Tese de Doutorado de Hemerson Yuri Ferreira Magalhães€¦ · HEMERSON IURY FERREIRA MAGALHÃES...

UNIVERSIDADE FEDERAL DO CEARÁ

FACULDADE DE MEDICINA

DEPARTAMENTO DE FISIOLOGIA E FARMACOLOGIA

PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM FARMACOLOGIA

HEMERSON IURY FERREIRA MAGALHÃES

PROPRIEDADES ANTICÂNCER DA FENSTATINA, 4-METOXIFENIL-3,4,5-

TRIMETOXIFENILMETANONA (RR07)

Fortaleza

2009




Tese submetida à Coordenação do Programa de Pós-Graduação em Farmacologia da Universidade Federal do Ceará como requisito parcial para a obtenção do grau de Doutor em Farmacologia.

Orientadora: Profª. Drª. Cláudia do Ó Pessoa

Fortaleza

2009

M165p Magalhães, Hemerson Iury Ferreira Propriedades anticâncer da fenstatina, 4-metoxifenil-3,4,5-trimetoxifenilmetanona (RR07) / Hemerson Iury Ferreira Magalhães. – Fortaleza, 2009. 184 f. : il. Orientadora: Profª. Drª. Cláudia do Ó Pessoa Tese (Doutorado) – Universidade Federal do Ceará. Faculdade de Medicina. Programa de Pós-Graduação em Farmacologia. 1. Estilbenos 2. Tubulina 4. Citotoxicidade 5. Antineoplásicos. I. Pessoa, Claudia do Ó (orient.) II. Título. CDD 615.31




Tese submetida à Coordenação do Programa de Pós-Graduação em Farmacologia da

Universidade Federal do Ceará como requisito parcial para a obtenção do grau de Doutor em

Farmacologia.

Aprovada em 14 / 08 / 2009

BANCA EXAMINADORA

_____________________________________________________

Profa. Dra. Cláudia do Ó Pessoa (Orientadora)

Universidade Federal do Ceará – UFC

_____________________________________________________

Prof. Dr. Demetrius Antônio Machado de Araújo

Universidade Federal da Paraíba – UFPB

_____________________________________________________

Prof. Dr. Hélio Vitoriano Nobre Júnior


___________________________________________________

Prof. Dr. Daniel Pereira Bezerra

Universidade Federal de Sergipe – UFS

___________________________________________________

Prof. Dr. Manoel Odorico de Moraes


A meus pais,

por todo ensinamento e dedicação acreditando sempre me ensinando que a educação é a

chave para a abertura de muitas portas

AGRADECIMENTOS

DEUS OBRIGADO POR TUDO E POR TODOS!

À Telma Alves pelo apoio, companherismo e cumplicidade.

À Profª. Drª. Cláudia do Ó Pessoa pelo incentivo, suporte científico, dicas

importantes na realização desse trabalho, pelo incentivo no exercício na docência, pela

amizade e pela dedicação na busca por novos recursos para o Laboratório de Oncologia

Experimental da Universidade Federal do Ceará (obrigado por tudo!).

Ao Prof. Dr. Manoel Odorico de Moraes pelo reconhecimento do meu esforço na

tentativa de desenvolver um bom trabalho, e pela contribuição imensurável à pesquisa e apoio

logístico e científico ao Laboratório de Oncologia Experimental, Universidade Federal do

Ceará.

À Profª. Drª. Letícia Veras Costa-Lotufo, pelo apoio e auxílio no desenvolvimento

desse trabalho, por toda a ajuda fornecida no decorrer dos anos que estive no Laboratório de

Oncologia Experimental da Universidade Federal do Ceará.

Ao Prof. Dr. Rommel Burbano pelo auxílio na execução dos ensaios de

genotoxicidade no Laboratório de Biologia Celular da Universidade Federal do Pará (UFPA)

e por ter repassado todo o conhecimento com simplicidade, contribuindo para o

desenvolvimento esse trabalho.

A Profª. Drª. Ana Paula Negreiro Nunes, do Departamento de Clínica Odontológica

na Universidade Federal do Ceará, pela realização das análises histopatológicas.

Ao amigo Prof. Dr. Hélio Vitoriano Nobre Júnior que muito contribuiu desde o

inicio da minha caminhada na Pós Graduação desde e ainda continua auxiliando agora em seu

laboratório no Departamento de Farmácia da UFC e dessa forma contribuindo para realização

desse e de outros trabalhos que estão em execução.

Ao Prof. Dr. Demetrius Antônio Machado de Araújo da Universidade Federal da

Paraíba (UFPB) por ter aceitado o convite de participação no processo de defesa, bem como

pela inestimável contribuição na etapa de revisão da tese.

Ao amigo Prof. Dr. Daniel Pereira Bezerra no Departamento de Fisiologia da UFS

pelo incentivo em momentos delicados e pela ajuda e ensinamento em metodologias e

experimentos e pela oportunidade de convívio e trabalho no LOE.

A Profª. Drª. Gardênia Carmen Militão, do Departamento de Fisiologia na UFPI,

pelo auxilio em alguns experimentos, pelas dicas, amizade, por todo incentivo. E que ainda

me deve uma xícara de café com torradas às 17:00 horas.

Ao amigo Prof. Michel Pinheiro Ferreira, vulgo “The Limon Man” ou “limãozin" do

Setor de Histologia e Embriologia da UFPI, por sempre me auxiliar com palavras de conforto

e incentivo tipo “vai te lascar!” ou “nunca me viu não!” e por sempre estar disponível nos

momentos que precisei e por toda a colaboração neste trabalho e principalmente pela amizade.

Ao companheiro de Pós Graduação, e agora Dr. Diego Wilke Veras a quem tenho

muito a agradecer pelo auxilio nos ensaios de citometria e por todos os ensinamentos

repassados diariamente durante a convivência no LOE, um ser humano excepcional.

Ao amigo doutorando, Bruno Coelho Cavalcanti “The best researcher” com certeza

passei a ver a pesquisa com outros olhos por todo ensinamento por ele repassado.

Aos amigos da Pós Graduação e do HEMOCE, Marcos Martins “o predador” e

Eunice Bobô pelo incentivo e auxílio em todos os momentos que precisei sanar algumas

dúvidas.

As Profas. do Departamento de Farmácia e Análises Toxicológicas: Alcínia Lima,

Iêda Pereira, Janete Eliza Soares de Lima, Maria Augusta Drago Ferreira, Romélia

Pinheiro Gonçalves e Teresa Maria de Jesus Carvalho pela amizade, atenção, contribuição

e incentivo.

Aos funcionários do Departamento de Farmácia e Análises Toxicológicas: Adalgiza,

Eduardo e Lúcia Queiroga pela amizade e apoio.

Ao Prof. Dênis Pires de Lima pelo fornecimento da molécula que propiciou o

desenvolvimento deste trabalho.

A todos os professores do curso de Pós-Graduação em Farmacologia pela

contribuição na minha formação.

Aos amigos Breno Auad Alves, Danilo Rocha Damasceno, Elthon Góes Ferreira e

Gilberto Ferreira Linhares pela cumplicidade, amizade, paciência e companheirismo

auxiliando-me sempre nos momentos que precisei até mesmo em horários inoportunos.

A José Roberto (o negrinho das Alagoas) pela amizade (apesar de todo mau humor),

pelo auxilio nas atividades do laboratório, e pelos conselhos e incentivo e também ao grande

mestre Washington Barros (Vaston) – o homem MTT – pela amizade e apoio.

Aos amigos do LOE, no primeiro bloco: Arinice Costa, Eveline Alves, Andrew

Nunes, Igor (o boy do LOE), Fernanda de Castro, Gabriella, Germano, Kézia Lacerda,

Miller Barreto, Paula Abreu, Rafael e Vanessa (Dahlits da Adriana), Venúcia Magalhães

pelo agradável convívio e ajuda.

Aos amigos do LOE, bloco das autarquias: Aline Martins (protein microarray) Ana

Jérsia, Cecília Carvalho, Delano Marinho (autarquia federal, estadual e municipal),

Adriana Carvalho, Carla Sombra, Ivana Dantas, Patrícia Marçal e Kristiana Mousinho,

(as popozudas do LOE), Felipe Rocha (o mala), Márcio Roberto, Paula Jimenez (enfim

Doutora!), Patrícia Bonavides, Profa. Marne Vasconcellos, Dra. Raquel Montenegro,

Rômulo Feio, e pelo agradável convívio e ajuda.

A Silvana França (baronesa de Araruna), grande latifundiária do Conjunto Esperança

pela ajuda com as células, cuja dedicação é essencial para o laboratório;

Aos técnicos: Erivanda França, Luciana França, Adriano dos Santos, Maria de

Fátima, Rogéria Monontenegro e Paulo Macgaiver pelo auxílio sempre disponibilizado.

As secretárias Sheyla e a Adelânia Marinho pela paciência, preocupação e disposição

em ajudar em tudo que é possível, além do constante sorriso aberto no rosto;

Aos funcionários do Departamento de Fisiologia e Farmacologia: Francisco

(Chiquinho), Alana, Carlos, Haroldo, Iris, Flávia, Feranando pela ajuda na concretização

deste trabalho.

A Aura Yida Rhanes e Márcia Hermínia P. Borges funcionárias do Departamento

de Fisiologia e Farmacologia, que sempre estiveram dispostas a ajudar e tornar possível a

condução dos trabalhos burocráticos do Departamento de Fisiologia e Farmacologia.

A mente que se abre a uma nova idéia, jamais retorna ao seu tamanho original

(Albert Einstein)

RESUMO

A fenstatina, quimicamente designada de 4-metoxifenil-3,4,5-trimetoxifenilmetanona, denominada RR07, é uma bisarilcetona de esqueleto estilbenóide que pode ser obtida a partir da combretastatina A4, com reconhecida atividade citotóxica, por meio da oxidação de Jacobsen. Dentre as muitas atividades desencadeadas pelos estilbenos destacam-se atividade antiangiogênica, citotóxica e antitumoral. Para avaliar o seu potencial antineoplásico, um estudo farmacológico de suas propriedades anticâncer foi realizado em vários modelos biológicos. Utilizando o ensaio do MTT foi feito um estudo comparativo da citotoxicidade de moléculas estilbenóides com estruturas relacionadas ao composto RR07, onde foi observado que a presença do anel A (3,4,5-trimetoxifenil) é essencial para a atividade citotóxica da molécula. Determinou-se inicialmente a atividade citotóxica, frente a 13 linhagens tumorais pelo ensaio de redução do MTT sendo testados 11 compostos, (RR01, RR02, RR03, RR04, RR05, RR06, RR07, RR08, RR09, RR10, RR11), onde o estilbenóide RR07 destacou-se como um dos mais citotóxicos apresentando valores de CI50 que variaram de 0,009 a 17,49 μM. Posteriormente, os estudos de mecanismo de ação com o RR07 nas concentrações de 0,25; 0,50; 1,00; 2,00 e 4,00 μM, revelaram redução, de forma concentração-dependente, na viabilidade celular pelos métodos do azul de tripan e de BrdU (bromodeoxiuridina). As análises morfológicas feitas por hematoxilina/eosina mostraram núcleos metafásicos, onde no ensaio de incorporação por brometo de etídio/laranja de acridina evidenciou-se morte celular por apoptose nas concentrações de 0,25 e 0,50 μM, com células em necrose nas concentrações de 1,00; 2,00 e 4,00 μM, destacando-se alterações como desintegração membranar e picnose nuclear, nas concentrações de 0,25 μM e 1,00 μM, respectivamente. Nos ensaios por citometria de fluxo foi observado fragmentação do DNA com parada de ciclo na fase G2/M a partir da concentração 0,25 μM. A análise pelo ensaio do cometa, para o RR07 revelou atividade genotóxica do tipo concentração-dependente entre células mononucleadas de sangue periférico (PBMC), principalmente em 2,00 e 4,00 μM. A avaliação do RR07 no ensaio com tubulina isolada revelou inibição na polimerização da mesma em uma concentração de 10 μM. A análise antitumoral evidenciou inibição de 30,9% e 48,19%, respectivamente, para as doses de 20 e 40 mg/kg/dia de RR07 por via intraperitoneal (ip), e 55,68% de inibição para a associação de 10 mg/kg/dia de 5-fluorouracil com 20 mg/kg/dia de RR07 (ip), em camundongos transplantados com Sarcoma 180, onde se verificou redução no crescimento tumoral e alterações renais iniciais e reversíveis. Desta forma, a fenstatina, RR07, apresenta-se como uma proposta de ferramenta farmacológica útil para a pesquisa de novos derivados. Palavras-chave: Estilbenos. Tubulina. Citotoxicidade. Antineoplásicos.

ABSTRACT

The phenstatin, chemically known as 4-methoxyphenyl-3,4,5-trimetoxiphenylmethane, was called in the present study as RR07. This compound is a bisarylketone with stilbenoid skeleton obtained from combretastatin A4, with recognized cytotoxic and antineoplasic activities. Then, a detailed study of RR07 anticancer properties was conducted in several biological models. The cytotoxic activity of eleven compounds (RR01, RR02, RR03, RR04, RR05, RR06, RR07, RR08, RR09, RR10, RR11) was determined against thirteen tumor cell lines by MTT assay. Structure-activity relationship pointed out that the presence of ring A (3,4,5-trimethoxiphenyl) is essential for the cytotoxic potential. The RR07 was one of the most cytotoxic compounds, showing IC50 values ranging from 0.009 to 17.49 µM. Investigations on mechanism of action (0.25, 0.50, 1.00, 2.00 and 4.00 µM) showed a concentration-dependent manner cell viability reduction (trypan blue dye exclusion test) and proliferation decreasing (BrdU assay). Morphological alterations determined by hematoxylin/eosin and acridine orange/ethidium bromide fluorescent double staining methods indicated an increased number of apoptotic cells at lowest concentrations (0.25 and 0.50 µM) and necrotic cells at higher concentrations (1.00, 2.00 and 4.00 µM). Flow cytometry analyses showed that RR07 induced DNA fragmentation and cell cycle arrest at G2/M starting at 0.25 µM. In the comet assay performed with human peripheral blood mononuclear cells (PBMC), RR07 caused DNA strand breaks only at higher concentrations (2.00 and 4.00 µM). Experiments with isolated tubulin, RR07 also induced tubulin polymerization inhibition in a concentration of 10 μM. In vivo antitumor experiments showed that Sarcoma 180 transplanted-mice treated with RR07 intraperitoneally (ip) presented a tumor growth inhibition ratios of 30.9% and 48.19% (20 mg/kg/day and 40 mg/kg/day, respectively) and inhibition of 55.68% in associated treatment (5-Fluoruracil 10 mg/kg/day + RR07 20 mg/kg/day). Histopathological analyses of kidneys, spleen and livers revealed incipient and reversible alterations. In summary, RR07 can be considered as a pharmacological useful tool as well as a lead molecule to obtain novel compounds with low toxicity and promising antitumor properties. Key words: phenstatin, combretastatin A-4; tubulin; cytotoxic; antitumor activity.

LISTA DE ABREVIATURAS

5-FU 5-fluorouracil

7AAD 7-amino-actinomicina

AIF Apoptosis Inhibition Factor (Fator inibidor de apoptose)

APAF-1 Apoptotic Protease Activating Factor 1 (Fator ativador de apoptose)

Bcl-2 B-cell lymphoma 2

BrdU Bromodeoxiuridina

Caspase Cysteine-dependent aspartate-specific proteases

CI50 Concentração Inibitória Média

COL Colchicina

DMSO Dimetilsulfóxido

EPM Erro Padrão da Média

FADD Fas Associated Death Domain (Domínio de morte ligado ao Fas)

GDP Guanosina difosfato

GTP Guanosina trifosfato

HE Hematoxilina/Eosina

MTT 3-(4,5-dimetil-2-tiazol)-2,5-difenil-brometo de tetrazolium

NMP Normal Melting Point (Ponto normal de derretimento)

PAMs Proteínas associadas aos microtúbulos

PBMC Células mononucleadas de sangue periférico

PBS Phosphate Buffer Solution (Tampão Fosfato)

PE Ficoeritrina

PHA Fitohemaglutinina

Pi Fosfato inorgânico

PI Iodeto de propídeo

PTX Paclitaxel

RESV Resveratrol ou {5-[2-(4-hidroxifenil)-vinil]-benzeno-1,3-diol}

RPMI Roswell Park Memorial Institute

RR01 Ácido 3-(3,4-dimetoxifenil)-2-fenil acrílico

RR02 Ácido {[3-(4-acetoxi-3-metoxifenil)-2-fenil acrílico]}

RR03 {[(1,2-dimetoxi-4-(Z)-2-fenil-1-etenil) benzeno]}

RR04 {1,2-dimetoxi-4-[(E)-2-fenil-1-etenil] benzeno}

RR05 Ácido 3-(3,4-metoxifenil)-2-fenil acrílico

RR06 Ácido 3-(4-hidroxi-3-metoxifenil)-2-fenil acrílico

RR07 (4-metoxifenil-3,4,5-trimetoxifenilmetanona)-fenstatina

RR09 [4-(1,8-dimetoxi-9H-xantenila-9)-2-metoxifenol]

RR10 Ácido 3-(2-hidroxifenil)-2-fenil acrílico

RR11 [9-(4-hidroxi-3-metoxi)-3,4,5,6,7,9-hexahidro-2H-xantene-1,8-diona]

rTNF Fator de necrose tumoral recombinante

Smac/DIABLO Second mithocondria-derived activator of caspases

VNB Vimblastina

LISTA DE FIGURAS

Figura 1 Ilustração esquemática mostrando as fases do ciclo e divisão celular........... 29

Figura 2 Formação, estrutura e estabilização dos microtúbulos................................... 30

Figura 3 Processo de montagem e estruturação dos microtúbulos em células

eucarióticas de mamíferos.............................................................................. 32

Figura 4 A dinâmica de polimerização e despolimerização dos microtúbulos............. 35

Figura 5 Esquema representando o transporte de elétrons e fosforilação oxidativa..... 37

Figura 6 Vias de morte celular...................................................................................... 39

Figura 7 Vias extrínseca e intrínseca da apoptose........................................................ 44

Figura 8 Diferentes sítios de ligação de drogas antimitóticas em locais diferentes no

heterodímero de tubulina................................................................................ 49

Figura 9 Estrutura da fenstatina.................................................................................... 51

Figura 10 Representação dos tipos de cometa, sendo indicado o escore atribuído a

cada cometa de acordo com o dano ao DNA................................................. 80

Figura 11 Fotomicrografias das células HL-60 tratadas e não tratadas, após 24 h de

incubação com RR07..................................................................................... 103

Figura 12 Morfologia das células da linhagem promielocítica (HL-60) após 24 h de

tratamento, coradas por laranja de acridina/brometo de etídeo e visualizadas

por microscopia de fluorescência..................................................................... 106

Figura 13 Análise histológica dos fígados de camundongos Mus musculus Swiss

transplantados com Sarcoma 180................................................................... 128

Figura 14 Análise histológica dos rins de camundongos Mus musculus Swiss


Figura 15 Análise histológica dos baços de camundongos Mus musculus Swiss


Figura 16 Análise histológica dos tumores de camundongos Mus musculus Swiss


Figura 17 Resumo esquemático do provável mecanismo de ação do estilbenóide

fenstatina (RR07) em estudo com células HL-60 após 24 h de incubação.... 153

LISTA DE GRÁFICOS

Gráfico 1 Efeito da viabilidade em células leucêmicas (HL-60).................................. 100

Gráfico 2 Curva cinética de crescimento celular na linhagem HL-60 (leucemia

promielocítica humana) tratada com o composto RR07 nas concentrações

de 0,25; 0,50; 1,00; 2,00 e 4,00 µM.............................................................. 101

Gráfico 3 Determinação do percentual de síntese do DNA.......................................... 104

Gráfico 4 Determinação dos percentuais sobre os eventos celulares (viabilidade

celular, apoptose e necrose) avaliado em linhagem celular HL-60

(leucemia promielocítica)............................................................................. 107

Gráfico 5 Freqüência de dano ao DNA........................................................................ 108

Gráfico 6 Índice de dano ao DNA................................................................................ 108

Gráfico 7 Avaliação de integridade de membrana plasmática por citometria de fluxo 112

Gráfico 8 Integridade da membrana plasmática das células HL-60 após 24 h de

incubação...................................................................................................... 113

Gráfico 9 Número de células viáveis analisadas por citometria de fluxo..................... 114

Gráfico 10 Efeito no ciclo celular após incubação por 24 h com o RR07...................... 116

Gráfico 11 Determinação da fragmentação do DNA...................................................... 117

Gráfico 12 Análise da variação do potencial transmembrânico da mitocôndria (ΔΨm)

por citometria de fluxo em células HL-60.................................................... 118

Gráfico 13 Análise da externalização da fosfatidilserina por citometria de fluxo em

células HL-60................................................................................................ 119

Gráfico 14 Análise da detecção da ativação de caspases efetoras 3 e 7 por citometria

de fluxo em células HL-60........................................................................... 120

Gráfico 15 Análise da detecção da ativação de caspase iniciadora 8 por citometria de

fluxo em células HL-60................................................................................ 121

Gráfico 16 Ensaio de inibição de polimerizção da tubulina in vitro.............................. 122

LISTA DE QUADROS

Quadro 1 Alguns estabilizadores e desestabilizadores de microtúbulos.......................... 48

Quadro 2 Semelhanças estruturais e funcionais entre alguns estilbenos.......................... 52

LISTA DE TABELAS

Tabela 1 Etapas da Carcinogênese: Principais Características..................................... 24

Tabela 2 Diferenças básicas entre apoptose e necrose.................................................. 41

Tabela 3 Nome químico, sigla utilizada, massa molecular e estrutura química do

resveratrol e derivados estilbenóides............................................................. 63

Tabela 4 Linhagens celulares tumorais utilizadas no ensaio de citotoxicidade in

vitro, através do método do MTT.................................................................. 65

Tabela 5 Protocolo dos tratamentos do RR07 aplicado às culturas temporárias de PBMC.... 82

Tabela 6 Atividade citotóxica de compostos estilbenóides frente às linhagens tumorais.. 95

Tabela 7 Atividade citotóxica de compostos estilbenóides frente às linhagens tumorais.. 96

Tabela 8 Atividade antimitótica do resveratrol e análogos estilbenóides no

desenvolvimento de ovos de ouriço-do-mar Lytechinus variegatus nos

estágios de 1ª divisão, 3ª divisão e blástula................................................... 97

Tabela 9 Avaliação do potencial hemolítico do resveratrol e outros compostos

estilbenódies................................................................................................... 98

Tabela 10 Avaliação citotóxica do composto RR07 na linhagem tumoral estabelecida

(HL-60) e na linhagem normal obtida por cultura primária (PBMC) com

24 horas de incubação.................................................................................... 99

Tabela 11 Aberrações cromossômicas (ACs) e índice mitótico (IM) em culturas de PBMC

humanos com RR07 na fase G1 (Experimentos 1 e 2) do ciclo celular................. 109

Tabela 12 Aberrações cromossômicas (ACs) e índice mitótico (IM) em cultura de PBMC

humanos com RR07 na fase G1/S (Experimentos 3 e 4) do ciclo celular.............. 110

Tabela 13 Aberrações cromossômicas (ACs) e índice mitótico (IM) em cultura de PBMC

humanos com RR07 na fase G2/M (Experimentos 5 e 6) do ciclo celular............ 111

Tabela 14 Avaliação do ciclo celular.............................................................................. 115

Tabela 15 Avaliação do efeito sobre o peso relativo dos tumores e percentual de

inibição tumoral em camundongos (Mus musculus Swiss) transplantados

com Sarcoma 180........................................................................................... 123

Tabela 16 Efeito do RR07 sobre o peso relativo dos órgãos e tumores de camundongos

(Mus musculus Swiss) transplantados com Sarcoma 180.................................. 124

Tabela 17 Resumo dos resultados encontrados no estudo do potencial antitumoral da

fenstatina (4-metoxifenil-3,4,5-trimetoxifenilmetanona)............................... 133

SUMÁRIO

1 INTRODUÇÃO.............................................................................................................. 23

1.1 O câncer........................................................................................................................ 23

1.2 Epidemiologia do câncer............................................................................................. 25

1.3 O ciclo celular e o câncer............................................................................................ 25

1.4 O processo de divisão celular..................................................................................... 27

1.5 Os microtúbulos – estrutura, função e importância para as células...................... 30

1.6 A dinâmica dos microtúbulos..................................................................................... 32

1.7 As mitocôndrias – importância como alvos terapêuticos......................................... 36

1.8 Os padrões de morte celular....................................................................................... 37

1.9 Vias de ativação da apoptose...................................................................................... 42

1.9.1 Via extrínseca do processo apoptótico....................................................................... 43

1.9.2 Via intrínseca do processo apoptótico....................................................................... 44

1.10 Novos agentes citotóxicos.......................................................................................... 46

1.10.1 Os novos inibidores dos microtúbulos..................................................................... 49

1.10.2 Fenstatina, a molécula desse estudo........................................................................ 50

2 RELEVÂNCIA E JUSTIFICATIVA........................................................................... 53

3 OBJETIVOS................................................................................................................... 54

3.1 Geral............................................................................................................................. 54

3.2 Específicos.................................................................................................................... 54

4 MATERIAIS E MÉTODOS.......................................................................................... 56

4.1 Materiais utilizados..................................................................................................... 56

4.1.1 Equipamentos............................................................................................................ 56

4.1.2 Soluções, Reagentes e Fármacos.............................................................................. 57

4.1.3 Modelos utilizados na pesquisa................................................................................. 62

4.1.3.1 Biológicos................................................................................................................ 62

4.1.3.2 Comitê de Ética....................................................................................................... 62

4.2 Metodologia Experimental......................................................................................... 62

4.2.1 Obtenção do composto RR07 e outros derivados estilbenóides............................... 62

4.2.2 Manutenção das células............................................................................................ 64

4.2.3 Avaliação da atividade citotóxica em células tumorais in vitro pelo método do MTT.... 65

4.2.3.1 Princípio do teste..................................................................................................... 65

4.2.3.2 Procedimento experimental..................................................................................... 65

4.2.3.3 Análise dos dados.................................................................................................... 66

4.2.4 Avaliação da atividade antimitótica – Desenvolvimento embrionário em ovos de

ouriço-do-mar (Lytechinus variegatus)............................................................................. 66

4.2.4.1 Princípio do ensaio.................................................................................................. 66



4.2.5 Avaliação do dano à membrana plasmática – Atividade Hemolítica em Eritrócitos

de Camundongos Mus musculus Swiss................................................................................ 68




4.3 Caracterização da atividade antiproliferativa do composto RR07 em células

HL-60 e em cultura primária de células mononucleadas do sangue periférico

(PBMC) pelo ensaio do MTT............................................................................................ 69

4.3.1 Procedimento experimental........................................................................................ 69

4.3.2 Análise dos dados....................................................................................................... 70

4.4 Estudos de Mecanismo de Ação................................................................................. 70

4.4.1 Viabilidade celular – Teste de exclusão do azul de Tripan...................................... 70




4.4.2 Avaliação cinética do crescimento celular em HL-60 pelo método do azul de Tripan....... 71




4.4.3 Análise de alterações morfológicas – Coloração com hematoxilina e eosina........ 72




4.4.4 Determinação do percentual de inibição de síntese de DNA: incorporação da

bromodeoxiuridina – Ensaio do BrDU.............................................................................. 73

4.4.4.1 Princípio do teste..................................................................................................... 73

4.4.4.2 Procedimento Experimental.................................................................................... 73


4.4.5 Avaliação do padrão de morte celular – Coloração diferencial com laranja de

acridina (LA) / brometo de etídeo (BE)............................................................................. 74




4.4.6 Avaliação citotóxica em células mononucleadas de sangue periférico humano (PBMC).. 75

4.4.6.1 Aspectos éticos, coleta de sangue e isolamento das células PBMC........................ 75

4.4.7 Avaliação da atividade citotóxica do composto RR07 em células mononucleadas

do sangue periférico (PBMC)............................................................................................ 76



4.4.7.3 Análise dos dados.................................................................................................... 764.4.8 Atividade genotóxica em células mononucleadas do sangue periférico – Teste do Cometa...... 77

4.4.8.1 Seleção de voluntários e obtenção do material para análise.................................. 77



4.4.8.4 Execução do teste do Cometa.................................................................................. 78

4.4.8.4.1 Preparo das lâminas............................................................................................. 78

4.4.8.4.2 Lise celular........................................................................................................... 78

4.4.8.4.3 Neutralização e corrida em eletroforese.............................................................. 79

4.4.8.4.4 Coloração............................................................................................................. 79

4.4.8.4.5 Análise dos dados................................................................................................. 79

4.4.9 Estudo de aberrações cromossômicas induzidas pelo composto RR07 em células

mononucleadas do sangue periférico (PBMC)................................................................. 80



4.4.9.3 Tratamentos............................................................................................................. 81

4.4.9.4 Preparação das lâminas.......................................................................................... 82

4.4.9.5 Análise citogenética................................................................................................. 82

4.4.9.6 Critérios de análise................................................................................................. 83

4.4.9.7 Análise estatística.................................................................................................... 83

4.4.10 Viabilidade celular por citometria de fluxo............................................................ 83

4.4.10.1 Análise da integridade de membrana plasmática por citometria de fluxo........... 83

4.4.10.1.1 Princípio do teste................................................................................................ 83

4.4.10.1.2 Procedimento experimental................................................................................ 84

4.4.10.1.3 Análise dos dados............................................................................................... 84

4.4.11 Analise da morfologia celular por citometria de fluxo.......................................... 84

4.4.11.1 Princípio do teste................................................................................................... 84

4.4.11.2 Procedimento experimental................................................................................... 84

4.4.11.3 Análise dos dados.................................................................................................. 85

4.4.12 Avaliação do ciclo celular e fragmentação de DNA por citometria de fluxo........ 85




4.4.13 Determinação do Potencial Transmembrânico de Mitocôndria (ΔΨm) – Ensaio

da rodamina 123................................................................................................................. 86




4.4.14 Detecção da externalização da fosfatidilserina – Teste da Anexina-V................. 87




4.4.15 Detecção da ativação de caspases........................................................................... 88




4.4.16 Ensaios de inibição da polimerização da tubulina in vitro.................................... 89

4.4.16.1 Princípio do ensaio................................................................................................ 89



4.4.17 Estudo do potencial antitumoral do composto RR07 em camundongos

transplantados com células tumorais do Sarcoma 180..................................................... 90




4.4.18 Avaliação histopatológica de órgãos de metabolização e da massa tumoral........ 92



4.4.18.3 Análise de dados.................................................................................................... 93

5 RESULTADOS............................................................................................................... 94

5.1 Estudo da atividade citotóxica de derivados estilbenóides...................................... 94

5.1.1 Estudo da atividade antiproliferativa em linhagens de células tumorais e células

mononucleares do sangue periférico (PBMC) pelo ensaio do MTT................................ 94

5.2 Avaliação da atividade antimitótica – Desenvolvimento embrionário em ovos

de ouriço-do-mar (Lytechinus variegatus)....................................................................... 96

5.3 Avaliação do dano à membrana plasmática – Atividade hemolítica em

eritrócitos de camundongos Mus musculus Swiss.......................................................... 98

5.4 Estudo do mecanismo de ação do RR07 em células HL-60 (leucemia promielocítica)...... 98

5.5 Estudo da atividade antiproliferativa do composto RR07 em cultura de células

HL-60 e PBMC com 24 horas de incubação pelo ensaio do MTT................................ 99

5.6 Estudo de Viabilidade Celular – Exclusão pelo método do Azul de Tripan.......... 99

5.7 Avaliação cinética da atividade antiproliferativa em cultura de células

leucêmicas da linhagem promielicítica HL-60 – exclusão por azul de tripan.............. 100

5.8 Análise morfológica – coloração diferencial com hematoxilina/eosina.................. 102

5.9 Determinação da síntese do DNA: incorporação da bromodeoxiuridina (BrDU) 104

5.10 Estudos para verificação dos padrões de morte celular........................................ 104

5.10.1 Marcação diferencial por Brometo de Etídio/Laranja de Acridina (BE/LA)....... 104

5.11 Avaliação do potencial genotóxico do RR07 em células mononucleadas do

sangue periférico (PBMC)................................................................................................ 107

5.12 Análise das aberrações cromossômicas em células mononucleares de sangue

periférico (PBMC) após tratamento com o RR07.......................................................... 109

5.13 Avaliação da integridade de membrana celular por citometria de fluxo em

cultura de células HL-60 tratadas com RR07................................................................. 111

5.14 Estudo do ciclo celular e fragmentação nuclear por citometria de fluxo em

cultura de células HL-60 tratadas com RR07................................................................. 114

5.15 Determinação do potencial transmembrânico de mitocôndria – (ΔΨm).............. 117

5.16 Detecção da externalização da fosfatidilserina por citometria de fluxo – Anexina V..... 118

5.17 Detecção da ativação de caspases 3, 7 e 8 por citometria de fluxo........................ 119

5.18 Ensaio de inibição da polimerização da tubulina in vitro...................................... 122

5.19 Estudo da atividade antitumoral do composto RR07 em camundongos

transplantados com Sarcoma 180.................................................................................... 122

5.20 Análise histopatológica dos órgãos de camundongos Mus musculus Swiss

tratados com RR07............................................................................................................ 123

5.21 Resumo dos resultados encontrados........................................................................ 132

6 DISCUSSÃO................................................................................................................... 134

7 PROPOSTA PARA O MECANISMO DE AÇÃO DA FENSTATINA (RR07)....... 153

8 PERSPECTIVAS............................................................................................................ 154

9 CONCLUSÃO................................................................................................................. 155

10 REFERÊNCIAS........................................................................................................... 156

23

1 INTRODUÇÃO

1.1 O câncer

O câncer é definido como um conjunto de enfermidades complexas, de caráter

mutacional, proliferativo, de crescimento celular anormal e descontrolado, em que células

animais, de diferentes tipos presentes em um mesmo microambiente, invadem os tecidos e

órgãos adjacentes, muitas vezes reduzindo os espaços internos, induzindo a compessão entre

os órgãos, quando ocorrem em estruturas sólidas, podendo ainda se propagar para outras

regiões do organismo, pelo processo denominado metastase (SILVA et al., 2007;

KLAUNING; KAMENDULIS, 2008).

Em um aspecto geral, para que uma célula evolua de seu estado normal até assumir as

características de uma célula neoplásica, é necessária a ocorrência de uma série de mutações,

envolvendo genes que expressem proteínas cuja ação esteja relacionada ao controle do ciclo

celular. Caso esta ação seja no sentido de estimular a divisão celular, estes genes são

genericamente denominados como oncogenes e caso tenham por função inibi-la serão

considerados como genes supressores de tumor. Seja por função anormalmente exacerbada

dos oncogenes ou por inibição dos supressores, o resultado será a obtenção de uma célula que

apresentará um ganho proliferativo em relação às demais, tornando-se insensível aos

estímulos apoptóticos (PETTERS et al., 2005; SILVA et al., 2007).

As células mutadas tendem a ser benignas, quando simplesmente, há uma massa

localizada de células que se multiplicam vagarosamente e se assemelham ao seu tecido

original, raramente constituindo um risco de vida para o organismo formado pelas mesmas.

Por outro lado, um tumor maligno ou neoplasma (novo crescimento) caracteriza-se pela

proliferação e acúmulo de células muito agressivas e de crescimento incontrolável, mesmo na

ausência de fatores de crescimento. Porém, o que realmente distingue células benignas de

malignas, é a capacidade destas últimas invadirem outros tecidos, formando as metástases

(GEIGER; PEEPER, 2007; LIOTTA; KOHN, 2001; KUMAR et al., 2005).

Assim, considera-se neoplásica a célula que adquire as seguintes “características

metabólicas” e capacidades biológicas: 1 – perda do controle da proliferação e divisão celular;

2 – “imortalização celular” devido à ativação da enzima telomerase; 3 – alterações

cromossômicas (de estrutura e número); 4 – perda das propriedades adesivas da membrana

plasmática, que permite o reconhecimento célula-célula e a inibição por contato do

movimento e crescimento celular; 5 – perda de função e da capacidade de diferenciação ou

24

especialização; 6 – capacidade para invadir tecidos vizinhos ou distantes e formar metástases;

7 – capacidade de induzir a formação de novos vasos sangüíneos (angiogênese). Dessa forma,

todos os casos de câncer estão envolvidos com as vias de transmissão de sinais biológicos e

no controle positivo e negativo do ciclo celular e da morte celular programada (LIOTTA;

KOHN, 2001; RIBEIRO; SALVADORI; MARQUES, 2003).

No organismo humano, pode-se desenvolver quase 200 tipos de câncer que

correspondem aos vários sistemas celulares (INSTITUTO NACIONAL DO CANCER, 2008,

KLAUNING; KAMENDULIS, 2008). Em geral o processo de carcinogênese é muito lento,

podendo levar vários anos para que uma célula cancerosa origine um tumor detectável. Dessa

forma, os principais estágios desencadeados para a instalação de um câncer são: a iniciação, a

promoção e a progressão, apresentando cada uma das etapas características peculiares

(DONNICI et al., 2005; OGA; CAMARGO; BATISTUZZO, 2008).

A iniciação é o primeiro estágio da carcinogênese. Nessa etapa, considerada

irreversível e crítica, as células sofrem o efeito dos agentes potencialmente carcinogênicos, os

quais provocam modificações em alguns proto-oncogenes ativando-os, porém ainda não

detectável clinicamente, ou seja, as células encontram-se "iniciadas", porém, "latentes" até

que um evento epigenético revele as alterações genéticas (OGA; CAMARGO;

BATISTUZZO, 2008).

Na fase seguinte, denominada promoção, as células “iniciadas” podem sofrer o efeito

de agentes oncopromotores, induzindo a expressão dos proto-oncogenes, sendo necessário,

para isso, um longo e continuado contato com o carcinógeno (Tabela 1). A suspensão do

contato muitas vezes interrompe o processo nesse estágio. Sendo assim, a promoção pode

compreender, pelo menos, dois mecanismos independentes: a ativação gênica e a atividade

mitótica (ESSERS; VERMEULEN; HOUTSMULLER, 2006; KLAUNING; KAMENDULIS,

2008).

Tabela 1 – Etapas da Carcinogênese: Principais Características.

Etapas Características

Iniciação Irreversível Requer fixação (divisão celular)

Promoção Reversível Modulação ambiental

Progressão Irreversível Cariótipo instável

Manifestação Infiltração de tecidos Metástase

. Fonte: Adaptado de DONNICI et al. (2005)

25

Entretanto, aparentemente isto não é suficiente para que esta célula dê origem a um

tumor com volume detectável e capaz de ameaçar a vida do indivíduo. Para que um

determinado grupo de células consiga manter um crescimento sustentado é necessário que

exista uma fonte de suprimento sanguíneo específico e constante. Há muitas décadas foi

percebido que os tumores apresentam uma vascularização bastante proeminente em relação

aos tecidos normais. Estes achados foram sempre considerados como uma conseqüência do

processo inflamatório decorrente das áreas focais de necrose existentes na massa tumoral

(PETTERS et al., 2005; SILVA et al., 2007).

Em última instância, ocorre a progressão tumoral que envolve ciclos sucessivos de

mutação e seleção, caracterizando-se por alterações metabólicas e morfológicas interpretadas

como perda de diferenciação, multiplicação descontrolada e irreversível, e agressividade das

células alteradas. Nesse estágio o câncer já está instalado, evoluindo até o surgimento das

primeiras manifestações clínicas da doença (AHMED; RAHMAN, 2006; ESSERS;

VERMEULEN; HOUTSMULLER, 2006).

1.2 Epidemiologia do câncer

A Sociedade Norte-americana de Câncer contabiliza anualmente mais 1,5 milhões de

óbitos. Nesse país foram esperados para o ano de 2008, cerca de 1.437.180 de novas

ocorrências, com estimativa de 565.650 mortes pela doença (JEMAL et al., 2008).

Há muitos anos, o câncer firmou-se como um importante fator de mortalidade em todo

o planeta, sendo a segunda causa de morte no Brasil, atrás apenas das doenças

cardiovasculares. As últimas estimativas referentes à população brasileira apontam para o

surgimento de 466.730 novos casos de câncer, para o ano de 2009, onde o câncer de pele do

tipo não-melanoma representará cerca de 115 mil novos casos estimados, além deste, outros

tipos mais incidentes serão os cânceres de próstata (49 mil) e de pulmão (27 mil) no sexo

masculino e os cânceres de mama (49 mil) e de colo do útero (19 mil) no sexo feminino. Os

dados acompanham o mesmo perfil da magnitude observada no mundo (DONNICI et al.,

2005; INCA, 2008).

1.3 O ciclo celular e o câncer

O processo dinâmico celular, que ocorre de forma ordenada, pode ser mais bem

compreendido avaliando-se o curso da vida, onde uma célula surge quando ocorre a fusão ou

26

divisão de duas células. Esses eventos se iniciam por ocasião de um programa de replicação, o

qual envolve um período de crescimento seguido pela divisão, sendo denominado ciclo

celular (ALMEIDA et al., 2005).

Howard e Pele (1951) descreveram pela primeira vez o ciclo celular e o dividiram

didaticamente em duas fases distintas respectivamente denominadas de mitose e de interfase.

Com o passar dos anos, cada uma das fases foi mais bem caracterizada e os diferentes

mecanismos envolvidos paulatinamente desvendados. Resumidamente pode-se caracterizar a

mitose como uma fase distributiva e a interfase como uma fase preparatória. Durante a

interfase ocorre a síntese do DNA e este período recebe a denominação de fase S. Aos dois

intervalos de tempo entre a fase M e a fase S atribuíram-se os nomes de fase G1 e G2,

respectivamente (GOLIAS; CHARALABOPOULOS; CHARALABOPOLOS, 2004;

REHEN, 2007).

O ciclo celular é um processo evolutivo-conservativo, utilizado por todas as células

eucariotas para controlar o crescimento e divisão celular. A estimulação para o crescimento

inicia-se com a liberação de fatores, os quais se ligam a receptores na membrana da célula e

desencadeiam uma cascata de proteínas transdutoras de sinal. Essa seqüência de eventos

impulsiona a célula através do ciclo celular, que é constituído de quatro estágios: duas fases

de intervalos denominadas G1 e G2, em que ocorrem à síntese de RNA e de proteínas; uma

fase S, onde acontece a formação e replicação do DNA, e uma fase dita M, onde a célula

executa o processo de divisão em duas células filhas, conhecido por mitose (CRECZYNSKI-

PASA; PEDROSA, 2001; FOSTER, 2008).

Normalmente a proliferação é ordenada finamente por uma série de mecanismos, o

que permite ou inibe a progressão do ciclo em cada fase. Na fase G1 (“gap”: intervalo), as

células monitoram o ambiente interno e externo, produzindo nucleotídeos, enzimas,

descondensando cromossomos e garantindo uniformidade morfológica do núcleo, ou seja,

preparando-se para a síntese de DNA, ou a permanência no estado de quiecência (G0), que é

um estágio de extensão variável, onde a célula executa seu papel normal no organismo (célula

em repouso). Ainda no intervalo G1 (fase de reentrada no ciclo), observa-se a síntese de RNA

e proteínas, geralmente, sendo considerado o período mais longo do ciclo (Figura 1). Antes

de progredir para a fase seguinte, a célula deve vencer um ponto crítico (ponto de restrição)

conhecido por G1/S (FOSTER, 2008; MALUF; POMPEIA, 2005).

Em seguida, a célula progride para a fase S (síntese), que é um processo lento e

irreversível, onde ocorre efetivamente a replicação do conteúdo genético. Nessa etapa, a

enzima topoisomerase é imprescindível para o processo de separação das fitas de DNA-filhas,

27

sendo o momento em que se pode estudar o ciclo celular por meio da incorporação de

timidina tritiada em tecido ou em cultura, pela técnica de BrdU, a qual, permite quantificar o

número de células em proliferação (ALBERT; LEHNINGER; NELSON, 2006; FOSTER,

2008; PELLEGRINI; PINTO; CASTILHO, 2008).

Tão logo se complete a duplicação do DNA, dá-se início a fase G2, na qual, a célula

produz proteínas e RNA, organizando-se para a separação ou duplicação propriamente dita

que ocorrerá na fase M. Juntas, as fases G1 e G2 proporcionam um período adicional para a

célula crescer e duplicar suas organelas citoplasmáticas (KUMAR et al., 2005).

Dentre os sinais, o que aponta a entrada da célula na fase M é a progressiva

condensação dos cromossomos, facilitando assim a separação durante a mitose (PERDIGÃO;

TAVARES, 2001; PINTO; FELZENSZWALB, 2003; REHEN, 2007).

