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SEPSEA Pró-Reitoria de Pós-Graduação e Pesquisa

Pós-Graduação em Ciências Genômicas e Biotecnologia

Centro de Analises Proteômicas e Bioquímicas

O uso da clavanina A nanoestruturada

no controle da sepse polimicrobiana

Brasília - DF

2012

Autor: Amanda Caroline Marques Saúde

Orientador: Dr. Octávio Luiz Franco

Coorientador: Drª Simoní Campos Dias

AMANDA CAROLINE MARQUES SAÚDE

O USO DA CLAVANINA A NANOESTRUTURADA

NO CONTROLE DA SEPSE POLIMICROBIANA

Dissertação apresentada ao Programa de Pós-Graduação Stricto Sensu em Ciências Genômicas e Biotecnologia da Universidade Católica de Brasília, como requisito parcial para obtenção do Titulo de Mestre em Ciências Genômicas e Biotecnologia.

Orientador: Dr. Octávio Luiz Franco

Coorientadora: Simoní Campos Dias

Brasília

2012

Ficha elaborada pela Biblioteca Pós-Graduação da UCB

26/09/2012

S255u Saúde, Amanda Caroline Marques.

O uso da clavanina a nanoestruturada no controle de sepse

polimicrobiana. / Amanda Caroline Marques Saúde – 2012.

89f. ; il.: 30 cm

Dissertação (mestrado) – Universidade Católica de

Brasília, 2012.

Orientação: Prof. Dr. Octávio Luiz Franco

Coorientação: Simoni Campos Dias

1. Doenças bacterianas. 2. Serviços de saúde. 3. Engenharia

genética. I. Franco, Octávio Luiz, orient. II. Dias, Simoni Campos,

coorient. III.Título.

CDU 575

Dissertação de autoria de Amanda Caroline Marques Saúde, intitulada “O uso da Clavanina A

nanoestruturada no controle de sepse polimicrobiana”, apresentada como requisito parcial para

obtenção do grau de Mestre em Ciências Genômicas e Biotecnologia da Universidade Católica

de Brasília, em 09 de fevereiro de 2012, defendida e aprovada pela banca examinadora abaixo

assinada:

________________________________________________

Prof. Dr. Octávio Luiz Franco

Universidade Católica de Brasília.

_______________________________________________

Profª. Dra. Simoni Campos Dias


_______________________________________________

Drª.Susana Elisa Moreno

Universidade Católica Dom Bosco

(Examinador externo)

_______________________________________________

Dr. João Alexandre R. G. Barbosa


Brasília

2012

Dedico este trabalho aos meus pais, que me

propiciaram uma vida digna, e me ensinaram que tudo

é possível desde que sejamos honestos e tenhamos a

convicção de que sempre existem escolhas e, que a

desistência não é uma delas. E que sonhar e

concretizar são verbos proporcionais a nossa vontade.

AGRADECIMENTO

Aos meus pais que possibilitaram a realização desse sonho;

Aos meus irmãos que me apoiaram a continuar acreditando em tudo que ainda posso realizar.

Ao meu companheiro Marcio, que me apoiou de forma indescritível;

Ao professor Octávio Luiz Franco, que me apresentou o mundo científico e me mostrou os

melhores caminhos;

A professora Simoní Campos Dias, que além de coorientadora se tornou uma grande amiga;

Aos amigos, Alicia Ombredane, Bernardo Petriz e Mariana Dornelles que sempre estiveram ao

meu lado me ajudando e apoiando;

A todos do grupo CAPB, por proporcionarem um ambiente de trabalho agradável e propício ao

conhecimento científico e

Aos colaboradores João Alexandre R. G. Barbosa, Luciano Paulino da Silva, Osmar Nascimento

Silva e Susana Elisa Moreno por todo o auxilio e dedicação.

SAÚDE, A. C. M. O uso da clavanina A nanoestruturada no controle da sepse polimicrobiana. Tese

(Mestrado em Ciências Genômicas e Biotecnologia). Universidade Católica de Brasília. Brasília –DF. 2012.

RESUMO

A resistência de bactérias infecciosas a antibióticos têm sido considerada um enorme

problema mundial. Alguns estudos têm demonstrado a eficiência de peptídeos extraídos de

animais marinhos contra bactérias patogênicas humanas. Dentre estes, as clavaninas,

peptídeos catiônicos isolados do tunicado marinho Styela clava, apresentam uma grande

atividade bactericida. Neste trabalho a nanobiotecnologia foi utilizada para encapsular

clavanina A, objetivando o desenvolvimento de nanoantibióticos injetáveis contra sepse

bacteriana. Para isso, a clavanina A foi dissolvida em solução de polímero Eudragit® L100-

55 e copolímero Eudragit® RS30D (3:1 m:m). Os dados obtidos por microscopia de força

atômica e espectroscopia de espalhamento de luz dinâmico, demonstraram que as

nanopartículas secas apresentam cerca de 120 nm e em solução apresentam 372 nm,

respectivamente, com potencial zeta de -7,16 mV e índice de polidispersão de 0,123. A taxa

de encapsulação foi de 98 %, obtida utilizando-se cromatografia de fase reversa em coluna

Phenomenex C-18. Bioensaios in vitro demonstraram que a clavanina A nanoestruturada

apresentou 91 % de atividade bactericida, enquanto o peptídeo livre utilizando-se uma

concentração de 2 g.ml-1, não apresentou atividade inibitória. Nas mesmas concentrações

o peptídeo nanoestruturado causou 20 % de inibição do desenvolvimento de K. pneumoniae

e 40 % de P. aeruginosa. Não foi encontrada atividade inibitória contra as cepas de E. coli.

As nanopartículas contendo o peptídeo antimicrobiano clavanina A não apresentaram

atividade hemolítica. Os ensaios de sepse in vivo foram realizados utilizando-se

camundongos C57BL6 inoculados com 25 l de suspensão bacteriana contendo as quatro

espécies bacterianas previamente coletadas do ceco de camundongos. Estes ensaios

apresentaram 60 % de sobrevida dos camundongos induzidos a sepse letal na presença do

peptídeo nanoestruturado (2 g.ml-1). A clavanina A livre, em concentrações similares, não

apresentou nenhum efeito de sobrevida. Os dados aqui reportados mostram que a clavanina

A associada à nanoestrutura tem sua atividade aumentada e pode ser utilizada no

tratamento de infecções bacterianas. Desta maneira, estes estudos sugerem que as

nanopartículas podem ser utilizadas como uma metodologia eficaz no desenvolvimento de

produtos farmacêuticos e biotecnológicos através da potencialização da ação dos peptídeos

nanoencapsulados.

Palavras chave: Nanobiotecnologia. Clavanina A. Nanopartículas. Sepse.

ABSTRACT

The resistance of infectious bacteria against current medicines is a worldwide problem.

Previous studies have demonstrated the efficacy of peptides extracted from marine animals

against human pathogenic bacteria. Among them clavanins, which are antimicrobial peptides

isolated from marine tunicate Styela clava, show 23 amino acids residues, cationic properties

and also high bactericidal activity. In this work nanobiotechnology was used to encapsulate

the antimicrobial peptide clavanin A aiming to develop injectable nanoantibiotics against

bacterial sepsis. Firstly, clavanin A was dissolved in a polymer Eudragit® L100-55 and

copolymer Eudragit® RS30D solution (3:1 w:w). Atomic force microscopy and dynamic light

scattering showed dry nanoparticles ranging from height of 120 nm and nanoparticles in

aqueous solution with 372 nm, respectively, with zeta potential of -7,16 mV and

polidispersion index of 0.123 mV. An encapsulation rate of 98 % was assessed by using a

Phenomenex C-18 column reversed-phase chromatography. Bioassays showed that

nanostructured clavanin caused 91 % of S. aureus inhibition, while free peptide at a standard

concentration of 2 g.ml-1, was unable to inhibit bacterial development. Similar

concentrations of nanostructured peptide caused 20 % of development inhibition of K.

pneumoniae and 40 % of P. aeruginosa. Any inhibitory activity against E. coli was observed.

