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Técnica de Western Blotting
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Western Blotting (Immunoblotting)
Método utilizado para a imunodetecção de proteínas após sua separação por eletroforese em gel e transferência de um extrato
proteico para uma membrana adsorvente. Kurien & Scofield, 2006
Permite detectar, caracterizar e semi-quantificar múltiplas proteínas, principalmente aquelas que estão em baixas quantidades na amostra.
1973 – Edwin Southern Southern Blotting - DNA 1977 – James Alwine e colaboradores Northern Blotting - RNA 1979 – Towbin e colaboradores Western Blotting - Proteínas
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Etapas da técnica
- Eletroforese – SDS-PAGE - Transferência para membrana - Bloqueio - Adição de anticorpos específicos - Detecção da reação
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Alberts, Biologia Molecular da Célula 5ºedição
Eletroforese SDS-PAGE
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https://www.youtube.com/watch?v=J5qPKK0GGDo
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Soro gama IgG
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Transferência para membrana
Nitrocelulose (menor custo) PVDF (maior sensibilidade, ligação e retenção)
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Bloqueio
Leite, soro albumina bovina (BSA) ou ovo albumina
- Membrana – alta afinidade por proteína
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Adição de anticorpos específicos
Detecção de sinal (colorimétrico ou quimioluminescente)
Substrato da enzima Anticorpo secundário Conjugado com enzima
Anticorpo primário Proteína alvo
Membrana contendo proteína transferida
Indireto
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Direta
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Detecção da reação
Substrato DAB- Diaminobenzidina- cor marrom
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https://www.youtube.com/watch?v=pRIn3p7x3V8
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Aplicações no diagnóstico e pesquisa animal
Técnica recente que possui alta sensibilidade e especificidade com emprego crescente em diagnóstico de doenças animais.
Diagnóstico - Encefalopatias espongiformes transmissíveis
- Leishmaniose visceral americana
- Mieloencefalite equina por protozoário
- Salmonelose
- Mycoplasma hyopneumoniae (suínos)
Pesquisa- Neoplasias
Doenças hereditárias
Descobertas de proteínas para produção de vacinas
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Science, v 235
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