UBAIII Biologia Molecular 1º Ano 2012/2013. 17Jan/2013MJC-T14 Sumário: D. Técnicas de Biologia...
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UBAIII Biologia Molecular
1º Ano2012/2013
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17Jan/2013MJC-T14
Sumário: D. Técnicas de Biologia Molecular em Ciências da Saúde
Capítulo XIV. Técnicas básicas para o estudo de ácidos nucleicos. Isolamento e purificação de ácidos nucleicos Separação de ácidos nucleicos Visualização Tecnologia de DNA recombinante
Capítulo XV. Biotecnologia Aplicada às Ciências da Saúde Microarrays princípios da técnica
O que são microarrays? Vários tipos de sondas (DNA, cDNA, RNA, proteínas) Hibridização Leitura Aplicações dos microarrays em medicina:
Expressão diferencial de genes Biomarcadores Marcadores de alvos clinicos, funções biológicas semelhantes, ligação entre genes Detecção de agentes patogénicos
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Purificação dos ácidos nucleicos Homogeneização das células Lise nuclear com solução tamponada de NaCl
com SDS.
Precipitação proteica com fenol/clorofórmio Centrifugação Adição de etanol precipitação dos ácidos
nucleicos17Jan/2013MJC-T144
Separação das
proteínas e RNA
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Obtido o DNA em filamentos brancos É novamente dissolvido em solução aquosa Tratado com RNAse Pode ser também obtido RNA se o tratamento
for feito com DNAse RNAse ou DNAse removidas com protease Lavagem com fenol (para remover .....) Precipitação com etanol.
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Mais recentemente.... Colunas para isolamento de DNA
Membranas e matrizes que ligam DNA especificamente
Lisado de células + matriz lavado e centrifugado Eluição da matriz.
http://www1.qiagen.com/jump/QIAampKits/QIAampKitsReferences.aspx
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Separação do DNA Tamanho Composição de
bases Topologia Sequência de
nucleótidos
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Electroforese Ultracentrifugação
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Electroforese
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http://learn.genetics.utah.edu/content/labs/gel/
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Ultracentrifugação – Velocidade de sedimentação
Unidades S influência da massa.
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Ultracentrifugação – Centrifugação equilibrada
Separa também moléculas com radioisótopos.
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Hibridização de ácidos nucleicos
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Hibridização de ácidos nucleicos
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Tecnologia do DNA recombinante – enzimas de restrição
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Formação do DNA recombinante
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17Jan/201316 MJC-T14
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17Jan/201317 MJC-T14
Clonagem do DNA em bactérias
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17Jan/201318 MJC-T14
Clonagem do DNA em bactérias
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17Jan/201319 MJC-T14
Clonagem do DNA em bactérias
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17Jan/201320 MJC-T14
Clonagem do DNA em bactérias
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17Jan/201321 MJC-T14
Clonagem do DNA em bactérias-screening
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17Jan/201322 MJC-T14
Clonagem do DNA em bactérias-screening
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Separação dos Plasmideos por centrifugação
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Corte com as enzimas
de restrição iniciais
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Clonagem do DNA em vírus
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Clonagem do DNA em vírus
17Jan/2013MJC-T1425
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Clonagem do DNA em vírus
17Jan/2013MJC-T1426
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O que significa Microarray?
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O que é posto nas lâminas? Sondas (?)
Moléculas com capacidade de se ligar a outras hibridizar DNA cu RNA Proteínas
Qual a origem deste material? Bibliotecas de DNA
Genómicas cDNA
DNA RNA
Proteínas17Jan/2013MJC-T1428
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Escolha das sondas a utilizar Comprimento
20-100 bases Especificidade Impressão da lâmina
Orientação do fragmento Hibridização pretendida
As sondas hibridizam com a amostra que é marcada com fluorescência. Assim um sinal fluorescente no resultado o que
significa?
17Jan/2013MJC-T1429
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Condições de hibridização Quantidade e qualidade da amostra
Replicação com [amostra] Solução de hibridização e lavagem
Normalmente é definida pelo fabricante do chip Tempo de incubação
Gerido em função de estudos piloto e também definido pelo fabricante
Temperatura de incubação Depende por vezes da sequência (conteudo GC) Porquê?
17Jan/2013MJC-T1430
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Leitura do chip Depende de ter sido utilizado 1 ou 2 corantes
diferentes
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Expressão diferencial de genes
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Expressão diferencial de genes
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Expressão diferencial de genes
17Jan/2013MJC-T1434
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Recursos utilizados
Capítulo 18 Karp secções 18.9-18.11. e secção 18.13.
Capítulo 12 Karp secção 12.4 http://www.bio.davidson.edu/Courses/genomic
s/chip/chip.html (Microarray de DNA de leveduras).
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