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Neuroprotección por 2-(3,4-dihidroxifenil)-etanol
y Ácidos grasos poliinsaturados-omega-3
en modelos in vitro e in vivo
BERTA LUZÓN TORO
Tesis Doctoral
Mayo 2005
Neuroprotección por 2-(3,4-dihidroxifenil)-etanol
y Ácidos grasos poliinsaturados-omega-3
en modelos in vitro e in vivo
Memoria presentada por la licenciada Berta
Luzón Toro para optar al grado de Doctora
en Biología.
Granada, Mayo 2005
Berta Luzón Toro
Esta Tesis Doctoral ha sido realizada en la empresa Puleva
Biotech, S.A. y en la Universidad de Granada, en colaboración
con la Universidad de Saarland (Alemania), bajo la dirección del
Doctor Arjan Geerlings.
Arjan Geerlings
Doctor en Ciencias Químicas
Puleva Biotech,S.A.
Departamento de Biomedicina. Puleva Biotech S.A.(Granada)
Departamento de Bioquímica y BªMolecular. Universidad de Granada
Deparmento de Neurobiología. Universidad de Saarland (Homburg-Saar, Alemania)
“No puedo cambiar la dirección del viento, pero
puedo ajustar mis velas para alcanzar siempre
mi destino”
(Jimmy Dean).
A mis padres y a mis hermanas.
Abreviaturas
4 Desaturasa= Delta4 Desaturasa
5-HT= Serotonina
7-DHC= 7-dehidrocolesterol
AA= Ácido araquidónico
AAL= Ácido -linolénico
Abs=Absorbancia
ABTS= Ácido sulfónico 2,2'-Azino-di-(3-Etilbenzotiazolina)
Ac= Acetilcolina
AcN= Acetonitrilo
ACTH= Hormona Adrenocorticotrópica
ADH= Ácido docosahexaenoico
Ag/AgCl= Plata/cloruro de plata
AGEs= Ácidos grasos esenciales
AGPIs= Ácidos grasos poliinsaturados
AK= Ácido kaínico
AL= Ácido linoleico
AMPA= Receptor ionotrópico de Glutamato
ApoE= Apoliproteína E
ASTM =Asociación Americana de Prueba de Materiales
AT= Ácido tiobarbitúrico
A = Pétido beta amiloide
BHE= Barrera hematoencefálica
BHT= 2,6-di-tert-butil-4-metilfenol
BSTFA= N,N-Bis (trimetilsilil) trifluoroacetamida
CA = regiones del hipocampo denominadas Cornu Ammonis
CAT= Catalasa
CG-MS= Gases masas
Ci/mmol= Cantidad total de radioactividad por milimol (actividad
específica de compuestos marcados radioactivamente por unidad de masa)
Col= Colesterol
COMT= Catecol-O-metiltransfesasa
Contr= Control
COX= Ciclooxigenasa
Abreviaturas
CRH= Hormona liberadora de corticotropina
C-terminal= Carboxilo terminal
Cu= Cobre
DA=Dopamina
DAB= Diaminobenzidina
DHPA= Dihidroxipropiladenina
DMSO= Dimetil sulfóxido
DOPAC= Ácido 3,4-dihidroxifenilacético
DOPAL= 3,4-dihidroxifenilacetaldehído
DOPET= 2-(3,4-dihidroxifenil)-etanol
DPA= Ácido Docosapentaenoico
DTT= Ditiotreitol
EA= Enfermedad de Alzheimer
EAE= Encefalitis autoinmune experimental
EAF= Forma familial de la Enfermedad de Alzheimer
EDTA= Ácido etilén diamino tetraacético
EGTA= Ácido N,N,N',N'-tetraacético etilenglicol-bis (2-aminoetileter)
ELISA= Ensayo inmunoenzimático ligado a enzimas
ELO= Elongasa
EM= Esclerosis Múltiple
eNO= Óxido nítrico endotelial
ENU= Etil nitrosa urea
EP= Enfermedad de Parkinson
EPA= Ácido eicosapentaenoico
EROs= Especies reactivas de oxígeno
FCS= Suero bovino fetal
FCN= Factor de crecimiento nervioso
Fen= Fenilalanina
g= Medida de centrifugación
g= Gramos
GSD= Glutatión superóxido dismutasa
He= Hembra(s)
h= Horas
Abreviaturas
H2O2= Peróxido de hidrógeno
HCl= Ácido clorhídrico
HLA= Antígeno humano de histocompatibilidad
HMG-CoA reductasa= 3-hidroxi-3-metilglutaril coenzima A
reductasa
HPLC= Cromatógrafo líquido de alta resolución
HVA= Ácido 4-hidroxi-3-metoxifenilacético
IC50= Dosis inhibitoria de crecimiento 50.
IL= Interleukina
Ile= Isoleucina
kDa= Kilodalton
kg= Kilogramos
KH2PO4= Fosfato dipotásico
KHPO4= Fosfato monopotásico
KOH= Hidróxido potásico
L= Litro(s)
LAD= Lipoproteínas de alta densidad
LAM= Laberinto acuático de Morris
LBD= Lipoproteína de baja densidad
LBD= Lipoproteínas de baja densidad
LC5D= Latosterol C5-desaturasa
LCR= Líquido cefalorraquideo
Leu= Leucina
Lis= Lisina
LMBD= Lipoproteínas de muy baja densidad
m/z= Masa/carga
M= Molar
Ma= Macho (s)
mA= Miliamperios
MAO (A y B) = Monoamino oxidasa ( variantes A y B)
MDA= Malondialdehido
Me2SO= Dimetil sulfóxido
MeOH= Metanol
Abreviaturas
Met= Metionina
mg/kg= Miligramos/kilogramo
mg= Miligramos
min= Minutos
mJ= Megajulio
mL= Mililitro
mm= Milímetro
mM= Milimolar
mmin= Medición mínima
MOPAL= 4-hidroxi-3-metoxifenilacetaldehído
MOPET= 4-hidroxi-3-metoxifeniletanol
n= Tamaño de muestra
Na2HPO4= Fosfato disódico
NADH= Nicotinamin adenin dinucleótido
NaH2PO4= Fosfato monosódico
NE= Norepinefrina
ng= Nanogramos
nm= Nanometros
nM= Nanomolar
NMDA= N-metil-D-aspartato
Om-3= Omega-3
Om-6= Omega-6
ON=Ovillos neurofibrilares
Pb= Pares de bases
PBS= Tampón fosfato salino
PCR= Reacción en cadena de la ADN polimerasa
PMSF= Fenil metil sulfonil fluoruro
PN= Placas neuríticas
PPA= Proteína precursora del amiloide
PS= Presenilinas
PS1= Presenilina 1
PS2= Presenilina 2
Psi= Unidad de medida de presión
Abreviaturas
PSS= Solución salina fisiológica
P-tau= proteína tau-hiperfosforilada
RE= Retículo endoplasmático
r.p.m.= Revoluciones por minuto
S105= Sobrenadante obtenido tras centrifugar a 105.000 x g
SBF= Suero bovino fetal
SDS= Dodecil sulfato sódico
SIM= Método de análisis por CG-MS (Selected Ion Monitoring).
SNC= Sistema nervioso central
SOD= Superóxido dismutasa
SRAT= Sustancias reactivas de ácido tiobarbitúrico
T= Tiempo
TBE= Tris borato EDTA
TBS-T= Tris buffer salino Tween-20
Th1= Linfocitos colaboradores-1
TNF- = Factor de necrosis tumoral alfa
Tris= Tris (hidroximetil)-amino metano
U/mL= Unidades de enzima por mililitro
UV= Ultravioleta
Val= Valina
Wt= Salvaje
YAC= ratón transgénico portador de cromosomas artificiales de levadura
Zn= Cinc
-PPA= Proteína precursora del amiloide-alfa
-secretasa= Alfa-secretasa
-PPA= Proteína precursora del amiloide-beta
-secretasa= Beta-secretasa
-secretasa= Gamma-secretasa
µg= Microgramo
µJ =Microjulio
µL= Microlitro
µm= Micras
µM= Micromolar
Índice
RESÚMEN 10
SUMMARY 32
I. INTRODUCCIÓN. 53
I.1. Neurodegeneración. 53
I.1.1. Concepto. 53
I.1.2. Estrés oxidativo. 53
I.1.3. Marcadores de estrés oxidativo. 55
I.1.3.1. Malondialdehido (MDA). 55
I.1.3.2. Sustancias reactivas con ácido tiobarbitúrico (SRAT). 56
I.1.4. Modelo animal de estrés oxidativo: Ácido Kaínico. 56
I.1.5. Neuroinflamación. 58
I.2. Enfermedades neurodegenerativas. 60
I.2.1. Concepto. 60
I.2.2. Enfermedad de Alzheimer (EA). 61
I.2.2.1. Origen de la EA. 61
I.2.2.2. Incidencia de la EA. 62
I.2.2.3. Neuropatofisiología de la EA. 63
I.2.2.4. Cambios estructurales en la EA. 64
I.2.2.4.1. Placas neuríticas (PN). 65
I.2.2.4.2. Ovillos neurofibrilares (ON). 66
I.2.2.5. Estrés oxidativo en la EA. 67
I.2.2.6. Genética de la EA. 69
I.2.2.6.1. Proteína precursora del amiloide (PPA). 71
I.2.2.6.1.1. Rutas de procesado de PPA. 73
I.2.2.6.1.2. Efectos neurobiológicos de los metabolitos de PPA. 75
I.2.2.7. Presenilinas (PS). 76
I.2.2.8. Modelos animales de la EA. 79
I.2.2.8.1. Transgénicos de PPA. 80
I.2.2.8.2. Transgénicos de PS. 81
I.2.2.9. Laberinto acuático de Morris (LAM). 81
I.2.3. Enfermedad de Parkinson (EP). 83
I.2.3.1. Origen de la EP. 83
Índice
I.2.3.2. Incidencia de la EP. 83
I.2.3.3. Neuropatofisiología de la EP. 83
I.2.3.4. Dopamina y la EP. 86
I.2.3.5. Mecanismo de neurodegeneración en la EP. 87
I.2.3.6. Actividades enzimáticas implicadas en la EP: Monoamino
oxidasa (MAO). 88
I.2.4. Esclerosis múltiple (EM). 89
I.2.4.1. Origen de la EM. 89
I.2.4.2. Incidencia de la EM. 89
I.2.4.3. Neuropatofisiología de la EM. 90
I.2.4.3.1. Fase inflamatoria y fase neurodegenerativa de la EM. 91
I.2.4.4. Genética de la EM. 92
I.2.4.5. Modelos animales de la EM. 93
I.3. Terapias. 94
I.3.1. Farmacología. 94
I.3.1.1. Aplicada a la EA. 94
I.3.1.1.1. Inhibidores de la Acetilcolinesterasa. 94
I.3.1.1.2. Drogas anti-A . 95
I.3.1.1.3. Agentes anti-inflamatorios. 96
I.3.1.1.4. Terapia hormonal sustitutoria. 96
I.3.1.1.5. Estatinas. 96
I.3.1.1.6. Neurotransmisores: Acetilcolina (Ac). 97
I.3.1.1.7. Moduladores del receptor NMDA. 98
I.3.1.2. Aplicada a la EP. 99
I.3.1.3. Aplicada a la EM. 99
I.3.2. Dieta. 100
I.3.2.1. Antioxidantes. 100
I.3.2.1.1. Búsqueda de antioxidantes. 100
I.3.2.1.1.1. Aceite de oliva: DOPET. 101
I.3.2.1.1.1.1. Actividades biológicas de DOPET. 104
I.3.2.1.1.1.2. Metabolismo de DOPET. 105
I.3.2.1.1.1.3. Relación de DOPET con catecolaminas. 107
Índice
I.3.2.1.2. Colesterol. 108
I.3.2.1.2.1. Metabolismo del colesterol:
Latosterol C5-desaturasa. 108
I.3.2.1.2.2. Colesterol y la EA. 110
I.3.2.1.2.3. Colesterol y la EM. 114
I.3.2.1.3. Ácidos grasos poliinsaturados (AGPIs). 114
I.3.2.1.3.1. Clasificación de los ácidos grasos de la dieta. 115
I.3.2.1.3.2. Funciones fisiológicas de AGPIs. 116
I.3.2.1.3.3. Metabolismo de los AGPIs. 117
I.3.2.1.3.4. AGPIs y colesterol. 119
I.3.2.1.3.5. Ácido docosahexaenoico (ADH). 122
I.3.2.1.3.6. AGPIs y la EA. 124
II. OBJETIVOS. 130
III. MATERIALES Y MÉTODOS. 133
III.1. MATERIAL. 133
III.1.1. Modelos animales experimentales. 133
III.1.2. Modelos celulares experimentales. 135
III.1.3. Dietas experimentales. 135
III.2. MÉTODOS. 137
III.2.1. Técnicas. 137
III.2.1.1. Sacrificio de los animales. 137
III.2.1.2. Extracción de ADN. 137
III.2.1.3. PCR. 138
III.2.1.4. Lisados de proteínas. 139
III.2.1.5. Western Blot. 139
III.2.1.6. ELISA A 40 y A 42. 140
III.2.1.7. Determinación de ácidos grasos en cerebro y plasma de
ratón. 141
III.2.1.8. Determinación de colesterol total en plasma y cerebro.
142
Índice
III.2.1.9. Disección y parafinación del cerebro de ratón. 143
III.2.1.10. Preparación de las secciones de tejido e inmunotinción
con el kit ABC-Vectastain. 144
III.2.1.11. Screening de compuestos naturales con capacidad
antioxidante. 145
III.2.1.12. Biodisponibilidad de DOPET. 147
III.2.1.12.1. Determinación de DOPET por HPLC-ABTS. 147
III.2.1.12.2. Cuantificación de DOPET por HPLC. 148
III.2.1.12.3. Determinación de DOPET por CG-MS. 149
III.2.2. Obtención de DOPET por síntesis química. 153
III.2.3. Estudios de neuroprotección. 153
III.2.3.1. Cultivo celular. 153
A) Para la medida de citotoxicidad. 153
B) Para el ensayo COMET. 154
C) Para el efecto de DOPET sobre la captación de dopamina y
norepinefrina in vitro. 155
III.2.3.2. Aislamiento de mitocondrias hepáticas. 156
III.2.4. Microarrays en ratones sondados con DOPET. 157
III.2.5. Estudios de antioxidación. 158
III.2.5.1. Detección de MDA en cerebro. 158
III.2.5.2. Detección de MDA en plasma. 158
III.2.5.3. Cuantificación de la actividad catalasa en cerebro de
conejo. 164
III.2.5.4. Modelo de ácido kaínico:
Laberinto acuático de Morris. 165
III.2.6. Estudios de estabilidad de DOPET en agua. 166
III.2.7. Estudios del metabolismo del colesterol. 168
III.2.7.1. Determinación de actividad Latosterol-C5-Desaturasa por
HPLC. 168
III.2.7.2. Efecto de diferentes dietas en el metabolismo del
colesterol de conejos. 172
Índice
III.2.7.3. Determinación de la concentración de colesterol en
cerebro y plasma. 173
III.2.7.4. Concentración de latosterol en cerebro por CG-MS. 174
IV. RESULTADOS. 178
IV.1. Estudios en modelos animales de la EA. 178
IV.1.1. Estudios con dietas enriquecidas en AGPIs omega-3 en
modelo transgénico simple PPA de la EA. 178
IV.1.1.1. Determinación de ácidos grasos en cerebro y plasma. 178
IV.1.1.2. Determinación de colesterol total en cerebro y plasma.184
IV.1.1.3. ELISA A 40. 186
IV.1.1.4. Correlación entre colesterol en y A 40. 189
IV.1.2. Estudios en ratones mutantes KOZACK-colesterol 16. 191
IV.1.2.1. Determinación de la concentración de colesterol en
suero. 191
IV.1.2.2. Inmunotinción de secciones de tejido embebidas en
parafina. 194
IV.1.2.3. ELISA A 40 y 42. 196
IV.1.3. Estudios en modelo de ratón transgénico doble PPA/PS1 de
la EA. 199
IV.1.3.1. Inmunotinción de secciones de tejido embebidas en
parafina. 199
IV.1.3.2. ELISA A 40 y 42. 201
IV.1.3.3. Determinación de la concentración de colesterol en
plasma. 203
IV.2. Estudios con DOPET. 206
IV.2.1. Screening de compuestos naturales con capacidad
antioxidante y potencial neuroprotector. 206
IV.2.2. Biodisponibilidad de DOPET. 207
IV.2.2.1. Determinación de DOPET por HPLC-ABTS. 207
IV.2.2.2. Determinación de DOPET por CG-MS. 208
IV.2.3. Estudios de antioxidación. 210
Índice
IV.2.3.1. Detección de malondialdehido (MDA). 210
IV.2.3.1.1. MDA en cerebro de rata. 210
IV.2.3.1.2. MDA en plasma de ratón. 211
IV.2.3.1.3. Cuantificación de la actividad catalasa en cerebro de
conejo. 214
IV.2.4. Estudios de neuroprotección. 216
IV.2.4.1. Medida de citotoxicidad de DOPET. 216
IV.2.4.2. Ensayo COMET. 222
IV.2.4.3. Modelo de excitotoxicidad con ácido kaínico: laberinto
acuático de Morris. 223
IV.2.5. Microarrays en ratones sondados con DOPET. 225
IV.2.6. Efecto de DOPET en un modelo animal de Esclerosis
Múltiple (EM). 230
IV.2.7. Estudios del metabolismo del colesterol. 235
IV.2.7.1. IC50 de DOPET para la actividad enzimática Latosterol-C5
desaturasa. 235
IV.2.7.2. Efecto de diferentes dietas en el metabolismo del
colesterol de conejos. 239
IV.2.8. Efecto de DOPET sobre la captación de dopamina y
norepinefrina in vitro. 245
IV.2.8.1. IC50 de DOPET para la actividad Monoamino oxidasa
(MAO) en mitocondrias aisladas de hígado y cerebro de rata. 252
V. DISCUSIÓN. 255
V.1. Estudios en modelos animales de la EA. 257
V.1.1. Estudios con dietas enriquecidas en AGPIs omega-3 en
modelo transgénico simple PPA de la EA. 257
V.1.2. Estudios en ratones mutantes KOZACK-colesterol 16. 259
V.1.3. Estudios en modelo de ratón transgénico doble PPA/PS1 de la
EA. 260
V.2. Estudios con DOPET. 264
V.2.1. Estudios de antioxidación. 265
V.2.2. Estudios de neuroprotección. 266
Índice
V.2.2.1. Modelo de excitotoxicidad con ácido kaínico: laberinto
acuático de Morris. 267
V.2.3. Microarrays en ratones sondados con DOPET. 268
V.2.4. Efecto de DOPET en un modelo animal de Esclerosis Múltiple
(EM). 269
V.2.5. Estudios del metabolismo del colesterol. 271
V.2.5.1. Estudios sobre LC5D. 272
V.2.5.2. Efecto de diferentes dietas en el metabolismo del colesterol
de conejos. 273
V.2.6. Efecto de DOPET sobre la captación de dopamina y
norepinefrina in vitro. 274
VI. CONCLUSIONES. 280
VII. PROYECTOS DE FUTURO. 285
VIII. BIBLIOGRAFÍA. 288
RESÚMEN
Resúmen10
La enfermedad de Alzheimer (EA), la enfermedad de Parkinson (EP) y la
esclerosis múltiple (EM) son procesos neurodegenerativos de origen
multifactorial, que cursan con reacciones inflamatorias, neurotoxicidad
glutamatérgica, incremento en los niveles de hierro y óxido nítrico, eliminación
de los antioxidantes endógenos, reducción de los factores tróficos y pérdida de
neuronas, entre otros eventos. Constituyen algunas de las patologías que mayor
coste económico suponen para la sociedad actual.
El que un proceso neurodegenerativo sea un mecanismo multifactorial, podría
explicar porqué el limitado número de terapias clínicas neuroprotectoras que
utilizan drogas simples, no consiguen generar resultados significativos. Por
tanto uno de los principales objetivos en neurodegeneración y neuroprotección
es la determinación de cuáles de estos factores constituyen los causantes
primarios, la secuencia en la que tienen lugar y si actúan en concurrencia con los
procesos patogénicos.
Los mecanismos neuroprotectores pueden ser afrontados desde modificaciones
dietarias, que es el fundamento de la presente Memoria, basada en la aplicación
de los ácidos grasos poliinsaturados omega-3 (AGPIs omega-3) y de un
compuesto polifenólico, 2-(3,4-dihidroxifenil)-etanol (DOPET), en una serie de
sistemas in vitro e in vivo asociados a procesos y enfermedades
neurodegenerativas como la EA, la EP y la EM. Se analizarán marcadores
propios de cada patología, parámetros de oxidación y la modificación del perfil
lipídico. La investigación realizada sobre los mecanismos que llevan a la muerte
neuronal, han llevado a la creencia que el uso terapéutico de antioxidantes
podría resultar de utilidad en estas patologías.
Resúmen 11
COLESTEROL
El cerebro es el órgano del cuerpo humano que contiene mayor cantidad de
colesterol (20 mg/g de tejido). Una de las razones que explican la relativa
insensibilidad de las enfermedades que afectan al SNC a los niveles séricos de
colesterol, podría basarse en la regulación independiente del metabolismo del
colesterol en el SNC con respecto a la periferia.
Uno de los factores de riesgo más prevalentes en la EA es la Apolipoproteína 4
(Apo E), isoenzima de la proteína de transporte de colesterol Apo E, presente
tanto en el cerebro como en la periferia. Hay multitud de enzimas implicadas en
el metabolismo del colesterol que también muestran una conexión putativa con
el inicio tardío de la EA, como la colesterol 24-hidroxilasa asociada al citocromo
P450, implicada en la oxidación del colesterol a 24(s)-hidroxicolesterol.
El consumo de niveles elevados de colesterol y grasas saturadas se asocia con un
mayor riesgo de demencia, mientras que el consumo de pescado, fuente
importante de AGPIs, se asocia con la reducción de este riesgo y la protección
frente a la demencia (Kalmijn et al., 1997). El nivel medio de colesterol total y
de lipoproteínas de baja densidad (LBD)-colesterol en sangre, están
significativamente elevados en pacientes de la EA con respecto a los controles
sanos de avanzada edad y relacionado con el estatus Apo 4. Los niveles de
colesterol cerebral también aparecen elevados en la corteza frontal de pacientes
de la EA y enfermedad coronaria arterial (Notkola et al., 1998).
El colesterol procedente de la dieta, afecta al metabolismo del colesterol
cerebral, acelerando el envejecimiento cerebral a través de un incremento en los
niveles cerebrales de colesterol como consecuencia de un mayor estrés
oxidativo.
Las membranas de los cerebros de pacientes afectados por la EA, presentan una
mayor degradación de fosfolípidos, ya que la peroxidación lipídica asociada a la
enfermedad altera la composición de las membranas en contraste con el
proceso normal de envejecimiento, provocando una reducción en el ratio molar
colesterol:fosfolípidos que reduce la anchura de las membranas, por lo que el
Resúmen12
incremento en colesterol puede ser un mecanismo de defensa celular para
proteger las membranas del daño oxidativo.
El colesterol es un débil antioxidante y estabilizante de la estructura de las
membranas. Se ha sugerido que el colesterol formaría parte del sistema
antioxidativo jerárquico (incluyendo melatonina, ascorbato, ubiquinol, vitamina
E, tioles como el glutatión y los AGPIs) que protege a las células de las acciones
detrimentes de los oxirradicales. Cuando este sistema está sometido a estrés y
deficiencias, el colesterol se oxida y moviliza indicando que el colesterol de la
membrana se intercambia con las reservas exógenas cuando ocurre un proceso de
peroxidación lipídica. Por tanto, cuando el estrés oxidativo es suficiente,
disminuye el contenido en colesterol mitocondrial y microsomal e incrementa la
fluidez de las membranas en las sinapsis del cerebro (Huertas et al., 1992; Wood
et al., 1995).
Existen evidencias epidemiológicas, bioquímicas y genéticas que relacionan al
colesterol con la EA, y se ha demostrado que el colesterol modula el procesado
de la proteína precursora del amiloide (PPA) y que su contenido puede afectar a
la actividad de las secretasas. Los metabolitos de PPA en cerebro pueden ser
modulados por el colesterol de la dieta, un efecto que requiere la presencia de
ApoE. El colesterol incrementa los niveles celulares de PPA, disminuye el
metabolismo y la liberación de -PPAs e incrementa la producción y deposición
amiloidogénica de A .
El colesterol es el esteroide más prevalente en humanos y es producido en una
multi-cascada, que comienza con la acción de la -hidroxi- -metilglutaril CoA
(HMG-CoA) sintasa y la HMG-CoA reductasa. Esta última es una de las dianas
de las estatinas, un tipo de drogas para reducir el colesterol y cuyo efecto
benificioso en la EA continúa siendo hoy día tema de controversia. El vínculo
directo entre las alteraciones en el metabolismo del colesterol y otros lípidos de
membrana en la EA, permanece aún por esclarecer, ya que aún se desconoce si
tales alteraciones son responsables de la disfunción y muerte neuronal.
Resúmen 13
DOPET
El aceite de oliva es un componente importante de la dieta Mediterránea y es
reconocido como fuente de la denominada “comida funcional” por su elevado
contenido en antioxidantes fenólicos naturales. Posee una composición única, a
base de un 56%-84% de ácido oleico y un 3%-21% de ácido linoleico. Algunos
estudios atribuyen un efecto modesto pero directo en la reducción de los niveles
de colesterol para las grasas monoinsaturadas cuando se toman de manera
independiente y reemplazando equicalóricamente a la ingesta de carbohidratos.
Entre las actividades biológicas atribuídas a los fenoles del aceite de oliva figuran
la inhibición de la oxidación de las LBD, tanto in vitro como ex vivo, la inhibición
de la derivatización de apoproteínas y de la agregación plaquetaria, la reducción
de los tromboxanos B2 y leucotrienos B4 producidos por leucocitos humanos
activados, la eliminación de las especies superóxido y reactivas de oxígeno, la
inhibición del daño al ADN, de la nitración inducida por tirosina activada por
peroxinitrito así como acción hipotensiva.
La estructura de los compuestos fenólicos, formados por anillos aromáticos con
sustituyentes hidroxilos, es especialmente adecuada para ejercer una actividad
antioxidante (donador de hidrógeno o electrones, o captador de radicales libres).
La capacidad de los compuestos fenólicos como quelantes de metales,
especialmente cobre y hierro, les permite actuar indirectamente como
antioxidantes mediante la inhibición de la acción de los metales como
catalizadores en la formación de radicales libres.
Entre esos compuestos fenólicos se encuentran los fenoles simples de C6-C2,
flavonoides o secoiridoides. La oleuropeína, el principal secoiridoide amargo que
debe ser eliminado de las aceitunas para hacerlas comestibles, y sus derivados
hidrolíticos, como DOPET, oleuropeína aglicanos y oleodio-11-metil ester, son los
componentes fenólicos predominantes en la pulpa de la aceituna. Otros
compuestos fenólicos cuantitativamente importantes son el tirosol y ácidos
fenólicos como el ácido vanílico y cafeico. Todos estos fenoles están implicados en
la prevención de la formación de otros productos de peroxidación lipídica, como
los isosprostanos, malondialdehido y lipoperóxidos, manteniendo sus niveles
Resúmen14
cercanos a los basales. Otras actividades biológicas atribuidas a estos polifenoles
son la modulación de la formación de trombos y de la inflamación, la defensa del
hospedador ante la infección por parásitos, propiedades antimutagénicas,
anticarcinogénicas y antiglicémicas.
Se seleccionó DOPET por ser el principal o-difenol detectable en el aceite de oliva
virgen extra, tanto en su forma libre como esterificada con ácido elenólico para
formar oleuropeína aglicano. Entre las actividades biológicas de DOPET figuran
la capacidad de prevención de la oxidación de LBD, la agregación plaquetaria e
inhibición de las enzimas 5- y 12-lipooxigenasas, reducción de los efectos
citotóxicos ejercidos por la formación de malondialdehido sobre varios sistemas
de células humanas, efecto antiproliferativo y capacidad para permeabilizar las
membranas de las células intestinales humanas. Uno de los mecanismos
propuestos para la efectividad de los polifenoles implicaría su estructura tipo
catecol, conocida por conferir protección frente a una variedad de insultos
neurotóxicos.
AGPIs OMEGA-3.
Hace más de 30 años que se determinó que la causa de la reducción en la tasa de
mortalidad por enfermedad coronaria correspondía a la ingesta de grasa de foca,
ballena y pescado, ricas en Ácido Eicosapentaenoico (EPA) y Ácido
Docosahexaenoico (ADH). Los investigadores también observaron la efectividad
de los AGPIs omega-3 para reducir los niveles de colesterol y triglicéridos en el
suero, y años después se ha corroborado el efecto hipocolesterolemiante en
monos Rhesus.
Los ácidos grasos son componentes esenciales de la dieta humana, implicados en
el crecimiento y la reproducción. Están asociados con numerosas patologías,
como la enfermedad cardiovascular. El sistema nervioso presenta el mayor
contenido lipídico tras el tejido adiposo. Entre el 50 y el 60% del peso seco del
cerebro adulto son lípidos, 35% de los cuales están representados por los ácidos
grasos poliinsaturados (AGPIs) y entre los que los fosfolípidos son los
componentes cuantitativamente más significativos de las membranas lipídicas.
Resúmen 15
Los ácidos grasos de la dieta son importantes para el cerebro, influenciando
tanto al tejido adulto como al envejecido.
Los AGPIs, se subdividen, a su vez, en el grupo omega-3 y en el grupo omega-6.
La mayoría de los efectos beneficiosos se atribuyen a los omega-3, aunque es
necesario mantener un balance apropiado entre ambas series para el normal
desarrollo y mantenimiento del organismo, que se estima en una relación de 6:1
(omega6:omega3) para un adulto sano.
Los AGPIs, son moduladores putativos de la neurotransmisión en el cerebro y en
el eje hipotalámico-pituitario-adrenal, controlando la expresión génica de los
tejidos lipogénicos, hígado y sistema inmune, lo que deriva en la modificación de
determinados procesos cognitivos y fisiológicos y lo que demuestra que poseen
efectos anti-inflamatorios clínicamente importantes (Mori and Beilin, 2004).
Estudios cuantitativos in vivo demuestran, que aproximadamente un 5% del
contenido en ADH y AA del cerebro es metabolizado y reemplazado por ácidos
grasos provenientes de la dieta a través de la circulación sanguínea.
El principal mecanismo de actuación neuroprotectora y cardioprotectora de la
serie omega-3, podría basarse en la supresión de la síntesis y liberación tanto de
Factor de necrosis tumoral alfa como de Interlequina-10, en la modulación de
las respuestas anti-inflamatorias del eje hipotalámico-pituitario-adrenal y en el
incremento de la liberación de Acetilcolina. Por tanto parece existir una estrecha
interacción entre el Sistema Nervioso Central (SNC), los órganos endocrinos,
citoquinas y los AGPIs omega-3. Esta podría ser una de las razones que
explicasen el beneficio de estos ácidos grasos en condiciones tales como la EA, la
EP, enfermedades inflamatorias, diabetes mellitus, hipertensión, septicemia y
arteriosclerosis.
La presente Memoria ha sido realizada en el Departamento de Biomedicina de la
empresa Puleva Biotech S.A. y en el Departamento de Bioquímica y Biología
Molecular de la Universidad de Granada, en colaboración con el Departamento
de Neurobiología de la Universidad de Saarland (Homburg-Saar, Alemania), y
los objetivos que se planificaron para su ejecución fueron:
Resúmen16
A. Estudiar la relación entre colesterol y la EA:
1) Modulación ejercida por los AGPIs omega-3 de la dieta sobre los niveles de
colesterol y la patología de la EA en un modelo animal de la EA.
2) Influencia de parámetros como la edad y/o el género en los niveles de
colesterol en diferentes modelos animales de la EA.
B. Demostrar el efecto neuroprotector de DOPET en sistemas in vitro e in vivo.
3. Efecto neuroprotector de DOPET in vitro.
4. Efecto neuroprotector de DOPET in vivo.
5. Relación de DOPET y el colesterol.
6. Influencia de DOPET sobre la actividad MAO, implicada en la EP.
Resúmen 17
A continuación se recogen los resultados obtenidos.
Estudios en modelos animales de la EA.
Estudios con dietas enriquecidas en AGPIs omega-3 en un modelo
transgénico simple PPA de la EA.
Algunos autores han demostrado la capacidad de los AGPIs omega-3 para
inducir una reducción en los niveles de colesterol y suprimir la inflamación, lo
que ha permitido establecer una conexión directa con el retraso en el inicio del
desarrollo de patologías como la EA y la EP.
Se decidió evaluar el efecto de una dieta compuesta por EPA:ADH en un modelo
animal de ratón transgénico simple PPA.
En cuanto al análisis del perfil lipídico, se obtuvo una reducción significativa en
el nivel de Ácido Araquidónico (AA) tanto en plasma como en cerebro en el
grupo omega-3 con respecto al grupo control, revelando así la efectividad de la
dieta omega-3 sobre la composición lipídica de las membranas. La reducción en
el contenido en ácidos grasos omega-6 favorece la actuación de los omega-3. El
incremento significativo de ADH en cerebro y la ausencia de alteración en
plasma, apoyan la hipótesis de la sustitución de los omega-6 por omega-3 en las
membranas cerebrales como consecuencia de la dieta.
Se obtuvo una disminución en los niveles de colesterol en cerebro en el grupo
omega-3 con respecto al grupo control, mientras que solamente las hembras
transgénicas alimentadas con omega-3 experimentaron un descenso en los
niveles de colesterol plasmático.
Dada la descrita mayor susceptibilidad de las hembras a padecer la EA y la
relación entre colesterol y esta patología, estos resultados podrían considerarse
beneficiosos para la aplicación de los AGPIs omega-3 en este modelo animal, ya
que mejora la composición lipídica y disminuye la concentración de colesterol a
nivel cerebral, reduciendo el riesgo de formación de depósitos A .
En cuanto al análisis de los niveles de A -40 en cerebro, no se obtuvieron
diferencias significativas entre ambos grupos, probablemente porque el grupo
Resúmen18
no alcanzó los 6 meses de edad apropiados para el desarrollo completo de la
patología. Sin embargo, se obtuvo una tendencia en el grupo de hembras
alimentadas con omega-3 a la reducción en los niveles de amiloide cerebral.
Si los cambios de colesterol en plasma alteran al metabolismo de los esteroles en
el SNC o afectan la función cognitiva del cerebro o la incidencia de demencia, es
algo que permanece aún por esclarecer.
Estudios en ratones mutantes KOZACK-colesterol 16.
Se obtuvieron diferencias entre ambos géneros, tanto en la acumulación de
depósitos de amiloide como en los niveles de colesterol sérico. La correlación
entre A y colesterol resultó negativa para las hembras y positiva para los
machos, aunque no resultaron de significación estadística, por lo que
establecemos una tendencia a ser negativa o positiva en cada caso. Tanto los
cortes inmunohistoquímicos y los Western blot frente a PPA y A evidenciaron
la mayor expresión de la patología en el grupo de las hembras frente al grupo de
los machos, las cuales mostraron menores niveles de colesterol en suero, que
refuerza la tendencia a que la correlación sea negativa.
Estudios en modelo de ratón transgénico doble PPA/PS1 de la EA.
Se han realizado numerosos estudios para elucidar la relación entre el contenido
en colesterol plasmático y la generación de A , aunque la correlación aún no se
ha establecido de manera definitiva. En el presente estudio se analizó la relación
existente entre ambos parámetros durante el envejecimiento normal en ratones
dobles transgénicos PPA/PS1, que expresan ambas proteínas humanas mutantes
(PPA y PS1) y ratones control no transgénicos, todos hembras y a tres tiempos
(3, 8 y 13 meses de edad).
Se obtuvo una marcada reducción en los niveles de colesterol plasmático entre
los grupos de transgénicos de 3 y 13 meses, mientras que en los no transgénicos
permaneció invariable conforme avanzaba la edad, lo que permite apreciar la
influencia del genotipo y la edad sobre los niveles de colesterol. Aunque se ha
Resúmen 19
descrito que los niveles cerebrales de esteroles, incluyendo colesterol y sus
precursores, no sufren modificaciones entre ratones transgénicos PPA y no
transgénicos durante el envejecimiento, en realidad se conoce muy poco sobre
los niveles plasmáticos de colesterol, y en nuestro grupo se obtuvo una
diferencia significativa entre los animales de 13 meses transgénicos y controles
de la misma edad, lo que refuerza la influencia del genotipo sobre el
metabolismo del colesterol.
Se obtuvo un incremento dramático en los niveles de A (variantes 40 y 42) en
los transgénicos de 8 y 13 meses, en comparación con el grupo de jóvenes
transgénicos. La correlación entre el los niveles de A en cerebro y el contenido
de colesterol en plasma resultó significativamente negativa en nuestro modelo.
Mientras que en los estudios realizados por otros autores se modifican los
niveles de colesterol de manera artificial (ej.: dieta hipercolesterolémica,
estatinas), en nuestro estudio los animales no recibieron ningún tipo de
tratamiento o dieta especial con semejante finalidad.
Algunos estudios clínicos en pacientes de la EA apoyan una correlación positiva
mientras que otros describen una relación negativa entre ambos parámetros. Así
mismo, se han realizado estudios en animales en los que ratones alimentados con
dietas enriquecidas en colesterol o tratados con inhibidores de la síntesis del
colesterol, que soportan bien una relación negativa como la observada en nuestro
estudio o una relación positiva.
La comparación de todos estos estudios entre sí y con el nuestro es de relativa
validez, en base tanto a las diferencias de edad para los animales utilizados en
cada caso, lo que supondría diferencias en los niveles hormonales, como a la
ausencia de tratamiento en nuestro estudio, pero sigue manteniendo la duda
acerca de la relación entre colesterol en sangre y amiloide en cerebro.
Resúmen20
Estudios con DOPET.
Se realizó un screening entre numerosos extractos naturales y compuestos
polifenólicos, con objeto de seleccionar aquéllos con capacidad antioxidante y
para pasar al cerebro.
Compuestos Positivos (antioxidantes que cruzan BHE) Extractos naturales:
Hoja de olivo; esencia de tomillo ( 500µL/ratón);
Aceite de pepita uva (500µL/ratón, comercial)
Polifenoles:
Timol (Sigma, 10mg/ratón disuelto en aceite virgen);
Carvacrol (Sigma, 20mg/ratón en aceite girasol; muy tóxico); Ácido homovanílico;
Ácido hidroxibenzoico; Ácido siríngico, 2-(3,4-dihidroxifenil)-etanol
Tabla 1: Compuestos naturales positivos tras el análisis por HPLC-ABTS.
Listado de los extractos naturales y polifenoles que tras ser administrados a los
animales demostraron cruzar la BHE y presentar capacidad antioxidante. = 254 nm
y 734 nm.
De todos los compuestos positivos para ambas capacidades, se eligió DOPET por
la descrita actividad antioxidante, por cruzar la barrera hematoencefálica, de
manera rápida y eficaz, y su permanencia en cerebro durante 1 h
aproximadamente. Así mismo, el hecho de ser un componente del aceite de oliva
y la importancia de éste en la dieta Mediterránea, nos hizo escogerlo para
estudios de neuroprotección.
El Departamento de Química de Puleva Biotech, S.A., realizó la síntesis de
DOPET para su utilización en todos los estudios.
Resúmen 21
Figura 1.: Cromatograma de DOPET obtenidos por HPLC-ABTS. El análisis
de DOPET por HPLC-ABTS confirmó la capacidad antioxidante del compuesto
comparado con Vitamina C. El pico obtenido a 6,3 min corresponde a 10 µg de DOPET.
Tiempo de análisis=60 min, utilizando PDA a 280 nm.
Estudios de antioxidación.
Los radicales libres son mediadores del daño oxidativo en enfermedades
neurodegenerativas y uno de los marcadores utilizados para determinar este
tipo de daño es el Malondialdehido (MDA).
En un primer estudio in vitro se determinó mediante ensayo colorimétrico la
capacidad de DOPET para reducir la producción de sustancias reactivas de ácido
tiobarbitúrico (SRAT), marcador de lipoperoxidación. Los ensayos realizados con
DOPET revelaron su efectividad antioxidante frente al daño oxidativo provocado
a las membranas cerebrales de rata.
Por tanto, se pasó a realizar un estudio en ratones alimentados con dietas
enriquecidas con colesterol y suplementadas con DOPET en el agua de bebida
durante 30 días. El grupo que recibió el compuesto redujo de manera significativa
sus niveles plasmáticos de MDA determinados mediante HPLC-FLD.
Resúmen22
Finalmente, se determinó la actividad Catalasa, enzima capaz de evitar el daño
oxidativo a las membranas, en el cerebro de conejos de un modelo de
aterogénesis creado mediante manipulación dietaria y suplementados con
DOPET. Se establecieron 7 grupos: dieta control (30 y 60 días), dieta
aterogénica (30 y 60 días), dieta aterogénica más DOPET (30 días) y los 30 días
siguientes con dieta control y dieta aterogénica durante 1 mes y el siguiente mes
con dieta control. Sin embargo, no se obtuvieron diferencias estadísticamente
significativas entre ninguno de los grupos.
En definitiva, estos resultados confirmaron la capacidad antioxidante del
compuesto tanto in vitro como in vivo, protegiendo a las membranas cerebrales
del daño oxidativo que supone la peroxidación lipídica.
Estudios de neuroprotección.
Basándonos en la capacidad antioxidante descrita para DOPET decidimos
determinar su potencial neuroprotector en una serie de ensayos in vitro e in
vivo.
Utilizando diferentes concentraciones de DOPET en cultivos de células C6 y
células neuronales de hipocampo incubadas frente a diversos agentes oxidantes
(H2O2, glutamato, péptido A 22-35) se confirmó la protección del compuesto a
concentraciones inferiores a 100 µM, por encima de la cual el preparado
induciría muerte celular.
Para verificar que la neurotoxicidad inducida por DOPET a concentraciones de
100 µM, se llevó a cabo el ensayo COMET, basado en la irradiación de un cultivo
celular con UV-C, generadora del daño en el material genético responsable de
mutaciones y muerte por apoptosis. Se confirmó que la concentración empleada
de DOPET no protegía del daño ocasionado por la irradiación en estas células.
Resúmen 23
Microarrays en cerebro e hígado de ratones sondados con DOPET.
Se ha descrito la capacidad de los compuestos fenólicos de la dieta para prevenir
respuestas celulares como la apoptosis y la diferenciación por activación de una
cascada de eventos moleculares. Por el interés creciente sobre la mejora de la
eficacia de estos compuestos antioxidantes sobre dianas terapéuticas, se decidió
realizar un estudio genómico sobre la influencia de dos concentraciones
diferentes de DOPET en hígado y cerebro de ratón.
Se seleccionaron todos los genes que resultaron de interés para esta Memoria, y
entre todos ellos se escogieron dos genes: el gen de la Esterol-C5-desaturasa
(reprimido en hígado de ratón por 10 mg de DOPET) y el gen de la Mielina
(sobreexpresado en hígado de ratón por 10 mg de DOPET).
Modelo de excitotoxicidad con kainato: laberinto acuático de Morris.
Uno de los rasgos más característicos y devastadores de la EA es la afectación
de la memoria, asociada fundamentalmente a la región cerebral denominada
hipocampo. El laberinto acuático de Morris (LAM) es una técnica muy efectiva
para la evaluación del proceso conocido como “empeoramiento de la memoria”,
consistente en una prueba realizada en una piscina para la evaluación de la
capacidad de aprendizaje y memorización de los animales. Se han descrito
diferencias significativas en base al fondo genético de cada raza de ratón que se
utilizan normalmente para evaluar el neurocomportamiento. Aunque está
descrita la mayor sensibilidad de la raza Balb/c frente al estrés provocado por
pruebas como el LAM, se decidió poner a punto un protocolo de afectación
hipocampal mediante la inyección intraperitoneal de ácido kaínico (AK), con
objeto de crear un modelo animal sobre el que determinar si DOPET era capaz
de prevenir la pérdida de memoria y /o de mejorar el daño provocado por AK
en una raza tan vulnerable como Balb/c.
El modelo funcionó porque no solamente se consiguió generar un déficit de
memoria en los animales que recibieron AK, sino que aquéllos ratones que
Resúmen24
recibieron DOPET junto con la toxina lograron ejecutar el LAM correctamente y
de igual manera que los controles.
0
10
20
30
40
50
60
70
80
90
0 1 2 3 4 5 6 7
Tiempo (días)
Tie
mp
o la
ten
cia
(seg
)
CONTROL
A K
DOPET
DOPET+A K
Figura 2.: Representación del aprendizaje de todos los grupos de
animales en el Laberinto acuático de Morris. Se muestran los valores medios
del tiempo de latencia (segundos en alcanzar la plataforma) en cada grupo durante
los 7 días del estudio. Se observan diferencias significativas entre el grupo control y
AK (P<0,001), así como entre el grupo con toxina (AK) y el grupo DOPET+AK
(P<0,05). No hubo diferencias entre el grupo DOPET y el grupo DOPET+AK.
Efecto de DOPET en un modelo animal de Esclerosis Múltiple (EM).
La EM es una enfermedad desmielinizante crónica del SNC y es la mayor causa de
disfunción neurológica traumática en los adultos jóvenes. Las lesiones se
caracterizan por infiltraciones de linfocitos y macrófagos fundamentalmente, así
como por varios grados de pérdida axonal y desmielinización.
Resúmen 25
Se eligió un modelo animal de la EM, denominado EAE (Encefalitis Autoinmune
Experimental), por tratarse de un reconocido modelo animal con signos clínicos y
lesiones que asemejan los observados en la EM, con objeto de estudiar el efecto de
DOPET sobre los brotes de la enfermedad. Se analizó el efecto sobre el
neurocomportamiento y la progresión de la enfermedad de los animales. Los
resultados se basaron en la medición diaria de los scores de cada animal en cada
uno de los grupos (control y DOPET). Los datos recogidos muestran una mejora
significativa en la incidencia como en la gravedad de los brotes diarios en el grupo
que recibió agua con DOPET.
0
0,5
1
1,5
2
2,5
7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21
22 23
24 25
26
28
Tratamiento (días)
Scor
e ac
um
ula
do
DOPET
Control
Figura 3.: Representación del score diario para cada grupo a lo largo
del estudio. La diferencia obtenida para el grupo DOPET con respecto al control
presentó significación estadística (P= 0,06).
En definitiva, la información obtenida puede ser de gran interés para el futuro
desarrollo de un tratamiento aplicado a la EM basado en las propiedades de un
antioxidante natural como DOPET.
Resúmen26
Estudios del metabolismo del colesterol.
El colesterol no esterificado es un componente estructural esencial de la
membrana plasmática de cada célula. El SNC en los humanos contiene unos 23
miligramos de colesterol por gramo de tejido a pesar de suponer el 2,1% del
peso corporal. En todos los animales, la mayoría del proceso de crecimiento y
diferenciación del SNC tiene lugar durante los primeros años de vida, y el
colesterol necesario para ello proviene casi exclusivamente de síntesis de novo.
Algunos autores han descrito una relación directa entre los niveles plasmáticos
de colesterol y la incidencia de demencia, incluyendo la EA. El tratamiento con
agentes farmacéuticos que reducen la concentración del colesterol plasmático
parece asociarse con una menor incidencia de tales demencias. Sin embargo
hay que enfatizar que la mayoría de estas asociaciones no han sido verificadas.
Por tanto, de confirmarse la relación entre ambos parámetros, las lipoproteínas
transportadoras de colesterol contribuirían de manera muy destacada en el
contendio de colesterol del cerebro y la médula espinal, afectando directa o
indirectamente al procesado de proteínas como la proteína precursora del
amiloide (PPA) o los receptores de neurotransmisores.
Algunos estudios previos apoyan la capacidad de DOPET para inhibir la
peroxidación provocada por la oxidación de las lipoproteínas de baja densidad
(LBD), por lo que desarrollamos una serie de ensayos in vitro e in vivo para
determinar su capacidad hipocolesterolemiante.
Estudios sobre LC5D
Los resultados obtenidos en los Microarrays realizados con el compuesto,
revelaron la capacidad de DOPET para reprimir el gen de la Esterol-C5
desaturasa en hígado, por lo que decidimos estudiar la enzima Latosterol–C5
desaturasa. Se trata de una enzima implicada en el metabolismo del colesterol,
mediando la transformación de latosterol en 7-Dehidrocolesterol, precursor del
colesterol. La inhibición de esta enzima podría resultar de interés para evitar
un incremento en los niveles de colesterol.
Resúmen 27
Se determinó la IC50 de DOPET para la LC5D y se obtuvo un valor igual a 187
µM, lo que indicaba que era capaz de inhibir a la enzima. Estos datos
concordaban con los resultados obtenidos en el análisis de la influencia sobre la
expresión génica, en los que la dosis más alta (10 mg) era la más efectiva en la
inhibición de este gen.
Para concluir el estudio bioquímico de esta enzima, se determinó su Km
mediante HPLC frente a diferentes concentraciones de sustrato (latosterol). Se
obtuvo un valor de Km igual a 157,3 µM.
Efecto de diferentes dietas en el cerebro de conejos.
Se estableció un modelo de aterogenia en conejo mediante manipulación
dietaria, para analizar el efecto de dietas suplementadas con DOPET en un total
de 56 conejos, divididos en 7 grupos de 8 animales cada uno, alimentados con
dietas controles y aterogénicas a dos tiempos, 30 y 60 días. Se determinaron una
serie de parámetros bioquímicos relacionados con el metabolismo del colesterol
plasmático y cerebral. En los grupos suplementados con DOPET se obtuvo una
mejora en el perfil lipídico plasmático, mediante una reducción en el colesterol
total y LAD-colesterol (P<0,05) tras 60 días de tratamiento. Así mismo, se
observó una reducción de los triglicéridos plasmáticos en el grupo DOPET con
respecto al resto de los grupos. Por tanto, la relación colesterol:LAD se redujo en
el grupo DOPET. Aunque no hubo diferencias en el contenido de colesterol
cerebral, probablemente a causa de la corta duración del estudio (2 meses) en
relación a la vida media de este esterol en cerebro (6 meses). Sin embargo, el
grupo DOPET (1 y 2 meses) experimentó una reducción en el contenido de
latosterol cerebral, de menor vida media que el colesterol en cerebro.
Resúmen28
Efectos de DOPET sobre la captación de dopamina y norepinefrina en
células PC12.
En base a la similitud molecular de DOPET (C8O3H10) con la Dopamina
(C8H11NO2), se planteó un estudio para determinar si el compuesto era capaz de
actuar sobre el metabolismo de las catecolaminas o incluso ser reconocido por
los transportadores de estas aminas, que suponen una diana terapéutica en la
investigación frente a la EP.
El presente estudio se realizó en colaboración con la Dra. S. Hilfiker (Universidad
de Manchester, Inglaterra). Se diseñó para probar los efectos de DOPET en la
captación y liberación de dopamina (DA) desde las células PC12. Se trata de un
modelo catecolaminérgico muy útil, poseedor de todas las proteínas relevantes
para el transporte y metabolismo de DA y NE, y una herramienta excelente para
elucidar los efectos de compuestos noveles sobre la captación, secreción y
degradación de monoaminas.
Se determinó la capacidad de actuación del compuesto a nivel del transportador
de DA (TDA) y del transportador de norepinefrina (TNE). Así mismo, se evaluó su
actuación sobre una de las enzimas responsables de la eliminación intracelular de
DA, como es la Monoamino oxidasa (MAO). El hecho de obtener un efecto de este
compuesto sobre las posibles vías de retirada de DA, podría ser de utilidad
terapéutica en patologías como la EP.
Los resultados obtenidos en los ensayos realizados demuestran que DOPET es un
compuesto potente incrementado las cantidades tanto de DA como de NE
intracelulares. Los efectos de DOPET sobre el consumo de DA podrían estar
mediados por un efecto del compuesto sobre TNE, que también transporta DA.
Los resultados de este estudio indican que DOPET podría actuar modulando al
TNE, lugar de acción de un rango de drogas con potencial terapéutico. Bajo
condiciones patológicas, el TNE podría actuar en la progresión de enfermedades
como el fallo cardiaco, asociado con la reducción en la función y densidad de
TNE. Una intervención dirigida a la mejora de TNE en esta patología cursaría con
efectos beneficiosos. El esquema del modo de actuación propuesto para DOPET
sería el siguiente:
Resúmen 29
Figura 3.: Mecanismo de acción de DOPET en células PC12. DOPET
activaría al transportador TNE, responsable de la captación de NE y DA en la célula
para su posterior incorporación en vesículas. No se ha demostrado este mecanismo a
través de la activación de TDA. DBH= Dopamina-beta-hidroxilasa
En base a la hipótesis propuesta como mecanismo de acción (Figura 3), en la
que DOPET podría facilitar la internalización de DA, previniendo de la
degradación de la misma mediante la acción de la MAO, y apoyados por los
estudios que confirman la efectividad de algunos compuestos fenólicos como
inhibidores de MAO, se analizó la capacidad de DOPET como inhibidor de la
MAO-B en mitocondrias aisladas de cerebro de rata.
Los resultados determinaron que se trataba de un compuesto con un elevado
potencial inhibidor sobre la actividad MAO-B en cerebro (IC50 = 16,3).
NE + DA DA Extacelular
TNE TDA
Intracelular
+
DOPET NE + DA
+
DOPET
vesículas
?
DOPET
MAODOPAL
APOPTOSIS
DOPET
DA HVACOMT
NE
-
DBHNE DA
Resúmen30
Finalmente, y a modo de conclusión global de esta Memoria, se han compilado
los principales hallazgos relacionados con DOPET y los AGPIs omega-3 de la
dieta utilizados en los diferentes sistemas in vitro e in vivo:
1) En relación a los efectos de los AGPIs omega-3, aplicados en un modelo
animal de la EA, se demuestra su capacidad para mejora el perfil lipídico de los
ratones transgénicos simples PPA. Se obtuvo una reducción significativa en los
niveles de colesterol y AA (omega-6) en plasma y cerebro, así como un
incremento en ADH (omega-3) en cerebro. Así mismo, se observó una diferencia
significativa entre dietas, géneros y entre genotipos, revelando que los animales
alimentados con dieta omega-3 experimentaron los cambios más notables en su
perfil lipídico, y concretamente las hembras transgénicas alimentadas con dieta
omega-3 fueron las que más positivamente se vieron afectadas. Además, en este
grupo de hembras se obtuvo una tendencia a la reducción en los niveles de A -
40 cerebral, lo que apunta que la dieta omega-3 podría haber resultado
beneficiosa para la patología de haberse completado los 6 meses de edad
(adecuados para el pleno desarrollo de la enfermedad).
2) En los estudios realizados con DOPET, se ha demostrado su capacidad para
ejercer neuroprotección tanto en sistemas in vitro como in vivo.
a. Por su capacidad para atravesar la BHE.
b. Por su efecto antioxidante en células C6 y neuronas de hipocampo
sometidas a diferentes agentes oxidantes, así como por su capacidad para
reducir los niveles de peroxidación lipídica in vitro e in vivo.
c. Por su capacidad para mejorar la incidencia de los brotes en un animal de
EAE, con una tendencia a ser un beneficio significativo.
d. Por su capacidad para inhibir el metabolismo del colesterol, inhibiendo a la
LC5D. Así mismo ha demostrado reducir los niveles de colesterol en plasma y de
latosterol en cerebro de conejos.
e. Por su capacidad para inhibir a la MAO in vitro e in vivo.
SUMMARY
Summary 32
Neurodegenerative disorders as Alzheimer’s disease (AD), Parkinson’s disease
(PD) and Multiple Sclerosis (MS) have a multifactorial origin, attending with
toxic and inflammatory reactions, glutamatergic neurotoxicity and increment
on the iron and nitric oxide levels, scavenging of the endogenous antioxidants,
reduction in trophic factors and loss of neurons, among other events. They are
some of the most devastating pathologies with a highest cost in the current
society.
