Serviço Público Federal Universidade Federal de Goiás Instituto … · 2012. 12. 17. · Ao...

Serviço Público Federal

Universidade Federal de Goiás Instituto de Ciências Biológicas

Programa de Pós-Graduação em Biologia - Mestrado Área de Concentração – Biologia Celular e Molecular

FLÁVIA DE CASTRO PEREIRA

Avaliação do Potencial Citotóxico, Genotóxico e Antitumoral do Ditionato de cis-Tetraamino(oxalato)rutênio(III) em Diferentes

Linhagens Celulares

Goiânia 2010

FLÁVIA DE CASTRO PEREIRA

Dissertação de Mestrado apresentada ao Programa de Pós-Graduação em Biologia da Universidade Federal de Goiás para obtenção do Título de Mestre em Biologia, Área de concentração em Biologia Celular e Molecular. Orientadora: Prof. Dra. Elisangela de Paula Silveira Lacerda.

Goiânia 2010

Avaliação da Atividade Citotoxica, Genotóxica e Anti-Tumoral do Composto Ditionato de cis-Tetraamino(oxalato)rutênio(III) sobre

Diferentes Linhagens Celulares

Flávia de Castro Pereira B.Sc1 *

Profª. Dr.ª Elisângela de Paula Silveira Lacerda1

1 Laboratório de Genética Molecular e Citogenética. ICB I - sala 200. Campus II. Universidade Federal de Goiás.

* Correspondência: [email protected] Elisângela de Paula Silveira Lacerda Universidade Federal de Goiás Instituto de Ciências Biológicas Departamento de Biologia Geral

Janeiro/ 2010

iii

Programa de Pós-Graduação em Biologia Instituto de Ciências Biológicas Universidade Federal de Goiás

BANCA EXAMINADORA DA DISSERTAÇÃO DE MESTRADO

Aluna: FLÁVIA DE CASTRO PEREIRA Orientadora: Profa. Dra. ELISÂNGELA DE PAULA SILVEIRA LACERDA

Membros: 1. Dra. ELISÂNGELA DE PAULA SILVEIRA LACERDA

2. Dr. ALZIR AZEVEDO BATISTA

3. Dra. SIMONE MARIA TEIXEIRA DE SABÓIA-MORAIS

ou

4. Dr. CLÁUDIO CARLOS DA SILVA

5. Dra. LEE CHEN CHEN

Data: 22/01/2010

iv

Dedicatória

Aos meus pais, Maria Francisca Pereira de Castro e Orlando de Castro Sobrinho,

exemplo de coragem, vida e amor. Obrigada pelo incentivo, compreensão, amor,

dedicação e orações em todos os momentos da minha vida. A vocês, o meu eterno

amor.

Ao meu namorado Cesar Augusto Sam Tiago Vilanova Costa, pelo amor, dedicação,

carinho e compreensão, que sempre esteve presente em todos os momentos.

Obrigada por nunca desistir de mim, e por todo apoio e amor nesses seis anos

juntos.

Ao meu irmão Patrick Carlos de Castro, por sempre estar presente em minha vida.

v

AGRADECIMENTOS

Primeiramente, agradeço a Deus por mais esta etapa de aprendizagem em minha

vida, mas, acima de tudo, o agradeço por sempre ter me colocado no caminho certo,

por nunca me deixar enfraquecer em meio às adversidades.

Agradeço a todos que, direta ou indiretamente, contribuíram para a realização deste

trabalho e, em especial, à minha orientadora, Profa. Dra. Elisângela de Paula Silveira

Lacerda, pelo exemplo de pesquisadora a ser seguido, que me ensinou grandes

lições sobre conduta profissional e pessoal e a quem dedico profunda admiração,

respeito e carinho. Muito do que sou, devo a você. Obrigada por estar sempre

presente e, o mais importante, obrigada por acreditar em mim.

Ao Prof. Dr. Luis Alfredo Pavanin e sua equipe do Laboratório de Química da

Universidade da Federal de Uberlândia, pela síntese e fornecimento do composto de

Rutênio, muito importante para a realização deste trabalho.

À Profa. Dra. Marize Campos Valadares Bozinis pela disponibilidade do Laboratório

de Farmácia para leitura das amostras.

À equipe do Laboratório de Genética Molecular e Citogenética, em especial aos

meus amigos César Augusto Sam Tiago Vilanova Costa, Aliny Pereira de Lima,

Alessandra Braga de Santana, Manuela Rocha Rezende, Hugo Delleon da Silva e

Lucas Gomes Carlos Pereira, obrigado pela confiança e auxílio durante o mestrado e

acima de tudo, pela amizade.

vi

A todos os estagiários do Laboratório de Genética Molecular e Citogenética em

especial à Franciely Mariana dos Santos Melo, Wanessa Carvalho, Mariana Pedrosa

Batista, Darline Kist Engelmann e Osmar Nunes de Oliveira que me auxiliaram em

partes da pesquisa.

À minha colega Polyana Lopes Benfica, pela leitura das amostras no citômetro de

fluxo.

Aos funcionários da Universidade Federal de Goiás; pelo auxílio e compreensão no

decorrer da pesquisa.

Ao Instituto de Ciências Biológicas da Universidade Federal de Goiás, pela estrutura

didática e técnica para a realização dos estudos e trabalhos do mestrado.

Ao Conselho Nacional de Pesquisa, CNPq, pela bolsa de estudos.

À toda a minha família pelo incentivo.

vii

“Não importa o que você faça ou sonhe que possa fazer: comece logo. A audácia,

por si só, atrai criatividade, poder e magia”.

“Goethe”

viii

SUMÁRIO

Lista de Figuras da Introdução e da Revisão de Literatura........................... x

Lista de Figuras e Tabelas do Artigo 1............................................................ xi

Lista de Figuras do Artigo 2.............................................................................. xii

Lista de Figuras e Tabelas do Artigo 3............................................................ xii

Lista de Anexos.................................................................................................. xiv

Siglas e Abreviaturas......................................................................................... xv

Resumo............................................................................................................... xviii

Abstract............................................................................................................... xx

1. INTRODUÇÃO................................................................................................. 23

1.1. Câncer........................................................................................................... 23

1.2. Compostos de Rutênio no Tratamento do Câncer........................................ 25

2. REVISÃO DE LITERATURA........................................................................... 30

2.1. Ciclo Celular.................................................................................................. 30

2.2. Apoptose....................................................................................................... 32

2.3. Quimioterapia antineoplásica ....................................................................... 37

2.4. Compostos baseados em metal usados na terapia antitumoral .................. 40

2.5 Complexos de Rutênio e seu Mecanismo de Ação................... 45

2.6. Cultura de Células ........................................................................................ 55

2.7. Citotoxicidade................................................................................................ 57

3. JUSTIFICATIVA............................................................................................... 60

4. OBJETIVOS..................................................................................................... 62

4.1. Objetivo Geral............................................................................................... 62

ix

4.2. Objetivos Específicos ................................................................................... 62

5. METODOLOGIA.............................................................................................. 63

5.1. Sintese do Composto Ditionato de cis-Tetraamino(oxalato)rutênio(III) ........ 63

5.2. Teste Allium cepa.......................................................................................... 64

5.3. Droga antitumoral controle............................................................................ 65

5.4. Preparação do composto de Rutênio para ensaios biológicos in vitro.......... 65

5.5. Meio de cultura celular.................................................................................. 66

5.6. Linhagens celulares tumorais e normais ...................................................... 66

5.7. Cultura de células tumorais........................................................................... 67

5.8. Avaliação do potencial citotóxico e antitumoral............................................. 67

5.9. Ensaio cometa............................................................................................... 70

5.10. Citometria de fluxo: Avaliação das fases do ciclo celular e apoptose......... 72

5.11. Eletroforese em gel de agarose.................................................................. 73

5.12. Análise Estatística....................................................................................... 74

6. PRODUÇÃO CIENTÍFICA............................................................................... 75

6.1. ARTIGO 1..................................................................................................... 77

6.2. ARTIGO 2..................................................................................................... 104

6.3. ARTIGO 3..................................................................................................... 129

7.0. CONCLUSÕES............................................................................................. 158

8.0. CONSIDERAÇÕES FINAIS.......................................................................... 155

9.0. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS............................................................. 162

10.0 ANEXOS...................................................................................................... 172

Lista de figuras e tabelas dos Artigos x

LISTA DE FIGURAS E TABELAS DA INTRODUÇÃO E REVISÃO DE LITERATURA

Tabela 1 – Estimativas, para o ano 2008, do número de casos novos por

câncer, em homens e mulheres, segundo localização primária........... 25

Figura 1 – Pontos de checagem do sistema de controle do ciclo celular.............. 32

Figura 2 – Caracteristicas de uma célula em necrose e apoptose........................ 34

Figura 3 – Via intrínseca e extrínseca da apoptose............................................... 36

Figura 4 – Estrutura química da Cisplatina............................................................ 41

Figura 5 – Estrutura química de antitumorais a base de platina............................ 42

Figura 6 – Diferentes tipos de adutos DNA-cisplatina, para uma dada seqüência aleatória. O aduto intrafita 1,2-GG (superior esquerdo) é considerado uma lesão crítica................................................................................... 43

Figura 7 – Estrutura química do composto NAMI-A (transimidazoldimetilsulfoxidotetraclororutênio).................................. 44

Figura 8 – Estrutura do composto de Rutênio KP1019 {Indazolium trans-[(tetracloreto)bis(1H-indazol)rutênio(III)]}............................................ 45

Figura 9 – Mecanismo de ação do rutênio no ambiente da célula tumoral....... 48

Figura 10 – Estrutura Química do Composto de rutênio Cloreto de cis-Tetraaminodiclororutênio (III)........................................................... 54

Figura 11 – Complexo de Ditionato cis-Tetraamino(oxalato)rutênio(III)............. 54

Figura 12 – Classificação de leitura para o Ensaio Cometa................................ 71

Lista de figuras e tabelas dos Artigos xi

LISTA DE FIGURAS E TABELAS DO ARTIGO 1 Figure 1 – Mitotic index of A. cepa root tips exposed to cis-

[Ru(C2O4)(NH3)4]2(S2O6) and Pb (NO3)2……………………...………… 86

Figure 2 – Chromosomal aberrations in root tip cells of A. cepa L. exposed to Ruthenium complex (a, b, d, and e) and lead nitrate (c, f, g, and h)... 89

Table 1 – Cytogenetic Analysis of A. cepa Root Cells Exposed to Different Concentrations of cis-Tetraammine(oxalato)Ruthenium(III) Dithionate and Lead Nitrate for Different Periods………………...…… 91

Lista de figuras e tabelas dos Artigos xii

LISTA DE FIGURAS DO ARTIGO 2 Figure 1 – Chemical structure of cis-Tetraammine(oxalato)Ruthenium(III)

Dithionate………………………………………………………………. 124

Figure 2 – Anti-proliferative activity of cis-Tetraammine(oxalato)Ruthenium (III) Dithionate compound towards A-549 and MRC-5 cell lines…… 125

Figure 3 – Cytotoxic activity of cis-Tetraammine(oxalato)Ruthenium(III) Dithionate compound towards A-549 and MCR-5 cell lines ............ 126

Figure 4 – Proliferation of A-549 tumor cells cultured in the presence of different concentrations of cis-[RuCl2(NH3)4]Cl compound……...…. 127

Figure 5 – DNA agarose gel electrophoresis profile of A-549 cells cultured in the presence of cis-[Ru(C2O2)(NH3)4]2(S2O6) compound…………... 128

Lista de figuras e tabelas dos Artigos xiii

LISTA DE FIGURAS E TABELAS DO ARTIGO 3

Figure 1 – Chemical structure of cis-Tetraammine(oxalato)Ruthenium(III) Dithionate………………………………………………………………... 152

Figure 2 – Anti-proliferative activity of cis-Tetraammine(oxalato)Ruthenium(III) Dithionate compound towards K562 cell line………………………... 153

Figure 3 – Cytotoxic activity of cis-Tetraammine(oxalato)Ruthenium(III) Dithionate compound towards K562 cell line (a and b)…………….. 154

Figure 4 – Induction of DNA strand breaks of A-549 cells cultured in the presence of cis-[Ru(C2O4)(NH3)4]2(S2O6) compound…………...….. 155

Figure 5 – Cell cycle profile histogram of K562 cells treated with cis-Tetraammine(oxalato)Ruthenium(III) Dithionate…………………..... 156

Table 1 – Cell cycle analysis of K562 tumor cell lines after treatment with cis-Tetraammine(oxalato)Ruthenium(III) Dithionate…………………….. 157

Siglas e Abreviaturas xiv

ANEXOS Anexo 1 – Artigo 1 “Cytotoxic and genotoxic effects of cis-

Tetraammine(oxalato)Ruthenium(III) Dithionate on the root meristem cells of Allium

cepa “, publicado no periódico Biological Trace Element Research, Springer, (2009)

128, 258-268;

Siglas e Abreviaturas xv

SIGLAS E ABREVIATURAS

AIF – Fator indutor de apoptose, do inglês Apoptosis-Inducing Factor;

Bad – Agonista de morte celular associado a BCL2, do inglês BCL2-associated

agonist of cell death

Bak – Protéina destruidora de Antagonistas de BCL2, do inglês BCL2-

antagonist/killer 1;

Bax – Proteína X associada à BCL2 , do inglês BCL2- associated X protein;

Bcl2 – Proteína reguladora anti-apoptótica, do inglês B-cell CLL/lymphoma 2.

Bcl-w – Proteína reguladora anti-apoptótica, agonista de Bcl2;

Bcl-Xs – Proteína reguladora pró-apoptótica antagonista de Bcl2;

Bid – Proteína reguladora pró-apoptótica antagonista de Bcl2, do inglês BH3

interacting domain death agonist;

Bik – Proteína reguladora pró-apoptótica antagonista de Bcl2, do inglês BCL2-

interacting killer

cis-Pt (II) – Cisplatina II;

DD – Domínio de morte celular, do inglês Death Domain;

DIABLO – Proteínas ligantes de IAP com baixo ponto isoelétrico, do inglês direct IAP

binding protein with low PI;

DL50 – Dose Letal 50%;

DMSO – Dimetilsulfóxido;

DNA – Ácido Desoxirribonucléico;

Et al. – e outros, do latin et alii;

Fas – receptor de superfície envolvido na ativação da apoptose (pertence a família

TNF);

Siglas e Abreviaturas xvi

Fase M – fase de mitose do ciclo celular;

Fase S – fase de síntese do ciclo celular;

FDA (E.U.A.) – Food and Drug Administration, agência regulatória de alimentos e

medicamentos dos Estados Unidos da América;

FLIPs – Proteína inibitória homóloga a FLICE, do inglês FLICE-like inhibitory protein;

G0 – Do inglês Gap, intervalo. Fase Gap0 do ciclo celular;



HIV – Vírus da Imunodeficiência Humana;

IAPs – Proteinas inibidoras de apoptose, do inglês Inhibitors of Apoptosis Proteins;

IC50 – Inibição de Concentração 50%;

INCA – Instituto Nacional de Câncer;

Kbp – quilopares de bases;

KP1019 – Composto Indazolium trans-[(tetracloreto)bis(1H- indazol)rutênio(III)];

Mcl-1 – Leucemia mielóide - sequência 1, do inglês Myeloid Cell Leukemia

Sequence 1;

mg.kg-1 – Miligrama por quilograma;

mg.mL-1 – Miligrama por mililitro;

MS – Ministério da Saúde.

NAMI A – Composto trans-imidazoldimetilsulfoxidotetraclororutênio;

NCI – Instituto Nacional do Cancer dos Estados Unidos da América, do inglês

National Cancer Institute;

NO – Óxido Nitrico;

NGFr – Fator de crescimento de nervos, dos inglês Nerve Growth Factor;

Omi/HtrA2 - proteína A requerida em altas temperaturas;

Siglas e Abreviaturas xvii

pH – potencial hidrogeniônico

RM175 – Composto de Rutênio [(h6-C6H5C6H5)Ru(en)Cl]+;

RNA – Ácido Ribonucléico;

Ru (II) – Rutênio em estado de oxidação II;

Ru (III) – Rutênio em estado de oxidação III;

Ru (IV) – Rutênio em estado de oxidação IV

SMAC – Segundo ativador de caspase derivado da mitocôndria, do inglês Second

Mitochodria-Derived Activator of Caspases;

Tf – Proteína transferrina;

TNF – Fator de necrose tumoral, do inglês Tumor Necrosis Factor;

TRAIL-R1 – Superfamília do Receptor 1 do Fator de Necrose Tumoral, do inglês

Tumor necrosis factor receptor 1;

Abstract xviii

RESUMO Apesar do sucesso da cisplatina e dos medicamentos à base de platina, o

mercado de fármacos ainda é acessível para novas drogas á base de metal que

oferecem uma melhor viabilidade, tais como a administração oral, o que pode ajudar

a diminuir os efeitos colaterais graves e custos clínicos. Além disso, novos estudos

concentram-se na investigação de novas drogas com maior eficácia, ou seja, drogas

que interajam de forma diferente com o DNA, o que pode levar à superação da

resistência inata ou adquirida de certos tipos de tumores. Dentre os vários

complexos a base de metais desenvolvidos, os complexos de rutênio (III)

representam uma nova família de promissores agentes anticâncer. No presente

estudo foi investigado in vitro o efeito do composto Ditionato de cis-

Tetraamino(oxalato)rutênio(III) sobre a viabilidade celular, distribuição das fases do

ciclo celular, mecanismos de indução de apoptose e danos a molécula de DNA. Os

resultados provenientes da análise do teste Allium cepa mostraram um efeito tempo

dose-dependente. A avaliação mostrou que a concentração de rutênio teve um

impacto maior do que o tempo de exposição. O efeito também se mostrou

cumulativo, com uma quase completa inibição da mitose em uma concentração de

rutênio de 0,1 mg mL-1 ou superior por períodos superiores a 24 h. Por outro lado, os

resultados não revelaram efeitos clastogênicos significativos nas células

meristemáticas expostas ao complexo de rutênio (III). A comparação entre os

valores dos Índice Mitótico de células meristemáticas de cebolas tratadas com o

complexo de rutênio em relação às células tratadas com nitrato de chumbo também

mostrou que o complexo de rutênio induziu uma inibição mitótica média oito vezes

maior do que o chumbo. Notadamente, as freqüências de anomalias e aberrações

celulares mitóticas foram quase quatro vezes e três vezes menores,

respectivamente. Os resultados mostram que o composto estudado causa

Abstract xix

significativa redução da proliferação das células A549 com viabilidades entre 55,5%

para 24,6% quando tratados com 40 µM por 24 e 48h; e 32% para 18,2% quando

tratados com 150 µM por 24 e 48h. O composto de rutênio(III) induz moderada

(31,9% e 39,6% para concentrações 10 e 40 µM, respectivamente) para alta

degradação (74% para a concentração 150 µM) para avaliação da atividade

citotóxica das células A549 (IC50= 33,72 µM). Quanto à linhagem de fibroblasto de

pulmão humano normal MRC-5, não mostrou redução significativa na proliferação

celular na presença do composto. Quando tratadas com altas concentrações do

Ditionato cis-Tetraamino(oxalato)rutênio(III) por 48 horas, celulas MRC-5 mostraram

viabilidades altas de 85% e 78,4% para 40 µM e 150 µM, respectivamente. A

atividade citotóxica e antiproliferativa revelou que a cultura de células K562 nas

concentrações de 40 e 150 μg mL-1 do composto de Rutênio(III) mostrou redução

significativa na proliferação 72h de exposição, com viabilidades de 88,2% para

55,6% quando tratadas com 40 µM por 24 e 72h; e 76,2% para 26,7% quando

tratadas com 150 µM por 24 e 72h. O composto de Rutênio(III) induziu baixa [22,4%

(24h) para 28,2% (48h) e 29,8% (24h) para 35,7% (48h) para concentrações de 10 e

40 µM, respectivamente] para moderada [44% (24h) e 53% (48h) para

concentrações de 150 µM] atividade citotóxica em células K562. Após a incubação

de 48 h, o valor da IC50 foi de 18,28 µM. Quando comparado o ciclo celular de

células não tratadas, a análise indica que as células foram arrastadas para sub-G1

apresentando um aumento de 1,7 para 2,2 e 2.4% no número de células em sub-G1

por 24, 48 e 72 h, respectivamente, quando comparado com o grupo controle. O

composto também causou um significativo aumento em danos celulares nas

concentrações testadas quando comparado com o controle negativo, o que pode

estar associado com efeitos citotóxicos diretamente no DNA celular.

Palavras-chave: Apoptose, atividade antitumoral, A549, citotoxicidade, Ditionato de

cis-Tetraamino(oxalato)rutênio(III), genotoxicidade, K562.

Abstract xx

ABSTRACT

Despite the resounding success of cisplatin and closely related platinum

antitumor agents, the movement of other transition-metal antitumor agents toward the

clinic has been exceptionally slow. Non-Platinum chemotherapeutic

metallopharmaceuticals hold much promise for the future, and needs to be actively

explored in a large variety of tumor types in combination therapies. The preparations

of metallocomplexes with potential antitumor activity has been one of the main

targets of transition metal chemistry since Rosenberg’s discovery of cisplatin {cis-

diamminedichloridoplatinum(II), cis-[Pt(NH3)2Cl2]} cytotoxic activity in the 1960s. In

1978, cisplatin was approved as the first platinumbased drug for the oncology

treatment, although several negative side-effects (nephrotoxicity, neurotoxicity,

nausea, etc.) had been induced on treated patients. Nevertheless, cisplatin was

followed by carboplatin {cis-diammine-1,1´ -cyclobutanedicarboxylateplatinum(II),

[Pt(NH3)2(cbdc)], approved in 1985} and oxaliplatin {1R,2R-

diamminocyclohexaneoxalatoplatinum(II), [Pt(dach)(ox)], approved in 1996}, which

met requirements of improving antitumor activity and reducing disadvantages of

cisplatin, carboplatin and oxaliplatin represent the second, and third platinum-based

drug generations, respectively. Nowadays, not only platinum-bearing complexes are

extensively studied with the aim to broaden a spectrum of transition metal-based

complexes which could be used in the treatment of cancer. Ruthenium complexes

have shown potential utility in chemotherapy and photodynamic therapy. Ruthenium

complexes generally have lower toxicities compared to cisplatin attributed to their

specific accumulation in cancer tissues. In vitro and in vivo studies show high

anticancer activity of Ruthenium complexes and some of them are currently

undergoing clinical trials. In the present work we studied the antitumor activity of the

Abstract xxi

Ruthenium(III) compound cis-Tetraammine(oxalato)Ruthenium(III) Dithionate {cis-

[Ru(C2O4)(NH3)4]2(S2O6)} against different tumor and normal cells lineages, analising

cell viabilities, cell cycle distribution, apoptosis induction mecanistics and genome

DNA damage. Correlation tests were performed to determine the effects of the time

of exposure and concentration of Ruthenium complex on mitotic index (MI) and

mitotic aberration index on Allium cepa root cells. A comparison of MI results of cis-

[Ru(C2O4)(NH3)4]2(S2O6) to those of lead nitrate reveals that the Ruthenium complex

demonstrates an average mitotic inhibition eightfold higher than lead, with the

frequency of cellular abnormalities almost fourfold lower and mitotic aberration

threefold lower. A. cepa root cells exposed to a range of Ruthenium complex

concentrations did not display significant clastogenic effects. The cis-

Tetraammine(oxalato)Ruthenium(III) Dithionate therefore exhibits a remarkable

capacity to inhibit mitosis, perhaps by inhibiting DNA synthesis or blocking the cell

cycle in the G2 phase. Results showed that Ruthenium(III) causes a significant

reduction of proliferation of A549 cells with viabilities ranging from 55.5% to 24.6%

when treated with 40 µM for 24 and 48h; and 32% to 18.2% when treated with 150

µM for 24 and 48h. The Ruthenium(III) compound induced a moderate (31.9% and

39.6% for concentrations 10 and 40 µM, respectively) to high degree (74% for

concentration 32 µM) of cytotoxic activity against A549 cells (IC50= 33.72 µM). On the

other hand, the normal lung fibroblast MRC-5 did not show significant reduction

proliferation in the presence of Ruthenium(III) compound. Even when treated with

higher concentrations of cis-Tetraammine(oxalato)Ruthenium(III) Dithionate for 48

hours, MRC-5 cells showed viabilities ranging from 85% to 78,4% for 40 µM and 150

µM, respectively. The antiproliferative and cytotoxic activity revealed that K562 cells

cultured with concentrations 40 and 150 μg mL-1 of Ruthenium(III) compound showed

Abstract xxii

significant reduction of proliferation after 72h of exposition, with viabilities ranging

from 88.2% to 55.6% when treated with 40 µM for 24 and 72h; and 76.2% to 26.7%

when treated with 150 µM for 24 and 72h. The Ruthenium(III) compound induced low

[22.4% (24h) to 28.2% (48h) and 29.8% (24h) to 35.7% (48h) for concentrations 10

and 40 µM, respectively] to moderate [44% (24h) and 53% (48h) for concentration

150 µM] of cytotoxic activity against K562. After incubation for 48 h, the IC50 value

was 18.28 µM. Compared to the cell cycle profiles of untreated cells, flow cytometric

analysis indicated a sub-G1 arresting effect of Ruthenium compound on K562 cells,

inducing a 1.7-fold, 2.2-fold and 2.4-fold increase in the number of sub-G1 cells for

24, 48 and 72 h, respectively, when compared to control. The compound also caused

a significant increase in tailed cells in any of the concentrations tested compared with

negative control that can be associated cytotoxicity with direct effect on K562 cells

DNA.

Keywords: cis-Tetraammine(oxalato)Ruthenium(III) Dithionate; Cytotoxicity;

Antitumor activity; A549; K562, Ruthenium(III) compounds; immunomodulatory

activity, Apoptosis.

Introdução 23

1. INTRODUÇÃO

1.1. Câncer O câncer é o resultado de um acúmulo de alterações genéticas, e

epigenéticas, que comprometem o controle do crescimento celular normal e a

diferenciação terminal, em que o acúmulo de mutações no DNA é a causa

subsequente ao desenvolvimento neoplásico e, consequentemente, ao surgimento

da doença (Hollstein et al., 1999; Lodish et al., 2000; Griffith et al., 2001; Alberts et

al., 2004).

A carcinogênese pode ser compreendida como um processo complexo no

qual se encontram envolvidos muitos genes, particularmente os que regulam a

estabilidade e o reparo do DNA, o crescimento celular, a imunidade e a

quimiorresistência às drogas. Um grupo de genes envolvidos nesse processo é

denominado genes supressores tumorais, os quais parecem agir normalmente,

como reguladores da proliferação celular (Anderson et al., 1994; Nagai, 1999; Sigal

& Rotter, 2000; Cavalcante JR et al., 2002; Gleich & Salamone, 2002).

As causas de câncer são variadas, podendo ser externas ou internas ao

organismo, estando inter-relacionadas. As causas externas referem-se ao meio

ambiente e aos hábitos ou costumes próprios de uma sociedade. As causas internas

são, na maioria das vezes, geneticamente pré-determinadas, e estão ligadas à

capacidade do organismo de se defender das agressões externas. Há diferentes

tipos de câncer com distintas causas moleculares. As alterações oncogênicas

podem ser divididas em dois grandes grupos: por aquisição (introduzidos por

infecção viral) e desenvolvimento (mutações em protooncogenes) de oncogenes; ou

por alterações genéticas que contribuem para o desenvolvimento do câncer devido à

perda da funcionalidade dos genes supressores de tumor, que protegem as células

Introdução 24

contra a divisão celular descontrolada (Diffley & Evan, 1999; INCA, 2010).

O câncer é uma das doenças mais comuns e graves vistas na medicina

clínica (Jemal et al., 2004). Dados epidemiológicos demonstram que o câncer, de

alguma forma, ataca mais que um terço da população mundial, sendo responsável

por mais de 20% de todas as mortes, e, em países desenvolvidos, chega a ser

responsável por mais de 10% do custo total em cuidados médicos (IARC, 1990;

Cairns, 1995; Barreto et al., 1998; Thompson et al., 2008).

