Síntese e Avaliação da Atividade Antimicrobiana e ... · Danniel Delmondes Feitoza Síntese e...

Universidade Federal de Pernambuco Centro de Ciências da Saúde

Departamento de Ciências Farmacêuticas Programa de Pós-Graduação em Ciências Farmacêuticas

Dissertação de Mestrado

Síntese e Avaliação da Atividade Antimicrobiana e Citotóxica da série 2-[(4-piridinil-metileno)hidrazono]-

5-benzilideno4-tiazolidinonas

Danniel Delmondes Feitoza

Recife - PE, 2010

Danniel Delmondes Feitoza

Síntese e Avaliação da Atividade Antimicrobiana e Citotóxica da série 2-[(4-piridinil-metileno)hidrazono]-

5-benzilideno-4-tiazolidinonas

Dissertação Apresentada ao Programa

de Pós-Graduação em Ciências

Farmacêuticas como Parte dos

Requisitos para a Obtenção do Título

de Mestre em Ciências Farmacêuticas –

Área de Concentração: Síntese e

Planejamento de Fármacos.

Orientador: Prof. Dr. José Gildo de Lima

Co-orientador: Prof. Dr. Alexandre José da Silva Góes

Recife - PE, 2010

Feitoza, Danniel Delmondes

Síntese e avaliação da atividade antimicrobiana e citotóxica da série 2-[(4-piridinil-metileno)hidrazono]-5-benzilideno-4-tiazolidinonas / Danniel Delmondes Feitoza . – Recife: O Autor, 2010.

93 folhas: il., fig., tab. e quadro.

Dissertação (mestrado) – Universidade Federal de Pernambuco. CCS. Ciências Farmacêuticas, 2010.

Inclui bibliografia.

1. 4-tiazolidinona. 2. Antimicrobiana. 3.

Antiproliferativa. 4. Hibridação molecular. 5.

Simplificação molecular. I.Título.

UFPE

615.19 CDD (22.ed.) CCS2010-172

ii

Universidade Federal de Pernambuco Centro de Ciências da Saúde

Departamento de Ciências Farmacêuticas Programa de Pós-Graduação em Ciências Farmacêuticas

Reitor

Prof. Amaro Henrique Pessoa Lins

Vice-Reitor

Prof. Gilson Edmar Gonçalves e Silva

Pró-Reitor para Assuntos de Pesquisa e Pós-Graduação

Prof. Anísio Brasileiro de Freitas Dourado

Diretor do Centro de Ciências da Saúde

José Thadeu Pinheiro

Vice-Diretor do Centro de Ciências da Saúde

Márcio Antônio de Andrade Coelho Gueiros

Chefe do Departamento de Ciências Farmacêuticas

Prof. Dalci José Brondani

Vice-chefe do Departamento de Ciências Farmacêuticas

Antonio Rodolfo de Faria

Coordenador do Programa de Pós-Graduação em Ciências Farmacêuticas

Prof. Pedro Rolim Neto

Vice-Coordenadora do Programa de Pós-Graduação em Ciências Farmacêuticas

Prof.ª Beate Saegesser Santos

iii

A minha família, em especial meus pais Nereu e Luzidete, por todo esforço em me dar

oportunidades e incentivos para que eu chegasse até aqui e pela compreensão nos

momentos alegres e difíceis na minha vida...

iv

AGRADECIMENTOS

Primeiramente a Deus pelo dom da vida, pelas oportunidades que tem me concedido e

pela força para vencer cada desafio e dificuldade.

A minha família, em especial meus pais e irmãos, pelo apoio e incentivo.

Ao Prof. Dr. José Gildo de Lima pela oportunidade concedida e conhecimento

compartilhado desde o tempo de iniciação científica.

Ao Prof. Dr. Alexandre Góes pelas idéias, sugestões e ensinamentos para realização

deste trabalho.

Á Prof. Dra. Janete Magali Araújo e a Mestranda Érica Soares do laboratório de Ensaios

antimicrobianos do Departamento de Antibióticos da UFPE, pela realização dos ensaios

biológicos.

Á Profa. Dra. Terezinha Gonçalves da Silva, Profa. Dra. Silene Carneiro do

Nascimento, Maria do Desterro Rodrigues e Jaciana Santos Aguiar do Laboratório de

Bioensaios para Pesquisa de Fármacos e Laboratório de Cultura de Células,

departamento de Antibióticos - UFPE, pela realização dos ensaios de citotoxicidade.

Aos integrantes da Central Analítica, em especial Eliete, Ricardo, Severino, Elias e

Abeni, pela dedicação na realização dos experimentos espectroscópicos.

Aos amigos de laboratório Liesen, Thiago e George, por repassarem toda experiência

nos trabalhos realizados no laboratório, e aos demais pelos momentos de descontração e

aperreio no decorrer da realização das disciplinas.

Á PROPESQ e CNPq pelo apoio financeiro parcial.

A todos(as) os(as) professores(as) que, com paciência e dedicação, contribuíram para

minha formação ao longo de todos os anos.

v

“Vemos e vamos hoje mais longe porque nos apoiamos em ombros de gigantes...”

Autor desconhecido

vi

Resumo

A resistência bacteriana é um problema de saúde pública. A disseminação do uso de antibióticos e sua presença no meio ambiente fizeram com que as bactérias desenvolvessem defesas relativas aos agentes antibacterianos, impondo sérias limitações as opções para o tratamento de infecções. Em consonância, o câncer é uma das doenças que mais causam temor na sociedade, por ter se tornado um estigma de mortalidade e dor. Devido a estes fatos alarmantes tem-se aumentado a procura por fármacos que proporcionem um tratamento mais eficaz e seguro. 4-tiazolidinonas se destacam por pertencerem a uma classe de compostos com atividade biológica comprovada; vários produtos naturais e sintéticos contêm esse heterociclo em suas estruturas. Com base na importância dessas moléculas desenvolvemos a síntese da série 2-[(4-piridinil-metileno)hidrazono]-5-benzilideno4-tiazolidinonas 4a-l intencionando desenvolver novas moléculas potencialmente ativas contra bactérias e fungos, e com atividade antineoplásica. Adotamos como estratégia de planejamento a hibridação molecular e simplificação molecular. Os compostos foram obtidos em três etapas. As tiossemicarbazonas 2a-d foram sintetizadas utilizando quantidades equimolares de 4-formilpiridina e tiossemicarbazidas 1a-d em meio hidroetanólico com pequena quantidade de ácido acético como catalizador. As 4-tiazolidinonas da série 3a-d foram obtidas pela ciclização de 4-formilpiridina tiossemicarbazonas 2a-d com ácido cloroacético em presença de acetato de sódio anidro em meio etanólico; os compostos finais 5-bezilideno-4-tiazolidinonas 4a-l foram sintetizados pela condensação de aldeídos aromáticos com intermediários 3a-d. Os compostos foram purificados e apresentaram rendimentos entre 47-82%, em adição foram caracterizados por suas propriedades físico-químicas e por métodos espectroscópicos (IV, RMN 1H e 13C) e espectrométrico (MS). Todos os compostos da série 4a-l, além de seus intermediários 3a-d, foram testados in vitro frente a bactérias, fungos e para atividade antineoplásica. Os compostos 4a-l não apresentaram atividade antimicrobiana considerável, no entanto, o intermediário 3b mostrou considerável atividade antibiótica frente a B. subitilis e antifúngica frente a C. albicans, com zona média de inibição (ZMI) de 26 mm e 25 mm, respectivamente. Este composto apresentou altos valores de CMI (250 µg/mL e 500 µg/mL) em comparação aos antibióticos cloranfenicol (CMI = 30 µg/mL) e rifampicina (CMI = 120 µg/mL) e o antifúngico nistatina (CMI = 50 µg/mL). A atividade anticâncer dos compostos 3a-d e 4a-l foram testadas contra células NCI-H292 (obtidas de carcinoma mucoepidermoíde de pulmão), HEp-2 (obtidas de carcinoma epidermoíde de laringe) e K562 (leucemia mielocítica crônica). O composto 3b apresentou inibição similar ao etoposideo (CI50 = 4,48 µg/mL) para células K562 (CI50 = 4,25 µg/mL). O composto 4l mostrou-se eficaz para inibição de células NCI-H292 com CI50 = 1,38 μg/mL (etoposideo 1,31 µg/mL). A ausência de hemólise em eritrócitos de camundongos (CE50 > 500 µg/mL) sugere que a citotoxicidade não está relacionada a danos na membrana. A inserção do grupo benzilidênico (série 4a-l) não foi eficiente para uma atividade antimicrobiana plausível. Para atividade anticâncer o composto 4l mostrou uma ótima atividade frente a células NCI-H92 podendo ser compensador um estudo mais aprofundado deste composto.

Palavras-chave: 4-tiazolidinona, Antimicrobiana, Antiproliferativa, Hibridação

molecular, Simplificação molecular.

vii

Abstract

Bacterial resistance is a public health problem. The use of antibiotics and their presence in the environment meant that the bacteria develop defenses relating to antibacterial agents by imposing serious limitations of the options for the treatment of infections. Moreover, cancer is a disease that causes more fear in society it has become a stigma of death and pain. Due to these alarming facts, it has increased the demand for drugs that provide treatment more effective and safe. 4-tiazolidinone ring system is a core structure in various biological active compounds with a wide range of biological and pharmacological properties. Based on the importance of these compounds, we carried out the synthesis of series 5-benzylidene-2-(pyridine-4-ylmethylene)hydrazono)-thiazolidin-4-one 4a-l in order to obtain potentially active antimicrobial and anticancer agents. Among the main strategies used in planning a series of structural analogues from a prototype we used the molecular hybridization and molecular simplification for design the compounds 4a-l. These target compounds were obtained in three steps. The thiosemicarbazones 2a-d were synthesized by heating the equimolar amounts of 4-formylpyridine and thiosemicarbazides 1a-d in water/ethanol media. Then, the synthesis of 2-(pyridine-4-ylmethylene)hydrazono)-thiazolidin-4-one intermediates 3a-d was performed by cyclization of 4-formylpyridine thiosemicarbazones (2a-d) with chloroacetic acid in the presence of sodium acetate anhydrous in etanol. The final compounds 5-arylidene-4-thiazolidinones 4a-l were obtained by condensation of the previous products with commercially available aromatic aldehydes. The reaction was carried out in ethanol with piperidine as catalyst. The compounds were purified and showed yields between 47-82%. In, addition, they were characterized by their physicochemical properties and by IR, NMR 1H and 13C and MS. The compounds 3a-d and 4a-l were tested preliminary for antimicrobial activity by the disc diffusion method against various bacteria and fungal species. In general, the results indicated weak antimicrobial activities for all compounds. However, the compounds 3b showed significant mean zone inhibition (MZI) for bacillus subtilis (26 mm) and for candida albicans (25 mm), but this derivative demonstrated higher values of MIC (>500µg/mL and >250 µg/mL, respectively) when compared with the standard drugs chloranphenicol (MIC = 30 µg/mL) and rifampicin (MIC = 120µg/mL) for antibacterial activity and nistatin (MIC = 50 µg/mL) for antifungal activity. Next, the antiproliferative activity of the compounds 3a-d and 4a-l was tested against the NCI-H292, HEp-2 and K562 cell lines. Except for compounds 3b e 4l, the results indicated no significant antiproliferative activity for both series. The inhibitory effect of compound 3b on the growth of the K562 cell line was similar to that of etoposide with IC50 = 4.25 µg/mL and IC50 = 4.48 µg/mL, respectively. Compound 4l showed excellent anticancer activity against NCI-H292 cell line with IC50 = 1.38 µg/mL. This compound showed equipotent to methotrexate (IC50 = 1.31 µg/mL) and more active than etoposide (IC50 = 2.75 µg/mL). The absence of hemolysis in erythrocytes of mice (EC50 > 500 µg/mL for 3b and 4l) suggest that the citotoxicity is not related to membrane damage………… Keywords: 4-thiazolidinones. Antimicrobial. Antiproliferative. Hybridization molecular. Simplification molecular

viii

Listas de Esquemas

Esquema 1. Análise retrossintética de 4-tiazolidinonas ......................................................... 22

Esquema 2. Formação dos regioisômeros de 2-amino-4-tiazolidinonas ............................... 23

Esquema 3. Reações entre tiossemicarbazonas e ácidos α-halogenados ou ésteres de

etila α-halogenados com formação de 4-tiazolidinonas substituídas e não substituídas na

posição 5 do anel ..................................................................................................................... 23

Esquema 4. Influência de grupos volumosos em aciltiossemicarbazidas na obtenção de

4-tiazolidinonas ou 1,3,4-oxadiazóis ....................................................................................... 24

Esquema 5. Reação de condensação de três componentes “one pot” para síntese de 4-

tiazolidinonas ........................................................................................................................... 25

Esquema 6. Reação de síntese de 4-tiazolidinonas a partir de hidrazonas e ácido

mercaptoácetico utilizando micro-ondas ................................................................................. 25

Esquema 7. Síntese de tioureido-4-tiazolidinonas não substituídas na posição 5 do anel

a apartir de tiossemicarbazonas e ácido α-mercaptoacético .................................................... 26

Esquema 8. Síntese de 4-tiazolidinona a partir de derivados da malontioamida ................... 26

Esquema 9. Síntese de 4-tiazolidinonas a partir de tiossemicarbazonas com compostos

dicarbonilados α-β-insaturados ................................................................................................. 27

Esquema 10. Esquema de síntese de derivados 5-benzilideno-4-tiazolidinonas .................... 28

Esquema 11. Esquema de síntese de derivados 5-benzilideno-4-tiazolidinonas

utilizando piperidina como base .............................................................................................. 28

Esquema 12. Rota de síntese empregada na preparação das tiossemicarbazonas e 4-

tiazolidinonas planejadas .............................................................................................................

Esquema 13. Mecanismo de reação catalisada por ácido apartir de aldeído e

tiossemicarbazida para obtenção de tiossemicarbazonas ......................................................... 61

Esquema 14. Mecanismo de reação geral para obtenção das 4-tiazolidinonas da série

3a-d

.............................................................................................................................................

