Síntesis de gelantes que poseen un puente disulfuro para ...
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UNIVERSITAT JAUME I Escuela Superior de Tecnología y Ciencias Experimentales Departamento de Química Orgánica e Inorgánica Curso 2018/2019 Síntesis de gelantes que poseen un puente disulfuro para el auto-ensamblaje de nanopartículas en medio acuoso Trabajo Fin de Máster Autor: Ignacio Martínez Esteve Director: Juan Felipe Miravet Celades
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UNIVERSITAT JAUME I
Escuela Superior de Tecnología y Ciencias Experimentales
Departamento de Química Orgánica e Inorgánica
Curso 2018/2019
Síntesis de gelantes que poseen un puente
disulfuro para el auto-ensamblaje de
nanopartículas en medio acuoso
Trabajo Fin de Máster
Autor: Ignacio Martínez Esteve
Director: Juan Felipe Miravet Celades
UNIVERSITAT JAUME I
Escuela Superior de Tecnología y Ciencias Experimentales
Departamento de Química Orgánica e Inorgánica
Curso 2018/2019
Síntesis de gelantes que poseen un puente
disulfuro para el auto-ensamblaje de
nanopartículas en medio acuoso
Trabajo Fin de Máster
Autor: Ignacio Martínez Esteve
Director: Juan Felipe Miravet Celades
El Dr. Juan Felipe Miravet Celades, Profesor Titular del Departamento de Química
Inorgánica y Orgánica de la Universitat Jaume I de Castellón de la Plana, y el Dr.
César Augusto Angulo Pachón, Investigador de la Universitat Jaume I,
CERTIFICAN
Que el trabajo fin de grado con el título Síntesis de gelantes que poseen un puente
disulfuro para el auto-ensamblaje de nanopartículas en medio acuoso ha sido
realizado por Ignacio Martínez Esteve bajo su dirección, en el grupo Organic
Molecular Nanomaterials with Biomedical Applications del Departamento de
Química Inorgánica y Orgánica de la Universitat Jaume I de Castellón de la Plana.
Lo que certificamos a los efectos oportunos en Castellón de la Plana a 18 de julio
de 2019.
Fdo. Dr. Juan F. Miravet Celades Fdo. Dr. César A. Angulo Pachón
Agradecimientos
En primer lugar, me gustaría agradecer a mi tutor y director del este trabajo, Dr. Juan
Felipe Miravet Celades, por su dedicación y entrega.
También me gustaría agradecer al Dr. César Augusto Angulo Pachón por su paciencia,
su profesionalidad y su inestimable ayuda, así como su compañía en las interminables
horas de DLS.
Por supuesto, doy las gracias a las personas con las que compartí laboratorio, las cuales
ayudaron a que mi estancia allí fuera muy agradable, en especial a Noelia.
Y, desde luego, no quiero olvidarme de mi madre, la cual ha hecho posible mi estancia
aquí en Castellón. Sin su apoyo, sacrificio y entrega yo no sería la persona que soy. Por
todo eso y mucho más, gracias.
ABREVIATURAS
Suc Radical ácido succínico
Val Radical valina
Trp Radical triptófano
Cst Radical cistamina
DLS Dinamic Light Scattering
NPs Nanopartículas
GSH Glutatión reducido
Cbz ó Z Grupo benciloxicarbonil
TEM Transmission Electron Microscope
ÍNDICE
1. INTRODUCCIÓN 1
1.1. Nanogeles 1
1.2. Glutatión 3
1.3. Introducción al DLS 6
1.4. Introducción a la fluorescencia 9
2. OBJETIVOS 13
3. RESULTADOS Y DISCUSIÓN 15
3.1. Síntesis 15
3.2. Determinación de valores de pka 16
3.3. Análisis de la formación de nanopartículas mediante DLS 19
3.4. Microscopía electrónica 24
3.5. Fluorescencia 26
4. CONCLUSIONES 29
5. SECCIÓN EXPERIMENTAL 31
6. ANEXOS 37
6.1. Espectros de RMN 37
INTRODUCCIÓN
1
1. INTRODUCCIÓN
1.1. Nanogeles Las nanopartículas orgánicas están adquiriendo una gran importancia
actualmente en su uso como transportadores de fármacos en el apartado biomédico.
Los portadores de administración controlada de fármacos pueden mejorar las
propiedades farmacocinéticas de una amplia variedad de medicamentos. Además de
la liberación controlada de moléculas pequeñas (aprobadas por la FDA) y de los
liposomas cargados de fármacos quimioterapéuticos,1 los portadores de
nanopartículas son esenciales para el suministro de fármacos biomacromoleculares,
incluidos los ácidos nucleicos que no pueden atravesar las membranas celulares por sí
mismos. La incorporación de medicamentos en las nanopartículas no solo suprime de
manera efectiva la interacción con los componentes sanguíneos, sino que también
mejora la especificidad de los fármacos, reduce la toxicidad sistémica, mejora las tasas
de absorción del tratamiento y brinda protección a los productos farmacéuticos contra
la degradación.2, 3, 4
El diseño de portadores de administración de fármacos eficientes ha
evolucionado para llegar a proporcionar materiales biofuncionales innovadores. 5 Entre
los biomateriales disponibles, los hidrogeles han demostrado su valor en diversos
aspectos biomédicos.6
Los hidrogeles se describen como redes de polímeros tridimensionales
hidrófilas que pueden absorber grandes cantidades de agua o fluido fisiológico, al
1 Anselmo, C. A.; Mitragotri, S. J. Control. Release 2014, 190, 15. 2 Peer, D.; Karp, J. M.; Hong, S.; Farokhzad, O. C.; Margalit, R.; Langer, R. Nat. Nanotechnol. 2007, 2, 751. 3 Cheng, W; Gu.L; Ren, W; Liu, Y. Sci. Eng., C. 2014, 45, 600. 4 Kanasty, R.; Dorkin, J.R.; Vegas, A.; Anderson, D. Nat. Mater., 2013, 12, 967. 5 Remaut, K.; Sanders, N. N.; De Geest, B. G.; Braeckmans, K.; Demeester, J.; De Smedt. S. Mat. Sci. Eng. R., 2007, 58, 117. 6 Raemdonck, K; Demeester, J.; De Smedt, S. Soft Matter 2009, 5, 707.