The multifactorial origin of these diseases may explain why the limited number
of clinical neuroprotective therapies using single drugs, failed to show
significant results. Thus, the fundamental objective in neurodegeneration and
neuroprotection research is to determine which of these factors constitute the
primary event, the sequence in which they occur and whether they act in
concordance with the pathogenic process.
The neuroprotective mechanisms could be confronted with dietary skills, which
is the main purpose of this Memory, based on the application of
polyunsaturated fatty acids omega-3 (PUFAs omega-3) and a polyphenolic
compound as 2-(3,4-dihydroxyphenyl)-ethanol (DOPET) on in vitro and in vivo
systems related with neurodegenerative disorders as AD, PD and MS. Some
markers of these diseases, as well as some oxidation and lipidic parameters will
be analyzed. The intense investigations on the mechanisms why neurons die
have led to the belief that the therapeutic use of antioxidants could be of help in
these pathologies.
Summary 33
CHOLESTEROL
The brain is the organ with the highest amount of cholesterol (20 mg/g tissue)
in the human organism. One of the reasons to explain why the disorders
affecting the Central Nervous System (CNS) are relatively insensitive to serum
cholesterol levels, could be based on the independent regulation of the
cholesterol metabolism in the CNS in comparison with the levels in the
periphery.
One of the most prevalent risk factors for AD is the Apolipoprotein (Apo E4),
which is an isoenzyme of the cholesterol transport protein called Apo E present
in brain and also in periphery. Many enzymes are implied in cholesterol
metabolism, connected putatively with the late-onset of AD, as cholesterol-24-
hydroxilase associated to cytochrome P450, which is implied in cholesterol
oxidation to 24(S)-hydroxycholesterol.
The cholesterol and saturated fats consumption is associated with a higher risk
to develop dementia, while fish ingestion is related with lower risk and
protection against this process (Kalmijn et al., 1997). The total serum
cholesterol and LDL-cholesterol levels are significantly elevated in AD patients
in comparison with non-demented people, and related with the Apo E4 status.
The brain cholesterol levels in the frontal cortex were also elevated in those AD
patients (Notkola et al., 1998).
The cholesterol from diet is able to affect the brain cholesterol metabolism,
accelerating the brain aging as a consequence of the increase in the brain
cholesterol levels and a higher oxidative stress. The brain membranes of AD
patients show more phospholipids degradation than a normal aged brain,
reduced cholesterol:phospholipid ratio and narrower membranes. The
increment in the cholesterol amount could act as a defensive mechanism of the
cell to protect the membranes form the oxidative damage.
Cholesterol is a weak antioxidant and stabilizing agent of the membrane
structure. It has been suggested the role of cholesterol protecting cells from the
oxyradical attack besides melatonin, ascorbic acid, ubiquinol, vitamin E,
glutation and PUFAs. When this system is under stress and has deficits,
Summary 34
cholesterol is oxidized and interchanged with the exogenous reservoir. So then,
when the oxidative stress is high enough, the mitochondrial and microsomal
cholesterol levels are reduced and the membrane fluidity in the brain synapses
used to increase (Huertas et al., 1992; Wood et al., 1995).
There are epidemiologic, biochemical and genetical evidences to relate
cholesterol and AD. The brain APP metabolites could be modulated by the
cholesterol from diet in presence of Apo E. Cholesterol is able to increase
cellular APP levels and to reduce the metabolism and release of -APPs as well
as to favor the amyloidogenic production and deposition. Cholesterol is one of
the most abundant steroids in human beings and it is produced by a
multicascade which begins with -hydroxy- -metylglutaril CoA (HMG-CoA)
synthase and HMG-CoA reductase. The last enzyme is one of the targets for
cholesterol-lowering drugs (statins) and its effectiveness against AD is still a
controversial theme. In AD, the direct link between alterations in cholesterol
metabolism and other membrane lipids still remains uncertain.
Summary 35
DOPET
Olive oil is an important component of the Mediterranean diet and is
recognized as a source of the so-called “functional food” because of the
natural phenolic antioxidant content. It has a unique composition, with a 56-
84% oleic acid and a 3-21% linoleic acid. Some research attributes a modest
but direct effect to monounsaturated fats on the reduction of the cholesterol
levels and replacing carbohydrates in the caloric profile.
Among the biological activities attributed to phenols in olive oil we found the
inhibition of LDL oxidation, in vitro and ex vivo, the inhibition of the
apoprotein derivatization and platelet aggregation, the reduction of
tromboxan B2 and leucotrien B4 produced by activated human leukocytes,
scavenging of reactive oxygen species and the inhibition of DNA damage and
nitration induced by activated tyrosine peroxinitrite.
The structure of the polyphenols, containing an aromatic ring with hydroxyl
radicals is especially convenient to work as an antioxidant (donator of
hydrogen or electrons, or scavenging free radicals).
The capacity of phenols as metal chelators, specially iron and copper, let
them operate as antioxidants trough the inhibition of the formation of free
radicals catalyzed by the metals. Some of these compounds are simple
phenols, flavonoids or secoiridoids. Oleuropein is the main bitter secoiridoid
which is eliminated from olives to makes them eatable, and its hydrolytic
derivatives as DOPET, oleuropein aglycans and oleo-11-methyl ester are the
main components in the olive pulp. Tyrosol and phenol acids as vanillic and
cafeic acid are some other quantitative important compounds. All of these
phenols are implied in the prevention of the lipid peroxidation products, as
isoprostanes, malondialdehyde (MDA) and lipoperoxides, whose levels are
close to the basal one. These phenols also modulate the thrombo formation
and inflammation, the host defense against parasitic infection and they have
antimutagenic, anticarcinogenic and antiglicemic properties.
DOPET is the main o-diphenol detectable in extra virgin olive oil, in free and
sterified form with elenolic acid to produce oleuropein aglycan.
Summary 36
Some of the biological activities related to DOPET are the prevention of
Lipoprotein Low Density (LDL) oxidation, platelet aggregation and 5- and 12-
lipooxigenase inhibition, reduction of the cytotoxic effects caused by MDA
formation in some human cell systems, antiproliferative effect and capacity to
permeabilize the human intestine cells.
One of the mechanisms proposed for the effectiveness of the polyphenols may
involve its catechol-like structure, known to confer protection against a variety
of neurotoxic products.
Thirty years ago it was discover that coronary diseases in Eskimos was lower
than in other population due to the consumption of seal fat, whale and fish, all
of them rich in Eicosapentaeonic and Docosahexaeonic acids (EPA and DHA
respectively). The researchers also saw a reduction in the serum cholesterol and
triglycerides levels by the PUFAs omega-3 consumption, an effect that has been
seen some years later in Rhesus monkeys.
Fatty acids are essential components of the human diet, implied in growth and
reproduction. They are associated with much pathology as the cardiovascular
disorder. The nervous system shows the highest lipid content after adipose
tissue. Between the 50 to 60 % of the dry weight in an adult brain are lipids,
where 35% of them are represented by PUFAs and among them phospholipids
are the quantitatively more significant components in the lipid membranes.
Dietary fatty acids are therefore important for the adult and aged brain.
PUFAs are further subdivided in omega-3 and omega-6 groups. Most of the
beneficial effects are attributed to omega-3 but not to omega-6, although a
correct balance between both type of PUFAs is needed for the normal
development and maintenance of the organism, which has been estimated in 6:1
(omega-6:omega-3) for an healthy adult.
PUFAs are putative modulators of neurotransmission in the brain and in the
hypothalamic-pituitary-adrenal axis, controlling the gene expression in
lipogenic tissues, liver and the immune system. This property has direct effects
on cognition and physiological processes, and reveals its anti-inflammatory
capacity (Mori and Beilin, 2004).
Summary 37
Quantitative in vivo studies demonstrated that approximately 5% of brain DHA
and arachidonic acid (AA) are metabolized and replaced by dietary fatty acids
through the blood circulation.
The principal mechanism of cardio- and neuroprotective actions of omega-3
fatty acids could be mediated by the suppression of Alfa-Tumoral Necrosis
Factor and Interleukin-10 synthesis and release, through the modulation of the
anti-inflammatory responses from the hypothalamic-pituitary-adrenal axis and
by an increase in Acetylcholine release. This might explain why and how these
fatty acids could be beneficial in AD, PD, inflammatory diseases, diabetes
mellitus, hypertension, septicemia and atherosclerosis.
The current Memory has been realized in the Biochemistry and Molecular
Biology Department (University of Granada, Spain) and the Department of
Biomedicine of Puleva Biotech S.A. (Granada, Spain), in collaboration with the
Neurobiology Department of the University of Saarland (Homburg-Saar,
Saarland, Germany) and the objectives planned were:
A. To study the relationship between cholesterol and AD:
1) Role of a diet enriched in PUFAs omega-3 on cholesterol and AD pathology
in an AD animal model.
2) Influence of age and/or gender on cholesterol levels on some AD animal
models.
B. To demonstrate the neuroprotector effect exerts by DOPET on in vitro and
in vivo systems.
3. Neuroprotection of DOPET in vitro.
4. Neuroprotection of DOPET in vivo.
5. Relation between DOPET and cholesterol levels.
6. Influence of DOPET on MAO activity, implies in PD.
The results obtained in this Memory are summarized hereafter.
Summary 38
Studies in animal models.
Studies with diet enriched with omega-3 PUFAs in a simple APP
transgenic mouse model of AD.
Some authors have demonstrated that omega-3 PUFAs were able to reduce
cholesterol levels and suppress inflammation. This property has permitted to
establish a direct link with the delay in the onset of AD and PD.
A diet enriched with EPA: DHA was tested in a simple APP transgenic mouse
model.
The biochemical analysis of lipid profile showed a significant reduction in
plasma and brain AA levels in omega-3 group compared to the control group.
These results reveal the effectiveness of the diet to alter the lipid membrane
composition in brain. A decrease in omega-6 fatty acids in the membranes
propitiates the actuation of omega-3 PUFAs. The fact that brain DHA levels were
significantly increased and the absence of changes in DHA plasma levels,
support the idea that omega-6 could be substituted by omega-3 PUFAs in brain
membranes as a consequence of the omega-3 enriched diet.
The brain cholesterol levels resulted reduced in omega-3 group, while the plasma
cholesterol levels decreased only in the female transgenic mice fed with omega-3
enriched diet.
Regarding the brain A -40 levels quantification we could not find any significant
difference among the groups, most probably because the animals could not get 6
months of age to develop the disease properly. However, we could find a
tendency to reduce the amyloid brain levels in the female mice feeding with
omega-3 diet. The question that remains is whether the changes in plasma
cholesterol levels modify the sterol metabolism in CNS or whether they affect the
cognitive function or the incidence of dementia.
Summary 39
Studies in AD mutant mice KOZACK-cholesterol 16.
After the last study, we continue with the analysis of the relationship between
serum cholesterol levels and brain amyloid levels.
We get some gender differences in brain A and serum cholesterol levels. The
correlation between both parameters was negative in female mice while it
was positive in male group, although this relation was not statistically
significant. We could suggest a negative tendency for females or positive
tendency for males animals. The inmunohystochemistry and Western blot to
determine APP and A evidenced the higher expression of the pathological
markers in female animals against males, which paradoxically showed the
lowest serum cholesterol levels. This point supports the negative tendency in
this group.
Studies in AD double transgenic mice model APP/PS1.
There are many studies that analyze the relationship between cholesterol
levels and A , although this relation still remains unclear. In the present
study we tried to elucidate the link between plasma cholesterol and brain A
levels throughout the normal aging in a transgenic mouse model expressing
both mutant human amyloid precursor protein and mutant human
presenilin-1 during normal aging, PPA/PS1, and wild-type mice, all of them
female grouping by age (3, 8 and 13 months).
Measurements of plasma cholesterol levels revealed a significant reduction in
aged transgenic mice, whereas plasma levels in young and aged wild type
mice remained almost unchanged. We could appreciate the influence of
genotype and age on cholesterol levels. Although it has been described that
brain sterol levels are unchanged among transgenic and no transgenic mice,
we found a significant reduction between 13 months-old transgenic mice and
same age wild type mice. This result shows the genotype influence on
cholesterol metabolism.
Summary 40
As expected, brain A (40 and 42) levels increased significantly in the 8 and 13
months transgenic mice compared with mice 3 months old. Statistical analysis
revealed a significant negative correlation between plasma cholesterol and brain
A levels during aging in this model.
Whereas a couple of former studies report on the modulation of cholesterol
levels, using either high-cholesterol diets or cholesterol-lowering drugs, we tried
to elucidate the relationship between plasma cholesterol and brain A during
normal aging, by measuring plasma cholesterol content and brain A -42 levels
in untreated APP/PS1 transgenic and age- and sex-matched wild type control
mice.
Clinical studies in AD patients support either a positive or a negative correlation
among both parameters. There are feeding studies in mice with diet enriched in
cholesterol and mice treated with cholesterol-synthesis inhibitors which showed
a positive or a negative correlation like our study. The comparison of all of these
studies with our experiment has relative validity, because of the age differences
among animals used which implies hormonal variances. Another factor to
consider is the absence of treatment in the current study.
Summary 41
Studies realized with DOPET.
After the absence of effect of PUFAs omega-3 on the pathological markers of
an AD model, except for the modifications in the lipid profile, we decided to
search for a natural compound which could cross the blood brain barrier
and with antioxidant properties, to study its neuroprotector potential.
We analyzed the antioxidant capacity of a huge amount of natural
compounds, based on the HPLC-ABTS method to know it in comparison
with the chromatogram obtained for the ABTS cation. The positive
copmpouds we selected were:
Positive compounds (antioxidants which cross the BBB) Natural extracts:
Olive leaf; thymus essence (500µL/mouse);
Oil of grapped nugget (500µL/mouse, commercial)
Poliphenols:
Tymol (Sigma, 10mg/Mouse; dissolved in oil);
Carvacrol (Sigma, 20mg/Mouse dissolved in oil; highly toxic);Homovanillic
acid; Hidroxybenzoic acid; Siringic acid, 2-(3,4-dihidroxyphenil)-ethanol
Table 1: Natural compounds which crossed the BBB and with
antioxidant properties. Animals were oral-gavaged with some natural extracts
and polyphenols to test their capacity to cross the BBB and their power as
antioxidants. = 254 nm y 734 nm.
From all positives compounds abovementioned, we decided to select 2-(3,4-
dihidroxyphenil)-ethanol because is one of the major antioxidants included
in olive oil which has a relevant role in the Mediterranean diet and in the
current society.
The Department of Chemistry of Puleva Biotech, S.A. made the compound
through a synthetic way to use it in the rest of experiments.
Summary 42
It was demonstrated the ability of DOPET to cross the BBB, in a fast way which
let it be inside the brain during 1 hour. The antioxidant power was analyzed by
HPLC-ABTS and the linear regression model was determined by HPLC.
Figure 1.: Chromatogram obtained of DOPET by HPLC-ABTS. Comparison
among DOPET and Vitamin C to demonstrate the antioxidant capacity of our
compound.The retention time was 6,3 minutes to 10 µL DOPET (1 g/L), corresponding
to 10 µg of the compound. Analysis time= 60 min., using PDA (280 nm).
Summary 43
Antioxidation and DOPET.
Free radicals are mediators of oxidative damage in neurodegenerative
disorders and one marker of such damage is Malondialdehyde (MDA).
In a first in vitro study, the effect of DOPET on the thiobarbituric reactive
substances (TBARS) production was determined. TBARS are considered a
marker of lipoperoxidation. The assays realized with DOPET showed it as a
good antioxidant against oxidative damage in rat brain membranes.
After these results, DOPET showed to protect from lipid peroxidation, and
we made a study in mice fed during 30 days with a diet enriched with
cholesterol and supplemented with DOPET in drinking water. We found a
significant reduction in the plasma MDA levels of the group supplemented
with DOPET, determined by HPLC-FLD.
Finally, we analyzed the brains of the rabbits for the cholesterol study in this
Memory to analyze the effect of DOPET in diet on the catalase activity. These
animals were divided in 7 groups, feeding in a different way: control diet (30
and 60 days), aterogenic diet (30 and 60 days), aterogenic diet plus DOPET
(30 days), aterogenic diet plus DOPET 30 days and the next 30 days with
control diet plus DOPET and an aterogenic diet (30 days) and the next 30
days with control diet. The results did not show any effect of DOPET on the
catalase enzimatic activity.
Definitely, these results demonstrated the antioxidant capacity of DOPET in
vitro and in vivo, protecting brain membranes from oxidative damage
generated by lipid peroxidation.
Neuroprotection and DOPET.
Based on the antioxidant capacity of DOPET, we decided to determine the
neuroprotector power in some in vitro and in vivo assays.
We used different concentrations of DOPET in C6 cells and hippocampal
neurons culture tested with some oxidants (H2O2, glutamate, A 22-35 peptide).
Summary 44
It was confirmed the validity of this natural antioxidant under concentrations
of 100 µM, because over this concentration showed to induce cell death.
To confirm the neurotoxicity induced by DOPET at 100 µM, we develop an assay
so-called COMET, based in the UV-C irradiation of a cell culture to induce
damage and mutations to genes and a subsequent apoptosis.
Finally, this concentration of DOPET used was confirmed to be unable to protect
cells from DNA damage.
Microarrays in liver and brain of mice with DOPET oral-gavaged.
The ability of dietary phenols to prevent cell responses as apoptosis and
differentiation by activation of a molecular cascade has been described. There is
a growing interest around the improvement of antioxidant compounds to use
them on therapeutic targets. For this reason, we realized a microarray study to
know the influence of two concentrations of DOPET on mouse liver and mouse
brain gene expression.
From a large list of genes, we selected 2 genes from the whole outcomes: Sterol-
C5-desaturase (downregulated in liver by 10 mg of DOPET) and Myelin (up
regulated in liver by 10 mg of DOPET).
Model of excitotoxicity with kainic acid: Morris Water Maze.
One of the most characteristic features in AD is the memory impairment,
basically associated with the hippocampus. Morris Water Maze (MWM) is a
technique so useful to evaluate this process. Briefly, it is a test realized in a
swimming pool to check the learning and memory of the rodents. There are
some differences related with the genetic background of the strains used in
neurobehavioral tests. The strain more sensitive against stress evoked by MWM
is Balb/c, but we trained this strain in a study where they received kainic acid
(KA) by an intraperitoneal injection and DOPET by oral-gavage, to know if this
substance was able to avoid the memory impairment caused by KA and/or
improve the damage evoked by this neurotoxin.
Summary 45
The model worked well because we induced a memory deficit in mice injected
with KA, while mice with DOPET completed the test as efficiently as controls.
We observed a significant difference between the DOPET groups in relation
with the KA+DOPET-treated mice, so we could say DOPET was able to
protect this model from hippocampal damage evoked by KA.
0
10
20
30
40
50
60
70
80
90
0 1 2 3 4 5 6 7
Time (days)
Lat
ency
(se
c)
CONTROL
KA
DOPET
DOPET+KA
Figure 2.: Morris Water Maze Task in mice treated with KA and DOPET.
We found a significant learning of the DOPET group in relation with the AK+DOPET
treated mice.
Summary 46
Study in an animal model of Multiple Sclerosis with DOPET
disolved in drinking water.
MS is a chronic demyelinating disorder of CNS and the main reason of traumatic
neurological dysfunction in young adults. Lesions are basically lymphocytes and
macrophages infiltrations, axonal damage and demyelization.
We selected the EAE model (Experimental Autoimmune Encephalitis) because it
is a recognized animal model able to develop the clinical signs and lesions
observed in MS. The aim of the study was to determine the activity of DOPET to
affect the attacks and progression of the disease. The outcomes were realized in
the daily measurement of the scores of each animal in every group. We found a
significant improvement in the incidence and gravity of the attacks in mice
consuming DOPET in drinking water. The information above could be of interest
to develop of therapies for MS, based on a natural antioxidant as DOPET.
0
0,5
1
1,5
2
2,5
7 8 9
10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 28
Tratamiento (días)
Scor
e ac
um
ula
do
DOPET
Control
Figure 3.: Representation of the scores evaluated for each group. The
difference among DOPET and control group has a tendency to be statistically
significant (P= 0,06).
Summary 47
Studies in colesterol metabolism.
Non-esterified cholesterol is a structural component in the plasmatic
membrane of each cell. Human CNS contains 23 mg cholesterol per gram of
tissue althoughº brain constitutes only a 2,1% of the corporal weight. In all
animals, the main process of CNS growth and differentiation occurs during
the first years of lifespan and the cholesterol required come from de novo
synthesis.
Some authors support a direct relation between plasma cholesterol levels and
the incidence of developing dementia. The treatment with cholesterol-
lowering drugs has shown to be associated with a lower risk of dementia.
Anyway, all of these hypotheses need further confirmation. If both
parameters will be related as they suggested, cholesterol transporter
lipoproteins will contribute in a direct or indirect way to process APP or
neurotransmitter receptors.
Some studies demonstrate the inhibition exerted by DOPET on lipid
peroxidation. Based on these, we realized some in vitro and in vivo studies to
analyze that hypocholesterolemic power.
Studies realized with LC5D
After the microarrays outcomes we performed some assays to study the
enzyme Lathosterol-C5 desaturase (LC5D), because DOPET down regulated
its gene expression in liver.
LC5D is an enzyme implies in cholesterol metabolism, catalyzing the
conversion of Lathosterol in 7-Dehydrocholesterol, a precursor of cholesterol.
Inhibiton of this enzyme could be of interest to avoid the increase of
cholesterol.
The IC50 of DOPET for this enzyme was equal to 187 µM. This value indicates
the capacity to inhibit it, but with a relative elevated amount of compound.
Summary 48
Study of the effect of different diets on the brain of rabbit.
An atherogenic model in rabbit was established by dietary manipulation, to
analyze the effect of DOPET supplementation in a total of 56 animals, distributed
in 7 groups (n=8) feeding with control diets and atherogenic diets at two time
points, 30 and 60 days. Some biochemical parameters related with cholesterol
metabolism (total plasma cholesterol, HDL and triglycerides; total brain
cholesterol and lathosterol) were determined.
We found plasma cholesterol and plasma HDL-cholesterol reduction (P<0,05)
in DOPET group at 2 months time point. Also, the triglycerides in this DOPET
group were reduced in relation the rest of the groups. So then, the ratio
cholesterol:HDL in DOPET group was decreased at 2 months after treatment.
There were no differences for the brain cholesterol levels, probably because of
the short period of the study (2 months) in comparison with the time-life of
cholesterol in brain (6 months). However, the animals in the first group
supplemented with DOPET showed a reduction of lathosterol in brain.
Effects of DOPET on Dopamine and Norepinefrine uptake in PC12
cells.
Based on the structural-molecular similarity between DOPET (C8O3H10) and
Dopamine (C8H11NO2), we decided to study if our compound was able to work
on the metabolism of catecholamine or even if it could be recognized some
amine transporters, because these are some of the targets in the research
against PD.
The current study was realized in collaboration with PhD. Dª. S. Hilfiker
(University of Manchester, England). It was designed to test the effects of
DOPET on Dopamine (DA) uptake and release from PC12 cells. This is a
catecholaminergic model expressing all the relevant proteins for the transport
and metabolism of DA and NE. It is the perfect skill to elucidate the effects of
novel compounds on monoamine uptake, secretion and degradation.
Summary 49
The role of DOPET on dopamine transporter (DAT) and Norepinefrine
transporter (NET) as well as its influence on MAO (enzyme responsible of DA
cell release) was determined.
DOPET has been found to be a potent compound at specifically increasing the
amounts of intracellular [3H]-DA and [3H]-NE. The effects on DA could be
mediated by an influence of our compound on NET, which also transport DA.
Thus, the present data strongly support that DOPET may act to modulate NET,
which is the site of action of a range of drugs with therapeutic and abuse
potential. Under pathological conditions, changes in NET function might play a
key role in the progression of diseases like heart failure, associated with
reduction in NET density and function. It is likely that interventions enhancing
NET in the failing heart would be expected to achieve beneficial effect.
The scheme of a hypothetical mechanism of action for DOPET could be as
follows:
Summary 50
Figure 3.: Mechanism of action for DOPET in PC12 cells. DOPET could
activate NET which is responsible of NE and DA uptake in cell, to follow through the
incorporation into vesicles. This effect has been not demonstrated trough DAT.
DBH= Dopamine-beta-hydroxilase.
Some studies have analyzed the effectiveness of phenol and alkaloid compounds
as inhibitors of MAO activity, but until now there is no evidence of that power
for DOPET, structurally related with Dopamine and its metabolites.
Based on the hypothesis proposed for the mechanism of action of DOPET
described in figure 3, where DOPET could facilitates the uptake of Dopamine,
avoiding its degradation by MAO, and also counting with the references which
support the role of phenols as inhibitors of MAO, we determine the power of our
compound to inhibit MAO-B in mitochondria isolated from rat liver and brain.
The outcomes validated DOPET as an inhibitor of MAO-B activity in brain
(IC50 = 16,3) and liver (IC50 = 72,4).
NE + DA DA Extacelullar
TNE TDA
Intracelullar
+
DOPET NE + DA
+
DOPET
vesicles
?
DOPET
MAODOPAL
APOPTOSIS
DOPET
DA HVACOMT
NE
-
DBHNE DA
Summary 51
Finally, we could elaborate a global conclusión of this Memory, through the
compilation of the main results with DOPET and omega-3 PUFAs from diet
used on some in vitro and in vivo systems.
1) Regardind the effects exerted by omega-3 PUFAs enriched diet applied in
an animal model of AD, we found some benefits in the lipid profile of these
simple transgenic APP mice. A reduction in plasma and brain cholesterol and
AA (omega-6) levels, as well as brain AHD (omega-3) levels was observed.
We obtained a significant difference between control and omega-3 enriched diet,
but we demonstrated a gender and genotype difference. Female transgenic APP
mice fed with omega-3 enriched diet were the ones with the better improvement
of all lipidic parameters, and they showed a tendency to reduce brain A -40
levels. These outcomes suggest the omega-3 enriched diet would work properly
in the pathology of AD if our animals should have reached 6 months of age.
In the studies realized with DOPET, we have demonstrated its capacity as a
neuroprotector in vitro and in vivo.
a. Because of its ability to cross the brain blood barrier.
Because of its antioxidant effect on C6 and hippocampal cells damaged by some
oxidants, and because DOPET avoided lipid peroxidation in vitro and in vivo.
b. Because DOPET improved the incidence of developing Multiple Sclerosis in
an EAE animal model.
c. Because DOPET inhibited LC5D, an enzyme implied in cholesterol
biosynthesis. Further on, DOPET reduced significantly plasma colesterol levels
and brain lathosterol in an atherogenic model in rabbit.
d. Because its capacity to inhibit MAO in vitro and in vivo.
I. INTRODUCCIÓN
Capítulo I. Introducción 53
I.1. Neurodegeneración.
I.1.1. Concepto.
La neurodegeneración es un proceso multifactorial que conduce a la muerte de
neuronas, mediante la ejecución de una serie de reacciones tóxicas, incluyendo
inflamación, neurotoxicidad glutamatérgica, incremento de hierro y óxido
nítrico, eliminación de antioxidantes endógenos, reducción en la expresión de
factores tróficos, disfunción del sistema ubiquitín-proteasoma, y expresión de
proteínas pro-apoptóticas (Mandel and Youdim, 2004).
I.1.2. Estrés oxidativo.
El daño oxidativo que sufren las biomoléculas neuronales, la acumulación de
hierro en regiones específicas del cerebro, y los procesos inflamatorios
combinados con la proliferación de microglía reactiva, son algunos de los
principales aspectos patológicos asociados con el envejecimiento y algunas
enfermedades neurodegenerativas.
El cerebro es particularmente sensible al daño oxidativo, en base a su elevada
tasa de consumo de oxígeno acoplada a los bajos niveles de mecanismos de
defensa antioxidantes, como el glutatión y un elevado contenido en ácidos
grasos poliinsaturados (AGPIs) en las membranas, que son fácilmente
oxidables. La acumulación de daño oxidativo se relaciona con el envejecimiento
y los radicales libres están implicados, directa o indirectamente, en la
patogénesis de numerosas enfermedades neurodegenerativas asociadas con el
envejecimiento, como la enfermedad de Alzheimer (EA) y la enfermedad de
Parkinson (EP) (Christen, 2000; Owen, 1996).
Capítulo I. Introducción 54
Figura I.1.: Teoría de la oxidación en la EA. El proceso normal de
envejecimiento, unido a ciertas mutaciones en los genes determinantes de la EA
llevaría a la exacerbación en la producción de péptido A , causante del incremento
en la generación de las especies reactivas de oxígeno (EROs) responsables del daño
final a las neuronas.
El oxígeno es imprescindible para la vida pero, paradójicamente, su
metabolismo produce las denominadas especies reactivas de oxígeno (EROs) de
elevada toxicidad para las células. Entre las EROs figuran los radicales libres,
que contienen electrones altamente reactivos desapareados como los radicales
superóxido, el radical hidroxilo, el óxido nítrico, peróxido de hidrógeno y
peroxinitrito. Todos estas especies son redox-activas y pueden interaccionar con
componentes celulares, como las proteínas (ej: afectando su estructura y
función), lípidos (ej: generando peroxidación lipídica de los ácidos grasos
insaturados) y ADN (ej: provocando mutaciones genéticas). Están implicados en
Capítulo I. Introducción 55
numerosas patologías como la EA, la EP, isquemia, trauma cerebral y la
esclerosis múltiple (EM).
Por su elevada tasa metabólica y su reducida capacidad para la regeneración
celular, el cerebro es el órgano más susceptible al daño provocado por las EROs,
que suele derivar en muerte celular o daño irreversible. Determinados
marcadores de peroxidación lipídica (ej: malondialdehido), han sido
identificados en el hipocampo de pacientes de la EA y en la sustancia negra de
pacientes con la EP, demostrando el elevado índice de EROs en las principales
regiones afectadas por la patología (Butterfield, 2002a; Hensley, 1998). La
evidente implicación del estrés oxidativo en estas enfermedades no prueba que
esté implicado en neurodegeneración. La interacción entre varios de estos
componentes no ha de ser necesariamente una cascada sino que puede cursar a
modo de ciclo de sucesos, donde el estrés oxidativo desempeña un papel
primordial (Andersen, 2004).
Entre los procesos que generan radicales libres de oxígeno, encontramos rutas
metabólicas de ácido araquidónico, óxido nítrico y péptido beta amiloide (A )
(Ayasolla et al., 2004).
I.1.3. Marcadores de estrés oxidativo.
I.1.3.1. Malondialdehido (MDA).
Los marcadores de estrés oxidativo pueden proveer una herramienta potente
para evaluar la progresión de la enfermedad estudiada y el tratamiento
aplicable en tal caso. Uno de estos marcadores, el MDA, se forma a partir de
la ruptura de endoperóxidos durante las últimas etapas de oxidación de los
AGPIs, principalmente de aquéllos que contienen tres o más dobles enlaces.
El MDA reacciona con grupos amino primarios de moléculas biológicas por lo
que aparece tanto in vivo como aldehído libre o aducto con otros
componentes celulares (Marnett, 1999). El método más común para
determinar el MDA (libre o asociado), es un procedimiento colorimétrico que
Capítulo I. Introducción 56
detecta la reacción con ácido tiobarbitúrico (AT), en base a que el MDA
pertenece al grupo de sustancias reactivas de AT in vivo (SRAT).
Recientemente se han correlacionado los niveles de MDA con el desarrollo de
la EA, en base al genotipo de la apoliproteína E (ApoE) del paciente. Los
estudios post-mortem han revelado un incremento en los niveles del MDA en
el hipocampo, corteza piriforme y amígdala, y cortezas temporal, frontal,
parietal y occipital (DiCiero, 2000).
I.1.3.2. Sustancias reactivas con ácido tiobarbitúrico (SRAT).
Los SRAT son una medida de peroxidación lipídica no específica (Butterfield,
2002b). Hay cierta controversia en relación a la zona con un mayor
incremento de SRAT en la EA. Mientras que algunos estudios encuentran ese
aumento en el lóbulo frontal y no en el cerebelo, otros lo detectan en las
cortezas occipital y sensorial. Únicamente el lóbulo parietal inferior parece
verse afectado por lipooxidación en un estudio, mientras que otros aportan
datos significativos de afectación en hipocampo y corteza (Lovell, 1995).
I.1.4. Modelo animal de estrés oxidativo: Ácido kaínico.
La muerte neuronal es un marcador de numerosas enfermedades
neurodegenerativas, como la EA, la EP y la corea de Huntington. La pérdida
de la función cerebral, causada por neurodegeneración, afecta a millones de
personas cada año y supone una de las causas primarias de discapacidad de
larga duración. Estudios recientes sobre el mecanismo de
neurodegeneración han confirmado que, en numerosas ocasiones, la muerte
neuronal comienza mediante la sobreexcitación de neuronas en respuesta a
la acumulación extracelular de elevados niveles de glutamato, un
aminoácido excitatorio (Lipton, 1994). Este mecanismo de
neurodegeneración se denomina excitotoxicidad.
Entre los numerosos mecanismos que intervienen en la degeneración
excitotóxica, un proceso que se asocia con muerte celular tras un ataque
Capítulo I. Introducción 57
isquémico o epiléptico, es la ruptura de la barrera hematoencefálica (BHE),
permitiendo así la entrada de las proteínas plasmáticas al parénquima cerebral.
Numerosas patologías implican la afectación de la BHE, como los tumores
cerebrales y la EM (Roelcke, 1995). En contraposición a lo esperado, los
estudios in vivo para comprobar la relación entre el daño neuronal y la ruptura
de la BHE, han confirmado que se trata de dos procesos independientes, en que
la apertura de la BHE sucede tras la muerte neuronal y las proteínas
plasmáticas, consecuentemente, no iniciarían la degeneración (Chen, 1999).
A B
Figura I.2.: Excitotoxicidad en una terminal sináptica tras una
isquemia. Un proceso isquémico supone el bloqueo de los vasos que riegan el
cerebro, y con ello el cese de oxígeno en las neuronas. Esto desencadena la
sobreexcitación de la neurona dañada, en la que el intercambio normal de iones a
través de los receptores de glutamato de la membrana plasmática (A) se altera
generando un liberación excesiva de Ca2+, rompiendo la homeostasis del calcio y
activando así una cascada de enzimas capaces de destruir la membrana de la
neurona, y por tanto a la célula (B).
En base al concepto de excitotoxicidad, se establece un modelo que induce
neurodegeneración en el sistema nervioso central (SNC) de manera similar a
la observada en varias patologías, generada mediante la inyección de un
agonista del receptor del glutamato, el ácido kaínico (AK). El AK fue aislado
Capítulo I. Introducción 58
del alga roja Digenea simplex y utilizado como agente anti-ascaridiasis en
Japón tras la guerra. Comenzó a ser utilizado desde 1970, cuando se
describió su potente actuación como neurotoxina en el SNC de mamíferos
(Shinozaki, 1970). Las inyecciones locales de AK provocan lesiones axonales
y provocan convulsiones cuando es aplicado sistemáticamente en algún área
del sistema límbico cerebral. Aparte de estos efectos directos, la
administración de AK ejerce lesiones secundarias distantes en otras regiones
cerebrales, notablemente en hipocampo, corteza piriforme y la amígdala
(Schwob, 1980).
La principal característica de AK en relación con la epilepsia, es su potencial
para inducir un síndrome con un estado epiléptico agudo de origen límbico,
con el subsecuente daño neuronal cerebral similar al contemplado en la
epilepsia del lóbulo temporal en humanos.
La aplicación de AK conlleva un patrón de daño neuronal en la formación
hipocampal, con especial afectación en las células piramidales de la región
CA3 y las interneuronas del hilo del giro dentado. La degeneración neuronal
permanece durante meses, llevando a la contracción masiva del hipocampo y
de la amígdala, corteza piriforme y áreas de la corteza entorrinal (Baran,
1988).
I.1.5. Neuroinflamación.
Numerosas enfermedades neurológicas, incluyendo la EA, la EP y la EM,
comparten una característica patológica fundamental, como es la serie de
reacciones inflamatorias atípicas. La neuroinflamación puede ser tanto causa
como consecuencia del estrés oxidativo crónico.
En el caso de la EA, parece que se trata de un lazo de retroalimentación, en
que la patología provoca una activación de la microglía y una mayor
producción de citoquinas pro-inflamatorias, que a continuación estimulan la
generación de A , que a su vez es capaz de activar varias rutas inflamatorias.
Los estudios realizados en pacientes de la EA, mediante la administración de
drogas anti-inflamatorias no-esteroideas, revelan que los tratamientos debe
Capítulo I. Introducción 59
realizarse antes de la aparición de los síntomas clínicos a los grupos de mayor
riesgo y al menos durante un período de dos años para conseguir que el
tratamiento sea eficaz (Mhatre, 2004).
Capítulo I. Introducción 60
I.2. Enfermedades neurodegenerativas.
I.2.1. Concepto.
Las enfermedades neurodegenerativas incluyen un grupo de enfermedades
de causa desconocida y que contienen como atributo común el curso
progresivo de los síntomas, reflejo de la desintegración paulatina de una
parte o partes del SNC. Todas ellas presentan algunas características clínicas
comunes, en cuanto a que su inicio es insidioso, y su curso progresivo, sin
remisiones. No tienen un tratamiento etiológico y las actuaciones
terapéuticas son sintomáticas en algunos casos y paliativas en todos ellos.
Las repercusiones socioeconómicas son muy importantes, pues al propio
proceso de la enfermedad hay que sumar el impacto psíquico, la merma en la
calidad de vida, la incapacidad laboral, la pérdida de las habilidades sociales,
la carga física y psíquica de los cuidadores de estos pacientes y el enorme
gasto económico que conlleva la atención social y sanitaria de todas estas
personas (Sáenz de Pipaón). Actualmente, las enfermedades degenerativas
del cerebro son las más comunes y las que mayor coste sanitario suponen
para la sociedad.
El estudio de las enfermedades neurodegenerativas de origen esporádico y
familial en la última década y la identificación de mutaciones en ciertos
genes, han permitido la caracterización de numerosos rasgos distintivos de
las lesiones cerebrales propias de estas patologías.
Una serie de factores de riesgo ambientales y de comportamiento se han
propuesto para cada enfermedad, aunque aún hoy día la mayoría de estas
asociaciones carecen de consistencia y especificidad.
Capítulo I. Introducción 61
I.2.2. Enfermedad de Alzheimer (EA).
I.2.2.1. Origen de la EA.
Esquirol y Pinel hicieron una descripción apropiada del cuadro clínico de la
demencia. Las placas neuríticas (PN) fueron descritas en Paris en 1892 en un
caso de epilepsia y posteriormente en Praga en pacientes con demencia.
Durante muchos años se pensó que la EA era una entidad clínico-patológica
con muy pocas excepciones que no se ajustaban a un mismo patrón.
Actualmente, se sabe que la EA es heterogénea en diversos aspectos. Estas
diferentes etiologías están basadas en un proceso patofisiológico común,
consistente en un incremento en la deposición de péptido beta amiloide (A )
(Hyman, 1996).
Figura I.3.: Regiones cerebrales afectadas en la EA. Tanto la corteza como
regiones internas (hipocampo, amigdala) resultan alteradas en el transcurso de la
patología.
Capítulo I. Introducción 62
I.2.2.2. Incidencia de la EA.
Actualmente se calcula en unos 200 millones el número de personas afectadas
por esta patología en el mundo. Es una patología que afecta a personas de
ambos sexos, aunque de mayor prevalencia en mujeres, que sólo en España
afecta a más de 450.000 personas y se calcula que esta cifra podría duplicarse
en el año 2020. Entre ellas, un 64% son mujeres y un 36% hombres. Un 10% no
reciben tratamiento y un 90% de los enfermos españoles se hayan aún sin
diagnosticar. Es la cuarta causa de muerte en España, su incidencia es del 1% y
su prevalencia del 1.5% entre personas de 60 a 70 años y del 20% en mayores de
85 años.
En personas que padecen síndrome de Down, se estima que el 25% pueden
mostrar signos y síntomas de demencia tipo Alzheimer a partir de los 35-40
años. El porcentaje aumenta con la edad, de modo que en la década de los
sesenta el porcentaje alcanza cifras que son muy variables según las diversas
estadísticas.
Capítulo I. Introducción 63
I.2.2.3. Neuropatofisiología de la EA.
La demencia es un síndrome común a una variedad de enfermedades que
afectan, directa o indirectamente, al SNC. La causa más frecuente de
demencia es la EA, una degeneración primaria del SNC cuyo diagnóstico
definitivo suele hacerse post mortem por la presencia de hallazgos
neuropatológicos y neuroquímicos característicos.
La demencia se caracteriza por un deterioro cognitivo, por lo general
irreversible y progresivo, que compromete a la memoria a corto y largo plazo,
el lenguaje, el reconocimiento de objetos y las funciones ejecutivas. Durante
el proceso normal de envejecimiento, tiene lugar un desequilibrio entre
neuropéptidos y hormonas en las neuronas sometidas a estrés metabólico
(Heininger, 1999). Las demencias plantean un problema epidemiológico de
escala mundial, sobre todo en los países desarrollados, debido al
envejecimiento considerable y progresivo de su población.
En un cerebro normal envejecido, encontramos tanto el péptido A , como las
PS, proteína tau-hiperfosforilada (P-tau) y los ovillos neurofibrilares (ON), lo
que sugiere que su producción es independiente y podrían suponer un estado
preclínico de la enfermedad (Price and Morris, 1999). Estos procesos no son
específicos para la EA y únicamente con algunos factores cuantitativos y
cualitativos adicionales, identificados como factores epidemiológicos de
riesgo, estos procesos relacionados con la edad, pueden conducir al
desarrollo de marcadores patomorfológicos de la EA.
A pesar de los adelantos en la patogenia de la EA, su etiología es aún
desconocida. Una de las hipótesis planteadas es que sea provocada por virus
lentos o priones, en base a la similitud de manifestaciones clínicas, los
hallazgos neuropatológicos y la semejanza histoquímica y ultraestructural
entre priones y depósitos de amiloide, mientras que otros estudios la
relacionan con herpesvirus (Castellani, 2004; Itzhaki, 2004).
Capítulo I. Introducción 64
I.2.2.4. Cambios estructurales en la EA.
La atrofia cerebral observada macroscópicamente en los pacientes con esta
enfermedad, hizo pensar inicialmente que se trataba de un proceso de
degeneración difusa del cerebro.
Pero actualmente se sabe que afecta a las áreas
de asociación y a los circuitos neuronales de
la corteza límbica mientras que algunas áreas
del cerebro permanecen intactas (Stein, 1998).
Además se observa un ensanchamiento de los ventrículos,
aumento del líquido cefalorraquídeo y disminución de sustancia blanca.
Neuropatológicamente, la EA se caracteriza por una serie de eventos
espaciales y temporales, que comprometen secuencialmente al prosencéfalo
basal, corteza entorrinal, hipocampo, amígdala y áreas de asociación cortical
(Braak, 1997). La patología de tipo Alzheimer cursa con depósitos difusos de
A , pérdida neuronal por necrosis y apoptosis, gliosis, distrofia, y activación y
agrupamiento de la microglía dentro de las PN (Calhoun, 1998; Hsiao et al.,
1996; Moechars, 1999).
Mientras que en general el tamaño de las neuronas puede ser un marcador
para la degeneración, las largas neuronas piramidales hipocampales de la
región CA3 parecen ser relativamente más resistentes a la neurodegeneración,
indicando que la vulnerabilidad es determinada por algo más que meramente
el tamaño y la morfología celular. Los marcadores neuronales que destinan a
las células a la degeneración en la EA, incluyen:
a) Equipamiento concreto de proteín-kinasas.
b) Elevados niveles de proteínas de los neurofilamentos.
c) Expresión de la isoforma de tau y del ARNm de tau bajo estrés celular
(Morrison, 1998).
d) Marcada activación de varias catepsinas proteinasas pertenecientes al
sistema endosoma-lisosomal.
e) Incremento de la actividad del intercambiador Na+/Ca2+ en corteza
frontal y temporal
Capítulo I. Introducción 65
f) Disminución en la función de los canales de Ca2+ y el tipo de calbindina
expresada en estas células
g) Abundancia relativa de pro- y anti-apoptóticos y la intrínseca
maquinaria de muerte celular programada (Cataldo and Paskevich, 1998;
Sagara and Schubert, 1998). En el hipocampo, las capas CA1 y CA3 son
particularmente vulnerables a isquemia, trauma, epilepsia y EA.
Los cambios neuroquímicos en la corteza de pacientes con EA se asocian con: a)
pérdida de neuronas colinérgicas en el prosencéfalo basal, correlacionado con la
reducción cortical de la enzima colina-acetil-transferasa; b) mayor densidad de
ovillos neurofibrilares (ON); c) mayor severidad clínica de la demencia; d)
pérdida de estructuras presinápticas; e) aumento del número de receptores
colinérgicos por célula, como posible mecanismo de compensación a la
denervación y f) disminución de la cantidad total de receptores colinérgicos de
tipo muscarínico y nicotínico en la población, lo que supone la pérdida de
neuronas.
I.2.2.4.1. Placas neuríticas (PN).
Las PN son lesiones extracelulares, esféricas, que contienen depósitos del
péptido A y pueden presentarse en un espectro de configuraciones que va
desde las PN difusas hasta las PN maduras, en función de los tipos celulares que
presenten.
En el cerebro de pacientes con la EA,
la frecuencia de PN maduras es
significativamente mayor que en los
individuos no demenciados de la
misma edad y su densidad se
correlaciona positivamente con la
severidad de la demencia.
En la región que rodea a la PN, se producen procesos de inflamación asociados a
una activación de la microglía. Además, la inflamación parece estar asociada a la
Capítulo I. Introducción 66
formación de radicales libres, estrés oxidativo, trastornos en la homeostasis del
calcio y a trastornos de la membrana mitocondrial, procesos que contribuirán
en la muerte neuronal (Nagy et al., 1996).
I.2.2.4.2. Ovillos neurofibrilares (ON).
Los ON son acúmulos intraneuronales de haces de fibras helicoidales apareadas.
Estas fibras están constituidas por formas insolubles (hiperfosforiladas y/o
ubicuitinizadas) de la proteína asociada a microtúbulos de tipo tau. Su
frecuencia es marcadamente mayor en pacientes con la EA, su número aumenta
conforme progresa la enfermedad
y su densidad se correlaciona positivamente con la severidad del deterioro
cognitivo, posiblemente a consecuencia de la relación entre la muerte y la
disfunción neuronal.
En efecto, la presencia de ON en el
hipocampo se correlaciona con la magnitud
del deterioro de la memoria, mientras que su
presencia en la corteza de asociación se
correlaciona con la magnitud del deterioro
cognitivo total. (Dani, 1997).
Capítulo I. Introducción 67
I.2.2.5.Estrés oxidativo en la EA.
Numerosas evidencias relacionan al estrés oxidativo con la patofisiología de la
EA (Markesbery, 1997).
El equilibrio entre la actividad oxidativa ejercida por los oxidantes (EROs y
metales de transición) y por los antioxidantes (superóxido dismutasa (SOD),
catalasa (CAT), glutatión superóxido dismutasa (GSD) y vitaminas E, C y A)
determina la susceptibilidad de los tejidos al daño oxidativo (McCord, 1993).
Sin embargo, el patrón de expresión de las enzimas antioxidantes como SOD,
GSD y CAT en el cerebro de pacientes de la EA no es consistente. La actividad
SOD en líquido cefalorraquídeo (LCR) y eritrocitos aparece incrementada y
reducida a nivel plasmático (Rinaldi et al., 2003).
La implicación del estrés oxidativo en la patogénesis de la EA es evidente por
las siguientes razones:
a) Las neuronas son particularmente sensibles a los radicales libres, por
su reducido contenido en glutatión (importante antioxidante natural) y su
elevado contenido en AGPIs en sus membranas (Prasad et al., 1998).
b) El envejecimiento es el principal factor de riesgo de la EA, y algunas
EROs pueden acumularse durante años (Benzi, 1995).
c) Estudios post-mortem de cerebros de la EA revelan numerosos
marcadores de estrés oxidativo, tales como: formación de proteín carbonilos
en el lóbulo parietal inferior e hipocampo, peroxidación lipídica, nitración y
oxidación proteica y daño al ADN nuclear y mitocondrial, aunque existe cierta
controversia a este respecto (Hayn, 1996; Lovell et al., 1997; Lyras et al.,
1997). Una posible explicación a esta inconsistencia podría encontrarse en el
genotipo apo E, de modo que aquéllos individuos portadores del alelo 4
serían más susceptibles a la
peroxidación (Ramassamy, 1998).
d) Los agentes capaces de eliminar radicales libres, reducen la toxicidad
generada por A . Estudios in vivo indican que el estrés oxidativo puede
promover la patogénesis de la EA, apoyando la fiabilidad de los
Capítulo I. Introducción 68
enfoques terapéuticos basados en antioxidantes. La peroxidación lipídica
causada por A en las membranas de las células cerebrales, es inhibida por la
suplementación con antioxidantes, que protege tanto de la neurotoxicidad
causada por A extracelular como del estrés oxidativo inducido por la
acumulación intracelular de A (Butterfield, 1994; Ohyagi, 2000).
Figura I.4: Compendio de factores que desencadenan estrés oxidativo.
e) La EA cursa con anomalías mitocondriales, que podrían explicar las
alteraciones en la producción de radicales libres (Beal, 1995).
f) Estudios clínicos con vitamina E y selegilina (inhibidor de la enzima
monoamino oxidasa-B) en pacientes de la EA mostraron una significativa
reducción del proceso patogénico (Sano, 1997).
g) Estudios inmunohistoquímicos han localizado una mayor actividad Cu-Zn-
SOD, Mn-SOD, CAT, ferritina y transferrina en PN y ON (Connor, 1992).
Cada vez son mayores las evidencias que sugieren que las perturbaciones en los
sistemas que emplean L-glutamato, están detrás de numerosos mecanismos
patogénicos entre los que cuentan la hipoxia-isquémica,
epilepsia y enfermedades neurodegenerativas crónicas, como la corea de
Huntington y la EA. Prácticamente la totalidad de las neuronas del SNC llevan
Capítulo I. Introducción 69
el subtipo NMDA de los receptores ionotrópicos de L-glutamato, mediador del
influjo de Ca2+ post-sináptico. La excesiva activación de los receptores de
NMDA por efecto de la excitotoxicidad, puede incrementar la vulnerabilidad
de las neuronas como consecuencia de la alteración en la distribución regional
de los subtipos de receptores de NMDA (Hynd, 2004).
Estudios recientes en ratones transgénicos de la EA, muestran el papel
protector que ejerce la proteína precursora del amiloide (PPA) contra el daño
excitotóxico en neuronas, mediante la regulación de la función de los
transportadores gliales de glutamato, lo que se traduce en una mayor
susceptibilidad a la toxicidad asociada al glutamato, al igual que en pacientes
de la EA (Masliah, 2000).
I.2.2.6. Genética de la EA.
En la etiología de la EA encontramos una paradigmática interacción “genes-
ambiente” que contribuye a la manifestación de la enfermedad. Numerosos
estudios epidemiológicos han demostrado que una historia familial positiva es
un factor de riesgo para la EA (Mendez, 1992).
Desde hace más de 10 años parece claro que la EA, en humanos, está causada
por unas 100 mutaciones de alta penetrancia autosómicas dominantes en tres
genes: PPA, presenilina 1 (PS1) y presenilina 2 (PS2) (Chartier-Harlin, 1991;
Hardy, 1997).
La forma familial de la EA (EAF) supone entre un 4-8% de todos los casos,
causada por mutaciones en PS1 en la mayoría de los casos. Las mutaciones en
PPA comprometen a un porcentaje pequeño pero significativo de los casos,
mientras que las mutaciones en PS2 son raras y no completamente penetrantes
(Sherrington, 1996). La posibilidad de utilizar las mutaciones de la EAF para
estudiar el 92-96% de los casos de la EA de
causa genética por definir, se refuerza con la observación de que la EAF aparece
de manera idéntica a los casos esporádicos de la EA, excepto que EAF suele
iniciarse antes de los 60 años de edad.
Capítulo I. Introducción 70
Adicionalmente, la forma más común de la enfermedad, de inicio tardío, se he
relacionado con un polimorfismo en el gen de la ApoE, que incrementa la
susceptibilidad a la patología. El alelo 4 de ApoE, localizado en el cromosoma
19, incrementa de 5 a 8 veces el riesgo de desarrollar la forma familiar y la forma
esporádica de la enfermedad (Soininen, 1996).
Estudios recientes revelan que estos cuatro genes únicamente provocan el 30%
de las variantes genéticas de EA y que deben existir otros factores genéticos
implicados, aún por identificar (Tanzi and Bertram, 2001).
En la tabla I.1. se resumen las alteraciones genéticas en la EA y sus efectos en
el metabolismo de A .
Capítulo I. Introducción 71
Cromosoma Producto Edad comienzo Efecto
21 Mutación de
la PPA
Temprana Sobreproducción
A
14 Presenilina 1 Temprana Aumento
producción A 42
1 Presenilina 2 Temprana Aumento
producción A 42
19 APOE 4 Tardío/temprana Aumento
depósitos A
12 Proteína
relacionada
con receptor
de LBD
Temprana Intercede en el
efecto del alelo
APOE 4
6 HLA-A2 Temprana Regula el proceso
inflamatorio
17 Bleoximicina
hidroxilasa
Tardío/temprana Aumenta la
producción de
amiloide
LBD=lipoproteína de baja densidad. APOE=lipoproteína E. HLA=antígeno
humano de histocompatibilidad.
Tabla I.1.: Genes implicados en la patología de la EA.
I.2.2.6.1. Proteína precursora del amiloide (PPA).
El gen de la proteína precursora del amiloide (PPA) está albergado en el
cromosoma 21, crítico también para el desarrollo del síndrome de Down. El
péptido A es la pieza central en el puzzle que entraña la EA y el principal
constituyente de la angiopatía cerebral amiloidea. Se deposita en el centro de
las placas y resulta neurotóxico tanto in vitro como in vivo. Este fragmento
beta forma parte de una proteína mayor denominada PPA. Esta proteína está
implicada en la adhesión célula-célula y célula-matriz extracelular,
Capítulo I. Introducción 72
diferenciación neuronal, y plasticidad y estabilidad sináptica (Mattson et al.,
1997).
Es una molécula con varios dominios que contienen una única región
transmembrana, el extremo aminoterminal, que se extiende hacia el ambiente
extracelular y un corto extremo carboxiterminal que lo hace hacia el citosol
(Lamb, 1993). Se sobreexpresa en neuronas, astrocitos y células microgliales en
respuesta a multitud de factores de estrés celular, como daño axonal, la pérdida
de inervación y de factores tróficos, un choque térmico, procesos inflamatorios,
isquemia, hipoglucemia, trauma cerebral, excitotoxicidad, ataques epilépticos,
estrés oxidativo y envejecimiento (Wallace et al., 1993).
Las mutaciones que provocan los cambios típicos en cerebros afectados por la
EA, resultan en un procesado alternativo de PPA, incrementando la producción
de A en las neuronas y células periféricas (Citron, 1994; Haass et al., 1994).
Aunque estas mutaciones son responsables de una pequeña fracción de los casos
de EAF, es evidente el valor de A en la etiología de la EA.
Las mutaciones autosómicas dominantes en PPA asociadas con EAF, se localizan
en torno a los lugares de procesado por y -secretasas. La denominada
mutación Swedish, en los aminoácidos 670 y 671 desde Lis-Met hasta Asp-Leu se
encuentra aguas arriba del lugar de procesado de la -secretasa y supone un
incremento de 5 a 8 veces en la formación tanto de A 40 como de A 42 (Citron
et al., 1992). Otras dos mutaciones diferentes en el aminoácido 717, la mutación
London, Val-Ile, y la mutación Indiana, Val-Fen, son adyacentes al lugar de
procesado e incrementan específicamente la producción de A 42 (Suzuki et al.,
1994).
