sobre o desenvolvimento tumoral - SBBq KAMILLA... · 2018-03-27 · Assim, com os valores de IC 50...
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UNIVERSIDADE FEDERAL DE SÃO JOÃO DEL REI – UFSJ
CAMPUS CENTRO OESTE DONA LINDU – CCO
PROGRAMA MULTICÊNTRICO DE PÓS GRADUAÇÃO EM BIOQUÍMICA E
BIOLOGIA MOLECULAR
KAMILLA MONTEIRO DOS SANTOS
Estudos in vitro e in vivo da atividade de extratos de Bauhinia
sobre o desenvolvimento tumoral
Divinópolis 2017
UNIVERSIDADE FEDERAL DE SÃO JOÃO DEL REI – UFSJ
CAMPUS CENTRO OESTE DONA LINDU – CCO
PROGRAMA MULTICÊNTRICO DE PÓS GRADUAÇÃO EM BIOQUÍMICA E
BIOLOGIA MOLECULAR
KAMILLA MONTEIRO DOS SANTOS
Estudos in vitro e in vivo da atividade de extratos de Bauhinia
sobre o desenvolvimento tumoral
Tese apresentada ao Programa Multicêntrico de Pós-Graduação em Bioquímica e Biologia Molecular da Universidade Federal de São João Del Rei, como requisito parcial para a obtenção do grau de Doutor. Orientadora: Profa. Dra. Rosy Iara Maciel Azambuja Ribeiro. Co-orientadora: Profa. Dra. Maria Luiza Vilela Oliva.
Divinópolis 2017
FOLHA DE APROVAÇÃO
AGRADECIMENTOS
Este trabalho é resultado de contribuições de inúmeras pessoas que
colaboraram direta ou indiretamente de forma fundamental para a sua construção.
Consciente de que é impossível listar todos que acrescentaram conhecimentos e
experiências essenciais, que tornaram possível a execução deste trabalho e que ao
decorrer dos anos engradeceram minha profissão e maneira de ver o mundo, preciso
expressar meu agradecimento à:
Minha orientadora Profa. Dra. Rosy Iara Maciel de Azambuja Ribeiro, por
depositar sua confiança em mim e me proporcionar oportunidades e aprendizados que
realmente mudaram a minha vida. À minha co-orientadora Profa. Dra. Maria Luiza
Vilela Oliva, pelas contribuições intelectuais e práticas, me recebendo em seu
laboratório para a execução de parte do trabalho. Aos componentes das bancas de
qualificação Profa. Dra. Hérica de Lima Santos, Prof. Dr. Hélio Batista Santos, e Prof.
Dr. Renato J. S. Oliveira e aos componentes da banca de defesa da tese Prof. Dr.
Geovanni Dantas Cassali, Profa. Dra. Maria Lucia Zaidan Dagli, Profa. Dra. Miriam
Teresa Paz Lopes e Prof. Dr. Rui Manuel Vieira Reis pelas tão valiosas sugestões.
Aos meus colegas do Laboratório de Patologia Experimental (Lapatex), pela
convivência diária e amizade construída ao longo dos anos. Muitos já não trabalham
mais lá, terminaram suas dissertações e TCCs, outros, permaneceram na “Família
Lapatex” e foi maravilhoso podermos crescer juntos. Por me auxiliarem com suas
experiências e contribuírem com o meu crescimento pessoal, e pela amizade, quero
expressar meu agradecimento à Damiana Nunes, Gabriela Francine, Izabela Faria,
Natália Ribeiro, Flavia Medeiros, Aline Coelho, Gabriela Alves, Tamara Longatti,
Carolina Correa, Leonardo Matos, Karini Avelar, Natane Carvalho, Stephanie Corsino,
Alessandra Sousa, Caio Baeta, Thais Barbosa, Bruna Pimenta, Lohanna França,
Lucas Azevedo, Patrik Vital, Ana Gabriela, Mylane Matos, Gilvânia Rabelo, Lorena
Raspanti, Maria Juliana Passos, Edilene Santos Elias Raad, Luís Ribeiro e José
Antônio. Também agradeço ao Programa Multicêntrico de Pós Graduação em
Bioquímica e Biologia Molecular, por me proporcionar a conclusão de um sonho, me
sinto honrada em compor a primeira turma de Doutores deste programa.
Um trabalho com tantas técnicas executadas somente foi possível graças às
instituições parcerias que eu gostaria de agradecer: ao laboratório de Petroleômica e
Forense da Universidade Federal do Espírito Santo, no qual foi realizado a
espectrometria de massas, coordenado pelo Prof. Dr. Wanderson Romão, e suas
alunas Fernanda Endringer e Heloá Santos, por me acolher e ensinar a interpretação
dos gráficos. Ao Laboratório de Oncologia Molecular do Hospital do Câncer de
Barretos, coordenado pelo Prof. Dr. Rui Reis e ao Biologista responsável pela cultura
de células Prof. Dr. Renato J. S Oliveira, por realizar os experimentos com as células
de mama humanas e pelos testes de Western Blot, além das inúmeras dicas e
sugestões de ambos. À Universidade Federal de São Paulo, em especial à minha Co-
orientadora Profa. Dra. Maria Luiza Vilela Oliva e seus alunos Fabricio Pereira Batista
e Nathalia Neto por me receberem em seu laboratório para a realização de parte dos
testes e pela amizade construída em tão poucos dias. Também quero agradecer aos
professores da Universidade Federal de São João del Rei, que de alguma forma me
auxiliaram nessa caminhada, sendo em parceria com uso de equipamentos ou
compartilhamento de experiências: Prof. Dr. Rafael Chagas, Prof. Dr. Hélio Batista,
Prof. Dr. Ralph Thomé e Profa. Dra. Danyelle Rios. Além destes gostaria de agradecer
aos técnicos de laboratório e funcionários da Pós-graduação que sempre me
auxiliaram quando necessário.
Por fim, quero deixar o meu agradecimento especial aos meus familiares que
foram o meu apoio emocional durante essa caminhada, entenderam as minhas
ausências, inclusive nos fins de semana, e sempre estiveram ao meu lado me
incentivando a seguir em frente. Eles são os meus alicerces e minhas inspirações,
deixo o meu agradecimento, amor incondicional e dedico esse trabalho à: Alisson de
Sousa Dias, Keila Monteiro Barbosa, Daniella Barbosa Monteiro dos Santos, Antônio
Anacleto dos Santos Neto, Antônio Marcio dos Santos e Venuza Monteiro Barbosa.
Obrigada Deus, por mais essa conquista e por guiar a minha vida sempre!
RESUMO Entre os tipos de câncer existentes, o câncer de mama tem se destacado por ser o mais comum entre as mulheres e o segundo tipo mais prevalente em toda a população. A principal causa de morte de pacientes com câncer de mama é devido a metástase, que para ocorrer, necessita da remodelação do microambiente tumoral. Assim, é evidente a importância da busca por novas fontes de terapias antitumorais e antimetastáticas, que muitas vezes têm sido encontradas no reino vegetal. O gênero Bauhinia é amplamente utilizado na medicina tradicional como antidiabético e agente antioxidante. Neste trabalho, foram avaliadas as atividades antitumoral e antimetastática das frações ID7, IA19, IID10 e IIIA32, produzidas a partir dos caules de três espécies de Bauhinia sobre a linhagem de câncer de mama murino 4T1. Estas frações apresentaram 100% de inibição de metaloproteinases de matriz (MMP-2 e MMP-9) em estudo prévio. A viabilidade celular foi avaliada utilizando MTT, vermelho neutro e azul de tripano, em 24, 48 e 72 horas de tratamento, nas concentrações de 5, 10, 25, 50, 75 e 100 µg/mL sobre 4T1 e carcinoma cervical humano (HeLa). Em seguida foram determinadas as seletividades das frações pelas linhagens tumorais. Assim, com os valores de IC50 e tempos de tratamento obtidos pelo ensaio de MTT, foram realizados os testes de migração celular por fechamento de ferida e Boyden chamber, invasão celular usando Matrigel e adesão celular. Também foram quantificadas as células em apoptose por fluorescência. As gelatinases e o óxido nítrico presentes no sobrenadante das células 4T1 foram quantificados por zimograma e por quimioluminescência, respectivamente. A fração mais seletiva foi escolhida para avaliar os demais ensaios, como a expressão das proteínas de via de morte celular PARP, caspase-7 e caspase-8 por western blot. Também foi avaliada a atividade da fração mais seletiva sobre linhagens tumorais de câncer de mama humano BT-20, MDA-MB-231 e MCF-7 por MTS. Também foi avaliada a ação desta fração sobre camundongos inoculados com 4T1. Foram realizadas análises histológicas dos tumores primários, fígados e pulmões extraídos dos animais. A fração mais seletiva foi caracterizada por espectrometria de massa (MS-ESI-). As frações estudadas diminuíram a viabilidade das linhagens 4T1 (IC50 ID7: 23,47; IA19 33,7; IID10 11,19; IIIA32 82,31) e HeLa (IC50 ID7 23,02; IA19 55,59 e IID10 31,85) pelo método usando MTT (72h). ID7 foi a mais seletiva (IS 2,27 e 1,84 quando avaliada sobre esplenócitos murinos e leucócitos mononucleares humanos). Além disso, todas as frações testadas diminuíram a viabilidade de membrana das células 4T1 pelo método usando azul de tripano (IC50<5; 72h). Todas as frações utilizadas aumentaram apoptose tardia (>30%, p=0,0324), diminuíram a porcentagem de células viáveis (>50% p=0,0002) e inibiram a migração das células 4T1 pelo ensaio de fechamento de ferida (>60%, p=0,0001). Todas as frações também aumentaram a adesão das células 4T1 aos componentes da membrana basal (>60%, p=0,0001), além de diminuir a presença de gelatinases ativas secretadas (>75% p<0,005). As frações IID10 e IA19 inibiram a migração pelo ensaio Boyder chamber, (65% e 76%, p=0,0027) e ID7, IID10 e IIIA32 diminuíram a invasão celular (55%, 50%, 52%, p=0,001). O tratamento com ID7 aumentou a expressão de PARP (100%, p=0,001), caspase-7 (300%, p=0,001) e caspase-8 (100%, p=0,001) e se mostrou seletivo para a linhagem de câncer de mama triplo negativo (CMTN) MDA-MB-231 (IC50 10,2 µg/mL). No ensaio in vivo com camundongos inoculados com 4T1, ID7 diminuiu o volume (20%, p=0,0204) e peso (35%, p=0,0354) dos tumores coletados e diminuiu a metástase pulmonar (40%, p=0,0239). Além disso ID7 aumentou a área de necrose (32%, p= 0,0031) dos tumores
e diminuiu a inflamação no fígado (60%, p=0,001). A caracterização por MS-ESI- evidenciou principalmente ácidos graxos, um flavonoide e um diterpeno na constituição de ID7. Assim, constatou-se que as frações de Bauhinia testadas, em especial a fração ID7, apresentam atividade antitumoral seletiva e sobre vários mecanismos da metástase do câncer de mama in vitro. Sugere-se que as classes de ácidos graxos, flavonoides e diterpernos estejam correlacionados com tais atividades. Palavras-chave: câncer de mama triplo negativo, plantas medicinais, metástase,
viabilidade celular, 4T1.
ABSTRACT Among the existent cancer types, breast cancer has been highlighted as being more
common among women and the second most prevalent type in the entire population.
The main cause of death of cancer patients is due to metastasis, which requires the
remodeling of the tumor microenvironment. Thus, the importance of the search for new
sources of antitumor and antimetastatic therapies, which have often been found in the
plant kingdom, is evident. The genus Bauhinia is widely used in traditional medicine as
antidiabetic and antioxidant agent. In this work the antitumor and antimetastatic
activities of ID7, IID10, IA19 e IIIA32 fractions of the stems of three species of Bauhinia
on the murine breast cancer line 4T1. These fractions showed 100% inhibition of matrix
metalloproteinases (MMP-2 and MMP-9) in a previous study. Cell viability was
assessed by the MTT assays, neutral red and trypan blue at 24, 48 and 72 hours of
treatment at 5, 10, 25, 50, 75 e 100 µg/mL concentrations, on 4T1 and human cervical
carcinoma. Then, the selectivity of the fractions by the tumor lines was determined.
Thus, with the IC50 values and treatment time obtained by this assay, cell migration
tests by wound closure and Boyden chamber, invasion using Matrigel and cell
adhesion were performed. Also, they were quantified the apoptotic cell by fluorescence
assay. Gelatinases and nitric oxide present in the supernatant of 4T1 cells were also
quantified. The most selective fraction was chosen to evaluate the other assays, such
as the expression of PARP, caspase-7 and caspase-8 cell death pathway proteins by
western blot. It was also evaluated the activity of the most selective fraction on BT-20,
MDA-MB-231 and MCF-7 human breast cancer tumor lines, by MTS, and on mice
inoculated with 4T1. Histological analyzes of the tumors, livers and lungs extracted
from the animals were performed. The most selective fraction was characterized by
MS-ESI- spectrometry. The fractions studied reduced the 4T1 viability (IC50 ID7: 23,47;
IA19 33,7; IID10 11,19; IIIA32 82,31) and HeLa (IC50 ID7 23,02; IA19 55,59 and IID10
31,85), by MTT assay. The fractions increased late apoptosis (>30%, p=0,0324),
decreased the percentage of viable cells (>50% p=0,0002) and inhibited the 4T1
migration by the wound closure assay (>60%, p=0,0001). All fractions increased the
4T1 adhesion to basement membrane components (>60%, p=0,0001), in addition to
decreasing the presence of secreted active gelatinases (>75%, p= 0,005). IID10 and
IA19 fractions inhibited migration by the Boyder Chamber assay (65% e 76%,
p=0,0027), and ID7, IID10 and IIIA32 decreased invasion cell (55%, 50%, 52%,
p=0,0001). Treatment with ID7 increased the expression of PARP (100%, p=0,001),
caspase-7 (300%, p=0,001) and caspase-8 (100%, p=0,001) and was selective for the
MDA-MB-231, triple negative breast cancer lineage (IC50 10,2 µg/mL). In the in vivo
assay with mice inoculated with 4T1, ID7 decreased the volume (20%, p=0,0204) and
weight (35%, p=0,0354) of the tumors after withdrawn and decreased lung metastasis
(40%, p=0,0239). In addition, ID7 increased the necrosis area of tumors (32%, p=
0,0031) and decreased the inflammation in the liver (60%, p=0,001). The
characterization showed mainly fatty acids, flavonoid and diterpene in the ID7
constitution. Thus, it was found that the Bauhinia fractions tested, especially the ID7
fraction, exhibit selective antitumor on various mechanisms of breast cancer
metastasis activity. It is suggested that fatty acids, flavonoids and diterpenes are
correlated with such activities.
Keywords: triple negative breast cancer, medicinal plants, metastasis, cell viability,
4T1.
SUMÁRIO
1. INTRODUÇÃO.......................................................................................................16
1.1 CÂNCER….......................................................................................................16
1.2 METÁSTASE...................................................................................................19
1.3. CANCER DE MAMA........................................................................................22
1.4 CLASSIFICAÇAO DOS TUMORES DE MAMA X TERAPIA DEPENDENTE..23
1.5 PRINCIPAIS TRATAMENTOS DO CÂNCER ..................................................24
1.6 PESQUISAS ENVOLVENDO O CÂNCER: O USO DE LINHAGENS
CELULARES....................................................................................................26
1.7 O USO DE PLANTAS MEDICINAIS NO TRATAMENTO DO CÂNCER...........27
1.8 O GÊNERO BAUHINIA....................................................................................29
2 OBJETIVOS............................................................................................................33
2.1 OBJETIVOS ESPECÍFICOS...........................................................................33
3 MATERIAIS E MÉTODOS......................................................................................34
3.1 DESENHO EXPERIMENTAL...........................................................................34
3.2 AMOSTRAS.....................................................................................................34
3.3 OBTENÇÃO DE EXTRATOS BRUTOS E PARTIÇÕES..................................35
3.4 CROMATOGRAFIA EM CAMADA DELGADA................................................36
3.5 CROMATOGRAFIA EM COLUNA POR GRAVIDADE....................................36
3.6 CÉLULAS TUMORAIS E CONDIÇÕES DE CULTURA..................................37
3.7 OBTENÇÃO DE LEUCÓCITOS MONONUCLEARES HUMANOS.................38
3.8 OBTENÇÃO DE ESPLENÓCITOS MURINOS................................................39
3.9 AVALIAÇÃO DA VIABILIDADE CELULAR....................................................39
3.9.1 Viabilidade celular pelo método usando o MTT................................39
3.9.2 Viabilidade celular pelo método usando o azul de tripano................40
3.9.3 Viabilidade celular pelo método usando o vermelho neutro.............41
3.9.4 Índice de seletividade...........................................................................42
3.10 MORFOLOGIA E MORTE CELULAR USANDO FLUORESCÊNCIA...........42
3.11 MIGRAÇÃO CELULAR PELO ENSAIO DE FECHAMENTO DE FERIDA.....43
3.12 ENSAIO DE MIGRAÇÃO USANDO INSERTOS BOYDER CHAMBER.........44
3.13 ENSAIO DE INVASÃO...................................................................................46
3.13.1 Montagem dos insertos......................................................................46
3.13.2 Fixação das células............................................................................47
3.13.3 Coloração.............................................................................................47
3.14 ENSAIO DE ADESÃO CELULAR..................................................................48
3.15 ANÁLISE DE GELATINASES NO SOBRENADANTE CELULAR................49
3.15.1 Coleta do sobrenadante.....................................................................49
3.15.2 Zimograma..........................................................................................49
3.16 ANÁLISE DE ÓXIDO NÍTRICO (ON).............................................................50
3.17 AVALIAÇÃO DA EXPRESSÃO DE PROTEÍNAS DE MORTE CELULAR
POR WESTERN BLOT.................................................................................50
3.18 VIABILIDADE DE CÉLULAS DE CANCER DE MAMA HUMANO................52
3.19 ENSAIO IN VIVO...........................................................................................52
3.20 ANÁLISES HISTOLÓGICAS........................................................................54
3.21 ESPECTROMETRIA ATÔMICA DE MASSAS – ESI....................................54
3.22 ANÁLISE ESTATÍSTICA...............................................................................55
4. RESULTADOS.......................................................................................................56
4.1 AS FRAÇÕES ID7, IA19, IID10, E IIIA32 DIMINUEM A VIABILIDADE DAS
CÉLULAS 4T1 E HELA PELO MÉTODO USANDO MTT.....................................57
4.2 O MÉTODO USANDO AZUL DE TRIPANO DETECTOU DIMINUIÇÃO DA
VIABILIDADE DAS CÉLULAS 4T1 QUANDO TRATADAS COM AS
FRAÇÕES ID7, IA19 E IID10...........................................................................62
4.3 AS FRAÇÕES ID7, IA19, IID10, E IIIA32 NÃO ATINGEM IC50 NO
TRATAMENTO DAS CÉLULAS 4T1 ATRAVÉS DO ENSAIO USANDO
VERMELHO NEUTRO...................................................................................64
4.4 AS FRAÇÕES ID7, IA19 E IID10 DIMINUEM A VIABILIDADE DAS CÉLULAS
4T1 COM IC50 MAIS BAIXOS PELO MÉODO USANDO AZUL DE
TRIPANO.........................................................................................................68
4.5 A FRAÇÃO ID7 É A MAIS SELETIVA SOBRE A VIABILIDADE DAS
CÉLULAS TUMORAIS.....................................................................................69
4.6 AS FRAÇÕES ID7, IA19 E IID10 INDUZEM APOPTOSE TARDIA E
MODIFICAM A MORFOLOGIA CELULAR.......................................................70
4.7 AS FRAÇÕES ID7, IA19, IID10 E IIIA32 DIMINUEM A MIGRAÇÃO DE
CÉLULAS 4T1 IN VITRO..................................................................................72
4.8 AS FRAÇÕES ID7, IID10 E IIIA32 DIMINUEM A INVASÃO DE CÉLULAS 4T1
IN VITRO...........................................................................................................75
4.9 AS FRAÇÕES ID7, ID19, IID10, E IIIA32 AUMENTAM A ADESÃO DE
CÉLULAS 4T1 À MOLÉCULAS DA MATRIZ EXTRACELULAR, IN VITRO......77
4.10 AS FRAÇÕES ID7, IA19, IID10 E IIIA32 DIMINUEM A PRESENÇA DE
GELATINASES ATIVAS NO SOBRENADANTE CELULAR.........................78
4.11 AS FRAÇÕES ID7, IA19, IID10, E IIIA32 NÃO ALTERARAM A LIBERAÇÃO
DE OXIDO NÍTRICO DE CÉLULAS 4T1 IN VITRO........................................79
4.12 ID7 ATUA SOBRE A MORTE CELULAR PELA VIA EXTRÍNSICA................79
4.13 ID7 É SELETIVO PARA LINHAGEM DE CANCER DE MAMA
MDA-MB-231..................................................................................................81
4.14 A FRAÇÃO ID7 INIBIU O CRESCIMENTO TUMORAL E A PERDA DE PESO
DE ANIMAIS INOCULADOS COM 4T1..........................................................81
4.15 ID7 DIMINUIU O VOLUME E O PESO DO TUMOR 4T1 RETIRADO DO
ANIMAL..........................................................................................................82
4.16 ID7 DIMINUIU A ÁREA DE NECROSE DOS TUMORES...............................83
4.17 ID7 DIMINUIU A METÁSTASE PARA OS PULMÕES....................................85
4.18 ID7 DIMINUI OS FOCOS DE INFILTRADO INFLAMATÓRIO NOS
FÍGADOS........................................................................................................87
4.19 CARACTERIZAÇÃO DE CONSTITUINTES DA FRAÇÃO ID7......................89
5 DISCUSSÃO...........................................................................................................91
6 CONCLUSÃO........................................................................................................104
ANEXO 1..................................................................................................................105
ANEXO 2..................................................................................................................109
REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS……………………..……………………………..110
LISTA DE FIGURAS
Figura 1: Papéis das MMPs na progressão do câncer...............................................18
Figura 2: Incidência de novos casos de câncer de mama no ano de 2012.................20
Figura 3: B. variegata: A: esxicata; B: flor de B. variegata; C: flor de B. variegata
cândida.......................................................................................................................28
Figura 4: B. ungulata: A: esxicata; B: árvore; C: flor..................................................29
Figura 5: Separação de leucócitos mononucleares humanos..................................36
Figura 6: Esquema de produção de ferida para ensaio de migração usando células.41
Figura 7: Inserto Boyden Chamber para ensaio de migração....................................42
Figura 8: Inserto Boyden Chamber com Matrigel para ensaio de invasão.................44
Figura 9: Camundongo com tumor de células 4T1 induzido no flanco esquerdo.......49
Figura 10: Viabilidade de células tumorais tratadas com ID7, através do teste usando
MTT............................................................................................................................55
Figura 11: Viabilidade de células tumorais tratadas com IA19, através do teste usando
MTT............................................................................................................................56
Figura 12: Viabilidade de células tumorais tratadas com IID10, através do teste
usando MTT................................................................................................................57
Figura 13: Viabilidade de células tumorais tratadas com IIIA32, através do teste
usando MTT................................................................................................................58
Figura 14: Viabilidade de células 4T1 tratadas com ID7, através do teste usando azul
de tripano....................................................................................................................59
Figura 15: Viabilidade de células 4T1 tratadas com IA19, através do teste usando azul
de tripano....................................................................................................................60
Figura 16: Viabilidade de células 4T1 tratadas com IID10, através do teste usando
azul de tripano............................................................................................................60
Figura 17: Viabilidade de células 4T1 tratadas com ID7, através do teste usando
vermelho neutro..........................................................................................................61
Figura 18: Viabilidade de células 4T1 tratadas com IA19, através do teste usando
vermelho neutro..........................................................................................................62
Figura 19: Viabilidade de células 4T1 tratadas com IID10, através do teste usando
vermelho neutro..........................................................................................................63
Figura 20: Viabilidade de células 4T1 tratadas com IIIA32, através do teste usando
vermelho neutro.........................................................................................................64
Figura 21: Viabilidade das células 4T1 tratadas com as frações de Bauhinia, a partir
do teste de fluorescência............................................................................................66
Figura 22: Ensaio de migração por fechamento de ferida de células
4T1.............................................................................................................................68
Figura 23: Ensaio de migração Boyden Chamber de células 4T1..............................69
Figura 24: Ensaio de invasão Boyden Chamber de células 4T1.................................70
Figura 25: Porcentagem de células 4T1 viáveis aderidas aos componentes colágeno
I, colágeno IV, fibronectina e laminina........................................................................72
Figura 26: Gelatinases ativas presentes no sobrenadante de células 4T1 tratadas com
as frações de Bauhinia...............................................................................................73
Figura 27: Teor de óxido nítrico presente no sobrenadante de células 4T1 tratadas
com as frações de Bauhinia........................................................................................73
Figura 28: Expressão das proteínas de vias de morte celular em células 4T1 tratadas
com ID7 e Cisplatina...................................................................................................74
Figura 29: Viabilidade de linhagens de câncer humano tratadas com ID7, através do
teste usando MTT.......................................................................................................75
Figura 30: Crescimento tumoral e peso, do tumor 4T1 em
camundongos.............................................................................................................76
Figura 31: Volume e peso dos tumores extraídos dos camundongos inoculados com
células 4T1.................................................................................................................77
Figura 32: Análise de necrose em tumores 4T1 extraídos de camundongos tratados
com ID7 e grupo controle............................................................................................78
Figura 33: Pulmões extraídos de animais inoculados com 4T1..................................80
Figura 34: Análise de metástases pulmonares dos camundongos com 4T1 do grupo
controle e tratados com ID7........................................................................................80
Figura 35: Análise de infiltrado inflamatório nos fígados de camundongos com tumor
4T1 tratados com ID7 e grupo controle.......................................................................82
Figura 36: Perfil de ID7 por espectrometria de massas MS-ESI- com os sinais de maior
intensidade.................................................................................................................83
LISTA DE TABELAS
TABELA 1 - Nomenclatura dos extratos de Bauhinia................................................34
TABELA 2 - Índice de seletividade de frações de Bauhinia à células tumorais e não
tumorais......................................................................................................................65
TABELA 3 - Índice de seletividade de frações de Bauhinia às células tumorais em
72 horas de tratamento..............................................................................................65
TABELA 4 - Moléculas identificadas por MS-ESI na fração ID7 de Bauhinia...........84
LISTA DE ABREVIAÇÕES
ATP – Adenosina Tri-Fosfato
BME – Extrato de Membrana Basal
BSA – Albumina de Soro Bovina
cis-DDP – Cisplatina
CBDCA – Carboplatina
CCD – Cromatografia em Camada Delgada
CMTN – Câncer de Mama Triplo Negativo
CRC1 – Câncer de Colo-Retal tipo 1
CRC 5 – Câncer de Colo-Retal tipo 2
DMEM - Dulbecco's Modified Eagle Medium
DNA – Ácido Desoxirribonucleico
IC50 – Concentração inibitória mínima
INCA – Instituto Nacional do Câncer
IS – Índice de Seletividade
LA - laranja de acridina
MMPs – Metaloproteinases de Matriz
MMP-2 - Metaloproteinase 2
MMP-9 – Metaloproteinase 9
MEC- Matriz Extracelular
MTT - (3-(4,5-dimetiltiazol-2-il)-2,5-difenil brometo de tetrazolio).
