Exame de Qualificação

“Projeto de um Sistema de Estimulação Elétrica, Registro, Amplificação e Filtragem de Sinais de

Neurônios em Matriz de Microeletrodos”

Francisco Fambrini Dr. José Hiroki Saito

FACCAMP Orientador

ffambrini@gmail.com saito@dc.ufscar.br

Sumário1- Introdução

2 - Pesquisa bibliográfica sobre MEA,

Aspectos gerais;

3- Pesquisa bibliográfica sobre o

Hardware e Software de sistemas MEA ;

4- Proposta de trabalho;

5- Validação, resultados esperados e cronograma;

6- Resultados preliminares

Introdução

• Objetivo geral:– Desenvolvimento de um projeto completo para Aquisição e

Registro de dados a partir de MEA padrão de 60 eletrodos da MultiChannel Systems, incluindo soquetes elétricos, gerador de sinais de teste, amplificadores, circuitos para estimulação dos neurônios, filtros e placa de aquisição de dados.

• Motivação:– Ir de encontro ao domínio da tecnologia de interface neurônio-

eletrodo relativa à MEA e a outros dispositivos como EEG.

Pesquisa bibliográfica sobre MEA, aspectos gerais.

Matriz de Microeletrodos (Microelectrode Array – MEA, em inglês)

MEA é um dispositivo de nanotecnologia construído com a mesma tecnologia dos circuitos integrados.

Serve para cultura de células neuronais in vitro, em tecidos ou dissociadas.

Acima, uma MEA padrão da MultiChannel Systems com eletrodos de 30 µm de diâmetro e 200 µm de espaçamento entre si, com 60 microeletrodos (pontos escuros nas extremidades condutoras e raias isoladas).

Neurônios e células da Glia

Neurônios são células básicas do cérebro e do sistema nervoso.Células da glia tem funções de sustentação, nutrição e defesa dos neurônios.

A maior parte dos tumores do SNC(Sistema Nervoso Central) são tumores gliais. Neuroblastomas são muito raros.

Medidas de Neurônios in vitro usando MEA

• As medidas usando MEA podem ser em:

– Tecidos neuronais - fatias de células obtidas de uma parte do cérebro;

– Neurônios dissociados - aqueles separados da fatia de tecido do cérebro.

• Os neurônios podem ser cultivados por várias semanas e os seus sinais eletrofisiológicos medidos ao longo do tempo.

• Atividade elétrica – Extracelular , espontânea ou evocada, de um grupo de

neurônios• Amplitude do sinal extracelular entre 20 e 40 µV.

• Frequência de amostragem entre 5 e 48 kHz.• Dados na ordem de Gbytes.

Padrões de atividade:

• Atividade basal : repouso• Spike: pico do sinal; atividade elétrica de um ou mais neurônios• Burst: sequência de spikes num intervalo pequeno de tempo

Características dos Sinais em MEA

Detecção dos Spikes Spike: Impulsos nervosos ou potenciais de ação Produzidos por um ou mais neurônios É observado por um período de tempo relativamente longo

25.8 26 26.2 26.4 26.6 26.8

-150

-100

-50

0

50

100

100-01-basale1-1-12

Time [sec]

Am

plitu

de [

uV]

25.8 26 26.2 26.4 26.6 26.8

-150

-100

-50

0

50

100

100-01-basale1-1-12

Time [sec]

Am

plitu

de [

uV]

26.34 26.35 26.36 26.37 26.38 26.39 26.4 26.41 26.42 26.43

-120

-100

-80

-60

-40

-20

0

20

40

100-01-basale1-1-12

Time [sec]

Am

plitu

de [

uV]

26.34 26.35 26.36 26.37 26.38 26.39 26.4 26.41 26.42 26.43

-120

-100

-80

-60

-40

-20

0

20

40

100-01-basale1-1-12

Time [sec]

Am

plitu

de [

uV]

Sinal Eletrofisiológico

Por que estudar spikes? A informação está contida nos spikes e no atraso

entre dois spikes consecutivos.

• Desvio padrão é calculado sobre a atividade basal

• Limiar é calculado como um múltiplo do desvio padrão

Detecção dos Spikes

Detecção dos Bursts

Burst:

Sequência de spikes que ocorrem em um período pequeno de tempo Duração igual a soma de todos os ISI (intervalo entre spikes) contidos

num mesmo conjunto

Identificação de Bursts

Hipóteses:

O Burst é caracterizado por um certo número de spikesDefinir número mínimo de spikes pertencentes a um burst

Spikes de um mesmo Burst encontram–se muito próximosDefinir espaçamento temporal mínimo para considerar se o spike

é pertencente ao burst ou não

Os Bursts encontram–se separados por no mínimo centenas de ms.