Las mutaciones de PPA identificadas en los casos de EAF provocan un deterioro
de la plasticidad neuronal, en la que la extensión de las neuritas y la transmisión
sináptica son defectivas y por tanto podrían inducir alteraciones durante el
desarrollo cerebral (Hsia, 1999).
Capítulo I. Introducción 73
I.2.2.6.1.1. Rutas de procesado de PPA.
Existen dos rutas, mutuamente exclusivas, por las que PPA puede ser
metabolizada. La vía secretora (Fig I.5A), en la que la proteína es integrada en
la membrana plasmática del pericario y transportada a las membranas
sinápticas, donde es atacada por -y -secretasas, dentro del dominio A ,
liberando así al ectodominio soluble denominado -PPAs junto a un pequeño
fragmento denominado p3, lo que excluye la generación de A (Bayer et al.,
2001). La secreción requiere la maduración completa de PPA en el retículo
endoplásmico y aparato de Golgi.
Por otro lado, mediante la llamada vía amiloidogénica (Fig I.5.B y I.5.C), la
proteína es procesada en primer lugar por una -secretasa en la parte más
distal dentro de la molécula, generando un fragmento C-terminal de 12 kDa
que es procesado a continuación por una -secretasa, produciendo un péptido
hidrofóbico de 39 a 43 residuos, denominado A , que comprende entre 11 a 15
aminoácidos de la región transmembrana y los 28 residuos animoterminales
de la misma. Estas variantes de A son segregadas constitutivamente por
células con actividad metabólica normal y se encuentran en el plasma y el
líquido cefalorraquideo (LCR) de mamíferos sanos (incluído el hombre). El
péptido A secretado tiende a agregarse, formando oligómeros anfifílicos que,
superando ciertas concentraciones críticas, tienden a depositarse en los
tejidos, especialmente aquéllos formados por el A 42 (Selkoe, 2001). El 90%
de los péptidos A en cerebro son del tipo A 40, y el 10% restante lo
constituyen los más fibrilogénicos A 42/43.
Capítulo I. Introducción 74
Figura I.5: Rutas de procesado de PPA: El procesado de PPA está dividido en dos
rutas: la vía no-amiloidogénica alfa, en la que PPA es procesada por una -secretasa,
evitando la producción de A . Sin embargo, en la via amiloidogénica, PPA es cortada
por - y -secretasas que conducen a la liberación del péptido A . Recientemente, la -
secretasa se ha identificado como una BACE/Asp2 (enzima de procesado de PPA unida
a una proteasa de membrana ligada a aspártico) (Vassar et al., 1999). La PS1 actúa
directamente en el procesado por -secretasas.
El procesado de PPA es regulado mediante un ciclo celular-dependiente del
equilibrio entre fosforilación/desfosforilación (Gouras et al., 1998). Las
cascadas de fosforilación implican a la proteína kinasa C isoforma-específica,
proteína kinasa A, fosfolipasa A2, fosfoinositol, proteína kinasa activada por
mitógenos así como a la fosforilación de tirosina. Algunos de los factores
capaces de incrementar la liberación de PPAs incluyen la activación de
receptores de neurotransmisores (muscarínicos, nicotínicos, glutamato
metabotrópico y serotoninérgicos) al igual que de receptores de factores de
crecimiento, interleukinas, neuropéptidos y agentes como el
A (40-42)
PPA (770, 751, 695)
y secretasas
y secretasas
Vía amiloidogénica ( -PPAs)
Vía secretora ( -PPAs) C83
C99
P3
A)
B)
C)
Capítulo I. Introducción 75
ácido araquidónico (AA) (Mills and Reiner, 1999). La escasez de suministro
energético y la sobrecarga de Ca2+ inducen tanto el incremento en la
producción de PPA así como la ruta amiloidogénica de procesado de esta
proteína. Una mayor expresión de PPA y ciertas mutaciones dirigen a la
molécula desde la vía secretora hacia la amiloidogénica. Se ha demostrado
que situaciones de isquemia, hipoglucemia y trauma cerebral pueden inducir
una mayor producción de PPA y de su ARNm, tanto en modelos animales
como en cultivos celulares (Murakami et al., 1998).
In vivo, el estrés excitotóxico induce la expresión de PPA en la región que
rodea al corazón necrótico de las PN y favorece la producción de PPA en
astrocitos reactivos (Panegyres, 1998). La inhibición del metabolismo
energético de la mitocondria altera el procesado de PPA, para generar un
derivado potencialmente amiloidogénico. Inversamente, la función
mitocondrial puede verse comprometida por A , ya que en respuesta a una
falta de energía, el fallo mitocondrial se exacerbaría.
I.2.2.6.1.2. Efectos neurobiológicos de los metabolitos de
PPA.
Tanto PPA como -PPAs son neurotróficos de una manera parcialmente
isoforma-dependiente, completando así la “rama” neuroprotectora del lazo de
retroalimentación PPA-Ca2+. Son responsables del aumento de la
supervivencia neuronal, la extensión de las neuritas y el brote axonal in vitro
así como del incremento de la densidad sináptica y el desarrollo de la
memoria in vivo (Meziane et al., 1998). En la corteza de los ratones
transgénicos, la PPA humana tiene un efecto sinaptotrófico que reside en un
péptido de 17 aminoácidos (Yamamoto et al., 1994). Las -PPAs protegen
también frente al daño causado por hipoxia, isquemia y daño neuronal
excitotóxico atenuando la elevación de Ca2+ inducida por glutamato y
contrarrestando el efecto inhibidor del glutamato en el crecimiento de las
dendritas. La actividad excitoprotectora de las -PPAs
Capítulo I. Introducción 76
podría estar relacionada con la supresión directa de las corrientes de NMDA y
con el incremento de la re-captación de glutamato por parte de los astrocitos en
base a una mayor producción de la proteína del transportador de glutamato
(Masliah et al., 1998).
Las acciones celulares de A han sido motivo de numerosos artículos (Mills and
Reiner, 1999). Le han sido atribuidos papeles neurotóxicos, neurotróficos o
neuromoduladores. Estudios in vitro y en menor medida in vivo han demostrado
las propiedades neurotóxicas de concentraciones muy bajas de A fibrilar,
mediadas por la disrupción de la homeostasis del Ca2+-energía redox.
Concentraciones aún menores de este péptido en estado soluble, resultan
neurotóxicas y neurotróficas. En base a estos hallazgos, se le atribuye un papel
patofisiológico en la EA.
I.2.2.7. Presenilinas (PS).
La presenilina-1 (PS1) y la presenilina-2 (PS2) están codificadas por los genes
albergados en los cromosomas 14 y 1, respectivamente, y se relacionan con el
desarrollo de la mitad de los casos de la EAF con una edad de comienzo en torno a
los 40 años (Hardy, 1997). El conocimiento sobre el papel que desempeñan las PS
está aún por completar, aunque ya se conoce que actúan en diferenciación
neuronal, plasticidad sináptica, supervivencia celular, apoptosis y modulación de
la excitabilidad neuronal, homeostasis del Ca2+ y transducción de señales (Capell
et al., 1997; Handler et al., 2000; Hartmann et al., 1997). Ambas PS están
localizadas en el retículo endoplasmático, aparato de Golgi y en estructuras
vesiculares del compartimiento somatodendrítico de las neuronas,
predominantemente en regiones vulnerables al desarrollo de la EA, donde se
expresan de manera coordinada (Culvenor et al., 1997). El procesado
endoproteolítico de las PS origina dos fragmentos proteicos y está regulado
durante el desarrollo (Thinakaran et al., 1996). La producción de PS incrementa
en respuesta a una serie de estresores metabólicos como la isquemia, trauma y la
EA. Por ejemplo, la expresión de la PS1 disminuye en el hipocampo de pacientes
Capítulo I. Introducción 77
con la EA pero la incrementa en la fracción libre de ovillos aunque no en las
neuronas que contienen ovillos (Giannakopoulos et al., 1997).
La disminución en la generación de la PS1 resulta en un menor crecimiento y
una mayor susceptibilidad a la apoptosis. Las PS interaccionan directamente
con PPA, incrementando la secreción de -PPAs y son necesarias para el
correcto procesado de PPA por -secretasas (Marambaud et al., 1998;
Weidemann et al., 2002).
Un claro ejemplo del papel que desempeña la PS1 lo refleja el modelo
transgénico de ratones mutantes para PS1, donde se encuentra deteriorada la
habilidad neuronal para diferenciarse, el crecimiento de las neuritas se reduce
y se altera la plasticidad sináptica a largo plazo en la región CA1 del
hipocampo (Dowjat et al., 1999). Los cerebros que portan PS1 mutante
exhiben un incremento masivo de deposición de A e incluso una patología
cerebral severa y mayores niveles plasmáticos de A (Tamaoka, 1998).
Evidencias recientes sugieren que PS1 podría ser una -secretasa (Wolfe,
1999). Los estudios de fotoafinidad indican que los inhibidores de -secretasa
se unen específicamente a PS1 y PS2, lo que indica que las PS podrían
contener el sitio activo para dicha actividad enzimática, aunque esta hipótesis
requiere confirmación (Li, 2000).
Los mutantes para PS1 y PS2 presentan un incremento significativo en la
expresión de PPA en los fibroblastos, una reducida producción y secreción de
-PPAs, un incremento en la acumulación y secreción de A 40 y A 42
intracelular en células transfectadas y ratones transgénicos de una manera
edad-dependiente (Borchelt et al., 1996; Duff et al., 1996; Marambaud et al.,
1998).
El papel que juegan las PS en la regulación de la apoptosis, puede ser
modulado por su procesado proteolítico dado que la generación de fragmentos
C-terminales de PS1 y PS2 retrasa la apoptosis mientras que las mutaciones de
PS1 y PS2, incrementan la vulnerabilidad a este proceso de muerte celular
programada (Guo et al., 1998; Vezina et al., 1999; Wolozin et al., 1996).
Capítulo I. Introducción 78
Figura I.6: Estructura molecular de las proteínas PS1 y PPA. Se indican los
lugares de procesado por las correspondientes enzimas ( -, -, y -secretasas).
En relación a la actuación de las PS en la homeostasis de Ca2+ en las neuronas,
puede estar mediada por las propiedades intrínsecas de los canales de Ca2+, por
unión y regulación de la actividad de la proteína G0 modulando las corrientes de
Ca2+ y favoreciendo las corrientes de los canales de K+ (Smine et al., 1998). Las
mutaciones de PS1 alteran la señalización y homeostasis del Ca2+, perturban la
función mitocondrial, favorecen la producción de radicales oxidativos en cultivos
de líneas celulares y sinaptosomas y sensibilizan a las neuronas a la apoptosis
(Begley et al., 1999).
Capítulo I. Introducción 79
Figura I.7.: Gráfico representativo de la molécula de PS2 anclada en la
membrana plasmática.
I.2.2.8. Modelos animales de la EA.
Antes de identificar las mutaciones genéticas que conducen a la EA, los
modelos animales se centraban en reproducir los aspectos más específicos de
la neuropatología, desde el daño neuronal hasta la depleción colinérgica.
Aunque informativos, estos modelos eran demasiado restringidos, por lo que
se crearon los modelos de ratones transgénicos, basados en la expresión de
genes mutantes de la EA en humano, que han demostrado ser perfectamente
válidos y enormemente explicativos (Campion, 2001). Modelos transgénicos
de ratón que expresan PPA mutante imitan algunas de las características
patológicas y comportamentales más prominentes en la EA (Hsiao, 1998;
Price, 1998).
Capítulo I. Introducción 80
El modelo animal de esta enfermedad cursa con un deterioro cognitivo,
anomalías tanto en la transmisión sináptica
como en la potenciación a largo-plazo, un incremento en los niveles cerebrales de
A , particularmente de A 42, y una reducción en los niveles de -PPAs,
disfunción mitocondrial y un mayor estrés oxidativo (Hsiao, 1998; Moechars,
1999; Pappolla, 1998).
I.2.2.8.1. Transgénicos de PPA.
El primer modelo transgénico de la EA sobreexpresaba PPA (no mutante), tanto
en su totalidad como en su forma amiloidogénica (Pearson, 1993). La
característica común en ambos modelos, era la no producción de placas frente a
una gran acumulación de A , fenómeno corroborado por la no formación de
placas a pesar de los elevados niveles de expresión de la PPA salvaje humana
(Mucke, 2000). Incluso la total expresión genómica de PPA en un ratón
transgénico YAC es insuficiente para producir la deposición hasta alcanzados
niveles muy elevados de A (Lamb, 1999). Otro factor crucial es la edad: todas las
líneas de ratón que sobreexpresan PPA son aparentemente normales al nacer,
pero comienzan a desarrollar la histopatología en torno a la mitad de período
vital de un ratón normal.
La distribución de placas no es uniforme en el cerebro de un ratón individual,
aunque la disposición regional es similar en todas las líneas de ratón. Es
significativo que ninguno de los modelos de ratón demuestra una
neurodegeneración comparable a la observada en la EA humana, quizás porque
no viven lo suficiente como para desarrollar la patología en su plenitud.
A nivel de comportamiento, la pérdida de memoria es uno de los primeros y más
prominentes rasgos en los modelos de roedor de EA, por lo que las pruebas para
este modelo se centran en aprendizaje y memoria.
Capítulo I. Introducción 81
Aunque es probable que la pérdida masiva de neuronas pueda afectar al déficit
de comportamiento, la función cognitiva también puede verse comprometida
con una moderada o nula pérdida neuronal. De hecho, los modelos
transgénicos de PPA presentan una acumulación de proteínas relacionadas con
la patología, que provocarían el déficit de aprendizaje y memoria en ausencia
de una pérdida celular significativa. Por tanto, parece plausible que las
alteraciones comportamentales podrían ser el resultado de alteraciones en la
fisiología sináptica (Campion, 2001).
I.2.2.8.2. Transgénicos de PS.
El gran número de modelos que sobreexpresa las mutaciones en la PS1, refleja
que estas mutaciones suponen la mayoría de los casos de la EAF. Aunque
estos modelos no reproducen exactamente la patología de la EA, la creciente
evidencia de que la PS1 es una -secretasa, sugiere que los mutantes PS1
suponen una importante herramienta en el desarrollo de tratamientos para la
EA.
Los cruces de mutantes PPA con mutantes PS1, resulta en animales que
producen una mayor cantidad de A que la generada por el transgénico
simple(Borchelt, 1997; MCGowan, 1999). A pesar de mostrar una temprana y
extensiva deposición de placas, no presentan una neurodegeneración
significativa en el hipocampo o corteza prefrontal.
I.2.2.9. Laberinto acuático de Morris (LAM).
El denominado laberinto acuático de Morris (LAM) fue descrito hace 20 años
como un dispositivo para el estudio del aprendizaje espacial y la memoria en
ratas y ratones de laboratorio (Morris, 1984). Los ratones desarrollan la
prueba de manera diferente a las ratas, aunque los autores indican que no se
debe a diferencias en las habilidades espaciales (Whishaw, 1996).
Capítulo I. Introducción 82
Entre los factores que afectan al resultado de la prueba, se encuentra el género y
la raza de los animales. En relación a la raza, encontramos resultados
contradictorios. Mientras que para algunos autores los ratones BALB/cByJ son
los que peor desarrollan el laberinto, argumentando su mayor sensibilidad al
estrés causado por esta prueba en relación a otras razas (Francis, 1995). Sin
embargo, estudios posteriores comparativos entre 4 razas de ratones, no
encuentran diferencias significativas entre los ratones C57BL/6 y los
BABL/cByJ, a pesar de ser los ratones negros los recomendados para este tipo de
prueba por considerar que poseen mejores habilidades visuales que los albinos
(Wehner, 1988, Royle, 1999 #1027).
En términos nutricionales, se ha demostrado una mejora en el déficit-edad
dependiente observado en el laberinto, mediante la suplementación con
extractos con actividad antioxidante así como en ratas alimentadas con AGPIs
omega-3 durante varias generaciones (Joseph, 1999).
El hipocampo es una estructura cerebral necesaria para la adquisición y
recuperación de la información espacial, al igual que para su consolidación y
almacenamiento. Prueba de ello es la inactivación hipocampal reversible
mediante la aplicación de un antagonista AMPA/Kainato que compromete
seriamente el desarrollo del LAM en ratas (Riedel, 1999). La aplicación de
antagonistas de receptores de aminoácidos excitatorios (ej: receptores de
NMDA; Kainato y AMPA) como compuestos capaces de influir en la capacidad
de aprender mediante el desarrollo de LAM en roedores, han demostrado jugar
un papel muy impotante en el aprendizaje espacial, variando su efecto en función
del momento de administración (antes o después del aprendizaje) (D´Hooge,
2001; Morris, 1994).
Capítulo I. Introducción 83
I.2.3. Enfermedad de Parkinson (EP).
I.2.3.1. Origen de la EP.
En 1817, James Parkinson publicó su famoso monográfico “ensayo sobre el
pulso tembloroso”. En este documento, describe una enfermedad
neurológica, conocida hoy como EP, consistente en un temblor de reposo y
una forma peculiar de discapacidad motora progresiva.
Durante décadas, desde el descubrimiento de la base patológica y
neuroquímica de la EP, se ha intentado entender su etiopatogenia a través de
un único mecanismo, implicándose sucesiva e incluso reiteradamente un
origen infeccioso, metabólico, tóxico o genético. Sin embargo es mucho más
probable un orígen multifactorial. El amplio espectro experimental y clínico
de factores y causas que provocan degeneración de la sustancia negra así lo
indica.
I.2.3.2. Incidencia de la EP.
Se estima que en España más de 500.000 personas padecen esta enfermedad,
se estima que aparecen unos 6.000 casos anuales con una ligera mayor
incidencia en los hombres. La prevalencia de la EP en países industrializados
se estima alrededor de un 3% de la población general y en torno a un 1% de la
población mayor de 60 años (de Rijk, 2000). Personas de todas las etnias
pueden verse afectadas y los hombres muestran mayor predisposición a la
enfermedad y la edad de inicio de la patología se sitúa entre el final de los 50 y
la primera mitad de los 60 (Inzelberg, 2002).
I.2.3.3. Neuropatofisiología de la EP.
El parkinsonismo describe un síndrome caracterizado por rigidez, temblor y
bradikinesia, del cual la EP es la principal causa y la enfermedad más
Capítulo I. Introducción 84
común que afecta a la función motora y movimiento. La patología es atribuida a
la pérdida selectiva de neuronas en la substantia nigra, dañando las
proyecciones dopaminérgicas desde la substantia nigra pars compacta hasta el
núcleo caudado y estriado, comprometiendo a los ganglios basales y
neoestratum. Además afecta a las neuronas motoras de la columna vertebral y
tronco cerebral, causando fragilidad muscular y debilitamiento, que puede ir
acompañada de demencia progresiva (Mayeux, 2003). Patológicamente, el
envejecimiento está asociado con la pérdida de neuronas pigmentadas en la
substantia nigra, pero en un patrón que difiere del contemplado en la EP
(McGeer, 1977).
Entre las neuronas que permanecen, se desarrollan los denominados cuerpos
intraneuronales de Lewy y las neuritas de Lewy. Los cuerpos de Lewy,
responsables de la mayoría de los síntomas no motores, no están confinados a la
substantia nigra, sino que aparecen en corteza, amígdala, locus coeruleus ,
núcleo vagal, y el sistema nervioso autonómico periférico (Braak, 2003).
Figura I.8.: Cuerpos de Lewy propios de la EP. Son estructuras eosinofílicas
presentes en el citoplasma de las neuronas. Normalmente son circulares, con un
núcleo proteínico denso rodeado de un halo periférico.
Capítulo I. Introducción 85
Los signos clínicos aparecen cuando se ha perdido tanto un 80% de la DA
estriatal como un 50% de las neuronas nigrales (Fearnley, 1991). Al igual que
en la EA, el diagnóstico definitivo de la EP idiopática se realiza en estudios
post-mortem.
Numerosos estudios parecen confirmar la naturaleza multifactorial de la
epidemiología de la EP, en la que el envejecimiento, factores ocupacionales,
ambientales y genéticos parecen influir en el riesgo de padecer la enfermedad
(Gorell et al., 2004).
Entre las características motoras asociadas a la EP, destacan el temblor de
reposo, rigidez y bradikinesia y entre los rasgos no-motores, la disfunción
autonómica, cambios cognitivos y psiquiátricos, síntomas sensoriales y
alteraciones del sueño (Samii et al., 2004).
El 40% de los individuos con la EP desarrolla demencia y el 50% presenta
depresión. Las similitudes clínicas, patológicas y genéticas entre la EP y la EA
sugieren que la ApoE podría estar implicada en la etiología de la EP (Wilson,
2000). Un par de estudios recientes relacionan la EP con esta lipoproteína,
aunque únicamente Parsian y colaboradores obtienen una asociación
significativa entre el alelo apo 4 y los pacientes de la EP con demencia
(Parsian, 2002).
Mientras que en la EA, el alelo apo 2 ejerce un papel neuroprotector
retrasando la edad de inicio de la patología, no existen evidencias de esa
asociación en el caso de la EP. Sin embargo, el alelo apo 4 parece ejercer el
mismo efecto en ambas patologías, incrementando el riesgo y disminuyendo la
edad de inicio de la enfermedad, aunque en la EP el efecto parece más
moderado que en la EA. En base a este hallazgo, parece lógico sugerir que la
patofisiología de la EA y de la EP podrían compartir ciertos elementos. De
hecho, los alelos apo parecen estar asociados de manera significativa con las
respuestas de las neuronas al estrés neurológico presente en la EA, la EM, la
esclerosis lateral amiotrófica y la EP (Li et al., 2004).
Capítulo I. Introducción 86
I.2.3.4. Dopamina y la EP.
Uno de los principales rasgos de la EP es la degeneración de las neuronas
dopaminérgicas del cerebro medio, que lleva a la total pérdida de la dopamina
cerebral (DA). Aunque las neuronas de DA son escasas (<1/100.000 neuronas
cerebrales), desempeñan un papel muy importante en la regulación del
comportamiento motor, del humor, de la motivación y de la memoria de trabajo
(Girault and Greengard, 2004).
La DA fue identificada como un neurotransmisor potencial en el cerebro a finales
de los 50s por Carlsson (Carlsson, 1959). Años después se comprobó que la EP
estaba acompañada de un descenso dramático en el contenido de DA de los
núcleos putamen y caudado, lo que condujo a la aplicación de levodopa, un
precursor metabólico de la DA, como terapia eficaz de remplazamiento para
aliviar los síntomas de la EP.
Figura I.9.: Degradación de la DA en las neuronas nigrostriatales. La
enzima mitocondrial MAO metaoliza la DA en la sustancia negra, favoreciendo la
pérdida de este neurotransmisor en las terminales nerviosas con la consecuente
pérdida de funciones motoras ligadas a la región nigroestriatal del cerebro.
Capítulo I. Introducción 87
Los cuerpos celulares de las neuronas de DA que inervan el núcleo caudado y
el putamen, están localizados en la denominada sustancia negra, mientras que
aquéllas que inervan el estriado ventral y la corteza prefrontal presentan una
localización más medial en el área tegmental ventral. La DA no es un simple
neurotransmisor excitatorio o inhibitorio, sino que se trata de un
neuromodulador que altera la respuesta de las neuronas diana a otros
neurotrasmisores en función del estado funcional en que se encuentren esas
neuronas. La DA también regula la actividad de los canales iónicos de voltaje,
tanto de Na+ como de Ca 2+, mediante la modulación del estado de
fosforilación de estos canales o de proteínas asociadas.
En el cerebro en desarrollo de los mamíferos, la DA contribuye a la
morfogénesis mediante la dirección de las células madre neurales. Estudios in
vitro e in vivo avalan la capacidad que posee la DA para regular la
neurogénesis durante la edad adulta, por lo que la pérdida de este
neurotransmisor en la EP afecta inexorablemente a la neurogénesis en estos
pacientes, que presentan una reducción en los precursores neuronales
(Hoglinger et al., 2004).
I.2.3.5. Mecanismo de neurodegeneración en la EP.
La neurodegeneración podría relacionarse con la disfunción mitocondrial,
estrés oxidativo, excitotoxicidad, apoptosis e inflamación. El descubrimiento
de las mutaciones en los genes que codifican para la -sinucleína, parkina y
ubiquitina C-terminal hidrolasa-1 en la variante familial de la EP, sugieren un
posible error en el sistema ubiquitín-proteosoma como vía final común en
neurodegeneración (McNaught, 2001).
La sustancia negra par compacta de los pacientes de la EP contiene
numerosas proteínas nitradas y oxidadas, resistentes a la degradación
proteosomal, lo que sugiere un incremento de la excitotoxicidad, aunque el
mecanismo exacto por el que tiene lugar la concentración anormal de
proteínas es aún desconocido (Halliwell, 1998).
Capítulo I. Introducción 88
I.2.3.6. Actividades enzimáticas implicadas en la EP:
Monoamino oxidasa (MAO).
La actividad enzimática mitocondrial denominada monoamino oxidasa (MAO)
regula los niveles intracelulares de aminas biogénicas (ej: neurotransmisores y
neurotoxinas) y la actividad neuronal en el SNC, eliminando el nitrógeno de los
grupos amino de las moléculas sobre las que actúa y protegiendo al organismo de
los efectos de las aminas dietarias activas farmacológicamente. Las dos
isoenzimas de MAO, A y B, inactivan catecolaminas como la DA, adrenalina,
noradrenalina e histamina, y parecen tener diferentes dominios de actividad en
el organismo. Ambas isoenzimas presentan diferentes sustratos y
especificaciones de inhibición, y están codificadas en dos genes del brazo corto
del cromosoma X. El tejido cerebral presenta ambos tipos de actividad, aunque
las neuronas adrenérgicas parecen presentar actividad MAO-A exclusivamente.
La MAO-A oxida preferentemente serotonina, y es inactivada irreversiblemente
por bajas concentraciones de clorgilina. La MAO-B oxida feniletilamina y es
inactivada irreversiblemente por pargilina y deprenil. La DA, tiramina y
triptamina son sustratos de ambas isoenzimas. La inhibición de la MAO-B se
asocia con la mejora en la actividad de la DA, al igual que con el descenso en la
producción de peróxido de hidrógeno (H2O2). Ambas actividades están mediadas
por diferentes moléculas enzimáticas y están reguladas independientemente por
factores endógenos y exógenos, incluyendo determinantes genéticos, hormonas,
y envejecimiento. En humanos, la inhibición de la actividad MAO-A se relaciona
con el tratamiento de la depresión, mientras que la baja actividad MAO-B puede
aliviar los síntomas y ralentizar la progresión de la EP (Pintar and Breakefield,
1982). La digestión normal de la DA por parte de la MAO-B, se lleva a cabo
mediante un proceso de desaminación de la DA para formar un aldehído, NH4 y
H2O2, la cual suele degradarse por acción de una glutatión peroxidasa, en
presencia de hierro, rompiéndose en radicales hidróxido que dañan las
membranas celulares. Por tanto, cuando se afectan las membranas de las
neuronas dopaminérgicas, se favorece el desarrollo de la EP.
Capítulo I. Introducción 89
I.2.4. Esclerosis múltiple (EM).
I.2.4.1. Origen de la EM.
Hace unos años, se propuso una hipótesis según la cual la EM se produciría
en las poblaciones con antecedentes escandinavos, a través de las invasiones
vikingas, que fueron más extensas de lo que se suele conocer y que llegaron
no sólo a Inglaterra, Irlanda, Islandia, Groenlandia o la zona más
septentrional de los EE.UU, sino a países situados al sur como Francia,
España, Italia, Grecia, Turquía, Rusia y parte de Asia (Poser, 1995).
I.2.4.2. Incidencia de la EM.
La Esclerosis Múltiple (EM) es la enfermedad neurológica crónica
desmielinizante primaria del SNC más frecuente en adultos jóvenes en Europa
y Norteamérica, a la que además se le atribuye un carácter autoinmune,
mediada por células Th1 CD4+ mielina-específicas, que culmina en
neurodegeneración (Croxford, 2003). En España se han completado 5
estudios que demuestran que se trata de una zona de riesgo medio-alto, con
cifras en torno a los 50 pacientes/100.000 habitantes, 3 nuevos
casos/100.000 habitantes/año y 0.35 fallecimientos/100.000 habitantes/año
(Fernandez, 1990).
Se expresa en sujetos genéticamente predispuestos sobre los que, por azar,
incidiría un factor ambiental desconocido, probablemente un virus, que
activaría un proceso inmune anormal, que originaría los fenómenos
inflamatorios y desmielinizantes propios de la enfermedad. La predisposición
genética es compleja, estando involucrados varios loci en su susceptibilidad.
Se han descrito focos y epidemias, que apoyan la existencia de un factor
ambiental.
Las mujeres están más afectadas por la EM, con una frecuencia doble a la de
los hombres. La enfermedad comienza al inicio de la edad adulta, con ataques
inflamatorios recurrentes contra la materia blanca del cerebro, causando una
Capítulo I. Introducción 90
miríada de daños neurológicos, incluyendo ceguera, pérdida de sensación y
coordinación, incontinencia de intestinos y vejiga, y dificultad para caminar.
Alrededor de un tercio de los pacientes que desarrollan la forma recaída-
remisión, evolucionan a una forma más crónica con una marcada
discapacidad.
I.2.4.3. Neuropatofisiología de la EM.
El principal marcador de la enfermedad es la placa, que es un área de mielina
que ha sido denudada por inflamación y marcada subsecuentemente por la
cicatrización de células no-neurales en el cerebro, incluyendo microglía
derivada de médula ósea y astroglía (Steinman, 2003).
La etiología de la EM es aún enigmática, aunque la mayoría de los
investigadores abogan porque el ataque inmune contra la materia blanca es
primordial, derivando en la degeneración de los axones y la mielina como
procesos secundarios de esa inflamación. Probablemente, el proceso inmune
presente en la EM sea una consecuencia y no la causa, que sería única y de
naturaleza infecciosa, basada en la evidencia epidemiológica que confiere a las
infecciones víricas la propiedad de iniciar/exacerbar la enfermedad clínica
(Olson, 2001). Las evidencias de una causa viral de la EM son indirectas, pues
no se ha logrado aislar de forma reproducible ningún virus ni partícula viral
en tejidos afectados por la enfermedad. Los virus implicados en la etiología de
esta enfermedad, incluyen virus del moquillo canino, virus del sarampión,
virus de varicela zoster, virus del herpes simple HHV6, virus de la encefalitis
por garrapatas y retrovirus Lm7 (Simon, 1996).
Capítulo I. Introducción 91
Numerosos grupos han analizado los polimorfismos en todo el genoma, para
determinar la conexión con la susceptibilidad a la EM (Dyment, 2002). De
todos estos estudios, se establece que los transcritos más abundantes en las
placas de EM, corresponden a la B-cristalina, prostaglandina D sintasa,
proteína de unión prostática, proteína ribosomal L17 y osteopontina. La
osteopontina debe ejercer funciones pleiotrópicas en la patogénesis de la
enfermedad desmielinizante. La producción de esta proteína por parte de las
células gliales puede atacar a las células Th1, y cuando es expresada por glía y
células ependimales, puede permitir que las células T penetren en el cerebro.
Recientemente se ha comprobado la capacidad de las neuronas para producir
esta molécula y participar en el proceso autoinmune.
I.2.4.3.1. Fase inflamatoria y fase neurodegenerativa de la
EM.
Las células T, las células B y las células presentadoras de antígenos,
incluyendo los macrófagos, entran en el SNC, donde secretan ciertas
citoquinas responsables del daño a la oligodendroglía, las células responsables
de fabricar la mielina que cubre los axones neuronales (ver figura I.11.). El
daño causado a la mielina afecta a la transmisión de los impulsos eléctricos.
Una vez que la BHE está quebrada, numerosas células inflamatorias pueden
penetrar y acumularse en la sustancia blanca. Dentro del cerebro, las células T
autorreactivas y los macrófagos que las acompañan, permiten la liberación de
moléculas capaces de dañar la capa de mielina, como la osteopontina,
interleukina-23, interferón-gamma y el factor de necrosis tumoral alfa (FNT-
). La presencia de osteopontina puede atraer a los linfocitos Th1
colaboradores. Concomitantemente, las células B producen anticuerpos
mielina-específicos, que interaccionan con el complejo terminal y la cascada
del complemento para generar complejos de ataque a la membrana que
continuan dañando a la oligodendroglía (Steinman, 2003).
Capítulo I. Introducción 92
Figura I.11.: Representación de las fases neurodegenerativa e
inflamatoria de la EM. La alteración conjunta de las células T y B, lleva a la
producción de sustancias químicas capaces de dañar el revestimiento de mielina de
los axones nerviosos del propio individuo.
I.2.4.4. Genética de la EM.
Los estudios genéticos de ligamiento y asociación han identificado al complejo
mayor de histocompatibilidad, como un determinante genético para la EM,
localizado en el brazo corto del cromosoma 6 (Compston, 1995). Este complejo
codifica los antígenos del sistema de histocompatibilidad que presentan los
antígenos peptídicos a las células T. La región clase II de este sistema, se asocia
fuertemente con la EM, en particular
Capítulo I. Introducción 93
con el alelo DR2 y su correspondiente haplotipo (DRB1*1501, DQA*0102,
DQB1*0602).
Los estudios familiares han permitido saber que la EM es entre 10 y 50 veces
más frecuente en los familiares de afectados por la enfermedad, que en la
población general, dependiendo del sexo. La transmisión recesiva ligada al
sexo, se elimina por la tasa mujer:hombre de 2:1 en los pacientes, mientras
que la herencia mitocondrial se elimina por la transmisión hombre-mujer. En
base a esto, se hipotetiza que en la EM existe un factor genético de
susceptibilidad, compatible con una herencia poligénica.
I.2.4.5. Modelos animales de la EM.
Uno de los modelos de la EM más utilizados en animales, es el de la
denominada encefalitis autoinmune experimental (EAE). El modelo de EAE
en marmotas, gracias a su similitud genética e inmunológica con el hombre,
provee de una plataforma experimental única para la investigación de los
mecanismos inmunopatogénicos básicos y para el desarrollo de tratamientos
más efectivos frente a la EM (t Hart et al., 2004).
Capítulo I. Introducción 94
I.3. Terapias.
La naturaleza multifactorial de la neurodegeneración, podría explicar por qué
únicamente un limitado número de terapias clínicas neuroprotectoras que
utilizan drogas simples, terminan avocadas a proporcionar resultados no
significativos. Por tanto, el objetivo principal en la investigación en
neurodegeneración y neuroprotección, es determinar cuales de esos factores
constituyen el evento primario, la secuencia en que dichos eventos se
desarrollan y si actúan en la ejecución de los procesos patogénicos.
Las estrategias de las terapias noveles neuroprotectoras apoyan la aplicación
de basureros de EROs, quelantes de metales de transición (ej: hierro y cobre),
drogas anti-inflamatorias no esteroideas, polifenoles antioxidantes naturales
no vitamínicos y drogas anti-apoptóticas.
I.3.1. Farmacología.
I.3.1.1. Aplicada a la EA.
I.3.1.1.1. Inhibidores de la Acetilcolinesterasa.
La pérdida de neuronas colinérgicas centrales del tronco cerebral basal fue la
primera observación bioquímica que se relacionó con la EA, y los déficits
colinérgicos se han relacionado directamente con la alteración en el procesado de
PPA (Roberson, 1997). Hasta la fecha, la única droga aprovada por la
Administración Federal de Drogas para el tratamiento sintomático de la EA, son
los inhibidores de acetilcolinesterasa, tacrina, donepezil, rivastigmina y
galantamina. Estos agentes no detienen la progresión, pero los estudios clínicos
han demostrado que estabilizan temporalmente el daño cognitivo y ayudan a
mantener la función global. Por tanto, las terapias que mejoran la función
colinérgica es probable que permanezcan en los regímenes de multidrogas.
Capítulo I. Introducción 95
I.3.1.1.2. Drogas anti-A .
La “hipótesis del amiloide”, que soporta la idea que el péptido A es el
principal responsable tanto de los casos familiares como esporádicos de la EA,
ha llevado a que la reducción en la generación, agregación y deposición de las
fibrillas de amiloide, constituya uno de los focos primordiales en el desarrollo
de drogas en la lucha contra la EA.
En este sentido, el uso de compuestos basados en difluorocetonas como
inhibidores de las -secretasas parece resultar una estrategia terapéutica de
utilidad. Entre las actuaciones más prometedoras que mejoran la eliminación
de A , figura la inmunización con A inyectado directamente en el modelo de
ratón PPA transgénico de la EA, que sobreproduce este péptido.
Pequeñas moléculas como el Congo rojo, algunos antibióticos y
antineoplásicos como la doxirubicina, previenen la toxicidad de A ,
posiblemente por la estabilización de los monómeros y la prevención de
oligomerización. Un antibiótico tan antiguo como el clioquinol, es efectivo
como interruptor de la fibrilación de A , aparentemente por su poder
quelante de hierro y de cinc (Cherny, 2001). Recientemente se ha descrito una
novedosa glicoproteína plasmática resistente a la proteolisis, denominada
proteína amiloide sérica, con capacidad para unirse a las fibrillas de A y
bloquear su degradación, desestabilizando los depósitos de A (Pepys, 2002).
La identificación de agentes capaces de eliminar esta proteína, favorecerían la
limpieza de los depósitos. El mejor candidato es el CPHP, un derivado
palindrómico de la prolina.
Capítulo I. Introducción 96
I.3.1.1.3. Agentes anti-inflamatorios.
Se ha observado una reducción en la frecuencia de la EA entre los individuos
tratados con drogas anti-inflamatorias no esteroideas, como el ibuprofeno, que
podrían actuar mediante la reducción de la cantidad de A 1-42 y/o alterando la
actividad -secretasa (Blasko, 2001; Weggen, 2001). Se ha asumido que el
mecanismo a través del cual actuarían las drogas anti-inflamatorios no
esteroideas, sería mediante la inhibición de la ciclooxigenasa (COX-1 y -2),
enzima implicada en la producción de mediadores de la respuesta inflamatoria.
Sin embargo, en este tipo de diana terapéutica hay que resaltar que hay
numerosas respuestas inflamatorias que son beneficiosas, lo que incrementa la
complejidad del desarrollo de nuevas drogas de este tipo.
I.3.1.1.4. Terapia hormonal sustitutoria.
El uso de estrógenos por mujeres post-menopáusicas, se relaciona con una
reducción en el riesgo de desarrollar la EA (Tang, 1996). Los estudios en modelos
animales parecen indicar que los estrógenos ejercerían un efecto anti-amiloide, a
través de la regulación del procesado de PPA a través de la vía amiloidogénica
(Greenfield, 2002).
I.3.1.1.5. Estatinas.
La asociación entre los agentes que reducen los niveles de colesterol en plasma
(inhibidores de la 3-hidroxi-3-metilglutaril coenzima A reductasa, HMG-CoA
reductasa) y la EA es positiva, disminuyendo el riesgo de iniciar la enfermedad
en algunos ensayos clínicos, posiblemente debido al papel de las lipoproteínas y
sus receptores en la limpieza de depósitos de A del cerebro, aunque su
efectividad necesita ser revisada y confirmada en futuros estudios (Fassbender et
al., 2002; Wolozin et al., 2000).
Capítulo I. Introducción 97
La eficacia de los AGPIs omega-3 en el tratamiento de la hipertrigliceridemia
es un hecho bien establecido (Harris, 1989). Pacientes con hiperlipidemia
combinada tratados con Pravastatina y AGPIs omega-3, muestran una
prometedora mejora a nivel de lípidos y lipoproteínas séricas. De manera
similar, se demuestra la efectividad de la administración de inhibidores de la
HMG-CoA reductasa combinados con ácido eicosapentaenoico (EPA),
mejorando el perfil lipídico de pacientes con hiperlipidemia (Nakamura et al.,
1999).
Los fármacos inhibidores de la enzima HMG-CoA reductasa, poseen un efecto
limitado en la reducción de los triglicéridos. La suplementación con AGPIs
omega-3 disminuye levemente el colesterol total sin incrementar el contenido
en lipoproteínas de baja densidad (LBD)-colesterol. Por tanto, cuando la
síntesis de colesterol es inhibida por las estatinas, los efectos de omega-3
favoreciendo la conversión de las lipoproteínas de muy baja densidad (LMBD)
en LBD se mantienen al margen (Lu et al., 1999).
I.3.1.1.6. Neurotransmisores: Acetilcolina (Ac).
La reducción de acetilcolina en torno a un 50%, está asociada con la pérdida
de neuronas sinápticas en un orden similar, identificando a los déficits
neuroquímicos con un reflejo de la desaparición neuronal. Los precursores de
Ac como la colina, han demostrado un beneficio a corto plazo en estudios de
demencias (Fioravanti, 1998). La administración de derivados de piridina, que
son agentes bloqueantes de canales de potasio, como la linopirdina o la
besipirdina, no son efectivos como liberadores de Ac. En cuanto a los
agonistas de receptores de Ac, como la xanomelina, sabcomelina, milamelina
y talsaclidina, presentan cierto beneficio pero están actualmente en fase
experimental. Agonistas nicotínicos como la galantamina, uno de los
inhibidores de la colinesterasa, ha demostrado ser eficaz en ensayos clínicos
mediante modulación alostérica.
Capítulo I. Introducción 98
I.3.1.1.7. Moduladores del receptor NMDA.
La excitotoxicidad provocada por la desrregulación de la actividad del
receptor NMDA, que provoca muerte neuronal, ha llevado al uso de
antioxidantes y desarrollo de moduladores efectivos de los receptores NMDA
para actuar sobre el daño neuronal.
La memantina es un antagonista no competitivo del receptor NMDA de
moderada afinidad, capaz de bloquear los canales del receptor NMDA en
estado de reposo, de manera similar al bloqueante fisiológico Mg2+,
disociándose del canal una vez activado. Esta capacidad para bloquear-
desbloquear tan rápidamente, priva a los pacientes de la EA de los efectos
secundarios asociados con los antagonistas de elevada afinidad. Los estudios
iniciales realizados en Estados Unidos, revelan un beneficio estadísticamente
significativo en pacientes con demencia moderada a severa (Rogawski, 2003).
Capítulo I. Introducción 99
I.3.1.2. Aplicada a la EP.
Los estudios realizados con agentes potencialmente neuroprotectores como la
vitamina E, selegilina (deprenil) y coenzima Q, ralentizan la progresión de la
enfermedad, aunque queda por verificar si se trata de un auténtico efecto
neuroprotector. Los ensayos con inhibidores de MAO-B selectivos han
provisto de evidencias suficientes para apoyar su acción como anti-depresivos,
posibles neuroprotectores y frente a la EP. La acción selectiva de estos
inhibidores sobre las formas específicas de MAO, resulta en la elevación de los
niveles de noradrenalina y serotonina (inhibición de MAO-A) y de DA y
feniletilamina (inhibición de MAO-B) (Shoulson, 2002). Los resultados de los
ensayos controlados con agonistas de DA frente a levodopa, indican que los
pacientes que comenzaron el tratamiento con tales agonistas mostraban una
tasa más lenta de pérdida de neuronas nigroestriatales con respecto a aquéllos
que recibieron levodopa. Sin embargo, la terapia con estos agonistas es eficaz
únicamente para tratar el primer par de años de la enfermedad. La levodopa
continúa siendo la droga antiparkinsoniana mas potente, a pesar de los
efectos colaterales (Luquin, 1992).
I.3.1.3. Aplicada a la EM.
El propósito más importante en cualquiera de los tratamientos terapéuticos de
la EM, es la prevención o pospuesta de la discapacidad a largo plazo.
Actualmente, los tratamientos disponibles son (revisados en (Goodin, 2002):
1) Inmunomoduladores: Interferon Beta, Cannabioides, Glatiramer
acetato.
2) Inmunosupresores: Ciclofosfamida, Metotrexato, Azatioprina,
Cladribina, Mitoxantrona.
3) Antiinflamatorios: Glucocorticoides
4) Otros: Inmonuglobulina intravenosa, intercambio plasmático,
vacunación con ADN (Dumont, 2004).
Capítulo I. Introducción 100
I.3.2. Dieta.
I.3.2.1. Antioxidantes.
En 1979, Miquel y Ecónomos fueron los primeros en demostrar que la
administración de algunos antioxidantes era capaz de aumentar la vitalidad y
la longevidad media de ratones. Posteriormente se observó que la
administración de ciertos antioxidantes protegía frente al deterioro de la
función inmune asociada al envejecimiento. El SNC, por su composición rica
en AGPIs, de fácil oxidación, es particularmente sensible a la alteración que
dicho proceso causaría en estructuras nerviosas. Aunque los estudios
epidemiológicos aún son muy parciales, se están realizando algunos ensayos
con suplementos de vitamina E para retardar la evolución de la EA o la EP.
I.3.2.1.1. Búsqueda de antioxidantes.
Por definición, una sustancia que está presente a bajas concentraciones en
comparación con las de un sustrato oxidable, puede ser considerada como un
antioxidante.
La intensa investigación relacionada con los mecanismos responsables de la
muerte neuronal, ha conducido a la utilización de antioxidantes como terapia
que podría actuar contra el envejecimiento y las enfermedades
neurodegenerativas.
Capítulo I. Introducción 101
Los antioxidantes contenidos en la dieta, especialmente los polifenoles,
presentan actividades anti-inflamatorias, son quelantes de hierro y son
capaces de eliminar radicales libres. La dieta Mediterránea, rica en frutas,
vegetales, cereales y legumbres y relativamente poca cantidad de carne, se
asocia desde hace años con una reducida incidencia en enfermedad coronaria
y algunos tipos de cáncer (Willet, 1995). Las grasas de la dieta son
determinantes ambientales significativos de aterosclerosis, y el aceite de oliva
es la grasa elegida en la región Mediterránea, donde es consumida en grandes
cantidades. El aceite de oliva es rico en ácido oleico (18:1n-9), que es también
el ácido graso monoinsaturado más abundante en todas las dietas y tejidos.
Una mayor ingesta de ácido oleico junto a una concomitante reducción en la
ingesta de grasa saturada, constituye uno de los pilares más importantes de
los efectos favorables de la dieta Mediterránea sobre la salud humana (Visioli,
1998a).
I.3.2.1.1.1. Aceite de oliva: DOPET.
El aceite de oliva se obtiene de las aceitunas del Olea Europea, un árbol que
crece fundamentalmente entre los paralelos 30 y 45. Forman parte importante
de la dieta Mediterránea y son reconocidas como fuente de la denominada
“comida funcional” por su contenido en antioxidantes fenólicos naturales.
Posee una composición única, a base de un 56%-84% de ácido oleico y un 3%-
21% de ácido linoleico (18:2n-6). Algunos estudios atribuyen un efecto
modesto pero directo en la reducción de los niveles de colesterol para las
grasas monoinsaturadas cuando se toman de manera independiente y
reemplazando equicalóricamente a la ingesta de carbohidratos (Mensink,
1992).
Capítulo I. Introducción 102
Entre las actividades biológicas atribuídas a los fenoles del aceite de oliva
figuran la inhibición de la oxidación de las lipoproteínas de baja densidad,
tanto in vitro como ex vivo, la inhibición de la derivatización de apoproteínas
y de la agregación plaquetaria, la reducción de los tromboxanos B2 y
leucotrienos B4 producidos por leucocitos humanos activados, la eliminación
de las especies superóxido y reactivas de oxígeno, la inhibición del daño al
ADN, de la nitración inducida por tirosina activadas por peroxinitrito y acción
hipotensiva, entre otras muchas (Visioli, 2001).
La fracción polifenólica del aceite de oliva supone de 500 a 800 mg/kg, en
función de otros factores clave, como la manera de producción y almacenaje
del aceite (Tsimidou, 1992). La estructura de los compuestos fenólicos,
formados por anillos aromáticos con sustituyentes hidroxilos, es
especialmente adecuada para ejercer una actividad antioxidante (donador de
hidrógeno o electrones, o captador de radicales libres). Es un hecho bien
establecido, el que la mayoría de las enfermedades neurodegenerativas
acumulan hierro en las regiones donde tiene lugar la muerte neuronal. Por
tanto la capacidad de los compuestos fenólicos como quelantes de metales,
especialmente cobre y hierro, les permite actuar indirectamente como
antioxidantes mediante la inhibición de la acción de los metales como
catalizadores en la formación de radicales libres (Conner and Grisham, 1996).
Además, la quelación de hierro es una aproximación terapéutica prominente
en la neuroprotección de la EP, la EA y la EM.
Capítulo I. Introducción 103
Entre esos compuestos fenólicos se encuentran los fenoles simples de C6-C2,
flavonoides y seicoiridoides. La oleuropeína, el principal seicoiridoide amargo
que debe ser eliminado de las aceitunas para hacerlas comestibles, y sus
derivados hidrolíticos, como el DOPET (3,4-dihidroxifeniletanol), oleuropeína
aglicanos y oleodio-11-metil ester, son los componentes fenólicos
predominantes en la pulpa de la aceituna (Panizzi, 1960). Otros compuestos
fenólicos que son cuantitativamente importantes son el tirosol y ácidos
fenólicos como el ácido vanílico y cafeico. Todos estos fenoles están
implicados en la prevención de la formación de otros productos de
peroxidación lipídica, como los isosprostanos, malondialdehido y
lipoperóxidos, manteniendo sus niveles cercanos a los basales. Otras
actividades biológicas atribuidas a estos polifenoles son la modulación de la
formación de trombos y de la inflamación, la defensa del hospedador ante la
infección por parásitos, propiedades antimutagénicas, anticarcinogénicas y
antiglicémicas (Benavente-Gª, 2000; Visioli, 1998b). La elección de un aceite
vírgen extra, cuyo contenido en polifenoles es el más elevado, permite un
mayor consumo de antioxidantes (aproximadamente 30-50 mg/día) que
poseen potentes actividades biológicas.
El 3,4-dihidroxifeniletanol (DOPET) es el principal o-difenol detectable en el
aceite de oliva virgen extra, tanto en su forma libre como esterificada con ácido
elenólico para formar oleuropeína aglicano (Capasso, 1996).
Fig.I.2.: Estructura química de DOPET.
Capítulo I. Introducción 104
Esta molécula hidrosoluble y liposoluble ejerce su actividad como
antioxidante tanto como quelante de iones metálicos libres como eliminando
radicales peroxilos (Aeschbach, 1994; D'Angelo, 2001). En condiciones
alcalinas, en presencia de cationes metálicos, el contenido de este compuesto
se ve reducido de manera significativa, lo que se atribuye a una oxidación
fenólica, que lleva a la total desaparición de este o-difenol tras 24 horas de
exposición a estos iones (Lattanzio, 1994).
I.3.2.1.1.1.1. Actividades biológicas de DOPET.
Uno de los prerequisitos para demostrar su significancia fisiológica, es la
determinación de dicho compuesto en el plasma humano. Un estudio reciente
en voluntarios confirma que el 98% del DOPET administrado en forma de
aceite de oliva virgen, aparece en plasma y orina en su forma conjugada,
principalmente glucuronoconjugados, sugiriendo un extensivo metabolismo
intestinal/hepático (Miro-Casas, 2003).
Las actividades biológicas del DOPET han sido revisadas recientemente. En
estudios in vitro se ha demostrado su capacidad para prevenir la oxidación de
LBD, la agregación plaquetaria e inhibición de las enzimas 5- y 12-
lipoxigenasas. Igualmente, ejerce un efecto inhibidor en las modificaciones en
las bases del ADN dependientes de peroxinitritos y nitración de tirosina.
Experimentos sobre citotoxicidad, revelan la efectividad de este compuesto
para contrarrestar los efectos citotóxicos ejercidos por especies reactivas de
oxígeno sobre varios sistemas de células humanas, como la protección frente a
la hemólisis y la formación de malondialdehido provocadas por H2O2 en
glóbulos rojos Además, recientemente se ha validado su efecto
antiproliferativo, su capacidad para atravesar la barrera hematoencefálica
(BHE) y la capacidad de permeabilizar las membranas de las células
intestinales humanas, que difunden de manera pasiva (Manna, 2000).
Capítulo I. Introducción 105
I.3.2.1.1.1.2. Metabolismo de DOPET.
Administrado oralmente, el DOPET puede ser absorbido tanto en ratas como
en humanos, aunque no existe información disponible sobre la toxicidad,
distribución orgánica y metabolismo (Bai, 1998). Estudios preliminares para
esclarecer el metabolismo de este compuesto, administrando exógenamente
DOPET-marcado a células intestinales, obtienen como único metabolito
marcado el MOPET, sugiriendo que la metilación podría estar catalizada por
la catecol-O-metiltransfesasa (COMT). Visioli y colaboradores aportan datos
en humanos, indicando que tras la ingesta del aceite de oliva de la dieta, este
fenol es absorbido de manera dosis-dependiente y excretado en la orina,
presumiblemente como un conjugado glucurónido (Visioli, 2000). Las
principales rutas metabólicas conocidas para el DOPET administrado
oralmente en ratas, quedan recogidas en la figura I.3.
Capítulo I. Introducción 106
Fig.I.3: Rutas metabólicas de DOPET. Los compuestos indicados se han
detectado en los órganos de rata, excepto MOPAL. La conversión de MOPET en
HVA a través de MOPAL se presupone (D'Angelo, 2001). Los compuestos, flechas y
conectores indicados en rojo pertenecen a la conexión entre DOPET y el
metabolismo de las catecolaminas [revisado en (Eisenhofer, 2001)]. COMT=
Catecol-O-metiltransferasa.
Los metabolitos oxidados (HVA y DOPAC) son las principales moléculas
derivadas del metabolismo de la DA, mediante la acción de la MAO y COMT en el
SNC. La conversión de DOPAC a DOPET a través de la DOPAC reductasa y de
DOPAC a MOPET ha sido descrita en cerebro de rata (Xu, 1995). Recientemente,
se ha detectado un incremento en los niveles de DOPAL y DOPET en el medio de
cultivo de células PC12 catecolaminérgicas incubadas en presencia de inhibidores
de la cadena respiratoria mitocondrial (Lamensdorf, 2000a; Lamensdorf,
2000b). Para confirmar si los metabolitos derivados de DOPET conservan las
propiedades biológicas de la molécula, se realizaron estudios in vitro que
confirman que la capacidad antioxidante se asocia con la integridad del motivo
ortodifenólico (Kohyama, 1997). La metilación del grupo hidroxil fenólico hace
perder dicha actividad. De hecho, DOPET reduce la proliferación celular e induce
MAO
DDOOPPEETTAldehído
deshidrogenasa
Aldehído reductasa DOPAL
Sulfotransferasa
Derivados sulfo-conjugados
COMT
Aldehído DH
DOPACHVA
COMTMOPAL
Derivados sulfo-conjugados
Sulfotransferasa
DOPAC
DOPAMINA
MAO
MOPET
Capítulo I. Introducción 107
apoptosis en leucocitos en respuesta a una rápida liberación del citocromo C
desde el espacio intermembranoso de la mitocondria (Della Ragione, 2000). A
pesar de los estudios que avalan la capacidad antioxidante de DOPET y sus
metabolitos, permanece aún por definir las bases moleculares de todos sus
efectos biológicos.
El hierro es uno de los metales más abundantes en el cerebro. Cierto nivel de
hierro debe estar disponible para actuar como cofactor en la síntesis de proteínas
y ácidos nucleicos, para las enzimas implicadas en la respiración mitocondrial y
la síntesis de neurotransmisores, al igual que para la síntesis de mielina (Ward,
1995). Sin embargo, cuando el hierro aparece en niveles superiores a los
necesarios, puede derivar en un componente tóxico para la célula. Se han
detectado tanto hierro como transferrina y ferritina en PN de la EA. Como metal
catalizador de reacciones oxidativas, algunos estudios sugieren que las proteínas
de unión a hierro, implicadas en la reacción de Fenton, se presentan en menor
cantidad en los pacientes de la EA (Evans, 1996). La administración oral de un
quelante de hierro biodisponible como el clioquinol, tanto en modelos animales
de la EP como en transgénicos de la EA, es significativamente beneficiosa para
ambas patologías (Cherny, 2001; Kaur, 2003).