......63

Esquema 15. Mecanismo da reação de síntese da 5-benzilideno-4-tiazolidinona 4a-l ......... 65

ix

Listas de Figuras

Figura 1. Estrutura da linezolida ............................................................................................ 21

Figura 2. Esquema de uma célula bacteriana exibindo locais de ação de alguns

antibióticos. DHFA, ácido diidrofólico; THFA, ácido tetrahidrofolato .................................. 19

Figura 3. Anel 4-tiazolidinona ................................................................................................ 21

Figura 4. Estruturas químicas de 4-tiazolidinonas com atividade antimicrobiana ................. 30

Figura 5. Estrutura química de 4-tiazolidinonas com atividade anticâncer............................. 31

Figura 6. Estruturas químicas de 4-tiazolidinonas com atividade, anti-iinflamatória e

bloqueadora de canais de cálcio ................................................................ ............................. 31

Figura 7. Estruturas químicas de 4-tiazolidinonas com atividade anti.T. gondii .................... 32

Figura 8. Planejamento de novos carbamatos híbridos inibidores de AChE a partir da

rivastigmina e do donepezil ..................................................................................................... 34

Figura 9. Planejamento de novas moléculas pela hibridização de benzocaína e

metoclopramida ....................................................................................................................... 35

Figura 10. Estrutura química de 1-HMR-1556 e da azimilida e planejamento de

hibridização molecular ............................................................................................................ 36

Figura 11. Simplificação molecular da quinina ...................................................................... 37

Figura 12. Simplificação molecular do catalpol ..................................................................... 37

Figura 13. Simplificação molecular do prototipo LASSBio-1018 ......................................... 38

Figura 14. Representação da série de derivados 4a-l planejadas neste trabalho .................... 39

Figura 15. Estruturas químicas de 4-tiazolidinonas planejadas ............................................ 40

Figura 16. Espectro de IV para 4-tiazolidinona 3c (pastilha de KBr) .................................. 67

Figura 17. Espectro de IV para o derivado 5-benzilideno-4-tiazolidinona

4l (pastilha de KBr). ................................................................................................................ 68

Figura 18. Espectro de RMN 1H para a 4-tiazolidinona 3c (DMSO-d6; 300 MHz),

ilustrando os singletos referente ao grupos metileno e azometínico ....................................... 69

Figura 19. Espectro de RMN 1H para o derivado 5-benzilideno-4-tiazolidinona 4f

(CDCl3; 300 MHz), ilustrando principalmente o singleto referente hidrogênio

vinilidenênico .......................................................................................................................... 71

Figura 20. Espectro de RMN 13C para a 4-tiazolidinona 3c, apresentando o sinal

referente a carbonila e ao carbono metilênico do anel 4-tiazolidinona (DMSO-d6; 75,4

MHz) ........................................................................................................................................ 72

x

Figura 21. Espectro de RMN 13C para o derivado 5-benzilideno-4-tiazolidinona 4f,

apresentando os sinais relativos aos carbonos endo e exo da ligação benzilidênica

(CDCl3; 75,4 MHz) ................................................................................................................. 73

Figura 22a. Halo de inibição do composto 3b frente a B. subtilis ......................................... 76

Figura 22b. Halo de inibição do composto 3b frente a C. albicans ....................................... 76

Listas de Tabelas

Tabela 1: Propriedades físico-química das tiossemicarbazonas ............................................. 61

Tabela 2: Propriedades físico-químicas e rendimentos de 4-tiazolidinonas 3a-d .................. 62

Tabela 3: Propriedades físico-químicas e rendimentos de

5-benzilideno-4-tiazolidinonas 4a-l ........................................................................................ 64

Tabela 4: Principais frequências de absorção observadas nos espectros de IV para as 4-

tiazolidinonas (3a–d) ............................................................................................................... 66

Tabela 5: Principais frequências de absorção observadas nos espectros de IV para as 5-

benzilideno-4-tiazolidinonas (4a–d) ....................................................................................... 67

Tabela 6: Principais deslocamentos químicos (ppm) observados nos espectros de RMN

¹H para as 4-tiazolidinonas (3a–d) .......................................................................................... 68


¹H para as 5-benzilideno-4-tiazolidinonas (4a–l) .................................................................... 71


¹³C para tiazolidinonas sintetizadas ......................................................................................... 72

Tabela 9: Halos em milímetros (mm) referentes á atividade antimicrobiana

dos compostos 3a-d e 4a-l ....................................................................................................... 75

Tabela 10: Atividade citotóxica dos compostos em células tumorais e atividade

hemolítica em eritrócitos de camundongos ............................................................................. 79

Lista de Quadro

Quadro 1: Espécies de bactérias e fungos utilizados nos ensaios de atividade

antimicrobiana para os compostos sintetizados. ...................................................................... 57

xi

Lista de símbolos e abreviações

AcOH Ácido acético

AcONa Acetato de sódio

AIDS Síndrome da Imunodeficiência Adquirida

Ar Aromático

ATTC American Type Culture Collection

CCD Cromatografia em camada delgada

CDCl3 Clorofórmio deuterado

CD2Cl2 Diclorometano deuterado

CE50 Concentração efetiva cinquenta por cento

CI50 Concentração inibitória cinquenta por cento

CMI Concentração mínima inibitória

Cq Carbono quaternário

DCC Dicicloexilcarbodiimida

DMAD Acetilenodicarboxilato de dimetila

DMF Dimetilformamida

DMSO Dimetilsulfóxido

DMSO-d6 Dimetilsulfóxido deuterado

DNA Ácido deoxiribonucléico

DP Desvio padrão

eq. Equivalente

EtOH Etanol

FM Fórmula molecular

HIV Vírus da imunodeficiência humana

IV Infravermelho

J Constante de acoplamento

MeOH Metanol

MHz Megahertz

mL Mililitro

MS Espectrometria de massas

nm Nanômetro

PBS Solução tamponada de fosfato padrão

xii

PM Peso molecular

PF Ponto de fusão

ppm Partes por milhão

Rf Razão de frente

RMN 13C Ressonância magnética nuclear de carbono 13

RMN 1H Ressonância magnética nuclear de hidrogênio

RNA Ácido Ribonúcleico

SIDA Síndrome da Imunodeficiência Adquirida

THF Tetraidrofurano

UFC Unidade formadora de colônia

UFPEDA Sigla – Coleção de cultura do Departamento de Antibióticos da UFPE

UV Ultravioleta

ZMI Zona média de inibição

λ Comprimento de onda

δ Deslocamento quimico

ν Estiramento

xiii

SUMÁRIO

1. INTRODUÇÃO E REVISÃO DE LITERATURA ................................................................. 15

1.1 - Resistência Bacteriana ............................................................................................................. 15

1.2 – Células Neoplásicas .................................................................................................................. 20

1.3 - 4-tiazolidinonas ........................................................................................................................ 21

1.3.1 - Obtenção de 4-tiazolidinonas a partir de reações envolvendo ácidos α-

haloacéticos e derivados com tiouréias, tiossemicarbazidas e tiossemicarbazonas. ......................... 22

1.3.2 - Obtenção de 4-tiazolidinonas a partir de reações envolvendo ácido α-

mercaptoacético. ................................................................................................................................ 24

1.3.3 - Obtenção de 4-tiazolidinonas a partir de compostos com a função tioamida e

anidrido maléico ou acetilenodicarboxilato. ...................................................................................... 26

1.3.4 - 5-benzilideno-4-tiazolidinonas.. ............................................................................................. 27

1.4 - Atividades Biológicas das 4-tiazolidinonas .............................................................................. 28

1.5 - Planejamento estrutural ............................................................................................................. 32

1.5.1 - Hibridização molecular .......................................................................................................... 33

1.5.2 Simplificação molecular ......................................................................................................... 36

2 – OBJETIVOS ............................................................................................................................. 38

2.1 - Objetivo Geral .......................................................................................................................... 38

2.2 - Objetivos específicos ................................................................................................................ 40

3 - MATERIAL E MÉTODOS ...................................................................................................... 41

3.1 - Parte Experimental ................................................................................................................... 41

3.1.1 – Cromatografias ..................................................................................................................... 41

3.1.2 - Pontos de Fusão ..................................................................................................................... 41

3.1.3 - Espectroscopias de IV, RMN 1H , RMN 13C e MS ............................................................... 41

3.2 - Procedimentos Experimentais .................................................................................................. 42

3.2.1 - Obtenção de 4-fenil-tiossemicarbazida ................................................................................. 42

3.2.2 - Procedimento geral de obtenção de tiossemicarbazonas ....................................................... 43

3.2.3 - Procedimento geral para obtenção de 2-[(4-piridinil)hidrazono]-4-tiazolidinonas

(3a-d) ................................................................................................................................................. 44

xiv

3.2.4 - Dados Físico-químicos e Espectroscópicos para 2-[(4-piridinil)hidrazono]-4-

tiazolidinonas (3a-d) ......................................................................................................................... 44

3.2.5 - Procedimento geral para obtenção de 2-[(4-piridinil)hidrazono]-5-benzilideno-4-

tiazolidinonas (4a-l). ......................................................................................................................... 47

3.2.6 - Dados Físico-químicos e Espectroscópicos para os derivados 2-[(4-

piridinil)hidrazono]-5-benzilideno-4-tiazolidinonas (4a-l). .............................................................. 47

3.3 - Atividades biológicas ............................................................................................................... 56

3.3.1 – Micro-organismos testados e padrão de inóculos ................................................................. 56

3.3.2 - Determinação da atividade antimicrobiana ........................................................................... 57

3.3.3 - Determinação da atividade citotóxica ................................................................................... 58

3.3.4 - Avaliação do potencial hemolítico em eritrócitos de camundongos ..................................... 59

4 - RESULTADOS E DISCUSSÃO ............................................................................................... 60

4.1 - Esquema Geral de Síntese ......................................................................................................... 60

4.2 - Metodologia sintética e mecanismos reacionais ....................................................................... 60

4.2.1 - Obtenção das tiosemicarbazonas (2a-d) ................................................................................ 60

4.2.2 - Obtenção de 2-[(4-piridinil)hidrazono]-4-tiazolidinonas (3a-d) ............................................ 62

4.2.3 - Obtenção de 2-[(4-piridinil)hidrazono)]-4-tiazolidinonas-5-benzilideno (4a-l) .................... 63

4.3 - Caracterização estrutural dos derivados tiazolidinônicos 3a-d e 4a-l ....................................... 65

4.4 - Resultados da Atividade Antimicrobiana .................................................................................. 74

4.5 - Resultado da Atividade Citotóxica .......................................................................................... 77

5 - CONCLUSÃO E PERSPECTIVAS ....................................................................................... 79

6 - REFERÊNCIAS BIBLIOGRAFICAS ................................................................................... 80

15

1 - INTRODUÇÃO E REVISÃO DE LITERATURA

1.1 - Resistência Bacteriana

No decorrer das últimas décadas o desenvolvimento de fármacos eficientes no

combate a infecções bacterianas revolucionou o tratamento médico, levando a redução

drástica da mortalidade causada por doenças microbianas. Por outro lado, a disseminação do

uso de antibióticos e sua presença no meio ambiente lamentavelmente fizeram com que as

bactérias também desenvolvessem defesas relativas aos agentes antibacterianos, com o

consequente aparecimento de resistência. O fenômeno da resistência bacteriana a diversos

antibióticos e agentes quimioterápicos impõe sérias limitações às opções para o tratamento de

infecções bacterianas, representando uma ameaça para a saúde pública (SILVEIRA et al.,

2006). Neste ponto é importante e necessário levantar esforços para colocar em prática

medidas de controle e políticas de saúde públicas visando a localizar e erradicar organismos

resistentes nos centros de saúde. A resistência bacteriana não deve ser vista como uma

consequência do progresso médico, que pode ser combatida através de novos antibióticos

(GOULD, 2008).

A indústria farmacêutica deve muito de sua prosperidade a descoberta de agentes

antibacterianos. Diversos agentes foram descobertos na década de 1940, como as

sulfonamidas, penicilinas e estreptomicina, seguidas rapidamente de tetraciclinas, isoniazida,

macrolídeos, glicopeptídeos, cefalosporinas, fluoroquinolonas e outras classes moleculares,

culminando com a rifampicina que foi comercializado na década de 1960 (PROJAN e

SHLAES, 2004; POWERS, 2004).

No entanto, as últimas décadas do século passado desenharam um declínio acentuado

na pesquisa industrial que visa a descobrir novos agentes antibacterianos, este declínio está

ocorrendo em um tempo de níveis crescentes de resistência aos medicamentos em uso. Muitas

das grandes empresas de biotecnologia extinguiram ou reduziram severamente suas pesquisas

para descoberta de novas classes de fármacos, comprometendo a necessidade de manutenção

de um fluxo saudável de novos e melhores agentes para combater a ameaça iminente da

resistência bacteriana a fármacos. A partir do ano 2000 poucos antibióticos foram

introduzidos na terapêutica antimicrobiana. Apenas a linezolida (Figura 1), um antibiótico de

16

origem sintética da classe das oxazolidinonas, foi introduzido no mercado farmacêutico em

2001 (GUIMARÃES et al., 2010; PROJAN e SHLAES, 2004; POWERS, 2004).

O N NO

O

NHAc

F

Figura 1 : Estrutura da linezolida

Embora a pesquisa por agentes antibacterianos tenha diminuído em muitas das grandes

empresas farmacêuticas as pequenas empresas começaram a preencher esta lacuna (BOGGS e

MILLER, 2004). Os agentes antimicrobianos são a terceira classe de medicamentos mais

rentáveis para as empresas farmacêuticas, superado apenas pelas drogas do sistema nervoso

central e cardiovascular. Em 2002, o mercado farmacêutico deste setor movimentou um

volume de cerca de 45 bilhões de dólares. (POWERS, 2004; BUSH, 2004). No entanto é

notável que poucos agentes antibacterianos garantam um retorno sobre os investimentos de

acordo com as necessidades das empresas farmacêuticas de hoje. Há várias razões para essa

incerteza de retorno financeiro, dentre elas a concorrência com muitos fármacos já existentes

no mercado (genéricos de preços baixos), a preservação do uso de velhos agentes

antimicrobianos pelos clínicos através do uso criterioso, e ainda, muitos especialistas

recomendam reservar os novos agentes para pacientes que possuem patógenos resistentes, o

que limita o uso potencial de um novo fármaco (POWERS, 2004; BOGGS e MILLER, 2004).

As primeiras utilizações de antibióticos constituíram um enorme impacto na alteração

da mortalidade para doenças bacterianas graves e fatais, em comparação com a ausência da

terapia na era pré-antibiótica (POWERS, 2004; BYARUGABA, 2004). No cenário atual os

fatores econômicos estão em desacordo com os interesses sociais, as doenças infecciosas tem

curso de duração terapêutico curto, o que torna difícil a obtenção de altos lucros nesta

terapêutica; Além de poder cair rapidamente em desuso por conta da resistência adquirida

frente a patógenos. O reconhecimento da implicação da saúde pública em lidar com os

antimicrobianos e os prazos envolvidos na criação de novos fármacos, remetem a possibilitar

que parte dos esforços financeiros para se colocar um fármaco no mercado deveria emergir de

fundos públicos, ou que venha a ser implantada uma nova estrutura de preços para fármacos

de uso restrito, buscando de alguma forma incentivos comerciais para a indústria (BOGGS e

MILLER, 2004; GOULD, 2009).

17

A resistência antimicrobiana é um problema de saúde pública. Esta se encontra

atrelada á pobreza, ignorância, fome, falta de saneamento básico, ao acesso inadequado aos

medicamentos, conflitos civis e ao descaso de governantes em desenvolver políticas de saúde

pública com controle de doenças infecciosas. Além disso, o aumento da população de

indivíduos imunocomprometidos com a epidemia do HIV / SIDA, com mais de 30 milhões de

casos nos países em desenvolvimento, promove uma maior dificuldade em tratar as infecções

(BYARUGABA, 2004).

A Organização Mundial da Saúde (OMS) estima cerca de 5 milhões de mortes

neonatais por ano decorrente de infecções bacterianas, a maioria em países de baixa e média

renda (KAYANGE et al., 2010). Este crescimento da resistência aos antibióticos pode

transformar pneumonia, tuberculose ou infecções urinárias em doenças sem tratamento e

ainda provocar um retrocesso em transplantes de órgãos, cirurgias de grande porte e até

mesmo sessões de quimioterapia.

Dentre os micro-organismos que sofreram grandes modificações na sensibilidade aos

antimicrobianos com o decorrer dos anos destacam-se os estafilococos, os enterococos e os

pneumococos (TAVARES, 2000). As infecções causadas por Staphylococcus aureus

resistente a meticilina (MRSA) é um dos maiores problemas na história da terapêutica

antimicrobiana, com aumento na taxa de mortalidade em países desenvolvidos de até 30%;

Em adição, ao longo dos anos o MRSA gerou uma drástica diminuição na sensibilidade á

maioria dos antibióticos das principais classes de uso comum como as cefalosporinas,

penicilinas, carbapenens, quinolonas e aminoglicosídeos (GOULD, 2008; JAPONI et al.,

2010) .

O aparecimento de bactérias resistentes a antibióticos pode ser considerado como uma

manifestação natural regida pelo princípio evolutivo da adaptação genética de organismos a

mudanças no seu meio ambiente. De fato, as bactérias têm mostrado sucesso na sua

capacidade de desenvolver resistências a múltiplas drogas. O conhecimento dos mecanismos

bioquímicos e genéticos envolvidos na resistência bacteriana é de grande importância para se

entender como uma bactéria pode desenvolver tal resistência (SILVEIRA et al., 2006;

GUIMARÃES et al., 2010).