Detecção dos Bursts

Spikes dentro dos bursts são muito próximos (ISImáx de 100 ms)Distância entre bursts de no mínimo 100 ms (IBImín de 100 ms)Formado por um número determinado de spikes (5 a 10 spikes)

Tipos de MEA – MultiChannel Systems

MEA padrão Thin MEA MEA256 de alta densidade

MEA planar – para cultura in vitro.

MEA padrão – com 60 eletrodos, considerada padrão da MultiChannel SystemsThin MEA – espessura fina para possibilitar imagem invertidaMEA256 – com 256 eletrodos

Mea Flexível

Serve para medir sinais em implantes no cérebro

Exemplo de aplicação em farmacologia biosensor para testes in vitro de drogas

Registros elétricos feito em 6 eletrodos em fatia de hipotálamo de rato. Cada ponto marcado com A, B, C, D, E e F é um microeletrodo onde foi aplicado um hormonio que estimula o hipotálamo (Ghrelin).

Os eletrodos que registraram aumento no número de spikes entre 24 e 40 s são das regiões B, C, E e F, região onde foi aplicado o hormônio.

As regiões A e D, mais distantes do ponto de aplicação do hormônio, tiveram significativa redução do número de spikes/segundo.

Hardware e Software de sistemas MEA

Laboratório de Eletrofisiologia para estudos de registros e estímulos de MEA

Soquete elétrico

Propiciar as conexões elétricas com a MEA e a sustentação mecânica

Amplificador para MEA

Muitos canais são necessários (60, 64, 128 ou 256 dependendo do sistema) e um nível de ruído elétrico baixíssimo é fundamental. Níveis de ruído tão baixos quanto 5 µV/√Hz são necessários à entrada do amplificador, a cada canal.

PGA (Programmable Gain Amplifier). Aspecto de um amplificador PGA headstage externo para MEA. O operador pode alterar o ganho de cada canal simplesmente alterando um ajuste no software de registro no computador.

- Ganho de Tensão: 1200 vezes;- Banda passante: 1 Hz – 3 kHz;- Contatos banhados a ouro substituíveis;- Acesso direto a cada eletrodo para estimulação;- Elemento de aquecimento interno, com sensor de temperatura.

Janela de controle do ganho do PGA no software Neuro-Righter

Soquete, amplificador e placa de aquisição de dados com conversor AD, fabricado por

MED64 Systems, Japão.

Softwares para fazer os registros dos sinais da MEA

MeaBench Neurorighter McRack MED64 Mobius

MEA Bench• Disponível grátis em: http://www.its.caltech.edu/~daw/meabench/

• MEABench comunica-se com o hardware através de um driver escrito por Thomas DeMarse ;

• Usa originalmente amplificadores de MultiChannel Systems.

Escrito em C, roda sob sistema operacional RT-Linux

Mea BenchInterface gráfica

NeuroRigther• Disponivel grátis: https://sites.google.com/site/neurorighter/

NeuroRighter possibilita rejeição do ruído usado em estimulo on-line, spike-detection, e pode gravar o pacote de dados com baixo período de latencia. Cada um dos 64 canais é amostrado em frequencia de 25 kHz, com periodo de amostragem em torno de 9 milissegundos.

Usa placas de conversores A/D e D/A (16 bit) da National Instruments (usadas com o Labview) que permite montar um sistema barato de registro e estimulação de dados.

NeuroRigtherInterface gráfica

MC Rack• É um dos softwares oficiais da MultiChannel Systems.

• Não é gratuito: http://www.multichannelsystems.com/software/mc-rack

MED64 Moebius

• Não é gratuito, disponivel em:

• http://www.med64.com/products/software.html

• Faz registro de potenciais evocados e expontâneos e grava e analisa spikes de cortes de cultura de células de neurônios.

• Usa hardware proprietário de MED64 Systems.

Soquetes disponíveis (MultiChannel Systems)

• Soquete montado dentro da blindagem para limitar captação de ruídos

Gerador de Sinais MEA-SG

Gera sinais elétricos variados nos pads de uma placa de circuito impresso que tem o mesmo formato da MEA padrão;Simula eletronicamente uma cultura de neurônios em MEA padrão e permite testar todo o sistema: soquetes, amplificadores, conversor AD e software de registro de dados.

