3,3 ± 1,8

8,3 ± 3,6

14,8 ± 13,1

1,3 ± 0,5

9,4 ± 4,1

30,6 ± 11,4

7,4 ± 2,3

2932 ± 993

124,5 ± 41,4

336,8 ± 136,7

117,0 ± 46,8

36,7 ± 17,2

53,8 ± 23,3

17,4 ± 6,7

32,2 ± 13,7

155,8 ± 84,4

1496,4 ± 676,9

110,2 ± 51,5

947,3 ± 861,8

195,9 ± 109,4

5,4 ± 3,1

13,7 ± 5,4

25,7 ± 16,5

1,7 ± 0,6

13,6 ± 5,8

47,6 ± 21,6

7,8 ± 2,1

<0,001

NS

0,03

NS

NS

0,02

NS

0,02

NS

<0,001

NS

NS

<0,001

0,002

<0,001

0,01

0,02

0,002

<0,001

NS

Os dados relativos à ingestão nutricional estão expressos como média ± desvio padrão. Teste de análise univariada comparando casos e controlos, ajustados para IMC e calorias. NS = Não significativo.

A ingestão nutricional foi também avaliada de acordo com a localização da doença (íleo,

cólon, e íleo-cólon) ou idade do doente (inferior ou superior a 40 anos). Relativamente à

ingestão de macronutrientes, observámos que a ingestão de proteínas e gordura saturada foi

significativamente mais elevada (P=0,04 e P=0,01, respectivamente) nos doentes com

doença íleo-cólica em comparação com as outras localizações da doença. Também a

ingestão de cálcio e vitamina K foi superior nos doentes com doença íleo-cólica (P=0,01 e

P<0,001, respectivamente). No que respeita às diferenças na ingestão de nutrientes de

acordo com a idade, verificámos que os doentes com idade inferior a 40 anos consumiam

mais gordura saturada (P=0,01), mais fibra (P=0,03), assim como mais vitamina A (P=0,04) e

mais vitamina D (P=0,02).

Quanto às DRI‟s para micronutrientes, também observámos que os doentes com DC

apresentavam uma dieta significativamente menos equilibrada no que respeita ao cálcio e

vitaminas A, C, D e E, em comparação com os controlos (Quadro 4).

Nutrição e Genes em Doenças Intestinais

75

Quadro 4. Percentagem de Doentes que Atingiram as DRI*

Casos Controlos Pŧ

Proteínas ť (N)

Gordura totalť (N)

Glícidosť (N)

Fibra (N)

Cálcio (N)

Selénio (N)

Vitamina A (N)

Vitamina C (N)

Vitamina D (N)

Vitamina E (N)

Vitamina K (N)

100 (78)

93,9 (73)

55 (44)

19,7 (15)

32,9 (25)

7,7 (6)

26,9 (21)

60,3 (47)

13,3 (10)

6,4 (5)

0

100 (80)

96,6 (78)

74,4 (58)

52,5 (38)

77,2 (61)

100 (80)

50 (40)

92,4 (73)

32,5 (26)

30,0 (24)

0

NS

NS

0,01

<0,001

<0,001

0,01

0,003

<0,001

0,005

<0,001

NS

*DDI – Dietary Reference Intake de acordo com idade e género – Food and Nutrition Board, Institute of Medicine, National Academies, 2002. ť Relativamente aos macronutrientes, a DRI é definida por um intervalo (Acceptable Macronutrient Distribution Range); assumiu-se que a DRI foi atingida se o limite mínimo do intervalo foi alcançado. ŧO P-value foi obtido pelo teste de qui-quadrado. NS = Não significativo.

Quando questionados acerca dos alimentos excluídos após o diagnóstico de DC, 29% dos

doentes tinham excluído os cereais da sua dieta habitual, 28% o leite, 18% os vegetais, e

11% a fruta. Mais ainda, quando correlacionada a exclusão destes alimentos com a ingestão

de nutrientes, observámos que a exclusão de leite estava associada a um consumo

significativamente inferior de cálcio (1010,3 ± 47,3mg vs 695,3 ± 70,9 mg P<0,001) e vitamina

K (22,3 ± 1,8 mg vs 5,88 ± 2,7mg P<0,001) e que a exclusão de vegetais estava associada a

um menor consumo de vitamina C (121,2 ± 10,1mg vs 79,8 ± 20,2 mg; P=0,01) e vitamina E

(8,7 ± 0,5mg vs 8,2 ± 0,9mg P=0,04).

Não foram encontradas diferenças na ingestão dietética relativamente à actividade da

doença, recessões intestinais anteriores, e a presente medicação. Foram investigadas

possíveis causas para o excesso de peso (ingestão dietética, localização da doença e/ou

actividade física), mas não foram observadas associações significativas.

DISCUSSÃO

No presente estudo observámos que, contrariamente ao que tem sido descrito em doentes

com DC (13,16,22), a forma de malnutrição mais comum neste grupo de doentes foi um

excesso de peso corporal ou mesmo obesidade. A desnutrição que tradicionalmente afecta

mais de 50% destes doentes foi observada nesta amostra em menos de 5%. Vários factores

podem explicar estas diferenças. Em estudos anteriores, os doentes incluídos estavam

maioritariamente hospitalizados, com doença activa grave, nos quais o repouso intestinal era

de extrema importância (7-9). Além disso, a maior parte dos doentes estaria sob terapêutica

com elevada dosagem de corticosteróides orais ou IV com consequências negativas no

estado nutricional (4,6).

Para evitar a interferência destas variáveis de confundimento, os estudos realizados

durante a última década incluíram essencialmente doentes em remissão. Assim, em 1998

Nutrição e Genes em Doenças Intestinais

76

Capristo e colaboradores (12) realizaram um estudo que incluiu doentes com colite ulcerosa

(CU) e com DC em remissão e verificaram que os últimos apresentavam peso corporal

significativamente mais baixo do que os doentes com CU ou controlos, com menos %MG,

mas sem diferenças na %MLG. Estes resultados diferem dos publicados por Geerling e

colaboradores (1,13), que descreveram a não existência de diferenças significativas no peso

ou IMC dos doentes com DC, em comparação aos doentes com CU e controlos, mas sim

uma redução na %MG corporal nos doentes com DC do género masculino. No último destes

estudos (13), os autores verificaram que apesar da ausência de sinais geralmente

reconhecidos como indicadores de desnutrição, os doentes com DC apresentavam menos

força e resistência nos músculos flexores. Mais tarde, Jahnsen e colaboradores (23)

observaram essencialmente uma redução da %MLG nos doentes do género masculino, com

preservação da %MG. Mais recentemente, Filippi e colaboradores (11) não encontraram

quaisquer diferenças no que respeita à altura, peso corporal ou IMC de 54 doentes com DC

em comparação com 25 controlos saudáveis, no entanto os doentes tinham significativamente

menos MG, com tendência para um aumento na MLG.

No presente estudo, realizado em 78 doentes não hospitalizados com doença ligeira a

moderada e 80 controlos com características demográficas semelhantes, observámos que o

peso e o IMC foram mais baixos nos doentes. Os dados da composição corporal também

diferiram entre doentes e controlos, e em concordância com outros estudos (13,23), estas

diferenças foram específicas em função do género. A %MLG foi significativamente inferior em

ambos os géneros, enquanto a %MG apenas estava reduzida nos homens. Podemos

especular se estas diferenças estarão relacionadas com diferentes factores. Embora os

estudos recentes tendam a incluir unicamente doentes em remissão, no estudo de Geerling

(13), quase 50% dos doentes estudados tinha um CDAI (Crohns disease activity index)>150,

o que indica que estes doentes apresentavam pelo menos algum grau de actividade de

doença. Para além disso, alguns dos doentes estavam sob corticoterapia (13/32), e a maioria

tinha sido já submetida a recessões intestinais apresentando síndrome do intestino curto

(27/32). Todas estas variáveis obviamente influenciarão o peso corporal assim como a

composição corporal.

É também de enfatizar que no presente estudo o tipo de malnutrição mais prevalente,

observado tanto nos doentes como nos controlos, não foi a desnutrição, mas antes um

excesso de peso corporal ou mesmo obesidade presente em mais de um terço dos

indivíduos. Este facto foi já descrito num estudo publicado recentemente (24) e pode ser

atribuído a diferentes factores. Em primeiro lugar, um grande número de estudos

epidemiológicos demonstra que a obesidade atingiu proporções epidémicas ao longo das

últimas décadas, principalmente no Mundo Ocidental (25,26). É também de realçar que no

presente estudo a percentagem de indivíduos sedentários, não activos, foi significativamente

mais elevada no grupo de doentes e, como seria de esperar, foi encontrada uma correlação

inversa entre esta variável e o aumento da %MG. Consequentemente, considerando que este

grupo de doentes se encontra num elevado risco de desenvolver excesso de peso, os

médicos devem estar alerta e recomendar a prática de exercício físico de forma a evitar esta

co-morbilidade. Adicionalmente, na era da terapia imunossupressiva e biológica, a

Nutrição e Genes em Doenças Intestinais

77

percentagem de doentes com doença activa crónica, para os quais uma reduzida dose de

corticosteróides seria frequentemente prescrita de forma crónica, é actualmente uma minoria.

