i

LAURA ALONSO

Caracterização do complexo proteico da RBP CAPRIN-1

Campinas

2015

ii

iii

iv

Ficha catalográficaUniversidade Estadual de Campinas

Biblioteca do Instituto de BiologiaGustavo Lebre de Marco - CRB 8/7977

Alonso, Laura, 1988- AL72c AloCaracterização do complexo proteico da RBP CAPRIN-1 / Laura Alonso. –

Campinas, SP : [s.n.], 2015.

AloOrientador: Katlin Brauer Massirer. AloDissertação (mestrado) – Universidade Estadual de Campinas, Instituto de

Biologia.

Alo1. Grânulos citoplasmáticos. 2. Proteínas de ligação a RNA. 3. Proteína

CAPRIN1 humana. I. Massirer, Katlin Brauer. II. Universidade Estadual deCampinas. Instituto de Biologia. III. Título.

Informações para Biblioteca Digital

Título em outro idioma: Characterization of the protein complex of the RBP CAPRIN-1Palavras-chave em inglês:Cytoplasmic granulesRNA-binding proteinsCAPRIN1 protein, humanÁrea de concentração: Genética Animal e EvoluçãoTitulação: Mestra em Genética e Biologia MolecularBanca examinadora:Katlin Brauer Massirer [Orientador]Daniel Martins de SouzaCláudia Vianna Maurer MorelliData de defesa: 25-06-2015Programa de Pós-Graduação: Genética e Biologia Molecular

Powered by TCPDF (www.tcpdf.org)

iv

v

vi

vii

1 Resumo

Proteínas de ligação à RNA (RNA-Binding Proteins RBPs) fazem parte de complexos proteicos a fim

de guiar o metabolismo de mRNAs e exercerem regulação de eventos pós-transcricionais como

localização de mRNA e tradução. CAPRIN1 é uma RBP citoplasmática capaz de induzir grânulos de

estresse citoplasmáticos e está presente em complexos dendríticos com função de transporte para

tradução localizada. Para tentar elucidar a função molecular de CAPRIN1 em grânulos

citoplasmáticos, foi caracterizado o complexo proteico atuante com CAPRIN1. A fim de identificar os

interagentes no complexo, primeiramente foi superexpressa a proteína de fusão FLAG-CAPRIN1 em

células humanas HEK293T, posteriormente CAPRIN1 foi imunoprecipitada com anticorpo anti-FLAG

e seus interagentes foram analisados por espectrometria de massas. Esta técnica identificou 62

proteínas co-precipitadas, das quais, 63% (36) são RBPs com função enriquecida em processamento

de mRNA e regulação de estabilização de mRNA. Como uma das funções sugeridas para grânulos

de estresse é a triagem de mRNAs para estabilização e degradação por grânulos de degradação (P-

bodies), escolhemos 9 interações com proteínas com função em regulação de estabilização para

avaliarmos as interações. A interação com IGF2BP1 e PABPC1, foram confirmadas por co-

imunoprecipitação, e IGF2BP1 interage com CAPRIN1 de modo dependente de RNA. Juntos, estes

resultados indicam que CAPRIN1 realiza importante função em estabilização de mRNAs-alvo.

viii

ix

2 Abstract

RNA binding proteins (RBPs) can be part of large protein complexes and they function by guiding

mRNA metabolism and by regulating post-transcriptional events such as mRNA localization and

translation. CAPRIN1 is a cytoplasmatic RBP capable of inducing cytoplasmic stress granules and

present in dendritic complexes for localized translation. In order to understand the molecular role of

CAPRIN1 in cytoplasmic granules we characterized its protein complex. To identify the partners in the

complex, we first overexpressed FLAG-CAPRIN1 in human HEK293T cells, then immunoprecipitated

CAPRIN1 with a anti-FLAG antibody and assayed protein interactors with mass spectrometry. This

approach identified 62 co-precipitated proteins, of which 63% (36) are RBPs with an enriched function

in mRNA processing and regulation of mRNA stability. As one of the suggested functions of stress

granules is mRNAs triage for stabilization or degradation by cellular P-bodies, we have chosen 9

interactors with function in regulating stability for binding evaluation. The interaction with IGF2BP1

and PABPC1, were confirmed by co-immunoprecipitation, and IGF2BP1 interacts with CAPRIN1 in a

RNA-dependent manner. Taken together, these results indicate that CAPRIN1 functions importantly

in mRNA stabilization.

x

xi

Índice Geral

1   Resumo  ......................................................................................................................................  vii  

2   Abstract  .......................................................................................................................................  ix  

DEDICATÓRIA  ...................................................................................................................................  xv  

AGRADECIMENTOS  .........................................................................................................................  xvii  

3   ABREVIATURAS  E  SIGLAS  ..........................................................................................................  xxiii  

4   Introdução  ....................................................................................................................................  1  

4.1   Proteínas  de  ligação  a  RNA  (ou  RNA  binding  proteins  –  RBPs)  .............................................................  1  

4.2   Perfil  de  Expressão  e  fenótipos  relacionados  a    RBP  CAPRIN1  ..............................................................  2  

4.3   Funções  propostas  para  CAPRIN1  ........................................................................................................  3  

4.4   CAPRIN1  e  a  formação  de  grânulos  citoplasmáticos  de  RNA  ................................................................  5  

5   Objetivos  ......................................................................................................................................  7  

5.1   Objetivo  Geral  .....................................................................................................................................  7  

5.2   Objetivos  específicos  ...........................................................................................................................  7  

6   Métodos  .......................................................................................................................................  8  

6.1   Condições  de  cultivo  de  células  HEK293T  ............................................................................................  8  

6.2   Teste  de  eficiência  de  transfecção  .......................................................................................................  9  

6.3   Clonagem  da  ORF  correspondente  a  proteína  CAPRIN1  .....................................................................  10  

6.4   Obtenção  do  cDNA  referente  a  proteína  CAPRIN1  .............................................................................  10  

6.4.1   Extração  de  RNA  .................................................................................................................................  10  

6.4.2   Transcrição  reversa  (RT)  .....................................................................................................................  10  

6.4.3   PCR  .....................................................................................................................................................  11  

xii

6.4.4   Purificação  do  gel  ...............................................................................................................................  12  

6.4.5   Digestão  do  produto  de  PCR  para  clonagem  ......................................................................................  12  

6.5   Preparação  do  plasmídeo  ..................................................................................................................  13  

6.5.1   Digestão  do  plasmídeo  para  clonagem  e  purificação  .........................................................................  13  

6.5.2   Ligação  do  inserto  ao  vetor  ................................................................................................................  13  

6.5.3   Transformação  em  bactéria  DH5-­‐alpha  .............................................................................................  14  

6.5.4   PCR  de  colônia  para  verificação  da  presença  de  inserto  ....................................................................  14  

6.5.5   Purificação  dos  plasmídeos  (miniprep)  ..............................................................................................  14  

6.5.6   Sequenciamento  ................................................................................................................................  15  

6.6   Superexpressão  da  proteína  teste  GFP  e  avaliação  de  eficiência  de  transfecção.  ...............................  15  

6.6.1   Padronização  de  Transfecção  e  Eficiência  de  Transfecção  .................................................................  15  

6.6.2   Extração  de  proteínas  .........................................................................................................................  16  

6.6.3   Quantificação  das  proteínas  ...............................................................................................................  16  

6.6.4   Western  Blot  ......................................................................................................................................  16  

6.7   Imunoprecipitação  com  proteína  teste  GFP  .......................................................................................  17  

6.8   Avaliação  da  localização  da  proteína  CAPRIN1  em  comparação  a  GFP  ...............................................  18  

6.8.1   Transfecção  ........................................................................................................................................  18  

6.8.2   Imunofluorescência  ............................................................................................................................  19  

6.9   Superexpressão  da  proteína  CAPRIN1  e  avaliação  de  eficiência  de  transfecção  .................................  19  

6.9.1   Transfecção  ........................................................................................................................................  19  

6.9.2   Extração  de  proteínas  .........................................................................................................................  20  

6.10   Imunoprecipitação  da  proteína  CAPRIN1  para  análise  por  espectrometria  de  massas  .....................  20  

6.11   Preparação  de  Amostras  Para  Espectrometria  de  massas  ................................................................  21  

6.11.1   Digestão  proteica  .............................................................................................................................  21  

6.11.2   Dessalinização  ..................................................................................................................................  21  

xiii

6.11.3   Espectrometria  de  massas  ...............................................................................................................  22  

6.12   Validação  e  caracterização  de  interações  proteicas  .........................................................................  22  

6.12.1   Co-­‐imunoprecipitação  da  proteína  CAPRIN1  superexpressa  ...........................................................  23  

6.12.2   Co-­‐Imunoprecipitação  de  proteínas  endógenas  e  tratamento  com  RNase  .....................................  23  

7   Resultados  e  Discussão  ...............................................................................................................  25  

7.1   Avaliações  celulares,  preliminares  a  superexpressão  da  proteína  CAPRIN1  .......................................  25  

7.2   Clonagem  da  ORF  correspondente  a  proteína  CAPRIN1  .....................................................................  29  

7.3   Avaliação  da  superexpressão  das  proteínas  GFP  e  CAPRIN1  ..............................................................  34  

7.4   Avaliação  da  localização  celular  da  proteína  CAPRIN1  em  comparação  a  GFP  ....................................  36  

7.5   Imunoprecipitação  com  proteína  teste  GFP  .......................................................................................  38  

7.6   Imunoprecipitação  da  proteína  CAPRIN1  ...........................................................................................  39  

7.6.1   Transfecção  ........................................................................................................................................  39  

7.6.2   Imunoprecipitação  .............................................................................................................................  39  

7.7   Espectrometria  de  massas  .................................................................................................................  41  

7.8   Validação  e  caracterização  de  interações  proteicas  ...........................................................................  45  

8   Conclusões  e  Perspectivas.  .........................................................................................................  50  

9   Referências  Bibliográficas  ...........................................................................................................  51  

Anexos  .............................................................................................................................................  55  

xiv

xv

DEDICATÓRIA

Dedico este trabalho a minha família:

Minha mãe Mafisa Vaz por todas as conversas, pelas noites mal-dormidas, pelas preocupações

e por me ajudar a ser e entender o que sou.

Meu pai José Rubens Alonso pelos valiosos conselhos, pelo incentivo, por sempre me fazer ser

uma pessoa melhor e por entender a minha ausência.

Meu irmão Marcelo Augusto Vaz Alonso por todo o companheirismo, amizade incondicional,

pelo carinho e incentivo.

Sem vocês eu não seria nada.

xvi

xvii

AGRADECIMENTOS

Agradeço a minha família pelo incentivo e carinho

Aos meus amigos que me ampararam em momentos de dificuldade

A minha orientadora Dra. Katlin B. Massirer pela oportunidade, pela paciência e por me guiar e

acreditar em mim

Ao Dr. Mario Bengston por todas as conversar inspiradoras e pela sua ajuda em momentos

críticos

Aos professores e colegas do grupo Network, por todas as dicas e ajudas no decorrer do

trabalho

Aos colegas de laboratório, em especial a Natacha A. Migita, Felipe E. Ciamponi e Michael T.

Lovci, que participaram diretamente deste trabalho

A Dra Adriana Franco Paes Leme, Bianca Alves Pauletti, Romênia Ramos Domingues e Sami

Yokoo do LnBio, pela espectrometria de massas e ajuda nos protocolos

Ao Dr Eugene Yeo pelos conselhos ao longo do projeto e pelos anticorpos cedidos

xviii

xix

Índice De Figuras

Figura 1.   Expressão gênica nos diferentes tecidos. ........................................................... 3  

Figura 2.   Representação esquemática dos domínios de CAPRIN1 .................................. 4  

Figura 3.   Ligação prefencial de CAPRIN1 a regiões 3’UTR de mRNAs-alvo por experimento

de CLIP-seq ......................................................................................................................... 5  

Figura 4.   Primers usados para clonagem .......................................................................... 12  

Figura 5.   Curva de crescimento das células HEK293T em cultura demostrando dobramento

em 24h 26  

Figura 6.   Eficiência de transfecção avaliada por FACS .................................................... 28  

Figura 7.   Amostras de RNA íntegras. ................................................................................. 29  

Figura 8.   Produto de PCR correspondente ao cDNA de CAPRIN1 .................................. 30  

Figura 9.   Plasmídeo pcDNA 3.1(+)-FLAG e inserto cDNA CAPRIN1 digeridos para clonagem

30  

Figura 10.   Inserto e plasmídeo purificados, utilizados para a ligação ........................... 31  

Figura 11.   Triagem por PCR de colônia para fragmento de CAPRIN1 ............................. 32  

Figura 12.   Alinhamento das sequências de CAPRIN1 obtidas contra o banco de dados de

sequências humanas UCSC ............................................................................................ 33  

Figura 13.   Eletroferograma de duas das reads confirmando sequenciamento de CAPRIN1

33  

xx

Figura 14.   Confirmação da superexpressão proteica de FLAG-GFP em células HEK293T

35  

Figura 15.   Confirmação da superexpressão proteica de FLAG-CAPRIN1 em células HEK293T

36  

Figura 16.   CAPRIN1 está localizada no citoplasma celular e apresenta padrão granular.