Amplificador - headstage

• Wagenaar e Potter propõe a seguinte topologia:

• Amplificador não-inversor, seguido de um filtro passa-altas de 2ª ordem e de um filtro passa-baixas passivo de 1ª ordem.

Conversor AD – Analógico Digital

• Multichannel Systems e MED64 possuem seus próprios conversores A/D vendidos com o equipamento deles (16 bits);

• Potter e Wagenaar utilizam placas da National Instruments (usadas com o Labview), ex: NI cDAQ 9138.

• Estrutura básica de um conversor A/D:

Multiplexador (MUX)

• Como são necessários registrar muitos canais, um multiplexador é necessário na entrada do conversor A/D. Esses muxs já fazem parte das placas de aquisição de dados, juntamente com o conversor A/D.

Proposta de Trabalho

Proposta de Projeto

• Projeto completo para Aquisição e Registro de dados a partir da MEA padrão de 60 eletrodos da MultiChannel Systems, incluindo soquetes elétricos, gerador de sinais de teste, amplificadores, circuitos para estimulação dos neurônios, filtros e placa de aquisição de dados. • Como os sinais eletrofisiológicos captados pelos

microeletrodos são da ordem de microvolts, esses sinais devem ser ampliados cerca de 1200 vezes por um sistema amplificador de duas fases, com técnicas especiais que evitam a amplificação de ruídos.

Etapas do trabalho

1- Estudo dos circuitos eletrônicos envolvidos.

2- Simulação computacional do amplificador, estimulador, gerador de sinais e placa de aquisição de dados (DAQ);

3- Construção dos protótipos: soquete, amplificador, estimulador, gerador de sinais e DAQ

4- Levantamento das medidas elétricas concernentes aos circuitos tais como: impedâncias, ganhos, níveis de ruído elétrico, sensibilidade, etc.

5- Comparação com as características elétricas descritas na literatura;

6- Validação de todo o sistema em condições reais de uso, aplicando-o em MEA onde se cultiva o tecido nervoso ou neurônios dissociados.

Detalhes do hardware

Causas de Ruído em Amplificadores

Distorção e ruído estão presentes em qualquer sistema físico real e normalmentecontribuem para a deterioração das características deste sistema.Um amplificador deveria fornecer idealmente em sua saída uma réplica do sinal deentrada multiplicado por uma constante.

No entanto sua saída contém também sinais adicionais ausentes na sua entrada, quesão os ruídos e distorções gerados no processo de amplificação.

Ruído é um tipo de erro que não está presente no sinal original vi, mas aparece nasaída independentemente de haver ou não sinal de entrada.Provém tanto dos circuitos internos como de fontes externas por acoplamentoeletromagnético.

O ruído tanto pode ser de natureza aleatória (randômico) como previsível(determinístico).

Ruído extrínseco• Tem causas externas, principalmente EMI (eletromagnetic

Interference) e RFI (rádio frequency interference).• Blindagens metálicas tem por função minimizar os ruídos

extrínsecos.

• O principal que precisa ser filtrado é o de 60Hz, da rede elétrica, e seus harmônicos (múltiplos inteiros).

O que é ruído intrínseco ?

+

VG1

R1 1k R2 2k

+

-

+

U1 OPA335

V1 2.5

V2 2.5

VF1

Vin vs Time

-1.5

-1

-0.5

0

0.5

1

1.5

0 2 4 6 8 10 12

Time (mS)

Vin

(m

V)

Vout Ideal vs Time

-4

-3

-2

-1

0

1

2

3

4

0 2 4 6 8 10 12

Time (mS)

Vo

ut

(mV

)

Vout with Noise vs Time

-4

-3

-2

-1

0

1

2

3

4

5

0 2 4 6 8 10 12

Time (mS)

Vo

ut

(mV

)

A principal fonte de ruído intrínseco é o movimento aleatório de cargas elétricas, que aumenta com o aumento da temperatura;

Tipos de ruído intrínseco em amplificadores

1) Ruído Branco (ou ruído térmico): tem densidade de potência constante ao longo do espectro.

2) Ruído Rosa (ou ruído 1/f):a densidade espectral de potência é inversamente proporcional à frequência do sinal.

3) Ruído de Pipoca: ocorre em semicondutores.

(1) e (2) tem distribuição estatística Normal ou Gaussiana e (3) tem distribuição multimodal

Obs: os nomes em inglês são:

1) White Noise or Broadband noise or Thermal noise

2) Pink noise or 1/f noise

3) Popcorn noise or Burst noise or Red noise

Equação de Johnson-Nyquist(Equação do ruído térmico)

fRkTE kn ∆= 4

T é a temperatura (kelvin)R é a resistência sobre a qual surge o ruído ( Ω ohms)ΔF é o intervalo de frequência (hertz)K é a constante de Boltzmann ( 1.381 x 10^ -23 joule/kelvin)En é a tensão média quadrática do ruído (valor RMS) em circuito aberto sobre um resistor R.