Furthermore, these structures do not showed hemolytic activity. In vivo sepsis bioassays

were performed by using C57BL6 mice inoculated with 25 l of bacterial suspension

containing the four bacterial species previously collected from mice cecum. These assays

presented a 60 % survival in mice induced to lethal sepsis in the presence of nanoformulated

peptides (2 g.ml-1). Free clavanin A at similar concentrations do not show any effect over

survival. Data here reported showed that clavanin A associated to nanostructures have their

antimicrobial activity improved and apparently could be utilized to threat bacterial infections.

Therefore, this study suggests that nanoparticles could be used as an effective method to

develop pharmaceuticals and biotechnology products using the potentialization of

nanoencapsulated peptides.

Key words: Nanobiotecnhology. Clavanin A. Nanoparticles. Sepsis.

LISTA DE ABREVIATURAS E SIGLAS

AFM (Atomic force microscopy)- Microscopia de Força Atômica

ANBIO – Associação Nacional de Biossegurança

CDC (Centre for Disease Control and Prevention) – Centro de controle e prevenção de

doenças

CO2 – Gás carbônico

DLS (Dinamic light scattering) – Espectroscopia de espalhamento de luz dinâmico

EDTA (Ethylenediamine tetraacetic acid) – ácido etilenodiamino tetra-acético

EHEC (Entero-hemorragic Escherichia coli) – Escherichia coli entero-hemorragica

ESBL - Enterobactérias produtoras de -lactamases

g – Gravidade

HPMC – Hidroxipopilmetil celulose

IAAS – Infecções Adquiridas em Serviços de Saúde

KPC - Klebsiela pneumoniae carpabenemase

M – Molar

mg – Miligrama

MIC – Concentração inibitória mínima

ml – Mililitro

MRPa – (Multi-drug Resistant Pseudomonas aeruginosa)

MRSA (Methicilin Resistant Staphylococcus aureus) – Staphylococcus aureus resistente a

meticilina.

MRSE (Methicilin resistant Staphylococcus epidermis) - Staphylococcus epidermis resistente

a meticilina

nm – Nanômetros

OMS – Organização Mundial de Saúde

PAMs – Peptídeos antimicrobianos

PBP (Penicilin Binding Protein) – Proteína ligada a penicilina

PBS (Phosphate buffered saline) – Tampão fosfato salino

PDI (polidispesity índex) – Índice de polidispersividade

PEG – Poli etileno glycol

PLGA ( poly(lactic-co-glycolic acid)) – Ácido polilático co-glicólico

SEM (Scanning eletron microscopy) – Microscopia eletrônica de varredura

SHU – Sindrome Hemolítica Urêmica

SIM – Sulfito, indol e motilidade

SIRS (Systemic inflammatory response syndrome) – Síndrome da resposta inflamatória

sistêmica

SRIS – Síndrome da Resposta Inflamatória Sistêmica

TFA – Ácido Triflouracético

TLRs – Receptores tool-like

TSI – Triplo, açúcar e ferro

UFC – Unidade Formadora de colônias

UTI – Unidade de Terapia Intensiva

VISA (Vancomycin-Intermediate Staphylococcus aureus) - Staphylococcus aureus resistente

a vancomicina

VRSA (Vancomycin resistant Staphylococcus aureus) - Staphylococcus aureus resistente a

meticilina.

g – Micrograma

l – Microlitro

LISTA DE TABELAS

Quadro 1: Principais agentes bacterianos causadores de Infecções Adquiridas em Sistemas

de Saúde e tipo de infecção a que estão relacionadas. 20

Quadro 2: Peptídeos antimicrobianos isolados de animais marinhos. 35

Quadro 3: Sequências primárias das clavaninas A-D. 37

Quadro 4: Grupos e tratamentos utilizados na realização dos testes de sepse in vivo,

realizados em camundongos C57B6 (black) : 52

Quadro 5: Grupos e tratamentos utilizados na realização dos testes inflamatórios in vivo,

realizados em camundongos C57B6 (black) : 53

LISTA DE FIGURAS

Figura 1: Porcentagem de uso de antibióticos sem prescrição médica nos diferentes países.

São descritas em vermelho as áreas que apresentam mais de 50 % de uso de antibióticos

sem prescrição médica, em roxo às que apresentam entre 20 e 50 %, em verde entre 5 e 19

% e em azul àquelas com menos de 5 %. 21

Figura 2: (A) Colônias típicas de S. aureus e (B) microscopia eletrônica de colônias de S.

aureus. 23

Figura 3: (A) Colônias típicas e (B) microscopia eletrônica de K. pneumoniae. 26

Figura 4: (A) Colônias típicas e (B) microscopia eletrônica de E. coli. 28

Figura 5: (A) Colônias típicas e (B) microscopia eletrônica de P. aeruginosa. 29

Figura 6: Mecanismos de formação de poros em membranas bacterianas por PAMs.

32

Figura 7: Múltiplas atividades relacionadas a funções antimicrobianas e imunomodulatórias,

apresentadas por diversos PAMs. 33

Figura 8: Tunicado Styela clava, do qual foi extraído o peptídeo antimicrobiano clavanina A

36

Figura 9: Exemplos de tipos de nanoestruturas utilizadas como carreadores de moléculas

bioativas (ilustração esquemática). (A) Dendrimeros, (B) Nanoemulsões, (C) Nanopartículas

Lipídicas sólidas, (D) Lipossomas (E) Nanopartícula metálicas (F) Ciclodextrina, (G)

Nanopartículas poliméricas (H) Nanotubo de carbono e (I) Fulerenos. 40

Figura 10: Nanopartículas poliméricas utilizadas como carreadores de moléculas bioativas

(ilustração esquemática). (A) Nanoesferas e (B) nanocápsulas 41

Figura 11: Estrutura molecular dos polímeros Eudragit® L100-55 (A) e RS 30D (B). 42

Figura 12: Nanoestruturas formadas a partir de sistema de emulsificação o/a, utilizando

polímero e copolímero em proporção 1:3 (respectivamente) adicionados de 100 g de

clavanina “A” sintética. Amostra não centrifugada e não diluída. 55

Figura 13. Nanopartículas poliméricas obtidas utilizando polímero e copolímero em

proporção 3:1 (respectivamente) adicionados de 100 g de clavanina “A” sintética. Imagens

obtidas por microscopia de força atômica, utilizando aparelho Agilent 9600 (Shimadzu,

Japão). Para obtenção da imagem utilizou-se superfície de mica muscovita. As imagens

foram corrigidas nos planos X e Y, as linhas que apresentavam má formação foram

retiradas. (A) Área de varredura de 50 x 50 m e (B) Área de varredura de 10 x 10 m.

56

Figura 14. Diâmetro das nanopartículas poliméricas obtidas utilizando polímero e copolímero

em proporção 3:1 (respectivamente) adicionados de 100 g de clavanina “A” sintética.

