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Universidade do Minho Mestrado Integrado em Engenharia Biológica Laboratórios de Tecnologias Alimentares Teste de Actividade da Catalase em Alimentos Docente: Luís Abrunhosa Data do início da elaboração do trabalho: 26 Outubro 2010 Data do fim do trabalho: 2 Novembro 2010 Data de entrega do relatório: 12 Novembro 2010 Autores: Duarte Filipe da Silva Martins 52497 Paulo Jorge Teixeira Freitas 52516 Sofia Alexandra Araújo Pereira 52530

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Laboratórios de Tecnologias Alimentares

Universidade do Minho

Mestrado Integrado em Engenharia Biológica

Laboratórios de Tecnologias Alimentares

Teste de Actividade da Catalase em

Alimentos

Docente: Luís Abrunhosa

Data do início da elaboração do trabalho: 26 Outubro 2010

Data do fim do trabalho: 2 Novembro 2010

Data de entrega do relatório: 12 Novembro 2010

Autores:

Duarte Filipe da Silva Martins 52497

Paulo Jorge Teixeira Freitas 52516

Sofia Alexandra Araújo Pereira 52530

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Sumário

Este trabalho teve como objectivo principal a extracção de catalase da polpa da batata

vermelha e o estudo do efeito da concentração de catalase, do substrato peróxido de

hidrogénio, da temperatura e do tempo na actividade e estabilidade enzimática. A extracção

desta enzima foi efectuada por trituração do tecido da batata sendo o extracto-mãe obtido,

homogeneizado em tampão Tris-HCl, a uma temperatura de 4ºC durante 30 minutos e

preservado num banho frio de forma a minimizar a desnaturação da enzima em questão.

De forma a determinar os efeitos da concentração de enzima, da concentração de

substrato, da temperatura e do tempo na velocidade de reacção, utilizaram-se discos de papel

de filtro humedecidos em diferentes concentrações extracto-mãe (0%, 20%, 40%, 60%, 80% e

100% v/v) para a primeira situação, e com mesma concentração de extracto-mãe (100%) para

as restantes situações. Estes discos foram colocados no fundo de tubos de ensaio contendo

diferentes concentrações de substrato (0%, 0,2%, 0,5%, 0,8%, 1%, 3%, 6% e 10% v/v) quando

se pretendeu determinar o efeito da concentração de substrato e uma concentração fixa de

substrato de 3% v/v para a determinação dos outros efeitos pretendidos. Assim, a velocidade

de reacção do disco é equivalente à divisão da distância que o disco percorre pelo tempo que

este demora a percorrê-la.

Quanto ao efeito das concentrações de enzima e de substrato na actividade enzimática

da catalase concluiu-se que, com o aumento destas concentrações, a velocidade dos discos

aumenta. Concluiu-se precisamente o oposto para o efeito da temperatura de operação na

actividade da enzima, uma vez que, a sua actividade diminuiu com o aumento da temperatura.

Verificou-se ainda que o tempo que as amostras de extracto-mãe permaneceram a 4 e

20 ºC não teve uma influência significativa na actividade enzimática da catalase, ao contrário

do que aconteceu para a temperatura de 50 ºC, na qual, após um período de tempo definido, a

catalase foi inactivada.

Em relação aos parâmetros cinéticos da catalase obtiveram-se, pela linearização da

equação de Michaelis-Menten, valores de 0,55±0,52cm.s-1 e 3,16±3,83g.mL-1, para vmáx. e Km

respectivamente e, utilizando um ajuste não-linear um valor de vmáx. de 1,79±1,71cm.s-1 e de

Km 18,00±3,79g.mL-1.

Palavras-Chave: Catalase; Batata; Concentração; Temperatura; Tempo; Peróxido de

Hidrogénio; Cinética.

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Índice

1. Introdução ................................................................................................................................. 1

1.1 Enzima e cinética enzimática .............................................................................................. 1

1.2 Catalase: estrutura, propriedades e funções. ..................................................................... 3

1.2.1 Mecanismo Molecular .................................................................................................. 4

1.2.2 Decoberta e História .................................................................................................... 5

2. Materiais e Métodos ................................................................................................................. 6

3. Resultados e Discussão ............................................................................................................. 6

3.1 Factores que afectam a actividade da catalase .................................................................. 6

3.1.1 Efeito da concentração do substrato na actividade enzimática .................................. 6

3.1.2 Efeito da concentração da catalase na actividade enzimática ..................................... 8

3.1.3 Efeito da temperatura na actividade enzimática ......................................................... 9

3.1.4 Efeito do tempo de reacção na actividade enzimática .............................................. 12

3.2 Estudo da cinética enzimática ........................................................................................... 13

3.2.1 Parâmetros cinéticos .................................................................................................. 13

4. Conclusão e Recomendações .................................................................................................. 16

5. Bibliografia .............................................................................................................................. 17

6. Anexos ..................................................................................................................................... 19

6.1 Exemplos de Cálculo .......................................................................................................... 19

6.2 Tabelas de Valores ............................................................................................................ 20

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1. Introdução

Este trabalho teve como objectivo principal a extracção de catalase da polpa

da batata vermelha e o estudo do efeito da concentração de catalase, do substrato

peróxido de hidrogénio, da temperatura e do tempo na actividade e estabilidade

enzimática. A batata foi escolhida como fonte de catalase devido ao facto de ser rica

nesta enzima e ser um material biológico de fácil aquisição.