2
tiempo que mantienen su estructura de red interna. 7, 8 Esto se debe a la presencia de
grupos hidrofílicos como –OH, –CONH–, –CONH2– y –SO3H en el polímero.9 Los
hidrogeles muestran propiedades de hinchamiento en lugar de disolverse debido a la
existencia de enlaces cruzados en su estructura. Su alto contenido de agua y baja
tensión superficial contribuyen a su biocompatibilidad y flexibilidad. Además, los
hidrogeles abarcan una alta capacidad de carga para compuestos bioactivos, tienen un
tiempo largo de circulación en sangre y son capaces de liberar su carga terapéutica de
forma controlada, por ejemplo, sitios tumorales. 10 La suma de estas propiedades más
la presencia de una red interior para la encapsulación de biomoléculas explican su
aplicación generalizada en ingeniería de tejidos, administración de fármacos y
diagnóstico.11, 12
Aunque hasta ahora la investigación se ha centrado principalmente en los
hidrogeles macroscópicos, comienza a haber un interés creciente en los hidrogeles de
dimensiones micro y nanoscópicas (denominados micro y nanogeles).13, 14
7 Peppas, N.A.; Bures P.; Leobandung, W.; Ichikawa, H. Eur. J. Pharm. Biopharm. 2000, 50, 27. 8 Gupta, P.; Vermani, K.; Garg, S. Drug Discov Today 2002, 7, 569. 9 Hamidi, M.; Azadi, A.; Rafiei, P. Adv. Drug Deliv. Rev. 2008, 60, 1638. 10 Gao, Y.; Xie, J.; Chen, H.; Gu, S.; Zhao, R.; Shao, J.; Jia, L. Biotechnol. Adv., 2014, 32, 761. 11 Peppas, N.A.; Hilt, J.Z.; Khademhosseini, A.; Langer, R., Adv. Mater. 2006, 18, 1345. 12 Molina, M.; Asadian-Birjand, M.; Balach, J.; Bergueiro, J.; Miceli, E.; Calderón, M. Chem. Soc. Rev. 2015, 44, 6161. 13 Nayak, S.; Lyon, L.A.; Angew. Chem. Int. 2005, 44, 7686. 14 Oh, J.K.; Drumright, R.; Siegwart D.J.; Matyjaszewski, K. Prog. Polym. Sci. 2008, 33, 448.
Figura 1.1. Tipos de geles
3
Las partículas de nanogel tienen propiedades similares a las del macrogel, pero
tienen el valor añadido de que, por ejemplo, tras la inyección intravenosa, se pueden
desplegar en áreas del cuerpo a las que no se puede acceder fácilmente mediante
hidrogeles macroscópicos.15 Como la mayoría de los nanogeles pueden ser captados
por las células, son candidatos ideales para la administración intracelular de fármacos.
Esto es de particular interés para los agentes terapéuticos que deben administrarse de
manera segura en el citoplasma de la célula diana, tales como oligonucleótidos, ARNsi,
péptidos y diversos agentes quimioterapéuticos de bajo peso molecular.6
1.2. Glutatión El glutatión (GSH) es un tripéptido compuesto por los aminoácidos glutamato,
cisteína y glicina que desempeña un papel antioxidante en los seres vivos.
Tiene importantes funciones como antioxidante, es parte importante de la
detoxificación de xenobióticos, es cofactor para las reacciones de isomerización y
también sirve como almacenamiento y transporte de cisteína.16 Además, es esencial
para la proliferación celular y tiene un papel importante en la apoptosis.17 Una función
muy importante del glutatión es mantener el potencial de óxido-reducción de la célula,
15 Malmsten, M. Soft Matter 2006, 2, 760. 16 Ballatori, N.; Krance, S.M.; Notenboom, S.; Shi, S.; Tieu, K.; Hammond, C.L. Bio. Chem. 2009, 390, 191. 17 Franco, R.; Cidlowski, J.A.; Cell Death Differ. 2009, 16, 1303.
Figura 1.2. Glutatión
4
ya que mantiene en estado reducido los grupos tiol de las proteínas y así permite la
generación de diversas cascadas de señalización intracelular.18
Varios compartimentos intracelulares como el citosol, las mitocondrias y el
núcleo celular contienen una alta concentración de glutatión (entre 2-10 mM), que es
de 100 a 1000 veces más alta que la de los fluidos extracelulares (entre 2-20 μM). Por
lo tanto, los polidisulfuros pueden degradarse en entornos fisiológicos (es decir, en
células), potencialmente con citotoxicidad reducida. Debido a esto, el glutatión ha sido
reconocido como un estímulo interno ideal para la rápida desestabilización de los
nanotransportadores dentro de las células para lograr una liberación intracelular del
fármaco eficiente.