No Brasil, estimativas para o ano de 2009 apontam que ocorreriam 489.270

casos novos de câncer. Os tipos mais incidentes seriam os de próstata e pulmão

para o sexo masculino e mama e colo útero para o sexo feminino (Tabela 01).Em

Goiás, acredita-se que neste mesmo ano, a incidência para novos casos seria de

16.130 para cada 100.000 habitantes (INCA/MS, 2010). Tornando-se o terceiro

grupo de causas de mortalidade, superado apenas por doenças cardiovasculares e

por morte acidental - incluíndo acidentes de trânsito quanto violência urbana - e

consolidando-se como um problema de saúde pública (INCA 2010).

Os termos “câncer”, “neoplasia maligna” e “tumor maligno” são sinônimos e

destinguem-se dos tumores benignos pelas suas propriedades de desdiferenciação,

poder de invasão e capacidade de metastizar-se, isto é, disseminar-se para outras

partes do corpo (Lodish et al., 2000).

Existem três abordagens principais para o tratamento do câncer: excisão

cirúrgica, irradiação e quimioterapia dependendo do tipo de tumor e do seu estágio

de desenvolvimento. A quimioterapia constitui o método mais utilizado para muitos

tipos de tumores e é subclassificada como curativa (controle completo do tumor),

adjuvante (esterilizar células residuais locais ou circulantes, diminuindo incidências

Introdução 25

de metástases à distância), neoadjuvante (redução parcial do tumor) e paliativa

(qualidade de sobrevida) (Laurence et al., 1997; INCA/MS 2009).

Tabela 1: Estimativas, para o ano 2008, do número de casos novos por câncer, em homens e mulheres, segundo localização primária.

Localização Primária Neoplasia Maligna

Estimativa de casos novos Masculino Feminino Total

Próstata 52.350 - 52.350

Mama Feminina - 49.240 49.240

Traquéia, Brônquio e Pulmão 17.800 9.830 27.630 Cólon e Reto 13.310 14.800 28.110 Estômago 13.820 7.680 21.500 Colo do Útero - 18.430 18.430 Cavidade Oral 10.330 3.790 14.120 Esôfago 7.890 2.740 10.630 Leucemias 5.240 4.340 9.580 Pele/Melanoma 2.960 2.970 5.930 Outras Localizações 59.130 78.770 137.900 Subtotal 182.830 192.590 375.420 Pele/não-Melanoma 53.410 60.440 113.850 Todas as Neoplasias 236.24o 253.030 489.270

Fonte: MS/Instituto Nacional de Câncer – INCA

Atualmente, têm sido pesquisadas novas abordagens para o tratamento do

câncer, incluindo a imunoterapia, o uso de inibidores da angiogenes, a terapia com

genes, as modificações da resposta biológica (por exemplo: interferons, fatores de

crescimento hematopoiético, entre outros) e a terapia fotodinâmica (Goodman &

Guilman, 2002).

1.2. Os compostos de Rutênio(III) no tratamento do câncer

Ultimamente, têm-se alcançado grandes avanços no desenvolvimento,

seleção e aplicação de agentes quimioterapêuticos, muitas vezes com sucessos

Introdução 26

clínicos notáveis, como no caso de tratamento para os linfomas ou de agentes

baseados em platina para o tratamento de câncer testicular. A quimioterapia

antineoplásica tem como objetivo o tratamento de diversos tumores malignos,

tornando-se uma das mais importantes e promissoras maneiras de combater o

câncer. Essa forma de tratamento pode ser empregada de forma curativa ou

paliativa, dependendo do tipo e extensão do tumor, além da condição física do

paciente. A associação da quimioterapia a outras formas de tratamento é bastante

comum (Mealey et al., 1994). Seu emprego antes da cirurgia e/ou radioterapia na

tentativa de promover a erradicação de micrometástases constitui a quimioterapia

neo-adjuvante. Porém, o uso depois da cirurgia e/ou radioterapia constitui a

quimioterapia adjuvante (Sonis, 1998).

No entanto, uma grande parte de pacientes com câncer, principalmente os em

estágios avançados, apresentam uma sobrevida bastante pequena. O ataque

indiscriminado promovido pelas drogas antineoplásicas às células de rápida

proliferação, cancerosas ou normais, produz os indesejáveis efeitos colaterais ou

tóxicos conhecidos e extremamente temidos pelos indivíduos que necessitam

submeter-se ao tratamento (Mealey et al., 1994). Uma parcela dos óbitos desses

pacientes acontece, principalmente, devido à administração de uma quimioterapia

ineficaz, especialmente quando se emprega agentes citotóxicos, o que leva a um

aumento da probabilidade de efeitos colaterais e a consequente diminuição da

qualidade de vida do paciente (Egger et al., 2005).

Os agentes alquilantes, de forma geral, têm como alvo a molécula de DNA da

célula tumoral, apresentando geralmente boa eficácia e produzindo aumentos

significativos na expectativa de vida de pacientes com câncer, especialmente

quando associados aos antineoplásicos de diferentes mecanismos de ação (Kelland,

Introdução 27

200). Porém, por sua relativa inespecificidade, tornam-se tóxicos também para os

tecidos saudáveis, principalmente os de maior grau de proliferação.

Conseqüentemente, os esforços agora estão direcionados no sentido de se produzir

agentes mais seletivos. Se isso for possível, poderíamos dispor de drogas mais

eficazes, pois agiriam especificamente nos mecanismos moleculares da neoplasia,

com um grau bem menor de toxicidade (Jung, 2007; Oliveira & Alves, 2002).

Neste contexto, os compostos de rutênio têm sido objetos de grande atenção

por terem propriedades antimetastática e de baixa toxicidade. Os componentes do

rutênio parecem penetrar na célula tumoral e ligar efetivamente ao seu DNA,

realizando ligação cruzada com as duas fitas, sendo então chamados de “cross-

linkers” (Kostova, 2006).

Existem três propriedades principais do rutênio que fazem com que seus

derivados sejam bem apropriados para aplicações biológicas; mudança de ligante –

os complexos de Rutêni (II) e (III) apresentam cinética de mudança de ligante similar

aos complexos de platina (II), sendo importante para as drogas atingirem o alvo

biológico sem serem modificadas; estados de oxidação – o rutênio é o único entre o

grupo de metais em que os estados de oxidação são acessíveis em condições

fisiológicas, permitindo a administração de complexos de Ru (III) que poderão ser

ativados por redução formando complexo de Ru (II) nos tecidos alvos. No sistema

biológico, a redução de Ru (IV) e Ru (III) é favorecida pela glutationa, ascorbato e

proteínas transportadoras de um único elétron, enquanto que o oxigênio e citocromo

oxidase promovem a oxidação do Ru (II); mimetizando o ferro – a baixa toxicidade

das drogas de rutênio é explicada pela habilidade que este elemento tem de imitar o

ferro na ligação a varias biomoléculas, incluindo a transferrina e a albumina. Em

mamíferos, estas duas proteínas são responsáveis pela solubilização e transporte de

Introdução 28

ferro, reduzindo a toxicidade deste metal (Alama et al., 2009; Pereira et al., 2009;

Kostova, 2006; Silveira-Lacerda et al, 2009b; Allardyce & Dyson, 2001).

A redução do Ru (III) para Ru (II) pode ser um mecanismo fundamental da

ativação celular por compostos de rutênio (Depenbrock et al., 1997). Os compostos

de Ru (III) podem ser reduzidos em áreas tumorais com hipóxia, a qual é capaz de

ligar-se rapidamente e causar dano ao DNA (Grguric-Sipka et al., 2003).

Em trabalhos anteriores, foi descrito que os composto Cloreto de cis-

Tetraaminodiclororutênio(III) (cis-[RuCl2(NH3)4]Cl) apresenta atividade citotóxica

sobre linhagem tumoral humanas Jurkat e HeLa, com IC50 de 190 e 3,5µM,

respectivamente (Frasca et al., 2001). Este composto apresentou atividade citotóxica

sobre as linhagens tumorais humanas Jurkat e HeLa, com IC50 de 190 e 3,5µM,

respectivamente (Frasca et al., 2000). Silveira-Lacerda et al., (2009b), trabalhando

com o mesmo composto, verificaram que o mesmo apresentava atividade citostática

significante, em estudos realizados com células tumorais humanas e de

camundongos. Os resultados indicaram que este composto apresentava atividade

citotóxica e genotóxica sobre células tumorais A-20, SK-Br-3, e S-180, onde DNA de

células tumorais tratadas apresentavam fragmentação do material genético.

Esse complexo de rutênio atua como droga citostática ao impedir a

progressão do ciclo celular da linhagem tumoral A-20 e induzir a apoptose.

Observou-se também que a atividade citostática exercida pelo composto de rutênio

sobre células mononucleares do sangue periférico humano foi menor quando

comparadas à atividade citostática deste composto em outras linhagens tumorais

que foram testadas (Silveira-Lacerda, 2009b). Verificou-se ainda que a toxicidade do

composto foi seletiva às células cancerígenas e com potencial efeito

Introdução 29

imunoestimulante sobre células mononucleares do sangue periférico humano

(Silveira-Lacerda, 2009a).

O Ditionato de cis-Tetraamino(oxalato)rutênio(III), assim como o Cloreto de

cis-Tetraamindiclororutênio(III), mostrou ação contra o tumor ascítico Sarcoma 180

in vivo, estatisticamente significativa e dose-dependente, e se mostrou mais efetivo

contra os tumores ascíticos em relação aos tumores sólidos (Barbosa, 2007). Com

este composto, também se tem observado baixa toxicidade frente às células

humanas normais e grande capacidade de bloqueio do ciclo celular de células de

linhagem tumoral.

Estudos indicam que comparados com outras drogas de coordenação, os

compostos baseados em complexos de rutênio estão entre os mais promissores

(Allardyce & Dyson, 2001). Desta forma, o complexos Ditionato de cis-

Tetraammino(oxalato)rutênio(III), assim como o Cloreto de cis-

Tetraamindiclororutênio (III), apresentam grande potencial para o uso clínico por

possuir baixa toxicidade, segundo dados preliminares provenientes de estudos

realizados no laboratório de Genética Molecular e Citogenética do Instituto de

Ciências Biológicas da Universidade Federal de Goiás.

O modo de ação dos compostos baseados em rutênio pode ser mais amplo e

complexo do que o esperado. É possível que estes compostos possuam a

habilidade de modular o consumo e a liberação de sinalizadores intercelulares, além

de importantes moléculas intracelulares (Clarke, 2003).

O aprofundamento do conhecimento acerca dos mecanismos pelos quais os

complexos organometálicos desempenham suas atividades no ambiente celular é de

suma importância para o sucesso clínico de drogas antitumorais baseadas em

metais, assim como auxiliará imensamente no desenvolvimento de novos compostos

Introdução 30

com elevado potencial clínico e no bem-estar humano (Pereira et al., 2009; Silveira-

Lacerda et al., 2009b).

Revisão de Literatura 31

2. REVISÃO DE LITERATURA

2.1. Ciclo celular

Nos últimos anos, a noção de proliferação celular evoluiu muito,

proporcionando maior conhecimento da biologia da célula. Por sua vez, esse avanço

está começando a originar novas abordagens para o desenvolvimento de agentes

antineoplásicos. Para se compreender como atuam os grandes antineoplásicos

atuais e como irão atuar os novos medicamentos, é importante se considerar as

características especiais da célula cancerosa (Laurence et al., 1997).

Diversos estudos demonstram que mutações em células somáticas e a

progressão do ciclo celular envolvem a expressão de uma série de genes, dentre

eles muitos oncogenes (Hollstein et al., 1991; Thompson et al., 1993; Alberts et al.,

2004). Os mecanismos de ativação desses genes, que participam na oncogênese,

incluem translocações cromossômicas, mutações de ponto, deleções, inversões e

amplificações do DNA (Merritt et al., 1990; Anderson et al., 1992; Alberts et al.,

2004).

Os cânceres geralmente parecem desenvolver-se por um processo no qual

uma população inicial de células levemente anormais, descendentes de uma célula

ancestral com uma única mutação, evolui em ciclos sucessivos de mutação e de

seleção natural. Em cada estágio, uma célula adquire mais uma mutação que lhe

confere uma vantagem seletiva em relação às células vizinhas, tornando-a mais apta

a prosperar naquele ambiente (Alberts et al., 2004). A evolução do tumor necessita

de uma grande dose de chance e normalmente leva muitos anos. Para esta

evolução, as células cancerosas adquirem propriedades especiais, que incluem

alterações nas vias de sinalização celular que levam as células tumorais a ignorar os

sinais do ambiente que normalmente mantém a proliferação celular sob controle


rígido, as células cancerosas também adquirem uma aversão anormal ao suicídio

(apoptose), de modo que evitam ou rompem as limitações normalmente

programadas para a proliferação; são geralmente instáveis; escapam do tecido

original e sobrevivem, proliferando em novos ambientes (Alberts et al., 2004).

A descoberta de drogas anticancerígenas pode ser resultado de testes

empíricos ou da síntese dirigida de substâncias. Os testes empíricos consistem na

seleção aleatória dos compostos que são testados em animais experimentais com

tumores. A síntese dirigida de substâncias químicas e de produtos biológicos contra

as células tumorais constitui um dos métodos empregados na atualidade, para

triagem de diversas drogas sintetizadas por grandes universidade e laboratórios. As

descobertas podem ser também, resultado de observações feitas ao acaso,

geralmente de substâncias sintetizadas para outras finalidades (Mather, 1998;

Freshney, 2000).

O ciclo celular é composto de duas fases funcionais e duas preparatórias. As

fases funcionais são a fase S, com síntese do DNA, e a fase M, ou mitose, com

segregação dos cromossomos duplicados. As fases preparatórias são a G1 (gap 1)

que prepara a célula bioquimicamente para as fases S e G2 (gap 2), que preparam a

célula para a mitose. As células que não se dividem ativamente podem ser

permanentemente removidas do ciclo por diferenciação ou ficar temporariamente

presas em um estado inerte, chamado de fase G0. (Alberts et al., 2004)

Pontos de checagem do ciclo celular podem interromper o ciclo se

determinados eventos não se completarem. A entrada na mitose é impedida, por

exemplo, quando a replicação do DNA não está completa; a separação dos

cromossomos na mitose é atrasada se alguns dos cromossomos não estiverem

adequadamente fixados no fuso mitótico. O avanço através de G1 e G2 é atrasado


pelos mecanismos de freagem se o DNA no cromossomo estiver danificado por

radiação ou por processos químicos. O atraso nestes pontos de checagem de dano

no DNA fornece tempo para o DNA danificado ser reparado; então a freagem do

mecanismo é liberada e o ciclo celular é retomado (Figura 1) (Alberts et al., 2004).

Figura 1 – Pontos de checagem do sistema de controle do ciclo celular (Alberts et al., 2004).

2.2. Apoptose

É essencial a compreensão da cinética do ciclo celular para o uso apropriado

da atual geração de drogas antineoplásicas. Muitos dos mais potentes agentes

citotóxicos atuam em fases específicas do ciclo celular e, portanto, têm atividade

apenas em células que estão em processo de divisão. Nos estudos in vitro da ação

citotóxica das drogas antineoplásicas, verifica-se que há distúrbios do ciclo celular e,

posteriormente, morte celular, embora cada droga possa apresentar mecanismos de

ação específicos. Isto sugere que vários estímulos citotóxicos iniciam os eventos que

conduzem à morte celular (Freshsney, 2000).

A morte celular pode ocorrer de duas formas: por necrose ou por apoptose

(Moraes et al., 2007). A necrose é a morte celular causada por trauma e, portanto,


há uma resposta inflamatória. As características das células em necrose são o

intumescimento celular e da mitocôndria, o aumento da permeabilidade da

membrana plasmática e ruptura da mesma e a desintegração das organelas e dos

componentes nucleares. A necrose é associada a danos graves como a hipóxia

aguda e a deficiência abrupta de nutrientes (Grivicich et al., 2007).

A apoptose, ou morte celular programada, foi primeiramente descrita em 1972

por Kerr, Wyllie e Currie para designar uma forma de morte celular que se distinguia

da morte por necrose, pois não se observavam danos à membrana plasmática e

nem resposta inflamatória. A apoptose pode ser ativada por diversos estímulos tais

como agentes fisiológicos na embriogênese e no sistema imune. Em condições

fisiológicas, a apoptose é um processo controlado, estando envolvida na

homeostase do tecido, representando um mecanismo de destruição seletiva das

células danificadas, cuja sobrevivência poderia prejudicar o organismo como um

todo. A célula, ao sofrer apoptose, apresenta alterações morfológicas e bioquímicas

distintas daquela em necrose. A célula apoptótica é caracterizada pelo encolhimento

celular, condensação e fragmentação da cromatina, que produz fragmentos de 50 a

300 kpb (Wyllie et al., 1980; Ramenghi et al., 2000; Maurillo et al., 2000; Grivicich et

al., 2007; Moraes et al., 2007).

A célula apoptótica se fragmenta formando os corpos apoptóticos. O

vazamento do citocromo c da mitocôndria para o citosol é uma das primeiras

características bioquímicas que precede as alterações no núcleo da célula em

apoptose (Figura 2). Estas propriedades diferem significantemente das

características de necrose ou morte celular acidental (Moraes et al., 2007).


A desregulação da apoptose pode interromper o delicado balanço entre

proliferação celular e morte celular e contribuir para o aparecimento de neoplasias e

doenças auto-imunes (Tompsom et al., 1993; Danial & Korsmeyer, 2004).

Quando o processo de apoptose é iniciado, ele promove a ativação de

eventos moleculares, que culminam na ativação de proteases, denominadas

caspases, as quais são responsáveis pela iniciação e execução da morte celular. A

regulação deste processo é realizada por fatores inibidores e ativadores da cascata

apoptótica, entre os quais podemos destacar os receptores de morte, pertencentes á

família do receptor TNF (Suda et al., 1993; Reiter et al., 2002), proteínas

pertencentes às famílias Bcl-2, IAPs, FLIPs (Timerbaev et al., 2006; Perianayagam

et al., 2006).

Figura 2 – Caracteristicas de uma célula em necrose (a) e apoptose(b) (Modificado de Anazetti,

2007).

A apoptose pode ser desencadeada por duas vias principais, a intrínseca e a

extrínseca. A chamada via extrínseca é iniciada pela ligação dos receptores de

morte que são membros da superfamília do fator de necrose tumoral (TNF) e do


fator de crescimento neuronal (NGF). Entre os receptores de morte, estão TNF-R1,

Fas (Apo-1/CD95), TRAIL-R1, TRAIL-R2 e NGF-R. Esses receptores são proteínas

transmembranares contendo uma porção externa, à qual o ligante se associa, e uma

porção citoplasmática, que contem o domínio de morte DD (Death Domain), eles

podem ativar diretamente a via efetora de caspases, moléculas com atividade

proteolítica e que são diretamente responsáveis pelo colapso celular característico

do processo apoptótico (Sharma et al., 2000; Moraes et al., 2007).

Por outro lado, a via intrínseca começa pela ação de diferentes sinais de

estresse intracelular, tais como irradiação, agentes quimioterápicos, vírus, bactérias

e ausência de fatores de crescimento celular, os quais convergem para a

mitocôndria. Esta organela contém, no seu espaço intermembranar, fatores

apoptogênicos, como citocromo c, AIF (Apoptosis-Inducing Factor), pró-caspases 2,

3 e 9, SMAC/DIABLO (Second Mitochodria-DerivedA activator of Caspases/direct

IAP binding protein with low pI), Omi/HtrA2 (High temperature requirement protein-2)

e endonuclease G53. Na presença de sinais apoptóticos, esses fatores são liberados

no citoplasma e alguns deles participam da ativação das caspases. Essa via

apoptótica, centrada na mitocôndria, é conhecida como via intrínseca mitocondrial ou

via de ativação das caspases dependente da mitocôndria (Sharma et al., 2000;

Moraes et al., 2007).

A manutenção desses fatores na mitocôndria ou sua liberação no citoplasma

é determinada por proteínas da família denominada Bcl-2. Por tal motivo, essa

família e a família das caspases são consideradas os principais reguladores do

processo de apoptose (Figura 3).

Existem pelo menos 20 membros da família Bcl-2 identificados até o

momento, os quais podem ser divididos em dois grupos principais, dependendo de


sua função. O grupo pró-apoptótico (Bax, Bcl-Xs, Bak, Bad, Bid, Bik, entre outros)

reúne os membros que induzem a liberação dos fatores apoptogênicos da

mitocôndria no citoplasma, resultando em apoptose. Já o grupo antiapoptótico (Bcl-

2, Bcl-XL, Mcl-1, Bcl-w e Boo, entre outros) reúne os que são responsáveis pela

manutenção desses fatores na mitocôndria, inibindo o processo de apoptose

(Moraes et al., 2007).

Figura 3 – Via intrínseca e extrínseca da apoptose (Modificado de Anazetti, 2007).


É provável que todas as células do corpo humano possuam a capacidade

intrínseca de sofrer apoptose. Isto sugere que todas as estruturas e processos

requeridos em pelo menos uma via de apoptose estão presentes na célula e

provavelmente sejam necessários à sua sobrevivência (Moraes et al., 2007).

Pesquisas realizadas na década de 1990 têm demonstrado que a morte

celular provocada pelas drogas quimioterápicas ocorre principalmente por indução

de apoptose. Esta classe de drogas tem o potencial de restabelecer a apoptose

celular, processo que se encontra alterado em células cancerígenas (Huschtscha et

al., 1998; Guchelaar et al., 1998; Huang & Oliff, 2001; Fesik et al., 2005; Moraes et

al., 2007).

2.3. Quimioterapia antineoplásica

A quimioterapia, tratamento que envolve drogas citotóxicas, tem sido

considerada como uma das principais ferramentas sistêmicas de combate ao câncer.

Pode ser aplicada em diferentes situações clínicas, como no tratamento primário de

neoplasias avançadas, sendo denominada, neste caso, de quimioterapia de indução.

Pode também ser utilizada como tratamento sistêmico após o controle do tumor

primário por cirurgia ou radioterapia. Sempre, no entanto, deve ser considerada a

eficácia da droga em relação ao tipo de tumor (El-Deiry, 1993; Burns & El-Deiry,

1999).

Dentre as principais formas de tratamento do câncer, para os quimioterápicos

há as seguintes classificações: (1) agentes alquilantes, que atuam por meio da

formação de ligações covalentes com o DNA, impedindo sua replicação; (2)

antimetabólicos, que bloqueiam ou subvertem uma ou mais vias metabólicas

envolvidas na síntese do DNA; (3) medicamentos obtidos por produção natural ou


alcalóides; (4) hormônios, dos quais os mais importantes são os esteróides, isto é,

glicocorticóides, estrogênios e androgênios e fármacos que suprimem a secreção de

hormônios ou antagonizam sua ação; (5) imunoterápicos, embora ainda

incipiente; (6) antibióticos, grupo de substâncias com estrutura química diversa,

que interagem com o DNA e inibem a síntese de proteínas; (7) inibidores mitóticos,

que levam à paralisação da divisão celular em metáfase ao atuar sobre a tubulina,

proteína formadora do fuso; (8) outros agentes, com mecanismos de ação que não

permitem a inclusão nos grupos apresentados anteriormente, como, por exemplo, a

dacarbazina, indicada no tratamento do melanoma avançado, sarcomas de partes

moles e linfomas (Rang, 2001; Goodman & Gilman, 2002; INCA, 2007).

No entanto, é importante salientar que os quimioterápicos antineoplásicos

podem atuar indistintamente em células sadias e tumorais, acarretando significativos

efeitos colaterais. As células do tecido hematopoiético, germinativo, aparelho

gastrintestinal e folículo piloso, devido à sua característica de rápida divisão celular,

são particularmente sensíveis a essas drogas. Assim, para favorescer a análise

padronizada desses efeitos, o Instituto Nacional do Câncer dos Estados Unidos (NCI

- National Cancer Institute) desenvolveu, no ano de 1982, o Common Toxicity

Criteria (Critérios comuns de toxicidade) para reportagem de efeitos e estudo de

novas drogas (Nicolini, 1988).

O Common Toxicity Criteria estrutura-se em apresentar efeitos adversos e

categorias em que encaixam esses efeitos: alérgicos/imunológicos, infecções,

auditivos, linfáticos, sangüíneos/da medula óssea, metabólicos, de musculatura

estriada esquelética, cardiovasculares, neurológicos, de coagulação, oculares,

dores, sintomas constitucionais, dermatológicos, pulmonares, endócrinos,


renais/geniturinários, gastrintestinais, malignidades secundárias, hemorragias,

funções sexuais/reprodutivas, hepáticas, e síndromes (NCI, 1999).

Na prática, tem sido difícil estabelecer uma dose efetiva que leve à máxima

destruição das células tumorais, induzindo, no hospedeiro, uma toxicidade reversível

e tolerável. Para a maioria desses quimioterápicos a margem entre a dose efetiva e

a tóxica é estreita, o que parece estar relacionado ao metabolismo da droga, rota e

protocolo de administração, além da sensibilidade intrínseca do tumor à droga.

Sendo que os efeitos colaterais mais comumente observados são toxicidade

hematológica, toxicidade gastrintestinal, cardiotoxicidade, hepatotoxicidade,

toxicidade pulmonar, disfunções reprodutivas, toxicidade vesical e renal, toxicidade

dermatológica, anafilaxia, neurotoxicidade e alterações metabólicas (Silva et al.,

2003).

Com relação ao metabolismo, as alterações mais comumente verificadas são

hipomagnesemia; hiponatremia – devido à síndrome da excreção inapropriada de

hormônio vasopressina, além de efeitos colaterais primários de alguns

medicamentos, como vômitos persistentes e diurese (Gaffey et al., 1993).

A erradicação completa das células tumorais é conseqüência de múltiplos

fatores que refletem as interações entre o tumor e o hospedeiro, a toxicidade

cumulativa do medicamento, limitando seu uso, a presença de tumor em locais de

difícil acesso ao quimioterápico, o estado geral debilitado do paciente, não

permitindo doses adequadas, alterações na velocidade de crescimento do tumor e

odesenvolvimento de resistência adquirida pelo tumor ao quimioterápico, entre

outros (Gaffey et al., 1993; Menezes, 2007).


2.4. Compostos baseados em metal usados na terapia antitumoral

Metais preciosos já eram usados para propostas medicinais a.C. (há mais de

3500 anos atrás). O ouro foi utilizado em várias áreas da medicina na Arábia e

China. Naquela época, metais nobres eram confiáveis para beneficiar a saúde, pela

sua raridade, contudo, pesquisas recentes têm associado as propriedades

medicinais de drogas inorgânicas com suas propriedades biológicas específicas

(Allardice & Dyson, 2001).

Compostos baseados em metal ampliam a possibilidade de construir

moléculas com ligações mais adequadas para os objetivos específicos da biologia.

Na verdade, íons metálicos apresentam uma grande variedade de números de

coordenação e geometrias, que permitem organizar os ânions nos mais diferentes

ligantes orgânicos (com suas propriedades químicas e biológicas) de forma mais

adequada à distribuição espacial, proporcionando melhor modalidades de ataque às

moléculas alvo (Pizarro et al., 2009).

Em meados dos anos 1960, Rosenberg e colaboradores, descobriram, por

acaso, as propriedades anticancerigenas da cisplatina {cis-[PtCl2(NH3)2]} (Figura 4),

durante as investigações do efeito de campos elétricos sobre o crescimento de

Escherichia coli. Os pesquisadores estavam usando eletrodos de platina em uma

solução contendo cloreto de sódio e sais de amônio, entre outros constituintes,

quando observaram um evento inesperado, as bactérias tornaram-se longos

filamentos e passaram a não se replicar. A divisão celular de E. coli havia sido

inibida. Uma análise mais extensa desta observação levou à conclusão de que o

ciclo replicativo bacteriano foi inibido por complexos amino-platina formados por

eletrólise (Pizarro et al., 2009).