Os processos de desenvolvimento de mecanismos de resistência antimicrobiana

variam de patógeno para patógeno. Em geral são causados por fatores básicos como:

inativação do antibiótico diretamente na molécula bioativa por alterações químicas, quase

sempre promovidas por enzimas bacterianas; modificação no alvo que leva a perda de

sensibilidade ao antibiótico; disseminação de plasmídeos com determinantes de resistência

18

múltipla entre bactérias; ativação da bomba de efluxo e permeabilidade externa da membrana

que promovem a redução da concentração do antibiótico sem sua modificação química

(GOULD, 2009; HARRIS e THORARENSEN, 2004; GUIMARÃES et al., 2010).

No entanto, existem maneiras que retardam o aparecimento destas resistências. Além

de medidas de controle de infecção, a cooperação dos profissionais médicos no controle dos

níveis de doses prescritas aos pacientes pode reduzir o uso e abuso de antimicrobianos. A

evolução e o avanço da tecnologia de métodos de diagnósticos mais eficientes, para

identificar com precisão os micro-organismos responsáveis pela infecção e ainda a

susceptibilidade destes frente a fármacos usados na terapêutica, promovem um

direcionamento mais racional na escolha do fármaco para o tratamento (BOGGS e MILLER,

2004; NEELY e HOLDER, 1999).

A grande maioria dos compostos antibacterianos desenvolvidos é orientada para inibir

a síntese de um ou mais componentes da parede celular bacteriana ou a um evento na

biossíntese nas moléculas de DNA ou RNA, a exceção mais importante a estes mecanismos

de ação é a sulfonilamida que atua inibindo a enzima Diidrofolato redutase, essencial para o

metabolismo bacteriano (Figura 2) (CHU et al., 1996). Porém, em tempos atuais, o

conhecimento do sequenciamento gênico e a identificação de genes e proteínas essenciais

para a sobrevivência dos micro-organismos, trazem novos modelos de aplicação e ampliação

dos alvos para novos fármacos. Outra nova abordagem, alimentada pelo sucesso no campo

viral, inclui estudos com anticorpos monoclonais humanos (THEURETZBACHER, 2009).

Avanços nas técnicas de cristalografia de raios X e modelagem molecular por computador

elucidam os mecanismos de inibição em 3D, mostrando com detalhes os sítios de ligação dos

fármacos. A identificação do sítio de ligação dos antibióticos e elucidação de seus

mecanismos inibitórios são ferramentas importantes para o desenvolvimento de novos

fármacos eficazes (HARRIS e THORARENSEN, 2004; VILA et al., 2005).

19

Figura 2. Esquema de uma célula bacteriana exibindo locais de ação de alguns antibióticos. DHFA: ácido diidrofólico; THFA: ácido tetrahidrofolato.

Por muitos anos uma boa parte dos fármacos lançados no mercado é derivada de

modificações estruturais de grupos já utilizados na terapêutica (THEURETZBACHER, 2009;

VILA et al., 2005). Entretanto, nos últimos 10 anos os pesquisadores têm voltado atenção

para desenvolvimento de antibióticos naturais, estes geralmente apresentam estruturas

químicas complexas importantes para as interações específicas e reconhecimento por alvos

macromoleculares em bactérias patogênicas (GUIMARÃES et al., 2010).

As ferramentas recentes da tecnologia tornaram mais racionais o desenvolvimento de

entidades químicas candidatas a fármacos, estas “novidades” no campo científico fortificam o

desejo de produção de um “fármaco ideal’’ (boa atividade, baixa toxicidade, boa

farmacocinética e principalmente que não desenvolva resistência) (VILA et al., 2005).

20

O cenário mostra um aumento na procura por fármacos mais eficazes e seguros, que

causem menos efeitos colaterais possíveis, proporcionando aos seus usuários menor rejeição e

maior sucesso nos tratamentos. A química orgânica medicinal através dos planejamentos e

modificações moleculares tem contribuído para a maior parte das novas descobertas,

observando-se um crescimento considerável de compostos sintéticos para uso medicinal.

1.2 - Células Neoplásicas

Câncer é o nome dado a um conjunto de doenças que têm em comum o crescimento

desordenado de células que invadem os tecidos e órgãos, podendo espalhar-se para outras

regiões do corpo. As mutações na sequência do DNA podem produzir mudanças no padrão da

expressão gênica que levam a célula ao descontrole do ciclo celular (VISSER et al., 2006).

O câncer é uma das doenças que mais atinge a população mundial e que está, a cada

ano, fazendo mais vítimas. De acordo com um relatório da Agência Internacional para

Pesquisa em Câncer (IARC)/Organização Mundial de Saúde (OMS) [World Cancer Report

2008], mais de 7 milhões de pessoas morrem de câncer e cerca de 12 milhões de casos são

diagnosticados a cada ano no mundo.

Devido à importância epidemiológica dos processos neoplásicos, inúmeras abordagens

terapêuticas vêm sendo propostas. As categorias básicas para o tratamento são: cirurgia,

radioterapia e quimioterapia. Esta última apresenta desfavorável aspecto, devido à

inespecificidade da droga e à dificuldade em se estabelecer uma dose efetiva para destruir o

máximo de células com o mínimo de efeitos colaterais para as células normais (SANTOS,

2003).

Um dos maiores obstáculos para o sucesso da quimioterapia no tratamento de alguns

tipos de neoplasias é o desenvolvimento, por parte das células tumorais, do fenômeno da

resistência aos fármacos utilizados, não havendo resposta ao tratamento (MISTRA et al.,

2001; HUBER et al., 2010).

A resistência a múltiplas drogas (MDR) é um caso de resistência adquirida, observada

em células tumorais, in vivo e in vitro, que consiste na ausência de resposta aos

quimioterápicos, tanto àquele que foi utilizado inicialmente, quanto a outros empregados

como alternativa (HUBER et al 2010). O termo MDR é usado para descrever um fenômeno

caracterizado pela capacidade de células tumorais apresentarem uma resistência simultânea a

21

diferentes agentes quimioterápicos estruturalmente e funcionalmente não relacionados

(WAGNER et al., 2003).

A inabilidade em tratar pacientes de forma efetiva após a recidiva do tumor deve-se a

múltiplos fatores de resistência. Os mecanismos de resistência representam diversas formas de

proteção da célula e do organismo e estão presentes na maioria das células normais. Em geral,

a resposta de células tumorais no tratamento com drogas pode ser definida por um vasto

número de mecanismos moleculares operando em diferentes estágios; que são eles, alteração

no transporte da droga através da membrana plasmática, alteração de enzimas-alvo, alteração

do metabolismo da droga, aumento da reparação do DNA e incapacidade para sofrer apoptose

(BERGMAN, 2003; STAVROVSKAYA e STROMSKAYA, 2008; HUBER et al., 2010).

Nos últimos cinco anos os químicos medicinais passaram a investigar a potencialidade

de compostos como as tiazolidinonas para uma possível atividade anticancerígena

(SUBTEL’NA et al., 2010). Apesar dos avanços nas pesquisas, com aumento de cura de

algumas malignidades, em países desenvolvidos e também em desenvolvimento o câncer é a

segunda causa de morte depois das doenças cardiovasculares (ROSTOM, 2006). Deste modo

cria-se uma árdua e continua tarefa de descobrir novos agentes anticâncer para que esta

enfermidade venha a ser combatida, e o mais importante, com altos índices de cura.

1.3 - 4-Tiazolidinonas

4-tiazolidinonas são compostos que possuem em sua estrutura base um anel de cinco

membros contendo dois heteroátomos, um átomo de enxofre (posição 1) e um átomo de

nitrogênio na posição 3, e um grupo carbonila na posição 4, podendo apresentar diversos

grupos químicos como substituintes nas posições 2, 3 e 5 (Figura 3) (SINGH et al., 1981;

PANICO et al., 1993; LIESEN et al., 2008).

Figura 3. Anel 4-tiazolidinona.

22

Em geral, as metodologias descritas na literatura para síntese destes compostos relatam

a reação entre ácidos α-haloacéticos e derivados com tiouréias, aciltiossemicarbazidas e

tiossemicarbazonas; Reações entre o ácido α-mercaptoacético e iminas substituidas, ou

através de reações de condensação com três componentes, do tipo “one-pot”, entre aminas,

aldeídos e ácido mercaptoacético (Esquema 1). Além disso, 4-tiazolidinonas são sintetizadas

pela reação de ciclização entre compostos que apresentam a função tioamida, como as

tiossemicarbazonas, e anidrido máleico ou acetilenodicarboxilato de metila (BROWN, 1961;

SINGH et al., 1981; LIESEN et al., 2008).

Esquema 1. Análise retrosintética de 4-tiazolidinonas.

1.3.1 - Obtenção de 4-tiazolidinonas a partir de reações envolvendo ácidos α-haloacéticos

e derivados com tiouréias, tiossemicarbazidas e tiossemicarbazonas

Laurent et al. (2004) e Ottanà et al. (2005) desenvolveram a síntese de 2-imino-4-

tiazolidinonas a partir de reações de tiouréias substituídas com ácidos α-cloroacético e α-

bromoacético ou derivados destes. Estas reações foram processadas em presença de bases

23

como acetato de sódio anidro ou piridina, evitando assim uma possível hidrólise ácida do

grupo imino formado.

Nesse mesmo trabalho, Laurent et al. (2004) mostraram que a utilização de tiouréias

assimétricas (R1 ≠ R2) leva a formação de regioisômeros, em que a regiosseletividade das

reações eram controladas pela presença de substituintes eletroatratores ligados ao nitrogênio

do grupo imino das 4-tiazolidinonas formadas (Esquema 2).

Esquema 2. Formação dos regioisômeros de 2-amino-4-tiazolidinonas.

Jolly e Sharma (1990) promoveram a reação de tiossemicarbazonas com ácidos

carboxílicos α-halogenados substituídos, tornando-se uma fácil metodologia para a obtenção

de 4-tiazolidinonas substituídas na posição 5 com grupos alquila ou arila. Os mesmos autores

ainda demonstraram que a utilização de ésteres de etila α-halogenados leva a formação de

compostos contendo o mesmo anel 4-tiazolidinona não substituído na posição 5 (Esquema 3).

24

X = Cl, BrR = R1, R2, R3 = H, Alquil, Aril

NN

S

NHR3

R1

R2

H

NN

R2

R1S

N OR3

R

NN

R2

R1S

N OR3

XO

O

R

O

OH

X

Esquema 3. Reações entre tiossemicarbazonas e ácidos α-halogenados ou ésteres de etila α-halogenados com formação de 4-tiazolidinonas substituídas e não substituídas na posição 5 do anel.

Küçükgüzel et al. (2002 e 2006) obtiveram 2-imino-4-tiazolidinonas a partir da

condensação envolvendo α-bromoacetato de etila e aciltiossemicarbazidas substituídas na

posição 4 com grupos pouco volumosos. No entanto, a presença de grupos volumosos como

fenila, p-metoxifenila ou ciclohexila levaram a formação de derivados 1,3,4-oxadiazóis, com

a perda de mercaptoacetato de etila (Esquema 4).

Esquema 4. Influência de grupos volumosos em aciltiossemicarbazidas na obtenção de 4-tiazolidinonas ou 1,3,4-oxadiazóis.

25

1.3.2 - Obtenção de 4-tiazolidinonas a partir de reações envolvendo ácido α-

mercaptoacético

A reação de condensação “one-pot” envolvendo ácido α-mercaptoacético com aminas

primárias ou ésteres de aminoácidos e aldeídos promove a formação de 4-tiazolidinonas 2,3-

dissubstituídas (Esquema 5) (BARRECA et al,. 2001, 2002 e 2003; RAO et al,. 2004;

DIURNO et al,. 1992; GUDUDURU et al,. 2004).

Esquema 5. Reação de condensação de três componentes “one pot” para síntese de 4-tiazolidinonas.

Srivastava et al. (2002) utilizaram esta metodologia para obtenção de 4-tiazolidinonas

usando tetrahidrofurano (THF) como solvente a 0º e dicicloexilcarbodiimida (DCC) como

agente de acoplamento, reagente que atua diretamente na formação do anel tiazolidinico. Em

estudo comparativo, entre o procedimento envolvendo DCC em THF e a reação assistida por

micro-ondas para a obtenção das mesmas 4-tiazolidinonas, Kavitha et al. 2006 demonstraram

que este último método pode otimizar a reação.

De fato, Neuenfeldt et al. (2010) proporcionaram a síntese de 4-tiazolidinonas a partir

de hidrazonas e ácido mercaptoacético usando micro-ondas obtendo bons rendimentos em

curto tempo de reação, a baixas temperaturas e dispensando o uso de solvente. No mesmo

trabalho os autores observaram que a reação não se processava em tolueno sob condições de

refluxo (Esquema 6).

26

Esquema 6. Reação de síntese de 4-tiazolidinonas a partir de hidrazonas e ácido mercaptoácetico utilizando micro-ondas.

El-Gendy et al. (1990) demonstraram que reações envolvendo ácido α-

mercaptoacético com tiossemicarbazonas, em benzeno seco, leva a formação de 3-tioureido-

4-tiazolidinonas (Esquema 7).

Esquema 7. Síntese de tioureido-4-tiazolidinonas não substituídas na posição 5 do anel a apartir de tiossemicarbazonas e ácido α-mercaptoacético.

1.3.3 - Obtenção de 4-tiazolidinonas a partir de compostos com a função tioamida e

anidrido maléico ou acetilenodicarboxilato

Berseneva et al. (1998) desenvolveram a síntese de análogos 2,5-dimetileno-4-

tiazolidinonas a partir da ciclização de derivados da malontiamida com DMAD, este sendo

um composto dicarbonilado α,β-insaturado (Esquema 8). Nesta reação os produtos obtidos

continham diferentes isômeros devido as duas duplas ligações carbono-carbono exocíclicas.

27

Esquema 8. Síntese de 4-tiazolidinona a partir de derivados da malontioamida.

Em trabalho recente em nosso grupo de pesquisa, Verçoza et al. (2009) obtiveram

novos derivados com a função ácida na posição 5 do anel tiazolidinônicos a partir de reação

entre tiossemicarbazonas substituidas e o anidrido maléico, em tolueno seco sob refluxo

(Esquema 9). Nesta metodologia há uma reação de adição do tipo tia-Michael, sendo que o

anidrido maléico funciona como aceptor de Michael.

Anidrido MaléicoTolueno secoDMFRefluxo

R = H, Alquil ou Aril.

NHN S

NHR1

NN

S

NO

R1

O

OHN

N

Rend. 37-60%

Esquema 9. Síntese de 4-tiazolidinonas a partir de tiossemicarbazonas com compostos dicarbonilados α-β-insaturados.

1.3.4 - 5-Benzilideno-4-tiazolidinonas

De acordo com artigo de revisão publicado por Brown (1961), diversos agentes

condensantes podem ser utilizados na reação de condensação aldólica entre o grupo metileno

do anel 4-tiazolidinona com o grupo carbonila de aldeídos ou cetonas, dentre eles acetato de

sódio anidro em ácido acético, amônia e cloreto de amônio em etanol, e piperidina também

em solução etanólica. Em adição, de acordo com Daboun et al. (1982), esta mesma reação

pode ser realizada a partir da reação do anel com 2-ciano-3[(4-nitro)-fenil]-acetato de etila,

utilizando piperidina como agente condensante.

28

Vicini et al. (2006) sintetizaram 2-tiazolimino-5-benzilideno-4-tiazolidinonas a partir

de 2-(tiazolimino)-4-tiazolidinonas usando acetato de sódio anidro em meio ácido (Esquema

10). Baseados nos espectros de RMN 13C os autores ainda descreveram a configuração Z para

a ligação C=C exocíclica dos produtos formados.