Cálculo do ruído térmico de um estágio amplificador

Função dos filtros• Reduzir a banda passante do amplificador e

consequentemente reduzir o ruído térmico;• Filtros Passa-Altas e Passa-Baixas na saída do

amplificador headstage para limitar ruido.

Amplificador Headstage

• 3 topologias possíveis:

-

+

IOP1

R1 10k

R2 1kin

out -

+

IOP2

R3 10k R4 10k

in2

out2 -

+

IOP3

-

+

IOP4

-

+

IOP5

R5 10k

R6 10k

R7

10k

R8 10k

R9 10k

R10 10k

R11 10kI2

I1

out3

Ref.

Inversor Não-inversor Amplif. Instrumentação

Amplificador Não-Inversor• Ganho é G= 1+(R2/R1) .... fora da saturação

in

outVdB V

VG log20=

in

outPdB P

PG log10=

Ganho de Tensão e de Potência em dB:

Melhor escolha: AI - Amplificador de Instrumentação

• Apresenta melhor CMMR (rejeição de ruído de modo comum) do que o amp. não-inversor.

Fazendo todos os resistores iguais a R

( )21

21 VV

R

RV

gout −

+=

Escolhido: Texas INA333

• Menor nível de ruído seria o INA118, porém custo muito alto (R$ 72,00 cada peça). INA333 custa R$ 11,00.

Filtros passivos de 1ª ordem

• Passa-baixas e Passa-Altas RC

Filtros de 1ª ordem atenuam -6 dB por oitava ou -20db /década

Curvas para os filtros

• Passa-baixas Passa-altas

RCFc

π2

1=

Frequência de corte ou Frequência de meia-potência é a frequência abaixo da qual ou acima da qual a potência na saída de um sistema é reduzida à metade da potência aplicada na entrada do mesmo sistema que corresponde uma redução a 70,7% do valor da amplitude de entrada. Em decibéis atenuação de -3 dB por oitava para filtros de 1ª ordem.

Filtros Ativos - com amplificador operacional

• Filtro ativo passa-baixas de 2 ordem: possui 2 elementos que armazenam energia - 2 capacitores - Filtro tipo Butterworth

• Função de Transferência:

• Frequência de corte:

2ª ordem: Atenuação de -40 dB por década ( ou -12 dB por oitava)

( )2

1

1

+

=

c

jH

ωω

ω

22112

1

CRCRFcorte π

=

Filtro Ativo Passa-Altas com Amplificador Operacional

• Filtro Passa-Altas de 2ª ordem tipo Butterworth com amplificador operacional - possui 2 capacitores.

Obs: Filtros de 2ª ordem possuem atenuação igual a -40 db por década (ou -12 dB por oitava).

Função de Atenuação é o inverso da Função de Transferência:

A(s) =1/H(s) H(s) =1/A(s)

Filtros Passa-Altas são derivadores e alteram a forma da onda !

Vo(t) : tensão na saída no instante t

Vi : tensão na entrada do filtro

Conversor Analógico/Digital

• Chip ADS 1299 – Conversor AD de 24 bits

Conversor A/D de 24 bits e multiplexador de 8 entradas num único chip

Resolução do ADC:

Validação e Resultados esperados

Validação do protótipo

• A validação constará de 3 etapas:

a) Simulação dos Circuitos em Computador;

b) Testes Elétricos dos protótipos (modelo físico) ;

c) Testes em Campo.

(a) Simuladores como LT-Spice (Linear®), Tina (Texas®), Proteus (Labcenter®) e Filterlab (Microchip®) serão utilizados;

(b) Construção dos protótipos em bancada e medidas de ruído do amplificador, possivelmente no Centro Renato Archer (CTI-2) em Campinas-SP.

(c) Testes efetuados com MEA cultivada in vitro, na Universidade Federal de Uberlândia, comparando o desempenho do sistema desenvolvido alvo dessa dissertação com o Sistema de Aquisição e registro de dados adquirido da MCS – Multichannel Systems da Alemanha.

Protocolo de testes a serem realizados na UFU ( Univ. Federal de Uberlândia)

• Uma cultura de células poderá ser preparada em laboratório de biologia da profa. Celina Lotufo na UFU e cultivada em MEA para o Teste de Campo.

