dinâmica da matéria orgânica no sedimento de um lago amazônico ...
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UNIVERSIDADE DO VALE DO ITAJAÍ - UNIVALI CENTRO DE CIÊNCIAS TECNOLÓGICAS DA TERRA E DO MAR – CTTMar
Letícia Zanatta Baratieri
Influência da temperatura e concentração de Tween20 sobre o crescimento de Halomonas sulfidaeris LAMA838 e Marinobacter excellens LAMA842
Itajaí 2013
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Letícia Zanatta Baratieri
Influência da temperatura e concentração de Tween20 sobre o crescimento de Halomonas sulfidaeris LAMA838 e Marinobacter excellens LAMA842
Tabalho de Conclusão de Curso Área de conhecimento: Oceanografia Sub- área de conhecimento: Biológica Modalidade: Pesquisa Orientador: Marcus Adonai Castro da Silva
Itajaí 2013
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AGRADECIMENTOS
Agradeço ao professor Marcus Adonai, pela orientação, paciência, dedicação e
apoio.
Ao pessoal do LAMA Tiago e César e também ao Tiago do LBB por me
ajudarem sempre que precisei.
A minha família que mesmo de longe sempre me incentivou muito.
Ao meu namorado pelo companheirismo, apoio e paciência.
Aos amigos mais antigos, que mesmo de longe estiverem sempre ao meu lado.
Aos amigos que fiz durante a faculdade, que ajudaram a tornar esse período
mais prazeroso.
3
LISTA DE FIGURAS
Figura 1. Crescimento dos micro-organismos H. sulfidaeris LAMA 838 e M. excellens
LAMA 842, em função da temperatura. O crescimento foi avaliado em caldo marinho
suplementado com Tween20 a 1%. Os valores plotados representam as médias
aritiméticas de triplicatas para cada temperatura testada, e as barras representam o
desvio padrão................................................................................................................16
Figura 2. Crescimento dos micro-organismos H. sulfidaeris LAMA 838 e M. excellens
LAMA 842, em função da concentração de Tween20. Os micro-organismos foram
cultivados por um dia em caldo marinho, a 30ºC (H. sulfidaeris LAMA 838) e entre 20 e
25ºC (M. excellens LAMA 842). Os valores plotados representam as médias
aritiméticas de triplicatas para cada concentração testada, e as barras representam o
desvio padrão................................................................................................................16
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LISTA DE APÊNDICES Apêndice1. Níveis de significância da ANOVA para taxa de crescimento em função da temperatura...................................................................................................................24
Apêndice 2. Resultados para a ANOVA, para os experimentos de crescimento em função da temperatura..................................................................................................24
Apêndice 3. Níveis de significância da ANOVA para taxa de crescimento em função da temperatura...................................................................................................................24
Apêndice 4. Resultados para a ANOVA, para os experimentos de crescimento em função da concentração de Tween20...........................................................................25 Apêndice 5. Curvas de calibração elaboradas no presente trabalho............................26
5
SUMÁRIO
1.INTRODUÇÃO ..........................................................................................................7
2.OBJETIVO GERAL ................................... ................................................................9
2.1.Objetivos específicos.......................... ..............................................................9
3.FUNDAMENTAÇÃO TEÓRICA............................ ................................................... 10
3.1.Enzimas marinhas............................... ............................................................ 10
3.2.Micro-organismos marinhos lipolíticos .......... ............................................... 10
3.3.Influência da temperatura sobre o crescimento m icrobiano ....................... 11
3.4.Influência da concentração do substrato sobre o crescimento microbiano................................................................................................................................ 11
4.MATERIAIS E MÉTODOS.............................. ......................................................... 13
4.1.Micro-organismos estudados..................... .................................................... 13
4.2.Experimentos de cultivo ........................ ......................................................... 13
4.3.Determinação do crescimento microbiano ......... .......................................... 14
4.4.Análise de dados............................... .............................................................. 14
5.RESULTADOS ....................................... ................................................................. 15
6.DISCUSSÃO ........................................................................................................... 18
7.CONCLUSÃO........................................ .................................................................. 21
REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS......................... .................................................. 22
APÊNDICES............................................................................................................... 25
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RESUMO
Os ecossistemas marinhos profundos apresentam uma grande diversidade
microbiológica. Muitos desses micro-organismos têm a capacidade de produzir
enzimas lipolíticas, e estas por sua vez, podem apresentar diversas aplicações
biotecnológicas: em tratamento de esgoto ou caixas de gordura, produção comercial
de biodiesel e produção de alguns alimentos e algumas drogas. Neste contexto, o
presente trabalho tem como objetivo determinar as melhores condições para o
crescimento das linhagens Halomonas sulfidaeris LAMA 838 e Marinobacter excellens
LAMA 842, previamente isoladas de amostras de sedimentos da região da cordilheira
Walvis, Atlântico Sul. Para tanto, os parâmetros avaliados foram temperatura e
concentração de substrato. Para a determinação da temperatura ótima de
crescimento, as bactérias foram inoculadas a partir de uma pré-cultura em meio Caldo
Marinho suplementado com Tween20 a 1% (CMT20), e incubadas durante um período
de 48 horas, nas temperaturas testadas (5ºC, 10ºC, 15ºC, 20ºC, 25ºC e 30ºC). E por
fim, na verificação da melhor concentração de substrato, os micro-organismos foram
mantidos em frascos Erlenmeyer, suplementado com Tween20 a quatro
concentrações distintas (0,001, 0,01, 0,1 e 1%), na temperatura ótima de crescimento,
determinada previamente. Para H. sulfidaeris entre as temperaturas testadas, aquela
em que a espécie apresentou um crescimento ótimo foi a 30°C e na concentração de
substrato, Tween 20 a 1%. Enquanto para M. excellens a temperatura ótima se
encontra entre 20 a 25°C e subtrato em concentração de 0,001 a 0,01%. A partir dos
resultados, é possível verificar que os organismos aqui estudados são mesófilos, e
que M. excellens é uma bactéria mais adaptada a ambientes pobres em nutrientes do
que H. sulfidaeris.
Palavras-chave : bactérias lipolíticas, crescimento, temperatura, substrato
7
1.INTRODUÇÃO
Os ecossistemas marinhos, especialmente os mares profundos, abrigam uma
grande diversidade filogenética de micro-organismos. Estes podem ter grande
importância ecológica e também diversas possibilidades de aplicações
biotecnológicas. No entanto, as dificuldades de acesso a esses locais e a manutenção
desses organismos em laboratório, tornaram seu entendimento bastante complexo.
Sua capacidade de sobreviver e manter suas atividades mesmo sob condições
de baixa temperatura e alta pressão despertaram o interesse da comunidade cientifica.
Desde a última década tem havido um esforço contínuo para se conhecer mais sobre
as enzimas de organismos marinhos. Entre as mais citadas com potencial
biotecnológico tem-se: proteases (GIONGO, 2006), carboidrases (BERTUCCI; COURI,
2004), peroxidases (DEBASHISH et al., 2005), lipase e celulases (ODISI et al., 2012).
Outro grupo de proteínas de grande interesse são as lipases, enzimas lipolíticas
produzidas por micro-organismos que apresentam variadas aplicações: em tratamento
de esgoto ou caixas de gordura, produção comercial de biodiesel e produção de
alimento e algumas drogas. No tratamento de esgoto ou em caixas de gordura, as
lípases atuam diminuindo custos de manutenção e reduzindo impactos negativos ao
meio ambiente (AEHLE, 2007). Na produção comercial de biodiesel, são ótimas
diminuindo a quantidade de resíduos e facilitando a recuperação do produto final.
Comparando-se combustíveis fósseis com biocombustíveis, o segundo apresenta a
vantagem de ser uma fonte de energia renovável (SALIS; MONDUZZI; SOLINAS,
2007). Na indústria alimentícia, seu uso está associado à produção de queijos, sucos
de frutas e vegetais, clarificação de sucos e vinhos, panificação e cervejaria
(BERTUCCI; COURI, 2004). E, em algumas drogas, possuem a capacidade de reduzir
os efeitos colaterais causados pelas mesmas (AEHLE, 2007; KIM et al., 2007).
Anterior ao processo de aplicação em microbiologia industrial, é necessário o
desenvolvimento de métodos para o controle ou otimização das atividades
microbianas, que por sua vez, depende muito do entendimento das influências
ambientais a que estes micro-organismos estão submetidos. Basicamente, os fatores
que mais controlam seu crescimento são: temperatura, pH, disponibilidade de água e
oxigênio (MADIGAN et al., 2004) e concentração do substrato (HORIKOSHI, 2011).
Cada organismo apresenta uma temperatura e/ou um pH mínimo abaixo do qual
não consegue crescer, um ótimo em que o crescimento ocorre rapidamente e um
máximo, acima do qual o organismo não consegue crescer. O oxigênio estabelece o
crescimento de organismos anaeróbios, aqueles que não são capazes de respirar
8
oxigênio, e aeróbios, capazes de crescer em ambientes com grandes concentrações
de oxigênio (MADIGAN et al., 2004). A concentração do substrato também está
relacionada ao crescimento microbiano. Acima de uma determinada concentração de
carbono (substrato), por exemplo, a taxa de crescimento será constante e, abaixo
dessa concentração, a taxa poderá diminuir consideravelmente (HORIKOSHI, 2011).