1.1 Enzima e cinética enzimática

Enzimas são catalisadores biológicos formados por longas cadeias de pequenas

moléculas denominadas aminoácidos. São portanto, um tipo de proteína com

actividade catalítica, sendo encontradas na natureza em todos os seres vivos. A sua

função é viabilizar a actividade das células, quebrando moléculas ou juntando-as para

formar novos compostos. Entende-se por cinética enzimática a análise quantitativa do

efeito de cada um dos factores que influenciam a actividade enzimática avaliada

através do aumento ou redução da velocidade da reacção catalisada (Junior e Pereira,

2001). Como catalisadores, as enzimas têm propriedades características:

Aceleram as reacções químicas sem se consumirem no processo;

Não alteram a posição de equilíbrio das reacções, fazendo apenas com que ele

se atinja de forma mais rápida;

Uma pequena quantidade de enzima catalisa um grande número de reacções,

regenerando-se indefinidamente;

São específicas para cada reacção, ou seja, actuam sobre um substrato

específico.

A cinética enzimática foi estudada pela primeira vez por Leonor Michaelis e

Maud Menten, em 1913, e propuseram um mecanismo para as reacções catalisadas

enzimaticamente. As suas concepções foram baseadas nos factos observáveis quando

um substrato sofre uma transformação sob a acção catalítica de uma enzima.

Consideraram que a conversão de um substrato (S), não é directa mas mediada por um

primeiro passo reversível cujo equilíbrio está apresentado na figura 1.

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Figura 1. Etapas baseadas no mecanismo de Michaelis-Menten, segundo as quais se processa uma reacção enzimática (Cabral et al., 2003).

Esta reacção inicia-se com a ligação do substrato ao centro activo da enzima,

formando o complexo enzima-substrato (ES). No segundo passo, praticamente

irreversível e limitante da velocidade global, ocorre a dissociação deste complexo

intermediário em produto com a libertação da molécula de enzima . Pela análise

dos dois equilíbrios, Michaelis e Menten chegaram aos parâmetros cinéticos que lhes

permitiram caracterizar a reacção e obtenção de um modelo:

velocidade máxima da reacção que traduz a eficiência catalítica da

enzima;

constante de Michaelis-Menten que traduz a afinidade da enzima pelo

substrato;

turnover number que indica o número máximo de moléculas que

a enzima converte em produto por unidade de tempo (Cabral et al., 2003).

O modelo proposto por Michaelis-Menten pode ser caracterizado pela equação 1

cuja representação gráfica se encontra apresentada pela figura 2.

Equação 1. Equação proposta por Michaelis-Menten (Cabral et al., 2003).

Figura 2. Representação gráfica de Michaelis-Menten (Junior e Pereira, 2001).

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Nem sempre é possível encontrar a velocidade máxima de reacção no estudo

da cinética enzimática, pois poderiam ser exigidas concentrações de substrato muito

elavadas, o que dificultava a sua obtenção. Este problema pode ser resolvido através

da inversão da equação de Michaelis-Menten (equação 2) como formulado por

Lineweaver-Burk (Marzzoco e Torres, 1999).

Equação 2. Linearização da equação de Michaelis-Menten segundo Lineweaver-Burk (Marzzoco e Torres, 1999).

1.2 Catalase: estrutura, propriedades e funções.

As reacções enzimáticas são muito importantes em alimentos, podendo ser

tanto benéficas, quanto prejudiciais. As enzimas catalase são exemplos de enzimas de

grande interesse na área alimentar.

A catalase foi uma das primeiras enzimas a serem purificadas até á

homogeneidade e tem sido objecto de intensos estudos. Das enzimas conhecidas, a

catalase está entre as mais eficientes, com taxas na ordem dos 20000 ciclos de reacção

catalíticos por segundo, por subunidade (perto do limite de difusão controlada). A

estrutura de diversas espécies de catalase tem sido estudada por difracção de raios X.

Embora seja claro que todas as catalases compartilham uma estrutura geral,

diferenciando no número e na identidade dos domínios (Boon et al., 2001).

A catalase (EC 1.11.1.6) é uma enzima que pertence à classe das Oxirredutases,

(catalisam reacções de transferência de electrões, ou seja reacções de oxidação-

redução), que usam o peróxido de hidrogénio como aceitador de electrões e também

como dador electrónico (Dourado e Abrunhosa, 2010). A catalase encontra-se

presente nos perixossomas de quase todas as células aeróbias protegendo estas de

efeitos tóxicos do peróxido de hidrogénio, que por catálise, é decomposto em oxigénio

e água, sem a formação de radicais livres (Boon et al., 2001). Uma molécula de

catalase pode converter milhões de moléculas de peróxido de hidrogénio em água e

oxigénio em segundos. A proteína é composta por um tetrâmero com quatro

subunidades idênticas. Cada monómero (cadeia polipeptídica) contém um grupo heme

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no centro catalítico. Este grupo protético consiste num átomo de ferro complexado

com uma profirina (hemoproteina). Os monómeros de catalase de certas espécies (por

exemplo vacas) contêm também uma ligação forte de NADP por subunidade. Este

NADP pode proteger a enzima da oxidação do substrato H2O2 (Boon et al., 2001;

Dourado e Abrunhosa, 2010). O pH óptimo da catalase é aproximadamente 7

(Reference, 2010).

