Técnicas de Imunologia Prof.Doutor José Cabeda Avaliação do repertório TCR.

Prof.Doutor José Cabeda Técnicas de Imunologia

Avaliação do repertório TCR

Prof. Doutor José Cabeda Técnicas de Imunologia

Escolha das regiões génicas a estudar

Regiões VRegiões V Limitado na variabilidadeLimitado na variabilidade Passível de estudo por Passível de estudo por

citometriacitometria CDR1 e CDR2CDR1 e CDR2

Variabilidade limitada à Variabilidade limitada à região Vregião V

CDR3CDR3 O mais variávelO mais variável Contribuição de V,D e JContribuição de V,D e J VariabilidadeVariabilidade

SequênciaSequência TamanhoTamanho


Purificar as células a estudar CD4 / CD8CD4 / CD8

Variabilidade de uma pode Variabilidade de uma pode obscurecer alterações na obscurecer alterações na outraoutra

Repertório muito diferenteRepertório muito diferente Local em estudoLocal em estudo

Sangue periférico Sangue periférico Tecidos infectado/tumorTecidos infectado/tumor Nódulos linfáticosNódulos linfáticos


Selecção da Técnica


Southern Blot


Multiplex PCR for CDR3 length


Electroforese Capilar (II)

Fluxo Electro-osmótico (FEO):Fluxo Electro-osmótico (FEO): A superfície do capilar de vidro-silica A superfície do capilar de vidro-silica

Tem grupos funcionais carregados negativamente, Tem grupos funcionais carregados negativamente, atrai iões carregados positivamenteatrai iões carregados positivamente Estes iões migram para o pólo negativo, carregando Estes iões migram para o pólo negativo, carregando

consigo moléculas do solvente. consigo moléculas do solvente. Moléculas neutras viajam á velocidade do FEOMoléculas neutras viajam á velocidade do FEO Moléculas positivas são mais rápidas que o FEOMoléculas positivas são mais rápidas que o FEO Moléculas negativas são mais lentas que o FEOMoléculas negativas são mais lentas que o FEO todas as moléculas migram para o pólo negativo (com todas as moléculas migram para o pólo negativo (com

velocidade que depende da sua carga e do seu peso velocidade que depende da sua carga e do seu peso molecular), onde podem ser detectadas com o mesmo tipo de molecular), onde podem ser detectadas com o mesmo tipo de aparelhagem utilizado em HPLC.aparelhagem utilizado em HPLC.


Electroforese capilar (III)


Métodos baseados na conformação Conformação do dsDNAConformação do dsDNA

não depende da sequêncianão depende da sequência A conformação de homodupletos é diferente da A conformação de homodupletos é diferente da

dos heterodupletosdos heterodupletos A conformação dos heterodupletos depende da A conformação dos heterodupletos depende da

sequencia de “mismatch”sequencia de “mismatch” Conformação do ssDNA Conformação do ssDNA

depende da sequência (forma zonas de dupleto depende da sequência (forma zonas de dupleto intramolécular, dependentes da sequência)intramolécular, dependentes da sequência)


Single Strand Conformation Polimorfism (SSCP) dsDNA é desnaturadodsDNA é desnaturado dsDNA é diluidodsDNA é diluido Renaturação rápidaRenaturação rápida Corrida em condições semi-Corrida em condições semi-

desnaturantes e a temperaturas desnaturantes e a temperaturas fixasfixas

Resultado depende muito de:Resultado depende muito de: Temperatura de corridaTemperatura de corrida Concentração de Concentração de

desnaturantedesnaturante Presença de certos químicos Presença de certos químicos

(ex: glicerol, etc)(ex: glicerol, etc)

WT1

WT2

mutantes


Heteroduplex Analysis (HA)

Heterodupletos causam Heterodupletos causam Distorção na conformaçãoDistorção na conformação Migração no gel mais lentaMigração no gel mais lenta

Heterodupletos podem existir por:Heterodupletos podem existir por: Co-amplificação por PCR de heterozigotosCo-amplificação por PCR de heterozigotos Introdução de DNA WT e M no mesmo PCRIntrodução de DNA WT e M no mesmo PCR

