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Tese de Doutorado
PREPARAÇÃO, CARACTERIZAÇÃO E APLICAÇÃO DE
NANOCOMPÓSITOS DE QUITOSANA/QUANTUM DOTS
FLUORESCENTES
Thatiana Montenegro Stamford Arnaud
Recife – PE, Brasil.
Setembro, 2012
UNIVERSIDADE FEDERAL DE PERNAMBUCO
CENTRO DE CIÊNCIAS EXATAS E DA NATUREZA
PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM CIÊNCIAS DOS MATERIAIS
Tese de Doutorado
PREPARAÇÃO, CARACTERIZAÇÃO E APLICAÇÃO DE
NANOCOMPÓSITOS DE QUITOSANA/QUANTUM DOTS
FLUORESCENTES.
Tese de doutorado apresentada ao Programa de Pós-
Graduação em Ciências de Materiais da
Universidade Federal de Pernambuco para obtenção
do Título de Doutor em Ciências de Materiais.
Orientação: Profa. Dra. Patrícia M. A. Farias
Thatiana Montenegro Stamford Arnaud
* Bolsista CNPq
Recife – PE, Brasil.
Setembro, 2012
UNIVERSIDADE FEDERAL DE PERNAMBUCO
CENTRO DE CIÊNCIAS EXATAS E DA NATUREZA
PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM CIÊNCIAS DOS MATERIAIS
Thatiana M. Stamford _________________________________________ Dedicatória
Aos meus pais que me ensinaram
com seus próprios exemplos de vida.
Thatiana M. Stamford ______________________________________ Agradecimentos
AGRADECIMENTOS
À Professora Dra. Patrícia Maria de Albuquerque Farias pela criatividade da elaboração
deste projeto, por sua firmeza em exigir resultados e principalmente por sua sinceridade,
apoio intelectual e persistência por acreditar no meu potencial.
Ao CNPq, pela bolsa concedida.
Ao Magnífico Reitor da Universidade Federal de Pernambuco, Professor Dr. Anísio
Brasileiro de Freitas Dourado e ao Vice- Reitor Prof. Sílvio Romero.
Ao Professor Dr. Eduardo Henrique Lago Falcão, Coordenador do Programa de Pós-
Graduação de Ciências dos Materiais e ao Vice - Coordenador Eduardo Padrón
Hernández pela nova administração.
Ao Professor Dr. André Galembeck por possibilitar o uso do viscosímetro do seu
laboratório, necessário para a caracterização do peso molecular da quitosana.
À Professora Dra. Giovannia Pereira pela ajuda em algumas etapas dos procedimentos
experimentais além do imenso apoio moral e intelectual.
Ao Professor Dr. Celso Pinto de Melo, por permitir a realização das análises de medidas
de tamanho por Espalhamento de Luz Dinâmico (DLS). Como também alguns espectros
de emissão e excitação dos Quantum Dots.
Thatiana M. Stamford ______________________________________ Agradecimentos
À Professora Dra. Magali pelo acesso ao freezer de -80ºC do Departamento de
Antibióticos, para acondicionamento das amostras a serem liofilizadas posteriormente
no Departamento de Química Fundamental.
Ao Professor Severino Alves Júnior do Departamento de Química Fundamental, por
disponibilizar o liofilizador do seu laboratório.
A Daniela e Iane por liofilizarem várias amostras de quitosana.
À Central Analítica do Departamento de Química Fundamental, especialmente à técnica
Eliete, pela disponibilidade e ajuda durante as medidas de ressonância magnética
nuclear, análise elementar e espectroscopia vibracional na região do infravermelho.
Ao CETENE que por intermédio da Dra. Cristina Peixoto, possibilitou a realização de
experimentos de Microscopia Eletrônica de Transmissão (MET), dos quais resultou a
aquisição de imagens das nanopartículas de quitosana.
Às técnicas do CETENE Gabriela, Joelma e Conceição, pelo apoio na preparação das
amostras para a visualização no Microscópio Eletrônico de Transmissão.
À Dra. Catarina Raposa que prestou imenso auxílio durante as análises de Microscopia
Eletrônica de Transmissão.
À Dra Horacina que possibilitou a realização do teste do HET-CAM e à Professora
Dra. Terezinha por disponibilizar todo o material dos testes de toxicidade assim como
as células neoplásicas de pulmão.
Thatiana M. Stamford ______________________________________ Agradecimentos
A técnica Maria e a aluna Sandrine pelo auxílio durante os testes de toxicidade pelo
método de MTT.
Aos colegas do Laboratório de Biofísica-química Professor Ricardo Ferreira,
Giovannia, Antonio, Cida, Rafael, Claudilene, Denise, Diego, Kilmara, Aluizio,
Clayton, Thiago, Bruno, Paulo e Polyana pela agradável convivência. Em especial, aos
colegas Antonio e Paulo Euzébio, pelo auxilio no Microscópio de fluorescência.
Aos funcionários da Secretaria do Programa de Pós-graduação em Ciência de Materiais,
Carlos, Esaú, Heloisa, Maria da Conceição, Andreza e Aylla Tainara.
Ao meu marido, Adrian, por sempre me ajudar nas realizações dos meus sonhos.
Ao meu filho, Gabriel, pela compreensão, apoio, otimismo e principalmente por
ensinar-me a valorizar todos os momentos vividos.
Aos meus pais, Newton e Tânia, pelo apoio incondicional em todas as etapas da minha
vida. A vocês, que me ensinaram princípios como honestidade, responsabilidade e
sempre acreditarem em mim, o meu amor e a minha eterna gratidão.
À minha irmã, Thayza, pela inspiração, ajuda e incentivo nesta jornada.
A todas as pessoas que, com a mais simples palavra, atitude ou auxílio, contribuíram
direta ou indiretamente na elaboração deste trabalho.
Thatiana M. Stamford ____________________________________________________
“A maior recompensa para o trabalho do
homem não é o que ele ganha com isso, mas o
que ele se torna com isso”.
Jhon Ruskin
Thatiana M. Stamford ____________________________________________ Resumo
RESUMO
O desenvolvimento de novos materiais baseados no uso da quitosana, a serem empregados
em aplicações tecnológicas e biomédicas, é um campo de pesquisa que tem despertado grande
interesse. Partículas nanométricas de quitosana têm sido utilizadas com eficiência como carreadores
de fármacos, e recentemente, estão sendo estudadas como funcionalizantes de marcadores tumorais.
Alguns trabalhos relatam a incorporação de compostos fluorescentes, tais como o FITC
(Isotiocianato de Fluoresceína) em nanopartículas de quitosana para a marcação de cultura de
células neoplásicas. No entanto, os fluoróforos orgânicos apresentam elevada fotoinstabilidade,
além de alto grau de toxicidade em relação a sistemas biológicos. Portanto, o presente trabalho
propõe a síntese de quantum dots de semicondutores e sua funcionalização com nanopartículas de
cloridrato de quitosana (NCQ) obtidas através do método de gelificação iônica com o tripolifosfato
de pentasódio (TPP). Para saber qual a NCQ ideal para esta funcionalização foi feito um estudo
preliminar variando o grau de desacetilação e despolimerização a fim de obter nanopartículas com
propriedades específicas para a aplicabilidade sugerida no presente trabalho. As técnicas utilizadas
para obter a caracterização estrutural, grau de desacetilação e despolimerização das quitosanas
foram respectivamente: espectroscopia vibracional na região do infravermelho, análise elementar /
ressonância magnética nuclear e medidas de viscosidade. A caracterização morfológica das
nanopartículas de quitosana e a determinação do tamanho médio das partículas foram realizadas
através da microscopia eletrônica de transmissão (MET) e por medidas de espalhamento dinâmico
de luz (DLS), respectivamente. A estabilidade do nanocompósito foi verificada através de medidas
de Potencial Zeta. Foram feitos testes de biocompatibilidade dos nanocompósitos através da
membrana corialantóide do ovo e pelo método do MTT. A marcação deste nanocompósito inédito
em células neoplásicas pulmonares (linhagem NCI-H292) foi observada pela microscopia de
fluorescência. Os resultados obtidos comprovaram que o CdS passivado com Cd(OH) e
funcionalizado com NCQ na proporção de 50:1 conseguiu marcar culturas de células de câncer de
pulmão. Os testes realizados com as membranas corialantóide do ovo sugeriram que o CdS e o
CdS/Cd(OH)2 são irritantes. No entanto, o método de MTT mostrou que o CdS/Cd(OH)2, as NCQ e
o NC não apresentam atividade citotóxica.
Palavras-chaves: quantum dots, nanopartículas de cloridrato de quitosana, gelificação
iônica, marcação celular, neoplasias pulmonares, HET-CAM, método do MTT.
Thatiana M. Stamford _____________________________________________Abstract
ABSTRACT
The development of new materials based on the use of chitosan, to be used in biomedical
and technological applications, is a field of research that has attracted great interest.
Nanosized particles of chitosan have been used effectively as carriers of drugs, and recently,
are being studied as functionalizing of tumor markers. Some studies have reported the
incorporation of fluorescent compounds, such as FITC (fluorescein isothiocyanate) on
chitosan nanoparticles for marking culture of neoplastic cells. However, organic
fluorophores have high fotoinstabilidade, and high degree of toxicity to biologic systems.
Therefore, this paper proposes the synthesis of semiconductor quantum dots and their
functionalization with nanoparticles of chitosan hydrochloride (NCQ) obtained by ionic
gelation method with pentasódio tripolyphosphate (TPP). To learn what NCQ ideal for this
functionalization was done a preliminary study by varying the degree of deacetylation and
depolymerization to obtain nanoparticles with specific properties for the applicability
suggested in this work. The techniques used for structural characterization, degree of
deacetylation and depolymerisation of chitosans were respectively vibrational spectroscopy
in the infrared region, elemental analysis / NMR and viscosity measurements.
Morphological characterization of chitosan nanoparticles and determining the average
particle size were performed by transmission electron microscopy (TEM) and by
measurements of dynamic light scattering (DLS), respectively. The stability of the
nanocomposite was verified by measurements of Zeta Potential. Tests were made
biocompatibility of the nanocomposites through the membrane and egg chorioallantoic by
the MTT method. The marking of the nanocomposite unprecedented in lung cancer cells
(NCI-H 292 strain) was observed by fluorescence microscopy. The results proved that the
CdS passivated with Cd (OH)2 and functionalized with NCQ at 50:1 ratio to score cell
cultures of lung cancer. The tests performed with the egg chorioallantoic membranes
suggested the CdS CdS and / Cd (OH)2 are irritating. However, the method of MTT showed
that CdS / Cd (OH) 2, and CN NCQ do not exhibit cytotoxic activity.
Keywords: quantum dots, nanoparticles of chitosan hydrochloride, ionic gelation, cell
labeling, lung cancer test, HET-CAM, MTT method.
Thatiana M. Stamford ____________________________________________________
LISTA DE FIGURAS
Páginas
Figura 01: Estrutura química da quitina e da celulose. ................................................... 22
Figura 02: Esquema da reação de N-desacetilação da quitina para obtenção de
quitosana através de hidrolise por hidróxido de sódio. ....................................................
23
Figura 03: Estrutura química da quitosana. .................................................................... 23
Figura 04: Diferentes nanopartículas com aplicação farmacêuticas: (A) nanoesfera
(sistema matricial) e (B) nanocápsula (sistema reservatório)...........................................
Figura 05: Método de copolimerização interfacial para se preparar nanocápsulas.........
Figura 06: Interação iônica entre a quitosana e o tripolifosfato de sódio (TPP)..............
Figura 07: Esquema de formação de um éxciton. h+ representa o buraco gerado na
banda de valência, pela excitação do elétron e-................................................................
26
27
28
31
Figura 08: Soluções de quantum dots de CdSe, sob iluminação UV............................. 32
Figura 09: Propriedades ópticas de semicondutores - quantum dots .............................. 33
Figura 10: Fotodegração em função do tempo: antígenos nucleares corados com
Alexa Fluor 488 e microtúbulos corados com QD 605- CdSe (Tempos observados: 0s,
20s, 60s, 120s e 180s) ......................................................................................................
35
Figura 11: Espectros de excitação e emissão típicos de quantum dots (esquerda) e
moléculas orgânicas (direita) utilizados como marcadores fluorescentes em
microscopia confocal ........................................................................................................
35
Figura 12: Redução do tamanho de partículas semicondutoras dentro do regime de
confinamento quântico (Eg= energia da banda proibida, “band gap”; BC= banda de
condução e BV= banda de valência) ................................................................................
37
Figura 13: Espectros de absorção (linhas contínuas) e emissão (linhas pontilhadas) de
quantum dots de CdSe com diferentes tamanhos. Os picos de absorção de nanocristais
com diâmetro de 2.3 /4.0 /3.8 /4.6nm estão em 507 /547 /580 /605nm. Os picos da
fluorescência estão em 528 /570 /592 /637 nm ................................................................
42
Figura 14: Representação esquemática da funcionalização do quantum dot .................. 44
Figura 15: Variação do Potencial Zeta de uma solução em função do pH...................... 46
Figura 16: Potenciais aplicações de quantum dot em sistema biológico ........................ 47
Figura 17: Disseminação de células tumorais (metástase) ............................................. 50
Figura 18: Representação do acúmulo de nanopartículas em regiões tumorais devido
ao efeito EPR ....................................................................................................................
51
Thatiana M. Stamford ____________________________________________________
Figura 19: Obtenção de uma linha celular a partir de um tecido..................................... 53
Figura 20: Estruturas do ovo fertilizado: (a) casca do ovo; (b) membrana
carialantóide; (c) clara e (d) câmara aérea .......................................................................
55
Figura 21: Representação da preparação de quantum dots de sulfeto de cádmio ........... 65
Figura 22: Passivação de quantum dot de CdS com Cd(OH)2 ........................................ 55
Figura 23: Representação da passivação da suspensão de quantum dots de CdS com
hidróxido de cádmio Cd(OH)2 e luminescência após passivação ....................................
65
Figura 24: Síntese (CdS), passivação (CdS/Cd(OH)2) e funcionalização do quantum
dot com NCQ (Nanocompósito: CdS/Cd(OH)2 + NCQ) ...............................................
69
Figura 25: Imagens das etapas experimentais do teste de irritabilidade: (a) Ovos no
10º dia de incubação; (b) Remoção da casca externa; (c) Eliminação de membrana
branca, previamente umidificada com água destilada; (d) Membrana Corialantóide do
ovo; (e) Aplicação da amostra e (f) Observação por 5 minutos........................................
70
71
Figura 26: Frasco de cultura contendo células descongeladas em manutenção ............. 75
Figura 27: Esquema da quitina/quitosana com as numerações dos prótons que
aparecem no RMN 1H.......................................................................................................
75
Figura 28: Interações intramoleculares e intermoleculares em/entre as cadeias de
quitosana ...........................................................................................................................
81
Figura 29: Espectro de RMN 1H da Quitosana Comercial (QC) .................................... 82
Figura 30: Espectro de RMN 1H da quitosana Desacetilada (QD) ................................. 83
Figura 31: Imagens de MET das nanopartículas de quitosana preparadas com
quitosana (a) comercial (b) desacetilada (c) desacetilada e despolimerizada...................
90
Figura 32: Imagens de MET das nanopartículas de quitosana preparadas com (a)
Quitosana Comercial Despolimerizada com peróxido a 5%. (NQCD5%) e (b)
Quitosana Comercial Despolimerizada com peróxido a 15% (NQCD15%) ...................
90
Figura 33: Imagens de MET das nanopartículas de quitosana preparadas com (a)
Quitosana Desacetilada Despolimerizada com peróxido a 5% (NQDD5%) e (b)
Quitosana Desacetilada Despolimerizada com peróxido a 15% (NQDD15%)................
91
Figura 34: Imagem de MET de nanopartículas de quitosana obtidas por gelificação
iônica usando o Triton X-100 como surfactante...............................................................
92
Figura 35: Histogramas com distribuição de tamanho das nanopartículas de (a)
Quitosana Comerciale Despolimerizada com peróxido a 5%. (QCD5%), (b) Quitosana
Comercial Despolimerizada com peróxido a 15% (QCD15%), (c) Quitosana
Thatiana M. Stamford ____________________________________________________
Desacetilada Despolimerizada com peróxido a 5% (QDD5%) e (d) Quitosana
Desacetilada Despolimerizada com peróxido a 15% (QDD15%) ...................................
94
Figura 36: Distribuição de tamanho das nanopartículas produzidas por quitosana (a)
comercial, (b) despolimerizada (c) desacetilada (d) desacetilada e despolimerizada.......
96
Figura 37: Estrutura do cloridrato de quitosana .............................................................. 101
Figura 38: Espectro de absorção da suspensão de nanopartículas de CdS/Cd(OH)2..... 102
Figura 39: Espectros de excitação (a) e emissão (b) da suspensão de CdS/Cd(OH)2
representados pela intensidade normalizada (u.a) versus comprimento de onda (nm).....
103
Figura 40: Microfotografia da membrana corioalantóide. (A) Aparência normal do
epitélio e de seus componentes e (B) Controle positivo de irritação NaOH a 0,1N,
visualizando hemorragia (H), lise vascular (L) e coagulação (C) ....................................
109
Figura 41: Imagem da microscopia de fluorescência de células neoplásicas
pulmonares com meio de cultura DMEN (Grupo:BRANCO)..........................................
111
Figura 42: Imagens de microscopia de fluorescência de células neoplásicas
pulmonares com meio de cultura DMEN e NCQ
(2,5mg/mL)..........................................
112
Figura 43: Imagens de microscopia de fluorescência de células neoplásicas
pulmonares com meio de cultura DMEN e CdS/Cd(OH)2...............................................
Figura 44: Imagens de microscopia de fluorescência de células neoplásicas
pulmonares com meio de cultura DMEN e NC (CdS/Cd(OH)2 com Glutaraldeído)......
113
114
Figura 45: Imagens de microscopia de fluorescência no visível de células neoplásicas
pulmonares com: a) meio de cultura DMEN e b) DMEN com NC (1:10) ......................
115
Figura 46: Imagens de microscopia de fluorescência de células neoplásicas
pulmonares com meio de cultura DMEN e NC (50:1)......................................................
116
Figura 47: Imagens de microscopia de fluorescência de células neoplásicas
pulmonares com meio de cultura DMEN e NC (100:1)....................................................
116
Thatiana M. Stamford ____________________________________________________
LISTA DE TABELAS
Páginas
Tabela 01: Parâmetros físicos para semicondutores.................................................. 38
Tabela 02: Classificação do potencial de irritação das substâncias de acordo com
o teste de irritabilidade HET-CAM ...........................................................................
72
Tabela 03: Classificação do potencial citotóxico das amostras de acordo com o
Método do MTT ........................................................................................................
73
Tabela 04: Atribuição das bandas do infravermelho da Quitosana Comercial (QC)
e da quitosana Desacetilada (QD) .............................................................................
78
Tabela 05: Integração dos picos do espectro de RMN 1H da Quitosana antes e
depois da desacetilação para o cálculo do grau de desacetilação...............................
83
Tabela 06: Valores dos graus de desacetilação em porcentagem da quitosana
determinados por RMN 1H, a partir de duas equações distintas.................................
84
Tabela 07: Percentuais de carbono, nitrogênio, hidrogênio, a relação carbono /
nitrogênio e o grau de desacetilação das amostras de Quitosana Comercial (QC) e
da Quitosana Desacetilada (QD) ...............................................................................
85
Tabela 08: Valores da viscosidade intrínseca e da massa molar viscosimétrica
média das quitosanas estudadas .................................................................................
88
Tabela 09: Atribuições das bandas do infravermelho das nanopartículas de
cloridrato de quitosana (NCQ) ...................................................................................
88
Tabela 10: Percentuais de carbono, nitrogênio, hidrogênio, a relação carbono /
nitrogênio e o grau de desacetilação da amostra de nanopartículas de cloridrato de
quitosana (NCQ) ........................................................................................................
99
Tabela 11: Valores da viscosidade intrínseca e da massa molar viscosimétrica
média das nanopartículas de cloridrato de quitosana (NCQ) ....................................
99
Tabela 12: Valores de potenciais encontrados para as amostras testadas ................ 105
Tabela 13: Potencial de irritação da água destilada (AD), Solução salina 0,9% (SS
0,9%), Sulfeto de cádmio (CdS) , Sulfeto de cádmio passivado com camada de
hidróxido de cádmio (CdS/Cd(OH)2), Nanopartícula de cloridrato de quitosana
(NCQ), Nanocompósito (NC) para o teste da Membrana Corialantoide do ovo
HET-CAM) para vasoconstricção, hemorragia e coagulação. Controle positivo:
lauril sulfato de sodio 1% (LSS1%). ........................................................................
106
Thatiana M. Stamford ____________________________________________________
Tabela 14: Valores de absorbância (Abs.) e percentual de Inibição de Crescimento
Celular (% IC) obtidos para o grupo controle, CdS/Cd(OH)2, NCQ e NC.................
110
Thatiana M. Stamford ____________________________________________________
LISTA DE ABREVIATURAS
A Absorbância
A 1655 Absorbância no comprimento de onda 1655 cm-1
A 3450 Absorbância no comprimento de onda 3450 cm-1
C % Percentual de carbono
C/N Relação entre carbono e nitrogênio
EPR Enhanced Permeation and Retention
CCS Centro de Ciências da Saúde
D2O Óxido de deutério
DLS Espalhamento Dinâmico de Luz
EA Análise Elementar
GD% Percentual do Grau de Desacetilação
H% Percentual de hidrogênio
H2 Núcleo de hidrogênio na posição 2 do anel glicopiranosídico
HET-CAM Hen’s Egg Test on Chorio- Allantoic Membrane
MET Microscopia Eletrônica de Transmissão
MTT Brometo de [3-(4,5-dimetiltiazol-2-il)-2,5-difeniltetrazólio]
µm Micrômetro(s)
Nm Nanômetro(s)
QC Quitosana Comercial
QCD5% Quitosana Comercial Despolimerizada 5%
QCD15% Quitosana Comercial Despolimerizada 15%
QDs Quantum dots
QD Quitosana Desacetilada
QDD5% Quitosana Desacetilada e Despolimerizada 5%
QDD15% Quitosana Desacetilada e Despolimerizada 15%
NQCD5% Nanopartícula de Quitosana Comercial Despolimerizada 5%
NQCD15% Nanopartícula de Quitosana Comercial Despolimerizada 15%
NQDD5% Nanopartícula de Quitosana Desacetilada e Despolimerizada 5%
NQDD15% Nanopartícula de Quitosana Desacetilada e Despolimerizada 15%
NCQ Nanopartícula de Cloridrato de Quitosana
NC Nanocompósito
TPP Tripolifosfato de pentasódio
Thatiana M. Stamford __________________________________________________
SUMÁRIO
Páginas
1. INTRODUÇÃO ................................................................................................. 20
1.1. QUITINA E QUITOSANA.......................................................................... 20
1.1.1. Histórico ............................................................................................ 20
1.1.2. Considerações ................................................................................... 21
1.1.3. Propriedades ..................................................................................... 24
1.2. NANOPARTÍCULA DE QUITOSANA .................................................... 25
1.2.1. Método de Gelificação Iônica........................................................... 28
1.3. QUANTUM DOTS...................................................................................... 29
1.3.1. Nanopartículas de semicondutores: quantum dots ......................
1.3.2. Confinamento quântico dos quantum dots ....................................
1.3.3. Obtenção e características dos quantum dots ................................
1.3.4. Colóides .............................................................................................
1.3.5. Propriedades ópticas dos quantum dots .........................................
1.3.5.1. Espectros de absorção e emissão .............................................
1.3.6. Passivação .........................................................................................
1.3.6.1. Sulfeto de Cádmio (CdS) ........................................................
1.3.7. Funcionalização ................................................................................
29
30
36
39
41
41
42
43
44
1.3.6.1. Potencial Zeta .........................................................................
1.3.8. Aplicação do Quantum Dot em Sistema Biológico ........................
1.4. ALGUMAS CONSIDERAÇÕES BIOLÓGICAS SOBRE O SISTEMA
ESTUDADO ...........................................................................................................
