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UNIVERSIDADE ESTADUAL DO SUDOESTE DA BAHIA - UESB

PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM QUÍMICA - PGQUI

PAULO ROBERTO TAVARES DE SOUZA

Terpenos isolados de Trichilia casaretti e Trichilia silvatica (Meliaceae)

Jequié - Ba

Outubro – 2008

Livros Grátis

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ii


Terpenos isolados de Trichilia casaretti e Trichilia silvatica (Meliaceae)

Dissertação apresentada ao Programa de Pós-graduação

em química da Universidade Estadual do Sudoeste da

Bahia como requisito parcial para obtenção do grau de

Mestre em Química.

Orientadora: Vanderlúcia Fonseca de Paula

Co-orientadora: Suzimone de Jesus Correia

Jequié - Ba Outubro - 2008

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UNIVERSIDADE ESTADUAL DO SUDOESTE DA BAHIA - UESB PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM QUÍMICA – PGQUI


Dissertação apresentada ao Programa de Pós-graduação em Química da Universidade

Estadual do Sudoeste da Bahia como requisito parcial para obtenção do grau de Mestre em

Química.

DISSERTAÇÃO APROVADA EM ____ / ____ / ____. Comissão Examinadora:

_______________________________________________ Profa. Dra. Vanderlúcia Fonseca de Paula

(Orientadora)

_______________________________________________ Profa. Dra. Glória Del Carmem Melendez Salazar

_______________________________________________ Profa. Dr. Fernando Faustino de Oliveira

iv

"Investir em conhecimento rende sempre os melhores juros"

Benjamin Franklin

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AGRADECIMENTOS

Gostaria de agradecer a Deus por tudo que fez e faz em nossas vidas

Aos meus familiares, em especial à minha mãe, pelo modo guerreiro como sempre

encarou as batalhas da vida.

À Universidade Estadual do Sudoeste da Bahia que possibilitou a realização de

minha graduação e mestrado. Aos professores, funcionários e amigos.

Aos colegas do Laboratório de Produtos Naturais Angélica Ferraz, André Dias,

Eleane Monaliza, Luciana, Rafaela, Larissa, Ariadna, Caíque e Jamille. Em especial a André

e Angélica, por todo o aprendizado, companheirismo e amizade que me proporcionaram, e a

Jamille, pelo apoio prestado em vários momentos.

À Profa. Guadalupe Edilma L. de Macedo, curadora do Herbário da UESB, por

ceder as informações botânicas e viabilizar a coleta das espécies estudadas.

Ao prof. Jorge Maurício David (UFBA), por ceder diversos horários reservados ao

seu Grupo de Pesquisa para a realização de experimentos de RMN.

Aos colegas Clayton, Jeferson e Bruno da UFBA, por toda a colaboração,

realizando os experimentos de RMN.

Ao prof. Luiz Cláudio de Almeida Barbosa (UFV) pela indispensável colaboração

com o nosso grupo de pesquisa, permitindo o uso dos equipamentos CG-

EM e RMN, para realização de diversas análises realizadas no decorrer deste trabalho.

Aos grandes amigos e colegas de turma Cléber, Luana, Melina, Daniela e John, pela

companhia nessa jornada.

Às amigas, Creuza, que me iniciou no mundo da química possibilitando meu

ingresso na vida acadêmica, e Elenir, pelos conselhos e orientações, sempre pertinentes e que

muito me ajudaram.

Aos professores do Programa de Pós-graduação em Química da UESB, Vanderlúcia

Fonseca, Valfredo Lemos, Regina Terumi, Luiz Augusto Cardoso, Sérgio Ferreira, Ronan

Batista, pela dedicação e intensa colaboração com a minha formação acadêmica e

profissional.

À professora Suzimone de Jesus Correia, de quem tive toda a atenção sempre que

solicitei, desde a época de graduação, com dedicação e sabedoria, solucionando problemas

e/ou apontando caminhos a seguir.

vi

À professora Vanderlúcia, que foi muito mais que uma orientadora, com extrema

dedicação e responsabilidade ao trabalho que se propõe a fazer, soube nos guiar na busca de

soluções e constitui-se num grande exemplo para todos, não só como profissional, mas

também e principalmente, como ser humano, capaz de responsabilizar com os outros mesmo

quando se encontrava em condições adversas.

À Fundação de Amparo à Pesquisa da Bahia - FAPESB pelo apoio financeiro, que

nos forneceu o devido suporte para desenvolvimento desta pesquisa.

vii

SUMÁRIO

1. INTRODUÇÃO ..................................................................................................................... 2

1.1. Estudo Químico de Plantas ................................................................................................. 2

2. REVISÃO DA LITERATURA ............................................................................................. 4

2.1. A Família Meliaceae ........................................................................................................... 4

2.2. O Gênero Trichilia .............................................................................................................. 6

2.2.1. Atividade Biológica das Espécies do Gênero Trichilia ................................................... 6

2.2.2. A Química do Gênero Trichilia ....................................................................................... 8

2.2.3. Descrição Botânica das T. casaretti e T. silvatica ......................................................... 21

2.2.3.1. Trichilia casaretti ....................................................................................................... 21

2.2.3.2. Trichilia silvatica ........................................................................................................ 22

3. OBJETIVOS ........................................................................................................................ 23

3.1. Objetivo Geral ................................................................................................................... 23

3.2. Objetivos Específicos ....................................................................................................... 23

4. MATERIAIS E MÉTODOS ................................................................................................ 25

4.1. Materiais ........................................................................................................................... 25

4.1.1. Materiais e reagentes utilizados ..................................................................................... 25

4.1.2 Preparo de Reagente ....................................................................................................... 25

4.1.3 Condições utilizadas nas análises cromatográficas e espectrométricas .......................... 25

4.1.3.1 Análise por CG-EM dos sesqui- e diterpenos .............................................................. 25

4.1.3.1.1. Análise dos óleos essenciais e dos sesquiterpenos isolados .................................... 26

4.1.3.1.2. Análise das frações TsF1 e TsF3 ............................................................................. 26

4.1.3.1.3. Cálculo dos índices de retenção (IK). ...................................................................... 26

Equação 1. Algoritmo de Kóvats. ............................................................................................ 26

4.1.3.2 Condições para análise por RMN de 1H e de 13C ........................................................ 27

4.2 Coleta das espécies ............................................................................................................ 27

4.3 Preparo dos Extratos Vegetais ........................................................................................... 30

4.4 Fracionamento do extrato etanólico das folhas da Trichilia silvatica (EFTs) ................... 31

4.5 Fracionamento do extrato hexânico das folhas da Trichilia casaretti (HFTc) .................. 37

4.6 Extração dos óleos essências ............................................................................................. 41

4.7 Ensaios biológicos para avaliar a atividade Inseticida dos Extratos das Folhas e da Casca do Caule de T.silvatica e T. casaretti ....................................................................................... 42

5. RESULTADOS E DISCUSSÃO ......................................................................................... 44

5.1. Ensaios biológicos para avaliar a atividade inseticida dos extratos .................................. 44

5.2. Constituintes químicos das folhas de T. silvatica ............................................................. 46

5.2.1. Constituintes isolados e/ou identificados do extrato etanólico ...................................... 46

5.2.1.1. Constituintes identificados por CG-EM ..................................................................... 46

5.2.1.1.1. TsF1: α-tocoferol (1) ................................................................................................ 46

5.2.1.1.2. TsF2: Mistura de sesquiterpenos ............................................................................. 48

5.2.1.1.3. TsF3: veridiflorol (3), óxido de humuleno (4) e palmitato de etila (5) ................... 50

5.2.1.2. Constituintes identificados por RMN ......................................................................... 54

5.2.1.2.1. TsF4: β-sitosterol (6) ............................................................................................... 54

5.2.1.2.2. TsF5 - TsF5A: (2S,3S,6R,7R)-humuleno-2,3;6,7-diepóxido (7A) e TsF5B: (2R,3R,6R,7R)-humuleno-2,3;6,7-diepóxido (7B) ................................................................... 58

5.2.1.2.3. TsF6: mustacona (8) ................................................................................................ 64

5.2.1.2.4. TsF7: Mistura contendo α-Amirina (9), β-amirina (10), pseudotaraxasterol (11) e lupeol (12) ................................................................................................................................ 70

5.2.2. Constituintes do óleo essencial (OETs) ......................................................................... 76

viii

5.3. Constituintes Químicos das Folhas de T. casaretti ........................................................ 79

5.3.1. Isolados por cromatografia em coluna ........................................................................ 79

5.3.1.1. TcF1: Mistura de β-sitosterol (6) e estigmasterol (27) ............................................ 79

5.3.1.2. TcF2A: aromadendrano-4β,10α-diol (28) ............................................................... 83

5.3.1.3. TcF3A: 8-epi-esclareol (29) ..................................................................................... 89

5.3.2. Constituintes do óleo essencial (OETc) ...................................................................... 95

5.4. Considerações sobre terpenos ........................................................................................ 99

6. CONCLUSÕES E PERSPECTIVAS ............................................................................. 110

7. REFERÊNCIAS .............................................................................................................. 111

ix

LISTA DE FIGURAS

Figura 1. Distribuição geográfica das espécies da família Meliaceae. ...................................... 5

Figura 2. Estrutura da Azadiractina A ........................................................................................ 6

Figura 3. Trichilia casaretti. . ................................................................................................... 21

Figura 4. Trichilia silvatica. . .................................................................................................. 22

Figura 5. Foto da exsicata de Trichilia casaretti. ..................................................................... 28

Figura 6. Foto da exsicata de Trichilia silvatica ....................................................................... 29

Figura 7. Procedimento geral para preparo dos extratos. ......................................................... 30 Figura 8. Fluxograma obtido a partir do fracionamento da fração EFTs................................ 302

Figura 9. Fluxograma obtido a partir do fracionamento da sub-fração EFTs3.6. ..................... 33

Figura 10. Fluxograma obtido a partir do fracionamento da fração EFTs 3.8.......................... 34

Figura 11. Fluxograma obtido a partir do fracionamento das frações EFTs5 e EFTs6. ........... 35

Figura 12. Fluxograma de frações obtidas a partir do fracionamento de EFTs5. ..................... 36

Figura 13. Fluxograma das frações obtidas a partir do fracionamento de EFTs4. ................... 37

Figura 14. Fluxograma obtido a partir do fracionamento de HFTc. ......................................... 38

Figura 15. Fluxograma obtido a partir do fracionamento da fração HFTc8. ............................ 39

Figura 16. Fluxograma obtido a partir do fracionamento da fração HFTc6. ............................ 40

Figura 18. Cromatograma da fração TsF1: α-Tocoferol (1). ................................................... 46

Figura 19. Espectro de massas (IE) de TsF1: α-Tocoferol (1).................................................. 47

Figura 20. Espectro de massas (IE) de uma amostra padrão de α-Tocoferol. .......................... 47

Figura 21. Cromatograma da amostra TsF2. ............................................................................ 49

Figura 24. Cromatograma da fração TsF3, obtido a partir da análise por CG-EM. ................. 51

Figura 25. Espectro de massas do Pico 7 de TsF3 – TsF3A: Óxido de Humuleno (4). ........... 51

Figura 28. Espectro de RMN de 1H (CDCl3, 300 MHz) da fração TsF4: β-sitosterol (6) ........ 56

Figura 29. Espectro de RMN de 13C (CDCl3, 75 MHz) da fração TsF4: β-sitosterol (6)......... 57

Figura 30. Cromatograma da fração TsF5 obtido na análise por CG-EM. ............................... 58

Figura 31. Espectro de massas (IE) de TsF5A. ......................................................................... 59

Figura 32. Espectro de massas (IE) de TsF5B. ......................................................................... 59

Figura 33. Espectro de RMN de 1H (CDCl3, 300 MHz) da fração TsF5: Mistura de estereoisômeros do Humuleno diepóxido (7A) e (7B). ............................................................ 62

Figura 34. Espectro de RMN de 13C (CDCl3, 75 MHz) da fração TsF5: Mistura de estereoisômeros do Humuleno diepóxido (7A) e (7B). ............................................................ 63

Figura 35. Cromatograma da fração TsF6. ............................................................................... 64

Figura 36. Espectro de massa de TsF6A: mustacona (8). ......................................................... 65

Figura 37. Espectro de RMN de 1H (CDCl3, 300 MHz) da fração TsF6: Mustacona (8). ........ 68

Figura 38. Espectro de RMN de 13C (CDCl3, 75 MHz) da fração TsF6: Mustacona (8). ........ 69

Figura 39. Espectro de RMN de 1H (CDCl3, 300 MHz) da fração TsF7: Mistura de triterpenos (9), (10), (11) e (12). ................................................................................................................. 72

Figura 39A. Espectro de RMN de 1H (CDCl3, 300 MHz) da fração TsF7, com ampliação da região de δ 4,95 a 4,81. ............................................................................................................. 73

Figura 40. Espectro de RMN de 13C (CDCl3, 75 MHz) da TsF7: Mistura de triterpenos (9), (10), (11) e (12). ........................................................................................................................ 74

Figura 40A. Espectro de RMN de 13C (75 MHz, CDCl3) da fração TsF7, região ampliada entre δ 160-78. .......................................................................................................................... 75

Figura 41. Cromatograma de OETs (região ampliada entre Tr 29,0 e Tr 36,5). ...................... 76

Figura 42. Cromatograma de OETs (região ampliada entre Tr 36,5 e 43,0). ........................... 76

Figura 43. Estruturas dos sesquiterpenos identificados no OETs. ............................................ 78

x

Figura 44. Espectro de RMN de 1H (CDCl3, 300 MHz) da fração TcF1: Mistura de β-sitosterol (6) e estigmasterol (27). ............................................................................................ 81

Figura 45. Espectro de RMN de 13C (CDCl3, 75 MHz) da fração TcF1: Mistura de β-sitosterol (6) e estigmasterol (27). ............................................................................................................ 82

Figura 46. Cromatograma obtido da fração TcF2. .................................................................... 83

Figura 47. Espectro de massas (IE) de TcF2A: Aromadendrano-4β,10α-diol (28). ................. 84

Figura 47A. Espectro de massas (IE) do espatulenol. .............................................................. 84

Figura 48. Espectro de RMN de 1H (CD3OD, 300 MHz) da fração TcF2: Aromadendrano-4β,10α-diol (28). ....................................................................................................................... 87

Figura 49. Espectro de RMN de 13C (CD3OD, 75 MHz) da fração TcF2: Aromadendrano-4β,10α-diol (28). ....................................................................................................................... 88

Figura 50. Cromatograma obtido a partir análise por CG-EM da fração TcF3. ....................... 89

Figura 51. Espectro de massas (IE) de TcF3A: 8-epi-Esclareol (29). ...................................... 90

Figura 52. Esqueleto do labd-14-eno-8,13-diol. ....................................................................... 91

Figura 53. Espectro de RMN de 1H (CDCl3, 300 MHz) da fração TcF3: 8-epi-Esclareol (29). .................................................................................................................................................. 92

Figura 56. Cromatograma de OETc ( região ampliada entre Tr 31,5 e Tr 40,8) ...................... 95

Figura 56A. Cromatograma de OETc (região ampliada entre Tr 46,0 a 58,0) ......................... 95

Figura 57. Espectro de massas (IE) do Pico 16 de OETc, IK= 1692. ....................................... 96

Figura 58. Estruturas das substâncias identificadas no OETc. ................................................. 98

Figura 59. Rotas metabólicas envolvidas na formação de terpenos. ...................................... 100

Figura 60. Biossíntese de terpenóides. .................................................................................... 101

Figura 62. Biossíntese de alguns esqueletos monoterpênicos a partir de DMAPP e IPP ....... 103

Figura 63. Formação de diversos esqueletos sesquiterpênicos a partir do FPP. ..................... 104

Figura 64. Formação do geranil-geranil difosfato a partir do FPP. ........................................ 105

Figura 65. Formação do copalil PP a partir do GGPP. ........................................................... 106

Figura 66. Formação do sestertepeno esclarina a partir do geranil-farnesil difosfato (GFPP). ................................................................................................................................................ 106

Figura 67. Ciclização do esqualeno para a formação de um triterpeno. ................................. 107

xi

LISTA DE TABELAS Tabela 1. Massas (g, peso seco) dos materiais vegetais coletados. .......................................... 31

Tabela 2. Massas dos extratos obtidos a partir do material vegetal coletado. .......................... 31

Tabela 3. Resultados dos ensaios biológicos ........................................................................... 45

Tabela 4. Substâncias identificadas na fração TsF2 ................................................................. 49

Tabela 5. Substâncias identificadas da fração TsF3 ................................................................. 53

Tabela 6. Dados de RMN de 13C, de TsF4 comparados com dados do β-sitosterol ................. 55

Tabela 7. Dados de RMN de 13C de TsF5A e TsF5B comparados com dados da literatura dos estereoisômeros ......................................................................................................................... 61

Tabela 8. Dados de RMN de 1H e de 13C(CDCl3) de TsF6A comparados com valores da literatura para mustacona (8) e oxo-ylangeno (8B) .................................................................. 67

Tabela 9. Dados de RMN de 13C (75 MHz, CDCl3) da fração TsF7 comparados com dados dos triterpenos lupeol, pseudotaraxasterol, α-amirina e β-amirina ........................................... 71

Tabela 10. Constituintes do Óleo essencial obtido das folhas da T. silvatica .......................... 77

Tabela 11. Dados de RMN de 13C (CDCl3) comparados com dados do β-sitosterol e do estigmasterol ............................................................................................................................. 80

Tabela 12. Dados de RMN de 1H (CD3OD) de TcF2A comparados com valores do aromadendreno-4β,10α-diol. .................................................................................................... 85

Tabela 13. Dados de RMN de 13C de TcF4A comparados com os dados de diversos estereoisômeros do aromadendrano-4,10-diol .......................................................................... 86

Tabela 14. Dados de RMN de 13C para a TcF3A em comparação com dados de diversos estereoisômeros com esqueleto labd-14-eno-8,13-diol ............................................................ 94

Tabela 15. Constituintes do óleo essencial obtido das folhas de T. casaretti ........................... 97

xii

LISTA DE QUADROS

Quadro 1. Estudos da atividade inseticida de algumas espécies do gênero Trichilia ................. 7

Quadro 2. Substâncias isoladas de espécies do gênero Trichilia ................................................ 8

xiii

LISTA DE SÍMBOLOS E ABREVIATURAS

AE - Acetato de etila

CC – Cromatografia em Coluna

CCDP – Cromatografia em camada delgada preparativa

CD3OD – Metanol deuterado

CDCl3 – Clorofórmio deuterado

CG-EM – Cromatografia em fase gasosa acoplada a espectrômetro de massas

d – dupleto

dd – duplo dupleto

DEPT – Distortionless Enhancement Polarization Transference

ECcTc – Extrato etanólico da casca do caule da Trichilia casaretti.