Correm-se no mesmo gel amostras WT, M e Correm-se no mesmo gel amostras WT, M e WT+MWT+M


Heteroduplex Analysis (HA)

Sensibilidade entre 80-90% (fragmentos <300bp)Sensibilidade entre 80-90% (fragmentos <300bp) Utilização do análogo de acrilamida (MDE ou Utilização do análogo de acrilamida (MDE ou

DEM) aumenta a sensibilidade da HADEM) aumenta a sensibilidade da HA A adição de ureia ao gel pode criar um ambiente A adição de ureia ao gel pode criar um ambiente

semi-desnaturante que aumenta a resolução do semi-desnaturante que aumenta a resolução do HAHA


Citometria de Fluxo


Análise de activação celular


Medida da função precoce de receptores: ensaio de activação CD69

CD2 “crosslinking”CD2 “crosslinking” CD2-biot + avidinaCD2-biot + avidina

Colher sangueColher sangue Incubar c/ Incubar c/ CD2/2R-avidina CD2/2R-avidina

4h-37ºC4h-37ºC LavarLavar Marcar c/Marcar c/

CD4/CD69/CD3CD4/CD69/CD3 CD8/CD69/CD3CD8/CD69/CD3

LavarLavar FixarFixar Analisar em citómetroAnalisar em citómetro


Titular no tempo o efeito do activador


Medida da expressão de receptores pós activação: ensaio quantitativo

Muitas moléculas variam de Muitas moléculas variam de expressão no decorrer da expressão no decorrer da activaçãoactivação CD95(fas)CD38,CD26, CD95(fas)CD38,CD26,

CD25, receptores de CD25, receptores de quimoquinas (CXCR4, quimoquinas (CXCR4, CCR3, CCR5)CCR3, CCR5)

Colher sangueColher sangue Marcar célulasMarcar células Correr no citómetro juntamente Correr no citómetro juntamente

com painel beads p/ calibração com painel beads p/ calibração da Intensidade de fluorescênciada Intensidade de fluorescência


Medida da activação celular: concentração intracelular de Ca2+

Colher sangueColher sangue Separar cel.mononuclearesSeparar cel.mononucleares cultivar em meio de cultura c/ cultivar em meio de cultura c/

PHA 3 dias em 5%COPHA 3 dias em 5%CO22

Cultivar 4 dias em meio c/ IL2Cultivar 4 dias em meio c/ IL2 Adicionar INDO-1Adicionar INDO-1 Incubar 40 min-31ºCIncubar 40 min-31ºC LavarLavar Incubar 5min-37ºCIncubar 5min-37ºC Ler no citometro 30 seg.Ler no citometro 30 seg. Interromper p/ ActivarInterromper p/ Activar Ler no citometroLer no citometro


Análise de Função celular

2 – Função das células fagociticas2 – Função das células fagociticas


Definir a população de monócitos

FSC/SSCFSC/SSC SSC/CD14SSC/CD14 SSC/CD16SSC/CD16

HLA-DR pode também ajudar:HLA-DR pode também ajudar: Monocitos HLA-DRMonocitos HLA-DR++

Granulócitos HLA-DRGranulócitos HLA-DR--


Definir a população de granulócitos

FSC/SSCFSC/SSC SSC/CD33SSC/CD33


Avaliação do aumento de expressão de integrinas 2

Integrinas b2Integrinas b2 CD11a (LFA1) expresso em CD11a (LFA1) expresso em

todos os leucócitostodos os leucócitos CD11b,CD11c expressos em CD11b,CD11c expressos em

monocitos, granulócitos e Nkmonocitos, granulócitos e Nk Partilham a cadeia Partilham a cadeia (CD18) (CD18) Mutações em CD18 originam Mutações em CD18 originam

LAD1 (leucocyte adesion LAD1 (leucocyte adesion deficiency type 1)deficiency type 1)

Estimular PBMC c/ PMA 15’-37ºCEstimular PBMC c/ PMA 15’-37ºC Preparar 1 tubo sem estimulaçãoPreparar 1 tubo sem estimulação Marcar c/ CD11bMarcar c/ CD11b Preparar tb um control IgG2aPreparar tb um control IgG2a FixarFixar Analisar em citómetroAnalisar em citómetro