1.4.1. Câncer ...............................................................................................
1.4.2. Cultura Celular.................................................................................
1.4.3. Carcinoma de Células Escamosas de Câncer de Pulmão ...........
1.5. TESTES DE BIOCOMPATIBILIDADE .......................................................
1.5.1. Teste de irritabilidade por HET-CAM .........................................
1.5.2. Teste de Toxicidade pelo Método do MTT ....................................
1.6. APLICAÇÃO DE NANOCOMPÓSITO EM SISTEMA BIOLÓGICO ........
45
47
48
48
52
53
55
55
56
56
Thatiana M. Stamford __________________________________________________
2. OBJETIVOS ...................................................................................................... 58
2.1. OBJETIVO GERAL .................................................................................... 58
2.2. OBJETIVO ESPECÍFICO ........................................................................... 58
3. PROCEDIMENTO EXPERIMENTAL ......................................................... 59
3.1. OBTENÇÃO DA QUITOSANA ................................................................. 59
3.1.1. Desacetilação da quitosana ................................................................. 59
3.1.2. Despolimerização da quitosana .......................................................... 59
3.2. PREPARAÇÃO DAS NANOPARTÍCULAS DE QUITOSANA ............ 60
3.2.1. Método de Gelificação Iônica ........................................................... 60
3.3. OBTENÇÃO DE NANOPARTÍCULAS DE CLORIDRATO DE
QUITOSANA .....................................................................................................
61
3.4. CARACTERIZAÇÃO DAS QUITOSANAS............................................... 62
3.4.1. Caracterização estrutural ................................................................ 62
3.4.1.1. Espectroscopia Vibracional na Região do Infravermelho ............ 62
3.4.2. Grau de desacetilação ...................................................................... 62
3.4.2.1. Ressonância Magnética Nuclear ................................................ 62
3.4.2.2. Análise Elementar ...................................................................... 63
3.4.3. Massa Molar ..................................................................................... 63
3.4.3.1. Medidas de Viscosidade .............................................................. 63
3.5. CARACTERIZAÇÃO DAS NANOPATÍCULAS DE QUITOSANA ....... 63
3.5.1. Medidas de Tamanho por Espalhamento Dinâmico de Luz ........ 63
3.5.2. Microscopia Eletrônica de Transmissão ....................................... 64
3.6. SÍNTESE DE QUANTUM DOTS ................................................................ 64
3.6.1. Síntese do sulfeto de cádmio (CdS) ................................................. 64
3.6.2. Passivação do CdS com Cd(OH)2 ................................................... 65
3.7. CARACTERIZAÇÃO DO QUANTUM DOT ............................................ 66
3.7.1. Espectroscopia de Absorção ............................................................ 66
3.7.2. Espectroscopia de Excitação e Emissão .........................................
3.7.3. Medidas de Tamanho por Espalhamento Dinâmico de Luz ........
67
67
3.8. OBTENÇÃO DO NANOCOMPÓSITO .....................................................
3.8.1. Funcionalização do quantum dot: Biocompatibilização ...............
67
67
Thatiana M. Stamford __________________________________________________
3.8.1.1. Glutaraldeído (Controle) .............................................................
3.8.1.2. Nanopartículas de cloridrato de quitosana (Nanocompósito) .....
3.8.1.3. Potencial Zeta ..............................................................................
3.9. TESTES DE BIOCOMPATIBILIDADE DO NANOCOMPÓSITO ..............
3.9.1. Teste de irritabilidade por HET-CAM ..........................................
3.9.1.1. Materiais e Equipamentos ..........................................................
3.9.1.2. Procedimento do teste HET-CAM ..............................................
3.9.2. Teste de Toxicidade pelo Método do MTT ....................................
3.9.2.1. Materiais e Equipamentos ..........................................................
3.9.2.2. Ensaio do MTT ...........................................................................
3.10. APLICAÇÃO DO NANOCOMPÓSITO EM SISTEMA BIOLÓGICO...
3.10.1. Sistema Biológico ............................................................................
3.10.1.1. Cultura de células .....................................................................
3.10.1.2. Preparo de placa de cultura de células de câncer de pulmão.....
3.10.2. Caracterização do Sistema Biológico ..........................................
3.10.2.1. Incubação e Preparo das lâminas ..............................................
3.10.2.2. Microscopia de Fluorescência ...................................................
3.10.2.3. Descarte do material biológico .................................................
4. RESULTADOS E DISCUSSÃO ......................................................................
67
68
69
70
70
70
70
72
72
72
74
74
74
75
76
76
77
77
78
4.1. CARACTERIZAÇÃO DA QUITOSANA .................................................. 78
4.1.1. Características Estruturais .............................................................. 78
4.1.1.1. Espectroscopia vibracional da região do infravermelho .............. 78
4.1.2. Grau de desacetilação ...................................................................... 79
4.1.2.1. Ressonância Magnética Nuclear ................................................. 80
4.1.2.2. Análise Elementar ........................................................................ 85
4.1.3. Massa Molar ..................................................................................... 86
4.1.3.1. Medidas de viscosidade ............................................................... 86
4.2. CARACTERIZAÇÃO DAS NANOPARTÍCULAS DE QUITOSANA .... 89
4.2.1. Microscopia Eletrônica de Transmissão (MET) .......................... 89
4.2.2. Medidas de Tamanho por Espalhamento Dinâmico de Luz ........ 92
4.3. CARACTERIZAÇÃO DAS NANOPARTÍCULAS DE CLORIDRATO
Thatiana M. Stamford __________________________________________________
DE QUITOSANA ............................................................................................... 97
4.3.1. Características Estruturais .............................................................. 97
4.3.1.1. Espectroscopia vibracional da região do infravermelho .............. 97
4.3.2. Grau de desacetilação ...................................................................... 98
4.3.2.2. Análise Elementar ........................................................................ 98
4.3.3. Massa Molar ..................................................................................... 99
4.3.3.1. Medidas de viscosidade ............................................................... 99
4.3.4. Microscopia Eletrônica de Transmissão ....................................... 100
4.4. CARACTERIZAÇÃO DOS QUANTUM DOTS DE CdS/Cd(OH)2........... 101
4.4.1. Espectroscopia de Absorção eletrônica........................................... 101
4.4.2. Espectroscopia de Excitação e Emissão ......................................... 103
4.5. OBTENÇÃO DOS NANOCOMPÓSITOS.................................................. 104
4.5.1. Potencial Zeta ................................................................................... 105
4.6. TESTES DE BIOCOMPATIBILIDADE DO NANOCOMPÓSITO.................... 106
4.6.1. Teste de Irritabilidade por HET-CAM........................................... 106
4.6.1.1. Água ............................................................................................. 107
4.6.1.2. Salina 0,9% .................................................................................. 107
4.6.1.3. CdS ............................................................................................... 107
4.6.1.4. CdS/Cd(OH)2 ............................................................................... 108
4.6.1.5. Nanopartículas de cloridrato de quitosana (NCQ) ....................... 108
4.6.1.6. Nanocompósito (NC).................................................................... 108
4.6.1.7. Lauril sulfato de sódio à 3% ......................................................... 109
4.6.2. Teste de toxicidade pelo Método do MTT....................................... 110
4.7. APLICAÇÃO DO NANOCOMPÓSITO EM SISTEMA BIOLÓGICO................ 111
4.7.1. Células de câncer de pulmão............................................................ 111
5. CONCLUSÕES ................................................................................................. 119
REFERÊNCIAS ........................................................................................................
PRODUÇÃO CIENTÍFICA DURANTE O DOUTORADO ..........................................
ANEXO – ARTIGO ENVIADO PARA CARBOHYDRATE RESEARCH.....................
121
138
142
Thatiana M. Stamford __________________________________________ Introdução
20
1. INTRODUÇÃO
1.1. QUITINA E QUITOSANA
1.1.1. Histórico
A quitina foi descrita pela primeira vez em 1811 na França por Braconnot,
professor de Historia Natural, que durante suas pesquisas ao tratar Agaricus volvaccus e
outros fungos, com solução alcalina, encontrou uma substância com conteúdo maior de
nitrogênio do que a madeira, concluindo que se tratava de uma nova substância
identificada em plantas, a qual denominou de “fungine” (Anjos, 2005). Em 1823, Odier
isolou uma substância contida nas carapaças de insetos semelhante à encontrada em
plantas, a qual chamou de quitina que em grego “khitón” significa túnica, envelope ou
cobertura, contudo não conseguiu detectar nitrogênio. Odier estabeleceu pela primeira
vez uma relação entre as substâncias de suporte encontradas na carapaça de insetos e
nos tecidos vegetais (Muzzarelli, 1977). Payen em 1843 detectou a presença de
nitrogênio da quitina e iniciou a discussão entre a diferença de celulose e quitina.
Ledderhose (1878) identificou a quitina como um composto de glucosamina e ácido
acético e escreveu a equação de hidrólise. Gilson (1894) confirmou a presença de
glucosamina na quitina (Stamford, 2007).
Odier e Childre relataram o isolamento da quitina usando vários tratamentos
com soluções de hidróxido de potássio concentrado o que os levou a um equívoco, pois
na realidade os pesquisadores haviam isolado a quitosana (Campos-Takaki, 2005). Esta
foi descrita pela primeira vez em 1859 por Rouget, como sendo uma quitina modificada,
pois em seus estudos relata que ao ferver a quitina em hidróxido de potássio
concentrado, a mesma fica solúvel em ácidos orgânicos (Muzzarelli, 1977). Em 1894
Thatiana M. Stamford __________________________________________ Introdução
21
Hoppe-Seyler, ao estudar a quitina modificada, propôs o nome quitosana, pelo fato de
que a quitosana possui a mesma quantidade de nitrogênio da quitina (Hong, 1996).
A quitosana foi produzida industrialmente pela primeira vez em 1971, no Japão.
As pesquisas sobre quitina e quitosana e suas aplicações só começaram a receber
investimentos científicos e tecnológicos em torno de 1979, quando se começou a
perceber o grande potencial de suas aplicações (Monteiro Júnior, 1999). Em 1986, o
Japão já possuía quinze industrias produzindo quitina e quitosana em escala comercial.
Atualmente, a quitosana devido a sua inúmeras aplicações, vem recebendo atenção
especial dos pesquisadores (Roberts, 1992; Monteiro Júnior, 1999; Wang et al., 2008;
Mauro et al., 2009).
1.1.2. Considerações
Quitina é um polímero natural, insolúvel, linear que apresenta o mesmo tipo de
unidade monomérica β-1,4 N-acetilglucosamina e, com exceção da celulose, é o
polissacarídeo mais abundante e largamente distribuído na natureza, (Canela & Garcia,
2001). Sua estrutura é similar à da celulose, exceto pelo fato de que o grupo hidroxila
do carbono na posição 2 do anel glicopiranosídico é substituído pelo grupo acetamida
(Figura 01). Esta semelhança estrutural é refletida nas funções similares exercidas por
estes dois polímeros na natureza, pois ambos atuam como material estrutural e protetor
(Signini, 2002; Campos-Takaki, 2005). A quitina é encontrada no exoesqueleto dos
crustáceos, insetos, artrópodes e na parede celular de fungos.
Thatiana M. Stamford __________________________________________ Introdução
22
Figura 01: Estrutura química da quitina e da celulose. Fonte: Signini, 2002..
A desacetilação da quitina conduz a um novo polímero denominado quitosana
(Amorim et al, 2000; Andrade et al., 2003). Geralmente o processo de desacetilação
ocorre a partir da hidrólise da quitina, em meio alcalino, em temperaturas elevadas sob
condições heterogêneas (Klug et al., 1998;Tonhi et al., 2002). No entanto, este processo
também pode ocorrer utilizando enzimas específicas, como a quitinase ou pela ação de
microrganismos (Monteiro Júnior, 1999; Kim & Rajapakse, 2005). A reação química
de desacetilação da quitina está representada na figura 02. A quitina pode sofrer vários
graus de desacetilação, resultando em diversos derivados da quitosana (Canela &
Garcia, 2001; Khan et al., 2002). O produto totalmente desacetilado é raramente obtido,
visto que o tempo necessário para completar a reação de desacetilação é longo e acaba
acarretando na despolimerização da cadeia. (Klug et al,1998).
.
Thatiana M. Stamford __________________________________________ Introdução
23
Figura 02: Esquema da reação de N-desacetilação da quitina para obtenção de quitosana
através de hidrolise por hidróxido de sódio. Fonte: Anjos (2005).
Quitosana é um copolímero natural, composto por unidades β-1,4 D-
glucosamina ligadas a resíduos de N-acetilglucosamina (Figura 02) (Chatterjee et al,
2005). A quitosana não é muito encontrada na natureza, quando comparada à quitina e a
celulose, podendo ser encontrada na parede celular de alguns fungos, principalmente da
Classe Zygomycetes e em alguns moluscos; (Silva et al, 2006). Desta forma, a melhor
maneira de obter quitosana é na indústria através da hidrólise química da quitina
(Pochanavanich & Suntornsuk, 2002; Okawa et al., 2003; Franco et al., 2005; Amorim
et al., 2006). Existem vários derivados da quitosana, os quais podem se diferenciar pelo
grau de desacetilação, assim como pela disposição dos grupos N-acetil residuais, na
cadeia do polímero (Rinaudo, 2006; Stamford et al., 2007).
Figura 03: Estrutura química da quitosana. Fonte: Hiorth et al., 2006
O
CH2
H
H
H
OH
NH2
H
OH
H
O
CH2
H
H
H
OH
NH2
HH
OH
O
n
O
CH2
H
H
H
OH
NH
H
OH
H
O
CH2
H
H
H
OH
NH
HH
OH
O
O
O
n
NaOH
Desacetilação
Quitina Quitosana
Thatiana M. Stamford __________________________________________ Introdução
24
1.1.3. Propriedades
A quitosana é um polímero caracterizado por propriedades específicas
revelando potencial para inúmeras aplicações em vários produtos comerciais. As
principais propriedades deste polissacarídeo são: bioatividade, biodegradabilidade,
biocompatibilidade, reatividade do grupo amino desacetilado, permeabilidade seletiva,
ação polieletrolítica, habilidade em formar gel e filme, habilidade de quelação e
capacidade adsortiva (Synowieck & Al-Khateeb, 2003; Tharanathan & Kittur, 2003).
No pH biológico a quitosana apresenta-se como um policátion. Em meio ácido
os grupos amino da quitosana captam íons hidrogênio do meio, resultando em uma
carga global positiva no polímero. Esta característica permite a sua interação com
moléculas carregadas negativamente tais como: gorduras, tecido animais ou vegetais,
membrana celular, entre outras formas (Horner et al., 1997; Pawtlowska, 1997). As
possibilidades de aplicações são ainda enriquecidas pelo fato que a quitosana pode ser
preparada em diferentes formas, tais como soluções de viscosidade controlada, géis,
filmes e membranas, microesferas e nanopartículas (Campana Filho et al., 2007,
Javakumar & Mano, 2007; Sezer et al., 2007; Wongpanit et al., 2007).
A quitosana vem sendo extensivamente estudada devido às suas propriedades
peculiares que lhe conferem um aproveitamento bastante versátil, tais como:
regeneração de tecidos epiteliais (Maia et al., 2006; Cho et al., 2007; Olmez
et al., 2007);
confecção de membranas artificiais (Costa et al., 2006);
promotor de osteogênese (Murugan & Ramakrishna, 2004);
coadjuvante da higiene oral (Sano et al., 2002; Sano et al., 2003);
absorção de gordura e redução do colesterol sérico (Gades & Stern, 2005);
componente de cosméticos (Kohei & Maki, 2006);
Thatiana M. Stamford __________________________________________ Introdução
25
remoção e recuperação de diferentes resíduos (Vivek & Torres, 2000);
biotransformação e detecção de pesticidas (Du et al, 2007)
recobrimento de sementes na agricultura (Velásquez, 2003);
degradação de corantes (Borderías, et al., 2005);
agente de floculação no tratamento de efluentes aquosos (Díaz et al., 2007).
antibacteriano (Ikinci et al., 2002; Chung et al., 2004; Yadav & Bhise, 2004,
Cao & Sun, 2007);
Embora nos últimos anos estas aplicações da quitosana, já estejam em evidência,
têm aumentado exponencialmente o número de pesquisas realizadas focando novas
aplicações da quitosana, principalmente no que diz respeito ao mundo nano. Isto se deve
ao fato de que os materiais nestas dimensões (nano) apresentam novas propriedades e
consequentemente, novas aplicações. É o que ocorre com as nanopartículas de
quitosanas, as quais estão sendo aplicadas em diversas áreas, como na
nanobiotecnologia como carreador de fármacos de liberação controlada (Kim et al.,
2004; Park et al., 2004; Mauro et al., 2009); e no auxilio de biomarcadores visando o
diagnóstico e tratamento de tumores malignos (Guo et al, 2008; Tan et al., 2007; Qi et
al, 2007; Wang et al., 2008).
1.2. NANOPARTÍCULAS DE QUITOSANA
O termo nanopartículas é genérico, sendo usado de acordo com o tamanho da
partícula a que se está referindo. Partículas com tamanho menor que 1µm são
consideradas nanopartículas, enquanto que as partículas maiores são denominadas
micropartículas (Azevedo, 2002). Shaffazick & Guterres (2003) classificaram a relação
de tamanho das partículas em: micropartículas e sistemas coloidais (lipossoma e
nanopartículas). As nanopartículas podem ser preparadas a partir de uma variedade de
Thatiana M. Stamford __________________________________________ Introdução
26
materiais, tais como: proteínas e polímeros. A seleção deste material depende de muitos
fatores, incluindo: (a) tamanho necessário das nanopartículas, (b) propriedades
intrínsecas da droga, (c) características da superfície como a carga e a permeabilidade,
(d) grau de biodegradabilidade, biocompatibilidade e toxicidade dentre outros. As
nanopartículas, constituídas por polímeros biodegradáveis, como é o caso da quitosana,
têm atraído a atenção dos pesquisadores devido às suas potencialidades terapêuticas e
estabilidade nos fluídos biológicos. O termo nanopartículas inclui as nanocápsulas e as
nanoesferas, as quais diferem entre si segundo a composição e organização estrutural
como mostra a figura 04.
Figura 04: Diferentes nanopartículas com aplicação farmacêuticas: (A) nanoesfera
(sistema matricial) e (B) nanocápsula (sistema reservatório). Fonte: Azevedo, 2002.
Denominam-se esferas aqueles sistemas em que o fármaco encontra-se
homogeneamente disperso ou solubilizado no interior da matriz polimérica. Desta forma
obtém-se um sistema monolítico, onde não é possível identificar um núcleo
diferenciado. Nanocápsula, ao contrário, constituem os chamados sistemas do tipo
reservatórios, onde é possível se identificar um núcleo diferenciado, que pode ser sólido
Thatiana M. Stamford __________________________________________ Introdução
27
ou líquido. Neste caso, a substância encontra-se envolvida por uma membrana,
geralmente polimérica, isolando o núcleo do meio externo.
Os métodos de obtenção de nanoesferas e nanocápsulas são semelhantes, porém
há diferença nos mecanismos de polimerização, os quais são classificados em métodos
baseados na: (a) dispersão ou precipitação de polímeros pré-formados; (b)
polimerização de monômeros dispersos in situ; (c) copolimerização interfacial que
forma nanocápsula pelo contato entre os monômeros na interface conforme ilustrado na
figura 05; (d) coacervação dos polímeros hidrofílicos ou gelificação iônica. (Azevedo,
2002; Mohanraj & Chen, 2006).
Figura 05: Método de copolimerização interfacial para se preparar nanocápsulas.
Fonte: Mohanraj & Chen, 2006.
A coacervação dos polímeros hidrofílicos ou gelificação iônica é o método
empregado no presente trabalho. No entanto, ao se tratar especificamente da preparação
de nanopartículas de quitosana, também existem na literatura (Liu et al., 2007; Gan &
Wang, 2007) outros métodos empregados para a obtenção de nanopartículas deste
biopolímero, como por exemplo: (a) emulsão “cross-linking”, (b) coalescência de gotas
de emulsão, (c) micela reversa e (d) modificação química da quitosana.
É importante enfatizar que, independentemente do método de preparação
empregado, os produtos são obtidos como suspensões coloidais aquosas.
Thatiana M. Stamford __________________________________________ Introdução
28
1.2.1. Método de Gelificação Iônica
A gelificação iônica é um método físico-químico de preparação de sistema
nanoparticulado que consiste, de um modo geral, na dissolução de um fármaco,
juntamente com um polímero, em determinado solvente, seguido da adição, sob
agitação constante, de um não-solvente à mistura. O não solvente pode causar a
precipitação do polímero ou a separação de fases (muitas vezes chamados de processo
de coacervação). Estes processos de coacervação podem ser divididos em: (a) simples
(por mudança no pH, força iônica, temperatura) ou (b) complexos (complexação entre
dois polieletrólitos de carga oposta). (Azevedo, 2002). Neste último caso, é o que
acontece entre a estrutura da quitosana (polieletrólito positivo) e a estrutura do
tripolifosfato de pentasódio (TPP), o qual é o surfactante utilizado no presente trabalho.
A interação entre estes dois compostos pode ser visualizada na figura 06.
Figura 06: Interação iônica entre a quitosana e o tripolifosfato de pentasódio (TPP).
Fonte: Azevedo et al., 2010.
.
Thatiana M. Stamford __________________________________________ Introdução
29
O tripolifosfato de pentasódio (TPP) foi usado para preparar nanopartículas de
quitosana porque é um polieletrólito atóxico, capaz de formar géis com a interação de
suas cargas negativas e a dos grupos aminos da quitosana. Esta interação pode ser
controlada pela densidade de carga da quitosana e do TPP, a qual depende
principalmente, do pH da solução (Berger et al., 2004).
Na literatura, estão disponíveis alguns artigos referentes à preparação de
nanopartículas biodegradáveis com polímeros hidrofílicos, como a quitosana, gelatina e
alginato de sódio (Calvo et al., 1997; Zhang et al., 2004; Du et al., 2007; Du et al.,
2009; Yang et al., 2010). Calvo et al. (1997) desenvolveram um método para preparar
nanopartículas de quitosana por gelificação iônica. O respectivo método envolve uma
mistura de duas fases aquosas, das quais uma é o polímero quitosana e a outra é um
poliânion de tripolifostato de pentasódio. Neste método, o grupo amino da quitosana é
carregado positivamente interagindo com o TPP de carga negativa para formar
coacervados com um tamanho na faixa de nanômetros. Coacervados são formados como
resultado de interação eletrostática entre duas fases aquosas, que, por gelificação iônica,
envolve o material em fase de transição do estado líquido para o gel (Gan & Wang,
2007; Yang et al., 2010).