Para além das reconhecidas complicações da obesidade, é crescente a evidência a sugerir a

obesidade como um estado de inflamação crónico (27,28). Parece assim que, pelo menos em

alguns doentes, a obesidade poderá estar associada a um reduzido grau de inflamação do

tecido branco adiposo (TBA), resultado de uma activação crónica do sistema imunitário inato

(29). Estudos recentes demonstraram que o TBA é caracterizado por um aumento da

produção e secreção de uma variedade de moléculas inflamatórias, incluindo TNF-alfa e IL-6,

que nestes doentes, podem contribuir para um aumento na actividade da doença (30).

Embora neste estudo não tenha sido observada nenhuma correlação entre o IMC e a

actividade da doença, seria interessante explorar, em estudos futuros com maior número de

doentes e com doença activa e activa grave, se o excesso de peso poderá ser um factor de

prognóstico negativo. A suportar esta hipótese, Hass e colaboradores no estudo

recentemente publicado (24) observaram que os doentes com DC e IMC>25 Kg/m2

necessitavam de intervenção cirúrgica mais precoce e, possivelmente, de terapia médica

mais agressiva.

Relativamente à ingestão de nutrientes, e em contraste com estudos anteriores que

incluíram maioritariamente doentes com doença inactiva (11), neste estudo a ingestão de

macronutrientes foi significativamente menor nos doentes do que nos controlos. De notar, que

embora a ingestão de gordura total e gordura polinsaturada tenha sido semelhante em ambos

os grupos, doentes e controlos, a ingestão de gordura monoinsaturada foi significativamente

mais reduzida nos casos. Foram também observadas algumas diferenças de acordo com a

localização da doença ou idade do doente, no entanto as razões para estas diferenças não

são óbvias.

Tal como em estudos anteriores (11,31,32), a ingestão de micronutrientes, nomeadamente

antioxidantes estava bastante diminuída nos doentes relativamente aos controlos. Quando

tentámos clarificar as causas para esta ingestão diminuída, os nossos resultados indicaram

que algumas destas deficiências estavam claramente relacionadas com a exclusão dietética

de determinados alimentos. Depois do diagnóstico de DC, uma elevada proporção de doentes

tende a evitar fibra, vegetais, e leite. Deste estudo, não podemos concluir se esta exclusão foi

feita com base nas recomendações dos profissionais de saúde, ou se dependeu unicamente

das crenças dos doentes. De facto, alguns médicos ainda prescrevem uma dieta com baixo

teor de resíduos, principalmente durante os períodos de doença activa e, por isso, os doentes

tendem a prolongar esta dieta por um período de tempo indeterminado. Mais importante,

observámos uma relação directa entre a exclusão destes alimentos e a ingestão reduzida de

certos nutrientes, nomeadamente entre a exclusão de leite e a ingestão reduzida de cálcio e

vitamina K. Estes últimos são seguramente importantes na patogénese da doença óssea

metabólica (33), uma condição frequentemente negligenciada neste grupo de doentes. Em

concordância com Fillipi e colaboradores (11), consideramos que as dietas com baixo teor de

resíduos devem ser evitadas durante longos períodos e que deve ser encorajado o consumo

de frutas e vegetais. Por isso, acreditamos que é muito importante desmistificar determinadas

ideias acerca das recomendações dietéticas nestes doentes, para as quais não existem

Nutrição e Genes em Doenças Intestinais

78

dados que suportem tais restrições e que certamente podem conduzir a deficiências

nutricionais. Adicionalmente, tendo em conta a ingestão reduzida de determinados

micronutrientes verificada no presente estudo, os suplementos multivitamínicos devem ser

sistematicamente recomendados.

Em suma, os nossos dados encontram-se em concordância com estudos mais recentes

(1,11-13,24), os quais demonstram que a prevalência de erros nutricionais observados em

doentes com DC permanece elevada. Embora as alterações do estado nutricional observadas

nos doentes com DC possam ser menos óbvias comparadas com estudos mais antigos, elas

ainda existem pelo que é recomendado um elevado grau de alerta que permita que estas

deficiências não passem despercebidas. De salientar, que também demonstrámos que o

excesso de peso estava presente em mais de um terço dos doentes e que, de acordo com o

que foi sugerido por um estudo anterior (24), o excesso de resposta inflamatória observada

em doentes obesos pode afectar negativamente o decurso da doença de DC.

EM DESTAQUE

O QUE JÁ É CONHECIDO

A malnutrição é comum nos doentes com Doença de Crohn (DC).

As dietas restritivas são frequentes nestes doentes.

A terapia da DC influencia o estado nutricional.

O QUE É NOVO

A forma de malnutrição mais prevalente nos doentes com DC é o excesso de peso corporal.

O excesso de massa gorda está associado à toma recente de corticoesteróides e falta de

actividade física.

As alterações na composição corporal dependem do género.

As alterações nos hábitos alimentares resultam em deficiências nutricionais específicas.

Foram identificadas alterações no tipo de gordura ingerida entre casos e controlos.

O excesso de resposta inflamatória nos doentes obesos pode afectar a doença.

Nutrição e Genes em Doenças Intestinais

79

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Nutrição e Genes em Doenças Intestinais

80

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Nutrição e Genes em Doenças Intestinais

81

Estudo 4

Ácidos Gordos e Polimorfismos da IL6 e TNFα: Um Exemplo de Nutrigenética

na Doença de Crohn

Catarina Sousa Guerreiro, Paula Ferreira, Lourdes Tavares, Paula Moura Santos, Manuela

Neves, Miguel Brito, e Marília Cravo

Fatty Acids, IL6, and TNFα Polymorphisms: An Example of Nutrigenetics in Crohn´s Disease

American Journal of Gastroenterology 2009;104(9):2241-49.

Nutrição e Genes em Doenças Intestinais

82

RESUMO

Objectivos: O objectivo deste trabalho foi estudar a interacção entre polimorfismos genéticos

(single nucleotide polymorphisms, SNPs) de citocinas pró e anti-inflamatórias e a ingestão de

gordura no risco de desenvolver doença de Crohn (DC) e na modificação da actividade da

doença.

Métodos: Foram analisados 7 SNPs nos genes interleucina 1 (IL1), factor de necrose tumoral

alfa (TNFα), linfotoxina alfa (LTα) e IL6 em 116 controlos e 99 doentes com DC. Foi avaliado

o tipo de gordura consumida, e foi analisada a interacção entre os SNPs e a gordura da dieta

na modulação da actividade da doença.

Resultados: Os indivíduos homozigóticos para o polimorfismo IL6-174G/C tinham um risco

seis vezes superior de DC (odds ratio (OR)=6,1; intervalo de confiança 95% (IC 95%)= 1,9-

19,4) enquanto o genótipo TT do polimorfismo TNFα-857C/T estava associado a doença mais

activa (OR=10,4; IC 95%=1,1-94,1). Um consumo elevado de gordura total, saturada, e

monoinsaturada, assim como um elevado rácio de ácidos gordos polinsaturados (AGPI) n-

6/n-3 estavam associados a um fenótipo mais activo (P<0,05). Para além disso, verificou-se

uma interacção entre a ingestão de gordura e os polimorfismos, com o consumo elevado de

gordura saturada e monoinsaturada a estarem associados à actividade da doença,

principalmente nos indivíduos possuidores das variantes alélicas dos polimorfismos TNFα-857

(OR=6,0, IC95%= 1,4-26,2; OR=5,17; IC95%=1,4-19,2, respectivamente) e IL6-174

(OR=2,95; IC95%=1,0-9,1; OR=3,21; IC95%=1,0-10,4, respectivamente). Por fim, nos

doentes com polimorfismo TNFα-857, um baixo consumo de AGPI n-3 e um rácio elevado n-

6/n-3 estava associado a uma maior actividade da doença (OR=3,6; IC 95%=1,0-13,0;

OR=5,92; IC 95%=1,3-26,5, respectivamente).

Conclusão: Estes resultados revelam que diferentes tipos de gordura poderão interagir com

o genótipo de citocinas, modulando a actividade da doença.