ECcTs – Extrato etanólico da casca do caule da Trichilia silvatica.

EFTc – Extrato etanólico das folhas da Trichilia casaretti.

EFTs – Extrato etanólico da folhas da Trichilia silvatica.

HCcTc – Extrato hexânico da casca do caule da Trichilia casaretti.

HCcTs – Extrato hexânico da casca do caule da Trichilia silvatica.

HFTc – Extrato hexânico das folhas da Trichilia casaretti.

HFTs – Extrato hexânico das folhas da Trichilia silvatica.

IE – Impacto de elétrons

IK – Índice de Kóvats

J – Constante de acoplamento (Hz)

m – multipleto

m/z – relação massa-carga

MeOH – Metanol

MHz – Megahertz

OETc – Óleo Essencial da Trichilia casaretti

OETs – Óleo Essencial da Trichilia silvatica

RMN de 13C – Ressonância Magnética Nuclear de carbono 13

RMN de 1H – Ressonância Magnética Nuclear de hidrogênio

s – simpleto

sext ap – sexteto aparente

sl – simpleto largo

t – tripleto

Tr – Tempo de retenção

UV – Ultravioleta

xiv

δ – deslocamento químico

λ – Comprimento de onda (nm)

xv

RESUMO

O presente trabalho apresenta o estudo químico e a avaliação da atividade inseticida

de extratos e dos óleos essenciais das folhas de Trichilia silvatica e Trichilia casaretti, ambas

pertencentes à família Meliaceae. Para avaliação da atividade inseticida destas espécies, os

extratos hexânico e etanólico das folhas e casca do caule foram testados in vitro sobre três

espécies de insetos considerados pragas agrícola ou doméstica: Plutella xylostella L.

(Lepidoptera: Plutellidae), Blatella germanica L. (Dictyoptera: Blattellidae) e Diaphania

hyalinata L. (Lepidoptera: Pyralidae). Embora nenhuma atividade significativa tenha sido

observada para os extratos testados, optou-se por realizar o estudo químico dos mesmos, uma

vez que a constituição química destas espécies é praticamente desconhecida. Do

fracionamento, por cromatografia em coluna de sílica gel, do extrato etanólico das folhas da

T. silvatica, foram isolados e/ou identificados o α-tocoferol (Vitamina E), os sesquiterpenos

espatulenol, veridiflorol, óxido de humuleno, (2S,3S,6R,7R)-humuleno-2,3;6,7-diepóxido,

(2R,3R,6R,7R)-humuleno-2,3;6,7-diepóxido, mustacona, o esteróide β-sitosterol e uma

mistura contendo os triterpenos α-amirina, β-amirina, pseudotaraxasterol e lupeol. Do extrato

hexânico de T. casaretti foram isolados o sesquiterpeno aromadendrano-4β,10α-diol, o

diterpeno 8-epi-esclareol, além de uma mistura dos esteróides β-sitosterol e estigmasterol. A

determinação estrutural das substâncias isoladas foi baseada na análise dos dados obtidos dos

espectros de RMN de 1H e RMN de 13C, incluindo experimentos como DEPT 90, DEPT 135,

além de espectrometria de massas (EM). Nos óleos essenciais foram identificados dezesseis

sesquiterpenos das folhas da T. silvatica e oito sesquiterpenos das folhas de T. casaretti. A

identificação destes sesquiterpenos foi realizada por meio da comparação de seus espectros de

massas com aqueles da biblioteca Wiley 7ª edição e também, pela comparação de seus índices

de Kovats, com valores descritos na literatura. Este estudo revelou um predomínio de

substâncias terpênicas, especialmente, sesquiterpenos tanto em T. silvatica quanto T.

casaretti.

xvi

ABSTRACT

This work presents the chemical study and evaluation of the insecticidal activity of

extracts and essential oils from the leaves of Trichilia silvatica and Trichilia casaretti, both

belonging to the family Meliaceae. To evaluate the insecticidal activity of these species the

hexane and ethanol extracts of leaves and stem bark were tested in vitro on three species of

insect pests considered agricultural or domestic: Plutella xylostella L. (Lepidoptera:

Plutellidae), Blatella germanica L. (Dictyoptera: Blattellidae) e Diaphania hyalinata L.

(Lepidoptera: Pyralidae). Though no significant activity has been observed for the extracts

tested, has been performed the chemical study from them, since the chemical constitution of

these species is practically unknown. Of the fractionation, by column chromatography on

silica gel, of the ethanol extract from the leaves of T. silvatica, were isolated and identified the

α-tocopherol (vitamin E), the sesquiterpenes spathulenol, veridiflorol, humulene oxide,

(2S,3S,6R,7R)-humulene-2,3;6,7-diepoxide, (2R,3R,6R,7R)-humulene-2,3;6,7-diepoxide,

mustakone, the steroid β-sitosterol and a mixture containing the triterpenes α-amyrin, β-

amyrin, pseudotaraxasterol and lupeol. Of the hexane extract from the leaves of T. casaretti

were isolated the sesquiterpene aromadendrane-4β,10α-diol, the diterpene 8-epi-sclareol, and

a mixture of the steroids β-sitosterol and stigmasterol. Structural formulas determination of

the substances isolated was based on analysis of data obtained from 1H NMR and 13C NMR

spectra, including experiments as DEPT 90, DEPT 135, and mass spectrometry (MS). In the

essential oils were identified sixteen sesquiterpenes of the leaves of T. silvatica and nine

sesquiterpenes from the leaves of T. casaretti. The identification of these sesquiterpenes was

performed by comparing their mass spectra with those from the Wiley 7th ed. library of GC-

MS and, by comparison of their Kovats index, with values reported in the literature. This

study revealed a predominance of terpenoids substances, especially sesquiterpenes, in both

Trichilia species studied.

SEÇÃO I

FUNDAMENTAÇÃO TEÓRICA

2

1. INTRODUÇÃO

1.1. Estudo Químico de Plantas

O estudo químico de plantas tem despertado ao longo da história o interesse de

farmacêuticos, químicos, médicos, agrônomos e mais recentemente de leigos, com vistas à

descoberta ou à justificativa das atividades daquelas usadas como medicinais (MATOS,

1997). Todo esse interesse deve-se ao fato da grande diversidade de produtos naturais

produzidos por espécies vegetais, os quais apresentam um imenso potencial e vários campos

de aplicação.

Segundo Cechinel (1997), outro aspecto a ser ressaltado é a quantidade de plantas

existente no planeta, sendo que a maioria é desconhecida sob o ponto de vista científico, onde

entre 250-500 mil espécies, somente cerca de 5% teriam sido estudadas fitoquimicamente até

o ano de 1996, e uma porcentagem menor ainda teria sido avaliada sob os aspectos biológicos.

Só para se ter uma idéia da importância dos produtos naturais, eles se encontram

presentes em, aproximadamente, 60% dos compostos anticancerígenos e em 75% das drogas

para tratamento de doenças infecciosas (NEWMAN et al., 2003; CRAGG et al., 2005 apud

MCCHESNEY et al., 2007)

Quando se trata da medicina, por exemplo, o conhecimento sobre plantas medicinais

simboliza muitas vezes o único recurso terapêutico de muitas comunidades e grupos étnicos.

O uso de plantas no tratamento e na cura de enfermidades é tão antigo quanto à espécie

humana. Ainda hoje nas regiões mais pobres do país e até mesmo nas grandes cidades

brasileiras, plantas medicinais são comercializadas em feiras livres, mercados populares e

encontradas em quintais residenciais (MACIEL et al, 2002). A importância da utilização de

plantas na área farmacêutica é tão grande que a implementação da Fitoterapia no sistema

público de saúde vem sendo sugerida desde 1988, sendo uma das diretrizes da I Conferência

Nacional de Assistência Farmacêutica, realizada em 2003 (VENDRUSCOLO et al, 2005).

Já no campo agroquímico, os produtos naturais com atividade inseticida despertam

especial atenção. Durante muitas décadas o Brasil teve sua economia baseada no setor

primário de produção e, ainda hoje, ocupa uma posição de destaque no abastecimento mundial

de cereais, frutas e outros produtos de origem vegetal sendo, portanto, o controle de pragas,

nativas ou exóticas, um desafio que persiste e tem se agravado ano após ano. Antes do

descobrimento do Brasil os insetos endêmicos desse território limitavam-se a alimentar-se de

3

plantas silvestres, situação que se modificou com o processo de colonização, quando parte dos

insetos nativos passou a tirar alimento das novas plantas e como estas normalmente

apresentavam-se concentradas, houve multiplicação rápida e desequilibrada de insetos.

(VIEGAS, 2003).

Segundo Pinto (2002), os estudos sobre Produtos Naturais ganharam evidência em

1976, quando se realizou na cidade do Vaticano, a semana de estudos “Produtos Naturais e a

Proteção de Plantas”. As discussões travadas nessa reunião focalizaram o papel de

determinados metabólitos secundários na defesa de plantas contra organismos predadores.

Segundo ele, a importância desse tema pode ser avaliada pela destruição cada vez maior dos

cultivares de cereais pelo ataque de pragas, que chega a causar a perda de 1/3 da produção

mundial de cereais. Pinto (2002) diz ainda que esse problema vem sendo agravado pela

prática cada vez mais freqüente de monoculturas e pela resistência dos predadores aos

inseticidas sintéticos. Além disso, a descoberta dos efeitos indesejáveis aos ecossistemas dos

inseticidas sintéticos, que tem no DDT seu principal vilão, deu um grande impulso na busca

por inseticidas naturais.

Para Mcchesney (2007) os estudos com produtos naturais sofreram um declínio nos

últimos anos. Segundo ele isto ocorreu por conta de alguns problemas na prospecção de

produtos naturais, tais como o grande período exigido para a comercialização de protótipos

desses materiais. Por outro lado, o pesquisador aponta algumas características peculiares dos

produtos naturais. Por exemplo, tem-se uma grande quantidade de organismos produtores de

metabólitos secundários, o que ocasiona a existência de uma grande variedade dessas

substâncias, bem como, propicia a existência de estruturas das mais variadas complexidades,

algo que ainda tem a colaboração dos processos de interação entre os organismos produtores.

O reino vegetal tem então contribuído de forma significativa para o fornecimento de

metabólitos secundários, utilizados nas mais variadas aplicações, as quais vão desde

fitoquímicos, modelos para o desenvolvimento de medicamentos sintéticos, agroquímicos, até

insumos para a indústria de alimentos, entre outras aplicações (PINTO et al., 2002; NIERO et

al., 2003 apud BUFFON, 2005).

4

2. REVISÃO DA LITERATURA

2.1. A Família Meliaceae

O uso de plantas com atividades inseticidas não é tecnicamente recente, ocorrendo

relatos dessa prática desde o século passado. No entanto, desde a década de 40, com o

surgimento de inseticidas sintéticos, que se mostravam mais eficientes e baratos, houve uma

descrença para com os inseticidas naturais. Contudo, com a necessidade de desenvolvimento

de novos produtos que não causassem ou tornassem mínimos os impactos ambientais, os

estudos e a posterior adoção dos produtos naturais se tornaram mais evidentes (CUNHA,

2004).

Na linha de frente dos estudos com produtos naturais que apresentam atividades

biológicas, tais como a atividade inseticida, vários relatos apontam para a família Meliaceae.

A família Meliaceae se destaca como fonte de plantas inseticidas dentre as diversas

famílias botânicas, tanto pelo número de espécies vegetais com atividade inseticida como pela

eficiência de seus extratos. Nessa família, incluem-se Azadirachta indica A. Juss (comumente

denominada nim ou nime) e Melia azedarach (conhecida popularmente por cinamomo, pára-

raios ou santa-bárbara), sendo a primeira espécie considerada, dentre as plantas inseticidas já

estudadas, como a mais eficiente (SCHMUTTERER, 1988; KOUL et al., 1990; MORDUE &

BLACKWELL, 1993; VENDRAMIM, 1997 apud ROEL et al., 2000).

A família Meliaceae, pertencente à Ordem Rutales, compreende 51 gêneros de

plantas lenhosas dos trópicos e sub-trópicos, economicamente, importantes como fonte de

madeira (RODRIGUES et al., 2008).

No Brasil são encontrados cerca de 6 gêneros e 100 espécies. A região amazônica é a

mais rica em espécies, especialmente em grupos monotípicos. Na Mata Atlântica ocorrem

quatro gêneros e 28 espécies, a maioria pertencente ao Trichilia, sendo oito delas endêmicas

da Mata Atlântica. Os centros com maior endemismo localizam-se no sul da Bahia e Espírito

Santo (Fig. 1), no Corredor Central da Mata Atlântica (PENNINGTON, 1981, In:

http://www.icb.ufmg.br/bot/mataatlantica/familias/Meliaceae.htm, acesso em 10/07/08).

http://www.icb.ufmg.br/bot/mataatlantica/familias/Meliaceae.htm

5

Figura 1. Distribuição geográfica das espécies da família Meliaceae. Disponível em:

http://www.icb.ufmg.br/bot/mataatlantica/familias/Meliaceae.htm. Acesso em: 10/07/08.

Na família Meliaceae, os limonóides são, provavelmente, os maiores representantes

da classe dos terpenos com atividade inseticida. Eles são conhecidos como meliacinas, devido

ao seu sabor amargo e suas principais fontes são espécies das famílias Meliaceae. São

encontrados com freqüência também em espécies das famílias Rutaceae e Cneoraceae Os

limonóides ou tetra-nor-triterpenos representam o nível máximo na seqüência de produção de

terpenóides em plantas que normalmente não são atacadas por insetos (VIEGAS, 2003).

Ainda segundo VIEGAS (2003), a azadiractina A (Fig 2), e um grupo de outros limonóides

estão intimamente associados à ação supressora de apetite ou inibidora de crescimento em

insetos de Azadirachta indica e têm sido extensamente estudados, com o objetivo de se

http://www.icb.ufmg.br/bot/mataatlantica/familias/Meliaceae.htm

6

conhecer a química, biossíntese, toxicologia e o potencial inseticida deste grupo de compostos

naturais.

Figura 2. Estrutura da Azadiractina A, limonóide isolado da Azadirachta indica (Meliaceae).

2.2. O Gênero Trichilia

O gênero Trichilia, pertencente a esta família, é constituído de aproximadamente 230

espécies, distribuídas principalmente na América Tropical. Em termos fitoquímicos, estudos

mostram que o gênero Trichilia é rico em metabólitos oriundos da rota biogenética dos

terpenos, tais como esteróides, triterpenos e os tetranortriterpenóides (limonóides)

(RODRIGUES et al., 2008).

.

2.2.1. Atividade Biológica das Espécies do Gênero Trichilia

Na literatura são encontrados diversos relatos sobre atividade biológica de espécies

do gênero Trichilia, a maioria relacionados à atividade inseticida. O Quadro 1 apresenta

alguns desses estudos.

7

Quadro 1. Estudos da atividade inseticida de algumas espécies do gênero Trichilia

Espécie(s) Partes da Planta / Substâncias Referência

Trichilia sp Folhas, caule, raiz e galhos (Hidroxi-metoxicinamadeíldo).

(CAZAL et al., 2008)

T. pallida Swartz Óleo Essencial (α-Copaeno, β-Elemeno, (E)-Cariofileno, Viridifloreno, α-Selineno, β-Cadineno, Germacreno B)

(TISSOTL et al., 2008)

T. claussenii e T. catigua Frutos e inflorescências (Catequina e Uridina)

(PASQUALOTTO et al.,

2008)

T. catigua, T. claussenii e T.

elegans

Ramos, folhas, sementes, arilo e exocarpo.

(MATOS, 2006)

T. pallida Swartz Folhas e ramos. (CUNHA et al., 2005)

T. pallida e T. rubra Flores, folhas e frutos (cumarinas, alcalóides, esteróides, limonóides e flavonóides.

(ROCHA, 2004)

T. casaretti, T. catigua, T.

clausseni, T. elegans, T.

pallens e T. pallida

Folhas e sementes (BOGORNI &

VENDRAMIM, 2003)

T. pallida Swartz Folhas e sementes (GONÇALVES-

GERVASIO, 2003)

T. pallida Swartz Folhas, frutos e ramos (SOUZA &

VENDRAMIM, 2001)

T. pallida Swartz Folhas e ramos (ROEL et al., 2000)

T. havanensis Jacq Frutos (LÓPEZ-OLGUÍN et al.,

1998)

8

2.2.2. A Química do Gênero Trichilia

As classes de metabólitos secundários isolados que mais se destacam no gênero

Trichilia são os terpenos e os esteróides. O quadro 2 apresenta alguns metabólitos isolados em

trabalhos com espécies desse gênero.