Además, el nivel de GSH está relacionado con muchas enfermedades humanas
como enfermedades neurodegenerativas, hepáticas, accidentes cerebrovasculares,
convulsiones y diabetes,19, 20, 21, 22 y con distintos cánceres: mama, ovario, cabeza,
18 Martínez-Sámano, J.; Torres-Durán, P.V.; Juárez-Oropeza, M. A. REB. 2011, 30, 56. 19 Estrela, J.M.; Ortega A.; Obrador E. Crit. Rev. Clin. Lab. Sci., 2006, 43, 143. 20 Djuric, Z.; Malviya, V. K.; Deppe, G.; Malone, J. M.; McGunagle, Jr. D. L.; Heilbrun, L. K.; Reading B. A.; Lawrence, D. J. Cancer Res. Clin. Oncol. 1990, 116, 379. 21 Balendiran, G.K.; Dabur, R.; Fraser D.; Cell Biochem. Funct. 2004, 22, 343. 22 Franco, R.; Schoneveld, O. J.; Pappa, A.; Panayiotidis, M. I. Arch. Physiol. Biochem. 2007, 113, 234.
glutathione
Photoactive unit
Molecular gelator
Nanogel particlePhotosensitizing/sensingis quenched
Diassembled nanogelPhotosensitizing/sensingis activated
Figura 1.3. Acción del glutatión
5
cuello, y pulmón.23 De hecho, la concentración anormalmente alta de GSH en células
cancerosas protege a las células contra los medicamentos contra el cáncer y los
radicales libres generados durante la radioterapia, que dan como resultado resistencia
a múltiples fármacos y a la radiación.19,20
Esto podría proporcionar un potencial desencadenante fisiológico para la
degradación del polidisulfuro y la administración del fármaco a los tejidos enfermos.24
La química del tiol-disulfuro se ha convertido en una herramienta relevante
para la preparación de sistemas especializados de administración de fármacos. 25 Los
23 Gamcsik, M. P.; Kasibhatla, M. S.; Teeter, S. D.; Colvin, O.M. Biomarkers 2012, 17, 671. 24 Sun, W.; Ji, W.; Hu, Q.; Gu, Z. Physiol. Rev. 2017, 97, 189. 25 Kgesa, T.; Choonara, Y.E.; Tyagi, C.; Tomar, L.K.; Kumar, P.; du Toit, L.C.; Pillay, V. Curr. Drug Deliv. 2015, 12, 282.
Figura 1.4. Acción del glutatión
6
grupos disulfuro reducibles de glutatión se han incorporado en nanogeles con
resultados prometedores,26, 27 e incluso con éxito para experimentos in vivo. 28
1.3. Introducción al DLS
El DLS (Dinamic Light Scattering) es una técnica que se usa para medir el
tamaño de las partículas en la región submicrónica. Esto lo hace mediante el sondeo
de la movilidad hidrodinámica de las partículas.29
La anterior figura ilustra esquemáticamente las fluctuaciones típicas de la
intensidad que surgen de una dispersión de partículas grandes y una dispersión de
26 Adamo, G.; Grimaldi, N.; Campora, S.; Sabatino, M. A.; Dispenza, C.; Ghersi, G. Chem. Eng. Trans. 2014, 38, 457. 27 Pérez, E.; Olmo, R.; Teijón, C.; Muñíz, E.; Montero, N.; Teijón, J. M.; Blanco M. D. Colloid Surface B 2015, 136, 222. 28 Liu, X.; Wang, J.; Xu, W.; Ding, J.; Shi, B.; Huang, K.; Zhuang, X.; Chen, X. Int. J. Nanomedicine 2015, 10, 6587. 29 International Standard ISO 22412, Particle size analysis — Dynamic Light Scattering (DLS), 2017.
Figura 1.4. Fluctuación de partículas grandes y pequeñas
7
partículas pequeñas. Las partículas pequeñas hacen que la intensidad fluctúe más
rápidamente que las grandes.30
Ver el correlograma de una medición puede dar mucha información sobre la
muestra. El momento en que la correlación comienza a decaer significativamente es
una indicación del tamaño medio de la muestra. Cuanto más inclinada es la pendiente,
más monodispersa es la muestra. Por el contrario, cuanto más extendida se vuelve la
pendiente, mayor es la polidispersidad de la muestra.
Una forma muy simple de describir la diferencia entre las distribuciones de
intensidad, volumen y número es considerar 2 poblaciones de partículas esféricas de
diámetro 5 nm y 50 nm presentes en igual número. En este caso se obtendría una
gráfica que consta de 2 picos (a 5 y 50 nm) y con una relación de 1:1. Si esta distribución
de números se convirtiera en volumen, entonces los 2 picos cambiarían a una relación
de 1:1000 (debido a que el volumen de una esfera es igual a 4
3𝜋 (
𝑑
2)3.Si esto se
convirtiera en una distribución de intensidad, se obtendría una relación de 1:1000000
30 Malvern Instruments. Dynamic Light Scattering: An Introduction in 30 Minutes, 2017.
Figura 1.5. Correlograma de partículas grandes y pequeñas
8
entre los 2 picos (porque la intensidad de la luz según la dispersión de Rayleigh es
proporcional a d6).
Un sistema de dispersión de luz dinámico típico consta de siete componentes
principales. En primer lugar, un láser (1) proporciona una fuente de luz para iluminar la
muestra contenida en una celda (2). Las partículas que se encuentran dentro de la celda
dispersan la luz en todos los ángulos, y es por ello que se usa un detector (3) para medir
la luz dispersada. En la serie Zetasizer Nano, la posición del detector estará en 173o o
90o, dependiendo del modelo en particular.
La intensidad de la luz dispersada debe estar dentro de un rango específico
para que el detector pueda medirla con éxito. Si demasiada luz es detectada (partículas
grandes o muestras a mayor concentración), entonces el detector se saturará. Para
evitar esto, se utiliza un atenuador (6), el cual reduce la intensidad de la fuente del láser
y, por lo tanto, reduce la intensidad de la dispersión. Sin embargo, para muestras que
no dispersan mucha luz, como partículas muy pequeñas o muestras de baja
concentración, la cantidad de luz dispersada deberá incrementarse. En esta situación,
el atenuador permitirá un mayor paso de luz a la muestra.