Análise obtida utilizando-se metodologia de Dynamic light scattering (DLS) em aparelho

Malvern Zetasizer Nano-Zs. As nanopartículas foram observadas em meio aquoso,

permitindo uma análise em solução de suas dimensões e propriedades. 58

Figura 15. Potencial zeta, das nanopartículas obtidas utilizando polímero e copolímero em

proporção 3:1 (respectivamente) adicionados de 100 g de clavanina “A” sintética. As

análises foram realizadas utilizando-se Dynamic light scattering (DLS) em aparelho Malvern

Zetasizer Nano-Zs. As nanopartículas foram observadas em meio aquoso, permitindo uma

análise em solução de suas dimensões e propriedades. 60

Figura 16. Teste de liberação com leituras a cada 12 horas, totalizando 48 h. Quantificação

de liberação por cromatografia de fase-reversa em coluna Phenomenex C-18. Utilizou-se

como parâmetro de quantificação a área do pico referente à presença do peptídeo,

comparada a área de picos previamente conhecidos, utilizando-se curva padrão de

quantificação. 62

Figura 17. Avaliação de atividade antibacteriana das nanoestruturas contendo clavanina A, a

uma concentração de 12g, contra Staphylococcus aureus. Utilizou-se como controle

negativo (c-) água destilada e como controle positivo (c+) o antibiótico comercial

cloranfenicol 40 g.ml-1. As barras verticais representam o desvio padrão. 63


uma concentração de 12g, contra Klebsiella pneumoniae. Utilizou-se como controle



Figura 19 Avaliação de atividade antibacteriana das nanoestruturas contendo clavanina A, a

uma concentração de 12g, contra Escherichia coli. Utilizou-se como controle negativo (c-)

água destilada e como controle positivo (c+) o antibiótico comercial cloranfenicol 40 g.ml-1.

As barras verticais representam o desvio padrão. 64


uma concentração de 12g, contra Pseudomonas aeruginosa. Utilizou-se como controle



Figura 21. Avaliação de atividade antibacteriana das nanopartículas contendo clavanina A

(N+P), a uma concentração de 12g, contra Staphylococcus aureus, Escherichia coli,

Klebsiella pneumoneae e Pseudomonas aeruginosa. Utilizou-se como controle negativo (c-)

água destilada e como controle positivo (c+) o antibiótico comercial cloranfenicol 40 g.ml-1.,

como comparativo foram utilizados o peptídeo livre (P.L.) e as nanopartículas sem o

peptídeo (N). As barras verticais representam o desvio padrão. 66

Figura 22. Ensaio hemolítico realizado com o uso de Triton X-100 0,1% como controle

positivo (C+), PBS 0,01M como controle negativo (C-). As barras verticais correspondem ao

desvio padrão. Foram utilizadas 12 g do peptídeo (clavanina A), as nanopartículas sem o

peptídeo e as nanopartículas contendo o peptídeo (12 g). 67

Figura 23. Análise de sobrevida realizada após indução de sepse subletal intraperitoneal,

com administração, também intraperitoneal, dos tratamentos de cada grupo. A indução de

sepse foi realizada utilizando-se um pool de bactérias constituído de S. aureus, E. coli, P.

aeruginosa e K. pneumoniae. O peptídeo livre (Pep.) foi comparado com o peptídeo

nanoestruturado (Nano. + Pep.) e a estrutura livre (Nanop.), o qual não contém o peptídeo,

utilizando-se diferentes concentrações do peptídeo nanoencapsulado (2, 4 e 12 g do

peptídeo clavanina A). 69

Figura 24. Análise de sobrevida realizada após indução de sepse letal intraperitoneal, com

administração, também intraperitoneal, dos tratamentos de cada grupo. A indução de sepse

foi realizada utilizando-se um pool de bactérias constituído de Staphylococcus aureus,

Escherichia coli, Pseudomonas aeruginosa e Klebsiela pneumoniae. O peptídeo livre (Pep.)

foi comparado com o peptídeo nanoestruturado (Nano. + Pep.) e a estrutura livre (Nanop.), o

qual não contém o peptídeo, utilizando-se diferentes concentrações do peptídeo

nanoencapsulado (2, 4 e 12 g do peptídeo clavanina A). 70

Figura 25. Análises de correlação de sepse e migração, realizadas após a indução de sepse

letal por via intraperitonial, com administração dos tratamentos de cada grupo. Os grupos

foram divididos em Letal, controle positivo (C+), 2 g de peptídeo nanoestruturado (Pep.

Nano) e nanoestrutura (Nano). A indução de sepse foi realizada utilizando-se um pool de

bactérias constituído de S. aureus, E. coli, P. aeruginosa e K. pneumoniae. O lavado

peritoneal foi obtido após 6 horas de indução de sepse. A análise estatística foi realizada por

ANOVA e Teste de Tukey, utilizando p>0,05, onde as amostras foram comparadas entre sí,

objetivando demonstrar sua similaridade (*). 72

Figura 26. Análise de migração de neutrófilos após indução de processo inflamatório por

carragenina, administrada por via intraperitoneal, com administração dos tratamentos de

cada grupo. A obtenção do lavado peritoneal foi realizada após 6 horas da administração do

indutor inflamatório. Foram utilizadas como controle positivo solução salina (salina) e

negativo a carragenina 500 g (Car.), as amostras de peptídeo livre (pep. Livre), peptídeo

nanoestruturado (Pep. Nano) e nanoestrutura (Nanoest.) foram comparadas aos controles

negativo e positivo visando a observação do efeito anti-inflamatório. A análise estatística foi

realizada por ANOVA e Teste de Tukey, utilizando p<0,05, onde as amostras foram

comparadas com as amostras controles sendo marcadas aquelas de acordo com a

similaridade entre a amostra e a solução salina (+) e a carragenina (*). 75

Figura 27. Análise de migração de neutrófilos após indução de processo inflamatório por

carragenina, administrada por via intraperitoneal, com administração dos tratamentos de

cada grupo. A obtenção do lavado peritoneal foi realizada após 12 horas da administração

do indutor inflamatório. Foram utilizadas como controle positivo solução salina (salina) e

negativo a carragenina 500 g (Car.), as amostras de peptídeo livre (Pep. Livre), peptídeo

nanoestruturado (Pep. Nano) e nanoestrutura (Nanoest.) foram comparadas aos controles

negativo e positivo visando a observação do efeito anti-inflamatório. A análise estatística foi

realizada por ANOVA e Teste de Tukey, utilizando p>0,05, onde as amostras foram

comparadas com as amostras controles sendo marcada a similaridade entre a amostra e a

solução salina (*), a carragenina (+) e a dexametasona (#). 76

SUMÁRIO

1. INTRODUÇÃO ................................................................................................ 18

1.1 INFECÇÕES ADQUIRIDAS EM SERVIÇOS DE SAÚDE (IASS) ..................... 18

1.2 INFECÇÕES SEPTICÊMICAS: DEFINIÇÕES E AGENTES CAUSAIS ........... 22

1.3 STAPHYLOCOCCUS AUREUS ...................................................................... 23

1.4 KLEBSIELLA PNEUMONIAE .......................................................................... 25

1.5 ESCHERICHIA COLI ....................................................................................... 27

1.6 PSEUDOMONAS AERUGINOSA .................................................................... 29

1.7 PEPTÍDEOS ANTIMICROBIANOS .................................................................. 30

1.8 PEPTÍDEOS ANTIMICROBIANOS EM ANIMAIS MARINHOS ........................ 33

1.9 CLAVANINAS .................................................................................................. 36

1.10 NANOBIOTECNOLOGIA................................................................................. 38

1.10.1 Nanocarreadores e sistemas poliméricos ......................................... 40

2. HIPÓTESE .......................................................................................................... 44