Quadro 2. Substâncias isoladas de espécies do gênero Trichilia

No Nome Estrutura Espécie Referência

1 2β,19-Hemicetal da

2α,3α-diidroxi-androstan-16-ona

OHO

HO

O

T.

clausseni

i

PUPO et al.,

1997.

2 2β,19-Hemicetal da

2α,3β-diidroxi-pregnan-16-ona

OHO

HO

O

3 2β,3β-Diidroxipre-gnan-16-ona

OHO

HO

4

(2R,3S,4S)-3-Hidroxi-4-metil-2-

(13’-fenil-1’-n-tridecil)-

butanolídeo O

OH

11

O

PUPO et al., 1998.

5


(11’-fenil-1’-undecil)buta-

nolídeo O

OH

9

O

6


metil-2-(1’-n-hexadec-7’(Z)-enil)butanolídeo

O

OH

7 5

O

7 (2R,3S,4S)-3-

Hidroxi-4-metil-2-(1’-n-tetradecil)-

butanolídeo O

OH

12

O

9

8 24-Metileno-26-

hidroxicicloartan-3-ona

O

OH

PUPO et al., 1996.

9 14-Hidroxielemol

OH

OH

PUPO et al., 2002.

10 Germacra-10(14)-eno-9,11,15-triol

OHOH

OH

11 Germacra-

3,10(14)-dien-9,11-diol-4-carbaldeído OH

OH

HO

12 Criptomeridiol

OHOH

MATOS, 2006.

13 24-Metileno-

3β,4β,22α-triidroxi-colesterol

HO

OH

OH

14 Campesterol

HO

10

15

13-Hidroxi-14-nordeidrocalohastin

a

O

OMe

OH

T.

cuneata

DOE et al.,

2005. 16

13-Acetoxi-14-

nordeidrocalohastin

a O

OMe

OAc

17 Maturinona

O

O

O

18 Dregeana-3

O

O

O

H

OAc

H

OAc

O

O

OAc

T.

dregeana

MULHOLLAND et al., 1980

apud MULHOLLAND et al., 2000.

19 (-)-Epicatequina OHO

OH

OH

OH

OH

OH

NAIDOO, 1997 apud

MULHOLLAND et al., 2000.

20 Kihadanina A

OO

O

O

OH

O

OO

O

T. elegans

ssp. elegans

GARCEZ et al, 1997.

11

21 Kihadanina B

OO

O

O

OO

O

O

OH

22 Elegantina A

OO

O

O

OO

OH

O

CO2Me

AcO

23 Elegantina B

OO

O

O

OO

O

OH

CO2Me

AcO

24 1,2-Diidro-1α-

acetoxielegantina A

OO

O

O

OO

OH

O

CO2Me

AcOAcO

12

25 1,2-Diidro-lα-

acetoxielegantina B

OO

O

O

OO

O

OH

CO2Me

AcOAcO

26

Sedanina

O

OAc

OH

AcO OH

H

O

OO

AcO

T .

emetica

KUBO et al., 1982 apud


27

Trichilina A

O

O

OH

OOH

OAcO

AcO

O

O NAKATANI et al., 1981apud


28

Trichilina B

O

O

OH

OOH

OAcO

AcO

O

O

13

29 Nymania 1

OO

OOH

HOO

OH OO

CO2Me

AcO

HO

GUANATILAKA et al., 1998

apud MULHOLLAND et al., 2000.

30

7α-23-diidroxi-3-oxo-24,25,26,27-

tetranorapotirucal-1,14,20(22)-trien-

21,23-olino

O

O

OAc

OAcO

T.

estipulata CORTEZ et al.,

1998.

31 Escopoletina O O

O

HO

32 Isofraxidina O

H3CO

H3CO

OCH3

33 Trichavensina

O

O

OAcOH

O

OOH

HOO

AcO

O

O

O

CO2Me

T.

havanens

is

HAHN et al., 1996.

34 3-

Hidroxipregnano-2,16-diona

HO

OO

T. hirta

CHAURET et

al., 1996.

35 2-Hidroxiandrosta-

1,4-dieno-3,16-diona

O

OHO

14

36

6-Hidroxi-11β-acetoxi-12α-(2-metilpropano-

iloxi)-3,7-dioxo-14β,15β-epoxi-1,5-

meliacadien-29-oato de metila

O

O

O

OH

O

H3CO2C

O

H3C(H3C)HC

AcO

O

T. pallida

T. pallida

SIMMONDS et al., 2001.

SIMMONDS et al., 2001.

37

6,11β-Hidroxi-12α-(2-metil-

propanoiloxi)-3,7-dioxo-14β, 15β-epoxi-1,5-melia-

cadien-29-oato de metila O

O

O

OH

O

H3CO2C

O

H3C(H3C)HC

HO

O

38

6-Hidroxi-11β-acetoxi-12α-(2-

metilbutanoiloxi)-3,7-dioxo-14β,15β-

epoxi-1,5-meliacadien-29-oato de metila O O

OH

O

H3CO2C

O

H3C(H3C)HC

AcO

O

39 Hirtina

O O

OH

O

H3CO2C

O

H3CH2C

AcO

O

O

40 Deacetilirtina

O O

OH

O

H3CO2C

O

H3CH2C

HO

O

O

15

41 24-Metileno cicloarta-3β-ol

HO

CUNHA, 2004.

42 Cicloarta-23-eno-3β,25-diol.

HO

OH

43 24-Metileno-colesterol

HO

44 Gedunina O

O

O OAc

O

O

16

45 Prieurianosideo

O

OH

OO

O

O

O

O

OHOH

OH

T.

prieurian

a

OLUGBADE et al., 2000.

46 Prieurianina

O

OO

OOH

O

O

HO

O

OH

AcOH2C

AcO

CO2Me

BEVAN et al., 1965; GULLO et

al., 1975 apud MULHOLLAND et al., 2000.

47 Ácido

(1R,3E,7Z,11S,12S)-dolabella-3,7,18-

trien-17- óico COOH

T.

trifolia RAMÍREZ et

al., 2000.

48 Cinchonaína Ia Cinchonaína Ib

OO

OH

H

OH

OH

OH

OH

OH

OH

O

T.

catigua

PIZZOLATTI et al., 2002.

49

Cinchonaína Ic (9R)

Cinchonaína Id

(9S)

O

OH

OH

OH

OH

O

HO

HO

O

HO

TANG, et al., 2007.

17

50 Catiguanina A Catiguanina B O

OH

OH

OH

OH

OH

O

HCO2Me

OH

HO

T.

catigua

51 (-)-Catequina

O

HH

H

OH

H

OH

OH

OH

HO

PASQUALOTT

O, 2008

52 Uridina

ON

NH

O

OHO

OHOH

53 7-Hidroxi-1-oxo-norcalameneno

O

HO

MATOS, 2006.

54 Espatulenol OH

55 Desacetilirtina

O

O

O

O O

O

H3CO2CH2C OH

HO

18

56 Angolensato de metila

O

O

O

O

CO2Me

O

57 Cedrelona

O

O

OH

O

58

12-Oxo-24-metileno-

cicloartan-3β-22-diol

HO

O

OH

T.

casaretti

AQUINO, 2008.

59 Piscidinol

O

OH

OH

OH

T.

quadrijug

a

RODRIGUES, 2008.

60 Diidronilocitina

HO

OH

O

19

61 Nilocitina

O

OH

O

62

3-Hidroxi-4-metoxi-

cinamaldeído

HO

HO

O

Trichilia

sp

CAZAL, 2008.

63

4-Hidroxi-3,5-dimetoxibenzaldeíd

o

MeO

HO

O

OMe

64

4-Hidroxi-3,5-dimetoxi-

cinamaldeído

MeO

HO

OMe

O

65 β-Sitosterol

HO

T.

ramalhoi GOMES, 2008. 66 Estigmasterol

HO

67 Lupeol

HO

20

68 Ácido 5-O-

Cafeoilmetoxiquínico

OH

OH

O

OOH

OHOH

HOOC

MeOCO

69 Apocinina C OO

OH

OH

OH

OH

OH

OH

O

70 Cinchonaínas OO

OH

OH

OH

OH

OH

OH

O

21

2.2.3. Descrição Botânica das T. casaretti e T. silvatica

2.2.3.1. Trichilia casaretti

A T. casaretti (Fig. 3) apresentou-se como árvores que medem de 5 a 8 m. Possuem

folhas medindo de 7 a 15,5 cm. Floresce de dezembro a fevereiro e frutos maduros dessa

espécie já foram coletados entre os meses de abril e setembro. No Brasil ela apresenta

diversos nomes vulgares, a depender do estado: Murta-vermelha e Baga-de-morcego (Santa

Catarina), Orvalho (Minas Gerais), Catiguá-branco (Rio Grande do Sul), e catiguá (Paraná,

Santa Catarina e Rio Grande do Sul). (KLEIN, 1984 apud PATRICIO et al, 2005).

Figura 3. Trichilia casaretti. A, hábito. B, inflorescência. C, flor sem corola, mostrando o

tubo estaminal. D, flor em corte longitudinal, mostrando androceu e gineceu. E, pétala. F,

gineceu. G, tubo estaminal aberto – face ventral. H, fruto. I, semente.

Fonte: PATRICIO & CERVI, 2005.

22

2.2.3.2. Trichilia silvatica

O nome Trichilia silvatica vem do latim silvatica e significa “que vive na floresta”.

(KLEIN, 1984, apud PATRICIO et al, 2005). Essa espécie (Fig. 4) apresentou-se como

árvores que medem entre e 5 e 10 metros de altura, com folhas medindo entre 8 e 24

centímetros de comprimento. Floresce de agosto a outubro e os frutos maduros surgem a

partir de novembro. No Brasil ela ocorre nos estados da Bahia, Rio de Janeiro, São Paulo,

Paraná, Santa Catarina e Paraná, denominada por alguns nomes vulgares tais como: Catiguá,

Catiguá-branco e Cutiavermelha (Santa Catarina) e Rosa-branca (Bahia). (PENNINGTON et

al, 1981 apud PATRICIO et al, 2005).

Figura 4. Trichilia silvatica. A, hábito. B, flor estaminada. C, flor em corte longitudinal,

mostrando androceu e gineceu. D, tubo estaminal aberto – face dorsal. E, pétala. F, flor

pistilada. G, gineceu. H, tubo estaminal aberto — face dorsal. I, fruto.

Fonte: PATRICIO & CERVI, 2005.

23

3. OBJETIVOS

3.1. Objetivo Geral

Realizar um estudo químico de espécies do gênero Trichilia visando obtenção de

substâncias com atividade inseticida.

3.2. Objetivos Específicos

1) Avaliar uma possível atividade inseticida dos extratos de folhas e cascas do caule

T. casaretti e T. silvatica;

2) Analisar uma análise preliminar, por RMN de 1H, dos extratos das folhas e cascas

do caule de T. casaretti e T. silvatica de espécies coletadas em diferentes períodos;

3) Isolar e identificar metabólitos secundários dos extratos de T. casaretti e T.

silvatica.

SEÇÃO II

PARTE EXPERIMENTAL

25

4. MATERIAIS E MÉTODOS

4.1. Materiais

4.1.1. Materiais e reagentes utilizados

As folhas e casca do caule foram moídas num liquidificador industrial Siemsen.

As fases estacionárias utilizadas na cromatografia em coluna foram sílica 60 (0,063-

0,200 mm) da Merck, Sephadex LH-20 da Pharmacia para permeação e sílica flash com

diâmetro de partícula entre 0,040-0,063 mm da Merck.

Nas placas de CCD foram utilizadas sílica gel GF254 da Merck e sílica gel PF254 da

Vetec, cuja suspensão era espalhada com espessura de 0,5 mm sobre placas de vidro que

foram ativadas em estufa a 100oC.

As cromatoplacas foram reveladas por irradiação com lâmpada ultravioleta nos

comprimentos de onda 254 e 365 nm ou com os reveladores químicos: ácido fosfomobilídico

e vapores de iodo.

Os solventes e reagentes utilizados foram grau PA das marcas Quimex, Vetec e Synth

e FMaia.

A eliminação do solvente foi realizada utilizando evaporador rotativo da marca

Fisatom.

4.1.2 Preparo de Reagente

Ácido fosfomobilídico: 4 g do ácido foram dissolvidos em 100 mL de etanol.

4.1.3 Condições utilizadas nas análises cromatográficas e espectrométricas

4.1.3.1 Análise por CG-EM dos sesqui- e diterpenos

As análises foram realizadas em um Cromatógrafo a Gás equipado com um detector

de massas Shimadzu QP5050. A coluna utilizada foi ELITE-5 de 30 m x 0,25 mm (di).

26

4.1.3.1.1. Análise dos óleos essenciais e dos sesquiterpenos isolados

Para análise dos óleos essenciais e alguns sesquiterpenos isolados das folhas da T.

silvatica e da T. casaretti as condições foram as seguintes: fluxo do gás de arraste (H2) foi 1,8

ml/min; temperaturas: do injetor, 220 ºC, da interface, 240 ºC e da coluna, 40º C isotérmica

durante 2 min, a partir daí programada na razão de 3 ºC/min, até atingir a temperatura máxima

de 240 ºC, permanecendo isotérmica por 30 min.

4.1.3.1.2. Análise das frações TsF1 e TsF3

Para as análises das demais amostras com constituintes voláteis utilizou-se outra

programação para o equipamento, sob as seguintes condições: fluxo do gás de arraste (H2) foi

1,8 ml/min; temperaturas: do injetor, 290 ºC, do detector, 290 ºC e da coluna, 100º C

isotérmica durante 1 minuto, a partir daí programada na razão de 5 ºC/min, até atingir a

temperatura máxima de 285 ºC, permanecendo isotérmica por 52 min.

4.1.3.1.3. Cálculo dos índices de retenção (IK).

Os índices de retenção (IK) foram calculados com base no Algoritmo de Kovats (Eq.

1), utilizando a série homóloga de hidrocarbonetos lineares de C9H20 (nonano) a C26H54 como

padrões.

Equação 1. Algoritmo de Kóvats.

IK = 100 (NC) + 100.[(log t’Rx) - (log t’Rz)] / [(log t’Rz+1) – log t’Rz)] Onde: IK – índice de retenção; NC – número de carbonos do hidrocarboneto que elui antes da substância analisada; t'Rx – tempo de retenção da substância analisada; t’Rz – tempo de retenção do hidrocarboneto que elui antes da substância analisada; t’Rz+1 – tempo de retenção da substância que elui depois da substância analisada.

27

4.1.3.2 Condições para análise por RMN de 1H e de 13C

Os espectros de Ressonância Magnética Nuclear de Hidrogênio (RMN de 1H) a 300

MHz e Ressonância Magnética Nuclear de Carbono 13 (RMN de 13C) a 75,5 MHz,

unidimensionais (1D) e bidimensionais (2D), foram registrados em espectrômetros Varian,

modelo GEMINI 2000 ou Mercury-300. Utilizou-se CDCl3 e CD3OD como solventes, e como

referência interna para estes o TMS. Os espectros foram obtidos no Instituto de Química da

UFBA e no Departamento de Química da UFV.

4.2 Coleta das espécies

As folhas e casca do caule de espécimes de Trichilia silvatica e Trichilia casaretti

foram coletadas na fazenda Brejo Novo (S 13º56’41” / O 40º06’33,9”; 617 m a 750 m), numa

Floresta estacional (Mata de Cipó), zona de transição, localizada no município de Jequié-BA,

nos meses de outubro de 2006 (1ª coleta) e janeiro de 2007 (2ª coleta). As Figuras 5 e 6

apresentam fotos das exsicatas depositadas no Herbário da UESB.

28

Figura 5. Foto da exsicata de Trichilia casaretti.

29

Figura 6. Foto da exsicata de Trichilia silvatica.

30

4.3 Preparo dos Extratos Vegetais

O material vegetal (folhas e casca do caule) foi seco em estufa com circulação de ar,

a 40 oC, e pulverizado. Em seguida, esse material foi submetido à maceração com hexano, à

temperatura ambiente, durante um período de 48 h. Esse procedimento foi repetido por três

vezes consecutivas. O filtrado obtido foi reunido e concentrado sob pressão reduzida,

originando os respectivos extratos hexânicos. O material vegetal retido após a última filtração

foi submetido à nova maceração, desta vez com etanol, durante um período de 48 h. Esse

procedimento também foi repetido por três vezes. O filtrado obtido foi reunido e concentrado

sob pressão reduzida, originando os respectivos os extratos etanólicos. O procedimento geral

para preparo dos extratos é apresentado de forma resumida na Figura 7.

Figura 7. Procedimento geral para preparo dos extratos.

A partir do procedimento descrito anteriormente foram obtidos os extratos analisados

nesse trabalho, e massa de cada um deles é apresentada na Tabela 1.

Torta Torta

31

Tabela 1. Massas (g, peso seco) dos materiais vegetais coletados.