Nesta pesquisa, as nanopartículas de quitosana serão utilizadas na
funcionalização dos quantum dots de sulfeto de cádmio para obter nanocompósitos de
quitosana/quantum dots fluorescentes de semicondutores.
1.3. QUANTUM DOTS
1.3.1. Nanopartículas de semicondutores: quantum dots
As pesquisas sobre nanopartículas de semicondutores fluorescentes (quantum
dots) evoluíram bastante na ciência de materiais para aplicações eletrônicas e
Thatiana M. Stamford __________________________________________ Introdução
30
biológicas, tornando possível o melhoramento de imagens para posterior diagnóstico
(Michalet et al., 2005).
As propriedades ópticas dos quantum dots foram intensamente estudadas na
década de 90. Desde que, o uso de ligantes conjugados com estes marcadores foi
relatado por Bruchez et al.(1998) e Chan and Nie (1998), muitas aplicações no campo
bioanalítico foram realizadas (Nagasaki et al., 2004). Os quantum dots, nanocristais de
semicondutores, apresentam várias vantagens em relação aos marcadores de moléculas
orgânicas. Além de serem altamente luminescentes, apresentam larga faixa de
comprimento de onda para excitação e um comprimento de fluorescência ajustável pelo
tamanho da partícula. Sob circunstâncias ideais, estes nanocristais podem ter um
elevado rendimento quântico, elevada absorbância e faixas estreitas de emissão,
podendo também fornecer diferentes emissões usando um único comprimento de onda
para excitação (Ballou et al., 2004).
1.3.2. Confinamento quântico dos quantum dots
Os quantum dots apresentam diâmetros na escala de 1 a 10nm. Por serem tão
pequenos, os elétrons e buracos, sofrem um forte confinamento quântico, modificando
as propriedades ópticas desses materiais. Uma nanopartícula de semicondutor encontra-
se em regime de confinamento quântico, quando suas dimensões são reduzidas a ponto
da diferença entre os valores de energia entre a banda de valência (BV) e a banda de
condução (BC), estejam próximas ou menores do que as dimensões do raio de Bohr do
seu éxciton (Figura 07).
Thatiana M. Stamford __________________________________________ Introdução
31
Figura 07 - Esquema de formação de um éxciton. h+ representa o buraco gerado na
banda de valência, pela excitação do elétron e-. Fonte: Chaves (2006).
O confinamento quântico pode ser interpretado de forma simples utilizando-se o
modelo de partícula na caixa. Segundo o modelo, um elétron encontra-se confinado
dentro de uma caixa virtual, onde as funções de onda do elétron se restringem ao
interior da caixa, não permitindo ao elétron que se desloque para além das limitações de
suas paredes. Quanto menor forem as dimensões da caixa, maior a separação energética
entre os diferentes subníveis de energia.
Fazendo-se uma analogia ao cristal de um semicondutor e definindo as cargas
elétricas nas BVs e nas BCs por funções de onda apropriadas, quando as dimensões do
cristal se reduzem a poucos nanômetros, há um distanciamento energético entre as
bandas, que se reflete no aumento do valor energético de seu band gap (Eg).
Além disso, ocorre uma discretização dos níveis de energia da BV e da BC,
podendo ocorrer o surgimento de novas bandas durante o processo de quantização
(Michalet et al., 2005). A sintonização do comprimento de onda de emissão, para um
mesmo material, controlando-se o tamanho dos quantum dots, ocorre devido ao fato de
que as diferenças entre os estados energéticos da BV e da BC (Energia do Band gap:
Eg), variam de acordo com o tamanho da partícula, para um mesmo material. Assim,
quanto menor a partícula de um dado semicondutor, maior a diferença de energia entre
Thatiana M. Stamford __________________________________________ Introdução
32
os estados da BV e da BC, ou seja, maior a Eg. Assim, partículas menores tendem a
luminescer em regiões próximas ao azul, enquanto que, as maiores apresentam
luminescência em regiões mais próximas ao vermelho. A Figura 08, ilustra emissão, no
visível, obtida para amostras contendo diferentes tamanhos de quantum dots de seleneto
de cádmio (CdSe), excitadas através de fonte de radiação eletromagnética na região do
ultravioleta.
Figura 08: Soluções luminescentes de quantum dots de CdSe, sob iluminação UV.
Fonte:http://lqes.iqm.unicamp.br/canal_cientifico/lqes_news/lqes_news_cit/lqes_news_
2008/lqes_news_novidades_1179.htmL
Os primeiros trabalhos que exploraram as características dos quantum dots de
semicondutores para fins de utilização como marcadores biológicos, foram publicados
simultaneamente por Bruchez et al. (1998) e Chan & Nie (1998). Desde então,
surgiram diversas aplicações dessa classe de materiais como biomarcadores (Farias et
al., 2005 ; Bera et al., 2010).
Esses novos métodos vêm apresentando algumas vantagens em relação aos
métodos convencionais para marcação celular e diagnóstico. Dentre elas, podem ser
citadas: emissão sintonizável em diversos comprimentos de onda, para um mesmo
material, variando apenas o tamanho da partícula; elevada fotoestabilidade; baixa
toxidade e marcação múltipla simultânea de diversos componentes e estruturas
celulares. Além do fato de que, os resultados podem ser obtidos com tempos de
Thatiana M. Stamford __________________________________________ Introdução
33
incubação da ordem de alguns minutos e o material biológico pode ser analisado no
próprio meio de cultura.
A distribuição dos estados de energia das bandas de valência e das bandas de
condução varia entre os diferentes tipos de semicondutores. Assim, o limite de tamanho
para a condição de confinamento quântico, varia de um semicondutor para outro.
A Figura 09 mostra um quadro de diferentes quantum dots com a região de
energia/comprimento de onda do primeiro pico de absorção permitido pelo controle do
tamanho entre 3 a 10nm para diferentes semicondutores.
As aplicações biológicas desse tipo de material, usualmente, restringem-se aos
semicondutores para os quais se obtém emissão na região do visível (400-800 nm). No
entanto, o comprimento de onda de emissão para aplicações em dispositivos de
comunicações ópticas, deve estar na região do infravermelho, ou seja, entre 1300 a
1600nm.
Figura 09: Propriedades ópticas de semicondutores - quantum dots.
Fonte: Harrison et al., 2000
Thatiana M. Stamford __________________________________________ Introdução
34
O principal problema que impedia a utilização de quantum dots como
marcadores fluorescentes em sistemas biológicos era a baixa eficiência de
luminescência. Esta baixa luminescência pode estar relacionada com: (a) presença de
níveis de impurezas localizados na superfície do material; (b) ausência de emissão por
interface e/ou (c) pelo correto tratamento de sua superfície (funcionalização). O
problema da baixa luminescência foi solucionado com uma camada extra de outro
semicondutor de gap óptico maior (passivação) e posterior funcionalização do quantum
dot. Isto pode ter acontecido devido: (a) ao deslocamento das impurezas para a região
mais externa ou (b) à emissão por interface e/ou (c) a associação do quantum dot com as
biomoléculas específicas viabilizada no processo de funcionalização. No final da década
de 90 aprendeu-se a funcionalizar a superfície dos quantum dots. E, atualmente,
quantum dots funcionalizados com estreptavidina, proteína A e biotina já podem ser
adquiridos no mercado.
Os estudos e aplicações dos quantum dots de semicondutores revelam que são
eficazes como novas sondas luminescentes com a finalidade de diagnóstico. O
direcionamento bem sucedido da partícula, para marcar um determinado tipo de
biomolécula, inclui a habilidade de alcançar tecidos e tipos específicos de células
(Watson et al. 2003; Wu et al.2003). Assim, surge um grande interesse na correta
funcionalização destes quantum dots para que eles escapem dos filtros biológicos, como
o sistema retículo endotelial.
Dentre os marcadores fluorescentes atuais, utilizam-se corantes orgânicos,
compostos de coordenação de íons lantanídeos e proteínas fluorescentes. As principais
desvantagens envolvidas nestes tipos de marcação são a rápida fotodegradação (Figura
10), alta toxicidade, indução de processos celulares indesejados, morte celular com
utilização de UV, além da presença de autofluorescência.
Thatiana M. Stamford __________________________________________ Introdução
35
Figura 10: Fotodegração em função do tempo: antígenos nucleares corados com Alexa
Fluor 488 e microtúbulos corados com CdSe (Tempos observados: 0s, 20s, 60s, 120s e
180s) – Fonte: Medintz et al. 2005.
Conforme mencionado anteriormente, os marcadores fluorescentes de quantum
dots apresentam várias vantagens em relação aos marcadores de moléculas orgânicas. A
Figura 11 mostra espectros de absorção e de emissão, típicos de quantum dots e
moléculas orgânicas. Um único laser pode excitar a luminescência em diferentes
comprimentos de onda de quantum dots com tamanhos diferentes, enquanto que, cada
corante orgânico precisa ser excitado num comprimento de onda único, o mesmo
acontecendo com os compostos de íons lantanídeos.
Figura 11: Espectros de excitação e de emissão típicos de quantum dots (esquerda) e
moléculas orgânicas (direita), utilizados como marcadores fluorescentes em
microscopia confocal. Fonte: Smith et al., 2004
Quando os elétrons são confinados em uma camada suficientemente estreita, o
princípio da incerteza torna-se relevante (Osvaldo, 2003). Assim, a posição do elétron e
a sua quantidade de movimento não podem ser determinados simultaneamente. Se um
elétron for confinado numa camada infinitamente fina, sua energia de confinamento
Thatiana M. Stamford __________________________________________ Introdução
36
deverá ser infinitamente alta. Mas, se os elétrons não tiverem energia suficiente para se
liberarem da camada, eles permanecerão num regime de confinamento, em um "poço
quântico". Essa característica nos estimula para a síntese, visando à obtenção de
materiais nanoestruturados, para que suas propriedades sejam moldadas de acordo com
suas dimensões (Farias et al., 2005). Os materiais comercialmente disponíveis ainda não
oferecem muitas vantagens, pois demandam um tratamento de superfície bastante
aprimorado, o que requer bastante conhecimento específico. Também, é importante
destacar que existem certas dificuldades para produção e reprodução de quantum dots
de qualidade.
1.3.3. Obtenção e características dos quantum dots
Os quantum dots de semicondutores são sistemas cristalinos obtidos por
crescimento controlado de um cristal pré-existente.
As características físico-químicas de um semicondutor variam com a redução do
seu tamanho, quando estes atingem dimensões de alguns nanômetros e encontram-se em
regime de confinamento quântico. A partir daí, propriedades como temperatura de
transição de fase, condutividade elétrica, absorção eletrônica dentre outras, tornam-se
dependentes do tamanho do material. Os grandes fatores responsáveis pela dependência
das propriedades com o tamanho dos quantum dots são os efeitos termodinâmicos de
superfície e efeitos quânticos.
Em cristais maiores, a superfície do material corresponde a uma pequena fração
do corpo do material; já em nanocristais, o número de átomos presentes em sua
superfície representa uma fração expressiva do total de átomos da partícula. Sendo
assim, estes átomos de superfície contribuem para a maior energia livre e determinam as
variações termodinâmicas. Foi observado, em partículas de CdS, que a temperatura de
Thatiana M. Stamford __________________________________________ Introdução
37
fusão pode variar (de 1750ºC - 444ºC para 1600ºC - 400ºC) quando macrocristais
passam para dimensões abaixo de 10nm (Santos, 2002).
Em semicondutores, a excitação de elétrons da banda de valência (BV) para
banda de condução (BC), separados pelo band gap, resulta em largas bandas no espectro
de absorção. À medida que as partículas diminuem de tamanho, o band gap, aumenta
(Figura 12), acarretando na alteração de algumas propriedades do material.
Figura 12: Redução do tamanho de partículas semicondutoras dentro do regime de
confinamento quântico (Eg= energia da banda proibida, “band gap”; BC= banda de
condução e BV= banda de valência). Fonte: Chaves (2006).
Quando os elétrons da banda de valência são excitados para a banda de
condução do semicondutor as vacâncias de elétrons, denominados buracos (h+) que
surgem na banda de valência, podem interagir com os elétrons excitados, através de
forças coulombianas fracas, formando um estado ligado. Este par ligado (éxciton de
Wannier) comporta-se como uma espécie independente, apresentando um conjunto de
níveis de energia distintos do semicondutor e um raio de Bohr (ɑB) característico
(Santos, 2002):
Thatiana M. Stamford __________________________________________ Introdução
38
A expressão 01 é utilizada para o cálculo do raio de Bohr, onde: ε0 é a
constante dielétrica no vácuo; ε∞ é a constante dielétrica do meio; me e mh são
respectivamente as massas efetivas do elétron e do buraco no semicondutor; m0 é a
massa do elétron em repouso.
A Tabela 01, segundo Santos (2002), apresenta alguns parâmetros para os
materiais semicondutores mais comuns.
Tabela 01 - Parâmetros físicos para semicondutores. Fonte: Chaves, 2006.
Os efeitos de confinamento quântico podem se basear na aproximação da massa
efetiva e é descrita por Santos (2002), através da expressão (02):
Onde: R= Raio; Eg= band gap do material macrocristalino; me e mh são respectivamente
as massas efetivas do elétron e do buraco no semicondutor; m0 é a massa do elétron em
repouso; ε0 é a constante dielétrica no vácuo; ε∞ é a constante dielétrica do meio.
Eq. 01
Eq. 02
Thatiana M. Stamford __________________________________________ Introdução
39
Através da equação (02) podemos visualizar que a variação da energia de band
gap observado nos espectros de absorção e emissão dos semicondutores é proporcional
a 1/R2. Ela descreve partículas no limite de confinamento quântico fraco e moderado,
mas apresenta desvios para partículas extremamente pequenas.
Um dos fatores limitantes para a preparação destes materiais é a necessidade de
preparar um número suficientemente grande de partículas monodispersas.
1.3.4. Colóides
A ciência de colóides estuda sistemas nos quais um ou mais dos componentes
apresentam pelo menos uma de suas dimensões dentro do intervalo de 1nm a 1μm
(Gunter Schmid, 2004).
O aspecto característico da ciência de colóides reside na importância relativa
atribuída às várias propriedades físico-químicas dos sistemas em investigação. Os
fatores que mais contribuem para a natureza global de um sistema coloidal são: as
dimensões das partículas; a forma; as propriedades superficiais; interações partículas-
partícula e interações partículas-solvente. Os princípios relacionados com os diferentes
sistemas coloidais baseiam-se no tamanho e elevada relação área/volume de partículas.
Se as partículas têm tamanhos diferentes, o sistema coloidal é denominado polidisperso
(Melo et al., 2010).
Como a área da superfície dispersa é elevada devido ao pequeno tamanho das
partículas, as propriedades da interface entre as duas fases, dispersas e de dispersão,
determinam o comportamento dos diferentes sistemas coloidais. Geralmente as
dispersões coloidais são termodinamicamente instáveis, devido à sua elevada energia
livre de superfície. Estas dispersões, segundo Souza et al. (2008), constituem sistemas
irreversíveis que não podem ser reconstituídos facilmente após a separação das fases.
Thatiana M. Stamford __________________________________________ Introdução
40
A síntese de nanopartículas coloidais ocorre por reações que permitam controlar
a nucleação e crescimento. O precursor é uma molécula ou um complexo que contêm
um ou mais átomos necessários para o crescimento do nanocristal. Uma vez que os
precursores são introduzidos na reação, eles se decompõem, dando forma a uma nova
espécie reativa (os monômeros). Estes irão causar a nucleação e o crescimento dos
nanocristais. A energia necessária para decomposição dos precursores é fornecida pelo
líquido na reação, por colisões térmicas ou por uma reação química entre o meio líquido
e os precursores, ou por uma combinação destes dois mecanismos (Murray et al., 1993).
Um parâmetro chave no crescimento controlado dos nanocristais é a presença de
surfactante o qual pode ser adsorvido dinâmicamente à superfície do quantum dot. O
surfactante é capaz de fornecer acesso para a adição de unidades monoméricas e
também consegui impedir a agregação dos nanocristais (Santos, 2002).
A escolha dos surfactantes varia em cada caso. Uma molécula que se ligue
fortemente à superfície do quantum dot não seria apropriada, porque impediria o
crescimento do nanocristal. Por outro lado, uma molécula de coordenação renderia
partículas grandes, ou agregados (Peng et al., 2000). Dentre alguns exemplos de
surfactantes incluem: alquil tióis, fosfinas, fosfatos, fosfonatos, amidas ou aminas,
ácidos carboxílicos e compostos aromáticos contendo nitrogênio. Este revestimento
permite uma grande flexibilidade e pode ser trocado por moléculas orgânicas ou grupos
funcionais com polaridade diferente. Além disso, os surfactantes podem ser
temporariamente removidos e uma camada de outro material com propriedades
eletrônicas, ópticas, ou magnéticas diferentes pode ser crescida no nanocristal
(Dabbousi et al., 1997; Peng et al., 1997). Controlando a mistura das moléculas do
surfactante pode-se controlar o tamanho e a forma dos quantum dots (Shaw, 1975;
Puntes et al., 2002).
Thatiana M. Stamford __________________________________________ Introdução
41
É possível revestir a superfície dos quantum dots com moléculas biológicas tais
como proteínas ou oligonucleotídeos. Muitas moléculas biológicas executam tarefas de
reconhecimento molecular com uma alta eficiência quando se ligam, especificamente, a
determinadas moléculas de receptores. Deste modo, foi possível fazer pequenos
agrupamentos de quantum dots mediados pelo reconhecimento molecular (Zanchet et
al., 2002) e marcar compartimentos específicos de uma célula com diferentes tipos de
quantum dots (Dubertret et al., 2002).
1.3.5. Propriedades ópticas dos quantum dots
1.3.5.1. Espectros de absorção e emissão
As propriedades ópticas de partículas coloidais de semicondutores e suas
alterações dependem do tamanho das partículas (Jaeckel, 1926). Um efeito interessante
nas nanopartículas de semicondutores é o alargamento da faixa entre os estados
eletrônicos ocupados e os estados desocupados. Isto afeta diretamente as propriedades
ópticas dos quantum dots em comparação com a maioria dos materiais.
A Figura 13 mostra que quantum dots menores têm um espectro de absorção
deslocado para comprimentos de onda mais curtos quando relacionados a quantum dots
maiores e à maioria dos materiais.
Thatiana M. Stamford __________________________________________ Introdução
42
Figura 13: Espectros de absorção (linhas contínuas) e emissão (linhas pontilhadas) de
quantum dots de CdSe com diferentes tamanhos. Os picos de absorção de nanocristais
com diâmetro de 2.3 /4.0 /3.8 /4.6nm estão em 507 /547 /580 /605nm. Os picos da
fluorescência estão em 528 /570 /592 /637 nm. Fonte: Gunter Schmid, 2004.
Nos quantum dots, o deslocamento Stokes é explicado pelo éxciton o qual é
definido como sendo a energia mínima necessária para criar um par de elétron-buraco
em um ponto quântico (quantum dot). (Reboredo et al., 2000; Jonhston-Halperin et al.,
2001).
O tamanho médio do quantum dot depende da posição do pico de luminescência,
e a largura deste pico está correlacionada à distribuição de tamanho dos nanocristais.
Conseqüentemente, o máximo no espectro de emissão e a sua largura podem ser usados
para estimar o tamanho médio e a distribuição de tamanho durante o crescimento do
nanocristal.
1.3.6. Passivação
A redução do volume da partícula resulta num aumento da relação área
superficial ⁄ volume, aumentando assim a contribuição de efeitos de superfície. A
superfície possui um grande número de defeitos resultantes da interrupção da rede
Thatiana M. Stamford __________________________________________ Introdução
43
cristalina e da maior energia livre dos átomos ali localizados (impurezas, vacâncias,
defeitos cristalográficos, etc.), os quais podem agir como centros de decaimento não
radiativo, resultando no decréscimo do rendimento quântico da luminescência, com a
diminuição do tamanho (Santos, 2002).
Através da passivação (recobrimento da superfície do quantum dot com camada
de outro semicondutor), podemos alterar a estrutura externa das partículas “passivando
as ligações químicas não balanceadas”. Com isso, novos estados energéticos podem ser
criados, promovendo transições radiativas eficientes. Para a passivação, geralmente,
utiliza-se uma camada de outro semicondutor de bandgap maior sobre a partícula
original.
Para quantum dots de sulfeto de cádmio (CdS), a passivação com hidróxido de
cádmio, Cd(OH)2, tem se mostrado eficiente no sentido de aumentar significativamente
a intensidade da emissão (Farias et al., 2005; Gunter Schmid, 2004). A natureza da
luminescência observada nas suspensões de CdS, antes da passivação, é explicada em
termos da recombinação excitônica em defeitos de superfície relacionados à vacância de
íons enxofre nas ligações terminais de CdS do cristal ou radicais HS.
1.3.6.1. Sulfeto de Cádmio (CdS)
À medida que a camada de Cd(OH)2 se forma, os defeitos profundos são
substituídos por defeitos mais rasos, formados a partir das ligações Cd-OH. Isto
melhora a estabilidade das partículas em solução. É importante destacar que, após a
passivação, não há precipitação das partículas em solução. Desta forma, pode-se dizer
que existe estabilidade das partículas em meio aquoso (Santos, 2002).
Thatiana M. Stamford __________________________________________ Introdução
44
1.3.7. Funcionalização
A funcionalização é caracterizada pela modificação química da superfície para
manter uma fotoestabilidade elevada, alta luminescência e, principalmente, baixa
toxicidade. Ela proporciona condições ótimas para marcações em materiais biológicos e
permite o monitoramento através da luminescência dos quantum dots (Chaves,2006).
A síntese geral dos quantum dots para bioimagem consiste no núcleo (Core) do
semicondutor (por exemplo, CdS) com uma concha (shell) inorgânica e orgânica (por
exemplo, Cd(OH)2 e glutaraldeído, respectivamente) como apresentado na Figura 14. O
shell inorgânico melhora as propriedades ópticas do núcleo (por exemplo, aumenta o
rendimento quântico) e minimiza a citotoxicidade induzida pelo semicondutor (Core)
após a fotodegradação. A concha orgânica (funcionalizante) é capaz de formar ligações
químicas com a superfície do quantum dot para que possa se complexar aos
componentes biológicos (Jiang et al., 2004).
Figura 14: Representação esquemática da funcionalização do quantum dot.
Fonte: Nascimento, 2009.
Thatiana M. Stamford __________________________________________ Introdução
45
O glutaraldeído é uma molécula orgânica que possui dois grupamentos
funcionais tipo aldeído e que pode se ligar às aminas primárias presentes nas
biomoléculas (proteínas, ácido nucléico, etc). Reações entre aldeídos e aminas primárias
podem gerar as bases de Schiff que, após redução, resultam em aminas secundárias
estáveis (Walt & Agayn, 1994).
O recobrimento de quantum dot com polímeros vem sendo empregado devido ao
crescimento de cadeias poliméricas sobre sua superfície. A força da ligação química
entre o semicondutor e a cobertura de polímero torna o nanocompósito mais estável,
podendo ser submetido a processos industriais (Walt & Agayn, 1994).
É importante destacar que, os funcionalizantes não podem interferir nas
propriedades espectroscópicas, estabilidade coloidal e coalescência dos quantum dots
(Chaves, 2006). Uma técnica de caracterização rotineiramente utilizada para verificar a
estabilidade de nanocompósito é a determinação do Potencial Zeta.