37  

Figura 17.   Verificação da Imunoprecipitação de FLAG-GFP por gel corado com prata.38  

Figura 18.   Gel de prata demonstrando a complexidade da amostra de IP de CAPRIN1 40  

Figura 19.   Confirmação de imunoprecipitação de CAPRIN1 e GFP, utilizando-se anticorpo

anti-FLAG .......................................................................................................................... 41  

Figura 20.   Enriquecimento da amostra em funções de ligação ....................................... 43  

Figura 21.   Proteínas de ligação à RNA representam 63,2% da amostra. ........................ 43  

Figura 22.   Proteínas envolvidas em processamento de RNA estão enriquecidas na amostra

. 45  

Figura 23.   Teste de anticorpos adiquiridos ....................................................................... 47  

Figura 24.   PaBPC1 e IGF2BP1 co-precipitam com CAPRIN1 .......................................... 48  

Figura 25.   Validação da interação de IGF2BP1 com CAPRIN1 ......................................... 49  

xxi

Índice De Tabelas

Tabela 1.   Amostras de co-imunoprecipitação. ................................................................. 24  

Tabela 2.   Contagem de células HEK293T para determinação do tempo de dobramento 26  

Tabela 3.   Teste de quantidades crescentes de lipofectamina para transfecção em células

HEK293T ............................................................................................................................ 27  

Tabela 4.   Eficiência de transfecção nas condições do experimento de imunoprecipitação

39  

Tabela 5.   Interagentes de CAPRIN1 identificados por espectrometria de massas ....... 42  

Tabela 6.   Proteínas escolhidas para teste de validação de Co-IP ................................... 45  

xxii

xxiii

4 ABREVIATURAS E SIGLAS

RBP proteínas de ligação à RNA (no inglês RNA Binding Protein)

‘ minutos

“ segundos

TA temperatura ambiente

pb pares de bases nitrogenadas

KDa Kilo Daltons

ORF Open Reading Frame

IP Imunoprecipitação

1

5 Introdução

5.1 Proteínas de ligação a RNA (ou RNA binding proteins – RBPs)

Durante a etapa de transcrição gênica os fatores de transcrição estão presentes nas células

como complexos proteicos que reconhecem regiões selecionadas do DNA, envolvendo-o

fisicamente. Enquanto isso, etapas de regulação pós-transcricional são reguladas

principalmente por proteínas de ligação a RNA (ou RNA binding proteins - RBPs) e esta é a

principal forma de regulação de expressão de genes durante o desenvolvimento1. As RBPs de

maneira geral fazem parte de complexos proteicos que se ligam aos RNAs mensageiros

precursores (pré-mRNAs) no núcleo e atuam nas etapas subsequentes de processamento de

RNA como splicing de regiões intrônicas e splicing alternativo de exons. Outros eventos são

predominantemente citoplasmáticos como estabilização de RNAs mensageiros (mRNAs)

transcritos e a função de guias para a regulação gênica por RNAs curtos não-codificantes,

como microRNAs2–4.

As RBPs exercem funções diversas de acordo com a presença de diversos domínios proteicos

para o reconhecimento, ligação e regulação de RNA, como o RRM (RNA Recognition Motif), o

RGG Box, DEAD/DEAH box, entre outros1. As RBPs podem atuar de maneira dependente ou

independentemente de complexos proteicos como spliceosomo ou complexo de

poliadenilação.

Na última década várias descobertas relacionaram falhas no mecanismo de regulação

por RPBs à doenças como Parkinson (proteína FAF1)5, autismo (proteína FOX1)6, síndrome

do cromossomo X frágil (proteína FMR1)7, esclerose lateral amiotrófica (proteína TDP43)8,

leucemia mielóide aguda, Alzheimer (proteína Musashi)8,9 e distrofia muscular miotônica

(muscleblind-like protein)10. Fato este, relacionado a importância de muitas RBPs no

2

desenvolvimento de tecidos somáticos, bem como com a capacidade de uma única RBP

regular muitos alvos, sendo assim, fenótipos mutantes podem apresentar falhas na regulação

de vários mRNAs1.

Além do envolvimento com doenças, RPBs estão relacionadas ao processo de manutenção

da pluripotência celular e da diferenciação em neurônios e outras células, podendo fazer parte

de coqueteis de fatores essenciais nos protocolos de reprogramação em células tronco

pluripotentes induzidas, como no caso da RPB LIN-28 que é atualmente reconhecida como

uma das proteínas-chave na manutenção da pluripotência celular11,12

A partir de um banco de dados de aproximadamente 1200 RBPs, montado e anotado em

nosso laboratório estamos definindo um grupo de RBPs que tenham evidência de relação com

processos neuronais de regulação de RNA. Neste banco, um subgrupo de interesse para

nosso laboratório são proteínas relacionadas ao armazenamanento de RNA e recrutamento

rápido de RNA citoplasmáticos. Uma dessas proteínas, com função ainda pouco conhecida na

formação de grânulos citoplasmáticos de RNA é a CAPRIN1 (cytoplasmic

activation/proliferation-associated protein-1), a qual está sendo estudada nesse projeto.

5.2 Perfil de Expressão e fenótipos relacionados a RBP CAPRIN1

CAPRIN1 é uma proteína citoplasmática altamente expressa em tecidos com alta taxa de

proliferação celular, sua expressão também está relacionada a alguns tipos de câncer, como o

melanoma, câncer de mama e osteossarcoma13–15. A exceção para este perfil é a alta

expressão em tecidos nervosos (Figura 1) que sabidamente apresenta baixa taxa de

proliferação celular. Em neurônios, CAPRIN1 se localiza em grânulos citoplasmáticos, onde

interage com outras proteínas para transportar mRNAs-alvo do soma para os dendritos para

que seja realizada a tradução localizada16–18.

3

Figura 1. Expressão gênica nos diferentes tecidos . A expressão de CAPRIN1 é elevada em tecidos com maior proliferação celular e em tecidos nervosos (www.genecards.org).

É sabido que o knockout de CAPRIN1 em camundongos é letal em 20 minutos após o

nascimento em decorrência de falhas respiratórias. O knockdown por sua vez, compromete o

desenvolvimento normal em camundongos, que apresentam corpo e órgãos menores em

comparação com o controle, além de ser observado em cultura primária, neurônios com

dendritos menos desenvolvidos e em menor quantidade17. Outra consequência do knockdown

relacionada aos tecidos nervosos é a menor localização de mRNAs-alvo de CAPRIN1 nos

dendritos, estes alvos ficam retidos no soma e a tradução localizada é prejudicada17.

A superexpressão de CAPRIN1 por outro lado, induz a formação de grânulos de estresse no

citoplasma celular19. A indução de grânulos de estresse a partir da superexpressão desta

proteína indica importante função na regulação dos alvos recrutados para este tipo de grânulo,

função esta, ainda não elucidada.

5.3 Funções propostas para CAPRIN1

A proteína CAPRIN1 apresenta um domínio coiled-coil (Figura 2) relacionado, em geral, à

regulação de transcrição. Apresenta ainda tags de sinalização para localização nuclear (NLS)

4

e exportação nuclear (NES), essenciais para a locomoção para dentro e fora do núcleo, o que

se relaciona com o transporte de mRNAs e regulação de eventos pós-transcricionais16,19–21. O

RGG motif em seu carboxy-terminal é uma estrutura típica de RBPs que consiste em uma

região rica em repetições de arginina e glicina e age como mediador de ligação à estruturas

secundárias de seus mRNAs-alvo22. Esta estrutura, juntamente com o coiled-coil em seu N-

terminal, parece ser essencial para a fosforilação de eIF-2α, o que desencadeia a formação de

grânulos citoplasmáticos de estresse16,19.

Figura 2. Representação esquemática dos domínios de CAPRIN1 . CAPRIN1 apresenta um domíCoiled-coil, domínio envolvido com regulação trascricional, um Nuclear Localization signal (NLS), um Nuclear export signal (NES), tags de sinalização de entrada e saída do núcleo e regiões ricas nos aminoácidos E, Q R e G (E-rich, Q-rich e RGG), típicas de RBPs.

A partir das regiões ricas em arginina e glicina e do RGG motif presentes em sua estrutura,

CAPRIN1 exerce regulação pós transcricional se ligando aos mRNAs-alvo. Experimentos de

ligação em larga escala realizados por Baltz e colaboradores23 e analisado por nosso grupo,

evidenciaram a ligação preferencial de CAPRIN1 à regiões codificantes de mRNAs e 3’UTR

(Figura 3), o que indica função no controle de estabilização de RNA e transporte24. O mesmo

set experimental mostrou preferência menor de ligação a íntrons, indicando que CAPRIN1

estaria pouco relacionada a regulação de splicing alternativo23.

5

Figura 3. Ligação prefencial de CAPRIN1 a regiões 3’UTR de mRNAs-alvo por experimento de CLIP-seq. Analises de mapeamento de sítios de l igação evidenciam a l igação preferencial de CAPRIN1 a regiões 3’ não codificantes, sugerindo função na estabil ização de seus alvos23. A baixa preferência a regiões intrônicas sugere pouca ou nenhuma função em splicing alternativo.

O experimento mostrou ainda, que CAPRIN1 se liga preferencialmente a estruturas G-

quadruplex de seus alvos. Esta estrutura é formada por repetições de quatro guaninas e está

enriquecida nas regiões 5’UTR e 3’UTR participando de diversas etapas no metabolismo de

RNAs25. Em 3’UTR, foi demonstrado que a ligação de proteínas à G-quadruplex está

relacionada ao transporte de genes repórter em neurônios através da formação de grânulos

citoplasmáticos26.

5.4 CAPRIN1 e a formação de grânulos citoplasmáticos de RNA

CAPRIN1 está relacionada à formação de dois tipos de grânulos. Um deles é responsável pelo

transporte de alguns mRNAs do soma de neurônios para os dendritos para que ocorra a

tradução localizada de proteínas com necessidade de mobilização rápida27. Neste cenário,

Shiina e colaboradores caracterizaram a ligação da proteína à região 3’UTR de alguns de seus

mRNAs-alvo, tais como synapsin1, FXYD1 e FXYD6, por meio de genes repórter.

3’UTR

DistalIntron

5' UTR

ProximalIntron

Genomic Content(pre-mRNA) (mRNA)

Transcriptome Content

CDS

5’UTR

Proximal intron

3' UTR

5' UTR

CDS

Exonic Content3' UTR

CDS

DistalIntron

5' UTR

ProximalIntron

Clusters' Content(pre-mRNA) (mRNA)

Transcriptome Content

5’ UTR

(pre-mRNA) (mRNA)

Transcriptome Content

6

Outro tipo de grânulo são os chamados grânulos de estresse (SG). Esses grânulos são

normalmente formados durante situações de estresse celular como choque térmico, exposição

à luz ultra violeta e tratamento com arsenito 28,29, porém podem também ocorrer por meio da

superexpressão de algumas proteínas de ligação a RNA, como CAPRIN1, que desencadeiam

a fosforilação de eIF2α por meio de kinases como PERK, HRI, GCN2, PKR e Z-DNA

kinase19,30–33. Com a fosforilação de eIF2α, a viabilidade do complexo eIF2α-GTP-tRNAi MET

fica reduzida e a maquinaria de iniciação traducional é bloqueada32. Algumas RBPs e RNAs

específicos são recrutados para os grânulos por meio de microtúbulos, porém, sabe-se que

estes componentes não são constantes, podendo ainda haver diferenças de acordo com tipo

de estresse e tipo de células33. Em neurônios, foram observados componentes essenciais

para o desenvolvimento de doenças neurodegenerativas como a proteína TDP43 e Fus,

fatores relacionados com a esclerose lateral amiotrófica (ALS)8,33–35, assim como a proteína

FMRP, associada a síndrome do X frágil36. Há proteínas específicas deste tipo de grânulo,

mas há outras que são compartilhadas com os P-bodies (processing bodies), responsáveis

pela degradação de RNAs30. Dentre estas, estão proteínas como XRN1, DHH1 e TTP29,33,37, o

que indica que componentes específicos parecem exercer funções específicas nos grânulos

de estrese. A relação com os P-bodies, é um indício de que os SGs são formados para

realizar a triagem de mRNAs específicos. Não há, porém, um consenso quanto a função

destes grânulos, quanto ao conjunto de seus mRNAs-alvo e de seus componentes nestas

situações. Sendo assim, a elucidação da função dos grânulos, bem como de seus

componentes, é essencial para o entendimento de doenças neurológicas que apresentam a

formação de SGs que em algum momento se tornam patológicos, tais como ALS e síndrome

do X-frágil35,36.