1.4 O processo de divisão celular

Durante o crescimento embrionário e o desenvolvimento posterior, a divisão celular

ocorre, em todo tecido. No organismo adulto, a maior parte dos tecidos torna-se quiescente. A

“decisão” da célula em se dividir ou não é de crucial importância para o organismo. A divisão

celular normal requer uma seqüência precisamente ordenada e eventos bioquímicos que

garantam a cada célula-filha um complemento inteiro das moléculas requeridas para a vida.

Investigações sobre o controle da divisão celular em diversas células eucarióticas têm

revelado mecanismos universais, sendo que as proteínas quinases e os mecanismos de

fosforilação de proteínas são considerados elementos centrais e determinam o tempo de

entrada na divisão celular garantindo a passagem ordenadamente através dos eventos que

formam todo o processo de divisão (ALBERT; LEHNINGER; NELSON, 2006).

A mitose é o mecanismo utilizado para a partilha do genoma, em células eucarióticas,

de forma igualitária. Nesse estágio, surgem dois eventos significativos, componentes da fase

M (mitose), do ciclo celular que correspondem à separação dos cromossomos filhos e à

divisão da célula em duas (citocinese). Notadamente, o aparato mitótico é uma estrutura

temporária que existe apenas durante a mitose para distribuição do material genético, embora

alguns eventos desdobrem-se continuamente, eles se encontram divididos em quatro estágios,

representando fases do movimento cromossômico (MOGILNER et al., 2006; NAKAYAMA;

NAKAYAMA, 2006).

Durante o primeiro subestágio, prófase, os cromossomos replicados, (cada um

abrangendo duas cromátides idênticas), são condensados dentro de arranjos compactos e

28

então liberados para o citoplasma, quando a membrana nuclear é rompida. Além disso, os

nucléolos ficam menos evidenes, ocorre ainda ganho de liquido pelo núcleo com

desorganização da carioteca, enquanto os centríolos começam a organizar o fuso de divisão

(MOGILNER et al., 2006; RUCHAUD; CARMENA; EARNSHAW, 2007).

No passo seguinte, metáfase, os cromossomos atingem o grau máximo de

espiralização, estando dispostos na região equatorial da célula, nesse momento as fibras do

fuso prendem-se aos centrômeros nos cromossomos. Na etapa da anáfase, cada par de

cromátides, move-se para lados opostos devido ao encurtamento das fibras do fuso

(movimento anafásico). Finalmente, os cromossomos já separados iniciam o processo de

desespiralização, ocorrendo também o reaparecimento dos nucléolos e a neoformação de uma

membrana em torno de cada conjunto de cromossomos (carioteca), caracterizando assim a

telófase (Figura 1). A divisão do citoplasma, denominada citocinese, produz, então, duas

células-filhas, cada uma com um complemento 2n do material genético original (SCHOLEY,

2003; REHEN, 2007).

29

Figura 1 – Ilustração esquemática mostrando as fases do ciclo e divisão celular. Evidenciam-se a duplicação do

DNA e segregação cromossômica, as ciclinas e quinases ciclina-dependentes envolvidas na regulação da

transição entre as etapas do ciclo celular. Fonte: Adaptado de RUCHAUD, CARMENA e EARNSHAW (2007);

PERDIGÃO e TAVARES (2001).

A duração de um ciclo celular varia muito de acordo com o tipo celular. Em células de

mamífero em cultivo, por exemplo, apresenta a fase G1 tem duração de 5 horas

aproximadamente, a fase S ocorre em 7 horas, enquanto as fases G2 e M ocorrem em 3 e 1

hora, respectivamente. Os períodos S, G2 e M são relativamente constantes para a maioria dos

tipos celulares, sendo G1 o que mais varia, podendo durar dias, meses ou anos, isso dependerá

da fase de latência, G0 (REHEN, 2007).

30

1.5 Os microtúbulos – estrutura, função e importância para as células

Microtúbulos, juntamente com filamentos intermediários e de actina são os principais

componentes de citoesqueleto em todas as células eucarióticas. Essas estruturas são únicas

para cada célula, estando rearranjadas em forma cilíndrica (Figura 2), contendo, geralmente,

13 protofilamentos e apresentando um diâmetro de 24 nm (MITRA; SEPT, 2008).

Figura 2 – Formação, estrutura e estabilização dos microtúbulos. Fonte: Adaptado de SOUZA (2004); JORDAN

e WILSON (2004).

Os microtúbulos são estruturas tubulares rígidas, que se apresentam em longos

filamentos de actina e intermediários, constituídos por polímeros de proteínas (tubulinas) de

aproximadamente 440 aminoácidos cada uma, com dimensões de 4 nm X 5 nm X 8 nm e

31

massa molecular de aproximadamente 50 kDa (McGROGAN et al., 2008; SCHIMIDT;

BASTIANS, 2007; ZHOU; GIANNAKAKOU, 2005a).

Presente em todas as células eucariotas, a tubulina existe sob a forma heterodimérica

αβ ou microtubular, pertencendo a uma antiga família de GTPases que polimerizam formando

um esqueleto de estrutura cilíndrica oca associado a proteínas denominadas PAMs – proteínas

associadas aos microtúbulos (MOGILNER et al., 2006).

Cada monômero de α e β tubulina consiste de três domínios funcionais: o domínio N-

terminal (constituído de 206 resíduos) o qual forma uma estrutura conhecida como Rossman

ligado a seis lâminas β paralelas e hélices (H1-H6) envolvido no nucleotídeo ligando

(GDP/GTP) (McGROGAN et al., 2008; ORR; VERDIER-PINARD, 2003).

O domínio central (resíduos 207-384) é formado pela mistura de quatro lâminas β (S7-

S10) e três hélices (H8-H10) e são envolvidos na porção longitudinal e lateralmente

contactando os monômeros de α e β tubulina na formação dos protofilamentos. Além disso, o

domínio central mostra ainda duas hélices antiparalelas (H11 e H12) apresentando 385

resíduos, o qual está implicado na ligação de proteínas associadas aos microtúbulos (PAMs)

como: a tau, a PAM2, a estatimina, a CENP-E (conhecida como quinesina 7) e a quinesina

mitótica Eg5 (conhecida como KSP ou quinasina proteína do fuso) (MIYAMOTO et al.,

2003; ORR; VERDIER-PINARD, 2003).

As duas subunidades α e β da tubulina são organizadas entre si por ligação de

hidrogênio pela região –CO2H terminal da subunidade β e a região terminal NH2 da

subunidade α, sendo a formação dos microtúbulos realizada pelo rearranjo regular em

cilindros flexíveis, obtidos em duas etapas: iniciação e elongação (HAMMEL et al., 1996;

JORDAN; WILSON, 2004; FOJO; MENEFEE, 2007).

Todos os protofilamentos num microtúbulo estão polarmente arranjados na forma

cabeça-com-cauda dos dímeros α e β-tubulina, ou seja, têm a mesma orientação, enquanto

uma extremidade está envolvida pela α-tubulina, a outra se encontra envolvida pela β-

tubulina (Figura 3). As subunidades diméricas de α e β tubulina interagem longitudinalmente

para formar os protofilamentos, os quais se associam lentamente em microtúbulos exibindo

polaridade estrutural e funcional (JORDAN; WILSON, 2004; BARTOLINI; GUNDERSEN,

2009; HAWKINS et al., 2009).

32

Figura 3 – Processo de montagem e estruturação dos microtúbulos em células eucarióticas de mamíferos. Fonte:

HAWKINS et al., 2009.

1.6 A dinâmica dos microtúbulos

As interações que mantêm α e β-tubulina num complexo heterodimérico são

suficientemente fortes a ponto de ser rara a dissociação das subunidades das proteínas em

condições normais. Cada subunidade de tubulina liga duas moléculas de GTP. Um sítio de

ligação do GTP localizado na α-tubulina liga-se irreversivelmente ao GTP e não hidrolisa

essa molécula enquanto o segundo sítio, denominado permutável localizado na β-tubulina,

liga-se ao outro GTP reversivelmente, hidrolizando-o em GDP regulando a adição de novas

subunidades de α e β-tubulina aos microtúbulos (MOGILNER et al., 2006; McGROGAN et

al., 2008).

Os centros de organização dos microtúbulos (MTOC), inclusive centrômeros e corpos

basais nucleiam a montagem de microtúbulos do citosol celular que pode oscilar entre as fases

33

de crescimento e encurtamento. Logo que os microtúbulos são montados a estabilidade da

estrutura fica na dependência da temperatura, assim, quando resfriados a temperatura até 4°C,

ocorre a despolimerização dos dímeros estáveis de α e β-tubulina, e, quando aquecidos até

37°C em presença de GTP, os dímeros se polimerizam em microtúbulos (JORDAN;

WILSON, 2004; MOGILNER et al., 2006).

Além disso, a iniciação e elongação dos protofilamentos ocorrem na presença de

proteínas associadas aos microtúbulos (PAM), Mg+2 e trifosfato de guanosina (TFP), sendo o

processo reversível em presença de Ca+2 a baixas temperaturas, em torno de 0°C – Figura 2 –

(SOUZA, 2004; MONGILER et al., 2006; McGROGAN et al., 2008; MITRA; STEP, 2008).

A montagem e desmontagem de microtúbulos depende da concentração critica de

subunidades de α e β-tubulina, sendo um processo especificamente orientado e programado,

assim quando os monômeros estão acima da concentração crítica ocorre a montagem da

estrutura, enquanto em baixas concentrações observa-se o processo de desmontagem

(McGROGAN et al., 2008; PAMPALONI; FLORIN, 2008).

Vale salientar que a polimerização dos microtúbulos é favorecida por uma

proteinoquinase dependente de AMP cíclico que promove a fosforilação dos monômeros de

tubulina. A montagem de monômeros de tubulina é um fenômeno polarizado, isto é, dímeros

se unem a um dos extremos dos microtúbulos enquanto se desprendem um do outro

(BARTOLINI; GUNDERSEN, 2009).

A estruturação polar dos microtúbulos mostra duas extremidades distintas, uma

extremidade (+) de crescimento rápido e uma extremidade (-) de crescimento lento, a

extremidade (+) é cineticamente mais dinâmica que a extremidade (-). Além disso, a

organização da estrutura microtubular ocorre pela adição, às extremidades livres, de

moléculas de tubulina contendo GTP. A hidrólise do GTP em GDP acontece depois da

ligação da tubulina e enfraquece as pontes que mantém os microtúbulos unidos (HADFIELD

et al., 2003; JORDAN; WILSON, 2004).

Os microtúbulos apresentam equilíbrio instável com o pool de dímeros de tubulina

solúveis presentes na célula. Por sua vez, os dímeros polimerizam e despolimerizam

constantemente (há constantemente incorporação de dímeros livres nas estruturas

polimerizadas e libertação de dímeros para o pool de tubulina solúvel) e assim os

microtúbulos podem sofrer ciclos rápidos de formação ou desagregação. Desta forma, as

extremidades dos microtúbulos têm a capacidade de permutar rapidamente entre os estágios

de crescimento e encurtamento, tanto em células in vivo e in vitro, este fenômeno,

denominado de instabilidade dinâmica, constitui uma propriedade essencial dos microtúbulos.

34

A polimerização dos dímeros de tubulina pode ser influenciada por fatores como a guanosina

trifosfato, o ambiente iônico e as PAMs (McGROGAN et al., 2008; MITRA; STEP, 2008).

A primeira fase da formação dos microtúbulos (fase de nucleação) é lenta. Na

presença de Mg+2 e GTP, a tubulina α e β agrega-se formando protofilamentos com as

subunidades α e β alternadas. A segunda fase (fase de elongação) ocorre de forma

relativamente rápida (JORDAN; WILSON, 2004; McGROGAN et al., 2008).

Para a heterodimerização da tubulina e para a associação de tubulinas na formação de

microtúbulos, o GTP tem de estar ligado a ambas as subunidades α e β. O GTP ligado à

tubulina é hidrolisado a GDP durante ou imediatamente após a polimerização, o que

enfraquece a afinidade de ligação da tubulina a moléculas adjacentes e favorece a

despolimerização contribuindo para o comportamento dinâmico dos microtúbulos. Os

heterodímeros podem associar-se ou dissociar-se a ambas as extremidades de um

microtúbulo, no entanto há uma maior tendência para a associação ocorrer na extremidade de

crescimento rápido onde a β-tubulina está exposta (McGROGAN et al., 2008).

Os microtúbulos podem sofrer um processo de formação e desagregação simultâneo,

em que as moléculas de tubulina (ligadas ao GDP) são continuamente libertadas da

extremidade (-), sendo repostas por ligação de moléculas de tubulina (ligadas ao GTP) à

extremidade (+) do mesmo microtúbulo, sendo que, este fenômeno parece ser crítico para o

movimento polar dos cromossomos durante a anáfase (JORDAN; KAMATH, 2007;

McGROGAN et al., 2008).

Durante a formação dos microtúbulos, os ciclos alternados de formação e

desagregação promovem uma instabilidade dinâmica que é critica para direcionar os

microtúbulos para os locais alvos, como por exemplo: os cinetocoros. A instabilidade

dinâmica, um fenômeno altamente regulado, é particularmente crítica na remodelação do

citoesqueleto durante a mitose (JORDAN; WILSON, 2004; McGROGAN et al., 2008).

A adição e a perda de subunidades ocorrem preferencialmente na extremidade (+),

onde o equilíbrio entre o crescimento e o encurtamento depende do GTP permutável ligado a

β-tubulina ou se o GTP foi hidrolisado a GDP + Pi – Figura 4 – (JORDAN; WILSON, 2004;

McGROGAN et al., 2008; HOWKINS et al., 2009).

35

Figura 4 – A dinâmica de polimerização e despolimerização dos microtúbulos. (A) Associação dos

heterodímeros α e β da forma cabeça-cauda. (B) Enlongamento da forma cilíndrica apresentando os 13

protofilamentos com as porções terminais (+) e (-) onde heterodímeros α e β na presença do GTP ligam-se a

porção (+) com a formação de GDP + Pi e formação da porção terminal. (C) Estabilização da porção terminal

dos microtúbulos – efeito dos taxanos. (D) A despolimerização ocorre quando a porção terminal GTP/GDP + Pi

é perdida, o Pi liberado da tubulina promove desestabilização e dissociação dos heterodímeros na porção

terminal (+) – efeito dos alcalóides da vinca. Fonte: Adaptado de JORDAN e WILSON (2004); McGROGAN et

al. (2008).

Os microtúbulos apresentam inúmeras funções incluindo manutenção da arquitetura

celular, organização da estrutura e transporte intracelular, sendo absolutamente necessários ao

processo de divisão celular (mitose), usado para formar uma estrutura estática chamada de

citoesqueleto, o qual dá forma à célula e determina a posição das organelas, além disso, as

propriedades dinâmicas dos microtúbulos são usadas para transmitir sinais celulares,

reorganizar organelas, proporcionar mobilidade às células, intervir no processo de secreção

36

celular e angiogênese (LIEKENS; DE CLERCQ; NEYTS, 2001; HAIT et al., 2007;

MORRIS; FORNIER, 2008; SABBATINI; SPRIGGS, 2009).

Estes papéis tornam os microtúbulos alvos altamente efetivos no tocante à descoberta

de agentes antimitóticos que possam ser utilizados no combate ao câncer incluindo neste rol

os taxanos, os alcalóides da vinca, os novos taxanos como as epotilonas, além da

combretastatina e seus derivados, incluindo as fenstatinas (ÁLVAREZ et al., 2008;

McGROGAN et al., 2008; PASQUIER; HONORE; BRAGUER, 2006).

1.7 As mitocôndrias – importância como alvos terapêuticos

As mitocôndrias ocupam aproximadamente 25% do volume do citoplasma celular,

sendo complexas estruturas que atuam como “casas de força” produzindo ATP durante o

metabolismo aeróbico. Constituídas por duas membranas uma externa (permeável a moléculas

de até 10.000 Daltons), e outra interna (com grande quantidade de invaginações) – formada

pelas cristas mitocondriais (CHAN, 2006).

Essas organelas possuem na membrana externa o CVDA (canal de voltagem

dependente de ânion) que regula a entrada e saída de diferentes componentes na organela, e

atuam no metabolismo energético celular onde os componentes da cadeia respiratória

localizados na membrana interna da mitocôndria sob a forma de quatro complexos proteína-

lípidos, o complexo I (NADHubiquinona oxidoreductase) com mais de 40 polipéptidos, o

complexo II (succinato-ubiquinona oxidoreductase), o complexo III (ubiquinolcitocromo c

oxidoreductase), o complexo IV (citocromo c oxidase), bem como o complexo V, ATP

sintetase (Figura 5), formam o sistema de fosforilação oxidativa, que fornece o ATP

necessário à célula (PATHANIA; MILLARD; NEAMATI, 2009).

37

Figura 5 – Esquema representando o transporte de elétrons e fosforilação oxidativa. Elétrons entre a cadeia

transportadora de elétrons (CTE) nos complexos I e II, sob a forma de NADH e FADH2, respectivamente. No

processo, os complexos I, III e IV bomba de prótons através da membrana mitocondrial interna. Acúmulo de

prótons no espaço intermembranar cria um gradiente de carga que é utilizada no V Complex (ATP sintase) para

conduzir a síntese de ATP em ADP e Pi. Inibidores específicos dos complexos são exibidos em negrito. Fonte:

PATHANIA; MILLARD; NEAMATI, 2009.

1.8 Os padrões de morte celular

Durante muito tempo, a morte celular foi considerada um processo passivo de caráter

degenerativo, que ocorre em situações de lesão celular, infecção e ausência de fatores de

crescimento. Conseqüentemente, a célula altera a integridade da membrana plasmática,

aumenta o seu volume e perde funções metabólicas vitais. No entanto, nem todos os eventos

de morte celular são processos passivos. Os organismos pluricelulares são capazes de induzir

a morte celular programada como resposta a estímulos intracelulares ou extracelulares

(HANGEARTNER, 2000).

38

Os processos de morte celular podem ser classificados de acordo com suas

características morfológicas e bioquímicas em: autofagia, mitose catastrófica, senescência, e

em destaque apoptose e necrose (Figura 6). Vale salientar que alterações na coordenação

desses tipos de morte celular estão implicadas em tumorigênese (CASTEDO et al., 2004;

OKADA; MAK, 2004; RICCI; ZONG, 2006).

A autofagia é um processo adaptativo e conservado evolutivamente, sendo controlado

geneticamente. Ocorre em resposta a quadros de estresse metabólico, resultando na

degradação de componentes celulares (DANIAL; KORSMEYER, 2005). O desencadeamento

do processo ocorre quando porções do citoplasma são encapsuladas pela membrana,

originando os autofagossomos, em seguida estes são fundidos aos lisossomos que os

degradam por ação das hidrolases (KELEKAR, 2005).

O quadro de mitose catastrófica envolve uma mitose aberrante, resultando em

segregação cromossômica errônea. É considerada um tipo de sinalização irreversível para a

morte celular (WEAVER; CLEVELAND, 2005).

39

Figura 6 – Vias de morte celular. As células saudáveis respondem aos estímulos de que conduzem ao

desencadeamento de eventos críticos alcançando o resultado final apropriado ao estímulo recebido. Em destaque

as mortes celulares por apoptose, autofagia, oncose (necrose) e piroptose. Fonte: Adaptado de FINK e

COOKSON (2005).

A senescência é um processo metabólico ativo essencial para o envelhecimento, ocorre

por ocasião de uma programação genética que envolve deterioração dos telômeros e ativação

de genes supressores tumorais. As células que entram em senescência perdem a capacidade

proliferativa após um determinado número de divisões (MOOI; PEEPER, 2006).

A necrose aparece como resultado de uma disfunção celular aguda em resposta a

condições severas de estresse ou depois da exposição a agentes tóxicos. É um processo

40

relativamente passivo, associado com a rápida depleção de ATP celular (SERGEY et al.,

2003). Morfologicamente, a necrose é caracterizada pelo aumento do volume celular e ruptura

da membrana plasmática, em que todo o conteúdo intracelular extravasa para o meio

intercelular (FINK; COOKSON, 2005). Esta saída do conteúdo de células mortas para o

espaço extracelular pode causar dano ao tecido, por afetar as células vizinhas ou por atrair

células pró-inflamatórias à lesão (RICCI; ZONG, 2006).

O conceito de morte celular programada foi proposto pela primeira vez por Lockshin e

Williams (1965), para indicar uma forma não acidental de morte celular, porém Kerr, Wyllie e

Currie (1972) sugeriram o termo apoptose, que é uma palavra de origem grega que quer dizer

“cair fora” ou “folhas caindo das árvores no outono”, para indicar esse tipo de morte, um tipo

de “suicídio celular” (GREEN; KROEMER, 2004; MALUF; POMPEIA, 2005). Além disso,

este é um mecanismo de defesa para remover células infectadas, mutadas, supérfulas ou que

sofreram algum dano, prevenindo processos patológicos como a imunodeficiência, a auto-

reatividade imune e o câncer (GUPTA, 2001; BAETU; HISCOTT, 2002; JOZA; KROEMER;

PENNINGER, 2002).

O fenômeno da apoptose pode ser reconhecido por algumas características

morfológicas marcantes e coordenadas, em pouco tempo, pode ser observado: retração celular

e conseqüente perda de aderência com a matriz extracelular e células vizinhas. As organelas

mantêm a morfologia, porém, em alguns casos as mitocôndrias podem apresentar ruptura na

membrana externa. A cromatina sofre condensação, concentrando-se junto à carioteca, que até

esse ponto se mantém intacta. Além disso, na membrana plasmática, formam-se

prolongamentos (blebs), os quais aumentam de tamanho e rompem, originando estruturas

contendo conteúdo celular (corpos apoptóticos), sendo rapidamente fagocitados por

macrófagos e removidos sem causar processo inflamatório (ZIEGLER; GROSCURTH,

2004). O núcleo se desintegra em fragmentos envoltos pela membrana celular, fragmentação

internucleossômica do DNA, a qual possui um padrão característico, fragmentos sempre

múltiplos de 200 pares de base (SARASTE; PULKKI, 2000; MATTIOLI et al., 2006).

As alterações morfológicas observadas (Tabela 2) são conseqüências de uma cascata

de eventos moleculares e bioquímicos específicos e geneticamente regulados, onde a apoptose

pode ser deflagrada por estímulos externos, por meio de receptores específicos, denominados

receptores de morte ou por estímulos internos de estresse intracelular, tais como, lesão do

DNA, ou perturbações no ciclo celular ou nas vias metabólicas (KUMAR et al., 2005).

41

Tabela 2 – Diferenças básicas entre apoptose e necrose

APOPTOSE VERSUS NECROSE Estímulo

Fisiológico (Ativação de vias bioquímicas, geneticamente reguladas) ou patológico

Patológico (Ambiente hostil ou agressão)

Ocorrência Acomete células individuais, desencadeando a eliminação seletiva de células patológicas

Acomete um grupo de células. Fenômeno degenerativo, conseqüência de lesão celular severa e irreversível

Reversibilidade Fenômeno torna-se irreversível após o “ponto de retorno”, com a deposição de material floculento e amorfo na matriz mitocondrial (liberação do citocromo c)

Irreversível, após ativação de endonucleases

Liberação de enzimas lisossômicas Ausente Presente

Características bioquímicas Processo envolvendo ativações e muitas vias enzimáticas

Perda de regulação iônica com severas alterações homeostáticas

Dependente de energia (ATP) Processo Passivo (sem necessidade de energia)

Fragmentação de DNA definida Digestão do DNA por endonucleases Pré fragmentação de DNA Pós fragmentação de DNA

Características morfológicas Membrana plasmática intacta; a estrutura encontra-se alterada, especialmente a orientação dos lipídios

Membrana plasmática danificada com conseqüente perda de integridade

Agregação da cromatina à membrana celular Floculação da cromatina Condensação celular (encolhimento celular) Inchaço da célula seguido de lise (edema) Formação de vesículas com membrana (corpos apoptóticos)

Lise completa sem formações de vesículas

Sem desintegração das organelas Desintegração das organelas Características fisiológicas

Morte de células individuais induzida por estímulos fisiológicos; (atividade programada)

Morte de grupos celulares evocado por distúrbios não fisiológicos

Fagocitose por células adjacentes ou macrófagos

Fagocitose por macrófagos

Resposta não inflamatória Resposta inflamatória freqüente Adaptado de KUMAR et. al. (2005)

As caspases (cysteine-dependent aspartate-specific proteases) pertencem à família das

cisteínas proteases que tem a capacidade de reconhecer e clivar substratos que possuam

resíduos de aspartato, levando à condensação, fragmentação nuclear e externalização de

fosfolipídios de membrana que irão sinalizar para estas células serem fagocitadas por

macrófagos (BOATRIGHT; SALVESEN, 2003; NICHOLSON; THORNBERRY, 1997).

42

As caspases encontram-se divididas em duas classes: as caspases iniciadoras (2,8,9 e

10) e as caspases efetoras (3,6 e 7), sendo essa classificação baseada na estrutura e

funcionalidade (BOATRIGHT; SALVESEN, 2003). Após um sinal de morte celular as

caspases são ativadas por clivagem proteolítica, onde podem interagir com receptores de

membrana ou moléculas adaptadoras que contenham domínios de morte (death domain).

Além disso, as caspases recebem denominações de acordo com o pró-domínio apresentado e

função no evento apoptótico (DIMRI, 2005). Caspases ditas iniciadoras possuem pró-

domínios longos (envolvidos na iniciação da cascata proteolítica), enquanto as efetoras

apresentam pró-domínios curtos ou inexistentes, os quais são responsáveis pela clivagem de

substratos (RUPNARAIN et al., 2004). Alguns substratos como a proteína p53 ao sofrerem

clivagem pelas caspases, se translocam para o núcleo, ativando a transcrição de genes pró-

apoptóticos como, por exemplo, a proteina Bax (SCHULER; MAURER; GOLDSTEIN,

2003; DEBATIN, 2004).

Embora o câncer exiba características muito heterogêneas, todos os tumores malignos

adquiriram a propriedade de crescer além dos limites impostos às células normais. A

expansão clonal de uma célula transformada depende de um descontrole da sua capacidade

proliferativa e de uma crescente incapacidade de morrer por apoptose.

Portanto, apesar da enorme variabilidade do câncer, evidências demonstram que a

resistência a apoptose é uma das características mais marcantes da maioria dos tumores

malignos (DIMRI, 2005; OKADA; MAK, 2004).

Resultados de diferentes estudos indicam que a survivina é um fator celular envolvido

na quimiorresistência e radiorresistência em tumores humanos, sugerindo que a inibição dessa

proteína pode levar a uma sensibilização aos tratamentos contra o câncer (ZAFFARONI;

PENNATI; DAIDONE, 2006).

1.9 Vias de ativação da apoptose

Dentre os eventos bioquímicos mais frequentemente observados durante a apoptose,

estão: ativação de caspases, permeabilização das membranas mitocondriais com vazamento de

diversas moléculas, ativação de fosfatidilserina e promoção da interligação de proteínas

(crosslinking) (PELLEGRINI; PINTO; CASTILHO, 2008).

Existem muitos fatores que podem desencadear o processo apoptótico, suprimindo

genes antiapoptóticos e ativando genes pro-apoptóticos, entre eles destacam-se: ligação de

moléculas a receptores de membrana, agentes quimioterápicos, radiação ionizante, danos no

43

DNA, choque térmico, privação de fatores de crescimento, baixa quantidade de nutrientes e

níveis aumentados de espécies reativas do oxigênio. A deflagração da apoptose pode ser

iniciada de duas diferentes maneiras: pela via extrínseca (citoplasmática) ou pela via

intrínseca (mitocondrial). Ambas apresentam três fases: a iniciação, a decisão e a degradação

(BAETU; HISCOTT, 2002; HANGEARTNER, 2000).

1.9.1 Via extrínseca do processo apoptótico

A via extrínseca é mais especializada sendo desencadeada pelo acoplamento de

ligantes específicos a um grupo de receptores de membrana pertencentes à duas superfamílias

de proteínas: a família dos receptores de fatores de necrose tumoral (rTNF) e a dos receptores

destes ligando (FULDA; DEBATIN, 2006). Esta ligação é capaz de ativar a cascata das

caspases (BRÖKER; KRUYT; GIACCONE, 2005). Os membros da família rTNF possuem

um subdomínio extracelular rico em cisteína, o qual permite que eles reconheçam seus

ligantes. Isso ocorre devido a trimerização e conseqüente ativação dos receptores de morte

específicos, em seguida, a sinalização é mediada pela porção citoplasmática desses receptores

que contém uma seqüência de 65 aminoácidos, chamada "domínio de morte" sendo, por isso,

conhecidos por "receptores de morte celular" (FULDA; DEBATIN, 2006). Alguns membros

envolvidos na indução de apoptose são: FasL (Fas ligante), fator de necrose tumoral alfa

(TNF-α), ligante do receptor de TNF indutor de apoptose (HENGARTNER, 2000).

Quando os receptores de morte celular reconhecem um ligante específico, os seus

domínios de morte interagem com moléculas conhecidas como FADD/MORT-1. Essas

moléculas podem recrutar então a caspase-8 que por sua vez poderá ativar pode clivar o Bid,

uma proteína pró-apoptótica da família Bcl-2, convertendo-a para a forma truncada e ativa

(tBid) desencadeando o processo de homo-oligomerização e translocação de proteínas pró-

apoptóticas da família Bcl-2 (Bak e Bax), para a mitocôndria, ativando a via intríseca –

Figura 7 – (LI et al., 1998; JIANG; WANG, 2004; BAETU; HISCOTT, 2002).

44

Figura 7 – Vias extrínseca e intrínseca da apoptose. Fonte: HANGEARTNER (2000).

1.9.2 Via intrínseca do processo apoptótico

A via intrínseca inicia-se na mitocôndria podendo ser representada também pelo

reticulo endopalsmático. Há várias teorias que tentam explicar como os mais variados agentes

podem ativar por estresse intracelular ou extracelular como a ausência de fatores de

crescimento, danos no DNA, hipóxia ou ativação de oncogenes. Os sinais que são

transduzidos em resposta a estes insultos convergem principalmente para a mitocôndria,

disparando a fase de iniciação. Inúmeros estudos sobre apoptose apontam a mitocôndria como

o principal mediador desse tipo de morte. Essa organela integra os estímulos de morte celular,

induzindo ao aumento da permeabilização mitocondrial e conseqüente liberação de moléculas

45

pró-apoptóticas nela presentes, porém o mecanismo de origem ainda permanece controverso

(ELMORE, 2007; WALLACE, 2008).

Quando sinais de morte alcançam à mitocôndria, alteram o potencial da membrana

mitocondrial interna (∆Ψ) devido a formação de megaporos, bem como a uma transição da

permeabilidade mitocondrial (TPM). Ao mesmo tempo, a água do espaço entre membranas

passa para a matriz mitocondrial, levando ao aumento do volume e à ruptura da organela e

conseqüente liberação de componentes internos mitocôndrias, (citocromo c e Smac/Diablo)

proteínas pró-apoptóticas para o citoplasma (KIM et al., 2007). O Smac/Diablo é capaz de

inativar inibidores endógenos da apoptose. (MALUF; POMPEIA, 2005).

Além da liberação de moléculas pela mitocôndria, ocorre o colapso do potencial

transmembrânico de mitocôndria (∆Ψm) e da TPM levam à perda da homeostasia celular,

interrompendo a síntese de ATP (devido à interrupção de forma indireta da cadeia

transportadora de elétrons) e aumentando a produção de espécies reativas do oxigênio

(EROS). O aumento nos níveis de EROS leva à oxidação de lipídios, proteínas e ácidos

nucléicos, causando o colapso do potencial transmembrânico de mitocôndria (∆Ψm) – Figura

7 – (ELMORE, 2007; PELLEGRINI; PINTO; CASTILHO, 2008).

A resposta mitocondrial ao dano oxidativo é uma importante via para o gatilho incial

apoptótico. Além disso, as espécies reativas de oxigênio (EROS) induzem a ativação das

caspases -9 e -3, enquanto, estudos indicam que durante a apoptose ocorre a formação de um

megaporo que contém diversas proteínas e abrange as membranas interna e externa da

mitocôndria (GOTTLIEB, 2001; BRÖKER; KRUYT; GIACCONE, 2005; YAMAGUCHI;

PERKINS, 2009).

Inúmeros sinais indutores de apoptose estimulam a mitocôndria, fazendo com que

ocorra um desacoplamento da cadeia respiratória e conseqüente liberação de citocromo c e

proteínas ativadoras da apoptose para o citosol, o qual forma um complexo com a APAF-1 e a

caspase-9, o chamado apoptossomo, que promove a clivagem da pró-caspase-9, liberando a

caspase-9, que uma vez estimulada ativa a caspase-3 que deflagrará o fenômeno apoptótico

(SCHULER; MAURER; GOLDSTEIN, 2003; RUPNARAIN et al., 2004; KIM et al., 2007;

YAMAGUCHI; PERKINS, 2009).

Mais recentemente, foi descrita a participação, na via mitocondrial, de uma

flavoproteína conhecida por Fator Indutor de Apoptose (AIF). A AIF migra da mitocôndria

para o núcleo após um estímulo de apoptose e induz a condensação da cromatina e

46

fragmentação do DNA (pares de base) em fragmentos de 50 kDa, independente da ativação

das caspases (KIM et al., 2007).

Na verdade, a via responsável pela sinalização entre o rompimento/estabilização dos

microtúbulos e a via mitocondrial permanece em grande parte desconhecida (VITALE et al.,

2009). Neste sentido, foi levantada a hipótese que existem vários fatores que induzem

mudanças na polimerização dos microtúbulos disponíveis para interagir com alvos específicos

(KROEMER; MARTIN, 2005). Agentes estabilizadores de microtúbulos, tais como

paclitaxel, são capazes de ativar a apoptose por via extrínseca em células de câncer de pulmão

(H460), envolvendo ativação de receptores de morte, na fase inicial do tratamento, e caspase-

8 (VITALE et al., 2009).

Outros agentes como os alcalóides da vinca e a colchicina modificam o citoesqueleto

afetando o sistema de tubulina/microtúbulos. Em células cancerosas, ambas as classes

suprimem a dinâmica dos microtúbulos causando instabilidade na formação da tubulina,

ativando o mecanismo de morte celular por via intrínseca ou mitocondrial (ESTEVE;

CARRE; BRAGUER, 2007).

1.10 Novos agentes citotóxicos

Em meados de 1950 foi realizada uma das primeiras pesquisas sistemáticas em larga

escala com rastreamento de drogas anticancer, organizada naquela ocasião pelo Instituto

Nacional do Câncer (NCI) nos Estados Unidos (HOTTA; UEOKA, 2005).

No último século, o desenvolvimento de agentes citotóxicos tem revolucionado a

terapia anticancer, elevando as taxas de sobrevivência e qualidade de vida de pacientes

acometidos por vários tipos de tumores (ISMAEL et al., 2008).

Muitas drogas quimioterápicas utilizadas na clínica atualmente incluem agentes que

atuam sobre o ciclo celular inibindo o estado de hiperproliferação das células tumorais e

conseqüente estimulando a indução de apoptose, que é o resultado esperado da quimioterapia.

Baseando-se no mecanismo de ação, estas drogas podem ser subdivididas nos seguintes

grupos: (I) drogas que interferem na síntese de DNA; (II) drogas que induzem dano ao DNA;

(III) drogas que inibem a função do fuso mitótico (SCHIMIDT et al., 2007). Este último

grupo de drogas tem obtido bons resultados na clínica e são classicamente conhecidos como

venenos do fuso (MOLLINEDO; GAJATE, 2003; JORDAN; WILSON, 2004; ZHOU;

GIANNAKAKOU, 2005a; PASQUIER; HONORE; BRAGUER, 2006).

47

Tradicionalmente, drogas que se ligam aos microtúbulos são classificadas em 2

grupos: os agentes estabilizadores dos microtúbulos onde estão inseridos os vários taxanos e

epotilonas e agentes que desestabilizam os microtúbulos incluindo os vários alcalóides da

vinca, colchicina, combretastatinas com derivados e análogos como as fenstatinas – Quadro 1

– (ÁLVAREZ et al., 2007; SCHIMIDT; BASTIANS, 2007).

48

Quadro 1 – Alguns estabilizadores e desestabilizadores de microtúbulos

Estrutura das substâncias (MM) Classe Ação Estágio de

desenvolvimento Referência

C

NH

N

CH3

H3COOC

OH

C

N

N

CH3

H3OC

CH3 OH

COOCH3COOCH3

CH3

Vinblastina

(816,01)

Alcalóide da vinca(desestabilizador de microtúbulos)

Liga-se ao domínio da

vinca na β tubulina (adjacente ao sítio de

ligação GTP)

Fase clínica GUPTA, 2003;

ATTARD et al., 2006

OOAc OH

O

OHH

OAcOO

ONH

OH

O

O

Palcitaxel (735,81)

Taxanos (estabilizadores

de microtúbulos)

Liga-se ao sítio dos

taxanos na interface

lateral dos microtúbulos

Fase clínica KAVALLARI;

VERRILLS; HILL, 2001

O

OO

O

N

O

H

O

Colchicina

(399,43)

Colchicina (desestabilizador de microtúbulos)

Liga-se à β tubulina

na interface entre os monô-

meros α e β

Fase clínica HADFIELD et al., 2003

CH3

O

CH3

CH3

O

HO

OH O

H3C CH3

CH3 OS

N

CH3

Epotilona B

(493,65)

Epotilonas (estabilizadores

de microtúbulos)

Liga-se ao sítio dos

taxanos na interface

lateral interna dos

microtúbulos

Fase II ATTARD et al., 2006

OH

OCH3

OCH3

H3CO

H3CO

H

Combretastaina A-4

(316,34)

Combretastatinas (desestabilizador de microtúbulos)

Atuam na despolimerização

e em baixas concentrações na supressão da dinâmica

dos microtúbulos

Fase II HADFIELD et al., 2003

H3CO

H3CO OCH3

OCH3

O

Fenstatina

(302,32)

Bisarilcetona (desestabilizador de microtúbulos)

Possivelmente atuam na

despolimerizaçãoe em baixas

concentrações na supressão da dinâmica

dos microtúbulos

Fase pré-clínica HADFIELD et al., 2003

49

1.10.1 Os novos inibidores dos microtúbulos

Muitas drogas utilizadas na terapêutica com propriedade anticâncer ligam-se em pelo

menos 3 locais distintos na subunidade β da tubulina: domínio da colchicina, da vinca e dos

taxanos – Figura 8 – (ÁLVAREZ et al., 2008).

Figura 8 – Diferentes sítios de ligação de drogas antimitóticas em locais diferentes no heterodímero de tubulina.

(a) Vincristina ligando-se ao domínio da vinca no microtúbulo – porção final (+) conduzindo a uma

despolimerização (b) Complexação da colchicina com os dímeros de tubulina no domínio de colchicina

localizado na interface entre a α e a β-tubulina suprimindo a dinâmica do microtúbulo (c) Paclitaxel liga à

superfície interior do microtúbulo no sítio de ligação dos taxanos, suprimindo a dinâmica dos microtúbulos.

Fonte: McGROGAN et al.(2008).

A descoberta de novas moléculas capazes de interferir com a polimerização e

despolimerização dos microtúbulos tem chamado a atenção de muitos grupos de pesquisa, os

quais trabalhando com a tubulina como uma proposta de alvo farmacológico, buscando novas

alternativas na terapêutica do câncer (HADFIELD et al., 2003; ROMAGNOLI et al., 2006).

50

Compostos que possuem em sua arquitetura o esqueleto estilbeno como o resveratrol

(3,4,5’-trihidroxi-trans-estilbeno) e análogos, apresentam semelhanças estruturais e funcionais

com as combretastatinas (cis-estilbeno) e derivados, além disso, podem ser precursores de

vários produtos sintéticos como as fenstatinas (PETTIT et al., 1998; HADFIELD et al., 2003;

ÁLVAREZ et al., 2008; LIMA et al., 2009).

Dentre os muitos agentes ligantes da tubulina, as combretastatinas destacam-se devido

a potente atividade citotóxica frente a células tumorais, bem como ação de maneira seletiva na

diminuição da vasculatura tumoral (ÁLVAREZ et al., 2008).

1.10.2 Fenstatina, a molécula desse estudo

As fenstatinas são bisarilcetonas, onde uma das rotas sintéticas utilizada para sua

obtenção refere-se a oxidação de Jacobsen sofrida pela combretastatina A-4 em meio básico

(PETTIT et al., 1998; HADFIELD et al., 2003). A combretastatina A-4 foi isolada pela

primeira vez em 1982, do arbusto da Combretum caffrum. Sendo que o fostafo de

combretastatina A-4 é uma prodroga, a qual atualmente vem sendo estudada na fase II da

pesquisa clínica nos Estados Unidos e também no Reino Unido, dando espaço para o

desenvolvimento de diversos análogos (ROMAGNOLI et al., 2006; VEGA-ÁVILA;

VELASCO-LEZAMA; JIMÉNEZ-ESTRADA, 2006; MADDIKA et al., 2007; ÁLVAREZ et

al., 2008). Desse modo, para a obtenção da fenstatina – RR07 – (Figura 9) pela reação

conhecida como oxidação de Jacobsen, é necessária a presença de compostos aromáticos,

sendo a reação limitada a anéis de benzeno, apresenta pelo menos 4 substituintes os quais

podem ser combinações de grupos alquil ou halogênios, onde os grupamentos alquis podem

ser metil, etil ou os halogênios: iodo, bromo ou cloro. A reação pode ainda ser utilizada como

meio de rearranjar polialquilbenzenos (PETTIT et al., 1998; HSIEH; LIOU; MAHINDROO,

2005). A molécula para a realização desse trabalho foi cedida pelo Prof. Dênis Pires de Lima,

do Departamento de Química Inorgânica da Universidade Federal do Mato Grosso do Sul.

51

Figura 9 – Estrutura da fenstatina

Uma das estratégias utilizadas para a concepção racional de droga é baseada na

utilização de uma substância conhecida como modelo para novas moléculas com certas

características estruturais que lhes permitam interagir com o mesmo receptor hipotético

(DOUGLAS, 1994; LORENZO; GUZMAN; MARQUEZ, 2002).

Compostos com semelhanças estruturais como colchicina, combretastatina A-4,

fenstatina e resveratrol compartilham semelhanças estruturais e farmacológicas (Quadro 2),

apesar de algumas diferenças no mecanismo de ação (PETTIT et al., 2000; LORENZO;

GUZMAN; MARQUEZ, 2002).

52

Quadro 2 – Semelhanças estruturais e funcionais entre alguns estilbenos.

Estilbeno Estrutura química Atividades Referência

Combretastatina A-4 MM = 316,34

OH

OCH3

OCH3

H3CO

H3CO

H

A B

- Interage com a porção β das tubulinas; - Antiangiogênico; - Citotóxico (CI50 em nM);

PETTIT et al., 1998; HADFIELDet al., 2003;

PETTIT et al., 2005;

Colchicina MM = 399,43

A

OCH3

H3CO

H3CO

NH

CH3

O

OCH3

O

B

C

- Interage com a porção β das tubulinas; - Parada em mitose;

HADFIELDet al., 2003; ÁLVAREZ et al., 2007;

Fenstastina MM = 302,32

H3CO

H3CO OCH3

OCH3

O

A B- Parada em Mitose; - Citotóxico - Não hemolítico;

HADFIELDet al., 2003; ÁLVAREZ et al., 2008;

JIANG et al., 2008;

Resveratrol MM = 228,24

OH

OH

OH

A

B - Citotóxico (CI50 > 10 mM); - Não hemolítico;

PETTIT et al., 2002; ÁLVAREZ et al., 2007;

LIMA et al., 2009;

53

2 RELEVÂNCIA E JUSTIFICATIVA

O câncer ou neoplasia maligna é uma patologia multifatorial desencadeada pelo

acúmulo de mutações no material genético, que regula os processos de crescimento e

proliferação celular. Assim, as células adquirem características como: perda dos limites de

replicação, inibição do processo apoptótico (morte celular programada), aquisição de auto-

suficiência no tocante a sinalização dos fatores de crescimento, perda dos limites dos tecidos

de origem e aumento do poder para a formação de novos vasos (angiogênese), sendo capazes

de modificar o ambiente que as cerca, desrespeitando fronteiras e migrando pelos diversos

tecidos do corpo, podendo estabelecer os surgimento de novos tumores (metástases), quando

conseguem se fixar em locais distantes do ponto de origem (SILVA et al., 2007). No Brasil,

em 2008, cerca de 230 mil novos casos de câncer entre homens e o mesmo número entre as

mulheres, acarretou no Sistema Único de Saúde – SUS – demandas hospitalares superiores a

400 milhões de reais, sendo crescente o numero de óbitos, que somente em 2008 vitimou

cerca de 40 mil pessoas (BRASIL, 2009).