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Figura 5 – Estrutura química de antitumorais a base de platina (Lookich & Anderson, 1998).

Depois de administrada intravenosamente e absorvida por difusão passiva

para o interior das células, a cis-Pt (II) adquire carga positiva durante uma reação de

ativação e reage, rapidamente, com bases púricas de nucleotídeos di- e trifosfatos,

formando ligações cruzadas com GpG e ApG (Figura 6). A posição do N7 das

guaninas é mais reativa do que da adenina e provém um forte sítio na fita de DNA

para ataques nucleofílicos pelos produtos de hidrólise do complexo de platina

(Bakhtiar & Ochiai, 1999).

Entretanto, a eficácia dessas drogas derivadas da platina é limitada pelos

mecanismos de resistência adquirida e inata. O uso da cisplatina na clínica é

também reduzido por apresentar neuro e nefrotoxicidade significantes, enquanto a

carboplatina é associada com a supressão de células da medula óssea (Lokich &

Anderson, 1998).

Essas descobertas têm estimulado a síntese de alguns complexos baseados

em metais do grupo da platina, como drogas potencialmente antitumorais, e que

demonstrem menor toxicidade em relação aos compostos de platina (Clarke, 2003).


Apesar do sucesso da cisplatina e medicamentos à base de platina, o mercado de

drogas ainda é acessível para novas drogas á base de metal que oferecem uma

melhor viabilidade, tais como a administração oral, o que pode ajudar a diminuir os

efeitos colaterais graves e custos clínicos. Além disso, novos estudos concentram-se

na investigação de novas drogas com maior eficácia, ou seja, drogas que interajam

de forma diferente com o DNA, o que pode levar à superação da resistência inata ou

adquirida de certos tipos de tumores (Pizarro et al., 2009) . Alguns resultados

promissores foram obtidos com derivados de diferentes metais, como Pt, Ti, Rh, Au

e Ru (Katsaros & Anagnostopoulou, 2002; Cabrera et al., 2004; Kostova, 2006)

Figura 6 - Diferentes tipos de adutos DNA-cisplatina, para uma dada seqüência aleatória. O aduto intrafita 1,2-GG (superior esquerdo) é considerado uma lesão crítica (Adaptado de Bakhtiar & Ochiai, 1999).

Em 1970, Clarke et al., relataram que pentamino-(purina)-rutênio(III) é capaz

de inibir a síntese de DNA e proteínas em células de carcinoma de nasofaringe in

vitro, o que desencadeou o interesse em complexos de rutênio como potenciais


fármacos anticancerígenos. Durante a década seguinte, Mestroni et al., (1989)

desenvolveu complexos hexacoordenados com Ru(II)dimetilsulfóxido e ligantes de

cloreto, em particular os cis- e trans-RuCl2 (dimetilsulfóxido)4, que apresentam

atividade anticancerígena in vitro e in vivo. Os complexos mostraram interagir tanto

in vitro e in vivo com o DNA, o seu alvo mais provável (Pizarro et al., 2009).

Hoje, existem duas drogas anticancerígenas baseadas em Rutênio em

ensaios clínicos: o NAMI A, desenvolvido em Trieste por Mestroni et al. (1998), e o

KP1019, desenvolvido por Keppler et al. (1996), em Viena. O antitumoral NAMI-A

possui uma citotoxicidade relativamente baixa para as células cancerosas, mas é

particularmente eficaz contra metástases de tumores sólidos, tanto em tumores

experimentais de murinos, quanto em tumores humanos enxertados em

camundongo nude, sendo pouco eficaz em tumores sólidos. A droga já concluiu a

fase I nos ensaios clínicos (Pizarro et al., 2009).

No entanto, em contraste com outras drogas anticâncer baseadas em metal

aqui analisadas, a atividade antimetastática do NAMI-A ocorre devido aos efeitos

combinados sobre o controle da angiogênese (possivelmente porque interfere com o

metabolismo de NO in vivo) e propriedades anti-invasivas para as células tumorais e

nos vasos sanguíneos. Embora tenha sido relatada a interação NAMI-A com o DNA

in vitro, essa ligação pode não contribuir para o seu mecanismo de ação (Vacca et

al., 2002; Pizarro et al., 2009) (Figura 7).

Figura 7 – Estrutura química do composto NAMI-A (transimidazoldimetilsulfoxidotetraclororutênio) (Vacca et al., 2002).


O composto Indazolium trans-[(tetracloreto)bis(1H-indazol)rutênio(III)]

(KP1019 ou FFC14A) (Figura 8) apresentou atividade citotóxica contra carcinoma de

cólon em ratos nas investigações pré-clínicas. O DNA tem sido proposto como um

dos alvos biológicos de KP1019, e também tem sido relatado que a droga

desencadeia a apoptose (Kapitza et al., 2005). No entanto, os mecanismos celulares

de ativação da apoptose ainda estão sob investigação (Egger et al., 2005, Kapitza et

al., 2005; Bergamo & Sava, 2007).

Figura 8 – Estrutura do composto de Rutênio KP1019 {Indazolium trans-[(tetracloro)bis(1H-indazol)rutênio(III)]} (Depenbrock, 1997).

2.5. Complexos de Rutênio e seu Mecanismo de Ação

O Rutênio-102 é o elemento químico metálico de símbolo Ru, pertencente ao

Grupo 8 da tabela periódica, o mesmo do ferro, presente na hemoglobina. Este

elemento químico possui propriedades antitumorais semelhantes à platina,

pertencente ao Grupo 10. É um metal branco, duro e brilhante, com quatro formas

cristalinas em seu estado reduzido. Se uma solução de clorato de potássio lhe é

adicionada, reage explosivamente oxidando-se. Sendo um metal raro, o rutênio teve

sua existência comprovada em 1844 na Rússia, pelo químico alemão Karl Karlovitch

Klaus (Greenwood & Earnshaw, 1997). Este optou por manter o nome sugerido por


seu conterrâneo, Gottfried Wihelm Osann, dedicado desde 1828 à pesquisa de um

novo elemento do grupo da platina a partir de um minério encontrado nos montes

Urais. O nome deriva de Ruthenia, topônimo latino para Rússia. Da classe dos

metais de transição, os compostos de rutênio são sais metálicos cujo mecanismo de

ação parece estar relacionado à sua estrutura espacial octaédrica (Greenwood &

Earnshaw, 1997).

A exploração de complexos de Rutênio para o uso como agente anticâncer foi

iniciada na tentativa de se obter uma droga menos tóxica e mais específica. Um

exemplo de especificidade proposto para complexos de Ru(III) sugere que eles se

liguem a transferrina e, conseqüentemente, podem ser alvos de células neoplásicas

e regulares positivamente a expressão de receptores de transferrina na membrana

celular, devido a um aumento do requerimento de ferro (Huxham et al., 2003).

A Transferrina (Tf), uma glicoproteína de aproximadamente 80 kDa, é o modo

primário de transporte de ferro para células de mamíferos e está relacionada com a

liberação de íons metálicos anticâncer em sítios tumorais (Frasca et al., 2001).

Srivastava et al., (1981) mostraram que rutênio radioativo como o 103RuCl3 liga-se à

soroalbumina humana e à Tf na corrente sanguínea de animais experimentais.

Contudo, o 103Ru-Tf foi preferencialmente encontrado em áreas de tumor,

provavelmente por causa do grande número de receptores para transferrinas na

superfície da célula tumoral (Frasca et al., 2001).

Desde que a Tf humana se encontra somente 30% saturada com o Fe+3 em

condições fisiológicas, é possível que a Tf seja o veículo para outros íons metálicos

trivalentes. Isto é relevante, porque as células tumorais apresentam um

requerimento nutricional elevado, o qual é favorecido pela angiogênese, que

promove o aumento do fluxo sanguíneo, e pelo aumento da permeabilidade das


membranas, resultando numa maior captação de nutrientes (Frasca et al., 2001). Em

muitos casos, a molécula alvo para agentes anticâncer baseados em metal parece

ser o DNA, mas outras interações moleculares também são importantes (Barca et

al., 1999).

O composto de rutênio é caracterizado por um mecanismo completamente

novo de ação: causa uma mudança de transferência de energia nas células (via

mitocôndria). Este princípio é facilitado pela ação da transferrina, considerando que

as células tumorais têm número aumentado de receptores para esta proteína, de

forma que em tecidos saudáveis, a concentração da droga foi presumivelmente mais

baixa e menos ofensiva (Frasca et al., 2001).

Uma das hipóteses sugere que os compostos de Rutênio (III) servem de pró-

drogas que são reduzidas, in vivo, pelas condições citoplasmáticas das células

tumorais: baixas concentrações de O2 em decorrência do consumo atípico de

nutrientes; pH baixo, devido à produção de ácido láctico na glicólise anaeróbia,

compensatória da falta de oxigênio; e à presença de glutationa em níveis

tipicamente altos. Essas alterações no ambiente citoplasmático das células tumorais

podem favorecer a conversão de Rutênio(II) a partir do Rutênio(III), intensificando

ligações ao DNA, com toxicidade seletiva às células tumorais (Figura 9) (Clarke,

2003; Silveira-Lacerda, 2009b).

Os possíveis mecanismos moleculares de ligação ao DNA têm sido

pesquisados. Os resultados sugerem que os complexos de rutênio promovem

crosslinks entre as duas fitas de DNA, possivelmente favorecido pelas restrições

impostas pela geometria octaédrica destes compostos. Este mecanismo difere da

formação de “crosslinks” intrafita induzida pela cisplatina e, conseqüentemente, as

linhagens de células tumorais que têm desenvolvido resistência à cisplatina, pela


aceleração da taxa de reparo de “crosslinks” intrafita, que são ainda susceptíveis aos

complexos de rutênio (Allardyce & Dyson, 2001).

Mestroni et al. (1989) sugeriram que o cis e trans-RuCl2(DMSO)4 interagem

com o DNA in vivo. Estudos de interação in vitro com nucleotídeos resultaram na

ligação entre rutênio e DNA, que ocorre principalmente no N7 da guanina entre

“clusters” na dupla hélice (Küng et al., 2001).

Figura 9 – Mecanismo de ação do rutênio no ambiente da célula tumoral (Adaptado de Clarke, 2003).

A redução do Ru(III) para Ru(II) pode ser um mecanismo fundamental da

ativação celular de drogas de rutênio (Depenbrock et al., 1997). Os compostos de


Ru(III) podem ser reduzidos em áreas tumorais com hipóxia em espécie ativa, a qual

é capaz de ligar-se rapidamente e causar dano ao DNA. Nestas condições,

complexos de aminorutênio podem ser ativados in vivo para coordenar uma

nucleobase em uma forma similar aos experimentos in vitro (Grguric-Sipka et al.,

2003).

O cis e trans-RuCl2(DMSO)4 são conhecidos por exibirem atividade

anticâncer, enquanto o cis-[Ru(acac)2(L)2](CF3SO3) (L=Im=Imidazol ou N-Met-lm)

mostrou citotoxicidade seletiva à hipóxia em alguns carcinomas de camundongo (Wu

et al., 2003). Muitos complexos de rutênio com estado de oxidação II ou III exibem

atividade antitumoral, especialmente contra cânceres metastáticos. Segundo Keppler

& Jakupec (2003) os complexos de rutênio têm atraído a atenção devido aos seus

potenciais antitumorais.

Em estudo feito com Hind[trans-RuCl4(ind)2] e com tris(8-quinolinato)gálio(III),

observou-se que o complexo de rutênio tem atividade particularmente alta contra

tumores coloretais, com melhor biodisponibilidade e concentração plasmática

adequada que o Gálio. Quando comparado ao complexo de Gálio, o composto de

Rutênio apresenta grande capacidade antiproliferativa e capacidade superior de

induzir apoptose in vitro (Seelig et al., 2002; Keppler & Jakupec 2003).

Vilaplana et al., (2006), estudaram o cis-dicloro-1,2-propilenodiamino-

N,N,N0,N0-tetraacetato rutênio (III) (RAP) de fácil solubilidade em água. Sua

atividade antitumoral tem sido avaliada in vivo. Recentes resultados mostraram que

o seu composto possui estabilidade quando se liga ao DNA e os danos causados no

DNA diminuem de acordo com a retirada do complexo de rutênio do meio de cultura.


Outro resultado importante foi obtido com o complexo de Ru(II)-DMSO com

ligantes imidazólicos, o qual desenvolveu atividade anti-metastática contra alguns

modelos tumorais em camundongos (Cabrera et al., 2004).

Estudos iniciais com isômeros de Ru complexado, o cis e trans-

RuCl2(DMSO)4 sugerem que os mesmos têm propriedades anticâncer,

especificamente anti-metástase em doses relativamente não tóxicas (Huxham et al.,

2003). A química sintética de metais de transição é bem desenvolvida,

particularmente com ligantes amino e imino, favorecendo para muitos pesquisadores

a inovação na formulação de novos metalofarmacêuticos.

Devido à estabilização por um forte campo de ligação, a maioria dos estados

de oxidação do rutênio [Ru(II), Ru(III) e Ru(IV)] em solução aquosa são usualmente

octaédrico e, freqüentemente, inertes a substituição de seus ligantes. As vantagens

da utilização dos complexos de rutênioamino no desenvolvimento de drogas são: (1)

os métodos seguros de sintetizar complexos estáveis com estruturas previstas, (2) a

habilidade e afinidade entre os ligantes, na transferência de elétrons e na razão de

substituição e (3) um conhecimento prévio dos efeitos biológicos dos complexos de

Ru (Clarke, 2003). Evidentemente, todos os compostos exibem diferentes

mecanismos de ação baseados na acidez do metal, dos ligantes e do seu estado de

oxidação (Meléncez, 2002; Grguric-Sipka et al., 2003).

Para Kapitza et al., (2003), o complexo trans-

[tetraclorobisindazóliorutenato(III)] e seu sal de sódio análogo, se mostraram efetivos

na terapia de tumor colo-retal autóctone de ratos, e o seu análogo imidazólico

mostrou atividade significativamente mais baixa. O complexo trans-

[tetraclorobisindazóliorutenato(III)] e seu sal de sódio análogo exibiram capacidade

de induzir apoptose, além de despolarização da membrana mitocondrial, redução da


atividade do Bcl2 e ativação da caspase 3. Esses efeitos podem ser parcialmente

inibidos pela N-acetyl-cisteína, indicando envolvimento do estresse oxidativo tanto

na indução da apoptose quanto na indução de danos no DNA. A inibição pela N-

acetil-cisteína é muito mais efetiva em células não malignas, apontando para um

potencial efeito protetor dos tecidos normais pela ação antioxidante.

Para os compostos de Ru(III), a redução in vivo para o Ru(II) pode ser

necessária para sua atividade. A captura celular deste rutênio também parece ser

mediada pela proteína transportadora de ferro, transferrina. Em geral, a

citotoxicidade dos complexos de rutênio está correlacionada com sua habilidade de

se ligar ao DNA. Porém, uma exceção é a atividade antimetastática do NAMI e seu

análogo (ImH)trans-[Ru(Im)(Me2SO)Cl4] que inibe a atividade colagenolítica tipo IV e

reduz o crescimento do tumor (Zhang & Lippard, 2003).

Um dos compostos a base de rutênio mais estudado é o NAMI-A (trans-

imidazoldimetilsulfóxidotetraclororutênio), sendo um dos complexos metálicos

antitumorais mais promissores desenvolvidos (Sava et al., 1999). Este composto

corresponde à molécula de NAMI com um imidazol+H+ no lugar do átomo de Na+.

NAMI-A foi inicialmente testado em modelos in vivo, manifestando efeitos

antimetastáticos, como no carcinoma de Lewis em ratos (Sava et al., 1999; Sava et

al., 2003), e com baixa toxicidade em ratos e cães (Bergamo et al., 2000). O

composto NAMI-A aumenta a espessura da cápsula em torno do tumor primário e da

matrix extracelular dos vasos sanguíneos tumorais e assim, previne a invasão pelas

células tumorais em tecidos e em vasos sanguíneos sadios (Sava et al., 1998).

Também testado em 24 pacientes humanos, inibiu a proliferação das células

cancerígenas (câncer sólido-pulmão) (Sava et al., 2003).


Estudos pré-clinicos com KP418 e KP1019 [trans-

tetraclorobisimidazolrutênio(III)] mostraram atividade promissora no tratamento de

tumores do colo retal (Kapitza et al., 2003; Hartinger et al, 2006). O RM175

[(N6C6H5C6H5)Ru(en)Cl]+, onde en-etilenodiamina é um composto organometálico de

rutênio que possui propriedades citotóxicas para estudos in vitro comparado com a

cisplatina (Aird et al., 2002). Outro complexo metálico de relevância que está sendo

estudado por Eric Meggers, na Universidade de Pensilvânia, o composto de rutênio

indolcarbozol que possui baixos valores de IC50 e mimetismo com estauroporinas

(Atilla-Gokcumen et al., 2006).

O NAMI-A (trans-imidazoldimetilsulfoxidotetraclororutênio) também possui

atividade em tumores sólidos metastáticos, em fase experimental (Sava et al., 2003).

Muitas drogas com compostos metálicos são usadas para outros tipos de

tratamentos além do câncer, como a prata, que é usada para o tratamento de

infecções microbianas, e o ouro, que atua no tratamento do câncer, vírus (HIV),

asma, malária e artrite reumática (Claire & Dyson, 2001).

A empresa farmacêutica MMI - Medical Marketing International anunciou, no

dia 30 de julho de 2007, a conclusão dos testes pré-clínicos de um composto de

rutênio que ela denominou MMI/ONCO 4403. Seus estudos de toxicidade teriam

demonstrado que o composto tem um perfil mais seguro que as substâncias

baseadas em platina. Os testes de toxicidade aguda em doses repetidas com o

MMI/ONCO 4403 não apresentaram supressão da medula óssea ou nefrotoxicidade

significativas, após 28 dias de observação (MMI, 2007).

O composto cloreto de cis-Tetraaminodiclororutênio(III) (cis-[RuCl2(NH3)4]Cl)

revelou apresentar atividade citotóxica sobre as linhagens tumorais humanas Jurkat

e HeLa, com IC50 de 190 e 3,5µM, respectivamente (Frasca et al., 2000). Silveira-


Lacerda et al., (2009b), trabalhando com o mesmo composto (Figura 10), verificou

que o mesmo apresentava atividade citostática significante, em estudo realizados

com células tumorais humanas e de camundongos. Os resultados indicaram que

este composto apresentava atividade citotóxica e genotóxica sobre células tumorais

A-20, SK-Br-3, e S-180, onde DNA de células tumorais tratadas apresentavam

fragmentação do material genético. Esse complexo de rutênio atua como droga

citostática ao impedir a progressão do ciclo celular da linhagem tumoral A-20 e

induzir a apoptose. Observou-se também que a atividade citostática exercida pelo

composto de rutênio sobre células mononucleares do sangue periférico humano foi

menor quando comparadas à atividade citostática deste composto em outras

linhagens tumorais que foram testadas (Silveira-Lacerda, 2009b).

Verificou-se ainda que a toxicidade do composto foi seletiva às células

cancerígenas e com potencial efeito imunoestimulante sobre células mononucleares

do sangue periférico humano (Silveira-Lacerda, 2009a). A citotoxicidade destes

complexos de rutênio parece estar correlacionada com sua ligação ao DNA, no

entanto, o mecanismo de ação destas drogas permanece ainda desconhecido

(Menezes et al., 2007).

Menezes et al. (2007), estudou o mesmo complexo de rutênio e observou que

esse composto possui atividade antitumoral sobre a linhagem tumoral Sarcoma 180

de camundongos in vivo e in vitro; onde valor encontrado para a DL50 foi de 99,76

mg kg-1 de animal, relativamente alta comparada às DL50 observadas para outros

quimioterápicos derivados de metal. De acordo com as análises bioquímica e

hematológica do sangue dos animais correlacionadas a histopatologia dos órgãos, o

complexo de cis-[RuCl2(NH3)4]Cl não provocou efeito toxicológico grave, não foi

genotóxico para células da medula óssea de camundongos, apresentou atividade


bactericida sobre Staphylococcus aureus e Escherichia coli, e demonstrou interagir

com o DNA plasmidial pUC18.

Ribeiro e colaboradores (2009) avaliaram, através de um estudo de

citogenética, cromossomos humanos em metáfase e possíveis fragmentação de

DNA, detecção de aberrações espontâneas e/ou induzidas pelo uso do composto

cloreto de cis-Tetraaminodiclororutênio(III), em cultura de linfócitos humanos do

sangue periférico. Sendo que não se observou alterações em nenhuma das células

tratadas, ou seja, sem danos no DNA.

Figura 10 – Estrutura Química do Composto de rutênio Cloreto de cis-Tetraaminodiclororutênio (III).

O complexo de Ditionato cis-Tetraamino(oxalato)rutênio(III) (Figura 11), assim

como o cis-Tetraamindiclororutênio(III), mostrou ação contra o tumor acístico

Sarcoma 180 in vivo, estatisticamente significativa e dose-dependente, e se mostrou

mais efetivo contra os tumores ascíticos em relação aos tumores sólidos (Barbosa,

2007).

Figura 11 – Complexo de Ditionato cis-Tetraamino(oxalato)rutênio(III).


Desta forma, o complexo de Ditionato cis-Tetraamino(oxalato)rutênio(III) por

apresentar atividade antitumoral leva à várias investigações dos efeitos das

propriedades químicas e biológicas destes complexos de rutênio, tanto na área dos

antineoplásicos quanto na detecção de diferentes atividades para os mesmos

compostos.

2.6. Cultura de Células

Embora a supremacia das células animais na produção dos biofármacos mais

sofisticados seja um processo recente, consolidado na década de 1990, as primeiras

experiências de cultivo de células animais, ainda que incipientes, datam do inicio do

século XX (Moraes et al., 2007).

As culturas celulares são métodos laboratoriais que, sob condições

apropriadas, tanto vegetais como animais, multiplicam-se e até diferenciam-se,

possibilitando as mais variadas análises científicas. O termo cultura de células

refere-se à cultura de células derivadas dos tecidos originais provenientes de uma

cultura primária, de uma linhagem celular ou de células provenientes do tratamento

por desagregação enzimática, química ou mecânica (Moraes et al., 2007).

A cultura tecidual foi uma das primeiras idéias do início do século XX como

método para estudar o comportamento das células animais, livres das variações

causadas durante a homeostasia normal e da tensão causada, pelo experimento em

si. Considerando as implicações do próprio nome, as técnicas foram elaboradas

primeiramente com fragmentos teciduais não desagregados dos tecidos, e o seu

crescimento era restrito pela migração das células provenientes destes tecidos, com

ocasionais e raras mitoses (Mather, 1998; Moraes et al., 2007).

A demonstração de que os tumores humanos também podiam ser cultivados


in vitro por meio de linhagens celulares contínuas levou ao interesse para a cultura

de células humanas (Mather, 1998; Freshney, 2000).

A maioria das células normais ou malignas tem uma sobrevida curta de

alguns dias ou semanas in vitro. Caso estas se duplique, podem durar cerca de

algumas semanas, ou até meses. Poucas destas células conseguem estabelecer

linhagens e imortalizar-se. A imortalização não é necessariamente uma

característica neoplásica ou de transformação maligna (Mather, 1998; Moraes et al.,

2007).

Culturas preparadas diretamente de tecidos de um organismo, sem a

proliferação celular in vitro, são chamadas de cultura primária, que pode ser feita

com ou sem um passo inicial de fracionamento para separar diferentes tipos de

células (Alberts et al., 2004).

Linhagens de células tumorais são mais fáceis de serem geradas, pois elas

podem se proliferar em alta densidade no frasco de cultura. Propriedades similares

podem ser induzidas experimentalmente em células normais pela transformação

com um vírus de indução. O resultado de linhagem de células transformadas, é que

pode causar tumores se injetadas em animais suscetíveis ao tumor. Ambas as

linhagens de células imortalizadas e transformadas são bastante utilizadas na

pesquisa de células, como fonte de grande número de células de um tipo uniforme,

especialmente aquelas que possam ser armazenadas em nitrogênio liquido a -196ºC

por um período indefinido e reter suas viabilidades, quando descongeladas. Tal fato

é importante se ter sempre em mente, pois células, em ambos os tipos de linhagens,

sempre diferem nos importantes segmentos de seus progenitores normais nos

tecidos de que são derivados (Alberts et al., 2002).

Há inúmeras razões para o não crescimento destas células em culturas como,


por exemplo, um balanço nutricional errôneo, a necessidade de fatores de

crescimento, a necessidade da interação com o estoma para crescimento celular

entre outros pré-requisitos, as aberrações genéticas, a diferenciação terminal e a

senescência natural (Freshney, 2000).

O desenvolvimento de linhagens celulares é frequentemente difícil. A cultura

primária, em geral, não é capaz de propagarem-se devido à nutrição. Apesar disso,

alguns tumores podem ser subcultivados e outros se imortalizam, ou seja,

estabelecem linhagens celulares continuas (Freshney, 2000).

2.7. Citotoxicidade

Definições de citotoxicidade variam, dependendo da natureza do estudo ou

simplesmente da indução das alterações metabólicas. Enquanto um agente

antitumoral pode ser requerido para destruir a célula, demonstrações da toxicidade

de outros fármacos podem requerer análises de mudanças metabólicas ou uma

alteração de sinalização célula-célula, que poderia promover um aumento

inflamatório ou uma resposta alérgica (Flint, 1998 apud Silveira-Lacerda, 2003).

De acordo com Freshney (2000), uma vez que uma célula é retirada de um

ambiente normal in vivo, a questão da viabilidade, particularmente no curso de

manipulação experimental, é fundamental.

Novas drogas, cosméticos e outros compostos químicos partem para os seus

extensivos testes de citotoxicidade. Estes testes normalmente envolvem um grande

número de animais experimentais, embora na Europa, estes experimentos estejam

sujeitos à nova legislação. Existem muitas pressões, sociais e econômicas, para se

desenvolver ao menos parte dos testes de citotoxicidade in vitro. A introdução de

linhagens de células especializadas e culturas organotípicas interativas e o uso


contínuo de culturas estabelecidas podem fazer com que estas propostas sejam

razoávies (Mather, 1998; Freshney, 2000; Moraes et al., 2007).

A toxicidade é um complexo evento in vivo, onde pode haver dano celular

direto, como uma droga anticancerígena citotóxica, efeitos fisiológicos como

transporte através de membrana no fígado, neurotoxicidade no cérebro, efeitos

inflamatórios e outros efeitos sistêmicos. Normalmente é difícil monitorar os efeitos

sistêmicos e fisiológicos in vitro, só que muitos ensaios determinam efeitos a nível

celular ou citotoxicidade. Definições de citotoxicidade variam, dependendo da

natureza do estudo, da mortalidade ou simplesmente da indução das alterações

metabólicas. Enquanto um agente anticancerígeno pode ser requerido para destruir

células, demonstrações da toxicidade de outros fármacos podem requerer análises

de mudanças metabólicas ou uma alteração de sinalização célula-célula, que

poderia promover um aumento inflamatório ou resposta alérgica (Flint, 1998; Moraes

et al., 2007).

Hoje, ensaios citotóxicos são bastante simplificados, baratos e fáceis de

quantificação e reprodução. Embora alguns autores considerem inadequados para o

desenvolvimento de novas drogas, por requererem boa ênfase na especialidade do

alvo molecular e uma precisa regulação metabólica, testes de citotoxicidade são

ainda relevantes, mas é bastante evidente a necessidade de suplementar com

testes refinados que levem a possíveis intervenções metabólicas (Silveira-Lacerda,

2003).

É importante que muitas medidas in vitro possam ser interpretadas em termos

de resposta in vivo das células, ou ao menos que as diferenças existentes entre os

parâmetros in vitro e in vivo sejam claramente compreendidas. Uma resposta tóxica

pode ser medida por alteração na sobrevida ou no metabolismo, enquanto que o


maior problema in vivo pode ser uma resposta tecidual ou sistêmica. Para que testes

in vitro sejam mais efetivos, modelos de respostas devem ser construídos, talvez

utilizando culturas organotípicas reconstruídas de vários tipos de células diferentes e

cultivadas em hormônios apropriados (Mather, 1998; Freshney, 2000).