3. JUSTIFICATIVA .................................................................................................. 45

4. OBJETIVOS ........................................................................................................ 46

4.1 OBJETIVOS ESPECÍFICOS ........................................................................... 46

5. MATERIAL E MÉTODOS .................................................................................... 47

5.1 SÍNTESE E DETERMINAÇÃO DE PUREZA DOS PEPTÍDEOS SINTÉTICOS:

47

5.2 PREPARAÇÃO DAS NANOPARTÍCULAS POLIMÉRICAS: ............................ 47

5.3 ANÁLISE MORFOLÓGICA .............................................................................. 48

5.3.1 Microscopia de Força Atômica ........................................................... 48

5.3.2 Espectroscopia de espalhamento de luz dinâmico ........................... 48

5.4 BIOENSAIOS IN VITRO .................................................................................. 50

5.5 EFICIÊNCIA DE ENCAPSULAÇÃO ................................................................ 49

5.5.1 Quantificação de encapsulação ......................................................... 49

5.5.2 Testes de liberação in vitro ................................................................. 50

5.6 ANÁLISES IN VIVO ......................................................................................... 50

5.6.1 AVALIAÇÃO DE MIGRAÇÃO DE NEUTRÓFILOS ................................ 52

6. RESULTADOS .................................................................................................... 54

6.1 CARACTERIZAÇÃO DAS ESTRUTURAS: .................................................... 54

6.1.1 EFICIÊNCIA DE ENCAPSULAÇÃO E LIBERAÇÃO SUSTENTADA IN VITRO:

61

6.2 Ensaios in vitro .............................................................................................. 63

6.2.1 TESTE DE HEMÓLISE .......................................................................... 67

6.3 Análises in vivo ............................................................................................. 68

6.3.1 SOBREVIDA.......................................................................................... 68

6.3.2 ANÁLISES DE MIGRAÇÃO DE NEUTRÓFILOS: .................................. 73

6.3.3 ANÁLISES DE MIGRAÇÃO DE NEUTRÓFILOS APÓS INDUÇÃO DE SEPSE

71

7. CONCLUSÕES ................................................................................................... 78

8. REFERÊNCIAS: .................................................................................................. 79

18

1 INTRODUÇÃO

1.1 INFECÇÕES ADQUIRIDAS EM SERVIÇOS DE SAÚDE (IASS)

Diferente das infecções contraídas fora do ambiente hospitalar, também conhecidas

como infecções contraídas em comunidades, as infecções hospitalares são caracterizadas

como sendo adquiridas após a admissão em hospitais, se manifestando durante a

internação ou até mesmo após a alta e, podendo se relacionar com a internação ou com

procedimentos hospitalares (DOUGLAS, LUM, ROY ET AL., 2004). No entanto essas infecções

não estão restritas aos ambientes hospitalares; podendo estar relacionadas a todos os

locais onde há assistência ao paciente, envolvendo sistemas de não-internação, como

enfermarias, ambulatórios e consultórios, o que amplia a denominação de infecções

hospitalares para Infecções Adquiridas em Serviços de Saúde (IASS) (DOUGLAS ET AL.,

2004; PITTET, ALLEGRANZI, STORR ET AL., 2008). O aumento de infecções relacionadas aos

sistemas de saúde tem representado uma das principais causas de mortalidade e aumento

nos custos hospitalares, uma vez que prolongam o tempo de internação e valor dos

tratamentos (WEINSTEIN, 1998; PITTET ET AL., 2008).

Atualmente as IASS afetam milhões de pessoas por ano em todo o mundo,

representando um problema de saúde pública global. Estima-se que a incidência das IASS

seja em torno de 5-10 % nos países desenvolvidos e com frequência média de 27 % nos

países em desenvolvimento (PITTET ET AL., 2008). Segundo dados do Center for Disease

Control and Prevention (CDC), avalia-se que nos Estados Unidos ocorram dois milhões de

casos por ano com aproximadamente 5 % de óbito, estes casos levam a custo hospitalar de

US$ 4,5 bilhões. Em países em desenvolvimento como a Albânia, o Brasil, a Tanzânia, a

Tailândia e a Tunísia estima-se que 27 % dos pacientes internados em Unidades de Terapia

Intensiva (UTIs) adquiram IASS (PITTET ET AL., 2008). Segundo a Associação Nacional de

Biossegurança (Anbio), Agência Nacional de Vigilância Sanitária (ANVISA) e a Organização

mundial de Saúde (OMS) a incidência de infecções hospitalares representa entre 14 % e 19

% dos casos registrados em hospitais brasileiros. Esta porcentagem chega a representar

cerca de 100 mil óbitos por todo o Brasil (BENEVIDES, 2011).

Os índices de morbidade associados à IASS são diretamente relacionados à gravidade

da doença que levou o paciente ao sistema de saúde, as condições nutricionais, aos tipos

de procedimentos diagnósticos ou terapêuticos e ao tempo de permanência do paciente no

hospital (KLEVENS, MORRISON, NADLE ET AL., 2007). As UTIs tendem a apresentar índices

maiores de morbidade, uma vez que o estágio inicial e a intensidade de procedimentos, aos

19

quais os pacientes são submetidos, apresentam-se de forma mais grave do que nos demais

pacientes (PITTET ET AL., 2008).

Inúmeros micro-organismos são responsáveis pela formação da microbiota hospitalar,

sendo formada principalmente por bactérias, fungos e vírus (comumente destacados como

principais causadores de IASS). Entretanto, as bactérias estão relacionadas a 87 % dos

casos, representando assim, os principais agentes causadores destas infecções. Dentre as

infecções hospitalares estima-se que 32 % correspondem a infecções de trato urinário, 22 %

a infecções de sítio cirúrgico, 15 % a infecções pulmonares e 14 % a infecções da corrente

sanguínea, sendo que em UTIs, esta última pode chegar a taxas alarmantes de até 50 %

(KLEVENS ET AL., 2007).

Muitas bactérias constituem a microbiota humana normal, podendo causar

infecções em indivíduos imunodeprimidos ou debilitados. Outras bactérias são

naturalmente patogênicas, além de possuírem maior virulência, podendo causar

infecções esporádicas ou epidêmicas, independente do estado do hospedeiro (OMS,

2002; ANVISA, 2004). Dentre os micro-organismos patogênicos supracitados estão as

bactérias Gram-positivas como Staphylococcus aureus e Staphylococcus epidermidis e

as bactérias Gram-negativas como Escherichia coli, Pseudomonas sp., Klebsiella sp.,

Proteus sp., Enterobacter sp. e Serratia sp. No Quadro 1 observam-se os principais sítios

de isolamento destes patógenos (CARVALHARES, PESQUERO, QUINTANA ET AL., 2008).

20

Quadro 1: Principais agentes bacterianos causadores de Infecções Adquiridas em Sistemas

de Saúde e tipo de infecção a que estão relacionadas.

Patógeno Sítios de isolamento

Gram-negativas

Escherichia coli Trato urinário, feridas cirúrgicas e sangue

Pseudomonas aeruginosa Trato urinário, trato respiratório e queimaduras

Klebsiella pneumoniae Trato urinário, trato respiratório e em feridas cirúrgicas.

Proteus mirabilis Trato urinário e em feridas cirúrgicas.

Enterobacter aerogenes Trato urinário, trato respiratório e em feridas cirúrgicas.

Serratia marcescens Trato urinário, trato respiratório e em feridas cirúrgicas.

Gram-positivas

Staphylococcus aureus Trato urinário, trato respiratório, feridas cirúrgicas e sangue.

Staphylococcus epidemidis Trato respiratório, pele e sangue

*Adaptado de: Agência Nacional de Vigilância Sanitária - ANVISA; (2004) e Carneiro; (2008)

O aumento dos custos associados a tratamentos de pacientes com infecções

causadas por micro-organismos resistentes está diretamente relacionado com a escassez

de medicamentos específicos aumentando a estadia do paciente nos hospitais (WEINSTEIN,

1998; PITTET ET AL., 2008). Além dos organismos abaixo citados serem comumente

encontrados em sítios de infecções adquiridas nos sistemas de saúde, cepas resistentes

destes micro-organismos apresentam-se como um dos maiores problemas relacionados à

IASS (CARVALHARES ET AL., 2008). A evidência de resistência microbiana foi primeiramente

descrita em 1929, pelo bacteriologista Alexander Fleming que descreveu o primeiro

antibiótico isolado, a penicilina. Com esse estudo Fleming demonstrou também a resistência

de alguns micro-organismos, como Enterobactérias e Pseudomonas aeruginosa, a esse

medicamento (FLEMING, 1929).