A descoberta de novas substâncias naturais ou sintéticas capazes de interferirem em

eventos celulares específicos como na polimerização ou despolimerização dos microtúbulos,

tem proporcionado a busca por moléculas com atividade cada vez mais especifica como, por

exemplo, algumas bisarilcetonas, dentre elas a fenstatina (4-metoxifenil-3,4,5-

trimetoxifenilmetanona) designado no presente estudo por RR07, e que em um futuro

próximo poderá ser utilizada como uma alternativa terapêutica para fármacos já consagrados

como a vincristina, a vimblastina, o paclitaxel, a doxorrubicina, o etoposido, o topotecan,

dentre outros (KAVALLARIS; VERRILLS; HILL, 2001; ROMAGNOLI et al.,2006;

ALVAREZ et al., 2008).

Diante do supracitado, este trabalho foi motivado pelo crescente aumento dos casos de

câncer e por não haver ainda uma droga que seja eficaz neste tratamento sem apresentar

efeitos colaterais importantes.

54

3 OBJETIVOS

3.1 Geral

Estudar as propriedades anticâncer do composto estilbenóide 4-metoxifenil-3,4,5-

trimetoxifenilmetanona, uma fenstatina que neste trabalho foi denominado RR07, em vários

modelos biológicos.

3.2 Específicos

• Estudar a atividade citotóxica do composto RR07 em diferentes linhagens

tumorais, no desenvolvimento embrionário do ouriço do mar Lytechinus

variegatus, bem como a atividade hemolítica em eritrócitos de camundongos;

• Avaliar a seletividade deste composto em relação às células mononucleares do

sangue periférico (PBMC);

• Avaliar o mecanismo de ação citotóxico do composto RR07, utilizando como

modelo a linhagem HL-60 (leucemia promielocítica):

o Avaliar a viabilidade, bem como, a cinética de crescimento de células

leucêmicas (HL-60) tratadas com o composto RR07;

o Investigar as alterações morfológicas (em HL-60) desencadeadas pelo

composto RR07, por meio da coloração hematoxilina/eosina,

o Avaliar o efeito do RR07 sobre a indução de morte celular pelo ensaio de

fluorescência laranja de acridina/brometo de etídio (LA/BE);

o Averiguar a ação antiproliferativa (em HL-60) do RR07 por meio da inibição

de síntese de DNA;

o Estudar, por meio de citometria de fluxo, o efeito do RR07 sobre a viabilidade

celular, o ciclo celular, a atividade das caspases 3, 7 e 8, indução de apoptose

inicial pelo ensaio da Anexina-V, além de investigar o potencial

transmembrânico de mitocôndria (ΔΨm) de células tratadas com o composto

RR07;

• Avaliar o potencial genotóxico do composto RR07 em células PBMC, pelo teste

do cometa;

55

• Comparar a ação do RR07 sobre a indução de aberrações cromossômicas em

células PBMC, comparando ao efeito desencadeado pela colchicina;

• Determinar a interferência do RR07 sobre a polimerização da tubulina (em

microtúbulo isolado);

• Estudar o potencial antitumoral do RR07;

• Analisar as características histopatológicas dos órgãos (rim, fígado e baço) de

camundongos (Mus musculus) Swiss transplantados com o tumor Sarcoma 180,

tratados por 7 dias com RR07.

56

4 MATERIAIS E MÉTODOS

4.1 Materiais utilizados

4.1.1 Equipamentos

• Agitador de placa, MLW Modelo Thys 2®

• Agitador de tubo, Donner AD 8850®

• Banho-maria, DELLTA Modelo 105Di®

• Centrífuga Centimicro, FANEN Modelo 212®

• Centrífuga Excelsa Baby, I FANEN Modelo 206®

• Centrífuga de placas, Eppendorf Modelo Centrifuge 5403®

• Centrífuga de lâminas, Shandon Southern Cytospin®

• Citômetro de fluxo, Guava EasyCyte mini®

• Deonizador de água Milli-Q, Milipore®

• Espectrofotômetro de placa DTX-880, Beckman Coulter®

• Fluxo laminar, VECO®

• Incubadora de células, (CO2 Water-Jacket Incubator) NUAIRE TS Autoflow®

• High Throughput Screening (HTS)/Laboratory Automation Workstation, Biomek

3000, Beckman

• Coulter®

• Máquina fotográfica digital, Olympus C-7070®

• Microondas, Panasonic®

• Microscópio óptico, Metrimpex Hungary/PZO-Labimex Modelo Studar lab®

• Microscópio óptico de inversão, Nikon Diaphot®

• Microscópio de fluorescência, Olympus®

• Micrótomo, Slee Mainz®

• pHmetro, Micronal B474®

• Pipetas automáticas, Gilson®

• Sistema de Eletroforese Horizontal mini Submarine, Amersham Biosciences®

57

4.1.2 Soluções, Reagentes e Fármacos

Ácido Acético Glacial - Vetec®

Ácido Clorídrico - Vetec®

Álcool Etílico - Vetec®

Agarose 1% 0,5 g de agarose

Água deionizada qsp 50 mL

FMC -

Bioproducts®

Agarose LMP 1,5% 1,5 g de agarose

PBS qsp 100 mL Gibco®

Agarose NMP 0,5% 0,5 g de agarose

PBS qsp 100 mL Gibco®

1 µL de anticorpo anti-BrdU Sigma® Anticorpo anti-BrdU

BSA 5% qsp 500 µL de solução Dako®

Anticorpo biotinilidado

anti-imunoglobulina de

camundongo

1 µL de anticorpo anti-imunoglobulina

BSA 5% qsp 100 µL de solução Sigma®

10 mg de azul de tripan Sigma® Azul de tripan 10%

PBS qsp 100 mL de solução -

BrdU 10 mM - Sigma®

1 mg de brometo de etídeo Sigma® Brometo de Etídio

100 μg/mL PBS qsp 10 mL de solução -

Citrato de Sódio - Química®

58

Cloreto de Sódio (NaCl) - Labsynth®

Colchicina 1 g Sigma®

5 µL de DAB Immunotech®

1 mL de Tris-HCl (Tris 0,05 M) pH= 7,6 Proquímios® Diaminobenzidina

(DAB) 2 µL de H2O2 Proquímios®

Dimetilsulfóxido

(DMSO) - Vetec®

Doxorrubicina –

fornecida pelo Instituto

do Câncer do Ceará –

ICC

- Zodiac®

EDTA - Qeel®

0,5 g de Eosina Doles®

80 mL de Álcool etílico

0,5 mL de Ácido acético Eosina 0,5%

20 mL de H2O -

1 µL de Estreptavidina – peroxidase Sigma® Estreptavidina –

peroxidase BSA 5% qsp 100 µL de solução Dako®

Ficoll - Sigma®

Fitohemaglutinina - Sigma®

Formaldeído 10% 100 mL de formaldeído

H2O qsp 1 L Dinâmica®

59

0,5 g de Hematoxilina Doles®

10 mL de Glicerina Labsynth®

25 g de Sulfato de alumínio Labsynth®

0,1 g de Iodeto de potássio Labsynth®

Hematoxilina 0,1%

H2O qsp 500 mL de solução -

Hidróxido de Sódio

(NaOH) - Vetec®

1 mg de iodeto de propídeo Boehringer® Iodeto de propídeo

50 µg/mL PBS qsp 50 mL

1 g de laranja de acridina (100 µg/mL) Fluka® Laranja de Acridina

H2O qsp 10 mL de solução -

Meio de cultura de

células RPMI 1640

Diluído em água deionizada e esterelizada,

filtrado em filtro millipore (0,22 µm) e

complementado com SBF 10%, 1% de

glutamina, 1% de antibióticos, 1% de

bicarbonato de sódio (0,75%) e 25 mM de

HEPES

Cultilab®

20 mg de MTT Sigma® MTT

PBS qsp 100 mL de solução -

N-Lauroylsarcosine - Sigma®

Paclitaxel 25 mg Sigma®

Penicilina 10.000 UI/mL Cultilab® Penicilina –

estreptomicina Estreptomicina 10 mg/mL Cultilab®

60

Ringer-lactato

Cloreto de Sódio = 0,600 g

Cloreto de Potássio = 0,030 g

Cloreto de Cálcio 2H2O = 0,020 g

Lactato de Sódio = 0,30 g

Água qsp 100 mL

Laboratórios

Biosintética®

Sulfato de Gentamicina - Gentamicin

Novafarma®

Solução de Eletroforese EDTA 1 mM, NaOH 300 mM, pH > 13 -

Solução de Lise

NaCl 2,5 M, EDTA 100 mM

Tris 10 mM, N-Lauroyl sarcosine 1%

pH = 10, Triton X-100 1%, DMSO 10%

-

Solução de

Neutralização Tris 0,4 M, pH = 7,5

Solução desnaturante

(para análise de

incorporação de BrdU)

Formamida 70%

2x SSC (pH entre 6,5 e 7,5 a 70 °C) Vetec®

Soro fetal bovino - Cultilab®

8,5 g de Cloreto de sódio (0,85%) Labsynth®

1,11 g de Cloreto de cálcio (10 mM) Reagen® Solução salina

(para hemólise) H2O qsp 1 L de solução -

SSC 10X

Cloreto de sódio 1,5 M

Citrato de sódio 0,15 M

H2O

-

61

Tampão de corrida

50X (TAE)

242 g de TRIS

57,1 mL de ácido acético glacial

100 mL de EDTA 0,5 M

-

8,766 g de Cloreto de sódio Labsynth®

2,14 g de NaHPO47H2O Labsynth®

0,276 g de NaHPO4H20 Labsynth® Tampão fosfato (PBS)

H20 qsp 1 L de solução (pH = 7,2) -

Cloreto de sódio 1,5 M Labsynth®

Tris 0,5 M (pH= 7,6) Proquímios® Tampão Tris (TBS) 10X

H2O -

Taxol®

fornecido pelo Instituto


ICC

6 mg/mL Bristol-Myers

Squibb®

50 mL de Tripsina 2,5% Cultilab®

0,125 g de EDTA Proquímios® Tripsina 0,25%

450 mL de PBS -

Triton X-100 - Isofar®

Velban®

fornecido pelo Instituto


ICC

10 mg/mL Ely Lilly®

Xilol 10% 100 mL de formaldeído

H2O qsp1 L Dinâmica®

5- Fluorouracil 2,5 mg/1 mL ICN

Farmacêutica®

62

4.1.3. Modelos utilizados na pesquisa

4.1.3.1. Biológicos

Camundongos albinos (Mus musculus) da linhagem Swiss

Linhagens celulares tumorais mantidas em cultura

PBMC humanos isolados de voluntários sadios

Gametas de ouriço do mar da espécie Litechinus varietatus

4.1.3.2 Comitê de Ética

Todos os procedimentos envolvendo a utilização de animais realizados no presente

estudo seguiram as recomendações do Conselho Brasileiro de Experimentação Animal

(COBEA), respeitando a legislação vigente, e sob autorização do Comitê de Ética em

Pesquisa com Animais (CEPA) da Universidade Federal do Ceará (protocolo nº 52/08).

4.2 Metodologia Experimental

4.2.1 Obtenção do composto RR07 e outros derivados estilbenóides

As substâncias utilizadas na execução deste trabalho foram cedidas pelo Prof. Dênis

Pires de Lima do Departamento de Química Inorgânica da Universidade Federal de Mato

Grosso do Sul. Os análogos estilbenóides foram obtidos no Laboratório de Síntese e

Transformações de Moléculas Orgânicas para Emprego Biológico (SINTMOLB) da

Universidade Federal de Mato Grosso do Sul. As moléculas foram sintetizadas a partir da

Reação de Perkin*, a qual possibilitou também a obtenção do estilbeno resveratrol, enquanto a

bisarilcetona fenstatina ou 4-metoxifenil-3,4,5-trimetoxifenilmetanona, neste trabalho

denominada RR07 (Tabela 3) foi obtida pela oxidação de Jacobsen a partir da

Combretastatina A-4 (PETTIT et al., 1998; HADFIELD et al., 2003; HSIEH; LIOU;

MAHINDROO, 2005; LIMA et al., 2009).

* A Reação de Perkin é uma reação orgânica desenvolvida por William Henry Perkin que pode ser usada na produção de ácidos cinâmicos pela condensação aldol de aldeídos aromáticos e anidridos ácidos na presença de um sal alcalino de ácido.

63

Tabela 3 – Nome químico, sigla utilizada, massa molecular e estrutura química do resveratrol

e derivados estilbenóides1

Substância (nome químico) Sigla MM2 Estrutura Química

Ácido 3-(3,4-dimetoxifenil)-2-fenil acrílico RR01 284,30

O

O

OH

OCH3

CH3

Ácido 3-(4-acetoxi-3-metoxifenil)-2-fenil acrílico RR02 314,28

O

OH

O

OCH3

OOH

1,2-dimetoxi-4-[(Z)-2-fenil-1-etenil] benzeno RR03 240,29O

O

CH3

CH3

1,2-dimetoxi-4-[(E)-2-fenil-1-etenil] benzeno RR04 244,32O

CH3

O

CH3

Ácido 3-(3,4-metoxifenil)-2-fenil acrílico RR05 254,28

O

OH

OCH3

Ácido 3-(4-hidroxi-3-metoxifenil)-2-fenil acrílico RR06 270,28

O

OH

OH

OCH3

4-Metoxifenil-3,4,5-trimetoxifenilmetanona RR07 302,32H3CO

H3CO OCH3

OCH3

O

4-(1,8-dimetoxi-9H-xantenila-9)-2-metoxifenol RR09 368,42

O

C H 3OO

CH 3

O

O H

C H 3

64

Substância (nome químico) Sigla MM2 Estrutura Química

Ácido 3-(2-hidroxifenil)-2-fenil acrílico RR10 240,25

O

OH

OH

9-(4-hidroxi-3-metoxi)-3,4,5,6,7,9-hexahidro-2H-xantene-1,8-diona RR11 340,37

O

OO

O

O H C H 3

5-[2-(4-hidroxifenil)-vinil]-benzeno-1,3-diol RESV 228,24OH

OH

OH

1Os estilbenos são compostos não flavonóides que contem o grupo funcional 1,2-difeniletileno possuindo ligação

dupla conjugada no sistema. Tais compostos são denominados fitoalexinas, dentre os quais destaca-se o

resveratrol (RIBÉREAU-GAYON, 2002). 2MM = Massa Molecular; RESV = Resveratrol;

4.2.2 Manutenção das células

No presente trabalho, utilizou-se dois tipos de linhagem celular, as linhagens em

suspensão (CEM, HL-60, JUKART e K-562) e as linhagens aderidas (B-16, B-16-F10, HCT-

8, MDA-MB 231 MDA-MB-435, MX-1, PC-3 e SF-295), todas obtidas através de doação do

Instituto Nacional do Câncer dos Estados Unidos (Bethesda, MD). As linhagens celulares que

foram utilizadas nos experimentos estão em destaque na Tabela 4. As células eram cultivadas

em frascos plásticos para cultura (Corning, 25 cm2, volume de 50 mL para células aderidas e

75 cm2, volume de 250 mL para células em suspensão), utilizando o meio de cultura RPMI

1640 complementado com 10% de soro fetal bovino e 1% de antibióticos

(penicilina/estreptomicina). As células foram mantidas em estufa a 37°C com atmosfera de

5% de CO2 e 95% de umidade, seguido da observação do crescimento celular com ajuda de

microscópio de inversão a cada 24 horas. Quando necessário às células eram repicadas em

meio de cultura nova, numa concentração de 0,5-1,0 x 106 céls/mL (BUTLER; DAWSON,

1992).

65

Tabela 4 – Linhagens celulares tumorais utilizadas no ensaio de citotoxicidade in vitro,

através do método do MTT.

Linhagem Celular Tipo Histológico do Câncer / Origem Concentração de

plaqueamento (células/mL)

HL-60 (*) Leucemia promielocítica humana 0,3 x 106 K-562 (*) Leucemia mielocítica crônica humana 0,3 x 106 CEM (*) Leucemia linfocítica humana 0,5 x 106 JUKART (*) Leucemia 0,3 x 106 MDA-MB 231 (**) Carcinoma de mama humano 0,1 x 106 MDA-MB 435 (**) Carcinoma de mama humano 0,1 x 106 MX-1 (**) Carcinoma de mama humano 0,1 x 106 HCT-8 (**) Carcinoma de cólon humano 0,7 x 105 PC-3 (**) Carcinoma de próstata humano 0,1 x 106 SF-295 (**) Glioblastoma 0,7 x 105 B-16-F10 (**) Glioblastoma 0,7 x 105 B-16 (**) Melanoma murino 0,6 x 105 (*) Linhagem de células em suspensão; (**) Linhagem de células aderidas

4.2.3 Avaliação da atividade citotóxica em células tumorais in vitro pelo método do MTT

4.2.3.1 Princípio do teste

A análise de citotoxicidade pelo método de redução do MTT, [3-(4,5-dimetiltiazol-

2yl)-2,5-difeniltetrazolium bromida], vem sendo utilizada no programa de screening do

National Cancer Institute dos Estados Unidos (NCI), sendo testadas mais de 10.000 amostras

a cada ano (SKEHAN et al., 1990), podendo ser utilizado para determinar citotoxicidade,

proliferação e ativação celular. O método baseia-se na redução do sal [3-(4,5-dimetiltiazol-

2yl)-2,5-difeniltetrazolium bromida] ou MTT, um composto de cor amarela, a formazan,

composto de coloração púrpura, pelos substratos celulares NADH, NADPH e succinato,

presentes na mitocôndria de células viáveis, seguida de análise colorimétrica (MOSMANN,

1983; BERRIDGE; TAN, 1993). No presente trabalho, este ensaio foi utilizado para seleção

das substâncias mais ativas.

4.2.3.2 Procedimento experimental

As células foram plaqueadas em concentrações variadas de acordo com a Tabela 4

para células suspensas e aderidas. O resveratrol, o RR07 e os outros compostos análogos

66

(RR01, RR02, RR03, RR04, RR05, RR06, RR09, RR10 e RR11), de esqueleto estilbenóide

foram acrescidos em concentrações, que variaram desde 1,70 até 67,85 μM.

Inicialmente, fez-se a diluição das substâncias em DMSO puro e estéril em uma

concentração estoque de 5 mg/mL, onde foram obtidas as concentrações finais 0,17 a 67,85

μM e adicionadas em placa de 96 poços (100 μL/poço). O quimioterápico doxorrubicina foi

usado como controle positivo. Após um período de incubação de 72 horas, as placas foram

retiradas e centrifugadas a 1500 rpm/15 minutos. O sobrenadante foi aspirado e foi adicionado

200 μL de uma solução contendo RPMI 1640 com 10% de MTT, sendo a placa colocada na

estufa a 5% de CO2 por 3 horas. Em seguida, as placas foram novamente centrifugadas a 3000

rpm/10 minutos, tendo o sobrenadante aspirado e seu precipitado ressuspendido em 150 μL de

DMSO e agitado por cerca de 10 minutos, até completa dissolução dos cristais de formazan.

As placas foram lidas no espectrofotômetro de placas a um comprimento de onda de 595 nm.

4.2.3.3 Análise dos dados

Os experimentos foram analisados segundo suas médias e respectivos EPMs. As

substâncias foram testadas em diluição do tipo seriada, em duplicata ou triplicata, foi montado

o gráfico absorbância versus concentração e determinado as suas CI50 (concentração inibitória

média capaz de provocar 50% do efeito máximo) e seus respectivos intervalos de confiança

(IC 95%) determinados a partir de regressão não-linear no programa GraphPad Prism versão

5.0 (Intuitive Software for Science, San Diego, CA, EUA).

4.2.4 Avaliação da atividade antimitótica – Desenvolvimento embrionário em ovos de

ouriço-do-mar (Lytechinus variegatus)

4.2.4.1 Princípio do ensaio

O ouriço-do-mar pertence ao Filo Echinodermata, Classe Echinoidea, Subclasse

Euechinoidea, por (RUPERT; BARNES, 1996). A espécie Litechinus variegatus é facilmente

mantida em laboratório e foi selecionada para a utilização em testes de toxicidade por

apresentar-se fértil o ano todo e possuir ovos pouco pigmentados, viabilizando, assim, a

execução de ensaios com seus gametas. Os óvulos apresentam uma coloração alaranjada

enquanto que os espermatozóides apresentam-se esbranquiçados. A membrana de fecundação

dos ovos é facilmente visualizada, assim como as várias fases da embriogênese.

67


A extrusão dos gametas foi induzida pela injeção de KCl 0,5 M na cavidade celômica

dos animais. Após extruídos, os óvulos foram lavados em uma proveta com água do mar

filtrada, por 3 vezes, para remoção da camada gelatinosa. Os espermatozóides concentrados

foram mantidos em baixa temperatura até o momento do uso. Após a última lavagem, os

óvulos foram ressuspendidos em 50 mL de água do mar filtrada e fecundação realizada pela

adição de 1 mL da suspensão de espermatozóides (0,05 mL da suspensão concentrada + 2,45

mL de água do mar filtrada) a 50 mL suspensão de óvulos. Após cerca de dois minutos, a

fecundação foi confirmada pela presença da membrana da fecundação, pela observação de

uma amostra das células ao microscópio. Um volume de 1 mL de ovos foram distribuídos

numa multiplaca com 24 cavidades, cada uma contendo os análogos incubados num volume

final de 2 mL nas concentrações de 10 e 100 µg/mL, mantidos à temperatura ambiente (26 ±

2°C) sob agitação constante. As amostras foram fixadas alíquotas de 0,2 mL em formalina

10%, quando se observou a maioria dos embriões do controle negativo nas fases da primeira e

terceira divisão e blástula. Cem ovos foram contados em cada amostra para obtenção da

porcentagem de células.

Foram testados resveratrol e análogos estilbenóides (RR01, RR02, RR03, RR04,

RR05, RR06, RR07, RR09, RR10 e RR11), os mesmos foram diluídos em DMSO na

concentração estoque de 1 mg/mL. A doxorrubicina, um quimioterápico com indicação para

diversos tipos de tumores, foi utilizado como controle positivo.


Os dados foram analisados a partir da média ± EPM de “n” experimentos no programa

GraphPad Prism versão 5.0 (Intuitive Software for Science, San Diego, CA, EUA).

68

4.2.5 Avaliação do dano à membrana plasmática – Atividade Hemolítica em Eritrócitos de

Camundongos Mus musculus Swiss


Esta metodologia, segundo descrita por Costa-Lotufo et al. (2002); Dresch et al.

(2005), baseia-se em avaliação espectrofotométrica e permite avaliar o potencial das

substâncias teste em causar lesões na membrana plasmática da célula, seja pela formação de

poros ou pela ruptura total.


Foi coletado o sangue de três camundongos (Mus musculus Swiss) do plexo orbital,

sendo diluído em 30 volumes de solução salina (NaCl 0,85% + CaCl2 10 mM). Os eritrócitos

foram lavados 2 vezes em solução salina, centrifugados (1500 rpm/3 minutos) para redução

da contaminação plasmática e ressuspensos em solução salina para obtenção de uma

suspensão de eritrócitos (SE) a 2%. Os ensaios foram realizados em multiplacas com 96

cavidades. Cada poço da 1ª fileira vertical recebeu 100 μL da solução salina. Na 2ª fileira

vertical, os poços receberam 50 μL da solução salina e 50 μL do veículo de diluição da

substância teste, neste caso, DMSO 10%. Aos poços da 3ª fileira vertical, foram adicionados

100 μL de solução salina e 100 μL das substâncias teste em solução. Da 4ª fileira vertical em

diante, os poços receberam 100 μL da solução salina, excetuando-se os da última fileira, que

receberam 80 μL de solução salina e 20 μL de Triton X-100 1% (controle positivo). As

diluições foram feitas da 3ª à 11ª cavidades verticais, retirando-se 100 μL da solução da

cavidade anterior e transferindo para a seguinte de modo que as concentrações foram sempre

diluídas pela metade, variando de 17,08 a 542,85 μM. Em seguida, 100 μL da suspensão de

eritrócitos foram plaqueados em todos os poços. Após incubação de 1 hora, sob agitação

constante à temperatura ambiente (26 ± 2°C), as amostras foram centrifugadas (5000 rpm/3

minutos) e o sobrenadante transferido para uma outra placa para a leitura da absorbância no

espectrofotômetro de placas a 540 nm. A atividade dos compostos foi determinada de maneira

relativa ao valor dos controles positivo e negativo.

Foram testados os compostos RR01, RR02, RR03, RR04, RR05, RR06, RR07, RR08,

RR09, RR10, RR11 e Resveratrol, os quais foram diluídos em DMSO na concentração

69

estoque de 5 mg/mL. As amostras foram testadas em curva de diluição seriada em

concentrações crescentes de 17,08 a 542,85 μM.



substâncias foram testadas em diluição do tipo seriada. Foi montado o gráfico absorbância

versus concentração e determinadas as suas CE50 (concentração efetiva média capaz de

provocar 50% do efeito máximo) e seus respectivos intervalos de confiança (IC 95%), obtidas

a partir de regressão não-linear no programa GraphPad Prism versão 5.0 (Intuitive Software

for Science, San Diego, CA, EUA).

4.3 Caracterização da atividade antiproliferativa do composto RR07 em células HL-60 e

em cultura primária de células mononucleadas do sangue periférico (PBMC) pelo ensaio

do MTT

4.3.1. Procedimento experimental

As células HL-60 foram plaqueadas na concentração de 0,3 x 106 células/mL

(procedimento anteriormente descrito no tópico 4.2.2) enquanto as células mononucleadas do

sangue periférico (PBMC) foram isoladas a partir de uma amostra de sangue periférico

(procedimento descrito no tópico 4.4.6) e plaqueadas na concentração 1 x 106 células/mL.

O composto RR07 foi então adicionado às células em uma curva de concentração que

variou desde de 1,70 até 67,85 μM. Após um período de incubação de 24 horas, as placas

foram retiradas e centrifugadas a 1500 rpm/15 minutos. O sobrenadante foi aspirado e foi

adicionado 200 μL de solução de MTT 10% em RPMI 1640, sendo a placa colocada na estufa

a 5% de CO2 por 3 horas. Em seguida, as placas foram novamente centrifugadas a 3000

rpm/10 minutos, tendo o sobrenadante aspirado e seu precipitado ressuspendido em 150 μL de

DMSO e agitado por cerca de 10 minutos, até completa dissolução dos cristais de formazan.

As placas foram lidas no espectrofotômetro de placas a um comprimento de onda de 595 nm.

70

4.3.2 Análise dos dados


substâncias foram testadas em diluição do tipo seriada, em duplicata ou triplicata. Foi

montado o gráfico absorbância versus concentração e determinadas as suas CI50 (concentração

inibitória média capaz de provocar 50% do efeito máximo) e seus respectivos intervalos de

confiança (IC 95%) determinados a partir de regressão não-linear no programa GraphPad

Prism versão 5.0 (Intuitive Software for Science, San Diego, CA, EUA).

4.4 Estudos de Mecanismo de Ação

4.4.1 Viabilidade celular – Teste de exclusão do azul de Tripan


O teste de exclusão por azul de Tripan permite quantificar as células viáveis das

células mortas pela substância testada. O corante penetra em todas as células, porém somente

as células viáveis conseguem bombear o azul de tripan para fora, sendo possível desta forma,

observar uma coloração azulada nas células mortas, por não poder bombeá-lo (JIMENEZ et

al., 2003; PERES et al., 2005).


Células da linhagem HL-60, na concentração de 0,3 x 106 células/mL, foram

incubadas por 24 horas com a substância RR07 nas concentrações de 0,25; 0,50; 1,00; 2,00 e

4,00 μM e examinadas ao microscópio de inversão. A concentração utilizada foi estimada a

partir do valor da CI50 (0,25 μM) encontrada no método do MTT para esta mesma linhagem

celular. Retirou-se 90 μL da suspensão de células e foi adicionado a 10 μL do azul de tripan

(10%). As células viáveis e as não viáveis foram diferenciadas a partir da contagem em

câmara de Newbauer. A Doxorrubicina (0,5 μM) foi usada como controle positivo (VERAS

et al., 2004).

71


Os dados foram analisados a partir da média ± EPM de “n” experimentos. Para

verificação da ocorrência de diferenças significativas entre os diferentes grupos, os dados

foram comparados por análise de variância ANOVA, com nível de significância de p < 0,001

no programa GraphPad Prism versão 5.0 (Intuitive Software for Science, San Diego, CA,

EUA).

4.4.2 Avaliação cinética do crescimento celular em HL-60 pelo método do azul de tripan

4.4.2.1. Principio do ensaio

Baseia-se no principio descrito na seção 4.4.1.1


Células das linhagens HL-60 foram plaqueadas em placas de 24 poços, na

concentração de 0,3 x 106 células/mL, e incubadas com o composto RR07 nas concentrações

de 0,25; 0,50; 1,00; 2,00 e 4,00 µM. Após cada período de incubação (3, 6, 12, 18 e 24 horas)

era retirada uma alíquota de 90 µL da suspensão de células e adicionado a 10 μL do azul de

tripan. Em seguida uma alíquota de 10 μL da solução de células foi colocada em uma câmara

de Newbauer e as células diferenciadas e contadas em viáveis e não viáveis.


O valor obtido para cada contagem foi montado em um gráfico e construído uma

curva com as variáveis: porcentagem de células viáveis versus log da concentração, para cada

tempo analisado, para a observação da cinética de crescimento das células tratadas. Foram

determinados também suas CI50 (concentração inibitória média capaz de provocar 50% do

efeito máximo) e seus respectivos intervalos de confiança (IC 95%) realizado a partir de

regressão não-linear utilizando o programa GraphPad Prism versão 5.0 (Intuitive Software for

Science, San Diego, CA, EUA). Para verificação da ocorrência de diferenças significativas

entre os diferentes grupos, os valores das CI50 foram comparados por análise de variância

72

(ANOVA) seguido do teste Student-Newman-Keuls, com nível de significância estatística de

95% (p < 0,05).

4.4.3 Análise de alterações morfológicas – Coloração com hematoxilina e eosina


A técnica de coloração hematoxilina-eosina (HE) permite diferenciar o citoplasma do

núcleo, possibilitando, assim, a análise de estruturas celulares. A hematoxilina é um corante

basofílico que tem maior afinidade pelas proteínas nucleares, dando ao núcleo numa cor lilás.

A eosina, por sua vez, liga-se melhor aos componentes citoplasmáticos conferindo-lhe uma

coloração rósea (BRYNE, 1998).


Células da linhagem HL-60 foram plaqueadas em placas de 24 poços, na concentração

de 0,3 x 106 células/mL, e incubadas por 24 horas com o composto RR07 nas concentrações

de 0,25; 0,50 e 1,00 μM. A doxorrubicina (0,50 μM) foi usada como controle positivo. Para

observar a morfologia das células, lâminas foram preparadas, com 50 µL da suspensão de

células, em citocentrífuga (cytospin) e fixadas com metanol 100% por 1 minuto. Em seguida,

as lâminas foram lavadas com água corrente para remoção do fixador e coradas, inicialmente,

com hematoxilina de harris 0,1% por 1 minuto. Após a lavagem com água destilada, as

lâminas foram imersas em eosina 0,5% por mais 1 minuto e visualizadas ao microscópio. Para

garantir a preservação do material, as lâminas foram desidratadas com solução de etanol:xilol,

até xilol 100%. Uma gota de bálsamo do Canadá foi pingada em cada lâmina e virada sobre

uma lamínula. Essa montagem foi deixada 24 horas para secar (VERAS et al., 2004).


As lâminas com células tratadas e não tratadas foram levadas ao microscópico para a

avaliação qualitativa de suas características morfológicas e comparadas às células do controle

negativo. Posteriormente, as células foram fotografadas para o registro das alterações

observadas.

73

4.4.4 Determinação do percentual de inibição de síntese de DNA: incorporação da

bromodeoxiuridina- Ensaio do BrDU


A bromodeoxiuridina (BrDU) é uma base nitrogenada análoga à timidina que é

incorporada ao DNA das células em proliferação. A detecção do BrDU é realizada por

técnicas de imuno-citoquímica, onde se ligam anticorpos monoclonais e um cromógeno

específico, a diaminobenzidina (DAB), que vai conferir uma coloração marrom ao núcleo das

células que incorporaram a BrDU (TAKAHASHI, 2003).

4.4.4.2 Procedimento Experimental

Células da linhagem HL-60 foram plaqueadas em placas de 24 poços, na concentração

de 0,3 x 106 células/mL, e incubadas por 24 h com o composto RR07 nas concentrações de

CI50 (0,25; 0,50 e 1,00 μM). As concentrações utilizadas foram calculadas a partir dos valores

de CI50, encontrados no ensaio da curva de crescimento no período de 24 horas de incubação.

A doxorrubicina (0,50 μM) foi usada como controle positivo. Três horas antes do período de

incubação o BrdU (0,01 μM) foi adicionado em cada poço da cultura de células. Após o

período de incubação, lâminas foram preparadas em citocentrífuga (cytospin) e postas para

secar por 2 horas. Após o período de secagem foram fixadas em metanol: ácido acético (7:1,5)

por 5 minutos. As células foram lavadas com tampão Tris (TBS) e incubadas em solução

desnaturante por 90 minutos a 70°C e pH 7,4. Após uma segunda lavagem com TBS, a região

adjacente às células foi circundada com caneta hidrofóbica. Em seguida, o material foi

incubado com anticorpo primário e deixado sob refrigeração durante a noite em câmara

úmida. A seguir, as células foram incubadas com anticorpo secundário biotinilado por 20

minutos e, então, com a solução de estreptavidina-fluoresceína por mais 20 minutos.

Adicionou-se o cromógeno DAB por 1-5 minutos, o qual foi removido com água destilada. A

contra-coloração das células foi realizada com hematoxilina de Harris a 0,1%.


Duzentas células foram contadas, diferenciando-as entre núcleo marrom

(incorporaram o BrdU) e não-marrom ou núcleo lilás (não incorporam o BrdU). Os dados

74

foram expressos como a média ± EPM de dois experimentos independentes (realizados em

duplicata). Para verificação da ocorrência de diferenças significativas entre os grupos, os

dados foram comparados pelo teste χ2, utilizando o programa Prism versão 5.0 (Intuitive

Software for Science, San Diego, CA, EUA). com nível de significância de 5% (p < 0,05).

4.4.5 Avaliação do padrão de morte celular – Coloração diferencial com laranja de

acridina (LA) / brometo de etídeo (BE)


O método de coloração pelo brometo de etídio/laranja de acridina permite diferenciar

células viáveis daquelas em processo de morte por apoptose ou necrose pela coloração

diferencial por fluorescência com base em alterações morfológicas nucleares e

citoplasmáticas (McGAHON et al., 1995). A laranja de acridina (LA) consegue atravessar

membranas celulares intactas e se ligam ao DNA, conferindo uma aparência verde ao núcleo

das células. O brometo de etídio (BE) é incorporado principalmente por células com a

membrana já danificada (não viáveis), ligando-se ao DNA e corando-o de laranja. As células

viáveis com membrana intacta apresentam núcleo uniformemente corado de verde pela laranja

de acridina (LA). As células em apoptose inicial (membrana ainda intacta) apresentam

manchas verdes brilhantes no núcleo (condensação da cromatina) e não são marcadas por

brometo de etídio (BE). Morfologicamente, observam-se alterações da membrana em

decorrência da formação de corpúsculos apoptóticos. As células em necrose (lesão de

membrana) apresentam um padrão de coloração uniforme, laranja-avermelhada e não há

formação de corpos apoptóticos. Possivelmente, as membranas plasmáticas permaneçam

intactas durante o fenômeno apoptótico até os últimos estágios quando se tornam permeáveis

aos solutos normalmente retidos.


As células HL-60 foram plaqueadas em placas de 24 poços, na concentração de 0,3 x

106 células/mL, e incubadas por 24 horas com o composto RR07 nas concentrações de 0,25;

0,50 e 1,00; 2,00 e 4,00 μM. As concentrações utilizadas foram estimadas a partir dos valores

de CI50, encontrados no ensaio do MTT para a linhagem HL-60 no período de 24 horas de

75

incubação. A doxorrubicina (0,50 μM) foi usada como controle positivo. Uma alíquota de 1

mL da suspensão de células foi transferida para um tubo eppendorf e centrifugada por 5

minutos a 2000 rpm. O sobrenadante foi descartado e as células ressuspendidas em 20 μL de

solução de PBS. Em seguida, 1 μL da solução de LA:BE foi adicionado a cada tubo e uma

alíquota dessas células transferido para uma lâmina, montado com lamínula, e em seguida

levadas ao microscópio de fluorescência para observação dos eventos celulares (GENG;

ZENG; WANG, 2003).


Para a quantificação percentual de cada evento celular (viáveis, necróticas e

apoptóticas), foram contadas 300 células de cada amostra. Os dados foram expressos como a

média ± EPM de três experimentos independentes. Para verificação da ocorrência de

diferenças significativas entre os diferentes grupos, os dados foram comparados por análise de

variância (ANOVA) seguido pelo teste de Dunnet, utilizando o programa GraphPad Prism

versão 5.0 (Intuitive Software for Science, San Diego, CA, EUA), com nível de significância

de 5% (p < 0,05).

4.4.6 Avaliação citotóxica em células mononuceladas de sangue periférico humano (PBMC)

4.4.6.1 Aspectos éticos, coleta de sangue e isolamento das células PBMC

Esse protocolo foi aprovado pelo Comitê de Ética em Pesquisa em Seres Humanos da

Universidade Federal do Ceará, estando registrado com o número 281/09, e foi conduzido de

acordo com a resolução 196/96 do Conselho Nacional de Saúde.

A coleta do sangue periférico foi realizada por profissionais capacitados, utilizando-se

seringas esterilizadas e descartáveis de 10 mL. Para tanto, foram escolhidos 3 voluntários

adultos saudáveis, na faixa etária de 20 a 30 anos, sem histórico de doenças recentes, não

fumantes, sem exposição recente a radiações, a medicamentos ou álcool (BURIM et al.,

2001).

As células PBMC foram isoladas a partir de uma amostra de 3 mL de sangue

periférico acrescida de 5 mL de PBS. Essa mistura foi adicionada a um tubo Falcon com 2 mL

de Ficoll e submetida à centrifugação por 30 minutos a 2000 rpm. Em seguida, a região

intermediária entre as hemácias e o soro, chamada de nuvem de células PBMC foi aspirada e

76

adicionada a um terceiro tubo. Posteriormente, completou-se com PBS até o volume de 11

mL e centrifugou-se o tubo a 108 g por 20 minutos. O sobrenadante foi descartado e o pellet

de PBMC foi ressuspendido em 2 mL de PBS.

4.4.7 Avaliação da atividade citotóxica do composto RR07 em células mononucleadas do

sangue periférico (PBMC)

4.4.7.1 Principio do ensaio

As células mononucleadas do sangue periférico (PBMC) de mamíferos são ideais para

se testar uma substância quanto a sua capacidade em produzir aberrações cromossômicas

(NATARAJAN; OBE, 1980). Supondo-se que haja uma correlação entre o dano induzido no

sangue e em outras células somáticas, as células tipo PBMC serviriam como um sistema

sentinela para grupos de alto risco (NORDENSON et al., 1984).


As células mononucleadas foram obtidas do sangue periférico de voluntários sadios

após centrifugação em gradiente de Ficoll. As células foram removidas, lavadas com tampão

fosfato e ressuspendidas em meio RPMI 1640 suplementado com 20% de soro fetal bovino

fetal, 100 U/mL penicilina, 100 μg/mL estreptomicina para uma concentração final de final 3

x 105 células/mL. Fitohemaglutinina (3%) foi adicionada para induzir a proliferação das

células periféricas mononucleadas. As células foram incubadas em estufa a 37°C com

atmosfera de 5% de CO2 durante 48 horas antes da adição do RR07 nas concentrações finais

de 0,12 a 82,6 μM.

A atividade citotóxica do composto RR07 e doxorrubicina foi avaliada pela contagem

das células que excluíram o corante azul de tripan após um períodos de incubação de 24

horas.


O composto RR07 foi testado em diluição seriada, em triplicata. A concentração

necessária para inibir 50% das células – CI50 – e o intervalo de confiança foi calculado a partir

de regressão não-linear utilizando o programa Prism versão 5.0 (Intuitive Software for

77

Science, San Diego, CA, EUA). Para verificação da ocorrência de diferença significativa

entre a citotoxicidade em células de HL-60 e em PBMC periféricos, os dados foram

comparados por teste t de Student não-pareado com nível de significância de 5% (p < 0,05).

4.4.8 Atividade genotóxica em células mononucleadas do sangue periférico – Teste do Cometa

4.4.8.1 Seleção de voluntários e obtenção do material para análise

Para o estudo com PBMC humano, foi utilizado sangue periférico de quatro doadores

voluntários, obedecendo aos seguintes critérios:

Ter entre 18 e 25 anos;

Estar em bom estado clínico de saúde;

Não fumante e não etilista;

Não estar fazendo uso de algum medicamento.

A coleta do material (sangue periférico retirado da veia cefálica ou basílica) foi

realizada por profissionais capacitados, nas dependências da UNIFAC (Unidade de

Farmacologia Clínica da Universidade Federal do Ceará – UFC), utilizando seringa

esterilizada e descartável.

A versão alcalina do Ensaio do Cometa, mais especificamente conhecido pela sigla

inglesa SCGE, (Single Cell Gel Electrophoresis), tem sido usada para avaliar a

genotoxicidade in vitro de muitos compostos em células normais e transformadas, humanas

ou animais (DAUER et al., 2003).

O teste do cometa é um método simples, rápido, econômico e sensível que permite a

detecção de dano em DNA em células individualizadas. Ao expor a célula ao composto para

avaliação do possível efeito genotóxico, o dano pode ser visualizado pela realização de uma

eletroforese em lâmina, onde, fragmentos das fitas de DNA carregadas negativamente

começam a migrar afastando-se do núcleo, em direção ao anodo. Quando corados com

brometo de etídeo, cada núcleo e sua “cauda” de fragmentos associada remetem a alusão de

um cometa. O tamanho da cabeça e o comprimento da cauda são os padrões avaliados para

determinar a intensidade do dano (SINGH et al., 1988; HARTMANN; SPEIT, 1997).

78


Este ensaio se baseia no processo de migração do DNA sobre o gel de eletroforese

devido à influência exercida por uma corrente elétrica.


As células mononucleadas do sangue periférico (PBMC – 0,5 x 105 células/mL), assim

como a linhagem HL-60 (0,3 x 106 células/mL) foram cultivadas em RPMI 1640

suplementado com 10% de soro fetal bovino e 1% de antibiótico, e plaqueadas em placas de

24 poços, sendo incubadas por 24 horas com o composto RR07 nas concentrações de 0,25;

0,50; 1,00; 2,00 e 4,00 μM respectivamente. A doxorrubicina (0,50 μM) foi usada como

controle positivo.

4.4.8.4 Execução do teste do Cometa

4.4.8.4.1 Preparo das lâminas

Após o período de incubação de 24 horas foi retirada uma alíquota de 20 μL de

células, a qual foi adicionada a 110 μL de agarose de baixo ponto de fusão 0,5% para preparo

das lâminas. As lâminas foram previamente cobertas por solução de agarose de ponto de fusão

normal 1,5% a 60°C e mantidas a temperatura ambiente por 24 horas até a solidificação da

agarose. Esta camada foi utilizada para promover a adesão da segunda camada de agarose de

baixo ponto de fusão, a qual foi preparada previamente. Em seguida, foram cobertas com

lamínulas (24 mm X 60 mm) para uniformizar a distribuição das células e mantidas a 4°C

para solidificação da agarose.

4.4.8.4.2 Lise celular

Após solidificação da agarose, a lamínula foi gentilmente removida e a lâmina

mergulhada em solução de lise (2,5 M NaCl, 100 mM EDTA and 10 mM Tris, pH 10, Triton

X-100 (0,1%) e DMSO (10%) a 4°C e protegida da luz, por no mínimo 1 hora antes da

corrida de eletroforese.

79

4.4.8.4.3 Neutralização e corrida em eletroforese

Depois de removidas da solução de lise, as lâminas foram colocadas em uma solução

de neutralização (300 mM de NaOH e 1 mM de EDTA, pH > 13; 4°C) por 15 minutos e

dispostas horizontalmente na cuba de eletroforese. A cuba foi mantida em banho de gelo para

a manutenção da temperatura em torno de 4°C, tendo sido acrescentada a solução de

eletroforese até completa imersão das lâminas.