La literatura que soporta los efectos biológicos beneficiosos de DOPET, lo
convierten en un buen candidato para diseñar estrategias terapéuticas noveles.
I.3.2.1.1.1.3. Relación de DOPET con catecolaminas.
Las catecolaminas son metabolizadas por múltiples enzimas, incluyendo la MAO,
COMT y sulfotransferasa. La aldehído reductasa y aldehído deshidrogenada,
actúan en secuencia con la MAO en la producción de los respectivos metabolitos,
resultando en una multiplicidad de rutas metabólicas. Como se observa en la
figura I.3., el principal metabolito procedente de la desaminación de la DA es
DOPAC, metabolizado a HVA mediante la acción de COMT.
Capítulo I. Introducción 108
I.3.2.1.2. Colesterol.
I.3.2.1.2.1. Metabolismo del colesterol: Latosterol C5-
desaturasa.
La ruta de biosíntesis de colesterol en mamíferos implica a más de 19
reacciones enzimáticas, comenzando con la condensación de acetil-CoA para
formar mevalonato, que se convierte en escualeno. A continuación y por
ciclación, se obtiene lanosterol. El colesterol se origina desde el lanosterol a
través de numerosas reacciones multienzimáticas, incluyendo
desmetilaciones, isomerización, desaturación y tres reducciones de puentes-
dobles (Figura I.4.) (Brunetti-Pierri, 2002). Los defectos en la biosíntesis de
colesterol, caracterizados por la acumulación de precursores metabólicos
específicos en los tejidos, están siendo implicados en numerosos síndromes de
malformación en humanos.
Las enzimas implicadas en la biosíntesis hepática de colesterol desde el
escualeno, se localizan en los microsomas (Bloch, 1965).
La enzima denominada latosterol C5-desaturasa (LC5D) cataliza la
introducción de un puente delta 5 en la molécula de latosterol (colest-7-en-3 -
ol) para formar 7-dehidrocolesterol (7-DHC), con la participación de oxígeno
molecular, nucleótidos reducidos de piridina y el sobrenadante obtenido tras
centrifugar a 105.000 x g (S105), que facilita la transferencia del sustrato
exógeno lipofílico desde los liposomas a la membrana que contiene la enzima,
asociada a las membranas microsomales al igual que su sustrato, el latosterol
(Ishibashi, 1981). La LC5D debe estar organizada en un sistema
multienzimático en la membrana, ya que la reacción requiere la presencia de
un sistema de transferencia de electrones desde el NADH hasta la desaturasa.
La hidropatía de LC5D sugiere que se trata de una enzima integral de
membrana con cuatro a cinco regiones de anclaje en la membrana (Kyte,
1982).
El retículo endoplásmico del hígado de rata es pobre tanto en el sustrato como
en el producto de la reacción de la LC5D, por lo que es un buen modelo para el
Capítulo I. Introducción 109
estudio de la cinética de enzimas de membrana. Para estudiar la cinética y las
propiedades de una enzima de membrana, donde uno de los sustratos es
también componente integral de la membrana, es necesario alterar la cantidad
de sustrato en la membrana mientras que se minimizan las ateraciones en el
ambiente de la membrana o en la conformación de la enzima. En este caso, se
preincorpora latosterol en las membranas microsomales mediante la
utilización de liposomas en presencia de una proteína citosólica, cuya
manipulación elimina la inserción cinética del sustrato lipofílico. La porción
de sustrato incorporado, es alcanzado por la enzima mediante difusión lateral
dentro del plano de la membrana (Takakuwa, 1994).
Fig I.4: Metabolismo del colesterol. A partir del latosterol, y mediante la enzima
LC5D, se obtiene el precursor del colesterol, 7-dehidrocolesterol.
Lanosterol Colest-8(9)- en-3 -ol
Colest-7-en-3 -ol (latosterol)
LC5D
7-dehidrocolesterol
COLESTEROL
4,4-dimetilcolest-8(9)-en-3 -ol
Capítulo I. Introducción 110
I.3.2.1.2.2. Colesterol y la EA.
El cerebro es el órgano del cuerpo humano que contiene mayor cantidad de
colesterol. Presenta una media de 20 miligramos de colesterol por gramo de
tejido, que es bastante más en comparación con los 3,2 miligramos de
colesterol por gramo de tejido presentes en el hígado (Sampugna, 1975). Una
de las razones que explican la relativa insensibilidad de las enfermedades que
afectan al SNC a los niveles séricos de colesterol, podría basarse en la
regulación independiente del metabolismo del colesterol en el SNC con
respecto a la periferia.
El factor de riesgo más prevalente en la EA identificado hasta la fecha es la
Apo 4, que es una isoenzima de la proteína de transporte de colesterol Apo E,
presente tanto en el cerebro como en la periferia (Mahley, 1988). Hay
multitud de enzimas implicadas en el metabolismo del colesterol que también
muestran una conexión putativa con el inicio tardío de la EA. Entre ellas
figuran la enzima colesterol 24-hidroxilasa asociada al citocromo P450
(Cyp46), implicada en la oxidación del colesterol a 24(s)-hidroxi-colesterol
(Papassotiropoulos, 2003).
El consumo de niveles elevados de colesterol y grasas saturadas está asociado
con un mayor riesgo de demencia, mientras que el consumo de pescado,
fuente importante de AGPIs, se asocia con la reducción de dicho riesgo y la
protección frente a la demencia (Kalmijn et al., 1997).
El nivel medio de colesterol total y de LBD-colesterol, están significativamente
elevados en pacientes de la EA con respecto a los controles sanos de avanzada
edad y relacionado con el estatus Apo 4 (Kuo et al., 1998; Notkola et al.,
1998). Los niveles de colesterol cerebral también aparecen elevados en la
corteza frontal de pacientes de la EA y enfermedad coronaria arterial (Sparks,
1997).
Un mayor consumo de ácidos grasos saturados y monoinsaturados y de
colesterol en la dieta, se relaciona con un aumento en el nivel de triglicéridos y
colesterol en suero y en cerebro y se asocia con un deterioro cognitivo (Oner et
al., 1991; Ortega et al., 1997).
Capítulo I. Introducción 111
En individuos de avanzada edad, los niveles plasmáticos de colesterol se
correlacionan con la presencia de lesiones en la materia blanca (Breteler et al.,
1994).
La distribución asimétrica del colesterol entre la cara exofacial y citofacial de
las membranas plasmáticas sinápticas, se va modificando a medida que
aumenta la edad, en base a la reducción en la fluidez de membrana y la
inhibición concomitante de la actividad ATPasa Ca2+/Mg2+, ya que ambas
dependen del contenido en colesterol y de un incremento en los productos de
peroxidación (Mecocci, 2004).
El colesterol procedente de la dieta, afecta el metabolismo del colesterol
cerebral, acelerando el envejecimiento cerebral con un incremento en los
niveles cerebrales de colesterol, a consecuencia de un mayor estrés oxidativo
(Sparks, 1997).
Las membranas de cerebros afectados por la EA, presentan una mayor
degradación de fosfolípidos, ya que la peroxidación lipídica altera la
composición de las membranas en contraste con el proceso normal de
envejecimiento, provocando una reducción en el ratio molar
colesterol:fosfolípidos que reduce la anchura de las membranas (Mason et al.,
1993; Nitsch et al., 1992).
El incremento en colesterol puede ser un mecanismo de defensa celular para
proteger las membranas del daño oxidativo. El colesterol es un débil
antioxidante y estabilizante de la estructura de las membranas (Urano et al.,
1997). Se ha sugerido que el colesterol formaría parte del sistema antioxidativo
jerárquico (incluyendo melatonina, ascorbato, ubiquinol, vitamina E, tioles
como el glutatión y los AGPIs) que protege a las células de las acciones
detrimentes de los oxirradicales (Joseph et al., 1997; Vatassery et al., 1997).
Cuando este sistema está sometido a estrés y deficiencias, el colesterol se oxida
y moviliza indicando que el colesterol de la membrana se intercambia con las
reservas exógenas cuando tiene lugar la peroxidación lipídica. Por tanto,
cuando el estrés oxidativo es suficiente, disminuye el contenido en colesterol
mitocondrial y microsomal e incrementa la fluidez de las membranas en las
sinapsis del cerebro (Wood et al., 1995).
Capítulo I. Introducción 112
En base a evidencias, existe un nexo de unión entre el metabolismo del
colesterol y la PPA. Los metabolitos de PPA en cerebro pueden ser modulados
por el colesterol de la dieta, un efecto que requiere la presencia de ApoE
(Howland et al., 1998). El colesterol incrementa los niveles celulares de PPA,
disminuye el metabolismo y la liberación de -PPAs e incrementa la
producción y deposición amiloidogénica de A (Bodovitz and Klein, 1996). A
disminuye la síntesis de varios lípidos, en particular de colesterol y
fosfolípidos.
El vínculo directo entre las alteraciones en el metabolismo del colesterol y
otros lípidos de membrana en la EA, permanece aún por esclarecer, ya que
aún no se conoce si tales alteraciones son responsables de la disfunción y
muerte neuronal. Los microdominios de membrana ricos en colesterol y
esfingolípidos son claves en varias rutas de señalización celular (Tsui-
Pierchala, 2002). La esfingomielina es la principal fuente de ceramidas, que
son generadas cuando la esfingomielina es procesada por las
esfingomielinasas, enzimas que son activadas por citoquinas inflamatorias
(Kronke, 1999). Las ceramidas desempeñan un papel destacado en la
regulación de procesos fisiológicos como la apoptosis (proceso que pueden
activar tanto en situaciones fisiológicas como patológicas) y están implicadas
en patologías como la EA y la EP (Alessenko, 2000). Se relaciona el
incremento en los niveles de estrés oxidativo asociado a las membranas, las
ceramidas de cadena larga y el colesterol libre de las células cerebrales,
durante el envejecimiento normal en neuronas en cultivo, en ratones y en
pacientes de la EA (Cutler et al., 2004). El modelo propuesto por el autor
sobre la patogénesis de la EA contendría la secuencia de eventos representada
en la figura I.5.
Capítulo I. Introducción 113
Fig. I.5.: Relación entre estrés oxidativo, colesterol y la patogénesis de
la EA. Datos recientes in vitro e in vivo sugieren la existencia de una interconexión
entre el estrés oxidativo generado como consecuencia del proceso normal de
envejecimiento, en combinación con la composición genética y la influencia del
ambiente, actuarían favoreciendo la acumulación de A , que a su vez
retroalimentaría dicho proceso oxidativo. El metabolismo del colesterol y la
producción de ceramidas aumentaría en respuesta a la oxidación, activando la
disfunción y muerte neuronal y propiciando la producción de A 42.
Estudios realizados en células no neuronales, avalan estos resultados.
Nuevamente, el estrés oxidativo y la producción de ceramidas generan la
acumulación de colesterol en estas células. Niveles elevados de colesterol en
cultivos celulares son capaces de inducir apoptosis, y el uso de estatinas
protege a las neuronas frente al daño oxidativo/isquémico (Buxbaum et al.,
2001; Honjo, 2002).
Producción y agregación de
AGenes,envejecimiento
y ambiente
Estrés oxidativo (Asociado a
membranas) Disfunción neuronal y muerte celular
Alteración de ceramidas y metabolismo del colesterol
Capítulo I. Introducción 114
I.3.2.1.2.3. Colesterol y la EM.
El perfil transcripcional de la EM indica que pueden estar involucrados
numerosos genes implicados en el metabolismo de los lípidos y el colesterol
(Lock, 2002). En cerebros de pacientes con la EM, se observa una menor
expresión de HMG-CoA reductasa, estearoil CoA desaturasa, acetoacetil-CoA
tiolasa, propionil CoA carboxilasa y enoil-CoA hidratasa. Dado el papel
pleiotrópico de HMG-CoA reductasa sobre el sistema inmune y la capacidad
de las estatinas para reducir los niveles de colesterol, mediante la inhibición
de esta enzima, se ha postulado la posible eficacia de las estatinas en el
tratamiento de la EM, y ya se han llevado a cabo prometedores estudios pre-
clínicos (Neuhaus, 2002; Youssef, 2002). Estudios con atorvastatina en el
modelo animal EAE de la EM, demuestran prevenir o revertir la patología
crónica, lo que lo convierte en una herramienta útil para actuar tanto en el
inicio de la fase inflamatoria como de la neurodegenerativa. La lovastatina
suprime la fase aguda de EAE en ratas (Stanislaus, 1999). En base a los
potenciales efectos neuroprotectores y anti-inflamatorios de las estatinas, se
las relaciona tanto con la EA como con la EM.
I.3.2.1.3. Ácidos grasos poliinsaturados (AGPIs).
Los ácidos grasos son componentes esenciales de la dieta humana, implicados
en el crecimiento y la reproducción. Están asociados con la obesidad y
numerosas patologías, como la enfermedad cardiovascular. El sistema
nervioso presenta el mayor contenido lipídico a continuación del tejido
adiposo. Entre el 50 y el 60% del peso seco del cerebro adulto son lípidos, 35%
de los cuales están representados por los ácidos grasos poliinsaturados y entre
los que los fosfolípidos son los componentes cuantitativamente más
significativos de las membranas lipídicas. Los ácidos grasos de la dieta son
importantes para el cerebro, influenciando tanto al tejido adulto como al
envejecido.
Capítulo I. Introducción 115
I.3.2.1.3.1. Clasificación de los ácidos grasos de la dieta.
Hay dos grupos principales de ácidos grasos dietarios, en función de su
metabolismo en mamíferos. El primero está formado por los ácidos grasos
saturados, responsables de proveer energía a la célula y el segundo lo
componen los ácidos grasos insaturados, precursores de numerosas hormonas
y generadores y/o controladores de procesos inflamatorios. Según el número
de dobles enlaces, pueden sub-clasificarse en (i) ácidos grasos
monoinsaturados, formados por una cadena de átomos de carbono con un
doble enlace, y (ii) AGPIs, con una cadena de dos o más dobles enlaces. Los
AGPIs, se subdividen, a su vez, en el grupo omega-3 y en el grupo omega-6
(Harris, 2004). La nomenclatura de los principales AGPIs omega-3 y omega-6
queda compilada en la figura I.6. (Yoshida et al., 1998). La mayoría de los
efectos beneficiosos se atribuyen a los omega-3, aunque es necesario
mantener un balance apropiado entre ambos tipos de AGPIs para el normal
desarrollo y mantenimiento del organismo. El balance óptimo de
omega6:omega3 para un adulto sano se aproxima a una relación 6:1
(Wijendran and Hayes, 2004). Algunos de los AGPIs son denominados ácidos
grasos esenciales (AGEs), ya que deben ser obtenidos de la dieta debido a la
imposibilidad para ser sintetizados por el organismo.
Capítulo I. Introducción 116
I.3.2.1.3.2. Funciones fisiológicas de AGPIs.
Los AGPIs son constituyentes de los lípidos como el colesterol y los
fosfolípidos, regulando funciones asociadas a las membranas, como las
actividades de enzimas, receptores y canales iónicos asociad unión de están
implicados en la regulación de la excitabilidad neuronal y la alteración de la
permeabilidad de las membranas celulares (Penzo et al., 2002). Hay una
correlación positiva entre la actividad molecular de las unidades (Na+, K+)-
ATPasa y la cantidad de ácido docosahexaenoico (ADH), uno de los AGPIs
omega-3 más beneficiosos, localizado en la bicapa lipídica circundante de los
tejidos. La suplementación de ratas envejecidas con elevadas cantidades de
ADH, revierte la reducción en la liberación de neurotransmisores relacionada
con la edad (McGahon et al., 1999). Además, los AGPIs son capaces de
modificar el comportamiento, actuando sobre la neurotransmisión
dopaminérgica (Chalon et al., 2001). La mejora de la función cortical
dopaminérgica, observada en ratas alimentadas con aceite de pescado, podría
ser una consecuencia del incremento en los niveles de ADH en la corteza. Sin
embargo, estos animales mostraban una reducida locomoción, que se
relacionó con los bajos niveles del principal AGPIs omega-6 en el estriado, el
ácido araquidónico (AA). Estos resultados contradicen a los observados en
ratas alimentadas con una dieta crónicamente deficiente en ácido -linolénico
(AAL) (Delion et al., 1996). Los animales alimentados con AA y ADH
presentaban mayores niveles de DA en las áreas cerebrales de
“procesamiento-integración” de la información visual-auditiva. Los AGPIs,
como moduladores putativos de la neurotransmisión en el cerebro y en el eje
hipotalámico-pituitario-adrenal, al igual que de las citoquinas en el sistema
inmune (SI), quedan recogidos en la figura I.7 (Yehuda et al., 1999). Controlan
la expresión génica de los tejidos lipogénicos, hígado y SI, cuya regulación
afecta a determinados procesos cognitivos y fisiológicos (Sessler and Ntambi,
1998). Los estudios en humanos y animales sobre los efectos de los AGPIs
omega-3 en en triglicéridos, LAD-colesterol, agregación plaquetaria, función
endotelial y vascular, presión sanguínea, excitabilidad cardiaca, estrés
Capítulo I. Introducción 117
oxidativo, citoquinas pro- y anti-inflamatorias y función inmune, revelan que
poseen efectos anti-inflamatorios clínicamente importantes (Mori and Beilin,
2004).
I.3.2.1.3.3. Metabolismo de los AGPIs.
Las rutas biosintéticas de los AGPIs omega-3 y omega-6 quedan detalladas en
la figura I.6. El metabolismo de los precursores, ácido linoleico (AL) y AAL,
involucra a las mismas enzimas, permitiendo una competición entre ambos
sustratos para la desaturación, aunque hay un-.a enzima que desatura/elonga
preferentemente a AAL, incrementando así la producción de omega-3 con
respecto a omega-6. La BHE desempeña un papel destacado durante el
transporte de AA y ADH desde la circulación hasta que penetran en el
cerebro. Estudios cuantitativos in vivo demuestran, que aproximadamente un
5% del contenido en ADH y AA del cerebro es metabolizado y reemplazado
por ácidos grasos provenientes de la dieta a través de la circulación sanguínea
(Rapoport, 2003). El cerebro es autónomo, con una lipogénesis activa de
novo de ácidos grasos monoinsaturados, produciendo AA y ADH en
diferentes regiones en función de los requerimientos metabólicos y los
procesa de una manera muy exclusiva.
Capítulo I. Introducción 118
18:2n-6 Ácido linoleico (AL)
4Desaturasa
ELO
6
18:3n-6 Ácido -linolénico
Aceites de girasol, maíz, soja, sésamo, cáñamo, onagra, borraja, semilla de grosella
20:3n-6Ácido dihomo- -linolenico
20:4n-6Ácido araquidónico (AA)
24:4n-6
24:5n-6
ELO
ELO
AGPIs OMEGA-6
22:5n-6 Ácido Docosapentaenoico
22:4n-6Ácido adrénico
18:3n-3 Ácido -Linolénico (AAL)
18:4n-3
20:4n-3
22:5n-3
24:5n-3
ELO
ELO
5
ELO
6
4Desaturasa
20:5n-3
Figura I.6: Rutas biosintéticas de los ácidos grasos dietarios en
mamíferos. Principales pasos de la biosíntesis de los ácidos grasos dietarios en
hígado, células del endotelio cerebrovascular y astrocitos: desaturación en el RE ( 6 y
5-Desaturasas), elongación de la cadena (Elongasa, ELO) y acortamiento de la
cadena ( 4 –Desaturasa o “ -oxidación parcial”). La vía más probable seguida por los
metabolitos es una -oxidación peroxisomal, antes de regresar al RE para completar
la síntesis y ser esterificados en fosfolípidos de membrana. El 1er nº= nº de átomos de
carbono/molécula ácido graso y el 2º= nº de dobles enlaces. La posición del 1er
carbono= n-6 o n-3 (Haag, 2003).
-oxidación parcial
5
ELO
24:6n-3
Aceite de lino, soja, calabaza, nueces, vegetales de hoja verde, pescado azul
22:6n-3 Ácido Docosahexaenoico
AGPIs OMEGA-3
Capítulo I. Introducción 119
I.3.2.1.3.4. AGPIs y colesterol.
Hace más de 30 años que dos científicos daneses, Bang y Dyerberg,
determinaron que las diferencias observadas en las tasas de mortalidad por
enfermedad coronaria, entre dos grupos poblacionales estudiados, uno de
esquimales de Groenlandia y otro de daneses, se debían a la ingesta de grasa
de foca, ballena y pescado, ricas en EPA y ADH, por parte de los esquimales
frente a la ingesta de grasas saturadas y productos ricos en colesterol de los
daneses (Bang et al., 1976; Dyerberg et al., 1975). Bang y Dyerberg también
observaron la efectividad de los AGPIs omega-3 para reducir los niveles de
colesterol y triglicéridos en el suero, y años después se han corroborado que
tanto EPA como ADH reducen las concentraciones plasmáticas de colesterol,
en estudios realizados en monos Resus (Davis et al., 1987).
El principal mecanismo de actuación neuroprotectora y cardioprotectora de
los ácidos grasos omega-3 (ver figura I.7.), podría basarse en la supresión de la
síntesis y liberación tanto de FNT- como de IL-10, en la modulación de las
respuestas anti-inflamatorias del eje hipotalámico-pituitario-adrenal y en el
incremento de la liberación de acetilcolina. Por tanto parece existir una
estrecha interacción entre el SNC, los órganos endocrinos, citoquinas y AGPIs
omega-3. Esta podría ser una de las razones que explicasen el beneficio de
estos ácidos grasos en condiciones tales como la EA, la EP, enfermedades
inflamatorias, diabetes mellitus, hipertensión, septicemia y arteriosclerosis
(Das, 2000).
Capítulo I. Introducción 120
Figura I.7.: Efectos de los ácidos grasos de la dieta en funciones fisiológicas
y cognitivas. Los AGPIs om-6 y om-3 tienen un papel pivotante en el eje hipotálamo-
pituitaria-adrenal (Yoshida et al., 1998). El grupo omega-6 (flechas punteadas) y
omega-3 (flechas con guión largo) son moduladores putativos de neurotransmisores
como la dopamina (DA), serotonina (5-HT) y norepinefrina (NE) y hormonas como la
hormona liberadora de corticotropina (CRH), hormona adrenocorticotrópica (ACTH) y
cortisol y citoquinas del sistema inmune. La regulación de vías de señalización y
producción afecta a funciones mediadas por el cerebro como la cognición (aprendizaje
y memoria) y procesos fisiológicos (dolor, termorregulación y sueño). Flechas finas y
completas= vías de excreción/recepción de diferentes componentes; flechas gruesas y
completas= conexión cerebro y eje hipotálamo-pituitaria-adrenal.
Funciones mediadas por cerebro
Fluidez membrana/Receptores/Integridad mielina
Termorregulación/Sueño/Dolor/Estrés/Aprendizaje y memoria
Colesterol
P450
Prostaglandinas
Barrera hematoencefálica cruzada por AGPIs
omega-6 y omega-3
Cerebro 5-HTDA, NE
HipotálamoCRH
PituitariaACTH
AdrenalesCORTISOL
Sangre
Sistemainmune
Capítulo I. Introducción 121
La composición de ácidos grasos de la grasa de la dieta desempeña un papel
fundamental en la determinación del nivel de colesterol plasmático. Tanto la
serie omega-3 como la serie omega-6 reducen los niveles de colesterol, pero
ambos actúan mediante mecanismos diferentes y los omega-3 son más
potentes, variando el efecto sobre las lipoproteínas y el metabolismo de los
ácidos grasos si se trata de EPA o de ADH (Takahashi and Horrobin, 1988).
Los niveles circulantes de colesterol y las tasas de mortalidad generales, son
significativamente menores en el área Mediterránea, correlacionadas
positivamente con el consumo de aceite de oliva (Rubba et al., 1987; Trevisan
et al., 1990).
La discrepancia existente entre numerosos estudios en relación al efecto del
aceite de pescado sobre los niveles de colesterol, se basa en 6 factores
(revisado en (Harris, 1989).
1) Presencia o no de una enfermedad relacionada con laslipoproteínas.
2) Tipo de enfermedad en su caso: en muchos estudios el descenso en
colesterol observado en pacientes hipertrigliceridémicos es debido
enteramente a la reducción en los niveles de LMBD-colesterol, sin verse
afectados los de LBD-colesterol.
3) Relación entre los niveles de colesterol total y de LMBD-colesterol.
4) Tipo de grasa en la dieta control: cuando el contenido en grasa
saturada de la dieta control es superior al de la dieta de aceite de pescado, es
más probable que los niveles de LBD en la dieta omega-3 sean más bajos.
5) Dosis y composición del aceite de pescado administrado.
6) La variedad de efectos de EPA frente a DHA: a diferencia de los
niveles plasmáticos de ADH, los de EPA son un buen marcador de la ingesta
de omega-3.
Capítulo I. Introducción 122
La revisión de los ensayos al azar controlados sobre el estudio de la efectividad
de los omega-3 como agentes secundarios para la prevención de
enfermedades cardiovasculares, realizados entre los años 1994 y 2003,
concluyen que aunque algunos estudios aportan datos sobre el beneficio sobre
reducción en colesterol, triglicéridos, LBD y LMBD, se necesitan estudios a
más largo plazo y que empleen una mejor metodología, para poder
recomendar la suplementación con omega-3 como tratamiento para la
hipertrigliceridemia (Lewis et al., 2004). En cualquier caso, la recomendación
sobre incrementar la ingesta en pescado puede conducir a efectos beneficiosos
a largo plazo mediados por mecanismos actualmente desconocidos. De hecho,
no se conoce una droga hipotrigliceridémica con mejor relación
riesgo:beneficio que los AGPIs omega-3.
I.3.2.1.3.5. Ácido docosahexaenoico (ADH).
El ácido docosahexaenoico (cis-4, 7, 10, 13, 16, 19 ADH; 22:6n-3), a pesar de
representar una pequeña fracción lipídica en el resto de los tejidos, representa
más del 17% del peso de los ácidos grasos totales en el cerebro adulto de ratas y
más del 33% del total de ácidos grasos en la retina (Hamano et al., 1996). Es
uno de los AGPIs omega-3 presente en los fosfolípidos de membrana de las
células retinales, membranas de las células excitables, corteza cerebral,
mitocondrias, sinaptosomas y vesículas sinápticas del cerebro, mediando la
señalización neuronal y la transmisión sináptica colinérgica (Jones et al.,
1997). Especialmente relevante para la maduración cerebral, tanto en roedores
como en humanos (Haag, 2003). Una de las funciones únicas de ADH en el
SNC es la síntesis de fosfolípidos necesarios para la estructura de la membrana
celular y consecuentemente, para la elongación de las neuritas.
Hay dos fuentes principales de ADH: endógenamente, se sintetiza
principalmente en el hígado y es transportado al cerebro como precursor, como
muestra la fig.I.8. Todos los mamíferos, humanos incluidos y felinos excluidos,
son capaces de sintetizar ADH a partir de AAL (presente en aceites vegetales,
Capítulo I. Introducción 123
no en el pescado) en el retículo endoplasmático. A diferencia del tejido adiposo
y del hígado, el cerebro no es un reservorio de AGPIs.
Exógenamente, se encuentra en vegetales y animales de origen marino, como
el pescado graso en la nutrición humana, principal fuente de ADH (Harris,
2004).
El ADH es necesario para el crecimiento y desarrollo funcional del cerebro
humano infantil y el mantenimiento normal del cerebro adulto. La
mielinización en los vertebrados es uno de los procesos principales durante el
desarrollo del SNC, tiene lugar en una dirección caudocraneal que involucra a
diferentes regiones a distintos tiempos. Ciertos factores ambientales, como la
dieta, podrían modificar este proceso. El hecho de que el cerebro contenga
uno de los contenidos lipídicos más elevados, hace que la deficiencia en AGEs
durante la fase más activa de la síntesis de mielina pueda generar
amielinización, desmielinización o demielinización. Los estudios animales
realizados con dietas suplementadas con aceite de pescado, revelan un efecto
negativo sobre la mielinización, mediante la ralentización de la velocidad de
conducción a través de la vía auditiva del tronco cerebral, así como de la
actividad 2’-3’-nucleótido cíclico-3’-fosforilasa, marcador de mielinización
(Saste et al., 1998). Sin embargo, se propone que la disrupción de la
mielinización se debería al desequilibrio en el ratio omega-3:omega-6, más
que a una influencia directa de omega-3 en la síntesis de mielina (Salvati et
al., 2000). Deacuerdo con este argumento, otro estudio aporta que un elevado
contenido en lípidos en la dieta prenatal afectaría a la expresión del gen de la
mielina, reduciendo la vulnerabilidad de la mielina a las alteraciones
nutricionales en el período postnatal, independientemente de su composición
en ácidos grasos. Algunas enfermedades demielinizantes, como la
adrenoleucodistrofia y la EM, podrían ser modificadas de manera beneficiosa
a través de la dieta (el “aceite de Lorenzo” o terapia de gliceril-trierucato-
trioleato), aunque esta hipótesis necesita confirmación. (Moser et al., 2003).
Los efectos beneficiosos de los AGPIs omega-3 pueden ser reforzados con la
adición apropiada de antioxidantes, con objeto de reducir la peroxidación
Capítulo I. Introducción 124
lipídica que tendría lugar tras la ingesta de estos ácidos grasos dietarios.
(Meydani, 1996).
Estudios in vitro realizados en astrocitos aislados de corteza cerebral de
hámster, demuestran la necesidad de una concentración adecuada de ADH en
el medio de cultivo para un crecimiento correcto, así como de un balance
apropiado entre omega-3:omega-6 en los fosfolípidos de sus membranas para
mantener un funcionamiento adecuado.
Teniendo en cuenta los estudios in vitro e in vivo, se estima que un
suplemento de unos 180 miligramos de ADH por cada 100 gramos de dieta, en
forma de leche humana o fórmulas infantiles suplementadas, podrían proveer
un 0,4% de los requerimientos energéticos (Alessandri et al., 2003).
I.3.2.1.3.6. AGPIs y la EA.
El inicio de la EA es la dificultad para recordar sucesos recientes. Conforme
avanza la enfermedad, lo7272s pacientes desarrollan un comportamiento
errático, alucinaciones y pérdida de control sobre sus funciones corporales. El
efecto de variables ambientales en combinación con la susceptibilidad genética
podría incrementar el riesgo de desarrollar la EA. Los estudios realizados en
cerebros de pacientes de la EA, muestran una reducción en los fosfolípidos de
membrana derivados de ácidos grasos totales (fosfatidiletanolamina y
fosfatidilinositol pero no en fosfatidilcolina) en comparación con los controles,
ligando así el incremento en la degradación de los fosfolípidos cerebrales en la
EA con el estrés oxidativo. (Prasad et al., 1998). A pesar de la elevada
vulnerabilidad de los AGPIs al ataque por radicales libres, los AGPIs omega-3
suprimen la inflamación y reducen el curso de una infección mediante el
descenso en la producción de citoquinas inflamatorias, lo que permite
correlacionarlos positivamente con el retraso en la evolución de enfermedades
como la EP y la EA (Christen, 2000; Youdim et al., 2000). Hace muchos años
que se estableció la “teoría de los radicales libres” como posible mecanismo
implicado en la patogénesis de los síndromes demenciales (Clausen, 1984). Los
AGPIs forman malondialdehido tras una auto-peroxidación, facilitando la
Capítulo I. Introducción 125
deposición de lipofuscina, considerado como un marcador del proceso de
envejecimiento, y de 4-hidroxinonenal, producto neurotóxico de la oxidación
de los AGPIs (Lamb and Simon, 2004).
Tanto el AA como el ADH incrementan los niveles de acetilcolina, en parte
debido a la estimulación de la captación de glucosa por el cerebro, lo que
supone una mejora en las habilidades de aprendizaje y memoria de los modelos
animales de experimentación (Minami et al., 1997).
Un incremento en los niveles de acetilcolina provoca un aumento en la síntesis
de óxido nítrico, beneficiando la consolidación de la memoria mediante la
prevención de la apoptosis. Los AGPIs incrementan el número de receptores de
insulina e influyen en la síntesis de óxido nítrico endotelial (eNO),
favoreciendo que la insulina proteja a las neuronas de la citotoxicidad causada
por el factor alfa de necrosis tumoral (FNT ). Cualquier modificación en la
conexión entre los AGPIs, insulina, receptores de la insulina, óxido nítrico,
acetilcolina, y FNT , puede generar tanto pérdida de memoria como muerte
neuronal, aumentando así el riesgo de iniciar la EA (Das and Fams, 2003).
Hogyes y colaboradores alimentaron ratas antes, durante y tras el embarazo,
con una dieta enriquecida con un exceso de ADH y otros AGPIs, acompañados
o no de los precursores AL y AAL (Hogyes et al., 2003). Los resultados
obtenidos compilaban una reducción en las células colinérgicas y pérdida de
neuronas y fibras, así como un incremento en la cantidad de ADH de los
fosfolípidos cerebrales. Tras estas observaciones, se han propuesto numerosos
mecanismos para explicar los efectos protectores de ADH sobre la muerte
celular: interferencia con la apoptosis, promoción del crecimiento de las
neuritas activado por el factor de crecimiento nervioso, incremento de la
eliminación de los radicales libres y reducción de la peroxidación lipídica y/o
modificando la sensibilidad de los receptores NMDA y disminuyendo el flujo
iónico a través de los canales de Na+, permitiendo así que haya una menor
actividad epileptiforme (Green et al., 2001). El hipocampo participa
activamente en el procesado de la formación espacial y el ADH está implicado
en la formación de la memoria (Morris et al., 1982). Un estudio sobre los
efectos de los déficits de AAL concluye, que la reducción en el recambio de las
Capítulo I. Introducción 126
vesículas sinápticas en la región CA1 del hipocampo afecta directamente a la
capacidad de aprendizaje de las ratas (Yoshida et al., 1997).
Los experimentos de alimentación de ratones jóvenes y viejos con ADH y
fosfatidilcolina de huevo, demuestran una clara mejora en las habilidades de
aprendizaje de ambos grupos. ADH parece reducir los niveles de AA y
fosfatidilcolina e incrementar la cantidad de colina en cerebro (Lim and Suzuki,
2001).
La administración crónica de ADH en ratas causa un incremento significativo
del ratio omega3:omega6 (indicador de la acción antioxidante de ADH) tanto
en hipocampo como en corteza frontal, mejorando la capacidad de aprendizaje
relacionada con la memoria y el déficit espacial que sigue al daño ocasionado
por hipoxia o isquemia. Curiosamente, se observa un descenso en la
peroxidación lipídica únicamente en el grupo ADH, solo en la corteza cerebral y
no en el hipocampo de los animales jóvenes, en oposición a los resultados
obtenidos en ratas envejecidas, lo que indica que la administración crónica de
ADH contribuye a la protección del daño neuronal, aunque Gamoh y
colaboradores sugieren que la administración de ADH podría mejorar la
memoria a cualquier edad en ratas (Gamoh et al., 2001). Okada y
colaboradores no consiguen probar ninguna diferencia en el contenido de ADH
en cerebro tras 3 semanas de administración en ratas (Okada et al., 1996). Por
tanto, se establece que para obtener efectos significativos se requiere un
período más prolongado de manipulación dietaria, como el realizado por
Gamoh y colaboradores tras 10 semanas de estudio. Sin embargo, estos autores
no pueden asegurar que las dosis empleadas puedan restaurar el daño por el
déficit de omega-3 en la capacidad de aprendizaje. Fukui y colaboradores
comprueban, mediante estudios del estrés oxidativo en ratas, que este proceso
contribuye al déficit en aprendizaje y memoria asociados al envejecimiento, y
que la suplementación de ADH combinado con catequinas mejora esas
capacidades en ratones adultos y envejecidos (Fukui et al., 2001; Shirai and
Suzuki, 2004). Por tanto, se establece que la efectividad de ADH es edad-
dependiente en el cerebro de animales alimentados con dietas enriquecidas con
aceite de pescado, evidenciada por el hecho de que en períodos pre- y post-
Capítulo I. Introducción 127
natales, el contenido de este ácido graso raramente sufre modificaciones en el
cerebro adulto. El ADH de la dieta protege del deterioro en las funciones
cognitivas en ratas con la EA.
Se necesitan dos generaciones para reducir el nivel de ADH en el cerebro de
rata y solamente dos meses para recuperarlo en las vesículas sinápticas
cerebrales (Barcelo-Coblijn et al., 2003).
En un modelo de rata de la EA, generado por infusión de A , la pre-
administración crónica de ADH reduce el deterioro en el aprendizaje, así como
el estrés oxidativo y la apoptosis propia de este modelo (Hashimoto et al.,
2002). Los estudios en ratones transgénicos de EA que sobreexpresan PPA,
sugieren una efectividad potencial de los ácidos grasos de la dieta, en relación a
la capacidad para eliminar péptidos A desde el cerebro a la circulación
(Friedland, 2002).
Calon y colaboradores demuestran que la reducción en el contenido en AGPIs
omega-3 en la dieta administrada a un modelo de ratón transgénico de EA,
resulta en una reducción de un 80-90% de la subunidad p85 de la
fosfatidilinositol-3-kinasa y de la debrina post-sináptica (proteína dendrítica), al
igual que ocurre en los pacientes de la EA. En este estudio, además, se
comprueba cómo la administración de ADH protege de las alteraciones
bioquímicas y comportamentales observadas en el grupo deficitario. La
vulnerabilidad selectiva de las proteínas dendríticas tanto a factores de riesgo
ambientales (ej: reducida ingesta de ADH) como genéticos (ej: PPA humana
mutante), conducen al desarrollo de la EA tanto en modelos animales como en
pacientes (Calon, 2004).
Recientemente, Roher et al evaluan la sustancia blanca de pacientes de la EA,
observando un daño axonal, en oligodendrocitos y en mielina análogo a la materia
gris (Roher et al., 2002). Comparando la sustancia blanca de individuos no-
dementes con los pacientes de la EA, se halló una reducción significativa en los
niveles de colesterol (12%) y niveles elevados de ácidos grasos en torno a las
lesiones propias de la EA. En contraposición a estos resultados, un estudio previo
encontró un descenso en los niveles de EPA, ADH y en el ratio omega-3:omega-6
en relación con el daño cognitivo y el envejecimiento (Conquer et al., 2000).
Capítulo I. Introducción 128
Finalmente, otro estudio no encuentra diferencias significativas en la
composición de ácidos grasos de la sustancia blanca, pero sí una reducción en
los plasmalógenos de la corteza frontal e hipocampo de los pacientes de la EA
(Guan et al., 1999). El descenso en AA y ADH está relacionado con el
incremento en componentes saturados en la sustancia gris del hipocampo de
pacientes de la EA (Soderberg et al., 1991).
Las concentraciones de los ésteres de colesterol, fosfatidilcolina,
fosfatidiletanolamina y fosfatidilserina de los AGPIs, tanto en suero como en
corteza parahipocampal de pacientes de la EA estan significativamente
reducidas, probablemente por la incapacidad para el anabolismo de acetil CoA
(Tully et al., 2003).
El consumo de pescado, al menos una vez por semana, reduce el riesgo de la
EA en un 60% y este efecto se atribuye a ADH, ya que su precursor AAL
protege a sujetos portadores del alelo apo 4 (Morris et al., 2003). Una gran
ingesta de pescado tiende a estar inversamente relacionada con el declive y
deterioro cognitivo, en base a la reducción en la inflamación del sistema
cerebrovascular. Sin embargo hay cierta controversia a este respecto. Los
datos obtenidos en animales indican que el consumo de AGPIs omega-3, en
general, afecta positivamente el estado cognitivo. Hasta la fecha, no se han
podido replicar esos resultados en ensayos clínicos. Algunos autores han
aportado datos sobre una correlación positiva entre la ingesta de pescado y la
reducción en el daño cognitivo, mientras que otros no ven ningún efecto
(Engelhart, 2002; Kalmijn, 2000).
II. OBJETIVOS
Capítulo II. Objetivos 130
La neurodegeneración en enfermedades como la enfermedad de Alzheimer
(EA), la enfermedad de Parkinson (EP) y la Esclerosis Múltiple (EM) parece
ser multifactorial, incluyendo reacciones tóxicas, inflamatorias,
neurotoxicidad glutamatérgica, eliminación de los antioxidantes endógenos,
reducción en los factores tróficos y expresión de las proteínas pro-
apoptóticas que conducen a la pérdida neuronal. Son algunas de las
patologías neurodegenerativas más devastadoras y que mayor gasto
económico suponen para la sociedad actual.
Los mecanismos de neuroprotección pueden ser afrontados desde
modificaciones dietarias.
Algunos componentes de la dieta Mediterránea han adquirido bastante
importancia en las últimas décadas en base a la demostración de su
efectividad frente a cardiopatías, envejecimiento y ciertos tipos de cáncer.
Entre esos componentes destacamos a los ácidos grasos poliinsaturados
(AGPIs) omega-3, presentes en el aceite de pescado, como ingredientes
capaces de reducir la presión sanguínea, proteinuria, niveles lipídicos e
inflamación. Así mismo, a los polifenoles se les atribuyen propiedades
plurifarmacológicas: mediante quelación de hierro, eliminación de radicales
libres responsables del daño oxidativo, activación de genes de supervivencia
y rutas de señalización celular, entre otras actividades.
Se ha demostrado recientemente el poder protector frente a la demencia de la
ingesta de flavonoides, compuestos fenólicos contenidos en el vino, vegetales,
frutas y te. Igualmente, se ha comprobado que la ingesta de vitaminas C y E
reduce el riesgo de desarrollar la EA y mejoran la función cognitiva.
Por tanto, se decidió estudiar tanto el efecto de una dieta enriquecida en AGPIs
omega-3 como de un compuesto fenólico como DOPET, contenido en el aceite
de oliva y de demostrado poder antioxidante, en sistemas in vitro e in vivo.
Hasta la fecha, se ha estudiado la capacidad protectora como antioxidante de
DOPET frente al cáncer, enfermedad cardiovascular y envejecimiento mediante
inhibición del estrés oxidativo. Sin embargo, no hay estudios concretos y
Capítulo II. Objetivos 131
contrastados aplicados a patologías como la EA, la EP ni la EM. Dado el
creciente interés suscitado por la dieta Mediterránea en nuestra sociedad actual,
unido a la dificultad para hallar tratamientos naturales verdaderamente
efectivos frente a enfermedades neurodegenerativas, se establecieron una serie
de objetivos:
A. Estudiar la relación entre colesterol y la EA:
1) Modulación ejercida por los AGPIs omega-3 de la dieta sobre los niveles de
colesterol y la patología de la EA en un modelo animal de la EA.
2) Influencia de parámetros como la edad y/o el género en los niveles de
colesterol en diferentes modelos animales de la EA.
B. Demostrar el efecto neuroprotector de DOPET en sistemas in vitro e in
vivo.
3. Efecto neuroprotector de DOPET in vitro.
4. Efecto neuroprotector de DOPET in vivo.
5. Relación de DOPET y el colesterol.
6. Influencia de DOPET sobre la actividad MAO, implicada en la EP.
III. MATERIALES Y MÉTODOS
Capítulo III. Materiales y Métodos 133
III.1. MATERIAL.
III.1.1. Modelos animales experimentales.
Todos los animales recibieron alimentación y agua ad libitum y fueron
mantenidos en ciclos de 12 h de luz y 12 h de oscuridad.
La manipulación y sacrificio de los animales transgénicos y mutantes se llevó
a cabo bajo la aprobación del Comité de Cuidado y Uso de Animales de
Aventis, al igual que de acuerdo con los estándares de la guía para el cuidado
y el uso de los animales de laboratorio (CNRS ILAR) y con respecto a las
reglas de la Comunidad Europea y Francesa.
Los modelos animales transgénicos y mutantes fueron:
A) Se utilizaron ratones transgénicos simples denominados PPA-Tg53,
generados y establecidos siguiendo los procedimientos estándares utilizados
para los híbridos CBA/C57B16 previamente descritos (Czech et al., 1997). Se
emplearon 5 tríos para gestar, formados por 1 macho transgénico y 2
hembras no transgénicas. Las crías fueron separadas con 4 semanas de edad
y mantenidas con las diferentes dietas (control y omega-3) durante 4 meses.
B) Se utilizaron las razas C57BL6 y C3H, de ambos géneros y de 3 meses y 6
meses de edad. Así mismo, se emplearon ratones transgénicos simples PPA-
Tg53 de la EA. Se establecieron varios grupos: de la raza C57BL6, C3H,
C57xC3H y Kozack-colesterol 16. Todas las razas fueron sumistradas por
Aventis (Francia).
Para optimizar el sitio de iniciación de translación de PPA, se introdujo una
secuencia consenso Kozack mediante mutagénesis dirigida por PCR: forward
primer, 5 -CCC GGG TCC ACC ATG CTG CCC GGT TTG G-3 ; reverse
primer, 5 -TTC AGG GTA GAC TTC TTG GC-3 . El producto de la PCR fue
subclonado en pCR2 (INVITROGEN, France), secuenciado y
subsecuentemente clonado dentro de un vector que contenía el cADN de
PPA751SL cADN empleando SmaI y AccI, reemplazando el 5 UTR de PPA por
el elemento Kozack.
Capítulo III. Materiales y Métodos134
Para crear la línea Kozack-Colesterol-16, se cruzaron incialmente las líneas
C57BL6 con C3H y a la descendencia se le inyectó Etil-nitrosa-urea (ENU),
que indujo una mutagénesis al azar. Posteriormente, los machos ENU fueron
cruzados con hembras C3H para obtener una línea que se denominó “Col-
16”. Finalmente, se realizaron cruces de “Col-16” con un modelo transgénico
simple de la enfermedad de Alzheimer, denominado PPA-Tg53. Los
descendientes que se obtuvieron fueron denominados Kozack-Colesterol-16.
El grupo estuvo formado por 25 animales, 17 hembras y 8 machos. La biopsia
de la cola para realizar el genotipado se llevó a cabo en el momento de
separar los animales de los progenitores, con 4 semanas de edad. Solamente
10 de estos animales (4 machos y 6 hembras) resultaron ser transgénicos.
Fueron sacrificados a los diferentes tiempos (3 meses de edad las líneas base
y 6 mese de edad los ratones mutantes).
C) Se utilizaron ratones transgénicos dobles de la EA, denominados
PPA/PS1, suministrados por Aventis (Francia) (Blanchard et al., 2003). Se
establecieron 3 grupos de hembras de 3 (n = 6), 8 (n = 7) y 13 meses (n = 10),
así como 2 grupos de hembras no transgénicas de 3 (n = 5) y 13 meses (n = 6)
de edad.
Los ratones dobles transgénicos PPA/PS1 empleados, expresan PPA-751 con
las mutaciones Swedish y London (promotor Thy1), al igual que la
Presenilina-1 humana mutante (M146L, promotor HMG) (Blanchard et al.,
2003).
La manipulación y sacrificio del resto de animales (sin modificación
genética), se llevó a cabo siguiendo la “Guía para el cuidado y la utilización de
animales de laboratorio” promulgada por el Instituto Nacional de Salud y
aprobado por el Comité Ético de la Universidad de Granada.
D) Se utilizaron ratones de la raza Balb/c, machos y de entre 20-30 g de peso
medio.
E) Se utilizaron ratas de la raza Wistar, machos, de unos 250 g de peso
medio.
Capítulo III. Materiales y Métodos 135
F) Se utilizaron ratones de la raza 129/Sv, H-2b de ambos sexos y ratones
salvajes. Todos los animales tenían entre 8 y 14 semanas de edad. En este
estudio, los animales se establecieron en dos grupos: control (con agua de
mineralización muy débil) y DOPET (con agua de mineralización muy débil
suplementada con DOPET). En esta ocasión fueron anestesiados mediante
una inyección intraperitoneal de 37 mg/kg de ketamina y 5,5 mg/kg de
xylazina.
Los procesos de inmunización, evaluación clínica y procesado de tejidos se
basó en los protocolos descritos previamente (Espejo et al., 2001).
G) Se utilizaron conejos de la raza New Zealand White, machos de unos 2,5
kg de peso medio.
III.1.2. Modelos celulares experimentales.
A) Se utilizaron células gliales C6, de morfología tipo fibroblasto y derivadas
del glioma de rata (Rattus Novergicus) (Benda et al., 1968).
B) Se utilizó la línea celular de fibroblastos L-929, procedente de tejido
conectivo subcutáneo, areolar y adiposo de ratón macho de 100 días de edad
y de la raza C3H/An (Sanford et al., 1950).
C) Las células PC12 que se utilizaron fueron obtenidas del “Riken Cell Bank”
(Instituto de Investigación Física y Química de Japón). Este estudio fue
realizado en colaboración con la Dra. S. Hilfiker (Universidad de Manchester,
Inglaterra).
D) Células neuronales de hipocampo de rata, de morfología tipo fibroblasto.
Línea H19-7/IGG-IR.
III.1.3. Dietas experimentales.
A) Dieta enriquecida en AGPIs omega-3: proteínas (Caseína) 20%;
metionina 0,3%; almidón 63,7%; fibra (celulosa) 5%; grasa 5% (de la cual el
15% son AGPIs omega 3 en la dieta omega-3); mix de vitaminas 1%;
Capítulo III. Materiales y Métodos136
sacarosa 5%; colesterol 0%; aceite omega-3: EPA: DHA (proporción 2:1)
(EUMEGA-EPA, Puleva Biotech, S.A.).
B) Dieta chow estándar comercial (PANLAB, Barcelona).
C) Dieta chow (95% mezcla estándar, 5% aceite girasol) y dieta chow con
1,5% colesterol.
D) Dieta conejo 112 (PANLAB, Barcelona): Humedad (11.0%), proteína
(13.5%), grasa (3%), glúcidos (50%), fibra (15.5%), minerales (7%). Energía
estimada según fórmula: 2321 kcal/kg. Contenido en ácidos grasos: ácido
palmítico (4700 mg/kg), ácido palmitoleico (330 mg/kg), ácido esteárico
(1020 mg/kg), ácido oleico (4800 mg/kg), ácido linoleico (5200 mg/kg),
ácido linolénico (1500 mg/kg). Aceites añadidos a las dietas: Aceite de
Girasol Alto Oleico (casa comercial de Guadix). La elaboración de las
distintas dietas se realizó mezclando la dieta base pulverizada con la grasa
atomizada, calentando levemente para mejorar el contacto entre ambas
fases. Las dietas fueron peletizadas y almacenadas en oscuridad a 4ºC hasta
su uso. Al comienzo y al final del estudio se recogió una alícuota para su
análisis en contenido de grasa y composición en ácidos grasos. Se adicionó
un 3% extra de grasa de diversas fuentes para conseguir un 6% de grasa
total.
Tipo de dieta Composición
Control 30 días (CO) 97% dieta estándar + 3% aceite girasol
Control 60 días (CF) 97% dieta estándar + 3% aceite girasol
Aterogénica 30 días (CA) 95.7% dieta estándar + 3% manteca de cerdo + 1,33% colesterol
Aterogénica 60 días (AA) 95.7% dieta estándar + 3% manteca de cerdo + 1,33% colesterol
Aterogénica 30 días + chow 30 días (AC) 1 mes dieta de CO y 1 mes dieta de CA
Aterogénica con DOPET 30 días (ADT) Dieta aterogénica con 3% grasa + sondaje con DOPET
Chow con DOPET (DT) Dieta estándar + sondaje con DOPET (10 mg/kg)
Tabla III.1.: Clasificación y composición de las dietas empleadas para
el estudio realizado en conejos.
Capítulo III. Materiales y Métodos 137
III.2. MÉTODOS.
III.2.1. Técnicas.
III.2.1.1. Sacrificio de los animales.
Los animales transgénicos y mutantes fueron sacrificados por asfixia dentro
de una cámara con hielo seco y posterior translocación cervical. El resto de
animales (ratones no modificados genéticamente, ratas y conejos) fueron
sacrificados mediante anestesia con pentotal sódico y guillotina.
En todos los casos, se diseccionó la cabeza mediante un corte entre el calotte
y la primera cervical y la piel y músculos se eliminan del cráneo.
Comenzando por el foramen magnum, se corta el cranium en dirección
anterior y el cráneo se retira cuidadosamente. Se ejerce presión con las
pinzas bajo el cerebro, en la región de la médula oblongata para poder retirar
el cerebro con cuidado desde la base del cerebro. Posteriormente se
diseccionan tanto el nervio óptico como los nervios en la región de la médula
oblongata. La sangre se recogió por punción cardiaca en viales de recolección
(Sarstedt, Nümbrecht, Germany). Tras una extracción rápida del cerebro, el
hemisferio derecho se congeló en nitrógeno líquido y el hemisferio izquierdo
se conservó en hielo seco para su posterior almacenamiento a –80°C. Se
obtuvo una muestra de la cola para ratificar el genotipado de cada animal con
anterioridad a todos los análisis.
III.2.1.3. Extracción de ADN.
Las biopsias de las colas se incuban a 55 °C durante toda la noche en
agitación continua (350 r.p.m.) en buffer de lisis (Tris HCl 100mM pH=8.5,
EDTA 5mM, SDS 0,4%, NaCl 400mM) y 10-15 µL/mL de Proteinasa K (300
µg/mL). Al día siguiente, se agitan y centrifugan a 13.000 r.p.m. durante 10
min a tª ambiente.
Capítulo III. Materiales y Métodos138
El sobrenadante se transfiere a un nuevo tubo que contiene 500 µL de
isopropanol. Tras agitar y repetir la centrifugación, el sobrenadante es
eliminado y el pellet se lava con 500 µL de etanol 70%. Después de
centrifugar, el pellet se seca durante 20 min a 55 °C y se resuspende en 70
µL de H2O estéril. Mantener el ADN a 4 °C durante toda la noche.
III.2.1.3. PCR.
El programa de PCR (Termociclador PTC-200, MJ Research) utilizado fue
específico para la amplificación de la proteína precursora del amiloide
(isoforma PPA 695) de 360 pb, PPA con “KPI domain larger”. El
programa consistió en: 94ºC (5min) y 35 ciclos: 94°C (1 min), 55°C (1
min), 72°C (1.5 min), 72ºC (5 min). El master mix preparado para esta
PCR consta de:
Cada muestra se compone de 1 µL de ADN (dilución 1:20 µL) y 9 µL de
master mix (10% Taq polimerasa (5 U/µL), 10% dNTP-mix (200 µM
dATP, dGTP, dCTP, dTTP), 10% PPA-forward primer(1:10), 10% PCR-
buffer (10x), 10% PPA-reverse primer(1:10), 100 mM Tris-HCl, pH 8.5,
500 mM KCl 0,1% gelatina, MgCl2 (50 mM) en H2O esteril). Las
secuencias de oligómeros (PEQLAB) empleadas fueron:
PPA-forward primer: 5’-GTA GCA GAG GAG GAA GAA GTG-3’
PPA-reverse primer: 5’-CAT GAC CTG GGA CAT TCT C-3’
Pares de bases: 682-703
1006-987
Finalmente, se realiza una electroforesis en gel de agarosa durante 10 min
a 180V en running buffer TBE 0,5x (buffer TBE 10x= Tris-Borato-EDTA;
108 g Tris base, 55 g ácido bórico, 9,3 g Na4EDTA y H2O destilada hasta 1
L, pH 8.3) para identificar los animales transgénicos.
Capítulo III. Materiales y Métodos 139
III.2.1.4. Lisados de proteínas.
Se pesa el hemisferio izquierdo y se homogeniza en potter mecánico en 8
volúmenes de PBS 0,01M con una tableta de inhibidor de proteasas
(ROCHE-Diagnostics GmbH, Manheim-Germany) por 50 mL de PBS.
Detección de la fracción soluble e insoluble de A con ácido
fórmico:Se mezclan 300 µL del homogenado en PBS inicial con 700 µL de ácido
fórmico (88% en H2O destilada). Se mantienen en agitación durante toda la noche a
4°C. Se centrifugan a 28.000 x g durante 1 h a 4°C y se añaden al sobrenadante 11 x
volúmenes de ácido fórmico (8.8 mL en total) de Tris-base 2 M para neutralizar el
ácido fórmico. Se ajusta el pH entre 6.0 y 8.0 y se guarda el sobrenadante a –80 °C.