Tecidos complexos e reações sistêmicas não deveriam ser assumidos, pois

não são simuladas in vitro. Ensaios para respostas inflamatórias, desordens

teratogênicas e disfunções neurológicas podem trazer um provável desentendimento

de interção célula-célula e a interação de hormônios endócrinos (Freshney, 2000).

De acordo com Flint (1998), testes in vitro são usados na avaliação do

potencial de toxicidade ou como parte de uma investigação do mecanismo de

identificação previa na toxicidade in vivo. Por exemplo, nos estágios iniciais de

descobertas farmacêuticas, quando o mínimo é conhecido sobre as propriedades de

uma nova molécula, simples triagens preditivas são apropriadas. Desta maneira, as

triagens de toxicidade são rotineiramente usadas para detectarem novas drogas

citostáticas e antitumorais, e também em outros programas de descobertas de

drogas para determinar se a toxicidade é induzida nas concentrações que tenham o

efeito farmacológico desejado. Desta forma, a descoberta de que os compostos de

Rutênio (III) podem apresentar atividade antitumoral, eleva a necessidade de

investigações sobre os possíveis efeitos em relação ao mecanismo de ação.

Justificativa 61

3. JUSTIFICATIVA

O conhecimento da biologia celular e molecular do câncer tem permitido aos

pesquisadores buscar novos alvos terapêuticos para tratar esta doença e minimizar

seus efeitos tóxicos sistêmicos sobre as células saudáveis. O interesse por novos

fármacos antitumorais a base de metais vem crescendo nestes últimos anos, devido

aos bons resultados obtidos por grupos de cientistas. Estudos revelam que os

complexos de rutênio apresentam uma incrível capacidade de inibir a mitose, o que

pode estar relacionado com a inibição da síntese de DNA, o bloqueio do ciclo celular

na fase G2 ou até mesmo nos processos de expressão gênica.

A habilidade de modular o recebimento e a liberação de mensageiros

celulares e outras moléculas intercelulares, como, por exemplo, o Ca2+ revela que as

ações realizadas pelos complexos de Ru(II) e Ru(III) na célula pode ser mais

complexo e amplo do que se espera, abrindo um importante caminho para se

entender os mecanismos pelos quais os complexos coordenados desempenham

suas atividades no ambiente celular, conhecimento este que é crucial para o

sucesso da aplicação clínica destes complexos.

O estudo com o complexo Ditionato cis-Tetraamino(oxalato)rutênio(III), por

apresentar principalmente atividade antitumoral in vivo, leva a necessidade de se

realizar uma triagem citotóxica e antitumoral em novas linhagens de células tumorais

e normal ainda não testadas. Isto pode conduzir a uma avaliação mais profunda e

detalhada de forma a permitir a compreensão das diferentes propriedades químicas

e biológicas desse novo composto. Estudando os possíveis efeitos biológicos,

toxicológicos, na estabilidade genômica; o mecanismo de ação, pode-se levar ao

desenvolvimento de fármacos com atividades mais acentuadas e toxicidade

Justificativa 62

diminuída em relação aos fármacos antitumorais atualmente utilizados pela

medicina.

Trata-se de um composto de Rutênio(III), sintetizado no Instituto de Química

da Universidade Federal de Uberlândia que iniciou seus estudos no Laboratório de

Genética Molecular e Citogenética da Universidade Federal Goiás com pesquisas in

vivo. Vê-se a necessidade de estudos pré-clínicos in vitro para maiores

investigações do mecanismo de ação deste complexo de rutênio se tornam

importantes para que se possa definir seu potencial clínico, contribuindo para o

desenvolvimento de uma nova possível droga antitumoral, com propriedades

complementares àquelas exibidas pelos fármacos utilizados na clínica atual.

Objetivos 63

4. OBJETIVOS 4.1. OBJETIVO GERAL

O objetivo geral do presente estudo foi avaliar o potencial citotóxico,

genotóxico, apoptótico e antitumoral de um novo composto a base de rutênio, o

Ditionato de cis-Tetraamino(oxalato)rutênio(III) como substância bioativa de origem

sintética utilizando diferentes linhagens celulares in vitro.

4.2 OBJETIVOS ESPECÍFICOS

• Avaliar o efeito inibidor da proliferação celular e potencial genotóxico,

utilizando células meristemáticas de Cebola (Teste Allium cepa);

• Avaliar o efeito inibidor da proliferação celular em linhagens de células

neoplásicas humanas in vitro K-562 (leucemia mielóide crônica), A-549

(carcinoma alveolar de pulmão humano);

• Avaliar o efeito inibidor da proliferação celular em linhagem de células

humanas normais in vitro MCR5 (fibroblasto de pulmão humano);

• Avaliar o efeito do composto de rutênio no ciclo celular e efeito apoptótico,

utilizando citometria de fluxo em linhagens de células neoplásicas;

• Avaliar o nível de degradação de DNA das células tratadas ou não com

diferentes concentrações do composto de Rutênio por meio do teste cometa.

Metodologia 64

5. METODOLOGIA 5.1. Síntese do Composto Ditionato de cis-Tetraamino(oxalato)rutênio(III)

O composto Ditionato de cis-Tetraamino(oxalato)rutênio(III) foi sintetizado no

Laboratório de Química Supramolecular do Instituto de Química da Universidade

Federal de Uberlândia (UFU), seguindo os procedimentos descritos por Gleu &

Breuel (1938) com algumas modificações adaptadas por Pavanin (1989).

Resumidamente, 1 grama (3,4x10-3 moles) de (RuCl3) foi adicionado a 25 mL de

hidróxido de amônio concentrado e previamente desaerados com argônio. A mistura

foi então refluxada sob argônio até a dissolução do sólido e aparecimento de uma

coloração rosada. Em seguida, adicionou-se 0,7g de Ditionato de sódio à solução

quente, sendo esta em seguida resfriada em banho de gelo, havendo então o

aparecimento de um sólido amarelo-avermelhado {(RuOH(NH3)5}2S2O6), que foi

coletado por filtração, lavado com pequenas quantidades de etanol e éter e secado

ao ar. Uma segunda porção de cristais foi obtida por adição de etanol (50mL). Este

material foi coletado por filtração, lavado com etanol e eter e secado ao ar. O

{(RuOH(NH3)5}2S2O6) foi dissolvido em ácido oxálico saturado (11 mL). A solução foi

então refluxada por aproximadamente 10 minutos sob lâmpada de argônio, havendo

o aparecimento de um precipitado amarelo (cis-[Ru(C2O4(NH3)4]2(S2O6)), a mistura

foi então resfriada para completar a precipitação. Os cristais de (cis-

[Ru(C2O4(NH3)4]2(S2O6)) foram isolados por filtração, lavados com etanol e éter, e

secados ao ar. O (cis-[Ru(C2O4(NH3)4]2(S2O6)) foi dissolvido em HCl a 5 molar

(12mL) e a solução foi refluxada por 10 minutos. A solução foi filtrada a quente e 30

mL de etanol foram adicionados ao filtrado. A solução foi resfriada, havendo então a

formação do sólido, que foi coletado por filtração, lavado com etanol e éter e secado

ao ar, resultando em um rendimento final de 55%.

Metodologia 65

O composto foi caracterizado por espectroscopia na região do ultravioleta,

utilizando um espectrofotômetro HP 8453 com arranjo de diodos, com interface PC

compatível com um HP Vectra XM, apresentando suas bandas características em

312 e 350 nm. Depois de sintetizado, o composto foi posteriormente encaminhado

ao Laboratório de Genética Molecular e Citogenética (UFG) para os estudos in vitro.

5.2. Teste Allium cepa

Os efeitos de inibição do crescimento de células meristemáticas de cebola

foram avaliados de acordo com o protocolo definido por Fiskesjö (1993).

Resumidamente, catáfilos de cebolas, de tamanho, forma e cores similares, além de

peso médio de 90g, foram colocados em água filtrada, trocada a cada 24h e

guardados em temperatura constante de 25o C, com fluxo de ar contínuo, por 120

horas. Os bulbos foram então pesados e suas raízes contadas e medidas

diariamente para estudo de controle morfológico. Uma vez que as raízes atingiram o

tamanho de 4 a 5 cm, as cebolas foram colocadas em uma solução aquosa

contendo Ditionato de cis-Tetraamino(oxalato)rutênio(III) nas concentrações de 0,01

mg.mL-1 (38 μM), 0,05 mg.mL-1 (190 μM) e 0,1mg.mL-1 (380 μM) por 24 e 48 h,

sendo que a solução foi trocada a cada 24 horas. Antes da exposição à solução de

rutênio, um quarto das raízes de cada bulbo foi coletada para compor o grupo do

controle negativo. Todos os testes foram repetidos em triplicata, sendo que cada

uma teve um grupo controle onde a solução de rutênio foi substituída por água

destilada, para controle negativo, e nitrato de chumbo(II) [50 μM de Pb(NO3)2], para

controle positivo. Dez raízes de cada bulbo foram coletadas em cada um dos

períodos e concentrações. Estas raízes foram colocadas em uma solução de

Carnoy’s [etanol (99%) e ácido acético glacial (3:1)] por 30 minutos, lavadas com

Metodologia 66

água destilada por três vezes e submetidas à hidrólise com solução aquosa de ácido

clorídrico (HCl) 1N a temperatura de 60°C. As raízes foram então secas e sua região

apical (aproximadamente 0,5 cm da região da ponta da raiz) foi macerada e então

corada com orceína acética. Para o estudo do índice mitótico (IM) e de aberrações

cromossômicas (AC), foram analisadas, em média, 5.000 células de cada bulbo. O

IM foi calculado para cada tratamento através da razão entre o número de células

em divisão divido por 100. Anormalidades celulares, assim como cromossômicas

(células binucleadas e polinucleares, micronucleos, pontes cromossômicas,

cromossômos atrasados e adiantados, cromossomos perdidos, má formação nuclear

e núcleos fragmentados) foram contadas nas células mitóticas e os resultados foram

plotados em tabelas e gráficos, para análise.

5.3. Droga antitumoral controle

Como controle positivo, utilizou-se as drogas Cisplatina (5 a 50 µM) e

Paclitaxel (5 a 50 µM) liofilizadas, obtida comercialmente da Sigma (Sigma-Aldrich

Co St Louis, MO, EUA).

5.4. Preparação do composto de Rutenio para ensaios biológicos in vitro

O composto Ditionato de cis-Tetraamino(oxalato)rutênio(III) foi pesado e

dissolvido em meio de cultura RPMI 1640 ou DMEN suplementado com 10% de soro

bovino fetal na concentração de 2mg.mL-1 (Solução estoque). Posteriormente foi

submetido a um ultra-som para dissolução completa e então o composto foi

esterilizado por filtração em membranas de 0,22 µm. Como controle positivo, foi

utilizado as drogas Cisplatina (50 µM) e Paclitaxel (25 µM).

Metodologia 67

5.5. Meio de cultura celular

Para a manutenção das linhagens de células tumorais, a dissolução dos

compostos testados e a realização dos ensaios biológicos seguiram o protolocolo

indicado pelo American Type Culture Collection (ATCC Rockville, Maryland, EUA)

utilizando-se meio RPMI-1640 ou DMEM (Sigma, St. Louis, MO, EUA) suplementado

com 10% de soro bovino fetal (Gibco®, Invitrogen, Carlsbad, CA, EUA) e 1% de

glutamina, eritromicina e estreptomicina (Sigma) em estufa com 5% de CO2 a uma

temperatura constante de 37ºC. O meio RPMI 1640, DMEM e o soro fetal bovino

foram adquiridos da Gibco® (Invitrogen, Carlsbad, CA, EUA). Os antibióticos foram

adquiridos da Sigma (Sigma-Aldrich Co St Louis, MO, EUA ).

5.6. Linhagens celulares tumorais e normais

Foram utilizadas às seguintes linhagens tumorais: K562 (leucemia mielóide

crônica), MCR-5 (fibroblasto de pulmão humano) e A549 (câncer de pulmão

humano) provenientes do American Type Culture Collection (ATCC Rockville,

Maryland, EUA).

5.7. Cultura de células tumorais

As células tumorais foram cultivadas em frascos para cultivo celular estéreis

com 75 e 175 cm2, contendo meio RPMI 1640 ou DMEN (de acordo com a

caracterista de cada linhagem), acrescentado de glutamina 2 µmol.L-1, bicarbonato

de sódio 10 mmol.L-1 e soro fetal bovino 10% (v/v), seguindo o protocolo da ATCC

(American Type Culture Collection). Para fins experimentais, as células foram

cultivadas em microplacas de 96 poços, fundo chato com tampa, na presença ou

ausência cisplatina ou Ditionato de cis-Tetraamino(oxalato)rutênio(III) conforme as

Metodologia 68

concentrações descritas anteriormente. As células foram incubadas em estufa a

37ºC com atmosfera contendo 5% de CO2.

Para a realização dos ensaios, previamente as linhagens tumorais aderentes

em fase de crescimento logarítmico foram removidas dos frascos de cultura celular

pela adição de 1 mL de tripsina 0,5% em solução tampão Fosfato 0,01 mol.L-1, pH

7,2 em solução salina 0,9% (PBS). Os frascos com solução de tripsina foram então

mantidos sob agitação manual por aproximadamente 60 segundos. Em seguida,

foram adicionados 10 mL de meio completo para neutralizar a tripsina e transferidos

para tubos plásticos.

Para células em suspensão, as mesmas foram retiradas diretamente das

garrafas e transferidas para tubo Falcon para procedimento de lavagem. As células

foram lavadas três vezes por meio da centrifugação a 1000 rpm por 10 minutos em

meio completo. Ao final da última lavagem, as células foram ressuspendidas em 5

mL de meio RPMI completo. Uma alíquota de 10µL da suspensão celular foi

colocada em 90 µL de Azul de Tripano 1% (m:v) (Sigma-Aldrich Co St Louis, MO,

EUA) e contadas em hemocitômetro (Câmara de Neubauer).

5.8. Avaliação do potencial citotóxico e antitumoral (inibição de proliferação

celular)

Para realização do estudo de citotoxicidade sobre as linhagens celulares

tumorais e normais, foram empregados três diferentes ensaios: método de redução

do tetrazólio (que avalia a atividade mitocondrial), o método de viabilidade por azul

de tripano (que avalia a integridade da membrana celular) e o ensaio de

sobrevivência clonogênica (ou eficiência de clonagem) em linhagens celulares (que

avalia se o agente é potencialmente genotóxico). Em todos os ensaios as células

Metodologia 69

foram incubadas com as diferentes concentrações do complexo de rutênio(III). As

mesmas foram incubadas em estufa úmida com 5% de CO2 por 48 h.

• Método de redução do tetrazólio

Para avaliar a atividade citotóxica e antitumoral do composto Ditionato de cis-

Tetraamino(oxalato)rutênio(III) foi utilizado o método colorimétrico do MTT. O

princípio deste método descrito por Mosman (1983) consiste em medir indiretamente

a viabilidade celular pela atividade enzimática mitocondrial das células vivas. Para o

teste do MTT, 2×103 de células foram semeadas em microplacas de 96 poços na

ausência ou presença do composto Ditionato de cis-Tetraamino(oxalato)rutênio(III)

ou cisplatina (droga controle) e incubadas por 24, 48 e 72 h em estufa a 37ºC com

atmosfera contendo 5% de CO2. Ao final do período de incubação, foi adicionado

aos poços de cultivo celular 10 μL de MTT na concentração de 5mg.mL-1, e após 3 h

de incubação com o MTT, foram acrescentados 50 μL SDS a 10% diluído em

HCL/0,01N. A quantificação da densidade óptica (DO) foi medida em

espectrofotômetro (Awareness Technology INE/ Stat Fax 2100). A porcentagem de

viabilidade celular foi determinada a partir da seguinte fórmula:

% Viabilidade = (Absorbância do Tratamento)/(Absorbância do controle negativo)

×100%

• Método de viabilidade por azul de tripano

A viabilidade celular após exposição às drogas pode ser medida pela exclusão

de corantes supravitais como o azul de tripano. O princípio deste teste consiste em

medir indiretamente a viabilidade celular através da integridade de membrana, onde

as células mortas que apresentam a membrana danificada absorvem este corante e

Metodologia 70

consequentemente coram-se em azul, já as células vivas permanecem intactas sem

coloração. Para o ensaio de azul de tripano, foram realizados os mesmos

procedimentos de plaqueamento e período de incubação como os realizados no

ensaio do MTT. No entanto, ao final do período de incubação, alíquota de 10 μL de

suspensão de células foram colocadas em 40 μL de azul de tripano a 1%, e desta

solução foi retirada uma alíquota para análise em câmara de neubauer, segundo

Peres & Curi (2005). Para determinar a porcentagem de viabilidade celular foi

utilizada a mesma fórmula descrita no item anterior. Ambos os ensaios MTT e Azul

de tripano foram utilizados para calcular o valor da concentração que inibe 50% do

crescimento celular (IC50) Para os ensaios, foram realizados três experimentos

independentes feitos em triplicata.

• Ensaio de sobrevivência clonogênica

Para analisar a capacidade proliferativa de células de formarem colônia após

exposição a um determinado agente antiproliferativo utiliza-se o ensaio de

sobrevivência clonogênica. O ensaio de sobrevivência clonogênica foi realizado

segundo Bezerra et al. (2008), onde 3×102 de células tumorais A549 foram

semeadas em frascos de cultura de 25 cm2 por um período de 24 h para aderência

das células, após este período foi retirado todo o meio celular e em seguida as

células foram tratadas com diferentes concentrações do composto Ditionato de cis-

Tetraamino(oxalato)rutênioIII (0,15 a 150 µM) por 24 e 48h. Após os períodos de

tratamento as células foram lavadas com solução de PBS para retirada do composto

e em seguida foi adicionado meio às garrafas. Posteriormente as células foram

incubadas por 10 dias, sendo as culturas observadas diariamente com o auxílio de

microscópio invertido (Leica). Ao final dos 10 dias de incubação o meio foi

Metodologia 71

descartado e as células lavadas com solução de PBS. Em seguida as células foram

fixadas com uma solução de metanol/ácido acético/água por 30 min, após período

de fixação as células foram coradas com Giemsa por 15 min. Para análise das

colônias a garrafas foram escaneadas em impressora (HP) e posteriormente foi feito

a análise com o auxílio do software Clono-Couter (Niyazi et al., 2007).

5.9. Ensaio cometa

O ensaio cometa é um método versátil e sensível para a detecção de quebras

de fita simples e dupla no DNA. Ele tem sido amplamente utilizado como uma

ferramenta para avaliações das respostas celulares aos danos no DNA, podendo ser

aplicado em estudos de genotoxicidade, biomonitoramento, ecotoxicológicos e ainda

alguns estudos que envolvem saúde humana (Tice et al., 2008).

Umas das maiores vantagens do Ensaio Cometa é a possibilidade de sua

aplicação em diferentes tipos celulares que não necessariamente estejam em

proliferação, tanto in vitro quanto in vivo (Collins et al.,1997; Trzeciak et al., 2008). A

versão alcalina do cometa (single-cell gel electroforesis) foi seguida de acordo com

Singh et al., (1988), com pequenas modificações.

As linhagens celulares foram quantificadas e depois foram tratadas com

concentrações diferentes do Ditionato de cis-Tetraamino(oxalato)rutênio(III), controle

positivo (Cisplatina) e negativo, por 24, 48 e 72 horas e então homogeneizados e

misturados em agarose low-melting (baixa fusão) e imediatamente colocada em uma

lâmina que já continha uma camada de gel de agarose a 1%. A lâmina com as duas

camadas de agarose foi colocada a 4°C por 5 minutos. Após foram incubadas em

uma solução de lise (2,5M NaCl, 10mM Tris, 100mM EDTA, 1% Triton X-100 and

10% DMSO, pH10,0) e colocada a 4°C por duas horas para remover proteínas e

Metodologia 72

membranas. Posteriormente, as lâminas foram colocadas na eletroforese com

tampão (300mM NaOH, 1mM EDTA, pH > 13,0). A corrida de eletroforese foi por 20

minutos, a 0,9 V/cm, 300 mA e a 4°C. Todo o procedimento foi realizado no escuro

ou sob luz amarela, de forma a prevenir danos ao DNA. As lâminas foram

mergulhadas em solução de neutralização (0,4M Tris, pH 7,5), lavada com água

destilada e secas a temperatura ambiente.

As lâminas foram preparadas em duplicatas e 100 núcleos analisados (50

núcleos para cada duplicata) utilizando microscópio de fluorescência (Leica)

equipado com filtro de excitação de 515-560nm, um filtro de barreira de 590nm, e

objetiva de 40x.

Figura 12 – Classificação de leitura para o Ensaio Cometa: ausência de cauda, ou seja, sem dano (classe 0); cauda menor do que o diâmetro da cabeça, muito pouco dano (classe 1); cauda até duas vezes o diâmetro da cabeça, pouco dano (classe 2): cauda maior que duas vezes o diâmetro da cabeça, alto dano (classe 3) e sem cabeça, dano máximo (classe 4) (Ribeiro et al., 2009).

Os núcleos sem danos no DNA apareceram intactos e sem cauda. Os

cometas foram classificados pelo software CometScore 15, em classes: ausência de

Metodologia 73

cauda, ou seja, sem dano (classe 0); cauda menor do que o diâmetro da cabeça

(classe 1); cauda até duas vezes o diâmetro da cabeça (classe 2): cauda maior que

duas vezes o diâmetro da cabeça (classe 3) e sem cabeça (classe 4) (Figura 12). As

recomendações para o ensaio cometa consideram tanto avaliações visuais quanto

as avaliações usando software (Burlinson et al., 2007). O total da contagem dos

danos foi de 100 por amostra, perfazendo um total de 500 núcleos (desde a

classificação 0 – sem danos – até classificação 4 – danos totais).

5.10. Citometria de fluxo: Avaliação das fases do ciclo celular e apoptose

O estudo de apoptose tem alterado a maneira de se encarar a ação

antineoplásica de agentes quimioterápicos. Há evidências de que ação antitumoral

de muitas drogas se deve em maior parte à sua ação sobre o limiar de apoptose do

que no potencial destrutivo celular. Desta forma, foram realizados estudos de

apoptose e o potencial antimitótico das células tumorais citadas anteriormente após

tratamentos com diferentes concentrações de rutênio.

• Avaliação da cinética do ciclo celular

Previamente, 5×105 de células tumorais foram cultivadas por 24, 48 e 72

horas na presença ou ausência de Ditionato de cis-Tetraamin(oxalato)rutênio(III). Ao

final do período de incubação, as células tumorais foram coletadas em tubos para

citometria de fluxo, lavadas por três vezes a 900 rpm/5 minutos/10ºC em solução

PBS contendo 1% de soro fetal bovino. Ao final da última lavagem, o sobrenadante

foi desprezado, o “pellet” celular foi levemente agitado e incubado com 3 mL de

MeOH 100%/60 minutos/4ºC. As células foram novamente lavadas uma vez em

solução de PBS a 900 rpm/5 minutos/10ºC, o sobrenadante desprezado e o “pellet”

Metodologia 74

celular ressupendido em 50 µL com solução corante de iodeto de propidio contendo

RNAse 20 µg.mL-1 de RNAse e 10 mg.mL-1 de Iodeto de propídio diluído em PBS.

As células foram incubadas por 30 minutos/4ºC em ambiente escuro e, ao final do

período de incubação, lavadas por mais 3 vezes em solução de PBS, o “pellet”

celular suspendido em 1mL de PBS e levadas para análise no citômetro de Fluxo

FACS Canto II (Becton Dickinson, Franklin Lakes, NJ, EUA).

4.11. Eletroforese em gel de agarose

As células de linhagens tumorais e normais foram incubadas com diferentes

concentrações da droga em estudo durante 48 h, em estufa úmida, com 5% de CO2

no ar. Uma quantidade de 2×106 células foram tratadas com diferentes

concentrações de cis-[Ru(C2O4)(NH3)4]2(S2O6) (de 0,15 a 150 µM) por 24 horas a 37

°C e 5% CO2. As células foram então retiradas do tratamento e centrifugadas a

300×g/15 min/10°C e lavadas com PBS. As células foram então ressuspendidas a

uma concetração de 1×106 cells mL-1 em um tampão de extração (Tris-HCl a 1

molar, Na2EDTA a 2 molar, 0,5mg L-1 de SDS) e tratadas com 20 mg L-1 de RNase A

a 37°C por 60 minutos. Passado o tempo, as células foram então incubadas com

proteinase K (100 mg L-1) a 37°C por 60 minutos. Depois da digestão por proteinase

K, foi adicionada solução salina (NaCl a 6 M) e centrifugada a 13,000×g por

10minutos. O sobrenadante foi então coletado e um volume igual de etanol (-20°C)

foi adicionado. As amostras foram então centrifugadas a 13,000×g por 30 minutos a

4°C. O sobredante foi então descartado e os pellets dissolvidos em tampão TE (1×)

e guardados em ultra-freezer (-80°C) até o momento de uso.

A concentração de DNA foi detectada por UV utilizando um espectrofotômetro

(Beckman DU-640, EUA). O DNA (5 µg por tubo) foi transferido para um gel de

Metodologia 75

agarose a 1,5%, que foi submetido a uma eletroforese a 100V cm-1 por 90 minutos.

O DNA nos géis foram visualizados através de transiluminação por ultravioleta, após

a coloração por brometo de etídio (5 µg mL-1) utilizando um sistema de imageamento

Omega® (UltraLum Inc., Claremont, CA, EUA).

4.12. Análise Estatística

Os resultados, expressos através de Média ± DP (ou EPM) e Mediana, foram

organizados e apresentados na forma de gráficos, tabelas, quadros e figuras. A

distribuição de freqüência foi obtida por meio da aplicação do teste do Qui-quadrado

(χ2) sob IC 95%.

Todas as variáveis sob estudo foram testadas para a hipótese de

normalidade. Para verificar diferenças significativas entre os grupos estudados

(toxicidade, anti-inflamatório e antitumoral), foram aplicados através de softwares

(GraphPad Prisma ou SPSS), os testes de análise de variância (ANOVA). Quando

detectada diferença significativa entre os grupos, foi aplicado o teste “t” de Student e

o teste de contraste de Tukey.

A variabilidade ou dispersão dos dados obtidos para um determinado

parâmetro foi medida através da faixa de variação ou range (diferença entre o valor

máximo e o valor mínimo), desvio-padrão da média e variância. Para todos os

grupos, consideram-se estatisticamente significativos quando p<0.

Produção Científica 76

5. PRODUÇÃO CIENTÍFICA

ARTIGO 1 – Cytotoxic and Genotoxic Effects of cis-Tetraammine

(oxalato)Ruthenium(III) Dithionate on the Root Meristem Cells of Allium cepa.

Autores - Flávia de Castro Pereira, Cesar Augusto Sam Tiago Vilanova-Costa, Aliny

Pereira de Lima, Alessandra de Santana Braga Barbosa Ribeiro, Hugo Delleon da

Silva & Luiz Alfredo Pavanin, Elisângela de Paula Silveira-Lacerda.

Periódico Científico – Biological Trace Element Research, Springer.

Qualis Capes – B3 para Ciências Biológicas I

Situação – Publicado, Biol Trace Elem Res Biological (2009) 128, 258-268 DOI

10.1007/s12011-008-8272-y

ARTIGO 2 – Antitumor activity of the compound cis-

Tetraammine(oxalato)Ruthenium(III) Dithionate against human lung alveolar

carcinoma epithelial cells (A-549).

Autores - Flávia de Castro Pereira, Aliny Pereira de Lima, Cesar Augusto Sam Tiago

Vilanova-Costa, Alessandra de Santana Braga Barbosa Ribeiro, Lucas Carlos Gomes

Pereira, Luiz Alfredo Pavanin, Wagner Batista dos Santos, Elisângela de Paula

Silveira-Lacerda.