Antes de iniciar a corrida de eletroforese, as lâminas ficaram em repouso por 20

minutos para permitir o desenrolamento do DNA, o afrouxamento de suas ligações e a

exposição dos sítios álcali-lábeis. Posteriormente, a eletroforese foi conduzida em baixa

luminosidade, usando 25 volts e corrente de 300 mA por 20 minutos. Após a eletroforese, as

lâminas foram retiradas da cuba e mergulhadas na solução de neutralização por 5 minutos, a

fim de neutralizar a alcalinidade. A fixação foi realizada com etanol 100%.

4.4.8.4.4 Coloração

Posteriormente, as lâminas foram coradas com 50 μl de solução de brometo de etídio

(20 µg/mL) e analisadas em microscópio de fluorescência.

4.4.8.4.5. Análise dos dados

A análise foi realizada de acordo com o padrão de escores previamente determinados

pelo tamanho e intensidade da cauda do cometa (Figura 10). Foram contados 100 cometas

por lâmina (n = 4) e classificados dentre as cinco categorias (0, 1, 2, 3 e 4), que representam a

percentagem de DNA na cauda do cometa, indicando o grau de dano sofrido pela célula

(LOVELL; THOMAS; DUBROW, 1999):

0 = sem danos ao DNA, portanto, sem cauda (< 5%)

1 = baixo nível de danos, com a cauda menor que o diâmetro da cabeça (5-20%)

2 = médio nível de danos, com a cauda representando 1-2x o diâmetro da cabeça (20-40%)

3 = alto nível de danos, com a cauda representando mais de 2x o diâmetro da cabeça (40-95%)

4 = dano total (> 95%)

80

O índice de dano (ID) foi obtido pela seguinte fórmula: ID = ini

i ×∑=

4

0

, onde in é o

número de células com nível de dano i (0, 1, 2, 3 ou 4). A freqüência de dano (FD) representa

a porcentagem de células que sofreram danos no DNA.

Os dados foram expressos como da média ± EPM de experimentos independentes (n =

2). Para verificação da ocorrência de diferenças significativas entre os diferentes grupos, os

dados serão comparados por análise de variância (ANOVA) seguida por Teste Student

Newman Keuls, com nível de significância estatística de 95% (p < 0,05) usando o programa

GraphPad (Intuitive Software for Science, San Diego, CA, EUA).

Figura 10 – Representação dos tipos de cometa, sendo indicado o escore atribuído a cada cometa de acordo com

o dano ao DNA. Classificação por categoria de dano: (0) sem dano (< 5%); (1) Baixo nível de dano (5-20%); (2)

médio nível de dano (20-40%); (3) alto nível de dano (40-95%); (4) dano máximo (> 95%). Fonte: Collins

(2004b)

4.4.9 Estudo de aberrações cromossômicas induzidas pelo composto RR07 em células

mononucleadas do sangue periférico (PBMC)


Os estudos de aberração se baseiam em alterações citológicas, as quais são

identificadas por corantes específicos e visualizadas por microscopia óptica.

81


As células PBMC (0,5 x 105 células/mL) foram cultivadas em frascos de cultura

contendo RPMI 1640 suplementado com 20% de soro fetal bovino, 1% de antibióticos e 3%

de fitohemaglutinina durante 72 horas a 37°C em atmosfera de 5% de CO2 de acordo com o

protocolo de Preston, San Sebastian e McFee (1987). Duas horas antes do término do tempo

de incubação, foi adicionada em todas as culturas uma solução de colchicina (4 µM) para a

obtenção de metáfases. Posterior ao tempo de cultivo, as culturas foram fixadas com uma

solução fixadora (metanol/ácido acético, 3:1) mantida previamente gelada (4°C).

A capacidade do RR07 em induzir aberrações cromossômicas foi avaliada em

diferentes fases do ciclo celular (G1, S e G2) de acordo com PESSOA e colaboradores (2003).

4.4.9.3 Tratamentos

Para a análise citogenética, foram utilizadas 5 concentrações do composto RR07 (0,25;

0,50; 1,00; 2,00 e 4,00 μM). Para avaliar a ação do RR07 nas diferentes fases do ciclo celular

(G1, S, G1/S e G2), foi utilizado o protocolo de tratamentos de acordo com Mitelman (1995).

Para a realização dos ensaios os experimentos foram divididos em seis, onde nos

experimentos 1, 3 e 5 as células foram tratadas com fitohemaglutinina, colchicina (controle

positivo – 4 μM), enquanto nos experimentos 2, 4 e 6 os PBMCs foram tratados inicialmente

com a fitohemaglutinina, com a finalidade de induzir a proliferação dos PBMCs, e em seguida

as células foram tratadas com a substância teste RR07, para observar o efeito da substância na

ausência da colchicina. A doxorrubicina foi utilizada como controle positivo nos seis

experimentos realizados na concentração de 0,50 μM.

1) Para avaliar o efeito do RR07 na fase G1 do ciclo celular, RR07 foi adicionado no

início da cultura (tempo zero) e após 50 horas foi adicionado colchicina que ficou incubada

junto com a droga teste por 2 horas (Experimento 1). O mesmo procedimento foi realizado

com o mesmo tempo de incubação, porém sem o acréscimo da colchicina (Experimento 2).

2) Para avaliar a fase de transição G1-S, o RR07 foi adicionado a cultura 24 horas após

o início de cultivo. Ao completar 50 horas do inicio da cultura, foi adicionado colchicina e

após 2 horas de incubação (52 horas), o material foi fixados em lâminas (Experimento 3). O

mesmo procedimento foi realizado adicionando-se RR07, porém na ausência de colchicina

(Experimento 4).

82

3) Para avaliar o efeito do composto RR07 na fase G2 do ciclo celular, as culturas

foram preparadas e após 69 horas do início da cultura, adicionou-se o composto teste RR07 e

após 1 hora (70 horas após o início da cultura) foi acrescentada a colchicina (4 µM). Com 72

horas após o início da cultura, o material foi fixado em lâminas (Experimento 5). O mesmo

procedimento foi realizado, porém sem o acréscimo de colchicina (Experimento 6), com

apresentado na Tabela 5.

Tabela 5 – Protocolo dos tratamentos do RR07 aplicado às culturas temporárias de PBMC.

Experimento Tratamento PHA RR07 COL Fixação

1 G1 0 h 0 h 50 h 52 h 2 G1 0 h 0 h __ 52 h 3 G1/S 0 h 24 h 50 h 52 h 4 G1/S 0 h 24 h __ 52 h 5 G2 0 h 69 h 70 h 72 h 6 G2 0 h 69 h ___ 72 h

PHA: fitohemaglutinina; COL: colchicina; RR07. Nota: Nos experimentos 2, 4 e 6 não foi adicionada a

colchicina para observar o possível efeito bloqueador do RR07 na fase de Metáfase.

4.4.9.4 Preparação das lâminas

Duas a quatro gotas (dependendo da quantidade do material) da suspensão celular

foram transferidas para lâminas limpa e seca. Após a montagem das lâminas, estas foram

coradas com uma solução de Giemsa (5%) por 7 minutos. Foram montadas cinco lâminas para

cada cultura.

4.4.9.5 Análise citogenética

A análise das lâminas foi realizada em microscópio óptico, com a finalidade de se

detectar possíveis alterações cromossômicas estruturais ou numéricas nas metáfases dos

PBMCs. Os cromossomos foram analisados com a objetiva de imersão (100X), em lâminas

codificadas, observando-se a posição do centrômero, alterações no grau de ploidia e

aberrações estruturais segundo Rabello-Gay, Rodrigues e Nonteleone-Neto (1991).

83

4.4.9.6 Critérios de análise

Os parâmetros analisados foram a frequência de células com aberrações

cromossômicas em 100 metáfases/cultura e o índice mitótico (IM), determinado pela

contagem do número de metáfases em 2000 linfoblastos/cultura (MOORHEAD et al., 1960).

O IM foi calculado usando-se a seguinte fórmula:

IM = 100oslinfoblastde totalNúmero

metáfases de Número×

4.4.9.7 Análise estatística

Para análise estatística do índice mitótico foram utilizados os testes ANOVA e o teste t

de Student para comparar as freqüências de células aberrantes em relação aos controles, no

software Prism® versão 5.0 (Intuitive Software for Science, San Diego, CA, EUA), sendo os

resultados considerados significantes quando p < 0,05.

4.4.10 Viabilidade celular por citometria de fluxo

A viabilidade celular foi avaliada por citometria de fluxo analisando-se a integridade

da membrana plasmática e pela contagem de células com morfologia normal.

4.4.10.1 Análise da integridade de membrana plasmática por citometria de fluxo

4.4.10.1.1 Princípio do teste

As células em apoptose mantêm suas membranas íntegras durante quase todo o

processo até a sua morte, diferentemente daquelas necróticas. Este ensaio se baseia na

capacidade de o iodeto de propídeo (PI), hidrofílico, penetrar apenas nas células cuja

membrana plasmática (MP) esteja rompida e emitir alta fluorescência vermelha somente

quando excitado pelo laser de argônio (488 nm) e estiver ligado ao DNA. As células cuja

membrana permanece íntegra emitem menor fluorescência (DARZYNKIEWICZ et al., 1992).

84

4.4.10.1.2 Procedimento experimental


incubadas por 24 h com a substância RR07 nas concentrações de 0,25; 0,50; 1,00; 2,00 e 4,00

μM. Uma alíquota de 100 µL de suspensão de células tratadas e não tratadas foi incubada com

100 µL de uma solução de PI a 50 µg/mL (diluído em tampão fosfato). Após 5 minutos, as

amostras foram analisadas por citometria de fluxo (EasyCyte, Guava Tecnologies, EUA).

Foram obtidas informações integridade de membrana utilizando-se o filtro para o espectro do

vermelho.

4.4.10.1.3 Análise dos dados

Os dados foram analisados a partir da média ± EPM de um número de experimentos.

Para verificação da ocorrência de diferenças significativas entre os diferentes grupos, os dados

foram comparados por análise de variância (ANOVA) seguida por Teste de Dunnet, com

nível de significância estatística de 95% (p < 0,05) no programa GraphPad Prism versão 5.0

(Intuitive Software for Science, San Diego, CA, EUA).

4.4.11 Analise da morfologia celular por citometria de fluxo


O citômetro de fluxo (EasyCyte, Guava Tecnologies, EUA) é capaz de comparar

populações de células quanto às características de tamanho e de granulosidade (relativo a

organelas, vacúolos etc). A partir desta ferramenta, pode-se delimitar a região (por meio de

um gate) que compreende a população de células normais realizando a contagem da

população de interesse.




4,00 μM. Uma alíquota de 100 µL de suspensão de células tratadas e não tratadas foi incubada

com 100 µL de uma solução de PI a 50 µg/mL (diluído em tampão fosfato). Após 5 minutos,

85

as amostras foram analisadas por citometria de fluxo (EasyCyte, Guava Tecnologies, EUA).

Foram obtidas informações sobre morfologia celular a partir do espalhamento frontal

(tamanho relativo entre as células) e espalhamento lateral (granulosidade relativa entre as

células).


Foi realizada a contagem separada das células que se encontravam dentro do gate

permitindo assim, analisar o efeito do RR07 sobre a redução da concentração de células

normais. Os dados foram analisados a partir da média ± EPM de um número de experimentos.

4.4.12 Avaliação do ciclo celular e fragmentação de DNA por citometria de fluxo.


Esse método consiste na capacidade do iodeto de propídeo se ligar ao DNA de células,

cuja membrana plasmática foi primeiramente lisada por um detergente para permitir a entrada

do corante no núcleo. O ciclo celular é constituído pelas seguintes fases: G1, S, G2 e M.

Durante o período de crescimento celular (fase G1) uma célula diplóide apresenta um

conteúdo 2n (n – conteúdo de um conjunto haplóide de cromossomos) em DNA nuclear, isto

é, possui duas cópias de cada gene. Durante a fase S ocorre a duplicação do genoma nuclear

(2-4n) e na fase seguinte (fase G2) ocorre o segundo período de crescimento celular, durante o

qual o conteúdo em DNA nuclear é mantido no nível 4n. Em seguida ocorre a mitose (fase M,

4n) durante a qual a célula se divide, formando-se duas células filhas, cada uma com um

conteúdo 2n em DNA. As células que não se encontram em divisão celular (G0) apresentam

um conteúdo 2n em DNA. Assim, as diferentes fases do ciclo celular podem ser determinadas

a partir do conteúdo de DNA que elas apresentam.

Quando as células se apresentam com a cromatina condensada e/ou DNA

fragmentado, a quantidade de PI incorporada é menor, e, portanto emitem uma fluorescência

mais baixa (GORMAN et al., 1997).

86




4,00 μM. A doxorrubicina (0,50 μM) foi usada como controle positivo. Uma alíquota de 100

µL de suspensão de células tratadas e não tratadas foi adicionado 100 µL de uma solução de

PI (50 µg/mL) diluído em tampão fosfato, contendo Triton X-100 a 0,2% e citrato de sódio

(0,1%). Após 30 minutos de incubação, no escuro, as amostras foram analisadas por

citometria de fluxo (EasyCyte, Guava Tecnologies, EUA) no filtro vermelho, onde foram

obtidos histogramas representando a quantidade de células em cada fase do ciclo celular (G1,

S e G2/M) e a quantidade de células com DNA fragmentado.


Os histogramas de ciclo celular montados como intensidade de fluorescência vermelha

(eixo x) versus números de células (eixo y) foram analisados no programa ModFit LT 3.1 com

a ferramenta syncronization wizard. Em seguida, de cada experimento realizado foram

contados 5000 eventos. Os dados foram expressos como a média ± EPM de três experimentos

independentes. Para verificação da ocorrência de diferenças significativas entre os diferentes

grupos, os dados serão comparados por análise de variância (ANOVA) seguida por Teste de

Dunnet, com nível de significância estatística de 95% (p < 0,05), no programa GraphPad

Prism versão 5.0 (Intuitive Software for Science, San Diego, CA, EUA).

4.4.13 Determinação do Potencial Transmembrânico de Mitocôndria (ΔΨm) – Ensaio da

rodamina 123


A mitocôndria é responsável pela iniciação da via intrínseca da apoptose. Quando o

Bcl-2/xl desprendem-se da membrana externa da mitocôndria, permitindo a abertura de poros

e a saída de H+ – causando a desestabilização do potencial transmembrânico de mitocôndria

(ΔΨm) – bem como a saída de citocromo c e Smac/DIABLO. O Bcl-2, citocromo c e

Smac/DIABLO livres no citoplasma são sinais para ativação da via intrínseca. A rodamina

123, um corante fluorescente liposolúvel e nucleofílico, é seqüestrada para dentro da

87

mitocôndria quando esta apresenta variação de potencial transmembrânico de mitocôndria

(ΔΨm) inalterado. Assim, as células viáveis emitirão alta fluorescência verde devido à maior

quantidade de rodamina 123 ligada às cargas positivas internas enquanto que as mitocôndrias

com polarização alterada terão menos afinidade pelo corante, gerando eventos que emitirão

menor fluorescência (GORMAN et al., 1997; QIAO; WONG, 2009).




4,00 μM. A uma alíquota de 100 µL de suspensão de células tratadas e não tratadas foi

adicionado 200 µL de uma solução de rodamina 123 diluída na concentração de 1 µg/mL

(diluído em tampão fosfato). Após 15 minutos de incubação, a 37°C no escuro, as amostras

foram lavadas com PBS, reincubadas por 30 minutos e então analisadas por citometria de

fluxo (EasyCyte, Guava Tecnologies, EUA) no filtro verde.


Em cada experimento foram contados 5000 eventos. Os dados foram expressos como

a média ± EPM de três experimentos independentes. Para verificação da ocorrência de

diferenças significativas entre os diferentes grupos, os dados foram comparados por análise de

variância (ANOVA) seguida por Teste de Dunnet, com nível de significância estatística de

95% (p < 0,05), no programa GraphPad Prism versão 5.0 (Intuitive Software for Science, San

Diego, CA, EUA).

4.4.14 Detecção da externalização da fosfatidilserina – Teste da anexina-V


A externalização do fosfolipídeo de membrana, fosfatidilserina é, frequentemente, um

dos primeiros eventos a ocorrer quando a célula entra em apoptose. Este ensaio permite

diferenciar células viáveis, apoptóticas e necróticas pela coloração diferencial por

fluorescência. Neste ensaio, a detecção das células apoptóticas é feita pela ligação da anexina-

V conjugada a PE com a fosfatidilserina externalizada (fluorescência amarela). Células

88

necróticas são coradas pelo corante 7AAD (7-amino-actinomicina), que emitem fluorescência

vermelha, e penetra nas membranas celulares desintegradas e se ligam ao núcleo. Células sem

marcação pelos corantes são viáveis, verdes são consideradas apoptóticas e positivas para os

dois corantes são consideradas necróticas (VERMES et al., 1995; FREIKMAN et al., 2009).



incubadas por 24 horas com a substância RR07 nas concentrações de 1,00; 2,50 e 5,00 μM.

Incubaram-se 135 µL da suspensão de células com 5 µL de 7AAD e 10 µL de Annexin-V-PE

do kit Guavanexin. Após 20 minutos de incubação, em gelo picado e no escuro, as amostras

serão analisadas por citômetria de fluxo (EasyCyte, Guava Tecnologies, EUA) com os filtros

vermelho e amarelo.


Os dados foram analisados a partir da média ± EPM dos experimentos. Para

verificação da ocorrência de diferenças significativas entre os diferentes grupos, os dados

foram comparados por análise de variância (ANOVA) seguida por Teste de Dunnet, com

nível de significância estatística de 95% (p < 0,05) no programa GraphPad Prism versão 5.0

(Intuitive Software for Science, San Diego, CA, EUA).

4.4.15 Detecção da ativação de caspases


As caspases formam uma família de proteases intimamente relacionadas ao processo

de morte por apoptose. As diferentes caspases podem desempenhar suas funções tanto na

ativação quanto na deflagração de todas as vias apoptóticas (WANG et al., 2005).

Para detecção de caspases ativadas serão utilizados os kits Guava® EasyCyte Caspase

3/7 Kit e Guava® EasyCyte Caspase 8 Kit. A realização da detecção se dá pela alta

fluorescência verde emitida, que ocorre na ligação covalente do FLICA™ (Fluorescent-

Labeled Inhibitor of CAspases) que atravessa facilmente a membrana plasmática. As células

em apoptose inicial serão marcadas exclusivamente pelo FLICA. A contra coloração para

89

detecção de células em apoptose tardia e necrose será feita com iodeto de propídeo (PI), o

qual é bastante hidrofílico e só é capaz de se ligar ao DNA das células que tiverem danos na

membrana plasmática emitindo então alta fluorescência vermelha quando excitado pelo laser

argônio (488 nm).



incubadas por 24 horas com a substância RR07 nas concentrações de 1,00; 2,50 e 5,00 μM.

Adicionou-se 10 µL de FLICA 10X às células controle e tratadas sendo incubadas por 1 h a

37°C, 5% de CO2, homogeneizando as amostras a cada 20 minutos. Após a incubação as

células foram lavadas com solução tampão de lavagem e adicionados 150 µL de PI diluído em

ST (75 µL de PI em 15 mL). Foi então realizada a aquisição no citômetro.


Através do programa GraphPad Prism versão 5.0 (Intuitive Software for Science, San

Diego, CA, EUA), os dados foram analisados segundo análise de variância ANOVA seguida

de Dunnet com nível de significância estatística de 95% (p < 0,05) das médias do percentual

dos experimentos realizados em triplicata de células viáveis, em apoptose inicial, apoptose

tardia e necróticas.

4.4.16 Ensaios de inibição da polimerização da tubulina in vitro


A realização deste ensaio está baseada na capacidade de um determinado agente inibir

a polimerização da tubulina, atividade esta que pode ser quantificada por espectrofotometria

em comprimento de onda de 340 nm (WALKER; SALMON; ENDOW, 1990; HYMAN et

al., 1993).

90


Todo o experimento foi realizado sob resfriamento em gelo. Em placa multiwell de 96

poços, foi acrescentando 35 µL da solução Tampão A, contendo 80 mmol/LPIPES (pH 6,8), 1

mmol/L MgCl2 1 mmol/L EDTA. Em seguida, foi adicionado ao tampão 5 µL de uma solução

contendo 10 mg/mL de tubulina de cérebro bovino (com grau de pureza > 99%, TI238,

Cytoskeleton, InC, Denver, CO, EUA) e 5 µL glicerol a 10%. Posteriormente, adicionou-se

10 µL/poço do composto teste RR07 (na concentração de 10 µM). Após a adição das

amostras foi acrescentado à solução tampão A (já plaquada), 5 µL de GTP a 10 mmol. Logo

em seguida a placa já preparada foi então lida em leitor de ELISA a cada minuto durante um

tempo máximo de incubação de 30 minutos. A absorbância usada foi de 340 nm a 32°C.

Utilizou-se como controle positivo o agente citotóxico nocodazole (na concentração de 10

µM), o qual inibe a despolimerização dos microtúbulos in vitro. Foi utilizado também DMSO

(1,6%) como controle negativo e solução tampão sem tubulina como branco.


Através do programa GraphPad Prism versão 5.0 (Intuitive Software for Science, San

Diego, CA, EUA), os dados foram analisados segundo análise de variância ANOVA seguida

de Dunnet com nível de significância estatística de 95% (p < 0,05).

4.4.17 Estudo do potencial antitumoral do composto RR07 em camundongos transplantados

com células tumorais do Sarcoma 180


Este ensaio baseia-se na capacidade de células (Sarcoma 180) adquirirem a forma

sarcomatosa sólida com o desenvolvimento de massa tumoral após inoculação em

camundongos (SCHABEL; GRISWOLD; LASTER, 1977).


A regressão total de tumores nos animais, a redução no crescimento dos tumores

sensíveis ao composto e/ou ao aumento da expectativa de vida durante o tratamento,

91

comparado com os animais não tratados são fatores diretamente relacionados à atividade

antitumoral. Schabel, Griswold e Laster (1977) demonstraram que o melhor resultado desses

fatores depende do procedimento do tratamento, que deverá ser começado até 48 horas após o

transplante. Neste período, as células tumorais já teriam iniciado a formação do nódulo

tumoral. O tumor utilizado foi o Sarcoma 180, o qual foi descoberto em 1914 no “Crocker

Laboratory (Columbia University, New York)”, sendo originalmente um tumor sólido, surgido

espontaneamente na região axilar de camundongos. Foi um tumor inicialmente classificado

como carcinoma mamário. Porém, após vários transplantes subcutâneos, assumiu a forma

sarcomatosa por volta de 1919 e, desde então, mantém-se inalterado até os dias de hoje.

Para averiguar o potencial antitumoral do RR07 foram utilizados camundongos

albinos da espécie Mus musculus Swiss machos adultos e sadios provenientes do Biotério

Central da Universidade Federal do Ceará (BIOCEN – UFC). Esses animais foram divididos

aleatoriamente em 6 grupos (n = 10 para cada grupo) com pesos variando entre 22 e 25 g (p <

0,05).

O modelo tumoral utilizado foi o tumor sólido do tipo Sarcoma 180. As células foram

implantadas na região axilar esquerda da pata dianteira. O animal doador, ou da manutenção,

foi sacrificado por deslocamento cervical, sendo realizado assepsia com álcool iodado. Em

seguida, foi retirado o líquido ascítico da cavidade abdominal e preparado uma suspensão de

células com 5,0 mL de Ringer lactato, 0,2 mL de gentamicina (5 mg/mL) e 0,5 mL do líquido

ascítico, para posterior contagem de células. Nos animais receptores, foram injetadas 2 x 106

células/0,5 mL na região axilar esquerda dos camundongos. Após 24 horas de inoculação, o

tratamento foi iniciado e realizado durante 8 dias consecutivos, utilizando como controle

negativo, o veiculo de diluição (DMSO 10%) e como controles positivos, os quimioterápicos

5-Fluorouracil – 5-FU – (10 mg/kg/dia), Vinblastina – VNB – (7 mg/kg/dia). Para o RR07,

foram estabelecidas as doses de 20 e 40 mg/kg/dia, além de um grupo o qual foi tratado com a

associação entre o quimioterápico 5-FU (10 mg/kg/dia) e o composto teste RR07 (20

mg/kg/dia). Todas as doses foram administradas via intraperitoneal (ip).

Todos os grupos foram mantidos sob as mesmas condições e sob regime de ingestão

ad libitum de ração comercial (Purina, São Paulo) e água clorada durante todo o período do

experimento.

Os animais foram pesados a cada 2 dias e observados quanto ao aparecimento de

qualquer sinal de toxicidade, como diarréia, letargia e convulsões. No final do experimento,

os animais foram sacrificados por deslocamento cervical, sendo seus órgãos (rins, baço,

92

fígado e estômago) e tumores dissecados para avaliação do peso relativo e da atividade

antitumoral, respectivamente.

O percentual de inibição do crescimento tumoral (IT) foi calculado pela fórmula:

IT (%) = [(A-B)/A] x 100

Onde:

A = média dos pesos dos tumores no grupo controle.

B = média dos pesos dos tumores nos animais tratados.


Os resultados (peso relativo dos órgãos e tumores) foram expressos como média ±

EPM. A diferença entre os grupos foi analisada por análise de variância (ANOVA) seguida de

Student Newman Keuls usando o programa GraphPad (Intuitive Software for Science, San

Diego, CA, EUA) e considerada estatisticamente significante quando p < 0,05.

4.4.18 Avaliação histopatológica de órgãos de metabolização e da massa tumoral


Este método está baseado nos princípios de preparo, coloração e fixação de tecidos,

além do auxilio da microscopia óptica para análise do material estudado.


Após o sacrifício e dissecação dos animais, os órgãos e os tumores foram armazenados

em formol 10% para posterior análise macroscópica em relação à cor, tamanho e presença de

focos hemorrágicos.

Posteriormente, os tecidos foram processados, embebidos em parafina e secções de 3-

5 μm de espessura foram preparadas em lâminas. Depois de fixadas em formol 10%,

desparafinizadas em xilol por 15 minutos e desidratadas em álcool em crescentes

concentrações, as lâminas foram lavadas em água destilada, coradas com hematoxilina/eosina,

e examinadas em microscópio óptico (x 400).

93

4.4.18.3 Análise de dados

A análise do material foi realizada pela patologista Profa. Dra. Ana Paula Nunes

Negreiros do Laboratório de Patologia Bucal da UFC. O material foi previamente preparado

foi analisado em microscópio óptico em aumento de 400 vezes.

94

5 RESULTADOS

5.1 Estudo da atividade citotóxica de derivados estilbenóides

5.1.1 Estudo da atividade antiproliferativa em linhagens de células tumorais e células

mononucleares do sangue periférico (PBMC) pelo ensaio do MTT

Os ensaios realizados inicialmente com o resveratrol e compostos com base

estilbenóide (RR01, RR02, RR03, RR04, RR05, RR06, RR07, RR08, RR09, RR10, RR11)

foram realizados em um painel com 12 linhagens tumorais que revelaram o estilbeno

fenstatina, uma 4-metoxifenil-3,4,5-trimetoxifenilmetanona, no presente trabalho denominada

(RR07), com elevado potencial citotóxico cujos valores variaram entre 0,009 a 17,49 μM

entre as linhagens testadas. Vindo em seguida o composto RR11, o qual foi citotóxico apenas

para as linhagens B-16 F10, CEM, Jukart e MDA-MB 435 cujos valores de CI50 foram de

4,31; 8,96; 30,95 e 37,13 µM, respectivamente. O composto RR01 apresentou citotoxicidade

para as linhagens testadas (Jukart, MDA-MB 231 e MX-1) com CI50 de 15,26; 19,24 e 40,48

µM, respectivamente. Já o composto RR03 foi citotóxico para as linhagens (HL-60, Jukart, K-

562 e MDA-MB 435) mostrando CI50 de 26,71; 19,64; 26,55 e 25,30 µM, respectivamente.

Para o composto RR06 observou-se citotoxicidade apenas para as linhagens Jukart e MDA

MB-435 com CI50 de 6,54 e 62,46 µM, respectivamente (Tabelas 6 e 7). As amostras RR02,

RR04, RR05, RR09 e RR10, não apresentaram potencial citotóxico, cujas CI50 foram maiores

do que 104 µM em todas as linhagens testadas. Já o resveratrol, molécula referencia para o

estudo do grupo estilbenóide apresentou citotoxicidade moderada, cuja CI50 foi 10,74 µM

para a linhagem HL-60 e para as demais linhagens foi de 22,52 µM a 62,87 µM.

95

Tabela 6 – Atividade citotóxica de compostos estilbenóides frente às linhagens tumorais.

Células humanas de leucemia (CEM, HL-60, JUKART, K-562), carcinoma de cólon (HCT-8)

e melanoma murino (B-16 e B16-F10). B-16 B-16-F10 CEM HCT-8 HL-60 JUKART K-562 Amostra

CI50 [μg/mL (μM)

Doxorubicina 0,03 (0,05) 0,02 – 0,04

0,04 (0,07) 0,03 – 0,05

0,02 (0,03) 0,01 – 0,02

0,04 (0,07) 0,03 – 0,05

0,02 (0,03) 0,01 – 0,02 NT 0,14 (0,24)

0,09 – 0,23

Resveratrol 14,35 (62,91) 11,97 – 17,21

5,82 (25,51) 5,14 – 6,59

5,91 (25,91) 4,39 – 7,97

5,82 (25,51) 5,14 – 6,59

2,45 (10,74) 1,95 – 3,09 NT 9,62 (42,18)

3,48 – 2,65

RR01 > 25 > 25 > 25 > 25 > 25 4,34 (15,26) 1,49-12,57 > 25

RR02 > 25 > 25 > 25 > 25 > 25 > 25 > 25

RR03 > 25 > 25 > 25 > 25 6,42 (26,71) 5,35 – 7,28

4,72 (19,64) 2,49 – 8,96

6,38 (26,55) 3,13 – 13,01

RR04 > 25 > 25 > 25 > 25 > 25 > 25 > 25 RR05 > 25 > 25 > 25 > 25 > 25 > 25 > 25

RR06 > 25 > 25 > 25 > 25 > 25 1,86 (6,54) 0,71 – 4,87 > 25

Doxorrubicina 0,03 (0,05) 0,02 – 0,04

0,04 (0,07) 0,03 – 0,05

0,02 (0,03) 0,01 – 0,02

0,04 (0,07) 0,03 – 0,05

0,02 (0,03) 0,01 – 0,02 NT 0,14 (0,24)

0,09 – 0,23

Resveratrol 14,35 (62,91) 11,97 – 17,21

5,82 (25,51) 5,14 – 6,59

5,91 (25,91) 4,39 – 7,97

5,82 (25,51) 5,14 – 6,59

2,45 (10,74) 1,95 – 3,09 NT 9,62 (42,18)

3,48 – 2,65

RR07 0,22 (0,72) 0,12 – 0,42

4,06 (0,40) 2,58 – 6,39

0,06 (0,19) 0,04 – 0,08

0,12 (0,40) 0,07 – 0,19

0,04 (0,13) 0,03 – 0,05

0,67 (2,21) 0,55 – 0,08

0,07 (0,26) 0,06 – 0,08

RR09 > 25 NT 14,31 (39,27) 5,52 – 37,03 > 25 > 25 > 25 > 25

RR10 > 25 NT > 25 > 25 > 25 > 25 > 25

RR11 > 25 1,46 (4,31) 0,78 – 2,75

3,05 (8,96) 0,63 – 14,5 > 25 > 25 10,53 (30,95)

7,52 – 14,72 > 25

* Valores de CI50 em μg/mL e (μM) originados de experimentos independentes (n=3) de análogos do resveratrol

obtidos pelo ensaio do MTT em um painel de linhagens celulares após 72 h de incubação. Os dados foram

obtidos por regressão não linear com intervalo de confiança de 95% através do programa GraphPad Prisma

versão 5.0 (Intuitive Software for Science, San Diego, CA, EUA). NT: não testado

96

Tabela 7 – Atividade citotóxica de compostos estilbenóides frente às linhagens tumorais.

Carcinoma de mama (MDA-MB 231, MDA-MB 435, MX-1), carcinoma de próstata (PC-3) e

glioblastoma (SF-295). MDA MB 231 MDA MB 435 MX-1 PC-3 SF-295 Amostra

CI50 [μg/mL (μM)

Doxorrubicina 0,33 (0,38) 0,18 – 0,26

0,48 (0,83) 0,34 – 0,66

0,076 (0,13) 0,17 – 0,24

0,24 (0,41) 0,21 – 0,27

0,23 (0,40) 0,19 – 0,25

Resveratrol NT 13,81 (60,55) 10,44 – 18,25 NT 3,51 (15,39)

2,99 – 2,45 NT

R01RR01 5,47 (19,24) (4,31- 6,95) > 25 11,51 (40,48)

(5,80 – 22,86) > 25 >25

RR02 > 25 > 25 > 25 > 25 >25

RR03 > 25 6,08 (25,30) 2,22 – 16,70 > 25 > 25 >25

RR04 > 25 >25 > 25 > 25 >25 RR05 > 25 >25 > 25 > 25 >25

RR06 > 25 17,76 (62,46) 16,36 – 19,30 > 25 > 25 >25

Doxorrubicina 0,33 (0,38) 0,18 – 0,26

0,48 (0,83) 0,34 – 0,66

0,07 (0,13) 0,17 – 0,24

0,24 (0,41) 0,21 – 0,27

0,23 (0,40) 0,19 – 0,25

Resveratrol NT 13,81 (60,55) 10,44 – 18,25 NT 3,51 (15,39)

2,99 – 2,45 NT

RR07 5,29 (17,49) 2,86 – 9,79

0,06 (0,21) 0,05 – 0,06

0,91 (3,01) 0,40 – 2,05

0,812 (2,68) 0,44 – 1,52

0,003 (0,009) 0,0009 – 0,001

RR09 >25 >25 >25 >25 >25 RR10 >25 >25 >25 >25 >25

RR11 NT 12,63 (37,13) 11,40 – 14,00 NT >25 >25

* Valores de CI50 em μg/mL e (μM) originados de experimentos independentes (n=3) de análogos do resveratrol

obtidos pelo ensaio do MTT em um painel de linhagens celulares após 72 h de incubação. Os dados foram

obtidos por regressão não linear com intervalo de confiança de 95% através do programa GraphPad Prisma

versão 5.0 (Intuitive Software for Science, San Diego, CA, EUA). NT: não testado

5.2 Avaliação da atividade antimitótica – Desenvolvimento embrionário em ovos de

ouriço-do-mar (Lytechinus variegatus)

Após avaliação da citotoxicidade pelo ensaio do MTT, os análogos estilbenóides

foram submetidos ao ensaio de desenvolvimento embrionário em ovos de ouriço do mar, com

o intuito de avaliar a atividade antimitótica.

Foi observado que todos os análogos RR07, RR11 e o resveratrol inibiram de maneira

completa o desenvolvimento embrionário dos ovos de ouriço-do-mar a partir da na primeira

divisão. Assim, os compostos RR07, RR11 e o resveratrol apresentaram atividade

antimitótica, semelhante a doxorrubicina, a partir da 1ª divisão celular, na menor concentração

testada de 33,07 e 27,37 µM para o RR07 e RR11 respectivamente (Tabela 8).

O composto RR10 causou moderada inibição na primeira divisão 44,5 ± 1,6, com a

maior concentração testada 416,23 µM, porém nos estágios posteriores a inibição foi de 100%

± 0 na fase de 3 divisão e 95,4 ± 2 na fase de blástula. Observou-se também que o análogo

97

RR02, RR03 e RR04 induziram total inibição do desenvolvimento nos três estágios

observados, apenas nas respectivas concentrações de 318,18; 416,16 e 409,29 µM. Enquanto

os compostos RR01, RR05, RR06, RR09 não inibiram o processo mitótico nas 1ª e 3ª

divisões, mesmo nas duas concentrações testadas, neste caso, o composto RR06 na

concentração máxima de 369,68 µM inibiu a fase de blástula (Tabela 8).

Tabela 8 – Atividade antimitótica do resveratrol e análogos estilbenóides no desenvolvimento

de ovos de ouriço-do-mar Lytechinus variegatus nos estágios de 1ª divisão, 3ª divisão e

blástula.

Substâncias Concentraçãoμg/mL (μM)

1a DivisãoInibição ±EPM (%)

3a DivisãoInibição ±EPM (%)

Blástula Inibição ± EPM (%)

10 (18,88) 100 ± 0 100 ± 0 100 ± 0 Doxorrubicina 100 (188,84) 100 ± 0 100 ± 0 100 ± 0 10 (35,17) 4,3 ± 1,5 0 ± 0 0,7 ± 0,7 RR01 100 (351,74) 3 ± 2,1 0 ± 0 0,7 ± 0,7 10 (31,18) 0 ± 0 2,3 ± 1,2 5 ± 2,5 RR02 100 (318,18) 100 ± 0 100± 0 100 ± 0 10 (41,61) 0 ± 0 100 ± 0 100 ± 0 RR03 100 (416,16) 100 ± 0 100 ± 0 100 ± 0 10 (40,92) 0 ± 0 6 ± (2,3) 83 ± 5,5 RR04 100 (409,29) 0 ± 0 100 ± 0 100 ± 0 10 (39,32) 0 ± 0 3,6 ± 3,2 0,3 ± 0,3 RR05 100 (393,26) 0 ± 0 9,3 ± 5,5 68,7 ± 3 10 (36,98) 0 ± 0 7,6 ± 3,8 5,3 ± 2,7 RR06 100 (369,98) 0 ± 0 7,3 ± 1,6 99,7 ± 0,3 10 (33,07) 100 ± 0 100 ± 0 100 ± 0 RR07 100 (330,77) 100 ± 0 100 ± 0 100 ± 0 10 (27,14) 2,3 ± 2,3 0,6 ± 0,6 3,7 ± 2,7 RR09 100 (271,42) 1 ± 0,6 1,6 ± 1,6 10,7 ± 6,4 10 (41,62) 12,3 ± 3,6 96,3 ± 1,6 97,3 ± 2,7 RR10 100 (416,23) 44,5 ± 1,6 100 ± 0 95,4 ± 2 10 (29,79) 100 ± 0 100 ± 0 100 ± 0 RR11 100 (293,79) 100 ± 0 100 ± 0 100 ± 0 10 (43,81) 97,9 ± 1,1 100 ± 0 100 ± 0 Resveratrol 100 (438,13) 100 ± 0 100 ± 0 100 ± 0

A tabela apresenta os valores de CI50 e o intervalo de confiança de 95% de dois experimentos independentes

realizados em triplicata para a primeira e terceira divisões e blástula. Dados obtidos por regressão não linear

através do programa GraphPad Prisma 5.0.a, (p < 0,05) comparado entre as substâncias por ANOVA seguido por

Student Newman Keuls.

98

5.3 Avaliação do dano à membrana plasmática – Atividade hemolítica em eritrócitos de

camundongos Mus musculus Swiss

Os estudos realizados para a determinação da atividade hemolítica por meio do dano

em membrana de eritrócitos indicaram que todas as amostras apresentaram CE50 > 200

µg/mL, não tendo apresentado atividade hemolítica na membrana dos eritrócitos (Tabela 9).

Tabela 9 – Avaliação do potencial hemolítico do Resveratrol e outros compostos

estilbenódies.

Substância-Teste EC50 μg/mL (μM) RR 01 (Ácido 3-(3,4-dimetoxifenil)-2-fenil acrílico) > 200 μg/mL (703,4 μM) RR 02 (Ácido 3-(4-acetóxi-3-metoxifenil)-2-fenil acrílico) > 200 μg/mL (636,3 μM) RR 03 (1,2-dimetoxi-4-[(Z)-2-fenil-1-etenil] benzeno) > 200 μg/mL (832,3 μM) RR 04 (1,2-dimetoxi-4-[(E)-2-fenil-1-etenil] benzeno) > 200 μg/mL (818,5 μM) RR 05 (Ácido 3-(3,4-metoxifenil)-2-fenil acrílico) > 200 μg/mL (786,5 μM) RR 06 (Ácido 3-(4-hidróxi-3-metoxifenil)-2-fenil acrílico) > 200 μg/mL (738,9 μM) RR 07 (4-metoxifenil-3,4,5-trimetoxifenilmetanona) – fenstatina > 200 μg/mL (661,5 μM) RR 09 (4-(1,8-dimetóxi-9H-xantenila-9)-2-metoxifenol) > 200 μg/mL (542,8 μM) RR 10 (Ácido 3-(2-hidroxifenil)-2-fenil acrílico) > 200 μg/mL (661,5 μM) RR 11 (9-(4-hidroxi-3-metoxi)-3,4,5,6,7,9-hexahidro-2H-xantene-1,8-diona)

> 200 μg/mL (832,4 μM)

Resveratrol (5-[2-(4-hidroxifenil)-vinil]-benzeno-1,3-diol) > 200 μg/mL (876,2 μM) EC50: concentração efetiva em que a substância-teste causa hemólise em 50% dos eritrócitos).

5.4 Estudo do mecanismo de ação do RR07 em células HL-60 (leucemia promielocítica).

Os compostos RR07 e RR11 foram previamente selecionados para dar continuidade

aos estudos, uma vez que, foram os mais citotóxicos e apresentaram atividade antimitótica no

desenvolvimento embrionário do ouriço do mar na menor concentração testada. Porém, a

disponibilidade de material para teste foi apenas para o RR07, sendo o estudo prosseguido. Os

estudos foram realizados na linhagem HL-60, após 24 h de incubação com as amostras.

99

5.5 Estudo da atividade antiproliferativa do composto RR07 em cultura de células HL-

60 e PBMC com 24 horas de incubação pelo ensaio do MTT

No ensaio de citotoxicidade em células mononucleares do sangue periférico (PBMC) o

composto RR07 mostrou elevada citotoxicidade, com CI50 de 5,68 μM após 24 horas

incubação. Na linhagem tumoral HL-60 a sua CI50 foi de 0,50 μM. Desse modo, na relação

comparativa dos PBMCs com a linhagem tumoral HL-60 (CI50 em PBMCs/CI50 em HL-60)

foi observado uma ação citotóxica da substância de aproximadamente 11 vezes mais ativa

para a linhagem tumoral quando comparada a atividade em PBMCs (Tabela 10).

Tabela 10 – Avaliação citotóxica do composto RR07 na linhagem tumoral estabelecida (HL-

60) e na linhagem normal obtida por cultura primária (PBMC) com 24 horas de incubação.

Linhagem CI50 [μg/mL (μM)]* Amostra HL-60 PBMC

RR07 (4-metoxifenil-3,4,5-trimetoxifenilmetanona) 0,15 (0,49) 0,11 – 0,18

1,77 (5,68) 1,30 – 2,27

Índice de seletividade 11 *A tabela apresenta os valores de CI50 originados de experimentos independentes (n=3) obtidos por regressão

não linear, através do programa GraphPad Prisma versão 5.0, com intervalo de confiança de 95% pelo método

do MTT após 24 horas de exposição. O índice foi calculado tomando como base a linhagem HL-60 (leucemia

promielocítica).

5.6 Estudo de Viabilidade Celular – Exclusão pelo método do Azul de Tripan

O ensaio de viabilidade celular por exclusão do azul de tripan em células HL-60

(leucemia promielocítica) permitiu diferenciar células viáveis (transparente) de células não-

viáveis (azul).

Na análise realizada após as 24 horas de incubação com o composto fenstatina (4-

metoxifenil-3,4,5-trimetoxifenilmetanona) – RR07 foi observada acentuada redução no

percentual de células viáveis correspondente a 26,66 ± 1,45; 20,66 ± 1,66; 16,33 ± 1,66; 12,66

± 1,45 e 8,00 ± 0,57% de acordo com as concentrações testadas de 0,25; 0,50; 1,00; 2,00 e

4,00 μΜ, respectivamente.

Vale ressaltar que, na maior concentração (4,00 μM), o composto RR07 causou 92% de

redução significativa (p < 0,001) no número de células viáveis, sendo indicativo de alto

potencial citotóxico dessa substância (Gráfico 1).

100

C D 0,25 0,50 1,00 2,00 4,000

102030405060708090

100ViáveisNão Viáveis

(μM)RR07

* **

* **

* *** **

Cél

ulas

HL

- 60

(%)

Gráfico 1 – Efeito da viabilidade em células leucêmicas (HL-60). A viabilidade de células leucêmicas foi

determinada por exclusão de azul de tripan após 24 horas de incubação com o RR07. O controle negativo (C) foi

tratado apenas com o veículo utilizado para a diluição da substância (DMSO). O controle positivo, doxorrubicina

0,5 μM (D). Os dados correspondem à média ± EPM de experimentos independentes (n=3). p < 0,001

comparado ao controle por ANOVA seguido pelo teste Student Newman-Keuls.