Detección de fracción soluble de A con SDS: se mezclan 200 µL del
homogenado en PBS con 2% de SDS (50µL de SDS 10%) y se dejan 30 min en hielo,
tras los que se centrifugan a 16000 x g 10 min antes de guardar el sobrenadante a –
80°C.
Detección de fracción soluble de A con PBS: se centrifuga el resto del
homogenado en PBS durante 10 min a 14000 r.p.m. y se conserva el sobrenadante a
–80°C.
La concentración de proteínas en los diferentes lisados se realizó en base al
ensayo de Bradford (DC protein-assay (Bio-Rad), empleando el kit BCA
(PIERCE, Rockford, USA).
III.2.1.5. Western Blot.
Los extractos totales de proteínas se desnaturalizan a 70 °C durante 10
min, y se reducen y separan en geles de 10 pocillos de 1.00 mm al 16% de
Tris Tricina (ANAMED Elektrophorese GmbH (Darmstadt). Cada muestra
se compone de: 3,75 µL de buffer para muestras (4x; ANAMED
Elektrophorese GMBH, Darmstadt), 1.5 µL de agente reductor
(INVITROGEN) y H2O estéril para un volumen final de 15 µL. Se cargan 4
µL de multimarcador (INVITROGEN). Se prepara el running-buffer (1x):
50 mL de NuPAGE MES buffer 20x con 950 mL de H2O desionizada. Se
Capítulo III. Materiales y Métodos140
mezclan 200 mL de running buffer 1x (ANAMED Elektrophorese GmbH,
Darmstadt) con 500 mL de antioxidante. Se añade esta mezcla a la cámara
que contiene el gel y se deja correr el gel a 60 V durante 10 min, dejándolo
a 200 V durante 35 min más. Se prepara el buffer de transferencia,
añadiendo 50 mL de Nu-PAGE 20x buffer transferencia a 850 mL de H2O
desionizada, 100 mL de metanol y 1 mL de Nu-PAGE antioxidante
(INVITROGEN). Una vez que el gel ha corrido, se coloca sobre dos
esponjas y un papel de transferencia (humedecidos en buffer de
transferencia), y se cubre con una membrana de nitrocelulosa,
completando el sándwich con otro papel y otras dos esponjas. Se deja
transferir durante 1 h a 30V. Tras la transferencia, se calienta la
membrana en PBS durante 5 min a máxima potencia en el microondas. Se
bloquea durante 1 h en 10% leche desnatada en polvo en 1x TBS-T y se
incuba durante toda la noche a 4°C con el anticuerpo primario WO-2
(policlonal, reconoce a un epitopo cercano al extremo C-terminal de PPA,
dentro del dominio A , monoclonal, aunque reconoce ambas especies de
A 1:5000 en TBS-T (Ida et al., 1996).
Al día siguiente, la membrana se lava dos veces durante 15 min con 1x
TBS-T a tª ambiente y en agitación. A continuación se incuba durante 2 h
con el anticuerpo secundario (cabra-anti ratón-HRP, policlonal, 1:3000 en
TBS). Se lava dos veces durante 15 min con 1x TBS-T a tª ambiente. Se
revelan las membranas por quimioluminiscencia (ECL, AMERSHAM).
Tras 1 min en contacto con el revelador, se exponen las membranas con
películas de alta quimioluminiscencia.
III.2.1.6. ELISA A 40 y A 42.
Para la determinación de A 40 y A 42 empleamos los lisados en PBS y
en ácido fórmico del homogenizado cerebral.
Para la cuantificación de los péptidos A 40/42, se siguieron las
instrucciones incluidas por el fabricante de los kits de ELISA (hAmyloid-
Capítulo III. Materiales y Métodos 141
40 y hAmyloid A 42 HS ELISA, The Genetics Company, Schlieren,
Switzerland).
Brevemente, el primer día del ensayo, se añaden los estándares y las
muestras con la solución “anticuerpo conjugado” en una placa de 96 pocillos.
Se incuba a 4°C durante toda la noche. El segundo día, se lava con la solución
“enzima conjugado”, que es eliminada a continuación con la solución
“sustrato conjugado”. Finalmente, se detiene la reacción y se mide la
absorbancia en el lector de placas, a 450 nm con un filtro de referencia de
620-650 nm. Los resultados se expresan como concentración de péptido A
en µg/g tejido.
III.2.1.7. Determinación de ácidos grasos en cerebro y
plasma de ratón.
Los ácidos grasos de cerebro y plasma se determinan mediante GC-MS
(cromatógrado de gases con detector de ionización de llama, AGILENT
TECHNOLOGIES 6890N). Para su extracción, se mezclan 300 µL o de
homogenado de cerebro en H2O destilada o de plasma de ratón con 2 mL de
solución metanol:tolueno (4:1 v/v) en un tubo PIREX. Se agita durante 1
min. Se agregan 200 µL de cloruro de acetilo, lentamente y en agitación
suave pero continuada. Se procede al gaseado con N2 previo al calentamiento
durante 1 h en bloque calefactor a 100ºC. Se detiene la reacción en hielo y se
deja enfriar antes de añadir 5 mL de carbonato potásico 6%, agitando en
vortex. Se centrifuga a 3000 r.p.m. durante 10 min y se extrae el
sobrenadante. Se agregan 50 µL de ese sobrenadante a un inserto para viales
de cromatografía. En relación al proceso cromatográfico, se inyectan 3 viales
con n-hexano como blanco antes de inyectar la muestra, para limpiar la
columna, así como una disolución patrón de control cada 5-10 muestras para
verificar el buen funcionamiento del equipo. Los parámetros cromatográficos
para la determinación de los ácidos grasos por Gases-Masas, quedan
incluidos en la tabla III.2.:
Capítulo III. Materiales y Métodos142
Matriz Disolución de ésteres metílicos de ácidos grasos en
n-hexano
Volumen de inyección 0.2 µL
Inyector 250ºC, 200 kPa, 50% flujo, 20ml/min flujo, 25
mL/min flujo total, 20ml/min sarver flow, 4 min
sarver time.
Columna 1.7 mL/min flujo, 29 cm/min, presión constante
Detector 280ºC, 45ml/min H2, 400 mL/min Aire, Makeup:
30mL/min He
Gradiente de
temperaturas
Temp. Inicial: 80ºC (sostener 3 min)
Rampa 1: 10 ºC/min
Temp final: 175 ºC (sostener 2 min)
Rampa 2: 3.5ºC/min
Temp final: 250ºC (sostener 4 min)
Tabla III.2.: Parámetros cromatográficos para la medición de ácidos
grasos por Gases-Masas.
III.2.1.8. Determinación de colesterol total en plasma y
cerebro.
La medición se basa en las siguientes reacciones, que producen finalmente
un producto coloreado (fenol quinonaimina):
Colesterol esterificado + H2O Colesterol + Ácido graso
Colesterol + ½ O2 + H2O Colestenona + H2O2
2 H2O2 + 4 – Aminoantipirina + Fenol Quinonaimina + 4 H2O
En plasma: Se determina el colesterol total en suero mediante un
ensayo colorimétrico. Para calibrar, se utiliza un suero de calibración
liofilizado estándares de colesterol (LT-SYS, Berlin, Germany): 0, 25, 50, 75,
100, 125, 150 mg/dL. Se añaden 3 µL de muestra y 3 µL de cada estándar en
placas de 96 pocillos. Se agregan 300 µL de reactivo del kit colorimétrico
para colesterol total (Infinity, Thermo, Melbourne, Australia) por pocillo y se
Capítulo III. Materiales y Métodos 143
incuba la placa durante 10 min en el incubador a 37°C. Finalmente se
determina la absorbancia a 500nm.
En cerebro: Se pesan 100 mg de cerebro de ratón, y se homogenizan
en un potter de vidrio en buffer Tris HCl 20 mM, EGTA 2 mM, EDTA 1 mM,
benzamidina 1 mM, DTT 1 mM y PMSF 1 mM, pH 7.4. Se realiza una primera
extracción en 1 mL de cloroformo:metanol (2:1), se mezcla en el vortex y se
centrifuga durante 10 min a 2500 r.p.m. Se retira la fase acuosa e interfase.
Se repite la extracción dos veces más, con 0.5 mL de cloroformo: metanol
(2:1) en cada ocasión. Se combinan las 3 fases clorofórmicas y se llevan a
sequedad con N2 líquido. Se resuspende en 175 µL de cloroformo:metanol
(2:1) y se toma una alícuota de 10 µL para combinarla con 25 de 2%
tritón:cloroformo. Se vuelve a llevar a sequedad con N2 líquido y se
resuspende en 50 µL de H2O destilada (factor dilución = 4).)
Se mide la absorbancia a 500 nm en espectrofotómetro en 5 µL de muestra
con la ayuda del kit de detección colorimétrica de colesterol total (Bio
Systems) y se determina la concentración de colesterol mediante la siguiente
fórmula:
Nota: El factor 70 procede de la operación: (175 µL/ 10 µL) x factor dilución 4 = 70
III.2.1.9. Disección y parafinación del cerebro de ratón.
El protocolo de parafinación realizado incluye la siguiente secuencia de
tratamiento del tejido incluido en los cassettes histológicos: Formalina, H2O
grifo (30 min), etanol 50% (1 h), etanol 60% (1 h), etanol 70% (1 h), etanol
80% (1 h), etanol 90% (1 h), etanol 100% (1 h), etanol 100% (1 h), xilol (1 h),
parafína (caliente). Se dejan solidificar los bloques a tª ambiente,
resguardados de la luz, al menos 1 día antes de realizar los cortes. Se realizan
30 cortes de 30 µm antes de cambiar a 4 µm y se recogen los cortes en
(Abs muestra/ Abs patrón) x 70
g tejido
[Colesterol total] (mg/g tejido) =
Capítulo III. Materiales y Métodos144
portaobjetos para extenderlos en un baño a 60°C. Se dejan secar durante
toda la noche en una estufa a 37°C.
III.2.1.10. Preparación de las secciones de tejido e
inmunotinción con el kit ABC-Vectastain.
Los hemisferios cerebrales diseccionados se dejan inmersos en el fijador
formalina 4% durante una semana a 4°C, incluídos en los cassettes
histológicos, deshidratados y embebidos en parafina. Los tejidos embebidos
en parafina se cortan en secciones de 4 µm utilizando el microtomo
(MICROM COOL OUT), se montan sobre los portaobjetos y se dejan secar
durante toda la noche a 37°C.
La deparafinación de las secciones de tejido, se realiza siguiendo una
secuencia en alcoholes de gradación decreciente: 2 x 5 min en xilol, 2 x 5 min
en etanol 100% y 1 x 5 min en etanol 95%. A continuación, se bloquea la
actividad peroxidasa endógena con metanol durante 30 min.
Para hidratar el tejido, se lleva a cabo el siguiente orden de inmersiones: 1 x 5
min etanol 95%, 1 x 1 min etanol 70% y 1 x 1 min H2O bidestilada. Se
calientan las muestras durante 10 min en microondas en buffer citrato a
máxima potencia y se dejan enfriar durante 15 min a tª ambiente. Se lavan
durante 1 min en H2O bidestilada, 3 x 5 min en Tritón-PBS (1M PBS + 0.1%
Tritón) y 1 x 1 min en PBS. A continuación se incuban en ácido fórmico 88%
durante 3 min (exactos). Se lleva a cabo un bloqueo inespecifico durante 1 h
para saturar la unión de epitopos inespecíficos. Se incuban durante toda la
noche con el anticuerpo primario [692= policlonal, para A ; 23850 y 40090=
policlonal, para PPA (humano); mx02= monoclonal, frente A (1:5000);
WO-2, monoclonal, que reconoce tanto A 40 como A 42; DAKO, Denmark).
Al día siguiente se lavan 3 x 5 min en Tritón-PBS (1M PBS + 0.1% Tritón) y 1
min en PBS. Se incuban con el anticuerpo secundario (policlonal, cabra-anti-
ratón-AP conjugado o biotina anti-conejo, (DAKO Cytomation, Denmark))
durante 1 h a 37°C. Se realizan 3 lavados de 5 min en PBS, antes de incubar
las secciones con la solución-sustrato diaminobenzimidina (100 µL DAB
Capítulo III. Materiales y Métodos 145
(ROTH) en 5 mL Tris buffer y 2.5 µL H2O2). La tinción tiene lugar bajo
control microscópico y se detiene por incubación en PBS. Se realiza una
contra-tinción con hematoxilina (solución de Harris, MERCK) (25 segundos)
y se lava brevemente en H2O destilada y durante 5 min en H2O corriente.
Para la deshidratación de las secciones, se incluyen en alcoholes de gradación
creciente: 1 x 1 min en etanol 70%, 1 x 5 min en etanol 95%, 2 x 5 min en
etanol 100% y 2 x 5 min en xilol.
Para montar las secciones, se embeben en Corbit-Bálsamo y se protegen con
el cubreobjetos para su sellado. Se dejan secar durante toda la noche en
campana de flujo antes de realizar las microfotografías en microscopio
electrónico (ZEISS).
III.2.1.11. Screening de compuestos naturales con capacidad
antioxidante.
Con objeto de seleccionar un compuesto natural con capacidad antioxidante
y de entrada al cerebro, se estudiaron una serie de compuestos seleccionados
entre un enorme grupo de diferentes extractos naturales y polifenoles (de
descrita capacidad antioxidante por razones estructurales (Mandel and
Youdim, 2004; Moosmann and Behl, 1999).
Capítulo III. Materiales y Métodos146
Analizados
Extractos varios Hoja de olivo, fresa, apio, albahaca y tomillo
(esencia), Ginkgo Biloba, cereza (rabo), arándano,
laurel, ajedrea, alcachofera, cantahueso,
manzanilla, pasiflora, aceite de pepita uva,
zahareña, llantén, perejil, encina, té rojo,
mejorana, cola de caballo, granada, romero, mirra,
enula, hoja de vid
Polifenoles Timol y Carvacrol (Sigma), Ácido 4-
hidroxifenilacético, Ácido cafeico, Ácido cinámico,
Ácido dihidroxibenzoico, Ácido gálico, Ácido
hidroxibenzoico, Ácido homovanílico, Ácido m-
courámico, Ácido metoxifenilacético, Ácido p-
courámico, Ácido sinápico, Ácido siríngico, Ácido
vinílico, 2,(3-4 dihidroxifenil)-etanol (ALDRICH)
Tabla III.3.: Listado de compuestos naturales del screening de
antioxidantes. Se analizó la capacidad para atravesar la BHE y el potencial
antioxidante tanto de extractos de compuestos naturales (HPLC-ABTS) como de
polifenoles (GC).
Capítulo III. Materiales y Métodos 147
III.2.1.12. Biodisponibilidad de DOPET.
El screening se basó en la administración de una dosis por ratón de 20 mg de
cada uno de los extractos naturales analizados. Se establecieron 4 grupos de
3 ratones Balb/c por grupo, cada uno de los cuales recibió 1 mg/mL de
extracto por sonda. Se sacrificaron a 20, 60 y 180 min y los extractos de los
cerebros se realizaron en n-hexano o metanol, y se procesaron mediante
HPLC-ABTS para determinar la capacidad para pasar la BHE así como su
potencial antioxidante.
Se centrifugaron a 12.000 r.p.m. y 4ºC.
III.2.1.12.1. Determinación de DOPET por HPLC-ABTS.
Para establecer la capacidad antioxidante de DOPET, se realizó un protocolo
experimental para la determinación de DOPET por HPLC-ABTS (HPLC-DAD
WATERS).
Se prepara una solución stock (550 µM) disolviendo 6,03 mg de ABTS+
(SIGMA, A1888) en 20 mL de PBS y se ajusta el pH a 7.4 con NaOH. A
continuación, se añaden 1,6 mg de persulfato potásico. Se incuba esta
solución stock durante 12 a 16 h en oscuridad a tª ambiente, para generar el
catión reactivo. Para preparar la solución extemporánea diaria (5.5 µM) a
partir del stock, se diluyen 2 mL de éste en 200 mL de PBS:MeOH (10%),
protegiéndolo de la luz.
Para la determinación cromatográfica, se cargan en primer lugar 10-100 µL
de muestra de extracto (solubilizado en MeOH, filtrado a través de filtro de
45 µM y degaseado con N2) en una columna C18 (5 µm), a un flujo de 0.8
mL/min y se utiliza el método instrumental basado en:
Capítulo III. Materiales y Métodos148
Tiempo Flujo %A %B Curva
0.01 0.80 100 0 6
30.00 0.80 0 100 6
40.00 0.80 0 100 6
50.00 0.80 100 0 6
60.00 0.80 100 0 6
Tabla III.4: Método instrumental de HPLC-ABTS para la medición de la
capacidad antioxidante de DOPET. Nota: A= Acético 2% y B=Metanol
La salida de la columna se une mediante una T a una bomba con el radical
ABTS+, a un flujo de 0.5 mL/min (Presión: 500-600 Psi), y a la salida se
mezclan en un loop de 2 mL que se conecta al final a un detector UV-diodo
array, midiendo la absorbancia a 254 nm y 734 nm, para poder analizar la
capacidad antioxidante de cada pico eluido del extracto natural.
Los datos se procesan dos veces con el software Millenium: la primera con el
método de procesamiento que integra los picos positivos obtenidos a 254 nm,
y la segunda con el método de procesamiento que integra los picos negativos
obtenidos a 734 nm (Koleva et al., 2001).
III.2.1.12.2. Cuantificación de DOPET por HPLC.
A partir de un preparado de DOPET sintético de concentración igual a 10
mM, se prepararon muestras de 3,75 µg, 7,5 µg, 15 µg, 22,5 µg y 30 µg.
Las condiciones del método empleado fueron: flujo de 0,8 mL/min y un
gradiente de 0%-100% (30 min), 100%-0% (35 min) y 100%-0% (40 min),
donde el buffer A: 10% acetonitrilo: acético 0.1%.
Capítulo III. Materiales y Métodos 149
[DOPET] Tiempo retención
(min) Área Altura Área/altura
3,75 µg 8,261 567.147 11.227 50,516
7,5 µg 8,299 848.575 16.736 50,704
15 µg 8,231 1.784.584 34.803 51,277
22,5 µg 8,183 2.747.671 53.204 51,644
30 µg 8,097 3.802.402 72.567 52,399
Tabla II.5.: Valores para la curva patrón de DOPET por HPLC.
La ecuación a la que se ajustó el modelo de regresión simple fue:
y= 50,204 + 0,07*x
El valor de P fue menor a 0,01, por lo que hay una relación estadísticamente
significativa entre las variables, a un nivel de confidencia del 99%.
Por tanto, con este ensayo establecimos la ecuación de ajuste lineal para
determinar la concentración de DOPET por HPLC en nuestras muestras.
III.2.1.12.3. Determinación de DOPET por CG-MS.
Con objeto de establecer el tiempo de absorción de DOPET en cerebro, se
establecieron 11 grupos de 3 ratones Balb/c por grupo que recibieron por
sondaje DOPET purificado (13 mg/kg peso). La administración de la dosis
correspondiente se llevó a cabo mediante sondaje con DOPET purificado y
posteriormente se sacrificaron por dislocación cervical para la extracción
rápida del cerebro a diferentes tiempos: 0 min, 3 min, 4 min, 5 min, 7 min,
10 min, 15 min, 20 min, 25 min, 30 min y 60 min. Para la identificación de
DOPET en el homogenado, se realizó una extracción con 1 mL de acetato de
etilo. Tras 5 min de centrifugación a 4 ºC, se inyectaron 100 µL del
sobrenadante en CG-MS.
La determinación de DOPET y sus metabolitos se ha llevado a cabo
empleando un cromatógrafo de gases con inyector automático (VARIAN
8200), acoplado a un espectrofotómetro de masas (VARIAN Saturn MS/MS
Capítulo III. Materiales y Métodos150
2000). Las condiciones de análisis optimizadas para la determinación del
compuesto en las muestras problema, se recogen en las tablas III.6. y III.7.
Fase estacionaria CP-Sil 8CB (30 m x 0.25 mm ID)
Fase Móvil Helio Purísimo
Vinyección ( L) 2 L
CG
Horno To = 45ºC (2 min)
T1 = 15ºC (20ºC/min, 8.25 min)
T2 = 270ºC (10ºC/min, 9.75 min)
Duración 30 min
Inyector 150ºC (30 min)
Espectómetro de masas
Temp. Trampa 200ºC
Temp. Manifold 50ºC
Temp. Transfer line 260ºC
Rango masas
Retraso 4.50 min
Hasta 6 min Cerrado
De 6 a 30 min 45 a 400 m/z
Flujo columna 1.0 mL/min
Relación de flujo 10
Modo de Medida Áreas
Réplicas 1
Tabla III.6.: Parámetros instrumentales para la medición de DOPET
mediante cromatógrafo de Gases.
Compuesto Iones
Naftol 201 + 216 m/z
2-(3,4 dihidroxifenil)etanol 267+268+370+371 m/z
Tabla III.7.: Iones seleccionados para el establecimiento del modo de
trabajo SIM.
Capítulo III. Materiales y Métodos 151
Para la elaboración de los patrones (tabla III.8) en el rango 0.05 – 2.5 mg/L,
se procede del siguiente modo: en una serie de eppendorf se adicionan, 1.75,
3.50 y 17.5 L de la disolución etanólica de 10 mg/L y 3.50 y 8.75 L de la
disolución etanólica de 100 mg/L. A continuación se adicionan 1 L de
disolución etanólica de naftol (1 g/L) y 350 L de plasma de ratón. Tras
agitar con vortex durante 1 min a tª ambiente, se realiza una primera
extracción de los analitos con 300 µL de acetato de etilo, agitando durante 1
min. Para separar las fases, se centrifuga a 6000 r.p.m. durante 5 min y se
transvasa el sobrenadante obtenido con una pipeta automática a un
eppendorf limpio y seco. Se repite la extracción del mismo modo y se unen
los extractos orgánicos. Se llevan a sequedad total en Speed Vac y se
redisuelve el residuo resultante en 180 L de acetato de etilo agitando
durante 1 min con vortex. La disolución resultante, se recoge con ayuda de
una pipeta automática y se introduce en un inserto para vial cromatográfico
de 200 L. Se vuelven a llevar a sequedad total y se resuspende en un
volumen final de 30 L de la mezcla derivatizante. Finalmente se inyectan 2
L de la muestra en el CG-MS.
y = 2,59x - 0,02
R2 = 0,98
0,0
0,5
1,0
1,5
2,0
2,5
3,0
0 0,2 0,4 0,6 0,8 1 1,2
Patrón (mg/L)
Áre
a D
OP
ET
Figura III.1: Curva patrón de DOPET obtenida por CG-MS.
Capítulo III. Materiales y Métodos152
Para la preparación de las muestras, se realizaron homogenados de los
cerebros se mezclan 350 l de muestra (homogenado de cerebro de ratón)
con 1 L de disolución etanólica de -Naftol (1 g/L). A continuación se
lleva a cabo el mismo tratamiento que el aplicado a los patrones. Los
resultados se expresan en mg de analito en litro de disolución. Dicha
concentración se determina mediante interpolación del área
correspondiente a cada una de las muestras en la función de calibrado
obtenida con los patrones de concentración conocida. El modelo de
calibración seleccionado es el linear de regresión univariante por mínimos
cuadrados. La precisión del método analítico se ha evaluado a partir de la
reproducibilidad de la señal analítica mostrada por 10 disoluciones de
concentración constante e igual a 7.5 g/L del analito, concentración que
corresponde a la zona central de la función de calibrado. La concentración
de los analitos se calcula por interpolación en las funciones de calibrado
establecidas con anterioridad.
Capítulo III. Materiales y Métodos 153
III.2.2. Obtención de DOPET por síntesis química.
El DOPET utilizado para todos los estudios en modelos in vitro e in vivo, fue
sintetizado en el Departamento de Síntesis Química de Puleva Biotech, S.A.
de acuerdo con el procedimiento descrito en 1999 por Capasso y
colaboradores (Capasso et al., 1999).
El método consiste en una reducción directa del ácido 2,4 dihidroxifenil
acético (ALDRICH) con hidruro de litio y aluminio (ALDRICH) en
tetrahidrofurano anhidro (FLUKA) a reflujo durante 2 h. El procesado
incluye la destrucción del exceso de poder reductor y posterior extracción con
acetato de etilo y purificación cromatográfica por HPLC (WATERS).
Para su administración a los animales, el compuesto se disolvió en H2O
destilada.
III.2.3. Estudios de neuroprotección.
III.2.3.1. Cultivo celular.
A) Para la medida de citotoxicidad:
Se crecen las células C6 en medio Hanks F10 (BIOMOL) con un 10% de suero
bovino fetal y solución antibiótico Penicilina/Estreptomicina (LABCLINICS).
Se tripsinizan las células (solución tripsina, CULTEX 1:2) y se centrifugan, y
finalmente se resuspenden en 10 mL de medio para realizar el contaje en el
hemacitómetro (Becton Dickinson-FACS Calibur).
Para la medición de la muerte celular en un cultivo de C6 sometido a
diferentes tratamientos, se utilizó el Kit “CytoTox 96” para ensayos de
citotoxicidad (PROMEGA, G 1780), cuyo objetivo es la detección
colorimétrica no radiactiva, basada en la medición la enzima lactacto
deshidrogenada, liberada tras la lisis celular. La enzima permite la
conversión de una sal de tetrazolio en un producto rojo de formazan. El color
formado es proporcional al número de células lisadas.
Capítulo III. Materiales y Métodos154
Cada muestra se compuso de 5 µL de células, 50 µL de triptan blue y 500
µL de PBS (1x). Se diluyen a 100.000 células/mL para tener 10.000
células por pocillo en la placa de 96 pocillos. Se incuban las placas durante
4 h para permitir que se adhieran a la placa, y se añade el agente oxidante
(H2O2, glutamato o péptido A , SIGMA) (200 µM, 20 µM y 1,2 mM
respectivamente) y DOPET (concentraciones de 25 µM, 100 µM y 500
µM). Se incuba la placa durante 24 h en un incubador de CO2 (37ºC). Se
añade el buffer de lisis 10x (15 µL/pocillo) y se incuba a 37ºC durante 1 h.
Se recoge el contenido total de cada pocillo y se centrifuga (12000 r.p.m., 1
min). Se agregan 50 µL de sustrato-mix reconstituído y se incuba 30 min a
tª ambiente en oscuridad. Se detiene la reacción con 50 µL de “solución
stop”. Se mide la absorbancia a 490 nm en contador de placas. La fórmula
aplicada para calcular el porcentaje de citotoxicidad correspondiente a la
absorbancia medida para cada ensayo fue:
Citotoxicidad(%)=(A oxidante)-(A sin oxidante)/A máx *100
B) Para el ensayo COMET:
Se cultivan los fibroblastos en medio DMEM-10%-FBS hasta confluencia
en una placa Petri. Se añade el compuesto objeto de estudio al cultivo y se
incuba durante 1 h. Dejar preparada una primera capa de agarosa en
portaobjetos (agarosa normal, 1%) a 4ºC. Se irradian las células a 200 mJ.
Tras la radiación, se lavan las células con PBS y se despegan de la placa
con tripsina. Se centrifugan y se resuspende el pellet en 1 mL de PBS (1x,
pH 7.4). Se añaden 300 µL de agarosa (2% en PBS a 37ºC) a 300 µL de la
suspensión de células. Se prepara la segunda capa de agarosa (esta vez con
las células) utilizando los portaobjetos con la primera capa de agarosa. Se
deposita el cubreobjetos en la superficie durante 20 min a 4 ºC. Se retira el
cubre y se añade la tercera capa de agarosa (1% agarosa normal). Se cubre
de nuevo y se incuba el portaobjetos 10 min a 4ºC hasta que solidifique la
agarosa. Se retira el cubre y se sumerge el portaobjeto en solución de lisis
(cantidades para 0.5 L: 73,1 g NaCl, 0,61 g Tris, 5 g lauril sarcosinato, 20,8
g EDTA, 2,5 mL Tritón X-100 y NaOH hasta pH=10) durante 1 h a 4ºC. Se
Capítulo III. Materiales y Métodos 155
coloca el portaobjetos en una cubeta de electroforesis con buffer de
electroforesis durante 30 min a 4ºC. Se inicia la electroforesis (buffer para
electroforesis (1 L): 0,42 g EDTA, 12 g NaOH, pH=13) a 20 V, 300 mA,
durante 40 min a 4ºC. Se tiñe el ADN en un baño de bromuro de etidio
(20 µg/mL) durante 3 min y se lava con Tris buffer 0.4 M (pH 7.5) en una
placa Petri. Para visualizar el ADN, se utiliza el microscopio de
fluorescencia (HAL 100, ZEISS) y se cuantifica el daño por el tamaño de la
cola mediante el contaje de píxeles en el monitor.
C) Para el efecto de DOPET sobre la captación de dopamina y
norepinefrina in vitro:
Las células fueron cultivadas en base al protocolo descrito por Rajebhosale y
colaboradores (Rajebhosale et al., 2003). Brevemente, las células se cultivan
en placas de 100 mm cubiertas con colágeno (colágeno de cola de rata tipo I,
BD, BIOSCIENCES). Se crecen a 37ºC en una atmósfera con un 5% de CO2 en
medio completo (RPMI 1640: con 10% suero de caballo y 5% de suero bovino
fetal, penicilina 50 U/mL y estreptomicina 50 U/mL). Se despegan las células
confluentes con una solución de 0.125% de tripsina, 0.5 mM EDTA en PBS
sin Ca 2+ ni Mg 2+, y se añaden a placas de 24 pocillos cubiertas por colágeno
hasta el 90% de confluencia, o en medio con 1% de suero y 50 ng/mL NGF
2.5S.
Tras 24 h (110% de confluencia o 4 x 10 5 células/pocillo), se realiza un
marcaje con 640 nM de monoaminas marcadas ([7,8-3H]-Dopamina (52
Ci/mmol), 1-[7,8-3H]-Norepinefrina (36 Ci/mmol), 5-hidroxi [3H] triptamina
trifluoroacetato (122 Ci/mmol) (AMERSHAM)) en DMEM (SIGMA) para los
tiempos indicados, lavando posteriormente 3 veces en DMEM. A
continuación, se recogen las células en 0.3 mL de buffer fosfato salino con 1
mM EDTA y 0.1% Tritón X-100 para el contaje en un contador de centelleo.
Para ensayos de secreción, las células lavadas se recolectan mediante 10
min de incubación con PSS (145 mM NaCl, 5.6 mM KCl, 2.2 mM CaCl2,
0.5 mM MgCl2, 5.6 mM glucosa, 15 mM HEPES-NaOH, pH 7.4) o con una
solución salina rica en K+ (PSS con 95 mM NaCl y 56 mM KCl) o con
Capítulo III. Materiales y Métodos156
Ionomicina en PSS (concentración final de Me2SO 0.5% v/v). Tras la
incubación, se eliminan los sobrenadantes y se resuspenden los pellets
como se describe con anterioridad, para proceder al contaje en contador
de centelleo (FACSCALIBUR, BECTON DICKINSON), con ordenador
MultiSync Fe 750+ (NEC).
La captación de aminas se determina añadiendo a las células un exceso de
100 veces la molaridad de los neurotransmisores no marcados, antes de
añadir el compuesto marcado. Por tanto, la captación específica se define
por la diferencia entre la captación total y la no-específica. Todos los
experimentos se realizaron en duplicado.
III.2.3.2. Aislamiento de mitocondrias hepáticas.
En base al protocolo descrito por Holt y colaboradores (Holt et al., 1997).
Se anestesia una rata o un ratón mediante inyección intraperitoneal de
pentotal sódico, para proceder a la extracción del hígado.
Se homogenizó el tejido en buffer fosfato sódico (3 mL/g de tejido) en
potter de vidrio. Se centrifuga durante 5 min a 1.000 r.p.m. a 4ºC, para
recoger los sobrenadantes y eliminar los pellets. Se vuelven a centrifugar
los sobrenadantes durante 30 min a 10.000 r.p.m. Se eliminan los
sobrenadantes y se resuspenden los pellets en buffer (1 mL/g tejido). Para
determinar la concentración de proteínas en la resuspensión de
mitocondrias, se lleva a cabo una medición por Bradford (Bradford, 1976).
Cada mezcla de reacción se preparó con 33 µL de mitocondrias, 167 µL de
solución cromogénica (ácido vanílico (1 mM), 4-aminoantipirina (500
µM), peroxidasa (4 U/ml), buffer fosfato potásico (0.2 M, pH 7.6). Se
mezclan, en un eppendorf limpio, 970 µL de la mezcla de reacción y 30 µL
de benzilamina (en aquéllos que lleven sustrato, concentración final de
300 µM). Todos los reactivos fueron obtenidos de SIGMA.
Las reacciones realizadas fueron: Control (sin inhibidor y sin sustrato),
muestras sin inhibidor pero con sustrato y muestras con concentraciones
crecientes de inhibidor con sustrato. Las reacciones se incubaron a 37ºC
Capítulo III. Materiales y Métodos 157
en agitación durante 1 h, tras la cual se detuvo en hielo y se centrifugaron
las muestras a 12.000 r.p.m. durante 5 min.
Para la determinación de la IC 50 de DOPET para la MAO, se midió la
A498 nm en el espectrofotómetro y se representó el porcentaje de
actividad enzimática frente al logaritmo de la concentración del inhibidor.
III.2.4. Microarrays en ratones sondados con DOPET.
Este estudio se realizó en colaboración con MedPlant Genetics (Bilbao,
España).
Durante 14 días se realizó el sondaje de 15 ratones hembra Balb/c
divididas en 3 grupos de 5 animales por grupo:
-Control: sondados con H2O mill-Q
-DOPET: recibieron 1 mg/mL en H2O milli-Q
-DOPET: sondados con 10 mg/mL en H2O milli-Q
Se midió la estabilidad de DOPET (Puleva Biotech, S.A.) en HPLC-ABTS y
se controló el peso de cada animal diariamente.
Los ratones se sacrificaron por dislocación cervical para una extracción
rápida del hipocampo, corteza cerebral e hígado. Todos los tejidos se
extrajeron en un tiempo inferior a 2 min para evitar la degradación del
ARN y se almacenaron a -80ºC.
Para el aislamiento de ARN, se homogenizaron 50-100 mg de tejido en 1
mL de Trizol y se centrifugaron a 12000 x g 10 min a 4ºC, pasando el
sobrenadante a otro tubo. Se incubaron las muestras durante 5 min a tª
ambiente y se añadieron 0.2 mL de cloroformo, agitando durante 15
segundos. Tras una incubación de 2 min a tª ambiente, se centrifugaron
(Ultracentrífuga (5804R, EPPENDORF) a 12000 x g, 15 min y a 4ºC. Se
transfirió la fase acuosa a un nuevo tubo y se añadieron 0.5 mL de alcohol
isopropílico. Tras 10 min a tª ambiente, se repitió la centrifugación, se
eliminó el sobrenadante y se lavó el pellet con 1 mL de 75% etanol.
Finalmente se centrifugó a 7500 x g, 5 min a 4ºC y se secaron los pellets a
tª ambiente durante 10 min, tras los cuales se resuspendieron en 20 µL de
Capítulo III. Materiales y Métodos158
agua mill-Q. Se midió la concentración de ARN (A260=1 40 µg/mL,
A260/A280 entre 1.6 y 1.8). Para verificar la presencia y pureza del ARN,
se corrieron las muestras en un gel de agarosa.
III.2.5. Estudios de antioxidación.
III.2.5.1. Detección de MDA en cerebro.
Las muestras se realizaron por duplicado, incluyendo el homogenado de
cerebro de rata, solución de SO4Cu (125 µM) y DOPET (5 mM). Se incubaron
a 37 ºC durante 2 h. Se llevó a cabo una calibración para la determinación
por espectrofotometría de la cantidad de MDA en cerebro, utilizando
concentraciones crecientes de MDA (20 µM; Solución stock de MDA: 8.15 µL
de disolución comercial de MDA-ALDRICH-en H2O milli-Q hasta 1 mM. Se
toman 200 µL de esta disolución y se enrasan hasta 10 mL en un matraz
aforado obteniendo de esta forma una disolución 20 mM). Del reactivo de
SRATs (0.19 g de ácido tiobarbitúrico (TBA) disueltos en 1.08 mL de HCl. Se
añaden 7 g de ácido tricloroacético y se disuelven en 30 mL de H2O milli-Q.
Se completa con H2O milli-Q hasta un volumen final de 50 mL. Finalmente
se añaden 50 µL de la disolución de BHT (2,6-di-ter-butil-4-metilfenol,
MERCK) al 10% en etanol) se incluyó 1 mL en las muestras y en los patrones.
Se agitó vigorosamente y se calentaron las muestras en el bloque calefactor a
100ºC durante 15 min. Se dejaron enfriar y se centrifugaron a 4000 r.p.m.
durante 10 min. Finalmente se midió la absorbancia en el sobrenadante a 535
nm.
III.2.5.2. Detección de MDA en plasma.
Se establecieron varios grupos de ratones alimentados con diferentes dietas:
grupo control (dieta chow), grupo colesterol (chow+1,5% colesterol), grupo
DOPET (chow+ DOPET en agua bebidade baja mineralización) y grupo
DOPET+colesterol (dieta con 1,5% colesterol y DOPET en agua). La
Capítulo III. Materiales y Métodos 159
estabilidad de DOPET en el agua fue controlada diariamente mediante la
toma de una alícuota del bebedero, y se comprobó por HPLC-Masas la pérdida
de un 16,6% de capacidad antioxidante transcurridas 24 h, por lo que fue
renovado diariamente.
Se determinó la concentración de MDA en plasma de ratón mediante HPLC-
FLD (HPLC 2695 WATERS provisto de: Inyector automático; bandeja para
muestras termostatizada 4-40ºC; horno de columna termostatizado 20-
60ºC; Detector de fluorescencia Waters 474; Ordenador Pentium III y
Software Millenium 4.0) siguiendo el método basado en el protocolo descrito
previamente (Fukunaga et al., 1998).
Capítulo III. Materiales y Métodos160
Fase
estacionaria
Columna LiChroCart 250-4 (Superspher 100 RP-18) 250 x 4.6
mm
Fase Móvil
(Isocrático)
Fase A: 96% Tampón KH2PO4 50 mM p = 6,8
Fase B: 4% Acetonitrilo/Agua (70/30)
Flujo 0.5 ml/min
Vinyección ( L) 50 L
Profundidad de
la Aguja
0 mm
Tcarrusel muestra
(ºC)
4.0 1.0 ºC
Tcolumna (ºC) 40.0 5.0ºC
Fluorescencia
( medida)
Excitación 515 nm / Emisión 543 nm; Ganancia 10
Duración
(tretencion)
12 min (7.11 min)
Modo de
Medida
Áreas
Réplicas 1
Tabla III.6.: Parámetros instrumentales. Eluyente A: Tampón KH2PO4 50
mM pH 6, Eluyente B (Acetonitrilo Agua (70/30).
En tubos eppendorf de rosca, se añadieron 20 L de patrón
(Malondialdehido-bis-(dimetil)-acetal 99%, ALDRICH; Disolución Madre 1
mM de MDA= 8.25 L de MDA en 50 mL de agua milli-Q) o de la muestra
respectiva, 500 L de un tampón Acetato sódico (2M, pH=3.5; >99%, PA-
Panreac; 118 mL de acético glacial con 600 mL de agua milliQ, se ajusta el
pH a 3.5 con NaOH 10 M y se añaden 2 g de TBA. Se ajusta de nuevo el pH=
Capítulo III. Materiales y Métodos 161
3.5 con NaOH 10 M y se enrasa con agua milli-Q a 1 L) que contiene a su vez
un 0,2% (Peso/Volumen) de TBA (Scharlau) y se agitó vigorosamente. Se
incubaron en el bloque calefactor a 95ºC durante 1 h y se centrifugaron a
10.000 r.p.m. durante 2 min a 4ºC para condensar vapores. Se adicionaron
500 L de del tampón KH2PO4 (50 mM pH=6.8; 3,4 g de KH2PO4, en 400
mL de agua milli-Q y se ajusta el pH a 6,8 con KOH 2M.) y se volvió a
centrifugar durante 10 min a 13.000 r.p.m en frío (4ºC). A continuación se
tomaron 600 L del sobrenadante y se mezclaron con otros 600 L de
tampón KH2PO4 (50mM pH=3.5; 3,4 g KH2PO4 en 400 mL de agua milli-Q.
Se ajusta el pH a 3,5 con HCl 1 M= 4,14 mL HCl 37% en 50 mL) y tras pasarlo
a un vial se inyectaron en HPLC.
Figura III.2.: Cromatograma de MDA en plasma por HPLC-FLD. El pico
obtenido para MDA se obtuvo a los 6,9 min.
Los resultados se expresan en µmoles/L de MDA en plasma. Dicha
concentración se determina mediante interpolación del área correspondiente
a cada una de las muestras en la función de calibración obtenida con los
patrones de concentración conocida. La concentración de MDA se calcula por
interpolación en las funciones de calibrado establecidas con anterioridad.
)()(
1 bPendienteaordenadaSeñalC
Capítulo III. Materiales y Métodos162
El modelo de calibración seleccionado es el linear de regresión univariante
por mínimos cuadrados. En la tabla III.7. se muestran los parámetros
analíticos principales.
Parámetro MDA
*n 10
*k 8
Ordenada en origen (a) 3.08·104
sa 1.12·104
Pendiente (b) (L·µmol-1) 1.39·105
sb (L·µmol -1) 2.30·103
Coeficiente R2 (%) 99.78
Desviación estándar SRC 2.34·104
Test de fallo de ajuste (Plof %) 34.56
Tabla III.7: Parámetros de la función de calibrado.* k= nº de niveles de
calibración; n=nº de inyecciones totales.
A(X 10000
Capítulo III. Materiales y Métodos 163
El intervalo de concentraciones seleccionado para la aplicación del método es
de 0,10 a 10,0 µmoles/L. En este rango, la linealidad calculada es 98,34%.
La precisión del método analítico se ha evaluado a partir de la
reproducibilidad de la señal analítica mostrada por 10 disoluciones de
concentración constante e igual a 5,0 µmol/L del analito, concentración que
corresponde a la zona central de la función de calibrado.
N Señal media D.E D.E.R.
MDA 10 6,997·105 1,69·105 2,42%
Tabla III.8.: Cálculo del coeficiente de variación del método.
En la tabla III.9. se muestran los valores de las sensibilidades del calibrado y
analíticas para cada uno de los componentes de la mezcla, de acuerdo con las
definiciones propuestas.
SRC Sensibilidad (L/µmol) Res Analitica
(µmol/L)
MDA 2,34·104 1,39·105 0,17
Tabla III.9.: Cálculo de la sensibilidad del calibrado y del método.
Se ha estudiado la estabilidad de las muestras una vez procesadas y dentro
del carrusel de inyección a 4ºC. Para ello se han tomado tres muestras reales
y tres patrones de distinta concentración y se han inyectado varias veces a lo
largo del tiempo. En ningún caso el porcentaje de pérdida de área superó el
5%, lo que indica que las muestras pueden ser mantenidas en el carrusel de
inyección a esa tª durante el tiempo necesario para la realización del análisis.
Capítulo III. Materiales y Métodos164
III.2.5.3. Cuantificación de la actividad catalasa en cerebro
de conejo.
Se homogenizó el hemisferio cerebral izquierdo con buffer (20 mM Tris-
HCl, 2 mM EGTA, 1 mM EDTA, 1 mM benzamidina, 1 mM DTT, 1 mM
PMSF, pH= 7.4; 1 mL/ mg de tejido). A continuación se centrifugó a
12.000 r.p.m. durante 40 min a 4ºC.
Tiempo de medida 2 min
Tiempo de retraso 0
Mostrar absorbancia relativa
Pendiente positiva
Rango 0.500
Factor 1.000
Prog. Cubetas auto
Ref. modo off
Tabla III.10.: Parámetros instrumentales del espectrofotómetro para
determinar la actividad enzimática Catalasa a 240 nm.
Cada muestra se elaboró con 900 µL de tampón fosfato sódico (50 mM
pH=7.4: NaCl 150 mM, EDTA 5 mM, tritón 1 % y SDS 0.5%) y 100 µL de
H2O2 (30%). Se añadieron 5 µL de cada muestra de proteínas y se mezclaron
rápidamente. Los parámetros de medida programados en el
espectrofotómetro fueron: tiempo de medida= 2 min; tiempo de retraso=0
min; absorbancia relativa; pendiente=positiva; rango=0.500; factor=1.000;
ref.modo=off. Tras determinar la absorbancia (A) a 240 nm, se expresa la
actividad como la caída de A240 durante el primer min por mg de proteína.
Capítulo III. Materiales y Métodos 165
III.2.7.4. Modelo de ácido kaínico: Laberinto acuático de
Morris.
Basándonos en el protocolo previamente descrito por Morris y colaboradores
(Morris, 1984), se dividió una piscina circular (1 metro diámetro) en 4
cuadrantes: sur, oeste, norte y este y se rellenó diariamente con unos 25 cm
de agua opaca, mediante la adición de unos 100 g de leche en polvo. La tª del
agua se mantuvo alrededor de los 25ºC y se colocaron referencias externas a
la piscina y al alcance visual de los animales. Se colocó una plataforma
circular y de superficie rugosa en posición suroeste e inmersa en la piscina,
cubierta por 1 cm de agua.
Se realizaron 2 bloques de entrenamiento diarios, con 4 pruebas por bloque,
durante 7 días y 1 h entre ambos bloques. Cada prueba se cronometró desde
el momento en que el animal entraba en el H2O hasta que tocaba la
plataforma con las patas delanteras. El inicio de cada una de las 4 pruebas
era la colocación del ratón en el agua, mirando hacia la pared, siguiendo el
orden: sur, oeste, norte, este. El tiempo máximo permitido para la
localización de la plataforma fue de 90 segundos. Si no era localizada, el
animal era guiado hacia ella y mantenido sobre la misma durante 15
segundos. Si la encontraba sin ayuda en el tiempo concedido, igualmente se
dejaba durante 15 segundos antes de ser retirado de la piscina.
Cada día y con anterioridad a la ejecución del entrenamiento, cada grupo de
ratones (n=10) fue sometido a un tratamiento concreto: el control de Ácido
Kaínico (SIGMA) recibieron 0,6 mg/día de la neurotoxina mediante
inyección intraperitoneal; el grupo sondado con DOPET (sintético) recibió 5
mg/día y el grupo “DOPET+AK” fue sondado e inyectado diariamente con las
dosis anteriormente especificadas. Así mismo, se estableció un grupo control
que no recibió ningún tipo de tratamiento.
Capítulo III. Materiales y Métodos166
III.2.7. Estudios de estabilidad de DOPET en agua.
Se planificó evaluar el efecto de DOPET disuelto en el agua de bebida, para
ser administrado en diferentes estudios, analizando la estabilidad del
compuesto en función del tipo de agua empleada.
Se escogieron 4 tipos de agua: Destilada, agua de mineralización débil
(500 mg/L de contenido global en minerales), agua de mineralización muy
débil (35 mg/L de residuo seco) y agua corriente del grifo. Se realizó un
calibrado para determinar la concentración de DOPET en cada tipo de
agua, utilizando cantidades igual a 0, 100, 200, 500, 1000, 1500, 2000 y
3000 ng de DOPET. Se adicionó una concentración de 0,2 g/L de DOPET
en cada tipo de agua, y se tomaron muestras a 0, 1, 3, 6, 9, 12, 24, 48 y 120
h. Se analizaron mediante HPLC-Masas (WATERS Alliance 2695m, con
detector de masas WATERS Micromass ZQ) en UV a 280 nm y en UV-MP.
La curva de calibrado obtenida para el análisis por UV-MP, se ajustó a la
ecuación:
y= 1865,8x + 129008; R2= 0,99
La curva de calibrado para el análisis mediante UV (280nm), correspondió
a:
y= 56,2x + 109,2; R2= 0,99
En la figura III.3. se muestran los porcentajes de la degradación de
DOPET a lo largo del tiempo en cada tipo de agua analizada mediante
HPLC-UV (280nm).
Capítulo III. Materiales y Métodos 167
0
20
40
60
80
100
0 30 60 90 120
Tiempo (h)
Deg
rad
ació
n D
OP
ET
(%)
Destilada
Grifo
Mineralz.débil
Minerlz.muy débil
Figura III.3.: Representación de la degradación de DOPET en cada tipo
de agua con el paso del tiempo. El análisis por HPLC-UV (280 nm) demostró
que el agua más apropiada para mantener la estabilidad del compuesto a lo largo
del tiempo era el agua de mineralización muy débil.
Una vez establecida como óptima el agua de mineralización muy débil para
mantener durante más tiempo la estabilidad de DOPET, se llevaron a cabo
estudios de la estabilidad en este tipo de agua, pero en condiciones de frío,
congelación, luz y oscuridad. A partir de una disolución de DOPET de 200
ppm, se estableció que su estabilidad no resultó alterada de manera
significativa bajo ninguna de las condiciones a las que se sometió el
compuesto.
Capítulo III. Materiales y Métodos168
III.2.7. Estudios del metabolismo del colesterol.
III.2.7.4. Determinación de actividad Latosterol-C5-
Desaturasa por HPLC.
El método se basa en los protocolos descritos previamente (Ishibashi and
Bloch, 1981; Kawata et al., 1985; Takakuwa, 1994).
Se realizó un homogenado de hígado de rata en hielo en 2,5
volúmenes/mg de tejido con buffer fosfato potásico 100 mM (11,7 g de
K2HPO4 en 200 mL de H2O destilada y 6,8 g de KH2PO4 en 0,5 L de H2O
destilada. Se ajustó el pH a 7.4 con la solución de KH2PO4 y se completó
con H2O hasta 0.5 L). En tubos con tapón de rosca (BECKMAN), se
centrifugó el homogenado a 13000 x g 10 min a 4ºC (Ultracentrífuga
OPTIMA L-90 K; Rotores Vti 50 y Vti 70). Se recogió el sobrenadante y se
centrifugó en los tubos con tapón de ajuste durante 1 h a 105000 x g a
4ºC. El sobrenadante (S105) fue sometido a diálisis en tubos de diálisis
(SIGMA) en buffer P (150 mL de buffer fosfato potásico 100 mM en 850
mL de H2O destilada y 0.042 g de EDTA; 3 cambios de buffer a 4ºC,
durante 4 h). La membrana de diálisis se lavó e hirvió previamente con
H2O destilada y EDTA durante 30 min. El pellet resultante de la
centrifugación se lavó y resuspendió en Tris HCl (pH=7.5, BIORAD) para
obtener microsomas. Se midió la concentración de proteínas por Bradford
y se llevó hasta una concentración de 10 mg/mL.
Para preparar liposomas, se mezclaron 2.5 mg de fosfatidilcolina de huevo
(SIGMA), 1 mg de latosterol (SIGMA) y 25 µg hidroxitolueno (SIGMA) en
cloroformo. Esta solución se secó con N2 y se mezcló con 2 mL de solución
A (8.55 g sacarosa, 0.12 g Tris en 100 mL de H2O destilada, pH=7.4, 0.042
g EDTA). Las muestras se sometieron a sonicación a 100 vatios durante 30
min en hielo hasta eliminar la turbidez.
Para preparar cada muestra de reacción (volumen final de 200 µL) se
mezclaron 40 µL de S105, 60 µL de liposomas (400 µM), 50 µL de
microsomas (0.5 mg de proteína) y 50 µL de buffer P. Se incubaron
Con formato: Fuente: 12pt
Capítulo III. Materiales y Métodos 169
durante 3 h a 37ºC en agitación en un termomixer. Transcurrido este
tiempo, se fueron añadiendo alícuotas de 2 µL de NADH (245 mM,
SIGMA) cada 10 segundos sobre la muestra. Transcurridos 5 min desde
que el inicio de la reacción para la primera muestra, se detuvo la misma
mediante la adición de la muestra sobre una solución de 0.5 mL de 20%
KOH en 50% metanol (11 g de KOH en mezcla de 25 mL de H2O destilada
y 25 mL de metanol) y 0.4 mL de buffer P. Se recogieron las muestras en
serie cada 10 segundos y se dejaron saponificar a tª ambiente durante 1 h.
Se realizaron 3 extracciones con 1 mL de n-hexano. Se reunieron las tres
fases orgánicas en un tubo de vidrio con tapón de rosca. Se secaron con N2
líquido y se resuspendieron en 100 µL de n-hexano. Finalmente, las
muestras fueron filtradas y preparadas en viales cromatográficos para ser
inyectados en HPLC 2695 (HPLC A, WATERS, nº Serie D98SM7647M
provisto de: inyector automático, horno de columna termostatizado 20-60
ºC y detector de PDA 2695, ordenador Pentium III y Software Millenium
4.0). Los parámetros instrumentales quedan recogidos en la siguiente
tabla III.11.:
Capítulo III. Materiales y Métodos170
Fase estacionaria Columna SupelcoSil LC-18-DB 150x4.1 mm,
5 m
100% Hexano/Isopropanol
Fase Móvil (Isocrática) Fase A: MeOH/Agua/AcN (55/5/40)
Flujo 1,0 mL/min
Vinyección 40 L
Profundidad Aguja 2 mm
Tcarrusel muestra (ºC) 5,0 5,0 ºC
Tcolumna (ºC) 50,0 5,0 ºC
Duración (tretencion) 20 min (t7-DHC = 11,29 min)
PDA Rango ( medida) 230 – 350 nm (280 nm)
Modo de Medida Áreas
Réplicas 1
Tabla III.11.: Parámetros instrumentales de HPLC para la
determinación de LC5D. Se utilizó como patrón el 7-dehidrocolesterol (7-DHC,
disolución madre de 1 g/L en metanol calidad HPLC).
La curva de calibración se realizó con concentraciones crecientes de 7-DHC
disuelto en hexano: 1 µg/mL; 10 µg/mL; 50 µg/mL; 100 µg/mL y 200
µg/mL. Los resultados obtenidos se muestran en la tabla III.12. y figura III.4.
Capítulo III. Materiales y Métodos 171
Patrón 7-DHC ng Área
1 10 30349
10 100 351784
50 500 1740055
100 1000 3480178
200 2000 6839381
Tabla III.12.: Valores obtenidos por HPLC-PDA para la curva patrón de
7-DHC. La ecuación a la que se ajustó la curva fue: y=-5,048 + 0,00029*x. R2=
0,9999.
Figura III.4.: Cromatograma para la identificación de 7-DHC en
microsomas hepáticos de rata, por HPLC-PDA (280nm). La
detección se realizó empleando como eluyente 100% de una mezcla
hexano/isopropanol. El tiempo de retención fue de 8,58 min.
Capítulo III. Materiales y Métodos172
III.2.7.4. Efecto de diferentes dietas en el metabolismo del
colesterol de conejos.
El estudio se llevó a cabo en 56 conejos alimentados durante 30 días con
una dieta aterogénica (dieta chow 95%, grasa saturada 3% (manteca de
cerdo), colesterol 1,33%) (Ramirez-Tortosa et al., 1998). Recibieron 150 g
de cada dieta al día y H2O ad libitum. La ingesta diaria se controló por
pesada diaria del sobrante. El peso de los animales se controló
semanalmente. El esquema de trabajo se recoge en la figura III.5. El
DOPET se administró por sondaje, 10 mg/conejo/día, resuspendido en
H2O ELIX al 0.9 % de NaCl y filtrado con filtro de 0.22 µm.
Se anestesiaron con pentotal sódico inyectado por vía intravenosa en la
vena marginal de la parte posterior de la oreja izquierda, se sacrificaron
por dislocación cervical y se extrajo sangre y cerebro.
Figura III.5.: Esquema del estudio realizado en 56 conejos alimentados
con diferentes dietas.