Nutrição e Genes em Doenças Intestinais

83

INTRODUÇÃO:

A doença de Crohn (DC) traduz uma situação inflamatória crónica, predominantemente

caracterizada por uma resposta tipo T-helper 1, que resulta numa produção excessiva de

citocinas pro-inflamatórias, como as interleucinas (IL) 6, IL8, e factor de necrose tumoral alfa

(TNFα) (1,2). Por esta razão, para o tratamento desta doença são alvo de investigação

agentes capazes de reduzir a secreção de citocinas pró-inflamátorias. Para além dos

esteróides e outros imunosupressores, e dos recentes agentes anti-TNFα, alguns estudos

têm focado a manipulação nutricional da inflamação, nomeadamente através da

administração dos ácidos gordos polinsaturados (AGPI) n-3. Diferentes fontes alimentares de

gordura com diferentes perfis de ácidos gordos, parecem ter efeitos na expressão de

diferentes citocinas (3). Em alguns estudos, nos quais o efeito anti-inflamatório do ácido gordo

n-3 (óleo de peixe) foi examinado nos doentes com DC, têm sido observadas algumas

discrepâncias (4,5). Quando Gassull e colaboradores (6) tentaram estudar o efeito do AGPI n-

6 vs AGMI (ácidos gordos monoinsaturados) n-9, verificaram uma maior taxa de remissão nos

doentes alimentados com AGPI n-6, ao contrário do que seria expectável. As razões para

estas inconsistências não são óbvias, mas poderão resultar de respostas individuais

diferentes devido a diferentes polimorfismos genéticos (7). De facto, para a DC mais de 10

loci de susceptibilidade genética foram identificados, os quais na presença de certos

estímulos ambientais, nomeadamente estímulos nutricionais, podem promover respostas

diferentes (8). Que seja do nosso conhecimento, nenhum estudo anterior tentou até à data

examinar o efeito conjunto que genótipos e nutrientes podem exercer na susceptibilidade e

actividade da DC.

O objectivo deste estudo foi investigar se os polimorfismos genéticos de citocinas pró e

anti-inflamatórias estariam relacionados com a susceptibilidade ou actividade da DC.

Estudámos igualmente se existiam algumas interacções entre estes polimorfismos de genes

de citocinas e o tipo de gordura da dieta na modulação da actividade da DC.

MÉTODOS

População

O protocolo do estudo foi aprovado pelos Comités Cientifico de Ética do Instituto Português

de Oncologia Francisco Gentil (IPOFG) e do Hospital Universitário de Santa Maria, ambos na

área de Lisboa. Todos os participantes deram o seu consentimento informado por escrito

antes do início do estudo.

Doentes com diagnóstico confirmado de DC, seguidos na consulta externa de rotina entre

o período de Setembro de 2004 e Novembro de 2007, foram solicitados para participar no

estudo. O diagnóstico foi baseado em critérios previamente definidos (9) e a actividade da

doença foi avaliada de acordo com o Índice Harvey-Bradshaw (IHB) (10). Nenhum dos

doentes tomava esteroídes no momento do estudo e nenhum estava hospitalizado. Porque o

nosso objectivo era o de explorar a associação entre a ingestão nutricional durante o último

ano e a actividade da doença durante o mesmo período apenas foram incluídos doentes com

doença ligeira a moderada. Uma vez que queríamos estudar esta relação com base num

longo período de tempo, conduziria a um viés incluir doentes hospitalizados com doença

Nutrição e Genes em Doenças Intestinais

84

grave. De acordo com o IHB, 36/99 (36,4%) dos participantes tinham doença moderadamente

activa com IHB ≥4, enquanto os restantes 63 (63,6%) apresentavam doença inactiva. Os

índices de actividade referem-se aos valores de pelos menos 3 das últimas consultas durante

o período de 1 ano. Foram excluídos do estudo os participantes que no momento de inclusão

apresentavam doença muito activa (IHB>7), ou com necessidade de toma de esteróides por

via sistémica (n=7). Todos os doentes tinham um peso estável nos últimos 3 meses

anteriores ao estudo. Todos os participantes que preenchiam os critérios de inclusão e que

foram convidados a participar no estudo, aceitaram e foram incluídos. Um total de 116

dadores de sangue ou voluntários do IPOFG, sem história prévia de doença inflamatória do

intestino, constituíram um grupo controlo para estudo do genótipo. Apesar de os controlos

serem ligeiramente mais velhos comparado com os doentes de DC (49,7 ± 11,8 vs.

40,4±14,6; P <0,01) a distribuição de género foi similar entre grupos.

Ingestão dietética

A ingestão dietética foi avaliada através da utilização de um questionário semi-

quantitativo de frequência alimentar (QFA), validado para a população Portuguesa (11),

constituído por 86 itens alimentares, com 9 possíveis respostas relativamente à frequência

média de consumo (nunca ou menos de 1 vez por mês até 6 ou mais vezes por dia), e com

três hipóteses de resposta quanto à quantidade da porção (menor, igual ou maior que a

porção média). A ingestão dietética foi analisada numa base de dados modificada do software

Food Processor Plus, versão 7 (ESHA Research, Salem, OR), que inclui alguns itens de

alimentos Portugueses e permite a quantificação dos diferentes macro e micronutrientes. Foi

solicitado aos participantes que descrevessem os seus hábitos alimentares durante o ano

anterior à entrevista. Na análise da interacção entre as variáveis genéticas e nutricionais, foi

utilizado o valor da mediana uma vez que o consumo de gordura não apresentava uma

distribuição normal. No nosso estudo, consumos abaixo ou acima da mediana foram definidos

como baixo ou elevado.

Processo de Genotipagem

Nos doentes com DC foram colhidas amostras de sangue total e armazenadas a -20ºC até

serem utilizadas; a extracção de DNA foi realizada com fenol-clorofórmio. Nos controlos a

extracção de DNA do sangue total foi realizada utilizando Generation Capture Card Kit - DNA

Purification/DNA Elution (Gentra Systems, Minneapolis, MN). Foram utilizadas as técnicas de

PCR e Restriction Fragment Length Polymorphism para analisar os polimorfismos nos genes

IL1, TNFα, LTα e IL6. Para a solução de mistura a utilizar no PCR com um volume final de 20

µL, foram utilizados 2 µL de solução tampão (Taq buffer +(NH4)2SO2) 10x), 2 µL de MgCl2 (25

mM), 2 µL dNTPs (desoxinucleótido trifosfato; Fermentas, St Leon-Roth, Germany) (2 mM),

0,66 µL de cada primer (6µm), 0,1 µL de Taq DNA polimerase, e 1-4 µL de DNA variando

conforme este tenha sido obtido da amostra sanguínea total ou através dos cartões

Generation Capture Card Kit, e H2O até obter o volume final de 20 µL. Os primers utilizados

foram: IL1β-511C/T:(forward(F):5‟-CCCAGCCAAGAAAGGTCAAT-3‟ e reverse (R):5‟-

GTGGGACAAAGTGGAAGACA-3‟), para IL1β+3,953C/T (F:5‟-

Nutrição e Genes em Doenças Intestinais

85

TCCCAGCTTCATCCCTACTG-3‟ e R:3‟-TGGAGGTGGAGAGCTTTCAG-3‟), para TNFα-

857C/T (F:5'- GTCGAGTATGGGGACCCCCCGTTAA-3' e R:5'-

TTTCATTCTGACCCGGAGAC-3'), para TNFα-308G/A

(F:5‟AGGCAATAGGTTTTGAGGGCCAT-3‟ e R:5‟-AAAGTTGGGGACACACAAGC-3‟),para

LTα+252A/G (F:5‟-GCTTCGTGCTTTGGACTACC-3‟ e R:5‟-AAGGTGAGCAGAGGGAGACA-

3‟), e IL6-174G/C (F:5'-TGCACTTTTCCCCCTAGTTG-3' e R:5'-

GCCTCAGACATCTCCAGTCC-3'). O IL1Ra é uma variação de repetições de DNA (VNTR)

com 86 pares de bases. Para análise deste ultimo, foi utilizado o seguinte protocolo de

amplificação: desnaturação a 95ºC durante 5 min, seguido de 35 ciclos de desnaturação a

95ºC durante 45 s, hibridação a 60º C durante 30 s e extensão a 72º C durante 1 min, com

uma extensão final a 72º C durante 10min.

A mistura para Restriction Fragment Length Polymorphism, com um volume final de 30 µL,

consistiu em 3 µL de solução tampão apropriada (10x) (New England Biolabs, Frankfurt,

Germany), 0,5µL de DdeI (IL1β -511C/T), NcoI (TNFα -308G/A), HincII (TNFα-857C/T), HinfI

(LTα+252A/G) e NlaIII (IL6), 1µL de BseYI (LTα+80C/A) e 0,25µL de TaqI (IL1β+3,953C/T,

0,3 µL de albumina de soro bovino (ASB) para enzimas específicas (TaqI, HincII, e NlaIII) e

H2O até perfazer o volume final de 30 µL. A reacção demorou 2 horas a 37ºC em todos os

polimorfismos, excepto no IL1β +3953C/T que foi realizado a 65ºC. Após a digestão, o

produto correu num gel a 4% e foram registados os genótipos de cada participante.

Análise estatística

O tratamento estatístico foi realizado com recurso ao SPSS para Windows, versão 16,0

(SPSS, Chicago, IL, EUA). Os resultados foram expressos como média ± desvio padrão,

número de participantes e (percentagem) ou como odds ratio (OR), e um intervalo confiança

de 95% (IC 95%). A análise bivariada foi realizada recorrendo aos testes t de Student e

Mann-Whitney para variáveis contínuas e teste de qui-quadrado para as variáveis

categóricas. Foi utilizada regressão logística múltipla para estudar a associação entre

variáveis relacionadas com actividade da doença.