Figura 1.6. Distribuciones de número, volumen e intensidad
9
La señal de intensidad de dispersión del detector se pasa a una placa de
procesamiento digital llamada correlador (4). El correlador compara la intensidad de
dispersión en intervalos de tiempo sucesivos para obtener la velocidad a la que varía la
intensidad. Esta información del correlador se pasa luego a un ordenador (5), donde el
software Nano analizará los datos y derivará la información del tamaño. Además, para
corregir cualquier diferencia en el espesor de la pared de la celda y la refracción del
dispersante, se instalan ópticas de compensación (7) dentro de la trayectoria del haz
de dispersión para mantener la alineación de los haces de dispersión.
1.4. Introducción a la fluorescencia Se sabe que las moléculas presentan varios niveles energéticos electrónicos y que
a temperatura ambiente el nivel energético que se encuentra más poblado es el de más
baja energía (fundamental). Como también se sabe, en un proceso de absorción
molecular medimos el paso de la molécula desde el estado fundamental a uno de los
estados excitados electrónicos de esa molécula.
Figura 1.7. Sistema de DLS
10
Cuando se produce el proceso de excitación, la molécula promociona un electrón
a un estado energético superior y por tanto se altera su configuración electrónica.
Obviamente también debe cambiar su estructura nuclear para adaptarse a esa nueva
distribución. Desde aquí la molécula devolvería la energía adquirida en forma de
radiación fluorescente.
Los movimientos nucleares son mucho más lentos que los movimientos
electrónicos y, por lo tanto, justo después del proceso de excitación la molécula
adquiere el estado electrónico excitado, pero sigue manteniendo la estructura nuclear
fundamental. Un instante más tarde la molécula se reordena, con lo que pierde parte
de la energía (Conversión Interna) adquiriendo entonces un estado excitado de menor
energía (figura 1.8.). La misma situación ocurre cuando la molécula vuelve al estado
fundamental.
En definitiva, parte de la energía del fotón absorbido se perderá en conversión interna,
y por tanto las moléculas devolverán menor energía de la adquirida.
Sin embargo, no todas las moléculas son fluorescentes. Se considera que la
fluorescencia va ligada a la capacidad que tenga la molécula de cambiar de estructura
entre el estado fundamental y el estado excitado, y eso depende fundamentalmente
de su aromaticidad y de su rigidez. La rigidez se puede relacionar con la existencia de
una estructura cíclica y la aromaticidad de una molécula cíclica se suele medir según la
Figura 1.8. Fluorescencia
11
regla de Hückel (molécula aromática es aquella que posee 4n+2 electrones
deslocalizados, siendo n un número entero).
OBJETIVOS
13
2. OBJETIVOS
El grupo de investigación en el que se ha realizado este trabajo está estudiando
la preparación de moléculas no poliméricas capaces de formar nanopartículas. En
concreto, una de las líneas de trabajo explora la preparación de nanopartículas
formadas por moléculas con puentes disulfuro. La idea es que en presencia de
glutationa se produzca la reducción a disulfuro y que esta ocasione la desagregación de
la partícula y la liberación de su cargo.
En el caso de las moléculas que se muestran a continuación, investigaciones
previas preliminares indicaban que a valores de pH neutros, donde predominan
especies iónicas, se formaban nanopartículas probablemente de tipo vesicular (Figura
2.1.)
Teniendo en cuenta lo anterior se proponen los siguientes objetivos:
-Sintetizar y caracterizar el compuesto SucValCst.
Figura 2.1. Vesícula
14
- Determinar las constantes ácido-base de SucValCst y SucValTrpCst. Esta última es una
molécula ya preparada previamente en el grupo.
-Estudiar la agregación de SucValCst y SucValTrpCst mediante DL.S
-Estudiar la agregación de SucValTrpCst fluorescencia.
Figura 2.2. Molécula del SucValCst
Figura 2.3. Molécula del SucValTrpCst
RESULTADOS Y DISCUSIÓN
15
3. RESULTADOS Y DISCUSIÓN
3.1. Síntesis
La preparación utiliza el aminoácido L-valina N-protegido con el grupo Z
(benciloxycarbonil) y activado como éster de N-hidroxisuccinimida. Esta molécula se
acopla con cistamina. Posteriormente se elimina el grupo N-protector Z usando
bromuro de hidrógeno en ácido acético. La diamina correspondiente se acila con
anhídrido succínico para dar lugar al producto buscado.
Esquema 3.1. Reactivos y condiciones: a) Cistamina, Et3N, THF, 24h, 66%; b) HBr al 33% en AcOH,
éter, 24h, 100%; c) Anhídrido succínico, Na2CO3, THF, 1h, 56-77%.
El mecanismo correspondiente a la desprotección del grupo Z se muestra a
continuación. La reacción transcurre en medio ácido. El anión bromuro ataca el
carbono bencílico, desplazando un ácido carbámico y generando bromuro de bencilo.
El ácido carbámico resultante es inestable, perdiendo dióxido de carbono, dando lugar
a la amina desprotegida buscada.
16
Esquema 3.2. Mecanismo desprotección grupo Z
3.2. Determinación de valores de pka Se realizaron valoraciones potenciométricas para determinar los valores las
constantes de acidez de los compuestos estudiados. Los valores obtenidos se
analizaron con el programa HYPERQUAD. Este programa ajusta los valores
experimentales a los calculados con una iteración de valores de pKa. En las gráficas
siguientes se muestran los valores obtenidos.
17
Figura 3.3. Hyperquad SucValCst
Figura 3.4. Hyperquad SucValTrpCst
3
3.5
4
4.5
5
5.5
6
2.3 2.5 2.7 2.9 3.1 3.3 3.5
pH
volume / mL
Observed pH Calculated pH
pKa AH2 =4.29 + 0.05pKa AH- = 5.22 + 0.05
SucValCst
18
Con los valores de pka obtenidos se pueden obtener los diagramas de
distribución de especies que se muestran a continuación. Puede observarse que la
especie completamente desprotonada, dianiónica, predomina por encima de pH 5-6,
aproximadamente, mientras que por debajo lo hace la especie neutra diprotonada. La
especie monoprotonada tiene un intervalo de pH de existencia limitado entre ambas
zonas, siendo minoritaria en todo el rango de valores de pH.