Dieta chow Dieta aterogénica
Dieta aterogénica + DOPET16 conejos Grupo ADT
(n=8)30 días
Chow + DOPET Grupo DT
(n=8)
16 conejos
Dieta aterogénica
Dieta aterogénica
30 días 30 días
Grupo AA (n=8)
Grupo CA (n=8)
16 conejos
Dieta chow 6% materia grasa
30 días 30 días
Grupo CF (n=8)
Grupo CO (n=8)
Dieta chow 6% materia grasa
30 días
8 conejos
30 días 30 días
Grupo AC (n=8)
Capítulo III. Materiales y Métodos 173
III.2.7.4. Determinación de la concentración de colesterol en
cerebro y plasma.
Cada hemisferio cerebral se pesó y homogenizó en buffer de homogenización
(1 mL/g tejido; 20 mM Tris-HCl, 2 mM EGTA, 1 mM EDTA, 1 mM
benzamidina, 1 mM DTT, 1 mM PMSF, pH= 7.4). La extracción de colesterol se
realizó con 40 mL de cloroformo:metanol (2:1, v/v) en un tubo falcon. Tras
mezclar bien, se centrifugó durante 10 min a 2500 r.p.m. La fase superior e
interfase se transfirieron a un nuevo tubo nuevo para repetir la extracción en
20 mL de cloroformo:metanol (2:1). Tras una última extracción para combinar
las 3 fases clorofórmicas, se llevaron a sequedad en rotavapor (BUCHI) a 45-
50ºC. A continuación se resuspendieron en 7 mL de cloroformo:metanol (2:1),
y se mezclaron 400 µL de esta resuspensión con 1 mL de una solución 2%
Triton X-100:cloroformo. Nuevamente se llevaron a sequedad para una
resuspensión final de las muestras en 0.5 mL de H2O. La cantidad de
colesterol total se determinó en 5 µL de muestra mediante la realización de un
ensayo colorimétrico-enzimático, siguiendo las instrucciones del kit (Bio
Systems). La concentración de colesterol total se expresó en mg/g de tejido
húmedo.
Para la determinación de la concentración de colesterol total, LAD-
colesterol, LBD-colesterol y triglicéridos en plasma, se siguió el protocolo
suministrado por el fabricante de los kits (Bio Systems). Tras la punción
cardiaca a los animales, la sangre se centrifugó durante 10 min a 3500 rpm
para obtener el plasma. Tanto para la determinación de colesterol total
como de triglicéridos (TG), se mezclaron 10 µL de muestra con el reactivo
del kit, y tras 10-15 min de incubación a tª ambiente se determinó la
absorbancia (A) a 500 nm en espectrofotómetro. La concentración de la
muestra se estableció mediante la fórmula: (A muestra /A patrón)*
Concentración patrón, donde la concentración del patrón era de 200
mg/dL. En el caso de la determinación de la concentración de LAD-
colesterol, se tomaron 200 µL de muestra iniciales, y la concentración del
patrón era de 52,5 mg/dL. Finalmente, el cálculo de la concentración de
Capítulo III. Materiales y Métodos174
LBD-colesterol se estableció según la fórmula de Friedewald: LBD= Col-
(TG/5) + LAD.
III.2.7.4. Concentración de latosterol en cerebro por CG-
MS.
El latosterol es un metabolito en el metabolismo del colesterol, que es
degradado por la enzima LC5D en 7-DHC. La determinación de latosterol
se llevó a cabo en base a estudios previos (Fassbender et al., 2001; Folch et
al., 1957) utilizando un cromatógrafo de gases con inyector automático,
acoplado a un espectrofotómetro de masas (CG-MS Varian provisto de:
Inyector automático Varian 8200; Cromatógrafo de gases Varian 3400;
Espectrómetro de masas Varian Saturn MS/MS 2000; Ordenador
Pentium II y Software Saturn 5.5.1). A continuación se muestran las
condiciones de análisis optimizadas para la determinación del compuesto
en las muestras problema.
Capítulo III. Materiales y Métodos 175
Fase estacionaria Supelco Sil ODS 2
Fase Móvil Helio Purísimo
Vinyección ( L) 2 L
CG
Horno To = 150 ºC (3 min)
T1 = 290 ºC (30ºC/min, 17.33 min)
Duración 25 min
Inyector 150 ºC (25 min)
Espectómetro de masas
Temp. Trampa 200ºC
Temp. Manifold 50ºC
Temp. Línea transferencia 260ºC
Rango masas
Retraso 4.50 min
De 4.5 min a 13.0 min Cerrado
De 13.0 a 14.5 min 45 a 650 m/z
Flujo columna 1.0 mL/min
Relación de flujo 10
Modo de Medida Áreas
Réplicas 1
Tabla III.13.: Parámetros instrumentales de GC-MS para la
determinación de latosterol en cerebro. Los iones de los compuestos
seleccionados para el método de trabajo SIM fueron: Naftol (201, 216 m/z),
Latosterol (443, 458, 459 m/z), Antraceno (178 m/z).
Capítulo III. Materiales y Métodos176
Para elaborar las muestras, se utilizó una alícuota de 0,5 mL de las
muestras obtenidas mediante el protocolo descrito anteriormente para la
determinación del colesterol total en cerebro, y se llevó a sequedad en
evaporador-Speed Vac. A continuación se disolvieron en 250 µL de acetato
de etilo. Las muestras se someten a sonicación durante 15 min y se agitan
en vortex durante 1 min. Por último se adicionan 10 µL del patrón interno
( -naftol (1 g/L) disuelto en etanol) y se derivatizan 25 µL de cada muestra
adicionando una mezcla constituida por 15 µL de BSTFA (N,N-Bis
(trimetilsilil)-trifluoroacetamida), 5 µL de piridina, 2.5 µL antraceno (500
mg/L) y 2,5 µL acetato etilo.
Los resultados se expresan en g de analito por litro de disolución. La
concentración se determina mediante interpolación del área
correspondiente a cada una de las muestras en la función de calibrado
obtenida con los patrones de concentración conocida.
El modelo de calibración seleccionado es el linear de regresión univariante
por mínimos cuadrados.
La curva patrón se ajustó a la ecuación: y= 0,025 + 0,088*x, y el valor
de R2= 99.66 %.
Recta de patrones disueltos en acetato de etilo, donde C= 0.1 mg/L; 0.5
mg/L; 1 mg/L; 5 mg/L; 10 mg/L; 20 mg/L. Sin embargo los resultados
finales son relativos, ya que la recta de patrones no está realizada en las
mismas condiciones que las muestras. Sería necesario trabajar con adición
de patrón.
IV. RESULTADOS
Capítulo IV. Resultados 178
IV.1. Estudios en modelos animales de la EA.
IV.1.1. Estudios con dietas enriquecidas en AGPIs
omega-3 en modelo transgénico simple PPA de la EA.
Con objeto de determinar la influencia de los AGPIs omega-3 de la dieta
sobre ciertos parámetros bioquímicos relacionados con el desarrollo de la
patología de la EA (niveles de colesterol, ácidos grasos y de péptido A ), se
decidió utilizar el modelo de ratón transgénico simple de la EA
denominado PPA-Tg53. Este modelo se caracteriza por expresar la proteína
PPA en un factor igual a 7, desarrolla los depósitos de A -40 en torno a los
6 meses de edad, y presenta neuritas. Lo escogimos para poder evaluar el
efecto de la dieta en un tiempo relativamente breve pero suficiente para
dejar actuar a los AGPIs.
IV.1.1.1. Determinación de ácidos grasos en cerebro y
plasma.
El 60% del cerebro está formado por lípidos estructurales. El ácido
araquidónico (AA; omega-6) y los ácidos docosahexaenoico y
eicosapentaenoico (DHA y EPA; omega-3) son necesarios para el
crecimiento y el neurodesarrollo (sensorial, perceptivo, cognitivo y motor)
(Clandinin, 1997). La relación ADH:AA se utiliza como indicador de la
maduración cerebral (Innis et al., 1997) y la relación AA:EPA como
indicador de la disponibilidad de precursores de eicosanoides,
determinantes en los procesos inflamatorios (Adams et al., 1996).
Los AGPIs son componentes de los fosfolípidos de membrana, y están
ligados a la EA por ser especialmente vulnerables al estrés oxidativo,
habiéndose descrito una mayor degradación de los fosfolípidos cerebrales
en estos pacientes (Prasad et al., 1998). Los AGPIs omega-3 contenidos en
la dieta suprimen la inflamación y disminuyen la producción de citoquinas
Capítulo IV. Resultados 179
pro-inflamatorias, por lo que se decidió estudiarlos en un modelo animal
de la EA, para analizar el beneficio de este tipo de dieta (EPA:ADH, en
proporción 2:1) sobre esta patología.
La determinación de ácidos grasos en cerebro se realizó mediante Gases-
Masas en 3 animales de cada género, genotipo y grupo de dieta. La distinción
por géneros (en este y otros parámetros), se estableció por la mayor incidencia
de la EA en el género femenino (Andersen K and L, 1999.; Miech RA and AS,
2002.).
Los resultados obtenidos en porcentajes de ácidos grasos totales para AA,
DHA y EPA, quedan recogidos en la tabla IV.1. y representados en las figuras
IV.1. (para AA) y IV.2. (para ADH).
Cerebro
AA
(Media) Error
ADH
(Media) Error
Machos_wt_control 10,2 0,55 15,9 0,36
Machos_PPA_control 11,1 0,30 16,5 0,23
Hembras_wt_control 9,67 0,08 15,2 0,25
Hembras_PPA_control 10,1 0,11 15,3 0,40
Machos_wt_omega3 9,89 0,08 16,6 0,53
Machos_PPA_omega3 9,77 0,20 16,7 0,24
Hembras_wt_omega3 10,1 0,26 16,5 0,29
Hembras_PPA_omega3 10 0,31 16,5 0,24
Tabla IV.1.: Valores para los niveles de ácidos grasos en cerebro en los
diferentes grupos de dietas. Se muestran los porcentajes de AA y ADH (totales)
en cada uno de los grupos, desglosados por tipo de dieta (control y omega3), género
y genotipo (wt= no transgénico, PPA=transgénico).En todos los subgrupos
estudiados se obtuvo un 0% de EPA en cerebro.
Capítulo IV. Resultados 180
6
9
1 2
AA
(%
)
Ma He
PPA
Ma He
Wt
Ma He
PPA
Ma He
Wt
CONTROL OMEGA-3
* *
*
Figura IV.1.: Representación del nivel medio de AA total en cerebro (%)
en cada uno de los grupos. Se representan ambos grupos de dietas,
distinguiendo entre géneros (Ma=machos y He=hembras) y genotipo (Wt=no
transgénicos y PPA= transgénicos). Se obtuvo un descenso estadísticamente
significativo (P<0,05; representado con un asterisco) entre el grupo omega-3
comparado con el grupo control en su conjunto, así como entre los machos
alimentados con omega-3 con respecto a los machos mantenidos con dieta control.
Capítulo IV. Resultados 181
9
12
15
18
AD
H(%
)
Ma He
PPA
Ma He
Wt
CONTROL OMEGA-3
Ma He
PPA
Ma He
Wt
*
*
Figura IV.2.: Representación de los porcentajes del nivel medio de ADH
(%) en cerebro en cada uno de los grupos. Se obtuvo un incremento
significativo (P=0,01) en el grupo omega-3 comparado con el grupo control, así
como un aumento significativo en el grupo de hembras transgénicas alimentadas
con omega-3 en relación a las hembras transgénicas con dieta control (P<0,05).
En relación a los niveles medios de AA en cerebro, el análisis estadístico por
ANOVA (Un factor) reveló un descenso estadísticamente significativo
(P<0,05) entre los ratones machos alimentados con dieta omega-3 en relación
a los animales del mismo género que recibieron dieta control. Así mismo,
comparando conjuntamente al grupo omega-3 con el grupo control, se obtuvo
una reducción estadísticamente significativa (P= 0,01) en el valor obtenido
para este ácido graso. No se observó una bajada significativa (P= 0,76) entre
las hembras alimentadas con cada tipo de dieta.
Con respecto a los niveles medios de ADH, la aplicación de ANOVA (Un
factor) demostró un incremento estadísticamente significativo entre el
grupo dieta omega-3 en relación al grupo control (P= 0,01). También se
obtuvo un aumento significativo de ADH entre las hembras PPA-control y
Capítulo IV. Resultados 182
las hembras PPA-omega-3 (P<0,05). Sin embargo, no se obtuvo ninguna
diferencia significativa entre los grupos de ratones machos (P= 0,57).
La extracción de ácidos grasos en plasma, se llevó a cabo en grupos de 4
animales por tipo de dieta, genotipo y género. Los resultados se muestran
en la tabla IV.2. y se representan en la figura IV.3.
Plasma
AA
(%) ADH (%)
EPA
(%)
Machos_wt_control 10,5 4,73 0
Machos_PPA_control13,5 5,92 0
Hembras_PPA_control 9,9 4,97 0
Machos_wt_omega36,8 5,99 2,99
Machos_PPA_omega34,69 5,14 2,87
Hembras_wt_omega3 5,85 5,95 2,7
Hembras_PPA_omega3 8,15 7,67 2,8
Tabla IV.2.: Valores medios (%) de ácidos grasos AA, ADH y EPA en
plasma. Debido al reducido volumen de plasma obtenido de cada ratón, se
utilizó el tejido de los 4 animales que representaban cada grupo para realizar la
extracción, salvo para el grupo de hembras no transgénicas de la dieta control,
que no pudo realizarse por falta de plasma.
Capítulo IV. Resultados 183
Figura IV.3: Representación de los valores medios de AA, ADH y EPA en
plasma. Se identificaron los picos por CG-Masas correspondientes a AA, ADH y
EPA en el plasma de cada grupo de ratones, diferenciados por genotipo, género y
dieta. Se obtuvo un descenso significativo (P<0,05) de los niveles de AA en el grupo
omega-3 con respecto al grupo control. No hubo distinción entre géneros ni
genotipos.
El análisis estadístico determinó una reducción estadísticamente significativa
(P<0,05) en los niveles de AA en plasma en el grupo omega-3 con respecto al
grupo control, aunque no se obtuvo ninguna diferencia significativa para los
niveles de ADH (P= 0,22). La aparición exclusiva de EPA en plasma del grupo
omega-3 se asocia con la composición de la dieta omega-3, elaborada con 10
g/kg EPA.
Por tanto, el análisis de los niveles de ácidos grasos en este estudio demostró
que no existían diferencias significativas entre el grupo de no-transgénicos y
de animales PPA, aunque al comparar los diferentes géneros se obtuvo una
reducción de los niveles de AA en machos omega-3 con respecto a los machos
alimentados con dieta control, mientras que en las hembras se observó un
incremento en los niveles de ADH cerebral entre hembras PPA-omega3
0
2
4
6
8
10
12
14
Áci
dos
gras
os t
otal
es(m
edia
,%)
CONTROL OMEGA-3
AA EP
A
AA
AA
AA
AA
AA
AA
AD
H
AD
H
AD
H
AD
H
AD
H
AD
H
AD
H
EP
A
EP
A
EP
A
Ma_Wt Ma_PPA He_PPA Ma_Wt Ma_PPA He_Wt He_PPA
*
**
*
Capítulo IV. Resultados 184
respecto a las hembras PPA-control. La suplementación de la dieta con AGPIs
omega-3 supuso una reducción de los niveles de AA (omega-6) totales, tanto
en plasma como en cerebro y un incremento de los niveles de ADH (omega-3)
totales en cerebro, independientemente de su género y genotipo.
IV.1.1.2. Determinación de colesterol total en cerebro y
plasma.
La determinación de colesterol en cerebro, mediante kit colorimétrico (Bio
Systems), dio lugar a los resultados incluidos en la tabla IV.3. y
representados en la figura IV.4.
0
5
10
15
20
25
[CO
L](
mg/
dL
)
CONTROL OMEGA-3
Ma He
PPA
Ma He
Wt
Ma He
PPA
Ma He
Wt
*
** *
*
Figura IV.4.: Representación de los valores medios de colesterol total
en cerebro. Se compararon ambos grupos de dietas y cada uno de los
subgrupos establecidos en base al género y genotipo. Se obtuvieron reducciones
significativas (P<0,05) en el grupo omega-3 respecto al control, así como entre
las hembras con dieta control respecto a los machos de su grupo, y finalmente un
descenso en los niveles de colesterol en los machos alimentados con omega-3
respecto a los machos mantenidos con dieta control.
Capítulo IV. Resultados 185
El análisis comparativo mediante ANOVA (Un factor) de los niveles de
colesterol total en cerebro, dio como resultado una reducción
estadísticamente significativa para el grupo omega-3 con respecto al grupo
control en su conjunto (P<0,05). Analizando los subgrupos, se obtuvo un
descenso en los niveles de colesterol de los machos alimentados con omega-3
en relación a los machos control. Finalmente se observó un descenso de este
parámetro en las hembras control en comparación con los machos
mantenidos con el mismo tipo de dieta.
Para la determinación de la concentración de colesterol total en plasma se
empleó un kit colorimétrico (Infinity, Thermo, Melbourne, Australia).
Los datos obtenidos se representan en la figura IV.5.
0
20
40
60
80
100
120
140
[CO
L](
mg/
dL)
CONTROL OMEGA-3
Ma He
PPA
Ma He
Wt
Ma He
PPA
Ma He
Wt
*
Figura IV.5.: Representación de los niveles de colesterol total en
plasma. Se muestran los valores medios para la concentración de colesterol total
determinada en plasma mediante espectrofotometría (500 nm). Tamaño de
muestra: PPA_contr (5xHe, 6xMa); Wt_contr (7xHe, 7xMa); PPA_om3 (9xHe,
6xMa); Wt_om3 (8xMa). Se obtuvo un descenso significativo (P<0,05) en el grupo
de hembras PPA alimentadas con omega-3 frente a las hembras PPA con dieta
control.
Capítulo IV. Resultados 186
El análisis estadístico demostró una reducción estadísticamente
significativa (P<0,05) entre el grupo de hembras PPA-control y las
hembras PPA-omega 3.
En resúmen, podemos establecer que los análisis de colesterol dieron como
resultado una reducción de los niveles de colesterol cerebral en el grupo
omega-3 en comparación con el grupo control, independientemente de su
genotipo y género. Esto es muy importante, ya que el contenido en
colesterol cerebral es difícilmente modificable, y con este tipo de dieta
hemos observado un efecto beneficioso. Al hacer la distinción por géneros,
se obtuvo una reducción del colesterol en cerebro de hembras alimentadas
con dieta control y de machos con dieta omega-3, con respecto a sus
respectivos géneros opuestos en sus grupos e independientemente de sus
genotipos. Sin embargo, el único grupo que sufrió un descenso de los
niveles de colesterol en plasma fueron las hembras PPA alimentadas con
omega-3, lo que hace pensar en que la sobreexpresión del gen PPA unida a
la dieta enriquecida en AGPIs omega-3 facilitó el descenso de dicho
parámetro.
IV.1.1.3. ELISA A 40.
El modelo animal utilizado en este estudio, PPA-Tg53, se caracteriza por
desarrollar depósitos cerebrales formados predominantemente por la
acumulación del péptido A 40, de manera prominente a partir de los 6
meses de edad.
El estudio tuvo que ser finalizado antes de que los animales cumplieran los
6 meses, en base a las muertes prematuras espontáneas (por causas
desconocidas y ajenas al estudio). Por tanto, se decidió determinar la
presencia de A 40 en los lisados de PBS (fracción soluble) mediante un
Western blot (geles “NU_PAGE”, (ANAMED Elektrophorese GmbH
(Darmstadt)) ya que los lisados de ácido fórmico se utilizan en animales de
mayor edad, que ya presentan depósitos peptídicos que necesitan ser
solubilizados. La fotografía del gel se muestra en la figura IV.6.
Capítulo IV. Resultados 187
Figura IV.6.: Western blot de los lisados de PBS de cerebro en ambos
grupos de dietas. Se seleccionaron los animales de edad más avanzada para
determinar la banda correspondiente a A 40 en los animales del estudio. Ya que la
banda que nos interesaba observar era la correspondiente al péptido A 40 y
esperábamos niveles bajos, tuvimos que exponer la membrana del gel durante más
tiempo del adecuado para observar las dos bandas correspondientes a la proteína
PPA. Anticuerpo primario =WO-2 (detecta PPA, C99 y ambas especies de A ) , que
revela que los animales transgénicos expresaban el transgén de 12 kDa (PPA) y
adicionalmente la banda de A de4 kDa correspondiente al procesado por las -
secretasas.
A pesar de obtener una banda muy tenue la consideramos suficiente para
proceder a la determinación por ELISA, utilizando el kit ELISA hAmyloid-
40 kit (The Genetics Company, Schlieren, Switzerland). Los resultados
obtenidos se representan en la figura IV.7.
Capítulo IV. Resultados 188
0
0,02
0,04
0,06
0,08
0,1
0,12
0,14
6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18
Edad (semanas)
A4
0 (
µg/
g)
Ma_contr
He_contr
Ma_om3
He_om3
†
†
Figura IV.7.: Niveles de péptido A 40 (µg/g) en cada subgrupo de
ratones PPA. Se representa la concentración de A 40 (µg/g) en los lisados de
PBS. Se obtuvieron reducidos niveles de péptido, probablemente por la temprana
edad a la que fueron analizados estos animales. Tamaño de muestra: n=6 (todos
los grupos).
Se observa una tendencia (representada por una cruz) al descenso de este
parámetro en las hembras de cada dieta, siendo más pronunciada en la dieta
omega-3. Dilución lisados PBS=1:10 en animales de 15 y 16,5 semanas y dilución
1:5 en los demás). Dilución del lisado en el buffer de homogenización=8 y factor
de neutralización= 11.
Al analizar los valores de A 40 obtenidos en los cerebros de cada uno de
los subgrupos establecidos por género y tipo de dieta, no se obtuvieron
diferencias significativas entre ambos tipos de dietas, aunque se observó
una diferencia de género, basada en la tendencia al descenso de este
parámetro en el grupo de las hembras conforme al incremento de la edad.
Esta tendencia resultaba más fuerte en las hembras alimentadas con
omega-3, en las que los niveles se ven reducidos en un factor 10 entre los
11,5 y los 16,5 meses de edad. Por tanto, podríamos hipotetizar que la dieta
Capítulo IV. Resultados 189
enriquecida con AGPIs omega-3 podría haber ejercido un claro descenso de
los niveles peptídicos si los animales hubieran sido sacrificados con 6
meses de edad, dado su efecto significativo sobre los niveles de colesterol y
ácidos grasos (cerebrales y plasmáticos) y su tendencia a la reducción en
los niveles de A 40.
IV.1.1.4. Correlación entre colesterol y A 40.
Hay numerosa bibliografía que relaciona el aumento en los niveles de
colesterol con un incremento del riesgo para desarrollar la patología de la
EA, aunque hasta la fecha continúa existiendo cierta controversia al
respecto.
Por tanto se plantearon dos objetivos: i) determinar si podría establecerse
una relación entre el incremento de colesterol (plasmático y/o cerebral) y el
aumento de A 40 en cada grupo de ratones (control y omega-3) y ii)
establecer si la dieta influyó en dicha relación.
Para ello, se analizaron estadísticamente los valores de todos los parámetros
mediante modelos de regresión linear, y se pudo concluir: i) en el grupo
alimentado con dieta control, no se pudo establecer una relación
significativa entre el incremento de colesterol y el aumento de A 40 y ii) en
el grupo con dieta omega-3 se obtuvo una tendencia al descenso de A 40
acompañado de la reducción en colesterol plasmático. Este resultado
coincide con el descenso de colesterol plasmático observado en hembras
PPA y su tendencia a la reducción en depósitos de A 40.
Finalmente, compilando todos los resultados de este estudio establecimos
las siguientes comparaciones:
1) Entre la dieta omega-3 y dieta control: el grupo om-3 presentó un
descenso significativo en los niveles cerebrales y plasmáticos de AA (om-6) y
un incremento en los niveles cerebrales de ADH y plasmáticos de EPA (om-
3). Así mismo, los niveles de colesterol en cerebro se vieron reducidos tras la
ingesta de esta dieta om-3. Se ha demostrado que un incremento en la
relación om-3:om-6 indica la actividad antioxidante de ADH y supone una
Capítulo IV. Resultados 190
mejora en funciones cognitivas como el aprendizaje y la memoria
(Hashimoto et al., 2002). Estos resultados indican una mejora evidente en
el metabolismo lipídico de los animales mantenidos con la dieta enriquecida
en AGPIs om-3, en los que el contenido en om-3 incrementaría a expensas
de una disminución en la composición de om-6, lo que supondría una
mejora en las membranas celulares, reforzada por la reducción en el
contenido en colesterol en cerebro. El hecho de que los animales presenten
modificaciones en los ácidos grasos y el colesterol cerebral indica la eficacia
de la dieta a corto plazo y su capacidad para atravesar la BHE.
2) Entre los ratones no transgénicos y transgénicos: no se obtuvieron
diferencias relevantes entre los animales salvajes y los transgénicos,
mientras que en el grupo de transgénicos se observó un beneficio en el
grupo alimentado con om-3 frente al control a nivel de una reducción en el
colesterol plasmático y un incremento en los niveles de ADH cerebral. Estos
resultados soportan el beneficio de este tipo de dieta enriquecida aplicada a
este modelo animal capaz de sobreexpresar el gen PPA en una magnitud de
7 veces con respecto al nivel normal de expresión.
3) Entre ambos géneros: mientras que los machos alimentados con om-3
presentan una disminución en los niveles de AA cerebral en relación a los
machos controles, las hembras om-3 mostraron una reducción del colesterol
plasmático, un aumento en los niveles de ADH cerebral y una tendencia a
reducir los niveles de A 40. Todos estos datos refuerzan las ventajas de la
suplementación con una dieta omega-3 en un modelo animal de la EA, y
especialmente para las hembras PPA, en base a la posible sustitución de los
omega-6 por los omega-3 de la dieta, lo que supone un claro y demostrado
beneficio para el equilibrio plasmático y cerebral a través del incremento en
la fluidez de las membranas celulares.
Capítulo IV. Resultados 191
IV.1.2. Estudios en ratones mutantes KOZACK-colesterol
16.
Tras los resultados obtenidos en el estudio anterior, nos pareció interesante
continuar con el estudio de la relación entre el colesterol en sangre y los
niveles de A en cerebro, utilizando otro modelo animal de la EA. Se
desarrolló un modelo mutante de la EA, denominado Kozack-Colesterol-16,
creado a partir del cruce de la línea denominada “Colesterol-16” (Col-16) con
un modelo transgénico simple de la EA, denominado PPA-Tg53.
Se determinaron los niveles de colesterol sérico tanto en los ratones mutantes,
mutantes no transgénicos (Kozack-Col16 sin expresar PPA) y en las líneas
progenitoras base y posteriormente se midieron los niveles de A 40 y de A
42 en cerebro.
En esta ocasión, volvimos a distinguir los subgrupos basados en el género
(Ma=machos, He=hembras) para comprobar si de nuevo se observaban
diferencias entre ambos.
IV.1.2.1. Determinación de la concentración de colesterol en
suero.
Para analizar el efecto causado por el cruce de dos líneas puras (C57 con bajos
niveles de colesterol y C3H con elevados niveles de colesterol), junto con la
mutación provocada por la inyección de ENU y el cruce con un modelo de la
EA, sobre los niveles de colesterol en suero, se determinó este parámetro en los
ratones mutantes Kozack-Col 16, Kozack-Col16 sin expresar PPA y en 3 grupos
de ratones: i) la línea progenitora C57Bl6/NCrl (6 meses de edad, n=5xMa y
n=5xHe), ii) la otra línea progenitora C3H/NCrl (6 meses de edad, n=5xMa y
n=5xHe) y iii) animales híbridos C57xC3H (3 meses de edad, n=10xMa y
n=10xHe). La determinación de los niveles de colesterol en estos 3 últimos
grupos nos daría una idea de los niveles basales de dicho parámetro en las
líneas puras.
Capítulo IV. Resultados 192
Los resultados obtenidos para los valores de colesterol en suero
determinados mediante kit colorimétrico (Infinity, Thermo; Melbourne,
Australia) en todos los grupos mencionados con anterioridad, se muestran
en la tabla IV.3. y se representan en la figura IV.8.
Género Raza
Edad(meses)
Media colesterol suero (mg/dL) Error
Ma C57Bl6/NCrl 6 91,7 13,8
He C57Bl6/NCrl 6 98,8 14,2
Ma C3H/NCrl 6 142,6 5,46
He C3H/NCrl 6 173 28,1
Ma C57xC3H 3 123,2 10,3
He C57xC3H 3 104,9 8,74
MaKoz-Col16-
PPA 6 106,9 33,5
HeKoz-Col16-
PPA 6 104,3 19,6
MaKoz-Col-16-
Wt 6 150,1 4,6
HeKoz-Col16-
Wt 6 115,7 12,5
Tabla IV.3.: Niveles de colesterol total en suero para todos los
animales incluidos en el estudio. Se muestran los valores medios
(±desv.promedio) del colesterol en suero (mg/dL) para cada grupo (por
genotipo) y subgrupo (por género). Las razas C57Bl6/NCrl y C3H/NCrl fueron
las líneas progenitoras iniciales, de los que se obtuvieron los híbridos C57xC3H
a partir de los cuales se crearon los mutantes Colesterol 16 que fueron cruzados
con los transgénicos simples de la EA, generando los mutantes transgénicos
Kozack-Col16.
Capítulo IV. Resultados 193
Estos resultados nos permitieron establecer que los niveles de colesterol en
suero alcanzaban un valor intermedio entre los niveles atribuidos a las líneas
base puras, tanto para los híbridos sin mutación, los animales Kozack-Col16
no transgénicos y los animales Kozack-Col16 PPA. Podríamos apuntar la
tendencia al descenso de estos niveles en los animales mutantes y
transgénicos (Kozack-Col16-PPA), quizás por la sobreexpresión de PPA en
relación a los no mutantes no transgénicos. No se observaron diferencias
significativas entre los géneros de cada subgrupo.
Figura IV.8.: Representación de la concentración media de colesterol en
suero en las 4 razas utilizadas en este estudio. Aunque no se obtuvieron
diferencias significativas entre los grupos de híbridos (C57xC3H) con respecto a los
grupos de mutantes Kozack-col16, transgénicos (PPA) y no transgénicos (Wt), se
observó una tendencia (cruz) a reducirse los niveles de colesterol en el grupo de
Kozack-PPA respecto a los Kozack-Wt, así como una tendencia a que los machos
Kozack-Wt presenten mayores niveles que los machos híbridos y mutantes PPA.
Al comparar los 4 grupos mediante la prueba de comparación múltiple de
Dunn, se obtuvieron diferencias significativas entre la línea C57 frente a
C3H (P<0,001), entre C3H y C57xC3H (P<0,01) y C3H frente a Kozack-
Col16 (P<0,01). Sin embargo, ni se hallaron diferencias significativas entre
C57 y C57xC3H, ni C57 frente a Kozack-Col16, ni entre C57 xC3H frente a
0
5 0
1 0 0
1 5 0
2 0 0
Col
este
rol (
mg/
dL)
C 5 7 B l C 3 H C 5 7 x C 3 H K o z -P P A †
K o z -
Ma
He
Ma
He
Ma
He
Ma
He
Ma
He
†
Capítulo IV. Resultados 194
Kozack-Col16 (P>0,05). Tampoco se obtuvieron diferencias
estadísticamente significativas entre los géneros de cada grupo.
Por tanto, el análisis de los niveles de colesterol en el suero de los animales
mutantes Kozack-Col16–PPA reveló cierta tendencia a reducir este
parámetro en relación a los niveles observados en los mutantes no
transgénicos.
IV.1.2.2. Inmunotinción de secciones de tejido embebidas
en parafina.
Para visualizar los niveles de PPA y A , se realizaron secciones de 4 µm
mediante microtomo (MICROM COOL OUT), a partir de los bloques de
parafina del hemisferio cerebral derecho fijado en formalina tras su
extracción.
Tras la inmunotinción con diferentes anticuerpos primarios específicos
para cada una de las proteínas de interés (23850 y 40090 para detectar
PPA; mx02 y 692 para visualizar A ), se realizaron micrografías de las
regiones más comprometidas en la patología de EA: corteza e hipocampo.
En estas zonas se localizan los depósitos de A , muy brillantes y
birrefringentes.
En la figura IV.9. se muestran las micrografías realizadas en microscopio
de fluorescencia (OLYMPUS D50; Software= Viewfinder Lite)
comparativas entre ratones de ambos géneros, tanto a nivel de corteza
como de hipocampo.
Capítulo IV. Resultados 195
Machos Hembras
PPA
A
A
A
Figura IV.9. Tinciones inmunohistoquímicas de ratones mutantes
Kozack-Col 16. Tinciones de corteza frente PPA (23850) muestran la abundancia
de esta proteína en las neuronas piramidales (asterisco) de las hembras (B) frente a
los machos (B. Tinciones frente A (692) de corteza (C, D) e hipocampo (E, F)
revelan una mayor deposición de amiloide en hembras (D, F) que en machos (C, E).
Tinción de corteza frente A (692) de ratón control mutante no transgénico (G) y
detalle de un depósito de amiloide (H). Contra tinción con hematoxilina
(magnificación: 100x (A, B, C, D, E, F, G), 400x (H).Anticuerpo 2º= Biotina anti
conejo.
B
*
A
C D
E F
G H
Capítulo IV. Resultados 196
A nivel de corteza, se observa una mayor cantidad de cúmulos granulares
de PPA en torno a las neuronas piramidales de esta región, en una sección
de una hembras en relación a la de un macho. Para las secciones de corteza
inmunomarcadas con anticuerpo anti-A , se detecta poca diferencia entre
un ratón macho mutante y un control mutante pero no transgénico,
mientras que una sección de una hembra mutante revela numerosos
depósitos de A dispersos por toda la corteza, como es característico de
este modelo a los 6 meses de edad, momento en que ya han desarrollado
plenamente la morfopatología de la enfermedad. Algo similar se aprecia en
las secciones de hipocampo. Mientras que la imagen obtenida del cerebro
de un animal macho muestra escasos depósitos de A , la mostrada para
una hembra evidencia la formación de numerosas agregaciones insolubles
de este péptido.
Estos resultados histoquímicos indican una diferencia entre ambos géneros
a nivel de abundancia de placas neuríticas en cerebro, siendo las hembras
las que mayor cantidad de depósitos presentaron. Para confirmar esta
distinción entre ambos géneros, se realizaron Western Blot y ELISA A 40
y A 42.
IV.1.2.3. ELISA A 40 y 42.
En primer lugar se realizó un Western Blot (Nu-PAGE) a partir de los
lisados de proteínas extraídas con SDS (fracción soluble). Los resultados se
muestran en la figura IV.11.
Capítulo IV. Resultados 197
Figura IV.10: Análisis de la expresión de PPA, C99 y A en ratones
Kozack-Col 16: Western Blot de lisados de proteínas realizados en 2% de SDS en
geles del 16% Tris-tricina. El anticuerpo WO-2 que confirma la expresión de la
banda de PPA (12 kDa), la banda C99 y la de A (4 kDa). La banda de A en las
muestras de animales hembras resultó más pronunciada que en los lisados de
machos.
Como se apreciaba en las micrografías, los animales hembra presentaban
mayores acumulaciones de A que los ratones macho, fenómeno que pudimos
corroborar mediante Western Blot, donde se aprecia una clara diferencia entre
ambos géneros a nivel de la banda de 4 kDa correspondiente al péptido A . Ya
que el anticuerpo utilizado es inespecífico y reconoce tanto la especie A 40
como A 42, decidimos realizar un un test de alta sensibilidad ELISA para cada
una de las especies del péptido amiloidogénico.
Para los ELISA se utilizaron los lisados de cerebro realizados en ácido fórmico
(fracciones soluble e insoluble de A ), dado que la edad de los animales era la
adecuada para el desarrollo completo de la patología, como confirman las
micrografías. Los resultados obtenidos se muestran en la tabla IV.4.
Capítulo IV. Resultados 198
Aß40 Aß42 Aß ratio=
(µg/g) (µg/g) (Aß42/Aß40)
Machos 0,28 ± 0,06 0,03 ± 0,02 0,098
Hembras 1,02 ± 0,55 0,12 ± 0,04 0,11
Tabla IV.4.: Concentraciones en µg/g de A 40 y 42 en ratones de ambos
géneros. Valores obtenidos para las concentraciones de A 40 (dilución 1:30) y A
42 (dilución 1:10) para lisados de ácido fórmico de ratones macho (n=4) y hembras
(n=6) mutantes de 6 meses de edad. Dilución del lisado (x8) y factor de
neutralización (x11).
El análisis por ELISA de las muestras confirmó la diferencia observada entre
machos y hembras en las micrografías y en el Western Blot. Las hembras
mutantes Kozack-Col 16-PPA presentaban mayores niveles en ambas
variantes de A , 40 y 42. El cálculo del denominado A ratio, se estableció en
base a estudios clínicos previos que permitieron establecer (Ida et al., 1996).
-Riesgo claro de padecer EA, si el ratio <1,0; valor en el límite que llevaría a la
repetición del test, cuando el ratio oscila entre 1,0 y 1,5, y ningún riesgo
declarado, cuando el ratio es >1,5. Por tanto con este barómetro establecimos
que ambos géneros presentaban un elevado riesgo de desarrollar la patología,
aunque las hembras mostraban mayores niveles del péptido amiloidogénico.
Capítulo IV. Resultados 199
IV.1.3. Estudios en modelo de ratón transgénico doble
PPA/PS1 de la EA.
Tras los dos estudios anteriores, en los que observamos que los ratones
transgénicos de la EA del género femenino presentaban diferencias con los
del género masculino en varios parámetros (colesterol, depósitos de
amiloide), decidimos planificar el presente estudio. Nos propusimos
analizar la relación existente entre los niveles de colesterol plasmático y de
A cerebral, a lo largo del tiempo. Para ello, se escogió un modelo de ratón
de la EA, transgénico doble PPA/PS1 (Blanchard et al., 2003), que
expresan la isoforma APP751 con las mutaciones Swedish y London
(promotor Thy1), al igual que la Presenilina-1 humana mutante (M146L,
promotor HMG). Se trata de un modelo diseñado para investigar la
formación y progresivas alteraciones de neuritas distróficas relacionadas
con los depósitos de A . En este modelo, los depósitos aparecen a una edad
muy temprana (2-4 meses de edad) porque la mutación en PS1 acelera la
acumulación de péptido amiloide en una magnitud igual a 2. Desde el inicio
de la deposición, la mayoría de los cúmulos peptídicos se rodean de un
elevado número de neuritas distróficas PPA-, ubiquitín- y MnSOD-
inmunorreactivas.
Por tanto, y con objeto de analizar los niveles de colesterol plasmático y de
A (40 y 42) cerebrales a diferentes tiempo, se establecieron 3 grupos de
animales hembra transgénicos de 3 (n=6), 8 (n=7) y 13 (n=10) meses de
edad y 2 grupos de animales hembra controles no transgénicos de 3 (n=5) y
13 (n=7) meses de edad.
IV.1.3.1. Inmunotinción de secciones de tejido embebidas
en parafina.
Se realizaron secciones de 4 µm mediante microtomo, a partir de los
bloques de parafina del hemisferio cerebral derecho fijado en formalina
Capítulo IV. Resultados 200
tras su extracción. La inmunotinción se llevó a cabo con los anticuerpos
específicos para cada una de las proteínas de interés y finalmente se
realizaron micrografías (figura IV.10) donde se aprecia la evolución de la
patología.
PPA A A
3meses
8meses
13meses
Figura IV.10. Tinciones inmunohistoquímicas de ratones PPA/PS1.
Tinciones de corteza frente PPA (23850; A, D, G) muestran una acumulación
progresiva con el incremento de edad de los animales. Tinciones frente A de
hipocampo (mx02; B, E, H) y corteza (mx02; C, F, I) revelan el incremento en
las deposiciones de amiloide, teñidas en marrón y muy birrefringentes. Contra
tinción con hematoxilina (magnificación: 100x (A, D, E, G, I), 200x (B, C, F, I).
A B C
D E F
G H I
Capítulo IV. Resultados 201
Las micrografías anteriores confirman la progresiva acumulación de PPA y
péptidos A en el hipocampo y la corteza de los animales PPA/PS1, desde que
se inicia la patología a los 3 meses hasta los 13 meses de edad, confirmando el
empeoramiento de la patología con el avance de la edad.
IV.1.3.2. ELISA A 40 y 42.
Según Blanchard y colaboradores (Blanchard et al., 2003), en el modelo
animal utilizado en el presente estudio todas las formas de Aß se agregan de la
misma manera. Por tanto, decidimos cuantificar los niveles de A 40 y A 42
en cada uno de los grupos de ratones establecidos por edades, para lo que
realizamos pruebas de ELISA a partir de los lisados de ácido fórmico (kits
facilitados por The Genetics Company, Switzerland). Los resultados obtenidos
se muestran en la tabla IV.5. y se representan en la figura IV.11.
Aß40 Aß42 Aß ratio=
Edad (meses) (µg/gr) (µg/gr) (Aß42/Aß40)
3 0,35 ± 0,12 1,7 ± 0,33 4,86
8 19,66 ± 5,42 22,22 ± 7,12 1,13
13 66,13 ± 12,81 40,96 ± 5,19 0,62
Tabla IV.5.: Niveles de A -40 y A -42 para cada uno de los grups de
ratones PPA/PS1. Los valores obtenidos revelaron el incremento de deposiciones
amiloideas (ambas especies de A ) conforme los ratones envejecieron. Los factores
de dilución para A 40 fueron 1:50 (3 meses), 1:1000 (8 meses) y 1:2000 (13 meses)
y para A -42: 1:100 (3 meses), 1:3000 (8 meses) y 1:5000 (13 meses). Factor de
dilución de los lisados= 10, dilución neutralización= 11.
Capítulo IV. Resultados 202
0
1 0
20
30
40
50
60
7 0
80
A t
otal
(µ
g/g)
8 meses3 meses 13 meses
A 40 A 42 A 40 A 42 A 40 A 42
***
Figura IV.11.: Valores medios de A total en ratones PPA/PS1 de todos
los grupos. Se representan los valores medios (µg/g) para A -40 y A -42 en
cada uno de los grupos de ratones PPA/PS1 establecidos por edades. Se confirma
el incremento de deposiciones observado en las micrografías.
Como esperábamos a la vista de las micrografías obtenidas en cada uno de
los grupos de animales, donde pudimos comprobar la acumulación
creciente de péptido amiloide conforme al envejecimiento de los ratones,
corroboramos este incremento mediante la cuantificación por ELISA, que
nos permitió concluir que en el avance de la edad, entre 3 y 13 meses de
edad en ratones hembra transgénicos dobles PPA/PS1 se ve acompañado
por un empeoramiento en uno de los principales rasgos de la patología de
la EA como son las deposiciones amiloideas en hipocampo y corteza
cerebral.
Capítulo IV. Resultados 203
IV.1.3.3. Determinación de la concentración de colesterol
en plasma.
A continuación se decidió analizar el nivel de colesterol plasmático en cada
grupo de transgénicos PPA/PS1 y de no transgénicos, para determinar la
influencia del envejecimiento y del genotipo sobre este parámetro. Para
ello, se empleó un kit de determinación colorimétrica para la medición de
la concentración de colesterol total en plasma obtenido por punción
cardiaca.
[Col]
(mg/dL) 3 meses 8 meses 13 meses
PPA-PS1
84,02 ±
3,39 76,25 ± 3,14
69,63 ±
2,63
Wt
91,04 ±
3,19 —
88,42 ±
6,28
Tabla IV.6.: Concentración de colesterol total en plasma para en
transgénicos PPA/PS1 y ratones controles. Se determinó la
concentración de colesterol en el plasma de los ratones PPA/PS1 de 3 (n= 6), 8
(n= 7) y 13 (n= 10) meses de edad, así como en los ratones no transgénicos (Wt)
de 3 (n=5) y 13 (n=7) meses de edad. No se utilizaron ratones Wt de 8 meses
porque solamente nos interesaban las dos edades extremas.
Capítulo IV. Resultados 204
0
1 0
20
30
40
50
60
7 0
80
90
1 00
Edad (meses)
[Co
lest
ero
l med
io]
(mg/
dL
)P P A/P S1 Wt
3 3 8 1 3 1 3
*
Figura IV. 12: Representación de los valores medios de colesterol total
en plasma en animales PPA/PS1 y controles. Se obtuvo un descenso
estadísticamente significativo entre los ratones PPA/PS1 de 3 meses y los de 13
meses de edad, mientras que entre los animales controles (Wt) de 3 meses y los de
13 meses de edad no se observó ninguna reducción en los niveles de este
parámetro. Curiosamente, se obtuvo una diferencia significativa (P<0,01) entre
los animales de 13 meses transgénicos respecto a los de 13 meses no transgénicos.
El análisis estadístico de la varianza mediante ANOVA de los niveles de
colesterol plasmático en cada grupo y en cada genotipo, nos permitió
establecer una diferencia significativa (P<0,05) entre los ratones PPA/PS1 de
3 meses y los de 13 meses de edad. La varianza observada se confirmó
mediante test C de Cochran, test de Bartlett y test de Hartley. Aunque no se
observó diferencia significativa ni entre los animales transgénicos de 3 y los de
8 meses, ni entre los de 8 y 13 meses de edad, el hecho de observar una
reducción de colesterol plasmático asociada con la edad, nos hizo pensar en la
influencia de las mutaciones sobre PPA y PS1 sobre este parámetro en plasma,
ya que no se encontraron diferencias significativas en los niveles de colesterol
Capítulo IV. Resultados 205
de los animales no transgénicos, lo que nos permitió descartar la bajada de
colesterol por razones debidas exclusivamente al envejecimiento. Otro
argumento a favor de esta teoría, es que a pesar de la bibliografía que apoya la
idea de que ni el colesterol ni sus precursores sufren modificaciones entre
ratones transgénicos PPA y no transgénicos durante el envejecimiento
(Lutjohann et al., 2002), encontramos una diferencia significativa entre los
PPA/PS1 de 13 meses y los no transgénicos de la misma edad lo que nos llevó
a argumentar la influencia del genotipo y no solamente de la edad sobre los
niveles de colesterol.
Capítulo IV. Resultados 206
IV.2. Estudios con DOPET.
IV.2.1. Screening de compuestos naturales con
capacidad antioxidante y potencial neuroprotector.
Las neuronas son extremadamente sensibles al ataque destructivo de los
radicales libres generados por peroxidación lipídica, oxidación de las
proteínas, daño al ADN, glicosilación y/o la actividad catalítica de metales
como el hierro, cinc, cobre y aluminio. En base al potencial de los AGPIs
omega-3 para actuar sobre el SNC (Chalon et al., 2001), se han realizado
estudios recientes que apoyan la suplementación de pacientes de
Esquizofrenia con dietas enriquecidas en omega-3 y antioxidantes como la
vitamina C y E (Arvindakshan et al., 2003). Así mismo, se han obtenido
resultados prometedores en pacientes de la EA tratados con agentes
quelantes de hierro y antioxidantes (Christen, 2000).
Por tanto, y tras la ausencia de un efecto directo sobre los niveles de A , en
el estudio realizado en un modelo animal de la EA alimentado con una
dieta enriquecida con AGPIs omega-3, nos planteamos la búsqueda de un
compuesto natural con capacidad antioxidante. Tras esa selección,
analizaríamos su capacidad neuroprotectora con la idea de utilizarlo como
compuesto individual y en un futuro poder complementar los beneficios
ejercidos por los AGPIs omega-3 de la dieta sobre los niveles de colesterol y
el perfil de ácidos grasos con un efecto antioxidante, y lograr una
neuroprotección por combinación de ambos tipos de compuestos.
Con tal objeto, se llevó a cabo un amplio screening para seleccionar un
compuesto natural, de fácil acceso en la dieta Mediterránea y con
capacidad antioxidante y para atravesar la BHE.
El screening se basó en la administración de una dosis (20 mg/ratón) de
cada uno de los extractos de diferentes compuestos naturales. Tras el
sacrificio a diferentes tiempos (20, 60 y 180 min), los extractos de los
cerebros se procesaron mediante HPLC-ABTS (HPLC-DAD, WATERS)
Capítulo IV. Resultados 207
para determinar tanto su capacidad para cruzar la BHE como su potencial
antioxidante.
En la tabla II.2. (Capítulo II de esta Memoria), se recogen los diferentes
extractos naturales y polifenoles que se analizaron. Entre los compuestos
positivos obtenidos, se encontraron:
Compuestos Positivos (antioxidantes que cruzan BHE) Extractos naturales:
Hoja de olivo; esencia de tomillo (Granadiet, 500µL/ratón);
Aceite de pepita uva (500µL/ratón, comercial)
Polifenoles:
Timol (Sigma, 10mg/ratón disuelto en aceite virgen);
Carvacrol (Sigma, 20mg/ratón en aceite girasol; muy tóxico); Ácido homovanílico;
Ácido hidroxibenzoico; Ácido siríngico, 2-(3,4-dihidroxifenil)-etanol
Tabla IV.7: Compuestos naturales positivos tras el análisis por HPLC-
ABTS. Listado de los extractos naturales y polifenoles que tras ser administrados a
los animales demostraron cruzar la BHE y presentar capacidad antioxidante. =
254 nm y 734 nm.
Se seleccionó a 2-(3,4-dihidroxifenil)-etanol (DOPET), por su elevada
capacidad antioxidante residente en el motivo o-difenol (Manna, 1997), la
importancia del aceite de oliva del que procede en la dieta Mediterránea, y la
relevancia de ésta en la sociedad actual.
IV.2.2. Biodisponibilidad de DOPET.
IV.2.2.1. Determinación de DOPET por HPLC-ABTS.
Antes de comenzar los diferentes estudios de neuroprotección con DOPET,
el Dpto. de Química (Puleva Biotech, S.A) consiguió sintetizar este
compuesto con una elevada pureza ( 99%) y fue el que utilizaríamos para
la ejecución del resto de esta Memoria. Por tanto, para confirmar la
capacidad antioxidante observada para DOPET natural en nuestro
Capítulo IV. Resultados 208
compuesto purificado, éste se analizó mediante HPLC-ABTS, para
establecer su espectro y facilitar su posterior reconocimiento en las
muestras biológicas.
El cromatograma obtenido para la capacidad antioxidante de DOPET en
comparación con la vitamina C, se muestra en la figura IV.13.
Figura IV.13.: Cromatograma de DOPET obtenidos por HPLC-ABTS.
El análisis de DOPET por HPLC-ABTS confirmó la capacidad antioxidante del
compuesto comparado con Vitamina C. El pico obtenido a 6,3 min corresponde a
10 µg de DOPET. Tiempo de análisis=60 min, utilizando PDA a 280 nm.
IV.2.2.2. Determinación de DOPET por CG-MS.
Dentro del ensayo de biodisponibilidad de este compuesto, se identificó por
CG-MS para determinar el tiempo de absorción en cerebro de ratón. Para
ello, se establecieron 11 grupos de 3 ratones Balb/c cada uno, sondados con
DOPET purificado (13 mg/kg peso). Los animales fueron sacrificados
mediante dislocación cervical y el cerebro se extrajo con rapidez a
diferentes tiempos: 0 min, 3 min, 4 min, 5 min, 7 min, 10 min, 15 min, 20
min, 25 min, 30 min y 60 min. EL compuesto fue identificado mediante
extracción con acetato de etilo en CG-MS. Los resultados se muestran en la
figura IV.14.
Capítulo IV. Resultados 209
0
0,0001
0,0002
0,0003
0,0004
0,0005
0,0006
0,0007
0,0008
0 3 4 5 7 10 15 20 30 60
Tiempo absorción (min)
DO
PE
T (µg
/g p
eso)
Figura IV.14.: Tiempos de absorción de DOPET en cerebro de ratón por
CG-MS. Se obtuvo un primer pico en las muestras de los animales sacrificados a los 3
min, mientras que a los 60 min el compuesto ya no aparecía en cerebro.
En base a estos resultados, se estableció que DOPET aparecía en cerebro
transcurridos 3 min tras el sondaje, y que desaparecen a los 60 min.
Capítulo IV. Resultados 210
IV.2.3. Estudios de antioxidación.
IV.2.3.1. Detección de malondialdehido (MDA).
IV.2.3.1.1. MDA en cerebro de rata.
Basándonos en la demostrada capacidad antioxidante de DOPET in vitro,
se establecieron una serie de ensayos para analizar la influencia de este
compuesto sobre la peroxidación lipídica in vivo, utilizando cerebro de
rata para estudiar uno de los marcadores de este proceso como es la
producción de SRATs, medida a través de MDA.
Se desarrolló el protocolo descrito en esta Memoria para la curva patrón
de MDA y para la medición de SRATs, empleando las membranas de
cerebro de rata. El agente oxidante utilizado fue el SO4Cu (20 µL y 80 µL
de solución stock 125 µM) y las cantidades utilizadas también para DOPET
fueron 2 y 10 µL (solución 5 mM). Se realizaron 2 grupos de muestras:
Control (negativo y positivo) y DOPET (cada cantidad establecida,
adicionada con cada una de las cantidades elegidas para el agente
oxidante). Todas las muestras se realizaron en triplicado. Los resultados
obtenidos mediante medición de la D.O. (535 nm), se representan en la
figura IV.15.
Capítulo IV. Resultados 211
0
0,05
0,1
0,15
0,2
0,25
0,3
0,35
0,4
0,45
Abs
(53
5nm
)
20 µL SO4Cu 80 µL SO4Cu
** ** **
C- C+ C+DOPET (2µL)
DOPET (2µL)
DOPET (10µL)
DOPET (10µL)
Figura IV.15: Efecto de DOPET como antioxidante frente al daño
provocado en las membranas por la producción de MDA. Se generó un
daño oxidativo en las membranas de cerebro de rata mediante la adición de SO4Cu,
responsable de la producción de SRATs. DOPET fue capaz de proteger de esta
agresión mediante la reducción de MDA, medido por espectrofotometría.
El análisis estadístico mediante prueba T reveló que DOPET ejerció un efecto
antioxidante significativo (P<0,001) frente al daño generado por un oxidante
com SO4Cu sobre las membranas lipídicas en cerebro de rata.
Por tanto se estableció que DOPET a bajas dosis era capaz de proteger de la
peroxidación lipídica en las membranas cerebrales, medida como MDA.
IV.2.3.1.2. MDA en plasma de ratón.
Para determinar si el efecto protector de DOPET sobre la peroxidación
lipídica observado in vitro era reproducible in vivo, se establecieron 4
grupos de 10 ratones cada uno alimentados durante 30 días con dieta
control, dieta enriquecida en colesterol (1,5%), dieta control con DOPET en
Capítulo IV. Resultados 212
el agua de bebida (1 mg/ratón/día) y dieta rica en colesterol más DOPET
diluido en el agua de bebida de baja mineralización. El objetivo era
conseguir que la dieta suplementada con un 1,5% de colesterol generase un
incremento exagerado de la peroxidación lipídica en estos animales para
poder determinar si DOPET ejercía in vivo su poder antioxidante y
neuroprotector.
Se determinaron las concentraciones de colesterol total, LAD-colesterol y
LBD-colesterol (para lo cual necesitamos determinar también los
triglicéridos) en plasma en cada grupo mediante ensayo colorimétrico (kit
de Bio Systems). Los datos se muestran en la tabla IV.8.
Grupos [Col total]
(mg/dL)
[LAD-col]
(mg/dL)
[LBD-col]
(mg/dL)
Control 121,6 ± 7,0 48,6 ± 12,6 137,9 ± 20,9
Colesterol 121,5 ± 14,9 41,3 ± 12,3 131,4 ± 19,7
Colesterol+DOPET 116,1 ± 6,2 39,8 ± 8,7 124,4 ± 11,0
DOPET 110,5 ± 13,4 50,4 ± 11,2 133,4 ± 19,3
Tabla IV.8. Concentraciones medias de colesterol total, LAD-col y
LBD-col en plasma de ratones alimentados con diferentes dietas. Todos
los parámetros se determinaron mediante espectrofotometría (500 nm) siguiendo
las instrucciones suministradas en cada kit (Bio Systems). No se obtuvieron
diferencias significativas entre ninguno de los grupos para ninguno de los
parámetros (P>0,05).