MATERIAL T. silvatica T. casaretti

Massa (g)

1a COLETA 2a COLETA 1a COLETA 2a COLETA

Folhas 1526,04 651,77 448,43 321,20

Cascas do Caule 1241,50 552,69 114,10 228,20

Tabela 2. Massas dos extratos obtidos a partir do material vegetal coletado.

EXTRATO CÓDIGO MASSA (g)

1ª COLETA 2ª COLETA

Hexânico das Folhas da T. silvatica HFTs 18,00 7,18

Etanólico das Folhas da T. silvatica EFTs 24,75 13,42

Hexânico da Casca do caule da T. silvatica HcCTs 2,52 2,48

Etanólico da Casca do caule da T. silvatica ECcTs 82,22 57,02

Hexânico das Folhas da T. casaretti HFTc 11,24 10,30

Etanólico das Folhas da T. casaretti EFTc 21,38 21,09

Hexânico da Casca do caule da T. casaretti HCcTc 1,30 6,60

Etanólico da Casca do caule da T. casaretti ECcTc 5,26 11,70

Todos os extratos obtidos foram submetidos a análises preliminares por CCD e RMN

de 1H. Como não se observou diferenças significativas entre extratos similares, de material

coletado em diferentes períodos, esses foram reunidos para posterior fracionamento.

4.4 Fracionamento do extrato etanólico das folhas da Trichilia silvatica

(EFTs)

Com base nas análises dos espectros de RMN de 1H e no perfil cromatográfico em

CCD, o extrato EFTs (38,17 g) foi escolhido para fracionamento inicial. Esse extrato foi então

submetido à CC filtrante, empregando-se sílica gel 60 como suporte e utilizando-se como fase

móvel inicialmente o solvente hexano e, gradativamente, aumentou-se a polaridade,

utilizando-se desde misturas de HEX:AE até acetato de etila e MeOH puros. Desta coluna

32

foram recolhidas 44 frações de 500 mL, as quais, após análises em CCD, utilizando vapor de

iodo e luz UV (λ=254 nm) como reveladores, foram reunidas em 11 grupos (Fig. 8).

Figura 8. Fluxograma obtido a partir do fracionamento da fração EFTs.

A sub-fração EFTs3 (2,223 g) foi fracionada com CC empregando-se sílica gel 60

como suporte e utilizando-se como hexano como fase móvel inicial e, posteriormente,

misturas de HEX:AE com polaridades crescentes. Dessa coluna forma recolhidas 130 frações,

as quais, após análises em CCD, utilizando ácido fosfomolibídico e luz UV (λ=254 nm) como

reveladores, foram reunidas 13 grupos. Nesse fracionamento foi obtido um sólido alaranjado,

EFTs 3.7 (TsF1), o qual foi submetido à análise por CG-EM.

A sub-fração EFTs3.6 foi fracionada, aplicando-se sílica gel 60 como suporte e

Hexano puro como solvente inicial. Em seguida foram introduzidas misturas de Hex/Acet em

polaridades crescentes e finalizou-se a coluna com MeOH. Desse fracionamento foram

obtidas 150 frações, as quais após análises em CCD e UV foram reunidas em 13 grupos (Fig.

9). O grupo EFTs 3.6.7 foi submetido a novo fracionamento, novamente utilizando sílica gel

60 como suporte e Hexano como fase móvel inicial. Do fracionamento do grupo EFTs 3.6.7,

33

foram obtidas 72 frações, as quais foram analisadas por CCD e UV, e agrupadas em 10

frações, dentre as quais a fração EFTs 3.6.7.2 (TsF3), uma substância oleosa de coloração

alaranjada, a qual foi submetida a análise por CG-EM pra posterior caracterização.

Figura 9. Fluxograma obtido a partir do fracionamento da sub-fração EFTs3.6.

Da fração EFTs3 procedeu-se também com o fracionamento da sub-fração EFTs 3.8.

A mesma foi submetida ao processo de cromatografia em coluna, utilizando como suporte

sílica gel 60 e Hexano como eluente inicial. A seguir foram aplicadas misturas de Hex/Acet

com polaridades crescentes. Nesse procedimento obteve-se 133 frações, as quais, após

análises em CCD utilizando ácido fosfomolíbdico como revelador e radiação UV, foram

agrupadas em 14 grupos, como apresentado na Figura 10. A sub-fração EFTs 3.8.9 foi

submetida a procedimento similar, obtendo-se agora 74 frações reunidas em 9 grupos. O

grupo EFTs3.8.9.6 foi submetido a outra separação cromatográfica, em condições

semelhantes às duas ocorridas anteriormente, originando 38 frações, agrupadas logo depois

em 5 grupos, dentre eles o grupo EFTs3.8.9.6.3 (TsF2), um óleo transparente que foi

submetido a análise por CG-EM.

34

Figura 10. Fluxograma obtido a partir do fracionamento da fração EFTs 3.8.

As subfrações EFTs1 (461 mg) e EFTs2 (943 mg) foram reunidas para

fracionamento em CC, empregando sílica gel 60 como suporte e utilizando-se hexano como

fase móvel inicial e, posteriormente, misturas de HEX:AE em polaridades crescentes. Dessa

coluna foram obtidas 83 frações, as quais, após análises em CCD, utilizando ácido

fosfomolibídico e luz UV (λ=254 nm) como reveladores, foram reunidas em 9 grupos (Fig.

11). As subfrações EFTs2A.5 (36,8 mg) e EFTs2A.6 (913,9 mg) foram submetidas à CCDP

em sílica gel PF254 (Fig. 11), utilizando como eluente misturas de HEX:AE (8:2), em ambos

os casos. Desses fracionamentos foram obtidas as sub-frações TsF5 e TsF6, duas substâncias

de aspecto oleosas, as quais foram submetidas a análises por RMN de 1H e 13C para

identificação.

35

Figura 11. Fluxograma obtido a partir do fracionamento das frações EFTs5 e EFTs6.

A sub-fração EFTs5 (3,116 g) foi submetida a fracionamento em CC, empregando-se

sílica gel 60 como suporte e hexano como solvente inicial. Posteriormente, utilizou-se como

eluente misturas de HEX:AE com polaridades crescentes. Dessa coluna foram obtidas 138

frações, as quais, após análises em CCD, utilizando ácido fosfomolibídico e luz UV (λ=254

nm) como reveladores, foram reunidas em 8 grupos (Fig. 12).

A sub-fração EFTs5.6 (474,2 mg) foi submetida a fracionamento em CC,

empregando-se sílica gel 60 como suporte e como solvente inicial hexano e, posteriormente,

misturas de HEX:AE com polaridades crescentes. Foram obtidas 106 frações dessa coluna, as

quais, após análises em CCD, utilizando ácido fosfomolibídico e luz UV (λ=254 nm) como

reveladores, foram reunidas em 13 grupos.

A sub-fração EFTs5.6.6 (207,7 mg) foi submetida a fracionamento em CC,

empregando-se sílica gel 60 como suporte e como solvente inicial hexano e, posteriormente,

misturas de HEX:AE com polaridades crescentes. Foram obtidas 79 frações dessa coluna, as

quais, após análises em CCD, utilizando ácido fosfomolibídico e luz UV (λ=254 nm) como

reveladores, foram reunidas em 9 grupos. A fração EFTs 5.6.6.3 apresentou-se como um

sólido branco, o qual foi denominado TsF4, e submetido a análises por RMN de 1H e 13C para

identificação.

36

Figura 12. Fluxograma de frações obtidas a partir do fracionamento de EFTs5.

Do extrato etanólico das folhas da T. silvatica fracionou-se também o grupo EFTs 4,

obtido do fracionamento inicial. Para tanto, aplicou-se a técnica de CC, empregando sílica gel

60 como suporte e Hexano como solvente inicial. Em seguida, foram introduzidas misturas de

Hex/Acet em polaridades crescentes. Assim foram obtidas 74 frações, analisadas por CCD,

utilizando radiação UV e ácido fosfomolíbdico como reveladores, as mesmas foram reunidas

em 8 grupos. A sub-fração EFTs4.4 passou por novo fracionamento, em condições

semelhantes ao procedimento anterior, apenas substituindo o hexano puro por uma mistura de

Hex/Acet como solvente inicial, e aumentando gradativamente a polaridade do eluente. Desse

modo obteve-se 35 frações, reunidas em 6 grupos após análises em CCD. Por fim, procedeu-

se com o fracionamento da sub-fração EFTs4.4.4, empregando novo procedimento de CC,

idêntico ao procedimento adotado para a sub-fração EFTs4.4. Deste foram obtidas 21 frações,

as quais foram analisadas e reunidas em 5 grupos, incluindo o grupo EFTs 4.4.4.2 (TsF7)(Fig.

13).

37

Figura 13. Fluxograma das frações obtidas a partir do fracionamento de EFTs4.

4.5 Fracionamento do extrato hexânico das folhas da Trichilia casaretti

(HFTc)

Com base no perfil cromatográfico apresentado em CCD, além das análises de RMN

de 1H, o HFTc (21,54 g) foi o segundo escolhido para o fracionamento. Esse extrato foi então

submetido a fracionamento cromatográfico em CC, utilizando-se sílica gel 60 como suporte e

como solvente inicial hexano e, posteriormente, misturas de HEX:AE com polaridades

crescentes. Dessa coluna foram obtidas 91 frações, as quais, após análises em CCD, utilizando

ácido fosfomolibídico e luz UV (λ=254 nm) como reveladores, foram reunidas 8 grupos (Fig.

14).

A sub-fração HFTc5 (1,0605 g) foi submetida a fracionamento em CC, utilizando-se

sílica gel 60 como suporte e uma mistura de HEX:AE (9:1) como solvente inicial.

Posteriormente, foram utilizadas misturas de HEX:AE com polaridades crescentes. Dessa

38

coluna obteve-se 67 frações, as quais foram reunidas em 10 grupos (Fig. 14), após análises em

CCD, utilizando ácido fosfomolibídico e luz UV (λ=254 nm) como reveladores.

A sub-fração HFTc5.4 (535,6 mg) foi fracionada em CC, fazendo uso de sílica gel

60 como fase estacionária e uma mistura de HEX:AE como solvente inicial. Misturas de

HEX:AE com polaridades crescentes foram utilizadas em seguida. Obteve-se 78 frações dessa

coluna, as quais foram reunidas em 9 grupos, após análises em CCD utilizando ácido

fosfomolibídico e luz UV (λ=254 nm) como reveladores. A sub-fração HFTc5.4.4 (TcF1) foi

submetida a análises por RMN de 1H e 13C a fim de proceder com a identificação das mesmas.

Figura 14. Fluxograma obtido a partir do fracionamento de HFTc.

A sub-fração HFTc8 (1,8934 g) foi submetida a fracionamento em CC, fazendo uso

de sílica gel 60 como suporte e uma mistura de HEX:AE (8:2) com solvente. Foram utilizadas

posteriormente, outras misturas de HEX:AE com polaridades crescentes. Nesse primeiro

momento, obteve-se 100 frações, reunidas a seguir em 12 grupos (Fig. 15), com base nas

análises em CCD, utilizando ácido fosfomolibídico e luz UV (λ=254 nm) como reveladores.

A sub-fração HFTc8.7 (123,3 mg) foi levada a fracionamento em CC, utilizando-se

Sephadex LH-20 como suporte e MeOH como eluente. O fracionamento resultou na obtenção

39

de 13 frações, reunidas posteriormente em 2 grupos, depois das análises em CCD, com uso de

ácido fosfomolibídico e luz UV (λ=254 nm) como reveladores.

A sub-fração HFTc8.7.2 (107,2 mg) foi então conduzida a uma CCDP, suportada em

sílica gel PF254 e tendo uma mistura de HEX:AE(4:6) como fase móvel. Desse fracionamento

foi obtida a fração HFTc8.7.2.2 (TcF2), uma substância oleosa, ligeiramente esverdeada, a

qual foi submetida a análises de RMN de 1H e 13C e CG-EM para identificação.

Figura 15. Fluxograma obtido a partir do fracionamento da fração HFTc8.

Do extrato hexânico das folhas da T. casaretti fracionou-se ainda a sub-fração

HFTc6, através de procedimento cromatográfico em coluna, utilizando sílica gel 60 como

suporte e misturas de Hex/Acet com polaridades para eluição. Obteve-se 78 frações,

analisadas por CCD e reunidas em 9 grupos, conforme Figura 16. O grupo HFTc6.5 foi

escolhido para novo fracionamento, o qual ocorreu de modo isocrático, empregando sephadex

LH-20 e MeOH como eluente. Foram obtidas 26 frações, as quais após analisadas por CCD,

foram agrupadas em 4 grupos. Por fim, o grupo HFTc6.5.3 passou por nova separação

cromatográfica em coluna, empregando novamente Sephadex LH-20 como fase estacionária e

MeOH como eluente. Obteve-se mais 20 frações, que foram reunidas em 03 grupos, após as

análises em CCD, reveladas em radiação UV e ácido fosfomolíbdico. O óleo obtido na fração

40

HFTc6.5.3.3 (TcF3) foi levado a análises por CG-EM e RMN de 1H e 13C, para possibilitar a

identificação do mesmo.

Figura 16. Fluxograma obtido a partir do fracionamento da fração HFTc6.

41

4.6 Extração dos óleos essências

Foram extraídos os óleos essências folhas da T. silvatica (OETs) e da T. casaretti (OETc),

respectivamente. Para tanto, utilizou-se uma aparelhagem do tipo Clevenger (Fig. 17) e um

procedimento de hidrodestilação. Nesse procedimento, cada amostra de 250 g de folhas foi

colocada num balão volumétrico de 500 mL, onde se adicionou 350 mL de água. Após duas

horas de destilação, ao hidrolato, recolhido num funil de separação, se adicionou Na2SO4

(anidro) e lavou-se com 20 mL de pentano por três vezes. O filtrado foi recolhido e enviado

para análises por CG/EM.

Figura 17. Aparelhagem do tipo Clevenger, utilizada na extração de óleos essenciais.

42

4.7 Ensaios biológicos para avaliar a atividade Inseticida dos Extratos das

Folhas e da Casca do Caule de T.silvatica e T. casaretti

Foram realizados ensaios biológicos para avaliar uma possível atividade inseticida dos

extratos HFTs, EFTs, HFTc E EFTc sobre três espécies de insetos: Plutella xylostella L.

(Lepidoptera: Plutellidae), Blatella germânica L. (Dictyoptera: Blattellidae) e Diaphania

hyalinata L. (Lepidoptera: Pyralidae).

Os extratos (50 mg) foram dissolvidos em 1 mL de etanol ou metanol, transferidos

para frascos de vidro de 10 mL e o solvente evaporado à temperatura ambiente. Após

completa evaporação do solvente, grupos de 10 insetos de cada espécie foram transferidos

para os vidros contendo os respectivos extratos ou frações.

Após a montagem dos experimentos, os frascos contendo as espécies foram supridos

com alimentos apropriados para cada espécie.

Em todos os tratamentos os frascos de vidros foram colocados em uma estufa

incubadora, a 25±0.5 oC, 75±5% de umidade relativa, com um fotoperíodo de 12 h. A

mortalidade dos insetos foi aferida 12 e 24 h após a montagem dos experimentos. Para cada

experimento foi realizado um controle, utilizando-se apenas o solvente (etanol ou metanol).

Todos os experimentos e respectivos controles foram conduzidos em triplicata.

SEÇÃO III

RESULTADOS E DISCUSSÃO

44

5. RESULTADOS E DISCUSSÃO

A partir do estudo químico de extrato etanólico das folhas da T. silvatica foi possível

identificar os constituintes presentes em sete frações: α-tocoferol (vitamina E) em TsF1;

espatulenol e veridiflorol em TsF2; espatulenol, óxido de humuleno e palmitato de etila em

TsF3; β-sitosterol em TsF4; humuleno 2,3;6,7-diepóxido e mustacona em TsF5 e TsF6,

respectivamente, e uma mistura de triterpenos em TsF7. Além disso, 16 sesquiterpenos foram

identificados no óleo essencial das folhas.

Já do extrato hexânico das folhas da T. casaretti, foi possível identificar os

constituintes de três frações: uma mistura dos esteróides β-sitosterol e estigmasterol em TcF1;

o sesquiterpeno aromadendrano-4β,10α-diol em TcF2 e o diterpeno 8-epi-esclareol em TcF3.

Da análise do óleo essencial foram identificados oito sesquiterpenos.

Estas substâncias foram identificadas pela análise dos dados espectrais de RMN de 1H e 13C uni e bidimensionais e por CG-EM.

5.1. Ensaios biológicos para avaliar a atividade inseticida dos extratos

Os extratos hexânicos e etanólicos das folhas e casca do caule de T. silvatica e T.

casaretti foram avaliados quanto a suas atividades inseticida sobre os insetos Plutella

xylostella, Blatella germanica e Diaphania hyalinata e os resultados são apresentados na

Tabela 3.