Uma vez que já tenha sido constatado o potencial biotecnológico das bactérias
produtoras de enzimas lipolíticas, a idéia que se segue é gerar um produto de
interesse comercial. Em microbiologia industrial, uma produção economicamente
viável só é possível se realizada em largas escalas (MADIGAN et al., 2004), para
tanto, se faz necessário a otimização do crescimento destes micro-organismos. Estes,
por razões econômicas, devem ser produzidos em grandes quantidades no menor
intervalo de tempo, o que reflete a necessidade de se determinar as condições mais
adequadas para o crescimento destas bactérias.
Foi realizado, em 2011, um trabalho visando avaliar a atividade lipolítica de
bactérias produtoras de lipases em diferentes substratos (ROSA, 2011). O trabalho
teve como objetivo isolar e caracterizar bactérias lipolíticas de amostras de sedimentos
oriundas de várias regiões do Oceano Atlântico. Baseado nesta pesquisa, o presente
trabalho dará continuidade ao anterior, procurando agora, as melhores condições para
o crescimento das bactérias que apresentaram resultados positivos quanto a produção
de enzimas, em função da temperatura e concentração de substrato.
9
2.OBJETIVO GERAL
Determinar as melhores condições de crescimento de duas bactérias marinhas
lipolíticas, Halomonas sulfidaeris LAMA 838 e Marinobacter excellens LAMA 842, em
função da temperatura e da concentração do substrato (Tween20).
2.1.Objetivos específicos
• Avaliar o crescimento das duas bactérias marinhas lipolíticas aqui estudadas,
em função de diferentes temperaturas.
• Avaliar o crescimento das duas bactérias marinhas lipolíticas estudadas, em
função de diferentes concentrações de Tween20.
10
3.FUNDAMENTAÇÃO TEÓRICA
3.1.Enzimas marinhas Os oceanos são vistos atualmente como um ambiente extremamente
promissor, no entanto sua matéria-prima ainda é pouco explorada. Trata-se de um
ecossistema com uma diversidade infinita de novos micro-organismos e estes por sua
vez, podem significar uma importante fonte de compostos bioativos fundamentais para
o avaço biotecnológico e desenvolvimento sustentável (RIVERA, 2012). Vinculado ao
grande potencial biotecnológico, estão as enzimas destes micro-organismos.
Debashish et al., (2005) cita Vibrio spp e V. alginolyticus como sendo organismos
capazes de produzir, respectivamente, enzimas protease e colagenase, que então,
podem ser utilizadas pelas indústrias de limpeza e farmacêutica.
Além destas, outra enzima que tem recebido bastante atenção é a lipase,
produzida por micro-organismos como Pseudoalteromonas sp J937 (MO etl al., 2007),
Pseudomonas sp MSI057 (KIRAN et al., 2008), Yarrowia lipolytica CL180 (KIM et al.,
2007), Bacillus pumilus B106 (ZHANG et al., 2009), Bacillus aerophilus LAMA 582 e
Bacillus stratosphericus LAMA 585 (ODISI et al., 2012)
3.2.Micro-organismos marinhos lipolíticos
Micro-organismos lipolíticos são aqueles capazes de produzir enzimas que
hidrolisam lipídeos. Pertencem a vários grupos filogenéticos, dos domínios de
procariotos, Bacteria e Archaea. Dentro destes domínios, são observados micro-
organismos marinhos em vários filos distintos. Um trabalho realizado por Seo et al.
(2005), encontrou uma nova espécie bacteriana produtora de lipase, Photobacterium
frigidiphilum, isolada a partir de sedimentos marinhos coletados a uma profundidade
de 1450 m. Sua atividade lipolítica foi observada em Ágar Marinho contendo o
substrato tributirina. Park et al, (2007) também determinou uma nova enzima lipolítica,
estudando a linhagem Vibrio GMD509, isolada a partir de ovos de lebre do mar,
Aplysia kurodai.
No decorrer das pesquisas a respeito de micro-organismos marinhos e o
ambiente que os circunda, muitas novas espécies acabam sendo descobertas. Outras
bactérias produtoras de lípases são as do gênero Halomonas e Marinobacter. Kaye et
al. (2004) procuraram avaliar a diversidade fisiológica e filogenética de bactérias de
fontes hidrotermais do oceano profundo. Como resultado, quatro isolados foram
11
totalmente caracterizados e, através de sequenciamento genético, classificados e
nomeados como Halomonas neptunia, H. sulfidaeris, H. axialensis e H. hydrothermalis.
