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Troubleshooting de Vials:
Revisão dos parâmetros críticos em sistemas de injeção
Sandra Cachopo & Pedro Batista 13 de Outubro 2016
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Bom dia a todos!
Sejam bem vindos a mais um seminário online da Waters.
Já iniciamos o nosso seminário e caso não nos esteja a ouvir
indique-nos, por favor, através do chat.
Assim que apresentação termine irá aparecer no vosso
ecrã um pequeno questionário o qual agradecemos a
vossa participação no envio de uma resposta.
Muito obrigada a todos!
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Desafios nos laboratórios
Realizar e assegurar a exatidão dos resultados cromatográficos
através de uma abordagem de garantia de qualidade.
Trabalhar com métodos robustos que forneçam resultados
sólidos, fiáveis e duradouros.
Minimizar o tempo que é utilizado para o diagnóstico de
problemas de mau funcionamento.
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Tempo de Retenção Área
Linearidade
Resolução
Tailing Número de pratos
teóricos Ruído
Estratégia de Troubleshooting
Reservatório de solventes
Bombas Injector
Coluna
Detector
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Problemas associados aos vials
À partida é o último parâmetro a considerar em caso de problemas*, no entanto, deverá ser considerado e analisado no início para a resolução de problemas.
(*) Problemas: - Forma de pico - Área/Sensibilidade - Linearidade - Contaminação cruzada - Contaminação: picos fantasma - Mau funcionamento dos equipamentos
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Agenda
Origem dos problemas cromatográficos
relacionados com o injetor
Contribuição dos vials para os problemas
cromatográficos
– Aspectos Dimensionais
– Aspectos Químicos
Vials Certificados: a qualidade dos vials e a sua
contribuição para a qualidade das análises em LC
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Agenda
Origem dos problemas cromatográficos
relacionados com o injetor
Contribuição dos vials para os problemas
cromatográficos
– Aspectos Dimensionais
– Aspectos Químicos
Vials Certificados: a qualidade dos vials e a sua
contribuição para a qualidade das análises em LC
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Problemas com origem no injetor
Injetor
– Parâmetros programados erroneamente
– Ar na seringa de injeção ou seringas de lavagem
– Volume de injeção inconsistente ou fora da gama de injeção
– Loop obstruído
– Loop mal configurado
– Parafusos e ferrrules “cravados” incorretamente
– Seringa danificada ou mal configurada
– Seringa contaminada
– Fuga nas válvulas
– Fuga nos retentores
– Volume de amostra insuficiente no vial para realizar a injeção
– Vial colocado numa posição errada
– Utilização de vials inadequados
– Solventes do injetor inadequados
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Possíveis problemas relacionados com sistema de injeção: “Carryover”
Problema Origem Injector Solução
Mais picos que os esperados, ou maior área que o esperado
Carryover: compostos que se arrastam de uma injeção anterior. Pode dever-se a: 1. Injetor que não limpa
corretamente/suficientemente entre cada injeção
a. Sistema de lavagem da agulha/injetor não funciona
b. Solventes de lavagem da agulha/injetor inadequados
c. Tempo de limpeza insuficiente.
d. Solventes de lavagem da agulha/injetor contaminados
e. Vials inadequados: fontes de contaminação
2. Coluna que não se limpa
corretamente/suficientemente entre cada injeção.
Verificar o equipamento para diagnosticar a origem da contaminação (documento de ajuda: diagnóstico de contaminação) Determinar se o carryover é na coluna ou no injetor.
a. Verificar o injetor e substituir peças defeituosas
b. Verificar os solventes de limpeza da agulha/injetor e substituir por uns mais adequados ao método
c. Aumentar tempo/volume de limpeza no método
d. Fazer uma injeção em full loop, se a cromatografia está ok, o solvente de limpeza está contaminado.
e. Descartar vials como fonte de contaminação (trocar vials, eliminar septo)
- Implementar fase de limpeza no gradiente ou tempo entre injeções.