45

Tabela 3. Resultados dos ensaios biológicos realizados com os extratos brutos de T. silvatica

e T. casaretti

Nº Extrato Mortalidade (%)

D. hyalinata B. germanica P. xylostella 12 h 24 h 12 h 24 h 12 h 24 h

1* ECcTc 3,3 17,0 3,3 3,3 0,0 6,4 2 EFTc 3,3 20,0 0,0 3,7 3,3 0,0 3 ECcTs 0,0 0,0 3,0 3,0 3,7 10,3 4 HFTs 0,0 0,0 5,6 8,9 0,0 4,1 5 HFTc 0,0 16,7 0,0 0,0 14,2 14,2 6 HCcTc 6,7 10,0 0,0 3,3 3,3 6,7

7** HCcTc-A 0,0 8,3 4,1 36,1 0,0 0,0 8 HFTc-A 0,0 10,0 0,0 3,7 3,3 17,4 9 EFTc-A 10,0 10,0 0,0 15,7 0,0 16,7

10 ECcTc-A 11,7 11,0 0,0 11,1 16,7 16,7 11 HCcTs-A 0,0 11,7 13,7 17,4 26,7 43,3 12 HFTs-A 0,0 0,0 0,0 3,7 10,8 14,2 13 EFTs-A 0,0 0,0 7,4 11,1 24,2 34,2 14 ECcTs-A 0,0 3,7 7,7 19,6 0,0 10,0

*(1–6) Extratos da primeira remessa de material coletado em outubro de 2006. ** (7–14) Extratos da segunda remessa de material coletado em janeiro de 2007.

Apesar de vários estudos realizados sobre atividades inseticidas de espécies do

gênero Trichilia (Quadro 1), as espécies estudadas nesse trabalho não apresentaram atividades

significativas. Plutella xylostella foi o inseto, dentre aqueles utilizados nos ensaios biológicos,

que apresentou maior sensibilidade aos extratos. De um modo geral, o extrato hexânico das

cascas do caule de T. silvatica foi o que apresentou maior atividade (43,3% de mortalidade)

dentre todos avaliados. No entanto, a toxicidade deste extrato, para os insetos testados, é

considerada relativamente baixa. A baixa atividade inseticida apresentada pelos extratos de T.

silvatica e T. casaretti pode indicar uma possível ausência de substâncias da classe dos

limonóides nestas espécies, uma vez que, estes são os principais responsáveis pela atividade

inseticida de plantas da família Meliaceae.

46

5.2. Constituintes químicos das folhas de T. silvatica

5.2.1. Constituintes isolados e/ou identificados do extrato etanólico

5.2.1.1. Constituintes identificados por CG-EM

5.2.1.1.1. TsF1: α-tocoferol (1)

(1)

TsF1 foi obtido da fração EFTs3, constituída por um óleo alaranjado. Sua

identificação foi realizada com base na análise por CG-EM. O cromatograma desta fração

(Fig. 18) mostrou a presença de três principais picos, sendo o composto referente ao pico

majoritário, denominado de TsF1, correspondendo a, aproximadamente, 65% da constituição

total da fração. A comparação do espectro de massas de TsF1 (Fig. 19) com espectros da

biblioteca Wiley 7th ed., indicou a possibilidade de este composto ser a vitamina E (α-

tocoferol). Para confirmação desta hipótese, uma amostra padrão foi analisada nas mesmas

condições. A semelhança entre os tempos de retenção e os espectros de massas de TsF1 (Fig.

19) e do α-tocoferol (Fig. 20), possibilitou a confirmação TsF1.

Figura 18. Cromatograma da fração TsF1: α-Tocoferol (1).

O

HO

47

Figura 19. Espectro de massas (IE) de TsF1: α-Tocoferol (1).

Figura 20. Espectro de massas (IE) de uma amostra padrão de α-Tocoferol.

48

O espectro de massas apresenta como fragmentos principais íons de m/z 165, 205 e

430. Poter e Baldas (apud SIQUEIRA et al., 2003) propõem uma rota de fragmentação para o

acetato de tocoferila: o íon de m/z 430 formado (Esquema 1, p. 48) sofre um processo de

fragmentação através de um rearranjo de hidrogênio (a) uma reação de retro Diels-Alder (b)

no anel pirânico do tocoferol, para dar origem ao íon m/z 165, ou a perda da cadeia alquílica

lateral para formar o fragmento m/z 205.

O

HO

3

O

HO

OH

HO

ab

Esquema 1. Rota de fragmentação padrão proposta para os ésteres do α-tocoferol. Fonte: SIQUEIRA et al., 2003.

5.2.1.1.2. TsF2: Mistura de sesquiterpenos

H

HO H

OH

Espatulenol (2) Veridiflorol (3)

A amostra TsF2, constituída por um óleo, foi analisada por CG-EM e o cromatograma

obtido desta análise (Fig 21), revelou que esta era constituída por dois componentes

majoritários TsF2A e TsF2B, correspondentes, aos picos 4 e 5, respectivamente. Além destes

dois compostos, a presença de vários outros constituintes minoritários também foi observada.

C29H50O2 m/z 430

C13H17O2 m/z 205

49

Entretanto, por esta metodologia, só foi possível identificar os dois principais constituintes

desta fração, TsF2A e TsF2B, correspondentes aos sesquiterpenos espatulenol (2) e

veridiflorol (3), respectivamente, presentes em TsF2 na concentração relativa de

aproximadamente 30% e 28%.

A Tabela 4 mostra os índices de retenção (IK) calculados para os constituintes

presentes nesta fração, bem como, comparação dos IK calculados com aqueles da literatura

(ADAMS, 1995) para os compostos identificados. As figuras 22 e 23 apresentam os

respectivos espectros de massas das substâncias identificadas nessa fração.

Figura 21. Cromatograma da amostra TsF2.

Tabela 4. Substâncias identificadas na fração TsF2

PICO IK cal IK Lit. Substância FM m/z (int. rel.)

1 1387 não identificado



4 1559 1576 Espatulenol C15H24O 43(100), 220(2). .

5 1573 1590 Veridiflorol C15H26O 43(100) 222(1)




50

Figura 22. Espectro de massas do Pico 4 de TsF2: Espatulenol (2).

Figura 23. Espectro de massas do Pico 5 de TsF2: Veridiflorol (3).

5.2.1.1.3. TsF3: veridiflorol (3), óxido de humuleno (4) e palmitato de etila

(5)

O

O

O

Óxido de humuleno (4) Palmitato de Etila (5)

51

A fração TsF6, constituída de um óleo de coloração amarela, também foi analisada por

CG-EM. O cromatograma dessa fração (Fig 24) mostrou um total de 44 picos, revelando que

a mesma era constituída por uma mistura complexa de substâncias. Apesar da diversidade de

constituintes químicos presentes em TsF3, só possível identificar as substâncias

correspondentes aos picos 7 (TsF3A), 10 (TsF3B) e 20 (TsF3C), cujos dados são

apresentados na Tabela 5 e nas figuras 25, 26 e 27, respectivamente. Dos constituintes

identificados, TsF3A, correspondente a 4,36%, TsF3B a 4,68% e TsF3C a 11,72% da fração

TsF3.

Apesar de serem observados 44 picos no cromatograma da Fig. 24, só foi possível

calcular o IK para 27 destes, uma vez que o tempo de retenção dos demais estava acima do

tempo de retenção do hidrocarboneto padrão de maior cadeia (C26H54), disponível para esta

análise.

Figura 24. Cromatograma da fração TsF3, obtido a partir da análise por CG-EM.

Figura 25. Espectro de massas do Pico 7 de TsF3 – TsF3A: Óxido de Humuleno (4).

52

Figura 26. Espectro de massas do Pico 10 de TsF3 – TsF3B: Veridiflorol (3).

Figura 27. Espectro de massas do Pico 20 de TsF3 – TsF3C: Palmitato de etila (5).

53

Tabela 5. Substâncias identificadas da fração TsF3

PICO IK cal IK Lit. Substância FM m/z (int. rel.)







7 1589 1606 Óxido de

Humuleno C15H24O 43(100) 220(1)



10 1609 1590 Veridiflorol C15H26O 43(100) 204(14)










20 1963 1983 Palmitato de etila C18H36O2 88(100), 284(6)








54

5.2.1.2. Constituintes identificados por RMN

5.2.1.2.1. TsF4: β-sitosterol (6)

A fração TsF4 apresentou-se como um sólido cristalino esbranquiçado, em forma de

agulhas. O espectro de RMN de 1H (Fig. 28) desta substância apresentou uma grande

quantidade de sinais relativos a hidrogênios metílicos, metilênicos e metínicos, na região de

δ 0,60–2,30, o que indicou a sua natureza alifática. Os sinais claramente observados neste

espectro foram aqueles de H-6 (δ 5,36, d; J = 5,4 Hz, 1H), correspondente a um hidrogênio

olefínico e de H-3 (δ 3,52, m), característico de hidrogênio geminal a um grupo hidroxila.

No espectro de RMN de 13C (Fig 29) os sinais em δ 140,7 (C-5) e δ 121,7 (C-6),

característicos de ligação dupla de compostos com esqueleto do tipo colestaneno (ZANON et

al, 2008) e em δ 71,8 (C-3) indicativo de carbono ligado a hidroxila, além dos sinais

correspondentes a 26 carbonos, observados na região de δ 56,8 a 11,9, sugeriram se tratar de

um esteróide. A comparação desses dados com aqueles descritos na literatura (Tabela 6),

possibilitou a identificação de TsF4 como o β-sitosterol (6), um esteróide comumente

encontrado em plantas.

HO

H

H H

1

3

6

15

1911

28

26

27

(6)

55

Tabela 6. Dados de RMN de 13C, de TsF4 comparados com dados do β-sitosterol

C TsF4

δ ( CDCl3) ββββ-sitosterol1

δ (CDCl3) ββββ-sitosterol2

δ (CDCl3) 1 37,3 37,3 37,2 2 31,7 31,9 31,6 3 71,8 71,8 71,8 4 42,3 42,3 42,3 5 140,7 140,8 140,7 6 121,7 121,7 121,7 7 31,9 31,9 31,9 8 31,9 31,9 31,9 9 50,1 50,2 50,1 10 36,5 36,5 36,1 11 21,1 21,1 21,1 12 39,8 40,5 39,9 13 42,3 42,3 42,3 14 56,8 56,9 56,6 15 24,3 24,4 24,3 16 28,2 28,9 28,8 17 56,1 56,0 56,0 18 12,0 12,1 11,9 19 19,4 19,4 19,4 20 36,1 36,5 36,1 21 18,8 19,0 18,8 22 34,0 31,9 33,9 23 26,1 25,4 26,6 24 45,9 42,3 45,5 25 29,2 28,9 29,1 26 19,8 21,1 19,9 27 19,0 19,4 19,0 28 23,1 24,4 23,0 29 11,9 12,1 12,0

(1) – Fonte: BORGES, 2006

(2) – Fonte: KOJIMA et al., 1990.

56

Fig

ura

28. E

spec

tro

de R

MN

de

1 H (C

DC

l 3, 3

00 M

Hz)

da

fraç

ão T

sF4:

β-s

itost

erol

(6)

57

Fig

ura

29. E

spec

tro

de R

MN

de

13C

(CD

Cl 3

, 75

MH

z) d

a fr

ação

TsF

4: β

-sito

ster

ol (6

).

58

5.2.1.2.2. TsF5 - TsF5A: (2S,3S,6R,7R)-humuleno-2,3;6,7-diepóxido (7A) e

TsF5B: (2R,3R,6R,7R)-humuleno-2,3;6,7-diepóxido (7B)

O

O

1

23

67

9

11

12

13

14

15

O

O

HH

O

O

H

H

(7) (7A) (7B)

O cromatograma obtido para a fração TsF5 na análise por CG-EM (Fig. 30),

possibilitou observar a presença de dois constituintes principais nessa fração (TsF5A e

TsF5B), representados pelos picos 2 (Tr=45,994 min) e 3 (Tr=46,403 min), os quais

correspondem, respectivamente, a aproximadamente 66% e 22% do total de constituintes da

fração.

Figura 30. Cromatograma da fração TsF5 obtido na análise por CG-EM.

Os espectros de massas de TsF5A e TsF5B (Fig. 31 e 32) foram praticamente

idênticos e apresentaram o pico do íon molecular m/z = 236. A massa molecular 236 sugeriu a

fórmula molecular C15H24O2, indicando a possibilidade de serem dois sesquiterpenos

oxigenados. No entanto, apenas pela comparação destes espectros com aqueles da biblioteca

(Wiley 7th Ed) do CG-EM, não foi possível propor uma fórmula estrutural para estes

sesquiterpenos, uma vez que os espectros selecionados por similaridade, ainda eram bastante

diferentes daqueles obtidos para os compostos presentes em TsF5, e nenhum deles foi

compatível com MM=236.

59

Figura 31. Espectro de massas (IE) de TsF5A.

Figura 32. Espectro de massas (IE) de TsF5B.

No espectro de RMN de 1H (Fig 33), os principais sinais observados para o composto

principal (TsF5A) foram um dupleto em δ 5,30 (J=15,6 Hz; H-5); um duplo duplo dupleto em

δ 5,47 (J=15,6; 10,5 e 4,8 Hz; H-6), indicando a presença de dois hidrogênios olefínicos; e

quatro simpletos em δ 1,31 (6H), δ 1,20 (3H) e δ 1,08 (3H), correspondentes a quatro metilas

ligadas a carbonos não hidrogenados.

O espectro de RMN de 13C (Fig. 34) de TsF5 apresentou dois conjuntos de sinais

correspondentes a 15 carbonos cada, confirmando se tratarem de dois sesquiterpenos, como já

indicado na análise por CG-EM. Estes conjuntos de sinais foram diferenciados entre si pela

intensidade dos sinais pertencentes a cada composto, compatível com a concentração relativa

de TsF5A:TsF5B (3:1), indicada no cromatograma da Figura 30. A grande similaridade entre

os valores de deslocamentos químicos observada tanto no espectro de RMN de 1H, quanto no

espectro de RMN de 13C, associada à grande semelhança entre os espectros de massas destes

(Fig. 31 e 32), indicaram a possibilidade de que TsF5A e TsF5B fossem estereoisômeros.

Com base no espectro de DEPT foi possível verificar a presença de quatro carbonos

metílicos: δ 16,7(C-12), δ 23,6(C-13), δ 30,9(C-14) e δ 16,7(C-15), quatro carbonos

metilênicos: δ 38,5(C-1), δ 35,0(C-4), δ 25,4(C-5) e δ 43,5(C-8), quatro carbonos metínicos: δ

64,9(C-2), δ 60,5(C-6), δ 122,8(C-9) e δ 143,1(C-10), e três carbonos não hidrogenados. Esta

informação possibilitou confirmar que todos os 24 hidrogênios, indicados pela fórmula

C15H24O2, estavam ligados a carbonos.

60

Os sinais observados no espectro de RMN de 13C de TsF5A, em δ 143,1(C-5) e δ

122,8(C-6) caracterizaram a presença de dois carbonos sp2. Já os sinais δ 64,9(CH-2), δ

63,6(C-1), δ 60,5(C-9) e δ 60,4(C-8), caracterizaram a presença de dois anéis oxiranos

trissubstituídos. A presença de quatro metilas também foi facilmente evidenciada pelos sinais

observados em δ 30,9(C-14), δ 23,6 (C-13) e 16,7 (C-12 e C-15), em conformidade com os

dados obtidos no espectro de RMN de 1H (Fig 33). Na Tabela 5 também são apresentados os

dados de RMN de 13C para TsF5B (constituinte minoritário), entretanto, não foi possível

tabular os dados de RMN de 1H, uma vez que a maioria dos sinais aparece sobrepostos com

os sinais de TsF5A (composto majoritário).

A partir dos dados obtidos nos espectros de massas, de RMN de 1H e RMN de 13C,

foi proposta a estrutura do humuleno diepóxido para os compostos presentes em TsF5. Estes

dados foram então comparados com os dados de vários isômeros do humuleno diepóxido

existentes na literatura (HEYMANN et al, 1994; HAYANO et al, 1996), evidenciando que a

fração TsF5 era constituída pelos estereoisômeros (2S,3S,6R,7R)-humuleno-2,3:6,7-diepóxido

(7A) e (2R,3R,6R,7R)-humuleno-2,3:6,7-diepóxido (7B). A comparação dos dados de RMN

de 13C, destes compostos com os dados de TsF5A e TsF5B é apresentada na Tabela 7.

61

Tabela 7. Dados de RMN de 13C de TsF5A e TsF5B comparados com dados da literatura dos

estereoisômeros (2S,3S,6R,7R) e (2R,3R,6R,7R) do humuleno-2,3;6,7-diepóxido

C

TsF5A (CDCl3)

TsF5A (CDCl3)1

TsF5A (CDCl3)

7A* (CDCl3)2

TsF5B (CDCl3)

7B** (CDCl3)2

δδδδH δδδδH δδδδC δδδδC δδδδC δδδδC 1 1,38 (m, 3H) 1,38 (dd, J=14; 9,5

Hz; 1H) 38,5 38,3 40,9 40,7

2 2,47 (d, J=9,3Hz; 1H)

2,48 (d, J=9,5Hz; 1H)

64,9 64,6 64,3 64,0

3 - - 63,6 63,3 63,2 63,0 4 1,08 (s, 1H) 1,08 (td, J=13,5; 5

Hz; 1H) 35,0 34,8 34,7 34,5

5 1,38 (m, 3H) 1,38 (dddd, J13,5; 10; 4; 2,5 Hz; 1H)

25,4 25,2 27,0 26,8

6 2,72 (dd, J=12, 4,8 Hz; 1H)

2,73 (dd, J=10; 5 Hz; 1H)

60,5 60,3 60,9 60,6

7 - - 60,4 60,1 63,2 63,0 8 1,64 (t, J=11,4 Hz;

1H) 1,65 (t, J=10,5 Hz;

1H) 43,5 43,3 42,5 42,3

9 5,47 (d, J=15,6; 10,5; 4,8 Hz; 1H)

5,49 (ddd, J=16; 10,5;

5 Hz; 1H)

122,8 122,6 124,0 123,8

10 5,30 (d, J=15,6 Hz; 1H)

5,31 (d, J=16 Hz; 1H)

143,1 142,8 142,6 142,4

11 - - 35,9 35,6 37,0 36,8 12 1,29 (s, 3H) 1,31 (s, 3H) 16,7 16,4 19,2 19,0 13 1,18 (s, 3H) 1,20 (s, 3H) 23,6 23,3 23,7 23,5 14 1,07 (s, 3H) 1,08 (s, 3H) 30,9 30,7 30,3 30,0 15 1,29 (s, 3H) 1,31 (s, 3H) 16,7 16,4 16,6 16,3

(*) (2S, 3S, 6R, 7R)-humuleno-2,3:6,7-diepoxido (**) (2R, 3R, 6R, 7R)-humuleno-2,3:6,7-diepóxido (1) Fonte: HEYMANN et al, 1994. (2) Fonte: HAYANO et al, 1996.