Em um outro trabalho, por sequenciamento genético, foi descoberta uma nova espécie
para o gênero Marinobacter, a M. excellens. Esta foi encontrada a partir de 5 estirpes
de bactérias halofílicas, gram-negativas isoladas de amostras de sedimento coletadas
na Baía de Chazhma, mar do Japão (GORSHKOVA et al., 2003).
Além destes, autores como Xiang et al. (2004) estudaram micro-organismos
lipolíticos psicrófilos dos gêneros Psychrobacter, Pseudoalteromonas e Pseudomonas,
do filo Proteobacteria, sendo isolados de sedimentos profundos do Oceano Pacífico.
Este trabalho teve ênfase na produção de lípases em diferentes temperaturas. E então
foi verificado que as bactérias cresceram entre 4°C e 30°C, com um crescimento ótimo
entre 10 e 20°C, e produziram também enzimas hidrolíticas como proteases, amilases
e gelatinases.
3.3.Influência da temperatura sobre o crescimento m icrobiano
A temperatura mais adequada para o crescimento de um micro-organismo
varia muito de acordo com sua necessidade e/ou tolerância. Há organismos cuja
temperatura ótima de crescimento situa-se em baixas temperaturas, estes são
denominados psicrófilos entre 15°C e 0°C e psicotolerantes, capazes de crescer a
0°C, mas com ótimo entre 20°C e 40°C. Por outro lado, existem os organismos mais
adaptados a ambientes com altas temperaturas, como os termófilos, podendo
apresentar um crescimento ótimo a uma temperatura superior a 45°C, ou ainda, os
hipertermófilos cujo ótimo é superior a 80°C (MADIGAN et al., 2004).
Yu et al., (2009), investigaram a capacidade de 338 cepas de bactérias
isoladas do gelo do mar Ártico, na Bacia do Canadá (77°30’N–80°12’N), de produzir
protease, lipase, amilase, quitinase, celulase e/ou agarase. Destes isolados, verificou-
se que produtores de lipase foram filogeneticamente comuns entre as cepas isoladas,
que a temperatura ótima de atividade occorre entre 20 e 35ºC mas que, mesmo a
baixas temperaturas (0°C), os organismos apresentaram elevada produtividade
enzimática, não havendo diferença significativa entre as bactérias psicrófilas e
psicotolerantes.
3.4.Influência da concentração do substrato sobre o crescimento microbiano
12
Todas as bactérias heterotróficas marinhas têm que enfrentar o mesmo
problema em mar aberto, a extração de substratos suficientes para o seu crescimento
em um ambiente que, de modo geral, é empobrecido de nutrientes. Em resposta a
estas condições, alguns micro-organismos se adaptaram para ter um ótimo
crescimento sobre baixas concentrações de nutriente, como os oliogotróficos. E outros
no entanto, são dependentes de condições de meio enriquecido em nutrientes, os
copiotróficos (HORIKOSHI, 2011).
Eguchi et al., (1996) e Fegatella et al., (1998) demonstraram que culturas de
uma bactéria placntônica, Sphingopyxis alaskensis (ultramicrobacteria oligotrófica),
respondem imediatamente a “upshift” de nutrientes aumentando sua taxa de
crescimento, atingindo seu máximo quando expostas a elevados níveis de glicose. No
entanto, a taxa máxima de crescimento S. alaskensis é baixa, se comparada com os
organismos copiotróficos (FEGATELLA et al., 1998).
13
4.MATERIAIS E MÉTODOS
4.1.Micro-organismos estudados
Os micro-organismos utilizados neste trabalho pertencem às linhagens
Halomonas sulfidaeris LAMA 838 e Marinobacter excellens LAMA 842. Estas bactérias
foram previamente isoladas de amostras de sedimentos da região da cordilheira
Walvis, no Oceano Atlântico, de profundidades de 4650 e 5000 m (SILVA et al., 2013),
e foram selecionadas com base na sua atividade lipolítica sobre quatro substratos
distintos, Tween20, Tween40, Tween60 e Tween80 por Rosa, (2011). Durante o
trabalho os micro-organismos foram mantidos a 4ºC em placas de Ágar Marinho
suplementado com Tween20 a 1%, sendo repicados mensalmente.