Periódico Científico – Journal of Trace Elements in Medicine and Biology, Elsevier.


Situação – Submetido ao periódico.

Produção Científica 77

ARTIGO 3 – Antitumor effects of the compound cis-

Tetraammine(oxalato)Ruthenium(III) Dithionate on K562 human erythroleukemia

cells.

Autores - Flávia de Castro Pereira, Aliny Pereira de Lima, Cesar Augusto Sam Tiago

Vilanova-Costa, Alessandra de Santana Braga Barbosa Ribeiro, Lucas Carlos Gomes

Pereira, Luiz Alfredo Pavanin, Wagner Batista dos Santos, Elisângela de Paula

Silveira-Lacerda.

Periódico Científico – Toxicology in Vitro, Elsevier.


Situação – Submetido ao periódico.

Artigo 1 78

Artigo 1 - Efeitos Citotóxico e Genotóxico do Ditionato de cis-Tetraamino(oxalato)Rutênio(III) em Células Meristemáticas de Raiz de

Allium cepa

Pereira, F. C.; Vilanova-Costa, C. A. S. T.; Lima, A. P.; Ribeiro, A. S. B. B.; Silva, H. D.; Pavanin, L. A.; Silveira-Lacerda, E. P.

Biol Trace Elem Res (2009) 128:258–268

DOI 10.1007/s12011-008-8272-y Resumo: Os complexos de Rutênio têm atraido muita atenção como futuros agentes

antitumorais baseados em metal de transição. O presente trabalho avalia os efeitos

mitotóxicos e clastogênicos induzidos pelo composto Ditionato de cis-

Tetraamino(oxalato)Rutênio(III) {cis-[Ru(C2O4)(NH3)4]2(S2O6)} em células

meristemáticas de raíz de cebola (Allium cepa), após difentes períodos de exposição

e concetração. Testes de correlação foram realizados de forma a se determinar a

influência do tempo de exposição e concentração do composto de Rutênio (III) sobre

p índice mitótico e índice de aberrações cromossômicas. A comparação entre os

Índices Mitóticos resultantes da exposição do meristema de cebola ao Ditionato de

Rutênio(III) e a Nitrato de Chumbo(II) revela que o complexo de Rutênio(III)

apresenta uma capacidade de inibição de mitose cerca de oito vezes maior que o

composto de chumbo, assim como um capacidade de causar aberrações

cromossômicas cerca de quatro vezes menor que o nitrato de chumbo. As células de

Allium cepa exposta a diferentes concentrações do complexo de Rutênio(III) não

mostraram ter sofrido efeitos clastogênicos significativos. O composto também

mostrou uma grande capacidade de inibir a mitose de células meristemáticas de

cebola, que pode estar associada à inibição da síntese de DBA ou pelo bloqueio do

ciclo celular, possivelmente na fase G2. Futuras inverstigações acerca do mecanismo

de ação deste complexo de Rutênio poderão auxiliar na determinação de seu

potencial clínico assim como contribuir para o desenvolvimento de um novo fármaco

antitumoral baseado em metal com propriedades complementares àquelas

mostradas pelas drogas antitumorais atualmente utilizadas na clínica médica.

Palavras-chave: Ditionato de cis-Tetraamino(oxalato)Rutênio(III), Citotoxicidade,

Genotoxicidade, Allium cepa, Compostos de Rutênio(III).

Artigo 1 79

Cytotoxic and genotoxic effects of cis-

Tetraammine(oxalato)Ruthenium(III) Dithionate on the root meristem cells

of Allium cepa

Flávia de Castro Pereiraa ([email protected])

Cesar Augusto Sam Tiago Vilanova-Costaa* ([email protected])

Aliny Pereira de Limaa ([email protected])

Alessandra de Santana Braga Barbosa Ribeiroa ([email protected])

Hugo Delleon da Silvaa ([email protected])

Luiz Alfredo Pavaninb ([email protected])

Elisângela de Paula Silveira-Lacerdaa ([email protected])

aLaboratório de Genética Molecular e Citogenética, Instituto de Ciências Biológicas,

Universidade Federal de Goiás - UFG, Goiânia, Goiás, Brazil.

bInstituto de Química, Universidade Federal de Uberlândia - UFU, Uberlândia, Minas

Gerais, Brazil.

*Corresponding Author: Cesar Vilanova-Costa, e-mail: [email protected]

Laboratório de Genética Molecular e Citogenética

Instituto de Ciências Biológicas - ICB I - Sala 200

Universidade Federal de Goiás

Campus Samambaia (Campus II)

Cx. Postal: 2425-0

Goiânia-GO, Brasil – 74690-970

Phone/Fax +55-62-3521-1481

Cell Phone +55-62-9901-0369

Artigo 1 80

Abstract

Ruthenium complexes have attracted much attention as building blocks for new

transition-metal-based antitumor agents. Present study determines the mitotoxic and

clastogenic effects induced in the root tips of Allium cepa by cis-

Tetraammine(oxalato)Ruthenium(III) Dithionate {cis-[Ru(C2O4)(NH3)4]2(S2O6)} at

different exposure periods and concentrations. Correlation tests were performed to

determine the Time (h) effect of the time of exposure and concentration of Ruthenium

complex on Mitotic Index (MI) and Mitotic Aberration Index (MAI). Comparing MI

results of cis-[Ru(C2O4)(NH3)4]2(S2O6) to lead nitrate, Ruthenium complex

demonstrate an average mitosis inhibition 8-fold higher than lead with cellular

abnormalities frequency almost 4-fold lower and mitotic aberration 3-fold lower.

Results of experiments did not show significant clastogenic effect on A. cepa root

cells exposed to Ruthenium complex at concentrations used. Cis-

Tetraammine(oxalato)Ruthenium(III) Dithionate shows a remarkably capacity to inhibit

mitosis that could be related to inhibition of DNA synthesis or blocking cell cycle in the

G2 phase. Further investigation of the action mechanisms of this Ruthenium complex

is important to define their clinical potential and to contribute to a rational approach for

possibly developing a new antitumor metal-based drug with antitumor properties

complementary to those exhibited by the drugs already in clinical use.

Key-words: Cis-Tetraammine(oxalato)Ruthenium(III) Dithionate; Citotoxicity;

Genotoxicity; Allium cepa; Ruthenium compounds.

Artigo 1 81

Funding sources

There are not any financial or personal interests that might be viewed as an

inappropriately influence to work presented. The attached manuscript, "Cytotoxic

and genotoxic effects of cis-Tetraammine(oxalato)Ruthenium(III) Dithionate on

the root meristem cells of Allium cepa " was completely financed by governmental

and non-profit institutions, Brazilian National Counsel of Technological and Scientific

Development (CNPq) and Research and Projects Finacing (FINEP).

Present work was supported by Research and Projects Finacing (FINEP)

(Grant No.01.06.0941.00/CT-Saúde to Elisângela de Paula Silveira-Lacerda) and by

Brazilian National Counsel of Technological and Scientific Development (CNPq)

through fellowships to Flávia de Castro Pereira (Grant No. 381302/2007-5), Cesar

Augusto Sam Tiago Vilanova-Costa (Grant No. 381303/2007-1) and Aliny Pereira de

Lima (Grant No. 370646/2007-0).

Ethical Approval

No studies involving human or experimental animals were conducted in this

work. Only meristematic cells of the onion (Allium cepa) were used. Technique is

suggested as model for environmental monitoring (Fiskesjö, 1985)

Artigo 1 82

1.0 Introduction

Several metallic compounds, recognized as potent antitumor agents, have

been developed and tested in vivo and in vitro (Menezes et al, 2007). Examples of

established antitumor metallodrugs, routinely clinically used, are cisplatin [cis-

diamminedichloroplatinum(II)] and its analogues carboplatin and oxaliplatin (Brabec &

Nováková, 2006). Nevertheless, its clinical utility have been proven limited due a

relatively narrow range of tumors and the development of acquired drug resistance.

Resistance to treatment can occur in certain disease types (ovarian and small cell

lung) or be present as intrinsic drug resistance in less-responsive disease types (non-

small cell lung and colon) (Wernyj & Morin, 2004; Karki et al, 2007). Furthermore,

cisplatin is administered intravenously due to its limited solubility in water and severe

side effects (Wong & Giandomenico, 1999).

Limitations of platinumbased complexes have prompted a search for more

effective and less toxic metal-based antitumor agents. Some of the efforts have been

directed in the design of non-platinum, transition-metal-based antitumor agents and

Ruthenium complexes have attracted much interest as alternative drugs to cisplatin in

cancer chemotherapy (Brabec & Nováková, 2006). During the last two decades a

number of Ruthenium (III) complexes have been synthesized and tested as

anticancer drugs (Kratz et al, 1994; Hartmann et al, 1995).

Ruthenium complexes have attracted much attention as building blocks for new

transition-metal-based antitumor agents. Ruthenium compounds offer the potential

over antitumor platinum(II) complexes currently used in clinic of reduced toxicity, a

novel mechanism of action, the prospect of non-cross-resistance) and a different

spectrum of activity (Zeller et al, 1991; Coluccia et al, 1993; Clarke, 2003; Alessio et

al, 2004). Non-cross-resistance in cisplatin resistant cancer cells and reduced toxicity,

Artigo 1 83

which is in part due to the ability of Ruthenium complexes to mimic the binding of iron

to molecules of biological significance, exploiting the mechanisms that the body has

evolved for non-toxic transport of iron, is a particularly attractive feature of Ruthenium

complexes (Allardyce et al, 2003). In addition, some chemical properties, such as rate

of ligand exchange, range of accessible oxidation states, and ability of Ruthenium to

mimic iron in binding to certain biological molecules make these compounds well

suited for medicinal applications as an alternative to platinum antitumor. Hence,

complexes based on Ruthenium have been proposed as potential antitumor activity

and antimestastatic behavior, showing lower systemic toxicity than platinum com-

pounds (Grguric-Sipka et al, 2003).

Plant bioassays, which are more sensitive and simple than most methods used

to detect the genotoxic effects of environmental pollutants, have been validated in

international collaborative studies under United Nations Envoronmental Program

(UNEP), World Health Organization (WHO) and United States Environmetal Protetion

Agency (US EPA), and demonstrated to be efficient tests for monitoring the

genotoxicity of environmental pollutants (Grant, 1999; Wu et al, 2007). Since Levan

introduced the first Allium test in year 1938, various chemicals have been tested for

their cytogenetic activities using this test (Türkoğlu, 2008). The test allows

investigation of universal mechanisms for meristematic plant cells permitting

extrapolation on animal cells providing valuable information in relation to possible

genotoxicity effect of several chemicals in mammals and especially in human (Yi et al,

2007; Levan, 1938; Ma, 1999).

For the purpose of evaluating the citotoxic effect induced by cis-

Tetraammine(oxalato)Ruthenium(III) Dithionate {cis-[Ru(C2O4)(NH3)4]2(S2O6)} and the

relevance of its biological activity, this study was carried out to determine the mitotoxic

Artigo 1 84

and clastogenic effects induced in the root tips of Allium cepa by the chemical at

different exposure periods and concentrations. Study results will contribute to a better

understanding of the action mechanism of cis-Tetraammine(oxalato)Ruthenium(III)

Dithionate upon the cellular system.

2.0 Materials and Methods

2.1. Cis-[Ru(C2O4)(NH3)4]2(S2O6) synthesis.

Cis-[Ru(C2O4)(NH3)4]2(S2O6) complex was prepared as follows procedure.

PentaamminechloroRuthenium(III) dichloride (1.0 g, 0.0034 mol) was refluxed in

deaerated concentrated ammonium hydroxide (25 ml) under a blanket of argon until

the solution turned dark pink. A stoichiometric amount of sodium Dithionate (0.70 g,

0.0034 mol) was then added to the hot solution from which, upon stirring in an ice

bath, precipitated pentaaminehydroxoRuthenium(III) Dithionate. Addition of 100%

ethanol completely precipitated the salt (1.2 g) which was filtered and air dried. The

off-white salt was dissolved in a saturated solution of oxalic acid dihydrate (12 ml),

and the mixture was refluxed under argon for about 5 min until a yellow solid

precipitated and the mother liquor turned brown. The mixture was cooled and the

yellow cis-Tetraammine(oxalato)Ruthenium(III) Dithionate was collected by filtration,

washed with ethanol and air dried. The compound was characterized by electronic

spectra at room temperature with HP 8453 spectrophotometer with diodes

arrangement, interfacing a compatible PC HP Vectra XM, using quartz cells. The

electronic spectra of the TetraammineoxalatoRuthenium(III) Dithionate complex

synthesized presenting bands in 260 and 350 nm. Carbon and hydrogen

Artigo 1 85

amicroanalyses were performed by the staff of the Central Analítica of the Chemistry

Institute of Universidade de São Paulo.

2.2. Allium cepa test (Onion test) preparation

Onion meristems (A. cepa) were used as study material. They are considered

one of the best biological models for the study of environmental pollutants (Fiskesjö,

1987). Onions are easy to store and to handle, and the root tip cells constitute a

convenient system for macroscopic (growth, EC50 values) as well as for microscopic

parameters (c-mitosis, stickiness, chromosome breaks). Since these cells possess

important plant activation enzymes, the Allium test has a wide area of application.

Furthermore, results from the test have shown good agreement with results from

other test systems, like eukaryotic as well as prokaryotic (Fiskesjö, 1987; Fiskesjö,

1993).

Inhibitory effects on root growth of onion bulbs (A. cepa) were tested according

to the methods defined by Fiskesjö (Fiskesjö, 1993). Briefly, onion bulbs, similar in

size, shape and color, with average weight of 90g were placed in filtered water,

changed every 24h and kept at a constant temperature of 25oC, with a continuous

airflow, for 120 hours. Bulbs were weighted and their roots counted and measured

daily for morphological control group data.

Once the roots had reached a average length of 4–5cm, they were placed in an

aqueous solution of cis-Tetraammine(oxalato)Ruthenium(III) Dithionate at

concentrations of 0,01 mg.mL-1 (38 μM), 0,05mg.mL-1 (190μM) and 0,1mg.mL-1

(380μM) for 24 and 48 h, the solution was changed every 24h. Prior to Ruthenium

complex exposition, a quarter of roots of every bulb were colleted for negative control.

All the tests were repeated, and each had a control, in which the solution of

Artigo 1 86

Ruthenium complex was substituted with distilled water as negative control and lead

(II) nitrate [50 μM Pb(NO3)2], as positive control. Additionally, bulbs were weighted

and their roots counted and measured daily for exposed group morphological data.

2.3. Preparation of root tip cells and Mitotic index determination.

All the experiments were carried out when the roots reached 4–5cm in length.

Ten roots were cut for each exposition period and concentration. They were placed in

Carnoy’s solution [ethanol (99%) and glacial acetic acid (3:1)] for 30 minutes, washed

with distilled water three times and submitted to hydrolysis with aqueous solution of

chloridric acid (HCl) 1N at 60°C temperature. Roots were dried and their apical

regions (approximately 0.5cm of root tip) were macerated and then dyed using acetic-

hydrochloric orcein. For the study of the mitotic index (MI), chromosomal aberrations

(ChA), an average amount of 5,000 root tip cells for each bulb were used in analysis.

The MI was calculated for each treatment as a number of dividing cells/100 cells.

Cytological abnormalities were scored in the mitotic cells and the results were

tabulated. Most abnormalities were presented with micrographs.

2.4. Statistical Analysis

The values of mean and standard deviation (S.D.) were obtained from the

results of 4 bulbs for each experimental group. Correlation tests were performed to

determine the Time (h) effect of the period of exposure and concentration of

Ruthenium complex on Mitotic Index (MI) and Mitotic Aberration Index (MAI). One-

way analysis of variance (ANOVA) and Dunnet’s t test were used to determine

significant difference (F=19.04, P<0.01) among groups exposed to Ruthenium

complex, lead nitrate (CAS 10099-74-8) (positive control) and purified water (CAS

Artigo 1 87

7732-18-5)(negative control). Statistical analyses were preformed and graphics were

done using GraphPad Prism 4 computer program (1992-2005 GraphPad Software,

Inc.)

3. Results and Discussion

3.1. Effect of Ruthenium complex on mitotic index

The mitotic index permits estimate the frequency of cellular division. The

inhibition of mitotic index can be attributed to effects of the environment chemicals on

DNA/protein synthesis of the biological system. These effects are manifested by

induction of interphase arrest or cell death.

Results derived from analysis of the effect of concentration and time of

exposure to Ruthenium complex show a decrease of the MI in the exposed roots (Fig.

1) dependent to concentration and period of treatment.

Results of multivariate tests on the MI in root tips of A. cepa exposed to

Ruthenium complex were signficant (*p<0.01). At this point, Ruthenium concentration

showed be more effective than time exposure. This could indicate that subjecting the

root tips to high concentrations for a short period of time is more effective than

Artigo 1 88

exposing them to low concentrations for longer periods. The effect is cumulative, with

a nearly complete inhibition of mitosis at the concentration of 0.1mg.mL-1 or higher for

periods longer than 24h.

Several chemicals have been reported to inhibit mitosis (Türkoğlu, 2008; El-

Ghamery et al, 2000). Reduction in the mitotic activity could be related to inhibition of

DNA sythesis or blocking cell cycle in the G2 phase, preventing the cell from entering

mitosis (Türkoğlu, 2008; Van’t Hof, 1968; Sudhakar et al, 2001). This suggest that cis-

[Ru(C2O4)(NH3)4]2(S2O6) may cause inhibition of DNA synthesis.

Silveira-Lacerda studying the effects of cis-

Tetraammine(oxalato)Ruthenium(III) Dithionate on Jurkat cells, found that Ruthenium

compound has the ability to block those cells on G2 phase (data not published yet),

hindering cells to enter in mitosis and the decreasing the tumour growth (Silveira-

Lacerda, 2003).

Comparing MI results of cis-[Ru(C2O4)(NH3)4]2(S2O6) to lead nitrate, Ruthenium

complex demonstrated an average mitosis inhibition 8-fold higher than lead with

cellular abnormalities frequency almost 4-fold lower and mitotic aberration 3-fold

lower. Results corroborate reports that link Ruthenium compounds to a remarkable

cell inhibition activity instead of cell death promotion, like apoptosis, and clastogenicity

(Menezes et al, 2007; Frasca et al, 2001).

There is substantial cytological data that nucleic acids, particularly nuclear

DNA, are the targets for most Ruthenium antitumor complexes (Frasca et al, 2001).

Clarke discuss about a correlation between cytotoxicity and DNA binding for

representative Ruthenium am(m)ine compounds and their anticancer activity in cell

cultures (Clarke, 2003). This behavior is consistent with DNA binding in vivo of a

number of ammine, amine and heterocyclic complexes such inhibition of DNA

Artigo 1 89

replication, mutagenic activity and induction of the SOS repairs mechanism, binding to

nuclear DNA and reduction of RNA synthesis. EDTA-type complexes of RuIII have

shown anticancer activity, apparently through DNA binding (Clarke, 2003; Carballo et

al, 1997).

Clarke and Frasca also reports that while the initial set of Ruthenium

complexes tested are likely to give rise to others molecules that would bind to DNA

and possibly be mutagenic, the idea of short-circuiting electrons transfer pathways,

synergetically coupled with other subcellular interactions, is one of the possibilities

which RuII and RuIII complexes controls the division and multiplication of determinate

cell types (Clarke, 2003; Frasca et al, 2001).

It is important to consider that preparations of “Ruthenium red” can bind to

polyanions such pectins on plants and protective mucopolusaccharide coat on some

tumor cells, thus concentrating in tumors and inhibiting growth through blocking

transport of Ca2+ on cell membranes (Clarke, 2003). Calcium antagonists transport,

such nifedipine, verapamil, erythrosine-B (and Ruthenium red as well) plays a partially

equal effect on plant tissues and cells. Calcium appears be a ubiquitous signal in all

plant tissues, and playing key regulatory role in response to environmental or

developmental stimuli (Dombrowski & Bergey, 2007). Same effect can be observed in

animal and human cells, where calcium controls a diverse array of cellular processes

from fertilisation through gene transcription, muscle contraction to cell death (Berridge

et al, 1998, Roderick et al, 2003).

3.3. Chromosome aberrations and Micronuclei induction

Results of experiments did not show significant clastogenic effect on A. cepa

root cells exposed to Ruthenium complex at concentrations used (Table 1). In Fig. 2,

Artigo 1 90

some changes are observed in the organization and morphology of the chromosomes

in the root tips exposed to the Ruthenium complex, despite these groups haven’t

shown significant difference to control group. Species of A. cepa bear large and few

chromosomes (2n=16) which are very long, well visible and easily stained, which

makes the evaluation of damages and disturbances in cell division cycle easier,

including aneuploidy, chromatid lag and stekinesis (Fig. 2c) (Grant, 1999; Fiskejö,

1987; Leme & Marin-Morales, 2008).

For all the concentrations and times longer than 24 h the induction of stekinesis

was not evidenced. This phenomenon is considered inductor to aneuploidy and

polyploidy and has been reported as indicative of high toxicity (Fiskejö, 1987;

Marcano et al, 2002; Marcano et al, 2004). Other anomalies had been observed, like

anaphasic bridges (Fig. 2a and 2b), which were accompanied, in some cases, by

chromosomal forwarding (Fig. 2d), isolated chromosomes (chromatids not

migrating)(Fig. 2e), and chromosomes with nondisjunction (chromatids not

separating) for groups exposed only to lead nitrate and the other exposed to lead

Artigo 1 91

nitrate followed by Ruthenium complex treatment. Those anomalies were not detected

in cells treated only with Ruthenium complex.

Lead nitrate results coincide with those reported by other authors for diverse

biological systems (Ribas et al, 1996; Rank & Nielsen, 1997; Alvarez-Moya, 2001;

Rank et al, 2002) and are evidence of lead toxic effect on exposed cells and induction

of chromosome damage in other organisms (Del Campo & Coletto, 1998).

Results reveal that the rate of mitosis abnormalities in groups treated with Ruthenium

complexes are lower than that showed by group exposed to lead nitrate. Although

their percentages increased as the concentrations and duration of the applied

treatment with cis-Tetraammine(oxalato)Ruthenium(III) Dithionate increased, there

were no statistically significant difference between treated groups.

Broken-egg and Binucleated cells were observed on treatment with higher

concentrations of Ruthenium complexes, lead nitrate and lead nitrate plus Ruthenium

treatment. The occurrence of binucleated cells is the result of inhibition of cytokinesis

of cell plate formation. Microtubules have been implicated in cell plate formation and

is well know that heavy metals, such as lead nitrate, interfere on their synthesis

pathway (Duhr et al, 1993; Pejchar et al, 2007; Stummann et al, 2007).

The micronucleus test (MN) is one of the simplest, short-term tests for

biomonitoring, permitting investigates the possible citotoxic and genotoxic effects of

some particular agents on cells (Linde-Arias et al, 2008). Evaluation of the currently

available database indicates that this approach (MN) has a high sensitivity for the

detection of cancer risks in humans (Majer et al, 2001). Hence, this test system might

be a useful tool for identifying genetic damage resulting from occupational and

lifestyle exposure (Kassie et al, 2000; Uhl et al, 2003), on exposed cells to determine

Artigo 1 92

chemical or substance (Majer et al, 2001), as well in chemoprevention trials (Pool-

Zobel et al, 1997; Eisenbrand et al, 2002).

Artigo 1 93

There are several possible hypotheses on the pathways of MN formation. One

of them is the induction of oxidative stress. The induction of reactive oxygen species

(ROS) was found on greater part of cells exposed to heavy and toxic

metals/semimetals, such arsenic (As3+), cadmium(Cd2+), cooper (Cu2+); lead (Pb2+),

manganese(Mn2+), mercury (Hg2+), nickel (Ni2+) and zinc (Zn2+); from plants to

mammalian and humans (Steinkellner et al, 1998; Knasmüller et al, 1998; Knasmüller

et al, 2008). The attacks of ROS on purine and pyrimidine bases and on deoxyribose

in DNA can cause DNA strand breakage, which can increase the probability of

chromosome/chromatid fragmentation, thereby leading to the observed increases of

MN formation (Yi et al, 2007).

The second pathway, and an important one, involves in the changes of protein

sulfhydryl groups (–SH). Binding to sulfhydryl groups, heavy metals can inactivate

some important enzymes involved in DNA repair and expression (Clemens, 2001;

Gebel, 2001), alter DNA repair mechanism and cause an increase in MN frequency

(Patlolla & Tchounwou, 2005).

Although a number of heavy metals are essential micronutrients required for a

wide variety of physiological processes on plants and animals, these same metals can

be toxic at concentrations higher than the threshold concentrations (Nagalaksmi et al,

2001). Furthermore, other metals and metalloids such as cadmium (Cd), lead (Pb) or

arsenic (As), which are generally considered nonessential elements, are potentially

highly toxic due to their activity with S and N atoms in the amino acid side chain, as

described before. A variety of adaptive responses to heavy metal toxicity have been

developed by plants, and the most frequent one is the biosynthesis of the ligands,

which can detoxificate heavy metals by complexing them into compounds (Rauser,

1990; Rauser, 1991; Rauser & Meuwly, 1995). Among the biosynthesised ligands, a

Artigo 1 94

class of oligopeptides with the general structure (γ–Glu–Cys)n–Gly (n=2–11), called

phytochelatins (PCs), and as well as their precursor, glutathione (GSH, γ–Glu–Cys–

Gly), were generally considered to play crucial roles in heavy metal detoxification

(Mehra & Mulchandani, 1995; Mehra et al, 1996).

Bontidean and cols. (2003) studied the possibility of using plant phytochelatins

as biorecognition elements of capacitive biosensors to selectively and sensitively

monitor heavy metals ions. Founds demonstrate that phytochelatin-biosensor has a

broad selectivity, sensing all heavy metals, with different response pattern that

provides additional data for a potential array sensor capable of detecting and

quantifying individual metal ions in a mixture (Bontidean et al, 2003). The absences of

micronucleus and significant chromosome alterations on onions cells exposed to cis-

Tetraammine(oxalato)Ruthenium(III) Dithionate is a indicative that Ruthenium

compound does not exhibit same cytotoxic and genotoxic activities of heavy and toxic

metals/semimetals.

4.0 Conclusions

In summary, an important finding on present study concerns about the effects

of cis-[Ru(C2O4)(NH3)4]2(S2O6) on the toxicity in Allium cepa bulb cells. Actually, cis-

Tetraammine(oxalato)Ruthenium(III) Dithionate shows a remarkable capacity to inhibit

mitosis that could be related to inhibition of DNA sythesis or blocking in the G2 phase

of the cell cycle.

The ability to modulate uptake and release of ubiquitous intercellular

messengers and important intracellular molecules, as the same way that Ruthenium

red has been probe that of Ca2+ (Clarke, 2003), reveals that RuII and RuIII complexes

actions on cell can be more complex and wider than is usually expected, opening an

Artigo 1 95

important pathway to understand the mechanisms of how metal complexes achieve

their activities in cellular environment, knowledge that is crucial to their clinical

success and to the rational design of new compounds with improved potency for

medicine and human welfare.

Finally, further investigation of the mechanism of action of this Ruthenium

complex is important to define their clinical potential and to contribute to a rational

approach for possibly developing a new antitumor metal-based drug with antitumor

properties complementary to those exhibited by the drugs already in clinic use.

Acknowledgements

This work was supported by Research and Projects Finacing (FINEP) (Grant

No.01.06.0941.00/CT-Saúde to Elisângela de Paula Silveira-Lacerda) and by

Brazilian National Counsel of Technological and Scientific Development (CNPq)

through fellowships to Flávia de Castro Pereira (Grant No. 381302/2007-5), Cesar

Augusto Sam Tiago Vilanova-Costa (Grant No. 381303/2007-1) and Aliny Pereira de

Lima (Grant No. 370646/2007-0).