1.2.1 Mecanismo Molecular

A reacção catalisada pela catalase é numa reacção de dismutação, ou seja, o

substrato actua tanto como redutor como oxidante. O mecanismo de acção da catálise

ainda não é totalmente conhecido. No entanto, pensa-se que a reacção de hidrólise do

peróxido ocorra em duas etapas fundamentais, estando estas apresentadas na figura

3.

H2O2 + → H do Fe (III) - E2O + O=Fe (IV) - E (. +)

H2O2 + O=Fe (IV) - E (. +) → H2O + Fe (III) - E + O2

2 H2O2 → 2 H2O2 + O2

Figura 3. Mecanismo de reacção da hidrólise do peróxido de hidrogénio (Dourado e Abrunhosa, 2010).

O Fe()-E representa o ferro do grupo heme ligado á enzima. Fe(IV)-E(.+)é uma

forma mesomérica de Fe(V)-E, o que significa que o ferro não é completamente

oxidado a V, mas recebe algum “apoio electrónico” do ligante heme. Como o peróxido

de hidrogénio entra no sítio activo, este interage com os aminoácidos Asn147

(asparagina na posição 147) e His74, originando um protão (ião hidrogénio) utilizado

na transferência entre os átomos de oxigénio. O átomo de oxigénio livre rearranja-se,

libertando a molécula de água recém-formada e o Fe(IV)=O. Este último reage com

uma segunda molécula de peróxido de hidrogénio para recompor Fe(III)-E produzindo

água e oxigénio. A reactividade do ferro pode ser melhorada pela presença ligante

fenolato de Tyr357 na posição 5 do ferro, que pode ajudar na oxidação do Fe(III) a

Fe(IV). A eficiência da reacção também pode ser melhorada através de interacções de

His74 e Asn147 com intermediários de reacção. Em geral, a taxa de reacção pode ser

determinada pela equação de Michaelis-Menten.

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A catalase também pode oxidar toxinas diferentes, tais como formaldeídos,

ácidos fórmicos, fenóis e álcoois. O mecanismo exacto desta reacção também não é

conhecido. Qualquer ião de metais pesados irá actuar como um inibidor não-

competitivo da catalase (Reference, 2010).

1.2.2 Descoberta e História

A catalase foi primeiramente descoberta como uma substancia em 1811

quando, Louis Jacques Thénard, que descobriu o peróxido de hidrogénio, sugeriu que a

sua decomposição era causada por uma substância. A actividade enzimática da

catalase foi descoberta em 1818 (Aebi e Suter, 1996). Só em 1901, Oscar Loew foi o

primeiro a atribuir-lhe o nome de catalase detectando a sua presença em muitas

plantas e animais, e também sugerido, que a substancia catalase seria uma enzima que

possuía ferro na sua estrutura pois quando reagia com cianeto era inibida (Warburg,

1923). Em 1937 a catalase de fígado bovino foi cristalizada por James B. Sumner e o

seu peso molecular foi estudado em 1938. Em 1969 a sequência de aminoácidos da

catalase bovina foi estudada. Foi em 1981 que a estrutura da proteína foi revelada

(Reference, 2010).

1.2.3 Aplicações humanas

A catalase é usada na indústria alimentar como forma de remoção, por

exemplo, do peróxido de hidrogénio do leite na produção de queijo. Outro uso está

relacionado com a embalagem dos alimentos evitando deste modo a oxidação destes.

Também é usada na indústria têxtil na remoção do peróxido de hidrogénio de tecidos

com o intuito de garantir que o material seja isento de peróxidos. É utilizada na higiene

das lentes de contacto. As lentes são desinfectadas com produtos de limpeza que

contêm uma solução de peróxido de hidrogénio. Uma solução contendo catalase é

depois utilizada na decomposição deste antes que as lentes possam ser novamente

utilizadas. Recentemente, a catalase começou a ser utilizada na indústria estética em

tratamentos de máscara combinada com peróxido de hidrogénio sobre a face, com a

intenção de aumentar a oxigenação celular das camadas superiores da epiderme

(Reference, 2010)

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2. Materiais e Métodos

A actividade experimental foi efectuada de acordo com o protocolo

experimental cedido pelos docentes, utilizando uma batata vermelha (Dourado e

Abrunhosa, 2010). De referir que durante toda a actividade foi utilizada como

referência, uma altura de 7cm e 10 mL de peróxido de hidrogénio, na determinação

dos tempos de emersão dos discos.

3. Resultados e Discussão

3.1 Factores que afectam a actividade da catalase

O objectivo era verificar se as diferentes condições metabólicas (concentração

do substrato, da concentração do extracto enzimático, da temperatura e do tempo de

reacção) em que o extracto de batata se encontrava provocariam alterações na

actividade de catalase. Todos os resultados apresentados nas figuras seguintes são a

média de dois ensaios em duplicado realizados, com os respectivos erros associados.