O nível de significância estatístico estabelecido foi P<0,05.

RESULTADOS

As características dos 99 doentes com DC (60 mulheres, 39 homens, idade média

40,4±14,6 anos) encontram-se descritas no Quadro 1. Apesar dos controlos serem

ligeiramente mais velhos que os casos (49,7±11,8 vs. 40,4±14,6; P<0,01), a distribuição do

género foi similar entre os grupos.

Nutrição e Genes em Doenças Intestinais

86

Quadro 1. Características dos participantesa

Idade 40,4±14,6

Género

Masculino 39,3 (39)

Feminino 60,6 (60)

Anos de doençab 11,2±8,9

Localização da doença

Íleon % (n) 29,3 (29)

Cólon % (n) 17,2 (17)

Íleon + Cólon % (n) 53,5 (53)

Forma de apresentação

Inflamatória % (n) 27,3 (24)

Fistulizante % (n) 34,3 (34)

Estenosante % (n) 38,4 (38)

Índice de Harvey-Bradshaw

IHB <4 % (n) 63,7 (63)

IHB≥ 4 % (n) 36,3 (36)

Medicação actual e anterior

Corticoterapia % (n) 80,8 (80)

Metotrexato % (n) 6,2 (6)

Azatioprina % (n) 78,4 (76)

Infliximab % (n) 1,0 (1)

Cirurgia prévia % (n) 49,5 (49)

Manifestações extra-intestinais % (n) 38,4 (38)

Hábitos tabágicos % (n) 14,2 (30)

Percentagem de energiab proveniente de:

Gordura Total 32,9 ± 5,9

Gordura Polinsaturada 5,1 ± 2,5

Gordura Monoinsaturada 14,4 ± 5,9

Gordura Saturada 10,6 ± 3,5

Rácio AGPI n-6/n-3 7,7 ± 2,8

DC, Doença de Crohn; IHB, Indice Harvey-Bradshaw; AGPI, ácidos gordos polinsaturados.

an=99 doentes.

bMédia ± desvio padrão.

O Quadro 2 mostra os diferentes genótipos dos doentes e dos controlos. Excepto para os

indivíduos homozigóticos para o polimorfismo IL6-174G/C, que apresentaram um risco seis

vezes maior de DC (OR=6,1; IC 95%=1,9-19,4), quando comparado com os controlos,

nenhum dos outros polimorfismos analisados teve influência no risco de desenvolver doença.

Nutrição e Genes em Doenças Intestinais

87

Quadro 2. Risco de DCa de acordo com os polimorfismos

Casos % (n) Controlos % (n) Pb OR IC 95%

IL6-174

GG 44,4 (44) 51,7 (60) 1

GC 37,4 (37) 44,8 (52) 0,002 0,97 (0,5-1,7)

CC 18,2 (18) 3,4 (4) 6,1 (1,9-19,4)

TNFα-857

CC 75,8 (75) 77,6 (90) 1

CT 18,1 (18) 20,7 (24) NS 0,9 (0,5-1,8)

TT 6,1 (6) 1,7 (2) 3,6 (0,7-18,4)

IL1Ra

AA 55,1 (55) 51,0 (59) 1

AB/AC/AD 32,1 (31) 40,2 (47) NS 0,74 (0,3-1,4)

BB/CB 12,8 (13) 8,8 (10) 1,34 (0,5-3,6)

IL1β+3,953

CC 48,7 (48) 42,2 (49) 1

CT 43,6 (43) 50,0 (58) NS 0,75 (0,4-1,4)

TT 7,7 (8) 7,8 (9) 0,85 (0,3-2,7)

IL1β-511

CC 47,4 (47) 48,0 (56) 1

CT 41,1 (41) 39,1 (45) NS 1,10 (0,6-2,0)

TT 11,5 (11) 12,7 (15) 0,92 (0,4-18,4)

TNFα-308

GG 76,9 (76) 72,5 (84) 1

GA 23,1 (23) 25,5 (30) NS 0,85 (0,5-1,8)

AA 0 (0) 2,0 (2) 0,01 (NS)

LTα+252

AA 62,8 (62) 56,1 (65) 1

AG 29,5 (29) 40,5 (47) NS 0,65 (0,3-1,2)

GG 7,7 (8) 3,4 (4) 1,75 (0,5-6,5)

DC, Doença de Crohn; IC, intervalo de confiança; IL, interleucina; LTα, linfotoxina alfa; NS, não significativo; OR; odds ratio; TNF, factor de necrose tumoral. an=99 no grupo caso e n=116 no grupo controlo.

bOs valores de P são resultado do teste de q-quadrado. O genótipo

wild type foi a categoria de referência para o cálculo do OR (regressão múltipla). OR ajustado para idade e género.

No que respeita à actividade da doença, a amostra com DC foi estratificada em doença

activa e doença inactiva, em função do IHB≥ 4 ou <4, respectivamente. Ao comparar o

consumo de gordura destes dois grupos de doentes, verificámos que estava associado a um

maior risco de doença activa um consumo elevado de gordura total, saturada, e

monoinsaturada (OR=2,56; IC 95%=1,1-6,0; OR=3,6; IC 95%=1,5-8,6; OR=3,3; IC 95%=1,4-

7,9, respectivamente). Para além disto, os participantes com um elevado rácio n-6/n-3

apresentaram igualmente uma actividade de doença significativamente mais elevada

(OR=2,3; IC 95%=1,0- 5,3) (Quadro 3).

Nutrição e Genes em Doenças Intestinais

88

Quadro 3. Influência da ingestão de gorduraa na actividade da doença

b

Doença inactiva % (n) Doença activa % (n) Pc OR IC 95%

d

Gordura Total

Elevada 42,9 (27) 65,7 (23) <0,01 2,56 (1,1-6,0)

Baixa 57,1 (36) 34,3 (12) 1

Gordura Saturada

Elevada 41,3 (26) 71,4 (25) <0,01 3,6 (1,5-8,6)

Baixa 58,7 (37) 28,6 (10) 1

Gordura Monoinsaturada

Elevada 39,7 (25) 68,6 (24) <0,01 3,3 (1,4-7,9)

Baixa 60,3 (38) 31,4 (11) 1

Gordura Polinsaturada

Elevada 46 (29) 57,1 (20) NS 1,6 (0,7-3,6)

Baixa 54 (34) 42,9 (15) 1

Gordura Trans

Elevada 44,4 (28) 60 (21) 1,9 (0,8-4,3)

Baixa 55,6 (35) 40 (14) NS 1

AGPI n-3

Elevado 47,6 (30) 48,6 (17) NS 1,0 (0,4-2,4)

Baixo 52,4 (33) 51,4 (18) 1

AGPI n- 6

Elevado 44,4 (28) 60 (21) NS 1,9 (0,8-4,3)

Baixo 55,6 (35) 40 (14) 1

Rácio n6/n3

Elevado 47,6 (30) 57,1 (20) 0,04 2,3 (1,0-5,3)

Baixo 52,4 (33) 42,9 (15) 1

DC, Doença de Crohn; IC, intervalo de confiança; NS, não significativo; OR; odds ratio; AGPI, ácido gordo polinsaturado. a

Elevado ou baixo consoante a ingestão foi superior ou inferior à mediana. b

Definiu-se doença activa se Índice Harvey Bradshaw≥4.

cOs valores de P são resultantes do teste de q-quadrado.

dO OR foi ajustado para a idade e

género. Os cut offs foram: gordura total=76,7g; gordura saturada=24,7g; gordura monoinsaturada=33,3g, gordura polinsaturada=11,5g; gordura trans=0,7g; AGPI n-3 =1,2g; AGPI n-6 =7,6g, e n-6/n-3=7,3.

O Quadro 4 descreve a associação entre os genótipos de genes de citocinas e a

actividade de doença. Observámos que genótipo TT do locus TNFα-857 foi o único

polimorfismo associado a uma maior actividade da doença (OR=10,4; IC 95%=1,1-94,1).

Nenhum dos outros polimorfismos genéticos analisados revelou qualquer associação com a

actividade da doença.