MTS - 2-[(5-Fluoresceinyl)aminocarbonyl]ethyl methanthiosulfonate
EROs – Espécies reativas de oxigênio
SFB – Soro Fetal Bovino
s/p - estreptomicina/penicilina
PBS - phosphate buffered solution
IP - iodeto de protídeo
ON – Óxido Nítrico
16
1 INTRODUÇÃO
1.1 CÂNCER
O termo câncer é a tradução latina da palavra grega carcinoma (de karkinos =
crustáceo, caranguejo). Este termo foi usado pioneiramente por Galeno
(aproximadamente 138 a 201 d C.) para indicar um tumor maligno da mama no qual
as veias superficiais apresentavam formato que assemelhava às patas de um
caranguejo. Este termo generalizou-se e hoje é usado para indicar qualquer neoplasia
maligna (BRASILEIRO-FILHO, 2011).
O câncer é uma das principais causas de morte dos seres humanos e é
caracterizado como a proliferação e propagação no organismo de células
transformadas (KANNAN et al., 2016). Esta patologia ocorre devido à diferenciação
celular anormal, em que mesmo quando interrompido o estímulo, a proliferação não
cede (HANAHAN e WEINBERG, 2011). O câncer pode surgir devido a alterações no
DNA (fatores genéticos) ou em mecanismos que controlam a expressão gênica
(fenômenos epigenéticos) em um ou mais locus envolvidos no controle da divisão e
da diferenciação celulares (BRASILEIRO-FILHO, 2011). Na maioria das vezes, a
ocorrência dessas mutações acarreta a morte da célula por apoptose ou indução de
senescência. Entretanto, em alguns casos, as células conseguem sobreviver, visto
que as mutações alteram a indução da morte celular. Com isso, estas células,
eventualmente adquirem um potencial ilimitado e descontrolado de proliferação
(HANAHAN e WEINBERG, 2011).
Estima-se que 14,1 milhões de novos casos de câncer tenham ocorrido no
decorrer de um ano entre a população mundial. As avaliações indicam que estes
índices estão aumentando cada vez mais, devido ao envelhecimento da população
assim como à crescente exposição à fatores de risco como tabagismo, excesso de
peso e o sedentarismo (GLOBOCAN, 2012). Além destes fatores, o consumo de
álcool, infecções por Helicobacter pylori, hepatite B e C, contato com luz ultravioleta,
poluentes ambientais (por exemplo, metais pesados) e mutações genéticas também
são possíveis precursores do desenvolvimento do câncer (FUTREAL et al., 2004;
PARK et al., 2008).
17
Os tumores podem ser classificados de acordo com vários critérios, como por
exemplo, pelo comportamento clínico (benignos ou malignos), pelo aspecto
microscópico (critério histornorfológico) e pela origem da neoplasia (critério
histogenético). Nem sempre esses elementos são usados na denominação da lesão,
sendo comuns alguns epônirnos, corno tumor de Wilms, linfoma de Hodgkin, tumor
de Burkitt, etc. tumores invasivos ou câncer, que apresentam alta atipia celular,
necroses, degenerações, hemorragias e ulcerações, devido principalmente à
multiplicação rápida das células podendo, inclusive, gerar metástase (BRASILEIRO-
FILHO, 2011).
Existem diversos mecanismos que estão envolvidos na evolução de uma célula
normal para uma célula potencialmente maligna (HAHN e WEINBERG, 2002), muitos
desses ocorrem devido a aquisição de vantagens de crescimento e sobrevivência,
através de mudanças genéticas e epigenéticas, permitindo a expansão clonal (HE et
al., 2013). O sequenciamento do genoma do câncer indicou que a maioria dos
canceres existentes exigem pelo menos cinco mudanças genéticas para evoluir para
a patologia do tipo maligna (WOOD et al., 2007). Além disso, as células tumorais
também exibem interações cruzadas com células inflamatórias, como os macrófagos,
no microambiente do tumor (MANTOVANI et al., 2008; GRIVENNIKOV et al., 2010).
Em tecidos em inflamação crônica (devido à infecção, tabagismo ou obesidade por
exemplo) os macrófagos atuam criando um ambiente que promova aquisição celular
de hits mutacionais tumorigênicos (GRIVENNIKOV et al., 2010). Além disso, os
tumores estabelecidos também ativam essas células para auxiliar na promoção e
progressão do tumor, facilitando a angiogênese, promovendo proliferação e invasão,
e suprimindo a imuno-resistência (GUO et al., 2017).
A maioria das alterações genéticas interferem no ciclo e no metabolismo
celular. Com isso, diversos modos de ação para a busca de anti-neoplásicos envolvem
a indução da morte das células sobre estes eventos. A morte celular pode ocorrer, por
exemplo, por apoptose, que é um mecanismo regulado principalmente por duas vias
de sinalização, a intrínseca e a extrínseca. Essas vias induzem a ativação de
caspases, que por sua vez desencadeiam as alterações celulares que caracterizam a
apoptose, como quebra da membrana nuclear, hipercondensação da cromatina e
degradação proteolítica das estruturas nucleares e citoplasmáticas (PARRISH et al.,
2013). Uma vez que a alteração dos processos de proliferação celular e a supressão
da apoptose constituem suporte para a progressão neoplásica comum a todos os tipos
18
de câncer, estas alterações metabólicas têm sido exploradas terapeuticamente no
controle e tratamento desta patologia (EVAN e VOUSDEN 2001).
Por outro lado, os quimioterápicos também podem agir por induzir necrose
tumoral. A morte celular por necrose ocorre em resposta à possíveis injúrias que as
células podem sofrer. É caracterizada morfologicamente pelo aumento citoplasmático,
ruptura da membrana plasmática e pela liberação do conteúdo extracelular. Nesse
evento ocorre um influxo descontrolado de Ca2+ que pode desencadear uma
sobrecarga mitocondrial e colapso na produção de ATP, interferindo na função da
bomba Na+/K+, levando assim à tumefação celular devido ao aumento de Na+
citosólico. Além disso, a diminuição da atividade mitocondrial, consequentemente,
interfere na ativação de capsases além de inibição de endonucleases (CURTIN et al.,
2002). Em conjunto com os demais fatores descritos, o aumento de espécies reativas
de oxigênio induzem a ruptura da membrana plasmática, com consequente indução
do extravasamento do conteúdo celular, sinalizando a migração e ativação de
resposta inflamatória do sistema imune (MCCONKEY, 1998).
Outro mecanismo de indução de morte de células tumorais é a autofagia. Esse
evento, que ainda não está totalmente elucidado, pode atuar sustentando o
desenvolvimento do tumor, uma vez que proporciona resistência das células tumorais
contra o estresse oxidativo e reduz a sensibilidade à estímulos de morte, permitindo
que a célula cancerosa sobreviva (WHITE et al., 2015). Com isso, o bloqueio da
autofagia impede a sobrevivência das células tumorais em condições de estresse
oxidativo e metástase, revelando assim, um promissor caminho terapêutico contra o
câncer (MIZUSHIMA, 2011).
Por fim, as células tumorais podem produzir óxido nítrico que também está
relacionado ao mecanismo de morte celular. Esse componente, comumente presente
no início da carcinogênese e na neovascularização do tumor, se em excesso, pode
levar à morte das células e à danos teciduais (COSTA et al., 2003).
Assim, embora as neoplasias envolvam muitos outros processos que também
apresentam alvos para a terapia do câncer, em quase todos os casos, a proliferação
celular descontrolada e a morte celular servem como principais alvos terapêuticos
(EVAN e VOUSDEN 2001).
19
1.2 METÁSTASE
A metástase consiste na migração das células do tumor primário para outros
tecidos e órgãos distantes. É responsável por 90% das mortes causadas por câncer
(TANSIA et al., 2016), visto que reduz enormemente as chances de sucesso de
qualquer terapia, devastando rapidamente o organismo, causando resistência às
terapias (NICÁCIO, 2009). Se um tumor for erradicado antes de produzir a metástase,
a sobrevida do indivíduo é aumentada consideravelmente. Porém, a presença de
células metastáticas que rapidamente geram implantes tumorais em outros órgãos e
posteriormente tumores secundários de difícil tratamento, inviabilizando as potenciais
retiradas cirúrgicas (HANAHAN E WEINBERG, 2011).
O mecanismo de migração das células tumorais durante a metástase é
bastante complexo. As células precisam vencer algumas barreiras fisiológicas
impostas pelo organismo como modificar suas propriedades de adesão, promovendo
a migração local, invadir o sistema circulatório (sanguíneo ou linfático) e,
posteriormente, sair da circulação para se inserir em outro tecido do organismo. Estes
processos de migração, invasão, adesão e a metástase são dependentes do
microambiente em torno do tumor (GIALELI et al., 2014). A remodelação do
microambiente tumoral está intimamente ligada às enzimas metaloproteinases de
matriz (MMPs), as quais têm sido relacionadas à cânceres de mama invasivos
(GOLUBNITSCHAJA et al., 2016; LOU et al., 2016).
As MMPs pertencem a uma família de zinco endopeptidases dependentes de
cálcio, composta por pelo menos vinte membros que degradam a matriz extracelular,
em processos patológicos e fisiológicos (MAHECHA e WANG, 2017). Podem ser
classificadas em sete grupos, com base nas suas estruturas e especificidade aos
substratos: (colagenases, metaloproteinases de matriz do tipo de membrana,
gelatinases, estromelisinas, matrilisinas, furano ativas e outras MMPs, que não se
enquadram em nenhuma destas classes) (TIAN-BIAO et al., 2011).
Entre essas enzimas, as MMP-2 e MMP-9 (gelatinases A e B, respectivamente)
têm um papel central na progressão do câncer, pois clivam componentes da matriz
extracelular como o colágeno I e IV, fibronectina e laminina, permitindo que as células
tumorais penetrem no estroma da matriz adjacente (DERYUGINA e QUIGLEY, 2015)
e, por isso, estão correlacionadas com o mau prognóstico do paciente com câncer de
20
mama (TZONEVA et al., 2016). Além disso, a identificação de novas funções
biológicas das MMPs, também em fases tardias do câncer, tem demonstrado a
relevância destas enzimas na sua progressão, além das funções clássicas já
conhecidas. Entre essas funções adicionais destacam-se a ativação de fatores de
crescimento, a supressão de células tumorais em apoptose, a destruição de
gradientes de quimiocinas desenvolvidos por resposta imune do hospedeiro e a
liberação de fatores angiogênicos (figura 1) (EGEBLAD e WERB, 2002; HOJILLA et
al., 2003).
Figura 1: Papéis das MMPs na progressão do câncer.
Fonte: Adaptado de GIALELI et al., 2011.
Como descrito, para realizar a invasão, as células tumorais precisam degradar
componentes da matriz extracelular e a membrana basal do ambiente tumoral. Essa
membrana basal é uma fina matriz que é encontrada em tecidos normais próxima às
células epiteliais, músculo liso, células adiposas e células de Schwann. É composta
principalmente por laminina, colágeno IV, proteoglicano de heparano sulfato, entactina
e vários fatores de crescimento. Diversos tumores produzem quantidades
significativas de matriz e de membrana basal e interagem com ela particularmente
durante a metástase (BENTON et al., 2011).
21
Atualmente, tem sido possível criar experimentos in vitro que mimetizem esses
processos de invasão, a partir da produção de um extrato de membrana basal
derivado de tumor. Esse extrato de membrana basal (conhecido como BME ou
Matrigel) foi primeiramente isolado a partir de um tumor murino, como uma mistura
bruta de proteínas em estado líquido a 4°C e que gelifica em condições fisiológicas a
24-37 °C (KLEINMAN e MARTIN, 2005). Estes hidrogéis contêm todos os
componentes encontrados na membrana basal e por isso possibilitam o estudo da
invasão de células tumorais (HUGHES et al., 2010).
Além da invasão, sabe-se que as interações adesivas das células tumorais
desempenham um papel crítico no processo de disseminação do tumor metastático,
uma vez que as moléculas de adesão atuam como moduladores positivos ou
negativos deste processo. Na metástase, as células tumorais presentes na corrente
sanguínea inicialmente se aderem às células endoteliais de determinados órgãos, a
partir de um processo mediado por integrinas. Em seguida, as células tumorais
metastáticas se aderem a elementos da membrana basal subendotelial, tais como
laminina e colágeno tipo IV e V, também mediada por integrinas beta 1 e beta 4.
Finalmente, as células tumorais metastáticas realizam a adesão a elementos de tecido
conjuntivo, tais como fibronectina e colágeno tipo I, para a movimentação para o
estroma subendotelial e subsequente crescimento nesses novos sítios (ZETTER,
1993). Além disso para se tornarem células tumorais metastáticas, as células do tumor
primário precisam se desprender destas moléculas de adesão presentes no tecido de
origem. Muitas vezes, uma diminuição na adesão célula-célula e/ou célula-matriz no
tumor primário tem sido correlacionada à invasão tumoral e metástase (CAVALLARO
e CHRISTOFORI, 2001). Assim, a adesão aos componentes do tecido conjuntivo
colágenos I e IV, fibronectina e laminina pode atuar positivo ou negativamente, agindo
isoladamente ou em conjunto para metástase (OKEGAWA et al., 2004).
Além disso, para ocorrer a metástase, as células malignas destacam-se do
tumor primário e adquirem as propriedades necessárias para implantar-se em um
determinado órgão, promovendo alterações nestes órgãos preparando-os para
receber as células que irão implantar-se. Atualmente, tem-se admitido que as células
tumorais adquirem as propriedades de implantar-se em outros sítios já na fase
precoce do desenvolvimento de um tumor. Assim, as células deixam o tumor primário
muito precocemente, instalam-se em locais distantes e sofrem alterações genéticas e
epigenéticas distintas em diferentes sítios secundários, até originar subclones
22
capazes de formar metástases. Deste modo as metástases são formadas por células
com perfil genético diferente daquele do tumor primário. Com isso, o tumor primário e
as metástases podem apresentar desenvolvimento paralelo (BRASILEIRO-FILHO,
2011).
1.3 CÂNCER DE MAMA
Entre os tipos de câncer existentes atualmente o câncer de mama é o mais
difundido entre as mulheres em todo o mundo, tanto nas regiões mais desenvolvidas
(794.000 casos em 2012) quanto nas regiões menos desenvolvidas (883.000 casos
em 2012) (GLOBOCAN, 2012) (figura 2). É o segundo câncer mais prevalente em toda
a população, com mais de um milhão de casos notificados a cada ano (INCA, 2016).
No Brasil, cerca de 25% dos cânceres são de mama e estima-se que cerca de 58 mil
novos casos desta doença ocorreram em 2016. Esta patologia não é exclusiva das
mulheres, podendo ocorrer em homens, com uma prevalência de 1% entre os casos
relatados (INCA, 2016).
Figura 2: Incidência de novos casos de câncer de mama no ano de 2012.
Fonte: Adaptado de Globocan, 2012.
Este tipo tumoral ocorre em mulheres de todas as idades, embora, quanto
maior a idade, mais alto é o risco do surgimento. As mulheres com as idades entre 20
23
e 29 anos representam apenas 0,3% dos casos de câncer de mama. Já entre
mulheres com idade entre 30 e 50 anos este índice aumenta para 20%, e em mulheres
com 65 anos ou mais a incidência chega à 50% (MILLER et al., 2012).
1.4 CLASSIFICAÇAO DOS TUMORES DE MAMA X TERAPIA DEPENDENTE.
Já se sabe que o câncer de mama é uma patologia heterogênea, classificada
em quatro subtipos de acordo com características das células tumorais, e que estes
subtipos apresentam diferenças moleculares, comportamento biológico, prognóstico,
padrão de metástase e resposta a tratamentos (LAMBERTINI et al., 2016). Assim o
câncer de mama foi classificado em A e B, Her 2 positivo e triplo negativo (CMTN). No
entanto, na prática clínica, a questão-chave não é a separação dos subtipos
intrínsecos molecularmente definidos, mas a discriminação entre os pacientes uma
vez que estes subtipos apresentam distintas respostas aos tratamentos (DE
LAURENTIIS et al., 2010).
Os cânceres de mama luminais representam cerca de 60 a 90% dos tipos de
câncer de mama, apresentam receptores de hormônios femininos com um padrão de
expressão gênica parecido aos das células normais que revestem os ductos e
glândulas mamárias. Esse subtipo responde a tratamentos hormonais como
Tamoxifen, Anastrozol, Letrozol. O câncer de mama luminal A é caracterizado como
de baixo grau e tem o crescimento mais lento que o luminal B (HON et al., 2016).
Esses tipos de tumores de mama, com receptores de estrogênio (RE), possuem uma
grande heterogeneidade, porém já se sabe que os níveis de RE constituem um
importante preditor da sobrevivência da doença e um forte indício de melhor resposta
à terapia endócrina (COATES et al., 2015).
Já o câncer classificado como Her2 positivo, possui inúmeras cópias do gene
Her2 e, consequentemente, o receptor Her2 em excesso em sua membrana
plasmática o que proporciona a proliferação celular acelerada. O tratamento para este
tipo de câncer é especifico, sendo utilizados atualmente bloqueadores do Her2 como
o Trastuzumab, Lapatinib, Pertuzumab e o TDM1. Esses cânceres tendem a crescer
e se espalhar de forma mais agressiva do que outros tipos de câncer de mama
(COATES et al., 2015).
24
O subtipo conhecido como triplo negativo ou basal representa
aproximadamente 15% dos tipos de câncer de mama, não apresenta receptores
hormonais e possui quantidades normais do receptor de membrana Her2. Devido a
esses fatos as terapias descritas anteriormente não são eficazes para esse subtipo
tumoral, sendo necessário o tratamento à base de quimioterapia (GLUZ et al., 2009).
Os padrões de expressões genéticas deste subtipo de câncer são semelhantes aos
padrões das células das camadas mais basais dos ductos e glândulas mamárias,
sendo este tipo mais comum entre pacientes com mutações no gene BRCA1 e entre
mulheres mais jovens e negras (CARSTEN-DENKERT et al., 2016). Assim,
atualmente existem muitas pesquisas sendo feitas para desenvolver novos
medicamentos para o câncer de mama triplo negativo, como os inibidores de PARP e
os bloqueadores do receptor de androgênio (CAREY et al., 2010).
Devido a esses fatores certos tipos de câncer são difíceis de tratar, apresentam
alto custo e apesar dos avanços alcançados na clínica, a baixa especificidade e alta
toxicidade dos tratamentos existentes atualmente corroboram com a necessidade de
encontrar melhores terapias (FRIESE et al., 2017).
1.5 PRINCIPAIS TRATAMENTOS DO CÂNCER
Existem três tipos principais de tratamento para o câncer: cirurgia, radioterapia
e quimioterapia. Também tem sido usada a terapia de fotorradiação com derivados
hematoporfirínicos e a imunoterapia (ALMEIDA et al., 2005). A cirurgia remove o tumor
de forma eficaz, desde que não ocorra metástase. Já a radioterapia é usada em
conjunto com as técnicas cirúrgicas. Entretanto, mesmo com o uso de métodos que
visam diminuir os efeitos colaterais, o tratamento por radiação é sujeito à severas
limitações (MURAD e KATZ, 1996).
A utilização destes métodos consegue curar cerca de um terço dos pacientes
com câncer. Nos demais casos, a neoplasia caracteriza-se pelo desenvolvimento
precoce de micrometástases, necessitando tratamentos com abordagem sistêmica,
que na maioria das vezes utiliza a quimioterapia (OLIVEIRA et al., 2002).
A maioria dos agentes quimioterápicos usados atualmente atuam de forma não-
específica, agindo sobre as células malignas e também sobre as células normais.
25
Entre eles os agentes alquilantes são os mais estudados e utilizados. Eles são
capazes de formar ligações interfilamentares com o DNA das células e necessitam
ser metabolizados pelas fosfamidases (enzimas microssomais hepáticas), para que
seus metabólitos possam exercer o efeito alquilante celular (GILMAN e PHILLIPS,
1990). Um exemplo de quimioterápico alquilante é o Melfalan, usado no tratamento
do câncer de mama.
Os antineoplásicos formados por compostos a base de platina, como a
Cisplatina (cis-DDP, comercialmente Platinil®, ou Platinol®) e Carboplatina (CBDCA,
Paraplatin®) também alquilam o DNA (MACHADO, 2000). As propriedades citotóxicas
destes compostos, assim como de numerosos análogos, têm sido atribuídas às suas
habilidades de formar ligações cruzadas do tipo inter ou intrafilamentares (HAHN e
WEINBERG, 2002). Contudo, apesar da ampla utilização clínica dos agentes
quimioterápicos antineoplásicos, especialmente os agentes alquilantes, estes
compostos são altamente tóxicos podendo acarretar danos e efeitos colaterais
(ALMEIDA et al., 2005).
Em contrapartida, atualmente, existem evidências que as atividades
antitumorais de medicamentos à base de plantas ou compostos de origem vegetal são
obtidos, principalmente, por modulação do estresse oxidativo e/ou reprogramação do
ambiente extracelular tumoral em vários tipos de câncer (CHENG et al., 2016),
atuando assim sobre a iniciação e resistência tumoral.
Para o câncer de mama, as terapias disponíveis atualmente resumem-se em
clínicos e cirúrgicos. O cirúrgico foi inicialmente descrito por Halsted no final do século
XIX, chamado de mastectomia radical, a partir da retirada de toda a glândula mamária,
da pele sobrejacente, dos músculos grande e pequeno peitoral, seguida do
esvaziamento axilar (HALSTED, 1894). Atualmente, se for concluído que há a
necessidade de se fazer uma cirurgia para a retirada do nódulo, esta pode ser
conservadora, as chamadas quadrantectomia ou tumorectomia ou, em casos mais
avançados, a mastectomia radical (ALMEIDA, 2006). Já os tratamentos clínicos
envolvem quimioterápicos e hormonioterápicos, e, em alguns casos a combinação
desses, cada qual com sua função e efeito colateral. Além disso, no tratamento do
câncer de mama também é utilizada a radioterapia que é comumente indicada logo
após o tratamento cirúrgico (MBAH et al., 2018).
Apesar destes protocolos de tratamento mostrarem resultados promissores,
ainda apresentam inconvenientes como efeitos colaterais tóxicos e a supressão do
26
sistema imunológico (MBAH et al., 2018; DIWANAY et al., 2004). As cirurgias, em
especial a mastectomia radical, ocasionam transformações dolorosas na vida das
mulheres, como alterações da autoimagem, da autoestima e comprometimento da
sexualidade (ALMEIDA, 2006), o que reforça a importância da busca por compostos
antineoplásicos que minimizem estes efeitos. Além disso, geralmente, o tratamento
do câncer é muito oneroso, exigindo instalações e medicamentos de alto custo e
equipe de saúde altamente especializada. Deste modo, encontrar agentes
antitumorais eficazes com menos efeitos colaterais nos sistemas vivos é um desafio
fundamental (MATHUR e JOSHI, 2013; NANDA et al., 2013).
1.6 PESQUISAS ENVOLVENDO O CÂNCER: O USO DE LINHAGENS
CELULARES
Diversas pesquisas buscando novas drogas antitumorais utilizam linhagens
celulares neoplásicas, pois promovem bases biológicas para o estudo do
desenvolvimento e progressão do câncer apresentando boa reprodutibilidade dos
resultados. Além dos testes in vitro, diversos estudos também avaliam o potencial
antitumoral de extratos vegetais usando modelos animais (RAJANI; ASHOK, 2009;
RUDNICK-GLICK, 2016), uma vez que apresentam a vantagem do fornecimento de
informações sobre o organismo como um todo, o que não é alcançado com outros
métodos (CHORILLI et al., 2007).
Entre as linhagens tumorais atualmente utilizadas na pesquisa do câncer de
mama estão as células 4T1 que são provenientes de adenocarcinoma mamário
murino em estágio IV, altamente tumorigênico e invasivo. Esse tipo tumoral tem a
capacidade de produzir metástases pela via hematógena para fígado, pulmões, ossos
e cérebro (HEPPNER et al., 2000), desenvolvendo-se de forma semelhante ao câncer
de mama em humanos. Além disso, essa linhagem tumoral é facilmente transplantável
e capaz de crescer em outras regiões anatômicas de camundongos BALB-c, como
quando inoculado nos flancos, na região subcutânea, o que facilita a avaliação do
crescimento tumoral. Este fato também possibilita que o tumor seja facilmente
removido cirurgicamente, de modo que a doença metastática possa ser estudada em
um ambiente animal comparável à situação clínica (PULASKI e OSTRAND-
27
ROSENBERG, 2001). Além disso, essa linhagem de câncer de mama murina
apresenta-se como um bom modelo de estudo in vivo pois se assemelha com o câncer
de mama triplo negativo humano (SILVA et al., 2016). Todas estas características
tornam a linhagem tumoral 4T1 muito utilizada para o estudo da progressão do câncer,
do processo metastático e de terapias antitumorais e antimetastáticas (HEPPNER et
al., 2000).
As linhagens de câncer de mama BT-20, MCF-7 e MDA-MB-231 também são
linhagens bem caracterizadas e amplamente usadas como modelos de estudo do
câncer (CARL et al., 1993). A linhagem MCF-7, do tipo histológico ductal é
considerada tipo luminal A, visto que é positiva para os receptores de estrogênio (RE+)
e receptores de progesterona (RP+) e é negativa para o receptor Her2. Já a linhagem
BT-20 é considerada do tipo Her2 pois apresenta esse receptor de membrana e é RE
e RP negativos (FRAPPAR, et al., 1989). Por fim, a linhagem MDA-MB-231 é uma
linhagem de câncer de mama ductal considerada triplo negativo visto que não
apresenta nenhum desses receptores (MACEDO, 2014).
Além da ação sobre a patologia estudada, uma potencial molécula bioativa
contra o câncer necessita passar por testes de toxicidade, a fim de avaliar a sua
atuação sobre outros tipos celulares presentes no organismo. Isto se torna muito
importante uma vez que o surgimento de efeitos colaterais ocorre principalmente
devido à não seletividade da molécula estudada (HUANG et al., 2010). A partir da
divisão do valor da IC50 do possível fármaco sobre as células não tumorais pelo valor
da IC5O sobre a linhagem tumoral obtém-se o índice de seletividade (IS). Valores desta
correlação acima de 1 são considerados tratamentos seletivos às linhagens tumorais
(RODRÍGUEZ-HERNÁNDEZ et al., 2017). O cálculo do IS pode ser feito utilizando
culturas primárias de células não tumorais, como as de leucócitos ou esplenócitos,
que permitem a manutenção celular em condições e concentrações de tratamento
controladas por um certo período (ALVES e GUIMARÃES, 2016).
1.7 O USO DE PLANTAS MEDICINAIS NO TRATAMENTO DO CÂNCER
Desde a década de 70 a utilização de terapias alternativas tem se popularizado
em todo o mundo, com um crescimento em aproximadamente 2 a 3% ao ano,
28
passando a ser utilizada por vários grupos, entre eles os pacientes oncológicos. A
procura por práticas complementares de saúde se dá principalmente pela insatisfação
com a medicina convencional, devido aos efeitos colaterais e a busca de afinidades
pela utilização de produtos naturais (JACONODINO, 2008). Assim, a população
também pode optar por tratamentos muitas vezes mais baratos e de fácil aquisição,
como as plantas medicinais, para poderem solucionar ou amenizar seus problemas
de saúde.
As terapias alternativas consistem em técnicas que buscam suprir as
necessidades dos indivíduos, tanto na prevenção como no tratamento ou cura,
considerando-os em todos os seus aspectos, em sua multidimensionalidade (HILL,
2003), sendo utilizada na maioria das vezes de forma complementar ao tratamento.
Entre as terapias alternativas existentes atualmente tem-se destacado o uso de
plantas medicinais (BARNES et al., 2008) que atuam em diversas esferas do
tratamento do câncer.
Segundo dados recentes, as populações em tratamento de câncer que mais
buscam terapias alternativas ou complementares são crianças e adolescentes
(SHENG-YU e EISER, 2009), mulheres com câncer de mama (PEREIRA e LIPPI,
2009) e indivíduos em cuidados paliativos (MANSKY e WALLERSTEDT, 2006). Um
levantamento com pacientes com câncer revelou que 89% dos entrevistados
conhecem algum tipo de terapia alternativa, sendo que 38% destes pacientes citaram
a fitoterapia. Além disto, 89% dos pacientes são favoráveis à utilização de práticas
complementares e, entre estes 69% já fazem o uso destas (JACONODINO, 2008).