Estudo de expressão de FcReceptor

3 FcReceptors: 3 FcReceptors: CD16CD16 CD32CD32 CD64CD64

CD64 aumenta rápidamente em monócitos e granulócitos em resposta CD64 aumenta rápidamente em monócitos e granulócitos em resposta a IFN-a IFN-, GCSF (não GMCSF) e IL12, GCSF (não GMCSF) e IL12

Marcação standard com Marcação standard com -CD64 utilizando beads standard para -CD64 utilizando beads standard para intensidade de fluorescência para a quantificaçãointensidade de fluorescência para a quantificação

Útil paraÚtil para Confirmação de um processo inflamatório agudoConfirmação de um processo inflamatório agudo Monitorizar e ajustar a dose em doentes a receber IFN-Monitorizar e ajustar a dose em doentes a receber IFN-


Estudo de quimiotaxia

Estudo é possível, mas não é frequente no Estudo é possível, mas não é frequente no laboratório de análises clinicaslaboratório de análises clinicas


Estudo de fagocitose Colher sangue em heparina (citrato e EDTA reduzem fagocitose)Colher sangue em heparina (citrato e EDTA reduzem fagocitose) Arrefecer o sangue em gelo-15minArrefecer o sangue em gelo-15min Misturar c/ E.coli marcadas c/ FITC e opsinizadas c/Ig e complemento Misturar c/ E.coli marcadas c/ FITC e opsinizadas c/Ig e complemento

(pool de soro)(pool de soro) Incubar 1 tubo a 37ºC e outro em gelo (control neg.)Incubar 1 tubo a 37ºC e outro em gelo (control neg.) Colocar em geloColocar em gelo Adicionar sol quenching fria para impedir a fluorescência devida a Adicionar sol quenching fria para impedir a fluorescência devida a

bactérias não internalizadas, mas ligadas à membrana no fagocitobactérias não internalizadas, mas ligadas à membrana no fagocito Lavar Lavar Adicionar sol.lise (lise de eritrócitos e fixação dos leucócitos)Adicionar sol.lise (lise de eritrócitos e fixação dos leucócitos) Analisar em citómetro em 30 min.Analisar em citómetro em 30 min. Adicionalmente pode-se marcar as células c/ Adicionalmente pode-se marcar as células c/ -CD14 e -CD14 e -CD33-CD33


Estudo de “Killing” A morte induzida pelos fagócitos é A morte induzida pelos fagócitos é

primáriamente o resultado da primáriamente o resultado da geração de radicais de oxigénio geração de radicais de oxigénio activos (RO)activos (RO)

A principal via de geração de RO é A principal via de geração de RO é a via da NADPH oxidasea via da NADPH oxidase

Deficiencias genéticas nestas Deficiencias genéticas nestas enzimas originam CGD (doença enzimas originam CGD (doença granulomatose crónica).granulomatose crónica).

Na presença de Peroxidases e Na presença de Peroxidases e HH22OO22, PMN’s normais , PMN’s normais convenientemente estimulados convenientemente estimulados oxidam o corante DHR-123 a oxidam o corante DHR-123 a rodamina.123, tornando as células rodamina.123, tornando as células fluorescentes. As células de fluorescentes. As células de doentes com CGD não doentes com CGD não metabolizam o corante.metabolizam o corante.


Análise de Função celular

3 – Apoptose3 – Apoptose


Colher sangue C/ Colher sangue C/ anticoagulanteanticoagulante

Manter o sangue sempre a RTManter o sangue sempre a RT Processar de imediato e nunca Processar de imediato e nunca

depois de 6h pós-colheitadepois de 6h pós-colheita Preparar PBMCPreparar PBMC


Detecção de células c/ menor conteúdo de DNA (subdiplóides)

lavar cels em HBSSlavar cels em HBSS Ressuspender (10Ressuspender (1066 cells) em ET-OH cells) em ET-OH Incubar 1 h a 4ºCIncubar 1 h a 4ºC Remover sobrenadante (SN)Remover sobrenadante (SN) Adicionar HBSS,RNAse e PIAdicionar HBSS,RNAse e PI Incubar 15 min a RTIncubar 15 min a RT Manter a 4ºC no escuroManter a 4ºC no escuro Ler no citómetroLer no citómetro

Activação de endonucleases origina a degradação de DNAActivação de endonucleases origina a degradação de DNA PI (iodeto de propidium) é um fluorocromo com afinidade para DNAPI (iodeto de propidium) é um fluorocromo com afinidade para DNA

DNA fica fluorescenteDNA fica fluorescente Intensidade de fluorescência é proporcional á quantidade de DNA/célulaIntensidade de fluorescência é proporcional á quantidade de DNA/célula


Detecção de células subdiplóides (Ex.)