5.7 Avaliação cinética da atividade antiproliferativa em cultura de células leucêmicas da

linhagem promielicítica HL-60 – exclusão por azul de tripan

A curva de crescimento celular foi usada para determinar a cinética de crescimento de

células leucêmicas (HL-60) sob ação do composto RR07, nos intervalos de tempo de 3 h, 6 h,

12 h, 18 h e 24 h. O composto foi testado em cinco concentrações diferentes de 0,25; 0,50;

1,00; 2,00 e 4,00 µM, as quais induziram uma redução no número de células viáveis, de modo

concentração-dependente.

A partir de 6 horas de tratamento foi observado uma redução número de células

viáveis de 61,5% ± 0,64% e 68,25% ± 1,18% nas concentrações testadas de 2,00 e 4,00 µM

respectivamente.

Enquanto que no período de 12 horas de incubação foi observado uma redução de 54%

(± 0,70%) no número de células viáveis a partir da menor concentração testada 0,25 µM. Já

no período de 24 horas foi detectada diminuição de 56,75% ± 1,10% para 0,25 µM e de

81,5% ± 1,32% para a concentração de 4,00 µM. Os controles positivos doxorrubicina (0,50

µM) e paclitaxel (0,05 µM) em 24 h de incubação, reduziram o numero de células viáveis em

101

63,5% ± 1,19% e 65,5% ± 0,64%, respectivamente, onde foi observada uma redução causada

pelo RR07 significativa em relação ao controle com valor de p<0,05 em 24 horas (Gráfico 2).

Gráfico 2 – Curva cinética de crescimento celular na linhagem HL-60 (leucemia promielocitica humana) tratada com o composto RR07 nas concentrações de 0,25; 0,50; 1,00; 2,00 e 4,00 µM. A viabilidade celular foi determinada por exclusão de azul de tripan nos tempos de 3, 6, 12, 18 e 24 horas de incubação. Os dados correspondem à média ± EPM de três experimentos independentes realizado em duplicata, (*p < 0,001) comparado ao controle por ANOVA seguido pelo teste Student Newman-Keuls. Doxorrubicina (0,50 µM) e Paclitaxel (0,05 µM) foram utilizados como controles positivos

3 horas

C -

DOX 0,5

PTX 0,05

0,2

50,5

01,0

02,0

04,0

00

10

20

30

40

50

60


RR 07

μM

Nº d

e cé

lula

s

6 horas

C -

DOX 0,5

PTX 0,05

0,2

50,5

01,0

02,0

04,0

00

10

20

30

40

50

60


μM

**

RR07

Nº d

e cé

lula

s12 horas

C -

DOX 0,5

PTX 0,05

0,2

50,5

01,0

02,0

04,0

00

10

20

30

40

50

60


μM

* * **

*

Nº d

e cé

lula

s

18 horas

C -

DOX 0,5

PTX 0,05

0,2

50,5

01,0

02,0

04,0

00

10

20

30

40

50

60


μM

** *

**

RR07

Nº d

e cé

lula

s

24 horas

C -

DOX 0,5

PTX 0,05

0,2

50,5

01,0

02,0

04,0

00

10

20

30

40

50

60


μM

* **

**

RR07

Nº d

e cé

lula

s

102

5.8 Análise morfológica – coloração diferencial com hematoxilina/eosina

No ensaio de avaliação da morfologia celular, após 24 horas de tratamento, foi

observado que as células não-tratadas apresentavam núcleos volumosos e homogêneos,

citoplasma com vacúolos pequenos e escuros (Figura 11A). Enquanto nas células tratadas

com a doxorrubicina a 0,50 µM foi identificada uma intensa destruição da membrana

plasmática, caracterizando células em necrose, além de fragmentação nuclear com alguns

núcleos picnóticos (Figura 11B).

Considerando as células tratadas com RR07 (0,25 µM) foi visto condensação

periférica regular da cromatina e fragmentação de DNA, características típicas de apoptose.

Alem disso, pôde-se observar células com inibição da metáfase (Figura 11C). Na

concentração de 0,50 µM foi verificado rompimento de membrana plasmática com liberação

de corpos apoptóticos, fragmentação nuclear e núcleo picnótico (Figura 11D). A análise das

células na concentração de 1,00 µM permitiu mostrar inibição de metáfase, fragmentação de

DNA e a presença predominante de vacuolização do núcleo, sugerindo morte celular por

apoptose, (Figura 11E). De modo menos freqüente, foi visualizado danos em membrana

plasmática e restos celulares, indicando necrose nas células tratadas com 2,00 µM (Figura

11F).

103

Figura 11 – Fotomicrografias das células HL-60 tratadas e não tratadas, após 24 h de incubação com RR07.

Aumento 400X (A,B,C,D e E). Aumento 1000X (F). A, controle negativo; B, doxorrubicina a 0,56 µM; C, D, E

e F, RR07 a 0,25; 0,50 e 1,00 µM respectivamente. Setas: pretas indicam exemplos de fragmentação nuclear;

vermelhas indicam membrana plasmática rompida; azuis indicam exemplos de redução do volume celular;

laranjas indicam blebing; verdes indicam inibição de mitose/presença de cromossomos metafásicos; amarelas

mostram núcleos picnóticos.

A

E

C D

B A

F

104

5.9 Determinação da síntese do DNA: incorporação da bromodeoxiuridina (BrDU)

A incorporação do nucleotídeo BrdU frente as células da linhagem HL-60 (leucemia

promielocítica) foi realizada após 24 horas de incubação com RR07, onde nas concentrações

de 0,25; 0,50 e 1,00 µM ocorreu a incorporação do BrdU correspondentes a 36,5 ± 2,55%;

17,63 ± 2,03% e 12,13 ± 1,49%, respectivamente. A redução foi significativa em todas as

concentrações testadas, com p < 0,001. A doxorrubicina 0,50 µM e o paclitaxel 0,05 µM

incorporaram BrdU em 15,75 ± 0,86 e 12,88 ± 0,85%, respectivamente (Gráfico 3).

C D P 0,25 0,50 1,000

20

40

60

80

100

**

*

* *

R R 0 7

(μ M )

87,50 ± 4,34

15,75 ± 0,8612,88 ± 0,85

36,5 ± 2,55

17,63 ± 2,0512,13 ± 1,49C

élul

as B

rdU

Pos

itiva

s (%

)

Gráfico 3 – Determinação do percentual de síntese do DNA. Foi avaliado pela incorporação de

bromodeoxiuridina (BrdU) nas células HL-60, após 24 h de incubação. O controle negativo (C) foi tratado

apenas com o veículo utilizado para diluição da substância (DMSO 1,6%). Os quimioterápicos doxorrubicina 0,5

μM e paclitaxel 0,05 μM foram utilizados como controle positivo (D e P, respectivamente). Os dados

correspondem à média ± EPM de experimentos independentes (n=2). *p < 0,001 comparado com o controle pela

análise de variância (ANOVA) seguida pelo teste de Student Newman-Keuls.

5.10 Estudos para verificação dos padrões de morte celular

5.10.1 Marcação diferencial por Brometo de Etídio/Laranja de Acridina (BE/LA)

As substâncias testadas, doxorrubicina 0,50 μM (controle positivo) e o RR07 nas

concentrações de 0,25; 0,50; 1,00; 2,00 e 4,00 μM, reduziram o número de células viáveis de

forma concentração dependente, sendo essa diminuição acompanhada pelo aumento de

105

células apoptóticas 57,78 ± 0,88%; 67,67 ± 2,16%, nas duas primeiras concentrações de 0,25

e 0,50 μM, respectivamente. Enquanto nas demais concentrações, foram observadas

diminuições no número de células apoptóticas 53,77 ± 3,85%; 53,00 ± 0,77%; 44,88 ± 0,96%,

correspondentes, respectivamente, às concentrações de 1,00; 2,00 e 4,00 μM, em detrimento

ao aumento no número das células necróticas cujos percentuais foram de 17,55 ± 1,23%;

22,11 ± 2,27%; 36,22 ± 1,49%; 41,22 ± 1,05% e 53,66 ± 0,83% para as respectivas

concentrações de 0,25; 0,50; 1,00; 2,00 e 4,00 μΜ do RR07 (Figura 12 e Gráfico 4).

Foi evidenciado ainda que as células HL-60 tratadas por 24 horas com o composto

RR07, a partir da concentração de 0,25 μΜ, sendo mais intenso na concentração de 0,50 μM,

apresentaram modificações morfológicas como condensação e fragmentação da cromatina,

diminuição do volume celular, sendo estas alterações constatadas por células apresentando

intensidade verde brilhante, característica de apoptose (Figura 12C e 9D).

A coloração alaranjada ou vermelha nas células foi visualizada desde a menor

concentração testada de 0,25 μM até a concentração máxima de 4,00 μM, onde foi visto um

maior número de células em estado de necrose correspondente a 17,55% ± 1,23% a 53,66 ±

0,83%, respectivamente, (*p < 0,001).

106

Figura 12 – Morfologia das células da linhagem promielocítica (HL-60) após 24 h de tratamento, coradas por

laranja de acridina/brometo de etídeo e visualizadas por microscopia de fluorescência. O controle negativo (A)

foi o DMSO (400X). O controle positivo (B) foi a doxorrubicina – 0,50 μM – (100X). Os quadros C, D, E, F, G

e H correspondem ao tratamento com o composto RR07 nas respectivas concentrações de 0,25; 0,50; 1,00; 2,00

e 4,00 μM em aumento de 400X. Setas: Brancas exibem exemplos de células viáveis com integridade nuclear e

de membrana; Amarelas apontam células com e surgimento dos corpos apoptóticos e fragmentação nuclear;

Laranjas indicam exemplos de aumento do volume celular e rompimento da membrana plasmática.

A

E

D

F

G H

C

B

107

C D 0,25 0,50 1,00 2,00 4,000

102030405060708090

100ViáveisApoptoseNecrose

(μM)

RR07

* **

* **

** *

**

**

* ** *

Cél

ulas

(%)

Gráfico 4 – Determinação dos percentuais sobre os eventos celulares (viabilidade celular, apoptose e necrose)

avaliado em linhagem celular HL-60 (leucemia promielocítica). A análise foi realizada após 24 horas de

incubação com o composto RR07 nas concentrações de 0,25; 0,50; 1,00; 2,00 e 4,00 μM. O controle negativo

(C) foi tratado apenas com o veículo utilizado para a diluição da substância (DMS0 1,6%). A doxorrubicina –

0,50 μM – foi utilizada como controle positivo (D). Os dados correspondem à média ± EPM de experimentos

independentes (n=3). *p < 0,001 comparado com o controle por ANOVA seguido por Student Newman-Keuls.

5.11 Avaliação do potencial genotóxico do RR07 em células mononucleadas do sangue

periférico (PBMC)

A avaliação do potencial genotóxico induzido pelo RR07 foi realizada através do teste

do cometa, em PBMCs, após 24 horas de incubação. As concentrações utilizadas neste ensaio

foram baseadas aos valores de CI50 encontrados no ensaio de citotoxicidade pelo MTT em

PBMC, a partir da menor concentração utilizada para a avaliação do potencial citotóxico em

24 horas de incubação (0,25 μM).

Foi observado que até a concentração de 1,00 μM não houve diferenças significativas

em relação ao padrão de migração do DNA quando comparadas ao grupo controle. Somente a

partir da concentração 2,00 μM foi observado um aumento na migração do DNA, de forma

concentração dependente e observou-se ainda a prevalência de cometas 3 e 4 (altos níveis de

dano), sendo característico de citotoxicidade (Gráficos 5 e 6). A analise de dados foi

estatisticamente significativa com *p < 0,05.

108

C 0,25 0,50 1,00 2,00 4,000

25

50

75

10001234

(μM)

RR07

**

Grau de DanoFr

equê

ncia

de

dano

(%)

Gráfico 5 – Freqüência de dano ao DNA. O composto RR07 nas concentrações de 0,25; 0,50; 1,00; 2,00 e 4,00 μM sobre PBMC, analisado pelo teste do cometa após 24 horas de incubação. C: controle negativo. Os dados correspondem à média ± EPM de dois experimentos independentes (*p < 0,05) comparado com o controle negativo por ANOVA seguido pelo teste de Dunnet.

C 0,25 0,50 1,00 2,00 4,000

100

200

300

400

RR07

μM

*

*

Índi

ce d

e da

no

Gráfico 6 – Índice de dano ao DNA. O composto RR07 nas concentrações de 0,25; 0,50; 1,00; 2,00 e 4,00 μM sobre células da linhagem PBMC (A e B), analisado pelo teste do cometa após 24 horas de incubação. C: controle negativo. Os dados correspondem à média ± EPM de dois experimentos independentes (*p < 0,05) comparado com o controle negativo por ANOVA seguido pelo teste de Dunnet.

109

5.12 Análise das aberrações cromossômicas em células mononucleares de sangue

periférico (PBMC) após tratamento com o RR07

As célilas PBMC foram inicialmente tratadas com colchicina (40 μM) e com o

composto teste RR07, nas concentrações de 0,25; 0,50; 1,00; 2,00 e 4,00 μM, sendo

observado que um aumento na concentração levou à diminuição no percentual do índice

mitótico – IM, situação mais evidente para a concentração 4,00 μM, correspondente a 2,8%

no experimento 1 (na presença de colchicina). No experimento 2 (na ausência da colchicina)

em uma mesma concentração foi observado um índice mitótico 0,6% (Tabela 11). As células

que foram tratadas apenas com RR07 (na concentração de 4,00 μM) na ausência de

colchicina, o percentual encontrado para o índice mitótico foi de 0,6; 0,8 e 2,5%,

respectivamente para as fases G1, G1/S e G2 (Tabelas 11, 12 e 13).

Vale salientar que as células, na fase G1, tratadas com o composto RR07 tiveram a

fase do ciclo bloqueada em metáfase, de forma semelhante ao bloqueio realizado pela

colchicina, com intensa condensação em um período de incubação de 52 horas. Foi observada

intensa condensação dos cromossomos em que em alguns casos assemelhou-se à condensação

causada pelo controle positivo – colchicina (Tabela 11 – Experimento 1).

Tabela 11 – Aberrações cromossômicas (ACs) e índice mitótico (IM) em culturas de PBMC

humanos com RR07 na fase G1 (Experimentos 1 e 2) do ciclo celular

ACs Experimento Tratamento (µM) IM (%)Gaps quebras Total

Pol Endo

- 4,6 1 0 1 1 0 0,25 4,0 3 1 4 2 0 0,50 3,8 3 1 4 2 0 1,00 3,0 2 2 4 1 1 2,00 2,9 3 2 5 2 0 4,00 2,8 4 4 8 2 0

Dox 0,5 2,0 4 7 11 3 0

1

- 0,2 0 0 0 0 0 0,25 1,0 3 1 4 0 0 0,50 2,2 4 2 6 0 1 1,00 2,3 3 2 5 2 0 2,00 1,8 2 2 4 0 0 4,00 0,6 3 3 6 1 2

2

Dox 0,5 0 0 0 0 0 0 Pol: Células Poliplóides; Endo: Endoreduplicação; COL: (Controle positivo, 4 µM); DOX: Doxorrubicina

(Controle positivo, 0,50 µM). Experimento 1: RR07 + Colchicina; Experimento 2: RR07 sem colchicina

110

Os experimentos 2, 4 e 6 (Tabelas 11, 12 e 13) mostram que as células tratadas com o

composto teste RR07, na ausência da colchicina, indicavam acúmulo em metáfase, sendo este

efeito mais proeminente na fase G2 (Tabela 13 – Experimento 6). Vale destacar, que foram

observados eventos semelhantes no tocante à condensação dos cromossomos, porém em

menor intensidade e de significância estatística (p < 0,01). Para a análise da fase G2, as células

foram tratadas e incubadas por apenas 3 horas, onde os cromossomos apresentaram

interrupção da mitose (em metáfase) para o RR07, de modo semelhante ao apresentado pela

colchicina, quando no tratamento das células sob as mesmas concentrações.

Tabela 12 – Aberrações cromossômicas (ACs) e índice mitótico (IM) em cultura de PBMC

humanos com RR07 na fase G1/S (Experimentos 3 e 4) do ciclo celular.


Pol Endo

- 4,4 2 0 2 0 0 0,25 4,2 2 0 2 2 0 0,50 4,0 2 1 3 1 1 1,00 3,4 4 2 6 1 1 2,00 3,2 3 2 9 1 0 4,00 3,0 4 3 7 2 1

3

Doxo 0,5 2,5 10 5 15 2 1 - 0,2 0 0 0 0 0

0,25 1,6 1 0 1 1 0 0,50 2,8 1 0 1 0 0 1,00 2,7 1 3 4 1 0 2,00 1,9 2 3 5 0 1 4,00 0,8 1 4 5 1 0

4

Doxo 0,5 0 0 0 0 0 0 Pol: Células poliplóides; Endo: Endoreduplicação; COL: Colchicina (Controle positivo, 4 µM); DOX:

Doxorrubicina (Controle positivo, 0,50 µM). Experimento 3: RR07 + Colchicina; Experimento 4: RR07 sem

colchicina

Para a análise da fase G1/S do ciclo celular, as células foram tratadas em condições

semelhantes as do experimento 1 e 2, porém em um tempo de cultura de apenas 28 horas.

Após análise das células pode-se constatar a repetição do fenômeno (Tabela 12 –

Experimento 3) com o controle negativo – colchicina (40 μM) e sem o controle negativo

(Tabela 12 – Experimento 4), havendo diminuição do tempo de exposição foi observado

menor numero dos cromossomos, facilitando a visualização das mitoses, constatando também

diminuição da citotoxicidade.

111

Tabela 13 – Aberrações cromossômicas (ACs) e índice mitótico (IM) em cultura de PBMC

humanos com RR07 na fase G2/M (Experimentos 5 e 6) do ciclo celular.


Pol Endo

- 5,0 2 0 2 1 0 0,25 4,9 2 1 3 1 0 0,50 4,7 1 1 2 0 0 1,00 4,5 0 1 1 1 1 2,00 4,2 2 2 4 1 0 4,00 4,0 4 4 8 2 0

5

Doxo 0,5 4,0 13 7 20 4 4 - 0,2 0 0 0 0 0

0,25 1,9 2 0 2 0 0 0,50 3,2 2 0 2 0 0 1,00 3,5 1 1 0 0 0 2,00 3,0 1 3 4 0 0 4,00 2,5 5 5 10 0 0

6

Doxo (+) 0 0 0 0 0 0 Pol: Células poliplóides; Endo: Endoreduplicação; COL: Colchicina (Controle positivo, 4 µM) DOX:

Doxorrubicina (Controle positivo, 0,5 μM). Experimento 5: RR07 + Colchicina; Experimento 6: RR07 sem

colchicina

Vale ressaltar o registro de quebras cromatídicas e cromossômicas (parciais e totais –

Experimento 6), indicaram o efeito clastrogênico do RR07 em todos os seis experimentos

realizados. Foi observado ausência de endoduplicação, porém com presença de poliploidia

(Tabela 13).

5.13 Avaliação da integridade de membrana celular por citometria de fluxo em cultura

de células HL-60 tratadas com RR07

A viabilidade celular serviu como parâmetro para avaliar por citometria de fluxo a

integridade da membrana plasmática de células com morfologia normal. Foram observadas

redução da viabilidade das células quando comparadas ao controle negativo (98,26% de

células viáveis) e também ao controle positivo doxorrubicina a 0,50 μM (89,96% células

viáveis).

A viabilidade das células HL-60 tratadas com RR07 foi reduzida de forma não

significativa, sendo a maior redução na concentração de 4,00 μM correspondente a 87,69%

das células viáveis (Gráficos 7 e 8). Apesar de não terem sido observadas alterações no

tocante ao percentual da integridade de membrana, o número total de células viáveis foi

112

sempre reduzido no grupo das células tratadas, isso quando comparadas ao número de células

no controle negativo (Gráfico 9).

C D 0,23 0,49 0,99 1,98 3,960

25

50

75

100

RR07

(μM)

Inte

grid

ade

de m

embr

ana

(%)

Gráfico 7 – Avaliação de integridade de membrana plasmática por citometria de fluxo. Células HL-60 incubadas

com o RR07 nas concentrações de 0,25; 0,50; 1,00; 2,00 e 4,00 μM e com controle doxorrubicina a 0,50 μM. Os

dados foram analisados a partir da média ± EPM de 3 experimentos. Para verificação da ocorrência de diferenças

significativas entre os diferentes grupos, os dados foram comparados por análise de variância (ANOVA) seguida

por Teste de Dunnet, com nível de significância estatística de 95% (p < 0,05) no programa GraphPad Prism

versão 5.0.

113

Gráfico 8 – Integridade da membrana plasmática das células HL-60 após 24 h de incubação. Histogramas do

Plot intensidade de fluorescência vermelha (eixo x) versus número de células (eixo y). A, células não tratadas; B,

doxorrubicina a 0,50 μM; C, D, E, F e G, RR07 nas concentrações de 0,25; 0,50; 1,00; 2,00 e 4,00 μM,

respectivamente. Marcador 1 (esquerda): percentagem de células viáveis. Marcador 2 (direita): percentagem de

células não viáveis. Foram analisados 5 mil eventos por amostra.

G 98,26% 1,74%

89,46%

10,54%

95,39%

4,61%

95,66%

4,34%

A D C B

95,13% 4,87%

94,14% 5,86%

87,69% 12,31%

E F G

114

C D0,2

50,5

01,0

02,0

04,0

00

250000

500000

750000

1000000

1250000

** ** ** ** ** **

RR07

(μM)

Nº d

e cé

lula

s (x

106 )/m

L

Gráfico 9 – Numero de células viáveis analisadas por citometria de fluxo. Incubação com o composto RR07 nas

concentrações de 0,25; 0,50; 1,00; 2,00 e 4,00 µM sobre o número total de células leucêmicas de HL-60,

analisado por citometria de fluxo, utilizando iodeto de propídeo, após 24 horas de incubação. (C) representa o

controle negativo; (D) controle positivo Doxorrubicina (0,50 µM). Os dados foram analisados a partir da média

± EPM de “n” experimentos. Para verificação da ocorrência de diferenças significativas entre os diferentes

grupos, os dados foram comparados por análise de variância (ANOVA) seguida por Teste de Dunnet, com nível

de significância estatística de 95% (*p < 0,05) no programa GraphPad Prism versão 5.0.

5.14 Estudo do ciclo celular e fragmentação nuclear por citometria de fluxo em cultura

de células HL-60 tratadas com RR07

No tratamento com doxorrubicina a 0,50 µM foi observada intensa fragmentação de

DNA (82,69%) sem nenhuma alteração no perfil do ciclo celular. As células tratadas com

RR07 revelaram diminuição significativa no número de células na fase G0/G1 onde todas as

células tratadas apresentaram percentuais baixos em ralação ao controle negativo. Foi

observado que, com o aumento da concentração do composto RR07 ocorria elevação do

numero de células na fase S, porém não foi diferente em relação aos controles. Além disso, foi

visto o pronunciado acúmulo na fase G2/M desde a menor concentração testada de 0,25 µM

com 57,27%. Com o aumento da concentração (0,50; 1,00; 2,00 e 4,00 µM), ocorreu

115

respectivamente, uma diminuição no percentual de células em G2/M correspondente a 51,54;

51,31; 50,54 e 26,32% de células concentradas nesta fase (Tabela 14 e Gráfico 10).

Vale ressaltar, que as análises dos dados apontaram intensa fragmentação do DNA em

todas as concentrações testadas, sendo observado que na menor concentração (0,25 µM) o

índice foi de 59,4%, enquanto nas concentrações subseqüentes (0,50; 1,00 e 2,00 µM) os

percentuais de fragmentação foram, respectivamente, 60,51; 62,22 e 67,08%, comparadas ao

controle negativo.

Porém, a maior concentração testada do composto RR07 (4,00 µM) foi capaz de

aumentar em 60 vezes a fragmentação do DNA celular, apresentando percentual de 67,54%,

quando comparado ao controle negativo (p < 0,05) (Tabela 14 e Gráfico 11).

Tabela 14 – Avaliação do ciclo celular. Efeito do composto RR07 sobre a distribuição do

ciclo celular em células leucêmicas (HL-60) determinado por citometria de fluxo utilizando

iodeto de propideo, após 24 horas de incubação. C: controle negativo; D: Doxorrubicina 0,3

µg/mL (0,50 μM) usada como controle positivo.

Fase do ciclo celular (%) Substâncias Concentração (µM)

G0/G1 S G2/M C - 33,10 57,21 9,69

D 0,50 32,2 65,93 1,87

0,25 9,67* 33,05 57,28* 0,50 10,67* 37,79 51,54* 1,00 9,33* 39,4 51,27* 2,00 7,55* 41,91 50,54*

RR07

4,00 10,47* 63,21 26,32 Os dados correspondem à media ± EPM de três experimentos independentes. Cinco mil eventos foram contados

em cada experimento (*p < 0,05) comparado com o controle negativo por ANOVA seguido pelo teste de

Dunnett.

116

Gráfco 10 – Efeito no ciclo celular após incubação por 24 h com o RR07. Os histogramas de ciclo celular foram

analisados no ModFit LT 3.1. Eixo x: intensidade de fluorescência e eixo y: números de células HL-60,

determinadas por citometria de fluxo utilizando iodeto de propídeo. A – controle negativo; B – Doxorrubicina

(0,50 μM); C, D, E, F e G RR07 nas concentrações de 0,25; 0,50; 1,00; 2,00 e 4,00 μM, respectivamente.

E D

G0/G1 A

Channels (RED-HLin-Red Fluorescence (RED-HLin))0 40 80 120 160

Num

ber

060

120

180

240

S G2/M

Debris Fase G0/G1 Fase G2/M Fase S

Channels (RED-HLin-Ciclo celular (RED-HLin))0 40 80 120 160

Num

ber

020

4060

80

B G0/G1

S G2/M

Debris Fase G0/G1 Fase G2/M Fase S

Channels (RED-HLin-Red Fluorescence (RED-HLin))0 40 80 120 160

Num

ber

020

4060

C

G0/G1

S

G2/M Debris Fase G0/G1 Fase G2/M Fase S


Num

ber

020

4060 G0/G1

S



Num

ber

020

4060

8010

0

G0/G1

S



Num

ber

020

4060

F

G0/G1

S


G


Num

ber

020

4060

80 G0/G1

S


117

C D 0,25 0,50 1,00 2,00 4,000

25

50

75

100

RR07

* * * * **

(μM)

Frag

men

taçã

o do

DN

A (%

)

Gráfico 11 – Determinação da fragmentação do DNA. Efeito do composto RR07 nas concentrações de 0,25;

0,50; 1,00; 2,00 e 4,00 µM sobre a fragmentação do DNA nas células leucêmicas de HL-60, analisado por

citometria de fluxo utilizando iodeto de propídeo, após 24 horas de incubação. (C) representa o controle

negativo; (D) controle positivo Doxorrubicina (0,50 µM). Os dados foram analisados a partir da média ± EPM

de “n” experimentos. Para verificação da ocorrência de diferenças significativas entre os diferentes grupos, os

dados foram comparados por análise de variância (ANOVA) seguida por Teste de Dunnet, com nível de

significância estatística de 95% (*p < 0,05) no programa GraphPad Prism versão 5.0.

5.15 Determinação do potencial transmembrânico de mitocôndria – (ΔΨm)

Ensaio da rodamina 123 – por citometria de fluxo em cultura de células HL-60

tratadas com RR07. Os resultados obtidos demonstraram aumento no percentual de células

com alteração do potencial transmembrânico de mitocôndria (ΔΨm) nas células HL-60

tratadas com o composto RR07 (0,25; 0,50; 1,00; 2,00 e 4,00 µM), sendo estatisticamente

significante nas concentrações de 0,50; 1,00 e 2,00 µM (p < 0,05) (Gráfico 12).

Na menor concentração avaliada (0,25 µM) foi possível observar que 38,61 ± 7,53%

das células apresentavam despolarização na membrana mitocondrial, enquanto no controle

negativo o índice foi de apenas 7,83%. Na concentração de 0,50 µM foi constatado o máximo

de despolarização correspondente a 53,18 ± 19,46% (p < 0,01), seguido de uma diminuição

118

do percentual destas células, onde na maior concentração 4,00 µM o percentual observado foi

de 31,32 ± 13,03% (* p < 0,05; **p < 0,01) (Gráfico 12).

C D 0,25 0,50 1,00 2,00 4,000

25

50

75

100

RR07

*** *

(μM)% d

e cé

lula

s de

spol

ariz

adas

Gráfico 12 – Análise da variação do potencial transmembrânico da mitocôndria (ΔΨm) por citometria de fluxo

em células HL-60. Após 24 h de incubação do RR07 nas concentrações de 0,25; 0,50; 1,00; 2,00 e 4,00 μM. A

doxorrubicina a 0,50 μM foi utilizada como controle positivo. Os dados foram comparados por análise de

variância (ANOVA) seguida por Teste de Dunnet, com nível de significância estatística de 95% (* p < 0,05; **p

< 0,01) no programa GraphPad Prism versão 5.0.

5.16 Detecção da externalização da fosfatidilserina por citometria de fluxo – Anexina V

Após o tratamento das células HL-60 com o composto RR07 nas concentrações de

1,00; 2,50 e 5,00 μM, foi observado à indução da externalização de fosfatidilserina de forma

concentração dependente, porém de modo não significativo segundo a análise estatística

realizada com os resultados adquiridos. Na maior concentração (5,00 µM) o percentual de

células em apoptose inicial foi de 10,05% (Gráfico 13).

119

Gráfico 13 – Análise da externalização da fosfatidilserina por citometria de fluxo em células HL-60. Controle

negativo (A) e tratadas com doxorrubicina 0,50 µΜ – controle positivo (B) e RR07 nas concentrações de 1,00;

2,50 e 5,00 μM (respectivamente C, D e E) com 24 h de incubação. Percentagem de células em: Verde –

quadrante inferior esquerdo – viáveis; Azul – quadrante inferior direito – apoptose inicial; Róseo – quadrante

superior direito – apoptose tardia; e Lilás – quadrante superior esquerdo – necrose. Os dados foram comparados

por análise de variância (ANOVA) seguida por Teste de Dunnet, (*p < 0,05; **p < 0,01) no programa GraphPad

Prism versão 5.0.

5.17 Detecção da ativação de caspases 3, 7 e 8 por citometria de fluxo.

As células (HL-60) foram incubadas por 24 horas com a substância RR07 nas

concentrações de 1,00; 2,50 e 5,00 μM.

O RR07 reduziu o número de células viáveis de maneira concentração dependente,

sendo significativo (*p < 0,01), em todas as concentrações testadas de 1,00; 2,50 e 5,00 μM,

enquanto aumentou o percentual de células em estágio de apoptose inicial nas concentrações

de 2,50 e 5,00 µM, indicando ativação para das caspases 3 e 7 (Gráficos 14 e 15).

Pode-se constatar também aumento do percentual de células em apoptose tardia na

concentração de 5,00 µM, correspondente a 29,97% (Gráficos 14 e 15) nos dois ensaios das

caspases. Entretanto, foi observado apenas no ensaio da caspase 8 um aumento do percentual

C

88,81% 6,31%

0,98% 3,89%

90,86% 6,87%

1,83% 0,43%

A

90,08% 5,91%

0,76% 3,23%

D E

84,87% 10,05%

0,77% 4,30%

71,46% 20,12%

7,04% 1,37%

B

* *

120

de 7,61; 9,68 e 12,72% de células em necrose nas três concentrações testadas 1,00; 2,50 e

5,00 µM.

Gráfico 14 – Análise da detecção da ativação de caspases efetoras 3 e 7 por citometria de fluxo em células HL-

60. (A) percentual de células viáveis. (B) percentual de células em apoptose inicial. (C) percentual de células em

apoptose tardia. (D) percentual de células em necrose. A doxorrubicina (D) 0,5 µΜ foi utilizada como controle

positivo. O composto RR07 foi testado nas concentrações de 1,25; 2,5 e 5,0 μM com 24 h de incubação. Os

dados foram comparados por análise de variância (ANOVA) seguida por teste de Dunnet com (*p < 0,05 e **p <

0,01) utilizado o programa GraphPad Prims versão 5.0.

30 ± 9,2 %

45,4 ± 0,0%

66,4 ± 6,7% 69,5 ± 3,2%

CDox

1,25 2,5 5,0

0

25

50

75

100

*

RR07

% d

e cé

lula

s em

nec

rose

CDox

1,25 2,5 5,0

0

25

50

75

100

RR07

*

% d

e cé

lula

s em

apo

ptos

e ta

rdia

CDox

1,25 2,5 5,0

0

25

50

75

100

* *

*

RR07

% d

e cé

lula

s vi

ávei

s

CDox

1,25 2,5 5,0

0

25

50

75

100

** *

RR07%

de

célu

las

em a

popt

ose

inic

ial

D

BA

C

7,7 ± 1,9%

9,7 ± 0,8%

8,3 ± 2,7%

A B

C D

121

Gráfico 15 – Análise da detecção da ativação de caspase iniciadora 8 por citometria de fluxo em células HL-60.

(A) percentual de células viáveis. (B) percentual de células em apoptose inicial. (C) percentual de células em

apoptose tardia. (D) percentual de células em necrose. A doxorrubicina (D) 0,5 µΜ foi utilizada como controle

positivo. O composto RR07 foi testado nas concentrações de 1,25; 2,5 e 5,0 μM com 24 h de incubação. Os

dados foram comparados por análise de variância (ANOVA) seguida por teste de Dunnet com (*p < 0,05 e **p <

0,01) utilizado o programa GraphPad Prims versão 5.0.

CDox

1,25 2,5 5,0

0

25

50

75

100

* **

RR07

% d

e cé

lula

s vi

ávei

s

CDox

1,25 2,5 5,0

0

25

50

75

100

RR07

*

% d

e cé

lula

s em

apo

ptos

e in

icia

l

CDox

1,25 2,5 5,0

0

25

50

75

100

RR07

*

% d

e cé

lula

s em

apo

ptos

e ta

rdia

CDox

1,25 2,5 5,0

0

25

50

75

100

*

RR07

% d

e cé

lula

s em

nec

rose

C D

B A

22,0 ± 7,0%

7,7 ± 1,2%

57,0 ± 6,3% 73,5 ± 0,8% 69,1 ± 4,4%

8,3 ± 2,6%

A

D C

B

122

5.18 Ensaio de inibição da polimerização da tubulina in vitro.

Neste ensaio realizado com tubulina isolada a fenstatina (RR07) na concentração de 10

µM foi capaz de inibir a polimerização da tubulina de forma muito semelhante ao controle

positivo nocodazole, que é uma droga já consagrada como um agente despolimerizante de

microtúbulos devido a ligação com o dímero α-β da tubulina.

Desta forma, o RR07 apresentou-se como um potente inibidor da polimerização da

tubulina (Gráfico 16).

0 2 4 6 8 10 12 14 16 18 20 22 24 26 28 300.20

0.25

0.30

0.35

0.40

0.45

0.50

0.55

TAMPAO DMSO N 10 RR07 10

Tempo (min)

Den

sida

de ó

ptic

a (3

40nm

)

Gráfico 16 – Ensaio de inibição de polimerizção da tubulina in vitro. Linha pontilhada verde – Branco

representado pelo tampão. Linha pontilhada laranja (o controle negavito representado pelo DMSO). Linha

pontilhada em vermelho (controle positivo Nocodazole – 10 µM). Linhas em azul (RR07 10 µM).

5.19 Estudo da atividade antitumoral do composto RR07 em camundongos transplantados

com Sarcoma 180

Na análise dos grupos, após a realização do ensaio, foi observado que o composto teste

RR07 nas doses de 20 e 40 mg/kg/dia foi capaz de diminuir o crescimento da massa tumoral

em 30,9 ± 6,99 g (1,54 ± 0,16 g) e 48,19 ± 2,57 g (1,16 ± 0,06 g) respectivamente, sendo

considerado significativo (b,c,d, p < 0,05) quando comparado ao controle negativo (DMSO

10%) (2,23 ± 0,14 g) (Tabela 15).

123

Tabela 15 – Avaliação do efeito sobre o peso relativo dos tumores e percentual de inibição

tumoral em camundongos (Mus musculus Swiss) transplantados com Sarcoma 180.

Tratamento Dose (mg/kg/dia)

Ganho de pesocorporal (g) Tumor (g) Inibição

tumoral (%)C - 6,63± 0,10 2,23 ± 0,14 -

5-FU 20 5,20± 0,68c,d 1,11 ± 0,03a 50,36 ± 1,18 VBN 7 -1,70 ± 0,76a,b 0,81 ± 0,23a 63,86 ± 10,1 PTX 5 -2,60 ± 0,81a,b 1,02 ± 0,18a 54,27 ± 8,00 RR07 20 9,20 ± 1,39b,c,d 1,54 ± 0,16a 30,90 ± 6,99 RR07 40 7,29 ± 0,52c,d 1,16 ± 0,06a 48,19 ± 2,57

RR07 + 5-FU 20 + 10 5,56 ± 0,80c,d 0,99 ± 0,06a,b 55,68 ± 2,72 Nota: Os dados estão apresentados como média ± EPM de dez animais. a, quando comparado com o grupo

controle (DMSO 10%); b, quando comparado somente com o grupo 5-fluorouracil (5-FU); c, quando comparado

somente com o grupo vinblastina (VNB), d, quando comparado somente com o grupo paclitaxel (PTX) por

ANOVA seguido de Student-Newman-Keuls. a, b, c e d (p < 0,05).

Nos animais tratados tanto com 5-FU (20 mg/kg/dia) como com a vinblastina (7

mg/kg/dia) ocorreu uma redução no volume do crescimento do tumor correspondente a 1,11 ±

0,03 g e 0,81 ± 0,23 g, cujos percentuais de inibição foram de 50,36 ± 1,18% e 63,86 ±

10,1%, respectivamente (a,b,c,d, p < 0,05). Já o outro controle positivo, utilizado nesta etapa

do trabalho, paclitaxel (5 mg/kg/dia) propiciou a redução da massa tumoral referente a 1,02 ±

0,18 g, onde o percentual de inibição foi de 54,27 ± 8,00% (a, p < 0,05).

Além disso, a associação entre RR07 (20 mg/kg/dia) e o quimioterápico 5-FU (10

mg/kg/dia), revelou redução significativa (a, p < 0,05) da massa tumoral (0,99 ± 9,3 g) cuja

inibição foi de 55,98%, comparado ao controle negativo – DMSO 10% (Tabela 15).

5.20 Análise histopatológica dos órgãos de camundongos Mus musculus Swiss tratados

com RR07

Após o tratamento dos animais, de acordo com os grupos anteriormente citados, os

órgãos foram retirados e pesados, onde após análise, o peso relativo úmido mostrou diferença

estatisticamente significante, a (p < 0,05). Em relação ao baço dos grupos tratados com RR07

nas doses de 20 e 40 mg/kg/dia intraperitoneal (ip) houve redução de peso (0,79 ± 0,09 e 0,81

± 0,08 g, respectivamente para 20 e 40 mg/kg/dia) em relação ao controle negativo – DMSO

10% (0,93 ±0,10 g), porém a redução com significância ocorreu somente quanto ao peso dos

baços dos animais tratados com os controles positivos 5-FU (0,58 ± 0,10 g); vinblastina (0,38

± 0,06 g) e paclitaxel (0,34 ± 0,02 g) nas respectivas doses de 20; 7 e 5 mg/kg/dia (ip).

124

Quando analisada massa corpórea dos animais ao final do experimento foi observado

relativo ganho de peso dos grupos RR07 nas doses de 20 (9,20 ± 1,39 g), 40 mg/kg/dia (7,29

± 0,52 g) (ip) e associado RR07 20 + 5-FU 10 mg/kg/dia (5,56 ± 0,80 g) (ip), sendo

considerado significativo, b, c e d (p < 0,05) após análise estatística. Por outro lado, os

animais relacionados aos grupos dos controles positivos vinblastina e paclitaxel nas

respectivas doses de 7 e 5 mg/kg/dia (ip) revelaram diminuição significativa (p < 0,05) da

massa corpórea quando comparado ao grupo controle e os outros grupos (-1,70 ± 0,76 g) e (-

2,60 ± 0,81 g), respectivamente, para a vinblastina e paclitaxel 7 e 5 mg/kg/dia (Tabela 16).

Tabela 16 – Efeito do RR07 sobre o peso relativo dos órgãos e tumores de camundongos

(Mus musculus Swiss) transplantados com Sarcoma 180. Os animais foram sacrificados após

7 dias de tratamento com RR07 nas doses de 20 e 40 mg/kg/dia; associação entre RR07 20

mg/kg/dia com o quimioterápico 5-fluorouracil (5-FU) 20 mg/kg/dia. O controle negativo foi

tratado com o veículo de diluição da substância (DMSO 10%). Foram utilizados como

controles positivos os quimioterápicos: 5-fluororuracil (5-FU); vinblastina (VBN) e paclitaxel

(PTX) nas respectivas doses de 20, 7 e 5 mg/kg/dia

Fígado Baço Rins Tratamento Dose (mg/kg/dia)

Ganho de pesocorporal (g) g/100g de massa copórea

Tumor

C - 6,63± 0,10 5,63 ± 0,18 0,93 ±0,10 1,28 ± 0,05 2,23 ± 0,14 5-FU 20 5,20± 0,68 4,77 ± 0,04 0,58 ± 0,10a 1,23 ± 0,06 1,10 ± 0,03a VBN 7 -1,70 ± 0,76a,b 4,66 ± 0,33 0,38 ± 0,06a 1,16 ± 0,04 0,81 ± 0,23a PTX 5 -2,60 ± 0,81a,b 5,29 ± 0,14 0,34 ± 0,02a 1,19 ± 0,07 1,02 ± 0,18a RR07 20 9,20 ± 1,39b,c,d 5,87 ± 0,39 0,79 ± 0,09 1,24 ± 0,08 1,54 ± 0,16a RR07 40 7,29 ± 0,52c,d 5,56 ± 0,54 0,81 ± 0,08 1,14 ± 0,12 1,16 ± 0,06a RR07

+ 5-FU 20 + 10 5,56 ± 0,80c,d 5,39 ± 0,38 0,69 ± 0,07 1,27 ± 0,06 0,99 ± 0,06a,b,c

Nota: Os dados estão apresentados como média ± EPM de dez animais. a, quando comparado com o grupo

controle (DMSO 10%); b, quando comparado somente com o grupo 5-fluorouracil (5-FU); c, quando comparado

somente com o grupo vinblastina (VNB), d, quando comparado somente com o grupo paclitaxel (PTX) por

ANOVA seguido de Student-Newman-Keuls. a, b, c e d (p < 0,05).

Na análise histológica dos órgãos para o grupo controle negativo (DMSO 10%), os

fígados estudados mostraram-se escurecidos e elásticos macroscopicamente, enquanto a

análise microscópica indicou tumefação turva dos hepatócitos, congestão portal e da veia

centrolobular. Os rins dos animais do grupo controle negativo mostraram-se homogêneo e

pardo acinzentados por análise macroscópica, enquanto o estudo microscópico apontou

tumefação turva do epitélio tubular, presença de cilindros hialinos, com glomérulos

preservados. A avaliação macroscópica dos baços denunciou aumento de volume, sem

125

alterações visíveis, enquanto na análise microscópica foram visualizados folículos linfóides

evidentes e definidos, com presença de megacariócitos distribuídos ao longo das amostras.

Além disso, a análise macroscópica da massa tumoral dos animais do controle negativo

(DMSO 10%) revelou-se em tamanho homogêneo, com material ligeiramente rosado,

enquanto a análise microscópica mostrou neoplasia maligna constituída por células poligonais

e fusiformes, com pleomorfismo celular e nuclear, mitoses típicas e atípicas, além de células

tumorais gigantes, com invasão muscular e áreas de necrose de coagulação (Figuras 13A,

14A, 15A e 16A).