RC6H5CHO, CH3COOH,CH3COONa, Refluxo

R = H, Cl e NO2

S

N

N S

HNO

S

N

N S

HN

O

Rend. 39-94%

Esquema 10. Esquema de síntese de derivados 5-benzilideno-4-tiazolidinonas.

Otanna et al. (2009) sintetizaram análogos 5-benzilideno-4-tiazolidinona usando

piperidina em meio etanólico (Esquema 11). A configuração Z da ligação C=C exocíclica dos

produtos foi confirmada por estudos de difração de raios X e análises de espectros de RMN.

Esquema 11. Esquema de síntese de derivados 5-benzilideno-4-tiazolidinonas utilizando piperidina como base.

29

1.4 - Atividades Biológicas das 4-tiazolidinonas

Compostos contendo o anel 4-tiazolidinona possuem grande interesse científico

devido ao amplo espectro de atividade biológica relatado para seus derivados, este é um

heterociclo importante encontrado em numerosos produtos naturais e sintéticos (VERMA e

SARAF, 2008). O anel 4-tiazolidinona possui vários sítios de substituição (posição 2, 3 e 5), o

que leva a um grande número de análogos estruturais com diferentes atividades biológicas.

Kavitha et al. (2006) demonstraram que 4-tiazolidinonas contendo o grupo (1-[2-

amino-1-(4-metoxi-fenil)-etil]-cicloexanol) possuem atividades significantes frente à cepas

bacterianas e de fungos como Pseudomonas fluorescens e Trichoderma, respectivamente. Os

compostos apresentaram menores valores de Concentração mínima inibitória (CMI) quando

comparadas com drogas padrões como estreptomicina e nistatina (Figura 4a).

Vicini et al. (2006) exploraram a atividade de 4-tiazolidinonas e derivados 5-

benzilideno frente a bactérias Gram-positivas e Gram-negativas (Figura 4b). Os derivados 5-

benzilidenos mostraram excelentes atividades quando comparados com a ampicilina. Nesse

trabalho os autores demonstraram a importância e superioridade em potencial dos derivados

5-benzilideno em relação a 4-tiazolidinonas não substituídas na posição 5.

Verçoza et al. (2009) sintetizaram e testaram a atividade de compostos 4-

tiazolidinonas com uma porção ácida na posição 5 do anel tiazolidínico e N-substituídas

frente a algumas bactérias Gram-positivas, Gram-negativas e fungos (Figura 4c). Para esta

série, o radical alquil na posição N-3 foi notável na capacidade de inibir o crescimento de

alguns micro-organismos.

Em trabalho recente, Liesen et al. (2010) avaliaram a atividade antibacteriana e

antifúngica de novos compostos 4-tiazolidinonas contendo o anel imidazol em sua estrutura

(Figura 4d). Os compostos testados mostraram atividade inibitória frente a Staphylococcus

aureus e Bacillus subtilis, além de Candida albicans e Candida sp.

30

NN

S

NR

O

O

OH

N

N

S

OH

R OH3CO

R = Aril ou Heteroaril

4a

S

HNN

ONS

R

R = OH, OCH3, NO2 ou Cl

4b

NN

HN N S

N

OH

OO

HO

R

R = H, OCH3, F, Cl.

4c

R = H, CH3, C2H5, C6H5.

4d

Figura 4. Estruturas químicas de 4-tiazolidinonas com atividade antimicrobiana.

Li et al. (2007) testaram a atividade antiproliferativa in vitro de análogos

tiazolidínicos frente a duas linhagens celulares de melanoma humano e contra células

fibroblásticas, estas para averiguar a seletividade dos compostos. Os resultados obtidos

mostraram que estes análogos possuem atividade contra melanoma metastático e que o

composto mais ativo revelou maior potência e seletividade que o sorafenibe (droga

padrão). Em trabalho recente, Havrylyuk et al. (2009) sintetizaram compostos 5-

benzilideno-4-tiazolidinona (Figura 5a) e realizaram experimentos para atividade

antiproliferativa em diversos tipos de células humanas. Os compostos testados

apresentaram uma considerável inibição de crescimento de células tumorais, alguns

mostrando padrões de seletividade para determinada linhagem celular.

31

Em análise da relação estrutura-atividade, Zhou et al. (2008) identificaram

compostos que atuam seletivamente em células de câncer de pulmão, inclusive nas

resistentes ao paclitaxel; mostrando baixa toxicidade ás células humanas normais

(Figura 5b). Os autores sustentam a promoção de grupos doadores de elétrons nos anéis

aromáticos e o sistema de três anéis na estrutura para a atividade anticancerígena dos

compostos.

NN

S

NO

R R1

5a

R = OH e OMe.R1 = Br, Cl, OH, OMe, NO2 e N(CH3)2.

NS

HNO

R

R1

5b

Figura 5. Estrutura química de 4-tiazolidinonas com atividade anticâncer.

Goel et al. (1999) relataram uma excepcional redução do edema em ratos

induzidos pela carragenina pala ação de 4-tiazolidinonas 2,3-substituídas, quando

comparadas com a fenilbutazona (Figura 6a). Além disso, Knutsen et al. (2007)

demonstraram a propriedade analgésica das 2-aril-tiazolidinonas mostrando que essas

moléculas atuam como bloqueadores seletivos de canais de cálcio tipo-N (Figura 6b).

32

N

OOHBr

S

O

R = H, OH ou OCH3

6a

SN

O

R = F, Br ou CF3

R

N

6b

R

Figura 6. Estruturas químicas de 4-tiazolidinonas com atividade anti-inflamatória e bloqueadora de canais de cálcio.

Em trabalho realizado em nosso grupo de pesquisa, Tenório et al. (2005)

demonstraram a potente atividade anti-T. gondii para 4-tiazolidinonas contendo a

função ácida na posição 5, bem como uma função arilhidrazona substituída na posição 2

do anel tiazolidinônico (Figura 7a). Em adição, Aquino et al. (2008) reportaram a ação

efetiva anti-Toxoplasma gondii de novos compostos 4-thiazolidinonas (Figura 7b),

algumas moléculas mostraram-se mais eficaz que a hidroxiuréia (droga de referência).

Além destes trabalhos, Liesen et al. (2010) obtiveram 4-tiazolidinonas com

excelente atividade frente ao parasita citado acima, relatando ainda que a maioria dos

compostos desta série tem melhor desempenho contra taquizoítas intracelulares (Figura

4c).

Figura 7. Estruturas químicas de 4-tiazolidinonas com atividade anti.Toxoplasma gondii.

33

1.5 - Planejamento Molecular

Em crescente competição global e descoberta de novos alvos moleculares as

indústrias farmacêuticas desejam o desenvolvimento de fármacos de uma forma rápida,

a baixos custos e que proporcione rentabilidade (LAZAR et al., 2004). Este setor

industrial movimenta bilhões de dólares e envolve milhares de pesquisadores titulados

em diversos laboratórios de pesquisa, tanto industriais quanto acadêmicos (BARREIRO,

2002).

O processo de descoberta de novos fármacos caracteriza-se pela multiplicidade

de fatores que devem ser considerados durante a etapa de planejamento molecular de

estruturas com eficiência terapêutica desejada (BARREIRO, 2002). Além de

biodisponibilidade, o processo de planejamento racional de novos fármacos leva em

conta a toxicidade e o metabolismo destes (SANT’ANNA, 2002).

Uma análise das principais formas de descoberta de novos fármacos evidencia

que a estratégia mais triunfal seja baseada na modificação de moléculas ativas já

existentes. A modificação molecular consiste, basicamente, em a partir de um protótipo

de estrutura e ação biológica conhecidas, sintetizar congêneres, análogos ou homólogos

estruturais do mesmo. Por este caminho, objetiva-se produzir um novo fármaco com

potencialidade aumentada, melhora na atividade específica, segurança e de manuseio

adequado por profissionais de saúde. São exemplos desta estratégia os análogos da

lovastatina: sinvastatina, provastatina, fluvastatina, atorvastatina (WERMUTH, 2004).

As principais estratégias da química medicinal empregadas no planejamento de

séries de compostos a partir de um protótipo são: hibridização molecular,

bioisosterismo, química combinatória, latenciação molecular (pró-fármacos) e

simplificação estrutural.

34

1.5.1 - Hibridização molecular

Hibridização molecular consiste, em geral, na associação de dois fármacos, ou

mesmo de duas substâncias bioativas, através de formação de ligação covalente. Por

esta estratégia, os compostos são obtidos através da conjugação de características

estruturais definidas de dois compostos bioativos distintos (BARREIRO et al., 2002).

O método oferece maior probabilidade de obtenção de derivados com

propriedades superiores ao composto protótipo, menor custo e menor tempo de

produção. Essa estratégia tem sido empregada para obtenção de diversos fármacos

disponíveis no mercado (STRUPEZEWSKI et al., 1991) e mostra-se atraente e

promissora para identificação de novos protótipos (BARREIRO et al,. 2002).

Campos et al. (2008) sintetizaram novos carbamatos com a intenção de obter

moléculas com atividade inibidora da acetilcolinesterase para o tratamento da Doença

de Alzheimer (DA) (Figura 8). Os autores criaram novas entidades químicas a partir da

hibridização molecular entre as estruturas da rivastigmina e do donepezil, dois fármacos

utilizados no tratamento da DA.

NO

O

N

OO

O

N

NN

O

H

NO

O

NR1

R2 W

Rivastigmina Donepezil

Figura 8. Planejamento de novos carbamatos híbridos inibidores de AChE a partir da rivastigmina e do donepezil.

35

Lazar et al. (2004) hibridizaram dois fármacos, a benzocaína e metoclopramida,

produzindo 14 moléculas candidatas a medicamento (Figura 9). Os dois fármacos

hibridizados possuem propriedades terapêuticas diferentes, além disto, 6 (seis) destes

candidatos a medicamento possuem alvos moleculares distintos; para os outros 8 (oito)

candidatos ainda não foi relatada a aplicação terapêutica. Os autores utilizaram a

estrutura básica do ácido p-aminobenzóico como molde para síntese das moléculas. Os

inúmeros fármacos conhecidos podem, através da modificação molecular, gerar novos

medicamentos utéis no tratamento de diversas doenças.

Figura 9. Planejamento de novas moléculas pela hibridização de benzocaína e metoclopramida.

36

Em trabalho recente, Du et al. (2009) utilizaram do princípio da hibridação

molecular na síntese de um novo composto antiarritímico. Os autores buscaram obter

efeito sinérgico pela hibridação de dois antiarritímico, a azimilida e o composto 1-

HMR-1556 (Figura 10). Com estas moléculas hibridas propõe-se o bloqueio duplo dos

canais de potássio.

Figura 10. Estrutura química de 1-HMR-1556 e da azimilida e planejamento de Hibridização molecular.

1.5.2 - Simplificação molecular

O processo de simplificação molecular consiste na síntese e ensaio sistemático

de análogos cada vez mais simples do composto modelo. Estes análogos são réplicas

parciais ou virtuais do fármaco protótipo (KOROLKOVAS e BURCKHALTER, 1982).

Essa estratégia é frequentemente utilizada na química medicinal; em particular, o

método é interessante para o desenvolvimento de novos fármacos antineoplásicos, uma

vez que um número considerável de quimioterápicos antineoplásicos é derivado de

produtos naturais, portanto, com estrutura química complexa (GARCIA et al,. 2010).

Um exemplo clássico é a simplificação molecular da quinina, um alcalóide

derivado da casca de Cinchona officinalis. Este alcalóide originou derivados

antimaláricos da classe hidroximetilquinolínicos (mefloquina) que substituíram os

37

fármacos mais antigos (Figura 11). Basicamente, neste exemplo, o anel rubânico da

quinina é simplificado pelo heterociclo piperidínico (BARREIRO 2002).

N

HO

CF3

CF3

NH

N

H3CO

NHO

Quinina Mefloquina

Figura 11. Simplificação molecular da quinina.

GARCIA et al. (2010) sintetizaram uma série de compostos com estrutura

simplificada do catalpol, composto de estrutura química complexa com atividade

antiproliferativa (Figura 12). Os autores observaram que os produtos simplificados

evidenciaram um fortalecimento da atividade antiproliferativa, quando comparados ao

catalpol.

Figura 12. Simplificação molecular do catalpol.

38

Silva et al. (2010) relataram a síntese e avaliação da atividade farmacológica de

derivados pirazina N-acilhidrazona designadas candidatos anti-inflamátorios e

analgésicos. Esta série foi planejada por simplificação molecular do protótipo

(LASSBio-1018). Neste trabalho um dos congêneres sintetizados mostrou melhor perfil

farmacológico em comparação ao protótipo. A figura 13 mostra a simplificação

molecular de um dos derivados obtidos.

Figura 13. Simplificação molecular do prototipo LASSBio-1018.

39

2 - OBJETIVOS

2.1 - Objetivo Geral

Considerando o grande potencial terapêutico apresentado pela classe das 4-

tiazolidinonas, assim como o conhecimento de métodos eficazes de síntese, objetivamos

neste trabalho a síntese e caracterização estrutural de novas moléculas desta classe,

explorando suas possíveis atividades antimicrobianas e citotóxicas.

Os novos compostos tiveram suas estruturas racionalmente planejadas para

atividade antimicrobiana e antineoplásica baseado no princípio da hibridização

molecular. Em adição, para esta última atividade utilizamos também, como modificação

molecular, o método de simplificação molecular. Desta forma, para a atividade

antimicrobiana, procuramos fazer a junção dos grupos químicos piridinil-hidrazono,

presentes em moléculas sintetizadas anteriormente em nosso laboratório por Verçoza et

al. (2009) (Figura 14b), com o benzilideno, presente em estruturas produzidas por

Vicini et al. (2006) (Figura 14a), no anel 4-tiazolidinona N-substituído. Em adição,

Zhou et al. (2008) definiram por um estudo de relação estrutura-atividade em uma série

de 2-fenilamina-4-tiazolidinonas 5 substituídas com a porção benzilidênica,

apresentando um grupo doador de elétron (Figura 14c), essencial para atividade

anticâncer em células de pulmão.

Por outro lado, fundamentado em estruturas desenvolvidas por Havrylyuk et al.

(2009) (Figura 14d) planejamos, também, por simplificação molecular compostos com

atividade anticâncer conservando estruturalmente os grupos arilhidrazônico e 5-

benzilideno-4-tiazolidinona.

40

NN

S

NR

O

O

OH

N

NN

N

S

NO

R

R1

SN

NS

NO

H

R'

R = H, CH3, C2H5, C6H6.

R1 = H, NO2, N(CH3)2.

NN

S

NO

Simplif icaçãoMolecular

R R1

HibridizaçãoMolecular

13a 13b

13d

13c

NS

HNO

R''

R'

Figura 14. Representação da série de derivados 4a-l planejadas estrategicamente por hibridização e simplificação molecular.

41

As moléculas propostas apresentam diferentes substituintes na posição N-3 (H,

CH3, C2H5 e C6H5) e no grupo benzilideno na posição 5 do anel tiazolidinona, este

último apresentando grupo eletroretirador (R1= NO2) ou eletrodoador (R1= N(CH3)2),

além de um derivado não substituído (R1= H) (Figura 15).

Figura 15. Estruturas químicas de 4-tiazolidinonas planejadas.

2.2 - Objetivos específicos

• Sintetizar derivados tiossemicarbazonas através das reações de adição entre

tiossemicarbazidas substituídas e não-substituída com 4-formil-piridina. Obter 4-

tiazolidinonas a partir de reações de ciclização de tiossemicarbazonas.

• Sintetizar derivados 5-benzilideno-4-tiazolidinonas apartir de reações de

condensação de 4-tiazolidinonas com aldeídos, utilizando piperidina como base.

