Técnica da Peroxidase

Reagentes: HBSS Ca2+ or/and Mg2+ free 3,3’,5,5’-tetremethylbenzidine hydrochloride (TMB; 10 mM) H2O2 H2SO4

Protocolo Experimental:

1. Preparar uma solução de Ácido Sulfúrico 2 M (100 mL)

2. Preparar no dia 10 mL de TMB 10 mM por cada 100 poços

3. Preparar no dia 10 mL de H2O2 5 mM por cada 100 poços

4. Diluir 15 µl de plasma em 135 µl de HBSS Ca2+ or/and Mg2+ free numa placa de 96 poços

5. Adicionar 150 µl de HBSS Ca2+ or/and Mg2+ free a três poços para servir como brancos

6. Adicionar 50 µl da solução TMB 10 mM a cada poço

7. Adicionar 50 µl da solução H2O2 5 mM a cada poço

8. Após 2 min a reacção é parada com 50 µl de H2SO4 2M

9. Transferir 200 µl de reacção para uma nova microplaca, para evitar overflow.

10. Medir a absorvância a 450 nm num leitor de microplacas.

A actividade da peroxidase (unidades mL-1 de plasma) é determinada segundo o pressuposto de que uma unidade de peroxidase produz uma mudança de abs de 1 unidade na densidade óptica.