1.3.7.1. Potencial Zeta
Potencial Zeta é uma abreviação de potencial eletrocinético em sistemas
coloidais. Do ponto de vista teórico, todos os materiais macroscópicos ou particulados
em contato com um líquido, adquirem uma carga elétrica em sua superfície. A carga
líquida na superfície da partícula afeta a distribuição de íons na sua vizinhança,
aumentando a concentração de contra-íons junto à superfície. Assim, forma-se uma
dupla camada elétrica na interface da partícula com o líquido (Schaffazick et al., 2003).
Essa dupla camada divide-se em duas regiões: uma região interna que inclui íons
fortemente ligados à superfície e uma região exterior onde a distribuição dos íons é
determinada pelo equilíbrio entre forças eletrostáticas e movimento térmico. Dessa
forma, o potencial nessa região decai com o aumento da distância da superfície até, a
Thatiana M. Stamford __________________________________________ Introdução
46
uma distância suficientemente segura, atingir o potencial da solução. Esse potencial é
convencionado como Potencial Zero (Bedê, 2010).
Em um campo elétrico, como em microeletroforese, cada partícula e os íons
mais fortemente ligados à mesma se movem como uma unidade, e o potencial no plano
de cisalhamento entre essa unidade e o meio circundante é chamado Potencial Zeta.
Esse potencial é função da carga superficial da partícula, de qualquer camada adsorvida
na interface com o meio, e da natureza e composição do meio que a circunda. Como
esse potencial reflete a carga efetiva nas partículas, ele se relaciona com a repulsão
eletrostática entre elas e com a estabilidade da suspensão. Segundo Andrade et al.,
(2008), o Potencial Zeta também varia em função do pH da solução que se deseja
analisar. A regra geral para a estabilidade eletrostática da solução é a faixa de Potencial
Zeta de +/- 30 mV. Se o potencial da solução estiver fora dessa faixa, então a solução
pode ser considerada instável conforme ilustrado na Figura 15.
Figura 15: Variação do Potencial Zeta de uma solução em função do pH.
Fonte: Andrade, 2008.
Thatiana M. Stamford __________________________________________ Introdução
47
A capacidade de se colocar diferentes tipos de grupos químicos em conjunto
sobre uma superfície amplia enormemente as possíveis aplicações dos quantum dots.
1.3.8. Aplicação dos Quantum Dots em Sistemas Biológicos
As propriedades ópticas dos quantum dots como marcadores biológicos têm
atraído muita atenção e superam algumas limitações encontradas pelos marcadores
orgânicos convencionais. A Figura 16 destaca as possíveis aplicações dos quantum dots
em sistemas biológicos.
Figura 16: Potenciais aplicações de quantum dots em sistema biológico.
Fonte: Chaves, 2006.
É possível detectar a fluorescência dos quantum dots em células vivas. Assim
como, estudar a interação destas células com os receptores de membrana e possíveis
afinidades. Eles também podem ser utilizados como biosensores para investigar
processos celulares como, por exemplo, a endocitose (processo pelo qual as células
Thatiana M. Stamford __________________________________________ Introdução
48
vivas absorvem materiais, através da membrana celular). Para células nervosas, a
endocitose dos quantum dots ocorre rapidamente, à temperatura fisiológica (Gomez et
al., 2005).
Estudos de materiais vivos ou fixados, utilizando nanopartículas de
semicondutores também são destacados em marcações de células, tecidos, órgãos e
investigação de tumores ou lesões (Chatterjee & Zhang, 2007; Liang & Gundersen,
2007; Yuang et al., 2010).
1.4. ALGUMAS CONSIDERAÇÕES BIOLÓGICAS SOBRE O SISTEMA
ESTUDADO
1.4.1. Câncer
Crescimento e diferenciação celular são processos essenciais para os seres vivos.
O crescimento celular é indispensável durante o desenvolvimento dos organismos e
necessário para repor as células que morrem pelo processo natural de envelhecimento.
A diferenciação por sua vez, refere-se à especialização morfológica e funcional das
células, permitindo o desenvolvimento de cada organismo como um todo integrado. Os
distúrbios do crescimento ou diferenciação celular, podem ter graves repercussões,
como, por exemplo, o surgimento de neoplasias (Souto, Falhari & Cruz, 2005).
Define-se neoplasia como a proliferação anormal de células que se multiplicam
com independência e descontrole. Isto é, não respondem aos mecanismos de controle
(por exemplo: apoptose) a que estão submetidos todas as células normais do organismo
e tendem a perder sua diferenciação. Carcinogênese é o termo utilizado para designar a
transformação de células normais em células cancerosas (Oliveira & Alves, 2002).
O termo câncer é genericamente utilizado para denominar todas as neoplasias
malignas. É a tradução latina da palavra grega carcinoma (de karkinos = crustáceo,
Thatiana M. Stamford __________________________________________ Introdução
49
caranguejo), foi utilizada pela primeira fez por Galeno (aproximadamente 138-201 d.
C.) para indicar um tumor maligno da mama, na qual as veias superficiais desse órgão
eram ramificadas, lembrando as patas de um caranguejo. O termo, hoje, é usado para
qualquer neoplasia maligna (Amar et al., 2005).
O câncer ocorre por uma alteração genética que pode ser transmitido a uma
célula normal através da transferência de genes tumorais. No entanto, os fatores
ambientais também desenvolvem o câncer. Segundo Belizário (2002), o
comportamento humano (tabagismo, maus hábitos alimentares, sedentarismo) é o
responsável por quatro em cada cinco casos de câncer.
Quanto à localização, aproximadamente 85% dos cânceres ocorrem em células
epiteliais e são classificados em carcinomas. Cânceres derivados de células mesodermas
(ex. ossos, músculos) são denominados sarcomas e cânceres de tecido glandular são
chamados de adenocarcinomas (Percorino,2008).
Quanto ao comportamento e evolução os tumores são divididos em duas
categorias: benignos e malignos. No primeiro caso, o tumor se desenvolve no seu lugar
de origem, não atingindo outros tecidos e no segundo caso, uma célula cancerosa se
desprende do tumor atingindo a corrente sanguínea e, desta maneira, o tumor se torna
capaz de invadir outros tecidos do corpo, causando a chamada metástase (Lopes,
Oliveira & Prado, 2002) representada na Figura 17. Um aglomerado de células tumorais
obtém nutrientes para o crescimento por difusão passiva até atingir um volume
aproximado de cerca de 2 mm3. Após este estágio, para continuarem crescendo é
necessária à formação de vasos sanguíneos para se nutrirem (angiogênese). Uma
variedade de sinais biológicos, enviados pelo tumor, dá início a angiogênese tumoral.
Os vasos sanguíneos formados para a nutrição do tumor são anormais, havendo
ramificações aberrantes, possuindo grande porosidade e tortuosidade no tecido
Thatiana M. Stamford __________________________________________ Introdução
50
endotelial. No entanto, o tumor desenvolve-se rapidamente. O tumor maligno figura
como sendo o mais grave, em termos de sequelas, e tem sido uma das principais causas
de morte da população mundial (Brannon-Peppas & Blanchette, 2004).
Figura17: Disseminação de células tumorais (metástase).
Fonte: http://cancervc.org.au/about-cancer/for=schools/general_cancer, acessado em
19/12/2009.
Quanto às características e propriedades das células neoplásicas, pode-se
destacar:
Características bioquímicas: As células neoplásicas possuem os mesmos
constituintes bioquímicos das células normais. Nestas células, o conjunto enzimático é
mais pobre do que o das células normais, já que suas vias metabólicas são mais simples
e têm mais água do que as normais. Elas possuem pH mais baixo por causa da intensa
atividade glicolítica e do resultante aumento do ácido lático. A quantidade de glicose
geralmente é pequena, devido à rápida metabolização. A quantidade total de
aminoácidos é menor, devido à alta síntese proteica (Nascimento, 2009).
Adesividade e Funções celulares: As células malignas têm menor adesão entre
si, devido às modificações e irregularidades da membrana plasmática. Por causa da
Thatiana M. Stamford __________________________________________ Introdução
51
perda da diferenciação celular, as células neoplásicas tendem a perder suas funções
específicas, podendo adquirir funções novas não existentes nas células normais. Além
disso, os sítios tumorais apresentam um aumento da permeabilidade vascular e baixa
drenagem linfática. Isto resulta no efeito de permeabilidade e retenção aumentada -
EPR (Enhanced Permeation and Retention Effect) o qual facilita o acúmulo de
nanopartículas preferencialmente nestes locais (Kyeongsoon et al.,2009). A Figura 18
mostra como ocorre o acúmulo de nanopartículas em regiões tumorais devido ao efeito
EPR.
Figura 18: Representação do acúmulo de nanopartículas em regiões tumorais devido ao
efeito EPR.
Fonte: POLLETO http://scienceblogs.com.br/bala_magica/2009/11/quando-a-
desuniao-pode-ajudar-a-salvar-vidas.php
Thatiana M. Stamford __________________________________________ Introdução
52
Segundo o Ministério da Saúde (INCA, 2011), o câncer representa a segunda
maior causa de morte na população masculina do Brasil. Devido a estes altos índices de
impacto na população, grandes são os esforços para se encontrar formas mais eficazes
de combater a doença. Uma das frentes mais importantes no tratamento do câncer é o
aprimoramento do diagnóstico. Tendo em vista que, a detecção precoce auxilia os
médicos a planejarem o tratamento adequado e a determinar o prognóstico da doença.
Neste sentido, têm sido desenvolvidos nanocompósitos fluorescentes com alta
sensibilidade e especificidade para auxiliar no diagnóstico precoce de neoplasias (Junior
et al., 2005; Farias et al., 2006; Liang & Gundersen, 2007; Yuang et al., 2010).
1.4.2 Cultura Celular
A cultura de células tem sido utilizada com frequência na pesquisa de
marcadores, permitindo a análise imediata do impacto destes compostos sobre a célula e
fornecendo respostas rápidas.
A cultura de células animais (cultura de tecidos ou de células
sanguíneas/hematopoiéticas ou outras) inicia-se pela dispersão das células obtidas a
partir de um fragmento de tecido (hematopoiético, muscular, epitelial ou outro) num
meio nutritivo apropriado, colocado em frasco ou placa de cultura. Após o que se
verifica que a maioria das células adere à superfície sólida e cresce em monocamada ou
em suspensão. Ou seja, para obter uma linhagem celular, primeiro é necessário consegui
células através da desagregação do tecido e depois colocá-las em um meio de cultura
(cultura primária). Posteriormente, são feitas subculturas com baixa densidade celular
para obter as culturas secundárias. E desta forma estabelecer uma determinada linhagem
celular (Cruz et al., 2009). A Figura 19 resume a forma de obtenção de culturas
celulares primárias e secundárias (linhas celulares) a partir de um fragmento de tecido.
Thatiana M. Stamford __________________________________________ Introdução
53
A cultura de células pode ser feita em monocamada ou em suspensão. Na cultura
em monocamada, as células vão aderir a um substrato e propagam-se. É o método mais
usado e tem como condição essencial a adesão ao substrato. A cultura em suspensão é
usada para células que sobrevivem e proliferam sem necessidade de adesão (Cruz et al.,
2009).
Figura 19: Obtenção de uma linha celular a partir de um tecido.
Fonte: Cruz et al., 2009.
1.4.3 Carcinoma de Células Escamosas de Câncer de Pulmão
Os pulmões são dois órgãos de estrutura esponjosa que têm forma de pirâmide,
estando a base de cada pulmão apoiada no diafragma. A função principal do pulmão é a
hematose que consiste na troca dos gases respiratórios (gás oxigênio e gás carbônico).
Também participa na regulação da temperatura corporal (Nascimento, 2009).
Thatiana M. Stamford __________________________________________ Introdução
54
O câncer do pulmão é um problema importante de saúde pública mundial, sendo
responsável por uma das maiores taxas de mortalidade por câncer em ambos os sexos.
Esse tipo de câncer é, geralmente, detectado em estágios avançados, uma vez que a
sintomatologia nos estágios iniciais da doença não é comum. Em decorrência disso, o
câncer de pulmão permanece como uma doença altamente letal (BRASIL, Ministério da
Saúde. INCA, 2010).
Segundo Uehara et al. (1998) os quatro tipos histológicos principais que
abrangem 95% dos casos são: carcinoma epidermóide, adenocarcinoma, carcinoma
indiferenciado de pequenas células e carcinoma indiferenciado de grandes células. Os
tipos mais comuns de neoplasia de pulmão são: (1) o carcinoma epidermóide e o
adenocarcinoma, representando 40 e 30%, respectivamente; (2) o carcinoma
indiferenciado de pequenas células que varia de 15 a 20%, e (3) o carcinoma
indiferenciado de grandes células com aproximadamente 10%. Outros tipos histológicos
incluem: tumores mistos, tumores carcinóides, mesoteliomas, sarcomas.
Segundo Morandi (2006), a Organização Mundial da Saúde (OMS) classifica as
neoplasias pulmonares, histologicamente, em:
Tumores epiteliais
o Benignos
Papilomas
Adenomas
o Lesões pré-invasivas
Displasia escamosa e carcinoma in situ
Hiperplasia adenomatosa atípica
Hiperplasia pulmonar difusa idiopática de células
neuroendócrinas
o Malignos
Carcinoma de células escamosas (epidermóide)
Carcinoma de pequenas células
Adenocarcinoma
Carcinoma de grandes células
Carcinoma adenoescamoso
Tumor carcinóide
Thatiana M. Stamford __________________________________________ Introdução
55
O carcinoma epidermóide de pulmão também é conhecido como carcinoma de
células escamosa. Representa 50 a 70% dos casos de carcinoma do pulmão,
apresentando íntima interação com o hábito de fumar (Morandi, 2006).
A linhagem celular abordada, neste trabalho, é a de células de carcinoma
epidermóide de pulmão humano (NCI-H 292), com cultura de crescimento em
monocamadas.
1.5. TESTES DE BIOCOMPATIBILIDADE
1.5.1. Teste de irritabilidade por HET-CAM
A membrana corioalantóide é uma típica membrana de ovos (fertilizados de
aves) que representa o órgão embrionário responsável pelas trocas gasosas enquanto o
embrião se desenvolve no interior do ovo (Steiling et al 1999).
Figura 20: Estruturas do ovo fertilizado: membranas extraembrionárias.
Fonte:http://www.sobiologia.com.br/conteudos/embriologia/reproducao14.php
Thatiana M. Stamford __________________________________________ Introdução
56
A forma como esta membrana responde a aplicação tópica de substâncias em
sua superfície corresponde um importante parâmetro para avaliar a biocompatibilidade e
toxicidade de drogas (Vargas et al 2007).
O modelo da membrana corioalantóide do ovo pode ser utilizado como
alternativa para estudo de angiogenesi e resposta inflamatória a biomateriais (Zwadlo-
Klarwasser et al 2001 e Valdes et al 2002). Similarmente na área de cosméticos sendo
usado para avaliar propriedades irritantes das formulações dos cosméticos e seus
ingredientes (Steiling et al 1999).
1.5.2. Teste de Toxicidade pelo Método de MTT
O princípio deste método consiste na absorção do sal MTT {brometo de [3-(4,5-
dimetiltiazol-2-il)-2,5- difeniltetrazólio]} pelas células, sendo reduzido no interior da
mitocôndria a um produto chamado formazan (cor azul). Este produto, acumulado
dentro da célula, é extraído através da adição de dimetilsulfóxido (DMSO) que é um
solvente apropriado para solubilizar os cristas de formazan (Mosmann, 1983). . Este
método tem sido muito utilizado para medir a sobrevivência e proliferação celular já
que permite determinar a funcionalidade mitocondrial das céluals tratadas. A quantidade
de células vivas é proporcional à quantidade de formazan produzida (Silva, 2009).
1.6. APLICAÇÃO DE NANOCOMPÓSITOS EM SISTEMA BIOLÓGICO
As propriedades ópticas dos quantum dots como biomarcadores têm atraído
muita atenção e superam algumas limitações encontradas nos marcadores orgânicos
convencionais.Desde a sua primeira apresentação em 1998, os quantum dots têm sido
sistematicamente testado em marcações fluorescentes in vitro e em procedimentos de
imagem in vivo (Michalet, 2005).
Thatiana M. Stamford __________________________________________ Introdução
57
Diversos autores mostraram marcações de células e de tecidos inteiros usando
diferentes modificações na superfície de distintos quantum dots o que permitiu o
entendimento e visualização de marcações em sistemas biológicos. O uso de
funcionalizantes, como gluteraldeído e poli(etilenoglicol) permitiu observar diferentes
interações dos marcadores com os sistemas biológicos (Jaiswal et al., 2002; Menezes,
2006; Kyeongsoon et al., 2009).
Conforme referido, para utilização de quantum dots em aplicações biológicas
são necessários estudos para obtenção do revestimento adequado da superfície dos
mesmos, o qual deve manter elevada luminescência e fotoestabilidade, assim como,
uma baixa toxicidade. Neste trabalho, destacamos o uso de nanocompósitos de
quitosana/quantum dots de semicondutores na marcação de células neoplásicas
pulmonares.
Thatiana M. Stamford __________________________________________ Introdução
58
2. OBJETIVOS
2.1. OBJETIVO GERAL
Neste trabalho, destacamos o uso das nanopartículas de semicondutores de
sulfeto de cádmio (CdS), passivadas com hidróxido de cádmio Cd(OH)2 e
funcionalizadas com nanopartículas de cloridrato de quitosana para marcação de
células neoplásicas de pulmão (linhagem de carcinoma epidermóide NCI-H292).
2.2. OBJETIVO ESPECÍFICO
I. Obter e caracterizar nanoparticulas de quitosana com diferentes graus de
desacetilação e despolimerização;
II. Obter e caracterizar o quantum dot de semicondutor (CdS/Cd(OH)2);
III. Obter nanopartículas de quitosana ideais para a funcionalização dos
quantum dots;
IV. Obter nanocompósito de quantum dot funcionalizado com nanoparticulas
de quitosana;
V. Avaliar o potencial de irritabilidade dos componentes do nanocompósito;
VI. Determinar o possível efeito citotóxico do nanocompósito utilizando o
método do MTT.
VII. Verificar a marcação de células neoplásicas pulmonares com este
nanocompósito.
Thatiana M. Stamford ____________________________ Procedimento Experimental
59
3. PROCEDIMENTO EXPERIMENTAL
3.1. OBTENÇÃO DA QUITOSANA
A quitosana utilizada neste trabalho foi extraída de exoesqueletos de caranguejo
e é comercializada pela empresa Aldrich como sendo quitosana Sigma-Aldrich® obtida
de carapaça de carangueijo. O fabricante forneceu a viscosidade como sendo maior que
200 000 cps. Contudo, o grau de desacetilação, bem como qualquer outra informação,
não foi mencionado.
3.1.1. Desacetilação da quitosana
Foram suspensos 5g de Quitosana Comercial (QC) em 220 mL de solução
aquosa de NaOH 40% (p/v) e mantidos sob agitação mecânica a 350 rpm, por 6 hs a
temperatura de 115ºC. Após, este período, o meio reacional foi filtrado e o sólido
lavado com água destilada até atingir um pH próximo a 7,0. Em seguida, a quitosana foi
lavada com 30 mL de metanol (PA) e seca a temperatura de 25ºC (Battisti & Campana
Filho, 2008). Nesta etapa, foi obtida a quitosana desacetilada (QD).
3.1.2. Despolimerização das quitosanas
Foram dissolvidos 2g de quitosana de cada grupo (QC e QD) em 100 mL de
0,1M HCl e agitado por 24 hs. Após este período, foram adicionados 20 mL de H2O2
(5% ou 15%) para cada 100 mL das soluções de quitosana e mantidos sob agitação
mecânica a 350 rpm por 2 hs a temperatura de 60ºC (Yang et al., 2010). Em seguida, os
meios reacionais foram filtrados à vácuo com três papéis de filtros quantitativo da
VETEC apresentando porosidade de 3, 0.8 e 0.45 µm, respectivamente.
Thatiana M. Stamford ____________________________ Procedimento Experimental
60
Após a última filtração, parte da solução foi retirada para a medida de
viscosidade. Na parte restante, foi adicionado etanol na proporção de 1:1 (v/v) para
cada grupo (QCD5%; QCD15%; QDD 5% e QDD15%).
Depois de 48 hs observou-se a precipitação das quitosanas. Para retirar todo o
sobrenadante, foi necessário centrifugar as quitosanas despolimerizadas a 4500 rpm por
10 minutos a temperatura de 25ºC. Em seguida, os precipitados forma transferidos para
uma placa de vidro e armazenados em um dissecador contendo sílica, até que as
amostras ficassem completamente secas para depois seguir com o método de gelificação
iônica.
3.2. PREPARAÇÃO DAS NANOPARTÍCULAS DE QUITOSANAS
3.2.1. Método de Gelificação Iônica
Foram dissolvidas 0,5g das quitosanas (QCD5%; QCD15%; QDD5% e
QDD15%) em 50 mL de ácido acético 2% e agitadas por 30 minutos. Em seguida, foi
adicionado lentamente a cada grupo 20 mL de TPP 1% e mantidos sob agitação durante
2 hs. Depois as soluções foram centrifugadas a 13 400 rpm por 10 minutos e os
sobrenadantes foram sendo retirados e acrescentado mais soluções nos mesmos
eppendorfs. Na última alíquota da solução, ao retirar o sobrenadante, foi acrescentado
água destilada e homogeinizada cada amostra com a finalidade de retirar o excesso de
reagentes utilizados nos processos de despolimerização e/ou preparação de
nanopartículas. Esta lavagem foi repetida 5 vezes sempre intercalando com a
centrifugação a 13.400 rpm por 5 minutos. Após a última lavagem, foram retirados os
sobrenadantes e os precipitados foram liofilizados. Nesta etapa, foram obtidas as
nanopartículas de cada grupo que apresentam as respectivas abreviações: NQCD5%;
Thatiana M. Stamford ____________________________ Procedimento Experimental
61
NQCD15%; NQDD5% e NQDD15% (metodologia adaptada por Yang et al., 2010 e
Ginani et al.,1999).
3.3. OBTENÇÃO DE NANOPARTÍCULAS DE CLORIDRATO DE
QUITOSANA
O cloridrato de quitosana foi obtido por dissolução da amostra QCD15% (1,0g
de quitosana/100 mL de ácido acético 1%) após agitação contínua durante 18 hs. Após
este período a solução obtida foi filtrada à vácuo com papel de filtro quantitativo da
VETEC com porosidade de 0.45 µm. Em seguida foi realizada diálise com membrana
de celofane com limite de exclusão de 12.000 Dalton por dois períodos consecutivos de
36 hs. O primeiro período, contra solução aquosa de NaCl 0,2mol/L e o segundo, contra
água deionizada (Signini & Campana Filho, 1998).
Após a diálise, a amostra de cloridrato de quitosana comercial despolimerizada
a 15% (CQ) teve o pH ajustado para 7,0 com NaOH a 0,1M. Em seguida, foi
acrescentado lentamente 1,2 mL de TPP 1% em 3,0 mL de CQ o que alterou o aspecto
da solução de transparente para leitosa. Depois, a solução foi centrifugada a 13.400 rpm
por 5 minutos a 25ºC e os sobrenadantes foram sendo retirados e acrescentado mais
soluções nos mesmos eppendorfs. Na última alíquota da solução - ao retirar o
sobrenadante - foi acrescentado água destilada e cada amostra foi homogeinizada com a
finalidade de retirar o excesso de reagentes utilizados na diálise. Esta lavagem foi
repetida 5 vezes sempre intercalando com a centrifugação a 13.400 rpm por 5 minutos.