Note-se ainda que, durante a análise experimental, a actividade enzimática foi

avaliada através da velocidade média dos discos humedecidos em extracto de batata,

durante o seu regresso à superfície nas soluções de peróxido de hidrogénio.

3.1.1 Efeito da concentração do substrato na actividade enzimática

A principal função da catalase nas células é prevenir a acumulação de peróxido

de hidrogénio a níveis tóxicos. Na verdade, sempre que a catalase é adicionada ao

peróxido de hidrogénio, este é imediatamente degradado em água e oxigénio (Brito,

2006). Na figura 4 observa-se o resultado dessa acção catalítica da enzima em soluções

com diferentes concentrações desse substrato: 0%, 0,2%, 0,5%, 0,8%, 1%, 3%, 6% e

10%.

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Figura 4. Efeito da concentração percentual de peróxido de hidrogénio ([H2O2]) na velocidade de emersão dos discos (vdisco).

A representação gráfica apresenta um aspecto crescente no sentido em que a

velocidade de emersão dos discos humedecidos com extracto enzimático aumenta

com o aumento da concentração de substrato na solução, até um máximo de

0,82±0,03cm.s-1 correspondente à catalise de 10% substrato (tabela 4, anexos). Nota-

se ainda que, existe uma inflexão da curva para concentrações acima de 1% de

peróxido de hidrogénio.

O que aconteceu foi que a reacção catalítica terá sido mais lenta em

concentrações de substrato menores e, por isso, foi maior o tempo que os pequenos

discos demoraram a acumular oxigénio suficiente para flutuar, nesses casos. Na

solução onde existia apenas Tris-HCl (correspondente ao ponto 0% em peróxido de

hidrogénio na figura 4), não ocorreu reacção catalítica, precisamente devido à

inexistência de substrato em solução, não sendo por isso libertado oxigénio. Dessa

forma, o disco não flutuou e não foi registado qualquer valor de velocidade.

Os resultados encontram-se em conformidade com o esperado, uma vez que,

com o aumento da concentração de peróxido de hidrogénio, aumentam as hipóteses

as moléculas de substrato “encontrarem” uma molécula de catalase, no mesmo

espaço de tempo. Isto é provocado pelo movimento térmico aleatório de peróxido de

hidrogénio e, admitindo que todas as moléculas de substrato se movem a velocidades

semelhantes (Campos, 2002).

0,0

0,1

0,2

0,3

0,4

0,5

0,6

0,7

0,8

0,9

0 2 4 6 8 10 12

v dis

co(c

m.s

-1)

[H2O2] (% v/v)

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Além disso, sendo a catalase uma molécula tetramérica, constituída por quatro

cadeias polipeptídicas com quatro grupos prostéticos hema com Fe(III) nos locais

activos da enzima que se oxida a Fe(IV) (Kimbrough et al., 1997) então, é esperado que

a velocidade de reacção aumente com a concentração do substrato até ao momento

em que todos os locais activos da enzima se encontram ocupados (Brito, 2006).

Observa-se, por fim, que a concentração de peróxido de hidrogénio não chega

a ser inibitória para a catalase pois nunca se verifica a diminuição da velocidade de

degradação do peróxido.

Na literatura, foi estudado o mesmo factor a influenciar a actividade da

catalase. O autor obteve o extracto enzimático por homogeneização (50g

batata/250mL de tampão fosfato) e determinou a velocidade de reacção em função de

concentrações de peróxido de hidrogénio (0,1%, 0,2%, 0,5%, 0,8%, 1%, 5% e 10%)

semelhantes às utilizadas neste protocolo. Tal como neste trabalho, verificou-se um

aumento da actividade da enzima com o aumento da concentração do substrato

(Brito, 2006).

3.1.2 Efeito da concentração da catalase na actividade enzimática

A partir da concentração de enzima obtida após trituração de 100g de batata

foram realizadas várias diluições do extracto enzimático: 0%, 20%, 40%, 60%, 80% e

100%. Conforme se vê na figura 5, a velocidade da reacção pode também ser afectada

pela concentração de enzima no extracto.

Figura 5. Efeito da concentração do extracto enzimático ([Extracto-Mãe]) na velocidade de emersão dos discos (vdisco).

0,0

0,5

1,0

1,5

2,0

2,5

3,0

3,5

0 20 40 60 80 100 120

v dis

co(c

m.s

-1)

[Extrato-Mãe] (% v/v)

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A curva apresentada na figura 5 permite constatar que a velocidade de reacção

aumenta com o aumento da concentração da enzima, até um valor máximo de

2,80±0,11cm.s-1 (tabela 3, anexos) correspondente à catalise com o extracto obtido

directamente da batata (100%).

O comportamento observado é lógico, visto que, quanto mais enzima estiver

presente nos discos, maior é a quantidade de substrato que pode ser degradado

enzimaticamente pois existem mais locais activos da enzima disponíveis para se

ligarem ao peróxido de hidrogénio e fazer a sua conversão em água e oxigénio (Brito,

2006).

Os maiores teores de enzima permitiram-lhe decompor mais peróxido de

hidrogénio, libertando mais oxigénio sob a forma de gás, e levando a uma flutuação

mais rápida dos discos. Consequentemente, a velocidade de reacção foi maior nesses

casos.