O reino vegetal é amplamente utilizado, de forma popular, no tratamento de
diversas doenças há centenas de anos, como por exemplo no tratamento da
hipertensão (PETKOV, 1979), gripes e resfriados, e doenças do trato digestivo e
estomacal (CALIXTO, 2000). Assim, é considerado uma das principais fontes para a
descoberta de novos compostos bioativos (SARAYDIN et al., 2012). Os compostos
naturais derivados de plantas, como os clássicos exemplos vincristina, vinblastina,
etoposido, paclitaxel, camptotecina, topotecano e irinotecano são utilizados para o
tratamento de diversos tipos de câncer (HUA et al., 2017). Assim, cada vez mais
medicamentos de origem vegetal ou produtos naturais derivados de plantas têm sido
analisados e apresentado atividades contra o câncer de mama in vitro e in vivo, sendo
que, as folhas são as partes vegetais mais estudadas. Plantas como Glycyrrhiza
glabra, Uncaria tomentosa, Camellia sinensis, Panax ginseng, Prunus armenaica,
29
Allium sativum, Arctium lappa e Curcuma longa têm sido reportadas com potencial
ação sobre o câncer de mama e têm sido utilizadas no tratamento desta doença em
diversas partes do mundo (BARAYA et al., 2016). Ostad et al. (2016) mostraram que
o extrato em clorofórmio de Centaurea bruguierana foi citotóxico sobre carcinoma de
mama. Além disso, a combinação de fármacos antitumorais e extratos derivados de
plantas pode oferecer uma vantagem significativa na eficácia dos tratamentos
existentes e na superação da resistência induzida por fármaco em pacientes com
câncer (CHENG et al., 2016; SANTOS et al., 2015).
Assim, a procura por novas e eficazes terapias antitumorais e também contra a
disseminação metastática, com baixo custo e mínimos efeitos colaterais, tem se
tornado cada vez mais primordial. Há que se destacar que muitas destas pesquisas
têm buscado moléculas ativas provindas de vegetais (SHARMA e ZAFAR, 2015).
1.8 O GÊNERO BAUHINIA
O gênero Bauhinia está incluído na família Fabaceae, de acordo com a lista de
espécies da flora do Brasil (VAZ, 2010) e é conhecido popularmente como Pata-de-
vaca, devido ao formato bilobado de suas folhas, em razão do crescimento parcial dos
folíolos que se assemelham à forma da pata de uma vaca (figura 3A) (LUSA e BONA,
2009). Esta família possui distribuição cosmopolita, incluindo cerca de 300 espécies
em todo o mundo, representando uma das maiores famílias das Angiospermas.
Os extratos de espécies do gênero Bauhinia apresentam comprovadas
atividades terapêuticas como as ações antibacteriana, antiulcerativa, antifúngica,
nefro-protetora, antimutagênica e também a ação contra o crescimento de tumores
hepáticos induzidos em ratos (RAJKAPOOR et al., 2006; PANDEY e AGRAWAL,
2009; PANI et al., 2011).
A espécie Bauhinia variegata L. é uma árvore de médio porte, caducifólia, de
origem asiática, mas muito cultivada no Brasil, ocorrendo desde o Piauí até o Rio
Grande do Sul (NASCIMENTO et al., 2005). Em algumas variações podem apresentar
flores brancas (figura 3C), sendo neste caso, denominadas Bauhinia variegata
candida (Aiton) Buch.-Ham (LUSA e BONA, 2009). A Bauhinia variegata é muito
utilizada para fins ornamentais devido à beleza das flores sendo muito difundida em
30
arborização de ruas. Esta espécie também apresenta propriedades biológicas como
a ação hipoglicemiante, que foi determinada a partir do isolamento de uma proteína
de cloroplasto dos extratos de suas folhas, com massa molecular e função
semelhantes à insulina (AZEVEDO et al., 2006). Outra ação terapêutica importante foi
comprovada em um estudo realizado por Oliva e Sampaio (2009), que demonstraram
que extratos hexânicos de folhas de B. variegata apresentam inibidores de enzimas
proteolíticas da cascata de coagulação do sangue. Estudos também já demonstraram
que o extrato etanólico desta espécie apresenta atividade antitumoral sobre o linfoma
ascítico de Dalton, em camundongos (RAJANI e ASHOK, 2009).
Avaliações fitoquímicas de extratos de B. variegata demonstraram a presença
de alcaloides, esteroides, flavonoides, taninos, naftoquinonas e terpenoides (DUARTE
et al., 2007). Dentre os esteroides, já foram identificados o sitosterol, o triterpenoide
lupeol, e os flavonoides narigenina-5.7-dimetoxi-4-ramnoglicosídeo, caempferol-3-
galactosídeo e caempferol-3-ramno-glucosídeo. Porém, ações terapêuticas destes
compostos não estão totalmente elucidadas (MARTÍNEZ et al., 2011; PAARAKH,
2009).
Figura 3: B. variegata: A: esxicata; B: flor de B. variegata; C: flor de B. variegata candida. Fonte: Santos (2011).
31
A B. ungulata L. é outra espécie deste gênero que apresenta altura entre 5 a
15 metros. Suas flores se desenvolvem durante a estação seca, em um período de
seis a sete meses, possuindo pétalas do tipo linear-lanceoladas de coloração rósea
(figura 4). Essa espécie é a única do gênero que apresenta ampla distribuição, sendo
encontrada na Caatinga, Cerrado, Mata Atlântica e Amazônica (NETO et al., 2008).
Estudos fitoquímicos dos extratos das sementes dessa espécie demonstraram a
presença de inibidores de enzimas proteolíticas e grande quantidade de compostos
de interesse terapêutico em suas folhas. Dentre estes, os flavonoides e alcaloides são
os que estão presentes em maior quantidade (CECHINEL-FILHO, 2009; NETO et al.,
2008).
Figura 4: B. ungulata: A: esxicata; B: árvore; C: flor. Fonte: Santos (2011).
Através da busca por moléculas bioativas, estudos recentes do nosso grupo de
pesquisa mostraram que as frações de Bauhinia ungulata apresentam potencial
atividade antimetastática, uma vez que inibiram completamente a atividade de
metaloproteinases 2 e 9 in vitro (SANTOS et al., 2015). Também já foi relatado que
extratos de Bauhinia variegata apresentam atividade contra linhagens tumorais como
32
câncer renal, melanoma, câncer de cólon (Colo-320), de pulmão (A-540) e leucemia
monocítica aguda (THP-1) e acredita-se que o flavonoide 5,7,4-trimetoxyflavona seja
o componente ativo responsável por esta atividade (RAJKAPOR, 2009; TARIQ et al.,
2015).
Portanto, tendo em vista o potencial biológico que extratos de espécies de
Bauhinia apresentam e a importância da identificação de plantas com atividade
antitumoral e antimetastática eficazes, neste trabalho foi investigada a atividade de
frações de caules de três espécies de Bauhinia (B. variegata, B. variegata candida e
B. ungulata). Essas frações foram selecionadas em trabalhos anteriores por inibirem
totalmente a atividade gelatinolítica de MMP-2 e MMP-9, sobre eventos in vitro
(SANTOS et al., 2015).
33
2 OBJETIVOS
Avaliar as atividades antitumoral e antimetastática de frações dos caules de
três espécies de Bauhinia (Bauhinia variegata L., Bauhinia variegata candida (Aiton)
Buch.-Ham e Bauhinia ungulata L.) sobre o câncer de mama.
2.1 OBJETIVOS ESPECÍFICOS
1. Avaliar os efeitos das frações ID7, IA19, IID10 e IIIA32 de Bauhinia sobre a
viabilidade das linhagens celulares tumorais de mama murina (4T1) e de colo uterino
humana (HeLa), assim como sobre esplenócitos murinos e leucócitos mononucleares
humanos.
2. Determinar a seletividade das frações de Bauhinia para células tumorais.
3. Obter a porcentagem de células 4T1 viáveis, em apoptose inicial e em apoptose
tardia, tratadas com as frações de Bauhinia.
4. Determinar a ação das frações de Bauhinia sobre a migração e sobre a invasão de
células 4T1.
5. Avaliar a ação das frações de Bauhinia sobre a adesão de células 4T1 à
componentes da matriz extracelular.
6. Analisar a atividade das gelatinases do sobrenadante de células 4T1, tratadas com
as frações de Bauhinia.
7. Avaliar os efeitos as frações de Bauhinia sobre a produção de óxido nítrico pelas
células 4T1.
8. Avaliar a expressão de proteínas de morte celular das células 4T1 tratadas com a
fração de Bauhinia mais seletiva.
9. Avaliar a ação da fração de Bauhinia mais seletiva sobre a viabilidade de linhagens
de câncer de mama humanas MCF-7, MDA-MB-231 e BT20.
10. Avaliar o potencial antitumoral e anti-metastático da fração mais seletiva das
espécies de Bauhinia em modelo tumoral 4T1 inoculado em camundongos BALB/c.
11. Realizar análises histológicas dos tumores, fígados e pulmões extraídos dos
camundongos.
12. Reconhecer as principais moléculas presentes na fração mais seletiva.
34
3 MATERIAIS E MÉTODOS
3.1 DESENHO EXPERIMENTAL
Organograma sobre o desenho experimental realizado na execução deste trabalho.
3.2 AMOSTRAS
As amostras de folhas, flores, ramos e frutos foram coletadas em maio de
2014, de uma árvore de cada espécie de B. variegata, B. variegata candida e B.
ungulata, apresentando como coordenadas geográficas de localização -20.150386 e
-44.888163; -20.1439 e -44.902899; -20.149716 e -44.886227, respectivamente. As
três espécies foram identificadas pelo professor Doutor Guilherme Araújo Lacerda
(CRBio 44480/04-D) e depositadas no Herbário fiel depositário do Departamento de
35
Botânica da Universidade Federal de Minas Gerais, sob os códigos: BHCB161588 (B.
ungulata L.), BHCB161589 (B. variegata L.) e BHCB161590 (B. variegata candida
(Aiton) Buch-Ham).
As plantas tiveram suas partes separadas (folhas, flores, ramos e frutos) para
que pudessem ser lavadas em água corrente e então, secas em temperatura
ambientes por sete dias. Em seguida, foram trituradas em um liquidificador industrial
(PANI et al., 2011).
3.3 OBTENÇÃO DE EXTRATOS BRUTOS E PARTIÇÕES
A obtenção dos extratos brutos foi realizada por maceração exaustiva a partir
da adição de 100 g de cada uma das amostras trituradas em 500 mL de solução hidro
alcoólica (etanol, 70%), sendo levemente agitados e, posteriormente, deixados em
repouso em frascos âmbar, por sete dias. Após este período, o macerado foi filtrado,
sendo adicionados mais 500 mL de solução hidro alcoólica (etanol, 70%) na amostra
residual. Este procedimento foi repetido até que o extrato proveniente do macerado
apresentasse coloração verde claro transparente. Os macerados totais foram
congelados em ultrafreezer à -80°C e liofilizados (Liofilizador modelo K 105, Liobrás
®) até a obtenção das amostras totalmente secas.
Para a realização das partições, os extratos brutos foram pesados (1 g) e
solubilizados em 45 mL de solução hidro alcoólica (etanol, 70%). Esta solução foi
transferida para um funil de separação juntamente com 45 mL de hexano, sendo o
funil agitado manualmente para mistura dos dois solventes. Aguardado repouso para
separação das fases, foi recolhida a porção hexânica (menos densa). A adição de
hexano e seu recolhimento foram repetidos por mais duas vezes. Este procedimento
também foi realizado com clorofórmio e acetato de etila. Ao final do experimento, a
partição hidro alcoólica residual foi recolhida. As partições obtidas A (hidro alcoólica –
etanol 70%), B (hexano), C (clorofórmio) e D (acetato de etila) foram congeladas a
-80 °C e em seguida liofilizadas (CECHINEL-FILHO, 2009). O procedimento foi
realizado repetidas vezes até a obtenção de massa, de cada uma das partições,
suficiente para a realização dos posteriores métodos.
36
3.4 CROMATOGRAFIA EM CAMADA DELGADA
Para a definição dos eluentes iniciais a serem utilizados nas colunas
cromatográficas de separação, foram preparadas placas de cromatografia em camada
delgada (CCD). Para isto, 7 g de sílica em pó para CCD foram acrescentadas em 17,5
mL de água destilada. Esta solução foi agitada vigorosamente e, em seguida, aplicada
em lâminas de 2,5 x 5 cm, que foram ativadas em estufa à 100ºC, durante 30 minutos.
Em seguida, aproximadamente 20 µL de cada partição foram aplicados na base
das placas de CCD. A eluição das placas foi realizada com a seguinte escala de
solventes, de polaridades crescentes (v/v): hexano, hexano/clorofórmio 1:1,
clorofórmio, clorofórmio/acetato de etila 1:1, acetato de etila, acetato de etila/metanol
1:1 e metanol. Seguindo esta ordem de eluição, o solvente de menor polaridade capaz
de iniciar o arraste da amostra em CCD foi selecionado para iniciar a coluna
cromatográfica.
3.5 CROMATOGRAFIA EM COLUNA POR GRAVIDADE
Para a realização da coluna cromatográfica, cerca de 0,5 g de cada amostra
das partições foram adicionados a uma bureta contendo 15 g de sílica gel 60G (0,05-
0,2 mm). A eluição da coluna ocorreu com a adição de solventes orgânicos de
polaridade crescente, iniciando com o solvente determinado pela eluição da CCD.
Foram aplicados 400 mL de cada eluente, e estes foram coletados sob gotejamento
constante em frascos de 50 mL cada. Após coletadas, as frações foram concentradas
por liofilização e agrupadas de acordo com o perfil fitoquímico determinado por CCD.
Neste trabalho foram utilizadas as frações nomeadas como ID7, IA19, IID7 e
IIIA32. As amostras utilizadas neste estudo foram selecionadas de acordo com
ensaios prévios em que estes extratos foram capazes de inibir totalmente a atividade
gelatinolítica das MMP-2 e MMP-9 em testes in vitro (SANTOS et al., 2015). Os
extratos foram provenientes dos caules de três espécies de Bauhinia, sendo que
foram codificados de acordo com nomenclatura padronizada no Laboratório de
37
Patologia Experimental (Tabela 1), constando de parte da planta, tipo de solvente
utilizado na partição e ordem da eluição da fração na coluna.
TABELA 1 - Nomenclatura dos extratos de Bauhinia
Legenda Descrição
I Bauhinia variegata
II Bauhinia variegata candida
III Bauhinia ungulata
A Partição hidroalcoólica (etanol 70%)
D Partição acetato de etilia
7 Ordem de eluição da fração da coluna
10 Ordem de eluição da fração da coluna
19 Ordem de eluição da fração da coluna
32 Ordem de eluição da fração da coluna
3.6 CÉLULAS TUMORAIS E CONDIÇÕES DE CULTURA
As células de adenocarcinoma cervical humano (HeLa) foram gentilmente
cedidas pelo Centro de Pesquisa em Oncologia Molecular do Hospital do Câncer de
Barretos. As células foram mantidas em meio de cultura DMEM suplementado com
10% (v/v) de soro fetal bovino (SFB) inativado pelo calor e com 1% de
estreptomicina/penicilina (s/p), a 37°C, em uma atmosfera de ar umidificado
enriquecido com 5% (v/v) de CO2.
As células de adenocarcinoma mamário murino (4T1) foram adquiridas
do Banco de Células do Rio de Janeiro (BCRJ). Estas células foram mantidas em meio
de cultura RPMI-1640 suplementado com soro 10% de fetal bovino (SBF) e 1% de s/p
em estufa de CO2 (5%), 37ºC.
Os experimentos realizados com as células BT-10, MCF-3 e MDA-MB-
231 foram realizados no Laboratório de Oncologia Molecular do Hospital do Câncer
de Barretos, sendo que as células BT-20, MCF-7 e MDA-MB-231 foram mantidas em
meio de cultura DMEM suplementado com 10% (v/v) de soro fetal bovino (SFB)
38
inativado pelo calor e com 1% de estreptomicina/penicilina (s/p), a 37°C, em uma
atmosfera de ar umidificado enriquecido com 5% (v/v) de CO2.
3.7 OBTENÇÃO DE LEUCÓCITOS MONONUCLEARES HUMANOS
Os leucócitos mononucleares humanos foram utilizadas para avaliar o índice
de seletividade das frações de Bauhinia a partir do método usando MTT.
O sangue periférico humano (40 mL) foi obtido de dois voluntários com
históricos saudáveis, livres de doenças crônicas e com valores normais de
hemograma (eritrócitos: 3,9 a 5,03 milhões/L; hemoglobina: 12 a 16 g/dL; hematócrito:
35 a 45%; VCM 87 a 103 fL; plaquetas 150 a 450 milhões/L; leucócitos 4,5 a 11 mil/L
em mulheres e eritrócitos: 4,32 a 5,52 milhões/L; hemoglobina: 13,5 a 18 g/dL;
hematócrito: 40 a 50 %; VCM 87 a 103 fL; plaquetas 150 a 450 milhões/L; leucócitos
4,5 a 11 mil/L em homens. Os voluntários somente participaram do trabalho após
lerem e assinarem o termo de consentimento livre e esclarecido. Esta metodologia foi
aprovada pelo Comitê de Ética em Pesquisa com Seres Humanos, da Universidade
Federal de São João del Rei, campus Dona Lindu, sob número de parecer 2.007.582
(anexo 1). Devido ao alto volume necessário, as coletas foram realizadas em dois
momentos distintos, com intervalo de 15 dias entre uma coleta e outra. O sangue
coletado dos voluntários foi distribuído em tubos de 5 mL contendo anticoagulante
heparina (5000 UI). Em seguida, o sangue foi transferido para tubos contendo Ficoll-
Paque (2:1 v/v) que foram centrifugados durante 40 minutos, a 1400 rpm, à
temperatura ambiente. A parte branca na camada acima do Ficoll-Paque foi recolhida
(figura 5).
Figura 5: Separação de leucócitos mononucleares humanos.
Fonte: Santos, 2015.
39
As células colhidas foram suspensas em meio de cultura DMEM suplementado
(10% de SFB e 1% de s/p) e adicionadas a frascos de plástico esterilizadas. Após 24
horas de incubação, o meio foi removido e as células foram lavadas com solução PBS
(phosphate buffered solution). As células aderentes foram consideradas leucócitos
mononucleares (PARISI, 2014).
3.8 OBTENÇÃO DE ESPLENÓCITOS MURINOS
Estas células foram utilizadas para avaliar o índice de seletividade das frações
de Bauhinia a partir do método usando MTT. Para isto, dois camundongos BALB/c
sadios, sendo um macho e uma fêmea, com dois meses de vida e peso entre 25 e
30g, foram anestesiados e eutanasiados por deslocamento cervical. Em seguida,
foram realizadas as dissecações dos animais em condições assépticas, sob chama
de bico de Bunsen e retirada a totalidade do baço de cada camundongo. Estes órgãos
foram levados à câmara de fluxo laminar onde os tecidos foram macerados utilizando
uma pinça estéril em solução salina (NaCl 0,9%) para a obtenção das células. Em
seguida, o material celular foi centrifugado à 2000 rpm, por 5 minutos e o
sobrenadante desprezado. Foram realizadas mais duas centrifugações usando
solução salina e por último as células foram suspensas em meio de cultura DMEM
suplementado com 10% de SFB e 1% de s/p.
3.9 AVALIAÇÃO DA VIABILIDADE CELULAR
3.9.1 Viabilidade celular pelo método usando o MTT
Foram realizados ensaios de viabilidade celular utilizando o corante MTT (3-
(4,5-dimetiltiazol-2-il)-2,5-difenil brometo de tetrazolio), que é um composto
hidrossolúvel, de coloração amarelo pálido que rapidamente é incorporado por células
viáveis e reduzido pelas desidrogenases mitocondriais. A partir desta redução é
formado o formazan, que apresenta coloração púrpura e é insolúvel em água, ficando
40
na forma de cristais no citoplasma celular (RISS et al., 2013). Para a realização do
teste, as garrafas contendo as linhagens tumorais (HeLa e 4T1) e não tumorais
(esplenócitos murinos e leucócitos mononucleares humanos) foram lavadas com PBS
e tripsinizadas com 500 µL de tripsina (2,5%). Após aguardados aproximadamente 2
minutos, as células foram retiradas das garrafas e centrifugadas à 2000 rpm, por 5
minutos. Após a centrifugação, o sobrenadante foi desprezado e as células foram
ressuspensas em 1 mL de meio de cultivo suplementado com 10% de SFB.
Em seguida, 20 µL desta suspensão de células foram solubilizados em 180 µL
de líquido de Turk (ácido acético 0,04% e azul de metileno 1% em água destilada) e
adicionados em Câmara de Neubauer para a contagem das células.
Após isso, foram adicionadas 2x104 células/mL em cada poço de placas de 96
poços, que foram mantidas a 37 °C e 5 % de CO2 por 24 horas. Após esse período o
meio de cultivo foi retirado e as células foram lavadas para a adição dos tratamentos.
Os tratamentos consistiram nas frações vegetais liofilizadas, que foram diluídas (1%
de DMSO) nas concentrações: 5, 10, 25, 50, 75 e 100 µg/mL em 100 μL de meio de
cultivo sem SFB, para 24 horas de tempo de tratamento e em 200μL de meio de cultivo
sem SFB, para 48 e 72 horas de tratamento. Decorridos os tempos de incubação das
células, 100 µL de MTT (2,5 mg/mL) foram adicionados em cada poço e após 3 horas,
foram aspirados e adicionados 100 μL de DMSO para a solubilização dos cristais de
formazam. Em seguida a absorbância da coloração púrpura formada foi avaliada por
espectrofotometria, a 570 nm (OLIVEIRA, 2011). Este ensaio foi realizado em
triplicata.
3.9.2 Viabilidade celular pelo método usando o azul de tripano
O ensaio de viabilidade celular por azul de tripano visa avaliar a toxicidade de
compostos a partir do dano à membrana celular, em que a célula somente se cora de
azul quando a membrana celular perde sua integridade (MASSON-MEYERS, 2016).
Para isto as células tumorais foram tripsinizadas e contadas usando solução de Turk
e Câmara de Neubauer de forma a serem adicionadas 2x104 células/poço em placas
de 96 poços, as quais foram mantidas a 37°C e 5% de CO2, por 24 horas. Os
41
tratamentos também consistiram nas mesmas frações vegetais e concentrações
utilizadas nos ensaios usando MTT (5, 10, 25, 50, 75 e 100 µg/mL). Após o período
de tratamento com os extratos, cada poço foi lavado com 100 µL de PBS e tripsinizado
com 40 µL de tripsina a 2,5%. Após o desprendimento das células, as placas foram
centrifugadas à 2000 rpm por 5 minutos e o sobrenadante foi descartado. Em seguida,
as células foram diluídas em 30 µL de azul de tripano a 0,04% (g/v em água) e as
células viáveis (não coradas pelo azul de tripano) foram contadas em Câmara de
Neubauer e microscópio óptico no aumento de 400x. Este ensaio foi realizado em
triplicata.
3.9.3 Viabilidade celular pelo método usando o vermelho neutro
O ensaio de viabilidade celular por vermelho neutro (3-amino-7-Dimetilamino-
2-metilfenazina) visa avaliar a toxicidade de compostos a partir do acúmulo deste
corante em lisossomos celulares (FOTAKIS e TIMBRELL, 2006). Para isto, as células
tumorais foram tripsinizadas e contadas usando solução de líquido de Turk em
Câmara de Neubauer de forma a serem adicionadas 2x104 células/poço em placas de
96 poços, que foram mantidas a 37°C e 5% de CO2 por 24 horas. Os tratamentos
também consistiram das mesmas frações e concentrações (1% de DMSO) utilizadas
nos ensaios usando MTT e azul de tripano (5, 10, 25, 50, 75 e 100 µg/mL), por 24, 48
e 72 horas. Após o período de incubação os poços foram lavados com 100 µL de PBS
e em seguida, foram adicionados 200 µL de solução de vermelho neutro (40 µg/mL
em PBS) em cada poço. As placas contendo as células com o vermelho neutro foram
incubadas por 3h e em seguida, o sobrenadante foi retirado e foram adicionados 200
µL de CaCl2 (1%) em formaldeído (0,5%, v/v). Após cinco minutos, o sobrenadante foi
aspirado e foram adicionados 100 µL de solução álcool ácido (1% v/v de ácido acético
em 50% de álcool etílico absoluto) em cada poço para a solubilização do corante. Em
seguida, a absorbância foi avaliada em leitor de microplacas a 540 nm (FRANÇA,
2008). Este ensaio foi realizado em triplicata.
42
3.9.4 Índice de seletividade
Para determinar o índice de seletividade (IS) foram calculadas as razões entre
as concentrações citotóxicas de cada fração para os esplenócitos e leucócitos
mononucleares humanos e os valores de IC50 atingidos para as linhagens 4T1 e HeLa
em 72 horas de tratamento. Foram comparados os valores de IC50 de linhagens
humanas (leucócitos mononucleares humanos/HeLa) e animais (esplenócitos/4T1)
separadamente. Foi considerado seletivo o tratamento com valor de IS igual ou maior
que 1,0 (SUFFNESS e PEZZUTO, 1991).
3.10 MORFOLOGIA E MORTE CELULAR USANDO FLUORESCÊNCIA
Os estágios de apoptose tardia e inicial foram contados por coloração com
iodeto de protídeo (IP) e laranja de acridina (LA) e examinados por microscopia de
fluorescência.
Para isto, as células 4T1 foram semeadas (2x104 células/poço) em placas
contendo 96 poços com meio de cultura RPMI-1640, suplementado com SBF 10% e
s/p 1%. Para isto, 20 µL desta suspensão de células foram solubilizados em 180 µL
de azul de tripano e adicionado à Câmara de Neubauer para a contagem das células.
Após 24 horas, o meio de cultura suplementado foi retirado, os poços foram
lavados com PBS e foram adicionados meio de cultura com as frações de Bauhinia
nas concentrações de tratamento que proporcionaram IC50 pelo teste usando MTT.
Assim, as frações ID7, IA19 e IID10 foram aplicadas nas concentrações: 25 µg/mL, 50
µg/mL e 25 µg/mL (1% de DMSO), respectivamente. Após 72 horas de tratamento, o
meio contendo os extratos foi aspirado, as células foram lavadas com PBS e
tripsinizadas com 40 µL de tripsina por poço. Em seguida, as células foram
centrifugadas a 2000 rpm por 5 minutos, ressuspendidas em 50 µL e PBS e coradas
com 10 µL de Iodeto de Propídeo (IP 10 µg/mL) e 10 µL de Laranja de Acridina (LA
10 µg/mL). Também foi aplicado Cisplatina (30 µg/mL) como controle positivo. As
células coradas foram aplicadas em lâminas de vidro e a morfologia das células foi
avaliada utilizando microscópio de fluorescência usando o filtro FITC e aumento de
43
400X. Foram obtidas 20 imagens em campos aleatórios e as células presentes foram
contadas. As células foram classificadas em viáveis, em apoptose inicial ou em
apoptose tardia. Para o cálculo de porcentagem em cada uma das etapas, foi
realizada regra de três simples considerando o número total de células encontradas
como 100%. O corante Iodeto de Propídeo é um marcador nuclear utilizado para
distinguir células em apoptose tardia. Como apresenta alto peso molecular, o IP
somente penetra em células que apresentam alterações na permeabilidade da
membrana, evento este que ocorre nos estágios finais da apoptose. Assim, a
marcação de vermelho alaranjado do IP foi considerada representativa de apoptose
tardia (DELPHI et al., 2015). O Laranja de Acridina marca as células em verde, sendo
que as células viáveis aparecem com núcleos esféricos, brilhantes e bem delimitados,
e por fim, as células em apoptose inicial apresentam fragmentos e vacúolos (BEHZAD
et al., 2016). Este ensaio foi realizado em duplicata.