Nutrição e Genes em Doenças Intestinais

89

Quadro 4. Influência do genótipo dos polimorfismos na actividade da DCa

Doença inactiva %(n) Doença activa % (n) Pb OR

IL6-174

GG 46,0 (29) 42,9 (15) 1

GC 38,1 (24) 34,3 (12) NS 0,97 (0,4-2,5)

CC 15,9 (10) 22,9 (8) 1,55 (0,5-4,7)

TNFα-857

CC 79,4 (50) 68,6 (24) 1

CT 19,0 (12) 17,1 (6) 0,04 1,04 (0,3-3,1)

TT 1,6 (1) 14,3 (5) 10,4 (1,1-94,1)

IL1Ra

AA 51,5 (51) 60,7 (70) 1

AB/AC/AD 36,4 (36) 25,0 (29) NS 0,57 (0,2-1,7)

BB/CB 12,1 (12) 14,3 (17) 0,98 (0,2-4,0)

IL1 -3953

CC 53,5 (53) 42,9 (50) 1

CT 38,4 (38) 50,0 (58) NS 0,60 (0,6-4,2)

TT 8,1 (8) 7,1 (8) 1,1 (0,2-6,8)

IL1β-511

CC 41,3 (41) 56,9 (66) 1

CT 46,5 (46) 32,8 (38) NS 0,49 (0,2-1,3)

TT 12,2 (12) 10,3 (12) 0,63 (0,1-2,9)

TNFα-308

GG 77,8 (77) 75,0 (87) 1

GA 22,2 (22) 25,0 (29) NS 1,15 (0,4-3,4)

AA 0 0 0

LTα+252

AA 63,6 (63) 61,2 (71) 1

AG 30,3 (30) 28,4 (33) NS 0,97 (0,3-2,8)

GG 6,2 (6) 10,4 (12) 1,80 (0,3-10,0)

DC, Doença de Crohn; IL, interleucina; LTα, linfotocina alfa; OR; odds ratio NS, não significativo; TNF, factor de necrose tumoral.

a Considerou-se doença activa se IHB≥4.

b Os valores de p são resultantes do teste q-quadrado. O genótipo wild type

foi a categoria referência para o cálculo do Odds Ratio (regressão múltipla). O OR foi ajustado para idade e género

Uma vez que nenhum outro polimorfismo genético revelou associação significativa com a

susceptibilidade à doença ou com a sua actividade, apenas os polimorfismos TNFα-857C/T e

IL6-174G/C foram incluídos na análise das interacções entre genótipo e ingestão de gordura

(Quadro 5).

Nutrição e Genes em Doenças Intestinais

90

Quadro 5. Influência da gorduraa e polimorfismos na actividade da doença

b

IL, interleucina; AGPI, ácidos gordos polinsaturados; TNF, factor de necrose tumoral.

a Elevado ou baixo refere-se a ingestão superior ou inferior à mediana.

b Definiu-se doença activa se Índice Harvey

Bradshaw≥4. Analisado por regressão múltipla. OR, ajustado para a idade e género, foi determinado utilizando os valores abaixo e acima da mediana de consumo. Os cut offs foram: gordura total=76,7g; gordura saturada=24,7g; gordura monoinsaturada=33,3g, gordura polinsaturada=11,5g; gordura trans=0,7g; AGPI n-3 =1,2g; AGPI n-6 =7,6g, e n-6/n-3=7,3. A combinação do genótipo IL6-174GG e TNFα-857CC e a ingestão reduzida foi considerada a categoria referência. Todas as interacções revelaram um P> 0,05.

Observámos que um elevado consumo de gordura saturada e monoinsaturada, assim como

um elevado rácio AGPI n-6/n-3 estavam associados a doença mais activa, em especial nos

indivíduos portadores das variantes alélicas do polimorfismo TNFα-857 (OR=6,0; IC 95%=1,4-

26,2; OR=5,17; IC 95%=1,4-19,2; OR=5,92; IC 95%=1,3-26,5). Apesar de não atingir

significado estatístico, já que o IC 95% inclui o valor 1,0 o que apenas revela uma forte

tendência, observámos também uma associação entre o elevado consumo de gordura

saturada e monoinsaturada e o polimorfismo IL6-174 (OR=2,95; IC 95%=1,0-9,1; OR=3,21; IC

95%=1,0-10,4) e entre o consumo reduzido de AGPI n-3 e o alelo polimórfico do TNFα-857

(OR=3,6; IC 95%=1,0-13,0). Não se verificaram quaisquer diferenças na pesquisa de relações

entre o comportamento da doença, terapêuticas anteriores com esteroides, Azatioprina,

IL6-174 TNFα-857

Wild type (GG) Com variante (GC/CC) Wild type (CC) Com variante (CT/TT)

Gordura Total

Elevada 1,10 (0,3-3,7) 2,30 (0,8-6,9) 3,5 (0,9-13,9) 4,7 (1,0-21,4)

Baixa 1,0 0,40 (0,1-1,6) 1,0 3,8 (1,3-11,2)

Gordura Saturada

Elevada 1,62 (0,5-5,7) 2,95 (1,0-9,1) 4,3 (1,0-19,0) 6 ,0 (1,4-26,2)

Baixa 1,0 0,36 (0,1-1,6) 1,0 5,7 (1,8-17,7)

G. Monoinsaturada

Elevada 0,75 (1,2-2,9) 3,21 (1,0-10,4) 1,66 (0,3-7,9) 5,17 (1,4-19,2)

Baixa 1,0 2,46 (0,7-8,8) 1,0 3,26 (1,2-9,1)

G. Polinsaturada

Elevada 0,82 (0,2-2,9) 1,56 (0,5-4,6) 1,39 (0,5-3,7) 2,86 (0,8-10,5)

Baixa 1,0 0,59 (0,2-2,0) 1,0 1,40 (0,3-5,8)

Gordura Trans

Elevada 1,61 (0,5-5,7) 2,14 (0,6-7,3) 3,6 (0,9-14,4) 5,17 (1,4-19,2)

Baixa 1,0 1,0 (0,3-3,5) 1,0 3,26 (1,2-9,1)

AGPI n-3

Elevado 0,54 (0,1-2,0) 1,1 (0,4-3,4) 1,64 (0,6-4,4) 1,16 (0,2-5,4)

Baixo 1,0 0,67 (0,2-2,1) 1,0 3,6 (1,0-13,0)

AGPI n-6

Elevado 1,41 (0,4-4,9) 1,98 (0,6-6,3) 1,93 (0,7-5,2) 2,90 (0,8-10,3)

Baixo 1,0 0,84 (0,2-2,9) 1,0 1,93 (0,5-8,3)

Rácio n-6/n-3

Elevado 1,75 (0,5-6,5) 2,33 (0,8-7,2) 1,6 (0,6-4,4) 5,92 (1,3-26,5)

Baixo 1,0 0,85 (0,3-2,6) 1,0 1,01 (0,3-3,8)

Nutrição e Genes em Doenças Intestinais

91

Metotrexato ou cirurgia, e os polimorfismos genéticos, ou o tipo e quantidade de gordura

ingerida.

DISCUSSÃO

Os factores ambientais e genéticos têm vindo a ser mais claramente aceites como factores

importantes não só na determinação da susceptibilidade à DC como também no

comportamento da doença e na resposta terapêutica (7). Neste estudo, avaliámos o efeito de

alguns polimorfismos de citocinas pró e anti-inflamatórias na modificação da susceptibilidade

para a DC e sua actividade. No que respeita à susceptibilidade da doença, observámos que

os indivíduos homozigóticos para o polimorfismo IL6-174G/C apresentavam maior risco de

desenvolver DC. Este é um novo achado, nunca antes observado por nenhum autor (12,13).

Dados de estudos in vivo e in vitro sugerem que o genótipo GG (wild type) está associado a

uma maior produção de IL6 comparado com os genótipos GC ou CC (14). A IL6 é uma

citocina multifuncional que estimula a resposta hepática de fase aguda, assim como a

diferenciação e activação dos macrofagos e células T (15). Contrariamente ao que poderia

ser esperado, observámos um maior risco de DC nos indivíduos homozigóticos para este

polimorfismo, mas não foi observada associação com a actividade da doença. Apesar da

associação com o aumento da susceptibilidade à doença ser inesperada, é importante

lembrar que embora o polimorfismo CC possa determinar uma reduzida produção de IL6,

muitos outros polimorfismos estão localizados no mesmo gene e não foram analisados neste

estudo embora possam modular a transcrição génica e influenciar a actividade da doença.

Esta hipótese é suportada pelos achados de Terry e colaboradores (15), que analisaram o

efeito do haplotipo promotor da IL6 na transcrição da IL6. Os autores concluíram que os

polimorfismos não existem isolados, e que deverá ser a combinação de alterações de bases

em vários locais que influenciam a transcrição do gene e a função da proteína.

No que respeita ao polimorfismo TNFα é interessante verificar que à semelhança de

Peeters e colaboradores (16), embora o polimorfismo por nós estudado tenha sido outro,

também verificámos que apesar de não aumentar a susceptibilidade para desenvolver

doença, o polimorfismo TNFα-857C/T estava associado a um aumento de actividade da

doença.

Mais interessantes foram as interacções observadas entre os factores genéticos e

nutricionais. Na década de 80, O‟Morain e colaboradores (17) foram os primeiros a referir que

uma dieta elementar poderia ser tão eficaz quanto os esteróides na indução de remissão da

DC. Os autores colocaram a hipótese de o mecanismo da acção deste tipo de nutrição

entérica poder estar relacionado com a sua reduzida alergenicidade, uma vez que as

proteínas eram fornecidas como dipeptidos ou aminoácidos. No entanto na década de 90,

três meta-análises de estudos controlados e randomizados que comparavam esteróides e

nutrição entérica não revelaram diferenças na resposta quando foram utilizadas dietas com

aminoácidos vs dietas com proteína completa (18-20). De acordo com a hipótese de Gassull

e colaboradores (6) o mecanismo pelo qual a nutrição entérica poderia promover a remissão

da DC estaria relacionado com o teor de gordura da dieta (21,22). Para além da quantidade

Nutrição e Genes em Doenças Intestinais

92

de gordura, as diferenças no tipo de gordura parecem também ser importantes na modulação

da inflamação do intestino (6).