7

6 Objetivos

6.1 Objetivo Geral

O presente trabalho teve como objetivo principal compreender a função da proteína CAPRIN1,

pela identificação das proteínas que interagem com CAPRIN1 e caracterizando-se assim, o

complexo de regulação em células de mamífero HEK293T.

6.2 Objetivos específicos

I. Otimização dos protocolos de cultura celular, superexpressão, imunoprecipitação e

clonagem.

II. Determinação dos componentes do complexo por espectrometria de massas.

III. Validação de duas proteínas interagentes de CAPRIN1 por co-imunoprecipitação

seguida de Western blot.

8

7 Métodos

7.1 Condições de cultivo de células HEK293T

Condições de cultivo das células de mamífero: para todos os experimentos, as células

transformadas *HEK293T (human embryonic kidney cells) foram mantidas em meio de cultura

DMEM 1x + glutaMax (Gibco cat 10566016) suplementado com 10% de soro fetal bovino

(Gibco cat 12657029) e mantidas em incubadora a 37°C em 5% de CO2. Para a realização de

passagens, as células foram tripsinizadas da seguinte maneira: o meio de cultura foi removido,

as células foram lavadas uma vez com PBS 1X, seguido da adição de 3mL de 0,25% tripsina-

EDTA (Gibco cat: 25200-072) para frasco T-75 (7,5cm2) e incubação a 37°C por 5’. Para

neutralizar o EDTA, foi adicionado meio de cultura com soro e as células soltas foram

centrifugadas por 5’ a 2000xg. O sobrenadante foi descartado e o precipitado de células foi

ressuspendido.

Para 1L de PBS:

8g NaCl (137mM), 0,2g KCl (2.7mM), 1,44g Na2HPO4 (10mM), 0,24g KH2PO4 (1.8mM)

Determinação do tempo de dobramento de células HEK293T: as célula foram tripsinizadas e

ressuspendidas em meio de cultura. Para calcular o volume de células a serem plaqueadas

para a curva de crescimento, as células foram diluídas 10 vezes em meio de cultura e 15uL

foram usados para contagem na câmara de Neubauer. O volume correspondente a 1,42 x105

células foi plaqueado em placas de 10cm2 (1,42 x 104 células/cm2), em duplicata para cada

9

ponto de coleta. Após 24, 48, 72 e 96 horas de crescimento, as células foram tripsinizadas e

contadas para se determinar o tempo de dobramento.

*As celulas HEK293T são células modificadas que expressam o SV40 large T antigen e

resistência a neomicina. Escolhemos as células HEK293T pois elas apresentam expressão

aumentada de plasmídeos transfectados em relação à linhagem HEK293 e são adequadas se

quisermos gerar células transfectantes estáveis futuramente.

7.2 Teste de eficiência de transfecção

As células foram mantidas e tripsinizadas como mencionado acima e o volume equivalente a 5

x105 células foi plaqueado em 4 poços de uma placa de 6 poços (5 x104 células/cm2) . Após

24h, foram preparados 5 tubos, no primeiro tubo, 10ug (2.5 ug de DNA x 4 poços) do

plasmídeo pcDNA-FLAG-GFP foram diluídos em meio OptiMEM (gibco cat 31985-062). No

segundo tubo, que serviu como controle, não foi colocada Lipofectamina (apenas 100uL de

optiMEM). E nos tubos seguintes foram colocadas as concentrações crescentes de

Lipofectamina 2000 (4,5ug, 7,5ug e 10,5ug). Após homogeneizar delicadamente por inversão,

os tubos foram incubados por 5’ a TA. Em seguida, o equivalente a 2,5ug de DNA diluído do

primeiro tubo foram adicionados aos tubos contendo Lipofectamina 2000 para a formação dos

complexos e incubados por 20’ a TA. Os complexos foram adicionados a cada poço contendo

as células. Após 48h as células foram tripsinizadas, ressuspendidas em meio DMEM + FBS e

contadas na câmara de Neubauer. Em microscópio com fluorescência foi contado o número

de células totais e o número de células verdes (que receberam o plasmídeo com GFP).

10

7.3 Clonagem da ORF correspondente a proteína CAPRIN1

Previamente à superexpressão em células de mamífero, foi necessário clonar o cDNA da

proteína CAPRIN1 no plasmídeo pcDNA 3.1 (+).

7.4 Obtenção do cDNA referente a proteína CAPRIN1

7.4.1 Extração de RNA

Duas placas de 10 cm2 contendo células HEK293T foram submetidas a extração de RNA pelo

reagente TRIzol (Ambion cat:15596018) segundo recomendações do fabricante. Os RNAs

foram armazenados a -80°C até o uso. A quantificação foi feita em Nanodrop (GE) e em

seguida foi feito um gel de agarose 1% para verificar a integridade e viabilidade do RNA

extraído.

7.4.2 Transcrição reversa (RT)

Para a síntese de cDNA, foram usados 5ug de RNA total das células HEK293T. O RNA foi

combinado com 0,7mM de cada nucleotídeo em dNTP mix (Denville) e a concentração final de

4uM de Oligo(dt) (sequência: TTTTTTTTTTTTTTTTTTTTVN). A reação foi aquecida a 65°C

por 5’ e incubada em gelo por 1’ para desnaturação do RNA e dos oligos. Foi feita uma

centrifugação breve e foi adicionado à reação Buffer da enzima Super Script III para 1X, 1uL

de DTT 0,1M (Invitrogen cat: y00147) e 200 unidades de SuperScript III (Invitrogen cat:

11

56575). A reação foi homogeneizada e incubada a 50°C por 30’, seguida de inativação a 70°c

por 15’. Em seguida, foram adicionadas 2 unidades de RNase H (Invitrogen cat:y01220) e a

reação foi incubada a 37°C por 20’ para digestão de RNA restante na reação.

7.4.3 PCR

A reação de RT foi utilizada para o PCR, realizado com a Enzima processiva Phusion High

fidelity DNA polymerase (Thermo Scientific cat: F530S) que possui a baixa taxa de erro de 4,4

x 10-7. A reação foi preparada com 1X de Pol buffer, 0,2mM de cada nucleotídeo em dNTP

mix, 0,5uM de cada primer para CAPRIN1, 1 unidade de Phusion DNA polimerase e 2 uL de

cDNA. A reação foi centrifugada brevemente e o PCR foi realizado utilizando-se 30 ciclos com

anelamento de 30’’ a 64°C e extensão de 2’30’’ a 72°C.

Os primers usados para esta etapa estão representados abaixo, em azul a parte da sequência

de CAPRIN1 (do inicio da sequência para o Forward e do final para o reverse). Em vermelho

os sítios das enzimas de restrição usadas, foram adicionados nucleotídeos extras (X) como

sítios de flanqueamento.

A Sequência codificante de CAPRIN1 corresponde a uma sequência de 2131pb.

12

Figura 4. Primers usados para clonagem : em azul, parte da sequência de CAPRIN1 para

alinhamento dos primers no cDNA. Em vermelho estão representados os sítios das enzimas de restrição usadas e seus nomes. Em verde, sít ios de flanqueamento uti l izados para facil i tar as reações seguintes

7.4.4 Purificação do gel

A banda correspondente ao produto de PCR foi purificada utilizando-se o Kit da Thermo

Scientific GeneJET Gel extraction #K0692 segundo recomendações do fabricante.

7.4.5 Digestão do produto de PCR para clonagem

O produto de PCR foi digerido de modo a resultar em extremidades coesivas (sticky ends) na

seguinte reação: 1ug do produto de PCR purificado com 20 unidades das enzimas BamHI

(NEB cat:R0136) e XhoI (NEB cat: R0146) por 6 horas a 37°C seguida de purificação.

13

7.5 Preparação do plasmídeo

7.5.1 Digestão do plasmídeo para clonagem e purificação

O plasmídeo pcDNA contendo uma sequência tag que resulta em 10 aminoácidos de

comprimento (FLAG) foi utilizado para a clonagem. A adição da sequencia FLAG é uma

estratégia utilizada no laboratório, a fim de possibilitar o uso do anticorpo geral anti-FLAG para

as imunoprecipitações de proteínas expressas. Isso evita que tenhamos que comprar vários

anticorpos específicos. Para se obter o plasmídeos linearizado para a clonagem, foi utilizado

1ug do plasmídeo e 20 unidades das enzimas BamHI (NEB cat:R0136) e XhoI (NEB cat:

R0146) por 6 horas a 37°C. A seguir foram adicionadas 10 unidades de fosfatase alcalina

(BioLabs: M0290S) para a etapa de defosforilação, impedindo, assim, que o plasmídeo

linearizado pudesse novamente circularizar. A purificação do plasmídeo do gel foi realizada

com o mesmo kit utilizado para o produto de PCR.

7.5.2 Ligação do inserto ao vetor

A ligação do inserto ao plasmídeo foi realizada com 100ng de vetor pFLAG, 100ng de inserto

(razão molar ~3:1 Inserto 2.1kb vetor 5.4kb), em concentração final de buffer da T4 DNA

Ligase (Fermentas cat:EL0011) 1x e 5 unidades de T4 DNA ligase. Foi feito um controle com

as mesmas condições mas sem inserto (vetor vazio). As reações foram homogeneizadas e

centrifugadas brevemente, depois incubadas a 16°C durante a noite.

14

7.5.3 Transformação em bactéria DH5-alpha

Após a inativação da ligase a 70°C durante 15’, a construção foi transformada em bactérias

E.coli DH5α quimicamente competentes. Para isso, 4uL da ligação e do vetor vazio foram

adicionados cada um em um tubo de 50uL de bactérias competentes.

7.5.4 PCR de colônia para verificação da presença de inserto

Para selecionar as colônias candidatas a serem sequenciadas, 20 colônias foram submetidas

ao PCR de colônia utilizando-se primers desenhados dentro da sequência de CAPRIN1

resultando em 627pb (buffer a 1X, 0,4mM de cada nucleotídeo em dNTP mix, 3mM de MgCl2

2, 1,25 unidades de Taq DNA polimerase (Thermo scientific cat:EP0405) e 0,2uM de cada

primer (Forward: 5’-TCCATTCACCTGTGGGACCT-3’ Reverso: 5’-

ACCAGAAGCGACACAGGTTCC-3’)). Como controle positivo foi realizada uma reação de

PCR com as mesmas condições contendo 50ng do inserto e como controle negativo, a reação

foi realizada com água. As amostras foram submetidas a 30 ciclos com anelamento de 58°C

por 30’’ e extensão de 72°C por 1’.

7.5.5 Purificação dos plasmídeos (miniprep)

As colônias contendo tamanho esperado no gel foram inoculadas em 5mL de LB com 50ug/uL

de ampicilina para seleção de bactérias transformadas. Após incubação a 37°C por 12h os

plasmídeos foram extraídos utilizando-se o kit Wizard Plus Minipreps DNA Purification Sustem

(Promega cat:A7100)

15

7.5.6 Sequenciamento

Foi realizado pelo laboratório LACTAD-UNICAMP, utilizando-se o BigDye Terminator v3.1

Cycle Sequencing Kit e Sequenciador 3730xL DNA Analyzer (Applied Biosystems) para

sequenciamento Sanger (eletroforese capilar). Foram usados quatro primers (Anexo Tabela

1), dois primers localizados no plasmídeo, serviram para confirmar o posicionamento correto

do inserto e sequenciar o começo e o final do mesmo.