3.11 MIGRAÇÃO CELULAR PELO ENSAIO DE FECHAMENTO DE FERIDA
Para avaliar o potencial dos extratos selecionados em inibir a migração celular,
as células da linhagem 4T1 foram adicionadas em placas de 24 poços (5x105 células
por poço) em meio de cultivo RPMI-1640 suplementado com 10% de SFB e 1% de s/p
e deixadas para aderir por 24 horas. Para isso 20 µL da suspensão de células
tripsinizadas foram solubilizados em 180 µL de azul de tripano e adicionado em
Câmara de Neubauer para a contagem das células a serem adicionadas em cada
poço. Após atingir 95% de confluência, as células foram lavadas com PBS e duas
feridas foram produzidas na monocamada de cada poço a partir da raspagem com
uma pipeta de plástico estéril (p100) (figura 6).
44
Figura 6: Esquema de produção de ferida para ensaio de migração usando células.
Fonte: LOPES, 2015.
As concentrações de tratamento utilizadas foram aquelas capazes de
proporcionar IC50 nos testes de MTT em 72 horas. As imagens das feridas após 0, 12,
24, 48 e 72 horas foram capturadas, sempre na mesma região da ferida, utilizando
microscópio invertido AXIO VERT A1 FL (CARL ZEISS®) com aumento de 400x e a
porcentagem de fechamento das feridas foi calculada pela seguinte fórmula:
Porcentagem de fechamento de feridas (%) = 100 (A - B) / A
Onde A é a largura das feridas antes da incubação, e B é a largura das feridas
após a incubação das células (MARTINHO et al., 2015). Este ensaio foi realizado em
duplicata.
3.12 MIGRAÇÃO CELULAR USANDO INSERTOS BOYDER CHAMBER
Com a intenção de avaliar a migração das células por quimiotaxia, foi realizado
o teste de migração Boyder chamber. Para isso, as células 4T1 foram tripsinizadas e
contadas com auxílio do corante azul de tripano e Câmara de Neubauer. Em seguida,
foram adicionadas 4x104 células em cada inserto.
45
Em cada poço de uma placa de 24 poços foi depositado um inserto com poros
de 5 µm e dentro de cada inserto foram adicionados 250 µL do preparado de células
com o meio de cultura contendo as frações de Bauhinia nas concentrações de IC50
obtidas em 72 horas pelo método de viabilidade celular usando MTT. Em seguida,
foram adicionados 300 µL de meio de cultivo RPMI-1640, contendo 2% de SFB, no
lado externo de cada inserto, para funcionar como quimioatrativo (figura 7). Em
seguida, as células foram incubadas por 24 horas a 37ºC e 5% CO2.
Figura 7: Inserto Boyden Chamber para ensaio de migração.
Fonte: Adaptado de Merck, 2016.
Após 24 horas em incubação, os insertos e os poços foram lavados
cuidadosamente com PBS. Em seguida, foram adicionados 250 µL de metanol dentro
do inserto e 250 µL de metanol dentro do poço (nas laterais do inserto). A placa foi
colocada na câmara fria e aguardados 30 minutos para a fixação das células.
Após o período de fixação, o metanol foi retirado e os poços e os insertos foram
lavados novamente com PBS. Em seguida, foram adicionados 250 µL de azul de
toluidina (1% m/v de azul de toluidina e 1% de tetraborato de sódio m/v diluído em
PBS) e aguardados 30 minutos em temperatura ambiente para a coloração. O lado de
dentro dos insertos foi limpo com o auxílio de hastes com pontas de algodão para
retirar as células que não migraram. Finalmente, imagens dos insertos foram obtidas
utilizando câmara fotográfica acoplada a um microscópio invertido (CARL-ZEISS®) em
46
aumento de 200X e as células foram contadas manualmente. Este ensaio foi
realizado, em duplicata.
3.13 ENSAIO DE INVASÃO
3.13.1 Montagem dos insertos
A Matrigel é uma mistura de proteínas comercializadas que se assemelha ao
ambiente extracelular encontrado em muitos tecidos e é usada junto ao sistema
Boyden chamber (poros de 5 µm) para mimetizar a invasão metastática de células
tumorais. Para o preparo da Matrigel, 1100 µL de PBS gelado foram adicionados à
220 µL de Matrigel. Em seguida, em uma placa de 24 poços, foram depositados um
inserto em cada poço e dentro de cada inserto foram adicionados 80 µL da Matrigel.
Após 30 minutos, foram adicionados, dentro de cada inserto, 250 µL da solução de
células contendo a diluição das frações (4x104 de células 4T1 por inserto). Para isso,
20 µL desta suspensão de células foram solubilizados em 180 µL de azul de tripano e
adicionados à Câmara de Neubauer para a contagem das células. Em seguida, foram
adicionados 300 µL de meio RPMI-1640 com 2% de SFB do lado externo dos insertos,
para agir como quimioatrativo (figura 8). Após isto, as células foram incubadas por 24
horas a 37ºC, 5% CO2.
47
Figura 8: Inserto Boyden Chamber com Matrigel para ensaio de invasão.
Fonte: Adaptado de Merck, 2016.
3.13.2 Fixação das células
Após 24 horas em incubação, o sobrenadante e a Matrigel dentro dos insertos
foram retirados usando hastes com pontas de algodão. Os insertos e os poços foram
lavados cuidadosamente com PBS. Após lavados foram adicionados 250 µL de
metanol dentro dos insertos e 250 µL de metanol dentro dos poços. A placa foi
colocada na câmara fria e aguardados 30 minutos para a fixação das células.
3.13.3 Coloração
Após o período de fixação o metanol foi retirado e os poços e os insertos foram
lavados novamente com PBS. Em seguida, foram adicionados 250 µL de azul de
toluidina. A coloração ocorreu por 30 minutos em temperatura ambiente e
posteriormente, os insertos foram lavados com PBS para a retirada do excesso de
corante. Por fim, imagens das células que realizaram invasão foram obtidas em
48
microscópio óptico invertido (CARL ZEISS®) e contadas manualmente. Este ensaio foi
realizado em duplicata.
3.14 ENSAIO DE ADESÃO CELULAR
Em cada poço de uma placa de 96 poços foram aplicados 100 µL de solução
das moléculas de adesão colágeno I (0,08 µg/mL), colágeno IV (0,04 µg/mL),
fibronectina (0,04 µg/mL) e laminina (0,04 µg/mL), sendo que colágeno I e IV foram
diluídos em ácido acético (PA) e a laminina e a fibronectina foram diluídas em PBS. A
placa foi deixada na câmara fria durante a noite. No outro dia, os poços foram
bloqueados com BSA a 1% (100 µL/poço) durante 1 h, a 37 °C. Após a incubação, o
BSA foi removido e os poços foram lavados por três vezes com 200 µL/poço de PBS.
As frações ID7, IA19, IID10 e IIIA32 de Bauhinia foram incubadas com as células 4T1
(5x104 células por poço) em meio RPMI-1640 contendo 2% SFB durante 30 min e à
temperatura ambiente. Para isto 20 µL desta suspensão de células foram solubilizados
em 180 µL de azul de tripano e adicionado em Câmara de Neubauer para a contagem
das células. Foram utilizadas as concentrações que proporcionaram a IC50 no teste
de viabilidade celular usando o MTT em 72 horas. Em seguida, as suspensões
celulares contendo as frações foram adicionadas aos poços e incubadas por 3 h.
Subsequentemente, as células não aderentes foram removidas por lavagem com PBS
(100 µL/poço), e as células aderentes foram fixadas com metanol PA (100 µL/poço)
durante 5 min e coradas com azul de toluidina 1% (100 µL/poço), por 5 min. As células
foram lavadas por quatro vezes com PBS (200 µL/poço), e o corante retido pelas
células foi liberado, por lise das células, através da incubação com solução de SDS
1%, durante 20 min, a 37°C. As absorbâncias foram mensuradas em
espectrofotômetro à 620 nm. Este ensaio foi realizado em duplicata.
49
3.15 ANÁLISE DE GELATINASES NO SOBRENADANTE CELULAR
3.15.1 Coleta do sobrenadante
As células 4T1 foram plaqueadas (5x105 células/poço) em placas de 24 poços
até atingir 90% de confluência. Posteriormente as frações de Bauhinia ID7, IID10, IA19
e IIIA32 foram aplicadas nas concentrações de IC50 obtidas pelo teste de viabilidade
celular usando MTT (25 µg/mL; 50 µg/mL; 75 µg/mL; 100 µg/mL, respectivamente) e
permaneceram por 24 horas. O controle consistiu do veículo de diluição dos extratos
(meio de cultura RPMI-1640 com 1% de DMSO). Após este período, o sobrenadante
foi coletado e mantido refrigerado.
3.15.2 Zimograma
Foram realizados dois minis géis de poliacrilamida, 7,5% e gelatina 0,2% (TRIS
HCl 8,8, 1,5 M), copolimerizado com dodecil sulfato de sódio (SDS). A eletroforese
(BioRad Protean II®) foi realizada em condições não redutoras (0,025 M de Tris-
hidroximetil-aminometano (Tris), 0,192 M de glicina e 0,1% de SDS (pH 8,5), a 125 V
constantes por 2,5 h, a 4°C. Após a eletroforese, os géis foram lavados durante uma
hora, sob agitação constante em solução de Triton X-100 (2,0 g%, m/v) para remoção
do SDS e, em seguida, submersos em tampão de ativação (0,05 M Tris-HCl, CaCl2
0,6 g%, m/v, pH 8,0), também sob agitação durante 18 horas, à temperatura ambiente.
Logo após os géis foram corados (azul de Comassie R-250 0,25%, metanol 45% e
ácido acético 10%) durante uma hora e descorados (etanol 30%, ácido acético10%
em água destilada, v/v) durante uma hora. Os zimogramas foram realizados em
duplicata.
Os géis obtidos nas eletroforeses, foram digitalizados em um scanner de mesa e
analisados pelo software Image J. O contraste das bandas claras no fundo escuro do
gel demostram a atividade gelatinolítica das gelatinases e foram quantificadas em
pixels pelo mesmo programa.
50
A fórmula utilizada para calcular a inibição foi:
Inibição % = [(100% × a) ÷ b] − c
a = resultado da análise enzimática da fração
b = resultado da análise enzimática do controle
c = percentual de atividade do controle
3.16 ANÁLISE DE ÓXIDO NÍTRICO (ON)
As células 4T1 foram plaqueadas em um número de 1x105 células/poço em
uma placa de 24 poços. Em seguida, em cada poço foi adicionado 1 mL de meio
RPMI-1640 (2% SFB) contendo uma das frações de Bauhinia. Foram utilizadas as
concentrações que proporcionarem IC50 no teste de viabilidade celular. As células
foram incubadas a 37ºC e 5% de CO2, por 24 horas. Após este período, as dosagens
de ON foram realizadas utilizando-se o sistema Nitric Oxide Analyser (NOATM 280i-
Sievers), que emprega o método de quimiluminescência pela conversão de nitrato ou
nitrito a óxido nítrico. Após o tratamento das células com as frações de Bauhinia, 20
μL do sobrenadante, mantido em condições refrigeradas e em presença de um agente
redutor (1% p/v de iodeto de sódio em ácido acético glacial), foram utilizados para
dosagem de NO. A reação do ozônio com o iodeto de sódio emite fótons de luz
vermelha, que são detectados pelo sistema. A concentração de ON foi calculada por
comparação com uma curva com concentrações conhecidas de NaNO3-. Este ensaio
foi realizado em duplicata.
3.17 AVALIAÇÃO DA EXPRESSÃO DE PROTEÍNAS DE MORTE CELULAR POR
WESTERN BLOT
As células 4T1, em meio de cultivo RPMI-1640, foram tratadas por 24 horas
com ID7 nas concentrações de 15, 25 e 40 μg/mL e com Cisplatina nas concentrações
51
de 15 e 20 μg/mL. Após esse período, as células foram lisadas com um tampão
contendo 50 mM de Tris, pH 7, 150 mM de NaCl, 5 mM de EDTA, 1 mM de Na3VO4,
10 mM de NaF, 10 mM de pirofosfato de sódio, 1% de NP-40 e solução de inibidores
de protease contendo 10 μg/mL de Leupeptina e Aprotinina, 1mM de DTT e PMSF e
0,01 M de EDTA, e então incubadas no gelo por 1 hora. Em seguida as amostras
foram submetidas à centrifugação a 13000 rpm, a 4°C, por 15 minutos. Após a
quantificação das proteínas totais usando o reagente Bradford (SIGMA-ALDRICH),
quantidades semelhantes de proteínas de cada amostra foram utilizadas para o
ensaio de acordo com a protocolo do fabricante (SIGMA-ALDRICH). Para a separação
das proteínas, foi utilizado SDS-PAGE 15% e a corrida foi realizada em sistema
BIORAD por aproximadamente 2 horas, à 110V. Após a eletroforese, as proteínas do
gel foram transferidas (Semi-Dry Transfer Unit, TE 70 PWR, GE Healthcare) para uma
membrana de nitrocelulose (Amersham Protram, 0,45 μm NC, GE Healthcare)
utilizando o tampão com 25 mM de Tris, 193 mM de glicina e 20% de metanol (v/v).
Posteriormente, o bloqueio da membrana foi realizado em tampão TBST 1X (Tris-HCl,
pH 7.6, Tween 20 0,1%) com 5% de leite Molico®, por 1 hora, à temperatura ambiente
e então a membrana foi lavada por imersão e agitação com TBST 1X. Logo após a
lavagem, as membranas foram incubadas com o anticorpo primário diluído em TBST
1X contendo 5% de BSA (SIGMA-ALDRICH) durante 1 hora, sob agitação e então a
membrana foi lavada 3 vezes com TBST 1X por 5 minutos. Foram avaliadas as
expressões de PARP clivada e total (#4967), caspase-8 clivada e total (#9746) e
caspase-7 clivada e total (#9492). Todos os anticorpos foram diluídos e incubados, de
acordo com as recomendações do fabricante (1/1000, v/v). Após a lavagem com TBS-
T, as membranas foram incubadas com o anticorpo secundário, conjugado com
peroxidase (#7074) diluído à uma proporção de 1:5000 (v/v). Em seguida, a
membrana foi revelada por quimiluminescência (ECL, Western Blotting detective
reagents, RPN2109; GE Healthcare, Piscataway, NJ) e posteriormente, as
membranas foram fotografadas usando ImageQuant LAS 4000 mini (GE Healthcare).
Todas os testes ocorreram em triplicata e a normalização foi realizada utilizando a
proteína endógena β-actina
52
3.18 VIABILIDADE DE CÉLULAS DE CÂNCER DE MAMA HUMANO
A ação da fração ID7 também foi avaliada sobre a linhagem de câncer de mama
humano MCF-7 (uma linhagem não invasiva, hormônio positiva e Her2 negativa)
(LEVENSON e JORDAN, 1997), MDA-MB-231 (linhagem celular invasiva e triplo
negativa) (CAILLEAU et al., 1978) e BT20, considerada Her2 positiva (FRAPPAR et
al., 1989). As células foram plaqueadas (5x103 células/poço) e incubadas por 24 horas
para adquirirem confluência. Em seguida as mesmas foram tratadas, por 24 horas
com 0, 5, 10, 25, 75, 100, 200 e 300 µg/mL de ID7, diluídos em meio de cultura e 0,5%
de SFB. Após este período, o meio de cultura foi retirado e a viabilidade celular foi
quantificada usando o kit CellTiter 96 Aqueous Cell Proliferation Assay (MTS)
(Promega, Madison, WI). Para isso as células foram novamente incubadas por 4
horas. Em seguida foi realizada a leitura em espectrofotometria à 490 nm. Este ensaio
foi realizado em triplicata.
3.19 ENSAIO IN VIVO
Os camundongos utilizados neste trabalho foram alojados, separadamente em
caixas gaiolas autoclaváveis de polipropileno (40 x 45 x 25cm). Receberam água e
ração comercial ad libitum, sob regime de luminosidade (12 horas de luz e 12 horas
sem luz), e foram higienizadas a cada três dias. Todos os animais foram submetidos
a um período de adaptação antes do início do experimento.
Para a indução dos tumores, as células de carcinoma mamário murino (4T1),
estabelecidas em cultura (meio RPMI-1640, 10% SFB) foram inoculadas (4x106
diluídas em 100 µL de meio RPMI-1640) no flanco esquerdo (figura 9) de 16
camundongos BALB/c, pesando aproximadamente 25 gramas.
53
Figura 9: Camundongo com tumor de células 4T1 induzido no flanco esquerdo.
Fonte Santos, 2016.
Foi utilizada a fração que diminuiu a viabilidade das células tumorais, com baixa
toxicidade em células normais. Os animais foram distribuídos em 2 grupos de 8
animais cada: o grupo controle recebeu 100 µL do veículo de diluição do extrato (NaCl
0,9%) e o grupo tratado, recebeu 100 µL da fração ID7 diluída em soro fisiológico na
concentração de 30 mg/kg de peso do animal. Todos os animais receberam os
tratamentos por via intraperitoneal do nono ao vigésimo primeiro dia após a inoculação
do tumor
Após o início do tratamento, a cada dois dias os animais foram pesados e os
tumores mensurados com auxílio de um paquímetro, sendo tomadas as medidas
látero-lateral, crânio caudal e diagonal do tumor. Também foram analisadas as
características físicas de cada animal como pelos levantados, regiões com ausência
de pelos e mobilidade da perna. Após 11 dias de tratamento, os animais foram
eutanasiados por deslocamento cervical e os tumores, pulmões e fígados de todos os
animais foram coletados, pesados e fotografados. Os nódulos nos pulmões e fígados
foram contados macroscopicamente. Após extraídos, os tumores foram mensurados
com paquímetro e o volume avaliado, a partir da quantificação do deslocamento
líquido após imersão em água. Em seguida, os órgãos e tumores foram fixados em
formol e após 24h transferidos e mantidos em etanol 70%.
Todos os testes usando animais foram aprovados pelo Comitê de Ética em
Pesquisa com Animais da Universidade Federal de São João del Rei sob número de
parecer 027/2016 – A (anexo 2).
54
3.20 ANÁLISES HISTOLÓGICAS
Os órgãos e tumores foram processados, incluídos em parafina histológica e
seccionados a 5 micrômetros para a produção de lâminas histológicas. Os tecidos
foram então corados com Hematoxilina de Harris e Eosina alcoólica (H/E) e analisados
à microscopia de luz.
Para a análise dos tumores, foram obtidas 20 imagens aleatórias (mas
seguindo um padrão) por lâmina, no aumento de 400X e analisadas as áreas contendo
necrose usando o software Image J. Para a análise das imagens dos pulmões,
também foram obtidas 20 imagens aleatórias por lâmina no aumento de 400X e
analisadas as áreas de metástase (massa de células tumorais) (REIGSTAD et al.,
2016; YE et al., 2015). Já para a análise das lâminas dos fígados foram obtidas sete
imagens aleatórias por lâmina e mensuradas as áreas de infiltrado inflamatório e/ou
tumoral, sob aumento de 200X e analisadas a presença de células mieloides
supressoras (CMS) (GODDARD et al., 2016; ILKOVITCH e LOPEZ, 2009).
3.21 ESPECTROMETRIA ATÔMICA DE MASSAS – ESI-
Para identificar os compostos presentes na fração ID7, que foi utilizada para o
ensaio in vivo, dissolveu-se 10 µL deste extrato em 1000 µL de solução de acetonitrila.
O extrato foi diretamente infundido com taxa de fluxo de 4.0 L/min-1 em um injetor ESI
(-). Foi utilizado espectrômetro de massas (modelo 9.4 T Solarix, BrukerDaltonics,
Bremen, Alemanha) do Laboratório de Petróleo da Universidade Federal do Espírito
Santo. O equipamento foi ajustado para o modo ión negativo, ESI (-) sobre um
intervalo de massa (M/z) de 150-1500. As condições da fonte foram pressão de gás
nebulizador de 1,5 bar, voltagem capilar de 3,9kV e temperatura capilar de
transferência de 200ºC. A acumulação de íons foi em 0,010s. Os espectros de massas
foram obtidos acumulando 64 varreduras de sinais transientes em quatro conjuntos
de dados de mega-pontos no domínio do tempo. Todos os espectros de massa foram
calibrados externamente utilizando NaTFA (m/z de 200 a 1200). A precisão de massa
utilizada foi de <5 ppm. Os espectros de massa foram adquiridos e processados
55
utilizando o software DataAnalysis (BrukerDaltonics, Bremen, Alemanha). As
composições elementares dos compostos foram determinadas medindo os valores
m/z. As estruturas propostas para cada fórmula foram atribuídas utilizando o banco
de dados Chemspider (www.chemspider.com). O grau de insaturação para cada
molécula foi deduzido diretamente de seu valor de DBE de acordo com equação: DBE
= c - h / 2 + n / 2 + 1, onde c, h e n são os números de átomos de carbono, hidrogênio
e nitrogênio, respectivamente, na formulação molecular (BALIANO et al., 2016).
3.22 ANÁLISE ESTATÍSTICA
As análises estatísticas para comparações únicas foram realizadas pelo teste t
de Student e as diferenças entre os grupos foram testadas usando o teste de
comparação múltipla ANOVA One Way usando o programa GraphPad Prims versão
7 p <0,05. Todos os resultados foram submetidos ao teste de normalidade Shapiro-
Wilk com p> 0,05.
56
4. RESULTADOS
Nesse trabalho, foram avaliadas as ações de ID7, IA10, IID10 e IIIA32 sobre a
viabilidade de células tumorais de câncer de mama murino (4T1), adenocarcinoma
cervical humano (HeLa) e sobre as células não tumorais esplenócitos murinos e
leucócitos mononucleares humanos, pelo método usando MTT. Com os valores de
IC50 obtidos nesses testes também foram determinados os Índices de Seletividades
das frações ID7, IA10, IID10 e IIIA32 às células tumorais. A fim de elucidar as
possíveis vias da perda da viabilidade celular, os ensaios usando vermelho neutro e
azul de tripano também foram realizadas com as células 4T1. Para confirmar esses
resultados, as atividades das frações de Bauhinia sobre a morfologia e perda de
viabilidade também foram mensuradas usando os corantes fluorescentes Iodeto de
Propídeo e Laranja de Acridina. Em seguida, foram avaliadas as atividades das
frações de Bauhinia sobre os mecanismos presentes na metástase, através dos
ensaios in vitro, como o teste de migração celular por fechamento de ferida e por
quimiotaxia (Boyden Chamber), ensaio de invasão celular usando Matrigel e ensaio
de adesão celular à componentes da matriz extracelular. Tendo em vista que as
frações usadas neste trabalho são capazes de inibir totalmente a atividade de
metaloproteinase-2 e metaloproteinase-9 in vitro (resultados realizados em estudo
prévio), e que estas enzimas são fundamentais para os processos de migração e
invasão, foi verificada a ação destas frações sobre as gelatinases (MMP-2 e MMP-9)
presentes no sobrenadante celular. O óxido nítrico presente no sobrenadante celular
também foi quantificado. Em seguida a fração mais seletiva foi selecionada para os
demais ensaios. Foram quantificadas as proteínas envolvidas com a via de morte
celular caspase-7, caspase-8 e PARP em células 4T1 tratadas com a fração mais
seletiva assim como a ação desta fração sobre a viabilidade de linhagens de câncer
de mama humanos MDA-MB-231, MCF-7 e BT-20. Para avaliar a ação da fração
selecionada sobre a progressão tumoral em modelo in vivo, as células 4T1 foram
inoculadas nos flancos de camundongos BALB-c e estes foram tratados com a fração
por 11 dias. Foram avaliados o crescimento tumoral, e o peso dos animais. Após o
tratamento os animais foram eutanasiados e os tumores, pulmões e fígados foram
coletados. Foi avaliada a ação da fração sobre a metástase para o pulmão e para o
57
fígado. Por fim, a fração selecionada foi caracterizada por espectrometria atômica de
massas.
4.1 AS FRAÇÕES ID7, IA19, IID10, E IIIA32 DIMINUEM A VIABILIDADE DAS
CÉLULAS 4T1 E HELA PELO MÉTODO USANDO MTT
O ensaio de viabilidade celular pelo método usando o MTT avalia a viabilidade
das células a partir da diminuição da atividade de enzimas mitocondriais. A fração ID7
foi pouco citotóxica para as linhagens 4T1 e HeLa em 24 horas de tratamento, não
monstrando diferença significativa de porcentagem de células viáveis em comparação
com as células do controle para 4T1 (figura 10A). Para HeLa, ID7 alcançou diferença
significativa apenas nas concentrações 50 e 75 µg/mL (figura 10B). Em 48 e 72 horas
de tratamento, a fração ID7 apresentou atividade citotóxica sobre as células 4T1 de
forma dose dependente, com IC50 de 29,93 µg/mL em 48 horas e 23,47 µg/mL em 72
horas de tratamento (figura 10A). Já para a linhagem HeLa, apresentou toxicidade em
72 horas de tratamento, com IC50 de 23,02 µg/mL (figura 10B).
58
Figura 10: Viabilidade de células tumorais tratadas com ID7, através do teste usando
MTT. As células 4T1 e HeLa foram plaqueadas (2x104 células/poço) em placas de 96
poços e após 24 horas, foram tratadas com ID7 nas concentrações 5, 10, 25, 50, 75
e 100 µg/mL, por 24, 48 e 72 horas. A viabilidade das células foi mensurada pela
metabolização do MTT, através de espectrofotometria (570 nm). Controle: 1% de
DMSO. A: Células 4T1; diferença significativa em 48 e 72h com p=0,0001. B: Células
HeLa; diferença significativa em 24h com p=0,0017 e 72h com p=0,0001. Cada coluna
representa a media ± d.p. de 3 experimentos independentes (ANOVA One Way).
A
B
A fração IA19 também foi citotóxica sobre as células 4T1 de forma dose
dependente em 48 e 72 horas de tratamento, apresentando IC50 de 39,20 µg/mL, em
48 horas e IC50 de 33,70 µg/mL em 72 horas (figura 11A). Quanto à linhagem HeLa,
He
La
4
T1
59
a fração IA19 apresentou atividade citotóxica significativa em 72 horas de tratamento,
com IC50 de 55,59 µg/mL (figura 11B).
Figura 11: Viabilidade de células tumorais tratadas com IA19, através do teste usando
MTT. As células 4T1 e HeLa foram plaqueadas (2x104 células/poço) em placas de 96
poços e após 24 horas foram tratadas com IA19 nas concentrações 5, 10, 25, 50, 75
e 100 µg/mL, por 24, 48 e 72 horas. A viabilidade das células foi mensurada pela
metabolização do MTT, através de espectrofotometria (570 nm). Controle: 1% de
DMSO. A: Células 4T1; diferença significativa em 48 e 72h com p=0,0001. B: Células
HeLa; diferença significativa em 72h, p=0,001. Cada coluna representa a media ± d.p.
de 3 experimentos independentes (ANOVA One Way).
A
B
4T
1
He
La
60
A fração IID10, em 24 horas de tratamento, apresentou ação citotóxica sobre a
linhagem 4T1 nas concentrações de 5, 10 e 25 µg/mL e para a linhagem HeLa nas
concentrações de 75 e 100 µg/mL com diferenças significativas com p=0,02 e
p=0,0013, respectivamente (figuras 12A e 12B). Já em 48 e 72 horas de tratamento,
foi citotóxica de forma dose dependente sobre as células 4T1 com IC50 de 16,33 µg/mL
e IC50 de 11,10 µg/mL, respectivamente com p=0,0001 (figura 12A). Para a linhagem
HeLa, IID10 atingiu IC50 de 31,85 µg/mL em 72 horas de tratamento (figura 12B).