Após a última lavagem, foi retirado o sobrenadante e o precipitado foi liofilizado. Nesta
etapa, foram obtidas as nanopartículas de cloridrato de quitosana (NCQ) as quais serão
utilizadas na funcionalização do quantum dots.
Thatiana M. Stamford ____________________________ Procedimento Experimental
62
3.4. CARACTERIZAÇÃO DAS QUITOSANAS
Diversas técnicas foram realizadas para a caracterização das quitosanas. As
características estruturais das quitosanas foram observadas por espectroscopia
vibracional na região do infravermelho. Os graus de desacetilação foram determinados
utilizando duas técnicas: RMN 1H e análise elementar. As massas molares foram
estimadas através de medida de viscosidade.
3.4.1. Caracterização estrutural
3.4.1.1. Espectroscopia vibracional na região do infravermelho
Os espectros no infravermelho foram obtidos em um espectrofotômetro com
transformada de Fourier da Bruker, modelo IF66, na região entre 4.000 cm-1
e 400 cm-1
.
Aproximadamente 1,5mg de cada quitosana foi seca em estufa a vácuo durante 15 hs a
60°C. Em seguida, foi adicionado 100mg de KBr e a mistura homogeneizada em
almofariz de ágata. As pastilhas de KBr foram preparadas e deixadas na estufa a vácuo a
110°C durante 20 hs. Por tanto, o espectro do pó das quitosanas foram obtidos
utilizando pastilha de KBr como suporte. As medidas foram realizadas na Central
Analítica do Departamento de Química Fundamental da UFPE (Signini e Campana
Filho, 1998).
3.4.2. Grau de desacetilação
3.4.2.1. Ressonância Magnética Nuclear
Os espectros de RMN 1H foram obtidos a partir de um procedimento descrito
por Signini e Campana-Filho (2000). O equipamento utilizado foi o da Varian Unity
Plus em 300 MHz. As soluções de quitosanas foram preparadas pela dissolução de
10mg de cada quitosana em 1mL de solução de HCl/D2O 1% (v/v), durante 24 hs
formando uma solução viscosa. Uma alíquota dessa solução foi colocada em um tubo de
Thatiana M. Stamford ____________________________ Procedimento Experimental
63
5mm de diâmetro para a análise a 50°C, com tempo de relaxação de 6 segundos e pulso
de 90º.
3.4.2.2. Análise Elementar
As análises elementares das quitosanas foram obtidas no equipamento
Analisador elementar modelo EA 1110 da Carlo Erba Instruments, na Central Analítica
do Departamento de Química Fundamental da UFPE.
3.4.3. Massa molar
3.4.3.1. Medidas de Viscosidade
Os pesos moleculares foram determinados por viscosidade, segundo a
metodologia proposta por Santos et al (2003). As medidas de viscosidade foram
realizadas utilizando um capilar de vidro tipo Cannon-Fenske (dinterno=1,01mm)
termostatizado a (25± 0,01)ºC, em um viscosímetro AVS-350 da Schott-Geräte. Para a
determinação da viscosidade intrínseca, [], foram preparadas soluções de quitosanas
(utilizando tampão de ácido clorídrico como solvente) com concentrações variando de
2,0 x 10-3
a 9,0 x 10-3
g/mL. Os tempos de escoamento foram determinados em
segundos. Foram feitas três medidas de cada amostra e calculada a média.
3.5. CARACTERIZAÇÃO DAS NANOPARTÍCULAS DE QUITOSANA
3.5.1. Medidas de Tamanho por Espalhamento Dinâmico de Luz (DLS)
Os tamanhos dos raios hidrodinâmicos das nanopartículas foram determinados
por Espalhamento Dinâmico de Luz (DLS) usando Zetasizer (Nano-ZS, Malvern, UK).
As medidas de DLS foram operadas com o comprimento de onda de 633nm a
25ºC com um ângulo de detecção de 90º. As amostras foram diluídas em ácido acético
1% (16 µmol/L) em água MilliQ. Três medidas subseqüentes foram determinadas para
cada amostra.
Thatiana M. Stamford ____________________________ Procedimento Experimental
64
3.5.2. Microscopia Eletrônica de Transmissão (MET)
A Microscopia Eletrônica de Transmissão (MET - FEI Morgagni) foi usada para
observar a morfologia das nanoparticulas de cada quitosana. As suspensões de
nanopartículas foram diluídas em água MiliiQ para 1:20 (v/v) e depois foi feito o
contraste negativo com solução de ácido fosfotungstico 1% (PTA). As amostras foram
gotejadas em grades de cobre e para remover o excesso foi usado papel de filtro.
3.6. SÍNTESE DE QUANTUM DOTS
3.6.1. Síntese de sulfeto de cádmio (CdS)
Em um balão contendo 95,5mL de água deionizada foram adicionados 2,0mL de
uma solução à 0,0051g/mL do estabilizante polifosfato de sódio [(NaPO3)]n (Sigma
Aldrich), com n igual à 9 e 2,5mL de uma solução 0,01 mol/L perclorato de cádmio
Cd(ClO4)2 (Sigma Aldrich).
O perclorato de cádmio foi preparado a partir de 0,642g de óxido de cádmio
(CdO). Para 0,005 mols de CdO, foi utilizado 0,01 mol de HClO4. Após pesar o CdO,
acrescentou-se água deionizada e, aos poucos, foram adicionados aproximadamente
1,44mL de HClO4, sob agitação constante. Na medida em que o material foi secando,
foi sendo acrescentada mais água. E em seguida, o pH da solução foi elevado com
NaOH de 4,0 para 8,5 (valor necessário para uma luminescência no comprimento de
onda de 500nm após passivação). O balão foi vedado com um septum de borracha. Com
auxílio de uma seringa foram adicionados à solução aproximadamente 750μL de gás
sulfídrico H2S (White Martins 98%). A solução resultante foi agitada continuamente
durante 10 minutos (Figura 21):
Thatiana M. Stamford ____________________________ Procedimento Experimental
65
Figura 21: Representação da preparação de quantum dots de sulfeto de cádmio (CdS).
Fonte: Chaves, 2006.
Após o tempo de agitação observamos a mudança da coloração da solução de
incolor para amarelo. Através desta observação verificamos a formação das
nanopartículas de sulfeto de cádmio.
A solução foi mantida à temperatura de aproximadamente 10ºC até a passivação.
Segundo Santos (2002), temperaturas mais baixas parecem retardar o crescimento das
nanopartículas. Isso pode ser explicado analisando a variação do Kps (Produto de
solubilidade) do CdS que diminui com a diminuição da temperatura.
3.6.2. Passivação do CdS com Cd(OH)2
A passivação se caracteriza pela formação de uma camada (casca) ao redor da
nanopartícula (núcleo), (Figura 22).
Figura 22: Passivação de quantum dots de CdS com Cd(OH)2. Fonte: Chaves, 2006.
Ao final da síntese das nanopartículas de CdS é necessário a formação de uma
camada de hidróxido de cádmio Cd(OH)2, com um semicondutor de gap maior. A
Thatiana M. Stamford ____________________________ Procedimento Experimental
66
passivação foi realizada aproximadamente após 24 hs de preparação das nanopartículas
de sulfeto de cádmio.
O pH da suspensão foi novamente ajustado com solução de NaOH, elevando-o
para 10,5. Em seguida, foi adicionado lentamente 6mL de perclorato de cádmio
Cd(ClO4)2 à 0,01mol/L, sob agitação constante (Figura 23). A adição lenta do
Cd(ClO4)2 evita a formação de grandes aglomerados de hidróxido de cádmio.
Figura 23: Representação da passivação de quantum dots de CdS com hidróxido de
cádmio Cd(OH)2 e luminescência após passivação. Fonte: Chaves, 2006.
A passivação pode ser inicialmente confirmada através de uma lâmpada de luz
UV (Figura 22) e posteriormente através de espectros de emissão e absorção, uma vez
que se observa facilmente uma identificação na emissão no verde.
3.7. CARACTERIZAÇÃO DO QUANTUM DOT
3.7.1. Espectroscopia de Absorção
As medidas de caracterização das nanopartículas foram realizadas utilizando o
instrumento UV/VIS Spectro-photometer, Perkin-Elmer modelo Lambda6, com
resolução de 0,5nm, na região de 190 a 900nm, utilizando a água como referência. As
medidas foram realizadas no laboratório do Professor Ricardo Ferreira do Departamento
de Biofísica da UFPE.
Thatiana M. Stamford ____________________________ Procedimento Experimental
67
3.7.2. Espectros de Excitação e Emissão
Foram utilizados 5mL da suspensão de CdS/Cd (OH)2 em uma cubeta de quartzo
durante as medidas de excitação e emissão. As medidas foram realizadas no
espectrofluorímetro Vinci- Instrument control ISS (K2), com resolução de 1,0 nm e
lâmpada de xenônio de 300W como fonte de excitação. As medidas foram realizadas no
Departamento de Física da UFPE.
3.7.3. Medidas de Tamanho por Espalhamento Dinâmico de Luz (DLS)
Os tamanhos dos raios hidrodinâmicos das nanopartículas foram determinados
por Espalhamento Dinâmico de Luz (DLS) usando Zetasizer (Nano-ZS, Malvern, UK).
As medidas de DLS foram operadas com o comprimento de onda de 633nm a
25ºC com um ângulo de detecção de 90º. As amostras não foram diluídas e três medidas
subsequentes foram determinadas para cada amostra.
3.8. OBTENÇÃO DO NANOCOMPÓSITO
3.8.1. Funcionalização do quantum dot: Biocompatibilização
Através da funcionalização do CdS/Cd(OH)2 com as NCQ, obteve-se o
nanocompósito inédito apresentado no presente trabalho. Para poder verificar a
intensidade da marcação deste nanocompósito (NC), foi preparado um controle com
glutaraldeído. Os procedimentos de funcionalização por glutaraldeído e pelas NCQ
estão descritas a seguir:
3.8.1.1. Glutaraldeído (Controle)
O glutaraldeído é usado como agente de fixação de células para microscopia,
mas utilizado em pequenas quantidades, pode-se observar sua interação com as
nanopartículas de CdS e uma possível ligação com materiais biológicos.
Thatiana M. Stamford ____________________________ Procedimento Experimental
68
Em um erlenmeyer de 100mL, foi adicionado 10mL de suspensão de
CdS/Cd(OH)2. Em seguida, adicionou-se lentamente 100μL de uma solução de
glutaraldeído a 0,01%, à temperatura de 25ºC e mantido em agitação por 10 minutos.
3.8.1.2. Nanopartículas de cloridrato de quitosana (Nanocompósito)
Após verificar a luminescência do quantum dot, foi preparado uma solução de
nanopartículas de cloridrato de quitosana (NCQ) na concentração de 2,5mg/mL
utilizando água Milli-Q. Foram medidos o pH do quantum dot e da solução de NCQ
(pH=8,5; pH= 5,5 respectivamente). A seguir, ajustou-se o pH de ambos para 7,5. O pH
das NCQ foi ajustado com solução de 0,1M de NaOH e a solução de CdS/Cd(OH)2 foi
ajustada com ácido perclórico (HCLO4) 0,1M.
Antes do processo de funcionalização, foram realizados vários testes de
diluições para verificar a “eficiência da luminescência” do quantum dot na presença da
solução de NCQ. Segundo Santos (2002), em amostras de CdS/Cd(OH)2, temos
aproximadamente 1013
nanopartículas/mL.
Foram preparadas as seguintes diluições:
• 0,5mL CdS/Cd(OH)2 + 5mL NCQ (1:10)
• 1mL CdS/Cd(OH)2 + 5mL NCQ (1: 5)
• 1mL CdS/Cd(OH)2 + 2mL NCQ (1: 2)
• 1mL CdS/Cd(OH)2 + 1mL NCQ (1: 1)
• 2,5mL CdS/Cd(OH)2 + 100µL NCQ (25: 1)
• 5mL CdS/Cd(OH)2 + 100µL NCQ (50: 1)
• 10mL CdS/Cd(OH)2 +100µL NCQ (100:1)
Thatiana M. Stamford ____________________________ Procedimento Experimental
69
A Figura 24, mostra um esquema que representa a síntese, passivação e
funcionalização do quantum dot.
Figura 24: Síntese (CdS), passivação (CdS/Cd(OH)2) e funcionalização do quantum dot
com NCQ (Nanocompósito: CdS/Cd(OH)2 + NCQ). Fonte: Chaves, 2006(Adaptado).
Para escolha da melhor diluição, foi observado se o sistema manteve:
1- As suas propriedades espectroscópicas (quando excitado com lâmpada na região do
Ultra Violeta) e;
2- Estabilidade coloidal (determinada através do Potencial Zeta).
3.8.1.3. Potencial Zeta
Utilizou-se o equipamento Zetasize localizado no Departamento de Física da
UFPE para medir o potencial zeta das nanopartículas de CdS/Cd(OH)2 funcionalizadas
com glutaraldeído e com as diferentes diluições de NCQ.
Para análises de potencial zeta foram utilizadas, em temperatura de 25ºC,
aproximadamente 4mL das mesmas suspensões descritas acima e citadas no item
3.8.1.2.
NCQ
NCQ
Thatiana M. Stamford ____________________________ Procedimento Experimental
70
3.9. TESTES DE BIOCOMPATIBILIDADE DO NANOCOMPÓSITO
3.9.1. Teste de Irritabilidade por HET-CAM
3.9.1.1. Materiais e Equipamentos: Tubos de ensaio, lupa, espátula, ovos
fertilizados, algodão, sistema de água do tipo MilliQ, solução salina 0,9%, amostras a
serem testadas (CdS; CdS/Cd(OH)2; NCQ; Nanocompósito (NC) e lauril sulfato de
sódio à 3%).
3.9.1.2. Procedimento do teste HET-CAM
No décimo dia de incubação, o reservatório acima do espaço aéreo do ovo foi
removido. A membrana corioalantóide do ovo foi exposta e umedecida com salina
fisiológica a 0,9%. A salina foi cuidadosamente removida com algodão, expondo a
membrana corioalantóide. Uma alíquota de 200µL da substância testada foi aplicada na
membrana corioalantóide do ovo fertilizado. Durante 5 minutos foram avaliados efeitos
irritantes como: hemorragia, coagulação e vasoconstricção. As etapas do procedimento
do teste da membrana corialantóide do ovo podem ser visualizadas na Figura 25.
(a) (b)
(c) (d)
Thatiana M. Stamford ____________________________ Procedimento Experimental
71
Figura 25: Imagens das etapas experimentais do teste de irritabilidade: (a) Ovos no 10º
dia de incubação; (b) Remoção da casca externa; (c) Eliminação de membrana branca,
previamente umidificada com água destilada; (d) Membrana Corialantóide do ovo; (e)
Aplicação da amostra e (f) Observação por 5 minutos.
Fonte: http://www.invitrocells.com.br/interna.php?area=servico&escolha=17
Foi observado o tempo (em segundo) que iniciava os processos de hemorragia,
coagulação e vasoconstricção. Estes tempos foram aplicados na fórmula a seguir:
(301- Hemorragia) x5 + (301- vasoconstricção) x7 + (301-Coagulação) x9
300 300 300
Onde:
Hemorragia → Representa o tempo (em segundo) quando primeiro apareceu à
hemorragia sanguínea.
Vasoconstricção → Representa o tempo (em segundo) quando primeiro surgiu à
vasoconstricção dos vasos.
Coagulação → Representa o tempo (em segundo) quando primeiro apareceu à
coagulação.
É possível quantificar, através desta fórmula, o potencial de irritação observado.
Além de obter a média ± desvio padrão da média para realizar a análise conforme a
classificação indicada na Tabela 02.
(e) (f)
Thatiana M. Stamford ____________________________ Procedimento Experimental
72
Tabela 02: Classificação do potencial de irritação das substâncias de acordo com
o teste de irritabilidade HET-CAM.
FAIXA DE PONTUAÇÂO CATEGORIA DE IRRITAÇÃO
0 - 0,9 Não Irritante
1 – 4,9 Ligeiramente irritante
5 – 8,9 Irritante
9 – 21 Muito irritante
3.9.2. Teste de Toxicidade pelo Método do MTT
3.9.2.1. Materiais e Equipamentos: linhagem de células tumorais; amostras a
serem testadas; dimetilsulfóxido; meio de cultura DMEN; tripsina; soro fetal bovino;
penicilina-estreptomicina; MTT; placas de cultura com 96 poços; pipetas de vidro;
micropipetas; câmara de fluxo laminar; microscópio óptico; centrifuga; leitor de ELISA;
incubadora a 37 °C e CO2 a 5%.
3.9.2.2. Ensaio do MTT
Células: A linhagem tumoral utilizada, NCI H-292 (câncer de pulmão–
humano), foi obtida do Banco de células do Rio de Janeiro, tendo sido cultivada em
meio DMEN, suplementados com 10 % de soro fetal bovino e 1 % de antibióticos,
mantidas em estufa a 37 C e atmosfera contendo 5% de CO2.
Amostras: As amostras foram diluídas em DMSO puro estéril e testadas na
concentração de 25 µg/mL.
Thatiana M. Stamford ____________________________ Procedimento Experimental
73
Análise de citotoxicidade pelo método do MTT vem sendo utilizada no
programa de screening do National Cancer Institute dos Estados Unidos (NCI), que
testa mais de 10.000 amostras a cada ano (SKEHAN et al., 1990). É um método rápido,
sensível e barato. Foi descrita primeiramente por Mosman (1983), tendo a capacidade
de analisar a viabilidade e o estado metabólico da célula. É uma análise colorimétrica
baseada na conversão do sal 3-(4,5-dimetil-2-tiazol)-2,5-difenil-2-H-brometo de
tetrazolium (MTT) em azul de formazan, a partir de enzimas mitocondriais presentes
somente nas células metabolicamente ativas. O estudo citotóxico pelo método do MTT
permite definir facilmente a citotoxicidade, mas não o mecanismo de ação (BERRIDGE
et al., 1996).
As células foram plaqueadas na concentração de 1 x 105 células/mL. A
suspensão foi distribuída em placas de cultura com 96 poços (100µL em cada poço). As
placas foram incubadas a 37ºC em estufa de CO2. Após 24h as substâncias testes foram
adicionadas (10 µL/poço) e as placas foram reincubadas a 37ºC por 72 horas em estufa
a 5% de CO2. Em seguida, foram adicionados 25 L da solução de MTT (5mg/mL em
PBS), e as placas foram incubadas por 3h. Ao final desse período o meio de cultura,
juntamente com o excesso de MTT foram aspirados e em seguida, 100 µL de DMSO foi
adicionado a cada poço para dissolução dos cristais formazan (Mosmann,1983 ; Alley et
al.,1988). A leitura óptica foi realizada em leitor automático de placas a 540 nm.
Estes valores foram processados pelo programa GraphPard-Prism 5.0 levando
em consideração que o controle utilizado foi o DMSO a 0,1%. Os ensaios foram
realizados em duplicata e expressos em percentagem de Inibição de Crescimento
Celular (%IC).
A Tabela 03 mostra uma escala de intensidade utilizada para avaliar o potencial
citotóxico das amostras testadas.
Thatiana M. Stamford ____________________________ Procedimento Experimental
74
Tabela 03: Classificação do potencial citotóxico das amostras de acordo com o
método do MTT.
INIBIÇÃO DE CRESCIMENTO
CELULAR (IC%)
CLASSIFICAÇÃO DO
POTENCIAL CITOTÓXICO
0 – 19% Sem atividade
20 – 49% Pouca atividade
50 – 69% Atividade moderada
70 – 100% Muita atividade
3.10. APLICAÇÃO DO NANOCOMPÓSITO EM SISTEMA BIOLÓGICO
3.10.1. Sistema Biológico
As células utilizadas, neste estudo, são da linhagem NCI-H 292, provenientes
de câncer de pulmão. Estas células foram fornecidas pelo Laboratório de Cultura
Celular do Departamento de Antibióticos, Centro de Ciências Biológicas da UFPE.
As células utilizadas foram cultivadas através de cultura celular em
monocamada.
3.10.1.1. Cultura de Células
São processos onde as células se mantém vivas em recipientes plásticos ou de
vidro, por determinado tempo, com a intenção de utilizá-las em diversos experimentos.
Neste processo, as células são mantidas em meio de cultura líquido e enriquecido, para
o seu melhor desenvolvimento e multiplicação, além de promover as condição ideais de
temperatura, pressão, umidade e pH (Farias et al., 2005).
Thatiana M. Stamford ____________________________ Procedimento Experimental
75
Utilizou-se o meio de cultura DMEM (Dulbecco’s Modified Eagle Medium,
Gibco), ao qual foi adicionado Soro Bovino Fetal, 1% de aminoácido L-glutamina, 1%
de antibiótico (Estreptomicina e Penicilina).
As células em cultura foram mantidas no Laboratório de Cultura de Células do
Departamento de Antibióticos da UFPE, onde as amostras foram adquiridas.
O procedimento descrito a seguir (3.10.1.2.) é utilizado para as células de câncer
de pulmão por terem um crescimento em monocamada, ou seja, quando as células se
multiplicam aderidas em uma das paredes do frasco de cultura onde são cultivadas
(Figura 26).
Figura 26: Frasco de cultura contendo células descongeladas em manutenção.
Fonte: Nascimento, 2009.
3.10.1.2. Preparo de placa de cultura de Células de câncer de pulmão
Foi retirado, com auxilio de uma bomba à vácuo, o meio de cultura antigo do
frasco que continha células de câncer de pulmão descongeladas em manutenção.
Depois, foi adicionado, ao frasco, 5 mL de tripsina (na superfície de crescimento
celular) sendo incubado na estufa a 35ºC por 3 minutos. Neste período, ocorre o
processo de tripsinização o qual destrói a trama proteica que liga as células promovendo
Thatiana M. Stamford ____________________________ Procedimento Experimental
76
a individualização celular. Em seguida, a tripsina foi retirada e a separação das células
foi confirmada pelo microscópio óptico. Adicionou-se 2,0 mL do meio de cultura
DMEM, fazendo jatos fortes, com a pipeta, contra a parede do frasco onde as células
estavam aderidas. Estes jatos auxiliam no descolamento das células da parede do frasco.
Acrescentou mais 2,0 mL do meio de cultura DMEM e uma alíquota desta suspensão
celular foi transferida para um eppendorf.. A seguir, foi colocado 90µL da suspensão e
10µL do corante azul de Tripan em uma câmara de Neubauer para observar a
viabilidade celular e prosseguir com a contagem de células. Esta contagem levou em
consideração o fator de correção da câmara para ajustar a suspensão em 105 células/mL.
3.10.2. Caracterização do sistema biológico
3.10.2.1. Incubação e Preparo das lâminas
Os materiais utilizados nesta etapa do experimento foram: suspensão celular
contendo 105 células/mL; lamínulas (18 x 18 mm); placas de cultura com 6 poços
(diâmetro de 30mm); meio de cultura DMEM; amostras testadas (CdS/Cd(OH)2; NCQ
na concentração de 2,5mg/mL e NC); solução de PBS e lâminas.
