Topico7.5-Enzimas

7/24/2019 Topico7.5-Enzimas

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CINTICA ENZIMTICA

1. CONCEITO

As enzimas so protenas especializadas em catalisar

reaes biolgicas, ou seja, aumentam a velocidade de uma

reao qumica sem interferir no processo.

Elas esto associadas a biomolculas, devido as suas

e!traordin"ria especificidade e poder cataltico.

#.# $mport%ncia

&articipa das reaes qumica de processos

biotecnolgicos'

E!s'

#.(E)*E+A-/ A012/0$1A

3. /bteno de Enanti4meros

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https://djalmasantos.files.wordpress.com/2011/10/03b.jpg


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2. Histria

/ nome enzima provm de 5in 6easts5, no qual

suspeitava7se que as cat"lises biolgicas estavam envolvidas

com a fermentao do a8car em "lcool.

A primeira descoberta foi feita por &a6en e &ersoz em#9::, quando encontraram uma subst%ncia termol"bil que

convertia amido em a8car, denominada amilase.

&asteur em #9;< postulou que as enzimas esto

associadas = estrutura e a vida da clula.

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Em #9>> ?uc@ener obteve sucesso na e!trao de

enzimas de clulas de leveduras que catalisavam a

fermentao alcolica.

A enzima foi primeiramente isolada na forma cristalina,

mas isto foi compreendido mel@or quando ummer em #B3;

isolou urease de feijo e evidenciou que estes cristais

consistem em protenas.

Coje 3


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&ara um perfeito entendimento sobre a estrutura de uma

enzima e como esta funciona, devemos consider"7la tanto

como uma protena quanto um catalisador biolgico.

1omo uma protena a enzima apresenta blocos de

construo denominados amino"cidos.

Algumas protenas so constitudas apenas de

amino"cidos. /utras protenas, alm de amino"cidos, contDm

outros componentes e so as protenas conjugadas.

A peroxidase e a ata!aseso e!emplos de enzimas com

estrutura conjugada e que apresentam por"iri#a "$rriacomo

cofator.

*uitas enzimas so compostas de uma cadeia

polipeptdica simples. Este caso de enzimas como a

ribonuclease, tripsina, pepsina e algumas alfa amilases.

&orm, e!iste um grande n8mero de enzimas que so

compostas por mais de uma cadeia peptdica. E!.' lactato7

desidrogenase composta por quatro cadeias polipeptdicas.

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A repetio das cadeias polipeptdicas na construo de

uma macromolcula de protena caracteriza a estruturao

quatern"ria que esta pode assumir.

%. NOMENC&ATURA E C&ASSI'ICA()O *AS ENZIMAS+

A nomenclatura mais utilizada feita pela adio do sufi!o

aseao nome do substrato c@amada de +ome )ecomendadoF,

ou seja, a molcula na qual a enzima e!erce sua ao.

+este caso'

- A enzima ureasecatalisa a @idrlise da uria

em am4nia e 1/3G

- A arginasecatalisa a @idrlise da arginina emornitina e uria, e'

- A fosfatase catalisa a @idrlise de steres de

fosfato.

Entretanto, esta nomenclatura simples no tem se

mostrado pr"tica uma vez que muitas enzimas recebem

denominaes que so muito pouco informativos.

&or esta razo, e tambm devido = descoberta de novas

enzimas, foi proposta uma classificao sistem"tica

recomendada por uma comisso internacional de especialistas.

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/ novo sistema de classificao divide as enzimas em

Seis C!asses ,ri#ipais, nas quais esto inclusas subclasses

de acordo com o tipo de reao catalisada.

He acordo com esta sistem"tica, cada enzima

designada por'

- Im No-e Reo-e#dado, usualmente pequeno e

apropriado para o uso di"rioG

- Im No-e Siste-tio, o qual identifica a reao

catalisada eG

- Im N/-ero de C!assi"ia0o, o qual usado

quando uma identificao precisa necess"ria.