62

Fig

ura

33. E

spec

tro

de R

MN

de

1 H (C

DC

l 3, 3

00 M

Hz)

da

fraç

ão T

sF5:

Mis

tura

de

este

reoi

sôm

eros

do

Hum

ulen

o di

epóx

ido

(7A

) e (7

B).

63

Fig

ura

34.

Esp

ectr

o de

RM

N d

e 13

C (C

DC

l 3, 7

5 M

Hz)

da

fraç

ão T

sF5:

Mis

tura

de

este

reoi

sôm

eros

do

Hum

ulen

o di

epóx

ido

(7A

) e (7

B).

64

5.2.1.2.3. TsF6: mustacona (8)

O

H

H

23

47

10

15

12 13

11

14

(8)

A fração TsF6 foi analisada por CG-EM e o cromatograma obtido (Fig. 35) indicou

que esta era constituída por um composto majoritário, correspondente ao pico 4 (Tr = 44,255

min), com concentração relativa de aproximadamente 72%, o qual foi denominado de TsF6A.

Para este composto foi calculado o índice de retenção (índice de Kovats, IK), de acordo com a

fórmula do item 3.1.3.1.3, cujo valor obtido foi de 1695.

Figura 35. Cromatograma da fração TsF6.

O espectro de massas de TsF6A (Figura 36) apresentou o pico do íon molecular em

m/z = 218. A comparação deste espectro com aqueles da biblioteca do equipamento (Wiley 7th

ed.), mostrou uma similaridade de 82% com o espectro de massas de Vulgarona B (8A), um

sesquiterpeno de fórmula molecular C15H22O (MM = 218). Entretanto, os dados de RMN

obtidos na literatura (MEEPAGALA, 2003) para a vulgarona B não são compatíveis àqueles

observados para a TsF6A.

65

Figura 36. Espectro de massa de TsF6A: mustacona (8).

O

Estrutura de vulgarona B

(8A)

No espectro de RMN de 1H de TsF6A (Fig. 37) observou-se a presença dos

principais sinais em: δ 5,74 (sext ap., J = 1,5 Hz, 1H), indicativo de hidrogênio olefínico; em

δ 2,68 (dd, J = 6,6 e 1,5 Hz, 1H) e δ 1,98 (dd, J = 6,6 e 1,5 Hz, 1H), característicos de

hidrogênios cis localizados em vértices opostos de um anel ciclobutano, como já reportado na

literatura (NYASSE, 1988); em δ 0,86 (d, J=6,6 Hz; 3H, H-13) e δ 0,85 (d, J=6,6 Hz; 3H, H-

12), indicando a presença de duas metilas de grupo isopropil; em δ 0,97 (s, 3H, H-15) uma

metila ligada a um carbono não hidrogenado; e em δ 2,00 (d, J=1,5 Hz, 3H, H-14), uma

metila ligada a carbono sp2, apresentando acoplamento alílico (4J) com um hidrogênio

olefínico.

No espectro de RMN de 13C (Fig. 38) é possível observar 15 sinais, evidenciando a

natureza sesquiterpênica para TsF6A. Os sinais de carbono em δ 204,4, correspondente a uma

carbonila cetônica, em δ 121,6 e δ 170,3, característicos de carbonos sp2, aliados aos dados

obtidos na análise por (CG- EM), confirmam a existência de uma carbonila α,β-insaturada em

TsF6A. Outros sinais característicos, presentes no espectro de RMN de 13C, foram aqueles em

66

H

H

O

δ 19,8, δ 20,2, δ 20,5 e δ 23,9 associados às quatro metilas, como observado no espectro de

RMN de 1H (Fig. 37).

Com base nas informações obtidas do espectro de DEPT (Tabela 8), pode-se concluir

que TsF6A era constituído por quatro carbonos metílicos, dois carbonos metilênicos, seis

carbonos metínicos e três carbonos não hidrogenados.

A partir de todas as análises já descritas foi possível propor o esqueleto apresentado a

seguir para TsF6A.

O

H

H

Estrutura proposta para TsF6A.

Foi então realizada uma pesquisa no SciFinder Scholar 2007, para verificar a

existência de substâncias com a estrutura equivalente àquela proposta para TsF6A. Nesta

pesquisa verificou-se a ocorrência de dois estereoisômeros, com a mesma estrutura proposta

para TsF6A, sendo estes conhecidos como mustacona (8) e 4-oxoilangeno (8B).

(8) (8B)

H

H

O

67

Por meio da comparação dos dados de RMN de 1H e 13C de TsF6A com aqueles

relatados na literatura para os estereoisômeros 4-oxoilangeno (DUH et al, 2004) e mustacona

(NYASSE et al, 1988), foi possível concluir que TsF6A se trata da mustacona (8). Além

disso, o índice de Kovats calculado (IKcal = 1695) para TsF6A apresentou-se de acordo com

aquele descrito na literatura (ZOGHBI et al, 2006) para a mustacona (IKlit = 1676). A

comparação dos dados de RMN entre os compostos acima mencionados é apresentada na

Tabela 7.

Tabela 8. Dados de RMN de 1H e de 13C(CDCl3) de TsF6A comparados com valores da

literatura para mustacona (8) e oxo-ylangeno (8B)

C/H TsF6A mustacona1 oxo-ylangeno2

δδδδH (J/Hz) δδδδC δδδδH (J/Hz) δδδδC δδδδH (J/Hz) δδδδC 1 2,68 (dd, J=6,6 e 1,5;

1H) 56,8 2,65 (dd, J=6,7 e 1,3; 1H) 56,6 2,27 (d, J=6,6; 1H) 64,3

2 - 204,4 - 203,5 - 203,3 3 5,74 (sext ap., J=1,5;

1H) 121,6 5,71 (ddq, J=0,9; 1,3 e 1,4;

1H) 121,4 5,80 (sl, 1H) 122,3

4 - 170,3 - 169,5 - 169,6 5 1,98 (dd, J=6,6 e 1,5;

1H) 56,2 1,96 (d, J=6,7 e 0,9; 1H) 55,9 2,47 (d, J=6,6; 1H) 46,7

6 2,67 (s, 1H) 54,7 2,64 (s, 1H) 54,6 2,66 (s, 1H) 56,4 7 1,73 (m, 1H) 45,6 1,7 (m, 1H) 45,4 1,69 (m, 1H) 44,9

8ax 1,52 (m, 1H) 22,2 1,50 (ddd, J=2,8; 10,5 e 10,5; 1H)

21,9 1,84 (m, 1H) 22,1

8eq 1,73 (m, 1H) - 1,7 (m, 1H) - - 9ax 1,85 (m, 1H) 36,9 1,85 (m, 1H) 36,7 1,88 (m, 1H) 36,7 9eq 1,73 (m, 1H) 1,7 (m, 1H) - 10 - 57,6 - 57,0 - 56,9 11 1,52 (dd, J=6,9; 6,9,

1H) 32,0 1,49 (dd, J=6,5 e 6,5; 1H) 31,7 1,66 (m, 1H) 32,0

12 0,86 (d, J=6,6; 3H) 19,8 0,83 (d, J=6,5; 3H) 19,4 0,89 (d, J=6,6; 3H) 19,5 13 0,85 (d, J=6,6; 3H) 20,2 0,81 (d, J=6,5; 3H) 19,9 0,85 (d, J=6,6; 3H) 19,7 14 2,00 (d, J=1,5; 3H) 20,5 1,98 (d, J=1,4; 3H) 20,2 2,02 (sl, 3H) 24,0 15 0,97 (s, 3H) 23,9 0,94 (s, 3H) 23,5 0,97 (s, 3H) 20,4

(1) – Fonte: NYASSE et al, 1988.

(2) – Fonte: DUH et al, 2004.

68

Fig

ura

37. E

spec

tro

de R

MN

de

1 H (C

DC

l 3, 3

00 M

Hz)

da

fraç

ão T

sF6:

Mus

taco

na (8

).

69

Fig

ura

38. E

spec

tro

de R

MN

de

13C

(CD

Cl 3

, 75

MH

z) d

a fr

ação

TsF

6: M

usta

cona

(8).

70

5.2.1.2.4. TsF7: Mistura contendo α-Amirina (9), β-amirina (10),

pseudotaraxasterol (11) e lupeol (12)

(9): R1= Me e R2=H; (11) (12)

(10): R1=H e R2=Me.

O espectro de RMN de 1H (Fig. 39) da fração TsF7 apresentou uma grande quantidade

de sinais entre δ 0,76 e δ 1,07, referentes a grupos metílicos e um multipleto em δ 3,21 junto

ao tripleto em δ 3,63 (J=6,6 Hz), característicos de hidrogênios oximetínicos. Também foram

observados vários sinais de hidrogênios olefínicos, aparecendo em δ 4,56 (m), δ 4,68 (m), δ

4,84 (dd, J=10,8 e 1,5 Hz), δ 4,91 (dd, J=17,1 e 1,5 Hz), δ 5,12 (t, J= 3,6 Hz), δ 5,18 (t, J= 3,6

Hz), δ 5,59 (m) e δ 5,81 (dd, J=10,2 e 6,9 Hz), apontando para uma mistura de triterpenos.

A grande quantidade de sinais presentes no espectro de RMN de 13C (Fig. 40)

também sinalizou para uma mistura de triterpenos na fração TsF7. Desses sinais, pôde-se

identificar vários, entre δ 35,0-14,0, referentes a grupos metílicos e metilênico, como já

observado no espectro de RMN de 1H. Os sinais em aproximadamente δ 79,3 (79,28, 79,25 e

79,23) caracterizaram uma mistura de triterpenos contendo 3β-OH. A presença de pelo menos

quatro constituintes nesta fração foi evidenciada pela observação de oito sinais de carbono

numa região do espectro característica de carbonos de dupla ligação (δ 108,9 a δ 151,2). Com

base nos sinais dos carbonos olefínicos e na comparação com dados da literatura (OLEA &

ROQUE, 1990), foi possível associar cada constituinte da fração TsF7 a um esqueleto

específico, do seguinte modo: os sinais em δ 151,2 e δ 109,6 são característicos de esqueleto

do tipo lupeno; os pares δ 139,8 e δ 118,9; δ 139,8 e δ 124,6 são característicos de esqueleto

urseno; e os sinais δ 145,4 e δ 121,9 caracterizam o esqueleto Oleaneno.

A partir das análises dos espectros de RMN de 1H e 13C, da caracterização dos

respectivos esqueletos associados aos pares de carbonos olefínicos, e da comparação com

dados da literatura (Tabela 9), foi possível identificar quatro dos constituintes da fração TsF4

HO

H

H3

23 24

25 26

27

28

5

6

11

15

21

22

R229

R1

HOH

H

H

3

29

30

23 24

25 26

27

28

5

6

11

15

21

22

H

H

HHO

71

como uma mistura dos triterpenos pentacíclicos lupeol, pseudotaraxasterol, α-amirina e β-

amirina.

Tabela 9. Dados de RMN de 13C (75 MHz, CDCl3) da fração TsF7 comparados com dados

dos triterpenos lupeol, pseudotaraxasterol, α-amirina e β-amirina

C TsF1A Lupeol1 TsF1B Pseudo-

taraxasterol1 TsF1C α-Amirina1 TsF1D β-Amirina1

δδδδ (CDCl3) 1 38,8 38,7 38,8 38,8 38,8 38,7 38,8 38,7 2 27,5 27,4 27,5 27,4 27,2 27,2 27,2 27,3 3 79,3 78,9 79,3 79,0 79,3 78,3 79,3 79,0 4 39,0 38,8 39,0 38,9 38,8 38,7 38,6 38,8 5 55,4 55,3 55,5 55,3 55,4 55,2 55,4 55,3 6 18,6 18,3 18,2 18,3 18,2 18,3 18,2 18,5 7 34,5 34,2 34,5 34,3 32,9 32,9 32,9 32,8 8 41,0 40,8 41,0 41,1 40,0 40,0 39,9 38,8 9 50,6 50,4 50,6 50,4 47,8 47,7 47,8 47,7 10 37,1 37,1 37,1 37,1 37,1 36,9 36,6 37,6 11 21,1 20,9 21,7 21,6 23,7 23,3 23,7 23,6 12 25,3 25,1 27,6 27,6 124,6 124,3 121,9 121,8 13 38,3 38,0 39,1 39,2 139,8 139,3 145,4 145,1 14 43,2 42,8 42,3 42,3 41,9 42,0 41,8 41,8 15 27,6 27,4 27,2 27,0 28,6 28,7 26,2 26,2 16 35,8 35,5 36,6 36,7 26,8 26,6 26,8 27,0 17 43,0 43,0 34,5 34,4 33,6 33,7 33,6 32,5 18 48,2 48,2 48,5 48,7 59,3 58,9 47,4 47,4 19 47,9 47,9 36,2 36,3 39,9 39,6 46,5 46,9 20 151,2 150,9 139,8 139,8 39,8 39,6 31,3 31,1 21 29,8 29,8 118,9 118,9 31,3 31,2 34,5 34,8 22 40,0 40,0 42,3 42,2 41,8 41,5 37,1 37,2 23 28,2 28,0 28,2 28,0 28,2 28,1 28,4 28,2 24 15,6 15,4 15,6 15,4 15,6 15,6 15,6 15,5 25 16,2 16,1 16,4 16,3 15,7 15,6 15,7 15,6 26 15,9 15,9 16,2 16,1 16,9 16,8 16,9 16,9 27 14,8 14,5 14,8 14,8 23,5 23,3 26,0 26,0 28 18,2 18,0 17,7 17,7 28,2 28,1 28,6 28,4 29 109,6 109,3 22,6 22,5 23,5 17,4 33,2 33,3 30 19,5 19,3 21,7 21,7 21,3 21,3 23,6 23,7 (1)- Fonte: MAHATO et al, 1994.

72

Fig

ura

39. E

spec

tro

de R

MN

de

1 H (C

DC

l 3, 3

00 M

Hz)

da

fraç

ão T

sF7:

Mis

tura

de

trite

rpen

os (9

), (1

0), (

11) e

(12)

.

Figu

ra 3

3A

α-a

mir

ina

e β-

amir

ina

73

Fig

ura

39A

. Esp

ectr

o de

RM

N d

e 1 H

(CD

Cl 3

, 300

MH

z) d

a fr

ação

TsF

7, c

om a

mpl

iaçã

o da

regi

ão d

e δ

4,95

a 4

,81.

lupe

ol

74

Fig

ura

40. E

spec

tro

de R

MN

de

13C

(CD

Cl 3

, 75

MH

z) d

a T

sF7:

Mis

tura

de

trite

rpen

os (9

), (1

0), (

11) e

(12)

.

75

Fig

ura

40A

. Esp

ectr

o de

RM

N d

e 13

C (7

5 M

Hz,

CD

Cl 3

) da

fraç

ão T

sF7,

regi

ão a

mpl

iada

ent

re δ

160

-78.

76

5.2.2. Constituintes do óleo essencial (OETs)

A análise por CG-EM do óleo essencial das folhas de T. silvatica (OETs) revelou que

este é constituído principalmente por sesquiterpenos. Nesta análise, de um total de

aproximadamente 41 picos, foi possível identificar apenas 16 destes, sendo 4 sesquiterpenos

oxigenados e 12 sesquiterpenos hidrocarbonetos. Os 16 sesquiterpenos identificados

correspondem a 88,4% do conteúdo total de componentes voláteis presentes neste óleo.

As Figuras 41 e 42 apresentam o cromatograma obtido para OETs. Os dados

referentes às substâncias identificadas são mostrados na Tabela 10, e suas respectivas

estruturas são apresentadas na Figura 43.

Figura 41. Cromatograma de OETs (região ampliada entre Tr 29,0 e Tr 36,5).

Figura 42. Cromatograma de OETs (região ampliada entre Tr 36,5 e 43,0).