Artigo 1 96

5.0 References

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Artigo 2 106

Artigo 2 – Atividade Antitumoral do composto Ditionato de cis-Tetraamino(oxalato)Rutênio(III) em Carcinoma de Células Epiteliais

Alveolares de Pulmão Humano (A549) Pereira, F. C.; Lima, A. P.; Vilanova-Costa, C. A. S. T.; Ribeiro, A. S. B. B.; Silva,

Pereira, L.C.; H. D.; Pavanin, L. A.; Santos, W.B.; Silveira-Lacerda, E. P.

Submetido ao Journal of Trace Elements in Medicine and Biology. J. Trace Elem. Med. Biol., ISSN: 0946-672X, Elsevier.

Resumo: O carcinoma de pulmão é uma das principais causas de mortalidade por câncer em países industrializados, sendo que o carcinoma de células pequenas do pulmão (CCPP) é responsável por cerda de 80% de todos os casos. O principal tratamento para pacientes com CCPP inclui a quimioterapia com compostos platinados, como a cisplatina [cis-diaminodicloroplatina(II)] e seus análogos, a carboplatina e a oxaliplatina. Todavia, a utilidade clínica destes compostos de platina tem provado ser limitada devido ao seu estreito espectro de tumores suceptíveis à esses fármacos, além do comum desenvolvimento de resistência desenvolvido pelos pacientes. Os complexos de rutênio tem mostrado possuir grande potencial na quimioterapia. No presente trabalho, foi estudada a atividade antitumoral do composto Ditionato de cis-Tetraamino(oxalato)Rutênio(III) {cis-[Ru(C2O4)(NH3)4]2(S2O6)} sobre carcinoma de pulmão humano (A549) e sobre fibroblastos sadios de pulmão de fetos humanos (MRC-5). Os resultados mostraram que o composto de Rutêno(III) causou uma redução significativa da proliferação das células tumorais A549, com viabilidades variando de 55,5% para 24,5%, quando as células foram tradadas com 40 µM do composto de Rutênio(III) por 24 e 48h; e de 32% para 18,2% quando tradas com 150 µM do composto de Rutênio(III)por 24 e 48h. O Ditionato de Rutênio(III) mostrou ser de moderado (31.9% e 39.6% para as concentrações 10 e 40 µM, respectivamente) a altamente citotóxico (64% para a concentração de 150 µM) para as células A549 cells (IC50= 33,72 µM). Por outro lado, as células sadias MCR-% não mostraram uma redução significativa de sua capacidade de proliferação na presença do composto de Rutênio(III), mesmo quando tratadas as maiores concentrações de Rutênio (III) utilizadas no presente estudo por um período de 48h. Estas células mostraram viabilidade de 85% a 78,4% para 40 µM e 150 µM, respectivamente. Os resultados indicam que o composto cis-[Ru(C2O4)(NH3)4]2(S2O6) é bastante promissor para futuros estudos como uma potencial droga anti-tumoral para o tratamento do câncer de pulmão. Palavras-chave: Ditionato de cis-Tetraamino(oxalato)Rutênio(III), Citotoxicidade, Atividade Antitumoral, A549, MRC-5, Câncer de Pulmão.

Artigo 2 107

Antitumor activity of the compound cis-

Tetraammine(oxalato)Ruthenium(III) Dithionate against human lung

alveolar carcinoma epithelial cells (A549).



Cesar Augusto Sam Tiago Vilanova-Costaa ([email protected])


Lucas Carlos Gomes Pereiraa ([email protected])


Wagner Batista dos Santosc ([email protected])

Elisângela de Paula Silveira-Lacerdaa ([email protected])* aLaboratório de Genética Molecular e Citogenética, Instituto de Ciências Biológicas, Universidade Federal de Goiás - UFG, Goiânia, Goiás, Brazil; bInstituto de Química, Universidade Federal de Uberlândia - UFU, Uberlândia, Minas Gerais, Brazil; cFaculdade Patos de Minas - FPM, Patos de Minas, Minas Gerais, Brazil. *Corresponding author: Elisângela de Paula Silveira Lacerda, e-mail: [email protected]





Cx. Postal:

Goiânia-GO, Brasil – 74

Phone/Fax +55-62-3521-1481

Cell Phone +55-62-9293-3121

Abstract: Lung cancer is one of the leading cause of cancer mortality in industrialized

Artigo 2 108

countries, with non-small cell lung cancer (NSCLC) accounting for nearly 80%. First-line

treatment for patients with advanced NSCLC includes platinum compounds such cisplatin

[cis-diamminedichloroplatinum(II)] and its analogues carboplatin and oxaliplatin.

Nevertheless, the clinical utility of these drugs has been proven limited due to the relatively

narrow range of tumors affected and the development of acquired drug resistance. Ruthenium

complexes have shown potential utility in chemotherapy. In the present work we studied the

antitumor activity of cis-Tetraammine(oxalato)Ruthenium(III) Dithionate {cis-

[Ru(C2O4)(NH3)4]2(S2O6)} against human lung carcinoma (A549) and normal human fetal

lung fibroblast (MRC-5) cell lines. Results showed that Ruthenium(III) causes a significant

reduction of proliferation of A549 cells with viabilities ranging from 55.5% to 24.6% when

treated with 40 µM for 24 and 48h; and 32% to 18.2% when treated with 150 µM for 24 and

48h. The Ruthenium(III) compound induced a moderate (31.9% and 39.6% for concentrations

10 and 40 µM, respectively) to high degree (74% for concentration 150 µM) of cytotoxic

activity against A549 cells (IC50= 33.72 µM). On the other hand, the normal lung fibroblast

MRC-5 did not show significant reduction proliferation in the presence of Ruthenium(III)

compound. Even when treated with higher concentrations of cis-

Tetraammine(oxalato)Ruthenium(III) Dithionate for 48 hours, MRC-5 cells showed

viabilities ranging from 85% to 78,4% for 40 µM and 150 µM, respectively. The presents

results indicate that cis-[Ru(C2O4)(NH3)4]2(S2O6) is worthy of further development as a

potential anti-tumor drug for lung cancer treatment.

Keywords: cis-Tetraammine(oxalato)Ruthenium(III) Dithionate; Cytotoxicity; Antitumor

activity; A549; MRC-5; Lung cancer.

Artigo 2 109

1. Introduction

Lung cancer is one of the leading cause of cancer mortality in industrialized countries,

with non-small cell lung cancer (NSCLC) accounting for nearly 80% (American Cancer

Society, 2009). Although surgery may be curative in early-stage NSCLC, most patients

present with inoperable advanced disease. These patients managed with best supportive care

alone have a median survival time of only 5 months and a 1-year survival rate of

approximately 10% (Shepherd, 2000). First-line treatment for patients with advanced NSCLC

includes platinum compounds such cisplatin [cis-diamminedichloroplatinum(II)] and its

analogues carboplatin and oxaliplatin (Shepherd & Carney, 2000; Brabec & Nováková,

2006). Nevertheless, the clinical utility of these drugs has been proven limited due to the

relatively narrow range of tumors affected and the development of acquired drug resistance.

Resistance to treatment can occur in certain disease types (ovarian and small cell lung

cancers) or present as intrinsic drug resistance in less responsive cases (NSCLC and colon

cancers) (Wernyj & Morin, 2004; Karki et al., 2007). Furthermore, cisplatin is administered

intravenously due to its limited solubility in water and severe side effects (Wong &

Giandomenico, 1999).

Ruthenium complexes have shown potential utility in chemotherapy and

photodynamic therapy (Clarke, 2003; Ronconi & Sadler, 2007). Ruthenium complexes

generally have lower toxicities compared to cisplatin attributed to their specific accumulation

in cancer tissues (Sava et al., 1998; Alessio et al., 2004). In vitro and in vivo studies show

high anticancer activity of Ruthenium complexes and some of them are currently undergoing

clinical trials (Jakupec et al., 2005; Hartinger et al., 2006).

The identification of new chemotherapeutics agents is critical for further progress in

the treatment of NSCLC. In comparison to the platinum(II) antitumor complexes currently

used in the clinic, Ruthenium compounds offer potentially reduced toxicity, a novel

Artigo 2 110

mechanism of action, the prospect of non-cross-resistance, and a different spectrum of activity

(Clarke, 2003; Alessio et al., 2004). The reduced toxicity is in part due to the ability of

Ruthenium complexes to mimic the binding of iron to molecules of biological significance,

exploiting the mechanisms that the body has evolved for non-toxic transport of iron (Frasca et

al., 2001). This reduced toxicity, together with non-cross-resistance in cisplatin-resistant

cancer cells, is particularly attractive attributes of these complexes (Allardyce et al., 2003).

Based on these evidences, in the present work we studied the cytotoxic and antitumor

activity of the Ruthenium(III) compound cis-Tetraammine(oxalato)Ruthenium(III) Dithionate

{cis-[Ru(C2O4)(NH3)4]2(S2O6)} against human lung carcinoma (A549) tumor cell line and

normal human fetal lung fibroblast (MRC-5).

2. Material and methods

2.1. Synthesis of cis-[Ru(C2O4)(NH3)4]2(S2O6)

The cis-[Ru(C2O4)(NH3)4]2(S2O6) complex (Figure 1) was synthesized at the

Universidade Federal de Uberlândia (UFU, Minas Gerais, Brazil) following a standard

protocol (Pereira et al., 2008). The compound was characterized by electronic spectra at room

temperature with the HP 8453 spectrophotometer with diodes arrangement, interfacing a

compatible PC HP Vectra XM, using quartz cells. Carbon and hydrogen microanalyses were

performed by the staff of the Analitical Centre of the Chemistry Institute of Universidade de

São Paulo (USP, São Paulo, Brazil).

2.2. Cell culture.

The human lung carcinoma A549 (ATCC number CCL-185TM) and normal human

fetal lung fibroblast MRC-5 (ATCC number CCL-171TM) cell lines were obtained from the

American Type Culture Collection (ATCC, Rockville, MD, USA). The cells were cultured in

DMEM medium (pH 7.2-7.4) supplemented with 100 U mL-1 penicillin G, 100 μg mL-1

Artigo 2 111

streptomycin, 2 mM L-glutamine, 1.5 g L-1 sodium bicarbonate, 4.5 g L-1 glucose, 10 mM

HEPES, 1.0 mM sodium pyruvate and 10% fetal calf serum 1% (w/v) (all reagents were

obtained from Gibco, Grand Island, NY) at 37°C, under a 5% CO2 humidified atmosphere.

A549 tumor cells were routinely sub-cultured using 2.5g L-1 trypsin-ethylenedinitrile

tetraacetic acid (EDTA) solution (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO).

The cells were disposed into 96 well plates (1×105 cells/well) and cultured in

Dulbecco’s modified eagle’s medium DMEM medium. Cells were harvested at specified

intervals and the number of cells per well was determined by cell counting with a

hemocytometer (Neubauer chamber). Briefly, cells were aspirated, washed in sterile PBS and

an aliquot of the cell suspension was put in Trypan Blue 1% (m/v) (Sigma Chemical Co.) and

counted. Only cell dilutions with > 95% of viable cells were included in the posteriors

analysis

2.3. Cell Viability (Trypan blue staining)

The viability of the cells was evaluated by the trypan blue exclusion assay. The A549

and MRC-5 cells were incubated for 24 h and 48 h with different concentrations of the tested

ruthenium compound (from 0.015 – 150 µM) at 37 °C. Additionally, the positive control was

applied (50 µM of Carboplatin). After incubation, the cells were washed in PBS (pH 7.4) and

suspended in a complete DMEM medium. Then 40 µL of the trypan blue solution (0.4%,

Sigma) and 10 µL of the cell suspension were mixed and after 5 min the percentage of viable

cells was evaluated under brightfield optical microscope using a Newbauer chamber. The

correlation between the viable cells (that excluded trypan blue dye) and dead cells (stained

cells) were assessed. The results are presented as mean±S.D. (standard deviation) from three

independent experiments.

Artigo 2 112

2.4. Cytotoxicity assay.

Cytotoxic activity of cis-[Ru(C2O4)(NH3)4]2(S2O6) on MRC-5 and A549 was

measured by modified MTT assay (Mosmann, 1983), which is based on the reduction of

yellow 3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyl tetrazolium bromide (MTT) to dark-blue,

insoluble formazan in mitochondria of the living cells. The MTT assay was performed in 96-

well tissue culture plates (Nalge-Nunc, Rochester, NY, USA) as follows: the cells (2 ×

103/well) were seeded in tissue culture plates and incubated with the different concentrations

of Ruthenium compound (from 0.015 – 150 µM) or Carboplatin (50 µM 1) dissolved in a total

volume of 100 μL/well for 24 h at 37 °C and 5% CO2. The cells incubated with medium only

served as a control. Following the exposure to the tested substances, the cells were incubated

with 10 μL of MTT solution (5 mg mL-1) (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA) for 3 h. The

microplates were then centrifuged (300×g/15 min/10°C) and the culture media were

discarded. Afterwards 200 μL of PBS/20% of SDS (lauryl sulfate) solution (Sigma-Aldrich,

USA) was added to each well to stop the reaction and plates were kept in the dark overnight.

After the next 12 h the absorbance of dissolved formazan was measured by a Stat Fax 2100

microplate reader (Awareness Technology, Palm City, FL, USA) at 565 nm. The cell viability

was expressed in % related to control (100% of viability). The cytotoxic rate was calculated

as follows: cytotoxicity (%) = [1 - (absorbance of the treated wells / absorbance of the control

wells)] ×100%. The cytotoxic effect of the tested substances was determined in at least three

independent experiments, where each one of the culture plates contained the wells with tested

concentration in triplicate, the wells with control (cells in medium) and the blank (culture

medium alone). The 50% inhibitory concentration (IC50) value was determined using

GraphPad Prism 4.02 for Windows (GraphPad Software, San Diego, CA, USA).

Artigo 2 113

2.5. Clonogenic assay

A clonogenic assay was employed to determine the cytotoxicity of different

treatments. A549 cells (1 × 105/well) were incubated with different concentrations of

Ruthenium compound (0.15 – 150 µM) or Carboplatin (50 µM) or Paclitaxel (25 µM)

dissolved in DMEN medium for 24 and 48h at 37 °C and 5% CO2. After the treatments, the

cells were rinsed with 5 ml of PBS three times and then trypsinized. The resuspended cells

were counted with a hemocytometer and plated at dilution of 300 in triplicate in culture

bottles (25 cm2) containing 5 mL of growth medium. The culture bottles were then kept in an

incubator at 37 ºC in a humidified atmosphere of 5% CO2 and air-mixed for 15 days, allowing

viable cells to grow into macroscopic colonies. Then, the medium was removed, and the cells

were fixed [methanol/acetic acid/water (1:1:8, v/v)] and stained using Giemsa 5%. Colonies

with more than 50 cells were counted under an inverted microscope by an observer who was

blinded with regard to the experimental group. The software Clono-Counter (Niyazi et al,

2007) was also used to evaluate the clonogenic growth by densitometric analysis of scanned

grey-scaled photos (200 dpi jpeg-files) of culture flasks. Calculation of survival fraction (SF)

was performed using the equation: SF = colonies counted/cells seeded × (PE/100), taking the

individual plating efficiency (PE) into consideration.

2.6. DNA laddering assay.

Briefly, 2×106 cells (A549) were treated with different concentrations of cis-

[Ru(C2O4)(NH3)4]2(S2O6) (1.5 – 150 µM) for 48 h at 37 °C and 5% CO2. Cells were harvested

and centrifuged at 300×g/15 min/10°C and washed with PBS. The cells were then

ressuspended at a concentration of 1×106 cells mL-1 in an extraction buffer (10 mmol L-1 Tris-

HCl, 0.1mol L-1 EDTA, 5g mL-1 SDS) and treated with 20 mg L-1 RNase A at 37°C for 60

min, followed by incubation with proteinase K (100 mg L-1) at 37°C for 60 min. An equal

Artigo 2 114

volume of saline solution (NaCl 6 M) was added to the cells and centrifuged at 13,000×g for

10min. The supernatant was collected and 2 volume ethanol (-20°C) were added. The samples

were centrifuged at 13,000×g for 30 min at 4°C. The supernatant was then discarded and the

pellets dissolved in TE buffer (1×). The concentration of DNA was detected using a UV

spectrophotometer (Beckman DU-640, USA). The DNA (5 µg/tube) was transferred to a

1.5% agarose horizontal gel, and electrophoresis was performed at 100V cm-1 for 90 min. The

DNA in the gels was visualized by ultraviolet transillumination after staining with ethidium

bromide (5 µg mL-1) using an Omega® molecular imaging system (UltraLum Inc., Claremont,

CA, USA).

2.7. Statistical analysis.

Three independent in vitro experiments were carried out. Statistical results were

expressed as the mean ± standard deviation of the means obtained from triplicates of each

independent experiment. Correlation tests were performed to determine the effects of

concentration of Ruthenium complex on tumor cell lines. Statistical significance of

differences *(p<0.05) as compared to untreated cells (control) was evaluated by applying

analysis of variance (ANOVA) and Tukey or Dunnet’s post tests, when applicable. The IC 50

(concentration that produces a 50% inhibitory effect on the evaluated parameter) was

graphically obtained from the dose-response curves.

3. Results

3.1. The cis-[Ru(C2O4)(NH3)4]2(S2O6) compound reduces proliferation of A549 tumor

cells by Trypan blue staining

Results derived from Trypan blue staining essay revealed that A549 cells cultured with

concentrations 40 and 150 μg mL-1 of Ruthenium(III) compound showed significant reduction

Artigo 2 115

of proliferation with viabilities ranging from 55.5% to 24.6% when treated with 40 µM for 24

and 48h; and 32% to 18.2% when treated with 150 µM for 24 and 48h (Figure 2). On the

other hand, the normal lung fibroblast MRC-5 did not show significant reduction proliferation

in the presence of Ruthenium(III) compound. Even when treated with higher concentrations

of cis-Tetraammine(oxalato)Ruthenium(III) Dithionate for 48 hours, MRC-5 cells showed

viabilities ranging from 85% to 78,4% for 40 µM and 150 µM, respectively.

3.2. The cis-[Ru(C2O4)(NH3)4]2(S2O6) compound presents cytotoxic activity towards

A549 tumor cell lines

To verify the cytotoxic activity of cis-[Ru(C2O4)(NH3)4]2(S2O6) on A549 and MRC-5

cell lines, tumor and normal cells were cultured for 24 h in the presence of different

concentrations of Ruthenium compound. The results (Figure 3) show that the Ruthenium(III)

compound induced a moderate (31.9% and 39.6% for concentrations 10 and 40 µM,

respectively) to high degree (74% for concentration 150 µM) of cytotoxic activity against

A549 (IC50= 33.72 µM) and a very low cytotoxic effect against MRC-5 cells (17,1% for

concentration 150 µM). The IC50 of cis-Tetraammine(oxalato)Ruthenium(III) Dithionate for

MRC-5 cells could not be assessed with concentrations tested.

3.3. The cis-[Ru(C2O4)(NH3)4]2(S2O6) compound reduced the colony forming ability of

A549 tumor cell line

In order to investigate the possible action of cis-Tetraammine(oxalato)Ruthenium(III)

Dithionate on the growth and proliferative characteristics of A549, tumor cells grown under

different concentrations of Ruthenium compound (0.15 – 150 µM), Carboplatin (50 µM) and

Paclitaxel (25 µM). The Ruthenium compound reduced the number of A549 colonies at all

concentrations tested and remarkably diminished colony forming ability at concentration 10

Artigo 2 116

µM (Figure 4) revealing a higher cytostatic capability than Carboplatin (50 µM). No colony

was observed when A549 cells were treated with 40 and 150 µM of cis-

[Ru(C2O4)(NH3)4]2(S2O6) and 25 µM of Paclitaxel. The control plating efficiency of A549

cells was 0.46 ± 0.02 (n = 09) (Figure 4).

3.4. cis-[Ru(C2O4)(NH3)4]2(S2O6) did not induce apoptosis in A549 cells as verified by

DNA ladder analysis.

To investigated if the inhibition of cell viability by Ruthenium(III) involve apoptotic

cell death, we examined DNA fragmentation using agarose gel electrophoresis. As shown,

A549 cells cultured in the presence of Ruthenium compound not presented DNA

fragmentation pattern in all of the concentration tested (Figure 5).

4. Discussion

Since the introduction of cisplatin in cancer therapy, metal complexes and

organometallic compounds have been gaining importance in oncology (Kostova, 2006; Sanna

et al., 2002). Metal-based compounds increase the possibility of developing molecules better-

suited for binding to specific biological targets. Although platinum-based anticancer therapies

have been used very successfully in the clinic to combat a range of cancers, they are not

universally applicable. Ruthenium complexes appear particularly promising; although they

exhibit lower cytotoxicity as compared to cisplatin, they are better tolerated in vivo (Sanna et

al., 2002; Guichard et al., 2005; Hartinger et al., 2006; Menezes et al., 2007). In the present

work, we studied the cytotoxic activity of cis-Tetraammine(oxalato)Ruthenium(III)

Dithionate cytotoxic towards human lung carcinoma (A549) tumor cell lines and normal

human fetal lung fibroblast (MRC-5).

Artigo 2 117

Measurement of the number of living cells using MTT or similar assays in drug-

treated and control cultures is the most commonly used method in cell-based screening

experiments. The results show that A549 tumor cells treated with a different concentration of

cis-Tetraammine(oxalato)Ruthenium(III) Dithionate, a Ruthenium-based complex, presented

anti-proliferative effect (Figure 2) and significant cytotoxic activity (Figure 3). Furthermore,

the Ruthenium(III) compound showed very low cytotoxic and anti-proliferative activity on

normal lung fibroblast MRC-5. These results confirm previous observations that

Ruthenium(III) complexes can mediate cytotoxic effects and induce cytotoxicity toward

tumor cells (Sava et al., 1983; Gagliardi et al., 1994; Silveira-Lacerda et al., 2009b).

The selective toxicity of Ruthenium(III) compounds in tumor cells should be related to

its capacity to bind to transferrin, the primary mode of iron transportation into mammalian

cells. Uptake of Ruthenium transferrin was substantially greater in tumors, possibly due to

abnormally increased expression of transferrin receptors on the surface of tumor cells (Kratz

et al., 1994; Frasca et al., 2001; Silveira-Lacerda et al., 2009b).

Taken together, results derived from MTT and Tryplan blue assays indicate that cis-

Tetraammine(oxalato)Ruthenium(III) Dithionate exhibits cellular effects according to

compound concentration and exposure time. As shown by proliferation, cytotoxicity,

profiles, post-incubation allowed us to observe that growth inhibition in A549 cell line was

irreversible, mainly after treatment with higher doses of Ruthenium complex (40 and 150 µM)

for 48 h exposure time. The Ruthenium(III) complex also reduced the clonogenic survival

capabilities of lung cancer cell lines in vitro. Data derived from clonogenic assay indicated

that treatment with Ruthenium exerts growth inhibitory and cytotoxic effects of lung cancer

cell lines in vitro upon short time treatment (24–48 h) with 40 µM of Ruthenium(III)

complex. For A549 tumor cells, concentrations of 40 µM or above Ruthenium were sufficient

to reduce survival of lung cancer cell line. On a mechanistic level our data reveal that

Artigo 2 118

Ruthenium(III) complex could trigger growth-inhibition and induces cell death of tumor cells.

Our previous studies on cell cycle changes after shorter exposure time (Menezes et al., 2007;

Silveira-Lacerda et al., 2009a; Silveira-Lacerda et al., 2009b) compared with this present

work was in favor of lengthening treatment time. The present study confirms the relevance of

prolonging exposure time to Ruthenium complexes, as 48 h of treatment enhances more

efficiently cytotoxicity and induces colony growth arrest in A549 tumor cell line.

Previous investigators have focused on Ru(III) complexes as potential anti-tumour

agents (Guichard et al., 2005). Ru complexes demonstrate similar ligand exchange kinetics to

those of platinum (PtII and PtIV) while displaying only low toxicity. Ruthenium(III) has the

ability to mimic iron in binding to plasma proteins including transferrin and albumin

(Allardyce et al., 2002). Transport and sequestration of Ru into tumour cells may be mediated

via protein transport and receptor mediated uptake (Bergamo & Sava, 2007).

It is important to note that this compound presents similar tumor cytotoxic activity

when compared to other chemotherapeutic agent such Carboplatin (Figure 3), as demonstrated

by MTT essay, where after 24 h of treatment IC50 was 33.72 µM and 50 µM for cis-

Tetraammine(oxalato)Ruthenium(III) Dithionate and Carboplatin, respectively. These results

corroborate previous observations that Ruthenium(III) complexes induces cytotoxicity

towards tumor cells such as human Jurkat, HeLa and SK-BR-3, and murine S-180 and A-20

tumor cell lines (Frasca et al., 2001; Silveira-Lacerda et al., 2009b). Besides being cytotoxic

in vitro for tumor cells, a previous report indicated that cis-[RuCl2(NH3)4]Cl exhibited

antitumor effects in vivo on S180 tumor cells, showing tumor volume reduction and increased

survival time in treated animals (Menezes et al., 2007).

Although the main focus of present study was not determine the type of death incurred

by A549 treated by cis-Tetraammine(oxalato)Ruthenium(III) Dithionate, previous reports

have shown that Ruthenium-based compounds, in particular Ru(III), can kill other types of

Artigo 2 119

tumor cells by apoptosis (Sanna et al., 2002; Kapitza et al., 2005; Brabec & Nováková, 2006;

Hartinger et al., 2006; Kostova, 2006; Silveira-Lacerda et al., 2009b). The significantly

reduced number of A549 cells in the presence of cis-Tetraammine(oxalato)Ruthenium(III)

Dithionate on previous essays suggests that this compound could be inducing cell death via

apoptosis. To examine pro-apoptotic properties of the Ruthenium(III) compound, A549 cells

were cultured in the presence of different concentrations of Ruthenium compound (1.5 – 150

µM) and then DNA ladder analysis was performed via agarose gel electrophoresis.

The DNA fragmentation pattern is an important biochemical sign of apoptosis,

representing DNA cleavage into oligonucleosomal fragments through activation of the

cysteine protease caspase-3, which is involved in the proteolytic cleavage of key downstream

proteins such as poly (ADP-ribose) polymerase (PARP) (Bortner et al., 1995; Clarke &

Stubbs, 1996). This process ultimately results in DNA fragmentation and apoptotic death

(Bortner et al., 1995).

However, results indicates that Ruthenium (III) compound used on present work was

unable to induce internucleosomal fragmentation on DNA or A549 cells, even when exposed

to different and high concentrations. Notwithstanding, results corroborate previous

observations where cisplatin-resistant cell line A549 does not undergo apoptosis even though

this agent causes the up-regulation of the pro-apoptotic genes Fas and Bax and the down-

regulation of the anti-apoptotic Bcl-2 gene (Almeida et al., 2007). Furthermore, few of the

coordinated compounds may function in a manner analogous to cisplatin, which appears to

bend DNA by cross-linking adjacent guanines, thereby causing a class of DNA binding

proteins to adhere to the site. Overall, the broad class of Ruthenium(III) antitumor agents

appears to differ from cisplatin by favoring interstrand rather than intrastrand cross-links

(Clarke et al., 1999).

Artigo 2 120

In agreement with this hypothesis, it was demonstrated that NAMI-A induced

apoptosis in the ECV304 transformed human endothelial and KP1019 in colorectal carcinoma

cell lines via activation of caspase-3 and DNA fragmentation (Bortner et al., 1995; Nunez et

al., 1998; Kapitza et al., 2005). Although this type of binding has been suggested to mimic, to

some extent, cisplatin-induced DNA crosslinking, other types of damage may exist that

dominate or contribute to the biological activity of cis-Tetraammine(oxalato)Ruthenium(III)

Dithionate. Thus, despite cis-Tetraammine(oxalato)Ruthenium(III) Dithionate was unable

induce DNA laddering on cells A549, other method most sensible to detection apoptosis

should be performed. Broadening the chemotherapeutic arsenal depends on understanding

existing agents with a view toward developing new modes of attack.