7.6 Superexpressão da proteína teste GFP e avaliação de eficiência de transfecção.

7.6.1 Padronização de Transfecção e Eficiência de Transfecção

Para verificar a expressão proteica a partir do plasmídeo nas células HEK293T, foi usado o

plasmídeo pcDNA-FLAG-GFP, que expressa GFP podendo ser visualizado pela submissão

das células à microscopia de fluorescência ou que pode ser investigada por reconhecimento

de anticorpo em Western blot. Com este controle, foram testadas as condições do Western

blot e do anticorpo anti-FLAG. As células mantidas em cultura foram tripsinizadas e contadas

como no teste de transfecção e a seguir foi plaqueado o volume correspondente a 3x 106

células por placa de 6 cm (5x105 células/cm2), no total 3 placas foram usadas. Após 24h foi

realizada a transfecção de duas placas, deixando-se uma placa não transfectada como

controle: 11ug de DNA (5,5ug para cada placa) foram diluídos em meio Opti-mem (Gibco

Cat:31985-062) para volume final de 500uL. Em tubo separado, a Lipofectamina 2000 foi

diluída em 6:1 em optimem. Os dois tubos foram incubados por 5’ a TA, misturados e

16

incubados por 20’ novamente a TA. Após a incubação, os complexos foram adicionados nas

placas que foram então mantidas em incubadora nas mesmas condições descritas

anteriormente. O meio de cultura das placas foi trocado após 24h. Após 48h as células de uma

das placas transfectadas foram contadas como no teste de eficiência de transfecção. As

células transfectadas das placas restantes, foram então lisadas para investigação da

expressão.

7.6.2 Extração de proteínas

As duas placas restantes, controle e transfectada, foram colocadas em gelo e o meio de

cultura foi aspirado. Após a lavagem com PBS gelado, a lise foi realizada com 200uL de RIPA

1X (Millipore cat:92590) contendo inibidor de protease (Roche). As células foram então

raspadas das placas, homogeneizadas e transferidas para um tubo de 1,5mL. Os tubos foram

centrifugados por 20’ a 4°C a 12000rpm e o pellet restante descartado.

7.6.3 Quantificação das proteínas

A quantificação de proteínas do lisado a serem utilizadas para Western Blot foi realizada pelo

método de Bradford (Bio-Rad cat:500-0006) e a placa usada foi lida em espectrofotômetro no

comprimento de onda de 620nm.

7.6.4 Western Blot

Foi seguido o protocolo de Sambrook, 1989 com algumas modificações e a parte do protocolo

da ligação de anticorpos foi realizada conforme recomendações do fabricante do aparelho

Odyssey (Licor).

No Western blot, foram testadas 3 concentrações (10, 20 e 30ug) de proteína do lisado celular

que foram aplicadas em gel de poliacrilamida-SDS (PAGE-SDS) a 10% com tampão beta

17

(para tampão 5x: 60mM Tris-HCl pH 6.8, 2% SDS, 10% glycerol, 5% β-mercaptoethanol,

0,01% bromophenol blue) para concentração 1X e Ripa 1X. Após a eletroforese, o gel foi

equilibrado por 15’ em tampão de transferência (Tris 25mM /Glicina192mM/SDS0,1% /Metanol

20%). Uma membrana de PVDF foi ativada em metanol 100% e então equilibrada em Transfer

buffer. As proteínas foram transferidas para membrana em sistema molhado (BioRad Mini

Trans-blot electrophoretic transfer cell) com tampão de transferência a 200mA por 2 horas

mantido em gelo. Depois da transferência a membrana foi bloqueada em solução blocking

buffer Odyssey (cat n. 927-40000) sob agitação durante a noite à 4°C. A membrana foi então

lavada 3 vezes com TBS-T (200mM tris, 1,5M NaCl, 1% tween20) com suave agitação por 10’.

A membrana foi incubada com anticorpo primário (anti-FLAG antibody, Sigma cat:F3165) em

diluição 1:10000 durante 1 hora e meia. Em seguida foi realizada mais uma lavagem com

TBS-T (3 vezes por 10’). Foi feita nova incubação com anticorpo primário para controle (anti-

tubulina antibody ABCAM cat:ab4074). A lavagem foi realizada novamente, depois a

membrana foi incubada com dois anticorpos secundários em diluição 1:15000 (Goat anti-rabbit

Odyssey cat:926-32211 e Goat anti-mouse Odyssey cat:926-68070) durante 45’ com agitação

suave. Depois de lavada novamente, conforme descrito anteriormente, a membrana foi

revelada segundo protocolo de fabricante do Odyssey CLx (Li-Cor, USA).

7.7 Imunoprecipitação com proteína teste GFP

A fim de testar as condições da imunoprecipitação e das beads anti-FLAG, o experimento foi

primeiramente realizado a partir do lisado proteico anteriormente utilizado para Western blot.

Seguindo as recomendações do fabricante, as beads magnéticas com anticorpo anti-FLAG já

incorporado (sigma-M8823-1) foram equilibradas e lavadas 3 vezes com TBS-T 1X (para 1L:

20mM Tris base, 0,15M NaCl, 0,1% tween-20) e uma vez com tampão de lise (para 50mL:

18

50mM Tris-HCl pH7.4, 1mM EDTA pH8, 140mM NaCl, 1% triton). 550ug de proteína foram

adicionados as beads e os tubos foram incubados por aproximadamente 12h sob rotação à

4oC para que o complexo proteico fosse ligado ao anticorpo contido nas beads. Usando

estante magnéticas, as beads foram lavadas com tampão de lise e TBS-T de modo que

proteínas inespecíficas não permanecessem ligadas. Por competição, as proteínas foram

eluídas com 10ug de 3x FLAG peptídeo (Sigma-F4799). Para confirmar a imunoprecipitação e

a eluição, uma parte do sobrenadante resultante da imunoprecipitação, do eluído, do tampão

das beads fervidas e do lisado de proteínas (como controle) foram aplicados em gel de

poliacrilamida-SDS (PAGE-SDS) a 10%.

Um gel de acrilamida com as mesmas condições do gel de Western blot foi usado para

coloração com prata SilverQuest (invitrogen-LC6070), permitindo visualizar a superexpressão

e a complexidade da amostra imunoprecipitada.

7.8 Avaliação da localização da proteína CAPRIN1 em comparação a GFP

Para avaliar a localização da proteína CAPRIN1 após sua superexpressão em células

HEK293T, foi realizado o protocolo de imunofluorescência da seguinte maneira:

7.8.1 Transfecção

Inicialmente, 0,5x105 células foram plaqueadas em 6 poços de uma placa de 24 poços

(0,25x105células/cm2), previamente cobertos com lamínulas estéreis. 24h depois, foram

realizadas transfecções como descrito anteriormente. Dois poços de células foram

transfectados com o plasmídeo pcDNA-FLAG-CAPRIN1, dois poços foram mantidos sem

transfecção como controle e dois foram transfectados com pcDNA-FLAG-GFP.

19

7.8.2 Imunofluorescência

48h após a transfecção, o meio de cultura dos poços usados foi descartado. As células foram

lavadas com PBS (NaCl 137mM, KCl 2.7mM, Na2HPO4 10mM, KH2PO4 1.8mM) e fixadas

com 3,7% formaldeído por 5’.

As células foram lavadas novamente e então permeabilizadas com 0,1% triton em PBS

2mg/mL BSA por 5’. O bloqueio foi então realizado por 1h em 0.05% Tween 20 em PBS

2mg/ml BSA (Blocking Buffer).

As células foram incubadas durante a noite com o anticorpo primário anti-FLAG em diluição

1:1000.

Após aproximadamente 16h, o anticorpo foi retirado e foram realizadas 4 lavagens de 10’

com Blocking Buffer seguidas de incubação com anticorpo secundário (invitrogen 488 anti-

mouse) por 2h. novamente foram realizadas 3 lavagens de 10’ com PBS. As lâminas foram

montadas com uma gota de SlowFade com Dapi (Invitrogen S36939) e vedadas com esmalte.

7.9 Superexpressão da proteína CAPRIN1 e avaliação de eficiência de transfecção

7.9.1 Transfecção

Após a padronização, os testes foram realizados para a proteína CAPRIN1

Concomitantemente à superexpressão da proteína CAPRIN1 para posterior análise por

espectro de massa, verificamos a expressão proteica a partir do plasmídeo pcDNA-FLAG-GFP

nas células HEK293T, como descrito acima.

As células mantidas em cultura foram plaqueadas com o correspondente à 2,2x 106 por placa

de 10cm para o teste de transfecção, no total 5 placas de 10cm foram usadas. Após 24h foi

20

realizada a transfecção do plasmídeo pcDNA-FLAG-GFP em duas placas de 10cm para

controle de imunoprecipitação e em uma placa de 6cm para eficiência de transfecção, e do

plasmídeo pcDNA-FLAG-CAPRIN1 em 3 placas de 10cm usando 10ug de DNA

Após 48h as células da placa de 6cm foram contadas como no teste de eficiência de

transfecção. As células transfectadas foram então lisadas para investigação da expressão e

imunoprecipitação.

7.9.2 Extração de proteínas

A extração das proteínas das placas restantes, controle de imunoprecipitação e

superexpressão de CAPRIN1, foi realizada como descrito anteriormente, porém com 1mL de

tampão de lise 1X (para 50mL: 50mM Tris-HCl pH7.4, 1mM EDTA pH8, 140mM NaCl, 1%

triton) contendo inibidor de protease (Roche).

7.10 Imunoprecipitação da proteína CAPRIN1 para análise por espectrometria de massas

A imunoprecipitação para análise por espectrometria de massas foi realizada com algumas

alterações devido à sensibilidade da maquina a ser usada.

500ug de proteína foram submetidos à imunoprecipitação. após a ligação dos complexos às

beads, foram realizadas 5 lavagens com TBS-T para que não restassem resíduos de

detergentes, o que poderia prejudicar o desempenho do espectrômetro. A eluição foi

otimizada para 10mg de 3x FLAG peptídeo (Sigma-F4799) por 2h em banho seco à 30ºC.

Uma segunda eluição foi realizada nas mesmas condições por 1h e uma terceira, com 5mg de

3x FLAG peptídeo por 30’ à 30ºC.

21

Para confirmar a imunoprecipitação, uma parte do lisado anterior a imunoprecipitação (INPUT)

e do sobrenadante resultante da imunoprecipitação foram aplicados em gel de poliacrilamida-

SDS (PAGE-SDS) a 10%.

A análise da superexpressão foi realizada como descrito para a proteína teste.

7.11 Preparação de Amostras Para Espectrometria de massas

Após a confirmação de imunoprecipitação por Western blot, 100ul dos complexos purificados

foram preparados para espectrometria de massas.

7.11.1 Digestão proteica

Para a redução das pontes dissulfeto foi adicionado DTT para 5mM final e as soluções foram

incubadas durante 25’ à 56ºC. a redução foi seguida de alquilação com IAA para 14mM e

incubação por 30’ à temperatura ambiente e protegida da luz. Em seguida, DTT para 5mM foi

adicionado para reprimir a ação de IAA restante, as soluções foram novamente incubadas por

15’ a TA protegidas da luz. CaCl2 para 1mM foi adicionado seguido de digestão com 1ug de

tripsina, as soluções foram incubadas durante a noite a 37ºC.

Após aproximadamente 16h, a reação foi parada com TFA para 1%.

7.11.2 Dessalinização

A dessalinização foi realizada com a coluna C18 SepPack (Waters, WAT 054960).

A coluna foi ativada com 3mL de ACN 100% e equilibrada com 1mL de solução 50/50

ACN/água com 0,1% ácido fórmico e 3mL de TFA 0,1%. A solução foi passada pela coluna e

os peptídeos, lavados com 3mL de TFA 0,1%. A amostra foi equilibrada com 0,1% de ácido

fórmico e então eluída com 2mL de solução 50/50 ACN/água com 0,1% ácido fórmico e 1mL

22

de solução 80/20 ACN /água com 0,1% ácido fórmico. As amostras foram então secas por

evaporador.

7.11.3 Espectrometria de massas

A espectrometria foi realizada pelo Laboratório Nacional de biociências com a máquina LTQ

Orbitrap Vellos EDT da Thermo Scientific, com ionização por eletrospray e detecção por Ion

Trap.

Os peptideos liofilizados foram separados por cromatografia com C18 (100mm 6100mm) RP-

nanoUPLC (nanoAcquity, Waters) acoplado a espectrômetro de massas Q-Tof Ultima (Waters)

com nanoeletrospray com taxa de injeção de 0,6ml/min. O gradiente usado foi de 2-90%

acetonitrila em 0,1% ácido fórmico por 45 minutos.

As voltagens usadas foram: do eletrospray foi de 3,5kV para eletrospray e 30V para o cone

com fonte de temperatura de 100uC.

O aparelho foi utilizado em modo “top three”, onde um espectro é adquirido seguido do MS/MS

dos 3 picos mais intensos. A exclusão de íons foi feita em 60s.