4.2.Experimentos de cultivo
Para determinação dos valores de temperatura ótimo, máximo e mínimo de
crescimento, as bactérias foram cultivadas em frascos de Erlenmeyer (125 ml),
contendo 75ml de meio Caldo Marinho (Himedia) suplementado com Tween20 a 1%
(CMT20), nas temperaturas: 5ºC, 10ºC, 15ºC, 20ºC, 25ºC e 30ºC. O inóculo foi feito a
partir de uma pré-cultura em meio CMT20, incubada por até 48 horas, na temperatura
testada. Após a inoculação das bactérias, os frascos foram incubados em estufa na
temperatura testada, com força g de 0,36276864, por períodos de 1 dia para os testes
de 30 e 25°C, 2 dias para os testes de 20 e 15°C e 5 dias para os de 10 e 5°C. O valor
máximo de temperatura corresponde ao maior valor deste parâmetro no qual o
organismo apresenta crescimento. Da mesma forma, o valor mínimo de temperatura
corresponde ao menor valor no qual se observa crescimento. O valor ótimo de
temperatura para o crescimento de um determinado organismo foi determinado a partir
da taxa de crescimento deste organismo em cada um dos valores de temperatura. O
valor ótimo de temperatura correspondeu ao valor no qual a taxa de crescimento é
máxima. Para a obtenção dos valores de taxa de crescimento, a densidade óptica (600
nm) das culturas foi determinada ao longo do experimento, em intervalos de uma hora
(temperaturas mais altas) a quatro horas (temperaturas mais baixas), como medida de
crescimento. Estas determinações foram realizadas em periodicidade variável, de
acordo com a temperatura testada. A partir das medições de densidade óptica, a taxa
14
de crescimento foi calculada como descrito abaixo. Neste procedimento foram
utilizadas triplicatas (BREZNAK e COSTILOW, 1994).
Para avaliação do crescimento com diferentes concentrações do substrato
lipídico (Tween20), o experimento foi similar ao descrito acima para as diferentes
temperaturas. Neste caso o micro-organismo foi incubado em meio CMT20 com quatro
concentrações distintas de Tween20 (0,001, 0,01, 0,1 e 1%), na temperatura ótima de
crescimento, determinada previamente.
4.3.Determinação do crescimento microbiano
O crescimento microbiano foi avaliado através da densidade óptica (DO),
determinada em espectrofotômetro a 600nm (WHITE, 2000). As leituras foram
limitadas a valores de DO inferiores a 0,3, pois acima destes valores a relação entre
número de células e absorbância perde linearidade. Quando necessário, a cultura foi
diluída para a leitura no espectrofotômetro.
Para o cálculo da taxa de crescimento, os valores de DO foram convertidos em
número de células por mililitro. Para isto, a partir de uma cultura densa dos micro-
organismos estudados, foram preparados seis padrões com concentrações distintas
de células, e valores de DO, dentro da faixa linear (inferiores a 0,3). Em paralelo, foi
determinada a concentração de células nesta cultura, através de contagens em meio
sólido (Ágar Marinho), pela técnica de espalhamento em placas. Posteriormente, a
relação entre DO e número de células foi expressa por uma equação da reta,
calculada utilizando-se o software Microsoft Excel. Esta equação permitiu a conversão
dos valores de DO em células por mililitro. O cálculo da taxa de crescimento foi
efetuado através da regressão linear dos dados logaritimizados (Log10) de densidade
celular em relação com o tempo, utilizando o mesmo software mencionado acima. A
partir do coeficiente angular obtido, a taxa de crescimento foi calculada pela fórmula K
= a*2,303, sendo K a taxa de crescimento e “a” o coeficiente angular (WHITE, 2000).
4.4.Análise de dados
Os valores de K para cada experimento de crescimento foram comparados
entre si, para determinação da temperatura ótima e concentração de tween20
preferencial de crescimento, através de análise de variância. Esta análise foi realizada
utilizando-se o software Statistica® versão 6.0.
15
5.RESULTADOS
Neste trabalho foram avaliadas quais seriam as melhores condições de
crescimento para as bactérias H. sulfidaeris LAMA 838 e M. excellens LAMA 842,
sendo a temperatura o primeiro parâmetro avaliado. Primeiramente foi realizado o
teste a 5°C, e, posteriormente a 10°C. Tratando-se de temperaturas muito baixas,
esperava-se que ambas as bactérias crescessem mais lentamente, por isso foram
cultivadas por aproximadamente 5 dias, no entanto, nenhuma das linhagens foi capaz
de crescer sob essas condições.