Durante este estudo, foi ainda usado um controlo: disco humedecido em Tris-

HCl sem catalase (correspondente ao ponto 0% em extracto-mãe na figura 5). Como

não havia enzima para degradar o substrato, não se formou oxigénio que fizesse com

que o disco de papel de filtro subisse, não sendo considerado valor de velocidade.

Na literatura, foi observada a mesma relação entre a actividade de catalase da

batata e a sua concentração, na medida em que uma aumenta com o aumento da

outra (Brito, 2006).

3.1.3 Efeito da temperatura na actividade enzimática

Amostras de extracto enzimático foram colocados às diferentes temperaturas a

testar (4ºC, 20ºC, 50ºC, 80ºC) e os resultados estão apresentados na figura 6.

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Figura 6. Efeito da temperatura (T) na velocidade de emersão dos discos (vdisco), em dois tempos diferentes de reacção.

De acordo com a figura 6, pode-se dizer que a velocidade média de emersão

dos discos diminuiu sempre com o aumento da temperatura de reacção, como está

evidente no aspecto decrescente das duas curvas.

Podem-se discutir três fases principais:

* no instante inicial da reacção (curva tracejada a preto), a velocidade dos

discos máxima foi atingida à temperatura de reacção mais baixa testada (4 ºC). Essa

velocidade de reacção mostrou-se ser muito superior relativamente ao ensaio à

temperatura ambiente (20ºC) e relativamente ao ensaio em que se aqueceu o ensaio

extracto enzimático até 50 ºC (tabela 5, anexos).

Foi ainda efectuado um ensaio a 80 ºC mas, depois de humedecer o disco com

catalase a essa temperatura, ele permaneceu imóvel na solução, não sendo detectada

velocidade.

* depois de o extracto enzimático permanecer durante 10 minutos à mesma

temperatura (curva tracejada a cinzento), a velocidade de reacção continuou a

apresentar o valor máximo para a temperatura de reacção igual a 4ºC, e, muito

superior à velocidade observada a 20ºC (tabela 5, anexos).

O disco voltou a não se deslocar na solução a 80ºC mas, ao contrário do ensaio

no instante inicial, o disco deixou de apresentar qualquer movimento de deslocação à

temperatura de 50ºC.

0,0

0,5

1,0

1,5

2,0

2,5

3,0

3,5

0 20 40 60 80

v dis

co(c

m.s

-1)

T (ºC)

tempo zero

após 10 minutos

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* não se observaram diferenças significativas no efeito da temperatura na

actividade da catalase entre o instante inicial da estabilização da temperatura

pretendida e o fim dos 10 minutos a essa temperatura, com a excepção da perda de

acção catalítica depois de o extracto enzimático permanecer 10 minutos a 50ºC.

Na verdade, o que foi observado ficou muito aquém no esperado, uma vez que,

conforme foi observado por Marques (2004), a baixas temperaturas existe uma menor

cinética das moléculas, uma menor probabilidade de ocorrerem colisões devidamente

orientadas e também uma maior rigidez estrutural das unidades enzimáticas, pelo que

a decomposição do peróxido de hidrogénio seria mais lenta. A actividade máxima da

catalase a 4ºC obtida neste estudo, não se assemelha, de todo, ao publicado.

Além disso, deveria ter-se verificado que o aumento da temperatura

aumentaria a velocidade de reacção porque a energia livre das moléculas também

aumentaria, isto é, as moléculas (de enzima e de substrato) mover-se-iam mais

rapidamente e a probabilidade de se encontrarem aumentaria também (Brito, 2006).

Neste estudo, a constante diminuição da velocidade de reacção (vdisco) com a

temperatura é inesperada. De acordo com NZIFST (2010), a temperatura óptima de

acção da catalase da batata é 30ºC, a partir da qual a enzima começa a perder

actividade. Por isso, para temperaturas inferiores à temperatura óptima, a reacção

deveria ocorrer mais lentamente (menor temperatura implica um menor movimento

das moléculas e uma maior dificuldade para que a reacção ocorra).

Encontra-se ainda publicado na literatura, que a temperatura da completa

inactivação/desnaturação da catalase da batata é de 55ºC (NZIFST, 2010) pelo que é

confirmado o facto de a velocidade dos discos ser mais reduzida para a temperatura

de 50ºC em relação à temperatura de 20 ºC e de não haver qualquer resultado nos

testes para a temperatura de 80ºC. O que acontece é que o aumento da temperatura

acima do valor da temperatura de desnaturação afecta consideravelmente a estrutura

terciária da enzima, bem como a estabilidade do complexo enzima-substrato (Taipa et

al., 2003).

Note-se que apesar da temperatura de inactivação total da catalase ser, como

foi dito acima, de 55ºC, pode ter havido desnaturação desta ao longo dos 10 minutos à

temperatura de 50ºC ou até mesmo ter havido um descuido do operador permitindo

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que a temperatura atingisse os 55ºC levando assim à desnaturação/inactivação da

enzima e, consequentemente, à ausência de movimento do disco quando colocado

numa solução de peróxido de hidrogénio.