Despite the resounding success of cisplatin and closely related platinum antitumor

agents, the movement of other transition-metal antitumor agents toward the clinic has been

exceptionally slow (Clarke et al., 1999). Non-Platinum chemotherapeutic

metallopharmaceuticals hold much promise for the future, and needs to be actively explored

in a large variety of tumor types in combination therapies.

The clinically investigated Ru(III) antimetastatic drug NAMI-A has completed clinical

phase I evaluation, and cutaneous toxicity was dose-limiting. Nausea and vomiting was also

noted. Mild reversible nephrotoxicity was noted and a pre- and post-hydration regimen was

utilized. Neurotoxicity and hepatic toxicities were not identified. Stable disease was identified

in a patient with non-small cell lung cancer (Bergamo et al., 2000).

Besides the already well established NAMI-A and KP-1019 activities on

gastrointestinal, breast, prostate, and ovarian cancers (Bergamo et al., 1999; Pluim et al.,

2004, Bergamo & Sava, 2007), the search for coordinated compounds with lower toxicity and

without secondary side-effects to treat cancer is an aim of cancer-treatment research. The

present study results indicate that Cis-[Ru(C2O4)(NH3)4]2(S2O6) is worthy of further

Artigo 2 121

development as a potential anti-tumor drug that could be used in the treatment of non-small

cell lung cancers.

Acknowledgments

The authors gratefully acknowledge the financial support of Research and Projects

Financing (FINEP) (Grant No.01.06.0941.00/CT-Saúde to Elisângela de Paula Silveira-

Lacerda), Brazilian National Counsel of Technological and Scientific Development (CNPq)

through fellowship to Flávia de Castro Pereira (Grant No. 131960/2008-3) and Coordination

for the Advancement of Higher Education Staff (CAPES) through fellowships to Aliny

Pereira de Lima and Cesar Augusto Sam Tiago Vilanova-Costa.

Funding sources

There are no financial or personal interests that might be viewed as inappropriate

influences on the work presented herein. This manuscript was completely financed by

governmental and nonprofit institutions, Brazilian National Counsel of Technological and

Scientific Development (CNPq), Research and Projects Financing (FINEP) and Coordination

for the Advancement of Higher Education Staff (CAPES).

Ethical Approval

No studies involving humans or experimental animals were conducted in this work.

The human lung carcinoma (A549) cells was purchased from the American Type Culture

Collection (ATCC, Rockville, MD, USA) and cultured in vitro.

Abbreviations

A549 human lung carcinoma cell line

cis-[Ru(C2O4)(NH3)4]2(S2O6) cis-Tetraammine(oxalato)Ruthenium(III) Dithionate

Artigo 2 122

DMSO dimethyl sulfoxide

EDTA ethylenediaminetetraacetic acid

ELISA enzyme-linked immunosorbent assay

IC50 50% inhibitory concentration

MTT 3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazolium

bromide

MRC-5 human fetal lung fibroblast

NAMI-A imidazolium-trans-DMSO-imidazole-

tetrachlororuthenate

NSCLC non-small cell lung cancer

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Artigo 2 126

Figure 1. Chemical structure of cis-Tetraammine(oxalato)Ruthenium(III) Dithionate.

Artigo 2 127

MRC-5 (24h) MRC-5 (48h) A-549 (24h) A-549 (48h)0

10

20

30

40

50

60

70

80

90

100

C+ (Carboplatin 50 µM)Ru (150 µM)

C- (Cells and Medium)Ru (0.015 µM)Ru (0.15 µM)Ru (1,5 µM)Ru (10 µM)Ru (40 µM)

**

*

** *

Treatment {cis-[Ru(C2O4)(NH3)4]2(S2O6)}

Cel

ls V

iabi

lity

(%)

Figure 2. Anti-proliferative activity of cis-Tetraammine(oxalato)Ruthenium(III) Dithionate

compound towards A549 and MRC-5 cell lines. The tumor and normal cells were cultured in

the presence or absence of cis-[Ru(C2O4)(NH3)4]2(S2O6) (0.015 – 150 µM) for 24 h and 48 h

as described in Material and Methods. The cell viability was assessed by correlation between

the viable cells (that excluded trypan blue dye) and dead cells (stained cells) using a newbauer

chamber. The data show the mean±S.D. (standard deviation) of three independent

experiments [GraphPad Prism version 4.02 for Windows (GraphPad Software, San Diego,

California, USA)]. *p<0.05 vs. negative control.

Artigo 2 128

Figure 3. Cytotoxic activity of cis-Tetraammine(oxalato)Ruthenium(III) Dithionate compound towards A549 and MCR-5 cell lines (a and b). The tumor and normal cells were cultured in the presence or absence of cis-[Ru(C2O4)(NH3)4]2(S2O6) (0.015 – 150 µM) for 24 h as described in Material and Methods. The ruthenium-based compound cytotoxicity was assessed by measuring the absorbance of dissolved formazan using a microplate reader. The reduction of yellow 3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyl tetrazolium bromide (MTT) to dark-blue, insoluble formazan only occurs in mitochondria of the living cells. The data show the mean±S.D. (standard deviation) of three independent experiments [GraphPad Prism version 4.02 for Windows (GraphPad Software, San Diego, California, USA)]. *p<0.05 vs. positive control. # = 0%.Red dotted line = IC50 concentration.

C- (Cell

s and M

edium)

Ru (0.01

5 µM)

Ru (0.15

µM)

Ru (1,5

µM)

Ru (3 µM

)Ru (1

0 µM)

Ru (40 µ

M)Ru (1

50 µM

)

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oplatin 50

µM)

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20

30

4050

60

70

80

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A549MRC-5

* *

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Cel

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)

-8.0 -7.5 -7.0 -6.5 -6.0 -5.5 -5.0 -4.5 -4.0 -3.50

10

20

30

40

50

60

70

80

90

100

A549MRC-5

IC50 = 33.72 µM

cis-[Ru(C2O4)(NH3)4]2(S2O6) concentration (log nM)

Cel

l Via

bilit

y (%

)

a b

Artigo 2 129

C- (Cell

s and M

edium)

Ru 0.15

µM

Ru 1.5 µ

M

Ru 10 µM

Ru 40 µM

Ru 150 µ

M

C+ (Carb

oplatin 50

µM)

C+ (Pac

litaxe

l 25 µ

M)

0

25

50

75

100

125

150

175

200

# # #

* *

24h 48h 24h 48h 24h 48h 24h 48h 24h 48h 24h 48h 24h 48h 24h 48h

cis-[Ru(C2O4)(NH3)4]2(S2O6)

Col

onie

s co

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Mea

n ±

S.D

.)

Figure 4. Proliferation of A549 tumor cells cultured in the presence of different concentrations of cis-[Ru(C2O4)(NH3)4]2(S2O6) compound. A549 cells (1 × 105/well) were incubated with different concentrations of Ruthenium compound (0.15 – 160 µM) or Carboplatin (50 µM) or Paclitaxel (25 µM) dissolved in DMEN medium for 24 and 48h at 37 °C and 5% CO2 as described in Material and Methods. After the treatments, the cells were rinsed, trypsinized, resuspended and plated at dilution of 300 in triplicate in culture bottles (25 cm2) that were kept in an incubator for 15 days, allowing viable cells to grow into macroscopic colonies. Then, cells were fixed and stained using Giemsa 5%. Colonies with more than 50 cells were counted under an inverted microscope by an observer who was blinded with regard to the experimental group. The data show the mean±S.D. (standard deviation) of three independent experiments [GraphPad Prism version 4.02 for Windows (GraphPad Software, San Diego, California, USA)]. *p<0.05 vs. negative control. # No colony was observed.

Figure 5

cis-[Ru(

concent

washed

and Me

with et

medium

Ld Ld

5. DNA ag

(C2O4)(NH3

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ted to 1×10

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omide and

arboplatin 50

549 cells

150 µM 4

lectrophore

compound

O4)(NH3)4]2(

06 cells mL

subjected to

visualized

0 µM for 48

s culture[Ru(C2O

Ru 48h

40 µM 10

sis profile o

d. 2×106 A

(S2O6) (1.5 -1. The DN

1.5% agaro

by ultrav

8h).

ed in theO4)(NH3)4

µM 1.5µM

of A549 ce

A549 cells

– 150 µM)

A was extr

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M C+

ells cultured

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n (C- = C

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tigo 2 130

sence of

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Material

e stained

ells and

Artigo 3 131

Artigo 3 – Efeito Antitumoral do composto coordenado Ditionato de cis-Tetraamino(oxalato)Rutênio(III) em Células de Leucemia Humana K562.

Pereira, F. C.; Lima, A. P.; Vilanova-Costa, C. A. S. T.; Ribeiro, A. S. B. B.; Silva,

Pereira, L.C.; H. D.; Pavanin, L. A.; Santos, W.B.; Silveira-Lacerda, E. P.

Submetido à Toxicology in Vitro. Toxicol. In Vitro, ISSN: 0887-2333, Elsevier.

Resumo: As leucemias compreendem um grupo de tipos de câncer que afetam significantemente a população e, especialmente, as crianças. A American Cancer Society (ACS) estimou que cerca de 35.070 novos casos de leucemia serão diagnosticados para o ano de 2009, onde cerca de 22.280 adultos e crianças virão à falecer. A quimioterapia é um dos principais tratamentos para a leucemia e a identificação de novos agentes quimioterápicos é um passo crítico para o progresso do tratamentos das leucemias. Os complexos de rutênio geralmente apresentam baixa citotoxicidade, quando comparados com a cisplatina – uma droga comumente utilizada no tratamento de leucemias – atribuídas a sua acumulação específica nos tecidos tumorais. No presente trabalho, foi avaliada a atividade antitumoral do composto Ditionato de cis-Tetraamino(oxalato)Rutênio(III) {cis-[Ru(C2O4)(NH3)4]2(S2O6)} contra eritroleucemia humana (K562). Os estudos de sua atividade antiproliferativa e citotoxicidade revelaram que as células tumorais K562 cultivadas com as concentração de 40 e 150 μM de rutênio(III) mostraram uma significativa redução na proliferação das células tumorais após 72h de exposição, com viabilidades variando de 88,2% a 55,6% quando tratadas com 40 µM por 24 e 72h; e de 76.2% para 26.7%, quando tratadas com 150 µM for 24 and 72h, respectivamente. Os compostos de Rutênio(III) induziram uma citotoxicidade variando de baixa [de 22.4% (24h) para 28.2% (48h) e de 29.8% (24h) para 35.7% (48h) para as concentrações de 10 e 40 µM, respectivamente] a moderada [44% (24h) e 53% (48h) para a concentração de 150 µM] frente as células tumorais K562. A análise do ciclo celular por citometria de fluxo indicou uma alta quantidade de células em sub-G1, um forte indicativo de apoptose, induzindo um aumento no número de células em sub-G1 de cerca de 1,7; 2,2 e 2,4 vezes para os períodos de 24, 48 e 72 horas de exposição, quando comparado ao grupo controle. O complexo de rutênio(III) também aumentou significativamente o numero de cometas em culturas de K562 em todas as concentrações utilizadas, o que pode estar associdado à citoxicidade com efeito direto no DNA das células tumorais. Assim, estudos adicionais tornam-se necessários de forma a se determinar os mecanismos de ação e o potencial da atividade antitumoral in vivo do composto Ditionato de cis-Tetraamino(oxalato)Rutênio(III). Palavras-chave: Ditionato de cis-Tetraamino(oxalato)Rutênio(III), Citotoxicidade, Atividade antitumoral, K562, Compostos de Rutênio(III), atividade imunomodulatória, apoptose.

Artigo 3 132

Antitumor effects of the coordinated compound cis-

Tetraammine(oxalato)Ruthenium(III) Dithionate on K562 human

erythroleukemia cells



Cesar Augusto Sam Tiago Vilanova-Costaa ([email protected])


Lucas Carlos Gomes Pereiraa ([email protected])


Wagner Batista dos Santosc ([email protected])

Elisângela de Paula Silveira-Lacerdaa ([email protected])*

aLaboratório de Genética Molecular e Citogenética, Instituto de Ciências Biológicas, Universidade Federal de Goiás - UFG, Goiânia, Goiás, Brazil; bInstituto de Química, Universidade Federal de Uberlândia - UFU, Uberlândia, Minas Gerais, Brazil; cFaculdade Patos de Minas - FPM, Patos de Minas, Minas Gerais, Brazil. *Corresponding author: Elisângela de Paula Silveira Lacerda, e-mail:

[email protected]





Cx. Postal:

Goiânia-GO, Brasil – 74

Phone/Fax +55-62-3521-1481

Cell Phone +55-62-9293-3121

Artigo 3 133

Abstract: Leukemia is a major type of cancer affecting a significant segment of the

population, and especially children. The American Cancer Society (ACS) estimated that

35,070 new cases of leukemia would be diagnosed in the United States in 2009, whereas

about 22,280 adults and children would die of leukemia during 2009 (American Cancer

Society, 2009). Chemotherapy is a common treatment for leukemia (Ge et al., 2009).

Ruthenium complexes have shown potential utility in chemotherapy and photodynamic

therapy (Clarke, 2003; Ronconi & Sadler, 2007). The identification of new chemotherapeutics

agents is critical for further progress in the treatment of leukemia. Ruthenium complexes


in cancer tissues (Sava et al., 1998; Alessio et al., 2004). Based on these evidences, in the

present work we studied the antitumor activity of the Ruthenium(III) compound cis-

Tetraammine(oxalato)Ruthenium(III) Dithionate {cis-[Ru(C2O4)(NH3)4]2(S2O6)} against

human erythroleukemia (K562) tumor cell line. The antiproliferative and cytotoxic activity

revealed that K562 cells cultured with concentrations 40 and 150 μM of Ruthenium(III)

compound showed significant reduction of proliferation after 72h of exposition, with

viabilities ranging from 88.2% to 55.6% when treated with 40 µM for 24 and 72h; and 76.2%

to 26.7% when treated with 150 µM for 24 and 72h. The Ruthenium(III) compound induced

low [22.4% (24h) to 28.2% (48h) and 29.8% (24h) to 35.7% (48h) for concentrations 10 and

40 µM, respectively] to moderate [44% (24h) and 53% (48h) for concentration 150 µM] of

cytotoxic activity against K562. After incubation for 48 h, the IC50 value was 18.28 µM.

Compared to the cell cycle profiles of untreated cells, flow cytometric analysis indicated a

sub-G1 arresting effect of Ruthenium compound on K562 cells, inducing a 1.7-fold, 2.2-fold

and 2.4-fold increase in the number of sub-G1 cells for 24, 48 and 72 h, respectively, when

compared to control. The compound also caused a significant increase in tailed cells in any of

the concentrations tested compared with negative control, that can be associated cytotoxicity

with direct effect on K562 cells DNA. Additional studies are needed to determine the

molecular mechanisms of the active components and to evaluate the potential in vivo

anticancer activity of the cis-Tetraammine(oxalato)Ruthenium(III) Dithionate.

Keywords: cis-Tetraammine(oxalato)Ruthenium(III) Dithionate; Cytotoxicity; Antitumor

activity; K562, Ruthenium(III) compounds; immunomodulatory activity, Apoptosis.

Artigo 3 134

1. Introduction

Leukemia is a major type of cancer affecting a significant segment of the population,

and especially children. In fact, leukemia is the most frequent childhood cancer, with 26% of

all cases, and 20% mortality (Canadian Cancer Society, 2005). The American Cancer Society

(ACS) estimated that 35,070 new cases of leukemia would be diagnosed in the United States

in 2009, whereas about 22,280 adults and children would die of leukemia during 2009

(American Cancer Society, 2009).

Although the incidence rate for this disease remains relatively unchanged, some

success has fortunately been attained in its treatment. But even if the success of clinical trials

in identifying new agents and treatment modalities has been significant, current treatments

have many limitations related to their side effects and the development of acquired drug

resistance (Jarry et al., 2003). The new therapeutic agents thus needed should be more active

and produce less side effects and they also should act through a mechanism different from that

of cytotoxic agents already used (Menezes et al., 2007; Silveira-Lacerda et al., 2009b).

Chemotherapy is a common treatment for leukemia (Ge et al., 2009). In general the

therapy uses a number of different anticancer drugs, which destroy cancer cells by preventing

them from growing and dividing rapidly. Unfortunately, a number of the body's normal, non-

cancerous cells (e.g., hair cells, red and white blood cells, blood-clotting platelets, and cells of

the gastrointestinal mucosa) also divide rapidly and are harmed by chemotherapy (Ge et al.,

2009; Kim et al., 2002). The side effects of chemotherapy hamper many normal activities of

patients undergoing treatment (Kim et al., 2002).

The preparations of metallocomplexes with potential antitumor activity has been one

of the main targets of transition metal chemistry since Rosenberg’s discovery of cisplatin

{cis-diamminedichloridoplatinum(II), cis-[Pt(NH3)2Cl2]} cytotoxic activity in the 1960s

(Rosember et al., 1965). In 1978, cisplatin was approved as the first platinumbased drug for

Artigo 3 135

the oncology treatment, although several negative side-effects (nephrotoxicity, neurotoxicity,

nausea, etc.) had been induced on treated patients (Kelland & Farrell, 2000). Nevertheless,

cisplatin was followed by carboplatin {cis-diammine-1,1´ -

cyclobutanedicarboxylateplatinum( II), [Pt(NH3)2(cbdc)], approved in 1985} and oxaliplatin

{1R,2R-diamminocyclohexaneoxalatoplatinum(II), [Pt(dach)(ox)], approved in 1996}, which

met requirements of improving antitumor activity and reducing disadvantages of cisplatin,

carboplatin and oxaliplatin represent the second, and third platinum-based drug generations,

respectively (Kelland & Farrell, 2000; Štarha et al., 2009). Nowadays, not only platinum-

bearing complexes are extensively studied with the aim to broaden a spectrum of transition

metal-based complexes which could be used in the treatment of cancer (Štarha et al., 2009).

Ruthenium complexes have shown potential utility in chemotherapy and

photodynamic therapy (Clarke, 2003; Ronconi & Sadler, 2007). Ruthenium complexes


in cancer tissues (Sava et al., 1998; Alessio et al., 2004). In vitro and in vivo studies show

high anticancer activity of Ruthenium complexes and some of them are currently undergoing

clinical trials (Jakupec et al., 2005; Hartinger et al., 2006).

The identification of new chemotherapeutics agents is critical for further progress in

the treatment of leukemia. In comparison to the platinum(II) antitumor complexes currently

used in the clinic, Ruthenium compounds offer potentially reduced toxicity, a novel

mechanism of action, the prospect of non-cross-resistance, and a different spectrum of activity

(Clarke, 2003; Alessio et al., 2004). The reduced toxicity is in part due to the ability of

Ruthenium complexes to mimic the binding of iron to molecules of biological significance,

exploiting the mechanisms that the body has evolved for non-toxic transport of iron (Frasca et

al., 2001). This reduced toxicity, together with non-cross-resistance in cisplatin-resistant

cancer cells, is particularly attractive attributes of these complexes (Allardyce et al., 2003).

Artigo 3 136

Based on these evidences, in the present work we studied the antitumor activity of the

Ruthenium(III) compound cis-Tetraammine(oxalato)Ruthenium(III) Dithionate {cis-

[Ru(C2O4)(NH3)4]2(S2O6)} against human erythroleukemia (K562) tumor cell line.

2. Material and methods

2.1. Synthesis of cis-[Ru(C2O4)(NH3)4]2(S2O6)

The cis-[Ru(C2O4)(NH3)4]2(S2O6) complex was synthesized at the Universidade

Federal de Uberlândia (UFU, Minas Gerais, Brazil) following a standard protocol (Pereira et

al., 2008). The compound was characterized by electronic spectra at room temperature with

the HP 8453 spectrophotometer with diodes arrangement, interfacing a compatible PC HP

Vectra XM, using quartz cells. Carbon and hydrogen microanalyses were performed by the

staff of the Analitical Centre of the Chemistry Institute of Universidade de São Paulo (USP,

São Paulo, Brazil).

2.2. Cell culture.

The human erythroleukemia (K562) cell line (ATCC number CCL-243TM) was

obtained from the American Type Culture Collection (ATCC, Rockville, MD, USA). The

cells were cultured in RPMI 1640 medium (pH 7.2-7.4) supplemented with 100U mL-1

penicillin G, 100μg mL-1 streptomycin, 2 mM L-glutamine, 1.5 g L-1 sodium bicarbonate, 4.5

g L-1 glucose, 10 mM HEPES, 1.0 mM sodium pyruvate and 10% fetal calf serum (FCS) (all

reagents were obtained from Gibco, Grand Island, NY, USA) at 37°C, 5% CO2 and

humidified atmosphere.

The cells were disposed into 96 well plates (1×105 cells/well) and cultured in RPMI

1640 medium. Cells were harvested at specified intervals and the number of cells per well

was determined by cell counting with a hemocytometer (Neubauer chamber). Briefly, tumor

Artigo 3 137

cells were aspirated, washed in sterile PBS and an aliquot of the cell suspension was put in

Trypan Blue 1% (m/v) (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA) and counted. Only cell dilutions

with > 95% of viable cells were included in the posteriors analysis.

2.3. Cell Viability (Trypan blue staining)

The viability of the K562 cells was evaluated by the trypan blue exclusion assay. The

tumor cells were incubated for 24 h, 48 h and 72 h with different concentrations of the tested

Ruthenium compound (from 0.015 – 32 µM) at 37 °C. Additionally, Carboplatin (50 µM) and

Paclitaxel (25 µM) were applied as positive control. After incubation, the cells were washed

in PBS (pH 7.4) and suspended in a complete RPMI 1640 medium. Then 40 µL of the trypan

blue solution (0.4%, Sigma) and 10 µL of the cell suspension were mixed and after 5 min the

percentage of viable K562 cells was evaluated under brightfield optical microscope using a

newbauer chamber. The correlation between the viable cells (that excluded trypan blue dye)

and dead cells (stained cells) were assessed. The results are presented as mean±S.D. (standard

deviation) from three independent experiments.

2.4. Cytotoxicity assay.

Cytotoxic activity of cis-[Ru(C2O4)(NH3)4]2(S2O6) on K562 was measured by

modified MTT assay (Mosmann, 1983), which is based on the reduction of yellow 3-(4,5-

dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyl tetrazolium bromide (MTT) to dark-blue, insoluble

formazan in mitochondria of the living cells. The MTT assay was performed in 96-well tissue

culture plates (Nalge-Nunc, Rochester, NY, USA) as follows: the cells (1 × 105/well) were

seeded in tissue culture plates and incubated with the different concentrations of Ruthenium

compound (from 0.15 – 150 µM) dissolved in a total volume of 100 μL/well for 24 h and 48 h

at 37 °C and 5% CO2. The cells incubated with medium only served as a control. Following

Artigo 3 138

the exposure to the tested substances, the cells were incubated with 10 μL of MTT solution (5

mg mL-1) (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA) for 3 h. The microplates were then

centrifuged (300× g/15 min/10°C) and the culture media were discarded. Afterwards 200 μl

of PBS/20% of SDS (lauryl sulfate) solution (Sigma-Aldrich, USA) was added to each well to

stop the reaction and plates were kept in the dark overnight. After the next 12 h the

absorbance of dissolved formazan was measured by a Stat Fax 2100 microplate reader

(Awareness Technology, Palm City, FL, USA) at 565 nm. The cell viability was expressed in

% related to control (100% of viability). The cytotoxic rate was calculated as follows:

cytotoxicity (%) = [1 - (absorbance of the treated wells)/(absorbance of the control

wells)]×100%. The cytotoxic effect of the tested substances was determined in at least three

independent experiments, where each one of the culture plates contained the wells with tested

concentration in triplicate, the wells with control (cells in medium) and the blank (culture

medium alone). The 50% inhibitory concentration (IC50) value was determined using

GraphPad Prism 4.02 for Windows (GraphPad Software, San Diego, CA, USA).

2.5. DNA laddering assay.

Briefly, 2×106 cells (K562) were treated with different concentrations of cis-

[Ru(C2O4)(NH3)4]2(S2O6) (from 0.15 – 150 µM) for 24 h at 37 °C and 5% CO2. Cells were

harvested and centrifuged at 300×g/15 min/10°C and washed with PBS. The cells were then

ressuspended at a concentration of 1×106 cells mL-1 in an extraction buffer (1 mol Tris-HCl, 2

mol Na2EDTA, 0,5g m L-1 SDS) and treated with 20 mg L-1 RNase A at 37°C for 60 min,

followed by incubation with proteinase K (100 mg L-1) at 37°C for 60 min. An equal volume

of saline solution (NaCl 6 M) was added to the cells and centrifuged at 13,000×g for 10min.

The supernatant was collected and 2 volume ethanol (-20°C) were added. The samples were

centrifuged at 13,000×g for 30 min at 4°C. The supernatant was then discarded and the pellets

Artigo 3 139

dissolved in TE buffer (1×). The concentration of DNA was detected using a UV

spectrophotometer (Beckman DU-640, USA). The DNA (5 µg/tube) was transferred to a

1.5% agarose horizontal gel, and electrophoresis was performed at 100V cm-1 for 90 min. The

DNA in the gels was visualized by ultraviolet transillumination after staining with ethidium

bromide (5 µg mL-1) using an Omega® molecular imaging system (UltraLum Inc., Claremont,

CA, USA).

2.6. Comet Assay

An aliquot of from each K562 culture was taken after 24 and 48 h incubation for the

alkaline version of the comet assay (Ribeiro et al., 2009). The compound cis-

[Ru(C2O4)(NH3)4]2(S2O6) was studied at different concentrations (from 10 – 150 µM).

Briefly, 300 μL of the cell suspension was centrifuged for 5 min (500 rpm) in a refrigerated

microcentrifuge (Sorvall Legend Mach 1.6 R, Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA,

USA). The resulting pellet was homogenized with 80 μL of a low melting point agarose

(0.5%), spread onto microscope slides pre-coated with a normal melting point agarose (1.5%),

and covered with a cover slip. After 5 min at 4°C, the cover slip was removed, and the slides

were immersed in cold lysis solution [2.4 M NaCl, 100 mM ethylenediamine tetraacetic acid

(EDTA), 10 mM Tris, 10% DMSO, and 1% Triton-X, pH 10] for 24 h.

After lysis, the slides were placed in an electrophoresis chamber and covered with

electrophoresis buffer (300 mM NaOH per 1 mM EDTA, pH>13) for a remaining 20 min to

allow DNA unwinding. The electrophoresis proceeded for 20 min (25 V and 300 mA).

Afterwards, the slides were submerged for 15 min in a neutralization buffer (0.4 M Tris– HCl,

pH 7.5), dried at room temperature, and fixed in 100% ethanol for 5 min. All the steps were

conducted in the dark to prevent additional DNA damage. Slide staining was performed

immediately before analysis using ethidium bromide (20 μg mL−1). Slides were prepared in

Artigo 3 140

duplicate, and 100 cells were screened per sample (50 cells from each slide) in a fluorescent

microscope (Leica Microsystems GmbH, Wetzlar, Germany) equipped with an excitation

filter of 515–560 nm and a barrier filter of 590 nm using a ×40 objective. The nucleus was

classified according to the migration of the fragments using the software CometScore 15

according to Ribeiro et al., 2009).

For damage index calculation, cells were sorted into four classes, according to tail

size. The damage index (DI) is the sum of classes of the 100 cells analyzed per fish, and may

vary from 0 (all cells undamaged – 0×100) to 400 (all cells highly damaged – 4×100). The

damage index is based on the length of migration and on the amount of DNA in the tail, and it

is considered a sensitive measurement of detectable DNA damage (Grisolia et al., 2009). To

quantify the damage to the DNA, the following formula was used:

DI (au) = N1 + N2 + N3 + N4 S/100

where DI = DNA damage index, au = arbitrary unit, N1 - N4 = nucleoids in levels 1, 2, 3 and

4, S = number of nucleoids analyzed, including level 0.