Para as análises dos interagentes encontrados foram usados os programas DAVID

Bioinformatic Database38 e o Cytoscape para clusterização de funções moleculares através do

aplicativo BINGO do gene ontology39.

7.12 Validação e caracterização de interações proteicas

Após a espectrometria de massas, foi escolhido um grupo de 9 proteínas com função

enriquecida na amostra e que tivesse ligação às funções propostas para grânulos de estresse

para validação da interação e caracterização quanto a dependência de RNA.

23

7.12.1 Co-imunoprecipitação da proteína CAPRIN1 superexpressa

Para a validação, primeiramente a imunoprecipitação de CAPRIN1 por meio das beads

magnéticas conjugadas com o anticorpo anti-FLAG foi repetida, porém a quantidade de

proteínas totais foi elevada a 1mg a fim da identificação das bandas correspondentes à

proteínas interagentes por Western blot ser facilitada. A eluição foi realizada fervendo as

beads magnéticas com tampão beta para concentração de 1x.

O Western blot foi realizado como descrito anteriormente e as membranas foram incubadas

com os anticorpos primários em diluição recomendada pelo fabricante (Anexo Tabela 2), por

2h e com os anticorpos secundários por 45’.

7.12.2 Co-Imunoprecipitação de proteínas endógenas e tratamento com RNase

Após o teste inicial de co-imunoprecipitação, as proteínas com interações confirmadas no

primeiro teste foram precipitadas com as beads magnéticas Dynabeads Protein A (Life

Tecnologies 10001D).

7.12.2.1 Cross Link

Para que o anticorpo seja conjugado às beads de forma estável, foi necessário realizar o cross

linking.

Para isso, o tampão das beads foi removido e 1ug de cada anticorpo, diluído em 200uL de

PBS/0,02% tween-20, foi acrescentado às beads que foram incubadas durante 10` à

temperatura ambiente com rotação.

O tampão foi então removido e a beads foram lavadas uma vez com PBS/0,02% tween-20 e

duas vezes com 0,2M triethanolamina pH8,2.

24

As beads foram ressuspendidas em 1mL de 20mM DMP em 0,2M triethanolamina pH8,2 e

incubadas com rotação durante 30’ à 20˚C. O tampão foi removido e as beads foram lavadas

3 vezes com PBS/0,02% tween-20.

7.12.2.2 Tratamento com RNase

Após a lise das amostras descrita anteriormente, foi realizado o tratamento com RNase A

(Qiagen 158922) em 1mg de cada amostra. 1mg de cada amostra se manteve sem tratamento

para comparação (Tabela 1).

A RNase foi adicionada à 10ug/100ul e as amostras foram incubadas em gelo durante 1h.

Tabela 1. Amostras de co-imunoprecipitação. Para a validação dos interagentes, cada IP foi realizada nas condições de superexpressão (OE) da proteína CAPRIN1 em comparação a superexpressão de GFP e com e sem tratamento com RNase

7.12.2.3 Imunoprecipitação

A imunoprecipitação foi realizada com 1mg das amostras descritas acima. A proteína foi

adicionada às beads após o cross link e tratamento com RNase e as amostras foram

incubadas com rotação à 4˚C durante aproximadamente 16h. Depois foram lavadas 5 vezes

com PBS1x e os complexos foram eluídos com tampão beta para concentração 1x a 80˚C por

5’ seguido de Western blot para análise de interagentes.

GFP$OE CAPRIN1$OE+"RNase +"RNase("RNase ("RNase+"RNase +"RNase("RNase ("RNase

IP$IGF2BP1

IP$PaBPC1

25

8 Resultados e Discussão

8.1 Avaliações celulares, preliminares à superexpressão da proteína CAPRIN1

Como os experimentos de superexpressão de proteínas estavam sendo realizados pela

primeira vez no laboratório, alguns parâmetros referentes às células em cultura foram

inicialmente avaliados.

Tempo de dobramento de células HEK293T

As células HEK293T plaqueadas no tempo zero foram contadas a cada 24 horas e plotadas

em curva de crescimento (Figura 5). Os resultados individuais das contagens e os cálculos da

razão entre os números de células dos tempos sucessivos, são mostrados na Tabela 2. Para

as condições descritas acima em nosso laboratório, observou-se que a cada 24h o número de

células foi bem próximo da duplicação (razão de 1.9, 1.9 e 1.8), condizendo com o que é

encontrado na literatura, utilizando-se células em suspensão mantidas em Erlenmeyer

(Cervera et al40). Surpreendentemente, poucos laboratórios mencionam tempos de

dobramento em artigos e nós achamos importante certificarmos em nossas condições

laboratoriais.

26

Figura 5. Curva de crescimento das células HEK293T em cultura demostrando

dobramento em 24h. No tempo zero as células foram plaqueadas na densidade de 1,4 x 104

células/cm2. Sucessivamente as células foram contadas a cada 24h conforme representação. Cada ponto representa a média da contagem de células de duas placas a cada 24h.

Tabela 2. Contagem de células HEK293T para determinação do tempo de dobramento. Número de células HEK293T contadas por placa nos tempos indicados e média do número de células nas duas placas. A última coluna mostra o cálculo da razão para o tempo de dobramento, próximo a 2, portanto o tempo de dobramento foi estipulado como 24h.

Horas Número de células x105

células/ml Número de células x105

células/ml Razão

dobramento Placa 1 Placa 2 Média

24 11 14 13 48 25 24 25 25/13=1,9 72 31 65 48 48/25=1,9 96 46 126 86 86/48=1,8

Avaliação da eficiência de transfecção como base para os experimentos de

superexpressão da proteína de interesse

Em seguida, para otimizar a concentração ideal de Lipofectamina 2000 (Invitrogen cat

1353709) em nossas condições laboratoriais, foram testadas três quantidades crescentes na

cultura de células HEK293T. Para verificação da eficiência, foi transfectado um plasmídeo

controle expressando GFP (pcDNA 3.1).

0  

20  

40  

60  

80  

100  

0   24   48   72   96  

Cél

ulas

/mL

( x10

E5)

Tempo (horas)

27

O número total de células contadas em cada poço e o número de células GFP+ está

representado na Tabela 3. Para as concentrações crescentes de lipofectamina observamos as

seguintes proporções de células GFP+: 57% (4,5ug de Lipofectamina) 50% (7,5ug de

Lipofectamina) e 45% (10,5ug de Lipofectamina). Nesse caso, a concentração crescente de

lipofectamina não aumentou a eficiência de transfecção, portanto, nos experimentos

seguintes, foram usados 4.5uL de lipofectamina para 2.5 ug de DNA.

No controle negativo (não-transfectado), as células apresentaram-se com aspecto saudável e

sem células verdes (GFP+). Houve perda de uma pequena parcela de células durante a

lavagem com PBS, explicada pela menor aderência de células HEK293T em relação às

células HEK293 em confluência alta.

Tabela 3. Teste de quantidades crescentes de lipofectamina para transfecção em células HEK293T. Foram contadas as células totais e em seguida as células transfectadas expressando GFP (GFP+). A última coluna representa a porcentagem das células transfectadas (células GFP+/total de células) que foi, em média, de 50%.

Quantidade de

lipofectamina

x104 células

totais/mL

x104 células

GFP+/mL

% de células

transfectadas

0ug 17 0 0

4,5ug 7 4 57

7,5ug 12 6 50

10,5ug 11 5 45

Para todos os experimentos de transfeção de CAPRIN1 foi realizada, em paralelo, uma placa

transfectada com plasmídeo pcDNA-FLAG-GFP para que esta servisse de controle de

transfecção, por contagem de células GFP+. Após 48h, as células desta placa foram

28

trispinizadas e contadas manualmente, sob fluorescência. Nos diversos experimentos, a

eficiência média obtida foi de 60%, ou seja, aproximadamente 60% das células contadas

apresentavam fluorescência verde. Esta eficiência representa um nível bom, no entanto o

protocolo de lipofectamina afirma fornecer até 80% de eficiência. Por este motivo, em

complementação às contagens manuais, foi realizada a contagem de células GFP+ por

citometria de fluxo pelo LacTad (Laboratório Central de Tecnologias de Alto Desempenho em

Ciências da Vida) que mostrou eficiência de 75,4%, o que está mais próximo da eficiência de

lipofectamina (figura 6). A diferença de aproximadamente 15% pode ser devida a não

visualização de células fracamente verdes na inspeção manual.

Figura 6. Eficiência de transfecção avaliada por FACS . Foram realizadas três placas para contagem em FACS. Por esta analise, a eficiência de transfecção foi de aproximadamente 75,4%. (FACS uti l izado no LaCTAD - Laboratório Central de Tecnologias de Alto Desempenho em Ciências da Vida).

Após os testes iniciais, foram realizados os experimentos de clonagem e transfecção para a

superexpressão da proteína CAPRIN1.

29

8.2 Clonagem da ORF correspondente a proteína CAPRIN1

A fim de se obter o cDNA de CAPRIN1 para a clonagem, uma duplicata de RNA total de

células humanas HEK293T foram extraídas e avaliadas em gel de agarose. As amostras

apresentaram-se íntegras, com bandas definidas equivalentes a 18S e 28S (Figura 7).

Figura 7. Amostras de RNA íntegras . Foi analisado 1ug de RNA total extraído de células

HEK293T. O RNA total se apresentou íntegro, com visualização das bandas ribossomais 28S e 18S.

Pelo fato das duas amostras de RNA apresentarem igual qualidade, a amostra 1 (RNA1)

foi utilizada para o passo seguinte de transcrição reversa e PCR. Após a reação de PCR, o

produto referente à CAPRIN1 foi verificado e uma banda única correspondente à

aproximadamente 2131pb foi observada (Figura 8). Para a purificação do produto de PCR, a

reação foi submetida a eletroforese e a banda correspondente foi cortada do gel, purificada,

digerida nas extremidades com enzimas de restrição BamHI e XhoI e novamente purificadas.

30

Figura 8. Produto de PCR correspondente ao cDNA de CAPRIN1. A banda de PCR

correspondendo a CAPRIN1 apresenta o tamanho correto de aproximadamente 2131pb, marcador 1Kb Plus.

Concomitantemente, o plasmídeo pcDNA-FLAG foi preparado. O plasmídeo foi linearizado por

digestão com as enzimas BamHI e XhoI, resultando num produto equivalente a 5389pb. Este

pode ser visualizado no gel de agarose abaixo (Figura 9). O fragmento liberado após a

digestão é de 50pb e quase não pode ser visualizado neste gel. Para conferir a integridade do

inserto após ser digerido, uma parte desta reação também foi analisada neste gel.

Figura 9. Plasmídeo pcDNA 3.1(+)-FLAG e inserto cDNA CAPRIN1 digeridos para clonagem. Banda correspondente ao plasmídeo digerido com as enzimas BamH II e Xho I no

31

tamanho esperado (5439pb) e banda referente ao inserto digerido com as mesmas enzimas apresentando também o tamanho esperado (2131pb). Marcador 1Kb plus (M).

Após a purificação dos produtos digeridos (Figura 10), a concentração do vetor obtida foi de

15ng/uL e a do produto de PCR para CAPRIN1 foi de 10ng/uL. O plasmídeo e o inserto

digeridos e purificados foram então combinados para a reação de ligação na proporção 3:1

(inserto:plasmídeo) (Figura 10) e posteriormente transformados em bactérias

quimiocompetentes.

Figura 10. Inserto e plasmídeo purificados, utilizados para a ligação. Verif icação dos passos finais de preparo do inserto e vetor para a clonagem, bem como da l igação. As bandas se apresentaram íntegras e nos tamanhos esperados

A transformação resultou em 1 colônia na placa controle de ligação contendo vetor vazio e 20

colônias na ligação do vetor + inserto.

Para a triagem das colônias, foi realizado PCR para 20 colônias, com objetivo de

encontrarmos as que continham inserto (Figura 11).

32

Figura 11. Triagem por PCR de colônia para fragmento de CAPRIN1 . Total de 20 colônias foram testadas para presença do inserto com o produto esperado de 627pb. 14 colônias apresentaram a banda de tamanho esperado após submissão à reação de PCR. Marcador 1kbPlus (M).

Das colônias obtidas, 14 apresentaram bandas do tamanho esperado para produto de PCR

interno a CAPRIN1 627pb: colônias 2 ,4 a 6 e 10 a 20. Foram escolhidas aleatoriamente as

colônias 4 e 11 para a confirmação por sequenciamento com 2 primers, como a colônia 11

apresentou melhor qualidade de read, o sequenciamento total do inserto foi realizado com

esta colônia.