De referir que para as temperaturas de 50 e 80ºC as amostras adquiriram uma

textura gelatinosa sendo este aspecto intensificado quando se mantiverem as

amostras expostas a estas temperaturas ao longo de 10 minutos. O aparecimento

desta textura pode ser um factor que confirme a existência de desnaturação das

proteínas presentes nas amostras.

3.1.4 Efeito do tempo de reacção na actividade enzimática

O extracto enzimático foi colocado a diferentes temperaturas durante 10

minutos para se avaliar o efeito que o tempo teria na velocidade de reacção. Foi

medida a actividade da catalase no instante inicial e ao fim de 10 minutos em repouso.

Os resultados estão apresentados na figura 7.

Figura 7. Efeito do tempo de reacção (t) na velocidade de emersão dos discos (vdisco), em duas temperaturas diferentes de reacção.

Na representação gráfica apresentada na figura 7, está evidente que 10

minutos de reacção pouco afectam a actividade da catalase na catálise do peróxido de

hidrogénio, tanto a 4 como a 20ºC. No entanto, se se tivesse considerado um maior

período de tempo, verificar-se-ia uma redução dessa actividade.

Como já foi referido, no início da reacção as moléculas de enzima têm os seus

locais activos livres pelo que a reacção com o substrato é muito rápida e directamente

0,00

0,50

1,00

1,50

2,00

2,50

3,00

3,50

0 2 4 6 8 10

v dis

co(c

m.s

-1)

t (min)

4 ºC

20 ºC

Page 16: T2 Grupo 3

Mestrado Integrado em Engenharia Biológica 13

Laboratórios de Tecnologias Alimentares

proporcional à quantidade de enzima disponível (reacção de 1º ordem). Contudo,

conforme a enzima começa a estar com os seus centros activos ocupados pelo

substrato a velocidade de reacção começa a diminuir o que corresponde a uma

situação de saturação da enzima, e onde a velocidade de degradação de H2O2 por

unidade de tempo diminui e se torna constante – reacção de ordem zero (Brito, 2006).

Na literatura, Brito (2006) considerou 10 minutos de reacção. Em concordância

com a teoria mas contrariamente ao que foi obtido neste trabalho, ele verificou que,

para uma determinada quantidade de enzima e de substrato, a velocidade de emersão

dos discos aumentava com o aumento do tempo. Contudo esse aumento não foi

linear! A velocidade de reacção aumentou durante os primeiros minutos vindo a

decrescer a partir daí.

3.2 Estudo da cinética enzimática

Tirando partido de uma metodologia mais elaborada pretendeu-se chegar a

dados que experimentalmente comprovassem o que vem descrito classicamente nos

livros. Nomeadamente, pretendeu-se fazer um estudo da cinética enzimática com

determinação de parâmetros como o vmáx e o Km.

3.2.1 Parâmetros cinéticos

Através dos valores experimentais obtidos da velocidade de emersão dos discos

para diversas concentrações de peróxido de hidrogénio (figura 4), efectuou-se a

transformação da equação de Michaelis-Menten (equação 1) para uma forma linear

(recta do tipo y= ax+b), permitindo a determinação matamética dos parâmetros Km e

vmáx característicos da catalase. Esta inversão directa dos termos da equação de

Michaelis-Menten traduz a equação de Lineweaver-Burk (equação 2), cuja

representação gráfica está apresentada na figura 8.

Page 17: T2 Grupo 3

Mestrado Integrado em Engenharia Biológica 14

Laboratórios de Tecnologias Alimentares

Figura 8. Linearização de Lineweaver-Burk relativa à actividade da catalase

A recta apresentada na figura 8 tem uma ordenada na origem igual a 1/vmáx e

um declive Km/vmáx. Esta representação permite uma boa estimativa de vmáx mas não

de Km; tem, ainda, a desvantagem de comprimir os pontos experimentais

correspondentes a concentrações elevadas de substrato numa pequena parte do

gráfico e dar ênfase aos pontos relativos a concentrações mais baixas (Taipa et al.,

2003).

Para ultrapassar as limitações provocadas pela linearização de Lineweaver-Burk

(compressão dos pontos referentes às concentrações mais elevadas de substrato)

recorreu-se a um ajuste não linear do modelo de Michaelis-Menten através do método

dos mínimos quadrados (figura 9), de forma a conseguir-se calcular valores de Km e

vMáx, semelhantes aos valores dos verdadeiros parâmetros cinéticos característicos da

catalase.

y = 5,7151x + 1,8079R² = 0,9406

0

5

10

15

20

25

0 0,5 1 1,5 2 2,5 3 3,5 4

1/v

0(s

.cm

-1)

1/[H2O2] (mL.g-1)

Page 18: T2 Grupo 3

Mestrado Integrado em Engenharia Biológica 15

Laboratórios de Tecnologias Alimentares

Figura 9. Curva experimental (linha preta tracejada) das velocidades de reacção (vdisco) em função da concentração de substrato ([H2O2]) e ajuste não linear (linha cinzenta contínua) do

modelo de Michaelis-Menten pelo método dos mínimos quadrados.

O modelo de Michaelis-Menten mostrou-se eficiente para descrever o

comportamento cinético da catalase, visto que as curvas prática e teórica das figura 9

se encontram praticamente sobrepostas.

Os resultados da determinação dos parâmetros cinéticos através dos dois

métodos matemáticos encontram-se apresentados na tabela 1.