1omo e!emplo do novo sistema de classificao,

considere a reao abai!o catalisada por uma enzima'

AT, reati#a A*, "os"oreati#a

/ +ome )ecomendado para esta enzima, que o

normalmente usado, creatininaquinaseeG

/ +ome istem"tico, baseado na reao catalisada,

ATP:creatina fosfotransferase. eu n8mero de classificao

EC 2.7.3.2, onde'

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- EC representa E#4-e Co--issio# o" t5e

I#ter#atio#a! U#io# o" 6io5e-istr4 a#d

Mo!e7!ar 6io!o84 9 IU6M6G

- / primeiro dgito, 2, a 1lasse transferaseFG

- / segundo dgito, 7, a ubclasse fosfotransferaseFG

- / terceiro dgito, 3, a ub subclasse em que a

fosfotransferase apresenta um grupo nitrogenado

como aceptor, eG

- / quarto dgito, 2, designa uma creatina quinase.

/ quadro abai!o relaciona os cdigos utilizados para a

aplicao do n8mero de identificao das enzimas.

1lassificao das Enzimas egundo a 1omisso de Enzimas1. Oxido-redutases reaes de o!idao7reduo ou

transferDncia de eltrons J Desidrogenasese OxidasesF

#.#.atuando em 1C7/C

#.3.atuando em 1K/

#.:.atuando em 1K/7

#.L.atuando em 1C7+C3

#.M.atuando em 1C7+C7

#.;.atuando em +AHC, +AH&C

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3. Transferases transferem grupos funcionais como amina,

fosfato, acil, carbo!il J Quinasese TransainasesF

3.#.grupos com um carbono

3.3.grupos aldedo ou cetona

3.:.grupos acil

3.L.grupos glicosil

3.>.grupos fosfatos

3.9.grupos contendo en!4fre

:.!idro"ases reaes de @idrlise de ligao covalente 7Pe#tidasesF

:.#.steres

:.3.ligaes glicosdicas

:.L.ligaes peptdicas

:.M.outras ligaes 17+

:.;.anidridos "cidosL.$iases catalisam a quebra de ligaes covalentes e a

remoo de molculas de "gua, am4nia e g"s carb4nico J

De%idratasese Descar&oxi"asesF

L.#. K1K1K

L.3. K1K/L.:. K1K+7

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M.'soerasesreaes de interconverso entre is4meros ticos

ou geomtricos 7 E#ierasesF

M.#.racemases;.$igases catalisam reaes de formao de novas molculas

a partir da ligao entre duas pr7e!istentes, sempre =s custas

de energia 7 (intetasesF

;.#. 17/

;.3. 17

;.:. 17+;.L. 171

:. CINTICA *A CAT&ISE ENZIMTICA

A cintica enzim"tica a parte da Enzimologia que estuda

a velocidade das reaes enzim"ticas bem como os fatoresque a influenciam.

/s princpios gerais da cintica das reaes qumicas

aplicam7se =s reaes catalisadas enzimaticamente.

Embora estas tambm mostrem um padro distinto que

no usualmente encontrado nas reaes no enzim"ticas'

Sat7ra0o o- o S7;strato.

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+o gr"fico abai!o podemos observar o efeito da

concentrao do substrato na ta!a de uma reao catalisada

por uma enzima.

(orma tpica de uma curva de cintica enzim"tica

Em bai!as concentraes de substrato, a velocidade da

reao aumenta = medida que aumenta a concentrao desubstrato, pois @" muita enzima livre para ligar o substrato.

Em concentraes elevadas de substrato, a velocidade da

reao atinge um patamar, pois os stios ativos da enzima

comeam a ficar saturados com molculas de substrato

comple!o EF.

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odas as enzimas apresentam o efeito da saturao,

porm variando consideravelmente no que diz respeito =

concentrao requerida para produzi7lo.

Esse efeito de saturao levou alguns pesquisadores a

estabelecerem a @iptese de que enzima e substrato reagem

reversivelmente para formar um comple!o.

Em #B#: a teoria da ao e cintica enzim"tica foi

desenvolvida por dois cientistas c@amados &. Mi5ae!is e M.

&. Me#te#, na qual uma reao enzim"tica pode ser e!pressa

pela seguinte equao'

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As molculas do substrato passam por uma srie de

formas geomtrica e eletricamente alteradas antes de

formarem produtos da reao.

As enzimas tDm muito maior afinidade por estes estados

de transio do substrato do que tDm por formas mais est"veis.