As sequências obtidas a partir do sequenciamento com quatro primers, como descrito em

métodos, foram montadas manualmente e alinhadas contra o genoma no programa UCSC

Genome Browser (http://genome.ucsc.edu/), a sequência foi alinhada corretamente à

sequência correspondente ao cDNA de CAPRIN1 e não foram detectadas mutações, como

mostrado na Figura 12.

33

Figura 12. Alinhamento das sequências de CAPRIN1 obtidas contra o banco de dados de sequências humanas UCSC. Em preto (marcado SEQUENCIAM), a sequência obtida das montagem das reads de sequenciamento do inserto clonado. A sequência alinhou corretamente com a sequência do gene de interesse CAPRIN1 em azul, com exceção da porção em vermelho que continha alguns nucleotídeos de baixa qualidade, mas permitindo verif icação dos nucleotídeos.

Figura 13. Eletroferograma de duas das reads confirmando sequenciamento de CAPRIN1 .

Cada pico representa uma base nitrogenada ( A- verde T-vermelho C-azul G-preto) e a altura

34

e formato dos picos, sua qualidade. O cromatograma mostra a alta qualidade das reads e baixo ruído (ausência de picos baixos).

8.3 Avaliação da superexpressão das proteínas GFP e CAPRIN1

Pelo fato de os experimentos de supreexpressão serem usados como base para o

projeto, as células HEK293T foram inicialmente transfectadas com o plasmídeo controle

expressando GFP (pcDNA-FLAG-GFP) em comparação com controle negativo de células não

transfectadas. As transfecções foram seguidas de avaliação por Western blot. Para investigar

a superexpressão, as células foram lisadas e as proteínas coletadas para Western blot 48h

após a transfecção. Como controle housekeeping foi utilizado o anticorpo anti-tubulina.

Na revelação do Western blot foi confirmada a superexpressão da proteína de fusão FLAG-

GFP indicado pela banda de aproximadamente 26kDa (Figura 14). Verificamos também que

10ug de amostra de proteínas totais são o suficiente para a visualização da superexpressão

da proteína no Western blot. A banda correspondente ao controle interno de Tubulina

apresenta o peso de aproximadamente 50 kDa e teve sua expressão detectada em todas as

amostras, como esperado. O protocolo de expressão pôde ser usado sem necessidade de

muitas modificações para a construção com CAPRIN1, mantendo os anticorpos e as

concentrações usadas nesse teste. O sinal equivalente à expressão de GFP em lanes de

células não transfectadas (nas lanes 2-4) é decorrente do vazamento de amostra da lane 5.

35

Figura 14. Confirmação da superexpressão proteica de FLAG-GFP em células HEK293T.

Foram testados 10, 20 e 30ug de proteína extraída das células HEK293T sem transfecção ou células transfectadas com pFLAG-GFP respectivamente. A banda de aproximadamente 50kDa é equivalente a expressão do controle interno TUBULINA e a de ~30kDa é equivalente a FLAG-GFP. As bandas confirmam a superexpressão de GFP e apresentam o peso molecular esperado. O marcador Page Ruler foi usado na lane 1. Gel PAGE 8%.

Após a confirmação da expressão de FLAG-GFP, o experimento foi realizado com o lisado de

células transfectadas com o plasmídeo pcDNA-FLAG-CAPRIN1, usando as mesmas

concentrações de anticorpos.

Para a superexpressão de CAPRIN1, porém, testamos 20, 30, 40 e 50ug de proteína, já que a

eficiência de tranfecção de GFP poderia ser maior que a de CAPRIN1.

Como no teste anterior, foi confirmada a expressão da proteína FLAG-CAPRIN1 em relação

as células não transfectadas (Figura 15). A concentração mais baixa testada, de 20ug de

proteínas totais, foi suficiente para visualização da banda no Western blot. O controle GAPDH

apresentou bandas correspondentes ao peso esperado (37KDa) tanto nas amostras com

superexpressão quanto no controle.

Após a aquisição do anticorpo para a proteína CAPRIN1 endógena, os testes foram repetidos

com este anticorpo (Figura 15) e, novamente, confirmaram a superexpressão da proteína.

36

Figura 15. Confirmação da superexpressão proteica de FLAG-CAPRIN1 em células HEK293T. Foram testados 20, 30, 40 e 50ug de proteína dos l isados de células com e sem superexpressão de CAPRIN1, respectivamente. As bandas em vermelho correspondem ao sinal do anticorpo secundário para anti-FLAG e em verde as bandas correspondentes ao anticorpo secundário ao controle interno anti-GAPDH. As bandas apresentam os pesos esperados tanto para GAPDH quanto para FLAG-CAPRIN1, confirmando a superexpressão de CAPRIN1. Os testes foram repetidos com o anticorpo para a proteína endógena (membrana no canto direito).

8.4 Avaliação da localização celular da proteína CAPRIN1 em comparação a GFP

Para a confirmação da localização da proteína CAPRIN1 superexpressa e confirmação da

indução de grânulos citoplasmáticos, foi utilizado anticorpo anti-FLAG e células transfectadas

com pcDNA-FLAG-CAPRIN1 em comparação com células transfectadas com pcDNA-FLAG-

GFP. Para controle de background de fluorescência, foram utilizadas células sem transfecção,

como descrito em métodos.

Após submeter as células à microscopia confocal, verificou-se que a proteína CAPRIN1

superexpressa se localiza predominantemente no citoplasma em comparação com o controle

20ug 30ug

40ug 50ug

20ug 30ug

40ug 50ug

M

HEK 293T FLAG-CAPRIN1 O/E HEK 293T

CAPRIN1 (αFLAG)

GAPDH

M

αCAPRIN1)

37

com GFP (Figura 16). A expressão de FLAG-GFP apresenta um padrão predominantemente

nuclear. Em contraste, a expressão de CAPRIN1 apresentou um padrão granular, sugerindo

formação de grânulos de estresse ou de agregados de proteínas causados pela

superexpressão. O controle de células não transfectadas não apresentou autofluorescência

(imagem não mostrada pois apresenta ausência de sinal).

A marcação utilizada para o núcleo, DAPI, não pôde ser observada concomitantemente na

microscopia confocal, pois o laser para excitação requerida não está disponível no

microscópio que foi utilizado, portanto, as células não transfectadas foram identificadas em

tons de cinza (painel inferior) e posteriormente foi avaliada a fluorescência.

Figura 16. CAPRIN1 está localizada no citoplasma celular e apresenta padrão granular. Imunofluorescência uti l izando anticorpo anti-FLAG em células transfectadas com FLAG-GFP,

Sem$transfecção$

38

com FLAG-CAPRIN1, e sem transfecção (painel inferior). Foi observada localização predominantemente nuclear da proteína GFP enquanto CAPRIN1 apresenta padrão granular citoplasmático, podendo ser decorrente da formação de grânulos de estresse.

8.5 Imunoprecipitação com proteína teste GFP

Como teste de padronização, o mesmo lisado proteico de células transfectadas com o

plasmídeo pCDNA-FLAG-GFP usado para o Western blot, foi submetido a imunoprecipitação

da proteína FLAG e comparado com o controle negativo de células não transfectadas. A

imunoprecipitação foi realizada por meio de beads magnéticas com anticorpo anti-FLAG como

descrito nos métodos.

Após a coloração do gel de poliacrilamida por prata (Figura 17), foi visualizada a banda

correspondente ao peso esperado da proteína de fusão FLAG-GFP (29,52 KDa) tanto no

eluído quanto no tampão das beads fervidas, significando que a imunoprecipitação e as

lavagens funcionaram como esperado, porém o precipitado não foi inteiramente eluído.

Figura 17. Verificação da Imunoprecipitação de FLAG-GFP por gel corado com prata. A amostra controle representa as células não submetidas à superexpressão e a amostra GFP+, células com superexpressão da proteína teste FLAG-GFP. Os controles de Input são formados por l isado proteico não submetido à Imunoprecipitação. Os eluídos, são formados pelos complexos purif icados das beads após a imunoprecipitação. As amostras denominadas Beads, são formadas por tampão das beads após serem fervidas e as denominadas Sobrenadante por proteínas que não foram ligadas as beads na imunoprecipitação. M representa o marcador Page Ruler. A imunoprecipitação ocorreu como esperado, porém a

39

eluição deve ser otimizada, pois a banda com o peso correspondente à proteína FLAG-GFP se apresentou mais intensa no fervido de beads.

8.6 Imunoprecipitação da proteína CAPRIN1

8.6.1 Transfecção

Como controle de eficiência de transfecção, uma placa de 6cm foi transfectada com o

plasmídeo pcDNA-FLAG-GFP. 48h após a transfecção, as células de cada placa foram

tripsinizadas e contadas 4 vezes. A tabela 4 mostra as médias obtidas com as contagens de

cada placa, neste caso a eficiência foi de aproximadamente 52%.

Tabela 4. Eficiência de transfecção nas condições do experimento de imunoprecipitação. Foram contadas as células totais e em seguida as células expressando GFP. A última coluna representa a porcentagem das células transfectadas (células GFP+/total de células), nessas condições, de aproximadamente 52%

X104 células totais/mL X104 células GFP+/mL % de células Transfectadas

Placa1 344 175 51

Placa2 188 101 54

8.6.2 Imunoprecipitação

Para a purificação dos complexos proteicos, os lisados celulares de três placas de 10cm de

diâmetro transfectadas com FLAG-CAPRIN1 foram submetidos à imunoprecipitação da

proteína FLAG e comparado com o controle negativo de células transfectadas com o

plasmídeo contendo FLAG-GFP. A imunoprecipitação foi realizada como descrito nos

métodos.

Após a coloração do gel de poliacrilamida por prata (Figura 18), foi visualizada uma banda

única correspondente ao peso esperado da proteína de fusão FLAG-GFP (29,52 KDa) no

40

eluído, significando que a imunoprecipitação e as lavagens funcionaram como esperado. A

imunoprecipitação da proteína CAPRIN1 resultou em uma banda correspondente a

aproximadamente 120KDa, maior que o resultante da tradução de sua sequência de

nucleotídeos (78KDa), porém se aproxima do peso encontrado por Sabile e colaboradores41

bem como por Grill e colaboradores20. O arraste e outras bandas visualizadas nas lanes de IP

são correspondentes a proteínas do complexo a serem analisadas por espectrometria de

massas.

Figura 18. Gel de prata demonstrando a complexidade da amostra de IP de CAPRIN1. As amostras usadas foram a proteína de interesse CAPRIN1 e o controle de espectrometria FLAG-GFP. Nas amostras Eluídos, estão representados os complexos purif icados das beads após a imunoprecipitação, com bandas nos pesos esperados e bandas de proteínas interagentes em CAPRIN1. Os inputs são formados por proteínas do lisado anteriormente à Imunoprecipitação e os sobrenadantes pelo restante de proteínas após a imunoprecipitação. A imunoprecipitação e as lavagens funcionaram corretamente, bem como a eluição dos complexos. M representa o marcador Page Ruler.

Para uma análise especificamente da IP, as amostras foram submetidas ao Western blot com

anticorpos para FLAG. Na revelação da membrana (Figura 19) pôde-se identificar as bandas

correspondentes aos controles antes da imunoprecipitação (input) mais intensas que os

controles após imunoprecipitação (sobrenadante), indicando a eficiência da

41

imunoprecipitação. As bandas de amostras eluídas das beads apresentaram pesos

moleculares corretos equivalentes a FLAG-CAPRIN1 e FLAG-GFP e quantidade de amostra

suficiente para espectrometria de massas.

Figura 19. Confirmação de imunoprecipitação de CAPRIN1 e GFP, utilizando-se anticorpo anti-FLAG. As amostras e controles de imunoprecipitação para FLAG-CAPRIN1 e controle FLAG-GFP foram submetidas ao Western blot com anticorpo anti-FLAG. As bandas do controle input, que representa as proteínas totais das células transfectadas, confirma a superexpressão das proteínas FLAG-CAPRIN1 e FLAG-GFP. O controle sobrenadante, formado de proteínas depletadas da imunoprecipitação, confirma a l igação das proteínas de interesse às beads. Os eluídos, constituídos pela eluição do complexo das beads, apresenta bandas de tamanhos esperados para as duas amostras.

8.7 Espectrometria de massas

Após a confirmação da imunoprecipitação por Western blot, uma amostra de

imunoprecipitação de FLAG-CAPRIN1 e uma de FLAG-GFP foram digeridas e dessalinizadas

como descrito em métodos. As amostras prontas foram então injetadas no espectrômetro

Orbitrap Velos ETD do Laboratório Nacional de Biociências (LnBio). A análise dos peptídeos

encontrados foi realizada pelo LnBio.