Tabela 1. Parâmetros cinéticos (vmáx e Km) da catalase obtidos pelo ajuste linear (Lineweaver-burk) e pelo ajuste não linear (mínimos quadrados) do método de Michaelis-Menten.

vmáx Km

(cm.s-1) ([H2O2] % v/v)

Ajuste linear Michaelis-Menten

Lineweaver-burk 0,55 ± 0,52 3,16 ± 3,83

Ajuste não linear Michaelis-Menten

Mínimos Quadrados 1,79 ± 1,71 18,00 ± 3,79

Por razões já mencionadas, os valores obtidos pelo ajuste dos mínimos

quadrados suportam menos erros associados e, por isso, tornam-se mais semelhantes

com a realidade. A partir dos resultados obtidos através dos dois modelos, pode

discutir-se que:

* o valor da velocidade máxima (vmáx) da reacção é inferior quando obtido pelo

ajuste linear de Lineweaver-burk. Curiosamente, ao visualizar a curva experimental da

0,00

0,10

0,20

0,30

0,40

0,50

0,60

0,70

0,80

0,90

0,0 5,0 10,0 15,0 20,0

v dis

co(c

m.s

-1)

[H2O2] (g.mL-1)

Experimental

Michaelis-Menten

Page 19: T2 Grupo 3

Mestrado Integrado em Engenharia Biológica 16

Laboratórios de Tecnologias Alimentares

velocidade de emersão dos discos consoante a concentração de substrato

representada na figura 9, tem-se a percepção de que a velocidade máxima não

ultrapassa 0,9cm.s-1 mas, o valor obtido pelo ajuste não linear para vmáx é muito

superior e igual a 1,79 ± 1,71cm.s-1. Isto porque, a velocidade máxima desta reacção

traduz a eficiência catalítica da enzima catalase para o peróxido de hidrogénio, e

então, diz-se que este parâmetro cinético é uma característica própria da enzima para

aquele determinado substrato (Cabral et al., 2003). Independentemente de nesta

actividade experimental não se ter observado a velocidade máxima de reacção, ela

existe e é única. Se fossem considerados maiores concentrações de substrato, ter-se-ia

verificado esse valor de velocidade máxima com que a catalase degrada o peróxido de

hidrogénio.

* o valor da constante de Michaelis (Km) é igualmente superior quando obtido

pelo ajuste não linear. Este parâmetro relaciona-se com a constante de dissociação do

complexo intermediário ES e, quanto mais elevado é o seu valor, menor é a afinidade

enzima-substrato. Sabendo ainda que Km traduz o valor da concentração de substrato

necessário para que a catalase atinja metade da sua velocidade máxima de reacção, é

lógico aceitar que Km,MínimosQuadrados > Km,Lineweaver-burk porque vmáx,MínimosQuadrados >

vmáx,Lineweaver-burk.

4. Conclusão e Recomendações

Finalizada a actividade experimental, e a análise e discussão dos resultados

obtidos, conclui-se que a actividade da enzima aumenta com o aumento das

concentrações de substrato e enzima.

Conclui-se também que com o aumento da temperatura de operação, a actividade da

enzima diminui atingindo uma temperatura à qual esta desnatura não se verificando

qualquer actividade enzimática.

Para temperaturas reduzidas, o tempo não tem uma influência significativa na

actividade enzimática da catalase, ao contrário do que acontece para temperaturas

mais elevadas, que leva à perda da actividade da enzima.

Page 20: T2 Grupo 3

Mestrado Integrado em Engenharia Biológica 17

Laboratórios de Tecnologias Alimentares

Os parâmetros cinéticos da catalase obtiveram-se pela linearização da equação

de Michaelis-Menten e pelo ajuste não-linear dos Mínimos Quadrados. Conclui-se que

o melhor método para obter a velocidade máxima da reacção foi o segundo.

Com vista à obtenção de resultados mais satisfatórios poder-se-ia proceder à

alteração de alguns aspectos protocolares nomeadamente no aumento da gama de

temperaturas utilizadas de modo a estudar o efeito da temperatura em intervalos mais

reduzidos; no aumento do tempo após a estabilização da temperatura pretendida

como forma de avaliar o seu efeito num período de tempo mais alargado; e no

aumento da concentração de peróxido de hidrogénio para permitir um estudo mais

correcto da cinética da reacção enzimática.

5. Bibliografia

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Page 22: T2 Grupo 3

Mestrado Integrado em Engenharia Biológica 19

Laboratórios de Tecnologias Alimentares

6. Anexos

6.1 Exemplos de Cálculo

Cálculo da Velocidade de Subida do Disco

Cálculo de vmáx. e Km – Ajuste não linear pelos Mínimos Quadrados

Para o cálculo das constantes cinéticas recorreu-se à ferramenta solver, do

programa Microsoft Excel 2007, fazendo-se um ajuste não linear com a utilização do

método dos mínimos quadrados.

O valor a ser minimizado neste método foi o resultado de

por alteração dos valores e .

em que, foi a velocidade obtida durante o

procedimento experimental e, é a velocidade dos discos estimada pela

equação de Michael-Menten (equação 1).