Todo o procedimento foi realizado na câmara de fluxo laminar e as lâminas e
lamínulas usadas foram devidamente esterilizadas.
Uma lamínula foi colocada em cada poço da placa e acrescentado 2mL do meio
de cultura DMEM. A placa foi incubada a 37ºC, CO2 a 5% por 2 hs para permitir a
aderência das células na lamínula. Após este período, retirou-se 500µL/poço do meio e
adicionou (500µL/poço) de cada amostra, sendo então incubada por 2 hs para permitir
que a substância atuasse em todas as células. Em seguida, o sobrenadante foi descartado
e cada lamínula foi retirada e colocada sobre uma lâmina recoberta com 20µL de PBS.
Thatiana M. Stamford ____________________________ Procedimento Experimental
77
As lâminas preparadas foram visualizadas no microscópio de fluorescência
convencional.
3.10.2.2. Microscopia de Fluorescência
A microscopia de fluorescência é uma das técnicas de imagem mais utilizada
para o estudo da dinâmica de células vivas, devido à sua capacidade de isolar diferentes
proteínas com um alto grau de especificidade. Baseia-se no fenómeno que certo material
emite energia detectável como luz visível quando irradiado com luz de um comprimento
de onda específico.
As análises por microscopia de fluorescência foram realizadas com o sistema
Leica CRT4000 do Laboratório de Biofísica-química Professor Ricardo Ferreira do
Grupo de Pesquisa em Nanoestruturas e Interfaces Biológicas da UFPE.
3.10.2.3. Descarte do material biológico
O descarte foi feito fazendo uma limpeza do material utilizado (ex. placas de
cultura de células e ponteiras plásticas) com hipoclorito de sódio a 2 % por 24 hs,
seguido de lavagem manual e descarte do material, sem posterior reutilização.
Thatiana M. Stamford _________________________________Resultados e Discussão
78
4. RESULTADOS E DISCUSSÃO
A apresentação dos resultados foi dividida em sete tópicos que serão discutidos
na seguinte ordem: (4.1) Caracterização da quitosana; (4.2) Caracterização das
nanopartículas de quitosana; (4.3) Caracterização das nanopartículas de cloridrato de
quitosana; (4.4) Caracterização do quantum dot; (4.5) Obtenção do nanocompósito;
(4.6) Testes de irritabilidade e toxicidade do nanocompósito e (4.7) Aplicação do
nanocompósito em sistema biológico.
4.1. CARACTERIZAÇÃO DA QUITOSANA
4.1.1. Características Estruturais
4.1.1.1. Espectroscopia vibracional na região do infravermelho
A espectroscopia na região do infravermelho permite observar e classificar
algumas bandas relativas a vibrações características dos grupos funcionais presentes na
estrutura da quitosana. A Tabela 04 mostra as bandas observadas nos espectros da
quitosana comercial (QC) e a quitosana desacetilada (QD) e suas respectivas
atribuições.
Tabela 04: Atribuição das bandas do infravermelho da Quitosana Comercial (QC) e da
Quitosana Desacetilada (QD).
Atribuições Intensidade Nº de onda (cm-1
)
QC QD QC QD
Anéis
Piranosídicos
0,675
0,706
0,966
0,918
1099,22
1152,29
895,33
1250,65
(-CH2 – OH)C-O 0,783 0,938 1384,64 1324,91
amidaC-N 0,787 0,924 1423,21 1430,34
amida IINH 0,781 0,917 1598,69 1588,46
amida IC=O 0,780 0,921 1594,84 1641,18
C-H 0,605 0,885 2923,56 2891,42
O-H 0,474 0,831 3448,09 3444,06
aminaNH 0,474 0,831 3448,09 3444,06
Thatiana M. Stamford _________________________________Resultados e Discussão
79
Os espectros obtidos para a quitosana comercial (QC) e para a quitosana
desacetilada (QD) mostram respectivamente um pico largo em 3448,09 e 3444,06 cm-1
,
na região correspondente ao estiramento OH. Esta aparece sobreposta à banda de
deformação axial NH do grupo amina (Nunthanid et al., 2001). No entanto, Figueiredo
(2002) relata que o grupo amina primária livre (-NH2) na posição C2 da glucosamina
apresenta outro pico na região entre 1220 e 1020 cm-1
.
Os picos em 2923,56 e 2891,42 cm-1
representam o estiramento C-H alifático
das amostras QC e QD respectivamente. Os picos em 1594,84 e 1641,18 cm-1
correspondem ao grupo amina acetilado da quitina indicando que as amostras não estão
totalmente desacetiladas (Figueiredo, 2002). Contudo, Anjos (2005) especifica este pico
em torno de 1655 cm-1
como sendo referente à banda de deformação axial C=O (amida
I) e o modo vibracional da deformação angular da ligação N-H (amida II) aparece como
um ombro em 1607 cm-1
.
Os picos em 1384,64 e 1324,91 cm-1
representam respectivamente o estiramento
C-O do grupo alcoólico primário (-CH2 – OH) das amostras QC e QD. A deformação
axial de C-N da amida aparece em 1423,21 e 1430,34 cm-1
para a quitosana comercial e
desacertilada, respectivamente. A banda intensa entre 800 e 1200 cm-1
está relacionada
aos anéis piranosídicos (Shigemasa et al., 1996).
4.1.2. Grau de desacetilação
O grau de desacetilação é considerado um dos principais parâmetros na
caracterização da quitina e da quitosana. Ele é definido como sendo o número de grupos
amina em relação ao número de grupos amida da cadeia polimérica.
Vários métodos já foram propostos para a sua determinação tais como:
espectroscopia no infravermelho, no ultravioleta, RMN 1H, RMN
13C, análise elementar
Thatiana M. Stamford _________________________________Resultados e Discussão
80
e titulações potenciométrica e condutimétrica. Entretanto, existe certa discrepância entre
os valores encontrados pelas diferentes técnicas. Por isso, até hoje, ainda busca-se
método mais adequado para sua determinação.
No presente trabalho, dois destes sete métodos foram realizados para determinar
o grau de desacetilação da quitosana: ressonância magnética nuclear de hidrogênio
(RMN 1H) e análise elementar.
4.1.2.1. Ressonância Magnética Nuclear
A ressonância magnética nuclear de 1H é uma técnica que permite a
quantificação de alto grau de desacetilação. A preparação da amostra é simples por
diversos motivos, tais como: não há necessidade de preparar curva analítica; utiliza uma
pequena quantidade de substância (miligramas) e não precisa purificá-la (caso os picos
de impurezas não tenham o mesmo deslocamento químico dos picos relevantes da
quitosana).
Segundo Lavertu, et al. (2003) a determinação do grau de desacetilação por
RMN 1H é feita utilizando uma relação entre os picos referentes aos prótons do grupo
acetoamido da quitina e os outros prótons, exceto o próton do carbono anomérico (C1)
da quitosana/quitina (Figura 27).
Figura 27: Esquema da quitina/quitosana com a numeração dos prótons que aparecem
no RMN 1H. Fonte: Anjos (2005).
OH4
OD
OD
H1
H2
NDH3
OD
C
H5
OD
C
H6
H6'
Hac
OH3C
D Deutério
Carbono
anomérico (C1)
Thatiana M. Stamford _________________________________Resultados e Discussão
81
Nesta técnica, a amostra de quitosana é dissolvida em solução de ácido
clorídrico deuterado resultando em uma solução viscosa, fazendo-se necessário que a
medida seja realizada a 50ºC para impedir interações intermoleculares e
intramoleculares (Figura 28), que modificam a integração dos picos, influenciando o
valor do grau de desacetilação. Assim, também, é necessário que as medidas sejam
realizadas rapidamente, de modo a minimizar problemas causados pela hidrólise da
quitosana, ou seja, a quebra das ligações glicosídicas que formam o biopolímero.
Figura 28: Interações intramoleculares e intermoleculares em/entre as cadeias de
quitosana. Fonte: Anjos (2005).
A Figura 29 mostra o espectro de RMN 1H para a Quitosana Comercial.
O
NH2
O
HOH2C
O
O
H
n
O
NH2
OO
HOH2C
O
O
H2N
OHO
CH2OH
HOH
n
n
Interações intramoleculares
Interações intermoleculares
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82
Figura 29: Espectro de RMN
1H da Quitosana Comercial (QC).
A Figura309 mostra o espectro de RMN 1H para a Quitosana Desacetilada.
26.07 4.67 3.00
Ha
c
H3,4,
5
HD
O
H1
H2
H6,6
’
Thatiana M. Stamford _________________________________Resultados e Discussão
83
Figura 30: Espectro de RMN
1H da Quitosana Desacetilada (QD).
Tabela 05.: Integração dos picos do espectro de RMN 1H da Quitosana antes e depois da
desacetilação, para o cálculo do grau de desacetilação.
O grau de desacetilação foi calculado pela equação 03, proposta por Hirai et al.
(1991), que utiliza os sinais dos prótons H2, H
3, H
4, H
5, H
6, H
6’ (H
2-6) de ambos os
monômeros e o pico referente aos núcleos do hidrogênio do grupo acetoamido (Hac
).
Hidrogênios
Integração dos picos
QC QD
Hac
3,00 3,00
H2 4,67 44,72
Σ H2,3,4,5,6,6’
30,74 242,1
1006
1
3
11% 62
HHGD ac
197.38 44.727
3.00
Eq. 03
Thatiana M. Stamford _________________________________Resultados e Discussão
84
Segundo a equação 04 proposta por Signini e Campana Filho (2000), que utiliza
a área do pico na região de 2ppm atribuído aos núcleos de hidrogênio do grupo
acetoamido (Hac
) e a área do pico em 3,4ppm referente ao núcleo de hidrogênio na
posição 2 do anel glicopiranosídico (H2).
Eq.04
Segundo a equação 04 só leva em conta os picos do grupo acetoamido (Hac
) e
dos hidrogênios do carbono na posição 2 do anel glicopiranosídico (H2). A escolha
desses dois picos se deve ao fato de que as áreas relativas aos núcleos dos grupos
metila, presentes no grupo acetamido e ao núcleo na posição 2 do anel
glicopiranosídico, estão relativamente livres das influências do pico de HOD. O
deslocamento químico (δ) de HOD, obtido nos espectros da quitosana antes e depois da
desacetilação, foram semelhantes entre si 4,4 e 4,5 ppm respectivamente. Estes valores
são semelhantes aos relatados por Anjos (2005) e Lavertu et al. (2003) que foi de 4,8
ppm. Estes diferem de Santos et al. (2003) que encontrou um valor próximo a 3,8 ppm.
Os valores dos graus de desacetilação variaram utilizando as equações 03 e 04,
como mostrado na Tabela 06.
Tabela 06: Valores dos graus de desacetilação em porcentagem da quitosana
determinados por RMN 1H, a partir de duas equações distintas.
Quitosana Eq.(03) Eq. (04)
QC 80% 79%
QD 97,5% 98%
1003
1%2
H
HGD
ac
Thatiana M. Stamford _________________________________Resultados e Discussão
85
4.1.2.2. Análise Elementar
A análise elementar é uma ferramenta que pode ser utilizada para a
determinação do grau de desacetilação da quitosana. Apesar de ser um método preciso,
deve ser usado com muita cautela em virtude dos diferentes teores de hidratação, que
variam de acordo com as condições de armazenamento e tratamento prévio da amostra.
A equação 05 foi proposta por Kassai et al. (2000) para determinar o grau de
desacetilação da quitosana, tendo em vista a relação entre carbono e nitrogênio, a qual
pode ser obtida pela análise elementar.
Eq.05
Onde C/N é a razão de carbono/nitrogênio. Esta razão, de acordo com Kassai et
al. (2000), varia de 5,145 em quitosana completamente desacetilada (monômero da
quitosana) a 6,816 em quitina inteiramente acetilada (monômero da quitina).
A Tabela 07 mostra os percentuais de carbono, nitrogênio, hidrogênio, a relação
carbono/nitrogênio e o grau de desacetilação encontrados nas amostras de quitosanas
analisadas.
Tabela 07: Percentuais de carbono, nitrogênio, hidrogênio, a relação carbono /
nitrogênio e o grau de desacetilação das amostras de quitosana comercial (QC), da
quitosana desacetilada (QD).
Quitosana C % N % H % C/N GD%
QC 39,01 7,12 10,58 5,478 80%
QD 36,66 7,08 7,71 5,178 98%
Este método só apresenta resultados precisos para a quitosana que não tem
resíduos de proteínas, caso contrário, é necessário à purificação da mesma. No presente
100
145,5816,6
145,51%
NCGD
Thatiana M. Stamford _________________________________Resultados e Discussão
86
trabalho não foi preciso purificar as amostras de quitosana, já que os resultados obtidos
na análise elementar foram semelhantes aos encontrados pela ressonância magnética
nuclear de hidrogênio. Por tanto, a próxima etapa do experimento foi à
despolimerização do polímero, a qual foi avaliada através das medidas de viscosidade
determinadas para cada grupo.
4.1.3. Massa Molar
4.1.3.1. Medidas de Viscosidade
As propriedades físico-químicas da quitosana dependem não somente do grau de
desacetilação, mas também da sua massa molar média. As determinações da massa
molar média de polímeros podem ser realizadas por cromatografia de permeação em gel
(GPC) ou por medidas de viscosidades.
A cromatografia de permeação em gel também chamada de cromatografia de
exclusão de tamanho é o método mais utilizado para a determinação da distribuição da
massa molar de polímeros (Stevens, 1999). Uma coluna cromatográfica separa as
frações cujas massas molares apresentam pequena variação. No caso da quitosana, tem
sido discutido o efeito da natureza química dos padrões de calibração sobre a
determinação de massa molar por GPC. Segundo Tsaih & Chen (1999), os melhores
resultados são obtidos através de padrões de calibração da própria quitosana. Entretanto,
a maior dificuldade surge da inexistência de amostras comerciais desses padrões.
Assim, para a determinação da massa molar média da quitosana utilizada neste estudo,
realizou-se medida de viscosidade.
A viscosidade de soluções poliméricas é a medida do volume hidrodinâmico
(tamanho ou extensão no espaço) do polímero em solução. A viscosidade de soluções
poliméricas diluídas é consideravelmente maior que a do solvente puro, ou de soluções
Thatiana M. Stamford _________________________________Resultados e Discussão
87
diluídas de pequenas moléculas. Isso se deve à grande diferença de tamanho entre as
moléculas do polímero e a do solvente. A viscosidade aumenta à medida que as
dimensões das moléculas poliméricas em solução aumentam. Assim, a viscosidade
polimérica é o resultado da comparação entre o tempo de escoamento do solvente em
um capilar e o tempo de escoamento da solução polimérica a determinada concentração
e temperatura. Embora seja um método não absoluto, a medida de viscosidade pode ser
utilizada para estimar/determinar a massa molar média de polímeros, utilizando-se um
viscosímetro e um capilar tipo Cannon-Fenske.
A medida de viscosidade foi realizada com soluções de quitosana de
concentrações na faixa de 2,0 a 9,0 mg/mL.
A razão do tempo de escoamento da solução do polímero pelo tempo de
escoamento da solução do solvente é chamada de viscosidade relativa. As viscosidades
específicas de cada quitosana foram calculadas aplicando a média dos tempos de
escoamento na expressão descrita abaixo (equação 06). Ambas as viscosidades são
adimensionais.
Eq.06
Onde:
η esp = viscosidade específica da amostra
t = tempo de escoamento da solução no viscosímetro
t0= tempo de escoamento do solvente puro no viscosímetro
Viscosidade reduzida é a viscosidade específica dividida pela concentração e
tem como dimensão o inverso da concentração.
C
esp
red
0
0
t
ttesp
Eq. 07
Thatiana M. Stamford _________________________________Resultados e Discussão
88
Onde:
η red = viscosidade reduzida da amostra.
C = concentração em gramas de polímero em 100 mL de solução.
As viscosidades intrínsecas das quitosanas foram encontradas pela extrapolação
do gráfico de viscosidade reduzida versus concentração à diluição infinita, com base na
equação 08 de Huggins (1942) mostrada abaixo:
ηred = [η] + KH [η]2 C Eq.08
A viscosidade intrínseca de uma solução polimérica está relacionada com a
massa molar viscosimétrica média (Tabela 08), através da equação de Mark-Houving
(Eq. 09). O valor da constante K e a dependem do polímero, do solvente e da
temperatura. Neste trabalho o solvente utilizado foi o ácido clorídrico na temperatura de
25ºC o qual apresenta os valores de 1,81x 10-5
e 0,93 para K e a, respectivamente.
(Eq.09)
Tabela 08: Valores da viscosidade intrínseca e a massa molar viscosimétrica média das
quitosanas estudadas.
Quitosana Viscosidade intrínseca []
(mL/g)
Massa molar média
(g/mol)
QC 3,8278 5,6 x 105
QC D5% 0,0326 3,2 x 103
QC D15% 0,0168 1,6 x 103
QD 0,4005 4,9 x 104
QD D5% 0,0500 5,2 x 103
QD D15% 0,0088 8,0 x 102
A massa molar média da quitina está entre 1,03 x 106 a 2,5 x 10
6 g/mol. Na
obtenção da quitosana pela reação de desacetilação, este valor é reduzido para 5 x 105 a
5 x 104 g/mol. Os valores das massas molares média das quitosanas QC e QD,
a
MK
_
Thatiana M. Stamford _________________________________Resultados e Discussão
89
apresentados na Tabela 08, estão de acordo com os relatados na literatura por Santos et
al. (2003) e Anjos (2005). No entanto, os valores dos grupos QC D15% e QD D15%
estão inferiores aos encontrados por Yang et al. (2010), ao empregarem a mesma
metodologia de despolimerização com concentração de 15%. Yang et al. (2010)
conseguiram reduzir a massa molar viscosimétrica de 2,4 x 105 para 3,6 x 10
3,
enquanto que, o presente trabalho, alterou a massa molar de 4,9 x 104 para 8,0 x 10
2.
4.2. CARACTERIZAÇÃO DAS NANOPARTÍCULAS DE QUITOSANA
4.2.1. Microscopia Eletrônica de Transmissão (MET)
A Microscopia Eletrônica de Transmissão (MET) tem sido muito empregada na
obtenção de informações relativas à forma e ao tamanho das nanopartículas (Yoo et
al.1999; Jeon et al., 2000). A MET pode permitir também a diferenciação entre
nanocápsulas e nanoesferas, possibilitando, inclusive, a determinação da espessura da
parede das nanocápsulas (Mosqueira et al., 2000). Rollot et al. (1986) demonstraram
que as nanoesferas apresentam uma estrutura polimérica sólida, ao passo que, as
nanocápsulas são formadas por um fino (cerca de 5nm) invólucro polimérico ao redor
do núcleo oleoso (Palumbo et al., 2002). Gouvender et al. (2000), através da MET,
mostraram que a incorporação de quantidades baixas ou elevadas de fármacos não altera
a morfologia de nanopartículas de quitosana.
Zhang et al. (2004) realizaram experimentos a fim de encontrar nanopartículas
de quitosana adequadas para liberação de fármaco mucosal. Para isto, os autores
avaliaram a influência do processo de desacetilação e despolimerização na obtenção do
tamanho destas nanopartículas. As imagens de MET das nanopartículas de quitosana
preparadas com quitosana comercial, desacetilada, assim como a desacetilada e
despolimerizada apresentaram respectivamente os seguintes tamanhos: 150-340nm,
Thatiana M. Stamford _________________________________Resultados e Discussão
90
145-158nm e 98nm. As nanopartículas de quitosana ideais para esta aplicabilidade,
sugerida pelos autores, foram as que obtiveram tamanho de aproximadamente de 98nm
através da MET.
Figura 31: Imagens de MET das nanopartículas de quitosana preparadas com quitosana
(a) comercial ; (b) desacetilada; (c) desacetilada e despolimerizada. Fonte: Zhang et al.
(2004).
As imagens de MET obtidas, neste trabalho, foram as do grupo NQCD5%,
NQCD15%, NQDD5% e NQDD15% visualizadas nas figuras 32(a), 32(b), 33(a) e
33(b), respectivamente. A escolha destes grupos teve como objetivo aprimorar as
descobertas de Zhang et al. (2004) e focar em outra aplicabilidade para estas
nanopartículas.
Figure 1:
Figura 32: Imagens de MET das nanopartículas de quitosana preparadas com (a)
Quitosana Comercial Despolimerizada com peróxido a 5%. (NQCD5%) e (b) Quitosana
Comercial Despolimerizada com peróxido a 15%. (NQC D15%).
(b)
150nm
150nm
(a)
Thatiana M. Stamford _________________________________Resultados e Discussão
91
A morfologia das nanopartículas de quitosana preparadas por gelificação iônica
usando QCD5% apresentou certa agregação entre as partículas, enquanto que, as obtidas
por QCD15% mostraram-se mais individualizadas. A distribuição do tamanho das
partículas é mais homogênea na imagem 32(b) indicando nanoesferas mais uniformes
entorno de 150 nm. A Figura 32(a) mostra as NQCD5% com tamanho entre 160 a
200nm.
Figura 33: Imagens de MET das nanopartículas de quitosana preparadas com (a)
Quitosana Desacetilada Despolimerizada com peróxido a 5%. (NQDD5%) e (b)
Quitosana Desacetilada Despolimerizada com peróxido a 15%. (NQDD15%).
As imagens de MET dos dois grupos de nanopartículas obtidos pela quitosana
desacetilada não apresentaram agregações entre as partículas. No entanto, mostraram
diferenças na distribuição do tamanho: as NQDD5% são mais heterogêneas
apresentando partículas com tamanho entre 100 e 175nm (Figura 33a) e as NQDD15%
são mais homogêneas com tamanho entorno de 130nm (Figura 33b). Contudo, houve
alteração na morfologia destas partículas, já que, observamos que suas nanoesferas não
são tão bem definidas quanto às visualizadas pelas NQCD15% (Figura 32b).
A morfologia das NQCD15% é semelhante à encontrada por Liu et al. (2007),
que obtiveram nanopartículas de quitosana por gelificação iônica utilizando o
Triton X-100 como surfactante em vez do TPP. No entanto, o tamanho das NQCD15%
(a)
300nm
300nm
(a) (b)
Thatiana M. Stamford _________________________________Resultados e Discussão
92
apresenta-se 25nm maior do que o encontrado por Liu et al. (2007). Este pequeno
aumento no tamanho é desejável, tendo em vista que o objetivo deste trabalho é
encontrar nanopartículas ideais para o diagnóstico e tratamento do câncer.
Figura 34: Imagem de MET de nanopartículas de quitosana obtidas por gelificação
iônica usando o Triton X-100 como surfactante. Fontes: Liu et al., 2007
4.2.2. Medidas de Tamanho por Espalhamento Dinâmico de Luz (DLS)
Os métodos usuais para a determinação da distribuição de tamanho das
nanopartículas consistem em Microscopia eletrônica de varredura (MEV), Microscopia
Eletrônica de Transmissão (MET) e Medidas de tamanho por Espalhamento Dinâmico
de Luz (DLS) também conhecida por Espectroscopia de correlação de fótons e Difusão
quase elástica de luz. Conforme o método empregado na sua determinação, diferenças
de tamanho de partículas podem ser verificadas, uma vez que a microscopia eletrônica
fornece uma imagem da partícula isolada do meio, enquanto que a espectroscopia de
correlação de fótons possibilita a determinação do raio hidrodinâmico das partículas em
suspensão (Schaffazick et al., 2003).