?
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Possíveis problemas relacionados com sistema de injeção: Forma de pico
Problema Origem Injetor Solução
Picos largos ou com “Tailing”
Volume de injeção ou concentração da amostra demasiado elevada Solvente de dissolução da amostras demasiado orgânico em relação à fase móvel Solvente de purga do injetor com demasiado orgânico Modo de injeção inadequado (no caso de injetores com vários modos de injeção) Parafusos e ferrules conectados de modo incorreto e que provocam um volume morto.
Reduzir para a metade o volume de injeção para verificar se esta na origem do problema. Diluir a amostras caso seja necessário. Verificar e substituir se necessário. Diluir a amostra com fase móvel (se possível) Solvente de purga deve ter composição similar a fase móvel inicial (proporção orgânico/água) e deve ser compatível com o solvente de dissolução da amostra. Testar com outro modo de injeção. Por ex. com Full Loop, podemos estar a injetar uma quantidade demasiada alta para a coluna. Verificar ligações. Corrigir problemas com as ligações
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Possíveis problemas relacionados com sistema de injeção: Forma de pico
Problema
Origem Injector Solução
Picos com “ombros” ou Fronting Picos saturados
Volume de injeção demasiado grande ou concentração demasiada alta ( sample overload) Solvente de dissolução da amostra demasiado orgânico Composição do solvente de purga do injetor demasiado orgânico Volume ou concentração de amostra injetada demasiado elevado .
Diluir amostra ou reduzir volume de injeção. Reduzir volume de injeção ou diminuir percentagem de orgânico no solvente de dissolução da amostra Solvente de purga do injetor deve ter composição semelhante a da fase móvel Diluir amostra ou reduzir volume de injeção.
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Possíveis problemas relacionados com sistema de injeção: Perda de sensibilidade
Problema
Origem Injector Solução
Linha de base plana Perda de Sensibilidade
Não injetou Agulha ou loop obstruído Volume de injeção incorretamente programado Injetor mal configurado Concentração insuficiente A amostra não esta completamente dissolvida ou precipita ao longo do tempo. Amostra evapora ou degrada-se Amostra aderida ao vial ou partes do injetor (por exemplo com agulha de peek, os compostos hidrofóbicos ficam aderidos a agulha )
Verificar que existe volume suficiente de amostra no vial, se a sua posição é a correta. Teste de pesagem do vial para verificar que aspira amostra corretamente. Substituir agulha ou Loop Verificar volume de injeção Verificar volume do loop e agulha. Caracterizar novamente volume de loop e agulha Aumentar a concentração ou volume de injeção. Verificar a solubilidade e se necessário aumentar a temperatura do compartimento de amostras (a baixas temperaturas pode precipitar) Diminuir a temperatura do compartimento de amostras. Utilizar vials adequados (descativados, plástico). Utilizar peças do injetor adequadas (experimentar outro tipo de agulhas)
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Possíveis problemas relacionados com sistema de injeção: Perda de sensibilidade
Problema
Origem injector Solução
Perda de sensibilidade
Agulha calibrada demasiado alta, ou mal programada no método Solventes do injetor: demasiado orgânico, resulta em má forma de pico, especialmente para os compostos mais hidrofílicos Seringa da amostra: Não se purgou bem ou existem bolhas de ar. Seringa de amostras mal configurada Fuga no injetor (seringa, loop, agulha…) Velocidade de aspiração da seringa demasiado alta. Pode originar bolhas Bolha de ar no fundo do vial. Típico na utilização de inserts Volume de amostra inferior ao volume residual do vial ou placa. Efeito vácuo/pressão vial
Realizar nova calibração Z da agulha. Comprovar que a altura da agulha no método é correta. Mudar a composição dos solventes do injetor. Purgar o injetor e verificar a agulha Verificar a configuração do injetor Realizar teste de fugas ao injetor. Verificar fugas nas ligações do injetor. Mudar a velocidade de aspiração no método. Colocar volume de amostra superior ao volume residual. Verificar volumes residuais de cada vial ou placa. Utilizar septos pre-slit
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Possíveis problemas relacionados com sistema de injeção: Variação tempos de retenção
Problema Origem injetor Solução
Diminuição progressiva do Tr Incremento progressivo do Tr Alteração do Tr para um novo valor fixo
Solução de dissolução da amostra mais forte que a fase móvel Volume de injeção e concentração excessivos Em modos de injeção PLUNO quando o solvente de purga (Weak Wash) é diferente da fase móvel.