• Realizar a caracterização físico-química de todos os compostos sintetizados, assim

como determinar a estrutura de todas as moléculas em estudo através da análise

dos espectros de IV, MS e RMN de 1H e 13C.

42

• Avaliar (in vitro) a atividade antimicrobiana dos compostos sintetizados frente a

fungos e bactérias da coleção de micro-organismos do Departamento de

Antibioticos da UFPE, utilizando os métodos de difusão em disco (determinação

do halo de inibição) e concentração mínima inibitória (CMI) em meio líquido.

• Avaliar (in vitro) a atividade citotóxica frente a células NCI-H292 (obtidas de

carcinoma mucoepidermóide de pulmão), Hep-2 (derivadas de carcinoma

epidermoide de larige) e K562 (leucemia mielocitica crônica), cedidas pelo

Instituto Adolfo Lutz, além de avaliar o potencial hemolítico em eritrocitos de

camundongos.

43

3 - Material e Métodos

3.1 - Parte Experimental

3.1.1 – Cromatografias

As cromatografias em camada delgada (CCD) foram conduzidas em placas de

Sílica Gel 60 F254 da MERCK de 0,25 mm de espessura. A leitura das mesmas foi

realizada através de radiação de ultravioleta (UV) no comprimento de onda (λ) de 254

nm.

3.1.2 - Pontos de Fusão

Os pontos de fusão foram medidos no equipamento BÜCHI-535, previamente

calibrado, em tubos capilares imersos em banho de silicone.

3.1.3 - Espectroscopias de IV, RMN 1H , RMN 13C e espectrometria de MS

Os espectros de IV foram obtidos em espectroscópico BRUKER IFS-66, em

discos de KBr.

Os espectros de massa foram obtidos por impacto de elétrons 70eV em um

aparelho VARIAN MAT 711.

Os espectros de RMN 1H e 13C foram obtidos em um equipamento UNITYplus-

300 MHz-VARIAN e VNMRS 400 WB, utilizando-se CDCl3, CD2Cl2 e DMSO-d6

como solventes. Os deslocamentos químicos (δ) foram reportados em ppm, utilizando

tetrametilsilano como referência interna. As constantes de acoplamento foram indicadas

em Hz, e as multiplicidades dos sinais foram designadas da seguinte forma: s – singleto,

d – dubleto, t – tripleto, m – multipleto.

44

3.2 - Procedimentos Experimentais

3.2.1 - Obtenção de 4-fenil-tiossemicarbazida

A uma solução contendo 0,93 mL (d= 1, 032 g/mL) de hidrato de hidrazina

dissolvidos em 20 mL de etanol, foram adicionados 1g (7,4mmols) de fenil

isotiocianato lentamente. A mistura foi agitada sob refluxo por 4h e, ao término da

reação, o etanol foi evaporado à pressão reduzida, e o sólido obtido foi lavado com água

e filtrado em funil sinterizado, obtendo-se cristais de coloração branca. A

tiossemicarbazida não substituída e derivadas de radical alquil foram obtidas

comercialmente.

H2NHN

S

NH

• Sólido branco; Rendimento de 83%, Rf =0,50 ( Acetato de etila/Hexano (3:2);

• PF = 136 - 137° C;

• PF literat. = 141-143° C (Malcolm et al.,1997) .

3.2.2 - Procedimento geral de obtenção de tiossemicarbazonas

As tiossemicarbazonas foram obtidas utilizando quantidades eqüimolares de

tiossemicarbazida com 4-piridino-carboxialdeído em presença de quantidade catalítica

de ácido acético glacial em meio hidroetanólico. As misturas reacionais foram

refluxadas por um período que variou entre 1 e 3 horas, com contínua agitação. As

respectivas reações foram monitoradas por CCD até o final.

Após resfriamento, os precipitados foram filtrados em funil sinterizado e

purificados após lavagem com água destilada.

45

3.2.2.1 - 4-formil-piridina tiossemicarbazona (2a)

• Sólido branco; Rendimento: 66%; Rf = 0,50 (Acetato de etila/Hexano 7:3);

• PF = 235-236° C;

• PF literat. = 253-254° C (Mendes et al., 2001);

• IV FT (ν cm-1 KBr): 3421 (NH 2), 3152 (N-H), 1536 (C=N), 1061 (C=S).

3.2.2.2 - 4-formil-piridina (N)4-metil-tiossemicarbazona (2b)

• Sólido bege; Rendimento: 82%; Rf = 0,50 (Acetato de etila/Hexano (7:3);

• PF = 234-236ºC;

• PF literat. = 238-239° C (Beraldo et al., 2001);

• IV FT (ν cm-1 KBr): 3151 (NH CH3), 2945 (N-Hhidrazínico), 1518 (C=N), 921

(C=S).

3.2.2.3 - 4-formil-piridina (N)4-etil-tiossemicarbazona (2c)

• Sólido amarelo; Rendimento: 73%; Rf =0,50 (Acetato de etila/Hexano (4:1);

• PF = 180-181ºC;

• PF literat. = 228-229 ° C (Beraldo et al., 2001);

• IV FT (ν cm-1 KBr): 3353 (NH CH2 CH3), 2980 (N-Hhidrazínico), 1526 (C=N),

1103 (C=S).

3.2.2.4 - 4-formil-piridina (N)4-fenil tiossemicarbazona (2d)

• Sólido amarelo; Rendimento: 81%; Rf =0,50 (Acetato de etila/Hexano (3:2);

• PF = 196-198ºC;

• PF literat. = 200° C (Grammaticakis, 1956);

46

• IV FT (ν cm-1 KBr): 3306 (NH C6H5), 3106 (N-Hhidrazínico), 1550 (C=N), 1189

(C=S).

3.2.3 - Procedimento geral para obtenção de 4-tiazolidinonas (3a-d)

Em um balão foram adicionados 1,66 mmols de tiossemicarbazona, 1 eq. de

ácido cloroacético e um 1eq. de acetato de sódio anidro em meio etanólico. A mistura

reacional foi aquecida com agitação continua e mantida sob refluxo por um período de

16-28 horas. A reação foi monitorada por CCD até seu término. Após resfriamento

houve formação de precipitado, este foi filtrado e o produto lavado com metanol ou

água.

3.2.4 - Dados físico-químicos e espectroscópicos para 4-tiazolidinonas da série (3a-

d).

3.2.4.1 - 2-[(4-piridinil-metileno)hidrazono]-4-tiazolidinona (3a)

F. M: C9H8N4OS

P.M = 220g/mol.

• Sólido branco; Rendimento: 67%; PF: 262-263ºC; Rf = 0,50 (Acetato de

etila/Hexano 7:3);

• PFLiterat. = 271ºC (Buu-Hoi et al., 1954)

• IV FT (ν cm-1 KBr): 1720 (NC=O), 1633 e 1550 (C=N), 1290 (NCS), 1230 (N-

N=C), 1058 (CS);

• RMN 1H (DMSO-d6, 400 MHz / ppm): δ 12,08 (s, 1H, N-H), 8,64 (d, 2H, J =

6Hz, CHaa’), 8,40 (s, 1H, CH=N), 7,65 (d, 2H, J = 6Hz, CHbb’), 3,90 (s, 2H, CH2-S);

47

• RMN 13C (DMSO-d6, 75,4 MHz / ppm): δ 174,1 (C=O), 167,8 (N=C), 154,2

(CH=N), 150,2 (CHaa’), 141,1 (Cq), 121,2 (CHbb’), 33 (CH2-S);

• MS(EI+) calc. 220,0419; obtido: 220,0379.

3.2.4.2 - 2-[(4-piridinil-metileno)hidrazono]-(3-metil)-4-tiazolidinona (3b)

F.M: C10H10N4OS

P.M: 234g/mol

• Sólido amarelo; Rendimento: 82%; PF = 146-148ºC; Rf = 0,50 (Acetato de

etila/Hexano 7:3);

• IV FT (ν cm-1 KBr): 1713 (NC=O), 1625 e 1568 (N=C), 1302 (NCS), 1120 (N-

N=C), 1044 (CS);

• RMN 1H (DMSO-d6, 300 MHz / ppm): δ 8,67 (d, 2H, Haa’, 4,5Hz), 8,52 (s, 1H,

HC=N), 7,70 (d, 2H, Hbb’, 3,9Hz), 4,25 (s, 3H, CH3), 4 (s, 2H, S-CH2);

• RMN 13C (DMSO-d6, 75,4 MHz / ppm): δ 172,2 (C=O), 167,3 (N=C), 155,4

(CH=N), 150 (CHaa’), 141,2 (Cq), 121,4 (CHbb’), 32,1 (S-CH2), 29,3 (CH3);

• MS(EI+) calc. 234,0575; obtido: 234,0533.

3.2.4.3 - 2-[(4-piridinil-metileno)hidrazono]-(3-etil)-4-tiazolidinona (3c)

F.M: C11H12N4SO

P.M: 248g/mol

48

• Sólido verde escuro; Rendimento: 75%; PF = 139-141ºC; Rf = 0,45 (Acetato de

etila/Hexano 1:1);

• IV FT (ν cm-1 KBr): 1715 (NC=O), 1615 e 1515 (C=N),1315 (NCS), 1235 (N-

N=C), 1088 (CS);

• RMN 1H (DMSO-d6, 300 MHz / ppm): δ 8,67 (d, 2H, Haa', J = 5,7Hz), 8,52 (s,

1H, CH=N), 7,69 (d, 2H, Hbb', J = 6Hz), 4 (s, 2H, S-CH2), 3,75 (q, 2H, J = 7,2 Hz), 1,2

(t, 3H, J = 7,2Hz);

• RMN 13C (DMSO-d6, 75,4 MHz / ppm): δ 171,8 (C=O), 166,4 (C=N), 155,4

(CH=N), 150,2 (CHaa'), 140,9 (Cq- Ar), 121,2 (CHbb'), 37,7 (N-CH2), 32,1 (S-CH2),

12,1 (CH3);

• MS(EI+) calc. 248,0732; obtido: 248,0598.

3.2.4.4 - 2-[(4-piridinil-metileno)hidrazono]-(3-fenil)-4-tiazolidinona (3d)

F.M: C15H12N4SO

P.M: 296g/mol

• Sólido bege; Rendimento: 70%; PF = 252-253 ºC; Rf = 0,55 (Acetato de

etila/Hexano 3:2);

• IV FT (ν cm-1 KBr): 1720 (NC=O), 1620 e 1535 (N=C), 1380 (NCS), 1230 (N-

N=C), 1035 (CS);

• RMN 1H (DMSO-d6, 300 MHz / ppm): δ 8,7 (d, 2H, Haa', J = 4,7Hz), 8,4 (s, 1H,

CH=N), 7,65 (d, 2H, Hbb', 4,7Hz), 7,41-7,60 (m, 5H), 4,18 (s, 2H, S-CH2);

• MS(EI+) calc. 296,0732; obtido: 296,0600.

49

3.2.5 - Procedimento geral para obtenção de 2-[(4-piridinometileno)hidrazono]5-

benzilideno-4-tiazolidinonas substituídas (4a-l)

Em um balão foram adicionados 0,55 mmoles de 4-tiazolidinona requerida, 0,66

mmoles de benzaldeído (1,2 eq.), 0,72 mmoles de piperidina (1,3 eq.) e 10 ml de etanol.

A mistura foi agitada sob temperatura de refluxo por um período de 3-24h; sendo

acompanhada por CCD. Após o fim da reação a solução foi resfriada até temperatura

ambiente e posteriormente em banho de gelo. O precipitado formado foi coletado em

funil sinterizado e lavado com água.

3.2.6 - Dados Físico-químicos e Espectroscópicos para os derivados 5-benzilideno-

4-tiazolidinonas (4a-l)

3.2.6.1 - 2-[(4-piridinil-metileno)hidrazono]-5-benzilideno-4-tiazolidinona (4a)

NN

N

S

HN

Oa

a'

b

b'

F.M: C16H12N4S O

P.M: 308 g/mol

• Sólido amarelo; Rendimento: 60%; PF = 282-283ºC; Rf = 0,45(acetato de

etila/hexano 7:3);

• IV FT (ν cm-1 KBr): 1715 (NC=O), 1640 e 1503 (C=N), 1572 (C=C), 1310

(NCS), 1235 (N-N=C), 1050 (CS);

• RMN 1H (DMSO-d6, 300 MHz / ppm): δ 12,75 (s, 1H, N-H), 8,70 (d, 2H, Haa’,

J = 5,4Hz), 8,55 (s, 1H, HC=N), 7,80 (d, 2H, Hbb’, J = 5,4Hz), 7,65 (s, 1H, HC=C),

7,40-7,60 (m, 5H);

• MS(EI+) calc. 308,0732; obtido: 308,0711.

50

3.2.6.2 - 2-[(4-piridinil-metileno)hidrazono]-5-p-nitro-benzilideno-4-tiazolidinona

(4b)

F.M: C16H11N5O3S

P.M: 353g/mol

• Sólido amarelo; Rendimento: 82%; PF = >300°C; Rf = 0,50 (Acetato de

etila/Hexano 7:3);


(NCS), 1300 (N-N=C), 1007 (CS);

• RMN 1H (DMSO-d6, 400 MHz / ppm): δ 12,55 (s, 1H, NH), 8,71 (d, 2H, Haa’, J

= 5,6Hz), 8,56 (s, 1H, CH=N), 8,36 (d, 2H, Hcc’, J = 7,6 Hz), 7,94 (d, 2H, Hdd’, J =

8,00 Hz), 7,76 (s, 1H,CH=C), 7,70 (d, 2H, Hbb’, J = 5,6 Hz);

• MS(EI+) calc. 353,0583; obtido: 353,0415.

3.2.6.3 - 2-[(4-piridinil-metileno)hidrazono]-5-p-dimetilamino-benzilideno-4-

tiazolidinona (4c)

51

NN

N

S

HN

Oa

a'

b

b'

N

c

c'd'

d

CH3

H3C

F.M: C18H17N5OS

P.M: 351g/mol

• Sólido amarelo laranja; Rendimento: 50%; PF = 252-253°C; Rf = 0,47 (Acetato

de etila/Hexano 7:3);


(NCS), 1250 (N-N=C), 1057 (CS);

• RMN 1H (DMSO-d6, 400 MHz / ppm): δ 12,43 (s, 1H, NH), 8,69 (d, 2H, Haa’, J

= 5,6Hz), 8,50 (s, 1H, CH=N), 7,74 (d, 2H, Hbb’, J = 5,2Hz), 7,61 (s, CH=C), 7,51 (d,

Hdd’, J = 8Hz), 6,85 (d, 2H, Hcc’, J = 8Hz), 3,02 (s, 6H);

• MS(EI+) calc. 351,1154; obtido: 351,1110.

3.2.6.4 - 2-[(4-piridinil-metileno)hidrazono]-(3-metil)-5--benzilideno-4-

tiazolidinona (4d)

F.M: C17H14N4SO

P.M: 322g/mol

• Sólido amarelo escuro; Rendimento: 58%; PF = 162-164ºC; Rf = 0,50 (Acetato


• IV FT (ν cm-1 KBr): 1701 (NC=O), 1620 e 1536 (N=C), 1565 (C=C), 1374

(NCS), 1125 (N-N=C), 1037 (CS);

52

• RMN 1H (DMSO-d6, 300 MHz / ppm): δ 8,72 (d, 2H, Haa’, J = 5,4Hz), 8,63 (s,

1H, CH=N), 7,77 (d, 2H, Hbb’, 5,7Hz), 7,75 (s,1H, HC=C), 7,50-7,70 (m, 5H), 2,55 (s,

3H, CH3);

• MS(EI+) calc. 322,0888; obtido: 322,0727.