Figura 3.5. Diagrama de especies SucValTrpCst
19
Figura 3.6. Diagrama de especies SucValCst
3.3. Análisis de la formación de nanopartículas
mediante DLS
Se estudió la formación de nanopartículas por las moléculas SucValCst y
SucValTrpCst mediante medidas de DLS. Se midió la intensidad de luz dispersada, que
depende de la cantidad y tamaño de partículas, a varios valores de pH. Como se observa
en la Figura 3.7., en el caso de SucValCst en el rango de pH 3-6, se obtiene una
intensidad de dispersión baja, indicativa de la ausencia de agregación. El valor de pH 7
representa un punto crítico a partir del cual se observa un aumento muy significativo
de la intensidad, indicando la formación de nanopartículas. Este resultado indicaría que
se observan nanopartículas cuando la molécula SucValCst se encuentra
completamente desprotonada, en su forma dianiónica, sugiriendo la formación de
especies de tipo vesícula.
20
El análisis de los datos de dispersión de luz, en concreto de los correlogramas
obtenidos por DLS, permite obtener una distribución de tamaños de los objetos
detectados. Como se observa en la Figura 3.8., se obtuvo una distribución de diámetros
bimodal, con partículas que presentaban diámetros promedio de aproximadamente
100 y 400 nm.
0
500
1000
1500
2000
2500
3000
2 3 4 5 6 7 8 9 10
Inte
sid
ad d
e lu
z d
isp
ersa
da
pH
Transformaciónmatemática
100 nm
400 nm
Figura 3.8. Correlograma del SucValCst (8 mM) a) y pH=7 (derecha)
Figura 3.7. Intensidad de luz dispersada medida por DLS
para las partículas formadas por SucValCst, c = 8 mM
21
En el caso de la molécula SucValTrpCst, el análisis de la intensidad de luz
dispersada a diferentes valores de pH reveló un comportamiento peculiar. En la figura
3.9. se muestra como la intensidad de luz dispersada sufre un aumento muy notable a
pH 6, siendo la misma muy inferior tanto a valores de pH superiores como inferiores.
Teniendo en cuenta los diagramas de distribución de especies mostrados
anteriormente, a pH 6 existe la forma monoaniónica de SucValTrpCst, y sería esta la
responsable de los objetos formados.
Un análisis de la intensidad de luz dispersada a pH 6 para diferentes
concentraciones de SucValTrpCst muestra como la concentración crítica de agregación
para esta molécula está en torno a 1 mM. A partir de este valor la intensidad sube
notablemente como resultado de la formación de agregados. (Figura 3.9.).
Figura 3.9. Intensidad de luz dispersada medida por DLS para las partículas formadas
por SucValCst, c = 2 mM
0
10000
20000
30000
40000
50000
60000
70000
2 3 4 5 6 7 8 9 10 11
Inte
sid
ad d
e lu
z d
isp
ersa
da
pH
22
Figura 3.10. Intensidad de luz dispersada medida por DLS para las partículas formadas
por SucValCst, pH = 6
También se realizó un estudio de la concentración crítica de agregación a pH
7.4, el correspondiente a tampón fosfato de pH biológico. A este valor de pH, según las
constantes de acidez anteriormente expuestas, la molécula debe estar en su forma
dianiónica. Puede observarse en la Figura 3.11. como se observa una concentración
crítica de agregación, observable por el aumento brusco de la intensidad, de
aproximadamente 5 mM (Figura 3.11.).
El análisis de distribución de tamaños por DLS muestra en el caso de
SucValTrpCst a pH 6, forma monoaniónica, una distribución monodispersa, con forma
gaussiana simétrica, y valores promedio de diámetro en torno a 200 nm (Figura 3.12.).
En el caso de la misma molécula a pH 7.4, forma dianiónica, se observa una distribución
menos simétrica centrada en torno a aproximadamente 100 nm (Figura 3.12.).
0
100000
200000
300000
400000
500000
0 0.5 1 1.5 2
Inte
nsi
dad
de
luz
dis
per
sad
a /
kcp
s
concentración / mM
23
Figura 3.11. Intensidad de luz dispersada medida por DLS para las partículas formadas
por SucValCst, pH 7.4
Figura 3.12. Distribución de tamaños para SucValTrpCst a pH 6 (izquierda) y pH 7
(derecha)
Por lo tanto, SucValCst como SucValTrpCst forman nanopartículas,
presuntamente de tipo vesícula, en su forma dianiónica que predomina a valores de pH
7.4. y superiores. En el caso de SucValTrpCst, es de destacar que al parecer su forma
0
20000
40000
60000
0 2 4 6 8 10 12 14
Inte
nsi
dad
de
luz
dis
per
sad
a /
kcp
s
concentración / mM
24
monoaniónica forma nanopartículas monodispersas a pH 6. Estas partículas son
diferentes a las que se detectan a pH 7.4, dadas las diferencias de intensidad de
dispersión de luz, así como de distribución de tamaños observadas por DLS.
3.4. Microscopía electrónica Se realizo un estudio de microscopia de electrónica para intentar obtener
imágenes de las partículas detectadas por DLS. Para ello se prepararon muestras sobre
rejillas de microscopia electrónica de transmisión y, se trataron con ácido
fosfotungtístico como agente de contraste y se dejaron secar al aire. Se realizó este
estudio solamente con SucValTrpCst, quedando pendiente la obtención de imágenes
de SucValCst.