Figura 12: Viabilidade de células tumorais tratadas com IID10, através do teste
usando MTT. As células 4T1 e HeLa foram plaqueadas (2x104 células/poço) em
placas de 96 poços e após 24 horas foram tratadas com IID10 nas concentrações 5,
10, 25, 50, 75 e 100 µg/mL, por 24, 48 e 72 horas. A viabilidade das células foi
mensurada pela metabolização do MTT, através de espectrofotometria (570 nm).
Controle: 1% de DMSO. A: Células 4T1; diferença significativa em 24h com p=0,02 e
em 48 e 72h com p=0,0001. B: Células HeLa; diferença significativa em 24h e 72 h,
p=0,0013. Cada coluna representa a media ± d.p. de 3 experimentos independentes
(ANOVA One Way).
A
B
4T
1
He
La
61
Já a fração IIIA32, em 72 horas de tratamento, foi capaz de diminuir em 50% a
viabilidade das células 4T1, com IC50 de 82,31 µg/mL (figura 13A). Contudo, essa
fração não foi citotóxica em nenhuma das concentrações utilizadas para a linhagem
HeLa (figura 13B).
Figura 13: Viabilidade de células tumorais tratadas com IIIA32, através do teste
usando MTT. As células 4T1 e HeLa foram plaqueadas (2x104 células/poço) em
placas de 96 poços e após 24 horas foram tratadas com IIIA32 nas concentrações 5,
10, 25, 50, 75 e 100 µg/mL por 24, 48 e 72 horas; A viabilidade das células foi
mensurada pela metabolização do MTT, através de espectrofotometria (570 nm).
Controle: 1% de DMSO. A: Células 4T1; diferença significativa em 24h com p=0,1732,
em 48 p=0,0003 e 72h com p=0,0014. B: Células HeLa; diferença significativa em 72h
p=0,0001. Cada coluna representa a media ± d.p. de 3 experimentos independentes
(ANOVA One Way).
A
B
He
La
62
4.2 O MÉTODO USANDO AZUL DE TRIPANO DETECTOU DIMINUIÇÃO DA
VIABILIDADE DAS CÉLULAS 4T1 QUANDO TRATADAS COM AS FRAÇÕES ID7,
IA19 E IID10
O ensaio usando azul de tripano avalia a viabilidade das células a partir da
integridade da membrana citoplasmática. Após o tratamento das células 4T1 com a
fração IID10, na dose de 5 µg/mL, em 24 h as células não tiveram sua viabilidade
alterada em relação as células do controle (figura 16). Com exceção desta, todas as
frações em todos os tempos e doses utilizadas foram eficazes em diminuir a
viabilidade das células em relação ao controle (figura 14, figura 15 e figura 16).
Figura 14: Viabilidade de células 4T1 tratadas com ID7, através do teste usando azul
de tripano. As células 4T1 foram plaqueadas em placas de 96 poços (2x104
células/poço) e após 24 horas foram tratadas com ID7 nas concentrações 5, 10, 25,
50, 75 e 100 µg/mL, por 24, 48 e 72 horas. Após esses períodos as células foram
tripsinizadas, coradas com azul de tripano e adicionadas à Câmara de Neubauer onde
foram contadas as células não coradas em azul (viáveis) usando o aumento de 400X.
Controle: 1% de DMSO. Diferença significativa em 24h com p=0,0030, em 48h com
p=0,0002 e em 72h com p=0,0001. Cada coluna representa a media ± d.p. de 3
experimentos independentes (ANOVA One Way).
63
Figura 15: Viabilidade de células 4T1 tratadas com IA19, através do teste usando azul
de tripano. As células 4T1 foram plaqueadas em placas de 96 poços (2x104
células/poço) e após 24 horas foram tratadas com IA19 nas concentrações 5, 10, 25,
50, 75 e 100 µg/mL, por 24, 48 e 72 horas. Após esses períodos as células foram
tripsinizadas, coradas com azul de tripano e adicionadas à Câmara de Neubauer onde
foram contadas as células não coradas em azul (viáveis), usando o aumento de 400X.
Controle: 1% de DMSO. Diferença significativa em 24h com p=0,0061, em 48h com
p=0,0001 e em 72h com p=0,0001. Cada coluna representa a media ± d.p. de 3
experimentos independentes (ANOVA One Way).
64
Figura 16: Viabilidade de células 4T1 tratadas com IID10, através do teste usando
azul de tripano. As células 4T1 foram plaqueadas em placas de 96 poços (2x104
células/poço) e após 24 horas foram tratadas com IID10 nas concentrações 5, 10, 25,
50, 75 e 100 µg/mL, por 24, 48 e 72 horas. Após esses períodos as células foram
tripsinizadas, coradas com azul de tripano e adicionadas à Câmara de Neubauer onde
foram contadas as células não coradas em azul (viáveis), usando o aumento de 400X.
Controle: 1% de DMSO. Diferença significativa em 24h com p=0,0006, em 48h com
p=0,0001 e em 72h com p=0,0001. Cada coluna representa a media ± d.p. de 3
experimentos independentes (ANOVA One Way).
4.3 AS FRAÇÕES ID7, IA19, IID10, E IIIA32 NÃO ATINGEM IC50 NO TRATAMENTO
DAS CÉLULAS 4T1 ATRAVÉS DO ENSAIO USANDO VERMELHO NEUTRO
O teste usando o vermelho neutro, que avalia a viabilidade das células a partir
da incorporação do corante nos lisossomos celulares, mostrou que nenhuma das
frações testadas diminuíram, de forma significativa (p<0,05), a viabilidade das células
4T1 em 24 horas de tratamento (figuras 17, 18, 19, e 20). Já em 48 horas de
tratamento, apenas a fração ID7 diminuiu a viabilidade das células nas concentrações
de 75 e 100 µg/mL (figura 17), porém sem atingir IC50. As demais frações, IA19, IID10
e IIIA32 não apresentaram diferença significativa de viabilidade celular em 48h de
tratamento (p<0,05) (figuras 18, 19 e 20). Em 72 horas de tratamento, as frações IA19
e IID10 diminuíram a viabilidade das células nas doses 10, 25, 50, 75 e 100 µg/mL
65
(figuras 18 e 19, respectivamente), e a fração IIIA32 nas concentrações de 25, 50, 75
e 100 µg/mL (figura 20) e ID7 nas concentrações 25, 75 e 100 µg/mL (figura 17),
porém nenhuma das frações testadas alcançou a IC50.
Figura 17: Viabilidade de células 4T1 tratadas com ID7, através do teste usando
vermelho neutro. As células 4T1 foram plaqueadas (2x104 células/poço) em placas de
96 poços e após 24 horas foram tratadas com ID7 nas concentrações 5, 10, 25, 50,
75 e 100 µg/mL por 24, 48 e 72 horas. Em seguida a viabilidade das células foi
avaliada pela captação de vermelho neutro, mensurada por espectrofotometria (540
nm). Controle: 1% de DMSO. Diferença significativa em 48h p=0,0049 e em 72h com
p=0,0167. Cada coluna representa a media ± d.p. de 3 experimentos independentes
(ANOVA One Way).
66
Figura 18: Viabilidade de células 4T1 tratadas com IA19, através do teste usando
vermelho neutro. As células 4T1 foram plaqueadas (2x104 células/poço) em placas de
96 poços e após 24 horas foram tratadas com IA19 nas concentrações 5, 10, 25, 50,
75 e 100 µg/mL por 24, 48 e 72 horas. Em seguida a viabilidade das células foi
avaliada pela captação de vermelho neutro, mensurada por espectrofotometria (540
nm). Controle: 1% de DMSO. Diferença significativa em 72h com p=0,0002. Cada
coluna representa a media ± d.p. de 3 experimentos independentes (ANOVA One
Way).
67
Figura 19: Viabilidade de células 4T1 tratadas com IID10, através do teste usando
vermelho neutro. As células 4T1 foram plaqueadas (2x104 células/poço) em placas de
96 poços e após 24 horas foram tratadas com IID10 nas concentrações 5, 10, 25, 50,
75 e 100 µg/mL por 24, 48 e 72 horas. Em seguida a viabilidade das células foi
avaliada pela captação de vermelho neutro, mensurada por espectrofotometria (540
nm). Controle: 1% de DMSO. Diferença significativa em 72h com p=0,0001. Cada
coluna representa a média ± d.p. de 3 experimentos independentes (ANOVA One
Way).
68
Figura 20: Viabilidade de células 4T1 tratadas com IIIA32, através do teste usando
vermelho neutro. As células 4T1 foram plaqueadas (2x104 células/poço) em placas de
96 poços e após 24 horas foram tratadas com IIIA32 nas concentrações 5, 10, 25, 50,
75 e 100 µg/mL por 24, 48 e 72 horas. Em seguida a viabilidade das células foi
avaliada pela captação de vermelho neutro, mensurada por espectrofotometria (540
nm). Controle: 1% de DMSO. Diferença significativa em 72h com p=0,0137. Cada
coluna representa a media ± d.p. de 3 experimentos independentes (ANOVA One
Way).
4.4 AS FRAÇÕES ID7, IA19 E IID10 DIMINUEM A VIABILIDADE DAS CÉLULAS
4T1 COM IC50 MAIS BAIXOS PELO MÉTODO USANDO AZUL DE TRIPANO
A análise dos valores de IC50 obtidos nos testes de viabilidade celular
mostraram que a fração IIIA32 não atingiu IC50 em nenhum dos ensaios realizados.
Pelo ensaio usando MTT foi verificado que todas as frações testadas somente
apresentaram IC50 após 48 ou 72 horas de tratamento da linhagem 4T1, e com
exceção de IID10, apenas em 72 horas quando testados sobre a linhagem HeLa. O
ensaio de viabilidade celular usando o azul de tripano mostrou valores de IC50 mais
baixos em relação ao ensaio usando MTT. As frações não atingiram IC50 pelo ensaio
usando vermelho neutro (tabela 2).
69
TABELA 2 - valores de IC50 obtidos pelos testes de toxicidade
MTT Azul de tripano
4T1 HeLa 4T1
24h 48h 72h 24h 48h 72h 24h 48h 72h
ID7 nd 29,93 23,47 nd nd 23,02 nd nd <5
IA19 nd 39,20 33,70 nd nd 55,59 7,44 0,45 1,77
IID10 nd 16,33 11,19 96,14 nd 31,85 14,48 5,36 4,65
IIIA32 nd nd nd 82,31 nd nd
nd: valor não determinado
4.5 A FRAÇÃO ID7 É A MAIS SELETIVA SOBRE A VIABILIDADE DAS CÉLULAS
TUMORAIS.
As frações que apresentaram IS maior que 1 foram consideradas seletivas para
a linhagem tumoral. Assim, a fração ID7 foi considerada seletiva para a linhagem HeLa
e para a linhagem 4T1. Já as frações IID10 e IIIA32 foram seletivas para a linhagem
4T1. A fração IA19 não foi considerada seletiva às células tumorais (tabela 3). Assim,
a fração ID7 foi selecionada para os demais testes pois, além de apresentar
seletividade foi a fração que apresentou maior rendimento em massa, possibilitando
a execução dos demais ensaios.
70
TABELA 3 – Índice de seletividade de frações de Bauhinia às células tumorais em
72 horas de tratamento.
4T1 HeLa
Fração IS
Esplenócitos
IS
Mononucleares
ID7 2,26735905 1,284100782
IA19 0,262726383 0,639863285
IID10 1,670217299 0,255855573
IIIA32 3,503127793 0,000340582
4.6 AS FRAÇÕES ID7, IA19 E IID10 INDUZEM APOPTOSE TARDIA E MODIFICAM
A MORFOLOGIA CELULAR
As frações ID7, IA19 e IID10 diminuíram a quantidade de células viáveis
quando comparada ao controle (p=0,0002). Essa atividade foi semelhante aos
resultados obtidos pelo tratamento com a Cisplatina, quimioterápico usado no
tratamento de diversos tipos de neoplasias. Também foi maior a quantidade de
células, tratadas com todas as frações usadas, em apoptose tardia (p=0,0324), de
forma semelhante ao observado nas células tratadas com a Cisplatina. Não foi
observada modificação na quantidade de células, tratadas com as frações de
Bauhinia, em apoptose inicial (figura 21 F). As frações ID7, IA19 e IID10 promoveram
85%, 81% e 84% de células em apoptose.
71
Figura 21: Viabilidade das células 4T1 tratadas com as frações de Bauhinia, a partir
do teste de fluorescência. As células 4T1 foram plaqueadas em placas de 96 poços
(2x104 células/poço) e após 24 horas foram tratadas com DMSO 1%, Cisplatina (30
µg/mL), ID7 (25 µg/mL), IID10 (25 µg/mL) e IA19 (50 µg/mL), durante 72 horas. Após
esse período as células foram tripsinizadas e coradas com 10 µL de Iodeto de
Propídeo (IP 10 µg/mL) e 10 µL de Laranja de Acridina (LA 10 µg/mL). Em seguida as
células foram aplicadas em lâminas de vidro e a morfologia das células foi avaliada
utilizando microscópio de fluorescência (400X). A: imagens fotográficas de células
tratadas com DMSO; B: imagens fotográficas de células tratadas com Cisplatina; C:
imagens fotográficas de células tratadas com ID7; D: imagens fotográficas de células
tratadas com IA19; E: imagens fotográficas de células tratadas com IID10. “cv”: células
viáveis. “ai”: apoptose inicial. “at”: apoptose tardia. F: Porcentagem de células viáveis,
em apoptose inicial e tardia. Diferença significativa em células viáveis com p=0,0002
em células em apoptose tardia com p=0,0324. Cada coluna representa a media ± d.p.
de 3 experimentos independentes (ANOVA One Way).
F
72
4.7 AS FRAÇÕES ID7, IA19, IID10 E IIIA32 DIMINUEM A MIGRAÇÃO DE
CÉLULAS 4T1 IN VITRO.
O teste de migração por fechamento de feridas avalia a capacidade das células
tumorais aderentes em migrar, buscando a confluência no ambiente in vitro. A partir
das fotomicrografias foi possível observar o total fechamento da ferida das células 4T1
do controle em 72 horas tratamento (figura 22A). Os tratamentos com todas as frações
diminuíram a migração das células 4T1 acima de 60%, em 24, 48 e 72 horas de
tratamento quando comparadas ao controle. Em 12 e 24 horas de tratamento a fração
IIIA32 aumentou o tamanho da ferida (figura 22 B).
73
Figura 22: Ensaio de migração por fechamento de ferida de células 4T1. As células
4T1 foram plaqueadas em placas de 24 poços (5x105 células por poço) e após 24
horas foram realizadas feridas nas monocamadas de células. Em seguida foram
adicionadas as frações ID7 (25 µg/mL), IA19 (50 µg/mL), IID10 (25 µg/mL) e IIIA32
(100 µg/mL). Após 12, 24, 48 e 72 horas de tratamento foram capturadas imagens das
feridas e a distância entre as bordas foi mensurada para a realização do cálculo de
fechamento de ferida. Controle: 1% de DMSO. A: fotomicrografias em aumento de
400X. B: Porcentagem de fechamento de ferida comparado ao controle de cada tempo
de tratamento. Diferença significativa com p=0,0001. Cada coluna representa a média
± d.p. de 3 experimentos independentes (ANOVA One Way).
A
B
Po
rce
nta
ge
m d
e f
ech
am
en
to d
e f
eri
da
74
O ensaio de migração Boyden chamber permite que as células migrem por
quimiotaxia (SZATMARY et al., 2015), sendo que, neste trabalho foi utilizado como
quimioatático o SFB. O tempo de tratamento, utilizado para este ensaio, foi
determinado a partir do menor tempo em que os resultados apresentaram diferença
significativa em todas as frações. Assim este ensaio ocorreu por 24 horas. A partir
desta metodologia apenas as frações IID10 e IA19 inibiram a migração das células
4T1 em 65% e 76% respectivamente, em 24 horas de tratamento (figura 23).
75
Figura 23: Ensaio de migração Boyden Chamber de células 4T1. As células 4T1 foram
adicionadas (4x104 células/inserto) à insertos com poros de 5 µm, em placas de 24
poços e tratadas por 24 horas com as frações ID7 (25 µg/mL), IA19 (50 µg/mL), IID10
(25 µg/mL) e IIIA32 (100 µg/mL). Foi usado meio de cultura RPMI-1640, contendo 2%
de SFB como quimioatrativo. Após esse período as células que não migraram foram
retiradas e as membranas dos insertos foram coradas com azul de toluidina.
Posteriormente foram capturadas imagens usando microscópio invertido (200X)
Controle: 1% de DMSO. A: fotomicrografias em aumento de 200X. B: Porcentagem
de células que migraram comparado ao controle de cada tempo de tratamento.
Diferença significativa com p=0,0027 (ANOVA One Way).
A
B
4.8 AS FRAÇÕES ID7, IID10 E IIIA32 DIMINUEM A INVASÃO DE CÉLULAS 4T1 IN
VITRO
O teste de invasão Boyden chamber, usando a Matrigel, mostrou que as
frações ID7, IID10, IIIA32 inibiram a invasão das células 4T1 (55%, 50%, 52%,
76
respectivamente) quando tratadas por 24 horas. A fração IA19 não inibiu a migração
das células de forma significativa quando comparada ao controle (figura 24).
Figura 24: Ensaio de invasão Boyden Chamber de células 4T1. As células 4T1 foram
adicionadas (4x104 células/inserto) à insertos com poros de 5 µm, contendo Matrigel,
em placas de 24 poços e tratadas por 24 horas com as frações ID7 (25 µg/mL), IA19
(50 µg/mL), IID10 (25 µg/mL) e IIIA32 (100 µg/mL). Foi usado meio de cultura RPMI-
1640, contendo 2% de SFB como quimioatrativo. Após esse período as células que
não invadiram foram retiradas e as membranas dos insertos foram coradas com azul
de toluidina. Posteriormente foram capturadas imagens usando microscópio invertido
(200X) Controle: 1% de DMSO. A: fotomicrografias em aumento de 200X. B:
Porcentagem de células que migraram comparado ao controle de cada tempo de
tratamento. Diferença significativa com p=0,0001 (ANOVA One Way).
A
B
77
4.9 AS FRAÇÕES ID7, ID19, IID10 E IIIA32 AUMENTAM A ADESÃO DE CÉLULAS
4T1 ÀS MOLÉCULAS DA MATRIZ EXTRACELULAR, IN VITRO
Todas as frações testadas foram capazes de aumentar a adesão das células
4T1 aos componentes colágeno I, colágeno IV, fibronectina e laminina com diferença
significativa quando comparada a adesão das células do controle (p=0,0001). A
Fração IID10 dobrou a porcentagem de células aderidas em todos componentes
(figura 25).
Figura 25: Porcentagem de células 4T1 viáveis aderidas aos componentes colágeno
I, colágeno IV, fibronectina e laminina. Em cada poço de uma placa de 96 poços foram
adicionados os componentes colágeno I (0,08 µg/mL), colágeno IV (0,04 µg/mL),
fibronectina (0,04 µg/mL) e laminina (0,04 µg/mL). Após a incubação foram
adicionadas as células 4T1 tratadas com ID7 (25 µg/mL), IA19 (50 µg/mL) IID10 (25
µg/mL), e IIIA32 (100 µg/mL) por 24 horas. Após esse período os poços foram lavados
e as células que permaneceram aderidas foram coradas com azul de toluidina. Esse
corante foi quantificado por espectrofotometria (620 nm) Controle: 1% de DMSO.
Diferença significativa com p=0,0001 (ANOVA One Way).
78
4.10 AS FRAÇÕES ID7, IA19, IID10 E IIIA32 DIMINUEM A PRESENÇA DE
GELATINASES ATIVAS NO SOBRENADANTE CELULAR
Devido à complexidade do meio de cultivo de células eucarióticas que contém
diversos nutrientes e metabólitos, as enzimas capazes de degradar a gelatina
presentes no gel de eletroforese não foram totalmente separadas e apareceram como
uma única banda, classificada como banda de gelatinases (figura 26A).
O zimograma do sobrenadante das células 4T1, tratadas com as frações de
Bauhinia, revelou que as frações ID7 e IID10 inibiram a presença de gelatinases ativas
em mais de 86%. O tratamento com as frações IA19 e IIIA32 também inibiram (63% e
70%, respectivamente) a atividade das gelatinases (figura 26B).
Figura 26: Gelatinases ativas presentes no sobrenadante de células 4T1 tratadas com
as frações de Bauhinia. As células 4T1 foram plaqueadas (5x105 células/poço) em
placas de 24 poços e tratadas com as frações ID7 (25 µg/mL), IA19 (50µg/mL) IID10
(25 µg/mL) e IIIA32 (100 µg/mL) por 24 horas. Em seguida o sobrenadante foi coletado
e a atividade gelatinolítica foi mensurada por gel de zimograma em que o contraste
das bandas claras no fundo escuro do gel demostraram a atividade gelatinolítica das
gelatinases. As imagens dos géis foram capturadas e as bandas foram quantificadas
usando o software Image J. Controle: 1% de DMSO. A: zimograma do sobrenadante.
B: Porcentagem de atividade de gelatinases presentes no sobrenadante celular.
Diferença significativa com p=0,0001 (ANOVA One Way).
79
4.11 AS FRAÇÕES ID7, IA19, IID10 E IIIA32 NÃO ALTERAM A LIBERAÇÃO DE
ÓXIDO NÍTRICO DE CÉLULAS 4T1 IN VITRO
A partir da análise de óxido nítrico foi possível observar que os tratamentos com
as frações de Bauhinia não modificaram sua expressão (figura 27).
Figura 27: Teor de óxido nítrico presente no sobrenadante de células 4T1 tratadas
com as frações de Bauhinia. As células 4T1 foram aplicadas (1x105 células/poço) a
poços de placas de 24 poços e tratadas com ID7 (25 µg/mL), IA19 (50 µg/mL), IID10
(25 µg/mL) e IIIA32 (100 µg/mL) por 24 horas. Após esse período o sobrenadante foi
coletado e o óxido nítrico foi dosado por quimioluminescência. Controle: 1%DMSO.
4.12 ID7 ATUA SOBRE A MORTE CELULAR PELA VIA EXTRÍNSICA
A quantificação das proteínas caspase-7 e caspase-8 determinantes da via de
morte celular juntamente com a quantificação de PARP, que demonstra dano celular,
foi realizado por western blot a partir do lisado das células 4T1. As leituras
densitométricas foram normalizadas pela expressão de β-actina e apresentadas como
razão relativa às culturas controle.
Os resultados mostram que a exposição à ID7 proporcionou um aumento
(100%) na proporção de cPARP/PARP, quando usado na concentração de 40 µg/mL
e de cCaspase 7/Caspase (300%) quando na concentração de 25 µg/mL (Figura 34
A, B e C). Além disso, na concentração de 40 μg/mL ID7 aumentou a expressão de
cCaspase8/Caspase 8 (100%), de forma semelhante ao tratamento com Cisplatina
(Figura 34 D).
80
Figura 28: Expressão das proteínas de vias de morte celular em células 4T1 tratadas
com ID7 e Cisplatina. As células 4T1 foram cultivadas em placas de 24 poços com
ID7 nas concentrações de 15, 25 e 40 μg/mL e com Cisplatina nas concentrações de
15 e 20 μg/mL. Após 24 h, na ausência de CMS2, foi realizada a lise celular com
tampão apropriado para isolamento de proteínas totais. Após a eletroforese e
transferência a membrana foi revelada por quimiluminescência. Os resultados foram
normalizados pela expressão de β-actina. Foram avaliadas as expressões de A:
PARPc/PARPp; B: cCaspase7/Caspase7; C: cCaspase8/Caspase8. Diferença
significativa com p=0,001 (ANOVA One Way).
81
4.13 ID7 É SELETIVO PARA LINHAGEM DE CANCER DE MAMA MDA-MB-231
O ensaio de viabilidade célular com as linhagens de câncer de mama MDA-
MB-231, MCF-7 e BT-20 revelou que ID7 é seletivo (IC50 10,2 µg/mL) para a linhagem
MDA-MB-231, uma linhagem caracterizada como triplo negativo (figura 29).
Figura 29: Viabilidade de linhagens de câncer de mama humano tratadas com ID7,
através do teste usando MTS. As células 4T1 foram plaqueadas (5x103 células/poço)
em placas de 96 poços e após 24 horas foram tratadas com ID7 nas concentrações
0, 5, 10, 25, 75, 100, 200 e 300 µg/mL. Após 24 horas de tratamento a viabilidade das
células foi mensurada pela metabolização do MTS, através de espectrofotometria (490
nm). Controle: 1% de DMSO. BT-20: linhagem Her2 positiva. MDA-MB-231: linhagem
triplo negativo. MCF-7: linhagem hormônio positiva, Her2 negativa. Diferença
significativa com p=0,001. Cada coluna representa a média ± d.p. de 3 experimentos
independentes (ANOVA One Way).
4.14 A FRAÇÃO ID7 INIBIU O CRESCIMENTO TUMORAL E A PERDA DE PESO
DOS ANIMAIS INOCULADOS COM 4T1.
As aferições do volume tumoral, realizadas a cada dois dias, mostraram que
ID7 inibiu o crescimento do tumor 4T1 quando comparado ao crescimento do tumor
IC50: 10,2 µg/mL
82
do grupo controle (figura 30 A). A exposição à ID7 também reduziu a perda de peso
destes animais, uma vez que os camundongos do grupo controle, mesmo
apresentaram tumores de volume maior, apresentaram menor peso corpóreo, quando
comparados ao grupo tratado com ID7 (figura 30 B).
Figura 30: Crescimento tumoral e peso, do tumor 4T1 em camundongos. As células
de 4T1 foram inoculadas (4x106 diluídas em 100 µL de meio RPMI-1640) no flanco
esquerdo de camundongos BALB-c. A partir do nono dia após a inoculação os animais
receberam a 100 µL de ID7 por gavagem, 30 mg/kg de peso do animal, diariamente.
Os animais do grupo controle receberam 100 µL do veículo de diluição do extrato
(NaCl 0,9%). Após o início do tratamento, a cada dois dias os animais foram pesados
e os tumores mensurados com auxílio de um paquímetro, sendo tomadas as medidas
látero-lateral, crânio caudal e diagonal do tumor. Os animais também foram pesados
a cada dois dias. Diferença significativa com p=0,001 (ANOVA One Way).
A B
4.15 ID7 DIMINUIU O VOLUME E O PESO DO TUMOR 4T1 RETIRADO DO ANIMAL
Após a eutanásia dos animais os tumores foram extraídos, pesados e o volume
mensurado. Foi possível observar que os tumores dos animais tratados com a fração
ID7 apresentaram menor volume e peso, de forma significativa (com p=0,0204 e
p=0,0354, respectivamente), quando comparados com os tumores do grupo controle
(figura 31)
83
Figura 31: Volume e peso dos tumores extraídos dos camundongos inoculados com
células 4T1. Após 11 dias de exposição à ID7 ou NaCl 0,95% (grupo controle) os
animais foram eutanasiados e os tumores foram retirados e pesados. Os volumes dos
tumores foram mensurados por deslocamento de líquido por imersão em água. A:
imagem dos tumores. B: volume (p=0,0204) e peso dos tumores (p=0,0354). Cada
coluna representa a média dos valores de peso e volume dos tumores dos animais de
cada grupo (ANOVA One Way).