Os animais tratados com o controle positivo 5-FU (20 mg/kg/dia) apresentaram

fígados macroscopicamente escurecidos com áreas de necrose coagulativa, enquanto a

microscopia mostrou intensa tumefação turva de hepatócitos e congestão portal e da veia

centrolobular. Sendo observada ainda por análise microscópica, a presença de

hemossiderófagos por entre os sinusóides, hiperplasia das células de Kupffer e focos de

esteatose microvesicular. Os baços dos animais desse grupo apresentaram-se pequenos,

enquanto a microscopia revelou a presença de folículos linfóides pequenos e circunscritos,

ampla polpa vermelha, hemossiderófagos, pigmentos de hemossiderina, raríssimos

megacariócitos. Enquanto os rins apresentaram-se brancacentos e pequenos na análise

macroscópica. Na microscopia do conteúdo renal foi observada intensa tumefação turva do

epitélio tubular, seguida de hemorragia glomerular e tubular. A análise macroscópica dos

tumores do grupo controle positivo 5-FU (20 mg/kg/dia) mostrou material em tamanho

reduzido, enquanto a microscopia apontou para presença de neoplasia maligna constituída por

células poligonais rarefeitas, pleomórficas, com anisocariose e áreas de necrose de coagulação

(Figuras 13B, 14B, 15B e 16B).

Um segundo controle positivo (Paclitaxel 5 mg/kg/dia) foi utilizado onde a análise

macroscópica do tecido hepático indicou coloração cinza-amarelada dos fígados em análise

macroscópica, enquanto a microscopia indicou desorganização dos cordões de hepatócitos,

esteatose microvesicular, apresentando ainda, necrose focal de hepatócitos, fragmentação

nuclear, congestão portal e da veia centrolobular com hemorragia sinusoidal. As alterações

nos rins, baço e massa tumoral foram semelhantes às encontradas no grupo controle 5-FU –

20 mg/kg/dia – (Figuras 13C, 14C, 15C e 16C).

A utilização de um segundo controle positivo (Vinblastina 7 mg/kg/dia) possibilitou a

verificação microscópica de alterações hepáticas importantes como: congestão portal e da veia

centrolobular, hiperplasia das células de Kupffer, intensa tumefação celular de hepatócitos,

degeneração hidrópica de hepatócitos, diversos focos inflamatórios, além da visualização de

126

algumas células de metástase tumoral. A avaliação microscópica do tecido renal, em um dos

fragemtos analisados, apresentou glomérulos preservados, discreta e moderada tumefação do

epitélio tubular (túbulos proximais e distais) e também a presença de cilindros hialinos

dispersos. Em relação à avaliação microscópica da ação do quimioterápico sobre o baço

foram observados a presença de folículos linfóides circunscritos e evidentes, limites de polpa

branca e de vermelha nítidos, ninhos de megacariócitos. Além disso, a pesquisa microscópica

da massa tumoral revelou neoplasia maligna composta por células poligonais exibindo

pleomorfismo celular e nuclear, hipercromatismo, presença de células gigantes malignas,

mitoses típicas e atípicas, extensas áreas de necrose de coagulação, invasão muscular

(Figuras 13D, 14D, 15D e 16D).

O tratamento dos animais com o composto teste RR07 permitiu avaliar alterações

ocorridas no tecido de metabolização hepático, onde na dose de 20 mg/kg/dia a macroscopia

apresentou órgãos escurecidos com aspecto semelhante ao controle, enquanto a microscopia

mostrou intensa degeneração hidrópica dos hepatócitos, congestão portal e da veia

centrolobular, hemorragia sinusoidal, pigmentos de hemossiderina, desorganização dos

cordões de hepatócitos, semelhante ao controle positivo com vinblastina (7 mg/kg/dia) e

paclitaxel (5 mg/kg/dia) algumas células com fragmentação nuclear. Na dose de 40

mg/kg/dia, o composto RR07 possibilitou a constatação de eventos como: congestão portal e

da veia centrolobular, hiperplasia das células de Kupffer, focos inflamatórios, intensa

tumefação celular de hepatócitos, pigmentos armazenados e grosseiros, provavelmente

consistentes com bilirrubina, alterações semelhantes ao controle positivo paclitaxel – 5

mg/kg/dia – (Figuras 13E, 14E, 15E e 16E e F).

Ao se analisar os tecidos relacionados com a excreção, neste caso os rins, observou-se

que o composto RR07 apresentou alterações microscópicas semelhantes tanto na dose de 20

como na dose de 40 mg/kg/dia, tais alterações evidenciadas foram intensa tumefação turva do

epitélio tubular, presença de muitos cilindros hialinos, glomérulos preservados, porém, alguns

glomérulos com rarefação celular, hemorragia glomerular e tubular, enquanto as

características macroscópicas foram semelhantes aos rins analisados no grupo controle. As

alterações no tecido esplênico causadas pelo RR07 tanto na dose de 20 como 40 mg/kg/dia

mostram alterações microscópicas semelhantes como: presença de folículos linfóides

definidos e circunscritos, raros megacariócitos distribuídos ao longo da amostra em ninhos,

pigmentos de hemossiderina, e evidente limite entra as polpas branca e vermelha.

Macroscopicamente, os baços mostraram-se aumentados em volume, semelhante ao controle.

Quanto a análise do conteúdo tumoral pode-se verificar que o composto RR07 testado nas

127

doses de 20 e 40 mg/kg/dia causaram decréscimo no tamanho da massa tumoral, quando

analisado macroscopicamente, enquanto a análise microscópica indicou que em ambas as

doses de 20 e 40 mg/kg/dia as células tumorais não mostraram alterações em sua morfologia,

porém na amostra havia extensas áreas de necrose de coagulação (Figuras 13E, 14E, 15E e

16E e F).

Outro grupo avaliado foi a associação entre 5-FU na dose de 10 mg/kg/dia com o

composto teste RR07 na dose de 20 mg/kg/dia, onde a análise do órgão de metabolização,

possibilitou visualizar alterações como: discreta congestão portal e da veia centrolobular,

hiperplasia das células de Kupffer, intensa tumefação celular de hepatócitos, esteatose

microvesicular, células inflamatórias de permeio, semelhante às alterações encontradas no

grupo tratado apenas com o 5-FU 20 mg/kg/dia. Já na análise dos rins, foram observadas

características como: glomérulos preservados, discreta tumefação do epitélio tubular (túbulos

proximais e distais), presença de diversos cilindros hialinos, semelhante ao observado com o

grupo tratado com o controle positivo vinblastina (7 mg/kg/dia). Avaliando a ação do

associação das substâncias sobre o baço foi possível constatar a presença de folículos

linfóides circunscritos e evidentes, ninhos de megacariócitos, pigmentos de hemossiderina,

semelhante às alterações encontradas nos grupos tratados com o composto RR07 na dose de

40 mg/kg/dia. Além disso, a análise do conteúdo tumoral indicou alterações semelhantes à

detectada quando no tratamento com o quimioterápico já consagrado, paclitaxel (5 mg/kg/dia)

e o composto teste RR07 nas duas doses testadas 20 e 40 mg/kg/dia (Figuras 13G, 14G, 15G

e 16G).

128

Figura 13 – Análise histológica dos fígados de camundongos Mus musculus Swiss transplantados com Sarcoma

180. Os animais foram sacrificados após 7 dias de tratamento por via intraperitoneal (ip). (A) Controle negativo

(DMSO 10%); (B) Controle positivo 5-fluorouracil (5-FU 20 mg/kg/dia); (C) Controle positivo paclitaxel (PTX

5 mg/kg/dia); (D) Controle positivo vinblastina (VNB 7 mg/kg/dia); (E) RR07 20 mg/kg/dia; (F) RR07 40

mg/kg/dia; (G) Associação entre RR07 20 mg/kg/dia + 5-FU 20 mg/kg/dia. Coloração realizada com

hematoxilina/eosina e análise em microscopia óptica com aumento de 400X

5 FU 20

Esteatose microvesicular

Hiperplasia das células de Kupffer

B

Tumeração celular

PTX 5

Esteatose microvesicular

Fragmentação nuclear

Desorganização dos cordões de hepatócitos

C

VNB 7

Necrose focal

D

RR07 20

Degeneração hidrópica

E

DMSO 10%

Congestão portal

A

Congestão da VCL

RR07 40


Hemossiderófagos

F


Associado

Estreatose microvesicular

G

129

Figura 14 – Análise histológica dos rins de camundongos Mus musculus Swiss transplantados com Sarcoma





hematoxilina/eosina e análise em microscopia óptica com aumento de 400X

VNB 7

D

DMSO 10%

Cilindro hialino

A

5 FU 20

Hemorragia

Tumefação celular

B

PXT 5

Tumefação turva

C

RR07 20

Tumefação turva

E

RR07 40

Cilindro hialino

F

Tumefação celular

Cilindro hialino

Associado

G

130

Figura 15 – Análise histológica dos baços de camundongos Mus musculus Swiss transplantados com Sarcoma





hematoxilina/eosina e análise em microscopia óptica com aumento de 400X (A, C e D) 100X (B, E. F e G)

Megacariócitos

DMSO 10%

A

5 FU 20

Polpa vermelha

B

PTX 5

Pigmentos de hemossiderina

C

Megacariócitos

VNB 7

D

Megacariócitos

Associado

G

RR07 40

Megacariócitos

F Polpa branca

Polpa vermelha

RR 07 20

E

131

Figura 16 – Análise histológica dos tumores de camundongos Mus musculus Swiss transplantados com Sarcoma





hematoxilina/eosina e análise em microscopia óptica com aumento de 400X.

5 FU 20

Rarefação celular

B

N d

DMSO 10%

A

RR07 20

Necrose de coagulação

E F

RR07 40

Necrose

Células normais

Mitose

PTX 5

C

Necrose celular

Necrose

VNB 7

Invasão Muscular

D

Necrose

Mitose

Associado

G

132

5.21 Resumo dos resultados encontrados

O estudo realizado com 10 análogos estilbenóides e o resveratrol possibilitou avaliar a

atividade citotóxica e antitumoral, onde mereceu destaque o composto fenstatina (4

metoxifenil-3,4,5-trimetoxifenilmetanona) – RR07

• O análogo RR07 apresentou maior citotoxicidade dentre os compostos para 12

linhagens tumorais testadas apresentando com valore mínimo de 0,01 µM.

• O composto RR07 foi um dos compostos que apresentou maior potencial

antimitótico em ovos de ouriço-do-mar Lytechinus variegatus, inibindo 100% da

divisão celular na 1ª e 2ª divisões, bem como no estágio de blástula.

• A citotoxicidade observada pelo análogo RR07 não está relacionada com dano à

membrana plasmática, visto que o composto não induziu hemólise em eritrócitos

de camundongos em concentração até 661,5 µM.

• A ação citotóxica exibida pelo RR07 foi cerca de onze (11) vezes maior para a

linhagem de células leucêmicas HL-60 quando comparado a atividade sobre

células mononucleadas do sangue periférico.

• O RR07 causou inibição de 36,5 ± 2,55% na síntese de DNA e de 57,78 ± 0,88%

morte celular por apoptose em células HL-60, quando testado na menor

concentração (0,25 µM) nos ensaios do BrDU e da acridina laranja/brometo de

etídio, respectivamente.

• O composto RR07 causou bloqueio de mitótico na fase de metáfase em células

HL-60, podendo também ser observado um acúmulo de células na fase G2 do ciclo

celular, alteração do potencial transmembrânico da mitocôndria avaliados através

de citometria de fluxo.

• Observou-se indução de apoptose em células HL-60 relacionada com a via

intrínseca principalmente (caspases efetoras 3 e 7) com 8,3 ± 2,6% de ativação,

bem como envolvimento da via extrínseca caspase 8 (ativadora).

• O RR07 mostrou um padrão de atividade semelhante ao descrito para outros

compostos relacionados os quais também possuem um anel benzeno trimetoxilado

(colchicina e combretastatina) que se sabe inibirem a mitose ligando-se a tubulina.

• O RR07 tem um perfil de atividade distinto do resveratrol, e parece atuar

semelhantemente as combrestatinas, compostos inibidores da divisão celular que

agem ligando-se as tubulinas.

133

• No ensaio de tubulina isolada in vitro, o estilbenóide RR07, na concentração de 10

µM, inibiu a polimerização da tubulina.

• O composto RR07 foi capaz de inibir 48,19 ± 2,57% do crescimento tumoral em

modelo de Sarcoma 180, na dose de 40 mg/kg.

Em um panorama mais abrangente, os resultados explandos anteriormente forma

condensados na Tabela 17.

Tabela 17 – Resumo dos resultados encontrados no estudo do potencial antitumoral da

fenstatina (4-metoxifenil-3,4,5-trimetoxifenilmetanona) – RR07

Estudo Resultados Atividade citotóxica

Em células tumorais +++ Em células normais (PBMCs) +++

Estudo do mecanismo de ação citotóxico Inibição da síntese de DNA +++ Morfologia diferencial por Laranja de acridina/Brometo de etídeo (LA/BE) Apoptose/Necrose Morfologia diferencial por Hematoxilina/Eosina (HE) Inibição em MetáfaseIntegridade de membrana - Análise do ciclo celular Parada em G2/M Indução de fragmentação do DNA +++ Potencial trasmembrânico de mitocôndria + Indução de caspases 3, 7 e 8 ++ Inibição da polimerização de microtúbulos +++

Genotoxicidade Estudo de aberração em PBMC +++

Atividade antitumoral Antitumoral em Sarcoma 180 +++ Toxicidade em órgãos e sistemas ++

(-) Sem efeito relevante; (+) Efeito Fraco; (++) Efeito Moderado; (+++) Efeito Forte.

134

6 DISCUSSÃO

Nos últimos anos a aplicação da quimioterapia tem conseguido êxitos notáveis na cura

de algumas formas de cânceres disseminados como a leucemia aguda infantil, distintos tipos

de linfomas, e alguns tipos de tumores sólidos. Ao contrário, a melhora no tratamento

sistêmico de tumores sólidos mais freqüentes em adultos (pulmão, mama cólon e pâncreas)

não sofreu grandes avanços, resultando em altos índices de mortalidade dentre os pacientes.

Há, portanto, uma clara e urgente necessidade de identificar, avaliar e desenvolver novos e

mais eficientes fármacos para o tratamento do câncer (LENZ, 2003; PETIT et al., 2008).

Dessa forma, o atual interesse na busca de novos agentes antimitóticos, por exemplo, é

conseqüência de sua importância para o tratamento de diferentes formas de tumores malignos.

Todo o sucesso na utilização de taxanos e dos alcalóides da vinca na terapia anticâncer tem

estimulado intensamente a busca por novos agentes com potencial antimitótico (RISINGER et

al., 2009). Outros compostos têm sido estudados por interromper a divisão celular sendo

efetivo no tratamento de tumores a exemplo da podofilotoxina, resveratrol e combretastatina,

as quais foram inicialmente obtidas por fontes naturais (PINNEY et al., 2005). Derivados

estilbenos a exemplo de microcomponentes como o resveratrol (3,4,5-trihidroxi-trans-

estilbeno) e combretastatina exibem uma gama de atividades biológicas incluindo

antineoplásico, quimiopreventivo, antioxidante e antiestrogênico (AGGARWAL et al., 2004).

A combretastatina A4 é o mais potente agente antimitótico isolado da Combretum

caffirum. O gênero do Combretum possui 250 espécies originadas das árvores tropicais.

Algumas dessas 24 espécies do gênero Combretum são bem conhecidas na medicina popular

da África, sendo usada para problemas cardíacos, tratamento de verrugas, doenças mentais e

envenenamento por escorpião (PINNEY et al., 2005; TY et al., 2009). Vale lembrar que

somente na índia a espécie Combretum latifolium parece ter sido usada na medicina popular

para o tratamento do câncer (PINNEY et al., 2005).

O resveratrol e um composto polifenólico produzido por várias espécies e encontrado

especialmente nas raízes e sementes de uma planta medicinal oriental chamada Polygonum

cupsidatum (kojo-kon), e na casca das uvas como metabólito secundário, para defesa

antifúngica. Além disso, está presente no vinho tinto, o qual tem sido documentado com

efeitos cardioprotetor e quimiopreventivo do câncer (BAUR; SINCLAIR, 2006); Muitos

desses efeitos fisiológicos decorrem da sua supressão na proliferação celular via inibição de

caminhos importantes na transdução do sinal e quinase ciclina dependente, promovendo a

diferenciação celular e a retirada de espécies reativas de oxigênio (ROS) intracelular e todas

135

essas respostas podem levar a indução de apoptose através da ativação mitocondrial

dependente e independente (PERVAIZ, 2004; CHEN et al.,2005).

Há mais de 30 anos atrás o Instituto Nacional do Câncer dos Estados Unidos vem

explorando largamente o screening da atividade anticâncer utilizando plantas terrestres dentre

elas tem sido identificadas à potencialidade anticâncer do Combretatum molle e Combretatum

caffirum (YEUNG et al., 2007). Os estudos foram iniciados em 1973 levando a identificação

da Combretastatina na C. caffirum, originaria do continente africano. Esses estudos

avançaram a partir de 1979 no qual foram isolados outros constituintes da C. caffirum, dentre

eles podem ser citados: estilbenos, bibenzil, dihidrofenentrenos e fenantrenos (PINNEY et al.,

2005). Essa descoberta levou ao isolamento e caracterização do (-) combretastatina a qual

apresentou potente inibição do crescimento celular em bioensaios de linhagens de

astrocitomas. Atualmente a combretastatina sódica A4 fosfatase vem sendo estudadas em

ensaios clínicos para o tratamento do câncer (LIN et al., 2007).

A combretastatina tem se destacado por apresentar uma estrutura quimicamente

simples, pela sua elevada atividade biológica como inibidor da polimerização da tubulina,

bem como um inibidor in vitro em linhagens celulares humanas, além de apresentar eficácia

in vitro como agente antiangiogênico (KIRWAN et al., 2004; MOUSSET et al., 2008). Desse

modo, pesquisas vêm sendo realizadas no desenvolvimento de novos análogos, inspirados na

combretastatina e no resveratrol, os quais vêm gerando publicações de patentes. As

combretastatinas A1 e A4 apresentam baixa solubilidade, o que levou a um impulso para o

desenvolvimento de novos compostos sintéticos, a partir da combretastatina, a qual está

dividida em 4 grupos majoritários de base estrutural dentre eles destacam-se: o da série A

(cis-estilbenos), série B (diariletileno), série C (quinona) e série D (lactonas macrocíticas)

(PINNEY et al., 2005).

É apropriado enfatizar que o potencial do resveratrol e da combretastatina tem sido

largamente estudado (LI et al., 2009), porém é importante contribuir no estudo para a

determinação da atividade biológica de novos análogos.

Esse trabalho estudou a atividade biológica dos análogos estilbenóides baseados no

resveratrol a exemplo dos: RR01, RR02, RR03, RR04, RR05, RR06, RR09, RR10, RR11 e o

análogo da combretastatina, à fenstatina, neste estudo denominado de RR07. A primeira etapa

do presente estudo consistiu na avaliação do potencial citotóxico dos análogos estilbenóides

baseados no resveratrol e na combretastatina, o RR07 foi testado em 11 linhagens de células

tumorais humanas, 2 murinas e em PBMCs humanas, através do método do MTT. Em

seguida foram realizados estudos para avaliar a atividade antimitótica em ovos de ouriço do

136

mar (Lytotechinuns variegatus), seguida pela investigação de atividade hemolítica buscando

caracterizar o mecanismo citotóxico direto sobre a membrana plasmática das células. Em

seguida, foi investigado o potencial mutagênico através dos ensaios do cometa e aberrações

cromossômicas. Posteriormente, com o intuito de elucidar o mecanismo de ação e a atividade

antitumoral in vivo, o composto mais ativo foi submetido a ensaios de citometria de fluxo para

caracterização da morte celular, bem como, avaliação do ciclo celular, ensaio de inibição da

polimerização da tubulina e determinação da atividade antitumoral em modelo de Sarcoma

180.

Há algum tempo, estudos de “screening” utilizando o ensaio do MTT tem sido uma

ferramenta essencial e eficaz para avaliar o potencial citotóxico de inúmeras substâncias

(POHLIT et al., 2007; MESQUITA et al., 2009). A determinação da citotoxicidade in vitro

tem se mostrado eficaz na descoberta de novos agentes antitumorais. A maneira mais rápida,

fácil e sensível é o screening com modelos in vitro (CRAGG; NEWMANN, 2000, FOUCHE

et al., 2008). Os testes em linhagens celulares humanas in vitro foram escolhidos, pois,

segundo VENDITI (1983), os ensaios com células leucêmicas murinas in vivo apresentavam

muitas vezes resultados falso-negativos para atividade antitumoral de novos compostos.

Enquanto que os mesmos compostos quando testados em células tumorais humanas

apresentavam resultados positivos na inibição da formação de colônias, esta constatação

sugeriu que o screening usando células tumorais humanas in vitro era preferencial no

desenvolvimento de novas drogas antitumorais (SHOEMAKER et al., 1984). Pelo fato dos

modelos celulares para o estudo da toxicidade serem mais econômicos, rápidos e fornecerem

resultados mais facilmente quantificáveis e com maior reprodutibilidade que os in vivo, o

interesse por inovações neste campo aumenta tanto quanto as necessidades das limitações já

existentes (FORNELLI et al., 2004).

No ensaio de citotoxicidade em diferentes linhagens de células tumorais humanas e

murina foram testados 12 diferentes análogos estilbenóides e o resveratrol. O resveratrol

inibiu a proliferação em todas as linhagens testadas com CI50 variando entre 10,74 para HL-60

e 2,91 µM em células B-16. Esses achados corroboram com muitos estudos previamente

realizados que demonstram o potencial do resveratrol como potente agente quimioterápico em

decorrência da sua ação na indução da apoptose (DORRIE et al., 2003; KANG et al., 2003;

MURIAS et al., 2005). Estudos prévios realizados por MURIAS e colaboradores em 2005,

usando a linhagem de células leucêmicas HL-60 obtiveram um valor de CI50 para o

resveratrol de aproximadamente 10 µM, possuindo a mesma magnitude dos achados obtidos

nesse trabalho.

137

Dentre os análogos estudados no presente estudo, os compostos RR03 e RR06

apresentaram moderada citotoxicidade. O composto RR06 inibiu a proliferação da linhagem

MDA-MB-435 e a Jukart com CI50 correspondente a 62,46 e 6,54 µM, enquanto composto

RR03 foi ativo nas linhagens HL-60, K-562 e MDA-MB-435, com valores de CI50 em 26,71;

26,55 e 25,30 µM, respectivamente. Essa moderada atividade segundo KANG e

colaboradores (2003), decorre da formação de dímeros e trímeros do resveratrol. Além disso,

CAI e colaboradores (2003), descreveram que os grupos 3,4-dihidroxil são importantes para

elevar a atividade anticâncer dos análogos de trans-resveratrol, confirmando as pesquisas de

MURIAS e colaboradores em 2005, demonstrando que a hidroxilação do resveratrol nas

posições 3,4’ e 5 eleva a atividade citotóxica em células HL-60 superior a ação observada

com o resveratrol. Essa afirmação reforça a não atividade citotóxica encontrada em nossas

moléculas.

Entretanto, vários grupos de pesquisa descrevem a importância da inserção dos grupos

de metoxil na estrutura do resveratrol, como observado no trans-3,4,5,4’-tetrametoxiestilbeno,

os quais elevam os efeitos de antiproliferativos em várias linhagens celulares e interferem na

polimerização dos microtúbulos (MA et al., 2008; LI et al., 2009). É importante ressaltar que

a adição do grupo hidroxil no anel B parece diminuir a atividade citotóxica do resveratrol e da

combretastatina A4, levando a uma fraca atividade citotóxica.

Dos estilbenóides avaliados a fenstatina foi o mais citotóxico, por apresentar CI50

menor que 18 µM em todas as linhagens testadas. Essa molécula pertence ao grupo da série

(A) das combretastatinas, sendo caracterizada como uma bisarilcetona que apresenta

esqueleto básico estilbenóide, em que o anel A (3,4,5–trimetoxifenil) é responsável por

algumas ações biológicas como: elevada citotoxicidade e atividade antiangiogência (WU et

al., 2007). Além disso, o anel B presente nas moléculas de fenstatinas e combretastatinas

possui uma hidroxila na posição 3 que quando substituída, por grupamentos como o anel 2

naftil promove variações na atividade e propicia a formação de compostos mais potentes sob a

ação citotóxica (PETTIT et al., 2002; ALVAREZ et al., 2007; 2008).

A fim de reforçar os resultados citotóxicos obtidos anteriormente, foi realizado o teste

do ouriço-do-mar, o qual é amplamente utilizado no estudo de drogas com efeitos citotóxicos

e teratogênicos (JACOBS; WILSON, 1986). Os ovos de ouriço apresentam extrema

sensibilidade a agentes tóxicos e uma série de peculiaridades no seu ciclo de

desenvolvimento, tornando-o bastante elucidativo no estudo de drogas com potencial

antiproliferativo. A inibição da divisão celular pode estar relacionada a vários eventos

envolvidos nesse processo, como a síntese de DNA e RNA, síntese protéica e polimerização

138

de microtúbulos. No ensaio dos ovos do ouriço-do-mar, esses processos podem, muitas vezes,

ser analisados individualmente (BRANDHORST, 1985; FUSETANI, 1987). O ciclo celular

das células embrionárias de ouriço-do-mar é bastante abreviado. É destituído da fase G1, que

antecede a fase S e a fase G2 encontra-se bastante reduzida. Desta maneira, drogas que atuam

durante a fase G1 não apresentam atividades neste bioensaio.

O resveratrol e o RR07 inibiram o desenvolvimento dos ovos de ouriço a partir de 43,8

µM e 33 µM respectivamente (Tabela 8), desde o primeiro estágio de divisão, demonstrando

que esse efeito é inespecífico, pois poderá ser devido a interação com DNA ou a síntese de

proteínas, bem como interferindo na formação do fuso mitótico. Por outro lado, os compostos

RR03 e RR04 na concentração ao redor de 40 µM inibiram o desenvolvimento dos ovos de

ouriço do mar a partir da terceira divisão celular. Desse modo, de acordo com JACOBS et al.,

(1981), se uma substância pura promove 100% de inibição neste ensaio na concentração de 16

µg/mL ou menos, esta pode ser considerada muito ativa. Assim a fenstatina e o resveratrol

podem ser considerados muito ativos, pois, inibiram completamente a mitose dos ovos em

concentração aproximada de 40 µM, o que reforça os resultados obtidos na citotoxicidade

com as linhagens celulares. Assim, a inespecificidade da atividade antimitótica da fenstatina

sugere que compostos com capacidade de inibir a mitose, a partir da primeira clivagem,

podem atuar interferindo na polimerização dos microfilamentos e induzindo o aparecimento

de embriões unicelulares polinucleados (FUSETANI, 1987).

A fim de verificar se a citotoxicidade às células tumorais estava envolvida com a lise

da membrana plasmática, foi realizado o ensaio de atividade hemolítica com eritrócitos de

camundongos, os quais possuem grande semelhança com os eritrócitos humanos,

principalmente quanto à sensibilidade (COSTA-LOTUFO et al., 2002; DRESCH et al.,

2005). Além disso, a estabilidade mecânica característica da membrana eritrocitária confere a

este método um ótimo indicador para averiguar agressões in vitro, sendo uma das etapas para

o screening de compostos citotóxicos (SHARMA; SHARMA, 2001).

A ausência de atividade hemolítica foi observada para todas as moléculas

estilbenóides testadas, na concentração máxima de até 876,2 µM, sugerindo possivelmente

que o mecanismo de atividade citotóxica desempenhado por estas substâncias, não esteja

relacionado à indução de dano a nível de membrana plasmática, mais sim devido a possível

interferência com o mecanismos intracelulares como interferência na molécula DNA, na

formação do fuso mitótico ou atuando em proteínas envolvidas no ciclo celular.

Dentre os vários problemas que podem ser identificados com o uso de fármacos

quimioterápicos, os efeitos colaterais se destacam, por conta da baixa seletividade encontrada

139

nestes compostos. Assim, células com elevado índice proliferativo como células presentes em

mucosas (trato gastrintestinal – TGI), epiteliais, células da medula óssea, incluindo células do

sistema hematopoiético como eritrócitos, trombócitos e células da linhagem branca (PBMC),

são afetadas durante o tratamento com os quimioterápicos, sendo considerado um desfio para

a terapêutica encontrar um composto capaz preservar as células saudáveis eliminando

preferencialmente as células tumorais (ANAZETTI et al., 2003).

Buscando demonstrar uma possível seletividade do RR07 para células saudáveis ou

tumorais, pelo ensaio do MTT, observou-se elevada citotoxicidade do composto frente a

linhagem tumoral leucêmica (HL-60) apresentando CI50 de 0,50 µM, enquanto para o mesmo

ensaio com PBMC, a CI50 foi de 5,68 µM que em análise comparativa não indicou

seletividade, apenas a linhagem HL-60 mostrou-se 11 vezes mais sensível que as células

PBMC.

A utilização de várias metodologias tendo como foco os modelos celulares é

considerada ferramenta de grande valia e importantes para estudos de toxicidade de

compostos, sendo a linhagem HL-60 (leucemia humana), de origem mielóide, uma das mais

amplamente utilizadas para o estudo de indução de apoptose, diferenciação e ciclo celular,

caracterizada pela predominância de neutrófilos promielocíticos, apresentando relação

núcleo/citoplasma assincrônica, com 10% de diferenciação espontânea para o estágio

monocítico, caracterizado por atividade quimiotática e fagocitária (GALLAGHER et al.,

1979; COLLINS, 1987a; MILITÃO et al., 2006; BEZERRA et al., 2007).

Com o intuito de confirmar e entender melhor os efeitos antiproliferativos

desencadeados pelo RR07 observados pelo ensaio do MTT, outros testes antiproliferativos,

foram realizados utilizando células leucêmicas da linhagem HL-60 em 24 horas de incubação,

onde observação da diminuição da proliferação celular, confirmou-se pela avaliação da

cinética de crescimento celular (em HL-60), teste de exclusão do azul de tripan, aliado ao

ensaio de inibição da síntese de DNA através da incorporação do BrdU, além da análise

morfológica com hematoxilina/eosina (HE) e laranja de acridina/brometo de etídeo (LA/BE).

A avaliação do perfil da curva de crescimento traduziu uma redução induzida pelo

RR07 sobre a proliferação da linhagem HL-60, corroborando com os resultados obtidos pelo

ensaio do MTT, sendo observado que a partir das 6 horas nas duas maiores concentrações

2,00 e 4,00 µM ocorre diminuição no número de células, porém é no período de 12 horas de

tratamento que pode ser vista redução acentuada no número total de células em todas as

concentrações testadas.

140

O teste de exclusão do azul de tripan foi realizado inicialmente para determinar a

viabilidade celular, tendo os resultados sido confirmados posteriormente por citometria de

fluxo. O ensaio permitiu distinguir as células capazes de drenar o corante ácido azul de tripan

para fora da célula em contraposição àquelas que não possuem essa capacidade. A absorção

desse corante é um forte indicativo de dano na membrana plasmática que culmina na morte

celular (HYNES et al., 2003; MINERVINI et al., 2004). O estilbeno RR07 reduziu o

percentual de células viáveis de maneira concentração-dependente, correspondente a uma

redução máxima de 92,00 ± 0,43% para a concentração de máxima testada de 4,00 μΜ

respectivamente, reforçando os estudos prévios de citotoxicidade por MTT após 24 h de

incubação, cuja CI50 foi de 0,50 µM. BOEHLE e colaboradores (2001) mostraram que o a

combretastatina A4, um estilbenóide de estrutura semelhante ao RR07, reduziu em 59% a

viabilidade de células KNS-62 (carcinoma e pulmão) na concentração de 0,01 µM em 24

horas de incubação.

Após a confirmação da citotoxicidade pelo MTT e posterior verificação de indícios de

atividade antiproliferativa através do ensaio de exclusão pelo azul de tripan e também a

análise da curva de crescimento outros modelos foram utilizados com o intuito de esclarecer

esta atividade.

O modelo proposto para investigação acerca do mecanismo de ação do RR07, foi

avaliação do efeito antiproliferativo através da incorporação do BrdU na síntese do DNA. A

incorporação da bromodeoxiuridina (BrdU), um análogo da timidina, em DNA recém

sintetizado, pode ser mensurada com o intuito de avaliar a taxa de proliferação por meio do

percentual de células que incorporam o BrdU (DOLBEARE et al., 1983). Na cinética celular,

o ciclo das células em proliferação apresenta-se nas fases G1, S, G2 e M, enquanto na fase G0

refere-se às células quiescentes ou não proliferantes (RAZA et al., 1991; MOGILNER et al.,

2006). As células presentes na fase S, de síntese, estão sintetizando novo material genético e,

portanto, utilizando os nucleotídeos presentes no meio (HOLM et al., 1998; SCHOLEY,

2003). Estas células obrigatoriamente irão incorporar BrdU em seu DNA que, por sua vez,

pode ser detectado com o uso de anticorpos conjugados anti-BrdU e técnicas de imuno-

histoquímica para sua marcação.

A incorporação do nucleotídeo BrdU pelas células da linhagem HL-60 foi inibida pelo

tratamento com o RR07, na menor concentração de 0,25 µM em 63,5 (± 2,55%). Nas

concentrações de 0,50 e 1,00 µM, respectivamente, ocorreu inibição na incorporação do BrdU

de 84,25 ± 0,86 e 87,12 ± 0,85%, respectivamente. Do total de 300 células contadas foi

observada redução na incorporação do BrdU, estando o resultado de acordo com os achados

141

obtidos com os ensaios do MTT e de viabilidade celular pela exclusão do azul de tripan.

Valendo salientar que concentrações acima de 1,00 µM não puderam ser aplicadas neste

ensaio, devido a alta citotoxicidade do RR07. Desta forma, esses dados são indicativos de um

possível mecanismo sobre a divisão celular. De forma semelhante, a combretastatina A4,

estilbeno de estrutura análoga ao RR07, inibiu a proliferação celular sendo possível visualizar

este achado pelo ensaio do BrdU (CHIANG et al., 2009).

Os dados obtidos até essa etapa da pesquisa conduziram os estudos para ensaios onde

as colorações do tipo hematoxilina-eosina e também, a coloração diferencial de laranja de

acridina e brometo de etídio (LA/BE), que permitem investigar as características morfológicas

das células, assim estas são úteis para sugerir o tipo de morte celular, seja por necrose ou

apoptose.

A análise citológica, em células da linhagem HL-60, revelou condensação periférica

regular da cromatina e fragmentação de DNA, com presença de vacuolização características

típicas de células em morte por apoptose. O bloqueio do ciclo celular em metáfase foi

observada desde a menor concentração testada de 0,50 µM. O efeito do RR07, desencadeado

sobre as células foi semelhante à ação descrita para o alcalóide colchicina (MUELLER et al.,

1979; ZHOU et al., 2005b; TERKELTAUB; ROBERT, 2008). Outros compostos

estilbenóides como a combretastatina A4 atuam inibindo a divisão celular com parada em

metáfase (BOEHLE et al., 2001).

A morte celular é um fenômeno essencial na homeostase do organismo e sua

ocorrência tem sido documentada durante o desenvolvimento embrionário e pós-embrionário.

Esta não é apenas importante para o desenvolvimento normal, mas também para a vida adulta

de muitos organismos vivos (GERCHENSON; ROTELLO, 1992; ELMORE, 2007). Dois

processos distintos comandam a morte celular, nomeados apoptose e necrose (MAJNO;

JORIS, 1995).

Apoptose é termo inicialmente utilizado por KERR (1972) para caracterizar alterações

morfológicas incluindo condensação da cromatina, expulsão de vesículas, fragmentação

nucelar e formação de corpos apoptóticos (FINK; COOKSON, 2005). As vias de sinalização

responsáveis pela iniciação e progressão da apoptose foram identificados, onde de maneira

geral, ocorrem através da ativação de uma família de enzimas de pelo menos 14 proteases

diferentes chamadas de caspases. As cisteíno-proteases também denominadas caspases são

sintetizadas como precursores inativos chamados procaspases (FULDA; DEBATIN, 2006). A

clivagem e ativação das procaspases podem ocorrer devido a uma série de estimulações

142

incluindo ativação de receptores de morte e danos no DNA (HERR; DEBATIN, 2001;

STRASSER et al., 2000; JOZA et al., 2002).

O evento apotótico é importante durante o desenvolvimento embrionário,

metamorfose, atrofia dependente de hormônio e inibição tumoral, seja regulando o número de

células ou eliminando células danificadas. O processo de apoptose induz a morte celular de

forma altamente regulada que elimina células ou tecidos indesejados protegendo o organismo

contra a formação de neoplasmas. Desarranjos no mecanismo apoptótico podem ocasionar

diversas patologias, inclusive o câncer (MAJNO; JORIS, 1995; OPALKA et al., 2002).

As duas principais vias do processo apoptótico são a via extrínseca, que é uma via

mediada por receptores de morte, tipo TNFr-1(receptor de fator de necrose tumoral do tipo 1)

e Fas (CD95), tendo como principal iniciadora a caspase-8 (GUPTA, 2003). E a via

intrínseca, a qual e desencadeada pelo aumento da permeabilidade mitocondrial, com

liberação de moléculas pró-apoptóticas (Mcl-1S, Bad e Bax) e citocromo c no citoplasma,

ativando a caspase-9, responsável pela iniciação desta via (STRASSER et al., 2000;

PAPADOPOULOS, 2006).

A morte celular por necrose pode ocorrer no desenvolvimento de várias doenças

incluindo câncer, doenças neurodegenerativas e doenças autoimune (FULDA; PERVAIZ,

2009). Esta pode ser causada por estímulos tóxicos, bem como depleção de O2 e stress

oxidativo (EDINGER; THOMPSON, 2004). Em contraste à apoptose, a morte por necrose é,

freqüentemente, atribuída simplesmente a perturbações metabólicas ou injúrias mecânicas,

resultando em uma rápida desestabilização da membrana plasmática, desnaturação das

proteínas intracelulares, digestão enzimática, catástrofe bioenergética por depleção de ATP a

níveis incompatíveis com a sobrevivência, sendo relacionada com a resposta inflamatória.

Muitos estímulos indutores de apoptose (por exemplo: citocinas, isquemia, calor, irradiação

e patógenos) fazem com que células da mesma população morram por necrose

(DARZYNKIEWICZ et al., 1992; SERGEY et al., 2003; KUMAR et al., 2005).

As avaliações morfológicas realizadas pelo ensaio da LA/BE mostraram que após o

tratamento com o RR07 (fenstatina), nas concentrações de 0,25 e 0,50 µM evidenciou-se

aumento na população de células apoptóticas com 57,78 ± 0,88%; 67,67 ± 2,16%, onde as

células apresentavam cromatina condensada, fragmentada e de um verde brilhante intenso

quando excitadas por luz azul (BRIGGS; JONES, 2005). Vale ressaltar que o achado de

células em apoptose condiz com os resultados obtidos por JIANG e colaboradores (2008),

ocasião em que o autor demonstra a indução de apoptose causada por alguns estilbenóides,

dentre eles a fenstatina.

143

Foi visto que com o aumento da concentração do RR07 (1,00; 2,00 e 4,00 µM)

ocorreu redução no número de células em apoptose com aumento de células necróticas,

chegando a 53,66% (± 0,83%), para a maior concentração testada (4,00 µM). As células em

necrose, ou seja, com lesão de membrana, apresentaram um padrão de coloração uniforme,

laranja-avermelhada e sem formação de corpos apoptóticos. Provavelmente, a ocorrência

desse fato, possa ser explicada devido às membranas plasmáticas permanecem intactas

durante as fases iniciais do fenômeno apoptótico, até os últimos estágios, quando ocorre então

aumento da permeabilidade da membrana aos solutos normalmente retidos (KUMAR et al.,

2005).

Os achados que evidenciaram sinais de necrose nas células foram detectados também

nos testes de exclusão por azul de tripan, que mostrou maior porcentagem de células não

viáveis, sendo confirmado também pelo ensaio de coloração por H/E.

Como a apoptose pode ser induzida também a partir de lesões no DNA, o passo

seguinte na pesquisa foi avaliar a ação genotóxica do RR07 através do teste do cometa, além

disso, verificar o potencial mutagênico do composto através dos ensaios de aberração

cromossômica.

O teste do cometa tem sido muito utilizado na avaliação da segurança de novos

fármacos (HARTMANN et al., 2003), visto que é considerado um método com sensibilidade

adequada no tocante à detecção da quebra de fitas simples ou dupla do DNA (GONTIJO;

TICE, 2003). Apesar da existência de uma gama de metodologias in vitro aplicadas à

determinação da toxicidade genética, o uso de células PBMC, obtidas do sangue periférico

como células-modelo para avaliar a genotoxicidade deve-se principalmente à revelação de tais

células como indicadores sensíveis aos agentes genotóxicos, pois há correlação entre os danos

induzidos nas células periféricas do sistema hematopoiético (sangue) e outras células

somáticas, além de apresentarem uma vida considerada relativamente longa, circularem por

todos os tecidos e serem de fácil obtenção (ALBERTINI et al., 2000).

O ensaio do cometa mostrou que o RR07 induziu dano em células PBMC de forma

concentração dependente, onde nas maiores concentrações, foram detectados os maiores graus

de dano ao DNA. A avaliação genotóxica do RR07 correlaciona-se aos dados obtidos pela

análise de outros estilbenos como a combretastatina A-4, ocasião em que PETIT e

colaboradores (2008) demonstraram que estas moléculas estilbenóides são capazes de induzir

dano na estrutura do DNA.

Compostos que também possuem anel trimetoxilado em sua estrutura como é o caso

da colchicina, mostram-se genotóxicos, em concentrações elevadas entre 1251,7 a 2503,5 µM,

144

devido sobretudo a danos cromossômicos induzidos por mecanismos secundários (KIFFE et

al., 2003).

Em relação à citotoxicidade, HARTMANN; SPEIT (1997) reportaram que a

ocorrência de cometas sem cabeça e com quase todo o DNA presente na cauda (cometas da

classe 4) após a eletroforese é uma provável indicação de efeito citotóxico. A ocorrência de

cometas da classe 4 tem sido descrita como o aspecto mais indicativo de células apoptóticas

dentro dos parâmetros do teste do cometa.

A ação de drogas citotóxicas pauta-se basicamente no alvo destas substâncias, onde

alterações no processo de transcrição e a replicação de células tumorais em estágio

proliferativo podem ser evidenciadas, entretanto a baixa seletividade destes compostos induz

a efeitos indesejáveis sobre as células sadias. Em análise comparativa do potencial citotóxico

do RR07, frente aos mononucleares do sangue periférico (PBMC) e a linhagem estabelecida

de HL-60, revelaram sensibilidade 11 vezes maior sobre as células leucêmicas em relação aos

PBMCs, apesar disso, a indução dos efeitos indesejáveis em tecidos normais é inevitável

(NEIDLE; THURSTON, 2005).

Já foi constatado que quimioterápicos como: antimetabólitos, alquilantes de DNA,

ciclo-específicos e os inibidores de fuso mitótico são drogas pouco seletivas, atuando sobre os

eventos da divisão em todas as células em processo mitótico (DONNICI et al., 2005;

SRIDHAR.; SYMONDS, 2008), dessa forma inúmeros ensaios citogenéticos tem sido

bastante úteis para identificação de agentes mutagênicos, que podem surgir em populações

expostas a estes agentes (AU et al., 2001).

As aberrações cromossômicas expressam alterações resultantes das tentativas de

reparação da quebras ocorridas nas cadeias do DNA, as quais podem ocorrer por lesões

primárias (induzidas) ou por ocorrência espontânea levando na maioria das vezes a reunião

não homóloga do DNA lesado, culminando com as aberrações cromossômicas, as quais se

correlacionam positivamente com aberrações em PBMCs e desenvolvimento de carcinomas

(PFEIFFER et al., 2000; NATARAJAN, 2002; OBE et al., 2002).

Na condução de testes de genotoxicidade ou mutagênese (aberrações cromossômicas),

a toxicidade induzida pelo tratamento é muito importante, sendo que o monitoramento do

índice mitótico (IM) é um bom indicador representativo da proporção de células em divisão,

desta forma, o tratamento de células com substâncias muito citotóxicas, causam aumento nos

valores de IM, induzindo algum tipo de impedimento na progressão do ciclo celular e/ou na

capacidade proliferativa. Durante os testes de aberrações cromossômicas, sejam eles in vivo

145

e/ou in vitro, o IM mostra-se como uma importante ferramenta para o monitoramento da

toxicidade celular (BRITO et al., 1996; AMORIM et al., 2000).

O composto RR07 foi capaz de induzir aberrações em todas as fases do ciclo, com o

composto sozinho ou associado à colchicina. As moléculas estilbenóides como o RR07

(fenstatina), combretastatina e análogos compartilham similaridade com a colchicina,

principalmente pela presença do anel A (trimetoxifenil), desta forma, tanto os estilbenos como

a colchicina induzem aberrações cromossômicas nas células (GAJATE; MOLLINEDO, 2003;

KIFFE et al., 2003).