Atualmente discute-se a relação entre a resistência bacteriana e a adaptação fisiológica em

resposta à mudança no ambiente, especialmente na membrana externa de natureza

lipoprotéica, que por sua vez, atua limitando a entrada de muitos tipos de moléculas,

21

inclusive agentes antibacterianos. Algumas bactérias Gram-negativas possuem, por

exemplo, a capacidade de responder a pressão de seleção por hidrolise do anel -lactâmico

por meio de lactamases, além de apresentar um fator de resistência conhecido como fator

R, plasmídeo que configura a resistência aos antibióticos, o qual pode ser disseminado por

conjugação (TAVARES, 2005; CARVALHARES ET AL., 2008; PADRÃO, MONTEIRO, MACIEL ET AL.,

2010).

Alguns autores ressaltam ainda, a ocorrência de mutações possivelmente induzidas

pelo uso indiscriminado de antibióticos em ambientes propícios a seleções mutagênicas

(como em hospitais, por exemplo). Morgan e colaboradores (2011) revisaram o uso de

antibióticos sem prescrição médica em trinta e cinco países, neste trabalho os autores

enfatizaram o alto índice de uso indiscriminado de antibióticos nos cinco continentes, como

demonstra a Figura 1. Com intuito de diminuir a ocorrência destes eventos, a Organização

Mundial da Saúde enfatiza a importância do uso de medicamentos apropriados para as

diversas condições clínicas, bem como a prescrição em doses adequadas e por período

suficiente para cura (PALMEIRA AND DA SILVA, 1994; SADER, MENDES, MONTELLI ET AL., 1998;

UENO AND JORGE, 2001; MARSARO JR, L;, LAZZARI ET AL., 2005).

Figura 1: Porcentagem de uso de antibióticos sem prescrição médica nos diferentes países.

São descritas em vermelho as áreas que apresentam mais de 50 % de uso de antibióticos

sem prescrição médica, em roxo às que apresentam entre 20 e 50 %, em verde entre 5 e 19

% e em azul àquelas com menos de 5 %.

*Fonte: (MORGAN, OKEKE, LAXMINARAYAN ET AL., 2011).

22

Para isso, faz-se necessária a existência de protocolos estratégicos que garantam a

prescrição e o uso racionais dos antibióticos atuais, após a restrição da venda destes

antibióticos não foi encontrado na literatura trabalhos que especifiquem as porcentagens de

uso indevido de antibióticos. Neste sentido o conhecimento sobre o perfil bacteriológico

encontrado nas UTIs permite o uso de antimicrobianos específicos, diminuindo

proporcionalmente o aparecimento de cepas multi-resistentes (OMS, 2002; CARVALHARES ET

AL., 2008; PADRÃO ET AL., 2010).

1.2 SEPSE: DEFINIÇÕES E AGENTES CAUSAIS

A definição e classificação de infecções que evoluem a quadros de sepse, sepse

grave e choque séptico relacionam-se diretamente à Síndrome da Resposta Inflamatória

Sistêmica (SRIS), esta resposta inflamatória pode ser desencadeada por diversos fatores,

dentre eles pode-se citar quadros de infecções, pancreatite, politrauma, isquemia, choque

hemorrágico, cirurgias e queimaduras (Bone, 1997). Desta forma a sepse caracteriza-se

pelo desencadeamento de SIRS relacionado a uma infecção, podendo, no entanto, evoluir

apresentando quadros de disfunções orgânicas secundárias, passando a ser definida como

sepse grave e, por fim, instabilidade cardiovascular, requerendo vasopressores, sendo

definida como choque séptico (MEDICINE, 1992 ).

A problemática causada pela grande incidência de infecções adquiridas em serviços

de saúde apresenta índices de morbidade diretamente relacionados ao estado inicial do

paciente e a intensidade de procedimentos, aos quais os pacientes são submetidos. Neste

sentido, a sepse apresenta-se como uma infecção de grande incidência e de difícil

tratamento, mesmo àquelas que não representam IASS (MEDICINE, 1992 ). Nos Estados

Unidos estima-se que de 20 a 80 % dos casos de sepse em UTI levem a óbito. Na América

Latina, incluindo o Brasil, os dados sobre a incidência de sepse são raros. No entanto,

estima-se que a incidência de sepse seja de 27 %, sendo que 23 % levam a óbito (SILVA

AND OTHER, 2002; CARVALHO, VIEIRA, FILHO ET AL., 2010).

Dentre os micro-organismos relacionados a septicemias são destacados fungos, vírus,

e bactérias. Dentre as bactérias são isoladas, principalmente, P. aeruginosa em 26,4 % dos

casos, S. aureus em 31,2 % dos casos, E. coli em 15,5 % e Klebisiella sp. em 8,59 %

(SALES JÚNIOR, DAVID, HATUM ET AL., 2006; CARVALHO ET AL., 2010). Poucas estratégias

utilizadas no tratamento da sepse bacteriana apresentam resultados positivos. Há grande

dificuldade de se encontrar fármacos eficazes no controle da infecção, SIRS e alterações

cardiovasculares. A Campanha de Sobrevivência a Sepse (Surviving Sepsis Campaign),

23

publicada em 2005 e revisada em 2008, teve como objetivo reduzir a mortalidade por

septicemias em 25 % em cinco anos, para isso o programa reforça o conceito de que no

tratamento da sepse tanto a precocidade quanto as ações guiadas por metas são de suma

importância, uma vez que essa infecção se apresenta como uma síndrome complexa, mas

reversível se abordada precocemente (HENKIN, COELHO, PAGANELLA ET AL., 2009; ARAÚJO,

2011).

1.3 Staphylococcus aureus

Staphylococcus aureus são cocos Gram-positivos da família Staphylococcaceae/

Micrococcaceae. Estes micro-organismos são catalase e coagulase positivos e oxidase-

negativos, apresentam diâmetro aproximado de 1,0 µm, são anaeróbios facultativos e

não esporulados, podem ser encontradas ao menos 200 variedades de espécies

(DURAI,NG AND HOQUE, 2010). S. aureus constituem uma colônia de cor amarelada

devido à produção de uma série de carotenóides, e distribuição na forma de cachos

irregulares (Figura 2), uma vez que as células se dividem sucessivamente em três planos

perpendiculares havendo ligação entre as células irmãs, após cada divisão sucessiva,

fato este, que determina a nomenclatura estafilococcus (MARSHALL AND WILMOTH, 1981).

S. aureus pode crescer em uma faixa de temperatura de 7,0 a 48,5 ºC (com temperatura

ótima entre 30-37 ºC), em pH entre 4,2-9,3 (sendo o pH ótimo entre 7,0-7,5) e em

concentrações de cloreto de sódio bastante elevados, cerca de 15 % (DURAI ET AL.,

2010).

Figura 2: (A) Colônias típicas de S. aureus e (B) microscopia eletrônica de colônias de S.

aureus.

*Fonte: Figura A (http://profjabiorritmo.blogspot.com) / 2011 e figura B

(http://farmaciainfoco.blogspot.com) / 2011. A B

A B

http://profjabiorritmo.blogspot.com/2010_09_01_archive.html

http://farmaciainfoco.blogspot.com/2011/04/grupo-de-bacterias-fica-resistente.html

24

Na maioria dos casos S. aureus pode habitar o corpo humano sem causar danos.