Reduzir o volume de injeção ou diluir com a fase móvel. Quando se utiliza um solvente mais fraco que a fase móvel pode injetar-se até 10% do volume da coluna, mas se este solvente é mais forte, o valor máximo é de 1%. Reduzir o volume de injeção ou diluir com a fase móvel. Quando se utiliza um solvente mais fraco que a fase móvel pode injetar-se até 10% do volume da coluna, mas se este solvente é mais forte, o valor máximo é de 1%. Verificar ou mudar o solvente de purga do injetor por um adequado e voltar a caracterizar o volume do sistema.
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Agenda
Origem dos problemas cromatográficos
relacionados com o injetor
Contribuição dos vials para os problemas
cromatográficos
– Aspectos Dimensionais
– Aspectos Químicos
Vials Certificados: a qualidade dos vials e a sua
contribuição para a qualidade das análises em LC
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Variação na aspiração do volume de amostra – implicação na
reprodutibilidade
Evaporação
Desenho da agulha– seleção correta do vial
Deslocamento do septo
Agulhas danificadas– implicações no funcionamento do
equipamento
Mechanical Issues
Total Recovery Max Recovery QSert
Aspectos Dimensionais
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Sintoma – área de pico aumenta em relação à primeira injeção do
mesmo vial
o Primeira injeção– área do pico menor
o Injeções posteriores– área de pico maior
Possível causa:
– Inadequada ventilação – formação de vácuo
o A formação do vacúo provoca perda de parte da amostra na retirada da
agulha (quando sai do vial)
Teste – confirmação
– Eliminar a tampa e septo do vial
– Realizar múltiplas injeções
– Área de pico consistente – o problema resolvido
Variação na aspiração do volume da amostra
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Recomendação
– Utilização de septos com “pre-slit” para uma melhor precisão na
aspiração da amostra
Não podendo utilizar septos “pre-slit” (relacionado com a evaporação)
– Conselho:
o Não encher os vials até ao topo
Variação na aspiração do volume da amostra
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Pode ser causada por:
– Perda de solvente
o Septo resselável
• “Slit” ou “no-slit”
o Septo não resselável
– Perda de analito da amostra
Estudo de evaporação:
Septo (PTFE/Silicone) “pre-slit” vs “no slit”
– Acetona – volátil (T ambiente ~20 C)
o Septo perfurado com agulha Alliance
o 20 vials para cada condição
Evaporação
Non Slit Slit
No pierce 2 hours 0 0
3 days 0.16% 2.16%
Pierced 2 hours 0 0
3 days 1.53% 3.20%
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Perda por evaporação – septo não resselável
Apenas PTFE – não resselável – grande perda
PTFE / Silicone – resselável
Temperatura ambiente ~20 C
-8.0%
-7.0%
-6.0%
-5.0%
-4.0%
-3.0%
-2.0%
-1.0%
0.0%
0 5 10 15 20 25 30
% lo
ss
Hours
Perda por Evaporação
50/50 Acetonitrile/Water
PTFE
Slit PTFE/Silicone
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Evaporação - Perda do analito
~1.5% perda por evaporação ~10 C
Concentração do analito varia
– Naftaleno (neutral + menor MW) evapora
– Componentes polares (ex: propranolol) não
QCRM 186006363 Methanol/20 mM potassium phosphate
-100000
-80000
-60000
-40000
-20000
0
20000
40000
60000
0 20 40 60 80
Ch
an
ge P
eak A
rea
Hours in Vial
Concentração do Analito
propranolol
amitriptyline
butyl paraben
naphthalene
dipropyl phthalate
acenaphthene
propranolol
naphthalene
amitriptyline
butyl paraben
dipropyl phthalate