77

Tabela 10. Constituintes do Óleo essencial obtido das folhas da T. silvatica

Pico IKCal IKLit Substância FM Concentração m/z (int. rel) 1 1339 1339 δ-elemeno C15H24 1,12 93(100), 204(2) 2 1374 1373 Isoledeno C15H24 tr 105(100), 204(20). 3 1377 1376 α-copaeno C15H24 1,97 105(100), 204(11). 4 1391 --- NI --- tr --- 5 1393 --- NI --- 1,49 --- 6 1410 1409 α-gurjeneno C15H24 0,55 41(100), 204(41). 7 1422 --- NI --- 7,01 --- 8 1430 --- NI ---

0,62 ---

9 1431 --- NI --- --- 10 1438 --- NI --- 0,28 --- 11 1441 1439 Aromadendreno C15H24 2,29 41(100), 204(11). 12 1447 --- NI --- 4,82 --- 13 1451 --- NI --- tr --- 14 1454 --- NI --- tr --- 15 1457 1454 α-humuleno C15H24 2,78 93(100), 204(4). 16 1464 1461 Aloaromadendreno C15H24 1,33 41(100), 204(14). 17 1475 --- NI --- tr --- 18 1480 --- NI --- tr --- 19 1485 1480 Germacreno D C15H24 10,14 41(100), 204(17). 20 1489 --- NI --- tr --- 21 1492 --- NI --- 1,02 --- 22 1504 1494 Biciclogermacreno C15H24 33,54 41(100), 204(11). 23 1509 1503 Germacreno A C15H24 1,33 41(100), 204(17). 24 1518 --- NI --- 0,31 --- 25 1528 1524 δ-cadineno C15H24 3,15 41(100), 204(40). 26 1556 1549 Elemol C15H26O

0,61 41(100), 220(1).

27 1559 --- NI --- --- 28 1561 1556 Germacreno B C15H24 1,52 41(100), 204(90). 29 1564 --- NI --- tr --- 30 1573 --- NI --- 1,40 --- 31 1584 1576 Espatulenol C15H24O 0,99 43(100), 220(1). 32 1591 1590 Veridiflorol C15H26O 3,87 43(100), 222(1). 33 1598 --- NI ---

3,98 ---

34 1603 --- NI --- --- 35 1608 --- NI --- 2,31 --- 36 1626 --- NI --- 0,72 --- 37 1630 --- NI --- 2,34 --- 38 1633 --- NI --- 1,41 --- 39 1638 --- NI --- tr --- 40 1648 1653 α-cadinol C15H26O 1,21 43(100), 204(14). 41 1663 --- NI --- 0,87 ---

78

HHO

H

Espatulenol (2)

O H

Veridiflorol (3)

δ-elemeno (13)

Isoledeno (14)

H

HH

α-copaeno (15)

α-gurjeneno (16)

Aromadendreno (17)

α-humuleno (18)

Aloaromadendreno (19)

Germacreno D (20)

Biciclogermaceno (21)

Germacreno A (22)

H

δ-cadineno (23)

O H Elemol (24)

Germacreno B (25)

H

H

H O

δ-cadinol (26)

Figura 43. Estruturas dos sesquiterpenos identificados no OETs.

79

5.3. Constituintes Químicos das Folhas de T. casaretti

5.3.1. Isolados por cromatografia em coluna

5.3.1.1. TcF1: Mistura de β-sitosterol (6) e estigmasterol (27)

HO

H

H H

(27)

A fração TcF1 apresentou-se como um sólido cristalino esbranquiçado, em forma de

agulhas. O espectro de RMN de 1H (Fig 44) de TcF1 apresentou uma grande quantidade de

sinais na região compreendida entre δ 0,67-2,35, caracterizando uma natureza alifática para os

constituintes dessa fração. Os principais sinais nesse espectro foram aqueles observados em: δ

3,52 (m, 1H) característico de hidrogênio geminal a hidroxila; δ 5,34 (d, J=6,0 Hz, 1H), δ

5,14 (dd, J=15,3 e 8,4 Hz, 1H), δ 5,00 (dd, J=15,3 e 8,4 Hz, 1H) correspondentes aos

hidrogênios olefínicos. Este espectro apresentou-se muito característico de uma mistura de β-

sitosterol (6) e estigmasterol (27).

No espectro de RMN de 13C (Fig 45) também foi possível observar alguns sinais

característicos destes esteróides, tais como aqueles em: δ 141,0, δ 122,0, δ 138,5 e δ 129,5,

referentes aos carbonos olefínicos, além do sinal em δ 72,0 que associado a um carbono

contendo um grupo 3β-OH. Pode-se ainda notar nesse espectro uma grande quantidade de

sinais na faixa de δ 12,1 a δ 32,1.

Da análise dos espectros de RMN de 1H e 13C, bem como da comparação desses dados

com aqueles da literatura (GOMES, 2007; BREITMAIER, 1993; GOULART et al, 1993)

(Tabela 11), pode-se concluir que a fração TcF1 trata-se de fato de uma mistura dos esteróides

β-sitosterol (6) e estigmasterol (27). As diferenças entre esses dois esteróides é caracterizada

pelos sinais no espectro de RMN de 1H de H-22 (δ 5,14) e H-23 (δ 5,00), presentes apenas na

estrutura do estigmasterol, junto àqueles do espectro de RMN de 13C em C-22 (δ 138,5) e C-

23 (δ 129,5).

80

Tabela 11. Dados de RMN de 13C (CDCl3) comparados com dados do β-sitosterol e do

estigmasterol

C TcF1A (β-Sitosterol)

TcF1B (Estigmasterol) β-Sitosterol1 Estigmasterol1 β-Sitosterol2 Estigmasterol3

1 37,5 37,5 37,2 37,2 37,3 37,3

2 31,9 31,9 31,6 31,6 31,6 31,6

3 72,0 72,0 71,7 71,7 71,7 71,8

4 42,5 42,4 42,3 42,2 42,3 42,3

5 141,0 141,0 140,7 140,7 140,8 140,7

6 122,0 122,0 121,7 121,7 121,6 121,7

7 32,1 32,1 31,9 31,9 32,0 31,9

8 31,9 31,9 31,6 31,6 31,9 31,9

9 50,4 50,3 50,1 50,1 50,2 50,1

10 36,7 36,4 36,5 36,1 36,5 36,4

11 21,5 21,4 21,2 21,0 21,1 21,1

12 40,0 39,9 39,7 39,6 39,8 39,7

13 42,5 42,5 42,2 42,2 42,3 42,3

14 57,0 57,1 56,71 56,7 56,8 56,9

15 24,6 24,6 24,3 24,3 24,3 24,4

16 29,2 28,5 28,9 28,2 28,3 28,2

17 56,1 56,1 55,9 55,9 56,1 55,9

18 12,2 12,1 11,9 11,8 11,9 11,9

19 19,6 19,6 19,4 19,4 19,4 19,4

20 36,4 40,8 36,1 40,5 36,2 40,5

21 19,0 21,5 18,7 21,2 18,8 21,2

22 34,1 138,5 33,9 138,3 34,0 138,4

23 26,2 129,5 26,0 129,2 26,1 129,3

24 46,0 51,5 45,8 51,2 45,9 51,2

25 29,3 29,3 29,1 29,1 29,2 31,9

26 20,1 19,3 19,8 19,0 19,8 19,0

27 20,1 19,3 19,8 19,0 19,8 19,0

28 23,3 25,7 23,0 25,4 23,1 25,4

29 12,5 12,3 12,2 12,0 12,3 12,3

(1) Fonte: GOMES, 2008. (2) Fonte: BREITMAIER, 1993. (3) Fonte: GOULART et al, 1993.

81

Fig

ura

44. E

spec

tro

de R

MN

de

1 H (C

DC

l 3, 3

00 M

Hz)

da

fraç

ão T

cF1:

Mis

tura

de

β-si

tost

erol

(6) e

est

igm

aste

rol (

27).

82

Fig

ura

45. E

spec

tro

de R

MN

de

13C

(CD

Cl 3

, 75

MH

z) d

a fr

ação

TcF

1: M

istu

ra d

e β-

sito

ster

ol (6

) e e

stig

mas

tero

l (27

).

83

5.3.1.2. TcF2A: aromadendrano-4β,10α-diol (28)

(28)

A fração TcF2 foi analisada por CG-EM e o cromatograma obtido (Fig. 46) indicou

que esta era constituída por um composto majoritário (TcF2A), indicado pelo pico 3 (Tr =

45,82 min), com concentração relativa de aproximadamente 76%.

Figura 46. Cromatograma obtido da fração TcF2.

O espectro de massas (Fig. 47) de TcF2A, apresentou o pico do íon molecular em

m/z = 238. A partir da comparação desse espectro com aqueles da biblioteca do equipamento

(Wiley 7th Ed), obteve-se uma similaridade de 84% com o espectro de massas do espatulenol

(Figura 47A), um sesquiterpeno de fórmula molecular C15H24O (MM = 220). A diferença de

18 unidades na razão m/z do pico do íon molecular de TcF2A, comparado à massa molecular

do espatulenol, indicou que este último deve ser formado a partir da perda de uma molécula

de água [M-18] de TcF2A, sugerindo, portanto, a fórmula molecular C15H26O2 (MM = 238)

para este composto.

H

OH

OH

H

15

6

10

4

11

1312

1

84

Figura 47. Espectro de massas (IE) de TcF2A: Aromadendrano-4β,10α-diol (28).

Figura 47A. Espectro de massas (IE) do espatulenol.

No espectro de RMN de 1H de TcF2 (Fig. 48) a observação de um duplo dupleto em

δ 0,43 (J= 10,8; 9,6 Hz, 1H) e um multipleto de δ 0,56-0,62 (1H), indicaram a presença de

um anel ciclopropânico (MEIRA et al, 2008). Foram observados também quatro simpletos em

δ 1,03 (3H), δ 1,04 (3H), δ 1,14(3H) e δ 1,21 (3H), correspondentes a quatro metilas. Os

demais sinais aparecem como multipletos sobrepostos na região de δ 0,70-2,00.

A partir do espectro de RMN de 13C (Fig. 49) foi possível confirmar a natureza

sesquiterpênica de TcF2, pela observação de sinais correspondentes a 15 carbonos. Os sinais

em δ 74,5 e δ 79,9, característicos de carbonos metínicos oxigenados, reforçaram a hipótese

da presença de duas hidroxilas em TcF2, como já indicado pelos dados obtidos na análise por

CG-EM. A não observação de qualquer sinal na região de ligação dupla confirma que o

fragmento em m/z = 220, correspondente ao espatulenol, é de fato, formado pela perda de uma

molécula de H2O em TcF2. Nesse espectro pode-se notar facilmente, ainda, os sinais

referentes a quatro metilas em δ 29,0, δ 15,6, δ 23,7 e δ 19,5, como também observado no

espectro de RMN de 1H (Fig. 48).

85

As informações acima descritas, possibilitaram propor a estrutura do

aromadendrano-4,10-diol para TcF2A. A partir desta proposta, os dados de RMN de 1H

(Tabela 12) e RMN de 13C (Tabela 13) de TcF2A foram comparados com dados da literatura

(MEIRA et al, 2008; MOREIRA et al, 2003; WU et al, 2000) para diversos estereoisômeros

do aromadendrano-4,10-diol. Estes estereoisômeros diferem entre si apenas pela

estereoquímica dos carbonos (C-4 e C-10) contendo os grupos hidroxila. Por meio desta

comparação, pôde-se concluir que TcF2A trata-se do aromadendrano-4β,10α-diol (28).

Tabela 12. Dados de RMN de 1H (CD3OD) de TcF2A comparados com valores do

aromadendreno-4β,10α-diol.

H TcF2A

(CD3OD) aromadendrano-4β,10α-diol1

(CDCl3) δ (J/Hz) δ (J/Hz)

1 2,40-0,70(m) 1,87(m, 1H) 2 2,40-0,70(m) 1,65(m, 2H) 3 2,40-0,70(m) 1,67(m, 2H) 4 - 5 2,40-0,70(m) 1,18(m, 1H) 6 0,43(dd, J=10,8 e 9,6; 1H) 0,44(dd, J=9,6 e 9,0; 1H) 7 0,62-0,56(m, 1H) 0,67(m, 1H) 8 2,40-0,70(m) 1,81(m,2H) 9 2,40-0,70(m) 1,53(m, 1H) 10 - 1,77(m, 1H) 11 - - 12 1,03(s, 3H) - 13 1,04(s, 3H) 1,04(s, 6H) 14 1,21(s, 3H) 1,25(s, 3H) 15 1,14(s, 3H) 1,18(s, 3H)

1- Fonte: MEIRA et al, 2008.

86

Tabela 13. Dados de RMN de 13C de TcF4A comparados com os dados de diversos

estereoisômeros do aromadendrano-4,10-diol

C

TcF4A Aromadendrano-4,10-diol (CDCl3) δ(CD3OD) 4β,10α 1 4α,10α 2 4α,10β 2 4β,10β 2

1 56,5 56,4 56,2 52,5 56,4 2 23,2 23,8 23,7 23,7 24,3 3 40,9 41,1 41,0 39,6 41,4 4 79,9 80,4 80,1 80,5 80,3 5 47,8 48,4 48,2 45,8 47,2 6 28,0 28,3 28,3 24,9 30,1 7 26,6 26,6 26,5 27,0 26,9 8 20,0 20,1 20,0 19,1 19,2 9 44,2 44,4 44,3 42,4 42,8 10 74,5 75,0 74,8 72,8 71,8 11 19,0 19,4 19,4 20,1 20,9 12 29,0 28,6 28,5 29,0 28,7 13 15,6 16,4 16,3 16,4 16,4 14 23,7 24,4 24,3 25,8 25,1 15 19,5 20,3 20,0 31,2 30,5

1- Fonte: MEIRA et al, 2008. 2- Fonte: MOREIRA et al, 2003.

87

Fig

ura

48. E

spec

tro

de R

MN

de

1 H (C

D3O

D, 3

00 M

Hz)

da

fraç

ão T

cF2:

Aro

mad

endr

ano-

4β,1

0α-d

iol (

28).

88

Fig

ura

49. E

spec

tro

de R

MN

de

13C

(CD

3OD

, 75

MH

z) d

a fr

ação

TcF

2: A

rom

aden

dran

o-4β

,10α

-dio

l (28

).

89

5.3.1.3. TcF3A: 8-epi-esclareol (29)

OHOH

1

34 6

8

1120

18 19

17

13

15

16

(29)

A fração TcF3 foi submetida a análise por CG-EM e o cromatograma obtido (Fig.

50) aponta a presença de um constituinte principal, correspondente ao pico 3 (Tr = 61,996

min), com concentração relativa de aproximadamente 81%, o qual foi denominado de TcF3A.

O índice de retenção (IK) calculado para esse composto, de acordo com a equação do item

4.1.3.1.3, foi igual a 2228.

Figura 50. Cromatograma obtido a partir análise por CG-EM da fração TcF3.

O espectro de massas (Fig. 51) de TcF3A, apresentou o pico referente ao fragmento

de maior massa em m/z = 290. A partir da comparação desse espectro com aqueles da

biblioteca do equipamento (Wiley 7th Ed), obteve-se uma similaridade de 80% com o espectro

de massas do geranil linalol (30), um diterpeno de fórmula molecular C20H34O (M = 290).

Geranil Linalol (30)

HO

90

Figura 51. Espectro de massas (IE) de TcF3A: 8-epi-Esclareol (29).

O espectro de RMN de 1H (Fig. 53) de TcF3 apresentou os principais sinais em: δ

0,81 (s, 3H), δ 0,85 (s, 3H), δ 0,84 (s, 3H), δ 1,12 (s, 3H) e δ 1,28 (s, 3H), referentes a cinco

metilas. A presença nesse espectro de três duplos dupletos em δ 5,06 (dd, J= 10,8 e 1,2 Hz,

1H), 5,18 (dd, J= 17,4 e 1,2 Hz, 1H) e em δ 5,87 (dd, J= 17,4; 10,8 Hz, 1H) caracterizaram a

existência de hidrogênios vinílicos.

No espectro de RMN de 13C de TcF3 foi possível identificar com clareza a presença

de 20 sinais de carbono, confirmando a natureza ditepêrnica de seu principal constituinte

(TcF3A). Na região de δ 150,0 a 70,0 deste espectro (Fig. 54), os sinais em δ 145,0 (C-14) e δ

112,0 (C-15) confirmaram a presença de ligação dupla do tipo vinílica. Nenhum outro sinal de

carbono sp2 foi observado nesse espectro, o que permitiu descartar completamente a

possibilidade de se tratar do geranil linalol, conforme sugerido pela biblioteca do CG-EM.

Além disso, os sinais em δ 73,6 (C-8) e δ 73,8 (C-13) indicaram a presença de dois carbonos

oxigenados no composto TcF3A, incompatível com a fórmula molecular proposta para o

geranil linalol (C20H34O). Esta informação indica que o fragmento observado em m/z=290,

pode ser resultante de uma possível perda de água do composto TcF3 e, portanto, não foi

observado o pico do íon molecular em m/z=308, compatível com a fórmula molecular

C20H36O2. No espectro de RMN de 13C outros importantes sinais observados foram aqueles

correspondentes a cinco metilas, em δ 27,7 (C-16), δ 30,8 (C-17), δ 33,5 (C-18), δ 21,9 (C-19)

e δ 15,3 (C-20). Os dados completos de RMN de 13C de TcF3A são apresentados na Tabela

13.

Baseando-se nos espectros de DEPT 90 e DEPT 135 foi possível atribuir a

multiplicidade de todos os sinais correspondentes aos 20 átomos de carbono, presentes no

espectro de RMN de 13C, sendo cinco metilícos, oito metilênicos, três metínicos e quatro

91

carbonos não hidrogenados. Esses dados também são incompatíveis com aqueles do geranil

linalol (30).

A análise detalhada dos dados de RMN de 1H e 13C, bem como os dados fornecidos

pelas análises em CG-EM, e a comparação com dados da literatura, possibilitou a proposição

de um esqueleto labd-14-eno-8,13-diol (Fig. 52) para TsF3A.

OHOH

Figura 52. Esqueleto do labd-14-eno-8,13-diol.