Entre as temperaturas testadas (5°C, 10°C, 15°C, 20°, 25°C e 30°C), H.
sulfidaeris LAMA 838 teve sua ótima taxa de crescimento a 30ºC, diferindo
estatisticamente dos outros valores experimentados, enquanto que M. excellens LAMA
842, teve seu crescimento ótimo na faixa de 20 a 25ºC, sem diferença estatística entre
estas duas temperaturas. Ambas as espécies cresceram somente a partir de 15°C,
portanto essa pode ser classificada como a temperatura mínima para o crescimento
das bactérias utilizadas neste estudo (Figura 1).
O segundo parâmetro testado foi o substrato Tween20, em quatro
concentrações diferentes, a fim de se identificar, entre estas, qual seria a mais
favorável ao crescimento de H. sulfidaeris LAMA 838 e M. excellens LAMA 842. De
acordo com os resultados obtidos, H. sulfidaeris LAMA 838 teve um incremento na sua
taxa de crescimento conforme o aumento das concentrações. Logo, a melhor
concentração de Tween20 para esta espécie é de 1%, e aquela em que o organismo
teve sua menor taxa de crescimento foi a 0,001%, ambas com significância estatística.
M. excellens LAMA 842, no entanto, apresentou um comportamento diferente se
comparada com H. sulfidaeris. Os valores obtidos para M. excellens não diferiram
estatisticamente entre si, ou seja, não houve grandes variações nas taxas de
crescimento entre os valores de concentração testados (Figura 2).
16
Figura 1. Crescimento dos micro-organismos H. sulfidaeris LAMA 838 e M. excellens LAMA 842, em
função da temperatura. O crescimento foi avaliado em caldo marinho suplementado com Tween20 a 1%.
Os valores plotados representam as médias aritiméticas de triplicatas para cada temperatura testada, e as
barras representam o desvio padrão.
Figura 2. Crescimento dos micro-organismos H. sulfidaeris LAMA 838 e M. excellens LAMA 842, em
função da concentração de Tween20. Os micro-organismos foram cultivados por um dia em caldo
marinho, a 30ºC (H. sulfidaeris LAMA 838) e entre 20 e 25ºC (M. excellens LAMA 842). Os valores
plotados representam as médias aritiméticas de triplicatas para cada concentração testada, e as barras
representam o desvio padrão.
17
Os resultados obtidos a partir do cálculo da taxa de crescimento foram
analisados com o auxílio do software Statistica® versão 6.0. Então foi observado que,
no parâmetro temperatura, o crescimento de H. sulfidaeris LAMA 838 apresentou
diferença significativa no experimento de 15 a 25°C e M. excellens LAMA 842 não teve
diferença significativa entre 20-25°C, sendo esta sua faixa ideal. Quanto a
concentração de substrato, por meio da análise estatística verificou-se que os valores
na taxa de crescimento para H. sulfidaeris apresentaram diferença significativa. E para
M. excellens estes valores não diferiram estatisticamente entre si.
18
6.DISCUSSÃO
A partir da taxa de crescimento encontrada em diferentes temperaturas de
cultivo, (Figura 1) para as duas bactérias estudadas neste trabalho, nota-se que elas
apresentaram um comportamento bastante diferente entre si. H. sulfidaeris LAMA 838
teve seu crescimento aumentado, conforme o aumento da temperatura, o que mostra
que o organismo tem uma preferência por ambientes mais quentes. Já M. excellens
LAMA 842 apresentou um crescimento constante até certo ponto, tendo sua taxa de
crescimento diminuída a partir de uma determinada temperatura (30°C ou abaixo de
15ºC), sendo assim, pode-se dizer que esta bactéria cresce melhor em ambientes um
pouco mais frios.
De um modo geral, a temperatura ótima de crescimento para as bactérias do
gênero Halomonas, fica em torno de 20 a 35°C, e para H. sulfidaeris LAMA 838 não foi
diferente. Neste caso, a melhor temperatura encontrada, entre as testadas, foi de
30°C, concordando com os resultados apresentados por Kaye et al., (2004) que
estudaram a mesma espécie, isolada de fontes hidrotermais submarinas, e apresentou
a mesma condição de crescimento encontrada no presente trabalho. É importante
ressaltar que as temperaturas testadas nesta pesquisa vão de 5 a 30°C e por isso, não
é possível afirmar se condicionada a temperaturas mais altas, esta bactéria cresceria
melhor, pois já foram relatadas algumas espécies do gênero Halomonas capazes de
crescer a 40 - 50°C (MATA et al., 2002).