Como puede observarse en la Figura 3.13. a pH 6 SucValTrpCst muestra objetos
alargados, de aspecto muy uniforme con una longitud aproximada de 200 nm y anchura
de unos 20 nm. Hay que tener en cuenta que el diámetro obtenido por DLS, diámetro
de unos 100 nm, es el resultado de ajustar los datos de dispersión de luz a partículas
esféricas. Por el contrario, a pH 7.4 se observan partículas con una morfología muy
diferente, esféricas con características de vesícula, presentando bordes con un
contraste más intenso que el interior. Adicionalmente, puede observarse la formación
de fibras helicoidales. De hecho, se observó que con el tiempo la muestra formo un gel
macroscópico, sugiriendo la evolución de las vesículas a fibras.
La racionalización de estas diferencias de forma no es trivial y se estudiará en
el futuro en el grupo de investigación en el que se ha realizado este trabajo.
25
pH = 6
pH = 7
Figura 3.13. Microscopía electrónica de SucValTrpCst a
pH 6 y 7.4
26
3.5. Fluorescencia
Dadas las características fluorescentes de la unidad de triptófano presente en
SucValTrpCst, se estudió la posibilidad de evaluar la agregación mediante medidas de
emisión. Todas las medidas con excitación con luz de 280 nm.
En la figura 3.14. se puede observar como a pH 6 el aumento progresivo de la
concentración de SucValTrpCst hasta 2.5 mM provoca un aumento de la fluorescencia
absoluta, sin embargo, a partir de esa concentración, la fluorescencia disminuye. Por
otro lado, la representación de la fluorescencia molar, es decir, el cociente entre
intensidad de fluorescencia y la concentración de SucValTrpCst en la muestra permite
ver un cambio brusco de tendencia (Figura 3.15.). Partiendo de concentraciones bajas,
al incrementar las mismas hasta 1 mM se observa una disminución lineal. Esto
probablemente indica perdida de eficiencia de emisión debido a “quench” de estados
excitados resultado de choques intermoleculares, que aumentan con la concentración.
Significativamente, a partir de 1 mM se observa una mucho menor dependencia de la
intensidad de emisión relativa. Esta transición puede adscribirse a un punto crítico
formación de nanopartículas que estaría en torno a 1-1.5 mM, valor que coincide con
el obtenido por DLS.
0
200
400
600
800
1000
300 350 400 450 500 550
Inte
nsi
dad
Longitud de onda (nm)
[0] [0.5] [1] [1.5] [2] [2.5] [3] [3.5]
Figura 3.14. Fluorescencia SucValTrpCst pH=6 [0-3.5mM]
27
Figura 3.15. Fluorescencia SucValTrpCst pH=6 [0-3.5mM]
Figura 3.16. Fluorescencia SucValTrpCst pH=7.4 [0-3.5mM]
De igual manera se hizo un estudio a pH 7.4 (Figuras 3.16. y 3.17.). En esta
gráfica se observa como la emisión absoluta disminuye con la concentración; y la
0
200
400
600
800
1000
300 350 400 450 500 550
Inte
nsi
dad
Longitud de onda (nm)
[0] [0.5] [1] [1.5] [2] [2.5] [3] [3.5]
0
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800
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1400
1600
1800
2000
0 0,5 1 1,5 2 2,5 3 3,5 4
Inte
nsi
dad
/ [
]
[ ] (mM)
28
relativa muestra dos tendencias diferentes antes y después de 1 mM. Este punto, por
la tanto, también representaría la concentración crítica de formación de agregados. Sin
embargo, este valor de concentración no coincide con el obtenido por DLS
(aproximadamente 4 mM). Esta contradicción podría indicar que los agregados
inicialmente formados a pH 7.4 son de tamaño muy pequeño, dispersando muy poca
intensidad de luz. Sería la evolución de estos agregados seminales hacia partículas
nanométricas las que provocaría la detección por DLS a partir de concentraciones de 4
mM.
Figura 3.17. Fluorescencia SucValTrpCst pH=7.4 [0-3.5mM]
0
1000
2000
3000
4000
5000
6000
7000
0 0,5 1 1,5 2 2,5 3 3,5 4
Inte
nsi
dad
/ [
]
[ ] (mM)
CONCLUSIONES
29
4. CONCLUSIONES
- Se ha sintetizado de forma eficiente y caracterizado la molécula SucValCst con
un rendimiento global del 51%.
- La valoración potenciométrica de SucValCst y SucValTrpCst muestra que a
valores de pH cercanos a la neutralidad, y superiores, estas moléculas están en
disolución como dianiones. Las especies monoaniónicas existen en un intervalo
de valores de pH limitado, en torno a 5-6, siendo siempre minoritarias.
- Los estudios de DLS demuestran la formación de nanopartículas a pH 7 para
ambas moléculas.
- En el caso de SucValTrpCst, a pH 6 se forman partículas de diferente naturaleza
de las obtenidas a pH 7.4, probablemente formadas por la especie
monoaniónica.
- Las imágenes de TEM obtenidas confirman la diferente morfología de las
nanopartículas formadas por SucValTrpCst a pH 6 y 7.4.
- Los estudios de fluorescencia de SucValTrpCst permiten determinar la
concentración critica de agregación de esta molécula.
SECCIÓN EXPERIMENTAL
31
5. SECCIÓN EXPERIMENTAL
5.1 Métodos Generales
Los espectros de RMN de 1H y de 13C fueron realizados con equipos 400 y 500 MHz,
usando como disolvente el dimetilsulfóxido a una temperatura de 30ºC. Las señales del
disolvente deuterado (DMSO-d6) que se toman como referencia son, el singulete de
2.50 ppm y el quintuplete que aparece a 39.52 ppm, de los espectros de 1H y 13C,
respectivamente. Las señales fueron asignadas con la ayuda de los métodos 2D (COSY
y HSQC).