3.2.6.5 - 2-[(4-piridinil-metileno)hidrazono]-(3-metil)-5(p-nitro-benzilideno)-4-

tiazolidinona (4e)

F.M: C17H13N5O3S

P.M: 367g/mol

• Sólido amarelo escuro; Rendimento: 50%; PF: 266-268ºC; Rf = 0,50 (Acetato de

etila/Hexano 3:2);


(NCS), 1130 (N-N=C), 1039 (CS);

• RMN 1H (DMSO-d6, 400 MHz / ppm): δ 8,74 (d, 2H, Haa’,J = 5,6 Hz), 8,68 (s,

1H, CH=N), 8,37 (d, 2H, Hcc’, J = 7,6 Hz), 7,97 (d, 2H, Hdd’, J = 8,0 Hz), 7,87 (s, 1H,

CH=C), 7,79 (d, 2H, Hbb’, J = 5,6 Hz), 2,55 (s, 3H);

• MS(EI+) calc. 367,0739; obtido: 367,0602.

53

3.2.6.6 - 2-[(4-piridinil-metileno)hidrazono]-(3-metil)-5(p-dimetilamino-

benzilideno)-4-tiazolidinona (4f)

F.M: C19H19N5SO

P.M: 365g/mol

• Sólido roxo; Rendimento: 47%; PF: 239-241ºC; Rf = 0,50 (Acetato de

etila/Hexano 3:7);


(NCS), 1200 (N-N=C), 1115 (CS);

• RMN 1H (CD2Cl2), 300 MHz / ppm): δ 8,65 (d, 2H, Haa’, J = 5,7 Hz), 8,39 (s,

1H, CH=N), 7,65 (d, 2H, Hbb’, J = 6Hz), 7,61 (s, 1H, CH=C), 7,52 (d, 2H, Hdd’, J =

8,7Hz), 6,75 (d, 2H, Hcc’, J = 9Hz), 3,37 (s, 3H), 3,02 (s, 6H);

• MS(EI+) calc. 365,1310; obtido: 365,1274.

3.2.6.7 - 2-[(4-piridinil-metileno)hidrazono]-(3-etil)-5-benzilideno-4-tiazolidinona

(4g)

NN

N

S

NO

a

a'

b

b'

CH3

F.M: C18H16N4OS

P.M: 336g/mol

54

• Sólido amarelo; Rendimento: 78%; PF: 162-161ºC; Rf = 0,50 (Acetato de

etila/Hexano 1:1);


(NCS), 1230 (N-N=C), 1080 (CS);

• RMN 1H (DMSO-d6, 300 MHz / ppm): δ 8,75 (d, 2H, Haa', J = 5,5Hz), 8,68 (s,

1H, CH=N), 7,82 (d, 2H, Hbb', J = 5,5 Hz), 7,78 (s, 1H, CH=C), 7,60-7,75 (m, 5H),

3,97 (q, 2H, J = 6,6Hz), 1,3 (t, 3H, J = 6,6Hz);

• MS(EI+) calc. 336,1045; obtido: 336,0870.

3.2.6.8 - 2-[(4-piridinil-metileno)hidrazono]-(3-etil)-5(p-nitro-benzilideno)-4-

tiazolidinona (4h)

F.M: C18 H15 N5 O S

P.M: 381g/mol

• Sólido vermelho escuro; Rendimento: 65%; PF = 244-246ºC; Rf = 0,45 (Acetato



(NCS), 1230 (N-N=C), 1080 (CS);

• RMN 1H (DMSO-d6, 300 MHz / ppm): δ 8,73 (d, 2H, Haa’, J = 5,7Hz), 8,68 (s,

1H,CH=N), 8,37 (d, 2H, Hcc’, J = 8,7Hz), 7,95 (d, 2H, Hdd’, J = 9Hz), 7,86 (s,1H,

CH=C), 7,78 (d, 2H, Hbb’, J = 6Hz), 4 (q, 2H, J = 6,9Hz), 1,3 (t, 3H, J = 6,9Hz);

• MS(EI+) calc. 381,0896; obtido: 381,0858.

55

3.2.6.9 - 2-[(4-piridinil-metileno)hidrazono)]-(3-etil)-5(p-dimetilamino-

benzilideno)-4-tiazolidinona (4i)

F.M: C20H21N5OS

P.M: 379g/mol

• Sólido vermelho escuro; Rendimento: 53%; PF: 222-224ºC; Rf = 0,45 (Acetato


• IV FT (ν cm-1 KBr): 1702 (NC=O), 1630 e 1520 (N=C), 1555 (C=C), 1350

(NCS), 1200 (N-N=C), 1035 (CS);

• RMN 1H (CDCl3, 300 MHz / ppm): δ 8,70 (d, 2H, Haa', J = 6Hz), 8,40 (s, 1H,

CH=N), 7,69 (d, 2H, Hbb', J = 6Hz), 7,67 (s, 1H, CH=C), 7,50 (d, 2H, Hdd', J = 9Hz),

6,75 (d, 2H, Hcc', J = 9Hz), 4,00 (q, 2H, J = 6,9 Hz), 3,10 (s, 6H), 1,35 (t, 3H, J = 6,9

Hz);

• RMN 13C (CDCl3, 75,4 MHz / ppm): δ 167,1 (C=0), 163,1 (C=N), 154,9

(CH=N), 151,1 (Cq.f), 150,0 (CHaa') 141,8 (Cq- Ar, piridina), 132,3 (CH=C), 132,2

(CH=C), 121,7 (CHbb'), 121,3 (CHdd’), 114,9 (Cq.e), 111,8 (CHcc');

• MS(EI+) calc. 379,1467; obtido: 379,1284.

56

3.2.6.10 - 2-[(4-piridinil-metileno)hidrazono]-(3-fenil)-5-benzilideno-4-tiazolidinona

(4j)

F.M: C22H16N4OS

P.M: 384g/mol


etila/Hexano 3:2);


(NCS), 1280 (N-N=C), 1050 (CS);

• RMN 1H (DMSO-d6, 300 MHz / ppm): δ 8,70 (d, 2H, J = 6Hz, CHaa’), 8,47 (s,

1H, CH=N), 7,81 (s, 1H, CH=C), 7,73 (d, 2H, 6Hz, CHbb’), 7,50-7,75 (m, 10H);

• MS(EI+) calc. 384,1045; obtido: 384,0890.

3.2.6.11 - 2-[(4-piridinil-metileno)hidrazono)]-(3-fenil)-5(p-nitro-benzilideno)-4-

tiazolidinona (4k)

NN

N

S

NO

a

a'

b

b'

O2N

c

c'd'

d

F.M: C22 H15 N5 O S

57

P.M: 429g/mol


etila/Hexano 3:2);


(NCS), 1290 (N-N=C), 1050 (CS);

• RMN 1H (DMSO-d6, 400 MHz / ppm): δ 8,69 (d, 2H, J = 5,6Hz, CHaa’), 8,49

(s, 1H, HC=N), 8,38 (d, 2H, J = 8,8 Hz, CHcc’), 8,00 (d, 2H, J = 8,4 Hz, CHdd’), 7,90

(s, 1H, CH=C), 7,72 (d, 2H, J = 5,2Hz, CHbb’), 7,50-7,57 (m, 5H);

• MS(EI+) calc. 429,0896; obtido: 429,0732.

3.2.6.12 - 2-[(4-piridinil-metileno)hidrazono]-(3-fenil)-5(p-dimetilamino-

benzilideno)-4-tiazolidinona (4l)

NN

N

S

NO

a

a'

b

b'

N

c

c'd'

d

CH3

H3C

F.M: C24 H21 N5 O S

P.M: 427g/mol

• Sólido amarelo laranja; Rendimento: 74%; PF: 220-221ºC; Rf = 0,50 (Acetato de

etila/Hexano 3:2);


(NCS), 1200 (N-N=C), 1050 (CS);

• RMN 1H (CDCl3, 300 MHz / ppm): δ 8,65 (d, 2H, Haa', J = 5,4Hz), 8,28 (s, 1H,

CH=N), 7,76 (s, 1H, CH=C), 7,63 (d, 2H, Hbb', J = 5,1), 7,5 (d, 2H, Hdd', J = 8,1),

7,41-7,56 (m, 5H), 6,80 (d, 2H, Hcc', J = 8,4 Hz), 3,00 (s, 6H);

58

• RMN 13C (CDCl3, 75,4 MHz / ppm): δ 166,9 (C=O), 163,7 (C=N), 155,7

(CH=N), 151,3 (Cq.f), 150,1 (CHaa'), 141,5 (Cq.Ar piridina), 134,6 (CH=C), 133,2

(CH=C),127,8-132,4 (CHf,g,h,i), 121,7 (CHbb'), 121,2 (CHdd’), 114,1 (Cq.e), 111,9

(CHcc');

• MS(EI+) calc. 427,1467; obtido: 427,1294.

3.3 - ATIVIDADES BIOLÓGICAS

3.3.1 – Micro-organismos testados e padrão de inóculos

Para o ensaio antimicrobiano foram utilizados bactérias gram-positivas, gram-

negativa, álcool-ácidos resistente e fungos da coleção de micro-organismos do

Departamento de Antibióticos da UFPEDA. Os organismos testados estão listados no

Quadro 1. No ensaio qualitativo utilizou-se o teste de difusão em ágar e no ensaio

quantitativo fez-se a determinação da concentração mínima inibitória (CMI).

Os meios de culturas utilizados foram Agar nutritivo (AN), Sabouraud (SAB) e

infusão Coração-Cérebro (BHI). Os micro-organismos foram incubados entre 30-37ºC

por 24-48 h, dependendo de cada micro-organismo. As suspensões dos micro-

organismos testes foram padronizadas através da escala de MacFarland com turbidez

correspondente a 0,5, equivalente a 108 unidades formadoras de colônias por mililitros

(UFC/mL).

Inicialmente foi realizado o teste qualitativo com os compostos sintetizados e as

substâncias que apresentaram halo de inibição superior a 18 mm foram submetidas à

determinação da concentração mínima inibitória (CMI).

59

Quadro 1: Espécies de bactérias e fungos utilizados nos ensaios de atividade antimicrobiana para os compostos sintetizados.

Bactérias Gram-positivas

Staphylococcus aureus (UFPEDA02)

Bacillus subtilis (UFPEDA 86)

Micrococus luteus (ATTC 2225)

Bactéria Gram-negativa Escherichia coli (UFPEDA224)

Bactéria Álcool-ácido resistente Mycobacterium smegmatis (UFPEDA 71)

Fungos

Candida albicans (UFPEDA 1007)

Candida sp. (UFPEDA 1315)

Aspergilus niger (UFPEDA 2003)

3.3.2 - Determinação da atividade antimicrobiana

Os ensaios iniciais para atividade antibacteriana e antifúngica foram realizados

em triplicata, de acordo com a metodologia de Difusão em Disco em meio sólido

(BAUER et al, 1966).

As soluções foram preparadas na concentração de 2,5 mg/mL para cada

composto testado. Os discos de papel foram embebidos com 40µL das soluções

preparadas, resultando em uma concentração final de 100µg/disco. Estes foram

colocados em placas de Petri contendo os meios de cultura previamente semeados com

micro-organismos testes. As placas de Petri foram incubadas a 37ºC (bactérias) ou 30ºC

(fungos) por 24-48 h, de acordo com a necessidade de crescimento do micro-organismo.

Discos umedecidos de DMSO foram utilizados como controle negativo.

Os resultados foram analisados através das médias aritméticas dos halos de

inibição, Zona Média de Inibição (ZMI), expressas em milímetros, e os compostos que

apresentaram halo maior ou igual a 18 milímetros foram selecionados para os ensaios de

60

CMI. Cloranfenicol e Rifampicina (antibacterianos), e Nistatina (antifúngico) foram

utilizados como drogas de referência na concentração de 100µg/disco.

Os valores da CMI foram determinados em meio sólido através do subcultivo

em placas de Agar utilizando diferentes concentrações dos compostos testados. Desta

forma os meios com diferentes concentrações do composto (1000µg/mL, 500µg/mL,

250µg/mL, 125µg/Ml, 65µg/mL) permitem observar em quais concentrações ocorre

inibição de crescimento do micro-organismo. A determinação da atividade

antimicrobiana foi feita dentro das normas estabelecidas pelo National Commitee for

Clinical Laboratory Standards com pequenas alterações (NCCLS, 1992; NCCLS, 1993).

3.3.3 - Determinação da atividade citotóxica

Para avaliação da citotoxicidade pelo método colorimétrico do MTT (brometo

de 3-[4,5-dimetiltiazol-2-il]-2,5-difeniltetrazólio) (MOSMANN, 1983; ALLEY et al.,

1988) foram utilizadas as linhagens HEp-2 (derivadas de tumor primário de laringe

humana), NCI-H292 (linhagem continua de células mucoepidermóide obtida a partir de

um carcinoma de pulmão humano) e K562 (leucemia mielocítica crônica). As células

foram isoladas em DMEM - Dulbecco’s Modified Ealgle Médium (GIBCO) com 10%

de soro fetal bovino (GIBCO), 1% de solução de antibiótico (penicilina 1000UI/mL e

estreptomicina 250mg/mL) e 1% de L-glutamina 200Mm (EAGLE, 1955).

Suspensões celulares de 105células/mL (HEp-2 e NCI-H292) e

0,3x106células/mL (K562), foram distribuídas em placas de cultura com 96 poços e

incubadas a 37ºC, em atmosfera úmida (5% de CO2), durante 24h. Em seguida as

substâncias teste (1,25 a 10μg/mL) foram adicionadas às placas. Após 72h de incubação

foi adicionado MTT e as placas foram mantidas na estufa e logo em seguida foi

adicionado DMSO a cada poço. O etoposídeo (0,625 a 10µg/mL) foi utilizado como

controle positivo. A leitura óptica foi feita em leitor automático de placas (450nm). A

CI50 (concentração que inibe 50% do crescimento celular em relação ao controle) e

respectivos intervalo de confiança 95% foram determinados a partir de regressão não-

linear utilizando o programa SigmaPlot versão 11.0.

61

3.3.4 - Avaliação do potencial hemolítico em eritrócitos de camundongos

O teste da atividade hemolítica foi realizado no composto que apresentou

citotoxicidade em células tumorais.

O sangue foi coletado de camundongos Swiss (Mus musculus) por punção

cardíaca. Os eritrócitos foram lavados com solução salina (NaCl 0,85% + CaCl2 10mM)

por centrifugação (3000 rpm/5min), o sobrenadante foi descartado e ressuspendidos em

solução salina para se obter uma suspensão de eritrócitos (SE) a 2%. Esses

experimentos foram realizados em multiplacas com 96 poços: 100µl de solução salina

(controle negativo); 50µl da solução salina e 50µl do veículo (branco); 80µL de solução

salina + 20µl de Triton X – 100 a 1% (controle positivo); 100µL de solução salina +

100µL de solução do composto 3b e 4l (3,09 a 500 μg/mL) diluída em DMSO a 10%

foram plaqueados. Em seguida 100µL da solução de eritrócitos foi plaqueada em todos

os poços. Após a incubação de 1h sob agitação constante à temperatura ambiente, o

sobrenadante foi analisado. A leitura óptica foi feita em leitor automático de placas

(450nm). A concentração efetiva 50% (CE50) e respectivo intervalo de confiança 95%

foram determinados a partir de regressão não-linear utilizando o programa SigmaPlot

versão 11.0. Extratos com valores de CE50 < 200µg/ml são considerados ativos

(COSTA-LOTUFO et al., 2005).

62

4 - RESULTADOS E DISCUSSÃO

4.1 - Esquema Geral de Síntese

O Esquema 12 apresenta a rota de síntese empregada na obtenção das

tiossemicarbazonas e 4-Tiazolidinonas planejadas.