Para o gênero Marinobacter, a faixa ótima de temperatura encontrada em
alguns trabalhos também pode variar bastante. Em espécies como M. segnicrescens,
o crescimento ótimo ocorre entre 30 e 37°C (GUO et al., 2007) e para M.
goseongensis entre 25 e 30°C (ROH, et al., 2008), por exemplo. No caso de M.
excellens LAMA 842, a bactéria apresentou um resultado similar ao descrito na
literatura, tendo seu crescimento ótimo entre 20 e 25°C. Trabalhos como o de
Gorshkova et al. (2003), encontraram o mesmo resultado para M. excellens isolada a
partir de sedimentos presentes no mar do Japão. Apesar dos trabalhos aqui citados
indicarem as temperaturas ótimas encontradas para H. suldaeris e M. excellens, os
mesmos fazem uma avaliação qualitativa dos organismos, tendo como principais
objetivos a identificação e caracterização genética de novas espécies dos gêneros,
diferentemente desde trabalho, cujo objetivo é encontrar as melhores condições de
crescimento para as duas espécies a partir de testes com diferentes valores de
temperatura.
Nenhum dos micro-organismos estudados se multiplicou nas temperaturas
inferiores a 15ºC, ou seja 5 e 10ºC. Isso foi inesperado, uma vez que Kaye et al.
19
(2004) relata que H. sulfidaeris cresce entre -1 e 35ºC, enquanto Gorshkova et al.
(2003) relata que M. excellens cresce entre as temperaturas de 10 e 41ºC. Além de H.
sulfidaeris, no trabalho citado anteriormente, foram estudadas diversas outras
espécies do gênero Halomonas, cada qual apresentando uma faixa diferente de
temperatura para seu crescimento. Como por exemplo H. hydrothermalis, isolada a
partir de fluidos hidrotermais de baixa temperatura no Sul do Oceano Pacífico, cresce
entre 2 e 40°C , ou ainda H. venusta isolada da superfície da água do mar tropical,
crescendo entre 4 e 40°C (Kaye et al.,2004). Para o gênero Marinobacter, já foram
encontradas espécies capazes de crescer entre 10 e 50°C, como a M. alkaliphilus
isolada da área adjacente ao vulcão, South Chamorro Seamount (TAKAI et al., 2005)
como também M. psychrophilus isolada do gelo encontrado no mar, na Bacia do
Canadá, capaz de crescer entre 0 e 22°C (ZHANG et al., 2008).
As diferenças nos padrões de crescimento podem estar relacionadas com o
tempo e com o meio de cultura utilizado no cultivo. Neste trabalho, os experimentos de
5 e 10°C duraram cerca de 5 dias, o que pode ter sido tempo insuficiente para que as
bactérias pudessem crescer. Outro fator importante que pode explicar essa diferença é
a composição do meio de cultura utilizado, pois podem variar muito de um estudo para
outro. Tratando-se de um experimento com baixas temperaturas, é muito importante a
escolha do meio de cultura utilizado, pois o meio pode fornecer componentes
crioprotetores, que a bactéria usa para se adaptar ao frio e, assim, manter suas
atividades. Wang et al., (2006) por exemplo, utilizaram em seu cultivo água do mar
artificial suplementada com triptona, L-tirosina, glucose e glicina, e a composição do
meio de cultura usado neste trabalho consiste basicamente em caldo marinho
suplementado com Tween20, o que pode ter tornando o meio pouco protetor contra as
baixas temperaturas.
Além disso, vários autores relatam variações fisiológicas e genéticas em
linhagens de bactérias marinhas provenientes de diferentes habitats, reconhecendo a
existência de diferentes ecotipos para um mesmo organismo. Um bom exemplo é o
estudo realizado por Rebollar et al. (2012), que a partir da caracterização genética de
três populações distintas de Exiguobacterium, coletadas na bacia Cuatro Cienegas
(México), concluíram que a divergência genética e fisiológica entre os isolados é
moldada pelos fatores ecológicos associados a diferentes nichos, especificamente
água e sedimento. Concluí-se portanto, que os micro-organismos podem se adaptar
ao meio em que vivem e por isso, as diferenças observadas podem estar relacionadas
com o seu habitat de origem.
Na Figura 2, os resultados mostram a resposta dos micro-organismos quanto a
concentração de substrato (Tween20) oferecida. Apesar de H. sulfidaeris crescer
20
relativamente bem em baixas concentrações, ela apresentou sua maior taxa de
crescimento a partir de concentrações maiores de substrato (1%). Kaye et al. (2004),
já destacaram a capacidade de 4 espécies de Halomonas, incluindo H. sulfidaeris, de
crescer sobre os baixos níveis de carbono no ecossistema marinho e ainda oxidar uma
extensa variedade de compostos orgânicos, permitindo-lhes aproveitar de muitas
formas os nutrientes transitoriamente disponíveis.