Para aprofundar os estudos dos efeitos celulares do RR07, foram realizados

experimentos em HL-60 utilizando citometria de fluxo. Nesses experimentos foram avaliados

os seguintes parâmetros: integridade de membrana, número de células, ciclo celular,

fragmentação de DNA, despolarização mitocondrial, anexina V e caspases 3,7 e 8.

A citometria de fluxo é uma ferramenta bastante valiosa para estudos estrutural e

funcional das células, sendo considerada rápida e precisa, tendo boa aplicação para

investigação de compostos com atividade antitumoral. Dentre uma série de possibilidades,

pode ser utilizada na pesquisa básica em biologia molecular e bioquímica da apoptose, bem

como na clínica para monitoramento de sinais iniciais de apoptose em tumor de pacientes

conseqüente de alguns protocolos de tratamento (A utilização de fluorocromos que possuem a

capacidade de intercalação com o DNA (iodeto de propideo) permite identificar a viabilidade

celular e fragmentação do material nuclear. As características inerentes à morfologia das

células apoptóticas como condensação da cromatina e a redução do volume celular são

detectadas por meio do desvio da luz incidida sobre a célula para frente e para o lado

(DARZYNKIEWICZ et al., 1992; RAMANATHAN, 1997, LIMA, 2005; FREIKMAN et al.,

2009).

Os estudos realizados com citometria de fluxo mostraram diminuição significativa no

número de células a partir a menor concentração (0,25 µM), contudo não foi observada perda

de integridade da membrana celular para as concentrações testadas de 0,25; 0,50; 1,00; 2,00 e

4,00 μM. Muitos trabalhos procuram diferenciar os estágios de apoptose e necrose, todavia a

distinção, em termos morfológicos, entre apoptose e necrose está pautada, principalmente, na

perda da integridade de membrana, onde as células em apoptose permanecem com suas

membranas íntegras, até atingir o estágio de apoptose tardia, em que se verifica o início da

instabilidade da membrana plasmática. Esses dados corroboram com os resultados obtidos

pelo método de exclusão por iodeto de propideo avaliado por citometria de fluxo (VAN

CRUCHTEN; VAN DEN BROECK, 2002; MASQUELIER et al., 2004).

146

Sendo assim, foi possível avaliar que a diminuição verificada na taxa de proliferação

celular e um aumento no número de células que incorporaram o iodeto de propideo

caracterizando o processo apoptótico (eventos iniciais e tardios), das células tratadas com o

RR07, correlacionando-se com os dados obtidos na literatura que mostram que o 3,4,5-

trimetoxi-4-bromo-cis-stilbeno induziu a redução da proliferação celular de células mamárias

MCF-7 na concentração de 50 µM (SANGJUN et al., 2009).

A anexina V é um representante de uma família de proteínas ligadas a fosfolipídios

dependentes de cálcio, e possuem alta afinidade por bicamadas fosfolipídicas de membrana,

ricas em fosfatidilserina. Os fluorocromos conjugados podem ser uma ferramenta

fundamental para monitorar mudanças na assimetria de membranas celulares fosfolipídicas,

sendo, portanto um excelente método para determinar a presença de células apoptóticas

(THIAGARAJAN; TAIT, 1990; KOOPMAN et al., 1994). Dessa forma, o ensaio da anexina

V foi realizado para detectar a externalização da fosfatidilserina (evento ocorrido na fase

inicial da apoptose), o qual é um fosfolipídio interno da estrutura da membrana, e que ao ser

externalizado, sinaliza para os macrófagos induzindo a fagocitose da célula, evitando a

liberação do conteúdo celular para o meio extracelular (VERMES et al., 1995;

ZIMMERMANN et al., 2001; FREIKMAN et al., 2009).

Após 24 horas de exposição ao RR07 observou-se um aumento, de modo

concentração não dependente, no número de células, anexina positiva (apoptose inicial e

tardia). Não houve aumento no numero de células em necrose (Gráfico 8). Vale salientar que

o evento de externalização da fosfatidilserina ocorre por conta da liberação de citocromo c

devido à perda de integridade da membrana mitocondrial (GOLDSTEIN et al., 2000;

FREIKMAN et al., 2009).

A mitocôndria desempenha papel chave na deflagração da apoptose em certas

condições. Muitas proteínas intracelulares participam da ativação dessa via de morte celular,

onde as proteínas pró-apototicas, da família Bcl-2, Bax e Bak se ligam a receptores na

membrana externa da mitocôndria causando o aumento ainda maior da sua permeabilidade.

Algumas proteínas pró-apoptóticas como a Bid, Bad, (da família Bcl-2), atuam de forma

inibitória sobre o efeito das proteínas anti-apoptóticas (Bcl-2 ou Bcl-XL) ou ativado de forma

direta (às proteínas Bax-simili). Muitos estímulos podem causar a formação de poros na

membrana interna da mitocôndria, o que acarreta uma maior passagem de água e de algumas

moléculas para o espaço intermembrana e conseqüentemente ruptura da membrana externa

mitocondrial (BÖKER et al., 2005; OLTERSDORF et al., 2005; HUERTA et al., 2007).

147

A alteração no potencial transmembrânico de mitocôndria (ΔΨm) pode ser mensurada

com o uso da rodamina 123, o que permite distinguir a possível via de ativação da apoptose –

via intrínseca e extrínseca – (GORMAN et al., 1997). Vale também lembrar que agentes

conhecidos como desacopladores, podem aletrar o potencial de transmembrancio mitocondrial

corrompendo o fino acomplamento existente entre o transporte de elétrons e a enzima ATP

sintase, causando a dissipação do gradiente de prótons através da membrana mitocondrial

interna criado pelo sistema de transporte de elétrons, levando à morte celular (BRENNER;

MAK, 2009).

O RR07 aumentou o percentual de células com baixo potencial transmembrânico de

mitocôndria (ΔΨm), desde a menor concentração avaliada (0,25 µM) indicando o

envolvimento da ativação da via intrínseca da apoptose. É válido ressaltar que além da

diminuição do potencial transmembrânico a fragmentação do DNA também é um processo

intrinsicamente relacionado à ativação da apoptose (ZONG; THOMPSON, 2006). Segundo os

experimentos de citometria de fluxo o composto RR07 foi capaz de induzir fragmentação de

DNA em todas as concentrações avaliadas, como observado por KASIBHATLA e

colaboradores (2004) em estudos com o a combretastatina A4.

Durante a apoptose pode-se observar a ativação de enzimas proteolíticas (cistenil

aspartato-específico proteases), as caspases, sendo estas agrupadas em dois tipos: iniciadoras

(2,8,9 e 10) e efetoras (3, 6 e 7) (WANG et al., 2005). O RR07 foi capaz de ativar as caspases

3 e 7 nas concentrações de 2,50 e 5,00 µM e também ativou a caspase 8 na maior

concentração avaliada (5,00 µM). A caspase 8 tem função iniciadora da via extrínseca,

enquanto as caspases 3 e 7 correlacionam-se com a via intrínseca, dessa forma pode-se

atribuir o envolvimento destas duas vias relacionados à iniciação da apoptose pelo RR07,

principalemente a via intrínseca. Apesar da ativação da caspase 8 ter sido detectada apenas na

maior concentração, os processos compatíveis com apoptose em estágios posteriores ao da

iniciação como, por exemplo, a fragmentação de DNA já foram detectados em concentrações

bem mais baixas 0,25 µM. Outro dado importante é que a ativação da via intrínseca

(despolarização de mitocôndria) ocorreu desde a 0,25 µM. Em estágios mais adiantados,

observa-se a ativação de virtualmente todas as vias apoptóticas. As caspases são enzimas

essenciais para o processo de apoptose e até então não foram evidenciadas em células

necróticas (NICHOLSON; THORNBERRY, 1997; ZONG; THOMPSON, 2006).

O estilbenóide combretastatina A4, também apresentou atividade antimitótica,

ligando-se no sítio de ligação da colchicina à tubulina, provocando a inibição da

polimerização da tubulina com interrupção da mitose e indução do desacoplamento

148

mitocondrial, colapso da membrana mitocondrial (SABZEVARI et al.,2004; YEUNG et al.,

2009).

O resveratrol foi capaz de ativar a caspase-8, seguido por clivagem do tBid, o que leva

a translocação de Bax e liberação de citocromo c pelas mitocôndrias. Secundariamente, o

resveratrol tem como alvo as mitocôndrias, levando a dissipação do potencial de membrana e

indução de apoptose, indicando que, além da ativação da apoptose por via extrínseca, a

participação da via intrínseca pode estar envolvida devido a despolarização da membrana

mitocondrial (LIN et al., 2009).

Experimentos realizados por VITALE e colaboradores (2007) mostraram que a

combretastatina não ativou a apoptose por via extrínseca, já que não se observou a clivagem

da pró-caspase-8 e ativação da caspase-8. Embora a combretastatina tenha afetado fortemente

a morfologia e funcionalidade das mitocôndrias, como mostrado pelo ensaio de

permeabilidade da membrana mitocondrial e liberação do citocromo c, o tratamento

concomitante com o inibidor específico da caspase-2, foi incapaz de reverter alterações

mitocondriais, indicando que a caspase-2 desempenha um papel de menor importância na

morte celular desencadeada pela interferência nos microtúbulos (BORREL et al., 2005;

LEBLANC et al., 2005). Estas observações apontam para diferentes causas nos mecanismos

que conduzem à citotoxicidade, não só entre as drogas que agem nos microtúbulos a partir da

estabilização ou despolimerização da tubulina, mas também entre os agentes desencadeantes

da morte celular.

Os dados obtidos por citometro de fluxo corroboram com outros achados, os quais

descrevem a capacidade de compostos estilbenóides como a combretastatina A4 (0,03 µM) e

a fenstatina (0,01 µM) em induzirem morte celular por apoptose após 24 horas de exposição

(PETTIT et al., 1998; ROMAGNOLI et al., 2006).

O desnecadeamento do processo apoptótico observado por citometria de fluxo, em

células HL-60 após tratamento com o RR07, pode estar também envolvido com o acúmulo de

células na fase G2/M, do ciclo celular, oberservado a partir da menor concentração testada

(0,25 µM). Neste caso, os dados obitidos após a análise do ciclo corroboram com os achados

descritos na literatura, onde o estilbeno, marchantina C, induziu parada do ciclo,

principalmente na fase G2/M na concentração de 16 µM (SHI et al., 2009).

Já há algumas décadas a tubulina tem sido um alvo molecular atraente e estratégico

para o desenvolvimento de novas drogas anticâncer, como os alcalóides da vinca, o taxus, a

colchicina e derivados, bem como os estilbenóides como o resveratrol, a combretastatina A4 e

a fenstatina (PETTIT et al., 2005; MOREAU et al., 2008). Drogas que agem em microtúbulos

149

geralmente pode se ligar a uma das 3 classes de sítios existentes na tubulina: sítio da

colchicina, dos alcalóides da vinca ou do paclitaxel (BECKERS; MAHBOOBI, 2003;

CRAGG; NEWMANN, 2005; JORDAN, WILSON, 2004).

De forma mais especifica os compostos estilbenóides possuem características

estequiométricas essenciais para inibição na formação dos microtúbulos que promovem a

ligação no mesmo local da colchicina, o anel A trimetoxilado aumenta a afinidade pela

tubulina, inibindo a polimerização da tubulina (MOLLINEDO; GAJATE, 2003; ALVAREZ

et al., 2008).

O composto nocodazole é outro inibidor dos microtúbulos, tendo ação reversível, inibe

a tubulina ligando-se a porção β da tubulina, próximo ao sítio de interação da colchicina,

conduzindo ao rompimento reversível de formação dos microtúbulos e de fuso mitótico

causando parada do ciclo celular na fase M (MOLLINEDO; GAJATE, 2003).

Os ensaios de inibição da polimerização da tubulina revelaram a capacidade da

fenstatina (RR07) em inibir a polimerização da tubulina para a concentração de 10 µM de

forma semelhante ao controle positivo nocodazole testado na mesma concentração (10 µM).

Alguns estudos mostraram que os compostos estilbenóides como a combretastatina A4 (AC-

7700) foram capazes de inibir a polimerização da tubulina já na concentração de 3,57 µM

(MONK et al., 2006). Outros resultados mostraram que a colchicina é capaz de inibir a

polimerização dos microtúbulos em aproximadamente 50% na concentração de 5 µM

(CHIANG et al., 2009).

É válido destacar que os trabalhos relacionados relatam o anel (A) trimetoxifenil

presente na combretastatina, colchicina e também na fenstatina como o grupamento químico

responsável pela ligação na estrutura da tubulina impedindo sua polimerização, interferindo

na formação do citoesqueleto (PETTIT et al., 1998; JIANG et al., 2008; CHIANG et al.,

2009).

Estudos in sílico de ancoramento (docking) mostraram que estilbenos como a

combretastatina A4 e a fenstatina se ligam entre a porção α-β da tubulina, sendo o mesmo

sítio de ligação da colchicina. Nesse estudo foi observado que quando as moléculas estão

ligadas ao sitio da tubulina as energias de repulsão são mínimas. Isto pode explicar os

mecanismos de citotoxicidade e atividade antitumoral desempenhados por alguns

estilbenóides como é o caso da fenstatina (BELLINA et al., 2006).

Além disso, vale salientar que a despolimerização induzida por colchicina ativa

pequenas proteínas guanosina nucleotídeo trifosfato, denominadas (RhoA), – isto pode ser

estendido para os demais compostos que agem no sítio da colchicina – as quais são

150

coordenadoras do rearranjo de microtúbulos e actina do citoesqueleto. O exato mecanismo

ainda não está totalmente esclarecido, mas a proteína RhoA é ativada por fatores

denominados trocadores de nucleotídeos guanidínicos (GEFs) que, normalmente, estão

ligados aos microtúbulos (como por exemplo a GEF-H1). As GEFs dissociadas ativam a

RhoA que, por sua vez, ativa RhoA quinases, causando fosforialção da miosina, actina e

provocando diversos efeitos celulares incluindo apoptose (MONK et al., 2006).

Drogas que interferem na dinâmica dos microtúbulos podem interferir na distribuição

cromossômica durante a mitose (BOEHLE et al., 2001). De acordo com a coloração

diferencial por hematoxilina eosina (HE), células HL-60 tratadas com o RR07 pode-se

observar acumulo de células em metáfase, de modo semelhante à colchicina. Esses dados

sugerem que o RR07 possa estar agindo no mesmo sítio de ligação da colchicina.

As pesquisas envolvendo animais de laboratório são atribuídas de grande importância

no tocante ao sistema experimental para a compreensão dos processos antitumorais de

compostos em animais. Muitos modelos experimentais utilizando camundongos são aceitos

na pesquisa contra o câncer devido a alguns aspectos importantes como: a semelhança

fisiológica de genes, células, tecidos, órgãos e sistemas, os quais se correlacionam muito bem

aos do homem (CHABNER et al., 2001; KAMB, 2005).

Buscando consolidar os resultados obtidos com os estudos in vitro a atividade

antitumoral (in vivo) da fenstatina (4-metoxifenil-3,4,5-trimetoxifenilmetanona) – RR07 foi

avaliada utilizando camundongos Mus musculus Swiss transplantados com o Sarcoma 180.

O Sarcoma 180 é um tumor originário de camundongo e uma linhagem celular bstante

utilizada na pesquisa de atividade antitumoral in vivo (LEE et al., 2003; MAGALHÃES et al.,

2006). Dentre as doses estudadas, foi verificado que os animais tratados com RR07 nas doses

de 20 e 40 mg/kg/dia aplicados via intraperitoneal (ip), durante 7 dias, apresentaram redução

no volume do tumor em 30,90 ± 6,99 e 48,19 ± 2,57%, respectivamente para as doses

supracitadas, quando comparado ao controle negativo (DMSO 10%). Estudos anteriores,

mostraram que moléculas estilbenóides de estrutura semelhante ao RR07 como a

combretastatina A4 e análogos apresentaram relevante atividade antitumoral. Além disso, o

composto AC-7700 (análogo da combretastatina) na dose de 43 mg/kg/dia, (subcutâneo por

25 dias) em camundongos transplantados com Sarcoma 180, induziu a inibição de 64% do

crescimento tumoral (NIHEI et al., 1999a).

Outro estudo mostrou que a combretastatina A4 na dose de 100 mg/kg/dia,

(subcutânea por 14 dias) conseguiu inibir o crescimento do Sarcoma de Ewing’s de rma

significativa com p < 0,001 (DALAL; BURCHILL, 2009).

151

Vale salientar que outras moléculas que atuam sobre a tubulina induzindo a efeitos

antimitóticos como a colchicina (1 mg/kg/dia intravenosa) e vinblastina (5 mg/kg/dia

subcutânea), ambas por 10 dias de tratamento, foram capazes de suprimir o crescimento

tumoral do adenocarcinoma (c-26) mostrando dessa forma, que compostos que atuam se

ligando a tubulina (antimitóticos) são potentes agentes antitumorais, induzindo parada no

ciclo celular e causando morte, na maioria das vezes, por apoptose e reduzindo a perfusão

sanguínea em tumores sólidos (NIHEI et al., 1999b).

As semelhanças estruturais, no que diz respeito ao anel (A) 3,4,5 trimetóxifenil,

presente em estilbenóides (combretastatina A4 e RR07) bem como na colchicina pode

explicar a ação citotóxica e antitumoral de tais compostos (GROSIOS et al., 1999; JIANG et

al., 2008).

Muitas drogas anti-câncer são administradas por via intraperitoneal (ip). A via

intraperitoneal é considerada uma rápida e direta, uma vez que propicia elevada

biodisponibilidade e não está sujeito ao metabolismo de primeira passagem ou inativação pelo

suco gástrico (UNDEVIA et al., 2005).

A perda ou ganho de peso corpóreo de animais submetidos a algum tipo de tratamento

é considerado um dos aspectos mais fáceis e lógicos de serem visualizados e avaliados. O

peso dos camundongos tratados com RR07 na dose de 20 mg/kg/dia (ip) causou ganho de

peso (7,66 ± 1,23 g) em ralação ao controle negativo, enquanto a dose de 40 mg/kg/dia (ip),

diminuiu o peso dos animais (6,13 ± 0,46 g), indicando indiretamente redução sobre a massa

tumoral e com isso, interferência no peso dos animais. Evidências que também apontam a

toxicidade in vivo de substâncias relacionam-se a aumento ou diminuição no peso relativo dos

órgãos pós-tratamento (BARDOCZ et al., 1996). Após a extração dos órgãos, foi observado

que apenas o baço dos grupos relacionados aos controles positivos 5-FU (20 mg/kg ip),

Vinblastina (7 mg/kg ip) e Paclitaxel (5 mg/kg ip) apresentaram redução no peso de

importância estatística (p < 0,05).

Os achados histopatológicos referentes à análise da massa tumoral dos animais

tratados com o RR07 nas doses de 20 e 40 mg/kg/dia (ip), mostrou aumento de áreas de

necrose de coagulação, acompanhado de rarefação celular, sendo indicativo de ação tóxica

sobre as células tumorais. A combretastatina A4 (100 mg/kg/dia sc) em avaliação para

determinação de atividade antitumoral induziu redução da massa tumoral com surgimento de

quadro necrótico e hemorrágico (GROSIOS et al., 1999).

Os estudos histopatológicos dos fígados dos animais tratados com o RR07 nas doses

de 20 e 40 mg/kg/dia (ip), levou a uma intensa degeneração hidrópica dos hepatócitos,

152

hemorragia sinusoidal, acúmulo de pigmentos de hemossiderina (degradação eritrocitária),

desorganização dos cordões de hepatócitos (alteração da arquitetura celular) e hiperplasia das

células de Kupffer (apenas da dose de 40 mg/kg/dia), que pode ser explicada pela ativação de

células mononucleadas envolvidas na degradação eritrocitária, na fagocitose de detritos

celulares, absorção de ferro ou por focos hemorrágicos devido à congestão vascular. Quando

os macrófagos teciduais são ativados, liberam citocinas pró-inflamatórias que estão

diretamente relacionadas à toxicidade tecidual local ou sistêmica, focos inflamatórios e

congestão venosa portal, embora esses achados não evidenciem toxicidade importante na dose

utilizada. As alterações de necrose hemorrágica causadas pelos estilbenóides como a

combretastatina A4, provavelmente estão relacionadas a ação inibitória sobre a formação e

perfusão tumoral (GROSIOS et al., 1999; YEUNG et al., 2007).

Vale destacar que algumas células apresentavam núcleos fragmentados, como foi

observado com o controle positivo (Paclitaxel 5 mg/kg/dia – ip). A degeneração gordurosa em

microgotas encontrada no fígado dos animais tratados com 5-FU certamente resulta de

defeitos no metabolismo dos ácidos graxos (KUMAR et al., 2005).

Muitos achados em biópsias sugerem que os fármacos devem ser considerados como

possíveis causadores de qualquer lesão hepática in vivo (SCHEUER; LEFKOWITCH, 2000).

O fígado apresenta-se como o principal órgão metabolizador e detoxificador do corpo,

estando sujeito a danos por uma enorme variedade de substâncias químicas farmacêuticas e

ambientais, porém algumas lesões hepáticas ocorridas na presença de xenobióticos (como o 5-

FU) são potencialmente reversíveis desde que a arquitetura do tecido conjuntivo se mantenha

íntegra e capaz de favorecer a regeneração hepatocelular, ao ponto que mesmo após a morte

de 50% dos hepatócitos por lesão aguda, caso a matriz extracelular e seus componentes

estejam intactos, ainda sim pode haver regeneração de lóbulos hepáticos inteiros (KUMAR et

al., 2005; LIEBLER; GUENGERICH, 2005).

As alterações renais induzidas pelo RR07 intraperitoneal se deve à hemorragia

glomerular e tubular com intensa tumefação do epitélio tubular e ao acúmulo de cilindros

hialinos no lúmen tubular. Hemorragias e cilindros hialinos também foram vistos nos grupos

controle negativo e nos animais tratados com os controles positivos: 5-FU (20 mg/kg/dia ip),

Vinblastina (7 mg/kg/dia ip) e Paclitaxel (5 mg/kg/dia ip). A intensa tumefação do epitélio

tubular indica leve toxicidade caracterizada por alterações incipientes e reversíveis (TISHER;

BRENNER, 1994).

153

7 PROPOSTA PARA O MECANISMO DE AÇÃO DA FENSTATINA (RR07)

De acordo com os resultados obtidos em ensaios in vitro e in vivo presume-se que o

composto RR07 atua inibindo a polimerização da tubulina, em seguida ocorre a

desestabilização da membrana e alteração do potencial transmembrânico mitocodrial (ΔΨm),

liberação de citocromo c e ativação de caspases 3 e 7 (via intrínseca) e também da caspase 8

(via extrínseca) induzindo a fragmentação do DNA cuasando a morte celular principalmente

por apoptose.

Figura 17 – Resumo esquemático do provável mecanismo de ação do estilbenóide fenstatina (RR07) em estudo

com células HL-60 após 24 h de incubação.

154

8 PERSPECTIVAS

Atualmente se vivencia uma era promissora, no combate mais efetivo ao câncer. No

desenvolvimento de grande potencial na busca racional de terapêuticas baseadas no

mecanismo molecular do câncer. Ainda existem muitos desafios, mas estes podem ser

superados pelo auxilio de poderosas técnicas relacionadas à genômica, à biologia molecular e

ao domínio da bioquímica, ao desenvolvimento de sondas químicas a fim de alcançar alvos

moleculares (proteínas oncogênicas codificadas), ou pelo menos para elucidar as vias

moleculares envolvidas na doença. Há prospectos excelentes por prolongar vida e curar as

pessoas até mesmo com câncer. Um avanço progressivo para o desenvolvimento de

medicamentos anticâncer verdadeiramente personalizados podem surgir durante os próximos

cinco a dez anos (COLLINS; WORKMAN, 2006).

O sucesso comercial e clínico de inibidores mitóticos como taxanos e alcalóides da

vinca alavancaram os estudos para melhora nas suas formulações e descoberta de novos

compostos antitumorais que atuem em microtúbulos. As principais razões para o

desenvolvimento de novas drogas ligantes de tubulina são impulsionadas pela expectativa de

melhorias no tocante à atividade antitumoral, à redução da toxicidade, aos melhores efeitos

farmacológicos e à tecnologia farmacêutica (formulação da droga) (ATTARD et al. 2006).

Desta forma, o maior entendimento da química medicinal e síntese química, aliadas a

tecnologia farmacêutica vem direcionando para a descoberta de compostos com atividades

farmacológicas mais específicas, otimizando os efeitos terapêuticos e minimizando os efeitos

adversos

155

9 CONCLUSÃO

A fenstatina (4-metoxifenil-3,4,5-trimetoxifenilmetanona), neste trabalho denominada

RR07 é um estilbenóide com potencial antimitótico, capaz de inibir a polimerização da

tubulina, alterando o potencial transmembrânico da mitocôndria e ativando o processo de

morte celular por apoptose, podendo ser considerado um protótipo de molécula anticâncer.

156

10 REFERÊNCIAS

AGGARWAL, B. B.; BHARDWAJ, A.; AGGARWAL, R. S.; SEERAM, N. P.;

SHISHODIA, S.; TAKADA, Y. Role of Resveratrol in Prevention and Therapy of Cancer:

Preclinical and Clinical Studies. Anticancer Res., v. 24, n. 5A, p. 2783-2840, 2004.

AHMED, M.; RAHMAN, N. ATM and breast cancer susceptibility. Oncogene, v. 25, n. 43,

p. 5906-5911, 2006.

ALBERT, L.; LEHNINGER, D. L.; NELSON, M. M. Biossinalização. In: NELSON, D. L.;

COX, M. Lehninger: princípios de bioquímica. 4. ed. São Paulo: Sarvier, 2006.

ALBERTINI, R. J.; ANDERSON, D.; DOUGLAS, G. R.; HAGMAR, L.; HEMMINKI, K.;

MERLO, F.; NATARAJAN, A. T.; NORPPA, H.; SHUKER, D. E.; TICE, R.; WATERS, M.

D.; AITIO, A. IPCS guidelines for the monitoring of genotoxic effects of carcinogens in

humans. Mutat. Res., v. 463, n. 2, p.111-172, 2000.

ALMEIDA, D. C. G. Ciclo celular. In: PERES, C. M.; CURI, R. (Ed.). Como cultivar

células. 1ª ed. Rio de Janeiro: Guanabara Koogan, 2005. p. 26-29.

ÁLVAREZ, C.; ÁLVAREZ, R.; CORCHETE, P.; LÓPEZ, J.L.; PÉREZ-MELERO, C.;

PELÁEZ, R.; MEDARDE, M. Diarylmethyloxime and hydrazone derivatives with 5-indolyl

moieties as potent inhibitors of tubulin polymerization. Bioorg. Med. Chem Lett., v. 16, n.

11, p. 5952-5961, 2008.

ÁLVAREZ, C.; ÁLVAREZ, R.; CORCHETE, P.; PÉREZ-MELERO, C.; PELÁEZ, R.;

MEDARDE, M. Synthesis and biological activity of naphthalene analogues of phenstatins:

Naphthylphenstatins. Bioorg. Med. Chem Lett., v. 17, n. 12, p. 3417-3420, 2007.

AMORIM, M. I. M.; MERGLER, D.; BAHIA, M. O.; DUBEAU, H.M.; MIRANDA, D. C.;

LEVEL, J.; BURBANO, R. R.; LUCOTTE, M. Cytogenetic damage related to low levels of

157

methyl-mercury contamination in the Brazilian Amazon. An. Acad. Bras. Ciênc., v. 72, n. 4,

p. 487-507, 2000.

ANAZETTI, M. C.; MELO, P. S.; DURAN, N.; HAUN, M. Comparative cytotoxicity of

dimethylamide-crotonin in the promyelocytic leukemia cell line (HL-60) and human

peripheral blood mononuclear cells. Toxicology, v. 188, n. 2/3, p. 261-274, 2003.

ATTARD, G.; GREYSTOKE, A.; KAYE, S.; DE BONO, J. Update on tubulina-binding

agents. Patologie Biologie, v. 54, p. 72-84, 2006.

AU, W.W.; BADARY, O. A.; HEO, M. Y. Cytogenetic assays for monitoring populations

exposed to environmental mutagens. Occup. Med., v. 16, n. 2, p. 345-357, 2001.

BAETU, T. M.; HISCOTT, J. On the TRAIL to apoptosis. Cytokine Growth Factor Rev., v.

13, n. 3, p. 199-207, 2002.

BARDOCZ, S.; GRANT, G.; PUSZTAI, A. The effect of phytohaemagglutinin on the

growth, body composition, and plasma insulin of the rat at different dietary concentrations.

Br. J. Nutr., v. 76, n. 4, p. 613-626, 1996.

BARTOLINI, F.; GUNDERSEN, G.G. Formins and microtubules. Biochimica et Biophysica

Acta. IN PRESS. 2009.

BAUR, J. A.; SINCLAIR, D. A. Therapeutic potential of resveratrol the in vivo evidence.

Nat. Rev. Drug. Disc., v. 5, p. 493-503, 2006.

BELLINA, F.; CAUTERUCCIO, S.; MONTI, S.; ROSSI, R. Novel imidazole-based

combretastatin A-4 analogues: Evaluation of their in vitro antitumor activity and molecular

modeling study of their binding to the colchicine site of tubulina. Bioorg. Med. Chem. Lett.,

v. 16, n. 22, p. 5757–5762, 2006.

158

BERRIDGE, M. The biochemical and cellular basis of cell proliferation assays. That use

tetrazolium salts. Biochemical, v. 4, p. 14-19, 1996.

BEZERRA, P. D.; MILITÃO, G. C. G.; CASTRO, F. O.; PESSOA, C.; MORAES, M. O.;

SILVEIRA, E. R.; LIMA, M. A. S.; ELMIRO, F. J. M.; COSTA-LOTUFO, L. V. Piplartine

induces inhibition of leukemia cell proliferation triggering both apoptosis and necrosis

pathways. Toxicol. In Vitro, v. 21, n. 1, p.1-8, 2007.

BOATRIGHT, K. M.; SALVESEN, G. S. Mechanism of caspase activation. Curr. Opin.

Cell Biol., v. 15, n. 6, p. 725-731, 2003.

BOEHLE, A. S.; SIPOS, M. D. B.; KLICHE, M. D. U.; KALTHOFF, H.; DOHRMANN, P.

Combretastatin A-4 prodrug inhibits growth of human non–small cell lung cancer in a murine

xenotransplant model. Ann. Thorac. Surg., v. 71, n. 5, p.1657–1665, 2001.

BORREL, C.; THORET, S.; CACHET, X.; GUE´NARD, D.; TILLEQUIN, F.; KOCH, M.;

MICHEL, S. New antitubulin derivatives in the combretastatina A4 series: synthesis and

biological evaluation. Bioorg. Med. Chem. Nº13, p.3853–3864, 2005.

BRANDHORST, P. B. Informational content of the echinoderm egg. In: BROWDER, L.W.

(Ed.). Developmental biology a comprehensive synthesis: oogenesis. New York: Plenum

Press, 1985. p. 525-576.

BRASIL. Ministério da Saúde. DATASUS. Disponível em: < http://tabnet.datasus.gov.br/>.

Acesso em: 13 jul. 2009.

BRENNER, D.; MAK, T.W. Mitochondrial cell death effectors. Current Opinion in Cell

Biology. nº21, p.871–877, 2009.

BRIGGS, C.; JONES, M. S. Green I-induced fluorescence in cultured immune cells: A

comparison with Acridine Orange. Acta Histochem., v. 107, n. 4, p. 301-312, 2005.

159

BRITO, A. R. How to study the pharmacology of medicinal plants in underdeveloped

countries? J. Ethnopharmacol., v. 54, n. 2/3, p. 131-138, 1996.

BRÖKER, L. E.; KRUYT, F. A. E.; GIACCONE, G. Cell death independent of caspases: a

review. Clin. Cancer Res., v. 11, n. 9, p. 3155-3162, 2005.

BRYNE, M. Is the invasive front of an oral carcinoma the most important area for

prognostication? Oral Dis., v. 4, n. 2, p.70-77, 1998.

BURIM, R. V.; CANALLE, R.; LOPES, J. L.; VICHNEWSKI, W.; TAKAHASHI, C. S.

Genotoxic action of the sesquiterpene lactone centratherin on mammalian cells in vitro and in

vivo. Teratog. Carcinog. Mutagen., v. 21, n. 6, p. 383-393, 2001.

BUTLER, M.; DAWSON, M. Cell culture labfax. [S.l.]: Blackwell Scientific Publications,

1992.

CAI, Y. J.; FANG, J. G.; MA, L. P. L.; LIU, Y. Z. L. Inhibition of free radical-induced

peroxidation of rat liver microsomes by resveratrol and its analogues. Biochim. Biophys.

Acta. v. 1637, n. 1, p. 31-38, 2003.

CASTEDO, M.; PERFETTINI, J.L.; ROUMIER, T.; ANDREAU, K.; MEDEMA, R.;

KROEMER, G. Cell death by mitotic catastrophe: a molecular definition. Oncogene, v. 23, n.

16, p. 2825-2837, 2004.

CHABNER, B. A.; RYAN, D. P.; PAZ-ARES, L.; GARCIA-CHABONERO, R.;

CALABRESI, P. Antineoplastic agents. In: HARDMAN, J. G.; LIMBIRD, L. E. (Ed.).

Goodman & Gilman`s: The Pharmacological Basis of Therapeutics. New York: McGraw-

Hill, 2001. p.1389-1459.

CHAN, D.C. Mitochondria: dynamic organelles in disease, aging, and development, Cell

nº125, p.1241–1252, 2006.

160

CHEN, Z. H.; HURH, Y. J.; NA, H. K.; KIM, J. H.; CHUN, Y. J.; KIM, D. H.; KANG, K. S.;

CHO, M. H.; SURH, Y. J. Resveratrol inhibits TCDD-induced expression of CYP1A1 and

CYP1B1 and catecol estrogen-mediated oxidative DNA damage in cultured human mammary

epithelial cells. Carcinogenesis, v. 25, n. 10, p. 2005-2013, 2004.

CHIANG, Y. K.; KUO, C. C.; WU, Y. S.; CHEN, C. T.; COUMAR, M. S.; WU, J. S.;

HSIEH, H. P.; CHANG, C. Y.; JSENG, H.Y.; WU, M. H.; LEOU, J. S.; SONG, J. S.;

CHANG, J. Y.; LYU, P. C.; CHAO, Y. S.; WU, S. Y. Generation of Ligand-Based

Pharmacophore Model and Virtual Screening for Identification of Novel Tubulin Inhibitors

with Potent Anticancer Activity. J. Med. Chem., 2009. in press.

COLLINS, A. R. The comet assay for DNA damage and repair. Mol. Biotechnol., v. 26, n. 3,

p.249-261, 2004b.

COLLINS, I.; WORKMAN, P. New approaches to molecular cancer therapeutics. Nat.

Chem. Biol., v. 2, n. 12, p. 689-700, 2006.

COLLINS, S. J. The HL-60 promyelocytic leukemia cell line: proliferation, differentiation,

and cellular oncogene expression. Blood, v. 70, n. 5, p. 1233-1244, 1987a.

COSTA-LOTUFO, L. V.; CUNHA, G. M. A.; FARIAS, P. A. M.; VIANA, G. S. B.;

CUNHA, K. M. A.; PESSOA, C.; MORAES, M. O.; SILVEIRA, E. R.; GRAMOSA, N. V.;

RAO, V. S. N. The Cytotoxic and embryotoxic effects of kaurenoic acid, a diterpene isolated

from Copaifera langsdorffi oleo-resin. Toxicon, v. 40, n. 8, p. 1231-1234, 2002.

CRAGG, G. M.; NEWMAN, D. J. Antineoplasic agents from natural sources: achievements

and future directions. Exp. Opin. Invest. Drugs, v. 9, p.1-15, 2000.

CRAGG, M. G.;NEWMAN, D. J. Plants as a source of anti-cancer agents. J.

Ethnopharmacol., v. 100, n. ½, p.72-79, 2005.

161

CRECZYNSKI-PASA, T. B.; PEDROSA, R. C. Alvos moleculares na pesquisa de

fitofármacos e fitoterápicos. In: YUNES, R.A.; CALIXTO, J. B. (Ed.). Plantas medicinais

sob a ótica da química medicinal moderna. Chapecó, SC: Argos Editora Universitária,

2001. p.195-229.

DALAL, S.; BURCHILL, S. A. Preclinical evaluation of vascular-disrupting agents in

Ewing’s sarcoma family of tumours. Eur. J. Canc., v. 45, n. 4, p.713-722, 2009.

DANIAL, N. N.; KORSMEYER, S. J. Cell death: critical control points. Cell, v. 116, n. 2, p.

205-219, 2004.

DARZYNKIEWICZ, Z.; BRUNO, S.; DEL BINO, G.; GORCZYCA, W.; HOTZ, M. A.;

LASSOTA, P.; TRAGANOS, F. Features of apoptotic cells measured by flow cytometry.

Cytometry, v.13, n. 8, p.795-808, 1992.

DAUER, A.; HENSEL, A.; LHOSTE, E.; KNASMULLER, S.; MERSCH-SUNDERMANN,

V. Genotoxic and antigenotoxic effects of catechin and tannins from the bark of Hamamelis

virginiana L. in metabolically competent, human hepatoma cells (HepG2) using single-cell

gel electrophoresis. Phytochemistry, v. 63, n. 2, p.199-207, 2003.

DEBATIN, K. M. Apoptosis pathways in cancer and cancer therapy. Cancer Immunol.

Immunother., v. 53, n. 3, p. 153-159, 2004.

DIMRI, G. P. What has senescence got to do with cancer? Cancer Cell, v. 7, n. 6, p. 505-512,

2005.

DOLBEARE, F.; GRATZNER, H.; PALLAVICINI, M. G.; GRAY, J. W. Flow cytometric

measurement of total DNA content and incorporated bromodeoxyuridine. Proc. Natl. Acad.

Sci. USA, v. 80, n. 18, p. 5573-5577, 1983.

DONNICI, C. L.; ALMEIDA, V. L.; LEITÃO, A.; REINA, L. C. B.; MONTANARI, C. A.;

PAZ, M. T. L. Câncer e Agentes Antineoplásicos Ciclo-Celular Específicos e Ciclo-Celular

162

Não Específicos que interagem com o DNA: Uma Introdução. Quim. Nova, v.1, n. 28, p.118-

129, 2005.

DORRIE, J.; GERAUER, H.; WACHTER,Y.; ZUNINO, S. J. Resveratrol induces extensive

apoptosis by depolarizing mitochondrial membranes and activating caspase-9 in acute

lymphoblastic leukemia cells. Cancer Res., v. 61, n. 12, p. 4731-4739, 2001.

DOUGLAS, K. T. Rational Drug Design in Parasitology. Parasitol. Today, v. 10, n. 10, p.

389-392, 1994.

DRESCH, R. R.; HAESER, A. S.; LERNER, C.; MOTHES, B.; VOZÁRI-HAMPE, M. M.;

HENRIQUES, A. T. Detecção de atividade lectínica e atividade hemolítica em extratos de

esponjas (Porífera) nativas da costa atlântica do Brasil. Rev. Bras. Farmacognosia, v. 15,

p.16-22, 2005.

EDINGER, A. L.; THOMPSON, C. B. Death by design: apoptosis, necrosis and autophagy.

Curr. Opin. Cell Biol., v. 16, n. 6, p. 663-669, 2004.

ELMORE, S. Apoptosis: A Review of Programmed Cell Death. Toxicol. Pathol., v. 35, n. 4,

p. 495–516, 2007.

ESSERS, J.; VERMEULEN, W.; HOUTSMULLER, A. B. DNA damage repair: anytime,

anywhere? Curr. Opin. Cell Biol., v. 18, n. 3, p. 240-246, 2006.

ESTEVE, M.A.; CARRE, M.; BRAGUER, D. Microtubules in apoptosis induction: are they

necessary? Curr Cancer Drug Targets. nº7, v.8, p.713-729, 2007.

FINK, S. L.; COOKSON, B. T. Apoptosis, Pyroptosis, and Necrosis: Mechanistic Description

of Dead and Dying Eukaryotic Cells. Infect. Imumun., v. 73, n. 4, p.1907–1916, 2005.

163

FORNELLI, F.; MINERVINI, F.; LOGRIECO, A. Cytotoxicity of fungal metabolites to

lepidopteran (Spodoptera frugiperda) cell line (SF-9). J. Inverteb. Pathol., v. 85, n. 2, p.74 –

79, 2004.

FOSTER, I. Cancer: a cell cycle defect. Radiography. v. 14, n. 2, p.144-149, 2008.

FOUCHE, G.; CRAGG, G.M.; PILLAY, P.; KOLESNIKOVA, N.; MAHARAJ, V.J.; A,

SENABE, J. In vitro anticancer screening of South African plants. J. Ethnopharmacol., v.

119, n. 3, p. 455–461, 2008.

FULDA, S.; DEBATIN, K. M. Extrinsic versus intrinsic apoptosis pathways in anticancer

chemotherapy. Oncogene, v. 25, n. 34, p. 4798-4811, 2006.

FUSETANI, N. Marine metabolites wich inhibit development of echinoderm embryos. In:

SCHEUR, P. J. (Ed.). Biorganic marine chemistry. Berlin: Springer-Verlarg, 1987. p.175.

GAJATE, C.; MOLLINEDO, F. Microtubules, microtubule-interfering agents and apoptosis.

Apoptosis, v. 8, n. 5, p. 413–450, 2003.

GALLAGHER, R.; COLLINS, S.; TRUJILLO, J.; MCCREDIE, K. AHEARN, M.; TSAI, S.;

METZGAR, R.; AULAKH, G.; TING, R.; RUSCETTI, F.; GALLO, R. Characterization of

the continuous, differentiating myeloid cell line (HL-60) from a patient with acute

promyelocytic leukemia. Blood, v. 54, n. 3, p. 713-733, 1979.

GEIGER, T. R.; PEEPER, D. S. Critical Role for TrkB Kinase Function in Anoikis

Suppression, tumorigenesis, and metastasis. Cancer Res., v. 67, n. 13, p. 6221-6229, 2007.

GENG, C. X.; ZENG, Z. C.; WANG, J. Y. Docetaxel inhibits SMMC-7721 human

hepatocellular carcinoma cells growth and induces apoptosis. World J. Gastroenterol., v. 9,

n. 4, p. 696-700, 2003.

164

GERCHENSON, M. A.; ROTELLO, R. J. Apoptosis: a different type of cell death. FASEB

J., v. 6, n. 7, p. 2450 – 2455, 1992.

GOLDSTEIN, J. C.; WATERHOUSE, N. J.; JUIN, P.; EVAN, G. I.; GREEN, D. R. The

coordinate release of cytochrome c during apoptosis is rapid, complete and kinetically

invariant. Nat. Cell Biol., v. 2, n. 3, p. 156-162, 2000.

GOLIAS, C. H.; CHARALABOPOULOS, A.; CHARALABOPOLOS, K. Cell proliferation

and cell cycle control: a mini review. Int. J. Clin. Pract., v. 58, n. 12, p. 1134-1141, 2004.

GONTIJO, A. M. M. C.; TICE, R. Teste do cometa para a detecção de dano no DNA e reparo

em células individualizadas. In: RIBEIRO, L. R.; SALVADORI, D. M. F.; MARQUES, E. K.

(Ed.). Mutagênese ambiental. Canoas, RS: ULBRA, 2003. p. 247-275.

GORMAN, A. M.; SAMALI, A.; McGOWAN, A. J.; COTTER, T. G. Use of flow cytometry

techniques in studying mechanisms of apoptosis in leukemic cells. Cytometry, v. 29, p. 97-

105, 1997.

GOTTLIEB, R. A. Mitochondrial and apoptosis. Biol. Signals Recept., v. 10, n. 3/4., p.147-

161, 2001.

GREEN, D. R.; KROEMER, G. The pathophysiology of mitochondrial cell death. Science, v.

305, n. 5684, p. 629-629, 2004.

GROSIOS, K.; HOLWELL, S. E.; MCGOWN, A. T.; PETTIT, G. R.; BIBBY, M. C. In vivo

and in vitro evaluation of combretastatin A-4 and its sodium phosphate prodrug. Br. J.

Cancer, v. 81, n. 8, p.1318–1327, 1999.

GUPTA, S. Molecular steps of death receptor and mitochondrial pathways of apoptosis. Life

Sci., v. 69, n. 25/26, p. 2957-2964, 2003.

165

HADFIELD, J. A.; DUCKI, S.; HIRST, N.; McGOWN, A.T. Tubulin and microtubules as

targets for anticancer drugs. Prog. Cell Cycle Res., v. 5, p.309-325, 2003.