El espectro de masas fue realizado por Mass Spectrometry triple Quadrupole Q-TOF
Premier con Electrospray y APCI acoplados (ESMS).
Las reacciones que necesitaban atmósfera inerte fueron llevadas a cabo bajo una
atmósfera de N2. Los reactivos disponibles comercialmente fueron utilizados tal y
como fueron recibidos.
5.2 Síntesis del SucValCst.
Esquema 5.1. Reactivos y condiciones: a) Cistamina, Et3N, THF, 24h, 66%; b) HBr al 33% en AcOH,
éter, 24h, 100%; c) Anhídrido succínico, Na2CO3, THF, 1h, 56-77%.
32
5.2.1. Síntesis del ZValCst.
A una suspensión del hidrocloruro de cistamina (2.0 g, 8.88 mmol) y Et3N (2.5 mL, 17.77
mmol, 2.0 eq.) en THF (50 mL) bajo atmósfera de nitrógeno y a temperatura ambiente
se le añadió gota a gota con un embudo de adición compensada una disolución de
ZValOSu (6.2 g, 17.77 mmol, 2.0 eq.) en THF (10 mL). La mezcla obtenida se dejó
agitando toda la noche en atmósfera de nitrógeno y a 55ºC. Seguidamente el disolvente
fue eliminado a vacío y el sólido obtenido se lavó primero con agua básica y luego con
agua ácida. Finalmente se realizó un último lavado con agua destilada obteniéndose un
sólido blanco el cual se dejó secando en estufa de vacío durante 16 horas a 50ºC.
Rendimiento: 3.62g, 66%.
RMN 1H (400 MHz, DMSO-d6): δ 8.10 (t, J = 5.3 Hz, 2H), 7.43 – 7.26 (m, 10H), 7.21 (d, J
= 8.8 Hz, 2H), 5.16 – 4.95 (m, 4H), 3.81 (t, J = 7.8 Hz, 2H), 3.49 – 3.19 (m, 4H, solapado
con singulete ancho del agua), 2.77 (t, J = 6.5 Hz, 4H), 1.95 (dq, J = 13.5, 6.7 Hz, 2H),
0.84 (aparente t, J = 6.0 Hz, 12H).
RMN 13C (101 MHz, DMSO-d6): δ 171.3, 156.1 (C=O), 137.1, 128.3 (x2) (CH), 127.7 (C),
127.6 (CH), 65.4 (CH2), 60.39(CH), 37.8, 37.1 (CH2), 30.19 (CH), 19.20, 18.14 (CH3).
HR ESMS: m/z: calcd for C30H42N4O6S2: 618.2624; found: 619.2621 [M + H+].
5.2.2. Síntesis del HValCst.
33
En un balón de dos bocas se pesó ZValCst (2.4 g, 3.84 mmol) y bajo atmósfera de
nitrógeno se añadió HBr 33% en ácido acético (10 ml). La mezcla se dejó agitando toda
la noche a temperatura ambiente. Trascurrido ese tiempo, se añadió lentamente dietil
éter (10 mL) observándose la precipitación de un sólido lila. El sólido es filtrado a vacío
y lavado con dietil éter. A continuación, el residuo se disuelve en agua destilada (100
mL) y seguidamente se lleva a pH 12 con hidróxido de sodio sólido. Finalmente se
realizaron extracciones con CHCl3 (x2 veces), la fase orgánica es secada con Na2SO4
anhidro y el disolvente es eliminado a vacío, obteniéndose un aceite amarillo.
Rendimiento: 1.35g, 100%.
RMN 1H (300 MHz, DMSO-d6): δ 8.04 (t, J = 5.6 Hz, 2H), 3.43 – 3.34 (m, 4H, solapado
con singulete ancho del agua), 2.93 (d, J = 5.1 Hz, 2H), 2.79 (t, J = 6.8 Hz, 4H), 1.96 –
1.79 (m, 2H, solapado con singulete ancho de las aminas), 0.86 (d, J = 6.9 Hz, 6H), 0.78
(d, J = 6.8 Hz, 6H).
RMN 13C (101 MHz, DMSO-d6): δ 174.6 (C=O), 60.0 (CH), 37.6, 37.3 (CH2), 31.5 (CH),
19.5, 17.0 (CH3).
HR ESMS: m/z: calcd for C14H30N4O2S2: 350.1888; found: 351.1888 [M + H+].
5.2.3. Síntesis del SucValCst.
A una disolución de la diamina (827 mg, 3.84 mmol, 1.0 eq.) en THF (150 mL) fue tratada
a 0ºC con carbonato de sodio (968 mg, 26.9 mmol, 7.0 eq.). La mezcla se agitó durante
15 minutos a 0ºC, después con la ayuda de un embudo de adición compensada se le
añadió gota a gota una solución de anhídrido succínico comercial (481 mg, 15.4 mmol,
4.0 eq.) en THF (130 mL). La mezcla resultante se agitó vigorosamente durante 16 horas
a temperatura ambiente. Al día siguiente, la mezcla fue concentrada a vacío, el residuo
34
sólido blanco se disolvió en agua (200 mL). A continuación, se añadió cuidadosamente
HCl al 37% hasta observarse la precipitación de un sólido blanco (pH = 2). El sólido fue
filtrado a vacío y el residuo se lavó con agua destilada hasta pH = 7. El compuesto final
se secó en estufa de vacío durante toda la noche a 50ºC. Rendimiento: 1.73g, 77%.
RMN 1H (400 MHz, DMSO-d6): δ 8.18 (t, J = 5.3 Hz, 1H), 7.93 (d, J = 8.9 Hz, 1H), 4.10
(dd, J = 8.9, 6.7 Hz, 1H), 3.34 (dtt, J = 19.9, 13.3, 6.6 Hz, 2H), 2.78 (t, J = 6.8 Hz, 2H), 2.41
(s, 4H), 1.97 (dp, J = 13.5, 6.8 Hz, 1H), 0.83 (dd, J = 6.8, 2.5 Hz, 6H).). El protón del ácido
no fue observado.