2.7. Cell Cycle Analysis by flow cytometry

In order to investigate the possible effect of the Ruthenium compound on cell cycle

progression, K562 cells were treated with different concentrations of cis-

[Ru(C2O4)(NH3)4]2(S2O6) (from 1.5 – 150 µM) for 24, 28 and 72 h. Briefly, 5×105 cells were

harvested by centrifugation, washed with PBS, fixed with 70% (v/v) cold aqueous ethanol and

stored overnight at -20 ◦C. The fixed cells were washed with PBS and incubated with

propidium iodide (PI; Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA) containing 0.05% RNase.

Samples were incubated at 4 ◦C in the dark and analyzed by flow cytometry (FACS CantoII,

BD Biosciences, San José, CA, USA). The percentage of cells in G1, S, G2 and sub-G1 was

analyzed using ModFit LT software (Verity Software House, Topsham, ME, USA).

Artigo 3 141

2.8. Statistical analysis.

Three independent in vitro experiments were carried out. Statistical results were

expressed as the mean ± standard deviation of the means obtained from triplicates of each

independent experiment. Correlation tests were performed to determine the effects of

concentration of Ruthenium complex on tumor cell lines. Statistical significance of

differences *(p<0.05) as compared to untreated cells (control) was evaluated by applying

analysis of variance (ANOVA) and Tukey or Dunnet’s post tests, when applicable. The IC 50

(concentration that produces a 50% inhibitory effect on the evaluated parameter) was

graphically obtained from the dose-response curves.

3. Results

3.1. The cis-[Ru(C2O4)(NH3)4]2(S2O6) compound reduces viability of K562 cells

Results derived from Trypan blue staining essay revealed that K562 cells cultured with

concentrations 40 and 150 μg mL-1 of Ruthenium(III) compound showed significant reduction

of proliferation after 72h of exposition, with viabilities ranging from 88.2% to 55.6% when

treated with 40 µM for 24 and 72h; and 76.2% to 26.7% when treated with 150 µM for 24 and

72h (Figure 2).

3.2. The cis-[Ru(C2O4)(NH3)4]2(S2O6) compound presents cytotoxic activity towards

K562 tumor cell lines

To verify the cytotoxic activity of cis-[Ru(C2O4)(NH3)4]2(S2O6) on K562 cell lines,

tumor cells were cultured for 24 and 48h in the presence of different concentrations of

Ruthenium compound. MTT reduction assay revealed that Ruthenium compound produced

dose and time-dependent cytotoxic effects on K562 cells. The results (Figure 3a) show that

the Ruthenium(III) compound induced low [22.4% (24h) to 28.2% (48h) and 29.8% (24h) to

Artigo 3 142

35.7% (48h) for concentrations 10 and 40 µM, respectively] to moderate [44% (24h) and 53%

(48h) for concentration 150 µM] of cytotoxic activity against K562. After incubation for 48 h,

the IC50 value was 18.28 µM (Figure 3b).

3.3. The cis-[Ru(C2O4)(NH3)4]2(S2O6) induced apoptosis in K562 cells as verified by DNA

ladder analysis.

The significantly reduced number of K562 cells in the presence of cis-

Tetraammine(oxalato)Ruthenium(III) Dithionate on previous essays suggests that this

compound could be inducing cell death via apoptosis. To examine pro-apoptotic properties of

the Ruthenium(III) compound, K562 cells were cultured in the presence of different

concentrations of Ruthenium compound (from 0.15 – 150 µM) and then DNA ladder analysis

was performed via agarose gel electrophoresis. K562 cells cultured in the presence of

Ruthenium compound did not present DNA fragmentation (Data not shown).

3.4 The cis-[Ru(C2O4)(NH3)4]2(S2O6) presents genotoxic effects against K562 tumor cells.

The alkaline comet assay has been used to assess the possible genotoxicity of cis-

Tetraammine(oxalato)Ruthenium(III) Dithionate against K562 cells. Results indicate that

K562 tumor cells cultured with Ruthenium(III) complex show a significant increase in DNA

damage index in any of the concentrations tested compared with negative control, in a dose-

dependent manner (Figure 4). Results show an average DNA damage index of 59 for 10 µM,

140 for 40 µM, 176 for 150 µM when K562 tumor cells were exposed to Ruthenium(III) for

24 h; and 108 for 10 µM, 154 for 40 µM and 197 for 150 µM, for 48 h of exposition. Thus,

the concentration of cis-[Ru(C2O4)(NH3)4]2(S2O6) might be associated cytotoxicity with direct

effect on K562 cells DNA (P<0.05).

Artigo 3 143

3.5 The cis-[Ru(C2O4)(NH3)4]2(S2O6) increased the number of K562 tumor cells in sub-

G1 phase, an indicative of apoptosis.

The cell cycle distribution of K562 cells treated with different concentrations of

Ruthenium compound (from 1.5 – 150 µM) for 24, 48 and 72h revealed a prominent

increasing of cells on sub-G1 phase at concentration 40 and 150 µM and reduction on G1, S

and G2 phases. Figure 5 shows that treatment with 40 and 150 µM of cis-

[Ru(C2O4)(NH3)4]2(S2O6) for 24, 48 and 72h caused an increase in the proportion of cells in

the sub-G1-peak correlating with fewer cells in G1, S and G2. The fraction of sub-G1 cells

increased from 34.5% in the control to 59% at 24h; 30.7% in the control to 68.6% at 48h;

35.5% in the control to 84.7% for 72h on cells treated with 40 µM of cis-

Tetraammine(oxalato)Ruthenium(III) Dithionate. The same effect was observed when A549

tumor cells were treated with 150 µM of Ruthenium(III) compound. The Ru(III) compound

caused a minor S phase accumulation after incubation at concentrations of 40 and 150 µM for

all periods of exposition (Table 1).

4. Discussion

Apoptosis is an active physiological process resulting in cellular self-destruction that

involves specific morphological and biochemical changes in the nucleus and cytoplasm

(Kostova, 2006). Agents that suppress the proliferation of malignant cells by inducing

apoptosis may represent a useful mechanistic approach to both cancer chemoprevention and

chemotherapy. While many anticancer agents have been developed, unfavourable side effects

and resistance are serious problems (Panchal, 1998). Since the introduction of cisplatin in

cancer therapy, metal complexes and organometallic compounds have been gaining

importance in oncology (Kostova, 2006; Sanna et al., 2002). Metal-based compounds increase

Artigo 3 144

the possibility of developing molecules better-suited for binding to specific biological targets

(Sanna et al., 2002; Hartinger et al., 2006).

Ruthenium complexes appear particularly promising; although they exhibit lower

cytotoxicity as compared to cisplatin, they are better tolerated in vivo (Sanna et al., 2002;

Hartinger et al., 2006; Menezes et al., 2007). Thus, there is growing interest in the use of new

organometallics for the treatment of various cancers and the development of safer and more

effective therapeutic agents (Kostova, 2006; Silveira-Lacerda et al., 2009b). In the present

work, we studied the cytotoxic activity of cis-Tetraammine(oxalato)Ruthenium(III)

Dithionate cytotoxic towards human erythroleukemia (K562) tumor cell line.

The antiproliferative activity of cis-Tetraammine(oxalato)Ruthenium(III) Dithionate, a

Ruthenium-based complex, have been evaluated in vitro against human leukemia (K562) cells

using trypan blue and MTT assay. Inhibition of cell proliferation is an important potency

indicator for chemotherapeutic drugs. As shown in Figures 2 and 3b, the tested compound

induces cell death in a dose and time dependent manner on K562 cells. It is found that the

effect was improved linearly while prolonging the incubation time. The determined IC50

values of this complex, 18.28 µM (Figure 3a), is considerably the same of those of the

commercially used antineoplastic drugs cisplatin (IC50 = 11 µM) and oxaliplatin (IC50 = 18

µM) on the same tumor cell line (Štarha et al., 2009). These results corroborate previous

observations that Ruthenium(III) complexes induces cytotoxicity towards tumor cells such as

human Jurkat, HeLa and SK-BR-3, and murine S-180 and A-20 tumor cell lines (Frasca et al.,

2001; Silveira-Lacerda et al., 2009b).

To explore the mechanisms of the cytotoxic effects produced by cis-

Tetraammine(oxalato)Ruthenium(III) Dithionate, drug-induced changes in cell cycle

distribution were examined. Compared to the cell cycle profiles of untreated cells, flow

cytometric analysis indicated the sub-G1 arresting effect of Ruthenium compound on K562

Artigo 3 145

cells, as Ru(III) Dithionate already induced a 48.2% increase in the number of sub-G1 cells

after a 48h incubation. The Ru(III) compound caused a minor S phase accumulation after

incubation at concentrations of 40 and 150 µM for all periods of exposition (Figure 5).

Treatment with 40 µM of cis-[Ru(C2O4)(NH3)4]2(S2O6) induced respectively a 1.7-fold, 2.2-

fold and 2.4-fold increase in the number of sub-G1 cells when compared to control for 24, 48

and 72 h, respectively (Table 1).

Furthermore, another important biochemical sign of apoptosis was studied: DNA

laddering and fragmentation (data not shown), possibly representing DNA cleavage into

oligonucleosomal fragments through activation of the cysteine protease caspase-3, which is

involved in the proteolytic cleavage of key downstream proteins such as poly (ADP-ribose)

polymerase (PARP) (Bortner et al., 1995; Clarke & Stubbs, 1996). This process ultimately

results in DNA fragmentation and apoptotic death (Bortner et al., 1995). Although this type of

binding has been suggested to mimic, to some extent, cisplatin-induced DNA crosslinking,

other types of damage may exist that dominate or contribute to the biological activity of this

drug prototype.

Several studies have been using this test to corroborate the results obtained in other

assays. In the present study, results derived from DNA laddering assay did not show K562

DNA fragmentation, instead the results shows DNA integrity and even differences on DNA

content. Is important note that this data does not corroborate with more sensitive techniques

such as flow cytometry and comet assay, used in this work. These techniques confirmed that

the Ruthenium(III) compound interfere on cell cycle and induces cells to enter apoptosis.

Thus, we can infer that the technique of DNA gel electrophoresis is not best assay to assess

the degradation of genome DNA.

The present study also evaluated the DNA-damaging effects detected by the alkaline

version of the comet assay in K562 cancer cells. This assay has been used as a test to predict

Artigo 3 146

the risk to develop certain diseases (renal cell carcinoma, cancers of the bladder, esophagus,

and lung) due to susceptibility of the individual to DNA damage (Ribeiro et al., 2009). The in

vitro comet assay is proposed as an alternative to cytogenetic assays in early

genotoxicity/photogenotoxicity screening of drug candidates as well as for neurotoxicity

(Witte et al., 2007).

The alkaline comet assay has been used to assess the genotoxicity of chemicals,

environmental exposures to carcinogens, toxins, and physical agents both in vitro and in vivo

(Trzeciak et al., 2000; Sekihashi et al., 2002). This method was also used to measure DNA

repair capacity in live cells (Banath et al., 1998) and acellular systems (Dusinská et al., 2004).

In our study, cis-[Ru(C2O4)(NH3)4]2(S2O6) shows a significant increase in tailed cells

in any of the concentrations tested compared with negative control (Figure 4). Consequently,

the concentration of cis-[Ru(C2O4)(NH3)4]2(S2O6) might be associated cytotoxicity with direct

effect on K562 cells DNA. Thus, it can be deducted that Ruthenium-based compounds present

selectivity to enter both tumor and normal cells. It is known that all the body cells present

transferrin receptors, particularly tumor cells, in which these receptors are found in higher

numbers. Due to these features, higher quantities of Ruthenium complexes penetrate tumor

tissue, reduce Ruthenium (III) to Ruthenium (II) and binding to DNA (guanine), and promote

strand breaks (Clarke & Stubbs, 1996; Lebwohl & Canetta, 1998; Sava & Bergamo, 2000;

Katsaros & Anagnostopoulou, 2002; Galanski et al., 2003; Desoize, 2004). Another

hypothesis is that even in small quantities this compound might enter normal cells, because

Ruthenium (III) complexes are activated only by its reduction when it finds an environment

with high concentration of glutathione, low pH, and occurrence of hypoxia. It is very common

to find tumor cells presenting these conditions since it is known that these cells have high

levels of glutathione and oxygen consumption when the nutrients are quickly used due to their

accelerated development promoting hypoxia (Sava & Bergamo, 2000). Consequently, these

Artigo 3 147

cells need more glycolitic energy, which increases the level of lactic acid in the tissues and

causes a decrease in the media pH. It is worth emphasizing that Ruthenium (III) compounds

can be used as pro-drugs that are activated by in vivo reduction to Ruthenium (II) (Desoize,

2004; Sava & Bergamo, 2000).

Broadening the chemotherapeutic arsenal depends on understanding existing agents

with a view toward developing new modes of attack. Indeed, few of the coordinated

compounds may function in a manner analogous to cisplatin, which appears to bend DNA by

cross-linking adjacent guanines, thereby causing a class of DNA binding proteins to adhere to

the site. Overall, the broad class of Ruthenium(III) antitumor agents appears to differ from

cisplatin by favoring interstrand rather than intrastrand cross-links (Clarke et al., 1999). In

agreement with this hypothesis, it was demonstrated that NAMI-A induced apoptosis in the

ECV304 transformed human endothelial and KP1019 in colorectal carcinoma cell lines via

activation of caspase-3 and DNA fragmentation (Bortner et al., 1995; Nunez et al., 1998;

Kapitza et al., 2005).

Despite the resounding success of cisplatin and closely related platinum antitumor

agents, the movement of other transition-metal antitumor agents toward the clinic has been

exceptionally slow (Clarke et al., 1999). Non-Platinum chemotherapeutic

metallopharmaceuticals hold much promise for the future, and needs to be actively explored

in a large variety of tumor types in combination therapies. Besides the already well

established NAMI-A and KP-1019 activities on gastrointestinal, breast, prostate, and ovarian

cancers (Bergamo et al., 1999; Pluim et al., 2004, Bergamo & Sava, 2007) the present results

indicate that cis-[Ru(C2O4)(NH3)4]2(S2O6) is worthy of further development as a potential

anti-tumor drug that could be used in the treatment of leukemia. Thus, additional studies are

needed to determine the molecular mechanisms of the active components and to evaluate the

Artigo 3 148

potential in vivo anticancer activity of the cis-Tetraammine(oxalato)Ruthenium(III)

Dithionate.

Acknowledgments

The authors gratefully acknowledge the financial support of Research and Projects

Financing (FINEP) (Grant No.01.06.0941.00/CT-Saúde to Elisângela de Paula Silveira-

Lacerda), Brazilian National Counsel of Technological and Scientific Development (CNPq)

through fellowship to Flávia de Castro Pereira (Grant No. 131960/2008-3) and Coordination

for the Advancement of Higher Education Staff (CAPES) through fellowship to Aliny Pereira

de Lima and Cesar Augusto Sam Tiago Vilanova-Costa.

Funding sources

There are no financial or personal interests that might be viewed as inappropriate

influences on the work presented herein. This manuscript was completely financed by

governmental and nonprofit institutions, Brazilian National Counsel of Technological and

Scientific Development (CNPq), Research and Projects Financing (FINEP) and Coordination

for the Advancement of Higher Education Staff (CAPES).

Ethical Approval

No studies involving humans or experimental animals were conducted in this work.

The human lung carcinoma (A-549) cells was purchased from the American Type Culture

Collection (ATCC, Rockville, MD, USA) and cultured in vitro.

Abbreviations

cis-[Ru(C2O4)(NH3)4]2(S2O6) cis-Tetraammine(oxalato)Ruthenium(III) Dithionate

DMSO dimethyl sulfoxide

EDTA ethylenediaminetetraacetic acid

Artigo 3 149

ELISA enzyme-linked immunosorbent assay

IC50 50% inhibitory concentration

K562 human erythroleukemia tumor cell line

MTT 3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazolium

bromide

NAMI-A imidazolium-trans-DMSO-imidazole-

tetrachlororuthenate

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Figure 1. Chemical structure of cis-Tetraammine(oxalato)Ruthenium(III) Dithionate.

Artigo 3 155

C- (Cell

s and M

edium) M)

μ

Ru (0.01

5 M)μ

Ru (0.15

M)μ

Ru (1.5

M)μ

Ru (10

M)μ

Ru (40

M)μ

Ru (150

M)μ

C+ (Carb

oplatin 50

M)μ

C+ (Pac

litaxe

l 25

0

10

20

30

40

50

60

70

80

90

100

**

24h 48h 72h 24h 48h 72h 24h 48h 72h24h 48h 72h 24h 48h 72h24h 48h 72h 24h 48h 72h 24h 48h 24h 48h


Cel

l via

bilit

y (%

)

Figure 2. Anti-proliferative activity of cis-Tetraammine(oxalato)Ruthenium(III) Dithionate

compound towards K562 cell line. The tumor cells were cultured in the presence or absence

of cis-[Ru(C2O4)(NH3)4]2(S2O6) (0.015 – 150 µM) for 24 h and 48 h as described in Material

and Methods. The cell viability was assessed by correlation between the viable cells (that

excluded trypan blue dye) and dead cells (stained cells) using a newbauer chamber. The data

show the mean±S.D. (standard deviation) of three independent experiments [GraphPad Prism

version 4.02 for Windows (GraphPad Software, San Diego, California, USA)]. *p<0.05 vs.

negative control.

Artigo 3 156

Figure 3. Cytotoxic activity of cis-Tetraammine(oxalato)Ruthenium(III) Dithionate compound towards K562 cell line (a and b). The tumor cells were cultured in the presence or absence of cis-[Ru(C2O4)(NH3)4]2(S2O6) (0.15 – 150 µM) for 24 h and 48h as described in Material and Methods. The ruthenium-based compound cytotoxicity was assessed by measuring the absorbance of dissolved formazan using a microplate reader. The reduction of yellow 3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyl tetrazolium bromide (MTT) to dark-blue, insoluble formazan only occurs in mitochondria of the living cells. The data show the mean±S.D. (standard deviation) of three independent experiments [GraphPad Prism version 4.02 for Windows (GraphPad Software, San Diego, California, USA)]. *p<0.05 vs. negative control. # = 0%. Dotted line = IC50 concentration for 48h of treament.

C- (Cell

s and M

edium) M)μ

Ru (0.15

M)μ

Ru (1.5

M)μ

Ru (10

M)μ

Ru (40

M)μ

Ru (150

010

20

30

4050

60

70

80

90100

# #24h 48h 24h 48h 24h 48h 24h 48h 24h 48h 24h 48h

** *

*


Cel

ls C

ytot

oxic

ity (%

)

-7.0 -6.5 -6.0 -5.5 -5.0 -4.5 -4.0 -3.50

10

20

30

40

50

60

70

80

90

100

IC50 = 18.28 µM

Cis-[Ru(C2O2)(NH3)4]2(S2O6) concentration (log nM)

Cel

l Via

bilit

y (%

)b a

Artigo 3 157

24h 48h0

50100150200250300350400

Control - (Cell and Medium)Ru (10 µM)Ru (40 µM)Ru (150 µM)C+ (Cisplatin 50 µM)

** * * *

* *


DN

A D

amag

e In

dex

Figure 4. Induction of DNA strand breaks of K562 cells cultured in the presence of cis-

[Ru(C2O4)(NH3)4]2(S2O6) compound. Cultures of K562 cells were exposed to increasing

concentrations of Ruthenium (III) complex for 24 and 48 h and submitted to SCGE-analysis.

DNA damage index was measured as described in materials and methods section. Results in

the figure represent the mean ±S.D. of 3 independent experiments using triplicate samples.

*Increased above control at P<0.05.

Artigo 3 158

Figure 5. Cell cycle profile histogram of K562 cells treated with cis-Tetraammine(oxalato)Ruthenium(III) Dithionate. . Tumor cells were cultured with different concentrations of cis-[Ru(C2O4)(NH3)4]2(S2O6) (from 1.5 – 150 µM), maintained for 24, 48 and 72h h, and then collected, washed with PBS, and stained with propidium iodide as described in “Material and Methods” section. PI fluorescence was analyzed by flow cytometry (FACS Canto II, BD Biosciences, San José, CA, USA).

Control Ru 1.5 µM Ru 10 µM Ru 40 µM Ru 150 µM

24h 48h 72h

Artigo 3 159

Control Ru 1.5 µM Ru 10 µM Ru 40 µM Ru 150 µM 24 h Mean ±S.D Mean ±S.D Mean ±S.D Mean ±S.D Mean ±S.DSub-G1 34.45 ±0.6 30.20 ±2.1 31.20 ±1.4 59.00 ±2.3 68.90 ±1.8G1 27.20 ±0.3 25.25 ±2.1 19.55 ±0.9 11.50 ±1.7 14.75 ±0.9S 19.05 ±0.1 27.50 ±1.1 29.10 ±1.1 18.60 ±2.1 11.40 ±0.8G2 14.10 ±0.1 14.85 ±0.8 18.10 ±0.7 9.15 ±1.6 4.00 ±0.1

48 h Sub-G1 30.70 ±0.7 24.65 ±1.1 40.55 ±2.6 68.60 ±1.1 67.60 ±0.1G1 35.65 ±0.6 31.70 ±1.0 14.85 ±2.6 8.35 ±0.4 19.30 ±0.4S 21.35 ±0.4 30.05 ±0.8 26.35 ±2.1 14.35 ±0.9 9.75 ±0.2G2 10.00 ±1.4 12.50 ±0.3 17.05 ±2.3 7.85 ±0.1 2.95 ±0.1

72 h Sub-G1 35.50 ±16.0 34.50 ±1.4 45.95 ±1.1 84.70 ±0.3 70.50 ±2.8G1 35.45 ±10.1 31.75 ±0.5 17.05 ±0.2 4.95 ±0.1 18.70 ±1.0S 20.05 ±4.7 23.80 ±0.6 26.05 ±0.6 7.20 ±0.6 9.25 ±1.6G2 7.45 ±0.8 9.30 ±0.4 10.50 ±0.3 3.10 ±0.1 1.45 ±0.2

Table 1. Cell cycle analysis of K562 tumor cell lines after treatment with cis-Tetraammine(oxalato)Ruthenium(III) Dithionate. The percentage of cells in G1, S, G2 and sub-G1 was analyzed using ModFit LT software (Verity Software House, Topsham, ME, USA). Percentage of viable cells at each phase of the cell cycle (G0-G1, S, G2-M). Data represent mean values±SD of triplicate samples or a histogram for each condition and cell type. The results shown are representative of at least three similar experiments. *p<0.05 vs. control

Conclusões 160

7. CONCLUSÕES

• O composto Ditionato de cis-Tetramino(oxalato)Rutênio(III) apresentou uma

notável atividade inibitória do ciclo de células meristemáticas de Allium cepa,

ao invés de promover a morte celular ou a clastogenicidade.

• Os resultados provenientes da análise do teste Allium cepa mostraram um

efeito tempo-dose dependentes, onde, quanto maior a dose do complexo de

rutênio e o tempo de tratamento, menor o índice mitótico das células

meristemáticas, mostrando que a concentração de rutênio (III) teve um

impacto maior do que o tempo de exposição;

• O composto Ditionato de cis-Tetramino(oxalato)Rutênio(III) apresentou

atividade antitumoral in vitro sobre as linhagens tumoral de Leucemia mielóide

crônica humana (K562) com IC50 igual a 18,28 µM e Carcinoma alveolar de

pulmão humano (A549) com IC50 igual a 33,72 µM, e leve atividade citotóxica

sobre células normais de Fibroblasto de pulmão humano (MRC-5);

• O composto Ditionato de cis-Tetramino(oxalato)Rutênio(III) induziu a

incapacidade de formação de colônia na linhagem A549 em concentrações

superiores a 40 µM;

• O composto Ditonato de cis-Tetramino(oxalato)Rutênio(III) induziu um alto

percentual de danos no DNA das células tumorais K-562 em concentrações

superiores a 10 µM;

• O composto Ditionato de cis-Tetramino(oxalato)Rutênio(III) interferiu no ciclo

celular das células tumorais K562, afetando a progressão do ciclo celular,

reduzindo o número de células em fase G1, S e G2 e aumentando o

percentual de células em sub-G1, revelando um forte efeito apoptótic.

Referências Bibliográficas 161

8. CONSIDERAÇÕES FINAIS

Apesar do grande sucesso alcançado pelos compostos de platina no

tratamento de diferentes tipos de tumores desde a década de 1970, os estudos

envolvendo outros agentes antitumorais baseados em metais de transição têm se

mostrado excepcionalmente escassos.

O modelo presente de tratamento do câncer ainda se baseia, em muito, no

desenvolvimento de agentes farmacológicos que ajam seletivamente sobre as

células de tecidos neoplásicos. Contudo, os agentes quimioterápicos atualmente

disponíveis, manifestam toxicidade significativa sobre os tecidos normais, o que

acarreta maior complicação do seu uso clínico, levando à profundas reflexões sobre

os critérios que se deve considerar acerca dos riscos versus benefícios da

quimioterapia. Apesar disso, os estudos sobre quimioterápicos coordenados não-

platinados têm apresentado resultados bastante promissores. Tais resultados levam

à necessidade de se estudar, ativamente, a grande variedade de agentes

organometálicos em diferentes tipos tumorais, explorando assim, novos mecanismos

de ação, que podem levar ao desenvolvimento de novas terapias contra o câncer.

No presente estudo, utilizamos diferentes metodologias que permitiram avaliar

os efeitos citotóxicos, genotóxicos e antitumoral do organometálico Ditionado de cis-

Tetramino(oxalato)Rutênio(III). Estes testes fazem parte da primeira fase dos

estudos necessários para a liberação de novos medicamentos no mercado, exigidos

pela ANVISA.

Inicialmente, avaliamos a capacidade do composto de Rutênio (III) de inibir a

proliferação celular e de induzir alterações genotóxicas, através do teste Allium cepa,

que utilizam células do meristema apical de bulbos do vegetal cebola. Foram

também realizadas análises de citotoxicidade através do Teste MTT e do teste de


coloração por Azul de Tripano, que permitiram avaliar um possível efeito citotóxico

do composto de Rutênio(III) sobre células tumorais e sadias de humanos e murinos.

Os resultados provenientes da análise do teste clonogênico, permitiram avaliar a

capacidade das células tumorais e normais em formar colônias após o tratamento

com o composto de Rutênio(III). A análise do ciclo celular e de indução de apoptose

de células tumorais pela citofluorimetria de fluxo, permitiu avaliar o efeito do

composto de Rutênio(III) sobre o processo de divisão celular, assim como a sua

capacidade de induzir apoptose sobre as linhagens tumorais estudadas. A análise

de dano ao DNA, através do ensaio cometa, permitiu avaliar a atividade genotóxica

do composto de rutênio(III) sobre linhagens tumorais e, finalmente, a análise de

fragmentação do DNA, através eletroforese em gel de agarose, permitiu também

avaliar a atividade genotóxica do composto.

A metodologia utilizada neste trabalho vem sendo utilizada por vários

pesquisadores, em diversos tipos de células e para várias finalidades, permitindo

analisar de forma prática, os compostos sintéticos ou derivados de produtos naturais

com potencial atividade antitumoral.

Os nossos resultados indicaram que o composto de Rutênio(III) inibiu a

proliferação celular em células de Allium cepa, sem contudo provocar alterações

clastogênicas significativas, demonstrando que o composto tem reduzida atividade

sobre células normais. A mesma ausência de efeito citotóxico foi observada nas

células de fibroblasto humano MRC5. Estes resultados corroboram os estudos que

apontam que os compostos de rutênio apresentam uma notável atividade inibitória

do ciclo celular de células tumorais, sem, contudo, promover a morte celular ou a

clastogenicidade em células sadias (Frasca et al., 2001; Menezes et al., 2007;

Silveira-Lacerda et al., 2009a). Finalmente, os resultados provenientes do presente


estudo indicam que o composto organometálico Ditionado de cis-

Tetramino(oxalato)Rutênio(III) {cis-[Ru(C2O4)(NH3)4]2(S2O6)} é digno de estudos mais

aprofundados que, possivelmente, podem levar ao desenvolvimento de um novo

fármaco com efeito antitumoral.


9. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS

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Anexos 174

10. ANEXOS Anexo 1

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