3a- R = H3b- R = CH33c- R = C2H53d- R = C6H5

4a- R = H ; R1 = H4b- R = H ; R1 = NO24c- R = H ; R1 = N(CH3)24d- R = CH3 ; R1 = H4e- R = CH3; R1 = NO24f- R = CH3; R1 = N(CH3)2

4g- R = C2H5 ; R1 = H4h- R = C2H5 ; R1 = NO24i- R = C2H5 ; R1 = N(CH3)24j- R = C6H5 ; R1 = H4k- R = C6H5 ; R1 = NO24l- R = C6H5 ; R1 = N(CH3)2

N

O

HH2N

HNS

NHR+

EtOH / H2OAcOH

NN

HN S

NHR

4-Formil-PiridinaTiossemicarbazona

Tiossemicarbazida

NN

N

S

NO

R

ClCH2CO2HAcONaEtOH

4-Tiazolidinona

NN

N

S

NO

R

R1

5-Benzilideno-4-Tiazolidinona

PiperidinaEtOH

CHOR1

2a-d

3a-d4a-l

Esquema 12. Rota de síntese empregada na preparação das tiossemicarbazonas e 4-tiazolidinonas planejadas.

63

4.2 - Metodologia sintética e mecanismos reacionais

4.2.1 - Obtenção das Tiosemicarbazonas (2a-d)

As formilpiridinas tiossemicarbazonas 2a-d já são relatadas na literatura

(GRAMMATICAKIS, 1956; MENDES et al., 2001; BERALDO et al., 2001). Esses

compostos podem ser facilmente preparados pela reação de condensação entre as

piridinacarboxialdeídos e tiossemicarbazidas, disponíveis comercialmente

(SORADNICK et al., 2003; HOLLA et al., 2003). As tiossemicarbazonas foram obtidas

apartir da reação entre a tiossemicarbazida requerida e quantidades equimolares de 4-

formil-piridina em água destilada e etanol. A reação é favorecida pelo caráter

nucleofílico do nitrogênio N1 das tiossemicarbazidas; Além disso, estas reações foram

aceleradas por catálise ácida (TENÓRIO et al., 2005)(Esquema 13). A Tabela 1

apresenta as propriedades físico-químicas das tiossemicarbazonas sintetizadas.

Tabela 1: Propriedades físico-químicas das tiossemicarbazonas. ______________________________________________________________________ Rend. % PF ºC Aspecto Rf* ______________________________________________________________________ 2a 68 237-238 Sólido branco 0,45 2b 70 235-236 Sólido amarelo claro 0,60 2c 67 180-182 Sólido amarelo claro 0,40 2d 89 196-197 Sólido amarelo claro 0,50 ______________________________________________________________________ ∗ Eluente: acetato de etila/hexano 7:3

O mecanismo de formação das tiossemicarbazonas inicia-se pela protonação da

carbonila do aldeído, levando a formação do íon oxônio. Em seguida ocorre o ataque

nucleofílico do nitrogênio N-1 da tiossemicarbazida para formar o intermediário

hemiaminal protonado (SMITH e MARCH, 2001). Este perde uma molécula de água e

após neutralização forma-se a tiossemicarbazona (Esquema 13).

64

Esquema 13. Mecanismo de reação catalizada por ácido apartir de aldeído e tiossemicarbazida para obtenção de tiossemicarbazonas.

De acordo com Karabatsos et al. (1964), as tiossemicarbazonas sintetizadas a

partir de uma amina primária podem ser obtidas nas configurações Z ou E, dependendo

do substituinte do aldeído utilizado. Em trabalho realizado por Tenório et al. (2005),

observou-se através de estudos de espectros de tiossemicarbazonas análogas a série 2a-

d que não há mudança de deslocamento ou de aparecimento de sinais diferentes para o

hidrogênio azometinico. Em nosso experimento de síntese só foi observada uma única

mancha nas cromatografias de camada delgada (CCD), podemos sugerir que as

tiossemicarbazonas foram obtidas preferencialmente na configuração E (OTA et al.,

1998).

4.2.2 - Obtenção de 2-[(4-piridinil-metileno)hidrazono]-4-tiazolidinonas

(3a-d)

A 4-tiazolidinona 3a já é relatada na literatura (Buu-Hoi et al., 1954). A série 3a-

d foi obtida a partir de reações das respectivas tiossemicarbazonas com ácido

cloroacético em presença de acetato de sódio anidro (evita a hidrólise ácida do grupo

imino) (OTTANÁ et al., 2005). Ao final das reações, uma lavagem dos precipitados

formados com solvente apropriado forneceu os compostos com pureza e rendimentos

satisfatórios (Tabela 2).

65

Tabela 2: Propriedades físico-químicas e rendimentos de 4-tiazolidinonas 3a-d. ______________________________________________________________________ Rend. % PF ºC Aspecto Rf / eluente ______________________________________________________________________ 3a 67 262-263 sólido branco 0,41(acetato de etila/hexano 7:3) 3b 82 146-148 sólido amarelo 0,50(acetato de etila/hexano 3:2) 3c 75 139-141 sólido verde escuro 0,46(acetato de etila/hexano 1:1) 3d 70 252-253 sólido bege 0,55(acetato de etila/hexano 3:2) ______________________________________________________________________

O mecanismo se inicia pela condensação do ácido cloroácetico com o átomo de

enxofre (S-alquilação) a partir da forma tiol da tiossemicarbazona. Em seguida, ocorre

um ataque intramolecular por parte do par de elétrons livres do nitrogênio na carbonila

do ácido cloroacético, seguido de perda de uma molécula de água, levando a formação

do heterociclo não substituído na posição C-5 (esquema 14) (JOLLY e SHARMA,

1990).

NN

HN

NHR

S

NN

N SH

NHR

ClH2C

O

OH

NN

N

NHR

SO

OH

NN

N

S

N OHO

HR+

-N

NN

S

NO

R

- H2O

-HCl

Esquema 14. Mecanismo de reação geral para obtenção das 4-tiazolidinonas da série 3a-d.

66

4.2.3 - Obtenção de 2-[4-piridinil-metileno]-5-benzilideno)-4-

tiazolidinonas (4a-l)

As 4-tiazolidinonas desta série foram obtidas a partir dos derivados 4-

tiazolidinônicos não substituidos na posição 5 do anel, seguindo um mecanismo de

condensação do aldeído. Nesta etapa, a condensação com os aldeídos se dá pela

utilização de piperidina em meio etanólico. O esquema 15 mostra o mecanismo da

reação de formação dos derivados 5-benzilideno-4-tiazolidinonas (4a-l).

Processos simples de purificação como lavagem com água ou metanol forneceu

compostos com purezas satisfatórias e rendimentos entre 47-82%. Suas propriedades

físico-químicas e rendimentos estão descritos na Tabela 3.

Tabela 3: Propriedades fisico-quimicas e rendimentos de 5-benzilideno-4-tiazolidinonas 4a-l. ______________________________________________________________________ Rend. % PF ºC Aspecto Rf / eluente ______________________________________________________________________ 4a 60 282-283 sólido amarelo claro 0,45(acetato de etila/hexano 7:3) 4b 82 >300 sólido amarelo 0,42(acetato de etila/hexano 7:3) 4c 50 252-253 sólido vermelho escuro 0,47(acetato de etila/hexano 7:3) 4d 58 162-164 sólido amarelo escuro 0,50(acetato de etila/hexano 3:2) 4e 50 266-268 sólido amarelo escuro 0,50(acetato de etila/hexano 3:2) 4f 47 239-241 sólido roxo 0,50(acetato de etila/hexano 7:3) 4g 78 162-163 sólido amarelo 0,50(acetato de etila/hexano 1:1) 4h 65 244-246 sólido vermelho escuro 0,45(acetato de etila/hexano 1:1) 4i 53 222-224 sólido vermelho escuro 0,45(acetato de etila/hexano 2:3) 4j 77 262-263 sólido amarelo 0,65(acetato de etila/hexano 3:2) 4k 69 296-297 sólido amarelo 0,50(acetato de etila/hexano 3:2) 4l 74 220-221 sólido amarelo laranja 0,50(acetato de etila/hexano 3:2)

67

O mecanismo da reação inicia-se com a formação de um ânion enolato no anel

4-tiazolidinona, através do tratamento com uma base, neste caso a piperidina. A

formação do enolato é facilitada devido ao efeito retirador de elétrons da carbonila

presente na posição 4 do anel; Além disso, o enxofre exerce efeito de campo eletro-

atrator favorecendo a estabilidade do enolato. Em seguida, ocorre um ataque

nucleofílico do carbânion ao carbono da função aldeído, o qual por eliminação de água

leva a formação do benzilideno na posição 5 do anel.

NN

N

S

NO

R

HH

NH

NN

N

S

NO

R

H- N

NN

S

NO

R

H

-

NH H+

N

NN

S

NR

O

H-

-

R1

OH

NN

N

S

NR

O

H

OHH

R1

NN

N

S

NR

O

H

OHH

R1

NN

N

S

NR

O

H

R1

- H2O

Esquema 15. Mecanismo da reação de síntese da 5-benzilideno-4-tiazolidinona.

68

4.3 - Caracterização Estrutural dos Derivados Tiazolidinônicos 3a-d e

4a-l

Os espectros de IV de todas tiazolidinonas sintetizadas apresentaram duas

bandas de absorção de fortes intensidades entre 1500-1647 cm-1 referentes ao

estiramento dos grupos C=N da posição 2 do anel e do grupo arilhidrazona (ERGENÇ

et al., 1999). Os espectros também mostraram fortes absorções entre 1698-1720 cm-1

associadas com bandas de amida I no anel tiazolidinico, assim como bandas entre 1120-

1300 cm-1 e 1007-1115 cm-1 referentes ao estiramento dos grupos N-N=C e CS,

respectivamente. Além disso, bandas de diferentes absorções entre 1290-1385 cm-1,

características de vibração angular do grupo NCS, evidenciam a formação do anel

tiazolidinico a partir das respectivas tiossemicarbazonas (ÇAPAN et al., 1999;

ULUSOY et al., 2002; EL-GENDY et al., 1990).

As bandas de absorção da carbonila nas 4-tiazolidinonas da série 3a-d (Tabela 4)

apareceram entre 1713-1720 cm-1. Para os derivados 5-benzilideno-4-tiazolidinonas

(4a-l) (Tabela 5) as bandas para essa carbonila apareceram entre 1698-1718 cm-1

(VICINI et al.,2006; KUÇUKGUZEL et al., 2006). Esse pequeno efeito batocrômico

ocorre devido a conjugação da carbonila destes últimos compostos com a dupla ligação

C=C exocíclica, a qual é responsável pelo enfraquecimento da ligação C-O. Em adição,

o estiramento referente a esta dupla ligação C=C foi caracterizado por bandas que

apareceram entre 1555-1581 cm-1.

As principais bandas de absorção abservadas nos espectro de IV para as 4-

tiazolidinonas, e suas referidas intensidades, são mostradas nas Tabelas 4 e 5. As

Figuras 16 e 17 ilustram, respectivamente, os espectros de IV dos compostos 3c e 4l.

69

Tabela 4: Principais frequências de absorção observadas nos espectros de IV para as 4-tiazolidinonas (3a–d). _____________________________________________________________________

NC=O (ν) C=N (ν) NCS (ν) N-N=C (ν) CS (ν) ______________________________________________________________________ 3a 1720 1633 e 1550 1290 1230 1058

3b 1713 1625 e 1568 1302 1120 1044

3c 1715 1615 e 1515 1315 1235 1088

3d 1720 1620 e 1535 1380 1230 1035

3 9 0 0 3 6 0 0 3 3 0 0 3 0 0 0 2 7 0 0 2 4 0 0 2 1 0 0 1 8 0 0 1 5 0 0 1 2 0 0 9 0 0 6 0 0 3 0 0 00 ,0

0 ,2

0 ,4

0 ,6

0 ,8

1 ,0

Tran

smitâ

ncia

F r e q u ê n c ia ( c m -1 )

P 1 C Z

Figura 16. Espectro de IV para 4-tiazolidinona 3c (pastilha de KBr).

1715 (NC=O)

1615 e 1515 (C=N)

70

Tabela 5: Principais freqüências de absorção observadas nos espectros de IV para as 5-benzilideno-4-tiazolidinonas (4a–d). _____________________________________________________________________ NC=O (ν) C=N (ν) C=C(ν) NCS (ν) N-N=C (ν) CS (ν) ______________________________________________________________________ 4a 1715 1640 e 1503 1572 1310 1235 1050

4b 1708 1625 e 1500 1581 1340 1300 1007

4c 1714 1647 e 1527 1573 1318 1250 1057

4d 1701 1620 e 1536 1565 1374 1125 1037

4e 1715 1624 e 1535 1567 1340 1130 1039

4f 1698 1598 e 1530 1566 1326 1200 1115

4g 1700 1613 e 1500 1555 1385 1230 1080

4h 1706 1613 e 1500 1555 1385 1230 1080

4i 1702 1630 e 1520 1555 1350 1200 1035

4j 1705 1616 e 1500 1570 1370 1280 1050

4k 1718 1620 e 1500 1575 1385 1290 1050

4l 1705 1615 e 1535 1580 1370 1200 1050

3 9 0 0 3 6 0 0 3 3 0 0 3 0 0 0 2 7 0 0 2 4 0 0 2 1 0 0 1 8 0 0 1 5 0 0 1 2 0 0 9 0 0 6 0 0 3 0 0 00 ,1

0 ,2

0 ,3

0 ,4

0 ,5

0 ,6

0 ,7

0 ,8

0 ,9

1 ,0

Tran

smitâ

ncia

F r e q u ê n c ia ( c m - 1 )

P 1 D Z 3 3

Figura 17. Espectro de IV para o derivado 5-benzilideno-4-tiazolidinona 4l (pastilha de KBr).

1705 (NC=O)

1615 e 1535 (N=C) 1580 (C=C)

71

Nos espectros de RMN ¹H dos compostos da série 3a-d a formação do anel foi

evidenciada pela presença de um singleto entre 3,90-4,18 ppm referente ao grupo S-CH2

(ENGENÇ et al., 1999). O aparecimento deste sinal para os dois hidrogênios

especificados mostra que os mesmos estão em um mesmo ambiente químico (Figura

18). Os hidrogênios referentes ao grupo CH=N para esta série são observados na região

entre 8,40-8,52 ppm (Tabela 6).

Tabela 6: Principais deslocamentos químicos (ppm) observados nos espectros de RMN ¹H para as 4-tiazolidinonas (3a–d). _____________________________________________________________________ CH=N CH2 Outros ______________________________________________________________________ 3a 8,40 3,90 12,08 (N-H)

3b 8,52 4,00 4,25 (CH3)

3c 8,52 4,00 3,75 (CH2) e 1,20 (CH3)

3d 8,40 4,18 7,41-7,61 (N-Ar)

72

Figura 17. Espectro de RMN 1H para a 4-tiazolidinona 3c (DMSO-d6; 300 MHz), ilustrando os singletos referente ao grupos metileno e azometínico.

Com relação aos espectros de RMN ¹H para os compostos 5-benzilideno-4-

tiazolidinonas (4a-l) os hidrogênios referente ao grupo CH=N apresentaram

deslocamentos químicos semelhantes aos da série 3a-d, entre 8,28-8,68 ppm (Tabela 7).

O desaparecimento dos singletos referentes ao grupo metileno na posição 5 do anel

tiazolidínico da série 3a-d, assim como a presença de um singleto entre 7,65-7,90 ppm

referente ao hidrogênio do grupo benzilideno, confirmam a estrutura dos derivados da

série 4a-d (Figura 19).