RMN 13C (101 MHz, DMSO): δ 174.5, 171.7, 171.7 (C=O), 58.4 (CH), 38.4, 37.6, 30.79,
30.6 (CH2), 30.0 (CH), 19.7, 18.6 (CH3).
HR ESMS: m/z: calcd for C22H38N4O8S2: 550.2053; found: 549.2049 [M – H+].
5.3 Determinación del pka.
Las valoraciones potenciométricas fueron llevadas a cabo a 298 K. El procedimiento
consistía en disolver 30 mg de SucValCst en 7 mL de NaOH 0.05 M, la disolución
resultante fue valorada con una solución comercial normalizada de HCl 0.1 M agitando
vigorosamente. El ácido fue añadido usando una bomba de adición “Just Infusion”
modelo NE-300 MR (0.033 mL/min, diámetro interno 14.57 mm), se usó una jeringuilla
analítica SGE hermética a los gases de 10 mL conectada a una aguja con Luer Lock de
acero inoxidable (0.7 mm x 300 mm). El pH fue monitorizado cada 10 segundos con un
pHmetro Mettler Toledo modelo S220 Seven Compact. Los datos de valoración
obtenidos fueron tratados con el programa HYPERQUAD. Para evaluar el producto de
solubilidad del derivado de ácido, la valoración fue detenida cuando se observó un
precipitado sólido. Luego, el producto de solubilidad se calculó iterativamente con el
programa HYSS2009, ajustando los valores al pH calculado y experimental.
35
5.4 TEM.
Las imágenes de transmisión electrónica fueron obtenidas usando un microscopio JEOL
2100 con pistola termoiónica LaB6 200 kV y equipado con una cámara CCD de alta
resolución Gatan Orius. Las muestras de TEM fueron preparadas sobre gradillas de
cobre Formvar/Carbon film on 200 mesh. El gel fue aplicado directamente sobre la
gradilla y el exceso de solvente fue cuidadosamente removido por capilaridad usando
un trozo de papel de filtro. Seguidamente, para tintar las muestras, se puso una gota
de ácido fosfotúngstico al 1% en agua sobre la gradilla durante dos minutos.
5.5 DLS (Dynamic Light Scattering).
Las medidas de tamaño de las nanopartículas se realizaron mediante dispersión
dinámica de la luz (DLS, por sus siglas en inglés), se usó un Zetasizer Nano ZS (Malvern).
Los análisis se llevaron a cabo usando un láser de He–Ne laser (633 nm) con un ángulo
de dispersión de 173o. Se usó el modo de optimización y atenuación automática para
todas las muestras, las medidas de las suspensiones de nanopartículas se hicieron con
cubetas de plástico óptico (PMMA), marca Hellma Analytics de 3 mL de capacidad y 10
mm de paso óptico. Todas las lecturas se realizaron a 25ºC.
5.6 Preparación de las nanopartículas.
Para la preparación y estudio de las nanopartículas se realizaron pruebas a diferentes
pH.
El tampón pH 3 fue preparado mediante glicina a 0.2M y HCl; los tampones pH 4 y 5
fueron preparados mediante ácido acético y acetato de potasio ambos 0.1M; los
tampones pH 6, 7.4 y 8 fueron preparados mediante NaH2PO4 y Na2HPO4 ambos 0.2M;
36
los tampones pH 9 y 10 se me dieron ya preparados. Todos los tampones fueron
filtrados con filtros de celulosa regenerada de 0.2 micras.
Para la preparación de muestras de SucValCst a una determinada concentración,
primero se calculaba la masa que se tenía que pesar en la balanza analítica sabiendo
que el volumen final siempre era de 2,5 ml. Tras hacer esto, se añadía el tampón
correspondiente previamente preparado y se sonicaba durante 30 min. Una vez
terminada la sonicación, se hacía un trasvase de 2 ml a una cubeta de plástico
previamente limpiada mediante pistola de aire. Finalmente, se lleva la muestra al DLS
para poder determinar el tamaño de partícula.
Hay que comentar que las muestras de pH=3, 4, 5, 6 no se disuelven bien y que
por lo tanto no se obtiene una disolución uniforme y homogénea, y como consecuencia
no se obtendrán buenos datos en el DLS. Las disoluciones son
blanquecinas/transparentes.
El compuesto SucValTrpCst se me dio ya preparado en el laboratorio, por lo
que no tuve que sintetizarlo.
La preparación del compuesto SucValTrpCst es prácticamente similar a la del
compuesto. La única diferencia se encuentra en el tiempo de sonicación; este segundo
compuesto al tener triptófano, es más grande, de mayor peso molecular y más
insoluble; es por ello que el tiempo de sonicación es algo mayor (unos 35-40 minutos).
Además, como ocurría en el SucValCst, las muestras tamponadas a pH ácidos
(3, 4, 5 y 6) son insolubles y se forman agregados, mientras que a partir de pH=7.4 las
muestras se disolvían con facilidad obteniéndose un líquido amarillo-transparente tras
la sonicación.
ANEXOS
6. ANEXOS
6.1. Espectros de RMN
Figura 6.1. Espectro de protón del ZValCst en DMSO-d6.
Figura 6.2. Espectro de carbono del ZValCst en DMSO-d6.
Figura 6.3. Espectro de protón del HValCst en DMSO-d6.
Figura 6.4. Espectro de carbono del HValCst en DMSO-d6.
Figura 6.5. Espectro de protón del SucValCst en DMSO-d6.
Figura 6.6. Espectro de carbono del SucValCst en DMSO-d6.