HAIT, W. N.; RUBIN, E.; ALLI, E.; GOODIN, S. Tubulin Targeting Agents. Update on

Cancer Ther., v. 2, n. 1, p. 1-18, 2007.

HAMMEL, E. Antimitotic natural products and their interactions with tubulin. Med. Res.

Rev., v. 16, n. 2, p.207-231, 1996.

HANGARTNER, M. O. The biochemistry of apoptosis. Nature, v. 407, n. 6805, p.770-776,

2000.

HARTMANN, A.; SPEIT, G. The contribution of cytotoxicity to DNA effects in the single

cell gel test (comet assay). Toxicol. Lett., v. 90, n. 2/3, p.183-188, 1997.

HARTMANN, A.; AGURELL, E.; BEEVERS, C.; BRENDLER-SCHWAAB, S.;

BURLINSON, B.; CLAY, P.; COLLINS, A.; SMITH, A.; SPEIT, G.; THYBAUD, V.;

TICE, R. R. Recommendations for conducting the in vivo alkaline comet assay. Mutagenesis,

v. 18, n. 1, p. 45-51, 2003.

HAWKINS T.; MIRIGIAN, M.; YASAR, M.S.; ROSS, J.R L..; Mechanics of microtubules.

Journal of Biomechanics. IN PRESS. 2009.

HERR, I.; DEBATIN, K. M. Cellular stress response and apoptosis in cancer therapy. Blood,

v. 98, n. 9, p. 2603–2614, 2001.

HOLM, M.; THOMSEN, M.; HOYER, M.; HOKALAND, P. Optimization of a flow

cytometric method for the simultaneous measuremente of cell suface antigen, DNA content,

and in vitro BrdU incorporation into normal and malignant hematopoietic cells. Cytometry,

v. 32, p. 28-36, 1998.

166

HOTTA, K.; UEOKA, H. New cytotoxic agents: a review of the literature. Clin. Rev. Onc.

Hemat., v.35, p.45-65, 2005.

HOWARD, A.; PELE, S. R. Synthesis of nucleoprotein in bean root cells. Nature, v. 167, n.

4250, p.599-600, 1951.

HSIEH, N. P.; LIOU, J. P.; MAHINDROO, N. Pharmaceutical design of antimitotic agents

based in combretastatins. Curr. Pharm. Des., v.11, n. 13, p.1655-1677, 2005.

HUERTA, S.; GOULET, E. J.; HUERTA-YEPEZ, S.; LIVINGSTON, E.H. Screening and

detection of apoptosis – Research review. J. Surg. Res., v. 139, n. 1, p.143-156, 2007.

HYMAN, A. A.; MIDDLETON, K. M.; CENTOLA, M.; MITCHISON, T. J.; CARBON, J.

Microtubule-motor activity of a yeast centromere-binding protein complex. Nature, v. 359, n.

6395, p. 533-536, 1993.

HYNES, J.; FLOYD, S.; SOINI, A. E.; O’CONNOR, R.; PAPKOVSKY, D. B. Fluorescence-

based cell viability screening assays using water-soluble oxygen probes. J. Biomolec.

Screen., v. 8, n. 3, p. 264-272, 2003.

INSTITUTO NACIONAL DO CÂNCER (INCA). Estimativa 2008-2009: Incidência de

câncer no Brasil. Rio de Janeiro, 2008.

ISMAEL, G.F.V.; ROSA, D. D.; MANO, M. S.; AWADA, A. Novel cytotoxic drugs: Old

challenges, new solutions. Cancer Treat. Rev., v. 34, n. 1, p.81-91, 2008.

JACOBS, R. S.; WHITE, S.; WILSON, L. Selective compounds derived from marine

organisms: effects on cell division in fertilized sea urchin eggs. Fed. Proc., v. 40, n. 1, p. 26–

29, 1981.

167

JACOBS, R. S.; WILSON, L. Fertized sea urchin egg as a model for detecting cell division

inhibitors. In: ASZALOR, A. (Ed.). Modern analysis of antibiotics. New York: Marcel

Dekker, 1986. p. 481-493.

JEMAL, A.; SIEGEL, R.; WARD, E.; HAO, Y.; XU, J.; MURRAY, T.; THUN, M. J. Cancer

Statistics, 2008. CA Cancer J. Clin., v. 58, n. 2, p.71–96, 2008.

JIANG, S.; CROGAN-GRUNDY, C.; DREWE, J.; TSENG, B.; CAI, S. X. Discovery of

(naphthalen-4-yl)(phenyl)methanones and N-methyl-N-phenylnaphthalen-1-amines as new

apoptosis inducers using a cell- and caspase-based HTS assay. Bioorg. Med. Chem. Lett.,

v.18, n. 21, p. 5725–5728, 2008.

JIANG, X.; WANG, X. Cytochrome C-mediated apoptosis. Annu. Rev. Biochem., v. 73, p.

87–106, 2004.

JIMENEZ, P. C.; FORTIER, S. C.; LOTUFO, T. M. C.; PESSOA, C.; MORAES, M. E. A.;

MORAES, M.O.; COSTA-LOTUFO, L.V. Biological activity in extracts of ascidians

(Tunicata, Ascidiacea) from the northeastern Brazilian coast. J. Exp. Marine Biol. Ecol., v.

287, n. 1, p. 93-101, 2003.

JORDAN, M. A.; WILSON, L. Microtubules as a target for anticancer drugs. Nat. Rev.

Cancer, v. 4, n. 4, p.253–265, 2004.

JORDAN, M.A.; KAMATH, K. How do microtubule-targeted drugs work? An overview.

Curr Cancer Drug Targets. v.7, nº8, p.730–742, 2007.

JOZA, N.; KROEMER, G.; PENNINGER, J. M. Genetic analysis of the mammalian cell

death machinery. Trends Genet., v. 18, n. 3, p.142-149, 2002.

KAMB, A. What’s wrong with our cancer models? Nat. Rev. Drug Discov., v. 4, n. 2, p.

161-165, 2005.

168

KANG, J. H.; PARK, Y. H.; CHOI, S. W.; YANG, E. K.; LEE, W. J. Resveratrol derivatives

potently induce apoptosis in human promyelocytic leukemia cells. Exp. Mol. Med., v. 35, n.

6, p. 467-474, 2003.

KASIBHATLA, S.; GOURDEAU, H; EEROVITCH, K.; DREWE, J.; REDDY, S.; QIU, L.;

ZHANG, H.; ERGERON, F.; BOUFFARD, D.;YANG, Q.; HERICH, J.; LAMOTHE, S.;

CAI, S. X.; TSENG,B. Discovery and mechanism of action of a novel series of apoptosis

inducers with potential vascular targeting activity. Mol. Cancer Ther., v. 3, n.11, p.1365-

1373, 2004.

KAVALLARIS, M.; VERRILLS, N.M.; HILL, B. T. Anticâncer therapy with novel tubulin-

interacting drugs. Drug Resist. Updat, v. 4, n. 6, p. 392-401, 2001.

KELEKAR, A. Autophagy. Ann. NY Acad. Sci., v. 1066, p.259-271, 2005.

KERR, J. F.; WYLLIE, A. H.; CURRIE, A. R. Apoptosis: a basic morphological

phenomenon with wide range implications in tissue kinetics. Br. J. Cancer, v. 26, n. 4, p.

239-257, 1972.

KIFFE, M.; CHRISTEN P.; ARNI, P. Characterization of cytotoxic and genotoxic effects of

different compounds in CHO K5 cells with the comet assay (single-cell gel electrophoresis

assay). Mutat. Res., v. 537, n. 2, p.151–168, 2003.

KIM, R.; EMI, M.; MATSUURA, K.; TANABE, K. Antisense and nonantisense effects of

antisense Bcl-2 on multiple roles of Bcl-2 as a chemosensitizer in cancer therapy. Cancer

Gene Ther., v. 14, n. 1, p.1-11, 2007.

KIRWAN, I. G.; LOADMAN, P. M.; SWAINE, D. J.; ANTHONEY, D. A. PETTIT, G. R.;

LIPPERT III, J. W.; SHNYDER, S. D.; COOPER, P. A.; BIBBY, M. C. Comparative

Preclinical Pharmacokinetic and Metabolic Studies of the Combretastatin Prodrugs

Combretastatin A4 Phosphate and A1 Phosphate. Clin. Cancer Res., v. 10, p.1446–1453,

2004.

169

KLAUNING, J. E.; KAMENDULIS, L.M. Chemical carcinogenesis. In: KLAASSEN, C. D.

(Ed.). Casarett and Doull's Toxicology: The basic science of poisons. 7th ed. [S.l.]:

McGraw-Hill, 2008. p. 329-380.

KOOPMAN, G.; REUTELINGSPERGER, C. P.; KUIJTEN, G. A.; KEEHNEN, R. M.;

PALS, S. T.; VAN OERS, M. H. Annexin V for flow cytometric detection of

phosphatidylserine expression on B cells undergoing apoptosis. Blood, v. 84, n. 5, p.1415-

1420, 1994.

KROEMER G.; MARTIN, S.J. Caspase-independent cell death. Nat Med nº11, p.725–730,

2005.

KUMAR, V.; ABBAS, A. K.; FAUSTO, N.; ROBBINS, S. L.; COTRAN, R. S. Pathology

basis of disease. 7th ed. [S.l]: WB Saunders, 2004.

LEBLANC, R., DICKSON, J. BROWN, T.; STEWART, M.; PATI, H.N.; VANDERVEER,

D.; ARMAN, H.; HARRIS, J.; PENNINGTON, W.; HOLT, H.L. LEE, M. Synthesis and

cytotoxicity of epoxide and pyrazole analogs of the combretastatins. Bioorg Med Chem,

13(21): 6025-34, 2005.

LEE, Y. L.; KIM, H. J.; LEE, M. S.; KIM, J. M.; HAN, J. S.; HONG, E. K.; KWON, M. S.;

LEE, M. J. Oral administration of Agaricus blazei (H1 strain) inhibited tumor growth in a

sarcoma 180 inoculation model. Exp. Anim., v. 52, n. 5, p.371-375, 2003.

LENZ, H. J. Clinical update: proteasome inhibitors in solid tumors. Cancer Treat. Rev., v.

29, suppl. 1, p. 41–48, 2003.

LI, H.; WU, W.K.K.; ZHENG, Z.; YU, L.; LI, Z.J.; WU, Y.C.; CHENG, K.W.; CHO, C.H.;

WANG, M. 2,3’,4,4’,5’-Pentamethoxy-trans-stilbene, a Resveratrol Derivative, is a Potent

Inducer of Apoptosis in Colon Cancer Cells via Targeting Microtubules. Bio. Pharm., 2009.

In Press.

170

LI, H.; ZHU, H.; XU, C. J.; YUAN, J. Cleavage of BID by caspase 8 mediates the

mitochondrial damage in the Fas pathway of apoptosis. Cell, v. 94, n. 4, p.491-501, 1998.

LIEBLER, D. C., GUENGERICH, F. P. Elucidating Mechanisms of Drug-induced Toxicity.

Nat. Rev. Drug Discov., v. 4, p. 410-420, 2005.

LIEKENS, S.; DE CLERCQ, E.; NEYTS, J. Angiogenesis: regulators and clinical

applications. Biochem.Pharmacol., v. 61, n. 3, p. 253-270, 2001.

LIMA, D. P.; ROTTA, R.; BEATRIZ, A.; MARQUES, M.R.; MONTENEGRO, R.C.;

VASCONCELLOS, M.C.; PESSOA, C.; MORAES, M.O.; COSTA-LOTUFO, L.V.;

SAWAYA, A.C.H.F.; EBERLIN, M.N. Synthesis and biological evaluation of cytotoxic

properties of stilbene-based resveratrol analogs. Eur. J. Med. Chem., v. 44, p.701-707, 2009.

LIMA, T. M. Citometria de fluxo. In: PERES, C. M.; CURI, R. Como cultivar células. 1. ed.

Rio de Janeiro, RJ: Guanabara Koogan, 2005. p.227-253.

LIN, H. L.; CHIOU, S. H.; WU, C.W.; LIN, W. B.; CHEN, L. H.; YANG, Y. P.; TSAI, M.

L.; UEN, Y. H.; LIOU, J. P.; CHI, C.W. Combretastatin A4-Induced Differential Cytotoxicity

and Reduced Metastatic Ability by Inhibition of AKT Function in Human. Gast. Cancer

Cells, v. 323, n. 1, p. 365-373, 2007a.

LIN, K.H.; HSIAO, G.; SHIH, C.M.; CHOU, D.S.; SHEU, J.R.Mechanisms of resveratrol-

induced platelet apoptosis. Cardiovascular Research nº83, p.575–585, 2009b.

LIOTTA, L. A.; KOHN, E. C. ‘The microenvironment of the tumourhost interface’, in

Nature, v. 411, p.375-379, 2001.

LOCKSHIN, R. A.; WILLIAMS, C.M. Progammed cell death. I. The cytology of

degeneration in the intersegmental muscles of the pernyi silkmoth. J. Insect Physiol., v. 11,

p.123-133, 1965.

171

LORENZO, M. A; GUZMAN, W.; MARQUEZ, C. J. Potenciales antimitoticos: 2. sintesis de

1-bencil-3-carboetoxi-2-quinolonas. Acta Cient. Venez., v. 53, n. 2, p.119-123, 2002.

LOVELL, D. P.; THOMAS, G.; DUBROW, R. Issue related to the experimental design and

subsequent statistical analysis of in vivo and in vitro comet assay. Teratog. Carcinog.

Mutagen., v. 19, p. 109-119, 1999.

MA, Z.; MOLAVI, O.; HADDADI, A.; LAI, R.; GOSSAGE, R.A.; LAVASANIFAR, A.

Resveratrol analog trans 3,4,5,4_-tetramethoxystilbene (DMU-212) mediates anti-tumor

eVects via mechanism different from that of resveratrol. Cancer Chemother. Pharmacol., v.

63, p. 27–35, 2008.

MADDIKA, S. A.; ANDEA, S. R.; PANIGRAHI, S.; PARANJOTHY, T.; WEGLARCZYK,

K.; ZUSE, A.; ESHRAGHI, M.; MANDA, K.D.; WIECHEC, E.; LOS, M. Cell survival, cell

death and cell cycle pathways are interconnected: Implications for cancer therapy. Drug

Resist. Updat, v.10, n. ½, p.13–29, 2007.

MAGALHÃES, H. I. F.; VERAS, M. L.; TORRES, M. R.; ALVES, A. P. N. N.; PESSOA,

O. D. L.; SILVEIRA, E. R.; COSTA-LOTUFO, L. V.; MORAES, M. O.; PESSOA, C. In

vitro and in vivo antitumor activity of physalins B and D from Physalis angulata. J. Pharm.

Pharmacol., v. 58, p.235-241, 2006.

MAJNO, G.; JORIS, I. Apoptosis, oncosis, and necrosis: an overview of cell death. Am. J.

Pathol., v. 146, p. 3-15, 1995.

MALUF, L. M. P.; POMPÉIA, C. Morte Celular: Apoptose e Necrose. In: PERES, C.M.;

CURI, R. (Ed.). Como cultivar células. 1. ed. Rio de Janeiro: Guanabara Koogan, 2005. p.

200-226.

MASQUELIER, M.; ZHOU, Q. F.; GRUBER, A.; VITOLS, S. Relationship between

daunorubicin concentration and apoptosis induction in leukemic cells. Biochem. Pharmac.,

v. 67, p.1047-1056, 2004.

172

MATTIOLI, F.; MARTELLI, A.; GOSMARA, M.; GARBERO, C.; MANFREDI, V.;

VARALDO, E.; TORRE, G. C.; BRAMBILLA, G. DNA fragmentation and DNA repair

synthesis induced in rat and human thyroid cells by chemicals carcinogenic to the rat thyroid.

Mutation Res., v. 609, p.146–153, 2006.

McGAHON, A. J.; MARTIN, S. M.; BISSONNETTE, R. P.; MAHBOUBI, A.; SHI, Y.;

MOGIL, R. J.; NISHIOKA, W. K.; GREEN, D. R. The end of the (cell) line: methods for the

study of apoptosis in vitro. Methods Cell Biol., v. 46, p. 153–185, 1995.

McGROGAN, B. T.; GILMARTIN, B.; CARNEY, D. N.; McCANN, A. Taxanes,

microtubules and chemoresistant breast cancer. Biochim. Biophys. Acta, v. 1785, n. 2, p. 96–

132, 2008.

MESQUITA, M. L.; PAULA, J. E.; PESSOA, C.; MORAES, M. O.; COSTA-LOTUFO, L.

V.; GROUGNET, R.; MICHEL, S.; TILLEQUIN, F.; ESPINOLA, L. S. Cytotoxic activity of

Brazilian Cerrado plants used in traditional medicine against cancer cell lines J.

Ethnopharmacol., v. 123, p. 439–445, 2009.

MILITÃO, G. C. G.; DANTAS, I. N. F.; PESSOA, C.; FALCÃO, M. J. C.; SILVEIRA, E.

R.; LIMA, M. A. S.; CURI, R.; LIMA, T.; MORAES, M. O.; COSTA-LOTUFO, L. V.

Induction of apoptosis by pterocarpans from Plastymiscium foribundum in HL-60 human

leukemia cells. Life Sci., v. 78, n. 20, p. 2409-2417, 2006.

MINERVINI, F.; FORNELLI, F.; FLYNN, K. M. Toxicity and apoptosis induced by the

mycotoxins nivalenol, depxynivalenol, and fumonisin B1 in a human erythroleukemia cell

line. Toxicol. In Vitro. v. 18, n. 1, p.21-28, 2004.

MITELMAN, F. (Ed.). ISCN 1995: International System for Human Cytogenetic

Nomenclature. Basel: Karger, 1995.

MITRA, A.; SEPT, D. Taxol allosterically alters the dynamics of the tubulin dimer and

increases the flexibility of microtubules. Biophys. J., v. 95, n. 7, p. 3252-3258, 2008.

173

MOGILNER, A.; WOLLMAN, R.; SCHOLEY-CIVELEKOGLU, G.; SCHOLEY, J.

Modeling mitosis. Trends in Cell Biology. v.16, nº2, p.88-96, 2006.

MOLLINEDO, F.; GAJATE, C. Microtubules, microtubule-interfering agents and apoptosis.

Apoptosis, v. 8, n. 5, p. 413–450, 2003.

MONK, K. A.; SILES, R.; HADIMANI, M. B.; MUGABE, B. E.; ACKLEY, J. F.;

STUDERUS, S.W.; EDVARDSEN, K.; TRAWICK, M. L.; GARNER, C. M.; RHODES, M.

R.; PETTIT, G. R.; PINNEY, K. G. Design, synthesis, and biological evaluation of

combretastatin nitrogen-containing derivates as inhibitors of tubulina assembly and vascular

disrupting agents. Bioorg. Med. Chem., v. 14, p.3231-3244, 2006.

MOOI, W. J.; PEEPER, D. S. Oncogene-induced cell senescence-halting on the road to

cancer. N. Engl. J. Med., v. 355, n. 10, p. 1037-1046, 2006.

MOORHEAD, P. S.; NOWELL, P. C.; MELLMAN, W. J.; BATTIPS, D. M.;

HUNGERFORD, D. A. Chromosome preparations of leukocytes cultures from human

peripheral blood. Exp. Cell Res., v. 20, p. 613-616, 1960.

MOREAU, E.; FORTIN, S.; LACROIX. J.; PATENAUDE, A.; ROUSSEAU, J.L.C.;

GAUDREAULT, R. C. N-phenyl-N’-(2-chloroethyl)ureas (CEUs) as potential antineoplastic

agents. Part 3: Role of carbonyl groups in the covalent binding to the colchicine-binding site.

Bioorg. Med. Chem., v. 16, n. 3, p.1206-1217, 2008.

MORRIS, P. G.; FORNIER, M. N. Microtubule active agents: Beyond the taxane frontier.

Clin. Cancer. Res., v. 14, n. 22, p.7167-7172, 2008.

MOSMANN, T. Rapid colorimetric assay for cellular growth and survival: Application to

proliferation and cytotoxicity assays. J. Immunol. Methods, v. 65, n. ½, p. 55-63, 1983.

MOUSSET, C.; GIRAUD, A.; PROVOT, O.; HAMZE, A.; BIGNON, J.; LIU, J. M.;

THORET, S.; DUBOIS, J.; BRION, J. D.; ALAMI, M. Synthesis and antitumor activity of

174

benzils related to combretastatin A-4. Bioorg. Med. Chem. Lett., v. 18, n. 11, p. 3266–3271,

2008.

MUELLER, G. A.; GAULDEN, M. E.; DRANE, W. The effects of varying concentrations of

colchicine on the progression of grasshopper neuroblasts into metaphase. J. Cell Biol., v. 48,

n. 2, p. 253-265, 1979.

MURIAS, M.; JAGER, W.; HANDLER, N.; ERKER, T.; HORVATH, Z.; SZEKERES, T.;

NOHL, H.; GILLE, L. Antioxidant, prooxidant and cytotoxic activity of hydroxylated

resveratrol analogues: structure–activity relationship. Biochem. Pharmacol., v. 69, n. 6, p.

903-912, 2005.

NAKAYAMA, K. N.; NAKAYAMA, K. Ubiquitin ligases: cell cycle control and cancer.

Nat. Rev. Cancer, v. 6, n. 5, p. 369-381, 2006.

NATARJAN, A. T.; OBE, G. Screening of human populations for mutations induced by

environmental pollutants: use of human lymphocyte system. Ecotoxicol. Environ. Saf., v. 4,

n. 4, p. 468-481, 1980.

NEIDLE, S.; THURSTON, D. E. Chemical approaches to the discovery and development of

cancer therapies. Nat. Rev. Cancer, v. 5, n. 4, p. 285-296, 2005.

NICHOLSON, D. W.; THORNBERRY, N. A. Caspases: killer proteases. Trends Biochem.

Sci., v. 22, n. 8, p. 299-306, 1997.

NIHEI, Y.; SUGA, Y.; MORINAGA, Y.; OHISHI, K.; OKANO, A.; OHSUMI, K.;

HATANAKA, T.; NAKAGAWA, R.; TSUJI, T.; AKIYAMA, Y.; SAITO, S.; HORI, K.;

SATO, Y.; TSURUO, T. A Novel Combretastatin A-4 Derivative, AC-7700, Shows Marked

Antitumor Activity against Advanced Solid Tumors and Orthotopically Transplanted Tumors.

Jpn. J. Cancer Res., v. 90, n. 9, p.1016–1025, 1999b.

175

NIHEI, Y.; SUZUKI, M.; OKANO, A.; TSUJI, T.; AKIYAMA, Y.; TSURO, T.; SATIO,

SACHIKO, S.; HORI, K.; SATO, Y. Evaluation of antivascular and antimitotic effects of

tubulina binding agents in solid tumor therapy. Jpn. J. Cancer Res., v. 90, n. 12, p.1387-

1395, 1999a.

NORDENSON, I.; BECKMAN, L.; LIDÉN, S.; STJERNBERG, N. Chromosomal

aberrations and cancer risk. Hum. Hered., v. 34, n. 2, p. 76-81, 1984.

OBE, G.; PFEIFFER, P.; SAVAGE, J. R.; JOHANNES, C.; GOEDECKE, W.; JEPPESEN,

P.; NATARAJAN, A. T.; MARTINEZ-LOPEZ, W.; FOLLE, G. A.; DRETS, M. E.

Chromosomal aberrations: formation, identification and distribution. Mutat. Res., v. 504, n.

½, p.17-36, 2002.

OGA, S.; CAMARGO, M. M. A.; BATISTUZZO, J. A. O. Bases da Toxicologia –

Mutagênese e Carcinogênese. In: ______. Fundamentos de toxicologia. 3. ed. São Paulo:

Atheneu, 2008. p. 83-99.

OKADA H.; MAK, T.W. Pathways of apoptotic and non-apoptotic death in tumour cells.

Nat. Rev. Cancer, v. 4, n. 8, p. 592-603, 2004.

OLTERSDORF, T.; ELMORE, S. W.; SHOEMAKER, A. R.; ARMSTRONG, R. C.;

AUGERI, D. J.; BELLI, B. A. et al. An inhibitor of Bcl-2 family proteins induces regression

of solid tumours. Nature, v. 435, n. 7042, p. 677-681, 2005.

OPALKA, B.; DICKOPP, A.; KIRCH, H. C. Apoptotic genes in cancer therapy. Cells

Tissues Organs, v. 172, n. 2, p.126-132, 2002.

ORR, G.; VERDIER-PINARD, P. Mechanisms of taxol resistance related to microtubules.

Oncogene, v. 22, n. 47, p.7280-7295, 2003.

176

PAMPALONI, F.; FLORIN, ERNST-LUDWIG. Microtubule architecture: inspiration for

novel carbon nanotube-based biomimetic materials. Trends in Biotechnology. v.26, nº.6,

2008.

PAPADOPOULOS, K. Targeting the Bcl-2 family in cancer therapy. Semin. Oncol., v. 33, n.

4, p. 449-456, 2006.

PASQUIER, E.; HONORE, S.; BRAGUER, D. Microtubule-targeting agents in angiogenesis:

where do we stand? Drug Resist. Updat., v. 9, n. ½, p.74–86, 2006.

PATHANIA, D.; MILLARD, M.; NEAMATI, N. Opportunities in discovery and delivery of

anticancer drugs targeting mitochondria and cancer cell metabolism. Advanced Drug Delivery

Reviews nº61, p.1250–1275, 2009.

PELLEGRINI, M. P.; PINTO, R. C. V.; CASTILHO, L. R. Mecanismo de crescimento e

morte de células animais cultivadas in vitro. In: MORAES, A. M.; AUGUSTO, E. F. P.;

CASTILHO, L. R. (Ed.). Tecnologia do cultivo de células animais de biofármacos a

terapia gênica. 1. ed. São Paulo: [s.n.], 2008. p.138-169.

PERDIGÃO, J.; TAVARES, A. Ciclo celular e novas terapias contra o câncer (o ano do

Nobel). Bol. Biotecnol., v. 70, p. 7-14, 2001.

PERES, C. M.; CURI, R. Como cultivar células. Rio de Janeiro: Guanabara Koogan, 2005.

PERVAIZ, S. Chemotherapeutic potential of the chemopreventive phytoalexin resveratrol.

Drug Resist. Updat., v. 7, n. 6, p. 333–344, 2004.

PESSOA, C.; VIEIRA, F. M. A. C.; LEMOS, T. G.; MORAES, M. O.; LIMA, P. D. L.;

RABENHORST, S. H. B.; LEYVA, A.; BURBANO, R. R. Oncocalyxone A from Auxema

oncocalyx lacks genotoxic activity in phytohemagglutinin-stimulated lymphocytes. Teratog.

Carcinog. Mutagen., suppl. 1, p. 215-220, 2003.

177

PETIT, I.; KARAJANNIS, M. A.; VINCENT, L.; YOUNG, L.; BUTLER, J.; HOOPER, A.

T.; SHIDO, K.; STELLER, H.; CHAPLIN, D. J.; FELDMAN, E.; RAFII, S. The

microtubule-targeting agent CA4P regresses leukemic xenografts by disrupting interaction

with vascular cells and mitochondrial-dependent cell death. Blood, v.111, n. 4, p.1951-1961,

2008.

PETTERS, C. F.; DE GEUS, L. F.; WESTPHAL, J. R.; DE WAAL, R. M.; RUITER, D. J.;

WOBBES, T.; OYEN, W. J.; RUERS, T. J. Decrease in circulating anti-angiogenic factors

(angiostatin and endostatin) after surgical removal of primary colorectal carcinoma coincides

with increased metabolic activity of liver metastases. Surgery, v. 137, n. 2, p. 246-249, 2005.

PETTIT, G. R.; GREALISH, M. P.; HERALD, D. L.; BOYD, M. R.; HAMEL, E.; PETTIT,

R. K. Antineoplastic Agents. 443. Synthesis of the Cancer cell growth inhibitor

hydroxyphenstatin and its Sodium diphosphate prodrug. J. Med. Chem., v. 43, n. 14, p.2731-

2737, 2000.

PETTIT, G. R.; GREALISH, M. P.; JUNG, M. K.; HAMEL, E.; PETTIT, R.K.; CHAPUIS,

J.C.; SCHMIDT, J.M. Antineoplastic Agents. 465. Structural modification of resveratrol:

Sodium reverastatin phosphate. J. Med. Chem., v. 45, n. 12, p. 2534-2542, 2002.

PETTIT, G. R.; RHODES, M. R.; HERALD, D. L.; HAMEL, E.; SCHMIDT, J.M.; PETTIT,

R. K. Antineoplastic Agents. 445. Synthesis and Evaluation of Structural Modifications of

(Z)- and (E)- Combretastatin A41. J. Med. Chem., v. 48, n. 12, p. 4087-4099, 2005.

PETTIT, G. R.; TOKI, B.; HERALD, D. L.; VERDIER-PINARD, P.; BOYD, M. R.;

HAMEL, E.; PETTIT, R. K. Antineoplastic Agents. 379. Synthesis of phenstain phosphate. J.

Med. Chem., v. 41, n. 10, p.1688-1695, 1998.

PFEIFFER, P.; GOEDECKE, W.; OBE, G. Mechanisms of DNA double-strand break repair

and their potencial to induce chromosomal aberrations. Mutagen, v. 4, n. 5, p. 289-302, 2000.

178

PINNEY, G. K.; JELINEK, C.; EDVARDSEN, K.; CHAPLIN, D. J.; PETIT, G. R. The

discovery and development of the Combretastatin. In: CRAGG, G. M.; KINGSTON, D. G. I.;

NEWMAN, D. J. (Ed.). Anticancer agents from natural products. [S.l.]: CRC Press, 2005.

p. 23-46.

PINTO, L. F. R.; FELZENSZWALB, I. Genética do câncer humano. In: RIBEIRO, L. R.;

SALVADORI, D. M. F.; MARQUES, E. K. (Ed.). Mutagênese ambiental. 1. ed. Canoas,

RS: ULBRA, 2003. p. 29-44.

POHLIT, A. M.; TIGRE, R. F.; CAVALCANTI, B. C.; MORAES, M. O.; COSTA-

LOTUFO, L. V.; MORAES, M. E. A.; SANTOS, E. V. M.; MORAIS, S. K. R.;

NUNOMURA, S. M.; PESSOA, C. Cytotoxic Fractions from the Leaves of Tachia

grandiflora. Pharm. Biol., v. 45, n. 5, p. 429–433, 2007.

PRESTON, R. J.; SAN SEBASTIAN, J. R.; McFEE, A. F. The in vitro human lmphocte

assay for assessing the clastogenicity of chemical agents. Mutat. Res., v. 189, n. 2, p.175-

183, 1987.

PROSKURYAKOV, S. Y.; KONOPLYANNIKOV, A. G.; GABAI, V. L. Necrosis: a specific

form of programmed cell death? Exp. Cell Res., v. 283, n. 1, p. 1-16, 2003.

QIAO, L.; WONG, B. C. Targeting apoptosis as an approach for gastrointestinal cancer

therapy. Drugs Res. Updat., v. 12, n. 3, p. 55–64, 2009.

RABELLO-GAY, M. N.; RODRIGUES, M.; NONTELEONE-NETO, R. Teste do

micronúcleo em medula óssea. In: ______. Mutagênese, carcinogênese e teratogênese:

métodos e critérios de avaliação. Ribeirão Preto, SP: FCA, 1991. p. 241.

RAMANATHAN, M. Flow cytometry application in pharmacodynamics and drug delivery.

Pharm. Res., v. 14, n. 9, p.1106-1114, 1997.

179

RAZA, A.; BOKHARI, J.; YOUSUF, N.; MEHDI, A.; MAZEWSKI, C.; KHAN, S.;

BAKER, V.; LAMPKIN, B. Cell cycle kinetic studies in human cancers. Arch. Pathol. Lab.

Med., v. 115, n. 9, p. 873-879, 1991.

REHEN, S. K. Ciclo Celular. In: CARVALHO, H. F.; RECCO-PIMENTEL, S. M. (Ed.). A

célula. 2. ed. Barueri, SP: Manole, 2007. p. 304-308.

RIBEIRO, L. R.; SALVADORI, D. M. F.; MARQUES, E. K. Genética do câncer humano.

In: ______. Mutagênese ambiental. 1. ed. Canoas, RS: ULBRA, 2003. p. 29-44.

RIBÉREAU-GAYON, P. Tratado de enologia – química del vino estabilización y

tratamientos. Buenos Aires: Hemisfério Sur, 2002.

RICCI, M. S.; ZONG, W. X. Chemotherapeutic approaches for targeting cell death pathways.

Oncologist, v. 11, n. 4, p. 342-357, 2006.

RISINGER, A. L.; GILES, F. J.; MOOBERRY, S. L. Microtubule dynamics as a target in

oncology. Cancer Treat. Rev., v. 35, n. 3, p. 255–261, 2009.

ROMAGNOLI, R.; BARALDI, P. G.; PAVANI, M. G.; TABRIZI, A.; PRETI, D.;

FRUTTAROLO, F.; PICCAGLI, L.; JUNG, M. K.; HAMEL, E.; BORGATTI, M.;

GAMBARI, R. Synthesis and biological evaluation of 2-amino-3-(3’,4’5’-

trimethoxybenzoyl)-5-aryl thiophenes as a new class of potent anti-tubulin agents. J. Med.

Chem., v. 49, n. 13, p. 3906-3915, 2006.

RUCHAUD, S.; CARMENA, M.; EARNSHAW, W. C. Chromosomal passengers:

conducting cell division. Nat. Rev. Mol. Cell Biol., v. 8, n. 10, p. 799-812, 2007.

RUPNARAIN, C.; DLAMINI, Z.; NAICKER, S.; BHOOLA, K. Colon cancer: genetics and

apoptotic events. Biol. Chem., v. 385, n. 6, p. 449-464, 2004.

180

RUPPERT, E. E.; BARNES, R. B. Zoologia dos invertebrados. 6. ed. São Paulo: Rocca,

1996.

SABBATINI P.; SPRIGGS, D. R. Epothilones: Better or more of the same? J. Clin. Oncol.,

v.27, n. 19, p. 3079-3081, 2009.

SABZEVARI, O., GALATI, G. et al. Molecular cytotoxic mechanisms of anticancer

hydroxychalcones. Chem Biol Interact, nº148, v.1-2, p:57-67, 2004.

SANGJUN, S.; JONG, E.; NIJMEIJER, S.; MUTARAPAT, T.; RUCHIRAWAT, S.; BERG,

M. V. D.; DUURSEN, M. B. Induction of cell cycle arrest in human MCF-7 breast cancer

cells by cis-stilbene derivatives related to VIOXX®. Toxicol. Lett., v. 186, n. 2, p.115-122,

2009.

SARASTE, A.; PULKKI, K. Morphological and biochemical hallmarks of apoptosis.

Cardiovasc. Res., v. 45, n. 3, p. 528-537, 2000.

SCHABEL, F.; GRISWOLD, D. P.; LASTER, W. R. Quantitative evaluation of anticancer

agent activity in experimental animals. Pharmacol. Ther. Part A: Chemotherapy Toxicology

and Metabolic Inhibitors, v. 1, n. 4, p. 411-435, 1977.

SCHEUER, P. J.; LEFKOWITCH, J. H. Drugs and toxins. In: SCHEUER, P. J.;

LEFKOWITCH, J. H. (Ed.). Liver biopsy interpretation. 6th ed. London: WB Saunders,

2000. p. 134–150.

SCHIMIDT, M.; BASTIANS, H. Mitotic drug targets and the development of noveol anti-

mitotic anticancer drugs. Drug Resist. Updat., v. 10, n. 4/5, p.162-181, 2007.

SCHOLEY, J.M. Cell division. Nature. nº422, p.746-752, 2003.

181

SCHULER, M.; MAURER, U.; GOLDSTEIN, J. C. p53 triggers apoptosis in oncogene-

expressing fibroblasts by the induction of Noxa and mitochondrial Bax translocation. Cell

Death Differ., v. 10, n. 4, p. 451-460, 2003.

SERGEY Y A. P, ANATOLI G. K, GABAI V.L. Necrosis: a specific form of programmed

cell death? Experimental Cell Research. v.283 p. 1-16, 2003.

SHARMA, P.; SHARMA, J. D. In vitro hemolysis of human erythrocytes by plant extracts

with antiplasmodial activity. J. Ethnopharmacol., v. 74, n. 3, p. 239-243, 2001.

SHI, Y. Q.; ZHU, C. J.; YUAN, H. Q.; LI, B. Q.; GAO, J.; QUA, X. J.; SUN, B.; CHENG, Y.

N.; LI, S.; LI, X.; LOU, H. X. Marchantin C, a novel microtubule inhibitor from liverwort

with anti-tumor activity both in vivo and in vitro. Cancer Lett., v. 276, n. 2, p.160–170,

2009.

SHOEMAKER, R. Antitumor drug screening with a human tumor colony forming assay

(HTCFA). Proc. Am. Assoc. Cancer Res., v. 25, p. 1292, 1984.

SILVA, T. H.A.; BUTERA, A. P.; LEAL, D. H. S.; ALVES, R. J. Agentes antitumorais

inibidores da angiogênese – Modelos farmacofóricos para inibidores da integrina ανβ3.

RBCF Rev. bras. ciênc. farm. (Impr.), 43, n. 1, p. 1-17, 2007.

SINGH, N. P.; McCOY, M. T.; TICE, R. R.; SCHNEIDER, E. L. A simple technique for

quantitation of low levels of DNA in individual cells. Exp. Cell Res., v. 175, n. 1, p. 184-191,

1988.

SOUZA, M. V. N. Novos produtos naturais capazes de atuar na estabilização de

microtúbulos, um importante alvo no combate ao câncer. Quim. Nova, v. 27, n. 2, p. 308-

312, 2004.

SRIDHAR, T.; SYMONDS, R. P. Principles of chemotherapy and radiotherapy. Obstet.

Gynaecol. Reprod. Med., v. 19, n. 3, p. 61-67, 2009.

182

STRASSER, A.; O’CONNOR, L.; DIXIT, V. M. Apoptosis signaling. Annu. Rev. Biochem.,

v. 69, p. 217-245, 2000.

TAKAHASHI, C. S. Testes citogenéticos in vitro e aneuploidia. In: RIBEIRO, L. R.;

SALVADORI, D. M. F.; MARQUES, E. K. (Ed.). Mutagênese ambiental. Canoas, RS:

ULBRA, 2003. p.151-172.

TERKELTAUB, R. A. Colchicine Update: 2008. Semin. Arthritis Rheum., v. 38, n. 6, p.

411-419, 2008.

THIAGARAJAN, P.; TAIT, J. F. Binding of Annexin V/placental anticoagulant protein I to

platelets. Evidence for phosphatidylserine exposure in the procoagulant response of activated

platelets. J. Biol. Chem., v. 265, n. 29, p. 17420-17423, 1990.

TISHER, C. C.; BRENNER, B. M. Renal pathology: with clinical and functional

correlations. Philadelphia: JB Lippincott Company, 1994.

TY, N.; KAFFY, J.; ARRAULT, A.; THORET, S.; PONTIKIS, R.; JOELLE, D.; MORIN-

ALLORY, L.; FLORENT, J. C. Synthesis and biological evaluation of cis-locked vinylogous

combretastatin-A4 analogues: Derivatives with a cyclopropyl-vinyl or a cyclopropyl-amide

bridge. Bioorg. Med. Chem. Lett., v. 19, n. 5, p.1318–1322, 2009.

UNDEVIA, S. D.; GOMES-ABUIN, G.; RATAIN, M. J. Pharmacokinetic variability of

Anticancer Agentes. Nat. Rev. Cancer, v. 5, n. 6, p. 447-458, 2005.

VAN CRUCHTEN, S.; VAN DEN BROECK, W. Morphological and Biochemical Aspects

of Apoptosis, Oncosis and Necrosis. Anat. Histol. Embryol., v. 31, n. 4, p.214-223, 2002.

VEGA-ÁVILA, E.; VELASCO-LEZAMA, R.; JIMÉNEZ-ESTRADA, M. Lãs plantas como

fuente de compuestos antineoplásicos. Revisión. Bioquimia, v. 31, n. 3, p. 97-111, 2006.

183

VENDITI, J. M. The National Cancer Institute antitumor drug discovery program, current and

future perspective: a commentary. Cancer Treat. Rep., v. 67, n. 9, p.767-772, 1983.

VERAS, M. L.; BEZERRA, M. Z.; BRAZ-FILHO, R.; PESSOA, O. D.; MONTENEGRO, R.

C.; PESSOA, C.; MORAES, M. O.; COSTA-LUTUFO, L. V. Cytotoxic epimeric

withaphysalins from leaves of Acnistus arborescens. Planta Med., v. 70, n. 6, p. 551-555,

2004.

VERMES, I.; HAANEN, C.; STEFFENS-NAKKEN, H.; REUTELINGSPERGER, C. A

novel assay for apoptosis. Flow cytometric detection of phosphatidylserine expression on

early apoptotic cells using fluorescein labelled Annexin V. J. Immunol. Methods, v. 184, n.

1, p. 39-51, 1995.

VITALE, I.; ANTOCCIA, A.; CENCIARELLI, C.; CRATERI, P.; MESCHINI, S.;

ARANCIA, G.; PISANO, C.; TANZARELLA, C. Combretastatin CA-4 and combretastatin

derivative induce mitotic catastrophe dependent on spindle checkpoint and caspase-3

activation in non-small cell lung cancer cells. Apoptosis. nº12, p.155–166, 2007.

WALKER, R.A.; SALMON, E.D.; ENDOW, S.A. The Drosophila claret segregation protein

is a minus-end directed motor molecule. Nature, v. 347, n. 6295, p.780-782, 1990.

WALLACE, K. B. Mitochondrial off targets of drug therapy. Trends in Pharmacological

Sciences. v.29, nº.7, 2008.

WANG, L.; SHI, G. G.; YAO, J. C.; GONG,W.; WEI, D.; WU, T. T.; AJANI, J. A.;

HUANG, S.; XIE, K. Expression of endothelial nitric oxide synthase correlates with the

angiogenic phenotype of and predicts poor prognosis in human gastric cancer. Gastric

Cancer, v. 8, n.1, p.18-28, 2005.

WEAVER, B. A.; CLEVELAND, D.W. Decoding the links between mitosis, cancer, and

chemotherapy: the mitotic checkpoint, adaptation, and cell death. Cancer Cell, v. 8, n. 1, p.7-

12, 2005.

184

WU, M.; SUN, Q.; YANG, C.; CHEN, D.; DING, C.J.; CHEN, Y.; LIN, L.; XIE, Y.

Synthesis and activity of Combretastatin A-4 analogues 1,2,3-thiadiazoles as potent antitumor

agents. Bioorg. Med. Chem. Lett., v. 17, n. 4, p. 869-873, 2007.

YAMAGUCHI, R.; PERKINS, G. Dynamics of mitochondrial structure during apoptosis and

the enigma of Opa1. Biochim. Biophys. Acta, v. 1787, n. 8, p. 963–972, 2009.

YEUNG, S.C.J.; SHE, M.; YANG, H.; PAN, J.; SUN, L.; CHAPLIN, D. Combination

Chemotherapy Including Combretastatin A4 Phosphate and Paclitaxel Is Effective against

Anaplastic Thyroid Cancer in a Nude Mouse Xenograft Model. J. Clin. Endocrinol. Metab.,

v. 92, n. 8, p. 2902–2909, 2007.

ZAFFARONI, N.; PENNATI, M.; DAIDONE, M. G. Survivin as a target for new anticancer

interventions. J. Cell Mol. Med., v. 9, n. 2, p.360-372, 2005.

ZHOU, J.; CHAU, C. M.; DENG, Z.; SHIEKHATTAR, R.; SPINDLER, M. P.; SCHEPERS,

A.; LIEBERMAN, P. M. Cell cycle regulation of chromatin at an origin of DNA replication.

EMBO J., v. 24, n. 7, p.1406-1417, 2005b.

ZHOU, J.; GIANNAKAKOU, P. Targeting microtubules for cancer chemotherapy. Curr.

Med. Chem. Anticancer Agents, v. 5, n. 1, p. 65–71, 2005a.

ZIEGLER, U.; GROSCURTH, O. Morphological fetures of cell death. News Physiol. Sci., v.

19, p.124-128, 2004.

ZIMMERMANN, K. C.; BONZON, C.; GREEN, D. R. The machinery of programmed cell

death. Pharmacol. Ther., v. 92, n. 1, p.57-70, 2001.

ZONG, W. X.; THOMPSON, C. B. Necrotic death as a cell fate. Review. Genes Dev., v. 20, n. 1, p.1-15, 2006.s

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