Detecção de células c/ quebras no DNA (Método TUNEL)

Introdução de dUTP-FITC nas Introdução de dUTP-FITC nas quebras do DNA pela TdTquebras do DNA pela TdT

Incubar c/ permeafix 40’-RTIncubar c/ permeafix 40’-RT LavarLavar Ressuspender na sol. Marcação Ressuspender na sol. Marcação

contendo TdT, tampão, dUTP-contendo TdT, tampão, dUTP-FITCFITC

Incubar 1h-37ºCIncubar 1h-37ºC LavarLavar Ler no citometroLer no citometro


Método TUNEL (Ex.)


Detecção de células c/ fosfatidilserina translocada Método da anexina V

A fosfatidilserina encontra-se A fosfatidilserina encontra-se habitualmente apenas no habitualmente apenas no folheto interno da membranafolheto interno da membrana

Em células apoptóticas a Em células apoptóticas a assimetria membranar perde-se assimetria membranar perde-se expondo fosfatidilserinaexpondo fosfatidilserina

A Anexina V é capaz de se A Anexina V é capaz de se ligar à fosfatidilserinaligar à fosfatidilserina


Método da anexina V (Ex.)


Estudos de citocinas


Estudos de citocinas Em condições normais não são detectáveis citoquinas nos Em condições normais não são detectáveis citoquinas nos

fluidos biológicosfluidos biológicos A presença de citoquinas nos fluidos biológicos é A presença de citoquinas nos fluidos biológicos é

caracteristicacaracteristica de situações patológicasde situações patológicas De estadios de situações patológicasDe estadios de situações patológicas

As citoquinas podem ser estudadas por:As citoquinas podem ser estudadas por: Imunoensaios (ELISA, RIA)Imunoensaios (ELISA, RIA) BioensaiosBioensaios Citometria Citometria Métodos molecularesMétodos moleculares


Detecção de citoquinas: ELISA


Bioensaios Uso de uma linha celular que responde à presença de uma Uso de uma linha celular que responde à presença de uma

citocinacitocina Cultura da linha celular na presença e na ausência de Cultura da linha celular na presença e na ausência de

fluido a testar, e na presença da citocina recombinante.fluido a testar, e na presença da citocina recombinante. A medida da actividade celular é indicadora da A medida da actividade celular é indicadora da

presença/ausência de citocinapresença/ausência de citocina Tipos de bioensaios (actividade celular medida)Tipos de bioensaios (actividade celular medida)

Actividade citotoxicaActividade citotoxica ProliferaçãoProliferação Função celular específicaFunção celular específica Quantidade de uma proteína induzidaQuantidade de uma proteína induzida


Activationof M in vitro

+/-

Cytokine secretion

Remove cytokine containing

supernatant

Test for effecton other

cells

Which cytokine?

Detecção de citoquinas:Bioensaios


Include an antibody that blocks

interleukin-1

Test for a characteristiceffect on other cells

e.g. interleukin-1Induces proliferation in

thymocytes

- IL-1 present+ IL-1 absent+

Especificidade dos bioensaios


Citometria de fluxo Estimular as célulasEstimular as células

MitogénioMitogénio Ag+coestimuladores Ag+coestimuladores

((-CD28+ -CD28+ -CD49d)-CD49d) Bloquear a secreção de Bloquear a secreção de

citoquinas (brefeldin –BfA ou citoquinas (brefeldin –BfA ou monensin)monensin)

Lisar os eritrócitos e fixarLisar os eritrócitos e fixar Permeabilizar as célulasPermeabilizar as células Marcar com anticorpoMarcar com anticorpo Analisar Analisar


Detecção de IFN-por citometria


Ensaios Moleculares

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