propranolol amitriptyline naphthalene
% Change 19.73% 19.23% -62.59%
MW 296 277 128
BP 435C 398°C 78°C
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Evaporação - Recomendações
Considerar:
Volatilidade do analito/solvente
Tempo que amostra permanece nos vials após a primeira injeção da
agulha
Septos resseláveis ou não
Opções:
Tempos de análise curtos:
– Muitas possibilidades- incluindo septo não resselável
Tempos de análise longos: requer septo resselável ou septo “no slit”
– Re-injetar a amostra – muito tempo após injeção inicial
o Dividir a amostra em mais do que um vial
o Refrigerar as amostras
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Desenho da agulha
Desenhos de agulha diferentes:
– Agulha ACQUITY UPLC H-Class com
orifício de aspiração na extremidade
– Agulha Alliance – agulha com orifício
de aspiração lateral
– Agulha “Fixed Loop” ACQUITY UPLC
Binário com agulha de punção –
sucção na ponta da agulha
o Agulha que desliza através do
interior da agulha de punção
Piercing Needle
Sample Needle
Bottom Draw
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Desenho da agulha
Agulha dos sistemas Alliances
– Combinação vial/desenho da agulha para correta aspiração da
amostra
– Agulha com orifício lateral
Vial de 2 mL Vial Total Recovery
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Desenho da agulha
Agulha dos sistemas ACQUITY UPLC H-Class
- Vials Maximum Recovery – aspira o volume limitado de amostra volume limitado de amostra no centro do vial
Vial Max Recovery Agulha com aspiração na ponta
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Desenho da agulha “Default offset”
Os sistemas de injeção têm um “Default offset” ou posicionamento da agulha por defeito – Direção Z – onde pára a agulha
Uma definição incorrecta do “Needle offset” pode:
– Incapacitar a aspiração suficiente da amostra do vial
– Volume residual excessivo
– Danificar a agulha
– Danificar o vial
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Desenho da agulha - Recomendações
Conhecer especificações dimensionais do injetor
Calibrar o posicionamento da agulha
Escolher o desenho do vial para maximizar o volume de
amostra (volume total e volume residual)
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Desenho da agulha - Recomendações
Selector de Vials http://www.waters.com/app/selector/en/vials.html
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Deslocamento do septo
Calibrar posicionamento da agulha para evitar danos – ex. Z
Alinhar injetor /rack vials ou carrossel para punção central no septo
Sistemas não alinhados e posição incorrecta da agulha podem causar
danos na agulha e/ou rutura do vial
Teflon
Silicone
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Deslocamento do septo Desenho da agulha pontiaguda vs redonda
Possíveis razões para as agulhas arredondadas:
– A agulha pode ficar arredondada ao furar uma
superfície dura
– Não visível a uma simples vista
Agulhas arredondadas requerem 3-5 vezes mais
de força para perfurar o septo
O deslocamento do septo pode ser um sinal ou
aviso de um problema no sistema de injeção
Pontiaguda
Arredondada
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Deslocamento do septo O que acontece durante a punção
Com agulha afiada: – Silicone é elástico e a agulha estica e
separa.
– Película de PTFE– estica até à rutura – não tem a elasticidade do silicone
Com agulha arredondada: – Silicone não se separa facilmente e terá
dificuldades em romper a película de PTFE.