73

Em trabalho realizado em nosso grupo de pesquisa por Aquino (2007) a

configuração Z para o hidrogênio benzilidênico dos derivados 5-benzilideno-4-

tiazolidinonas foi atribuída com base na análise dos espectros de RMN ¹H mostrando

um deslocamento químico maior devido ao maior efeito de desblindagem da carbonila

em relação ao enxofre. Tabela 7: Principais deslocamentos químicos (ppm) observados nos espectros de RMN ¹H para as 5-benzilideno-4-tiazolidinonas (4a–l). _____________________________________________________________________

CH=N CH=C Outros

______________________________________________________________________

4a 8,55 7,65 12,75 (N-H); 7,40-7,60 (5H)

4b 8,56 7,76 12,55 (N-H)

4c 8,50 7,61 12,43 (N-H)

4d 8,63 7,75 7,50-7,70 (5H)

4e 8,68 7,87 2,55 (CH3)

4f 8,39 7,61 3,02 (N(CH3)2)

4g 8,68 7,78 7,60-7,75 (5H)

4h 8,68 7,86 8,37 e 7,95 (Ar-NO2)

4i 8,40 7,67 3,10 (N(CH3)2)

4j 8,47 7,81 7,50-7,75 (5H)

4k 8,49 7,90 8,38 e 8,00 (Ar-NO2)

4l 8,28 7,76 3,00 (N(CH3)2)

74

Figura 19. Espectro de RMN 1H para o derivado 5-benzilideno-4-tiazolidinona 4f (CHCl3; 300 MHz), ilustrando principalmente o singleto referente hidrogênio vinilidenênico.

Os espectros de RMN ¹³C dos compostos tiazolidinônicos das duas séries em

questão apresentaram deslocamentos químicos referentes aos carbonos dos grupos

NC=O, imino (C=N) da posição 2 do anel tiazolidinico e C=N da função azometina

entre 167,1-174,1, 163,1-167,8 e 154,2-155,7, respectivamente (Tabela 8). Em adição

75

foram obtidos deslocamentos químicos específicos para S-CH2 entre 32,1-33,0 ppm,

para a série 3a-d (Figura 20).

Tabela 8: Principais deslocamentos químicos (ppm) observados nos espectros de RMN ¹³C para tiazolidinonas sintetizadas. _____________________________________________________________________ C=O C=N CH=N CH2 CH=C CH=C ______________________________________________________________________ 3a 174,1 167,8 154,2 33,0 ____ ____

3b 172,2 167,3 155,4 32,1 ____ ____

3c 171,8 166,4 155,4 32,1 ____ ____

4i 167,1 163,1 154,9 ____ 132,3 132,2

4l 166,9 163,7 155,7 ____ 134,6 133,2

Figura 20. Espectro de RMN 13C para a 4-tiazolidinona 3c, apresentando o sinal referente à carbonila e ao carbono metilênico do anel 4-tiazolidinona (DMSO-d6; 75,4 MHz).

CH

=N

Aromáticos

76

Os espectros de RMN ¹³C para os compostos 5-benzilideno-4-tiazolidinonas

apresentam ressonâncias entre 132,3-133,2 e 132,4-134,7 ppm referentes aos átomos de

carbono endo e exocíclico da ligação benzilidênica, respectivamente (Figura 21). A

tabela 8 mostra os principais deslocamentos químicos nos espectros de RMN ¹³C para as

tiazolidinonas sintetizadas.

Figura 21. Espectro de RMN 13C para o derivado 5-benzilideno-4-tiazolidinona 4f, apresentando os sinais relativos aos carbonos endo e exo da ligação benzilidênica (CDCl3; 75,4 MHz).

Para todos os compostos 4-tiazolidinonas sintetizados as massas moleculares

foram determinadas pela Espectroscopia de Massas de alta resolução (HRMS). Os

valores das massas moleculares obtidos foram confirmatórios para determinação de

todas as moléculas sintetizadas.

77

4.4 - RESULTADOS DA ATIVIDADE ANTIMICROBIANA

A avaliação da atividade antimicrobiana para os compostos 4-tiazolidinonas

sintetizados (3a-d e 4a-l) foi realizada primeiramente pelo método de difusão em disco.

Em uma segunda etapa, os compostos com halo igual ou superior a 18 mm foram

submetidos a testes para determinação da concentração mínima inibitória (CMI).

Os valores da ZMI obtidos no teste de difusão em disco para os compostos

testados são mostrados na Tabela 9.

78

Tabela 9: Halos em milimetros (mm) referentes a atividade antimicrobiana dos compostos 3a-d e 4a-d. Zona Média de Inibição (ZMI) em mm Composto ______________________________________________________________ Sa Bs Ml Ec Ms Ca Cs An

3a - 16 - - 15 16 - 17

3b - 26 - - 10 25 14 16

3c 15 17 17 - 15 16 9 16

3d - - 15 - - 13 10 -

4a - - - - 16 16 - 15

4b - - - - - - - -

4c - - - - - - - -

4d - - 16 - 15 15 12 16

4e - - - - 8 17 7 16

4f - - 15 - 7 17 10 -

4g - 14 15 - 16 16 - 15

4h - 8 16 13 17 17 10 9

4i - - 15 13 13 17 11 -

4j 11 - 15 - 12 13 11 -

4k - - 14 - - 13 10 -

4l - - 14 - - - 10 -

Rifampicina 31 20 49 14 30 NT NT NT

Cloranfenicol 25 27 50 27 NT NT NT NT

Nistatina NT NT NT NT NT 26 18 20

- : não possui sensibilidade ou ZMI menor que 7mm; NT: não testado Sa: Staphylococcus aureus, Bs: Bacillus subitis, Ml: Micrococcus luteus, Ec: Escherichia coli, Ms: Mycobacterium smegmatis, Ca: Candida albicans, Cs: Candida sp, An: Aspergilus niger.

Ao observar os resultados na Tabela 9 nota-se que o composto 3b apresentou

atividade antibiótica significante frente a B. subtilis e C. albicans. As Figuras 22a e 22b

mostram os halos para este composto. Apenas os compostos 3c e 4j apresentaram halos

de inibição frente a S. aureus, assim como somente os compostos 4h e 4i foram capazes

79

de apresentar halos frente a E. coli. Os demais compostos mostraram halos menores que

18 mm para os micro-organismos testados.

Os ensaios para determinação da concentração mínima inibitória (CMI) foram

realizados para o composto 3b frente a B. subtilis e C. albicans. De acordo com os

resultados deste teste, o valor da CMI para C. albicans e B. subtilis ficou entre 250-500

μg/mL e 500-1000 μg/mL, respectivamente. O cloranfenicol e a rifampicina

apresentaram CMI de 30 μg/mL e 120 μg/mL, respectivamente, frente a B. subitilis e a

nistatina teve CMI de 50 μg/mL para C. albicans.

Neste trabalho foram observados duas modificações estruturais nas moléculas

sintetizadas, a variação de um substituinte em N-3 e a presença de um grupo

benzilideno na posição 5 do anel 4-tiazolidinona. Em trabalho recente em nosso

laboratório, Verçoza et al. (2009) mostraram a importância de um grupo doador de

elétrons na posição N-3 do anel 4-tiazolidinona para uma atividade antimicrobiana de

suas moléculas sintetizadas frente a M. smegmatis, M. tuberculosis, M. luteus, C.

albicans e M. furfur. Os resultados do nosso trabalho apontam o composto 3b (R= CH3)

como o mais eficaz, entretanto, a presença de um grupo doador em N-3 não é

suficientemente comprobatório para eficácia da série.

Em adição, Vicini et al. (2006) apontam a importância de benzilidenos

substituídos na posição 5 do anel 4-tiazolidinona sendo essencial para atividade

antimicrobiana desta série. No entanto, a promoção de benzilideno ou benzilideno para

substituído com o grupo nitro ou dimetilamino mostraram efeito negativo quanto a

atividade antimicrobiana para a nossa série testada.

Figura 22a: Halo de inibição do composto 3b frente a B. subtilis.

Figura 22b: Halo de inibição do composto 3b frente a C. albicans.

80

4.5 - RESULTADOS DA ATIVIDADE CITOTÓXICA

O teste de atividade antineoplásica revelou uma excelente atividade do composto

4l frente a células do tipo NCI-H292 (obtidas de carcinoma mucoepidermóide de

pulmão). O derivado 5-benzilideno-4-tiazolidinona (4l) possui CI50 = 1,38 μg/mL, o que

coloca este composto em condições comparáveis ao metotrexato (CI50 = 1,25μg/mL),

utilizado como fármaco de referência. Já para as células HEp-2 (derivadas de carcinoma

epidermóide de laringe) e K562 (leucemia mielocitica crônica) o composto 4l não

mostrou atividade interessante. A ausência da hemólise em eritrócitos de camundongos

com CE50 > 500 µg/mL sugere que a citotoxicidade do produto 4l não está relacionado

ao dano da membrana.

Para a série de compostos 3a-d apenas o composto 3b apresentou atividade

anticâncer plausível para células do tipo K562. A Tabela 10 mostra os resultados de

todos os compostos sintetizados frente ás duas linhagens de células testadas.

Neste trabalho relatamos um composto que serve como protótipo para

elaboração de novas moléculas potenciais; no entanto, assim como relatam Havrylyuk et

al. (2009), são necessárias novas investigações que esclareçam as características da

atividade biológicas destas moléculas. Em acordo com Zhou et al. (2008) esse composto

contém o fragmento para-dimetilaminobenzilideno, descrito como requisito estrutural

essencial para atividade anticâncer contra células de pulmão.

81

Tabela 10: Atividade citotóxica dos compostos em células tumorais e atividade hemolítica em eritrócitos de camundongos. _____________________________________________________________________ Linhagem celular CI50 (μg/mL) Composto _____________________________________________________________ Hep-2 NCI-H292 K562 CE50 (μg/mL) ______________________________________________________________________ 3a > 10 > 10 >10 n.t

3b > 10 > 10 4,25 ± 0,36 n.t

3c > 10 > 10 >10 n.t

3d > 10 > 10 >10 n.t

4a > 10 > 10 >10 n.t

4b > 10 > 10 >10 n.t

4c > 10 > 10 >10 n.t

4d > 10 > 10 >10 n.t

4e > 10 > 10 >10 n.t

4f > 10 > 10 >10 n.t

4g > 10 > 10 >10 n.t

4h > 10 > 10 >10 n.t

4i > 10 > 10 >10 n.t

4j > 10 > 10 >10 n.t

4k > 10 > 10 >10 n.t

4l > 10 1,38 ± 0,04 >10 > 500

Metotrexato - 1,25 - -

Etoposideo 6,10 ± 0,19 2,75 ± 0,1 4,48 ± 0,23 -

CI50, CE50 e os respectivos intervalo de confiança 95% foram determinados a partir de regressão não-linear utilizando o programa SigmaPlot versão 11. n.t = não testado.

82

5 - CONCLUSÕES E PERSPECTIVAS

Neste trabalho sintetizamos uma série de compostos pertencentes á classe das 4-

tiazolidinonas utilizando metodologias eficientes e sendo estes obtidos com rendimentos

satisfatórios (47-82%). Todos os compostos foram caracterizados por suas propriedades

físico-químicas e por métodos espectroscópicos (IV, RMN 1H e 13C) e espectrométrico

(HRMS/IE). Alguns compostos não apresentaram solubilidades satisfatórias em

solventes apropriados para a realização dos espectros de RMN 13C.

Para as atividades antimicrobianas e antineoplásica foram testados os compostos

intermediários 3a-d e os compostos finais 4a-l. O composto 3b apresentou considerável

atividade antibiótica frente a C. albicans e B. subitilis. Dentre os compostos das séries

testadas observou-se que a inserção do grupo benzilidênico (série 4a-l) não foi eficiente

para atividade antibiótica. No entanto, são necessários estudos da relação

estrutura/atividade para obtenção de compostos 4-tiazolidinonas com atividade

antimicrobiana eficaz.

A atividade citotóxica dos compostos testados evidenciou que o composto 4l

mostrou-se eficaz para inibição de células NCI-H292 com CI50 = 1,38 μg/mL. Este

composto apresentou CI50 comparável ao metrotexato, que é utilizado como fármaco de

referência (tabela 10). Além disso, este composto não apresenta hemólise em células

eritrocitárias de camundongos. Este resultado torna-se incentivador para síntese de

substâncias com efeito antineoplásico dentro da classe das 4-tiazolidinonas.

Os resultados deste trabalho celebram o derivado 4-tiazolidinona 4l no âmbito

de compostos potencialmente promissores para o tratamento do câncer. Neste contexto,

criam-se perspectivas para a realização de novas sínteses com outros radicais com

intenção de identificar novos grupos com atividade antineoplásica, aumentando assim o

arsenal terapêutico para o combate ás diversas doenças.

83

6 - REFERÊNCIAS ALLEY, M. C.; SCUDIERO, D. A.; MONSK, A.; HURSEY, M. I.; CZERWINSKI, M. J.; FINE, D. L.; ABBOTT, B. J.; MAYO, J. G.; SHOEMAKER, R. H.; BOYD, M. R. Feasebility of drug screening with panels of human tumor cell lines using a microculture tetrazolium assay. Cancer Research, v. 48, p. 589 - 601, 1988. AQUINO, T. M.; LIESEN, A. P.; SILVA, R. E. A.; LIMA, V. T. CARVALHO, C. S.; FARIA, A. R.; ARAÚJO, J. M.; LIMA, J. G.; ALVES, A. J.; MELO, E. J. T.; GÓES, A. J. S. Synthesis, anti-Toxoplasma gondii and antimicrobial activities of benzaldehyde 4-phenyl-3-thiosemicarbazones and 2-[(phenylmethylene)hydrazono]-4-oxo-3-phenyl- 5-thiazolidineacetic acids. Bioorganic & Medicinal Chemistry, v. 16, p. 446-456, 2008. AQUINO, T. M. Síntese e avaliação das atividades anti-Toxoplasma gondii e antimicrobiana de Benzaldeído 4-fenil-3-tiossemicarbazonas e derivados 2[(fenil-4-tiazolidinona-5-substituídos. Tese de doutorado, Departamento de Ciências Farmacêutica. Universidade Federal de Pernambuco. Recife, 2007. ASHTON, W. T.; CANTONE, C. L.; CHANG, L. L.; HUTCHINS, S. M.; STRELITZ, R. A.; MACCOSS, M.; CHANG, R. S. L.; LOTTI, V. J.; FAUST, K. A.; CHEN, T.;BUNTING, P.; SCHORN, T. W.; KIVLIGHN, S. D.; SIEGL, P. K. S. Nonpeptide Angiotensin II Antagonists Derived from 4H-1,2,4-Triazoles and 3H-Imidazo[1,2-b][1,2,4]triazoles. Journal of Medicinal Chemistry, v. 36, p. 591-609, 1993. BARRECA, M. L.; CHIMIRRI, A.; DE LUCA, L.; MONFORTE, A. M.; MONFORTE, P.; RAO, A.; ZAPPALÀ, M.; BALZARINI, J.; DE CLERCQ, E.; PANNECOUQUE, C.; WITVROUW, M. Discovery of 2,3-diaryl-1,3-thiazolidin-4-ones as potent anti-HIV-1 agents. Bioorganic Medicinal Chemistry Letters, v. 11, p. 1793, 2001. BARRECA, M. L.; BALZARINI, J.; CHIMIRRI, A.; CLERCQ, E. D.; LUCA, L. D.; HOLTJE, H. D.; HOLTJE, M.; MONFORTE, A. M.; MONFORTE, P.; PANNECOUQUE,C.; RAO, A.; ZAPPALA, M. Design, Synthesis, Structure−Activity Relationships, and Molecular Modeling Studies of 2,3-Diaryl-1,3-thiazolidin-4-ones as Potent Anti-HIV Agents. Journal Medicinal Chemistry, v. 45, p. 5410, 2002. BARRECA, M. L.; CHIMIRRI, A.; DE CLERCQ, E.; DE LUCA, L.; MONFORTE, A. M.; MONFORTE, P.; RAO, A.; ZAPPALÀ, M. Anti-HIV agents: design and discovery of new potent RT inhibitors. Il Farmaco, v. 58, p. 259, 2003.

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