Muitos dos estudos que avaliaram a ingestão de gordura exploraram o efeito anti-

inflamatório dos ácidos gordos n-3. Estes ácidos gordos essenciais parecem ter importantes

efeitos immunomodulatórios, mediados principalmente através da modulação da síntese de

eicosanoídes, e também por alteração da fluidez da membrana celular, da transdução da

sinalização celular, alteração do conteúdo bacteriano intra-luminal, bem como da expressão

génica (23). Talvez a evidência mais convincente que os AGPI n-3 poderão ter um papel

protector na doença inflamatória do intestino por oposição aos AGPI n-6, que predominam na

dieta Ocidental, provem do estudo epidemiológico publicado por Shoda e colaboradores (24)

no qual os autores referem a associação entre o aumento na incidência de DC e um aumento

do consumo de gordura, especialmente de AGPI n-6, verificados nas últimas décadas. No

mesmo ano, Belluzzi e colaboradores (25), num estudo clínico com doentes com DC,

mostraram que a suplementação com cápsulas com um preparado de óleo de peixe era mais

eficaz na manutenção da remissão da doença do que o placebo. Contudo, subsequentes

estudos experimentais e clínicos examinaram o efeito anti-inflamatório dos ácidos gordos n-3

na doença inflamatória do intestino, em especial na DC, revelando resultados divergentes.

Numa meta-análise recentemente publicada (26), os autores concluíram que os dados

disponíveis são insuficientes para se delinear qualquer conclusão definitiva.

Em geral, os nossos resultados estão de acordo com outros estudos, já que um elevado

consumo de gordura total, saturada, e monoinsaturada estava associado a doença mais

activa. A relação entre gordura, em especial a saturada, e a inflamação não é nova. Tem sido

descrito que uma dieta rica em gordura saturada, particularmente trans, aumenta a produção

de monócitos de TNFα, IL1β, IL6, e de todas as citocinas pro-inflamatórias (27). Por oposição,

um consumo elevado de AGPI, particularmente de n-3, têm mostrado diminuir os níveis

circulantes de citocinas pro-inflamatórias (28).

No que respeita à gordura monoinsaturada é interessante observar que os nossos

resultados apoiam o estudo desenvolvido por Gassull e colaboradores (6). Nesse estudo

randomizado e controlado os autores estudaram os efeitos de uma dieta rica em n-6 vs. n-9 e

uma terapia convencional com esteroídes no tratamento da DC activa. O estudo foi

interrompido prematuramente, pois os doentes submetidos a uma dieta com n-9

apresentaram uma taxa de resposta muito inferior ao verificado nos outros dois grupos, ao

contrário do expectável. Que seja do nosso conhecimento, este é o primeiro estudo em

humanos que sustenta a observação de Gassull e colaboradores (6) que indicam que uma

dieta rica em gordura monoinsaturada pode ser deletéria para doentes com DC, uma vez que

essa dieta parece estar associada a um fenótipo mais activo.

Outra razão para as discrepâncias observadas relativamente ao efeito benéfico ou

deletério de vários tipos de gordura na actividade da DC, poderá estar relacionada a

polimorfismos de genes de citocinas. Assim, em concordância com o nosso estudo, Van Heel

e colaboradores (29) revelaram que a presença de pelo menos uma cópia do alelo TNFα-

857C/T estava associada a uma maior tendência para produzir mais TNFα na mucosa

inflamada ao nível do cólon, promovendo aumento de inflamação. A apoiar este conceito,

Nutrição e Genes em Doenças Intestinais

93

Grimble e colaboradores (4) mostraram, num grupo de indivíduos saudáveis, que os

diferentes genótipos do TNFα não estavam apenas associados a diferentes níveis de

produção de TNFα, mas também a diferentes sensibilidades para o efeito anti-inflamatório do

óleo de peixe. A capacidade do óleo de peixe em suprimir a produção de TNFα era mais

elevada quando a produção basal desta citocina era também superior. Neste estudo também

observámos que existia um sinergismo entre os polimorfismos estudados e os tipos de

gordura ingerida. O efeito deletério da gordura saturada ou monoinsaturada foi ainda maior

nos detentores dos alelos polimórficos dos genes TNFα-857C/T ou nos com IL6-174G/C.

Para além disso o alelo polimórfico do TNFα agiu também como factor promotor na presença

de uma dieta pobre em ácidos gordos n-3.

Uma limitação importante deste estudo refere-se ao viés da recordação associado ao uso

do QFA, uma vez que a quantificação da ingestão alimentar no último ano pode não ser muito

precisa. No entanto, num estudo recente (30) que teve como objectivo avaliar qual o método

mais apropriado para quantificar a ingestão alimentar, em situações de interacção dieta-gene,

os autores reconheceram que o registo múltiplo de 24 horas recall forneceria excelente

informação sobre os hábitos dietéticos, porém reconhecem que seriam necessários vários

dias de registo o que se tornaria economicamente insustentável. Concluem que, quando está

disponível um QFA validado para a população, verdadeiro no nosso caso, o QFA continua a

ser a ferramenta com melhor custo beneficio.

Outra limitação do nosso estudo está relacionada com o reduzido número de doentes

incluídos. No entanto, todos os nossos doentes têm um fenótipo bem caracterizado e uma

avaliação extensa do ponto de vista nutricional (31), e que seja do nosso conhecimento, este

é o primeiro estudo a avaliar as interacções entre polimorfismos genéticos de citocinas pró e

anti-inflamatórias e o tipo de gordura da dieta na modulação da actividade doença em

doentes com DC. A compreensão desta interacção poderá explicar inconsistências na

literatura e permitir recomendações nutricionais mais personalizadas nos doentes com DC.

EM DESTAQUE

O QUE JÁ É CONHECIDO

Factores ambientais e factores genéticos são importantes na determinação não só da

susceptibilidade para a doença de Crohn (DC) como também no comportamento da doença.

Diferenças no tipo de gordura poderão ser importantes na modulação da inflamação

intestinal.

Ácidos gordos polinsaturados (AGPI) n-3 poderão ter papel protector na doença inflamatória

intestinal em oposição aos AGPI n-6.

O QUE É NOVO

Indivíduos homozigóticos para o polimorfismo IL6-174G/C têm um aumento no risco de

desenvolver DC.

Uma dieta rica em gordura monoinsaturada parece estar associada a uma doença mais

activa.

Nutrição e Genes em Doenças Intestinais

94

Existe um sinergismo entre os polimorfismos e ingestão de gordura. O efeito

deletério/promotor de um consumo elevado/baixo de gordura depende dos polimorfismos

TNFα-857C/T e IL6-174G/C.

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Nutrição e Genes em Doenças Intestinais

96

Nutrição e Genes em Doenças Intestinais

97

CAPÍTULO 3

Nutrição e Genes em Doenças Intestinais

98

Nutrição e Genes em Doenças Intestinais

99

I) DISCUSSÃO

Em todas as patologias que afectam o tracto gastrintestinal, nomeadamente o cancro do

cólon e recto e a doença de Crohn, é muito importante o padrão alimentar e consequente

ingestão nutricional (1). Reflexo disso é o elevado número de publicações existentes sobre

esta temática que, embora com resultados discordantes, revelam associações entre o padrão

alimentar e o risco e/ou comportamento destas doenças (2-7). Segundo alguns autores, a

diferença de resultados encontrada na literatura resulta de múltiplas causas (8-10). Uma das

mais referenciadas está relacionada com a componente genética do indivíduo, dado que a

heterogeneidade genética das populações em estudo poderá justificar respostas diferentes a

estímulos nutricionais idênticos (9,11). Com o conhecimento completo do genoma humano foi

descoberto um novo leque de possibilidades para o estudo da potencial interacção entre

factores ambientais, em particular a nutrição, e factores genéticos (12). O conhecimento do

padrão alimentar e estado nutricional dos indivíduos, associado ao estudo do perfil genético,

tem vindo a despoletar interesse na comunidade científica ao poder vir a possibilitar um

aconselhamento nutricional mais personalizado (13).

O conjunto dos quatro artigos anteriormente apresentados permite dar a conhecer de

forma mais pormenorizada o padrão e estado nutricional de duas populações distintas, com

doenças distintas, que em comum afectam o tracto gastrintestinal. Nessas populações foram

também estudados exemplos de nutrigenética cujos resultados, a serem confirmados,

poderão a longo prazo permitir a realização de recomendações nutricionais mais

individualizadas.