42

Foram identificadas 226 proteínas, das quais se excluiu as proteínas comuns ao complexo de

controle FLAG-GFP e ao complexo de CAPRIN1 por serem inespecíficas. Proteínas com

menos de 3 peptídeos únicos identificados na amostra, também foram cortadas, já que a

confiabilidade de que estes peptídeos sejam pertencentes à proteína identificada diminui. O

complexo foi então caracterizado com 62 proteínas candidatas à interação com CAPRIN1

(Tabela 5).

Tabela 5. Interagentes de CAPRIN1 identificados por espectrometria de massas. Após analises iniciais, 63 proteínas foram identificadas como possíveis interagentes de CAPRIN1. Os símbolos dos genes correspondentes são representados abaixo com a frequência de peptídeos encontrada na amostra (score).

Após análises iniciais, a lista de proteínas foi clusterizada por função molecular no software

cytoscape (app BINGO). Observou-se que das funções menos especificas, as que estavam

mais enriquecidas nesta amostra eram de ligação a RNA, ligação a ácidos nucleicos e ligação

a proteínas (figura 20). Para direcionar a análise, as proteínas foram então, submetidas à

Official gene symbol Unique peptides Official gene symbol Unique peptides Official gene symbol Unique peptidescaprin1 19 DHX9 5 HNRNPK 4

HSPA1A 12 G3BP1 5 DDX17 4HSPA8 11 TUBB 5 SRRM2 4YBX1 10 SERBP1 5 RPL7 3EIF4B 9 HNRNPR 5 DDX5 3

HNRNPC 9 MAP1B 4 RPS3A 3PRMT5 8 RPS6 4 RPS3 3RPLP2 8 WDR77 4 IGF2BP3 3YBOX3 8 PABPC1 4 PPM1B 3HNRPD 7 HNRNPH1 4 RPS17 3SRSF1 7 PRMT1 4 NCL 3

ILF3 7 RPLP0 4 RBMX 3IGF2BP1 7 PABPC4 4 HSPA9 3Syncrip 6 TUBB4A 4 EIF2S3 3RPL7A 6 XRCC6 4 TUBA1B 3SF3B3 6 HNRNPL 4 SPTBN1 3

HNRNPA1 5 HNRNPA2B1 4 NCBP1 3RPL12 5 RPL21 4 ILF2 3KIF11 5 RPS9 4 FLNA 3RPS8 5 HNRNPH2 4 BCLAF1 3

HNRNPU 5 RPL23 4 RTCB 3

43

análise de enriquecimento no banco de dados DAVID Bioinformatics Resources 6.7, que

mostrou que a maior parte das proteínas candidatas, 63,2%, são classificadas como RBPs

(figura 21). Uma das proteínas identificadas foi a G3BP1, um marcador de grânulos de

estresse bem estabelecido. Esses resultados indicam a formação e a consequente

precipitação de grânulos de estresse, já que nesses complexos há enriquecimento dessa

classe de proteínas. O marcador de grânulos de estresse mais comum, TIA1, não foi

identificado, porém, na imunoprecipitação não foi usado inibidor de RNase, portanto

componentes mais distantes podem ter sido perdidos.

Figura 20. Enriquecimento da amostra em funções de ligação. Por meio do software cytoscape, a clusterização mostrou as funções moleculares mais enriquecidas (mais escuras). As setas estão na direção da função mais geral para mais específica. A análise mostra que proteínas com funções de l igação (à RNAs, à ácidos nucleicos ou à proteínas) aparecem mais na amostra.

Tabela 6. Proteínas de ligação à RNA representam 63,2% da amostra. O banco de dados DAVID Bioinformatics Resources classificou como RBPs (grupo menos especifico identificado anteriormente), grande parte das proteínas identificadas por espectrometria.

44

Como grande parte das proteínas candidatas tem função de ligação a RNA, esta função foi

mais explorada (Figura 22). Observou-se que destas proteínas, há um enriquecimento de

proteínas que se ligam a mRNAs e que podem estar envolvidas em estabilização ou

processamento destes RNAs, já que se ligam preferencialmente à cauda poli(A), 3’UTR ou

5’UTR de seus mRNAs-alvo. As funções destas proteínas podem nos dar um indicativo da

função dos grânulos formados, a hipótese aceita atualmente é de que os grânulos se formam

em situações de estresse, para que os RNAs fiquem protegidos de degradação.

Esse enriquecimento, junto com os resultados obtidos através do Par-Clip realizado por Baltz

e colaboradores23, que identificou a ligação preferencial de CAPRIN1 à porção 3’UTR de seus

alvos, indica a função de regulação de estabilização de CAPRIN1 nesses grânulos.

45

Figura 21. Proteínas envolvidas em processamento de RNA estão enriquecidas na amostra . O grupo menos especifico com 63,2% das proteínas encontradas, foi analisado separadamente. Observou-se enriquecimento das funções mais especificas envolvidas com processamento e estabil ização de mRNA, como ligação à cauda poli(A) e à 3’UTR.

8.8 Validação e caracterização de interações proteicas

Com os resultados de espectrometria de massas e a análise de funções moleculares,

foram escolhidas 9 proteínas com função de ligação a calda poli(A), 3’UTR e 5’UTR, já

que essas funções estavam enriquecidas, ou seja, mais presentes na amostra e são

relevantes para grânulos de estresse, para a validação de interação (Tabela 6).

Tabela 7. Proteínas escolhidas para teste de validação de Co-IP. Foram escolhidas proteínas com funções relevantes para os grânulos de estresse e enriquecidas na amostra analisada por espectrometria de massas.

46

Obtivemos doação de uma quantidade limitada de anticorpo para essas 9 proteínas a

fim de realizar testes iniciais de co-IP. Inicialmente testamos esses anticorpos em

Western blot usando lisado proteico de células HEK293T. Os anticorpos estão listados

na Tabela 2 em anexo e todos estes permitiram a detecção de bandas correspondentes

ao tamanho das proteínas (Figura 23) .

Proteína Função (UniProtKB)

hnRNPU

Ligação à DNA e RNA.Parte do complexo CRD que promove estabilização dp mRNA de MYC.

IGF2BP1

Recruta transcritospara mRNPS. Responsável por transporte e estabilização de mRNAs específicos.

SRSF1 Regula splicing Alternativo.

G3BP1Regula a formação de grânulos de estresse.

PaBPC4

Ligação à RNA por meio da calda poli(A). Pode estar envolvida na regulação do metabolismo de mRNAs.

IGF2BP3

Responsável por transporte e estabilização de mRNAs. Promove adesão celular em células cancerígenas.

hnRNPA2/B1Envolvida em processamento de pré-RNAs.

hnRNPA1Transporta mRNAs e modula a seleção de locais de splicing.

PaBPC1Envolvida na via de NMD (degradação de RNAs com mutação nonsense).

47

Figura 22. Teste de anticorpos adquiridos. Os testes foram realizados por Western blot com proteínas totais extraídas das células em cultura. O teste mostrou que todos os anticorpos funcionavam corretamente, identif icando bandas únicas de peso correspondente ao esperado das proteínas.

Em seguida, a primeira fase de validação constituiu em verificar a co-IP por Western blot

na mesma imunoprecipitação enviada para IP-MS, ou seja, superexpressão de FLAG-

CAPRIN1 ou de FLAG-GFP (controle), seguida de IP usando beads conjugadas com o

anticorpo anti-FLAG. Por meio desta técnica, foi validada a interação de CAPRIN1 com

PaBPC1, uma RBP localizada em grânulos de estresse37,42 que interage com outras

proteínas após fosforilação em sítios de intrincical disorder43 e tem função associada a

regulação de estabilização e à via de NMD (nonsense mediated decay)44,45. Foi validada

também a interação com IGF2BP1, RBP que possui múltiplos sítios de ligação à RNA46,

foi relacionada anteriormente à grânulos de estresse47,48, tem função no controle de

estabilização de RNAs49 e no transporte de RNAs aos dendritos50 (Figura 24).

48

A interação com a proteína hnRNPA1 foi considerada inespecífica, já que foi positiva

no controle de co-IP. A não validação da interação com a proteína G3BP1, identificada

anteriormente por Solomon e colaboradores51, pode ser devida a baixa sensibilidade do

anticorpo. As demais interações não validadas nesse conjunto de experimentos não

serão investigadas mais a fundo neste momento, mas poderiam sem avaliadas ainda

por outros métodos.

Figura 23. PaBPC1 e IGF2BP1 co-precipitam com CAPRIN1. Estas duas interações foram validadas na primeira fase de co-imunoprecipitação e foram precipitadas com anticorpos específicos na segunda fase. A interação com G3BP1, validada por outros autores, indica que as l imitações da técnica podem ter interferido na validação das outras interações.

A próxima fase de validação foi a precipitação das proteínas endógenas e verificação

de CAPRIN1 no Western blot. Neste momento final do projeto foi obtido um anticorpo

comercial anti-CAPRIN1, o que também nos possibilitou avaliar CAPRIN1 endógeno

em co-IP. Foi realizado também um tratamento dos IPs de IGF2BP1 e PaBPC1 com

RNase para verificação da dependência de RNA para interação destas proteínas com

CAPRIN1.

PaBPC1&

IGF2BP1&

hnRNPA1&

IGF2BP3&

PaBPC4&

SRSF1&

hnRNPA2/B1&

hnRNPU&

G3BP1&

GFP&

CAPRIN1&

49

Com este teste, foi validada a interação de CAPRIN1 com IGF2BP1 e caracterizada

como dependente de RNA (Figura 24). As imunoprecipitações de PABPC1 e de

CAPRIN1 endógenas não mostraram bandas no Western blot. Na imunoprecipitação

de IGF2BP1 a banda de CAPRIN1 não pôde ser identificada sem a superexpressão,

sugerindo que a quantidade de proteína endógena foi insuficiente ou dependente da

formação de grânulos de estresse em decorrência da superexpressão. Iremos

considerar este resultado inconclusivo e a melhor otimização do anticorpo para a

proteína CAPRIN1 endógena em projeto futuro. Neste momento iremos restringir

nossas conclusões aos experimentos de superexpressão.

Figura 24. Validação da interação de IGF2BP1 com CAPRIN1. A interação foi confirmada e caracterizada como dependente de RNA (A). A quantidade de proteína PABPC1(B) e CAPRIN1(C) não foi suficiente para a imunoprecipitação.

Os resultados obtidos indicam uma função do complexo proteico na regulação de mRNAs

em grânulos de estresse. O que corrobora para a hipótese de que os SGs podem triar os

RNAs que serão degradados ou estabilizados nos momentos de estresse. Apesar dos

indicativos obtidos por meio deste trabalho, a função de CAPRIN1 bem como da

associação com seus interagentes nos grânulos de estresse ainda necessitam de

elucidação. Novos experimentos de co-localização e de indução de diferentes tipos de

M OE GFP OE CAPRIN1

RNase + + - - M OE GFP OE CAPRIN1

RNase + + - -

CAPRIN1

IGF2BP1

M OE GFP OE CAPRIN1

RNase + + - - A B C

50

estresse com knockdown desta proteína, poderão nos dar melhor perspectiva quanto à

regulação de seus alvos. Além disso, testes de validação e investigação de mRNAs

ajudarão a elucidar o modo de regulação de RNAs exercido por CAPRIN1.

9 Conclusões.

• Os protocolos de cultura celular, superexpressão, imunoprecipitação, western blot e clonagem foram estabelecidos no laboratório.

• O complexo de CAPRIN1 foi caracterizado com 62 proteínas participantes e enriquecimento para função de ligação a RNA.

• Dentre as RBPs que compõe o complexo proteico de CAPRIN1 estão proteínas que se ligam a regiões regulatórias de estabilização.

• As proteínas IGF2BP1 e PaBPC1 interagem com CAPRIN1 em grânulos de estresse e a interação com IGF2BP1 é dependente de RNA.

• O complexo proteico ao qual CAPRIN1 pertence em grânulos de estresse tem potencial função de regulação de estabilização de RNAs-alvo.

51

10 Referências Bibliográficas

1. Lee, M.-H. & Schedl, T. RNA-binding proteins. WormBook 1–13 (2006). doi:10.1895/wormbook.1.79.1

2. Lunde, B. M., Moore, C. & Varani, G. RNA-binding proteins: modular design for efficient function. Nat. Rev. Mol. Cell Biol. 8, 479–90 (2007).