Estima-se que 60 % dos seres humanos saudáveis sejam portadores intermitentes de S.

aureus (LE LOIR,BARON AND GAUTIER, 2003). Quando em situações onde o sistema

imunológico encontra-se reprimido, como em casos de infecções secundárias (injúrias da

pele e doenças crônicas), o paciente pode se tornar vulnerável a infecções por esta

bactéria. A colonização por S. aureus pode causar inúmeras patologias, como por

exemplo, infecções localizadas ou disseminadas dentre elas foliculites, furúnculos,

carbúnculos, intoxicação alimentar, síndrome do choque tóxico, pneumonia, bacteremia,

gastroenterite estafilocócica, endocardite e osteomielite (MARSHALL AND WILMOTH, 1981;

LE LOIR ET AL., 2003). S. aureus coloniza principalmente o trato respiratório superior,

habitando primariamente a mucosa da nasofaringe. No entanto esta bactéria pode ser

encontrada regularmente em outros epitélios incluindo a pele, cavidade oral e o trato

gastrointestinal (KLUYTMANS,VANBELKUM AND VERBRUGH, 1997; LE LOIR ET AL., 2003).

A grande variedade de doenças humanas a que está relacionada S. aureus deve-

se a sua capacidade de produzir toxinas, exoenzimas, adesinas e proteínas

imunomoduladoras (LE LOIR ET AL., 2003). Desta forma a patogênese da infecção por S.

aureus pode ser caracterizada por um processo complexo, que envolve uma gama

diversificada de fatores de virulência associados à parede celular e secreção de

proteínas. Estas proteínas podem ser expressas coordenadamente em diferentes fases

de infecção tornando o tratamento ineficaz para cada fase infecciosa (NOVICK, PROJAN,

ROSENBLUM ET AL., 1984).

A produção de fatores de virulência em S. aureus tem sido controlada em

resposta a densidade de células, pelo fenômeno denominado quorum sensing, o qual

corresponde ao processo de comunicação intra e interespécies microbianas que permite

a regulação da expressão gênica em resposta a flutuações na densidade da população

celular. Além disto, fatores como a disponibilidade de energia e sinais ambientais são

produzidos quando necessário (NOVICK, 2003). Estes fatores podem ser organizados em

a) fatores de aderência como fibrinogênio, fibronectina, elastina e coagulase; b) fatores

relacionados à evasão da defesa do hospedeiro como enterotoxinas estafilocócicas (SEs

A-E, G-J, K, L, M, O e P), toxina esfoliativa A e TSST, proteína A, lipases e

polissacarídeos capsulares e c) fatores relacionados com a invasão e penetração/adesão

como toxinas α, β, δ, γ e δ – hemolisinas (NOVICK, 2003).

A resistência de S. aureus a penicilina surgiu após alguns anos de uso do

antibiótico, quando foram encontradas cepas de S. aureus capazes de produzir a enzima

25

penicilinase, a qual destrói a penicilina por hidrólise enzimática. Após a rápida disperção

do gene plasmidial que codifica a penicilinase tornou-se necessário o desenvolvimento de

antibióticos mais eficazes como a meticilina, uma penicilina modificada desenhada para

resistir à ação destrutiva da penicilinase estafilocócica. Porém, em 1961 (apenas dois

anos após liberação da meticilina para uso) o primeiro caso de S. aureus meticilina

resistente (Methicillin-Resistant Staphylococcus aureus - MRSA) foi relatado na

Inglaterra. A resistência à meticilina ocorre devido a síntese de uma nova proteína de

construção e manutenção da parede celular bacteriana, substituindo a proteína de

ligação à penicilina (Penicillin Binding Protein - PBP) pela PBP2a, a qual não pode ser

bloqueada pela ação do antibiótico (PAN, BATTISTI, ZONCADA ET AL., 2009; CARVALHO ET

AL., 2010).

Atualmente estas cepas representam mais de 60 % das infecções nos EUA, e

cerca de 40 % das infecções em hospitais brasileiros, sendo o risco de morte aumentado

em 2,5 vezes quando comparado a cepas sensiveis a meticilina. Em consequência

observou-se um aumento nos custos hospitalares de até 3,0 vezes quando comparados

aos custos relacionados a infecções por cepas não resistentes (PAN ET AL., 2009;

PANTOSTI AND VENDITTI, 2009; CARVALHO ET AL., 2010). A resistência a meticilina levou a

incorporação do uso da vancomicina no tratamento de pacientes infectados por MRSA.

Em 1996 vários trabalhos reportaram isolados resistentes à vancomicina, dentre as cepas

MRSA resistentes a vancomicina são descritas MRSA com Resistência Intermediária à

Vancomicina (Vancomycin-Intermediate S. aureus – VISA) e, MRSA Resistente à

Vancomicina (Vancomycin-Resistant S. aureus – VRSA) podendo-se também encontrar

S. aureus resistentes a vancomicina, mas não a meticilina (JENKINS, 2006).

1.4 Klebsiella pneumoniae

Bactérias do gênero Klebsiella têm como características morfológicas células

variando entre 0,3-1,0 μm de diâmetro e 0,6-6,0 μm de comprimento (Figura 3), são

diferenciadas das demais enterobactérias por apresentarem uma espessa cápsula

polissacarídica, estas bactérias apresentam temperatura ótima de crescimento a 37 ºC.

Dentre as espécies do gênero Klebsiela as espécies K. pneumoniae, K. oxytoca e K.

planticola tem sido comumente isoladas em ambientes hospitalares (PODSCHUN AND

ULLMANN, 1998).

26

Figura 3: (A) Colônias típicas e (B) microscopia eletrônica de K. pneumoniae.

*Fonte: (http://www.gefor.4t.com) / 2011.

Entre 1970 e 1980 um alto índice de infecções causadas por bactérias do gênero

Klebsiella foram associados à IASS, o que levou a um aumento no uso das

cefalosporinas. O uso cada vez mais disseminado deste antibiótico levou a grande

pressão de seleção destes micro-organismos, tornando necessária a produção de novas

gerações de cefalosporinas, sendo elas de 1ª a 5ª geração (COLOMBO, JANINI, SALOMAO

ET AL., 2009). Entre 1990 e 1996, um dos patógenos Gram-negativos mais comuns

consistia na K. pneumoniae, sendo esta responsável por 32 % das IASS. Como um

patógeno oportunista, Klebsiella sp. desenvolve-se primariamente em indivíduos

imunodeprimidos hospitalizados ou que apresentem alguma doença debilitante grave. Em

1998 estimava-se que 8 % de todos os casos de IASS dos Estados Unidos e Europa

tinham como principal agente K. pneumoniae, a qual correspondia por uma porção

significante de pneumonias, septicemias e infecções brandas em tecidos relatadas em

UTIs. Entre 2007 e 2011 foi observado um índice de mortalidade de 58 %, relacionado a

infecções causadas por bactérias carbapenemases em pacientes em UTIs (PODSCHUN

AND ULLMANN, 1998; ANVISA, 2011).

A carbapenemase, enzima capaz de conferir resistência a penicilinas,

cefalosporinas e monobactâmicos, foi inicialmente relatada em K. pneumoniae nos EUA,

em 1996, e encontrada posteriormente em outros países, incluindo Israel, China, Europa,

América Central, América do Sul e, recentemente, Brasil. Os primeiros relatos de K.

pneumoniae carbapenemase (KPC) no Brasil datam do ano de 2005, emergindo em São

Paulo, e sendo cada vez mais descritas na literatura, com casos em várias cidades

brasileiras, dentre elas Rio de Janeiro, Recife, Londrina, Belém do Pará e Brasília. Entre

2009 e 2010 este micro-organismo causou 70 mortes na capital paulista e atualmente já

A B

A B

http://www.gefor.4t.com/bacteriologia/klebsiella.html

27

registrados 135 casos de pessoas contaminadas com a bactéria, sendo 18 óbitos no

Distrito Federal, dispersa tanto pela rede pública de saúde quanto na particular

(MONTEIRO, SANTOS, ASENSI ET AL., 2009; PAVEZ,MAMIZUKA AND LINCOPAN, 2009;

PEIRANO, SEKI, VAL PASSOS ET AL., 2009; DIENSTMANN, PICOLI, MEYER ET AL., 2010).