A
B
4.16 ID7 DIMINUIU A ÁREA DE NECROSE DOS TUMORES
As análises histológicas dos tumores mostraram que o grupo controle
apresentou maior área de necrose, do que os tumores do grupo tratado com ID7
84
(figura 32). Acredita-se que a necrose evidenciada nos tumores pode ser
caracterizada como uma necrose coagulativa por hipóxia.
Figura 32: Análise de necrose em tumores 4T1 extraídos de camundongos tratados
com ID7 e grupo controle. Após a extração, os tumores foram processados, incluídos
em parafina histológica e seccionados a 5 micrômetros para a produção de lâminas
histológicas. Os tecidos foram então corados com Hematoxilina de Harris e Eosina
alcoólica (H/E) e analisados à microscopia de luz (400X). Foram mensuradas as áreas
contendo necrose usando o software Image J. A: Cortes histológicos (H/E). B: Área
(µm) de necrose dos tumores *: área de necrose. T: área de massa tumoral. Cada
coluna representa a média das áreas de necrose. Diferença significativa com
p=0,0031 (ANOVA One Way).
A
Controle ID7 (30 mg/kg de peso do animal)
B
85
4.17 ID7 DIMINUIU A METÁSTASE PARA OS PULMÕES
Após a coleta dos pulmões, esses foram fotografados e foi realizada a
contagem de nódulos indicativos de possíveis focos de metástase. A partir dessa
análise foi observado que os pulmões do grupo exposto à ID7 apresentaram um
menor número de focos de metástase, contados macroscopicamente, do que os
pulmões extraídos do grupo controle (figura 33).
Figura 33: Pulmões extraídos de animais inoculados com 4T1. Após 11 dias de
tratamento com ID7 (30 mg/kg de peso do animal) ou NaCl 0,95% (grupo controle) os
animais foram eutanasiados e os pulmões foram retirados. Foram contados os
números de nódulos visíveis macroscopicamente. A: Pulmões extraídos do grupo
controle e do grupo tratado com ID7 apresentando focos de metástase (seta preta).
B: Média do número de metástase presentes nos pulmões do grupo controle e do
grupo tratado com ID7. Diferença significativa com p=0,0239. Cada coluna representa
a média do número de nódulos visualizados macroscopicamente (ANOVA One Way).
86
A análise microscópica, das lâminas coradas por H/E dos pulmões revelou
menor número de focos de metástase com massa tumoral bem definida nos pulmões
tratados com ID7 (figura 34).
Figura 34: Análise de metástases pulmonares dos camundongos com 4T1 do grupo
controle e tratados com ID7. Após a extração, os pulmões foram processados,
incluídos em parafina histológica e seccionados a 5 micrômetros para a produção de
lâminas histológicas. Os tecidos foram então corados com Hematoxilina de Harris e
Eosina alcoólica (H/E) e analisados à microscopia de luz (200X). A: cortes histológicos
dos pulmões (H/E) do grupo controle e tratado com ID7. Focos contendo massa
tumoral estão circulados em preto. B: análise de área contendo massa tumoral
definida. Cada coluna representa a média das áreas de células tumorais nos pulmões.
Diferença significativa com p=0,001. (ANOVA One Way).
A
Controle ID7 (30 mg/kg de peso do animal)
B
87
4.18 ID7 DIMINUI OS FOCOS DE INFILTRADO INFLAMATÓRIO NOS FÍGADOS
As análises histológicas dos fígados não mostraram áreas com massa tumoral
bem definida. Porém, foi evidenciado que a exposição à ID7 diminuiu a área de
infiltrado inflamatório (figura 35A), assim como diminuiu o número de possíveis células
mieloides supressoras no órgão (figura 35B).
88
Figura 35: Análise de infiltrado inflamatório nos fígados de camundongos com tumor
4T1 tratados com ID7 e grupo controle. Após a extração, os fígados foram
processados, incluídos em parafina histológica e seccionados a 5 micrômetros para a
produção de lâminas histológicas. Os tecidos foram então corados com Hematoxilina
de Harris e Eosina alcoólica (H/E) e analisados à microscopia de luz (400X). A: cortes
histológicos contendo possivelmente CMS em destaque (seta preta). B: análise da
área (µm) de focos com infiltrado inflamatório em fígados. C: Análise do número de
possivelmente CMS em fígados. Diferença significativa com p=0,001.
A
B C
89
4.19 CARACTERIZAÇÃO DE CONSTITUINTES DA FRAÇÃO ID7.
O espectro obtido da fração ID7 usando MS-ESI- revelou a presença de sinais
com alta intensidade m/z (figura 36). A análise química destes espectros sugere a
presença de compostos orgânicos como ácidos graxos, diterpenos, flavonoides,
aminoácidos (tabela 4). A região de m/z entre 300 e 350 é referente à componentes
que não fazem parte da fração ID7, possivelmente contaminação por detergente ou
derivados de petróleo. Também foram detectados sinais m/z (225.58247) que não
foram encontradas sugestões de fórmulas moleculares.
Figura 36: Perfil de ID7 por espectrometria de massas MS-ESI- com os sinais de maior
intensidade.
90
TABELA 4 - Moléculas identificadas por MS-ESI- na fração ID7 de Bauhinia
M/z Fórmula Molecular [M-H]-
DBE Erro (ppm)
Possível molécula
225,58247 -
255,23299 [C16H32 O2 -H+]- 1 0,15 Ácido palmítico
281,24866 [C18H34O2 - H+]- 2 0,19 Ácido oleico
283,26433 [C18H36O2 - H+]- 1 0,26 Ácido esteárico
413,19720 [C24H30O6] 10 0,57 Diterpeno
593,12051 [C30H26O13]
18 0,73 Kaempferol
91
5 DISCUSSÃO
As frações ID7, IID10, IA19 e IIIA32, produzidas a partir de caules de três
espécies de Bauhinia, inibem completamente a atividade gelatinolítica das MMP-2 e
MMP-9, in vitro (SANTOS et al., 2015). Assim, neste trabalho foram avaliadas as suas
atividades antitumoral e anti-metastática, tanto in vitro, quanto in vivo. Todas as
frações estudadas diminuíram a viabilidade das linhagens tumorais HeLa e 4T1
utilizando o ensaio MTT, que estima a atividade das desidrogenases mitocondriais.
Esse resultado também foi encontrado, de forma significativa, quando foi utilizado o
ensaio azul de tripano, que avalia a integridade da membrana citoplasmática destas
células. Porém, não foram observadas alterações no metabolismo lisossomal,
verificado pela técnica usando o vermelho neutro. Além disso, estas frações
aumentaram o número de células em apoptose tardia e diminuíram o número de
células viáveis. As frações de Bauhinia usadas nesse trabalho também aumentaram
a adesão das células 4T1 aos componentes de membrana basal (colágeno I, colágeno
IV, fibronectina e laminina), inibiram a migração das células 4T1 pelo ensaio de
fechamento de ferida, além de diminuírem a presença de gelatinases ativas no
sobrenadante destas células. Ademais, as frações IID10 e IA19 diminuíram a
migração celular estimulada por quimiotaxia e as frações IID10 e IIIA32 diminuíram a
invasão celular. Além disso, a fração ID7 aumentou a expressão de proteínas
indutoras de apoptose por via extrínseca e foi seletiva para o câncer de mama humano
do tipo triplo negativo MDA-MB-231. ID7 ainda diminuiu o volume, o peso e área de
necrose dos tumores extraídos dos camundongos inoculados com 4T1. Esta fração
diminuiu o número de metástases pulmonares e de focos inflamatórios no fígado
desses animais (figura 37). Entre as substâncias encontradas nessa fração foram
caracterizados o ácido palmítico, o ácido oleico, o ácido esteárico, um diterpeno e o
Kaempferol.
92
Figura 37: Atividade antitumoral e anti-metastática de ID7.
Como os resultados encontrados neste trabalho, estudos tem mostrado
espécies de Bauhinia com potencial ação antitumoral (CHEW et al., 2014 e
KAEWPIBOON et al., 2012). Mishra et al. (2013) demonstraram que extratos de B.
variegata apresentaram atividade citotóxica em linhagens tumorais DU-145 (próstata),
HOP-62 (pulmão), IGR-OV-1 (ovário), MCF-7 (mama) e THP-1 (leucemia) e que eram
compostos dentre outros, por flavonoides e terpenoides, classe de substâncias
também encontradas em nosso trabalho. Já o estudo de Fang et al. (2010) mostrou
que as lectinas da mesma espécie diminuíram a proliferação da linhagem de câncer
de nasofaringe CNE-1. Com isto, acredita-se que o gênero Bauhinia, que apresenta
mais de 300 espécies em todo o mundo (SILVA e CECHINEL FILHO, 2002), possua
promissores componentes com ação antitumoral.
Atualmente, considera-se como potente atividade antineoplásica as
substâncias que apresentam IC50 ≤ 30 µg/mL (ITHARAT et al., 2004). A fração ID7
apresentou IC50 menor do que este valor, em ambas linhagens tumorais testadas. As
frações IA19 e IID10 também apresentaram IC50 abaixo de 30 µg/mL, mas somente
93
quando testadas sobre as células 4T1. Assim, as frações ID7, IA19 e IID10 foram
selecionadas para os testes de viabilidade celular com azul de tripano e vermelho
neutro.
Estes valores de IC50 ≤30 µg/mL foram alcançados sempre após 72 horas de
tratamento, o que também tem sido observado em outros estudos. TOR et al. (2013)
mostraram que o extrato de acetato de etila de Dillenia suffruticosa apresentou
menores IC50 em células de câncer de mama (MCF-7), nesse tempo de tratamento.
Assim como o extrato de Enicosanthellum pulchrum, que inibiu a proliferação de
células CAOV-3 (câncer humano de ovário) com maior atividade citotóxica (NORDIN
et al., 2015) e o extrato metanólico de Phaleria macrocarpa que apresentou atividade
anti-proliferativa sobre a linhagem de adenocarcinoma ovariano (SKOV-3) (LAY et al.,
2014) quando incubadas neste mesmo tempo. Assim, acredita-se que o tempo de
tratamento de maior eficácia encontrado neste trabalho é compatível com outros
estudos relatados na literatura e com quimioterápicos usados atualmente, o que
viabiliza a sua prospecção. Um bom exemplo é a doxorrubicina, que é um dos
quimioterápicos mais comumente utilizados contra tumores malignos, incluindo o
câncer de mama, e que tem sido empregada através de perfusão por 72 horas, a fim
de diminuir a toxicidade cardíaca sem prejudicar a atividade antitumoral (OGURA,
2001).
O uso de medicamentos à base de plantas com menores efeitos colaterais, mas
com potencial antitumoral, tem se tornado cada vez mais popular (KANNAN et al.,
2015). O índice de seletividade (IS) é um dado que auxilia estes estudos, pois pode
indicar a ação de um potencial agente antitumoral de forma seletiva sobre linhagens
neoplásicas em relação às células não tumorais, determinando a sua toxicidade e
indicando o uso deste extrato para futuros testes clínicos (SUFFNESS e PEZZUTO,
1991). Neste trabalho, dentre as frações testadas, ID7 foi a mais seletiva frente às
células tumorais, uma vez que apresentou IS acima de 1 para as células HeLa, quando
comparada os leucócitos mononucleares humanos, e acima de 2 para a linhagem 4T1
quando comparada com os esplenócitos murinos. Assim como os resultados relatados
neste trabalho, encontram-se na literatura estudos que também apresentam produtos
de origem natural com atividade citotóxica às células tumorais de forma seletiva. Uma
combinação de substâncias naturais apresentou atividade citotóxica altamente
seletiva à linhagem MCF-7, quando comparada à fibroblastos, e esta atividade ocorreu
devido a ação sinérgica dos seus constituintes (NGUYEN e HUYNH 2016). Outro
94
estudo mostrou que o extrato hexânico de Cystoseira tamariscifolia foi citotóxico às
células de hepatocarcinoma HepG2 de forma seletiva a partir de indução de apoptose
(VIZETTO-DUARTE et al., 2016). Assim, por atuar de forma seletiva, a fração ID7
pode ser considerada um potente agente antitumoral com menor potencial de causar
efeitos colaterais.
Atualmente, existe uma variedade de testes que estimam a viabilidade de
células, a partir de diferentes técnicas. A viabilidade celular a partir do método usando
o MTT, detecta células metabolicamente ativas, pois avalia a eficácia das
desidrogenases mitocondriais presentes nestas células em reduzir o sal MTT, que é
amarelo e solúvel, em formazan, que é um sal azul púrpura e insolúvel (RISS et al.,
2013). Por outro lado, danos aos lisossomos diminuem o acúmulo lisossomal do
corante vermelho neutro, pois este é captado e incorporado, por transporte ativo,
apenas nos lisossomos de células viáveis (FOTAKIS e TIMBRELL, 2006), estimando
assim a viabilidade celular por esta via. Já o método por azul de tripano avalia a
integridade da membrana citoplasmática que, quando comprometida, permite a
entrada do corante, marcando as células de azul. Consequentemente, estas técnicas
podem emitir dados distintos sobre o mecanismo de ação de um determinado
tratamento. Por essa razão, autores têm sugerido utilizar mais de um tipo de ensaio
para determinar a viabilidade celular, a fim de melhorar a confiança e evitar a
superestimação ou subestimação da toxicidade de um tratamento (FOTAKIS e
TIMBRELL, 2006), além de direcionar possíveis vias de atividade sobre a viabilidade
celular.
Neste contexto, os índices com maior toxicidade verificados nos resultados
usando MTT e azul de tripano sugerem que as frações de Bauhinia atuem sobre as
células tumorais na diminuição da viabilidade da membrana plasmática e do
metabolismo das mitocôndrias, mas que seu mecanismo de ação pode não influenciar
a via lisossomal (figuras 10 a 20). Assim como nosso trabalho, Masson-Meyers et al.
(2016) também encontraram níveis diferentes de sensibilidade quando comparou
estas três técnicas, apresentando maior sensibilidade quando realizado o ensaio
usando azul de tripano e menor sensibilidade quando usado o ensaio de vermelho
neutro.
Dentre os tipos de mecanismos de morte celular, destacam-se a apoptose e a
autofagia. Em células não tumorais, a autofagia atua na renovação celular,
degradando moléculas e organelas velhas ou defeituosas (TAIT et al., 2014), contudo,
95
acredita-se que no câncer a autofagia atue sustentando a sobrevivência das células
tumorais (WHITE et al., 2015). Entre os mecanismos celulares que evidenciam a
ocorrência de autofagia há a formação de vesículas ácidas e acúmulo de
componentes intracelulares nos lisossomos, formando os chamados autofagossomos
(WHITE et al., 2015). Como neste trabalho não foi verificado o acúmulo nos
lisossomos das células tratadas com frações de Bauhinia (figuras 17 e 20), acredita-
se que estas frações possam estar provocando a morte celular de 4T1, por outras vias
que não pela inibição da via autofágica.
Outro evento extremamente regulado de morte celular é a apoptose. Existem
dois mecanismos que podem desencadeá-la: a via intrínseca, conhecida como via
mitocondrial e a via extrínseca, que é dependente de receptores de superfície celular
(MCILWAIN et al., 2013). Como os resultados deste trabalho mostraram a perda da
viabilidade de membrana plasmática e a diminuição do metabolismo mitocondrial,
acredita-se que as frações de Bauhinia possam atuar sobre a viabilidade das células
4T1 a partir de algum evento de morte celular por apoptose. Atualmente sabe-se que
diversas linhagens tumorais são capazes de desenvolver rotas para evitar a apoptose
a fim de sobreviver (HANAHAN e WEINBERG, 2011). Assim, a indução da apoptose
em células tumorais pode ser um método de tratamento promissor na terapia do
câncer. Neste contexto, os produtos de origem natural têm sido cada vez mais
utilizados devido à sua capacidade de modulação desta via de morte celular (FULDA
et al., 2010).
A apoptose é uma forma de morte celular fisiológica ou patológica e pode ser
caracterizada por várias formas, incluindo o encolhimento celular, a condensação da
cromatina, a ativação das caspases entre outras proteínas, o rearranjo dos lipídios da
membrana e a fragmentação celular e do DNA. (SHIN et al., 2017). Deste modo, a fim
de investigar por qual via ocorreu a morte das células 4T1, induzidas pela fração ID7,
foram avaliadas as expressões de proteínas envolvidas na regulação da morte celular.
Na maioria das células as caspases são amplamente expressas em uma forma
inativa e uma vez ativadas podem acionar outras pro-caspases, permitindo o início de
uma cascata de proteases, amplificando a via de sinalização apoptótica (ELMORE,
2007). Diversas caspases já foram identificados e amplamente categorizados como
iniciadoras (caspase-2, -8, -9, -10), efetores ou executores (caspase-3, -6, -7) e
inflamatórias (caspase-1, -4, -5) (RAI et al., 2005).
96
Tendo em vista que o caminho de ativação de apoptose por via extrínseca é
desencadeado pelo receptor do ligante Fas e prossegue através da ativação da
caspase-8 e consequente ativação das caspases executoras 3 ou 7 (KRAMMER et
al., 2007) e que as caspases 7 e 8 tiveram sua expressão aumentada pelo tratamento
com ID7, acredita-se que essa fração induza a morte das células 4T1 por via
extrínseca. Além disso a clivagem de PARP, que foi aumentada no tratamento com
ID7, é um marcador bioquímico da apoptose (MISHRA et al., 2016). Outros estudos
também já revelaram a ação de extratos vegetais sobre células tumorais por via
extrínseca com a ativação dessas mesmas proteínas. Mishra et al, (2016)
demonstraram que os extratos de Betula utilis diminuíram a viabilidade de células de
câncer de mama MCF-7 e atribuíram essa atividade principalmente à ação de ácido
ursólico juntamente com ácido betulínico e ácido oleanólico sobre a via extrínseca de
apoptose. Wong et al, (2013) também revelaram a ação citotóxica de Vernonia
amygdalina sobre as linhagens de câncer de mama MDA-MB-231 e MCF-7 e
correlacionou essa ação, dentre outras vias, por ativação de via extrínseca de
apoptose dependente de caspases. Além desses Dhaheri et al, (2013) mostraram que
o extrato de Origanum majorana induziu a via apoptótica de células MDA-MB-231 por
extrínseca mediada por TNF-α, que induziu a sinalização a jusante, com ativação de
caspase 8, caspase 3 e clivagem de PARP.
A detecção de apoptose também pode ser realizada a partir de observações de
alterações morfológicas. A utilização do microscópio de fluorescência em abordagens
de detecção de apoptose tem uma série de vantagens expressivas, visto que a
fluorescência geralmente garante uma relação sinal-ruído mais elevada do que outras
técnicas, o que melhora a sensibilidade da análise (GALLUZZI et al., 2009). Além
disto, o método de detecção por fluorescência não envolve uma reação enzimática,
cuja eficácia pode ser afetada por variáveis incluindo a composição do tampão, o pH
e a temperatura. Os métodos de marcação dupla para a detecção da apoptose (LA e
IP) por fluorescência proporcionam resultados confiáveis e reprodutíveis, distinguindo
claramente as subpopulações de células apoptóticas (células apoptóticas precoces
ou tardias) e de células viáveis (BEHZAD et al., 2016).
As alterações morfológicas nas células 4T1 tratadas com as frações de
Bauhinia e utilizando o ensaio com LA e IP foram analisadas de forma semelhante às
descritas por pesquisadores anteriores (BELLATI et al., 2010). A observação da
formação de citoplasma denso com núcleo fragmentado e a presença de vacúolos na
97
membrana celular indicou que estas células estavam em apoptose inicial. Já os
núcleos fragmentados, marcados de vermelho pelo iodeto de protídeo representaram
a apoptose tardia (DELPHI et al., 2015). Nosso trabalho corrobora com um estudo que
mostrou a diminuição das células de câncer de ovário (CAOV-3) viáveis e o aumento
de células em apoptose tardia, também quando tratadas por 72 horas, com extratos
de Enicosanthellum pulchrum também tiveram o número de células viáveis diminuídas
e o de células em apoptose tardia aumentado (NORDIN et al., 2015). Assim, esses
resultados, juntamente com os encontrados pelo ensaio de western blot, demonstram
que as frações de Bauhinia atuem provavelmente induzindo a morte celular por
apoptose das células 4T1.
O desenvolvimento do câncer inclui a lesão pré-tumoral, a formação e
crescimento do tumor e a metástase. Este processo ocorre a partir de uma cascata
de fatores incluindo a adesão celular, a migração e a proteólise da matriz extracelular
(STEEG, 2003). Sabe-se que a taxa de sobrevivência de pacientes com câncer de
mama não passa de cinco anos e que este prognóstico é determinado
predominantemente se o câncer estiver com ocorrência de metástase (NIEVES et al.,
2009). Como a inibição do potencial metastático é essencial para melhorar o
prognóstico dos doentes, este trabalho buscou avaliar alguns dos mecanismos
envolvidos com a metástase deste tipo tumoral. Deste modo, constatou-se que todas
as frações de Bauhinia inibiram a migração das células 4T1 pelo ensaio de
fechamento de ferida. Assim como em nossos resultados, autores têm encontrado
componentes de origem vegetal como o ácido betulínico, que é um triterpenoide
(JIANG et al., 2010) e compostos polifenólicos (LEE et al.,2016) com ação sobre a
migração de células e correlacionado este ensaio com uma potencial ação anti-
metastática. Zheng et al. (2012) detectaram que o extrato de Actinidia valvata inibiu
tanto a migração quanto a invasão de células de carcinoma hepatocelular e SHIN et
al. (2016) também verificaram que a migração de células de câncer de mama MDA-
MB-231 foi inibida pelo extrato de acetato de etila de Euphorbia humifusa. Uma vez
que esta espécie apresenta em sua constituição o Kaempferol (DENG et al., (2008)
substância também encontrada em ID7 acredita-se que esta molécula possa estar
correlacionada com as atividades descritas.
A fim de complementar estes resultados, também foi realizado o teste de
migração usando a Boyden chamber. Vários estudos têm preferido este ensaio para
avaliar a migração de linhagens tumorais, pois seu princípio se baseia na orientação
98
por quimiotaxia das células pelo estímulo do SFB, rico em fatores de crescimento
(MAWA et al., 2016; LIM et al., 2015). Assim, embora as células tumorais possam se
mover de forma aleatória e/ou direcional, a invasão, a migração e a disseminação são
mais eficientes quando a célula está envolvida na migração dirigida, sendo o
mecanismo de direcionamento por quimiotaxia um dos mais importantes para as
células tumorais metastatizarem (ROUSSOS et al., 2011). Assim, acredita-se que
apenas as frações IID10 e IA19 inibiam a quimiotaxia ao SFB de células 4T1 in vitro.
Outro mecanismo essencial à metástase dos carcinomas é a invasão da
membrana basal. Esta membrana é uma fina camada de matriz extracelular,
subjacente ao epitélio e ao endotélio que separa estes tecidos do estroma
(DERYUGINA e QUIGLEY, 2015). As células tumorais devem atravessar esta
membrana para estabelecer a invasão e a metástase. Para isto, produzem proteases
que degradam a matriz extracelular, como as MMP-2 e MMP-9 (FOLGUERAS et al.,
2004). Entre os vários modelos de ensaios in vitro para invasão, os que utilizam
Matrigel são os mais confiáveis, reprodutíveis e representativos da invasão in vivo
(KLEINMAN e JACOB, 2001). Os resultados deste ensaio mostram que as frações
ID7, IID10 e IIIA32 inibiram a invasão das células 4T1. Niedzwiecki et al. (2016)
relataram que uma mistura contendo diversos compostos fenólicos inibiu, de forma
dose dependente, a invasão de células escamosas de carcinoma de cabeça e
pescoço utilizando Matrigel, assim como inibiu a migração e diminuição de MMP-2 e
MMP-9. Zheng et al. (2014) demonstraram que o extrato das sementes de Momordica
cochinchinensis suprime a migração e invasão de células ZR-75-30 de câncer de
mama humano via inibição de atividade de MMP-2 e MMP-9.
Nossos resultados corroboram os estudos encontrados na literatura pois, além
da inibição da migração e invasão, as frações de Bauhinia diminuíram a quantidade
de gelatinases ativas no sobrenadante. Recentemente foi demonstrado que o
composto Cyanidin-3-O-sambubioside, do fruto de Acanthopanax sessiliflorus, inibiu
a invasão de células de câncer de mama MDA-MB-231 através da diminuição de
MMP-9, também detectada por zimograma (LEE et al., 2013). Além disso, foi relatado
que uma isoflavona de soja reduziu a invasão destas mesmas células por inibição de
MMP-2 (MAGEE et al., 2014). Ademais, estudos anteriores têm afirmado que a
inibição das MMPs desempenha um papel importante no processo de metástase (JIA
et al., 2013, SHUMAN MOSS et al., 2012), fazendo com que com nossos achados
99
possamos sugerir que as frações de Bauhinia atuem como um potencial agente contra
o câncer e metástase, possivelmente por inibição da atividade de MMP-2 e MMP-9.
Além do exposto, no ambiente tumoral as MMPs apresentam o papel de
degradar componentes da matriz extracelular (MEC) como fibronectina, laminina,
colágeno I e colágeno IV, responsáveis pela adesão das células à matriz extracelular
facilitando assim a saída da célula do ambiente tumoral (GUAN, 2015). Neste trabalho
foi mostrado que as frações de Bauhinia aumentaram a adesão das células 4T1 a
estes componentes da MEC. Acredita-se que este resultado possa estar relacionado
com a menor quantidade de MMPs ativas no sobrenadante das células tratadas com
as frações de Bauhinia, ou que haja componentes nas frações que atuem aumentando
a adesão celular. As MMPs, quando inativas, não degradaram os componentes de
membrana basal e por isso possibilitam a adesão celular. Uma vez que os
mecanismos de adesão regulam o desprendimento das células proporcionando a
motilidade celular, e que esta é essencial para a ocorrência da metástase, pode-se
afirmar que a adesão é um evento crítico no desenvolvimento metastático (ALIZADEH
et al., 2014). Assim, torna-se evidente que as frações de Bauhinia são promissores
agentes que impedem o desprendimento celular, provavelmente devido à inibição de
MMPs, podendo suprimir a progressão do evento metastático.
Neste trabalho foi demonstrado que a fração ID7 apresentou atividade
citotóxica de forma seletiva, provavelmente atuando sobre a via de apoptose, além de
diminuir a migração e invasão celular, aumentando a adesão celular aos componentes
da MEC. Assim, esta fração foi selecionada para os testes in vivo (PULASKI e
OSTRAND-ROSENBERG, 2001). Porém, diversos fatores podem influenciar a
toxicidade de um composto ativo, como, fatores individuais do organismo que
receberá o tratamento, concentração da amostra testada, estado de dispersão (forma
e tamanho das partículas), solubilidade nos fluídos orgânicos, afinidade e
sensibilidade aos tecidos (CAZARIN et al., 2004), fazendo com que os testes in vivo
sejam ainda muito necessários.
Os resultados mostraram que a fração ID7 inibiu de forma significativa o
crescimento do tumor mensurado até o nono dia de tratamento e diminuiu o tamanho
final do tumor. Assim como observado neste trabalho, estudos têm comprovado a
atividade antitumoral in vivo de extratos das folhas de Bauhinia. O extrato de B.
variegata candida inibiu a o crescimento de tumores hepáticos induzidos em ratos
(RAJKAPOOR et al., 2006). Outro estudo, também usando extratos de das cascas de
100
B. variegata, apresentou atividade anticarcinogênica em ratos induzidos com câncer
de pele (PANDEY e AGRAWAL, 2009). Kannan et al. (2015) encontraram ação
antitumoral do extrato metanólico de B. tomentosa contra ascite induzida por linfoma
de Dalton.