– O septo cede até à rutura da película de PTFE ou o septo descola da tampa
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Deslocamento do septo
Pode também acontecer a aspiração de
parte do material do septo provocando
uma obstrução na agulha podendo ficar
danificada:
– Em situações em que os vials possuem
amostras congeladas
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Deslocamento do septo - Recomendações
Não aplicar demasiada força ao enroscar a tampa
Calibrar posicionamento da agulha para evitar danos– ex. Z
Definir “Default Offset” adequado
Alinhar injetor/rack vials ou carrossel para punção central
do septo
Utilizar tampas com septo adequado e proporção ótima de
PTFE/Silicone
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Agulha danificada
A agulha fica danificada ao romper uma superfície dura:
– Vial inadequado (ou inadequado “Needle Offset”)
– Pode alterar a capacidade resselável do silicone ao deformá-lo: falta
de reprodutibilidade de áreas
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Agulha danificada
Vial fora de tolerância Vial Certificado Waters
Todos os recipientes de vidro necessitam de um fundo côncavo para ser estável.
Para injetores– largura deve ser controlada.
O fundo deste vial pode danificar a agulha e até pode ocorrer a
rutura do vial
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Agulha danificada - Recomendações
Vials com tampas e septos adequados
“Needle offset” em função do vial
Dimensões adequadas do vial:
• Altura
• Largura
• Rosca
• Proporção Silicone/PTFE e características do material (rigidez, fragilidade)
• O vial deve ser cilíndrico com septo centrado para punção
Vials fora das tolerâncias dimensionais podem causar danos na agulha!
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Aspectos Dimensionais Resumo
Considerar o tipo de agulha do injetor
– Calibrar posicionamento da agulha, alinhamento
o Evitar falhas de injeções e danos na agulha
Septo “pre-slit” recomendado para uma melhor injeção e uma
aspiração precisa e repetitiva da amostra
Considerar vials adequados para o volume de amostras limitado
- seguir recomendações do fabricante.
Os vials certificados asseguram a qualidade!
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Picos fantasma
– Provenientes do septo
Degradação analito/amostra
Adsorção analito/amostra no vial
Mechanical Issues Aspectos Químicos
Vidro (superfície polar Si-O-H)
Tampa (PP/PE, polímeros)
Septo (Silicone/PTFE, polímeros)
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Picos fantasma
Produção do Vidro – processo final de “annealing”
– Resultado: superfície polar muito limpa e seca
– Facilita a aderência de impurezas
– Podem ser resíduos de:
o Processamento incompleto
o Manipulação inapropiada
o Processo de embalamento
Septo
– PTFE/Silicone
o Processo incompleto– podem originar picos (depende detector/sensibilidade)
Cuidado!:evitar que o laboratório seja a origem
• Manipulação (rotulagem) e armazenamento
• Equipamentos mais sensíveis
Surfactantes, Lubrificantes, Antiestáticos, Antioxidantes, Silicone baixo Mw
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Escolha o septo correcto
Material Compatibility Recommendations Self Sealing Max. Temp.
PTFE (Teflon) +
PE Septumless
All solvents;
Ideal for MS applications
Only suitable for one injection -
evaporationNo
260°C PTFE
80°C for PE
PTFE/Silicone
PTFE resistance until
punctured. After 1st
injection: alcohols,
acetone, ether, DMF, DMSO
Recommended for multiple
injections and sample storage.Very good 200°C
PTFE/Silicone
pre slitsame as above
Very good for multiple injections.
Eliminates vacuum formation and
delivers excellent reproducibility.
Prevents coring from bottom draw-
port needles.