1.5 Escherichia coli

Dentre as bactérias Gram-negativas, as Enterobactérias representam 80 % dos

isolados microbiológicos. Sendo responsáveis por cerca de 70 % das infecções urinárias

e 50 % das septicemias relacionadas a casos de IASS. A maior parte das Enterobactérias

pode ser encontrada no trato gastrointestinal humano, no reino animal, na água, no solo e

nas plantas. Dentre as Enterobactérias isoladas em infecções destacam-se Klebsiella sp.,

Escherichia coli, e Proteus sp.. A predominância destas espécies pode ser explicada pela

alta de virulência das cepas, causada pela existência de fimbrias, que auxiliam na

aderência a superfícies ou membranas mucosas (ANVISA, 2004; TORTORA,FUNKE AND

CASE, 2005). As E. coli (Figura 4) são bacilos anaeróbios facultativos, catalase positivos e

oxidase negativos. Podem apresentar dimensões entre 0,5 µm de diâmetro e 1,5 µm de

comprimento. E. coli são anaeróbias facultativas e podem se desenvolver em

temperaturas variando entre 8 e 48 ºC, com temperatura ótima de crescimento em 39 ºC

e pH tendendo a neutralidade, sendo bem resistentes a pHs levemente ácidos ou

básicos, 9 e 5, respectivamente (NEIDHARDT,INGRAHAM AND SCHAECHTER, 1990 ; VELOSO,

2006).

Dentre os enterococos, a bactéria E. coli tem sido descrita como o principal

agente identificado em infecções sanguíneas, sejam comunitárias ou relacionadas a

serviços de saúde, podendo ser, também relacionados como causadores primários de

infecções no trato urinário, meningite neonatal, septicemia hospitalar e enterites. As

infecções por E. coli apresentam índice de mortalidade entre 32 e 50 % em ambiente

hospitalar, comumente associado a resistência a antibióticos atuais (VON BAUM AND

MARRE, 2005; SANTOS, PIGNATARI, SILVA ET AL., 2009).

28

Figura 4: (A) Colônias típicas e (B) microscopia eletrônica de E. coli.

*Fonte: Figura A (http://archive.microbelibrary.org/) / 2011 e figura B

(http://criandocriancas.blogspot.com) / 2011.

Algumas cepas de E. coli possuem capacidade de resistência à drogas atuais como

ampicilina, sulfonamidas e doxiciclina. A resistência à amoxicilina/ácido clavulánico,

trimetoprim/sulfametoxazol e ciprofloxacina tem evoluído nos últimos seis anos

apresentando taxas que variam entre 20 % e 30 % de aumento de resistência a estes

antibióticos (SILVA, 2009). Em cepas de E. coli a mudança conformacional do rRNA, por sua

metilação, resulta na co-resistência aos macrolídeos, lincosamidas e estreptogramina

(GEORGOPAPADAKOU, RUSSO, LIEBMAN ET AL., 1987).

Em 2011, foram registrados 3.092 casos de Síndrome Hemolítica Urêmica (SHU),

causada por Escherichia sp.. O surto atingiu 16 países sendo 14 situados na Europa. Na

Alemanha, foram registrados 2.229 casos de infecções por E. coli, com 9 óbitos, alem

disto 759 casos de SHU foram relatados , sendo 21 fatais (OMS, 2011). Nos Estados

Unidos, foram notificados 3 casos de SHU e 1 caso suspeito de infecções causadas por

E. coli enterohemorragica (Entero-hemorragic Escherichia coli - EHEC). No Canadá,

houve relato de 1 caso suspeito de EHEC (OMS, 2011). Segundo Bezuidt e colaboradores

(2011) o surto causado pela bactéria EHEC teve como base a combinação de

características do genoma de cepas de E. coli, as quais permitiram novos determinantes

de virulência. Os autores demonstraram que as cepas encontradas em fezes de humanos

apresentavam determinantes de virulência que permitiam seu acesso a tecidos extra-

intestinais, causando infecções sistêmicas (BEZUIDT, PIERNEEF, MNCUBE ET AL., 2011).

A B

http://archive.microbelibrary.org/asmonly/details_print.asp?id=2289&lang=

http://criandocriancas.blogspot.com/2011/06/como-proteger-seu-filho-da-bacteria-e.html

29

1.6 Pseudomonas aeruginosa

Pseudomonas spp. são bacilos Gram-negativos com dimensões que variam entre 0,5

– 1,0μm de largura e 1,5 – 5,0μm de comprimento, aeróbios, não-esporulados, não-

fermentadores de glicose e móveis devido à presença de um flagelo polar. Pseudomonas

sp. são amplamente distribuídos, já que apresentam poucas exigências para seu

desenvolvimento. Estes micro-organismos podem se desenvolver em temperaturas de até

42°C. Pseudomonas aeruginosa (Figura 5), pode utilizar diferentes substratos como fonte de

carbono, desta forma pode ser isolada de água, plantas, solo e tecidos animais (MURRAY,

DREW, KOBAYASHI ET AL., 1992).

P. aeruginosa representa uma das espécies do gênero Pseudomonas com maior

importância clinica, uma vez que apresenta alto potencial de virulência. Este potencial pode

ser associado a fatores estruturais e às toxinas produzidas por P. aeruginosa, dentre os

quais se podem destacar a cápsula polissacarídea, a exotoxina A e a exoenzima S. P.

aeruginosa pode ser caracterizada de acordo com sua coloração, uma vez que os

pigmentos piocianina (azul) e pioverdina (fluorescente), além dos pigmentos piorrubina

(coloração avermelhada) e a piomelanina (coloração marrom / preto), são característicos

desta espécie (MURRAY ET AL., 1992).

Figura 5: (A) Colônias típicas e (B) microscopia eletrônica de P. aeruginosa.

*Fonte: Figura A (http://wdict.net/es/word/pseudomonas) / 2011 e figura B

(http://pseudomonas.com/p_aerug.jsp) / 2011.

P. aeruginosa apresenta-se, principalmente, de forma oportunista sendo,

comumente, associada a pacientes imunocomprometidos com neutropenia, diabetes mel-

litus, queimaduras extensas e neoplasias, além disto, o comprometimento do processo

respiratório normal por procedimentos invasivos ou ventilação mecânica, os quais tornam o

A B

http://wdict.net/es/word/pseudomonas+aeruginosa/

http://pseudomonas.com/p_aerug.jsp

30

individuo mais suscetível a infecções por este patógeno (LEVIN, BARONE, PENÇO ET AL.,

1999).

A resistência da espécie P. aeruginosa a antibióticos usuais, como os

carbapenemos, pode ser associada a diferentes mecanismos de resistência, dentre eles:

resistência intrínseca por indução cromossômica, alteração de sitio de ação, degradação do

antimicrobiano por produção de enzimas, sistemas de bomba efluxo do antimicrobiano,

alteração da permeabilidade da membrana externa de Gram-negativos e tolerância ao

antimicrobiano por produção de biofilme. Desta forma P. aeruginosa multiresistente

(multidrug resistent P. aeruginosa – MRPa) pode apresentar resistência a combinação

drogas, dificultando o tratamento de infecções causadas por estas cepas (LOMOVSKAYA, LEE,

HOSHINO ET AL., 1999; OIE, UEMATSU, SAWA ET AL., 2003; FERREIRA AND LALA, 2010).

1.7 PEPTÍDEOS ANTIMICROBIANOS

A proteção contra patógenos tem sido primordial para o sucesso evolutivo das mais

diversas espécies. Neste sentido são encontradas inúmeras linhas de defesas com

mecanismos de ação distintos. Dentre eles os peptídeos antimicrobianos desempenham

papel fundamental na proteção contra outros organismos e são encontrados em animais,

plantas, bactérias e fungos, entre outros (ZHANG, GU, CHAN ET AL., 2008).