Cancro do cólon e recto

A etiologia desta neoplasia tem sido amplamente estudada e sabe-se que nela estão

implicados múltiplos factores, nomeadamente os nutricionais (14). Em Portugal existem até à

data apenas dois estudos publicados que reconhecem os factores nutricionais como

potenciadores ou protectores de CCR (4,5). Embora com pequenas diferenças, os resultados

obtidos por esses autores são semelhantes aos por nós encontrados. No nosso estudo

observámos que os nutrientes mais associados à protecção de CCR são os carotenos,

vitamina C, vitamina E, folato, cálcio e fibra (15). Os nossos resultados sugerem que um

consumo de fibra superior a 26 g/dia e um consumo de cálcio superior a 1030 mg/dia

promovem uma redução no risco de CCR; também o consumo de vitamina C superior a 150

mg/dia e de carotenos superior a 870 μg/dia estavam associados a uma redução significativa

no risco de CCR (15). Estes valores apontados como protectores coincidem ou estão muito

próximos das DRI estabelecidas pela National Academy of Sciencies, que traduzem a

quantidade mínima necessária de nutrientes para assegurar as necessidades nutricionais de

um indivíduo saudável (16). Verificámos pois a importância da ingestão das doses mínimas

necessárias de nutrientes, sem qualquer necessidade acrescida. Porém, o consumo de

nutrientes foi avaliado a partir da ingestão alimentar e devemos realçar a reduzida evidência

que apoie a importância de um único nutriente específico a favor da importância dada ao

Nutrição e Genes em Doenças Intestinais

100

consumo de determinados alimentos como os frutos, legumes ou cereais, importantes

veículos de vários nutrientes como vitamina C, fibra ou carotenos, todos reconhecidos como

protectores para a carcinogénese colorectal (17). Ainda a respeito do padrão alimentar, os

nossos dados revelam uma associação deletéria entre o consumo de álcool e o risco de CCR

(15), tal como tem sido referenciado nalguma literatura (18).

Neste estudo foi igualmente avaliado o estado nutricional, sem o intuito de esclarecer a

sua importância como potenciador ou protector de CCR, uma vez que a avaliação nutricional

foi realizada já após o diagnóstico; o objectivo foi antes descrever o estado nutricional da

amostra estudada. Segundo o IMC, o excesso de peso foi o estado nutricional mais

prevalente nesta população: mais de 50% da amostra apresentou excesso de peso ou

obesidade, existindo desnutrição em apenas 5% dos indivíduos (15). Chaves e colaboradores

no seu recente estudo de numa população portuguesa de 457 doentes oncológicos, incluindo

61 doentes com CCR, observaram esta mesma tendência; segundo o IMC mais de 60% da

amostra apresentava excesso de peso e menos de 5% desnutrição, e os factores que mais

contribuíram para o desenvolvimento de desnutrição foram a idade dos doentes e duração da

doença (19). O facto de mais de 2/3 da população por nós estudada (86%) ter um diagnóstico

recente de CCR e mais de 60% não ter sido ainda sujeita a qualquer tipo de tratamento

(cirurgia, quimio ou radioterapia), cujos danos no estado nutricional estão já documentados

(20), pode justificar o facto de não termos verificado uma elevada percentagem de doentes

desnutridos. Se por um lado a percentagem de indivíduos desnutridos foi reduzida, por outro

a percentagem de indivíduos com excesso de peso e obesidade foi elevada; assim, a

população por nós estudada segue a mesma tendência da população Portuguesa em geral

(21). É ainda necessário realçar que a obesidade, é não só um factor de risco para o

desenvolvimento de diferentes tumores, nomeadamente o CCR, mas está também associada

a uma maior taxa de recidiva de cancro após tratamentos antineoplásicos e/ou cirurgia; e,

uma vez instalado o tumor, a taxa de sobrevida dos doentes obesos é menor quando

comparada com doentes com peso adequado (22,23).

Além da análise da ingestão e estado nutricionais, pretendemos também estudar dois

exemplos de nutrigenética no CCR. O primeiro (15) avaliou uma das variantes do gene APC,

um importante supressor tumoral. O polimorfismo D1822V APC só por si não alterou a

susceptibilidade de desenvolver CCR, tal como já verificado noutros estudos (24,25). Contudo

com os nossos dados verificámos que nos indivíduos com um consumo alimentar rico em

colesterol, a ausência deste polimorfismo aumentou o risco de CCR. Também para o cálcio e

fibra, o efeito protector destes foi mais evidente nos indivíduos cujo genótipo apresentava a

variante alélica (15). A confirmarem-se estes resultados, poderá ficar esclarecido um dos

motivos pelo qual certos nutrientes parecem desempenhar funções protectoras em certas

populações ao passo que esse efeito não é identificado noutras geneticamente diferentes. O

segundo exemplo (26), bastante mais estudado pela comunidade científica, diz respeito a

genes envolvidos no ciclo da metilação do DNA. Entre os polimorfismos por nós estudados, o

polimorfismo C677T MTHFR foi aquele que revelou maior associação com o CCR; a

presença da variante polimórfica estava associada a um menor risco de desenvolver CCR.

Analisando os diferentes subgrupos da população, agrupados consoante o genótipo e o

Nutrição e Genes em Doenças Intestinais

101

padrão alimentar, apenas se verificou um maior risco de CCR nos indivíduos com a variante

polimórfica e uma dieta com baixo teor de folato. Em resumo, no que respeita à interacção de

factores alimentares e genéticos, os nossos resultados sugerem que indivíduos possuidores

da variante do polimorfismo D1822V do gene APC estão mais protegidos para CCR caso

consumam uma dieta com elevado teor de fibra ou de cálcio. Pelo contrário, se não

possuírem essa variante, será importante que pratiquem uma dieta com baixo teor de

colesterol, de modo a reduzir o risco de CCR (15). No caso de possuírem um genótipo com

alelo mutado no C677T MTHFR, o elevado consumo de folato apresenta-se como protector

para o CCR (26). Os nossos dados parecem assim revelar a existência de um maior ou

menor risco de CCR em subgrupos da população geneticamente susceptíveis a determinado

padrão alimentar.

Doença de Crohn

Os dois estudos apresentados com enfoque na doença de Crohn tiveram como

objectivos: descrever o padrão alimentar e estado nutricional dos doentes de Crohn (27), bem

como estudar um exemplo de nutrigenética (28).

A maioria da população estudada apresentava DC com reduzida actividade, e todos os

doentes se encontravam em ambulatório sem teratêutica com corticoesteroides. No que

respeita ao estado nutricional, a forma mais prevalente de malnutrição foi o excesso de peso

observado em mais de um terço dos doentes; contráriamente ao descrito na literatura (29), no

nosso estudo a malnutrição por défice energético não foi muito prevalente, pelo contrário. No

estudo da composição corporal observámos nos nossos doentes uma %MLG

significativamente menor do que nos controlos, e no caso dos homens as diferenças na %MG

eram também significativamente inferiores (27). A destacar que, de acordo com o que foi

sugerido por Hass e colaboradores, o excesso de massa gorda pode conduzir a uma resposta

inflamatória excessiva ao ser responsável pela produção aumentada de citocinas pró-

inflamatórias como a IL6, e com isso afectar negativamente o desenvolvimento da doença

(30). Observámos também que o padrão alimentar dos doentes cumpria na generalidade as

recomendações em macronutrientes, mas que o consumo de micronutrientes, nomeadamente

antioxidantes, estava bastante diminuída. Esta inadequada ingestão de micronutrientes era

consequência de exclusões alimentares, cuja causa não foi por nós estudada, mas é sabido

que os doentes restringem frequentemente o consumo de certos alimentos pela sugestão de

associação a agravamento da sintomatologia (31); além disso, alguns profissionais de saúde

aconselham a realização de longos períodos de dietas restritivas com vista ao repouso

intestinal (32). A evidência mostra no entanto que não existe qualquer associação entre a

iniciação/activação da doença e o consumo de determinadonutriente/alimento (33). Fará parte

do papel do profissional da área da Dietética e Nutrição esclarecer os doentes sobre as

recomendações nutricionais a adoptar nas diferentes fases da doença. O doente deve

compreender o importante papel da dieta na DC, para além de conhecer como minimizar a

sintomatologia gastrintestinal, a dieta assume um papel fundamental na prevenção e

correcção de carências nutricionais. Fornecer um aconselhamento dietético adequado,

Nutrição e Genes em Doenças Intestinais

102

promovendo assim o bom estado nutricional, ajuda a minimizar os efeitos negativos da

reactivação da doença no estado nutricional dos doentes (34).

É consensual que tanto os factores genéticos como os ambientais são relevantes não

apenas para a susceptibilidade à doença, como também para o perfil e actividade da própria

doença (35). No presente estudo avaliámos o efeito de alguns polimorfismos de citocinas pró

e anti-inflamatórias, e a sua relação com a dieta na actividade da doença (28). As citocinas

são importantes mediadores inflamatórios, e alterações na sua produção como resultado da

presença de polimorfismos genéticos poderão ter influência na resposta inflamatória e com

isso influenciar o decurso da DC (36,37). Observámos que a presença do polimorfismo IL6-

174 aumenta o risco de DC enquanto o polimorfismo TNFα-857 não influencia a

susceptibilidade de desenvolver doença, mas sim de possuir uma doença mais activa. Mais

uma vez neste estudo foi demonstrado haver sinergismo entre os polimorfismos e a dieta, em

especial a gordura consumida. O efeito deletério da gordura saturada e monoinsaturada foi

superior nos indivíduos detentores dos alelos polimórficos dos genes TNF-857α e IL6-174, e

pelo contrário uma dieta pobre em AGPI n-3 era mais deletéria nos indivíduos com o alelo

polimórfico do TNFα-857.