Good 200°C
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Picos fantasma Provenientes do septo
Resistência a solventes de lavagem
(PTFE/Silicone)
– Agulhas “Flow through” FTN
o maioria dos injetores Alliance e ACQUITY H-
Class e I-Class
– Ao inserir a agulha no septo, o solvente lavagem
da agulha entra em contacto com septo
– Ao retirar a agulha a amostra entra em contacto
com o solvente de lavagem
Se re-injetarmos do mesmo vial:
o Contacto agulha com solvente de lavagem da
injeção anterior
o Os solventes pode solvatar algo do septo e a
agulha levará a contaminação para a amostra
o Aparecem picos na segunda injeção e em
posteriores
Solvente de lavagem da agulha
Septo degradado com o solvente de lavagem
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Picos fantasma Provenientes do septo - Múltiplas injeções
Alliance HPLC / ELSD, THF como solvente lavagem da agulha
Pico inesperado
Linha de base verde - vial sem septo
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Tabela criada segundo as recomendações dos fornecedores de vials
Classificação com base na utilização feita
Coluna com indicações de silicone provém de PTFE/silicone – resistência do
PTFE até perfuração
Solvent PTFE PE Silicone Chemical Resistance Rating
Acetone A A D A = excellent resistance
Acetonitrile A A B B = good
Acetic Acid A A A C = fair
Chloroform A A B D = poor
Dimethyl formamide A A D
Dimethyl sulfoxide A A C
Ethanol A A B
Ethyl acetate A A A
Ethyl ether A A D
Heptane A A D
Hexane A A B
Methanol A A A
Methylene chloride A A D
Methyl ethyl ketone A A C
Isopropanol A A A
Tetrahydrofuran A A D
Toluene A A B
Water A A A
Resistência Química
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Picos fantasma Provenientes septo - Recomendações
Condições Químicas
– Utilizar a menor % ACN na lavagem da agulha
Escolha correcta do septo
– Utilizar septos de acordo com a resistência a químicos
Estratégia injeção da amostra
– Dividir as amostras em diferentes vial
– Evitar re-injeção/contaminação
Nota: Considerar que a maior sensibilidade do sistema requer
material mais exigente - utilização de Vials Certificados.
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Degradação dos analitos
Analitos sensíveis à luz: vials âmbar filtram alguns comprimentos de onda
da luz
Analitos sensíveis ao pH: Atenção! o vidro pode aumentar o pH das
soluções aquosas.
Recomendações:
– Vials de plástico
– Vials TruView– são neutros
– Amostras tamponadas
Vidro âmbar Vidro claro
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Adsorção de analitos
O vidro contem intercambiadores iónicos, grupos silanois na sua
superfície que pode ser complexa e alguns analitos podem ter uma
grande reactividade (mais crítico para concentrações muito pequenas).
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Adsorção de analitos Recomendações
Vials vidro desactivado (DV): vidro tratado com organosilano
para neutralizar os grupos silanóis da superfície e tornar a
superfície hidrófobica.
Vials TruView™: proceso patentado de produção do vidro.
Vials de plástico: polipropileno PP.
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Agenda
Origem dos problemas cromatográficos
relacionados com o injetor
Contribuição dos vials para os problemas
cromatográficos
– Aspectos Dimensionais
– Aspectos Químicos
Vials Certificados: a qualidade dos vials e a sua
contribuição para a qualidade das análises em LC
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Vials Certificados
Testing LC/GC Certified LCMS Certified TruView LCMS Certified
Dimensions
Septum GC Test
HPLC UV Test - residues
MS Scan - ionizable masses
and polymer
Low Adsorption Test - ng/mL
level
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Recommended
Analyte Concentration µg/mL 100's ng/mL ng/mL or less
Detection UV/ RI MS more sensitive MS
Key Features cleaner septa
low adsorption glass,
cleanest/lowest bleed
septum
Certification Tests
Certificação para garantir a qualidade dimensional-
composicional dos vials em análise LC
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Vials Certificados
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Vials Certificados Recomendações
Analyte
ConcentrationDetection Source
Recommended
Product
µg/mL UV, RI (non MS) LC/GC Certified Vials
100's ng/mLsingle quadrapole and
older MS/MSLCMS Certified Vials
1 ng/mL and
lowerMS/MS
Truview LCMS
Certified Vials
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Documentação técnica
Catálogo 720001818EN
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