Diversos estereoisômeros com o esqueleto labd-14-eno-8,13-diol (Fig. 52) são

relatados na literatura, sendo o mais conhecido deles, o esclareol ((8R,13R)-labd-14-eno-8,13-

diol). Os dados de RMN de 13C de TcF3A (Tab 14) foram então comparados àqueles dos

diferentes estereoisômeros com o esqueleleto labd-14-eno-8,13-diol e, a partir desta

comparação, foi possível concluir que TcF3A se trata do 8-epi-esclareol (29), um constituinte

raro de plantas.

92

Fig

ura

53. E

spec

tro

de R

MN

de

1 H (C

DC

l 3, 3

00 M

Hz)

da

fraç

ão T

cF3:

8-e

pi-E

scla

reol

(29)

.

93

Fig

ura

54. E

spec

tro

de R

MN

de

13C

(CD

Cl 3

, 75

MH

z), d

e T

cF3:

8-e

pi-E

scla

reol

(29)

.

94

Tabela 14. Dados de RMN de 13C para a TcF3A em comparação com dados de diversos

estereoisômeros com esqueleto labd-14-eno-8,13-diol

C TcF3A 13-epi-esclareol 1 esclareol 2 ent-esclareol 3 8-epi-esclareol 4

δδδδC (CDCl3) 1 39,4 39,9 39,7 39,7 39,2 2 18,5 20,7 18,5 18,4 18,3# 3 42,3 42,2 42,0 42,0 42,0 4 33,6 32,7 33,3 33,2 33,2 5 56,2 56,2 56,1 56,1 55,9 6 18,4 19,3 20,6 20,5 18,1# 7 42,4 44,9 44,4 44,4 42,1 8 73,6 74,4 74,8 74,7 73,4 9 59,2 62,0 61,6 61,6 59,0 10 39,4 39,4 39,3 39,2 39,1 11 19,5 18,6 19,2 19,1 19,3 12 46,3 44,3 44,9 45,0 46,1 13 73,8 75,2 73,7 73,6 73,6 14 145,0 145,0 146,0 146,0 145,0 15 112,0 112,0 111,0 111,0 112,0 16 27,7 24,7 27,3 27,3 27,6 17 30,8 24,3 24,3 24,2 30,5 18 33,5 33,6 33,5 33,4 33,4 19 21,9 21,7 21,6 21,5 21,6 20 15,3 15,4 15,5 15,4 15,1

1- Fonte: DEMETZO et al, 1990. 2- Fonte: JASSBI et al, 2002. 3- EL-SEEDI et al, 2002. 4- Fonte: TORRENEGRA et al, 1992. (#) - as atribuições podem ter sido trocadas.

OH

OH

1

34

1918

6

2011

17

15

13

16

8

OH

OH

1

34

1918

6

2011

17

15

13

16

8

OH

OH

1

34

1918

6

2011

17

15

13

16

8

OH

OH

1

34

1918

6

2011

17

15

13

16

8

Esclareol 8-epi-Esclareol 13-epi-Esclareol ent-Esclareol

Figura 55. Estereoisômeros com esqueleto labd-14-eno-8,13-diol.

95

5.3.2. Constituintes do óleo essencial (OETc)

Na análise do OETc por CG-EM conforme descrito no item 4.1.3.1.3 e por

comparação com a biblioteca Wiley 7th Ed., foi possível identificar oito sesquiterpenos, dos

quais cinco são oxigenados e três são hidrocarbonetos. Apesar de apenas oito constituintes

terem sido identificados, no cromatograma (Fig. 56 e 56A), 25 picos podem ser visualizados.

Os constituintes identificados correspondem a 35,5 % da constituição total do óleo.

Mesmo não sendo possível a sua identificação por comparação direta com os dados

da biblioteca do CG-EM (Wiley 7th Ed), o pico 16 foi identificado por comparação com os

dados de TcF2A (Fig 47). A análise dos espectros de massas de TcF2A (Fig 47) e do

constituinte correspondente ao pico 16 do OETc (Fig 58), permitiu concluir que se tratam

provavelmente do mesmo composto, um estereoisômero do aromadendranodiol.

Figura 56. Cromatograma de OETc ( região ampliada entre Tr 31,5 e Tr 40,8)

Figura 56A. Cromatograma de OETc (região ampliada entre Tr 46,0 a 58,0)

96

Figura 57. Espectro de massas (IE) do Pico 16 de OETc, IK= 1692.

A Figura 51 apresenta as substâncias identificadas e a Tabela 15 descreve os dados

referentes aos picos.

97

Tabela 15. Constituintes do óleo essencial obtido das folhas de T. casaretti

Pico IKCal IKLit Substância FM Concentração m/z (int. rel)

1 1393 1391 β-elemeno C15H24 1,24 41(100), 204(1).

2 1442 1439 Aromadendreno C15H24 1,62 41(100), 204(11).

3 1480 1480 Germacreno D C15H24 0,64 41(100), 204(17).

4 1517 NI - 1,30 -

5 1557 1549 Elemol C15H26O 2,24 41(100), 220(1).

6 1566 NI - 0,51 -

7 1573 1565 Ledol C15H26O 0,96 43(100), 204(9).

8 1589 1576 Espatulenol C15H24O 27,24

43(100), 220(1).

9 1592 1581 Óxido de cariofileno C15H24O 41(100), 205(2).

10 1599 1590 Veridiflorol C15H26O 1,53 43(100), 222(1).

11 1617 NI - 1,27 -

12 1692 NI - 2,66 -

13 1702 NI - 1,88 -

14 1724 NI - 1,39 -

15 1727 NI - 1,54 -

16 1732 1738* Aromadendrano-4,10-diol C15H26O2 3,38 43(100), 220(4)

17 1751 NI - 2,05 -

18 1758 NI - 2,53 -

19 1760 NI - 1,57 -

20 1765 NI - 0,91 -

21 1777 NI - 1,04 -

22 1782 NI - 1,51 -

23 1852 NI - 1,30 -

24 1951 NI - 1,18 -

25 1997 NI - 9,80 -

* IK de TcF2A: Aromadendrano-4β,10α-diol (28)

98

β-elemeno (31)

Aromadendreno (17)

Germacreno D (20)

O H Elemol (24)

OH

Ledol (32)

HHO

H

Espatulenol (2)

H

H

O

Óxido de Cariofileno (33)

OH

Veridiflorol (3)

Figura 58. Estruturas das substâncias identificadas no OETc.

99

5.4. Considerações sobre terpenos

Todos os seres vivos possuem uma característica fundamental que é a presença de

atividade metabólica, que nada mais é do que um conjunto de reações químicas que ocorrem

no interior das células. Quando se trata de células vegetais, o metabolismo costuma ser

dividido em primário e secundário.

Define-se como metabolismo primário o conjunto de processos metabólicos que

desempenham uma função essencial no vegetal, tais como a fotossíntese, a respiração e o

transporte de solutos. Os compostos envolvidos no metabolismo primário possuem uma

distribuição universal nas plantas. Esse é o caso dos aminoácidos, dos nucleotídeos, dos

lipídios, carboidratos e da clorofila. Por outro lado, o metabolismo secundário dá origem a

compostos que não possuem uma distribuição universal, pois não são necessários para todas

as plantas. Como conseqüência prática, esses compostos podem ser utilizados em estudos

taxonômicos (quimiossistemática), como ocorrem com os limonóides, considerados

marcadores taxonômicos da família Meliaceae.

Os metabólitos secundários são substâncias produzidas pelos organismos vegetais,

mas que não participam dos processos de formação de protoplasto e geração de energia.

Muitos metabólitos secundários são mediadores em processos de interação das

plantas com o ambiente, especialmente como inibidores da germinação, na proteção contra

predadores, na atração de polinizadores, na proteção contra a perda de água e aumento de

temperatura. Como exemplo, espécies de Datura e Brugmansia (Solanaceae), conhecidas

como trombeteira ou dama-da-noite, apresentam perfume notável à noite e podem atrair

morcegos e mariposas (MELO, 2005). Um grande número de metabólitos secundários

apresenta alguma atividade biológica (inseticida, anti-inflamatória, analgésica etc)

Eles não ocorrem universalmente nas plantas, mas apresentam ampla diversidade

estrutural: taninos, flavonóides, alcalóides, glicosinolatos, pigmentos, ceras, etc. No entanto, o

número de vias metabólicas relacionadas à biossíntese da grande maioria dos metabólitos

secundários é muito pequeno.

Segundo YAMADA (2004) são três as principais classes de metabólitos secundários:

Terpenos, compostos fenólicos e compostos nitrogenados. Terpenos ou terpenóides

constituem o maior grupo de produtos secundários. As diversas substâncias desta classe são,

em geral, insolúveis em água e sintetizadas a partir de acetil CoA ou de intermediários

glicolíticos (Fig 59). Os terpenos são tóxicos e deletérios para muitos insetos e mamíferos

100

herbívoros; assim, eles parecem exercer importantes funções de defesa no reino animal. Entre

os terpenos têm-se os piretróides e a azadiractina com atividade inseticida; os óleos

essenciais, com propriedades repelentes de insetos; os cardenolídeos e as saponinas, de gosto

amargo e extremamente tóxicos para os animais superiores (YAMADA, 2004).

Apesar da grande diversidade de terpenos, apenas duas rotas metabólicas, a do

mevalonato e do MEP são responsáveis pela síntese dos mesmos, a partir de precursores

comuns. A Figura 59 apresenta as vias metabólicas envolvidas na síntese de terpenos.

Figura 59. Rotas metabólicas envolvidas na formação de terpenos.

Fonte: YAMADA, 2004.

Os terpenóides são sintetizados via mevalonato, o qual é formado pela condensação

aldólica de duas unidades da acetoacetil-CoA, seguida de uma hidrólise, originando a 3-

hidroxi-3-metilglutaril-CoA (HMG-CoA). Esse sofre uma reação de redução catalizada pela

enzima HMGCoA-redutase à mevalonato. O mevalonato é, então, convertido em isopentil-

pirofosfato (IPP) ou isopreno ativo e seu isômero dimetilalilpriofosfato (DMAPP). As

moléculas de IPP e DMAPP condensam e formam o trans-geranilpirofosfato, dando origem

aos monoterpenos e sesquiterpenos (SANTOS apud FREIRE, 2008). Tudo isso ocorre

segundo esquema apresentado na Figura 60, disposta a seguir.

101

Figura 60. Biossíntese de terpenóides.

Fonte: FREIRE, 2008.

A biossíntese de terpenos pode ocorrer também por outra via metabólica, a do 1-

deoxi-D-xilulose-5-fosfato (DXPS). Nessa via, o piruvato e o gliceraldeído-3-fosfato formam

o DXPS que, posteriormente, dá origem ao 2-metil-D-eritritol-4-fosfato (MEP). Em seguida,

são formados, por sucessivas reações, o isopentenil-difosfato (IPP) e o dimetilalil-pirofosfato

(DMAPP), os quais irão originar os terpenos (GUIMARÃES apud FREIRE, 2008).

Da condensação dos grupos isômeros ativos do isopreno, são originadas as diferentes

classes de terpenóides conhecidas, conforme figura 61.

102

Figura 61. Formação dos terpenóides a partir de duas rotas metabólicas.

Fonte: SILVA, 2008.

MONOTERPENOS

A combinação de DMAPP e IPP através da enzima prenil transferase produz o

geranil difostato (GPP, Fig. 62). Acredita-se que isso envolva a ionização de DMAPP ao

cátion alílico e posterior adição desse cátion à ligação dupla do IPP, produzindo um

monoterpeno fosfatado, geranil difosfato. A partir do GPP podem ser produzidos dois

isômeros, o linalil difosfato (LPP) e o neril difosfato (NPP), a partir da ionização do cátion

alílico, conduzindo a modificações na posição da ligação dupla ou do grupo difosfato. Esses

três compostos por mudanças relativamente pequenas, dão origem a uma série de

monoterpenos lineares encontrados como componentes de óleos voláteis, flavorizantes e

perfumes. O composto final pode ser um álcool, aldeído, ésteres e, especialmente, acetatos.

A partir daí, por diferentes processos de ciclização, os diferentes esqueletos

monoterpênicos são formados.

103

Figura 62. Biossíntese de alguns esqueletos monoterpênicos a partir de DMAPP e IPP.

SESQUITERPENOS

A adição de unidades IPP em extensão ao geranil difosfato (GPP) origina o precursor

fundamental dos sesquiterpenos, o farnesil difosfato (FPP), conforme figura 63. O FPP pode

então dar origem a sesquiterpenos cíclicos e lineares. Devido ao aumento de comprimento da

cadeia e a adição de uma ligação dupla, o número de possíveis modos de ciclização é também

aumentada, e uma enorme gama de estruturas mono-, bi- e tricíclicas podem resultar.

104

Figura 63. Formação de diversos esqueletos sesquiterpênicos a partir do FPP.

105

DITERPENOS

Por sua vez, os diterpenos são formados pela união de uma unidade IPP ao farnesil

difosfato, por meio da adição eletrofílica do IPP ao cátion alílico terciário formado a partir do

FPP. Dessa união surge o geranil-geranil difosfato (GGPP), de acordo com o esquema

apresentado na Figura 64.

Figura 64. Formação do geranil-geranil difosfato a partir do FPP.

Muitos dos diterpenos naturais surgem a partir da formação de carbocátion iniciada

pela protonação da ligação dupla no começo da cadeia que conduz a uma primeira seqüência

de ciclização (Fig 65). A perda do difosfato mais tarde também produz um carbocátion e

facilita futura ciclizações.

106

Figura 65. Formação do copalil PP a partir do GGPP.

SESTERTEPENOS

Embora muitos exemplos desse grupo de terpenóides naturais sejam conhecidos, eles

são encontrados principalmente em fungos e organismos marinhos, e apresentam

relativamente poucos tipos estruturais. O tipo mais comum de sestertepenóide é

exemplificado pela esclarina (Fig. 66) e esta estrutura pode ser encarada como o resultado de

uma ciclização em seqüência semelhante à que se vê com GGPP nos diterpenos, e com óxido

de esqualeno nos triterpenóides.

Figura 66. Formação do sestertepeno esclarina a partir do geranil-farnesil difosfato (GFPP).

107

TRITERPENOS

Os triterpenos constituem um amplo grupo de produtos naturais derivados do

esqualeno ou relacionado a precursores acíclicos com 30 carbonos. Duas sub-classes

importantes de triterpenos são os esteróides (os quais são componentes dos lipídios de

membrana e precursores de hormônios esteróides em mamíferos) e as saponinas (prontamente

reconhecidas pela formação de espuma em certos extratos vegetais).

Os triterpenos são formados a partir da união de duas moléculas de farnesil

pirofosfato (FPP), através de adição eletrofílica envolvendo carbocátio terciário de uma

unidade e ligação dupla da outra. Dessa união surge o hidrocarboneto conhecido como

esqualeno (Fig. 67), precursor dos triterpenos.

Figura 67. Ciclização do esqualeno para a formação de um triterpeno.

Fonte: DEWICK, 2002.

Neste trabalho foram identificados 22 sesquiterpenos, dos quais dois esqueletos

sesquiterpênicos são observados com maior freqüência: o germacreno, precursor dos

compostos germacreno A, germacreno B, germacreno D, biciclogermacreno e α-copaeno; e o

108

esqueleto humuleno, do qual derivam o óxido de humuleno, humuleno diepóxido, o α-

humuleno e o óxido de cariofileno.

O diterpeno esclareol, aqui isolado, tem como precursor o (+)copalil PP (Fig. 65),

originado da ciclização do GGPP.

Ainda foi possível identificar os esteróides β-sitosterol e estigmasterol, cujo

precursor é o triterpeno cicloartenol. Além deles foram identificados quatro triterpenos

pentaciclicos, α-amirina, β-amirina, pseudotaraxasterol e lupeol. Os três primeiros possuem o

esqueleto do tipo urseno e oleaneno, e o último, o esqueleto do tipo lupeno.

SEÇÃO IV

CONCLUSÃO

110

6. CONCLUSÕES E PERSPECTIVAS

Muitas espécies do gênero Trichilia já foram estudadas e uma variedade de

substâncias foram isoladas e identificadas, dentre as quais, muitas com atividades inseticidas.

Entretanto, sobre a espécie T. casaretti poucas informações são encontradas na literatura

sobre a sua constituição química, de modo que esse trabalho assume grande relevância

quando contribui para o conhecimento sobre essa espécie. No caso da T. silvatica, a

importância dessa pesquisa é ainda maior, já que não há relato de qualquer estudo químico

sobre essa espécie, caracterizando essa pesquisa como o primeiro estudo sobre a constituição

química dessa espécie.

Assim sendo, este trabalho vem colaborar com o informações significativas para o

conhecimento sobre plantas do gênero Trichilia.

Dentro desse gênero de plantas os triterpenos correspondem à principal classe de

compostos isolados. Sob esse aspecto essa pesquisa aponta numa nova vertente, fato

caracterizado pelo grande número de sesquiterpenos identificados, e substâncias de várias

classes de terpenóides foram aqui encontradas.

No que diz respeito às atividades inseticidas, apesar dos ensaios biológicos

realizados com os extratos preparados a partir do material vegetal coletado não apresentarem

resultados significativos, não foram realizados estudos de atividade inseticida para as

substâncias isoladas, ficando esses ensaios como perspectiva futura, bem como, o estudo

fitoquímico dos demais extratos ainda não trabalhados, no intuito de complementar a pesquisa

sobre essas espécies.

111

7. REFERÊNCIAS

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