Para M. excellens, ainda que os resultados obtidos mostrem uma leve
preferência por concentrações menores (0,001 e 0,01%), não ocorreram grandes
variações na taxa de crescimento, sugerido portanto que a bactéria já estava saturada
mesmo nas concentrações de substrato mais baixas (WHITE, 2000). A espécie
Sphingopyxis alaskensis apresentou um comportamento similar, sendo que sua taxa
de crescimento não muda entre o intervalo 0,8 a 800 mg/l de concentração de carbono
(CAVICCHIOLI et al., 2003). Sendo assim, pode-se dizer que M. excellens é um
organismo mais adaptado a ambientes pobres em nutrientes, logo, mais oligotrófico,
que H. sulfidaeris.
21
7.CONCLUSÃO
• As duas espécies de bactéria não conseguem crescer em temperaturas muito
baixas, podendo ser caracterizadas como micro-organismos mesófilos,
apresentando uma temperatura mínima de crescimento de aproximadamente
15°C e temperatura ótima para H. sulfidaeris em torno de 30°C e para M.
excellens de 20 a 25°C.
• Para H. sulfidaeris houve diferença significativa entre os valores de
concentração de substrato testados. A bactéria cresceu melhor na
concentração de 1%.
• M. excellens, não apresentou diferença significativa entre as concentrações de
substrato testadas, crescendo bem tanto em concentrações baixas como altas.
Trata-se, portanto, de um organismo mais oligotrófico que H. sulfidaeris.
22
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25
APÊNDICES
Apêndice1. Níveis de significância da ANOVA para taxa de crescimento em função da
temperatura.
LAM
A 8
38, 1
5°C
LAM
A 8
38, 2
0°C
LAM
A 8
38, 2
5°C
LAM
A 8
38, 3
0°C
LAM
A 8
42, 1
5°C
LAM
A 8
42, 2
0°C
LAM
A 8
42, 2
5°C
LAMA 838, 20°C 0,000179 LAMA 838, 25°C 0,000175 0,011058 LAMA 838, 30°C 0,000175 0,000177 0,012405 LAMA 842, 15°C 0,250562 0,001006 0,000175 0,000175 LAMA 842, 20°C 0,000431 0,552775 0,000421 0,000175 0,036563 LAMA 842, 25°C 0,000235 0,927762 0,001247 0,000175 0,008596 0,993510 LAMA 842, 30°C 0,095252 0,002790 0,000175 0,000175 0,998716 0,106269 0,026335
Apêndice 2. Resultados para a ANOVA, para os experimentos de crescimento em
função da temperatura.
SS Graus de liberdade MS F p Intercepto 1,801816 1 1,801816 992,1004 0,000000 Temperatura 0,745832 7 0,106547 58,6662 0,000000 Erro 0,029059 16 0,001816
Apêndice 3. Níveis de significância da ANOVA para taxa de crescimento em função da
temperatura.
LAM
A 8
38; 0
,001
LAM
A 8
38; 0
,01
LAM
A 8
38; 0
,1
LAM
A 8
38; 1
LAM
A 8
42; 0
,001
LAM
A 8
42; 0
,01
LAM
A 8
42; 0
,1
LAMA 838; 0,01 0,021358 LAMA 838; 0,1 0,000186 0,002586 LAMA 838; 1 0,000185 0,000185 0,000196 LAMA 842; 0,001 0,000185 0,000185 0,000185 0,000185 LAMA 842; 0,01 0,000185 0,000185 0,000185 0,000185 1,000000 LAMA 842; 0,1 0,000185 0,000185 0,000185 0,000185 0,821232 0,815600 LAMA 842; 1 0,000185 0,000185 0,000185 0,000185 0,946660 0,943796 0,999952
26
Apêndice 4. Resultados para a ANOVA, para os experimentos de crescimento em
função da concentração de Tween20.
SS Graus de liberdade MS F p Intercepto 0,986128 1 0,986128 3896,166 0,000000 Tween20 0,579367 7 0,082767 327,009 0,000000 Erro 0,003543 14 0,000253
Apêndice 5. Curvas de calibração elaboradas no presente trabalho
Curva Coeficiente Angular Intercepto R2
Concentração de células, LAMA 838 3*10-11 0,0327 0,9776
Concentração de células, LAMA 842 5*10-11 -0,0439 0,9999