Note-se que os valores de foram expressos nas unidades ,

sendo para isso necessário multiplicar a percentagens de substrato

pela respectiva massa específica .

Cálculo de vmáx. e Km – Ajuste linear Lineweaver-burk

Para o cálculo destes parâmetros foi também necessária a multiplicação da

concentração de H2O2 pela sua massa específica, ρ, obtendo-se a concentração de

substrato em g.mL-1. Traçando um gráfico com os valores de 1/[H2O2] e 1/v0

representados na tabela 6, obtém-se uma recta que representa a equação 2, e está

apresentada na equação 3.

Equação 3. Equação da recta obtida pela representação dos valores de 1/v0 em função de 1/[H2O2].

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Mestrado Integrado em Engenharia Biológica 20

Laboratórios de Tecnologias Alimentares

6.2 Tabelas de Valores

Tabela 2. Valor da massa de batata utilizada na preparação do extracto-mãe rico em catalase e valor da distância percorrida pelos discos no interior dos tubos de ensaio.

mbatata (g) 100,13

dpercorrida pelos discos (cm) 7

Tabela 3. Valores dos tempos que os discos demoraram a percorrer a distância de 7 cm, para uma amostragem dupla, em função da concentração de extracto-mãe de catalase e

respectivos valores médios de tempo, valores de desvios-padrão e valores da velocidade dos discos no interior dos tubos de ensaio calculados através desses mesmos valores médios de tempo e valor de distância, sendo que para as concentrações de extracto-mãe nas quais os

discos não percorreram qualquer distância se representa por “-“.

tpara percorrer d (s)

[Extrato-Mãe]

(% v/v) Amostra 1 Amostra 2

tmédio,para

percorrer d (s)

Desvio Padrão do

Tempo (s)

Vo

(cm.s-1)

0 - - - - -

20 75 78 76,5 2,12 0,09

40 13 12 12,5 0,71 0,56

60 8 10 9 1,41 0,78

80 3 5 4 1,41 1,75

100 2 3 2,5 0,71 2,80

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Mestrado Integrado em Engenharia Biológica 21

Laboratórios de Tecnologias Alimentares

Tabela 4. Valores dos tempos que os discos demoraram a percorrer a distância de 7 cm, para uma amostragem dupla, em função da concentração de substrato H2O2 e respectivos valores médios de tempo, valores de desvios-padrão e valores da velocidade dos discos no interior dos tubos de ensaio calculados através desses mesmos valores médios de tempo e valor de

distância sendo que para as concentrações de H2O2 nas quais os discos não percorreram qualquer distância se representa por “-“.

tpara percorrer d (s)

[H2O2] (% v/v) Amostra 1 Amostra 2

tmédio,para

percorrer d (s)

Desvio Padrão do

Tempo (s)

Vo

(cm.s-1)

0 - - - - -

0,2 94 180 137 60,81 0,05

0,5 95 73 84 15,56 0,08

0,8 40 64 52 16,97 0,13

1 65 44 55 14,85 0,13

3 19 20 20 0,71 0,36

6 12 12 12 0,00 0,58

10 10 7 9 2,12 0,82

Tabela 5. Valores dos tempos que os discos demoraram a percorrer a distância de 7 cm, para uma amostragem dupla, em função da temperatura para o instante inicial no qual as amostras

atingiram a temperatura desejada e para 10 minutos após esse tempo, mantendo as temperaturas constantes, e respectivos valores médios de tempo, valores de desvios-padrão e

valores da velocidade dos discos no interior dos tubos de ensaio calculados através desses mesmos valores médios de tempo e valor de distância, sendo que para as temperaturas nas

quais os discos não percorreram qualquer distância se representa por “-“.

tpara percorrer d (s)

Temperatura

(ºC) Amostra 1 Amostra 2

tmédio,para

percorrer d (s)

Desvio

Padrão do

Tempo (s)

Amostra 1

Instante

Inicial

(extracto mãe)

4 3 2 3 0,71 2,80

20 13 10 12 2,12 0,61

50 28 25 27 2,12 0,26

80 - - - - -

Após 10

minutos

(extracto mãe)

4 3 2 2,50 0,71 2,80

20 14 13 13,50 0,71 0,52

50 - - - - -

80 - - - - -

Page 25: T2 Grupo 3

Mestrado Integrado em Engenharia Biológica 22

Laboratórios de Tecnologias Alimentares

Tabela 6. Valores das concentrações de [H2O2] (em v/v e em g.mL-1), do inverso das concentrações de [H2O2] (em mL.g-1), da velocidade (em cm.s-1), do inverso dos valores de

velocidade (em s.cm-1) e da massa específica da catalase a 25 ºC (em g.mL-1).

ρ (a 20 ºC)

(g/mL)

[H2O2]

(% v/v)

[H2O2]

(g.mL-1)

1/[H2O2]

(mL.g-1)

Vo

(cm.s-1)

1/ Vo

(s.cm-1)

1,48

0 0 0 0 0

0,2 0,296 3,38 0,05 19,57

0,5 0,74 1,35 0,08 12,00

0,8 1,184 0,84 0,13 7,43

1 1,48 0,68 0,13 7,79

3 4,44 0,23 0,36 2,79

6 8,88 0,11 0,58 1,71

10 14,8 0,07 0,82 1,21