Los resultados para cada uno de estos parámetros plasmáticos no revelaron
diferencias estadísticamente significativas entre ninguno de los 4 grupos
(P>0,05). Sin embargo, se analizó la cantidad de MDA en plasma por HPLC
con detección fluorométrica y se obtuvo un descenso significativo de este
parámetro de peroxidación lipídica entre el grupo colesterol y el grupo
colesterol con DOPET en el agua de bebida (P<0,05). Los datos se
representan en la figura IV.16.
Capítulo IV. Resultados 213
Figura IV.16.: Valores medios de MDA obtenidos por HPLC-FLD en
plasma para cada grupo. Se observó un incremento significativo de MDA en el
grupo alimentado con un exceso de colesterol frente al resto de grupos. El grupo que
recibió DOPET en el agua de bebida (con dieta enriquecida en colesterol) presentó
una disminución significativa (P<0,05) en los niveles de MDA en plasma en
comparación con el grupo colesterol.
Por tanto, aunque no pudimos observar ningún efecto beneficioso de DOPET
sobre el metabolismo del colesterol en plasma, quizás por la breve duración
del estudio, si pudimos demostrar que el compuesto ejerció un efecto
neuroprotector y antioxidante en los animales que recibieron el compuesto
disuelto en el agua de bebida.
0
0.5
1
1.5
2
2.5
3
x10
12[M
DA
] (µ
M)
Chow Colest DOPET DOPET+Colest
*
Capítulo IV. Resultados 214
IV.2.3.1.3. Cuantificación de la actividad catalasa en
cerebro de conejo.
Tras los dos estudios anteriores sobre el efecto de DOPET en procesos de
peroxidación lipídica, nos planteamos analizar el efecto del compuesto
sobre la catalasa, una de las enzimas implicadas en la eliminación de una
molécula tóxica como la del peróxido de hidrógeno (H2O2). Esta enzima es
capaz de descomponer H2O2 en H2O y O2 evitando así el daño oxidativo a
los tejidos. Por este motivo, se emplearon los cerebros de los conejos
estudiados en el apartado IV.4.6.3. de este capítulo por tratarse de
animales sometidos a estrés oxidativo durante varios meses. En resumen,
los conejos fueron alimentados con una amplia gama de dietas
(especificadas en el capítulo II de esta Memoria) con objeto de inducir un
proceso aterogénico, provocando así un estrés oxidativo que nos permitiera
determinar el efecto de DOPET y de cada tipo de dieta sobre una serie de
parámetros del metabolismo del colesterol, como detallaremos en el
apartado correspondiente. Los resultados obtenidos para la medición de la
cinética de la actividad catalasa se muestran en la tabla IV.9.
Capítulo IV. Resultados 215
Grupos Tipos de dietas Catalasa(actividad media/mg)
Grupo 1 Control 30 días (CO) 0,29 ± 0,12
Control aterogénico (CA) 0,30 ± 0,15
DOPET (ADT) 0,27 ± 0,10
Control 60 días (CF) 0,27 ± 0,09
Aterogénica 60 días (AA) 0,29 ± 0,07
Grupo 2 Control 30 días (AC) 0,19 ± 0,09 Extra-vírgen (V) 0,26 ± 0,09 Refinado con omega3 (RW) 0,26 ± 0,07 Refinado (R) 0,22 ± 0,07 Omega-3 (W) 0,19 ± 0,03 (DOPET) DT 0,23 ± 0,10
Tabla IV.9.: Valores de actividad Catalasa en conejos alimentados con
diferentes dietas. Se determinó la absorbancia (A240 nm) en cada muestra
(proteínas+tampón fosfato sódico+H2O2) para expresar la actividad como la caída
de A240 durante el primer minuto de la cinética por cada mg de proteína.
El análisis estadístico de los datos de actividad Catalasa en cada grupo
mediante Prueba T, demostró que ninguno de los diferentes tipos de dietas
consiguió ejercer un efecto significativo sobre esta actividad enzimática.
Capítulo IV. Resultados 216
IV.2.4. Estudios de neuroprotección.
Una vez comprobada la capacidad de DOPET para cruzar la BHE y
penetrar en el cerebro, comenzamos con una serie de ensayos in vitro para
estudiar sus propiedades neuroprotectoras.
IV.2.4.1. Medida de citotoxicidad de DOPET.
Mediante la realización del protocolo descrito en el capítulo II de esta
Memoria para la medición de la citotoxicidad (1 día con 100.000
células/pocillo), se propuso determinar la capacidad neuroprotectora de
DOPET en astrocitos C6, tratadas en primer lugar con concentraciones
crecientes de DOPET, para ser incubadas seguidamente con un agente
causante de muerte celular por daño oxidativo. La medición de la
absorbancia nos permitió determinar el porcentaje de viabilidad en los
diferentes sistemas ensayados.
Se realizaron 6 placas de 96 pocillos y cada muestra se realizó en triplicado.
Los agentes oxidantes utilizados fueron: H2O2 (200 µM), péptido A 22-35
(20 µM) y glutamato (1,2 mM). Se incubaron las placas durante 2 h a 37 ºC
en atmósfera de 5% de CO2, se añadió DOPET y se dejó actuar entre 2 y 4 h
en las mismas condiciones de incubación. Finalmente, se adicionó el
compuesto oxidante, a la concentración establecida. Se incubaron durante 1
día (citotoxicidad) o 4 días (viabilidad) y se evaluaron los resultados
mediante la determinación de la absorbancia a 490 nm en un contador de
placas.
A continuación se representan los resultados en la figura IV.17. A partir de
estos datos, se puede establecer que una concentración de DOPET igual o
superior a 100 µM comenzaría a ser citotóxica, aunque hay que tener en
cuenta que el porcentaje de citotoxicidad correspondiente a esta
concentración fue únicamente del 2% y que el tiempo de retención de
DOPET en el cerebro es inferior a 1 h. Dada la enorme diversidad celular
Capítulo IV. Resultados 217
presente en el cerebro, serían necesarios numerosos ensayos en otros tipos
celulares para generalizar el efecto citotóxico de DOPET a todo el cerebro.
0,0
0,2
0,4
0,6
0,8
1,0
1,2
0 5 10 25 50 75 100 500
[DOPET] (µM)
Via
bil
idad
(%
)
Sin H2O2
Con H2O2
A)
0
0,1
0,2
0,3
0,4
0,5
0,6
0,7
0,8
0,9
1
1 ,1
0 5 10 25 50 7 5 100 500
[DOPET] (µM)
Via
bili
dad
(%)
( ) Sin A
(x) Con A
B)
0
0,2
0,4
0,6
0,8
1
1,2
0 5 10 25 50 75 100 500
[DOPET] (µM)
Via
bil
idad
(%
)
Sin Glutamato
Con Glutamato
C)
Capítulo IV. Resultados 218
(Viene de página anterior) Figura IV.17: Viabilidad celular (factor
100) en células C6 sometidas a diferentes oxidantes frente a
diferentes concentraciones de DOPET. Se observa como a partir de
concentraciones de DOPET iguales a 100 µM, la neuroprotección desciende para
los sistemas dañados con H2O2 (A) y glutamato (C), mientras que A (B) no
parece afectar a la viabilidad de estas células, lo que dificultó la interpretación
del efecto de DOPET sobre este sistema. Escala expresada en porcentajes,
multiplicados por el factor 100.
Se realizaron una serie de micrografías con el microscopio de fluorescencia
para los ensayos de citotoxicidad en células C6 (figura IV.18. y IV.19). En la
figura IV.16. se aprecia cómo el cultivo sufre el daño generado tanto por
H2O2 como por A 22-35, así como la incubación previa de las células con
DOPET (100 µM) parece proteger de la muerte celular generada por los
oxidantes.
Sin embargo, en la figura IV.17, las células fueron incubadas durante 4 días
con glutatión, en presencia o no de DOPET, y en esta ocasión los cultivos
demostraron estar protegidos del daño por glutatión hasta concentraciones
de DOPET de 100 µM. Por tanto pudimos establecer esta concentración de
DOPET como la máxima por debajo de la cual el compuesto era capaz de
ejercer neuroprotección sobre un cultivo celular.
Capítulo IV. Resultados 219
Oxidante Sin DOPET Con DOPET (100 µM)
Ninguno
(controles)
H2O2
(200 µM)
A 22-35
(20 µM)
Figura IV.18.: Micrografías de astrocitos C6 incubados con diferentes
oxidantes y DOPET para ensayos de neuroprotección. Las fotografías
fueron tomadas a las 24 h de inicio del ensayo. Células que crecen con normalidad en
el control negativo (A) y en el control positivo con DOPET (100 µM) (B), ven
reducida notablemente su población tras la exposición con H2O2 (200 µM) (C) y con
A (20 µM) (E). La incubación previa con DOPET antes del daño parece proteger en
ambos (D y F, respectivamente). Magnificación= 400x.
A B
D
F
C
E
Capítulo IV. Resultados 220
Tratamiento Controles Con Glutatión
(1,2 mM)
Ninguno
DOPET
(50 µM)
DOPET
(100 µM)
Figura IV.19.: Micrografías sobre la viabilidad de células C6, tras 4
días de ensayo. Frente al control negativo (A), se observa una marcada
disminución de la población celular tras la incubación con glutamato 1,2 mM
(B). El tratamiento con concentraciones de DOPET de 50 µM (C) y100 µM (E)
muestra cómo el efecto neurotóxico no es apreciable hasta concentraciones de
100 µM. El tratamiento conjunto de glutamato y DOPET a 50 µM (D) parece
mejorar el estado del cultivo con respecto al daño generado por glutamato,
efecto que no se observa con DOPET 100 µM (F). Magnificación= 400x.
A B
C D
E F
Capítulo IV. Resultados 221
Se decidieron realizar el mismo tipo de ensayos en células neuronales
procedentes de hipocampo de rata, en las que se determinó la
neurotoxicidad de DOPET aplicado junto a péptido A 22-35 . Los datos se
representan en la figura IV.20.
0
10
20
30
40
50
60
70
80
90
100
0 5 10 25 50 100 200 300 500 1000
[DOPET] µM
Via
bili
dad
(%
)
Figura IV.20: Representación de la viabilidad en cultivos neuronales
sometidos a daño oxidativo por A . (20 µM).Hasta concentraciones de
100 µM el compuesto es capaz de mantener la viabilidad celular a niveles
cercano al 100%.
Estos resultados, muestran cómo DOPET hasta concentraciones de 100 µM
no perdería su capacidad neuroprotectora induciendo muerte celular, como
observamos en los sistemas celulares de C6 ensayados con anterioridad.
Capítulo IV. Resultados 222
IV.2.4.2. Ensayo COMET.
Para confirmar si DOPET induce muerte celular por apoptosis, se llevó a
cabo el protocolo descrito en esta Memoria para mutagenicidad, basado en
la los métodos descritos previamente (Olivares et al., 2003; Qiu et al.,
2003). El fundamento de la técnica es la cuantificación del daño al ADN
mediante el marcaje de los núcleos con bromuro de etidio (20 µg/mL) de
manera que los núcleos de las células cuyo material genético ha sufrido
fragmentación por efecto de la radiación, muestran una cola o rastro de
ADN que se cuantifica tras la electroforesis mediante el software CASP
(Comet Assay Software Project).
Se realizó la exposición de un cultivo de fibroblastos L-129 a radiación UV-
C (2000 µJ) como control positivo, al que se adicionó DOPET (100 µM)
para comparar las micrografías mediante microscopio de fluorescencia
(510-595 nm). En las fotos y en el contaje posterior se apreció que DOPET
no logró proteger de la fragmentación del ADN de las células, con respecto
a los controles Definitivamente, este ensayo confirmó que concentraciones
de DOPET iguales a 100 µM inducen apoptosis en cultivos celulares.
Control
Negativo (a)
Control
Positivo
(UV-C) (b)
Frente a un cultivo no irradiado
(a), el control positivo (b)
evidencia
las colas de ADN (b) que la adición
de DOPET (c) no logró evitar.Control positivo
con DOPET
(100 µM) )(c)
Capítulo IV. Resultados 223
IV.2.4.3. Modelo de excitotoxicidad con ácido kaínico:
Laberinto acuático de Morris.
La muerte neuronal responsable de la neurodegeneración puede iniciarse
mediante la sobreexcitación de neuronas en respuesta a la acumulación
extracelular de elevados niveles de glutamato (aminoácido excitatorio)
(Lipton, 1994). Este mecanismo de neurodegeneración se denomina
excitotoxicidad En base a este concepto se estableció un modelo que induce
neurodegeneración en el SNC mediante la inyección de un agonista del
receptor del glutamato, el ácido kaínico (AK).
Uno de los métodos comúnmente utilizado para la evaluación de la memoria
en roedores, es el denominado Laberinto acuático de Morris, descrito en ratas
hace más de 20 años (Morris, 1984). Alguna bibliografía soporta la idea de la
mayor sensibilidad de los ratones de la raza Balb/c al estrés provocado por
este tipo de pruebas en relación a otras razas (Francis, 1995). Sin embargo,
estudios posteriores no encuentran diferencias entre los ratones negros
C57BL/6 y los albinos Balb/c, a pesar de ser los ratones negros los
recomendados para este tipo de prueba (Wehner, 1988, Royle, 1999 #1027).
Por todos estos argumentos, nos pareció interesante someter a la raza Balb/c
al Laberinto acuático de Morris, con objeto de analizar el efecto de DOPET
sobre la memoria de animales intactos y alterados mediante la inyección de la
neurotoxina ácido kaínico (AK). Los resultados beneficiosos obtenidos de
DOPET como antioxidante y neuroprotector en los sistemas in vitro e in vivo
analizados hasta el momento, nos impulsó a aplicarlo en un modelo de
neurodegeneración con el objetivo de probar su capacidad para prevenir de la
pérdida de memoria asociada al daño provocado por AK.
Inicialmente, se puso a punto el protocolo de entrenamiento para apreciar
el aprendizaje de la prueba en los animales y la dosis máxima de AK
aplicable a esta raza. Se estableció que la prueba debía durar 7 días
consecutivos, 2 bloques por día y 4 pruebas por bloque. Cada día se
administraba el tratamiento (AK= 0,6 mg/kg peso/día; DOPET= 5 mg/kg
Capítulo IV. Resultados 224
peso/día) previamente a la realización de las 8 pruebas diarias. Los
resultados se representan en la figura IV.22.
0
10
20
30
40
50
60
70
80
90
0 1 2 3 4 5 6 7
Tiempo (días)
Tie
mp
o la
ten
cia
(seg
)
CONTROL
A K
DOPET
DOPET+A K
Figura IV.22.: Representación del aprendizaje de todos los grupos de
animales en el Laberinto acuático de Morris. Se muestran los valores
medios del tiempo de latencia (segundos en alcanzar la plataforma) en cada
grupo durante los 7 días del estudio. Se observan diferencias significativas entre
el grupo control y AK (P<0,001), así como entre el grupo con toxina (AK) y el
grupo DOPET+AK (P<0,05). No hubo diferencias entre el grupo DOPET y el
grupo DOPET+AK.
Tras el análisis estadístico de los datos mediante ANOVA, se obtuvieron
diferencias estadísticamente significativas al comparar el grupo control y el
grupo AK, lo que confirmaba el daño provocado en la memoria de los
animales. Pero lo más importante fue observar que ni hubo diferencias entre
los dos grupos que recibieron DOPET, y que si hubo diferencias
significativas (P<0,05) entre el grupo que sólo recibió la toxina (AK) y el que
además de ser inyectado diariamente con la neurotoxina fue sondado
Capítulo IV. Resultados 225
previamente con DOPET, lo que apoyaba el potencial neuroprotector del
compuesto.
IV.2.5. Microarrays en ratones sondados con DOPET.
Tras los resultados obtenidos en el transcurso de la Memoria en relación a las
propiedades neuroprotectoras y antioxidantes de DOPET, decidimos que sería
de gran interés conocer la influencia del compuesto sobre la expresión génica.
Con tal fin, se analizó el efecto de 2 dosis del compuesto (1 y 10 mg/ratón
/día) sobre la expresión génica del cerebro e hígado de ratón mediante
microarrays (MedPlant Genetics) Se establecieron 3 grupos (n=5 por grupo)
de ratones Balb/c hembras que durante un período de tiempo de 14 días se
sondaron con agua (grupo control) y con cada una de las dosis establecidas de
DOPET disuelto en agua, cuya estabilidad fue analizada durante el desarrollo
del experimento mediante HPLC-ABTS. Los pesos de los animales se
controlaron diariamente, sin observar ninguna anomalía a lo largo del
estudio, como se observa en la figura IV.23.
Capítulo IV. Resultados 226
15
17
19
21
23
25
27
29
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15
Tiempo (días)
Pes
o (g
)
Control 1 Control 2 Control 3
Control 4 Control 5
15
17
19
21
23
25
27
29
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15
Tie mpo (dí a s)
DOPET1 0 mg-1 DOPET1 0 mg-2DOPET1 0 mg-3 DOPET1 0 mg-4DOPET1 0 mg-5
15
17
19
21
23
25
27
29
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15
Tiempo (días)
Pes
o (g
)
DOPET1mg-1 DOPET1mg-2 DOPET1mg-3
DOPET1mg-4 DOPET1mg-5
Figura IV.23: Pesos de los ratones
incluidos en el estudio de la expresión
génica en cerebro e hígado. No se observó
ningún cambio en ningún grupo, salvo la
ganancia normal de peso con el tiempo.
Tras el agrupamiento de las muestras de cerebro de ratón, la similitud entre la
dosis baja de DOPET y su control fue mayor, mientras que las muestras de
hígado de ratón presentan una mayor similitud entre dosis alta y baja que con
respecto al control. El análisis global de los GeneChips mostró un número
muy bajo de genes sobreexpresados o reprimidos de manera significativa,
sugiriendo que las dosis de DOPET utilizadas tuvieron una acción muy leve
sobre los tejidos estudiados. Los principales genes alterados en hígado se
muestran en las tablas IV.10.y IV.11., y los modificados en cerebro en la tabla
IV.12.
Capítulo IV. Resultados 227
GENES_Hígado
Sobreexpres_1mg Proceso biológico (a);ruta (b)
caspasa-9 a)inducción apoptosis, proteolisis, peptidolisis, actividad hidrolasa y peptidasa
b) -oxidación mitocondrial trombospondina-1 a)adhesión celular, regulación negativa Angiogénesis b) respuesta inflamatoria angiogenina-3 a)regulación negativa de biosíntesis proteínas calponina-2 a) contracción musculo liso Sobreexpres_10mg Proceso biológico proteína periférica mielina detención ciclo celular angiopoyetina-4 regulación negativa de Apoptosis
Tabla IV. 10.: Selección de los genes sobreexpresados en hígado de
ratones tratados con DOPET. Listado de los genes más relevantes en
relación con esta Memoria, que resultaron sobreexpresados en hígado de
ratón tras el sondaje con 1 mg y 10 mg de DOPET. De toda la selección
escogimos al gen de la proteína periférica de la mielina, con un factor de
expresión=2 2.1
Capítulo IV. Resultados 228
GENES_Hígado
Reprimd_1mg Proceso biológico (a); ruta (b)
citocromo P450 a)transporte electrones (familia-2, subfamilia-b) y (familia-3, subfamilia-a)
fosfatidilserina sintasa-1 a)biosíntesis/ metabolismo
fosfolípidos
receptor LBD a)homeostasis/metabolismo
de colesterol; transporte lípidos b)ruta señalización del
Factor-crecimiento-tumoral Beta
ornitina aminotransferasa a)actividad transferasa mitocondrial
factor de unión a elementos reguladores de esteroles a)metabolismo colesterol proteína tipo unión oxisterol-1A a)transporte/metabolismo esteroides y lípidos proteína precursor A -2 a)unión a proteínas y ADN sintasa de ácidos grasos a)biosíntesis/metabolismo ácidos grasos b)glicolisis y gluconeogénesis Reprimd_10mg Proceso biológico
esterol-C5-desaturasa metabolismo/ biosínt.esteroles
hidroxisteroide (17 beta)
deshidrogenasa-12metabolismo/ biosínt.esteroides
muerte celular programada-8 fragmentación ADN apoptosis presenilina-2 glicosilación-N terminal
Tabla IV.11.: Genes reprimidos en hígado de ratones sondados con
DOPET. Selección de los genes cuya expresión resultó reprimida por la
administración de 1 mg y 10 mg de DOPET en hígado de ratón. De entre todos
estos genes, se escogió el de la esterol-C5-desaturasa para estudios posteriores, con
un factor de represión= 2 -1.0.
Capítulo IV. Resultados 229
GENES_Cerebro Sobreexpres_1mg Proceso biológico glutatión S-transferasa mu5 metabolismo glutatión S-transferasa microsomal actividad transferasa proteína Tau estabilización microtúbulos Sobreexpres_10mg
metalotioneina-2 transducción señales mediadas por óxido nítrico
receptor transferrina endocitosis ión hierro semaforina A4 neurogénesis
proteína periférica mielina Aislamiento iónico de neuronas a través de células gliales
pro-opiomelanocortin-alfa ruta señalización neuropéptidos interleukina-5 respuesta inmune Reprimid_1mg receptor calcitonina receptor acoplado proteínas G Reprimd_10mg proteína kinasa II-alfa Ca2+/Calmodulina dependiente transición fase G1 a S en ciclo mitótico proteína kinasa IV Ca2+/Calmodulina dependiente transmisión sináptica entre nervios oncogen osteosarcoma neurogénesis y/o crecimiento celular
Tabla IV.12. Selección de genes alterados en cerebro de ratón. Listado de
genes sobreexpresados y reprimidos por ambas dosis de DOPET en cerebro de
ratón. Nuevamente se sobreepxpresó el gen de la Mielina con la dosis de 10 mg de
DOPET, al igual que en hígado. El factor de expresión de la mielina en cerebro=2 0.9.
Se escogieron dos genes para continuar con los estudios con DOPET:
-Gen de la Esterol C5 desaturasa: se trata de un gen implicado en el
metabolismo del colesterol, que resultó reprimido en hígado por la dosis más
elevada de DOPET. Se seleccionó por nuestro interés en la relación entre
DOPET y el metabolismo del colesterol, dada la relevancia de este esterol en
numerosas patologías, como la EA, y la importancia de encontrar un beneficio
directo del compuesto sobre el metabolismo del colesterol.
-Gen de la proteína periférica de la Mielina: es un gen implicado en
el aislamiento iónico de las neuronas por medio de células gliales,
sobreexpresado en hígado por la dosis de 10 mg de DOPET. Nos pareció
muy interesante analizar el efecto que el compuesto podría tener en un
Capítulo IV. Resultados 230
modelo animal de la EM, enfermedad desmielinizante y neurodegenerativa
de gran importancia en nuestra sociedad, de causa desconocida y aún sin
tratamiento curativo.
IV.2.6. Efecto de DOPET en un modelo animal de
Esclerosis Múltiple (EM).
Gracias a los resultados obtenidos en los microarrays de hígado de ratón,
en los que observamos que 10 mg de DOPET por ratón era capaz de generar
una sobreexpresión del gen de la Mielina, decidimos estudiar el efecto del
compuesto en una enfermedad desmielinizante como la Esclerosis
Multiple.
El presente estudio en un modelo de ratón de EM, denominado
Encefalomielitis Autoinmune Experimental (EAE), se llevó a cabo en
colaboración con la Unidad de Neuroinmunología Clínica del Hospital Vall
d’Hebrón (Barcelona) siguiendo un protocolo de inmunización descrito
anteriormente (Espejo et al., 2001), y que cursa con un EAE crónica. Este
estudio fue realizado en 2 grupos de ratones de la raza 129/Sv, H-2b (n=9,
cada grupo): Control (con agua de mineralización muy débil) y DOPET
(con el compuesto disuelto en agua de mineralización muy débil, 10
mg/ratón/día), con el objeto de comprobar la capacidad de DOPET para
mejorar la enfermedad y/o modificar alguno de los parámetros analizados.
El estudio duró 28 días, contando con el período de inmunización (que
tuvo lugar entre los días 0 y 7 del estudio). Los animales fueron pesados
diariamente y evaluados sus signos neuro-motrices siguiendo los criterios
descritos por Espejo y colaboradores (Espejo et al., 2001).
Los parámetros analizados durante el estudio fueron los siguientes:
-Incidencia: Número de ratones con algún síntoma de la enfermedad en
cualquier momento del estudio.
-Mortalidad: Número de ratones fallecidos a consecuencia de la
enfermedad.
Capítulo IV. Resultados 231
-Inicio: Día de inicio de la enfermedad contando desde la primera
inmunización (media del grupo, sólo animales enfermos).
-Cronicidad: Sumatoria de los scores diarios (media del grupo, todos los
animales inmunizados, valor= 0 para los no enfermos).
-Duración: Número de días con signos de enfermedad (media del grupo, todos
los animales inmunizados, valor= 0 para los no enfermos).
-Gravedad: Score máximo (media del grupo, todos los animales inmunizados,
valor= 0 para los no enfermos).
-Morbilidad: Número de días con pérdida de peso respecto al día anterior
(media del grupo, todos los animales inmunizados, valor= 0 para los no
enfermos).
Los resultados obtenidos se muestran en las tablas IV.13. y IV.14 y en la
figura IV.24.
Capítulo IV. Resultados 232
Día Control DOPET
(10mg/ratón/día)
7 0 0
8 0 0
9 0 0
10 0 0
11 0 0
12 0,1 0,1
13 0,1 0,2
14 0,2 0,2
15 0,6 0,4
16 1,2 0,4
17 1,4 0,4
18 1,5 0,7
19 1,5 0,4
20 1,6 0,7
21 1,7 0,7
22 1,7 0,7
23 1,7 0,7
24 2 0,9
25 2,3 0,9
26 2,3 0,9
28 2,3 0,9
Tabla IV.13.: Valores de score diario para el grupo control y el grupo
DOPET. Se recogen los valores medidos diariamente para cada animal
inmunizado de cada grupo, siguiendo el criterio de evaluación: 0=no signos
clínicos; 0,5=parcial pérdida del tono de la cola durante 2 días consecutivos;
1=parálisis de la cola entera; 2= suave paraparesis de 1 o ambos miembros
traseros; 3=paraplejia; 4=tetraparesis; 5=tetraplegia; 6=muerte.
Capítulo IV. Resultados 233
Incidencia Mortalidad Inicio Cronicidad Duración Gravedad Morbilidad
Control 7/9;78% 0/9;0% 16+4,02 22+21,59 8+5,98 2+1,93 3+4,13
DOPET 2/9;78% 0/9;0% 15+4,24 9+18,38 3+5,93 1+1,76 1+2,20
P 0,045 nd 0,4 0,093 0,044 0,052 0,077
Tabla IV.14.: Valores para los parámetros analizados en el estudio. Se
obtuvo una reducción estadísticamente significativa en el grupo DOPET frente al
control, en cuanto a la incidencia de la enfermedad y la duración de la misma
(P<0,05).
0
0,5
1
1,5
2
2,5
7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21
22 23
24 25
26
28
Tratamiento (días)
Scor
e ac
um
ula
do
DOPET
Control
Figura IV.24.: Representación del score diario para cada grupo a lo
largo del estudio. La diferencia obtenida para el grupo DOPET con respecto al
control presentó tendencia estadística (P= 0,06).
Los resultados mostrados en la Tabla IV.14. representan los valores de los
parámetros analizados en el estudio utilizando a todos los animales
inmunizados (n=9 por grupo) independientemente de si mostraban signos
o no de enfermedad. Puesto que la incidencia en el grupo DOPET fue muy
Capítulo IV. Resultados 234
baja (2 de 9), se corrigieron los valores anteriores utilizando sólo los
valores obtenidos en aquellos animales donde se detectó la enfermedad. En
este sentido, el valor para la cronicidad en el grupo control fue de 29±20,25
y de 41±7,42 para el grupo DOPET, aunque la diferencia entre estos valores
careció de significación estadística (P= 0,22). Igualmente, los valores para
la duración de los brotes, corregidos con esta consideración, fueron de
10±4,5 (control) y de 13±4,24 (DOPET), aunque nuevamente el valor de P
no fue significativo (P= 0,24). Finalmente, la corrección de la medición de
la gravedad resultó en valores de 3±1,59 (control) y 4±0 (DOPET) con una
P igual a 0,23 (no significativa).
Estos resultados sugieren la capacidad de DOPET para disminuir la
incidencia de esta enfermedad en el modelo animal utilizado, aunque
aquéllos animales que enfermaron lo hicieron con la misma intensidad que
los controles.
El hecho de que DOPET sobreexpresara al gen de la proteína Mielina pudo
ser la razón por la que el compuesto mostró un efecto en este modelo
animal de EM.
Capítulo IV. Resultados 235
IV.2.7. Estudios del metabolismo del colesterol.
A continuación se decidió abordar el análisis de la capacidad
hipocolesterolemiante del compuesto, en base a los resultados obtenidos en
los microarrays realizados en hígado de ratones tratados con el compuesto, en
los que una dosis de 10 mg reprimía la expresión del gen que expresa la
Esterol C5-desaturasa. Por tanto comenzamos estudiando la enzima
denominada Latosterol C5-desaturasa (LC5D), que cataliza la introducción de
un puente delta 5 en la molécula de latosterol (colest-7-en-3 -ol) para formar
7-dehidrocolesterol (7-DHC), con la participación de oxígeno molecular y
nucleótidos reducidos de piridina. El objetivo era determinar el potencial de
DOPET para inhibir la producción de colesterol en sistemas in vitro e in vivo,
confirmando así su efecto a nivel genético comprobado con anterioridad.
IV.2.7.1. IC50 de DOPET para la actividad enzimática LC5D.
En primer lugar, se determinó la constante de Michaelis-Menten (Km) de la
enzima LC5D, siguiendo el protocolo descrito en el capítulo II de esta
Memoria. La Km nos permitiría conocer la concentración del sustrato
(latosterol) a la que la reacción tenía lugar a la mitad de la velocidad máxima
(Vmáx), ajustándose a la ecuación: v/Vmáx= [Sustrato]/ (Km + [Sustrato]
Por tanto, la Km de la LC5D sería un indicador de la afinidad de la enzima por
el sustrato dado, y por tanto de la afinidad de la enzima por formar el
complejo enzima-sustrato.
Se aisló la enzima a partir de microsomas hepáticos de rata, por tratarse de los
orgánulos celulares en los que se aloja la proteína. Tras la puesta a punto de la
cantidad óptima de proteína microsomal (0,5 mg/mL), se realizaron todas las
reacciones en triplicado y se analizaron las muestras por HPLC-PDA (280
nm). Se obtuvieron los siguientes valores, representados en la figura IV.25.
Km= 157,3 µM; Vmáx= 107,03 µmol/mg proteína
Capítulo IV. Resultados 236
0
20000
40000
60000
80000
100000
120000
140000
160000
180000
5 55 105
155
205
255
305
355
40
5
455
505
555
[Latosterol] (µM )
Vel
ocid
ad (
nm
ol/m
g)
Figura IV.25.: Curva de Michaelis-Menten para determinar el valor de
la Km de LC5D en microsomas de hígado de rata. Los valores se
obtuvieron a partir de las áreas obtenidas para 7-DHC (producto de la reacción
catalizada por LC5D) mediante HPLC-PDA (280 nm) frente a diferentes
concentraciones de latosterol (sustrato).
La reacción catalizada por la actividad enzimática LC5D supone la
formación de colesterol en hígado, por lo que una vez determinada la Km de
la enzima, analizamos si DOPET era capaz de inhibir esa reacción mediante
una actuación directa sobre LC5D.
Se determinó la IC50 de DOPET para LC5D o concentración de compuesto
capaz de con estableció un protocolo para determinar la concentración del
producto de la reacción, 7-DHC, mediante HPLC-PDA (280nm), de manera
que pudiéramos medir la inhibición de la LC5D ejercida por DOPET a través
de una reducción en la producción de 7-DHC.
Las reacciones se realizaron de la misma manera que las muestras para la
determinación de la Km de la enzima (microsomas que llevan la enzima,
liposomas que contienen el sustrato, sobrenadante-105 que facilita la
Capítulo IV. Resultados 237
reacción y buffer fosfato potásico), salvo que en esta ocasión se adicionó
DOPET (diferentes concentraciones de un stock 6,5 mM).
A continuación se determinó la IC50 de DOPET para la LC5D. Los
resultados obtenidos para los diferentes ensayos se muestran en la figura
IV.26.
Figura IV.26.: Representación de los 3 ensayos seleccionados para
determinar la IC50 de DOPET para LC5D. Se representan los valores para la
actividad enzimática LC5D, expresada en porcentaje de pérdida de actividad en
función del incremento de la concentración de DOPET y por tanto de su capacidad
inhibidora. El valor medio para la IC50 de DOPET fue de 187 µM.
Se seleccionaron 3 de los ensayos realizados y se realizó la media,
concluyendo que el valor de la IC50 de DOPET para la enzima LC5D equivalió
a:
IC50 = 187 µM
Una vez conocida la capacidad inhibidora de DOPET sobre la enzima LC5D,
y teniendo en cuenta que LC5D es una metaloenzima, capaz de ser inhibida
por compuestos quelantes de hierro (Kawata et al., 1985), nos propusimos
0
25
50
7 5
100
125
150
0 50 100 150 200 250 300
[DOPET](µM)
Act
ivid
ad L
C5D
(%
)
*
IC50
Capítulo IV. Resultados 238
descartar que la inhibición ejercida por DOPET sobre la enzima se debiese a
su poder quelante de hierro. Para ellos, se incubaron las muestras con FeCl3
(10 µM, 30 µM y 100 µM), descartando esta posibilidad porque ni la
actividad enzimática ni la inhibición ejercida por DOPET resultaron
modificadas por la adición de FeCl3, como se observa en la figura IV.27.
0
2 0
4 0
6 0
8 0
1 00
1 2 0
1 4 0
1 6 0
0µM
DO
PE
T
10 µ
M F
eCl3
30 µ
M F
eCl3
100µM
FeC
l3
100µM
DO
PE
T
300µM
DO
PE
T
100µM
DO
PE
T+
10µM
FeC
l3
100µM
DO
PE
T+
30µM
FeC
l310
0µM
DO
PE
T+
100µM
FeC
l3
300µM
DO
PE
T+
100µM
FeC
l3
Act
ivid
ad L
C5D
(%
)
Figura IV.27.: Influencia del FeCl3 sobre capacidad inhibidora de
DOPET sobre LC5D. Se evaluó si la inhibición de DOPET (100 µM y 300 µM
sobre la metaloenzima LC5D era debida a su poder quelante de hierro. Su
capacidad inhibidora no resultó modificada tras la adición de FeCl3 (10 µM, 30 µM
y 100 µM).
Por todos estos resultados se estableció que DOPET era capaz de inhibir a la
enzima LC5D por mecanismos que no estaban basados en su poder quelante
de hierro.
Capítulo IV. Resultados 239
IV.2.7.2. Efecto de diferentes dietas en el metabolismo del
colesterol de conejos.
Tras los ensayos in vitro anteriores realizados en la enzima LC5D, en los que
DOPET demostró inhibir la enzima LC5D implicada en el metabolismo del
colesterol, se diseñó un estudio in vivo para analizar el efecto de este
compuesto aplicado con la dieta. El objetivo del estudio, fue la creación de un
modelo de aterogenia en conejo, por ser un animal en el que podía inducirse el
proceso de manera fácil y rápida mediante manipulación dietaria.
Se diseñaron 7 grupos de 8 conejos cada uno: 2 con dieta control (CO= 30 días
y CF= 60 días), 2 con dieta aterogénica (CA= 30 días y AA= 60 días), 1 con
dieta aterogénica 30 días y dieta control los 30 días siguientes (AC), 1 con
dieta aterogénica más sondaje con DOPET 30 días (ADT) y el último con dieta
control y DOPET durante 60 días (DT).
En primer lugar se realizó la extracción de colesterol total tanto en plasma
como en cerebro, LAD-colesterol y triglicéridos en plasma, determinados en
ambos tejidos mediante ensayo colorimétrico por espectrofotometría (kit Bio
System).
Los resultados obtenidos para los parámetros determinados en plasma, se
muestran en las figuras IV. 28-30.
Capítulo IV. Resultados 240
0
500
1000
1500
2000
2500
3000
CO CA ADT CF AA AC DT
Gr u pos seg ú n dieta
[Co
lest
ero
l] (
mg/
dL
)
*
Figura IV.28.: Colesterol total en plasma de cada uno de los grupos de
conejos del estudio. Se obtuvo un descenso significativo (P<0,05) en el grupo DT
(dieta aterogénica 1 mes y dieta chow más sondaje con DOPET durante 1 mes más)
con respecto a su control AC (igual que DT pero sin DOPET) y al grupo AA (2 meses
con dieta aterogénica).
Estos resultados demuestran la efectividad del modelo, dado el incremento de
los niveles de colesterol en los grupos con dieta aterogénica CA y AA con
respecto a sus controles CO y CF. La reducción del colesterol en el grupo DT,
sondado con DOPET durante 2 meses y alimentado con dieta aterogénica 1
mes y dieta control el mes siguiente, fue del 40% con respecto al grupo AC, lo
cual era significativo (P<0,05) y demostraba la eficacia del compuesto en los 2
meses de tratamiento.
Capítulo IV. Resultados 241
0
100
200
300
400
500
600
CO CA ADT CF AA AC DT
Grupos según dieta
[Tri
glic
érid
os]
(mg/
dL)
*
Figura IV.29.: Triglicéridos en plasma de conejo en cada grupo del
estudio. Se obtuvo una reducción significativa (P<0,05) de los triglicéridos en el
plasma de los animales del grupo DT con respecto a su grupo control AC y al grupo
AA, alcanzando valores muy similares al grupo control de 2 meses (CF =66 ±11
mg/dL; DT= 61±9 mg/dL).
Nuevamente, se observó un incremento significativo de los triglicéridos en
plasma de los grupos AC y AA. Sin embargo, en el grupo DT se produjo una
reducción significativa (P<0,05) del 50% en los niveles de este parámetro
plasmático. En esta ocasión también quedaba demostrada la eficacia de
DOPET en el tratamiento a 2 meses para mejorar el perfil lipídico en plasma
de los conejos.
Capítulo IV. Resultados 242
0
5
10
15
20
25
30
35
40
CO CA ADT CF AA AC DT
Grupos según dieta
[LA
D-c
ol]
(mg/
dL)
*
Figura IV.30: Concentración de LAD-colesterol en plasma para cada
grupo de conejos del estudio. Se observó un incremento significativo (P<0,05)
en el grupo DT, sondado con DOPET durante 2 meses, respecto a su control AC.
Se obtuvo un descenso significativo (200%) en los niveles de LAD-colesterol
en el grupo DT suplementado con DOPET en relación al resto de grupos.
Por tanto, los análisis de parámetros plasmáticos demuestran la reducción
significativa de la relación “colesterol total/LAD colesterol” en los animales
tratados con DOPET durante 2 meses, y por ende la eficacia del compuesto en
la mejora del perfil lipídico plasmático en este modelo animal.
A la vista de la mejora observada en plasma, se determinaron los niveles de
colesterol cerebro de los diferentes grupos de conejos y se obtuvieron los
siguientes resultados, recogidos en la figura IV.31.
Capítulo IV. Resultados 243
0
5
10
15
20
25
CO CA ADT CF AA AC DT
Grupos según dieta
[Col
este
rol]
(m
g/g)
Figura IV.31.: Colesterol en cerebro de los diferentes grupos de conejos.
No se obtuvo ninguna diferencia significativa entre los grupos para este parámetro.
En esta ocasión, no se observó ninguna diferencia significativa en los niveles
de colesterol cerebral entre los grupos. Es posible que la larga vida media del
colesterol en este órgano (6 meses) fuera la razón para que en un estudio de 2
meses no percibiésemos ningún efecto de DOPET sobre este parámetro.
Serían necesarios estudios a más largo plazo para poder detectar alteraciones
en el contenido en colesterol en cerebro por modificaciones dietarias.
Por tanto, ante la imposibilidad para detectar algún efecto de DOPET en la
concentración de colesterol en cerebro, se decidió estudiar uno de los
metabolitos intermediarios en el metabolismo del colesterol, como es el
latosterol (colest-7-en-3 -ol). La conversión de latosterol en colesterol pasa
por la formación de 7-dehidrocolesterol (7-DHC), y el ratio de conversión de
latosterol en colesterol se considera un marcador de la síntesis de colesterol
(Heverin et al., 2004).
A partir de las extracciones de colesterol, se realizó la obtención de latosterol
para su posterior detección por CG-MS.
Capítulo IV. Resultados 244
0
0,2
0,4
0,6
0,8
1
1,2
1,4
CO CA ADT CF AA AC DT
Grupos según dieta
[Lat
oste
rol]
(m
g/g)
**
**
Figura IV.32.: Valores de latosterol en cerebro de conejos. Se obtuvo una
disminución estadísticamente significativa (P<0,01) entre el grupo suplementado
con DOPET durante 1 mes (ADT) respecto a su grupo control (CO), así como una
reducción significativa (P<0,01) en los niveles de latosterol del grupo sondado con
DOPET durante 2 meses (DT) con respecto a su control (AC).
Los resultados obtenidos para los niveles de latosterol en cerebro, confirman
la idea anterior en relación a la ausencia de un efecto en colesterol en cerebro
por la breve duración del estudio. En este caso, se obtuvo una disminución
significativa (P<0,01) en los dos grupos que recibieron DOPET (1 y 2 meses),
lo que demuestra que el compuesto era eficaz en la reducción de los niveles de
un metabolito del colesterol en tan sólo 1 mes de tratamiento, por lo que
probablemente en un estudio a más largo plazo (6 o 7 meses) habríamos
observado una reducción en el colesterol total del cerebro de estos animales.
Por tanto, podemos concluir que DOPET favoreció el metabolismo lipídico en
ambos tejidos mediante la disminución de los niveles de colesterol total, LAD-
colesterol y triglicéridos en plasma, tras 2 meses de tratamiento, así como los
niveles de latosterol en cerebro, precursor del colesterol, en tan sólo 1 mes de
tratamiento.
Capítulo IV. Resultados 245
IV.2.8. Efecto de DOPET sobre la captación de dopamina
y norepinefrina in vitro.
La estructura molecular de DOPET (2, 3-4 dihidroxifeniletanol) es muy
similar a la molécula de Dopamina, como puede apreciarse en la figura IV.33.
OHOH
OH
OHOH
NH2
DOPAMINA (C8H11NO2)DOPET (C8H10O3)
Figura IV.33. Similitud estructural de DA y DOPET. Se trata de dos
moléculas formadas por un anillo fenólico, solamente diferenciadas por un grupo
NH en la molécula de la DA y un oxígeno en la estructura de DOPET.
En base a esta similitud molecular, se pensó que DOPET podría estar
implicado en el metabolismo de la DA, participando en reacciones catabólicas
de eliminación de la DA catalizadas por la enzima MAO, y/o en procesos de
reconocimiento por parte de los receptores de DA. Si el compuesto participara
en alguno de estos procesos, podría ser de gran relevancia en patologías como
la Enfermedad de Parkinson, donde la inhibición de la actividad Monoamino
Oxidasa (MAO) o la potenciación de la captación de DA por parte de sus
receptores suponen dos puntos clave en la búsqueda de terapias para la
enfermedad.
Por tanto, se diseñó un estudio en colaboración con la Dra. Hilfiker
(Universidad Manchester, Inglaterra) para probar los efectos de DOPET sobre
la captación y liberación de catecolaminas por parte de las células PC12. Estas
células representan un modelo catecolaminérgico adecuado, ya que secretan
monoaminas y desarrollan un fenotipo-tipo neuronal bajo tratamiento con
factor de crecimiento nervioso (FCN) (Greene and Tischler, 1976).
Capítulo IV. Resultados 246
Las monoaminas Dopamina (DA), Norepinefrina (NE) y Serotonina (5-
HT), son captadas por las células a través de diferentes transportadores
proteicos asociados a la membrana plasmática, y se concentran en
vesículas.
Las células PC12 expresan el transportador de DA (DAT) sensible a cocaína
y anfetamina (Zhu and Hexum, 1992), el transportador de NE membrana
sensible a la cocaína y Na+/Cl+ dependiente (NET) (Bruss et al., 1997) y el
transportador de 5-HT (SERT) (Yoffe and Borchardt, 1982).
El transporte de catecolaminas en neuronas, a través de la membrana
plasmática, está estrechamente acoplado al transporte vesicular hacia las
vesículas de almacenamiento, de manera que sólo una pequeña fracción de
las monoaminas es metabolizada por la MAO (Bonisch and Eiden, 1998).
La MAO se localiza dentro de las neuronas catecolaminérgicas,
metabolizando DA y NE a través de O-metilación. En roedores, NE y 5-HT
son sustratos exclusivos de MAO-A, mientras que la DA es sustrato tanto
de MAO-A como de MAO-B (Garrick and Murphy, 1982).
Tanto las PC12 indiferenciadas como las células diferenciadas por FCN,
derivadas de tejido de rata, contienen predominantemente MAO-A
(Youdim et al., 1986) y una baja actividad MAO-B (Wei et al., 1997).
Las PC12 expresan grandes cantidades de catecol-O-metiltransferasa, capaz
de metabolizar NE y DA en este sistema celular (Offen et al., 2001). En
resumen, este sistema celular contiene todas las proteínas relevantes para
el transporte y el metabolismo de DA y NE.
Para el estudio de DOPET en células PC12, se marcaron con [3H]-DA o
[3H]-NE, durante 1 h, en presencia o en ausencia de DOPET 5 µM (figura
IV.34)
Para asegurar la especificidad de la captación de los neurotransmisores
marcados, se incluyó un control en cada ensayo, con un exceso de 1000
veces la concentración molar de transmisor no marcado. La captación no
específica fue de <10% tanto para DA como para NE, y se restó de todos los
valores experimentales. DOPET no tuvo efecto en la cantidad de
neurotransmisor captado de manera no específica.
Capítulo IV. Resultados 247
DOPET incrementó la captación de [3H]-DA, aunque en un rango variable
(n=7; 71 ±48%). Este efecto era más pronunciado para [3H]-NE (n=5; 322
± 157%).
En base a la capacidad de las células PC12 para inducir la expresión de una
serie de proteínas implicadas en la diferenciación del FCN, se crecieron
durante 24 h en medio enriquecido con 1% de suero y 50 ng/mL de FCN antes
de medir la captación. Bajo estas condiciones, la mejora en la captación
inducida por DOPET era menos variable ([3H]-DA (n=4; 84 ±32%); [3H]-NE
(n=5; 588 ±304%).
Figura IV.34.: Captación de DA y NE en los sistemas tratados con
DOPET, con y sin pretratamiento con FCN. Se midió la captación de DA y NE
en células PC12 sin diferenciar y en células incubadas previamente con FCN que
inducía la diferenciación de las células y la expresión de una serie de proteínas,
obteniéndose un incremento en la captación de los neurotransmisores.
Las curvas dosis-dependientes sugieren que DOPET es muy potente para
incrementar el contenido de catecolaminas radiomarcadas dentro de las
células, con una Ki de aproximadamente 0.1 µM tanto para DA (n=2) como
para NE (n=3). Además, dicho incremento era tiempo-dependiente, con una
saturación igual a 3 h.
0
200
400
600
800
1000
Cap
taci
ón n
euro
tran
smis
or (
%)
DOPET DOPETDOPET+FCN
DOPET+FCN
DA NE
Capítulo IV. Resultados 248
Con objeto de establecer el mecanismo de acción de DOPET, se provocó la
secreción de [3H]-DA y de [3H]-NE por KCl, que evoca una secreción
dependiente de Ca 2+ por despolarización de la membrana y un influjo de Ca
2+ a través de los canales voltaje-dependientes de Ca 2+, y con ionomicina,
que actúa como un ionofóro para incrementar globalmente los niveles
intracelulares de Ca2+. Sin embargo, como se observa en la figura IV.35., los
valores de secreción fueron variables (debido a la sensibilidad de las células
diferenciadas con FCN a ser lavadas en placa) por lo que no pudimos
observar ningún efecto de DOPET sobre la secreción. Podríamos sugerir que
DOPET no modulase directamente la maquinaria de secreción, o que lo
haría modulando una serie de vías de transducción de señales que
impactaran en la eficacia de la maquinaria de secreción.
0
1 0
20
30
C
C+
DO
PE
T
KC
l
KC
l+D
OP
ET
Ion
o
Ion
o+
DO
PE
T
Sec
reci
ón
DA
(%
to
tal)
0
10
20
30
C
C+
DO
PE
T
KC
l
KC
l+D
OP
ET
Ion
o
Ion
o+D
OP
ETS
ecre
ción
NE
(%
tot
al)
Figura IV.35. Efecto de DOPET sobre la secreción de DA y NE
provocada por KCl y por ionomicina. En ningún sistema DOPET
incrementó la secreción ni de DA ni de NE inducidas por KCl o por ionomicina
(iono), como se observa al comparar los niveles secretados por cada uno de los
compuestos y el control (C) incubado únicamente con DOPET.
A continuación, para analizar el efecto de DOPET sobre la MAO, se comparó
la actuación del compuesto con el efecto ejercido por inhibidores específicos
de la MAO-A (Clorgilina, 15 µM, SIGMA) y MAO-B ((-)-Deprenil, 100 µM,
TOCRIS) en el sistema celular (figura IV.36). Mientras DOPET (10 µM)
incrementaba de manera efectiva los niveles de catecolaminas
intracelulares, ninguno de los inhibidores alteraba los niveles intracelulares
Capítulo IV. Resultados 249
de [3H]-DA o de [3H]-NE, ensayados en células no diferenciadas o en células
crecidas en suero al 1% con FCN durante 1 día. Estos datos sugieren que
DOPET, a la concentración utilizada, incrementó los niveles de
catecolaminas por un mecanismo que no se puede asociar con la inhibición
de las actividades MAO-A o MAO-B, por lo que su actuación podría tener
lugar sobre los transportadores.
A)
0
50
100
150
200
C
DO
PE
T
Clo
rgil
ina C
DO
PE
T
Clo
rgil
ina
(-)-
depr
enil
x10
3
Cap
taci
ón t
otal
DA
(dp
m)
Medio completo +1 %suero/FCN
B)
0
50
100
150
200
250
C
DO
PE
T
Clo
rgil
ina C
DO
PE
T
Clo
rgil
ina
(-)-
depr
enil
x10
3
Cap
taci
ón t
otal
NE
(dp
m)
Medio completo +1 %suero/FCN
Figura IV.36.: Comparación del efecto de DOPET con inhibidores de la
MAO (A y B). Se observó un incremento en la captación de DA (A) y NE (B) en
presencia de DOPET pero no de los inhibidores específicos de MAO.
Capítulo IV. Resultados 250
Ante la ausencia de un efecto claro sobre la MAO por parte de DOPET, se
quiso comprobar si DOPET actuaba en el transporte de las catecolaminas a
través de la membrana plasmática o modificando las enzimas implicadas
en el metabolismo intracelular de catecolaminas. Para tal efecto, se
marcaron las células en primer lugar con el transmisor y posteriormente se
incubaron con DOPET 1 µM en ausencia de dicho transmisor marcado. Al
proceder así, se produjo un incremento robusto del contenido intracelular
de transmisores radiomarcados. En contraste, al realizar este mismo
ensayo, pero lavando las células antes de incubarlas con DOPET durante 1
h, no se observó el mismo efecto. Estos resultados sugieren que DOPET
podría actuar en el transporte de catecolaminas a través de la membrana
plasmática más que sobre las enzimas del metabolismo de las monoaminas.
El mecanismo de actuación propuesto para DOPET se esquematiza en la
figura IV.37.
Capítulo IV. Resultados 251
Figura IV.37.: Mecanismo de acción propuesto para DOPET en células
PC12. El posible mecanismo de acción de DOPET consistiría en la activación del
transportador TNE que introduciría NE y DA en la célula, facilitando así la
incorporación de éstos en vesículas. No se ha demostrado que esta acción pudiera
ser llevada a cabo a través de la activación del transportador de DA (TDA). Por
otra parte, DOPET (concentraciones superiores a 5 µM) podría inhibir a la
actividad MAO, responsable de la degradación de DA. DBH= Dopamina-beta-
hidroxilasa
NE + DA DA Extacelular
TNE TDA
Intracelular
+
DOPET NE + DA
+
DOPET
vesículas
?
DOPET
MAODOPAL
APOPTOSIS
DOPET
DA HVACOMT
NE
-
DBHNE DA
Capítulo IV. Resultados 252
IV.2.8.1. IC50 de DOPET para la actividad Monoamino
oxidasa (MAO) en mitocondrias aisladas de hígado y cerebro
de rata.
Tras los resultados anteriores, en los que DOPET demostró actuar sobre el
metabolismo de las catecolaminas, bien a través de la activación de los
transportadores y/o inhibición de la actividad MAO, nos pareció interesante
analizar la capacidad de inhibición de diferentes concentraciones del
compuesto, superiores a la concentración empleada en aquél estudio (5 µM),
sobre la actividad MAO-B. Se estudió la inhibición de la MAO-B, porque este
fenómeno se asocia con la mejora en la actividad de la DA, al igual que con
el descenso en la producción de peróxido de hidrógeno (H2O2). Para ello se
realizaron una serie de ensayos in vitro para determinar la concentración
capaz de inhibir el 50% de actividad enzimática MAO-B (IC50), aislada en
mitocondrias de cerebro de rata. En patologías como la EP se emplean
inhibidores de la MAO con objeto de impedir la degradación de la dopamina
y evitar así las alteraciones neuromotoras derivadas de la pérdida de este
neurotransmisor.
La reacción que se desarrolló determinada mediante espectrofotometría, se
basó en métodos descritos previamente (Holt et al., 1997).
Benzilamina+MAO-B=Benzaldehído+H2O2
4-aminoantipirina oxidada+ácido vinílico=quinoneimina (color rojo)
Se aislaron mitocondrias en cerebro de rata por ser los orgánulos en los que
reside la actividad enzimática MAO, y se realizaron las reacciones
pertinentes con concentraciones crecientes de DOPET (0 µM a 125 µM en
cerebro) para la determinación de la IC50 del compuesto para MAO-B en
ambos tejidos. La adición de DOPET y el sustrato benzilamina se realizó
transcurridos 5 min tras la colocación de la mezcla (buffer, mitocondrias y
Peroxidasa 4-aminoantipirina
Capítulo IV. Resultados 253
solución cromogénica) en la cubeta de cuarzo dentro del espectrofotómetro,
para dejarla atemperar. Una vez añadido el inhibidor y el sustrato, se midió
la absorbancia a 498 nm, llevando a cabo una cinética de 20 min para
establecer el descenso en la formación del producto de la reacción a lo largo
del tiempo como consecuencia del efecto inhibidor de DOPET sobre la
actividad enzimática. Los resultados obtenidos para las 3 tandas de
reacciones se recogen en las figuras IV.38 (cerebro).
Figura IV.38.: IC50 de DOPET para la actividad MAO-B en cerebro de
rata. Se representan los valores conjuntos de los 3 ensayos realizados para la
actividad enzimática MAO-B(%), frente al logaritmo de la concentración de
DOPET.
El valor medio para la IC50 de DOPET correspondió a:
IC50 DOPET para MAO-B cerebral= 16.3 µM ± 1.3
Estos resultados demuestran que DOPET era capaz de inhibir a la enzima
MAO-B, a concentraciones un poco más elevadas que las empleadas en el
estudio de las catecolaminas descrito con anterioridad.