• Na UFU está sendo providenciada a instalação do laboratório de MEA com equipamento adquirido da MCS da Alemanha sob coordenação do prof. João Batista Destro Filho (verba aprovada pela FAPEMIG).

Caso o equipamento de MCS já esteja instalado na UFU, um teste comparativo será feito, com a finalidade de comparar o desempenho do protótipo descrito nesse trabalho com o equipamento de MCS.

• O teste comparativo deverá registrar a mesma cultura e os mesmos eletrodos em MEA, e comparar os registros em três aspectos:

a) Nível de ruído elétrico introduzido pelo amplificador e placa DAQ;

b) Resolução temporal (analisando os gráficos na tela do computador)

c) Resolução do conversor A/D.

CRONOGRAMA

Cronograma

1. Revisão bibliográfica e embasamento teórico. Investigar trabalhos científicos de base teórica, dos domínios envolvidos e trabalhos relacionados ao objetivo deste trabalho;2. Construir os modelos computacionais;3. Obtenção dos componentes eletrônicos;4. Elaborar um artigo descrevendo o trabalho e submetê-lo a conferências internacionais e nacionais;5. Preparo da Monografia para o Exame de Qualificação;6. Construir os protótipos;7. Efetuar as medidas elétricas com o protótipo;8. Fazer a validação do sistema na UFU;9. Redação do documento de Dissertação de Mestrado.10. Entrega e defesa da Dissertação de Mestrado;

Apêndice

• Estágio atual do desenvolvimento do trabalho

Efetuamos as medidas necessárias usando um Projetor de Perfil

E desenhamos nosso primeiro protótipo

...construímos artesanalmente nosso protótipo, usando inicialmente papel, xérox...

E foi evoluindo...

Até chegar no primeiro protótipo artesanalmente construído...

Mostrando toda a evolução do desenvolvimento do soquete...

Produzimos então os arquivos .DFX e Gerber, necessários à produção industrial do soquete

Como testar o soquete ?• Teste mais simples: usando solução salina ( NaCl a 3,5 % - mesma

concentração da água do mar, aplicado sobre a MEA)

Como testar o soquete ?• Construindo um dispositivo de testes e simulação para o

soquete e todo o sistema, chamado MEA-SG (Signal Generator) semelhante ao produzido por MultiChannel Systems

Protótipo do MEA-SG• Usando um microcontrolador PIC12F683, usa o conceito de síntese

digital por software das formas de onda desejadas:

Usando o PWM (Pulse Width Modulator) do microcontrolador PIC

• Na saída do PWM, coloca-se um circuito integrador de 2 ordem, usando 2 resistores e 2 capacitores;

Um integrador é...um filtro passa-baixas operando em um frequência f muito maior que sua frequência de corte, ou seja, f >>Fc. Levando-se em conta esse fato, escolheram-se valores adequados para os resistores e capacitores do filtro, de modo a minimizar o ripple na senóide produzida. Foi escolhido R1=1 Kohms, C1 = 470 nF, R2=1 Kohms e C2=100nF, de modo que a frequência de corte ficou em 734 Hz, para um pwm trabalhando a 500 KHz.

22112

1

CRCRFcorte π

=

Circuito final da segunda versão do MEA SG

Aspecto final do protótipo, ainda em placa padrão e circuito impresso

Desenhando a placa final do MEA SG

Circuito completo do amplificador- 1 canal

Equipamentos utilizados

Resultados Preliminares

1-Sinal medido na saída do amplificador com Osciloscópio Tektronix TDS1001-C;2-Ganho total do amplificador ajustado para G=1000;3-Amplificador alimentado com duas baterias de 12 volts associadas em série;4-Sinal de entrada gerado pelo MEA-SG com amplitude calculada para 100 uV;5-Temperatura ambiente em torno de 25º C

Obs: A rigor, o nível de ruído de um amplificador deveria ser medido com Analisador de Espectro e a unidade usual de medida de ruído deve ser V/√Hz, a qual leva em conta a frequência do sinal de entrada, mas dispunhamos apenas de um osciloscópio.

Alguns resultados obtidos - I

Resultados - II

Resultados - III

Resultados - IV

ResultadosNível de ruído em função do ganho de tensão para o

amplificador proposto

Artigo aprovado para publicação

• ISIE 2013 – 22nd IEEE International Symposium on Industrial Electronics, Taipen (Taiwan) que acontecerá nos dias 28 a 31 de Maio de 2013.

• Título do artigo:– “Low noise headstage design of MEA microelectrode signal

amplification “

Obrigado!!