Thatiana M. Stamford _________________________________Resultados e Discussão
93
Vários estudos têm sido desenvolvidos para avaliar os principais fatores que
afetam o diâmetro das partículas de sistemas nanoestruturados (Zhang et al., 2004; Gan
& Wang 2007; Liu et al., 2007; Atyabi et al., 2008; Du et al., 2009; Yang et al.,2010).
Geralmente, as nanopartículas, mesmo preparadas através de diferentes métodos,
apresentam diâmetros médios entre 100 e 300nm. No entanto, partículas com diâmetros
entre 50 e 70nm podem ser obtidas (Du et al., 2008). A composição quali-quantitativa e
o método de preparação das nanopartículas são fatores determinantes do diâmetro
médio e da polidispersão das partículas. Segundo Ginani et al. (1999) e Liu et al.
(2007), um fator que também pode interferir no método de gelificação iônica é o tipo de
surfactante empregado.
Medidas de distribuição de tamanho foram realizadas para as NQCD5%,
NQCD15%, NQDD5% e NQDD15%. Verificou-se que os histogramas encontrados
para estes grupos (Figura 35) apresentam resultados ligeiramente inferiores aos obtidos
pela MET. No entanto, como a microscopia fornece apenas uma imagem de uma
pequena porção das nanopartículas isoladas do meio, pode-se dizer que, os resultados de
ambas as técnicas de caracterização estão compatíveis.
No presente trabalho, os histogramas de distribuição de tamanho obtidos para as
NQCD5%; NQCD15%; NQDD5% e NQDD15% estão apresentados na Figura 35 (a,b,c
e d) respectivamente.
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94
Figure 35: Histogramas com distribuição de tamanho das nanopartículas de (a)
Quitosana Comerciale Despolimerizada com peróxido a 5%. (QCD5%), (b) Quitosana
Comercial Despolimerizada com peróxido a 15% (QCD15%), (c) Quitosana
(c)
(d)
(b)
(a)
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95
Desacetilada Despolimerizada com peróxido a 5% (QDD5%) e (d) Quitosana
Desacetilada Despolimerizada com peróxido a 15% (QDD15%).
A figura 35 apresenta uma distribuição bimodal granulométrica das partículas
para as quitosanas que foram despolimerizada com peróxido na concentração de 5%
apresentando tamanhos de 68 e 190nm para as nanopartículas obtidas pela QCD5%
(Fig.35 a) e de 167nm (60%) e 418nm (40%) para as nanopartículas obtidas pela
QDD5% (Fig. 35 c). No entanto, para as quitosanas despolimerizadas a 15% a
distribuição é unimodal granulométrica com tamanho médio das partículas entorno de
122nm e 137nm para as nanopartículas obtidas pela QCD15% (Figura 35b) e pela
QDD15% (Figura 35d) respectivamente. Enquanto que, na MET observam-se poucas
nanoesferas de tamanho próximo a 70nm e a maioria das nanopartículas entre 160 e
200nm para as nanopartículas obtidas pela QCD 5% (Figura 32a), nanoesferas entorno
de 150nm pela QCD15% (Figura 32b), nanopartículas entre 100 e 175nm pela QDD5%
(Figura 33a) e nanoesferas entorno de 130nm pela QDD 15% (Figura 33b).
Os resultados obtidos por DLS para as NQCD5% e 15% apresentaram tamanhos
inferiores aos encontrados por Zhang et al. (2004). Estes pesquisadores observaram
tamanhos diferenciados para as nanopartículas de quitosana comercial (150-340nm),
nanopartículas de quitosana despolimerizada (190-520nm), nanopartículas de quitosana
desacetilada (145-158nm) e para nanopartículas de quitosana desacetilada e
despolimerizada (98 nm) através do método de gelificação iônica conforme observado
na figura 36.
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96
Figure 36: Distribuição de tamanho das nanopartículas produzidas por quitosana (a)
comercial, (b) despolimerizada (c) desacetilada (d) desacetilada e despolimerizada
(Zhang et al., 2004).
O resultado de DLS encontrado por Zhang et al (2004) para as nanopartículas
obtidas com as quitosanas desacetiladas obtiveram tamanho médio de 150nm. No
entanto, estas nanopartículas não seriam adequadas para o diagnóstico e/ ou tratamento
de neoplasias devido à presença de dois picos menores encontrados no histograma da
distribuição de tamanho correspondendo a nanopartículas entorno de 20 e 50nm (Figura
36c). Estes tamanhos de nanopartículas são exatamente os que provocam os efeitos
colaterais nas quimioterapias já que não atingem apenas as células cancerígenas como
também as células sadias. Portanto, o presente trabalho teve o objetivo de eliminar estas
nanopartículas menores e obter nanopatículas com 150nm homogêneas e com a
morfologia bem definida. Dessa forma, as nanopartículas de quitosanas ideais para a
aplicabilidade sugerida neste trabalho são as obtidas pela QCD15%.
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97
Estas NQCD15% foram utilizadas para funcionalizar os quantum dotss. No
entanto, durante esta etapa experimental, observou-se que as NQCD15% interferiram
nas propriedades de estabilidade coloidal e coalescência dos quantum dots. Isto pode ter
ocorrido devido a incompatibilidade de pH entre as nanopartículas de quitosana (pH
5,0) e do marcador fluorescente (pH 8,5). Por tanto, foi necessário modificarmos estas
nanopartículas a fim de que as mesmas ficassem solúveis em meio aquoso e não
precipitassem em pH fisiológico (7,5). Levando em consideração, estes fatores, foi
elaborado um protocolo inédito (patente) para obter nanopartículas de cloridrato de
quitosana (NCQ).
Estas NCQ foram testadas na funcionalização dos quantum dotss e
posteriormente na marcação das células neoplásicas de pulmão e obtiveram bons
resultados. Resultados estes descritos no tópico 4.7.1.
A caracterização destas nanopartículas inéditas está apresentada no item 4.3,
descrita a seguir.
4.3. CARACTERIZAÇÃO DAS NANOPARTÍCULAS DE CLORIDRATO DE
QUITOSANA
Como as NQC, preparadas no presente trabalho, são consideradas inéditas, então
não podemos discutir os resultados obtidos. No entanto, iremos comparar com dados
encontrados na literatura para o cloridrato de quitosana (CQ) e/ ou com os próprios
grupos realizados nesta pesquisa.
4.3.1. Características Estruturais
4.3.1.1. Espectroscopia vibracional na região do infravermelho
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98
A espectroscopia na região do infravermelho permite observar e classificar
algumas bandas relativas a vibrações características dos grupos funcionais presentes na
estrutura das nanopartículas de cloridrato de quitosana (NCQ). A Tabela 09 mostra as
bandas observadas nos espectros da NCQ e suas respectivas atribuições.
Tabela 09: Atribuição das bandas do infravermelho das Nanopartículas de Cloridrato de
Quitosana (NCQ).
Atribuições Intensidade Nº de onda (cm-1
)
NCQ NCQ
Anéis
Piranosídicos
0,639
0,801
1080,84
1149,96
(-CH2 – OH)C-O 0,842 1378,41
amidaC-N 0,948 1514,71
Amida II NH 0,853 1606,86
Amida IC=O 0,829 1652,94
C-H 0,874 2998,72
O-H 0,554 3432,59
AminaNH 0,554 3432,59
O espectro obtido para as NCQ mostra um pico largo em 3432,59 cm-1
, na
região correspondente ao estiramento OH. Esta aparece sobreposta à banda de
deformação axial NH do grupo amina (Nunthanid et al., 2001). Provavelmente ocorre
uma incorporação de íons cloreto (Cl) ao grupamento amina protonado. Esta diferença
estrutural implica em alterações de propriedades que refletem na aplicabilidade deste
material.
4.3.2. Grau de desacetilação
4.3.2.1. Análise Elementar
O grau de desacetilação das NCQ foi determinado através da análise elementar
de acordo com Kassai et al. (2000), como descrito no tópico 4.1.2.2.
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99
A Tabela 10 mostra os percentuais de carbono, nitrogênio, hidrogênio, a relação
carbono/nitrogênio e o grau de desacetilação encontrado para as NCQ.
Tabela 10: Percentuais de carbono, nitrogênio, hidrogênio, a relação carbono /
nitrogênio e o grau de desacetilação da amostra de nanopartículas de cloridrato de
quitosana (NCQ).
Quitosana C % N % H % C/N GD%
NCQ 39,97 7,34 10,37 5,446 82%
Signini & Campana-Filho (1998) determinaram o grau de desacetilação do
cloridrato de quitosana (GDCQ= 77,3%) enquanto que, no presente trabalho foi
encontrado um GDNCQ= 82%. Isto sugere um aumento de 4,7% do GD após as
preparações das nanopartículas através do processo de gelificação iônica.
4.3.3. Massa Molar
4.3.3.1. Medidas de viscosidade
A medida de viscosidade foi realizada com soluções de nanopartículas de
cloridrato de quitosana (NCQ) nas concentrações de 2,0 a 9,0 mg/mL.
O protocolo usado para obter a massa molar viscosimétrica desta NCQ foi à
mesma descrita no tópico 4.1.3.1.
Tabela 11: Valores da viscosidade intrínseca e a massa molar viscosimétrica média das
nanopartículas de cloridrato de quitosana (NCQ).
Quitosana Viscosidade intrínseca []
(mL/g)
Massa molar média
(g/mol)
NCQ 0,0132 1,2 x 103
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100
Na obtenção da NCQ foi utilizada a QCD15%, portanto se faz necessário
comparar as duas massas molares. Os valores encontrados para as massas molares
média da QCD15% e da NCQ foram de 1,6x103
e 1,2 x 103
g/mol, respectivamente.
Então, pode-se dizer que a modificação da estrutura da quitosana de comercial para
cloridrato associada ao processo de gelificação iônica acarretou uma pequena redução
da massa molar deste polímero. No entanto, observou-se uma redução maior na massa
molar da QDD15% que apresentou o processo de desacetilação associado ao de
despolimerização com peróxido a 15% (8,0 x 102g/mol).
Os valores das massas molares viscosimétricas das QCD15% e da QDD15%
estão apresentados na Tabela 08.
É importante reforçar que as NCQ são um material novo (patente) e por isto não
existe na literatura resultados que possamos comparar. No entanto, o cloridrato de
quitosana (CQ) é abordado em alguns artigos (Signine & Campana Filho, 1998; Signine
& Campana Filho 2001; Gonçalves et al., 2005). A massa molar viscosimétrica do
cloridrato de quitosana já foi determinada por Signini & Campana Filho, (1998) e por
Bezerra (2011) que encontraram valores de 1,26 x 106
g/mol e 6,9 x 105 g/mol
respectivamente. Estes valores são superiores ao encontrado para as NCQ (1,2 x 103
g/mol).
4.3.4. Microscopia Eletrônica de Transmissão
As imagens de MET obtidas para as NCQ estão visualizadas nas figuras 38(a) e
38(b). A escolha deste grupo teve como objetivo melhorar a funcionalização dos
quantum dots e consequentemente focar na aplicabilidade proposta neste trabalho.
Finalidade esta, que seria encontrar um material capaz de diagnosticar neoplasias
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101
pulmonares e que futuramente possa ser associado a fármacos a fim de reduzir,
consideravelmente, os efeitos colaterais dos tratamentos quimioterápicos.
Figura 37: Imagens de MET das nanopartículas de cloridrato de quitosana (a) a barra de
tamanho é de 145nm e (b) a barra de tamanho é de 50nm.
A morfologia das NCQ preparadas por gelificação iônica usando QCD15% não
apresentou agregação entre as partículas. Neste aspecto foi semelhante as imagens
obtidas para as NQCD15% as quais mostraram-se bem individualizadas (Figura 32b).
A distribuição do tamanho das partículas é considerada homogênea em ambos os grupo
(Figura 32b e 37ª) indicando nanoesferas entorno de 150 e 145nm respectivamente.
A morfologia das NCQ observada na Figura 38b é bem diferente do encontrado
para os outros grupos desta pesquisa e também para outras imagens de nanopartículas
de quitosana apresentadas na literatura. Acredita-se que estes aspecto “de filamentos”
visualizados na superfície destas NCQ pode ser responsável pela peculiaridade das
propriedades e consequentemente aplicabilidade deste novo material. No entanto, outras
caracterizações e futuros experimentos fazem-se necessários antes de considerarmos
que estas nanopartículas são ideais para o diagnóstico e tratamento do câncer.
4.4. CARACTERIZAÇÃO DOS QUANTUM DOTS DE CdS/Cd(OH)2
4.4.1. Espectroscopia de absorção eletrônica
Thatiana M. Stamford _________________________________Resultados e Discussão
102
A suspensão foi analisada através de espectroscopia de absorção na região do
ultravioleta-visível. Através desta técnica pode-se verificar a qualidade da suspensão
coloidal com relação à sua homogeneidade. Mesmo sendo um método de preparação
relativamente simples e reprodutível, pequenas variações nas condições de síntese
resultam em grandes modificações na estabilidade da suspensão e no tamanho, assim
como na dispersão das partículas obtidas.
No espectro de absorção pode-se verificar, por exemplo, se ocorre espalhamento
causado por partículas maiores do que 1μm.
Segundo Santos (2002), relações Cd/S>1, durante a síntese, resultam no
deslocamento da banda de absorção para energias maiores, indicando uma diminuição
do tamanho das partículas. Um espectro representativo da suspensão de CdS/Cd(OH)2
está evidenciado na Figura 39.
300 400 500 600
0.0
0.2
0.4
0.6
0.8
Ab
s. (
u.a
.)
Comprimento de onda (nm)
Figura 38: Espectro de absorção da suspensão de nanopartículas de CdS/Cd(OH)2
Segundo Vossmeyer (1994), o tamanho da partícula pode ser relacionado
diretamente com o valor do primeiro máximo do comprimento de onda de absorção. Em
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103
476nm foi descrito um tamanho de aproximadamente 9,6nm e um band gap de 2,6eV,
destacando o regime de confinamento quântico fraco.
O espectro obtido apresenta absorção em torno de 471 nm, valor próximo a
valores descritos na literatura (Vossmeyer, 1994;Santos, 2002; Chaves, 2006).
4.4.2 Espectros de Excitação e Emissão
Os espectros de excitação e emissão da amostra de CdS passivada com Cd(OH)2
estão apresentados na figura 40 (a) e (b). Através destes espectros, podem-se verificar
os possíveis comprimentos de onda usados para excitar a amostra. No caso, pode excitar
as nanopartículas de CdS, passivadas por Cd-OH, nas regiões mais intensas do espectro
(375, 420 e 468nm), destacadas na figura 40 (a).
O espectro de emissão se constitui em um registro das intensidades de emissão
nos diversos comprimentos de onda da banda de emissão, em um comprimento de onda
fixo de excitação. Para suspensões de nanopartículas de CdS/Cd(OH)2 o espectro de
emissão foi obtido excitando a amostra em 365nm.
280 300 320 340 360 380 400 420 440 460 480 500
600000
700000
800000
900000
1000000
1100000
1200000
Figura 39: Espectros de: (a) excitação e (b) emissão da suspensão de CdS/Cd(OH)2
representados pela intensidade normalizada (u.a) versus comprimento de onda (nm).
400 450 500 550 600
0
200000
400000
600000
800000
1000000
1200000(a) (b)
Excitação
Em 365nm
Intensidade
Máxima de
1200000nm
ʎ = 490nm
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104
A posição do máximo (490nm) no espectro de emissão visualizado na figura
40(b) dá informações sobre a estrutura eletrônica do semicondutor e do tamanho das
partículas. Já a intensidade do pico revela os efeitos de superfície e de impurezas.
Para a Figura 40 (b), observamos uma intensidade máxima em torno de
1200000. O espectro de emissão informa características como à homogeneidade das
populações de nanopartículas envolvidas no processo de luminescência. A largura de
banda caracteriza qualitativamente os diferentes tamanhos existentes nas populações de
nanopartículas.
É importante destacar que o aumento da diluição das suspensões de
nanopartículas de CdS/Cd(OH)2 causa uma diminuição na intensidade da
luminescência, segundo observado no laboratório durante as tentativas de
funcionalização do quantum dots com as nanopartículas de quitosana. Além de haver
precipitação das quitosana durante este processo devido ao pH básico do meio.Tendo
sido, portanto, este o motivo da obtenção dos cloridrato de quitosana a fim de evitar
este efeito indesejável.
4.5. OBTENÇÃO DOS NANOCOMPÓSITOS
4.5.1. Potencial Zeta
O potencial zeta reflete o potencial de superfície das partículas, o qual é
influenciado pelas mudanças na interface com o meio dispersante, em razão da
dissociação de grupos funcionais na superfície da partícula ou da adsorção de espécies
iônicas presentes no meio aquoso de dispersão (Schaffazick et al., 2003).
Para caracterização da superfície das nanopartículas realizamos medidas para
verificar o potencial zeta das suspensões apresentadas na Tabela 12.
Thatiana M. Stamford _________________________________Resultados e Discussão
105
Tabela 12: Valores de potenciais encontrados para as amostras testadas.
pH Amostras Potencial Zeta
4,5
7,5
NQCD15%
NCQ
+ 40,63 mV
- 39,76 mV
8,5 CdS/Cd(OH)2 -26,12 mV
7,5 CdS/Cd(OH)2 + Glutaraldeído (0,01%) - 29,34 mV
7,5 CdS/Cd(OH)2 + NCQ (1:10)* - 26,42 mV
7,5 CdS/Cd(OH)2 + NCQ (1:5)* - 26,66 mV
7,5 CdS/Cd(OH)2 + NCQ (1:2)* - 26, 98 mV
7,5 CdS/Cd(OH)2 + NCQ (1:1)* - 27,34 mV
7,5 CdS/Cd(OH)2 + NCQ (5:1)* - 27,64 mV
7,5 CdS/Cd(OH)2 + NCQ (25:1)* - 29,55 mV
7,5 CdS/Cd(OH)2 + NCQ (50:1)* - 37,86 mV
7,5 CdS/Cd(OH)2 + NCQ (100:1)* - 29,75 mV
*Relação volume/volume como referido no item 3.8.1.2.
Na Tabela 12, estão descritos os valores de pH e de cada potencial zeta
encontrados para as amostras de NQCD15%, CdS passivadas com Cd(OH)2 e
funcionalizadas com glutaraldeído e com diferentes diluições de NCQ.
Chaves (2006) e Nascimento (2009) ao determinarem o potencial zeta do
CdS/Cd(OH)2 encontraram valores de ζ= -25,66 mV e ζ= -28,20 mV, respectivamente.
No presente trabalho, foi verificado um valor de ζ= -26,12. Estes três resultados
provavelmente diferem devido ao valor de pH da suspensão. Os autores citados acima
também obtiveram valores de potencial zeta para o CdS/Cd(OH)2 funcionalizado
Thatiana M. Stamford _________________________________Resultados e Discussão
106
com Glutaraldeído (0,01%) e encontraram os seguintes resultados: ζ= -27,64 mV e
ζ= -32,00mV.
Os resultados obtidos, nesta pesquisa, para suspensões de CdS/Cd(OH)2, sem
funcionalizante (ζ= - 26,12), e com funcionalizantes (ζ= -26,42 entre ζ= -37,86),
comprovaram um aumento da estabilidade das suspensões quando funcionalizadas com
glutaraldeído ou com as diferentes concentrações das NCQ. No entanto, Observou que a
proporção entre quantum dot e funcionalizante altera a estabilidade da amostra. O grupo
considerado mais estável, através do potencial zeta, foi o CdS/Cd(OH)2 + NCQ (50:1)
com pH= 7,5. Por tanto, estes quantum dots funcionalizados com estas NCQ foram
aplicados na marcação de células neoplásicas pulmonares.
4.6. TESTES DE BIOCOMPATIBILIDADE DO NANOCOMPÓSITO
4.6.1. Teste de Irritabilidade por HET-CAM
Tabela13. Potencial de irritação da água destilada (AD), Solução salina 0,9% (SS
0,9%), Sulfeto de cádmio (CdS) , Sulfeto de cádmio passivado com camada de
hidróxido de cádmio (CdS/Cd(OH)2), Nanopartícula de cloridrato de quitosana (NCQ),
Nanocompósito (NC) para o teste da Membrana Corialantoide do ovo (HET-CAM) para
vasoconstricção, hemorragia e coagulação. Controle positivo: lauril sulfato de sodio 1%
(LSS1%). Os ensaios foram repetidos 5 vezes.
Parâmetros AD SS 0,9% CdS CdS/Cd(OH)2 NCQ NC LSS 1%
Vasoconstrição ND ND 22.0 ± 5.2 30.2 ± 3.5 ND ND 6.0 ± 1.0
Hemorragia ND ND 0.0 ± 0.0 0.0 ± 0.0 ND ND 48.0 ± 3.0
Coagulação ND ND 0.0 ± 0.0 0.0 ± 0.0 ND ND 63.0 ± 3.0
Potencial de irritação ND ND 6.51 ± 0.12 6.32 ± 0.08 ND ND 17.74 ± 0.4
ND: Não detectado; Não-irritate: ND-0.9; pouco irritante: 1.0-4.9; Irritante: 5.0-8.9 e Severamente irritante: 9.0-21.0.
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107
4.6.1.1. Água destilada
Após administração de 200 µL de água na membrana corioalantóide do ovo e
transcorridos 5 minutos de observação, foi constatado que a água não proporcionou
hemorragia sanguínea, coagulação ou vasoconstricção dos vasos. O mesmo resultado
foi observado nas 5 repetições. Portanto, a água pode ser considerada não irritante, uma
vez que não proporcionou nenhum efeito irritante na membrana corioalantóide do ovo
em um período de observação de 5 minutos.
4.6.1.2. Salina 0,9%
Após administração de 200µL de salina 0,9% na membrana corioalantóide do
ovo e transcorridos 5 minutos de observação, foi constatado que a salina 0,9% não
proporcionava hemorragia sanguínea, coagulação ou vasoconstricção dos vasos. O
mesmo resultado foi observado em 5 repetições. Logo, a solução salina 0,9% também é
considerada não irritante.
4.6.1.3. CdS
Após administração de 200µL de CdS na membrana corioalantóide do ovo e
transcorridos 5 minutos de observação, foi constatado que esta substância
proporcionava vasoconstricção. O mesmo resultado foi observado nas 5 repetições.
Os tempos iniciais dos processos de vasoconstricção foram inseridos na fórmula
abaixo:
(301- Hemorragia) x5 + (301- vasoconstricção) x7 + (301-Coagulação) x9
300 300 300
A Tabela 13 mostra a média das cinco repetições e o desvio padrão dos
resultados numéricos que indicam o potencial de irritação do sulfeto de cádmio (CdS);
do hidróxido de cádmio (CdS/Cd(OH)2) e do controle positivo lauril sulfato de sodio
1% (LSS1%).
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108
No caso específico do teste com o CdS a observação da membrana
corioalantóide prosseguiu além dos 5 minutos, em 10, 15 e 20 minutos. Foi observado
que aos 20 minutos possivelmente a amostra de CdS promove hemorragia o que não foi
observado nos 5 minutos iniciais da observação. Onde fica evidente o agravamento da
irritação com o transcorrer do tempo.