0
25
50
7 5
100
0,5 1 ,5 2,5
Log [DOPET] (µM)
MA
O-B
(%
)
IC50
*
V. DISCUSIÓN
Capítulo V. Discusión 255
Las enfermedades neurodegenerativas como la Enfermedad de Alzheimer (EA),
la Enfermedad de Parkinson (EP) y la Esclerosis Múltiple (EM), de origen
multifactorial (reacciones tóxicas, inflamatorias, neurotoxicidad glutamatérgica,
incrementos en el nivel de hierro y de óxido nítrico, eliminación de los
antioxidantes endógenos, reducción en los factores tróficos y pérdida de
neuronas), son algunas de las patologías más devastadoras y que mayor gasto
económico suponen para la sociedad actual (Mayeux, 2003). Los mecanismos de
neuroprotección pueden ser afrontados desde modificaciones dietarias
(Mattson, 2002).
Las características clínicas clásicas de la EA incluyen una pérdida de memoria
amnésica (Greene, 1996; Pillon, 1993) entre otras alteraciones motoras (Kirk,
1991). El péptido A , componente de las placas seniles y molécula clave en la EA
(Bayer et al., 2001) es neurotóxico tanto in vitro como in vivo, mediante la
inducción de un estrés oxidativo asociado a las membranas celulares, que
conduce a perturbaciones en el metabolismo del colesterol que activarían una
cascada neurodegenerativa responsable del desarrollo de la enfermedad clínica
(Bodovitz and Klein, 1996; Cutler et al., 2004). La oxidación y peroxidación
lipídica, inflamación y activación de la cascada apoptótica de muerte celular son
considerados consecuencias secundarias de la generación y deposición de A
(Hardy, 2002).
El parkinsonismo describe un síndrome caracterizado por rigidez, temblor y
bradikinesia, del cual la EP es la principal causa y la enfermedad más común
que afecta a la función motora y al movimiento.
La EM es una enfermedad inflamatoria demielinizante crónica del SNC que
afecta a los jóvenes adultos y que al igual que la EA es de patogénesis
desconocida (Hong, 2004) aunque se ha sugerido que el daño axonal podría
ocurrir de manera independiente a los procesos inflamatorios (Maggs, 2004).
Los polifenoles presentan propiedades plurifarmacológicas, como la quelación
de hierro, el “scavenging” de radicales libres, la activación de genes de
supervivencia y de rutas de señalización celular. Por todo esto, se han elegido
como candidatos para la investigación en enfermedades neurodegenerativas
(Mandel and Youdim, 2004). Un compuesto fenólico como 2-(3,4-
Capítulo V. Discusión 256
dihidroxifenil)-etanol (DOPET), presente en el aceite de oliva, ha demostrado
ser un potente antioxidante, tanto in vitro como in vivo, junto a otras
actividades biológicas que le confieren importancia dentro de la dieta
Mediterránea (Visioli, 2001a). Se ha demostrado recientemente el poder
protector de la ingesta de flavonoides, compuestos fenólicos contenidos en el
vino, vegetales, frutas y te frente a la demencia (Commenges, 2000).
Igualmente, se ha comprobado que la ingesta de vitamina C y E reduce el riesgo
de padecer la EA (Engelhart, 2002) y mejoran la función cognitiva (Grodstein,
2003).
Por otra parte, hay que destacar la importancia de los AGPIs omega-3
contenidos en el aceite de pescado, como componentes dietarios capaces de
reducir la presión sanguínea, proteinuria, niveles lipídicos e inflamación
(Parinyasiri et al., 2004). Se ha demostrado su capacidad neuroprotectora en el
cerebro adulto y su conexión con el retraso de la EA (Kim et al., 2000b;
Lauritzen et al., 2000; Youdim et al., 2000). Recientemente se ha publicado la
eficacia de una dieta enriquecida en AGPIs omega-3 como una estrategia de
neuroprotección en un modelo animal de la EA (Calon, 2004).
El objetivo global de esta Memoria fue el estudio de la capacidad de
neuroprotección de dos componentes naturales habituales de la dieta
Mediterránea, como son los AGPIs omega-3 y el DOPET, aplicados a diferentes
sistemas sometidos a estrés oxidativo, procesos inflamatorios y relacionados con
el metabolismo del colesterol.
Capítulo V. Discusión 257
V. Estudios en modelos animales de la EA.
V.1.1. Estudios con dietas enriquecidas en AGPIs omega-3 en
modelo transgénico simple PPA de la EA.
Se ha demostrado la capacidad de los AGPIs omega-3 para inducir una
reducción en los niveles de colesterol (Contacos et al., 1993). Los AGPIs se
relacionan con el estrés oxidativo por su vulnerabilidad para ser atacados por los
radicales libres (Christen, 2000) y los omega-3 suprimen la inflamación y
mejoran el curso de una infección mediante la disminución de las citoquinas
pro-inflamatorias (Blok et al., 1996). Como consecuencia, se ha conectado a
estos ácidos grasos omega-3 con el retraso en el inicio del desarrollo de
patologías como la EA y la EP (Youdim et al., 2000).
En el momento en que se planificó y desarrolló este estudio no existía ningún
otro en que se analizara el efecto de una dieta enriquecida en AGPIs omega-3 en
un modelo animal de la EA, por lo que se decidió evaluar el efecto de esta dieta
en un modelo animal de ratón simple transgénico PPA.
La composición de ácidos grasos de los fosfolípidos de las membranas
neuronales refleja la ingesta de aquéllos en la dieta. El grado de desaturación de
los ácidos grasos determina la estructura tridimensional y por tanto su fluidez y
función. La enzima fosfolipasa A2 hidroliza los ácidos grasos de los fosfolípidos
de las membranas, liberando los AGPIs omega-6, que son metabolizados a
prostaglandinas, de elevado potencial inflamatorio en comparación con los
eicosanoides liberados por los AGPIs omega-3. El ratio omega-3:omega-6
influye en la neurotransmisión serotoninérgica y catecolaminérgica y en la
formación de las prostaglandinas, que son procesos vitales en el mantenimiento
de la función normal del cerebro (Haag, 2003). Por esta razón, los omega-3
suponen un mayor beneficio en patologías como la EA El hecho de encontrar
una reducción significativa en el nivel de AA tanto en plasma como en cerebro
en el grupo omega-3 con respecto al grupo control, indica una efectividad de la
dieta omega-3 en la composición lipídica de las membranas, que consigue
reducir el contenido en omega-6 propiciando el desarrollo de las propiedades
beneficiosas de los omega-3. Estos resultados se ven reforzados con la ausencia
Capítulo V. Discusión 258
de alteraciones en los niveles de ADH en plasma y con el incremento
significativo de ADH en cerebro, lo que favorece la hipótesis que establecimos de
una posible sustitución de los omega-6 por omega-3 en las membranas
cerebrales inducida por la dieta.
Los niveles de colesterol en cerebro disminuyeron de manera significativa en el
grupo omega-3 con respecto al grupo control, mientras que en plasma
únicamente las hembras transgénicas alimentadas con omega-3 experimentaron
este descenso. Teniendo en cuenta la mayor susceptibilidad de las hembras a
padecer la EA, y aunque la relación entre colesterol y esta patología permanece
aún por elucidar, estos resultados podrían considerarse muy positivos para la
aplicación de los AGPIs omega-3 en este modelo animal, puesto que no
solamente mejora la composición lipídica a nivel cerebral y plasmático, sino que
reduce la concentración de colesterol en ambos tejidos, y con ello la posibilidad
de favorecer la formación de depósitos A con la consecuente acumulación de
placas. Igualmente queda demostrada la capacidad de los omega-3 de la dieta
para cruzar la BHE.
En cuanto al análisis de los niveles de A -40 en cerebro, no se obtuvieron
diferencias relevantes entre ambos grupos alimentados con cada una de las
dietas. Las causas pueden ser varias: en primer lugar hay que tener en cuenta la
muerte prematura de los animales en torno a los 4 meses de edad, por causas
desconocidas y ajenas al estudio. Tratándose de un modelo que comienza a
desarrollar la patología de la EA alrededor de los 5 a 6 meses de edad, es muy
posible que las mejoras observadas a nivel plasmático y cerebral en cuanto a
niveles de colesterol y composición de ácidos grasos hubieran inducido una
reducción en los niveles cerebrales de A -40. Aunque podríamos alegar otra
causa: si en tan sólo 4 meses de edad se obtuvieron beneficios en el metabolismo
graso, los AGPIs omega-3 podrían ser efectivos únicamente en este sentido y
quizás no ser suficientes por sí solos para ejercer una mejora en el desarrollo de
la patología, planteándonos la búsqueda de otro compuesto con posibilidades
antioxidantes además de hipocolesterolemiantes que evitase una posible
peroxidación lipídica y que fuera un buen neuroprotector. Igualmente, nos
planteamos estudiar con mayor profundidad la relación entre los niveles de
Capítulo V. Discusión 259
colesterol y la EA en vista de que en este modelo no conseguimos establecer una
relación entre ambos parámetros. Si los cambios en la concentración de
colesterol en plasma altera el metabolismo de los esteroles en el SNC o si esos
cambios afectan la función cognitiva del cerebro o la incidencia de demencia, es
algo que permanece aún por esclarecer (Dietschy and Turley, 2001).
V.1.2. Estudios en ratones mutantes KOZACK-
colesterol 16.
Se llevaron a cabo estudios en un modelo mutante de la EA, que es un híbrido de
dos razas con niveles séricos de colesterol muy diferentes, C57 y C3H, que
posteriormente fue cruzado con el modelo transgénico simple PPA de la EA. Se
obtuvo una tendencia en los animales Kozack-Col16 –PPA a reducir los niveles
de colesterol en suero en comparación con los niveles observados en los
mutantes no transgénicos. Se observaron diferencias entre ambos géneros en la
acumulación de depósitos de amiloide, a nivel de los cortes
inmunohistoquímicos y en Nu-PAGE-Western blot frente a PPA y A , que
evidenciaron la mayor expresión de la patología en el grupo de las hembras
frente al grupo de los machos, confirmada por los valores obtenidos en la prueba
de ELISA para A (40 y 42). Aunque las diferencias en los niveles de colesterol
sérico entre los géneros no alcanzó significación estadística, quizás por el
reducido número de animales incluidos en el estudio, podemos hablar de una
tendencia en las hembras a presentar menores niveles de colesterol en suero que
los animales macho.
En definitiva, estos resultados nos hicieron continuar interesados en conocer la
relación entre colesterol y la EA, así como la influencia del género en el
desarrollo de la patología.
Capítulo V. Discusión 260
V.1.3. Estudios en modelo de ratón transgénico doble
PPA/PS1 de la EA.
Existen evidencias epidemiológicas, bioquímicas y genéticas que relacionan al
colesterol con la EA. Se ha demostrado que el colesterol modula el procesado de
PPA (Bodovitz and Klein, 1996) y que su contenido puede afectar a la actividad
de las secretasas (Wahrle et al., 2002). El colesterol es el esteroide más
prevalente en humanos y es producido en una multi-cascada, que comienza con
la acción de la -hidroxi- -metilglutaril CoA (HMG-CoA) sintasa y la HMG-CoA
reductasa. Èsta última es una de las dianas de las estatinas, un tipo de drogas
para reducir el colesterol y cuyo efecto benificioso en la EA continúa siendo hoy
día tema de controversia. En relación con estos resultados, hay numerosos
estudios que sugieren que el contenido en colesterol afecta al procesamiento de
PPA y a la generación de A , sin embargo la correlación aún no está bien
definida. Hay un par de estudios sobre la modulación de los niveles de colesterol
y la EA, en los que utilizaron dietas enriquecidas en colesterol o drogas
reductoras de colesterol (Sparks, 1997; Refolo et al., 2001). En el presente
estudio tratamos de elucidar la relación existente entre los niveles plasmáticos
de colesterol y los niveles cerebrales de A durante el envejecimiento normal,
mediante la medida de estos parámetros en ratones dobles transgénicos
PPA/PS1 (Blanchard et al., 2003; Schmitz et al., 2004) y ratones control no
transgénicos, todos ellos sin tratamiento y emparejados por género y edad.
Todos los animales PPA/PS1 mostraban abundantes depósitos de A en el
neuropilo del hipocampo, al igual que en regiones corticales. Los análisis de
varianza sobre los niveles de colesterol plasmático en los grupos de ratones
transgénicos (3, 8 y 13 meses de edad) revelaron una marcada reducción
conforme incrementaba la edad (P<0,005), aunque en el caso de los animales
no transgénicos no se observó ninguna diferencia en los niveles de colesterol
entre los 3 y los 13 meses de edad. Aunque los niveles cerebrales de esteroles,
incluyendo colesterol y sus precursores, no sufren modificaciones entre ratones
transgénicos PPA y no transgénicos durante el envejecimiento (Lutjohann et al.,
2002) se conoce muy poco sobre los niveles plasmáticos de colesterol. Sin
Capítulo V. Discusión 261
embargo, encontramos una diferencia significativa entre los PPA/PS1 de 13
meses y los no transgénicos de la misma edad lo que nos llevó a argumentar la
influencia del genotipo más que de la edad sobre los niveles de colesterol.
El análisis por ANOVA de los niveles de A 42 en la fracción extraída con ácido
fórmico reveló un incremento dramático en los transgénicos de 8 y 13 meses, en
comparación con el grupo de jóvenes transgénicos de 3 meses (P<0,0001).
Encontramos una correlación negativa y significativa (P<0,05) entre A 42 en
cerebro y colesterol en plasma en nuestro modelo, aunque el mecanismo por el
que el colesterol plasmático afecta a los niveles cerebrales de A 42 o viceversa,
actualmente permanece por determinar.
Mientras que la mayoría de los estudios utilizan ciertos protocolos para
influenciar el contenido en colesterol, mediante el uso de estatinas o mediante la
manipulación a través de la dieta, en nuestro estudio no se realizó ninguna
modificación con ese fin. Actualmente siguen existiendo algunas incógnitas en
torno a la relación existente entre los niveles plasmáticos de colesterol durante
el envejecimiento en pacientes de EA o en modelos animales de la enfermedad.
Un estudio clínico en pacientes de la EA y en sujetos controles no dementes,
concluyó que los niveles séricos de colesterol total y de LBD-colesterol estaban
asociados con una mayor deposición de A 42 en individuos con EA
neuropatológicamente confirmada (Kuo et al., 1998). Además observaron un
descenso significativo de los niveles de LAD-colesterol en el suero de pacientes
de la EA, mientras que Launer y colaboradores encontraron una correlación
positiva entre los niveles de LAD-colesterol en la tercera edad y el número de
placas neuríticas en el neocortex (Launer et al., 2001).
Entre los estudios realizados en animales, se han descrito resultados similares a
los nuestros realizados en ratones alimentados con dietas enriquecidas en
colesterol, que experimentaron un incremento significativo de los niveles
plasmáticos de colesterol y una reducción de los niveles cerebrales de A
cerebral (Howland et al., 1998) o de los niveles de A soluble del dominio
intracelular de PPA (George et al., 2004) mientras que en otro estudio
emplearon una dieta para inducir hipercolesterolemia y observaron un
incremento significativo de los niveles de A total (Refolo et al., 2000). Se han
Capítulo V. Discusión 262
realizado experimentos similares en conejos alimentados con ese tipo de dietas,
en los que la hipercolesterolemia incrementada la inmunorreactividad de A en
cerebro (Sparks et al., 1994) lo que genera la duda sobre si los diferentes
modelos animales son comparables. La reducción de colesterol mediante la
administración de un inhibidor de la síntesis de colesterol, se acompañó de la
reducción del procesamiento de PPA y como consecuencia de los niveles de A
en los ratones sometidos al tratamiento (Refolo et al., 2001). El tratamiento de
conejillos de indias con altas dosis de simvastatina resultó en reducidos niveles
de A en LCR (Fassbender et al., 2001). El tratamiento de ratones transgénicos
PPA con lovastatina, sin embargo, resultó en la reducción de los niveles
plasmáticos de colesterol pero incrementaba significativamente los niveles de
A 40 y A 42 en cerebro, al menos en ratones hembra (Park et al., 2003). Una
de las principales diferencias entre todos estos estudios en ratones transgénicos
PPA es la edad de los animales analizados. Se han empleado ratones muy
jóvenes (Refolo et al., 2001; Refolo et al., 2000) y animales de hasta 12 meses de
edad (George et al., 2004; Park et al., 2003) cuestionando la validez de la
comparación debido a las diferencias en los niveles hormonales. Los estudios
con ratones envejecidos encontraron una correlación significativamente
negativa entre los niveles de colesterol en suero (Park et al., 2003) o LAD-
plasmático (Shie et al., 2002) y A en cerebro. Todos los resultados asumen una
correlación negativa entre colesterol en suero/plasma y A en cerebro en las
hembras de ratón transgénico, lo que da una idea de la posible influencia del
género. Nuestros resultados coinciden con los estudios que han analizado
ratones PPA transgénicos envejecidos, ya que nosotros también hemos
encontrado esa correlación negativa, con una importante diferencia como es la
ausencia de tratamiento o de una dieta hipercolesterolémica. Se incluyeron
ratones no transgénicos en el presente estudio, para excluir la posibilidad de que
los efectos se debieran al simple envejecimiento, mientras que la mayoría de
estudios analizados únicamente comparan ratones tratados con no tratados.
Otro problema al intentar comparar los resultados de los estudios mencionados,
es la diversidad de los modelos de transgénicos empleados, desde transgénicos
simples PPA hasta transgénicos dobles PPA/PS1, que están basados en
Capítulo V. Discusión 263
diferentes composiciones genéticas. Nuestro modelo transgénico doble PPA/PS1
presentó una pérdida neuronal significativa cuando envejecieron (Schmitz et al.,
2004), que es una de las características que mejor refleja la patología de la EA
en relación con otros modelos transgénicos PPA, donde la pérdida neuronal no
ha sido confirmada. También utilizamos diferentes tiempos para analizar los
niveles de colesterol en plasma y los de A , mientras que la mayoría de los
estudios únicamente comparan ratones tratados y no tratados a un solo tiempo.
Esto no excluiría que haya cambios en el colesterol plasmático de otros ratones
PPA transgénicos a diferentes tiempos. Como ha sido descrito previamente, los
niveles de PPA completa, así como de C99, no se ven modificados durante el
envejecimiento en nuestro modelo, sin embargo, hay un fuerte incremento en la
deposición de A en los animales envejecidos (Blanchard et al., 2003). Se sabe
que A 40 oligomérico afecta al metabolismo del colesterol, provocando una
inhibición de la síntesis de colesterol y una reducción de sus niveles celulares de
una manera dosis y tiempo dependiente (Gong et al., 2002). La pregunta por
resolver es si los niveles circulantes de colesterol son capaces de regular los
niveles de A en cerebro. El hecho de encontrar una correlación negativa entre
ambos parámetros, y de carecer de los valores de colesterol en cerebro y de A
en plasma, deja la incógnita abierta mientras la compleja interacción entre A
cerebral y colesterol en plasma no esté plenamente establecida.
Capítulo V. Discusión 264
V.2. Estudios con DOPET
Tras los estudios realizados con AGPIs omega-3 en los que no conseguimos
observar un efecto neuroprotector aunque sí sobre el perfil lipídico, nos
planteamos la búsqueda de un compuesto natural que fuera capaz de cruzar la
barrera hematoencefálica y que presentara capacidad antioxidante, con objeto
de analizar su potencial neuroprotector y en un futuro poder trabajar con AGPIs
omega-3 y este compuesto antioxidante de manera conjunta.
Se realizó un screening entre numerosos extractos naturales y compuestos
polifenólicos, y finalmente se escogió un polifenol incluido en el aceite de oliva,
dadas las propiedades organolépticas y la potente capacidad antioxidante que
los polifenoles le confieren a esta grasa. El polifenol elegido fue el 2-(3,4-
dihidroxifenil)-etanol (DOPET), un o-difenol con declarado poder antioxidante
(Visioli, 2001b, de la Puerta et al., 2001), que nos pareció interesante estudiar
en mayor detalle por los beneficios descritos en la bibliografía, la importancia
del aceite de oliva en la sociedad actual, y el hecho de haber demostrado que
pasaba al cerebro nos abría la posibilidad de analizarlo como neuroprotector.
Por tanto, se plantearon una serie de estudios en relación a su capacidad
antioxidante, neuroprotectora e hipocolesterolemiante aplicándolo en sistemas
in vitro e in vivo.
Capítulo V. Discusión 265
V.2.1. Estudios de antioxidación.
Los radicales libres son mediadores del daño oxidativo en enfermedades
neurodegenerativas y uno de los marcadores de dicho daño es el MDA. El que
este tipo de marcadores contengan algún valor diagnóstico, es algo que debe
considerarse conforme progresa la enfermedad. Existe cierta evidencia sobre la
vinculación entre el incremento de los niveles periféricos de MDA y patologías
tipo EA y EP (Polidori et al., 2004).
La medición de los niveles de MDA es simple y económica, por lo que su
incorporación en los ensayos clínicos supondría una poderosa herramienta de
diagnóstico (Dib et al., 2002).
En un primer estudio in vitro se determinó la capacidad de DOPET para reducir
la producción de SRATs, marcador de lipoperoxidación. Los ensayos realizados
en presencia de DOPET revelaron la efectividad antioxidante del compuesto
frente al daño oxidativo provocado a las membranas cerebrales de rata.
A continuación se realizó un estudio en ratones alimentados con dietas
enriquecidas con colesterol y suplementadas con DOPET disuelto en el agua de
bebida, para determinar el efecto protector del compuesto sobre la peroxidación
lipídica provocada. Los grupos que recibieron DOPET mostraron una protección
significativa en los niveles plasmáticos de MDA, determinados mediante HPLC-
FLD.
En definitiva, estos resultados confirman la capacidad antioxidante del
compuesto tanto in vitro como in vivo, protegiendo a las membranas de un
daño oxidativo como la peroxidación lipídica.
Tras los estudios anteriores, se decidió analizar una de las actividades
enzimáticas que forma parte de las defensas antioxidantes naturales por la
eliminación del peróxido de hidrógeno formado en los tejidos, la catalasa. Se
utilizó el modelo de conejo creado para estudiar el efecto de DOPET sobre el
metabolismo del colesterol en esta Memoria, basado en la inducción de
aterogenia a través de la dieta para evaluar el beneficio de DOPET a 1 y 2 meses
de tratamiento. El hecho de ser un modelo sometido a un elevado estrés
Capítulo V. Discusión 266
oxidativo, nos pareció ideal para determinar la capacidad antioxidante del
compuesto sobre las membranas cerebrales, favoreciendo la actividad catalasa.
Sin embargo no se obtuvo ninguna diferencia significativa en los análisis de la
cinética de la enzima, quizás por el reducido período de tiempo del estudio, o
bien por la falta de eficacia del compuesto en este modelo a pesar de haber
demostrado su eficacia antioxidante en otros modelos animales como la rata y el
ratón.
V.2.2. Estudios de neuroprotección.
Basándonos en la capacidad antioxidante descrita para DOPET (Visioli, 2001b),
los resultados obtenidos para MDA y su capacidad para cruzar la BHE,
decidimos ampliar el conocimiento de las propiedades de este compuesto
mediante la determinación de su capacidad neuroprotectora en una serie de
ensayos in vitro utilizando diferentes concentraciones de DOPET frente a
diversos agentes oxidantes.
Se confirmó la efectividad del compuesto en concentraciones inferiores a 100
µM, favoreciendo la viabilidad celular. Sin embargo por encima de 100 µM el
preparado inducía muerte celular. Por tanto, se atribuyó capacidad
neuroprotectora al compuesto, dentro de las concentraciones permitidas.
La muerte celular puede tener lugar mediante procesos necróticos o apoptóticos.
Recientemente, se ha propuesto que han de ser otros mecanismos de muerte
celular diferentes a la clásica apoptosis los implicados en la progresión de las
enfermedades crónicas como la EA y la EP. La cascada intracelular que lleva a la
muerte neuronal en este tipo de patologías permanece aún por elucidar
(Jellinger and Stadelmann, 2001). Se ha descrito que DOPET puede inducir
apoptosis mediante el incremento de la fosforilación de Bcl-2 (proto-oncogén
humano localizado en el cromosoma 18) (Della Ragione et al., 2002).
Para verificar que la neurotoxicidad inducida por DOPET a concentraciones
superiores a 100 µM se debía a procesos apoptóticos, se llevó a cabo el ensayo
COMET, basado en la irradiación de un cultivo celular con UV-C, generadora del
daño en el material genético responsable de mutaciones y muerte por apoptosis.
Capítulo V. Discusión 267
Se estudió la capacidad de DOPET (100 µM), para modificar el tamaño de la
cola de ADN generada en las células irradiadas.
Se confirmó que la concentración empleada de DOPET generaba muerte por
apoptosis.
V.2.2.1. Modelo de excitotoxicidad con ácido kaínico: laberinto
acuático de Morris.
Uno de los rasgos más característicos y devastadores de la EA es la afectación
de la memoria, asociada fundamentalmente a la región cerebral denominada
hipocampo (Buckner, 2004). El laberinto acuático de Morris (LAM) es una
técnica muy efectiva para la evaluación del proceso conocido como
“empeoramiento de la memoria”, consistente en una prueba realizada en una
piscina dividida en 4 cuadrantes para evaluar la capacidad de aprendizaje y
memorización de los animales sobre la localización de una plataforma
sumergida en el agua, que les permite liberarse del estrés que el agua supone
para un roedor.
Se han descrito diferencias significativas entre las numerosas razas de ratón
que se utilizan normalmente para evaluar el neuro-comportamiento, ya que la
composición genética de cada especie conlleva una serie de rasgos propios
(Francis, 1995). La exposición prenatal a metilmercurio perturba a los ratones
Balb/c de manera distinta a la raza C57Bl/6J, alterando la actividad espontánea
de aquéllos y prolongando la latencia en la ejecución del LAM en éstos,
demostrando en definitiva las diferencias entre ambas razas (Kim et al., 2000a;
Wehner, 1988).
Ante la mayor sensibilidad de la raza Balb/c frente a pruebas como el LAM, se
decidió utilizar esta raza con la intención de comprobar si en un sistema tan
vulnerable DOPET era efectivo, para lo que se puso a punto un protocolo de
afectación hipocampal mediante la inyección intraperitoneal de Ácido kaínico
(AK), que es una neurotoxina que daña la memoria (Ben-Ari, 1985). Esto nos
permitió crear un modelo animal sobre el que determinar si DOPET era capaz
Capítulo V. Discusión 268
de prevenir de la pérdida de memoria y /o de mejorar el daño provocado por
AK.
Los datos recogidos en esta Memoria demuestran que el modelo funcionó, en
cuanto a que observamos un déficit de memoria en los animales que recibieron
AK, y que los animales sondados con DOPET ejecutaron el LAM correctamente
y de igual manera que los controles. Se obtuvo una diferencia significativa entre
los animales sometidos únicamente a AK y los que además de la toxina
recibieron la protección previa de DOPET, ya que estos últimoms mejoraron su
memoria y por tanto la ejecución de la prueba, lo que demostraba la efectividad
del compuesto en este modelo y en la neuroprotección frente al daño causado
con AK.
V.2.3. Microarrays en cerebro de ratones sondados con DOPET
Se ha descrito la capacidad de los compuestos fenólicos de la dieta para prevenir
de respuestas celulares vitales como la apoptosis y la diferenciación por
activación de una cascada de eventos moleculares. Existe un interés creciente
sobre la mejora de la eficacia de estos compuestos antioxidantes sobre dianas
terapéuticas (Narayanan et al., 2002).
Se decidió realizar un estudio genómico sobre la influencia de dos
concentraciones diferentes de DOPET en dos tejidos de ratón tan importantes
como cerebro e hígado. Para ello, se realizó un sondaje diario (n=15, 14 días)
para determinar el efecto de 1 mg y 10 mg del compuesto sobre la expresión
génica en esos tejidos.
Tras analizar todos los resultados obtenidos (ver tablas IV.10-12 en el capítulo
IV de esta Memoria), que demostraron que las dosis de DOPET utilizadas no
resultaron tóxicas, tanto por el mantenimiento de los pesos de los animales
como por la falta de influencia sobre genes implicados en procesos tóxicos, se
seleccionó la información relevante para la continuidad de esta Memoria,
resaltando la influencia de DOPET sobre la expresión de la Esterol-C5-
desaturasa (reprimido) y la del gen de la Mielina (sobreexpresado), ambos en
hígado.
Capítulo V. Discusión 269
V.2.4. Efecto de DOPET en un modelo animal de
Esclerosis Múltiple (EM).
La EM es una enfermedad desmielinizante crónica del SNC y es la mayor causa
de disfunción neurológica traumática en los adultos jóvenes. Las lesiones se
caracterizan por infiltraciones de linfocitos y macrófagos fundamentalmente,
así como por varios grados de pérdida axonal y desmielinización (Espejo et al.,
2001).
Tras haber obtenido mediante microarrays un efecto de DOPET sobre el gen de
la Mielina, que resultaba sobreexpresado en hígado por una dosis de 10 mg del
compuesto, y tras haber demostrado la capacidad antioxidante de DOPET en
varios sistemas, nos planteamos aplicarlo a un modelo de una enfermedad tan
compleja como la EM, en la que confluyen procesos de oxidación, inflamación y
neurodegeneración y donde la pérdida de la capa de mielina axónica es una de
las principales características de la patología.
Se eligió un modelo de EAE (Encefalitis Autoinmune Experimental), por tratarse
de un reconocido modelo animal con signos clínicos y lesiones que asemejan los
observados en la EM (Martin et al., 1992) para estudiar el efecto de DOPET sobre
los brotes de la enfermedad. Comenzamos analizando el efecto sobre el
neurocomportamiento y la progresión de la enfermedad de los animales. Los
resultados se basaron en la medición diaria de los scores de cada animal en cada
uno de los grupos (control y DOPET). Los datos recogidos mostraron una mejora
con tendencia a ser significativa en el grupo que recibió agua con DOPET frente
al grupo control, lo que sugiere el potencial de DOPET para disminuir la
incidencia de esta enfermedad en este modelo animal, aunque aquéllos animales
que enfermaron lo hicieron con la misma intensidad que los controles.
Capítulo V. Discusión 270
Los fármacos que se utilizan en la actualidad frente a la EM son
inmunosupresores, inmunomoduladores y antiinflamatorios, pero ninguno
de los tratamientos actuales contra la enfermedad utiliza antioxidantes como
DOPET, a pesar de existir numerosa bibliografía en la que DOPET aparece
únicamente como reactivo para la síntesis de compuestos aplicados a esta
patología pero no como componente único de un tratamiento. Nuestros
resultados confirman los argumentos que se propusieron hace un par de años
por Aruoma y colaboradores (Aruoma, 2003) sobre el potencial de sustancias
alimentarias como DOPET para combatir el estrés oxidativo en
enfermedades como la EM. Por tanto, con los resultados obtenidos nos
planteamos estudios futuros en este modelo animal, para analizar en mayor
detalle algunos de los parámetros bioquímicos marcadores de la patología,
que nos confirmaran la validez de DOPET como un potencial compuesto
terapéutico en la EM.
Capítulo V. Discusión 271
V.2.5. Estudios del metabolismo del colesterol.
El colesterol no esterificado es un componente estructural esencial de la
membrana plasmática de cada célula. Durante la evolución, esta membrana
pasó a ejercer un papel tremendamente especializado en el SNC como
componente principal de la arquitectura de la mielina compacta. Como
consecuencia, el SNC en los humanos contiene unos 23 mg colesterol /g de
tejido a pesar de suponer el 2,1% del peso corporal. En todos los animales, la
mayoría del proceso de crecimiento y diferenciación del SNC tiene lugar
durante los primeros años de vida, y el colesterol es necesario para ello,
proveniente de manera casi exclusiva de la síntesis de novo.
Se ha sugerido la relación directa entre los niveles plasmáticos de colesterol y la
incidencia de demencia, incluyendo la EA (Sparks et al., 1994; Evans et al.,
2000; Kivipelto et al., 2001). El tratamiento con agentes farmacéuticos que
reducen la concentración del colesterol plasmático parece asociarse con una
menor incidencia de tales demencias (Jick et al., 2000; Wolozin et al., 2000).
Sin embargo hay que enfatizar que la mayoría de estas asociaciones no han sido
verificadas en los estudios epidemiológicos más recientes y rigurosos. Por tanto,
de confirmarse la relación entre ambos parámetros, las lipoproteínas
transportadoras de colesterol (LAD y LBD) contribuirían de manera muy
destacada en los pools de colesterol de cerebro y médula espinal, afectando
directa o indirectamente al procesado de proteínas como la PPA o los receptores
de neurotransmisores (Howland et al., 1998).
Entre los objetivos de esta Memoria se encontraba el estudio de las
propiedades de DOPET como hipocolesterolemiante, tras los resultados
obtenidos en los microarrays que desvelaban su capacidad para reprimir al gen
de la Esterol-C5 desaturasa en hígado, que es una de las enzimas implicadas en
la formación de colesterol. Aparte de nuestros resultados, algunas referencias
previas apoyan la capacidad del compuesto para inhibir la peroxidación
provocada por la oxidación de las LBD (Salami, 1995), por lo que nos
propusimos desarrollar una serie de ensayos in vitro e in vivo para determinar
su influencia en el metabolismo del colesterol.
Capítulo V. Discusión 272
V.2.5.1. Estudios sobre LC5D.
Los resultados obtenidos en el estudio con Microarrays realizados con el
compuesto, nos llevaron a estudiar la enzima Latosterol –C5 desaturasa, cuyo
gen fue reprimido en hígado por la dosis más elevada de DOPET (10 mg).
LC5D es una enzima implicada en el metabolismo del colesterol, mediando la
transformación de latosterol en 7-DHC, que posteriormente se convierte en
colesterol. Por tanto, la inhibición en ese punto del metabolismo podría resultar
de interés para evitar un incremento en los niveles de colesterol.
Se determinó la IC50 de DOPET para la LC5D para conocer la potencia de la
inhibición ejercida, y se obtuvo un valor igual a 187 µM, lo que indica que
DOPET es capaz de inhibir la enzima, pero que es necesaria una cantidad
relativamente elevada del compuesto para lograrlo. Estos datos concuerdan con
los resultados obtenidos en el análisis de la influencia sobre la expresión génica,
en los que la dosis más alta (10 mg) era la más efectiva en la inhibición de este
gen.
Para concluir el estudio bioquímico de esta enzima, se determinó su Km
mediante la realización de una curva patrón y mediciones de la concentración
del producto de reacción (7-DHC) mediante HPLC frente a diferentes
concentraciones de sustrato (latosterol). Se obtuvo un valor de Km igual a 157,3
µM.
Capítulo V. Discusión 273
V.2.5.2. Efecto de diferentes dietas en el metabolismo del
colesterol de conejos.
A continuación se llevaron a cabo una serie de experimentos en conejos,
alimentados a dos tiempos (30 y 60 días) con dieta control y/o aterogénica, para
evaluar el efecto de DOPET sobre una serie de parámetros bioquímicos
relacionados con el metabolismo del colesterol (colesterol total, LAD y
triglicéridos en plasma y colesterol y latosterol en cerebro). De todos los
modelos animales, se escogió el conejo por la rapidez y facilidad con que
desarrollan un perfil aterogénico mediante la alimentación (Moghadasian,
2002). Los resultados obtenidos en plasma demostraron la eficacia del
tratamiento con DOPET durante 60 días respecto al resto de grupos controles y
aterogénicos, ya que se obtuvo un descenso significativo en los niveles de
colesterol total, LAD-colesterol y triglicéridos. En cuanto a los niveles de
colesterol en cerebro no se observaron diferencias significativas en ningún
grupo, lo que atribuimos a la reducida duración del estudio (2 meses) en
comparación con la vida media del colesterol en cerebro (6 meses). Este motivo
pudo ser suficiente para no permitirnos observar ningún efecto, ya que los
análisis de los niveles de latosterol, precursor de colesterol y de vida media más
reducida que éste, fueron muy diferentes, ya que se obtuvo una reducción
significativa en los niveles de latosterol para los animales suplementados con
DOPET (30 y 60 días), lo que indicaba la efectividad del compuesto para
modificar el perfil lipídico en plasma y en cerebro de animales sometidos a un
estrés oxidativo provocado por la dieta.
Capítulo V. Discusión 274
V.2.6. Efecto de DOPET sobre la captación de dopamina y
norepinefrina in vitro.
En base a la similitud molecular de DOPET (2, 3-4 dihidroxifeniletanol;
C8O3H10) y la molécula de Dopamina (DA; C8H11NO2), se pensó que DOPET podría
estar implicado en el metabolismo de la DA, participando en reacciones
catabólicas de eliminación de la DA catalizadas por la enzima MAO, y/o en
procesos de reconocimiento por parte de los transportadores de monoaminas
(transportador de DA y transportador de Norepinefrina). El hecho de obtener
un efecto de este compuesto sobre las posibles vías de retirada de DA, podría ser
de utilidad terapéutica en patologías como la EP, donde la inhibición de la
actividad Monoamino Oxidasa (MAO) o la potenciación de la captación de DA
por parte de sus receptores suponen dos puntos clave en la búsqueda de terapias
para la enfermedad.
El presente estudio se realizó en colaboración con la Dra. S. Hilfiker
(Universidad de Manchester, Inglaterra). Se diseñó para probar los efectos de
DOPET en la captación y liberación de dopamina (DA) desde las células PC12.
Este sistema celular es un modelo catecolaminérgico muy útil, que contiene
todas las proteínas relevantes para el transporte y metabolismo de DA y NE, y es
un excelente modelo para elucidar los efectos de compuestos noveles sobre la
captación, secreción y degradación de monaminas.
Los resultados obtenidos en los ensayos realizados demuestran que DOPET es
un compuesto potente incrementado las cantidades tanto de DA como de NE
intracelulares. Los principales puntos que evidencian el papel de DOPET en la
regulación del TNE, transportador de membrana plasmática antidepresivo y
cocaína-sensible Na+/Cl-Norepinefrina dependiente, fueron:
a) Al añadir DOPET a las células tras la carga con DA o NE radiomarcadas, el
compuesto resultaba inefectivo.
b) El principal transportador expresado en la superficie de las células PC12 no
diferenciadas es TDA. Tras la diferenciación con el factor de crecimiento
nervioso, tanto TNE como TDA mostraron un incremento en su localización en
el interior de las neuritas (Kadota et al., 1996; Kippenberger et al., 1999), con el
Capítulo V. Discusión 275
concomitante aumento en el consumo de radio-marcaje, sugiriendo un aumento
en el número de transportadores localizados en la membrana plasmática. Los
efectos de DOPET sobre la cantidad captada de DA-radiomarcada siempre
fueron menos pronunciados que aquéllos observados con NE-radiomarcada. Se
ha descrito que mientras que TDA solamente media la captación de DA, TNE
transporta DA y NE (Moron et al., 2002). Por tanto, los efectos de DOPET sobre
el consumo de DA podrían estar mediados por un efecto del compuesto sobre
TNE, que también transporta DA.
c) No se obtuvieron efectos de DOPET sobre la captación de serotonina.
d) Algunos inhibidores de MAO no tuvieron ningún efecto sobre la captación de
catecolaminas radiomarcadas, lo que reveló el incremento en DA marcada
dentro de las células no se debía a la inhibición de MAO. La MAO-A asociada a
las células PC12 ha demostrado ser sensible a clorgilina (IC50 1) (Youdim et al.,
1986; Tatton et al., 1994) y completamente inhibida a 15 µM. Aunque es un
hecho bien establecido que los inhibidores de MAO-A y MAO-B ejercen efectos
neuroprotectores en neuronas y células PC12 (Youdim et al., 2001; Boland et al.,
2002), estos efectos únicamente se observaban bajo prolongadas incubaciones y
de manera no tan acusada como los efectos de DOPET. Por tanto, si DOPET era
capaz de permitir la captación de DA en presencia de inhibidores específicos de
MAO, indicaba que el compuesto debía favorecer la actividad de los
transportadores.
Sin embargo hay otras dianas posibles, como la Catecol-O-metiltransferasa
(COMT), por dos razones: En primer lugar, la actividad COMT en células PC12
es muy elevada. Aunque las catecolaminas sean secuestradas muy rápidamente
desde el citosol al interior de las vesículas localizadas en las terminales
nerviosas, las catecolaminas radiomarcadas que permanecen en el citosol
pueden ser metabolizadas por COMT para formar un producto lipofílico capaz
de cruzar la membrana plasmática y abandonar las células por difusión.
En segundo lugar, la COMT de las PC12 puede ser inhibida por 1 mM de
tropolona (Tuler et al., 1989). Al aplicar tropolona durante 1 h, incrementa en
un 30% los niveles intracelulares de DA y NE radiomarcadas en células crecidas
en un medio completo.
Capítulo V. Discusión 276
La inhibición de COMT puede aumentar significativamente la acumulación
intracelular de los sustratos de la enzima (DA y NE pero no serotonina)
(Eshleman et al., 1997), pero hay que reseñar que estos estudios se han
realizado en líneas celulares con actividad COMT endógena y que expresan los
transportadores aminos por recombinación. Es probable que en otro tipo de
células como las PC12, el secuestro de catecolaminas en vesículas pudiera, al
menos en parte, prevenir semejante incremento.
En resumen, los resultados de este estudio indican que DOPET podría actuar
modulando el TNE, que es uno de los lugares de acción de un rango de drogas
con potencial terapéutico. Bajo condiciones patológicas, los cambios en la
función de TNE podrían actuar en la progresión de enfermedades como el fallo
cardiaco, asociado con la reducción en la función y densidad de TNE. Una
intervención dirigida a la mejora de TNE en esta patología cursaría con efectos
beneficiosos. Finalmente, el esquema del modo de actuación propuesto para
DOPET en este estudio se muestra en la figura E.1.
Capítulo V. Discusión 277
Figura E.1.: Mecanismo de acción propuesto para DOPET en células PC12.
El posible mecanismo de acción de DOPET consistiría en la activación del
transportador TNE que introduciría NE y DA en la célula, facilitando así la
incorporación de éstos en vesículas. No se ha demostrado que esta acción pudiera ser
llevada a cabo a través de la activación de TDA. Por otra parte, DOPET inhibiría la
actividad MAO, responsable de la degradación de DA. DBH= Dopamina-beta-
hidroxilasa
Existe un elevado volumen de estudios focalizados en la búsqueda de
inhibidores de la actividad Monoamino oxidasa, y algunos de ellos demuestran
la efectividad de algunos compuestos (fenólicos y alcaloides) en la inhibición de
MAO (Kong et al., 2004). Sin embargo, hasta la fecha no se ha analizado la
capacidad de un compuesto como DOPET, relacionado estructuralmente con la
Dopamina y sus metabolitos, para inhibir a la MAO.
Tras los resultados anteriores, se realizaron una serie de ensayos in vitro con
mayores concentraciones de DOPET, para determinar la concentración capaz de
NE + DA DA Extacelular
TNE TDA
Intracelular
+
DOPET NE + DA
+
DOPET
vesículas
?
DOPET
MAODOPAL
APOPTOSIS
DOPET
DA HVACOMT
NE
-
DBHNE DA
Capítulo V. Discusión 278
inhibir el 50% de actividad enzimática MAO-B (IC50), aislada en mitocondrias
de cerebro de rata. En base a la hipótesis propuesta como mecanismo de acción
(Figura E.1), en la que DOPET podría actuar facilitando la internalización de DA
y evitando la degradación de la misma mediante la acción de la MAO, y en base
a los estudios que avalan la efectividad de algunos compuestos fenólicos como
inhibidores de MAO, analizar la capacidad de DOPET como inhibidor de la
MAO-B.
Todos los ensayos se realizaron por triplicado y con un amplio rango de
concentraciones de DOPET para determinar finalmente que se trata de un
compuesto con un elevado potencial inhibidor sobre la actividad MAO-B en
cerebro (IC50 = 16,3), lo que sugiere que el compuesto presenta un potencial
inhibidor sobre MAO suficiente para ser estudiado en mayor detalle en un
futuro.
VI. CONCLUSIONES
Capítulo VI. Conclusiones 280
Tras la realización de esta Memoria, se establecieron las siguientes
conclusiones:
A. Para establecer la relación entre colesterol y la EA:
1) Una dieta dieta enriquecida con AGPIs omega-3 (Eicosapentaenoico y
Ácido Docosahexaenoico, EPA y ADH respectivamente) es capaz de mejorar
el perfil lipídico en un modelo de ratón transgénico simple PPA de la EA. Se
obtuvo una reducción en los niveles de colesterol plasmático y cerebral, que
reportaría los beneficios derivados de un bajo contenido de colesterol en las
membranas, como podría ser una menor producción de A a partir de PPA,
lo que favorecería el procesado normal de la proteína y con ello la
disminución del riesgo de desarrollar la patología. Así mismo, se observó una
sustitución de los ácidos grasos omega-6 por los omega-3 en las membranas
celulares plasmáticas y cerebrales, gracias a una disminución del contenido
en Ácido Araquidónico (AA, omega-6) y a un incremento en ADH y EPA
(omega-3). Pero no solamente se obtuvieron diferencias entre la dieta control
y la dieta enriquecida en omega-3, sino que se comprobaron tanto diferencias
de genotipo como de género. En relación al genotipo, los animales
transgénicos que recibieron dieta omega-3 mejoraron sus niveles de
colesterol y ADH en relación a los transgénicos con dieta control, lo que
indica una influencia de la sobreexpresión de PPA que en este caso los hizo
más susceptibles a los beneficios de la dieta enriquecida, lo que podría haber
supuesto una mejora en la deposición de amiloide si el estudio hubiera
podido llegar a término. En cuanto a la diferencia de géneros, destacable la
mejora observada en las hembras transgénicas om-3, que no solo mejoraron
su perfil lipídico respecto a los machos, sino que mostraron tendencia a
reducir los niveles de A -40. Todos estos datos refuerzan las ventajas de la
suplementación con una dieta omega-3 en un modelo animal de la EA, ya que
un incremento en la relación om-3:om-6 supone una mejora en funciones
cognitivas como el aprendizaje y la memoria [Hashimoto, 2002 #342] y el
hecho de encontrar un mayor beneficio en las hembras PPA, unida a la mayor
prevalencia de la EA en este género, reforzaría la suplementación de este tipo
de ácidos grasos en esta patología.
Capítulo VI. Conclusiones 281
2) Los estudios realizados en diferentes modelos transgénicos de la EA
(mutantes Kozack-colesterol16 y transgénicos dobles PPA/PS1) para analizar la
relación entre los niveles de colesterol en sangre y los de péptido A en cerebro,
ponen de manifiesto que el género femenino era el más proclive a la
manifestación de la patología. Así mismo, se obtuvo una correlación negativa
entre los parámetros estudiados: conforme progresaba la enfermedad,
incrementaban los depósitos de amiloide en cerebro (demostrado mediante
prueba ELISA y micro-secciones) y disminuían los niveles de colesterol en
sangre. Estos resultados son contrarios a los descritos en algunos estudios
[Refolo, 2001 #36][Simons, 1998 #32] [Sparks, 1994 #21] pero coinciden con los
observados por otros autores [Howland, 1998 #4] [George, 2004 #14] [Park,
2003 #5] lo que genera la duda sobre si los diferentes modelos animales son
comparables y la verdadera relación entre colesterol y nivel de amiloide. Hay que
tener en cuenta las diferencias entre todos estos estudios y con respecto al
nuestro, tanto en los tratamientos empleados como las edades de los animales, lo
que llevaría a la conclusión que realmente la relación entre colesterol, A y
parámetros como la edad y el género permanece aún por elucidar.
B. Efecto neuroprotector de DOPET en sistemas in vitro e in vivo.
3. Un compuesto natural presente en el aceite de oliva como el 2-(3,4-
dihidroxifenil)-etanol (DOPET) es capaz de atravesar la BHE en menos de 5
minutos y permanecer en el cerebro durante 1 h. Se ha puesto de manifiesto su
capacidad antioxidante mediante HPLC-ABTS y su potencial neuroprotector
hasta concentraciones de 100 µM en sistemas in vitro.
Se ha demostrado la capacidad antioxidante de DOPET, reduciendo el daño
oxidativo provocado por peroxidación lipídica mediante la disminución de los
niveles de MDA tanto in vitro como in vivo. Por tanto, se puede establecer que
el compuesto tiene propiedades neuroprotectoras debidas en gran medida a su
capacidad antioxidante.
Capítulo VI. Conclusiones 282
4. Se ha conseguido demostrar un efecto neuroprotector de DOPET en un
modelo de excitotoxicidad provocado por la inyección de ácido kaínico (AK)
que fue capaz de alterar la memoria en ratones sometidos a la ejecución del
Laberinto acuático de Morris. Los animales pretratados con DOPET e
inyectados posteriormente con AK demostraron aprender la prueba al igual
que los controles. El interés de este estudio es doble, por el efecto
neuroprotector del compuesto sobre el hipocampo dañado con la
neurotoxina, y por tratarse de una raza de ratón descrita como muy sensible
al estrés causado por este tipo de pruebas, por lo que haber observado un
efecto a pesar de no ser la raza más recomendada para pruebas de memoria,
incrementa el valor de los resultados obtenidos.
En base a estudios sobre la influencia de DOPET en la expresión génica de
hígado y cerebro mediante microarrays, se observó que el compuesto era
capaz de inducir la sobreexpresión del gen de la Mielina, por lo que se analizó
el efecto de DOPET en un modelo animal de Encefalitis Autoinmune
Experimental, modelo animal de Esclerosis Múltiple crónica. Se demostró la
efectividad de DOPET para mejorar la incidencia y duración de los brotes de
la enfermedad.
Por tanto, ambos estudios in vivo reforzaron la capacidad neuroprotectora de
DOPET y su potencial para ser utilizado como complemento en terapias
frente a enfermedades como la EM.
5. Basándonos en la inhibición de DOPET sobre el gen de la Esterol-C5-
desaturasa, revelada por los microarrays en hígado, se llevaron a cabo
estudios en la enzima Latosterol-C5 desaturasa, responsable de la
transformación de latosterol en 7-DHC, precursor del colesterol,
confirmando la capacidad de DOPET para inhibir la enzima en los ensayos
realizados in vitro.
Capítulo VI. Conclusiones 283
Por tanto, se analizó la capacidad de DOPET para modificar el metabolismo del
colesterol en un modelo de aterogenia en conejos, alimentados con dietas
suplementadas con DOPET durante 30 y 60 días. Se obtuvo una mejora en el
perfil lipídico plasmático de los animales suplementados con DOPET durante 60
días, mediante la reducción de los niveles de colesterol total, LAD-colesterol y
triglicéridos. Aunque no se observó ninguna diferencia en el contenido de
colesterol cerebral en los diferentes grupos de conejos, el hecho de observar una
reducción en los niveles de latosterol en cerebro, precursor del colesterol de
menor vida media, parece demostrar que el compuesto era efectivo en la mejora
del metabolismo del colesterol en plasma y en cerebro.
6. En estudios realizados con DOPET y su efecto en el metabolismo de las
catecolaminas, por razones de similitud estructural-molecular con la Dopamina,
sugieren que DOPET podría modular al transportador de Norepinefrina (TNE)
más que al de Dopamina, lo que podría actuar en la progresión de enfermedades
como el fallo cardiaco, asociado con la reducción en la función y densidad de
TNE. Tras la ausencia de efecto sobre la Dopamina, se determinó la IC50 de
DOPET para la actividad MAO-B en cerebro e hígado, demostrando su potencial
inhibidor sobre esta enzima, responsable de la degradación de la Dopamina,
pieza clave en la Enfermedad de Parkinson.
VII. PROYECTOS DE FUTURO
Capítulo VII. Proyectos de futuro 285
La realización de esta Memoria ha dejado una serie de preguntas que no
pudieron ser abordadas por falta de tiempo en el período destinado para la
ejecución de la misma, 4 años. Por tanto, se han planteado a modo de planes
para el futuro.
1) Relación entre el colesterol y A en modelos animales de la
Enfermedad de Alzheimer (EA). Hasta la fecha se han realizado numerosos
estudios a este respecto, pero continúa existiendo cierta controversia al respecto.
Los estudios realizados en esta Memoria han demostrado que el incremento de
amiloide iba acompañado de un descenso en colesterol sanguíneo (estudios en
mutantes y ratones PPA/PS1) o bien el descenso de colesterol cerebral no
pareció modificar los niveles de amiloide (probablemente porque el modelo
utilizado, ratón con dieta omega-3, no pudo completar el desarrollo de la
enfermedad). Por tanto, la ejecución de los 3 estudios en modelos animales de la
EA, nos hizo plantearnos la necesidad de analizar un modelo de la EA sin
tratamientos o dietas que alterasen los niveles naturales de colesterol, evaluando
ambos géneros, a diferentes edades y con animales controles no transgénicos
para considerar la influencia del genotipo. Se analizaría colesterol y amiloide,
ambos parámetros a nivel sérico y cerebral, realizando mediciones del contenido
en 24-S-hidroxicolesterol cerebral y plasmático, por tratarse de la forma en que
el colesterol cerebral pasa a sangre, con objeto de establecer el intercambio entre
ambos tejidos y conocer cómo el desarrollo de la patología afecta al metabolismo
de colesterol en sangre y en cerebro y su correlación con los niveles de amiloide.
2) Efecto de una dieta suplementada con DOPET y AGPIs omega-3 a
un modelo animal de la EA. Estudiar el efecto conjunto de dietas
suplementadas con AGPIs omega-3 y DOPET disuelto en el agua de bebida, en
un modelo de ratón de la EA, nos permitiría unificar los beneficios sobre el
metabolismo del colesterol de ambos componentes y la capacidad antioxidante
de DOPET para analizar todos los parámetros relacionados con la patología
(micro-secciones teñidas frente PPA y A ; ELISA A y niveles séricos y
cerebrales de colesterol).
Capítulo VII. Proyectos de futuro 286
3) Suplementar con DOPET un modelo animal de Esclerosis
Múltiple (EM) para estudios bioquímicos. El estudio realizado en esta
Memoria demostró una mejora significativa en los brotes de los animales,
por lo que sería muy interesante disponer de este modelo, suplementado con
DOPET a diferentes tiempos, y analizar parámetros bioquímicos e
inmunohistoquímicos, realizando micro-secciones de cerebro y médula
espinal para determinar la inmunorreactividad a la óxido nítrico sintasa
inducible (ONSi). Se trata de una enzima que produce óxido nítrico, aparece
en células microgliales y macrófagos y se expresa en las placas,
contribuyendo a la patología de la enfermedad (Hill et al., 2004). Así mismo,
también podrían realizarse una tinción mediante TUNEL (para detectar la
fragmentación del ADN por apoptosis) y triple fluorescencia para marcar los
macrófagos y astrocitos reactivos.
4) Administrar DOPET y ácido kaínico a ratas para realizar el
laberinto acuático de Morris. Para confirmar la efectividad del
compuesto en uno de los animales considerados más inteligentes para la
ejecución de pruebas de memoria y neuro-comportamiento, se realizaría el
mismo protocolo de tratamientos con AK y DOPET, e incluso durante más
largo tiempo para comprobar si la mejora de la memoria se mantendría con
el paso de varias semanas entre una prueba y la siguiente.
5) DOPET y el metabolismo de las catecolaminas. Hasta la fecha no
se ha descrito la aplicación de un compuesto como DOPET en la patología de
la EP. Tan sólo hay un par de artículos en la bibliografía que asocian a
DOPAL (precursor de DOPET) con el incremento del estrés metabólico en
células PC12 (Burke et al., 2003; Lamensdorf, 2000a). La ausencia de
estudios, junto con nuestros resultados, nos llevaría a la utilización de un
modelo de la EP, ratones de la raza C57Bl6 inyectados con la neurotoxina
MPTP (1-metil-4-fenil-1,2,3,6-tetrahidropirindina), para analizar el efecto de
la suplementación con DOPET, evaluando tanto los rasgos propios asociados
con la aplicación de la neurotoxina (rigidez, temblor de reposo) como
parámetros inmunohistoquímicos en micro-secciones de sustancia negra,
para evaluar la protección ejercida por DOPET en estos animales.
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