A partir deste modelo de reao proposto desenvolveu7se

uma equao que permite demonstrar como a velocidade de

reao varia em funo da concentrao do substrato'

vo a velocidade inicial para cada concentrao de substrato

Nma!a velocidade m"!ima

OP a concentrao de substrato

Q*a constante de *ic@aelis7*enten

Nma! o valor para o qual tende a velocidade = medida

que se aumenta a concentrao de substrato.

1orresponde = situao e!perimental em que todos os

centros ativos das molculas de enzima esto saturados de

substrato.

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Q* o valor de OP para o qual v oKNma!R3 e uma medida

da afinidade da enzima por um determinado substrato. S um

valor especfico de cada par de enzima7substrato.

/ quadro abai!o relaciona algumas enzimas e seus

respectivos Qm.

E#i-a S7;strato 1atalase C3/3 3MCo!oquinase Tlicose

(rutose


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&ode7se observar pelo quadro apresentado que os valores

de Q* no so fi!os e podem variar com a estrutura do

substrato, com o pC e com a temperatura.

&ara enzimas que atuam em mais de um substrato, cada

substrato tem um Q* caracterstico.

A constante de Mi5ae!is?Me#te# de uma enzima ,

portanto, uma caracterstica muito importante e fundamental,

no apenas matematicamente como tambm na avaliao da

atividade e na purificao das enzimas.

:. MECANISMO *A A()O ENZIMTICA

:.1. E#i-a o-o ata!isador

/ princpio de catalisador diminuir a energia de

ativao. A enzima se liga a uma molcula de substrato em

uma regio especfica denominada stio de ligao.

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Esta regio um encai!e que apresenta um lado

envolvido por cadeias de amino"cidos que ajudam a ligar o

substrato, e o outro lado desta cadeia age na cat"lise.

Em #9BL Emil (isc@er prop4s o modelo c@ave J

fec@adura para e!plicar a ao enzim"tica.

A enzima se encai!a com o substrato especfico no stio

ativo, como uma c@ave e fec@adura.

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anto a enzima quanto o substrato sofrem conformao

para o encai!e.

A enzima no aceita simplesmente o substrato, o

substrato distorcido para conformao e!ata do estado de

transio, o encai!e por induo, proposto por Qos@land

#BM9F.

Ao completar a reao cataltica a enzima libera o

produto e retorna a forma original. / processo ocorre em duas

etapas'

#F V E EW etapa reversvelF

3F E E V & etapa irreversvelF

W comple!o enzima7substrato

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:.2 'atores @7e I#"!7e#ia- #a e!oidade da Rea0o

E#i-tia+

#. emperatura ' Uuanto maior a temperatura, maior a

velocidade da reao, at se atingir a TEM,ERATURA

BTIMAG a partir dela, a atividade volta a diminuir, por

desnaturao da molcula.

3. pC ' $dem = temperaturaG e!iste um pH BTIMO, onde a

distribuio de cargas eltricas da molcula da enzima e,

em especial do stio cataltico, ideal para a cat"lise.

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:. 1oncentrao de enzima' a velocidade de transferDncia

de substrato em produto proporcional = quantidade de

enzima.

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:.3. I#i;i0o E#i-tia

*uitos tipos de molculas inibem as enzimas e podem

agir de v"rias formas. A principal distino entre i#i;i0o

reersDe! e i#i;i0o irreersDe!.

A forma que envolve ligaes no7covalentes reversvel,

atravs da remoo do inibidor.

X" a inibio irreversvel, a ligao molecular covalente.

o geralmente encontrados em reaes que apresentam

to!inas especficas.

:.3.1. I#i;i0o ReersDe!

E!istem v"rios modos que esto envolvidos com ligao

no covalente, eles diferenciam quanto ao mecanismo pelo

qual diminuem a atividade enzim"tica e como eles afetam na

cintica da reao.

A> I#i;i0o ReersDe! Co-petitia

Ima molcula apresenta estrutura semel@ante ao

substrato da enzima que se liga para realizar a cat"lise, ela

poder" aceitar esta molcula no seu local de ligao.

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*as no @aver" o processo cataltico, pois ocupando ostio ativo do substrato correto. &ortanto o inibidor compete

pelo mesmo local do substrato.