4.6.1.4. CdS/ Cd(OH)2
Após administração de 200µL de CdS/Cd(OH)2 na membrana corioalantóide do
ovo e transcorridos 5 minutos de observação, foi constatado que esta substância
proporciona vasoconstricção. O mesmo resultado foi observado nas 5 repetições. Os
dados numéricos apresentados na Tabela 13 indicam o potencial de irritação do
CdS/Cd(OH)2 com um valor da média ± desvio padrão igual á 6,32 ± 0,08. Deste modo,
o CdS/Cd(OH)2 pode ser considerado irritante.
4.6.1.5. Nanopartículas de cloridrato de quitosana (NCQ).
Após administração de 200µL de NCQ na membrana corioalantóide do ovo e
transcorridos 5 minutos de observação, fiu constatado que esta substância não
proporciona vasoconstricção, hemorragia e coagulação. O mesmo resultado foi
observado nas 5 repetições. Assim, de acordo com os resultados apresentados na tabela
13 as nanopartículas de cloridrato de quitosana (NCQ) podem ser consideradas não
irritantes.
4.6.1.6. Nanocompósito (NC).
Após administração de 200µL de NC na membrana corioalantóide do ovo e
transcorridos 5 minutos de observação, foi constatado que esta substância não
proporciona vasoconstricção, hemorragia e coagulação. O mesmo resultado foi
observado em 5 repetições. Por isto, de acordo com os resultados observados na Tabela
13, os nanocompósitos (NC) podem ser considerados não irritantes.
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109
4.6.1.7. Lauril sulfato de sódio á 3%
Após administração de 200µL de lauril sulfato de sódio à 3% em solução aquosa
na membrana corioalantóide do ovo e transcorridos 5 minutos de observação, foi
constatado que esta substância proporciona vasoconstricção, hemorragia sanguínea e
coagulação. O mesmo resultado foi observado nas 3 repetições. Os dados numéricos
apresentados na Tabela 13 indicam o potencial de irritação do lauril sulfato de sódio à
3% com um valor da média ± desvio padrão igual á 19,10 ± 0,06. Deste modo, o lauril
sulfato de sódio à 3% é considerado um irritante grave ou severo como visualizado na
Figura 40.
Figura 40: Microfotografia da membrana corioalantóide. (A) Aparência normal do
epitélio e de seus componentes e (B) Controle positivo de irritação NaOH a 0,1N,
visualizando hemorragia (H), lise vascular (L) e coagulação (C). Fonte: Bessa, 2010.
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110
4.6.2. Teste de Toxicidade pelo Método de MTT
Após obter a absorbância de cada grupo através do leitor ELISA no
comprimento de onda de 540nm, foi elaborada a Tabela 23 apresentada abaixo. O
percentual de Inibição de Crescimento Celular (% IC) foi calculado pelo programa
GraphPard-Prism.
Tabela 14: Valores de absorbância (Abs.) e percentual de Inibição de
Crescimento Celular (% IC) obtidos para o grupo controle, CdS/Cd(OH)2, NCQ e NC.
Grupo Abs. 1
λ(nm)
Abs. 2
λ(nm)
Ʃ Abs. % IC
GraphPard-
Prim
Controle 0,689 0,660 0,675 0
CdS/Cd(OH)2 0,715 0,746 0,731 0
NCQ 0,662 0,648 0,655 0
NC 0,723 0,699 0,711 0
NCQ: nanopartícula de cloridrato de quitosana; NC: nanocompósito.
A Tabela 14 mostra resultados numéricos que indicam a ausência de atividade
citotóxica do CdS/Cd(OH)2; NCQ e NC.
Por tanto, pode-se dizer que o CdS/Cd(OH)2 foi considerado irritante, mas sem
atividade citotóxica de acordo com o método do HET-CAM e MTT, respectivamente. A
NCQ e o NC não são irritantes nem citotóxicos segundo os resultados encontrados pelos
ensaios biológicos utilizados no presente trabalho.
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111
4.7. APLICAÇÃO DO NANOCOMPÓSITO EM SISTEMA BIOLÓGICO
O sistema biológico estudado foi à linhagem de cultura de células de câncer de
pulmão e para avaliar a aplicabilidade dos nanocompósitos verificou-se a luminescência
através da microscopia de fluorescência convencional dos respectivos grupos:
1) Meio de cultura DMEN (BRANCO);
2) CdS/Cd(OH)2 sem funcionalizante;
3) NCQ na concentração de 2,5mg/mL;
4) CdS/Cd(OH)2 funcionalizado com glutaraldeído a 0,01% (CONTROLE);
5) CdS/Cd(OH)2 funcionalizado com NCQ na relação de (1:10);
6) CdS/Cd(OH)2 funcionalizado com NCQ na relação de (50:1) e
7) CdS/Cd(OH)2 funcionalizado com NCQ na relação de (100:1);
4.7.1. Células de Câncer de Pulmão
A incubação das células de câncer de pulmão foi realizada por um período de 2
horas e observou-se luminescência facilmente detectável na região do vermelho (560-
700nm), devido à autofluorescência destas células. Sabe-se que alguns materiais
biológicos contêm compostos aromáticos e a ressonância destes pode gerar
luminescência.
Figura 41: Imagem da microscopia de fluorescência de células neoplásicas pulmonares
com meio de cultura DMEN (Grupo:BRANCO). A) Fluorescência no visível; B)
Fluorescência no vermelho e C) Sobreposição das imagens A e B.
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112
A Figura 41 mostra a imagem das células vivas do câncer de pulmão com o meio
de cultura DMEN. Este grupo é denominado de BRANCO por não apresentar nenhuma
amostra a ser analisada.
As células da linhagem NCI-H 292 foram incubadas com NCQ (2,5mg/mL) por
um período de 18 horas para permitir que a substância atuasse em todas as células. Foi
visualizado, também, fluorescência apenas no vermelho (620-770nm). Isto demonstra
que as NCQ sem o quantum dot não são capazes de marcar as células de câncer de
pulmão.
A figura 42 apresenta imagem de microscopia de fluorescência de células
neoplásicas pulmonares cultivadas em 1,5mL de meio de cultura DMEN e tratadas com
500µL de NCQ (2,5mg/mL).
Figura 42: Imagens de microscopia de fluorescência de células neoplásicas pulmonares
com meio de cultura DMEN e NCQ (2,5mg/mL) na proporção de (3:1) por 18 horas.
A) Fluorescência no visível; B) Fluorescência no vermelho e C) Sobreposição das
imagens A e B.
O sistema biológico estudado foi marcado com o CdS passivado com Cd(OH)2
sem funcionalizante por 18 horas. As imagens confirmaram que o quantum dot não
conseguiu marcar bem as células, possivelmente, por não apresentar interação com as
mesmas, ficando, por tanto, disperso no meio de cultura o que acarretou na marcação do
fundo e não das células.
Thatiana M. Stamford _________________________________Resultados e Discussão
113
A figura 43 mostra imagens obtidas pela microscopia de fluorescência em
cultura de células de câncer de pulmão incubadas com 1,5mL de meio de cultura
DMEN e 500µL de CdS/Cd(OH)2. Ao excitar a amostra na região do azul (450-490nm),
observa-se emissão no verde (500-565nm) e excitando no verde, verifica emissão no
vermelho (620-770nm). A imagem apresentada na figura 43D representa a sobreposição
destas contribuições, originando colorações diferenciadas.
Figura 43: Imagens de microscopia de fluorescência de células neoplásicas pulmonares
com meio de cultura DMEN e CdS/Cd(OH)2 na proporção de (3:1) por 18 horas. A)
Fluorescência no visível; B) Fluorescência no vermelho; C) Fluorescência no verde e D)
Sobreposição das imagens A, B e C.
O presente trabalho utilizou como grupo CONTROLE o quantum dot
funcionalizado com glutaraldeído já que este funcionalizante é conhecido e empregado
em marcações de células neoplásicas (Chaves, 2006; Nascimento, 2009). De tal forma
que primeiro foi preparado o NC na proporção de 50:1 (1mL de CdS/Cd(OH)2 com
20µL de Glutaraldeído 0,01%). Depois, retirou-se 500µL deste NC e acrescentou á
cultura de células da linhagem NCI-H292 com 1,5mL de meio de cultura DMEN.
As células de câncer de pulmão foram marcadas com CdS/Cd(OH)2
funcionalizadas com glutaraldeído a 0,01% durante 18horas. Detectou-se uma leve
fluorescência no verde (500-565nm) o que sugere uma possível ligação do glutaraldeído
com as proteínas presentes nas membranas das células neoplásicas pulmonares.
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114
A Figura 44 apresenta imagens obtidas pela microscopia de fluorescência das
células vivas do câncer de pulmão com CdS/Cd(OH)2 funcionalizado com
glutaraldeído.
Figura 44: Imagens de microscopia de fluorescência de células neoplásicas pulmonares
com meio de cultura DMEN e NC (CdS/Cd(OH)2 com Glutaraldeído – Grupo:
CONTROLE) na proporção de (3:1) por 18 horas. A) Fluorescência no visível; B)
Fluorescência no vermelho; C) Fluorescência no verde e D) Sobreposição das imagens
A, B e C.
Chaves (2006) observou imagens de MET de astrócitos e glioblastomas
marcados com CdS/Cd(OH)2 + glutaraldeído a 0,01% com diferentes tempos de
incubação e sugeriu que dois processos competiam cineticamente entre si: a interação
do marcador com proteínas da superfície celular e a sua endocitose.
Como descrito no item 3.8.1.2., antes do processo de funcionalização, foram
realizados, no presente trabalho, vários testes de diluições para verificar a “eficiência da
luminescência” do quantum dot na presença da solução de NCQ. Os nanocompósitos
preparados foram:
• 0,5mL CdS/Cd(OH)2 + 5mL NCQ (1:10)
• 1mL CdS/Cd(OH)2 + 5mL NCQ (1: 5)
• 1mL CdS/Cd(OH)2 + 2mL NCQ (1: 2)
• 1mL CdS/Cd(OH)2 + 1mL NCQ (1: 1)
• 2,5mL CdS/Cd(OH)2 + 100µL NCQ (25: 1)
• 5mL CdS/Cd(OH)2 + 100µL NCQ (50: 1)
• 10mL CdS/Cd(OH)2 +100µL NCQ (100:1)
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115
No entanto, depois de observar a baixa luminescência de alguns destes NC e
comprovar a instabilidade dos mesmos através dos resultados obtidos pelo potencial
zeta, ficou decidido realizar a marcação celular de apenas três destes NC:
1º) CdS/Cd(OH)2 com NCQ na proporção de 1:10; 2º) CdS/Cd(OH)2 com NCQ na
proporção de 50:1 (mais luminescente e estável) e 3º) CdS/Cd(OH)2 com NCQ na
proporção de 100:1. A Figura 45, 46 e 47 apresentam imagens obtidas pela microscopia
de fluorescência das células vivas do câncer de pulmão com os respectivos
nanocompósitos (NCs) citados anteriormente.
Figura 45: Imagens de microscopia de fluorescência no visível de células neoplásicas
pulmonares com: a) DMEN com NC (0,5mL de CdS/Cd(OH)2 e 5mL de NCQ – relação
1:10) na proporção de (3:1) por 18 horas e b) meio de cultura DMEN.
Não foi detectada luminescência na região no azul, verde ou vermelho para as
células de câncer de pulmão marcadas com o NC (relação 1:10). Contudo, observou-se
no visível que as células só com o meio de cultura continuaram a se movimentar, mas
não foi capturado imagens da fluorescência, devido à baixa intensidade de emissão.
Pode-se observar na imagem da Figura 45A uma quantidade significativa concentrada
do NC em determinados pontos (com formação de ilhas e aglomerados de
nanopartículas) entre as células de câncer de pulmão.
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116
A figura 46 destaca imagens obtidas para marcação das células de câncer de
pulmão funcionalizadas com NC (50:1). Após 18 de incubação, verificou-se uma boa
marcação na região do vermelho (620-770nm) e do verde (500-565nm) em
determinadas regiões das células neoplásicas.
O elevado índice de luminescência para este NC (50:1), bem como a diferença
morfológica observada nestas células, parece indicar que este NC não encontra barreira
para sua interação com o sistema biológico estudado.
Figura 46: Imagens de microscopia de fluorescência de células neoplásicas pulmonares
com meio de cultura DMEN e NC (1mL de CdS/Cd(OH)2 com 20µL de NCQ – relação
50:1) na proporção de (3:1) por 18 horas.
A figura 47 mostra imagens de microscopia de fluorescência obtidas para
marcação das células de câncer de pulmão funcionalizadas com NC (100:1). Após 18 de
incubação, observou uma discreta marcação das células neoplásicas na região do
vermelho (620-770nm) e do verde (500-565nm).
Figura 47: Imagens de microscopia de fluorescência de células neoplásicas pulmonares
com meio de cultura DMEN e NC (1mL de CdS/Cd(OH)2 com 10µL de NCQ – relação
100:1) na proporção de (3:1) por 18 horas.
Thatiana M. Stamford _________________________________Resultados e Discussão
117
O nosso grupo de pesquisa NIB (Nanoestruturas e Interfaces Biológicas)
realizou recentemente experimentos in vivo de acordo com o que segue:
- Um grupo de 120 camundongos foi submentido à inalação de aerosol
suspensão aquosa de quantum dots de CdS/Cd(OH)2 e CdS/Cd(OH)2 funcionalizados
com glutaraldeído (CdS/Cd(OH)2/Glut). Durante três dias esse grupo de animais foi
submetido à inalação, aspirando à atmosfera saturada de suspensão contendo quantum
dots. Tal procedimento foi realizado para os dois tipos de quantum dots aqui
mencionados.
- Um grupo de 120 camundongos foi mantido nas mesmas condições de
temperatura, alimentação, e demais parâmetros, exceto pela atmosfera do ambiente, que
foi mantida normal, sem a presença de quantum dots.
- Um grupo de 12 camundongos recebeu injeção subcutânea de suspensão de
quantum dots não funcionalizados (0,5 mg/ml).
- Um grupo de 12 camundongos recebeu injeção subcutânea de suspensão de
quantum dots subcutâneos (0,5mg/ml).
O volume utilizado para a injeção subcutânea foi o mesmo que vem sendo
utilizado pela BASF no estudo toxicológico de outros tipos de nanomateriais.
Observou-se que:
1- Os camundongos submetidos à aspiração e à injeção de quantum dots
não funcionalizados apresentaram uma pequena quantidade de íons Cd+2
no pulmão e
no fígado, implicando, por tanto certa toxicidade para este grupo experimental;
2- Em ambos os casos, o cádmio foi excretado nas fezes e não na urina;
3- O grupo submetido ao quantum dot funcionalizado com glutaraldeído
não apresentou toxicidade significativa.
Thatiana M. Stamford _________________________________Resultados e Discussão
118
O resultado obtido, pelo presente trabalho, em relação à toxicidade encontrada
através do método do MTT, concorda com o terceiro resultado encontrado por nosso
grupo de pesquisa realizado com a BASF. Embora, os funcionalizantes usados tenham
sido diferentes. Sugere-se realizar novos estudos in vivo com os nanocompósitos de
CdS/Cd(OH)2 funcionalizados com nanopartículas de cloridrato de quitosana.
Thatiana M. Stamford __________________________________________ Conclusões
119
5. CONCLUSÕES
De acordo com os resultados obtidos e considerando as condições
empregadas no presente estudo, pode-se concluir que:
O processo de desacetilação utilizado nesta pesquisa é eficaz para o
aumento do grau de desacetilação da quitosana comercial;
O processo de despolimerização com peróxido nas concentrações
utilizadas é eficaz tendo em vista que altera a massa molar viscosimétrica da
quitosana comercial;
O processo de desacetilação associado ao de despolimerização
apresenta ótimos resultados na redução da massa molar viscosimétrica da
quitosana comercial.
O grau de desacetilaçaõ e despolimerização influenciam na obtenção das
nanopartículas de quitosana ao empregar o método de gelificação iônica com
tripolifosfato de sódio (TPP);
A morfologia e a distribuição de tamanho das nanopartículas de
quitosana observadas por MET e DLS, respectivamente, sofrem alterações de acordo
com os diferentes valores de desacetilação e despolimerização.
As nanopartículas de quitosanas com grau de desacetilação de 80% e
98% seguidas de despolimerização com peróxido de hidrogênio de 5% ou 15% não são
capazes de funcionalizar o CdS/Cd(OH)2. No entanto, verifica-se nanopartículas com
morfologia mais definidas, assim como, uma distribuição mais homogênea nas
NQCD15%;
Thatiana M. Stamford __________________________________________ Conclusões
120
As nanopartículas de cloridrato de quitosana (NCQ) obtidas a partir das
NCD15% são capazes de funcionalizar o CdS passivado com Cd(OH)2;
As células neoplásicas pulmonares da linhagem NCI-H292 apresentam
uma autofluorescência no vermelho;
O CdS passivado com Cd(OH)2 não é capaz de aderir-se as células
neoplásicas pulmonares;
Segundo as imagens obtidas pela microscopia de fluorescência, as NCQ
provavelmente interagem com as células da linhagem NCI-H292;
O CdS/Cd(OH)2 funcionalizado com as NCQ conseguem marcar as
células neoplásicas pulmonares quando utilizados na proporção de 50:1.
O CdS e o CdS/Cd(OH)2 são considerados irritantes e que as NCQ e o
NC não são irritantes segundo o método HET-CAM.
O CdS, o CdS/Cd(OH)2, a NCQ e o NC não apresentam atividade
citotóxica de acordo com o método de MTT.
Thatiana M. Stamford ____________________________________________________
121
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PRODUÇÃO CIENTÍFICA DURANTE O DOUTORADO (2008-2012)
ARTIGOS COMPLETOS PUBLICADOS EM PERIÓDICOS
1. Physico-Chemical Characteristics and Functional Properties of Chitin and Chitosan
Produced by Mucor circinelloides Using Yam Bean as Substrate. Molecules (Basel.
Online), v. 16, p. 7143-7154, 2011. doi:10.3390/molecules16087143
2. Chitosan effect on dental enamel de-remineralization: An in vitro evaluation. Journal
of Dentistry, v.38, p.848 - 852, 2010 doi:10.1016/j.jdent.2010.06.004
3. Estudo experimental da ação do flúor na prevalência de cárie. Revista Brasileira de
Ciências da Saúde. , v.12, p.159 - 168, 2008.
CAPÍTULOS DE LIVROS PUBLICADOS
1. Influence of carbon and nitrogen source on the chitin and chitosan production by
Rhizopus arrhizuz–Factorial design
In: MICROBES IN APPLIED RESEARCH Current Advances and Challenges.1ed.
Espanha : World Scientific Publishing Co. Pte. Ltd, 2012, p. 412-416.
ISBN 1397898144050
2. Caracterização da quitosana e sua aplicação na nanotecnologia
In: Biotecnologia aplicada à agricultura: textos de apoio e protocolos experimentais.1
ed.Brasilia\Recife : EMBRAPA \ IPA, 2010, v.1, p. 733-760.
ISBN 9788573834956
TRABALHOS COMPLETOS PUBLICADOS EM ANAIS DE
CONGRESSOS
1. Physico-chemical characterization of chitosan from M. circinelloides.
In: 9th International Conference of the European Chitin Society, 2009, Veneza.
Conference Book EUCHIS 2009, 2009
Thatiana M. Stamford ____________________________________________________
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RESUMOS EXPANDIDOS PUBLICADOS EM ANAIS DE
CONGRESSOS
1. Biocompatibility and antifungal potential of chitosan with differents molecular weight
against Penincillium
In: 6th Iberoamerican Chitin Society (VI SIAQ) and 12th International Conference on
Chitin and Chitosan (XII ICCC), 2012, Fortaleza. General Program and Book of
Abstracts. , 2012. p.105 - 105
2. Antimicrobial activity of chitosan with differents molecular weight mouthwash against
Streptococcus mutans: Comparative study with commercial mouthwashes
In: 6 th Iberoamerican Chitin Symposium, 12 th International Conference on Chitin and
Chitosan, 2012, Fortaleza. General Program and Book of Abstracts. , 2012. p.122 - 122
3. Antimicrobial activity and biocompatibility of chitosan with differents molecular weight
as alternative natural compound to inhibit Candida
In: 6 th Iberoamerican Chitin Symposium, 12 th International Conference on Chitin and
Chitosan, 2012, Fortaleza. General Program and Book of Abstracts. , 2012. p.120 -
120
4. Physico-chemical analyses of distintc chitosan and their potential as quantum dots
biocompatibilization agents
In: 11ª International Conference on Advanced Materials, 2009, Rio de
Janeiro. Conference book of 11ª ICAM. , 2009.
5. Physico-chemical analyses of distintc chitosan and their potential as quantum dots
biocompatibilization agents.
In: 11ª International Conference on Advanced Materials, 2009, Rio de Janeiro.
Conference book of 11ª ICAM 2009, 2009
Thatiana M. Stamford ____________________________________________________
140
RESUMOS PUBLICADOS EM ANAIS DE CONGRESSOS
1. Influence of carbon and nitrogen source on the chitin and chitosan production by
Rhizopus arrhizus - FACTORIAL DESIGN.
In: IV International Conference on Environmental, Industrial and Applied
Microbiology, 2011, Malaga. Abstract Book BIOMICROWORLD 2011, 2011. p. 303-
303.
2. Estudo in vitro da ação do gel dentário à base de quitosana microbiologica como agente
preventivo e terapêutico para a doença cárie.
In: 27º Reunião da Sociedade Brasileira de Pesquisa Odontológica, 2010, Águas de
Lindoia. Brazilian Oral Research. São Paulo: Imprensa Científica, 2010. v. 24. p. 45-45.
3. Viabilidade do verniz dentário a base de quitosana microbiologica como agente
preventivo e nterapeutico para a doença cárie.
In: 27º Reunião da Sociedade Brasileira de Pesqusia Odontologica, 2010, Aguas de
Lindoia. Brazilian Oral Research. São Paulo: Imprensa Científica, 2010. v. 24. p. 132-
132.
4. Nanospheres of chitosan and CdTe quantum dots for the development of drug carrier
systems
In: IX Brazilian MRS Meeting, 2010, Ouro Preto. Book Abstract of IX Brazilian MRS
Meeting. , 2010.
5. Physico-chemical caracterization of chitosan from shrimp Litopenaeus vannamei.
In: 9th International Conference of the European Chitin Society, 2009, Veneza.
Conference Book EUCHIS 2009, 2009.
6. Bioatividade da quitosana como agente anticariogênico.
In: 26º Reunião da Sociedade Brasileira de Pesquisa Odontológica, 2009, Aguas de
Lindoia. Anais do 26º SBPqO, 2009.
Thatiana M. Stamford ____________________________________________________
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7. Redução da formação da placa bacteriana dentária por quitosana na presença de
sacarose.
In: 26º Reunião da SBPqO, 2009, Aguas de Lindoia. Anais do 26º SBPqO, 2009
DEMAIS PRODUÇÕES TÉCNICAS
1. Palestra “O biopolímero do século” no programa de Pós-Graduação em Nutrição
da UFPE, nível mestrado e doutorado, 2010.
2. Curso de quitosana na agricultura e no meio ambiente, 2008. (Extensão, Curso de
curta duração ministrado)
Thatiana M. Stamford ____________________________________________________
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ANEXO
ARTIGO ENVIADO PARA
CARBOHYDRATE RESEARCH