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Técnica Básicas para

Análises de Células e

Tecidos

Algumas grandezas...

1km 1.000m

1m 100 cm

1cm 10 mm

1mm 1000 m

1 m 1000 nm

1Å (Angstron) 10-10m

Visão panorâmica da célula

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Visão panorâmica da célula

Aumento e Poder de Resolução

Resolução: menor distância para que duas partículas apareçamcomo objetos separados.

O limite de resolução da Microscopia Óptica é de 0,2 m

Visão panorâmica

da célula

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Desenvolvimento da Microscopia

-Microscópio Óptico (luz)

-Microscópio Eletrônico (elétrons)

Microscópio óptico – utiliza feixes de luz

Desenvolvimento da Microscopia

Sistemas de lentes (condensador, objetiva eocular)

O limite de resolução do MO é de 0,2 m edepende essencialmente da objetiva.

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Microscópio óptico

Desenvolvimento da Microscopia

Microscópio óptico de campo claro

Desenvolvimento da Microscopia

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Microscópio óptico de fluorescência

Desenvolvimento da Microscopia

Microscópio óptico de fluorescência

Desenvolvimento da Microscopia

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Microscópio óptico confocal

Desenvolvimento da Microscopia

Outros tipos de microscópios ópticos

Desenvolvimento da Microscopia

Iluminação direta (sem coloração)

Contraste de fase (refração da luz)

Contraste diferencial de interferência (refraçãoda luz)

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Microscópio eletrônico

-utiliza feixes de elétrons

-lentes eletromagnéticas

Desenvolvimento da Microscopia

Alta resolução, abaixo de 0,3 nm.

Material biológico é impregnado com metais pesados

como ósmio, chumbo e urânio

Microscópio eletrônico de transmissão:

Desenvolvimento da Microscopia

Estrutura e funcionamento

Alta resolução

Necessita de cortes muito finos

(0,02 a 0,1 m)

Material biológico é impregnado

com metais pesados como ósmio, chumbo e urânio

Imagem elétron-densa (escura) e

elétron-lúcida (clara)

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Microscópio eletrônico de transmissão

Desenvolvimento da Microscopia

Microscópio eletrônico de varredura

Desenvolvimento da Microscopia

Alta resolução

Fragmentos maiores ou tecidos inteiros

Material biológico é recoberto com metais

como ouro ou platina

Estrutura tridimensional (3D)

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Microscópio eletrônico de varredura

Desenvolvimento da Microscopia

MICROSCOPIA ELETRÔNICA DE VARREDURA

Microscópio eletrônico devarredura

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Centro de Microscopia Eletrônica

UNESP - Botucatu

MEVMET

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Preparação de material para análise ao microscópio

As células e tecidos precisam estar perfeitamente

preservados, apresentando a mesma estrutura e

composição química que possuíam quando vivas.

Preparação de material para análise ao microscópio

Fixação – Preserva a morfologia e composição do tecido. Fixador mais utilizado

Formaldeído. Para microscopia eletrônica (ME) os tecidos necessitam de tratamentos

especiais em soluções de aldeído glutárico e tetróxido de ósmio.

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Preparação de material para análise ao microscópio

Lavagem

Preparação de material para análise ao microscópio

Desidratação –Retirada da água presente nos tecidos através de

sucessivos banhos em uma série de etanol (70%80%90%100%).

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Preparação de material para análise ao microscópio

Diafanização ou clareamento–Substituição do etanol por líquido miscível

(geralmente xilol) com o meio de impregnação e retirada de lipídios.

Preparação de material para análise ao microscópio

Meio de impregnação –Substituição do líquido

(xilol) por parafina ou resina sintética. A resina

sintética possibilita cortes mais finos (1 a 2 m). O

ME necessita de cortes muito finos (0,02 a 0,1 m)

e por isso utiliza se resinas mais duras. Neste caso os cortes são feitos com navalhas de vidro ou

diamante.

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Preparação de material para análise ao microscópio

Meio de inclusão –Suporte para o tecido impregnado.

Preparação de material para análise ao microscópio

Tecido preparado para análise ao Microscópio Eletrônico

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Preparação de material para análise ao microscópio

Micrótomo

Instrumento para cortar finas fatias do tecido (menores que 1m de espessura).

Preparação de material para análise ao microscópio

Micrótomo automatizado –Permite a obtenção rápida de cortes sem

passar pelas etapas descritas antes.

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Preparação de material para análise ao microscópio

Micrótomo

Realizando cortes do material

Preparação de material para análise ao microscópio

Micrótomo

Instrumento para cortar finas fatias do tecido (menores que 1m de espessura).

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Preparação de material para análise ao microscópio

Estufa 60 oC

Derreter e eliminar a parafina

Preparação de material para análise ao microscópio

Xilol

Retirada da parafina Série alcoólica - Rehidratação.

Hidratação completa

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Preparação de material para análise ao microscópio

Coloração

Preparação de material para análise ao microscópio

Hematoxilina/Eosina (HE)

Coloração freqüentemente utilizada

Coloração –A maioria dos corantes utilizados se comportam como ácido ou base.

Estrutura celular basófila, liga-se a corantes básicos.

Estrutura celular acidófila, liga-se a corantes ácidos.

Além destes corantes freqüentemente utilizados, utiliza se também outros tipos de coloração, como a impregnação com sais de prata e ouro.

Corantes básicos: azul-de-tuluidina, azul-de-metileno, hematoxilina...

Corantes ácidos: eosina, orange G, fucsina ácida...

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Preparação de material para análise ao microscópio

Além destas colorações frequentemente utilizadas, outros métodos baseados em reações químicas (citoquímica), imunológicas (imunocitoquímica), entre outras, também podem ser empregados.

...outras técnicas que podem ser empregadas na BiologiaCelular e Molecular

: Radioautografia: Imunocitoquímica

: Cromatografia: Eletroforese

: Cristalografia e difração de raio-X: Hibridação de ácidos nucléicos

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Preparação de material para análise ao microscópio

Montagem das lâminas

Preparação de material para análise ao microscópio

Análise do Material

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Preparação de material para análise ao microscópio

Resultados

Plano de corte