Em resumo, apesar destas interessantes associações, o resultado de estudos como

estes que publicámos, cujo objectivo principal foi avaliar a interacção dieta-gene (15,26,28),

são na maioria das vezes limitados devido às interacções dinâmicas e evolutivas entre genes

e ambiente (9,38,39). Só quando os mecanismos envolvidos na interacção gene-nutriente-

doença estiverem esclarecidos poderá fazer sentido equacionar ferramentas para a

personalização alimentar com base na componente genética (38).

Dos nossos estudos podemos destacar a importância da prática de uma dieta saudável,

equilibrada nos diferentes macro e micronutrientes, da manutenção de adequado peso

corporal e da prática de exercício físico regular em situações de CCR e de DC. Na

abordagem à nutrigenética, os nossos resultados parecem revelar a importância dos factores

nutricionais em indivíduos geneticamente susceptíveis, fazendo crer que nalguns subgrupos

da população (geneticamente susceptíveis) a nutrição pode assumir um papel preponderante

no risco de doença.

II) CONSIDERAÇÕES FINAIS

Especula-se na comunidade científica se a aplicação e interpretação de testes

nutrigenéticos permitirão num futuro mais ou menos próximo melhorar significativamente o

tratamento de doenças (9). A capacidade de identificar a susceptibilidade genética individual

para uma determinada doença fornece uma ferramenta eficaz na promoção da saúde de

forma nunca antes possível (40); o interesse por esta temática tem vindo a ganhar relevo

entre investigadores, indústria e o público em geral (41). A confirmarem-se alguns dos

resultados já publicados, indicadores de que uma intervenção nutricional pode colmatar

deficiências e potenciar atributos geneticamente delineados, várias questões a seguir

enunciadas são colocadas à aplicação do aconselhamento nutrigenético (40,42-44). Sabendo

Nutrição e Genes em Doenças Intestinais

103

que em geral a maioria das doenças resulta da interacção de vários polimorfismos e

diferentes factores ambientais que condicionam a sua evolução, fará sentido realizar

aconselhamento nutricional com base no efeito de um ou outro polimorfismo? Será o

conhecimento actual sobre nutrigenética suficiente para ajustar individualmente as

recomendações nutricionais? Como se contornam as questões éticas associadas a um

aconselhamento que tem por base o material genético? Como se garante que a informação é

utilizada de uma forma social e moralmente correcta? Quem deverá ter acesso à informação?

Deverão os testes genéticos estar directamente disponíveis ao consumidor? Estará o

consumidor seguro? Como reagirão os consumidores à informação que lhes é facultada?

Qual o custo/benefício associado ao estudo dos polimorfismos? Estas questões, na maioria

ainda sem resposta, são alvo de estratégias internacionalmente desenvolvidas, como

acontece com a Nutrigenomics for Dietitian Initiative, cujo intuito é aumentar o conhecimento

genético dos profissionais de dietética e nutrição para que estes se tornem conhecedores

credíveis e autónomos em nutrigenética (45). Para este fim, continuam a ser desenvolvidas

várias iniciativas: a) plataformas de comunicação entre profissionais interessados na área que

permitem a troca e partilha de conhecimento ou mesmo b) o desenvolvimento de

instrumentos de trabalho que incidem na genética humana e sua relação com a dieta.

Para que no futuro a informação obtida pelos modelos nutrigenéticos possa ser

efectivamente utilizada na promoção da saúde, Subbiah e colaboradores propõem algumas

estratégias de actuação (39):

Aumentar o conhecimento nutrigenético junto dos clínicos em especial os envolvidos

em doenças crónicas;

Aumentar conhecimento/treino ao nível da genómica, proteómica, metabolómica, e

nutrigenómica/nutrigenética junto dos profissionais de dietética e nutrição e conselheiros

genéticos;

Acrescentar disciplinas que abordem estas temáticas nos planos de estudo de

estudantes de medicina, de dietética e/ou nutrição e também de genética;

Desenvolver guidelines de actuação e regulamentação no que respeita à certificação

de testes nutrigenéticos e aspectos legais associados;

Promover apoio financeiro para estudos de larga escala com intervenção

nutrigenética.

Em conclusão, como qualquer outra ciência, a nutrigenética requer tempo, investigação e

dedicação para a sua implementação. Só com sólidos conhecimentos baseados na evidência

será possível promover a saúde e controlar a doença tendo por base ciências inovadoras

como a nutrigenética (40,46)

É possível afirmar que a nutrição no século XXI se apresenta como um fascinante campo

de investigação e aplicação, no qual diariamente surgem novos avanços no modo como

percepcionamos a interacção entre estilos de vida, genótipo e a doença (47).

“Do not expect beneficts in the near future – nutrigenetics is very much an emerging field”

(Susan Aldridge, 2007)

Nutrição e Genes em Doenças Intestinais

104

III) REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS

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Nutrição e Genes em Doenças Intestinais

XIX

AGRADECIMENTOS

Em meados do ano de 2006 iniciei o projecto que veio a ser a essência da minha

Tese. Mais tarde, com o início das publicações surgiu o desafio de fazer a sua

compilação, sustentando esta Tese de Doutoramento.

Durante todo este processo, desde a génese e planeamento dos estudos até ao

final da sua publicação, muitos foram os que me apoiaram, ensinaram e estimularam,

permitindo-me crescer do ponto de vista pessoal e científico.

Destaco a Prof. Doutora Marília Cravo, a quem faço um agradecimento sincero,

pela sua disponibilidade e atitude pedagógica, a sua dinâmica e o seu permanente

gosto pelo desafio. Obrigada pela confiança que em mim depositou.

Ao Prof. Doutor Miguel Brito, à Dr.ª Lourdes Tavares, à Dr.ª Paula Moura Santos,

ao Dr. Bruno Carmona e à Dr.ª Paula Ferreira, muito obrigada também pela ajuda

que sempre me prestaram durante este processo de trabalho.

E porque ao longo destes anos de trabalho intenso, questões profissionais foram

por vezes relegadas para segundo plano, agradeço a preciosa colaboração dos

meus colegas e amigos de trabalho da ESTeSL: Lino, Catarina, Joana, Marisa e

Rute, o facto de me ampararem em muitos momentos, permitindo a minha

concentração e dedicação a este projecto.

No campo familiar foram também alguns (espero que não muitos(!)) os momentos

em que estive menos presente, para conseguir tornar este Doutoramento possível.

Agradeço aos Pais pelo apoio, disponibilidade e paciência para ouvir. Um

agradecimento profundo ao João pela serenidade que me transmitiu ao longo de

todo este processo.

Uma palavra final de agradecimento para a Prof. Doutora Ermelinda Camilo pela

sua disponibilidade para ser minha orientadora da Tese desde a formalização dessa

intenção em 2007. O seu rigor, capacidade crítica e perseverança representaram

importantes mais valias, não só no resultado final deste trabalho, como para mim

enquanto pessoa.

A todos, muito obrigada!

Nutrição e Genes em Doenças Intestinais

XX

ANEXOS

Catarina S Guerreiro, Marília Cravo, Miguel Brito, Pedro M Vidal, Paulo O Fidalgo, e Carlos N

Leitão

The D1822V APC polymorphism interacts with fat, calcium, and fiber intakes in modulating the

risk of colorectal cancer in Portuguese persons.

American Journal of Clinical Nutrition 2007; 85(6):1592-97.

Catarina Sousa Guerreiro, Bruno Carmona, Susana Gonçalves, Elisabete Carolino, Paulo

Fidalgo, Miguel Brito, Carlos Nobre Leitão, e Marília Cravo

Risk of colorectal cancer associated with the 677 polymorphism in 5, 10-

methylenetetrahydrofolate reductase in Portuguese patients depends on the intake of methyl-

donor nutrients.

American Journal of Clinical Nutrition 2008; 88(5):1413-18.

Catarina Sousa Guerreiro, Marília Cravo, Ana Raimundo Costa, Ana Miranda, Lourdes Tavares,

Paula Moura-Santos, Pedro Marques Vidal, e Carlos Nobre Leitão

A comprehensive approach to evaluate nutritional status in Crohn‟s patients in the era of

biologic therapy: a case-control study.

American Journal of Gastroenterology 2007;102(11):2551-56.

Catarina Sousa Guerreiro, Paula Ferreira, Lourdes Tavares, Paula Moura-Santos, Manuela

Neves, Miguel Brito, e Marília Cravo

Fatty acids, IL-6 and TNF-α polymorphisms: An example of nutrigenetics in Crohn‟s disease.

American Journal of Gastroenterology 2009;104(9):2241-49.