/ efeito da reao modifica o Q*, mas no altera a

velocidade.

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6> I#i;idor ReersDe! #o Co-petitio

/corre quando um molcula ou on pode se ligar em um

segundo local na superfcie enzim"tica no no stio ativoF.

$sto pode distorcer a enzima tornando o processo

cataltico ineficiente.

/ inibidor no competitivo pode ser uma molcula que

no se assemel@a com o substrato, mas apresenta uma grande

afinidade com a enzima.

S o mecanismo inverso do inibidor competitivo, porque

inibe a ligao do comple!o E e no da enzima livre.

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/ efeito da reao modifica a velocidade e o Q*

permanece constante.

:.3.2. I#i;i0o IrreersDe!

Algumas subst%ncias se ligam covalentemente =s

enzimas dei!ando7as inativas.

ntese de prostaglandinas inibida.

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+a maioria dos casos a subst%ncia reage com o grupo

funcional no stio ativo bloqueando o local do substrato,

dei!ando a enzima catalticamente inativa.

$nibidores irreversveis podem ser e!tremamente

seletivos, pois so semel@antes ao substrato.

:.%. Co"atores

&ara alguns tipos de processos biolgicos, apenas a

cadeia protica no suficiente, por isso a protena requer uma

molcula denominada o"ator.

/ 1ofator pode ser uma pequena molcula org%nica,denominada oe#i-aou um on met"lico.

A cat"lise ativa enzima7cofator denominada

5o!oe#i-a, quando o cofator removido, fica a protena, a

qual catabolicamente inativa e denominada apoe#i-a.

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:.%.1. Coe#i-as

A molcula org%nica que se liga =s enzimas para ativar

uma reao, denominada coenzima, cada tipo apresenta uma

funo qumica particular, algumas so agentes o!i7redutoras,

outras transferidoras, etc.

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. TCNICAS EM,REFA*AS NO ESTU*O *AS ENZIMAS

.1. A#!ise de e!oidade de rea0o ata!Dtia

E!istem duas formas essenciais para o estudo da

cintica de uma enzima.

- &rimeiramente deve ser feito medies sob

condies na qual manten@a o estado de equilbrioG

- Hepois observar a aplicabilidade da equao de

*ic@aelis7*enten, e determinar a velocidade de

reao pela concentrao do substrato e da enzima.

.1.1 A#!ise do E@7i!D;rio de Rea0o

/ equilbrio de uma reao enzim"tica estabelecido em

segundos ou poucos minutos. Algumas tcnicas de avaliao'

A> Espetro"oto-etria

S um mtodo simples e apurado. S medido pela

absoro de luz na regio espectral do substrato ou produto

formado na reao.

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6> '!7oresG#ia

S similar a metodologia de espectrofotometria. /

substrato ou o produto deve emitir fluorescDncia neste

espectro.

A tcnica vantajosa por ser altamente sensvel, a

soluo a ser empregada deve estar e!tremamente diluda.

C> Tit7!a0o a7to-tia

S utilizada quando a reao produz ou consome "cido ou

base. itula7se na soluo "cido ou base para que o pC

continue constante. A quantidade de "cido ou base consumido o valor da reao cataltica enzim"tica.

*>.A#!ise Radioatia

S avaliado quando o substrato marcado com istopo

radioativo, o qual ser" perdido ou transferido durante a reao

a ser estudada. S um mtodo e!tremamente sensvel para

an"lise cintica enzim"tica.

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.2. A#!ises de rea0es o- a!ta e!oidade

.2.1 Stopped '!oJ

A enzima e o substrato so inicialmente separados em

seringas, que rapidamente libera seu conte8do at uma

c%mara misturadora e em seguida passa para a seringa que

para a reao.

+este instante um detector mede a absorb%ncia de luz ou

fluorimetria.

.2.2 Te-perat7re K7-p

/ processo ocorre quando a mistura de reao, que est"

em equilbrio numa emperatura #, rapidamente passada

uma temperatura 3.

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/ ponto de equilbrio mudar" e a reao deve ocorrer

para que a reao alcance um novo equilbrio.

