Tecnologia do DNA recombinante e aplicações
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Tecnologia do DNA Recombinante & Aplicações
Identificação Genética - Fingerprinting
Complementaridade de Cadeias
Tm
Estringência
Clonagem
Inserto
Amplicação do Clone em Bactéria
Utilizações do DNA Clonado
Utilizações do DNA Clonado
Retrotranscrição
Vetor & Inserto
Enzimas de Restrição
4 bases
Corte & Ligação
Vetores• Plasmídios
– Pequenos fragmentos circulares de DNA– Replicação independente do DNA bacteriano– Presença ou ausência dentro da bactéria– Quantidade variável– Resistência a drogas e outras características– Bom método para amplificar o DNA clonado– Fragmentos clonáveis até 20kb– Fragmentos grandes são perdidos– Plasmídios clássicos
• pBR322• pUC18
Modos de introdução de DNA recombinante em bactérias.
Vetores: pBR322 & pUC18
Seleção de vetores com clone
polylinker
Vetores
• Fago Lambda– Acomoda um total de 45-50kb– Inserto de cerca de 15kb– DNA automaticamente embalado em
partícula infectante
• Fagos Unifilamentares– DNA unifilamentar é convertido dentro da
bactéria para replicação– Facilidade para sequênciamento dos clones
Fago Lambda
Detecção de Gene de Interesse – Plaqueamento de Fagos
Uso de sondas de DNA e RNA para identificar o clone portador do gene de interesse.
Vetores
• Cosmídios– Híbridos de fago e plasmídio– Replicação em bactérias ou embalados
como fagos– Sequências virais eliminadas permitindo
introdução de DNA exógeno de até 45kb entre os sítios cos
– Partícula viral penetra na bactéria, mas não tem potencial replicativo
Vetores de Grande Porte
• BAC: Bacterial Artificial Chromosome– Cromossomo Artificial de Bactéria– Inserto médio de 150kb– Inserto máximo de 400kb– Se replica como um plasmídio dentro da
bactéria– Utilizado amplamento pelo Projeto
Genoma
Vetores de Grande Porte
• Cromossomo Artificial de Levedura– Se comporta como um pequeno
cromossomo que se replica dentro do eucarionte e carrega seu DNA de interesse
– Tamanho médio do inserto: 500Kb– Tamanho máximo do inserto: 1Mb– Contém todas os elementos necessários
para se replicar e segregar dentro da levedura
Cromossomo Artificial de Levedura
Introdução de DNA Exógeno
DNA Shotgun
Polimerase Chain Reaction - PCR
Gel de Agarose
Southern e Northern Blots
Mapas de Restrição - RFLP
Sequenciamento Capilar - Eletroferograma
Manipulação em Cultura de Células e Semeadura
Produção de Camundongos Transgênicos
Transgênico para Hormônio do Crescimento
Diagnóstico Pré-Natal