3. Wells, D. G. RNA-binding proteins: a lesson in repression. J. Neurosci. 26, 7135–8 (2006).

4. Keene, J. D. RNA regulons: coordination of post-transcriptional events. Nat. Rev. Genet. 8, 533–43 (2007).

5. Song, J. et al. Structure and interaction of ubiquitin- associated domain of human Fas- associated factor 1. 18, 2265–2276 (2009).

6. Martin, C. L. et al. Cytogenetic and molecular characterization of A2BP1/FOX1 as a candidate gene for autism. Am. J. Med. Genet. B. Neuropsychiatr. Genet. 144B, 869–76 (2007).

7. Cook, D., Cameron, S. a & Jones, E. V. Fragile X mental retardation protein: regulator of specific mRNAs or master regulator of global translation? J. Neurosci. 30, 7121–3 (2010).

8. Kwiatkowski, T. J. et al. Mutations in the FUS/TLS gene on chromosome 16 cause familial amyotrophic lateral sclerosis. Science 323, 1205–8 (2009).

9. Lovell, M. a & Markesbery, W. R. Ectopic expression of Musashi-1 in Alzheimer disease and Pick disease. J. Neuropathol. Exp. Neurol. 64, 675–80 (2005).

10. Pistoni, M., Ghigna, C. & Gabellini, D. Alternative splicing and muscular dystrophy. RNA Biol. 7, 441–52 (2010).

11. Wilbert, M. L. et al. LIN28 binds messenger RNAs at GGAGA motifs and regulates splicing factor abundance. Mol. Cell 48, 195–206 (2012).

12. Richards, M., Tan, S., Tan, J., Chan, W. & Bongso, A. The transcriptome profile of human embryonic stem cells as defined by SAGE. Stem Cells 51–64 (2004).

13. Gong, B. et al. Caprin-1 is a novel microRNA-223 target for regulating the proliferation and invasion of human breast cancer cells. Biomed. Pharmacother. 67, 629–636 (2013).

14. Kedracka-Krok, S. et al. Proteomic analysis of proton beam irradiated human melanoma cells. PLoS One 9, e84621 (2014).

15. Campanile, C. et al. Characterization of different osteosarcoma phenotypes by PET imaging in preclinical animal models. J. Nucl. Med. 54, 1362–8 (2013).

52

16. Shiina, N., Shinkura, K. & Tokunaga, M. A novel RNA-binding protein in neuronal RNA granules: regulatory machinery for local translation. J. Neurosci. 25, 4420–34 (2005).

17. Shiina, N., Yamaguchi, K. & Tokunaga, M. RNG105 deficiency impairs the dendritic localization of mRNAs for Na+/K+ ATPase subunit isoforms and leads to the degeneration of neuronal networks. J. Neurosci. 30, 12816–30 (2010).

18. El Fatimy, R. et al. Fragile X mental retardation protein interacts with the RNA-binding protein Caprin1 in neuronal RiboNucleoProtein complexes [corrected]. PLoS One 7, e39338 (2012).

19. Solomon, S. et al. Distinct structural features of caprin-1 mediate its interaction with G3BP-1 and its induction of phosphorylation of eukaryotic translation initiation factor 2alpha, entry to cytoplasmic stress granules, and selective interaction with a subset of mRNAs. Mol. Cell. Biol. 27, 2324–42 (2007).

20. Grill, B., Wilson, G. & Zhang, K. Activation/division of lymphocytes results in increased levels of cytoplasmic activation/proliferation-associated protein-1: prototype of a new family of proteins. J. … (2004).

21. El Fatimy, R. et al. Fragile X mental retardation protein interacts with the RNA-binding protein Caprin1 in neuronal RiboNucleoProtein complexes [corrected]. PLoS One 7, e39338 (2012).

22. Thandapani, P., O’Connor, T. R., Bailey, T. L. & Richard, S. Defining the RGG/RG motif. Mol. Cell 50, 613–23 (2013).

23. Baltz, A. G. et al. The mRNA-bound proteome and its global occupancy profile on protein-coding transcripts. Mol. Cell 46, 674–90 (2012).

24. Chen, C. Y. a, Ezzeddine, N. & Shyu, A. Bin. Chapter 17 Messenger RNA Half-Life Measurements in Mammalian Cells. Methods Enzymol. 448, 335–357 (2008).

25. Melko, M. & Bardoni, B. The role of G-quadruplex in RNA metabolism: Involvement of FMRP and FMR2P. Biochimie 92, 919–926 (2010).

26. Millevoi, S., Moine, H. & Vagner, S. G-quadruplexes in RNA biology. Wiley Interdiscip. Rev. RNA 3, 495–507 (2012).

27. Shiina, N., Yamaguchi, K. & Tokunaga, M. RNG105 deficiency impairs the dendritic localization of mRNAs for Na+/K+ ATPase subunit isoforms and leads to the degeneration of neuronal networks. J. Neurosci. 30, 12816–12830 (2010).

28. Hua, Y. & Zhou, J. Survival motor neuron protein facilitates assembly of stress granules. FEBS Lett. 572, 69–74 (2004).

29. Kramer, S. et al. Heat shock causes a decrease in polysomes and the appearance of stress granules in trypanosomes independently of eIF2(alpha) phosphorylation at Thr169. J. Cell Sci. 121, 3002–3014 (2008).

53

30. Anderson, P. & Kedersha, N. Stress granules: the Tao of RNA triage. Trends Biochem. Sci. 33, 141–50 (2008).

31. Towers, E. R., Kelly, J. J., Sud, R., Gale, J. E. & Dawson, S. J. Caprin-1 is a target of the deafness gene Pou4f3 and is recruited to stress granules in cochlear hair cells in response to ototoxic damage. J. Cell Sci. 124, 1145–55 (2011).

32. Anderson, P. & Kedersha, N. RNA granules. J. Cell Biol. 172, 803–8 (2006).

33. Wolozin, B. Regulated protein aggregation: stress granules and neurodegeneration. Mol. Neurodegener. 7, 56 (2012).

34. Liu-Yesucevitz, L. et al. Tar DNA binding protein-43 (TDP-43) associates with stress granules: analysis of cultured cells and pathological brain tissue. PLoS One 5, e13250 (2010).

35. Li, Y. R., King, O. D., Shorter, J. & Gitler, A. D. Stress granules as crucibles of ALS pathogenesis. J. Cell Biol. 201, 361–372 (2013).

36. Linder, B. et al. Tdrd3 is a novel stress granule-associated protein interacting with the Fragile-X syndrome protein FMRP. Hum. Mol. Genet. 17, 3236–46 (2008).

37. Kedersha, N. et al. Stress granules and processing bodies are dynamically linked sites of mRNP remodeling. J. Cell Biol. 169, 871–884 (2005).

38. Huang, D. W., Sherman, B. T. & Lempicki, R. A. Systematic and integrative analysis of large gene lists using DAVID bioinformatics resources. Nat. Protoc. 4, 44–57 (2008).

39. Maere, S., Heymans, K. & Kuiper, M. BiNGO: A Cytoscape plugin to assess overrepresentation of Gene Ontology categories in Biological Networks. Bioinformatics 21, 3448–3449 (2005).

40. Cervera, L., Gutiérrez, S., Gòdia, F. & Segura, M. M. Optimization of HEK 293 cell growth by addition of non-animal derived components using design of experiments. BMC Proc. 5 Suppl 8, P126 (2011).

41. Sabile, A. a. et al. Caprin-1, a novel Cyr61-interacting protein, promotes osteosarcoma tumor growth and lung metastasis in mice. Biochim. Biophys. Acta - Mol. Basis Dis. 1832, 1173–1182 (2013).

42. Kedersha, N. et al. Dynamic Shuttling of TIA-1 Accompanies the Recruitment of mRNA to Mammalian Stress Granules ✪. 151, 1257–1268 (2000).

43. Kedersha, N., Ivanov, P. & Anderson, P. Stress granules and cell signaling: More than just a passing phase? Trends Biochem. Sci. 38, 494–506 (2013).

44. Barbosa, C., Luı, A., Peixeiro, I. & Liebhaber, S. A. Interaction of PABPC1 with the translation initiation complex is critical to the NMD resistance of AUG-proximal nonsense mutations. 40, 1160–1173 (2012).

54

45. Behm-ansmant, I., Gatfield, D., Rehwinkel, J. & Izaurralde, E. decay. 26, 1591–1601 (2007).

46. Müller-mcnicoll, M. & Neugebauer, K. M. How cells get the message  : dynamic assembly and function of mRNA – protein complexes. Nat. Publ. Gr. 14, 275–287 (2013).

47. Bley, N. et al. Stress granules are dispensable for mRNA stabilization during cellular stress. Nucleic Acids Res. 43, e26–e26 (2014).

48. Weidensdorfer, D. et al. Control of c-myc mRNA stability by IGF2BP1-associated cytoplasmic RNPs. RNA 15, 104–115 (2009).

49. Denti, M. a, Viero, G., Provenzani, A., Quattrone, A. & Macchi, P. mRNA fate: Life and death of the mRNA in the cytoplasm. RNA Biol. 10, 37–41 (2013).

50. Papoulas, O. et al. dFMRP and Caprin, translational regulators of synaptic plasticity, control the cell cycle at the Drosophila mid-blastula transition. Development 137, 4201–4209 (2010).

51. Solomon, S. et al. Distinct structural features of caprin-1 mediate its interaction with G3BP-1 and its induction of phosphorylation of eukaryotic translation initiation factor 2alpha, entry to cytoplasmic stress granules, and selective interaction with a subset of mRNAs. Mol. Cell. Biol. 27, 2324–2342 (2007).

55

Anexos

Tabela 1 Primers usados no sequenciamento do inserto. F representa primer foward e R reverse, foram usados na reação de sequenciamento para confirmação do inserto. Em vermelho estão os primers padrão T7 e BGH localizados no vetor a 50pb antes e depois do inserto. Em preto são mostrados os primers desenhados no inserto

Tabela 2 Anticorpos usados na primeira fase de validação por co-imunoprecipitação. Os anticorpos foram usados na diluição descrita para a incubação das membranas de western blot após a imunoprecipitação da proteína CAPRIN1. As proteínas a serem investigadas foram escolhidas por suas funções moleculares e score na espectrometria de massas.

T7 F TAATACGACTCACTATAGGGRNG F TCCATTCACCTGTGGGACCTRNG R GAACCTGTGTCGCTTCTGGTT

BGH R TAGAAGGCACAGTCGAGGC

Membrana( anticorpos(primários( concentração(de(uso( anticorpos(secundários( concentração(de(uso(score(da(proteina(no(MS

1 Mouse&α&hnRNPU&(Sta&cruz&SC632315)

0,2ug/mL Goat&α&mouse&680nm& 1:15000 5

2 Mouse&α&IGF2BP1&(MBL&RN00IM) 1&ug/mL Goat&α&mouse&680nm& 1:15000 73 Rabbit&α&SRSF1&(Bethyl&A3026052A) 0,5ug/mL Goat&α&Rabbit&680nm& 1:15000 7

Rabbit&α&G3BP1&(MBL&RN009P) 1&ug/mL

Mouse&α&Flag&(Sigma&F3165) 1&ug/mL

Rabbit&α&PaBPC4&(MBL&RN022P) 1&ug/mL

Mouse&α&Flag&(Sigma&F3165) 1&ug/mLabbit&α&IGF2BP3&(MBL&RN009P) 1&ug/mLMouse&α&Flag&(Sigma&F3165) 1&ug/mL

Rabbit&α&hnRNPA2/B1&&(Genetex&GTX127928)

0,05ug/mL 1:15000

Mouse&α&Flag&(Sigma&F3165) 1&ug/mL

8 Rabbit&α&hnRNPA1&&(Proteintech&11176616AP)

0,16ug/mL Goat&α&Rabbit&680nm& 1:15000 5

9 Rabbit&α&PaBPC1&&(Proteintech&10970616AP)

0,04ug/mL Goat&α&Rabbit&680nm& 1:15000 4

10 Rabbit&SYNCRIP&&(Proteintech&1402461)

0,03ug/mL Goat&α&Rabbit&680nm& 1:15000 6

4Goat&α&Rabbit&680nm&+&Goat&α&mouse&800nm& 1:15000 5

Goat&α&Rabbit&680nm&+&Goat&α&mouse&800nm& 1:15000

7Goat&α&Rabbit&680nm&+&Goat&α&mouse&800nm& 4

6

5

Goat&α&Rabbit&680nm&+&Goat&α&mouse&800nm&

1:15000

4

3

56

57