Também foi observado que ID7 inibiu a metástase das células 4T1 para o
pulmão e para o fígado. Estes achados reforçam os resultados dos ensaios in vitro da
ação de ID7 sobre os mecanismos de metástase. Atualmente são encontrados na
literatura muitos exemplos de drogas que exibem um comportamento citotóxico e anti-
metastático em células tumorais em ensaios in vitro, mas que perdem a eficácia
quando são testados em ensaios in vivo. Em muitos casos isso ocorre devido à efeitos
quimiorresistentes conferidos às células tumorais, pelo microambiente do câncer nas
condições do organismo como um todo (HOLLE et al., 2016). Corroborando com
nossos resultados o extrato de Glycyrrhiza uralensis, inibiu a migração e produção de
MMP-9 de células 4T1 in vitro e inibiram a metástase pulmonar dessas células em
experimentos in vivo sugerindo que essas ações sejam provocadas principalmente
por um flavonoide (PARK et al., 2016), classe de compostos também encontrada em
ID7. Assim, nossos resultados mostram que ID7 pode ser desenvolvido como um
agente para prevenir ou atrasar o crescimento e metástase do tumor uma vez que foi
ativo contra o crescimento e desenvolvimento metastático em ambas condições
experimentais.
As células tumorais são comumente cercadas por várias células do estroma
incluindo fibroblastos, células vasculares angiogênicas e células imunes infiltrantes
(HANAHAN et al., 2012) Dentre estas, as células mieloides infiltradas acumulam-se
em grandes quantidades em áreas onde os níveis locais de oxigênio são baixos e
podem apoiar a proliferação e progressão tumoral através da promoção da
angiogênese e invasão (MURDOCH et al., 2004). As análises histológicas dos fígados
dos animais não tratados mostraram um número elevado de células de defesa, com
acentuada presença de células possivelmente derivadas mieloides, classificadas
como supressoras (CMS). Esta classe de células contribui e ajuda a orquestrar a
imunossupressão tumoral pois podem interagir com células T, macrófagos e células
NK, para criar um ambiente favorável à progressão tumoral. Estudos já revelaram que
esse tipo de célula apresenta uma tendência de acúmulo no fígado interagindo com
as células de Kupffer (ILKOVITCH e LLOPEZ, 2009). Em contrapartida, a análise
101
histológica dos fígados dos animais tratados com ID7 mostraram uma redução do
número de células possivelmente caracterizadas como CMS.
À medida que as terapias que controlam o sítio do câncer do tumor primário
melhoram, a incidência de metástase tem aumentado e o manejo dos pacientes com
metástase continua sendo um desafio (HANAHAN et al., 2012). Além disso, a
imunossupressão induzida por tumor desempenha um papel fundamental na evasão
tumoral do sistema imunológico (ILKOVITCH e LLOPEZ, 2009), assim acredita-se que
ID7 possa ter um papel na prevenção da metástase de 4T1. A função de CMS também
já foi reduzida pela Withaferina A, um componente abundante no extrato de raíz de
Withania somnifera. Acredita-se que essa atividade ocorra principalmente pela
diminuição da IL-10 e de espécies reativas de oxigênio (EROs) produzidos pelas CMS
(SINHA e OSTRAND-ROSENBERG, 2013). Tendo em vista que extratos de outras
espécies de Bauhinia, como a Bauhinia championii já inibiram a produção de EROs,
pela inibição das mitocôndrias produtoras de EROs (LIAO et al., 2016) e que já foi
evidenciado que terapias com peptídeos conjugados à ácido palmítico, composto
presente em ID7, induzem a imunidade antitumoral pela diminuição da função de
macrófagos associados ao tumor por bloqueio de IL-10 (SHEN et al., 2014), acredita-
se que essa fração, em especial o ácido palmítico presente em sua constituição possa
atuar sobre essas moléculas auxiliando na imunidade antitumoral.
A linhagem de células 4T1, utilizadas nesse trabalho, é considerada uma
linhagem de câncer de mama do tipo triplo negativo (CMTN) (SILVA et al., 2016) que
é um tipo de câncer de mama altamente agressivo (KAUR et al., 2012). Os ensaios
de viabilidade com células de câncer de mama humano mostraram que ID7 foi seletivo
às células MDA-MB-231 que também são caracterizadas como triplo negativo pois
não possuem receptores para estrogênio, progesterona ou Her2 (KAUR et al., 2012).
Atualmente já é de conhecimento que esse tipo de câncer de mama (CMTN) é
altamente agressivo e corresponde entre 10 a 20% dos cânceres de mama
diagnosticados (SILVA et al., 2016). Tendo em vista que os pacientes com CMTN não
se beneficiam das terapias moleculares ou endócrinas existentes atualmente,
principalmente devido à ausência de alvos desses fármacos, a quimioterapia
citotóxica continua sendo a única modalidade de abrangência sistêmica disponível
(JEONG et al., 2012). Assim, considerando que o fenótipo triplo negativo possui mal
prognóstico com características altamente agressivas, e ainda que os medicamentos
citotóxicos ou genotóxicos disponíveis produzem eficácia limitada e efeitos adversos
102
significativos (KIM et al., 2017), a ação seletiva evidenciada neste trabalho, de ID7
sobre esse tipo tumoral é muito relevante.
Recentemente alguns compostos de origem natural também têm mostrado
ação sobre o CMTN. Já foram encontrados alguns peptídeos ativos (SILVA et al.,
2016) e o extrato de Paeonia suffruticosa, que também diminui a viabilidade das
células MDA-MB-231 porém por indução de apoptose pela via intrínseca (KIM et al.,
2017). Entre os compostos encontrados em ID7, os diterpenos pertencem à uma
classe de compostos secundários que pode estar relacionada com esta atividade uma
vez que já foi relatado que alguns tipos de diterpenos, isolados de algas marinhas da
espécie Laurencia alfredensis, apresentaram atividade antiproliferativa sobre células
MDA-MB-231 e sobre HeLa, assim como nosso estudo (DZIWORNU et al., 2017).
Além disso, acredita-se que os compostos encontrados na caracterização de
ID7 possam estar relacionados às atividades antitumorais encontradas, uma vez que
foi identificado que o ácido palmítico, extraído de algas marinhas, apresentou
atividade citotóxica seletiva para células leucêmicas humanas sem alterar a
viabilidade de células HDF normais. Além disso, esse ácido graxo induziu a apoptose
das células tumorais e também apresentou atividade antitumoral in vivo (HARADA et
al., 2002). Outro estudo mostrou que o extrato de Ganoderma tsugae var. Jannieae
apresentou atividade citotóxica sobre a linhagem de câncer de mama MCF7 e que
este extrato apresenta, principalmente, ácido palmítico, ácido oleico e ácido linoléico
em sua composição (CHAN et al., 2015). Ainda de acordo com nossos resultados, o
extrato lipofílico de Viscum album L., contendo diversos tipos de ácidos graxos,
apresentou atividade antiproliferativa e induziu a morte celular por apoptose de
linhagens tumorais Molt4, K562 e U937 (URECH et al., 2005). Saab et al. (2015)
revelaram que o extrato das sementes de Laurus nobilis L apresentou atividade
citotóxica frente a linhagens tumorais resistentes à quimioterápicos, atividade devida
ao ácido oleico e ácido palmítico, dentre outros componentes.
A caracterização fitoquímica da fração ID7 também sugeriu a presença do
flavonoide do tipo tilirosídeo chamado de Kaempferol e de diterpenos. Estes
resultados também corroboram com resultados anteriores do nosso grupo de trabalho
a partir da análise por CCD-UV. Acredita-se que estes flavonoide e diterpeno também
possam atuar nas atividades antitumorais e antimetastáticas encontradas neste
trabalho, uma vez que já é de conhecimento que o Kaemperol é um fitoestróegeno
conhecido por desempenhar um papel quimiopreventivo. Lee et al. (2016)
103
identificaram este flavonoide como um agente eficaz na inibição do comportamento
metastático do câncer de mama (MCF-7). Assim como diterpenos, que são uma classe
de substâncias com já comprovada ação antitumoral. Extratos de Salvia revelaram
ação antitumoral e tem essa atividade atribuída ao seu conteúdo de diterpenos e
fenóis (HAO et al., 2016).
Neste contexto um estudo revelou que a presença de lipídeos em extratos
contendo compostos fenólicos auxilia na solubilização destas substâncias, o que pode
potencializar a sua atividade. Neste estudo foi verificado que os extratos fenólicos
ligados a lipídeos exerciam atividades antiproliferativas contra as linhagens celulares
de câncer de colorretal CRC1 e CRC5 e que este extrato continha ácido esteárico,
ácido linoleico e ácido palmítico em sua composição, além de flavonoides como o
Kaempferol (ALU'DATT et al., 2014).
A análise química também sugeriu outras moléculas não mencionadas como
tendo atividade antitumoral. Assim sugere-se que a fração ID7 seja futuramente
purificada e que a atividade dos seus componentes seja avaliada separadamente a
fim de verificar se tais moléculas apresentam ações terapêuticas isoladamente ou de
forma sinérgica.
104
6 CONCLUSÃO
A partir dos resultados encontrados, foi possível concluir que as frações ID7, IID10,
IA19 e IIIA32 apresentam atividades, in vitro, sobre mecanismos do desenvolvimento
tumoral e metastático da linhagem de câncer de mama 4T1; E que a fração ID7 se
mostrou um potencial agente antitumoral visto que, além de atuar de forma seletiva
sobre o desenvolvimento tumoral e mecanismos metastáticos in vitro, diminuiu o
crescimento do tumor 4T1, a metástase pulmonar e a inflamação nos fígados de
camundongos. Por fim, concluímos que os Ácidos graxos, Kaempferol e diterpenos
estejam relacionados com estas atividades.
105
ANEXO 1 – Parecer de aprovação do Comitê de Ética em Pesquisa com Seres
Humanos.
106
107
108
109
110
ANEXO 2 – Parecer de aprovação do Comitê de Ética em Pesquisa com Animais
111
REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS
ALIZADEH, A. M.; SHIRI, S. S.; FARSINEJAD. Metastasis review: from bench to bedside. Tumour Biol. v. 35, n. 9, 2014. ALMEIDA, R. A. Impacto da mastectomia na vida da mulher. Revista da Sociedade Brasileira de Psicologia Hospitalar, v. 9, n. 2, 2006. ALMEIDA, Vera Lúcia de et. al. Cancer and cell cicle-specific and cell cicle nonspecific anticancer DNA-interactive agents: an introduction. Quím. Nova. São Paulo, v. 28, n. 1, p. 118-129, Feb. 2005. Disponível em: <https://goo.gl/Iq9suc>. Acesso em: 16 set. 2005. ALU'DATT, M. H.; RABABAH, T.; EREIFEJ, K.; GAMMOH, S.; ALHAMAD, M. N.; MHAIDAT, N.; KUBOW, S.; JOHARGY, A.; ALNAIEMI, O. J. Investigation of natural lipid-phenolic interactions on biological properties of virgin olive oil. J Agric Food Chem, v. 10, n. 62, 2014. ALVES, E. A.; GUIMARÃES, A. C. R. Cultivo celular. Conceitos e Métodos para a Formação de Profissionais em Laboratório de Saúde. Disponível em: <https://goo.gl/unhbg>. Acesso em: 18 ago. 2016. AZEVEDO, C. R.; MACIEL, F. M.; SILVA, L. B.; FERREIRA, A. T.; DA CUNHA, M.; MACHADO, O. L.; FERNANDES, K. V.; OLIVEIRA, A. E.; XAVIER-FILHO, J. Isolation and intracellular localization of insulin-like proteins from leaves of Bauhinia variegata. Brazilian Journal of Medicine and Biology Research. v. 39, n. 11, 2006. BALIANO, A.P.; PIMENTEL, E. F.; BUZINA, A. R.; VIEIRA, T. Z.; ROMÃO, W.; TOSE, L. V.; LENZ, D.; DE ANDRADE, T. U.; FRONZA, M.; KONDRATYU, T.P.; ENDRINGER, D.C. Brown seaweed Padina gymnospora is a prominent natural wound-care product. Revista Brasileira de Farmacognosia. v. 26, n. 6, 2016. BARAYA, Y. S.; WONG, K. K.; YAACOB, N. S. The Immunomodulatory Potential of Selected Bioactive Plant-Based Compounds in Breast Cancer: a review. Anticancer Agents Med Chem. 2016. BARNES, P. M.; BLOOM, B.; NAHIN, R. L. Complementary and Alternative Medicine Use Among Adults and Children: United States, 2007. National Health Statistics Reports. v. 12, n. 10, 2008. BEHZAD, S.; EBRAHIM, K.; MOSADDEGH, M.; HAERI, A. Primula auriculata Extracts Exert Cytotoxic and Apoptotic Effects against HT-29 Human Colon Adenocarcinoma Cells. Iranian Journal of Pharmaceutical Research. n. 1, 2016. BELLATI, F.; NAPOLETANO, C.; RUSCITO, I.; PASTORE, M.; PERNICE, M.; ANTONILLI, M.; NUTI, M.; BENEDETTI PANICI P. Complete remission of ovarian cancer induced intractable malignant ascites with intraperitoneal bevacizumab. Immunological observations and a literature review. Invest New Drugs. v. 28, n. 6,
112
2010. BENTON, G.; KLEINMAN, H. K.; GEORGE, J.; ARNAOUTOVA, I. Multiple uses of basement membrane-like matrix (BME/Matrigel) in vitro and in vivo with cancer cells. International Journal of Cancer. v. 128, n. 8, 2011. BRASILEIRO-FILHO, G. BOGLIOLO: Patologia Geral. 8. ed. Rio de Janeiro: Guanabara Koogan, 2011. CAILLEAU, R.; OLIVÉ, M.; CRUCIGER, Q. V. Long-term human breast carcinoma cell lines of metastatic origin: preliminary characterization. In Vitro. v. 14, n. 11, 1978. CALIXTO, J.B. Efficacy, safety, quality control, marketing and regulatory guidelines for herbal medicines (phytotherapeutic agents). Braz J Med Biol Res, v.33, n. 2, 2000. CAREY, L.; WINER, E.; VIALE, G.; CAMERON, D.; GIANNI, L. Triple-negative breast cancer: disease entity or title of convenience? Nat Rev Clin Oncol, v.7, 2010. CARL, G.; CASTLE. S. A.; DIANE, F. M.; KLOTZ, M. H. Expression of a Constitutively Active Estrogen Receptor Variant in the Estrogen Receptor-negative BT-20 Human Breast Cancer Cell Line. Cancer research, v.15, 1993. CARSTEN-DENKERT, M. D.; CORNELIA LIEDTKE, M. D. ANDREW TUTT, M. D. GUNTER VON MINCKWITZ, M. D. Molecular alterations in triple-negative breast cancer the road to new treatment strategies. Lancet. v. 6, 2016. CAVALLARO, U.; CHRISTOFORI, G. Cell adhesion in tumor invasion and metastasis: loss of the glue is not enough. Biochim Biophys Acta, v. 1, n. 1552, 2001. CAZARIN, K. C. C.; CORRÊA, C. L. C.; ZAMBRONE, F. A. D. Redução, refinamento e substituição do uso de animais em estudos toxicológicos: uma abordagem atual. Revista Brasileira de Ciências Farmacêuticas. São Paulo, SP, v. 40, n. 3, pp. 289-299, jul./set., 2004. Disponível em: <https://goo.gl/ZmLbJL>. Acesso em: 16 set. 2016. CECHINEL-FILHO, V. Chemical composition and biological potential of plants from the genus Bauhinia. Phytotherapy Research. v. 23, n. 10, 2009. CHAN, J. S.; ASATIANI, M. D.; SHARVIT, L. E.; TRABELCY, B. BARSEGHYAN, G. S.; WASSER, S. P. Chemical Composition and Medicinal Value of the New Ganoderma tsugae var. jannieae CBS-120304 Medicinal Higher Basidiomycete Mushroom. Int. J. Med Mushrooms, v. 17, n. 8, 2015. CHENG, Y. T.; YANG, C. C.; SHYURA, L. F. Phytomedicine-Modulating oxidative stress and the tumor microenvironment for cancer therapy. Pharmacological Research, v. 114, dez. 2016. CHEW, Y. L.; LIM, Y. Y.; STANSLAS, J. Ee GC4, Goh JK2. Bioactivity-Guided Isolation of Anticancer Agents from Bauhinia Kockiana Korth. Afr J Tradit Complement Altern Med, v. 11, n. 3. 2014.
113
CHORILLI, M.; MICHELIN, D. C.; SALGADO, H. R. N. Animais de laboratório: o camundongo. Rev. Ciênc. Farm. Básica Apl. v. 28, n. 1, 2007. COATES, A. S.; WINER, E. P.; GOLDHIRSCH, A.; GELBER, R. D.; GNANT, M.; PICCART-GEBHART, B.; THÜRLIMANN H.J. SENN PANEL MEMBERS PANEL. Tailoring therapies improving the management of early breast cancer: St Gallen International Expert Consensus on the Primary Therapy of Early Breast Cancer 2015. Ann Oncol, v. 26, n.8. 2015. COSTAI, M.T.; FABENIII, R. C.; APTEKMANNIII, K. P.; MACHADO, R. R. The different roles of nitric oxide with focus on cancer. Ciência Rural. v. 33, n. 5, set. 2003. CURTIN, J. F.; DONOVAN, M.; COTTER, T. G. Regulation and measurement of oxidative stress in apoptosis. J. Immunol. Methods. n. 265, 2002. DE LAURENTIIS, M.; CIANNIELLO, D.; CAPUTO, R.; STANZIONE, B.; ARPINO, G.; CINIERI, S.; LORUSSO, V.; DE PLACIDO S. Treatment of triple negative breast cancer (TNBC): current options and future perspectives. Cancer Treat Rev. v. 36, 2010. DELPHI, L.; SEPEHRI, H.; KHORRAMIZADEH, M. R.; MANSOORI, F. Pectic-Oligoshaccharides from Apples Induce Apoptosis and Cell Cycle Arrest in MDA-MB-231 Cells, a Model of Human Breast Cancer. Asian Pacific Journal of Cancer Prevention. v. 16, n. 13, 2015. DENG, F.; TANG, N.; XU, J.; SHI, H.; ZHAO, M.; ZHANG, J. New a-pyrrolidinonoids and glycosides from Euphorbia humifusa. Journal of Asian Natural Products Research, v. 10, n. 6, 2008. DERYUGINA, E. I.; QUIGLEY, J. P.; Tumor angiogenesis: MMP-mediated induction of intravasation- and metastasis-sustaining neovasculature. Matrix Biol, 2015. DHAHERI, Y. A.; EID, A.; ABUQAMAR, S.; ATTOUB, S.; KHASAWNEH, M.; AICHE, G.; HISAINDEE, S.; IRATNI, R. Mitotic Arrest and Apoptosis in Breast Cancer Cells Induced by Origanum majorana Extract: Upregulation of TNF-α and Downregulation of Survivin and Mutant p53. PLoS One, v. 8, n. 2, 2013. DIWANAY, S.; CHITRE, D.; PATWARDHAN, B. Immunoprotection by botanical drugs in cancer chemotherapy. J Ethnopharmacol. v. 90, n. 1, 2004. DUARTE, M. R.; SILVA, A. G.; COSTA, R. E.; FARIA, L. T Bauhinia variegata: Diagnose morfoanatômica a análise comparativa entre exemplares de regiões climáticas distintas. Latin American Journal Pharmacy. v. 26, 2007. DZIWORNU, G. A.; CAIRA, M. R.; MARE, J.; EDKINS, A. L.; BOLTON, J.J.; BEUKES, D.R.; SUNASSEE, S. N. Isolation, Characterization and Antiproliferative Activity of New Metabolites from the South African Endemic Red Algal Species Laurencia alfredensis. Molecules, n. 22, v. 4, 2017. EGEBLAD, M. and WERB, Z. New functions for the matrix metalloproteinases in
114
cancer progression. Nat. Rev. Cancer, v. 2, 2002. ELMORE, S. Apoptosis: A Review of Programmed Cell Death. Toxicol Pathol, v. 35, n. 4, 2007. EVAN, G. I.; VOUSDEN, K. H. Proliferation, cell cycle and apoptosis in cancer. Nature. n. 411, 2001. FANG, E. F.; WONG, J. H.; BAH, C. S.; LIN, P.; TSAO, S. W.; N. G. TB. Bauhinia variegate var. variegate trypsin inhibitor: From isolation to potencial medicinal applications. Biochemical and Biophysical Research Communications. Orlando. v. 396, n. 4. 2010. FOTAKIS, G.; TIMBRELL, J. A. In vitro cytotoxicity assays: Comparison of LDH, neutral red, MTT and protein assay in hepatoma cell lines following exposure to cadmium chloride. Toxicology Letters. v. 160, n. 2, 2006. FRANÇA, F. D. Avaliação das linhagens vero e mdck na sinalização celular e como alternativas para estudo da nefrotoxicidade utilizando anfotericina b. 2008. Dissertação (Mestrado) – Faculdade de farmácia, Universidade Federal de Minas Gerais, Minas Gerais, 2008. FRAPPART, L.; FALETTE, N.; LEFEBVRE, M. F.; BREMOND, A.; VAUZELLE, J. L.; and SAEZ, S. In vitro study of effects of 1,25 dihydroxyvitamin D3 on the morphology of human breast cancer cell line BT.20 Differentiation, v.40, 1989. FRIESE, C.R., HARRISON, J.M., JANZ, N.K., JAGSI, R., MORROW, M., LI, Y., HAMILTON, A.S., WARD, K.C., KURIAN, A.W., KATZ, S.J., HOFER, T.P. Treatment-associated toxicities reported by patients with early-stage invasive breast cancer. Cancer. v.123, n. 11, 2017. FULDA, S. Modulation of apoptosis by natural products for cancer therapy. Planta Med. v. 76, n. 11, ago. 2010. FUTREAL, P. A.; COIN, L.; MARSHALL, M.; DOWN, T.; HUBBARD, T.; WOOSTER, R.; RAHMAN, N.; STRATTON, M. R. A census of human cancer genes. Nature Reviews Cancer. v. 4, n. 4, mar. 2004. GALLUZZI, L. et al. Guidelines for the use and interpretation of assays for monitoring cell death in higher eukaryotes. Cell Death Differ. 2009. GIALELI, C. H. Dynamic interplay between breast cancer cells and normal endotheliummediates the expression of matrix macromolecules, proteasome activityand functional properties of endothelial cells. Biochimica et Biophysica Acta. 2014. GIALELI, C.; ACHILLEAS D.; THEOCHARIS e NIKOS K.; KARAMANOS. Roles of matrix metalloproteinases in cancer progression and their pharmacological targeting. FEBS Journal, v. 278, 2011.
115
GILMAN, A.; PHILLIPS, F. S.; Science 1946, 103, 409;Haskel, C. M.; Cancer Treatment, Saunders: Philadelphia, 1990. GLOBOCAN. Cancer Incidence and Mortality Worldwide: IARC Cancer Base No. 11. 2012. Disponível em: <https://goo.gl/3JYr9o>. Ascesso em: 16 out. 2016. GLUZ, O.; LIEDTKE, C. GOTTSCHALK, N.; PUSZTAI, L.; NITZ, U.; HARBECK, N. Triple-negative breast cancer current status and future directions. Ann Oncol, v. 20, 2009. GODDARD, E.T.; FISCHER, J.; SCHEDIN, P. A Portal Vein Injection Model to Study Liver Metastasis of Breast Cancer. J. Vis. Exp. v. 118, 2016. GOLUBNITSCHAJA, O. et al. Breast cancer risk assessment: a non-invasive multiparametric approach to stratify patients by MMP-9 serum activity and RhoA expression patterns in circulating leucocytes. Amino Acids. v.3, 2016. GRIVENNIKOV, S. I.; GRETEN, F. R.; KARIN, M. Immunity, inflammation, and cancer. Cell, n. 140, 2010. GUAN, X. Cancer metastases: challenges and opportunities. Acta Pharmaceutica Sinica B. v. 5, n. 5, 2015. GUO, X.; ZHAO, Y.; YAN, H.; YANG, Y.; SHEN, S.; DAI, X.; JI, X.; JI, F.; GONG, X.; LI, L.; BAI, X.; FENG, X.; LIANG, T.; JI, J.; CHEN, L.; WANG, H.; ZHAO, B. Single tumor-initiating cells evade immune clearance by recruiting type II macrophages. Genes & Development, v. 31, 2017. HAHN, W. C.; WEINBERG, R. A. Modelling the molecular circuitry of cancer. Nature Reviews Cancer, v. 2, 2002. HALSTED, W. S. The Results of Operations for the Cure of Cancer of the Breast Performed at the Johns Hopkins Hospital from June, 1889, to January, 1894. Ann Surg. v. 20, n. 5, 1894. HANAHAN, D.; WEINBERG, R. Hallmarks of cancer: the next generation. Cell, v. 144, n. 5, 2011. HANAHAN, D.; COUSSENS, L.M. Accessories to the crime: Functions of cells recruited to the tumor microenvironment. Cancer Cell, v. 21, 2012. HAO, D. C.; GE, G. B.; XIAO, P. G. Nticancer drug targets of Salvia phytometabolites: Chemistry, biology, and omics. Curr Drug Targets. 2016. HARADA, H.; YAMASHITA, U.; KURIHARA, H.; FUKUSHI, E.; KAWABATA, J.; KAMEI, Y. Antitumor activity of palmitic acid found as a selective cytotoxic substance in a marine red alga. Anticancer Res, v. 22, n. 5, 2002. HE, G. B; DHAR, D.; NAKAGAWA, H.; FONT-BURGADA, J.; OGATA, H.; JIANG, Y. H.; SHALAPOUR, S.; SEKI, E.; YOST, S, E.; JEPSEN, K.; FRAZER, K. A.;
116
HARISMENDY, O.; HATZIAPOSTOLOU, M.; ILIOPOULOS, D.; SUETSUGU, A.; HOFFMAN, R. M.; TATEISHI, R.; KOIKE, K.; KARIN, M. Identification of Liver Cancer Progenitors Whose Malignant Progression Depends on Autocrine IL-6 Signaling. Cell n. 155, 2013. HEPPNER, G. H.; MILLER, F. R.; SHEKHAR, P. V. M. Nontransgenic models of breast cancer. Breast Cancer Research. v. 2, 2000. HILL, A. Guia das medicinas alternativas: todos os sistemas de cura natural. In: Trovo MM, Silva MJP, Leão ER. Terapias alternativas/complementares no ensino público e privado: análise do conhecimento dos acadêmicos de enfermagem. Rev Latino-Am Enferm, n. 13, v. 4, 2003. HOJILLA, C. V., MOHAMMED, F. F. and KHOKHA, R. Matrix metalloproteinases and their tissue inhibitors direct cell fate during cancer development. Br. J. Cancer, v. 89, 2003. HOLLE, A. W.; YOUNG, J. L.; SPATZAB, J. P. In vitro cancer cell–ECM interactions inform in vivo cancer treatment. Advanced Drug Delivery Reviews, v. 97, n.1, 2016. HON, J. D.; SINGH, B.; SAHIN, A.; DU, G.; WANG, J.; WANG, V. Y.; DENG, F. M.; ZHANG, D. Y.; MONACO, M. E.; LEE, P. Breast cancer molecular subtypes: from TNBC to QNBC. Am J Cancer Res, v.6, n.9, 2016. HUA, F.; SHANG, S.; HU, Z. Seeking new anti-cancer agents from autophagy-regulating natural products. J Asian Nat Prod Res, v. 19, n. 4, 2017. HUANG, S. T.; PANG, J. H.; YANG, R. C. Anti-cancer effects of Phyllanthus urinaria and relevant mechanisms. Chang Gung Med J. 2010. HUGHES, C. S.; POSTOVIT, L. M.; LAJOIE, G. R. Matrigel: a complex protein mixture required for optimal growth of cell culture. Proteonomics, v. 10, 2010. ILKOVITCH, D.; LOPEZ, D.M. The Liver is a Site for Tumor Induced Myeloid-Derived Suppressor Cell Accumulation and Immunosuppression. Cancer Res, v. 1, n. 69, 2009. INCA – Instituto Nacional do Câncer José de Alencar Gomes da Silva. Disponível em: <https://goo.gl/dLEQ5V>. Acesso em: 11 ago. 2016. ITHARAT, A.; HOUGHTON, P. J.; ENO-AMOOQUAYE, E.; BURKE, P. J.; SAMPSON, J. H.; RAMAN, A. In vitro cytotoxic activity of thai medicinal plants used traditionally to treat cancer. Journal of Ethnopharmacology, v. 90, n. 1, 2004. JACONODINO, C. B.; AMESTOY, S. C.; THOFEHRN, M. B. A utilização de terapias alternativas por pacientes em tratamento Quimioterápico. Cogitare Enferm, v. 13, n. 1, 2008. JEONG JH, JUNG SY, PARK IH, LEE KS, KANG HS, KIM SW, et al. Predictive factors of pathologic complete response and clinical tumor progression after preoperative chemotherapy in patients with stage II and III breast cancer. Investigational new drugs.