A mudana r"pida de temperatura obtida por uma

e!ploso de corrente eltrica nos eletrodos imergidos na

mistura de reao.

/ tempo de rela!amento entre a mudana de

temperatura medido por absorb%ncia ou fluorescDncia.

.3. A#!ise @7a#titatia da atiidade e#i-tia

&ara obteno de uma an"lise quantitativa necess"riosaber'

- oda estequiometria de uma reao catalticaG

- e a enzima requer adio de cofatores como um on

ou coenzimaG

- A dependDncia da enzima sob a concentrao do

cofator ou substratoG

- / pC timoG

- A temperatura pela qual a enzima est" est"vel e

apresenta alta atividade.

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- / procedimento para determinao do aparecimento e

desaparecimento do substrato de um produto de

reao.

A an"lise quantitativa confirmada quando o substrato

ou o produto colorido ou absorvido em luz ultravioleta.

/ valor de aparecimento ou desaparecimento do produto

ou substrato absorvido por luz pode ser analisado pelo

espectrofot4metro.

Alm do produto ou substrato pode 7 se analisar o

intermedi"rio aquele que serve como ponte para o

desencadeamento de outra reaoF.

.3.1. ,7ri"ia0o e#i-tia

As enzimas so encontradas na natureza em misturas

comple!as, geralmente as clulas apresentam centenas ou

mais diferentes enzimas, para um estudo aprofundado deve7se

purificar a enzima a ser estudada.

Em alguns casos possvel atravs da aplicao de

mtodos especficos utilizar enzimas nos estado impuro, mas

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na maioria dos casos, a presena de outras enzimas interfere

nos substratos desviando as reaes especficas.

.3.2. M$todos de p7ri"ia0o

1) este J primeiramente faz7se uma an"lise quantitativa

da atividade da enzima a ser estudada. A enzima deve

ser isolada utilizando 7 se o teste de atividade em

diferentes fraes, sendo mais importante que a

e!atido do mtodo.

2) &rocedimento Teral J definio da unidade

enzim"tica, concentrao e atividade especfica.

3) /rigem enzim"tica J determinao do local tecidoF de

maior quantidade, geralmente a r"pida centrifugaoadquire enzimas mitocondrial.

4) E!trao J necess"rio ter a enzima em soluo e,

portanto, a ruptura de membranas. Heve Jse utilizar

um tampo, pois ao romper o tecido pode ocorrer

liberao de subst%ncias "cidas que degradam a

enzima. /s mtodos utilizados so o mec%nico com

partculas de areia, nitrogDnio lquido, 5s@aYer5 em alta

velocidade, ondas de ultrassom e solventes como

acetona.

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.3.3 U#idade de atiidade e#i-tia

S definida pela quantidade que causa transformao de

# mmol de substrato por minuto a 3MZ1 sob condies timas.

A atividade especfica o n8mero de unidade de enzimas

por miligrama de protena, mede a pureza da enzima.

A atividade molar ou molecular ou n8mero de 5turnover5,

o n8mero de molculas do substrato transformado por uma

8nica molcula de enzima ou 8nico stio de ligao em um

minuto, quando a enzima est" no valor de limite.

A atividade molar pode ser calculada pela velocidadem"!ima.

A nova unidade internacional da atividade enzim"tica

determinada pela 51omisso da Enzima5 o 5Yatal5, o qual

definido como a transformao do substrato em # mol por

segundo.

.3.%. M$todos de 'raio#a-e#to

/ e!trato de enzimas apresenta in8meras subst%ncias

com diferentes pesos moleculares e de acordo com seu

interesse de estudo utilizam7se diferentes mtodos'

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1) &recipitao por diferena de pC

2) Hesnaturao por aquecimento

3) &recipitao com solventes org%nicos etanol,

acetonaF

4) &recipitao por sais sulfato de am4niaF

5)Adsoro

6) 1romatografia 7 o mecanismo de separao depende

da adsoro, troca i4nica, afinidade especfica para

imobilizar ligantes especficos ou efeitos de

peneiramento molecular.

7) Eletroforese 7 a mobilidade das protenas causada

por campo eltrico

8) 1ristalizao9) 1oncentrao J reduo de volume atravs de

evaporao do solvente ou congelamento.

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