117
v. 30, n. 1, 2012. JIA, W.; GAO, X. J.; ZHANG, Z. D.; YANG, Z. X.; ZHANG, G. S100A4 silencing suppresses proliferation, angiogenesis and invasion of thyroid cancer cells through downregulation of MMP-9 and VEGF. Eur Rev Med Pharmacol Sci, v. 17, n.11, 2013. JIANG, M. et al. Influence of betulinic acid on proliferation, migration, cell cycle and apoptosis of pancreatic cancer cells. Chin J Integr Med, v. 35, n. 22, 2010. KAEWPIBOON, C.; LIRDPRAPAMONGKOL, K; SRISOMSAPC,
WINAYANUWATTIKUN, P.; YONGVANICH, T. Studies of the in vitro cytotoxic, antioxidant, lipase inhibitory and antimicrobial activities of selected Thai medicinal plants. BMC complementary and alternative medicine, v. 12, n. 217, 2012. KANNAN, N.; SAKTHIVEL, K. M.; GURUVAYOORAPPAN, C. Anti-tumor and Chemoprotective Effect of Bauhinia tomentosa by Regulating Growth Factors and Inflammatory Mediators. Asian Pac J Cancer Prev, v. 16, n. 18, 2016. KAUR, P.; NAGARAJA, G. M.; ZHENG, H.; GIZACHEW, D.; GALUKANDE, M.; KRISHNAN, S.; ASEA, A. A mouse model for triple-negative breast cancer tumor-initiating cells (TNBC-TICs) exhibits similar aggressive phenotype to the human disease. BMC Cancer, v.12, n.120, 2012. KIM, D.; RADIN, D.; LEONARDI, D. Probing the Molecular Mechanisms Governing the Oncolytic Activity of Paeonia suffruticosa on Triple-negative Breast Cancer Cells In Vitro. Anticancer Research, n.37, 2017. KLEINMAN, H. K.; JACOB, K. 2001. Invasion Assays. Current Protocols in Cell Biology, Mai, 2001. KLEINMAN, H. K.; MARTIN, G. R. Matrigel: Basement membrane with biological activity. Semin Cancer Biol, v. 15, 2005. KRAMMER PH, ARNOLD R AND LAVRIK IN: Life and death in peripheral t cells. Nat Rev Immunol, n. 7, v.7, 2007. LAMBERTINI, M.; PINTO, A.C.; AMEYE, L.; JONGEN, L.; MASTRO, L. D.; PUGLISI,
F.; POGGIO, F.; BONOTTO, F.; FLORIS, G.; VAN ASTEN, K.; WILDIERS, H.; NEVEN,
P.; AZAMBUJA, E.; PAESMANS, M.; AZIM, H. The prognostic performance of
Adjuvant! Online and Nottingham Prognostic Index in young breast cancer patients.
British Journal of Cancer, v. 115, 2016.
LAY, M. M.; KARSANI, S. A.; MOHAJER, S.; ABD, MALEK, S. N. Phytochemical constituents, nutritional values, phenolics, flavonols, flavonoids, antioxidant and cytotoxicity studies on Phaleria macrocarpa (Scheff.) Boerl fruits. BMC Complement Altern Med. 2014. LEE, G. A.; CHOI, K. C.; HWANG, K. A. Kaempferol, a phytoestrogen, suppressed triclosan-induced epithelial-mesenchymal transition and metastatic-related behaviors of MCF-7 breast cancer cells. Environ Toxicol Pharmacol, v. 22, n. 49, 2016 A.
118
LEE, K. P.; KIM, J.E; KIM, H; CHANG, H, R; LEE, D.W. PARK, W.H. Bo-Gan-Whan regulates proliferation and migration of vascular smooth muscle cells. BMC Complementary and Alternative Medicine. 2016 B. LEE, S. J.; HONG, S.; YOO, S. H.; KIM, G. W. Cyanidin-3-O-sambubioside from Acanthopanax sessiliflorus fruit inhibits metastasis by downregulating MMP-9 in breast cancer cells MDA-MB-231. Planta Med, v. 79, n. 17, 2013. LEVENSON, A. S.; JORDAN, V. C. MCF-7: the first hormone-responsive breast cancer cell line. Cancer Res. v. 57, n. 15. 1997 LIAO, P.; SUN, G.; ZHANG, C.; WANG, M.; SUN, Y.; ZHOU, Y.; SUN, X.; JIAN, J. Bauhinia championii Flavone Attenuates Hypoxia-Reoxygenation Induced Apoptosis in H9c2 Cardiomyocytes by Improving Mitochondrial Dysfunction. Molecules, v.4, n. 21, 2016. LIM, L.; YUN, J. J.; JEONG, J. E.; WI, A. J.; SONG, H. Inhibitory Effects of Nano-Extract from Dendropanax morbifera on Proliferation and Migration of Vascular Smooth Muscle Cells. J Nanosci Nanotechnol. 2015. LOPES, G. F. Estudo in vitro da ação de extratos de Tapirira guianensis Aubl sobre linhagens células de cabeça e pescoço. Trabalho de conclusão de curso – Universidade Federal de São João del Rei – Faculdade de Bioquímica, 2015. LOU, C.; ZHU, Z.; ZHAO, Y.; ZHU, R.; ZHAO, H. Arctigenin, a lignan from Arctium lappa L., inhibits metastasis of human breast cancer cells through the downregulation of MMP-2/-9 and heparanase in MDA-MB-231 cells. Oncol Rep. 2016. LUSA, M. G.; BONA, C. Análise morfoanatômica comparativa da folha de Bauhinia forficata Link e B. variegata Linn. (Leguminosae, Caesalpinioideae). Acta Botanica Brasilica, v. 23, 2009. MACEDO, TACIANE. Avaliação in vitro do papel de micrornas na regulação da expressão de genes associados ao processo de metástase no câncer de mama. Dissertação de Mestrado – Hospital de Câncer de Barretos, 2014. MACHADO, A. E. H. Terapia fotodinâmica: princípios, potencial de aplicação e perspectivas. Química Nova, n. 23, v. 2, 2000. MAGEE, P. J.; ALLSOPP, P.; SAMALETDIN, A.; ROWLAND, I. R. Daidzein, R-(+)equol and S-(-)equol inhibit the invasion of MDA-MB-231 breast cancer cells potentially via the down-regulation of matrix metalloproteinase-2. Eur J Nutr. 2014. MAHECHA, A. M.; WANG, H. The influence of vascular endothelial growth factor-A and matrix metalloproteinase-2 and -9 in angiogenesis, metastasis, and prognosis of endometrial cancer. Onco Targets Ther, v.19, n.10, 2017. MANTOVANI, A.; ALLAVENA, P.; SICA, A.; BALKWILL, F. Cancer-related inflammation. Nature, n. 454, 2008.
119
MARTÍNEZ, M. M.; OCAMPO, D. M.; GALVIS, J. H.; VALENCIA, A. Actividad antibacteriana y citotoxicidad in vivo de extractos etanólicos de Bauhinia variegata L. (Fabaceae). Revista Cubana de Plantas Medicinales, v. 16, p. 313-323, 2011. MARTINHO, O.; ZUCA, L. E.; REIS, R.M. AXL as a modulator of sunitinib response in glioblastoma cell lines. Experimental Cell Research, v. 332, n. 1, 2015. MANSKY, P. J.; WALLERSTEDT, D. B. Complementary Medicine in Palliative Care and Cancer Symptom Management. Cancer Journal, v. 12, 2006. MASSON-MEYERS, D.S; BUMAH, V.V; ENWEMEKA, C.S. A comparison of fourmethods for determining viability in human dermal fibroblasts irradiated with blue light. Journal of Pharmacological and Toxicological Methods, v. 79, 2016. MATHUR, A.; JOSHI, H. Ethnobotanical studies of the Tarai Region of Kumaun, Uttarakhand, India Ethnobotany Research and Applications, v.11, 2013. MAWA, S.; JANTAN, I.; HUSAIN, K. Isolation of Terpenoids from the Stem of Ficus aurantiaca Griff and their Effects on Reactive Oxygen Species Production and Chemotactic Activity of Neutrophils. Molecules, 2016. MBAHA, C.; RUYCKC, K.; SCHRIJVERC, S.; SUTTERA, C.; SCHIETTECATTEA, K.; MONTENA, C.; PAELINCKD, L.; NEVEA, W.; THIERENSC, H.; WESTE, C.; AMORIMB, G.; THASB, O.; VELDEMAND, O. A new approach for modeling patient overall radiosensitivity and predicting multiple toxicity endpoints for breast cancer patients. Acta oncologica, 2018. MCCONKEY, D. J. Biochemical determinants of apoptosis and necrosis. Toxicology Letters, n. 99, 1998. MCILWAIN, D. R.; BERGER, T.; MAK, T. W. Caspase functions in cell death and disease. Cold Spring Harb Perspect Biol, v. 5, n. 4, 2013. MERCK, KGaA, Darmstadt, Germany and/or its affiliates. Disponível em: <http://www.merckmillipore.com/BR/pt>. Acessado em: outubro, 2016. MILLER, K. D.; SIEGEL, R. L.; LIN, C. C.; MARIOTTO, A. B.; KRAMER, J. L.; ROWLAND, J. H.; STEIN KD7, ALTERI R8, JEMAL A9., R. et. al. Cancer treatment and survivorship statistics. CA Cancer J Clin. 2012. MISHRA, A., SHARMA, A.K. KUMAR, S. SAXENA, A.K. PANDEY, A.K. Bauhinia variegata leaf extracts exhibit considerable antibacterial, antioxidant, and anticancer activities. Biological Medical Research International. v. 11, 2013. MISHRA, T.; ARYA, R. K.; MEENA, S.; JOSHI, P.; PAL, M.; MEENA,B.; UPRETI, D.K.; RANA, T. S.; DATTA, D. Isolation, Characterization and Anticancer Potential of Cytotoxic Triterpenes from Betula utilis Bark. PLoS One, v. 25, n. 11, 2016. MIZUSHIMA, N. Autophagy in protein and organelle turnover. Cold Spring Harb Symp
120
Quant Biol, v. 76, 2011. MURAD, A. M.; KATZ, A. Oncologia: bases clínicas do tratamento. Rio de Janeiro: Guanabara Koogan, 1996. MURDOCH, C.; GIANNOUDIS, A.; LEWIS, C.E. Mechanisms regulating the recruitment of macrophages into hypoxic areas of tumors and other ischemic tissues. Blood, v. 104, 2004. NANDA, Y.; SINGSON, N.; RAO, A. N. Ethnomedicinal plants of Thadou tribe of Manipur (India)-1. Pleione, v. 7, 2013. NASCIMENTO, T. C. et. al. Ecologia da polinização de Bauhinia variegata (L.) (Fabaceae - Caesalpinioidea). Instituto de Biologia, Universidade Federal de Uberlândia–MG (UFU), 2005. NETO, M. et. al. Flavonoids and alkaloids from leaves of Bauhinia ungulata L. Biochemical Systematics and Ecology, v. 36, 2008. NICÁCIO, Wagner Patrick Junqueira de Souza Coelho. Modelo difusivo-advectivo para o crescimento de tumores avasculares em ambiente com nutrientes e células normais. Dissertação de Mestrado – UFMG, 2009. NIEDZWIECKI, A.; ROOMI, M. W.; KALINOVSKY, T.; RATH, M. Anticancer Efficacy of Polyphenols and Their Combinations. Nutrients, 2016. NIEVES, A. R.; COLBURN, N. H.; SIMEONE, A. M.; TARI, A. M. Programmed cell death 4 inhibits breast cancer cell invasion by increasing tissue inhibitor of metalloproteinases-2 expression. Breast Cancer Res Treat. v.114, 2009. NGUYEN, M. N. T.; HUYNH, T. D. H. Selective cytotoxicity of a Vietnamese traditional formula, Nam Dia long, against MCF-7 cells by synergistic effects. BMC Complementary and Alternative Medicine, 2016. NORDIN, N.; MAJID, N. A.; HASHIM, N. M.; RAHMAN, M. A.; HASSAN, Z.; ALI, H. M. Liriodenine, an aporphine alkaloid from Enicosanthellum pulchrum, inhibits proliferation of human ovarian cancer cells through induction of apoptosis via the mitochondrial signaling pathway and blocking cell cycle progression. Drug Des Devel Ther. 2015. OGURA, M. Adriamycin (doxorubicin). Gan To Kagaku Ryoho. 2001. OKEGAWA, T.; PONG, R. C.; LI, Y.; HSIEH, J. The role of cell adhesion molecule in cancer progression and its application in cancer therapy. Acta Biochim Pol, v. 51, n. 2, 2004. OLIVA, M. L. V.; SAMPAIO, M. U. Action of plant proteinase inhibitors on enzymes of physiopathological importance. Anais da Academia Brasileira de Ciências, v. 81, 2009. OLIVEIRA, Ruth Medeiros de. Avaliação da atividade antioxidante, anticoagulante e
121
antiproliferativa de extratos aquosos de Marsdenia megalantha. Dissertação (Mestrado em Bioquímica), Universidade Federal do Rio Grande do Norte, 2011. OLIVERA, P.; PEREZ, E.; ORTEGA, A.; TERUAL, R.; GOMES, C.; MORENO, L. F.; DUEÑAS, A.; DE LA GARZA, J.; MELENDEZ-ZAJGLA, J.; MALDONADO, V. Estrogen receptor expression in giant cells tumors of the bone. Human Pathology. v. 33, 2002. OSTAD SN1, RAJABI A2, KHADEMI R3, FARJADMAND F4, EFTEKHARI M2, HADJIAKHOONDI A2, KHANAVI M5. Cytotoxic Potential of Centaurea bruguierana ssp. belangerana: The MTT Assay. Acta Med Iran. v. 54, n. 9, 2016. PAARAKH, P. M. Isolation of Phytoconstituents from the leaves of Bauhinia variegata Linn. Journal of Pharmacy Research. v. 2, n. 8, 2009. PANDEY, S.; AGRAWAL, R. C. Effect of Bauhinia Variegate Bark Extract on DMBA-Induced Mouse Skin Carcinogenesis: A Preliminary Study. Global Journal of Pharmacology. v. 3, n. 3, 2009. PANI, S. R.; MISHRA, S.; SAHOO, S.; PANDA, P. K. Nephroprotective effect of Bauhinia variegata (Linn.) whole stem extract against cisplatin-induced nephropathy in rats. Indian Journal of Pharmacoloy, v. 43, n. 2, 2011. PARK, S.; BAE, J.; NAM, B. H.; YOO, K. Y. Aetiology of cancer in Asia. Asian Pacific Journal of Cancer Prevention. 2008. PARK, S. Y.; KWON, S. J.; LIM, S. S.; KIM, J. K.; LEE, K. W.; PARK, J. H. Y. Licoricidin, an Active Compound in the Hexane/Ethanol Extract of Glycyrrhiza uralensis, Inhibits Lung Metastasis of 4T1 Murine Mammary Carcinoma Cells. Int. J. Mol. Sci. n.17, v. 934, 2016. PARRISH, A. B.; FREEL, C. D.; KORNBLUTH, S. Cellular mechanisms controlling caspase activation and function. Cold Spring Harb Perspect Biol. v. 5, n. 6, 2013. PEREIRA, G. P. G.; LIPPI, U. G. Avaliação da dor oncológica no câncer de mama metastático. Dor, v. 10, n. 4, 2009. PETKOV, V. Plants and hypotensive, antiatheromatous and coronarodilatating action. Am J Chin Med. v. 7, n. 3, 1979. PULASKI, B. A.; OSTRAND-ROSENBERG, S. Mouse 4T1 breast tumor model. Curr Protoc Immunol Chapter. 2001. RAI, N. K.; TRIPATHI, K.; SHARMA, D.; SHUKLA, V. K. Apoptosis: a basic physiologic process in wound healing. Int J Low Extrem Wounds, v. 4, n. 3, 2005. RAJANI, G. P.; ASHOK, P. In vitro antioxidant and antihyperlipidemic activities of Bauhinia variegata Linn. Indian Journal of Pharmacology, v. 41, n. 5, 2009. RAJKAPOOR, B.; JAYAKAR, B.; MURUGESH, N.; SAKTHISEKARAN, D. Chemoprevention and cytotoxic effect of Bauhinia variegata against N-
122
nitrosodiethylamine induced liver tumors and human cancer cell lines. Journal of Ethnopharmacology, v. 104, v. 3, 2006. REIGSTAD, I.; SMELAND, H.Y.H.; SKOGSTRAND, T.; SORTLAND, K.; SCHMID, M. K.; REED, R.K.; STUHR, L. Stromal Integrin α11β1 Affects RM11 Prostate and 4T1 Breast Xenograft Tumors Differently. PLos One, v.11, n.3, 2016. RISS, T. L.; MORAVEC, R. A.; NILES, A. L. Cytotoxicity testing: Measuring viable cells, dead cells, and detecting mechanismof cell death. In: M. J. Stoddart (Ed.), Mammalian Cell Viability Methods and Protocols, 2013. RODRÍGUEZ-HERNÁNDEZ, D.; BARBOSA, L. C. A.; DEMUNER, A. J.; NAIN-PEREZ, A.; FERREIRA, S. R.; FUJIWARA, R. T.; DE ALMEIDA, R. M.; HELLER, L.; CSUK, R. Leishmanicidal and cytotoxic activity of hederagenin-bistriazolyl derivatives. Eur J Med Chem, v. 10, n. 140, 2017. ROUSSOS, E. T.; CONDEELIS, J. S.; PATSIALOU, A. Chemotaxis in cancer. Nat Rev Cancer, 2011. RUDNICK-GLICK, S.; COREM-SALKMON, E.; GRINBERG, I.; MARGEL, S. Targeted drug delivery of near IR fluorescent doxorubicin-conjugated poly(ethylene glycol) bisphosphonate nanoparticles for diagnosis and therapy of primary and metastatic bone cancer in a mouse model. J Nanobiotechnology, v. 5, n. 14. 2016. SAAB, A. M.; GUERRINI, A.; ZEINO, M.; WIENCH, B.; ROSSI, D.; GAMBARI, R.; SACCHETTI, G.; GRETEN, H. J.; EFFERTH, T. Laurus nobilis L. Seed Extract Reveals Collateral Sensitivity in Multidrug-Resistant P-GlycoproteinExpressing Tumor Cells. Nutrition and Cancer, v. 67, n. 4, 2015. SANTOS, Kamilla Monteiro dos. Foto do arquivo pessoal da autora. Fotografado em maio de 2011 - 2011. SANTOS, Kamilla Monteiro dos; et al. Inhibition of gelatinase activity of MMP-2 and MMP-9 by extracts of Bauhinia ungulata L. Bioscience Journal, v. 31, n. 2, 2015. SANTOS, Kamilla Monteiro dos. Foto do arquivo pessoal da autora. Fotografado em maio de 2015 - 2015. SANTOS, Kamilla Monteiro dos. Foto do arquivo pessoal da autora. Fotografado em Fevereiro de 2016 - 2016. SARAYDIN, S. U.; TUNCER, E.; TEPE, B.; KARADAYI, S.; ÖZER, H.; ŞEN, M.; KARADAYI, K.; INAN, D.; ELAGÖZ, Ş.; POLAT, Z.; DUMAN, M.; TURAN, M. Antitumoral effects of Melissa officinalis on breast cancer in vitro and in vivo. Asian Pac J Cancer Prev, v. 13, n. 6, p. 2765-70, 2012. SHARMA, K., ZAFAR, R. Occurrence of taraxerol and taraxasterol in medicinal plants. Pharmacogn Rev. v. 9, n.17, 2015.
123
SHIN, S.S.; WON, S.Y.; NOH, D.H.; HWANG, B.; KIM, W.J.; MOON, S.K. Morin inhibits proliferation, migration, and invasion of bladder cancer EJ cells via modulation of signaling pathways, cell cycle regulators, and transcription factor-mediated MMP-9 expression. Drug Dev. Res. v. 78, 2017. SHEN, K. Y.; SONG, Y. C.; CHEN, I. H.; CHONG, P.; LIU, S. J. Depletion of tumor-associated macrophages enhances the anti-tumor immunity induced by a Toll-like receptor agonist-conjugated peptide. Hum Vaccin Immunother. v. 10, n. 11, 2014. SHENG-YU, F.; EISER, C. Body image of children and adolescents with cancer: A systematic review. Body Image. v. 6, n. 4, 2009. SHIN Y. S.; CHANG, G. K.; YOU, J. J.; YEARAM, J.; HYERYOUNG, J.; JIHYUN, I. M.; YOONGHO, L. Euphorbia humifusa Willd exerts inhibition of breast cancer cell invasion and metastasis through inhibition of TNFα-induced MMP-9 expression. BMC Complement Altern Med. v.16, n.413, 2016. SHUMAN MOSS L.A., JENSEN-TAUBMAN S., AND STETLER-STEVENSON W.G. 2012. Matrix metalloproteinases: changing roles in tumor progression and metastasis. Am. J. Pathol. 2012. SILVA, V. L.; FERREIRA, D.; NOBREGA, F. L.; MARTINS, I. M.; KLUSKENS, L. D.; RODRIGUES, L. R. Selection of Novel Peptides Homing the 4T1 CELL Line: Exploring Alternative Targets for Triple Negative Breast Cancer. PLoS ONE, v.11, n.8, 2016. SILVA E CECHINEL FILHO: Plantas do gênero Bauhinia: composição química e potencial farmacológico. Quimica Nova. v. 25, n. 3, 2002. SINHA, P.; OSTRAND-ROSENBERG, S. Myeloid-derived suppressor cell function is reduced by Withaferin A, a potent and abundant component of Withania somnifera root extract. Cancer Immunol Immunother. v. 62, n. 11, 2013. STEEG, P. S. Metastasis suppressors alter the signal transduction of cancer cells. Nature Rev Cancer. v.3, 2003. SZATMARY, A. C.; STUELTEN, C.H.; NOSSAL, R. Improving the design of the agarose spot assay for eukaryotic cell chemotaxis. RSC Adv. v. 5, n. 4, 2015. TAIT, S. W.; ICHIM, G.; GREEN, D. R. Die another way-non-apoptotic mechanisms of cell death. J Cell Sci. v. 127, n. 10, 2014. TANSI, F. L.; RÜGER, R.; BÖHM, C.; KONTERMANN, R. E.; TEICHGRAEBER, U. K.; FAHR, A.;
HILGER, I. Potential of activatable FAP-targeting immunoliposomes in intraoperative imaging of spontaneous metastases. Biomaterials, 2016. TARIQ, A.; MUSSARAT, S.; ADNAN, M. Review on ethnomedicinal, phytochemical and pharmacological evidence of Himalayan anticancer plants.Journal of Ethnopharmacology. n.164, 2015. TIAN-BIAO, ZHOU Y.; H. Q. A., CHAO OU, FENG; YING LEI, LI; NA SU, EI; FANG,
124
HUANG YAN; JUN, ZHAO. All-trans retinoic acid can regulate the expressions of gelatinases and apolipoprotein-E in glomerulosclerosis rats. Vascular Pharmacology. 2011. TOR, Y. S.; YAZAN, L. S.; FOO, J. B.; WIBOWO, A.; ISMAIL, N.; CHEAH, Y. K.; ABDULLAH, R.;
ISMAIL, M.; ISMAIL, I. S.; YEAP, S. K. Induction of apoptosis through oxidative stress-related pathways in MCF-7, human breast cancer cells, by ethyl acetate extract of Dillenia suffruticosa. BMC Complementary and Alternative Medicine. 2013. TZONEVA, R.; UZUNOVA, V.; APOSTOLOVA, S.; KRÜGER-GENGE, A.; NEFFE, A. T.; JUNG, F.; LENDLEIN, A. Angiogenic potential of endothelial and tumor cells seeded on gelatin-based hydrogels in response to electrical stimulations. Clin Hemorheol Microcirc. 2016. URECH, K.; SCHER, JM.; HOSTANSKA, K.; BECKER, H. Apoptosis inducing activity of viscin, a lipophilic extract from Viscum album L. J Pharm Pharmacol, v.57, n.1, Jan. 2005. VAZ, AMSF 2010. Bauhinia in lista de espécies da flora do Brasil. Jardim Botânico do Rio de Janeiro. Disponível em <http:qqfloradobrasil.jbrj.gov.br/2010>. Acessado em janeiro de 2016. VIZETTO-DUARTE, C. CUSTÓDIO, L.; ACOSTA, G.; LAGO, J. H.; MORAIS, T. R.; BRUNO DE SOUSA, C.; GANGADHAR, K. N.; RODRIGUES, M. J.; PEREIRA, H.; LIMA, R. T.; VASCONCELOS, M. H.; BARREIRA, L.; RAUTER, A. P.; ALBERICIO, F.; VARELA, J. Can macroalgae provide promising anti-tumoral compounds? A closer look at Cystoseira tamariscifolia as a source for antioxidant and anti-hepatocarcinoma compounds. Peer J. v. 16, n. 4, 2016. WHITE, E.; MEHNERT, J. M.; CHAN, C. S. Autophagy, Metabolism, and Cancer. Clin. Cancer Res, v. 15, n. 21, 2015. WONG, F. C.; WOO, C.C.; HSU, A.; TA, B. K. H. The Anti-Cancer Activities of Vernonia amygdalina Extract in Human Breast Cancer Cell Lines Are Mediated through Caspase-Dependent and p53-Independent Pathways. PLoS One, v. 8, n. 10, 2013. WOOD, L.D.; PARSONS, D.W.; JONES, S.; LIN, J.; SJO BLOM, T.; LEARY, R.J.; SHEN, D.; BOCA, S.M.; BARBER, T.; PTAK, J.; et al. The genomic landscapes of human breast and colorectal cancers. Science, n. 318, 2007. YE, Y.; LIU, S.; WU, C.; SUN, Z. TGFb modulates inflammatory cytokines and growth factors to create premetastatic microenvironment and stimulate lung metastasis. J. Mol. Hist; n.46, 2015. ZETTER, B. R. Adhesion molecules in tumor metastasis. Semin Cancer Biol. v. 4, n. 4, ago. 1993. ZHENG Guo-yin, XIN Hai-liang, LI Bai, XU Yan-feng, YI Ting-jiao , and LING Chang-quan. Total Saponin from Root of Actinidia Valvata Dunn Prevents the Metastasis of Human Hepatocellular Carcinoma Cells. Chin J Integr Med. 2012.
125
ZHENG, L.; ZHANG, YM, ZHAN YZ, LIU CX. Momordica cochinchinensis seed extracts suppress migration and invasion of human breast cancer ZR-75-30 cells via down-regulating MMP-2 and MMP-9. Asian Pac J Cancer Prev. 2014.