No intuito de se produzir fármacos e produtos biotecnológicos efetivos contra micro-

organismos patogênicos, a purificação de peptídeos antimicrobianos se tornou uma

ferramenta útil, possibilitando o uso de centenas destes (PAMs) isolados. Os diferentes

PAMs isolados possuem origem distinta, assim como o seu espectro de atividade e

estrutura, apresentando algumas propriedades comuns como revisadas por Kindrachuck e

colaboradores (2010). Estes peptídeos possuem, comumente: a) sequências menores que

60 resíduos de aminoácidos (geralmente entre 12 e 50 aminoácidos, principalmente L-

aminoácidos); b) carga líquida positiva (geralmente entre +2 e +9) devido à presença de

resíduos básicos de lisina, arginina ou histidina, juntamente com domínios hidrofóbicos (em

torno de 50 % de resíduos hidrofóbicos); c) características anfipáticas e, d) grande

variedade em dobramentos estruturais, incluindo α-hélices, folhas-β, hélices estendidas e

loops (KINDRACHUK,NIJNIK AND HANCOCK, 2010).

Estas características conferem aos PAMs a capacidade de interagir com as mais

diversas membranas lipídicas, as quais se tornam alvos eficientes no mecanismo de ação

destes peptídeos. Assim, esses peptídeos podem apresentar amplo espectro de atividade

31

contra vários alvos, incluindo bactérias Gram-positivas e Gram-negativas, fungos, parasitas,

vírus, entre outros (KINDRACHUK ET AL., 2010). Os PAMs podem, também, apresentar

atividade sobre componentes intracelulares, o qual pode ocorrer de diversas formas, dentre

elas, se deslocando através da membrana citoplasmática e atuando sobre o metabolismo,

se ligando ao DNA, inibindo a replicação, a transcrição e a tradução, inibindo atividade

enzimática e síntese de parede celular ou até mesmo estimulando os mecanismos de

defesa do hospedeiro, aumentando ainda mais seu potencial antimicrobiano (KINDRACHUK ET

AL., 2010).

A atividade destas moléculas está diretamente relacionada à seqüência de

aminoácidos, a qual define suas propriedades bioquímicas (carga, anfipaticidade e

hidrofobicidade) e configuração tridimensional (conformação molecular, ângulo polar e

geometria) definindo então os elementos cruciais para sua atuação (GANZ, 2003; BROGDEN,

2005). As interações entre PAMs e a membrana tem como principio básico a alteração e a

alteração da permeabilidade da bicamada lipídica, causando sua despolarização e

desequilíbrio osmótico celular. Para que haja esta interação o peptídeo pode ser atraído

para a superfície microbiana, o que pode ocorrer por força eletrostática ou por cargas

líquidas existentes na superfície do micro-organismo. Em seguida o peptídeo se insere na

membrana citoplasmática (BROGDEN, 2005).

Nguyen e colaboradores (2011) ilustraram a diversidade de propriedades estruturais

dos peptídeos antimicrobianos e mecanismos de ação associados à interação entre o PAM

e a membrana microbiana (Figura 6). Os mecanismos de peptídeos com atividade

antimicrobiana podem ser baseados em sua estrutura. Desta forma a grande diversidade de

PAMs liberados durante um processo infeccioso pode agir sinergicamente, ou ainda um

mesmo PAM pode apresentar vários mecanismos de ação, ampliando seu efeito

antimicrobiano (NGUYEN,HANEY AND VOGEL, 2011).

32

Figura 6: Mecanismos de formação de poros em membranas bacterianas por PAMs.

*Adaptado de Nguyen (2011).

Alguns peptídeos demonstram, além da atividade antimicrobiana, uma atividade

imunomodulatória, a qual se caracteriza pelo estímulo da resposta imune humoral do

hospedeiro contra o patógeno, mediada pelo peptídeo. Neste sentido os peptídeos com

atividade imunomudolatória possuem efeito direto na imunidade humoral (Figura 7),

relacionando-se aos processos de atividade quimiotática e indução de quimiocinas; indução

de mediadores imunes e estimulação de atividades microbicidas; efeitos na sobrevivência e

apoptose de leucócitos e células epiteliais; estimulação da proliferação celular e promoção

da angiogenese (mecanismo de crescimento de novos vasos sanguíneos a partir dos já

existentes, o qual ocorre por meio de ação direta do peptídeo nas células endoteliais) e

atividades antiendotóxicas e anti-inflamatórias: objetivando evitar sepse os peptídeos agem

de modo a suprimir seletivamente respostas pró inflamatórias além de aumentar a atividade

imune de efeito protetor (KINDRACHUK ET AL., 2010).

Agrupamento de lipídios “carregados”

Bicamada não intermediária

Oxidação de

alvo lipídico

Carreador

aniônico

Despolarização não lítica

da membrana

Eletroporação

Carpete

Poro toroidal

Poro toroidal desordenado

Espessamento da membrana Barril stave

Adsorção da

Membrana

Mudança

conformacional

+ + +

Membrana bacteriana

33

Figura 7: Múltiplas atividades relacionadas a funções antimicrobianas e imunomodulatórias,

apresentadas por diversos PAMs.

*Adaptado de Kindrachuck et al.(2010).

Desta forma, pode-se destacar que peptídeos que apresentam atividade

antimicrobiana associada à atividade imunomodulatória são biotecnologicamente inovadores

para o desenvolvimento de medicamentos eficazes contra patógenos resistentes, uma vez

que promovem não só a função inibitória do processo infeccioso, mas também estimulam o

sistema imune do hospedeiro regulando o processo inflamatório e endotóxico (KINDRACHUK

ET AL., 2010).

1.8 PEPTÍDEOS ANTIMICROBIANOS EM ANIMAIS MARINHOS

Os invertebrados marinhos representam cerca de 30 % das espécies animais

distribuídas em vinte filos encontrados nos mais diversos ambientes. Apesar de não

apresentarem um sistema imune adaptativo, como os vertebrados, o sistema imune dos

invertebrados marinhos garantiu o sucesso evolutivo destes animais, permitindo sua

proteção contra microrganismos patogênicos e levando assim a possibilidade de

colonização dos mais diversos ambientes (BARRACCO, 2004; TINCU AND TAYLOR, 2004).

Atividade imunomodulatória

Supressão inflamatória:

Atividade antiendotóxica

Atividade anti-inflamatória

Indução da apoptose

Lise da Membrana

Indução de citocinas e quimicinas

Quimiotaxia

Degranulação de macrocélulas

Diferenciação celular

Polarização Th1/Th2

Adjuvanticidade

Angiogenese

Alvos citoplasmáticos ou de membrana

Atividade antimicrobiana

Ativação e aumento:

34

O sistema imune, de forma geral, tem sido representado pela imunidade inata, a

qual pode ser definida como a primeira linha de defesa contra a maioria dos micro-

organismos (TINCU AND TAYLOR, 2004). Segundo Mydlarz et al. (2006) a efetividade da

resposta imune dos invertebrados marinhos tem como princípio diferenciar agentes

infecciosos e não infecciosos, invalidar ou destruir invasores e por fim eliminar células

danificadas ou doentes. Para isso o sistema imune se divide em sistema imune humoral, o

qual se baseia em agentes antimicrobianos, e reações de coagulação da hemolinfa e

melanização celular e, sistema imune celular, o qual se baseia em barreiras físico-químicas

melanina, fagocitose, vesículas granulado, enzimas antioxidantes e proteínas adesivas

(MYDLARZ,JONES AND HARVELL, 2006).

Este sistema faz de uma forma geral, uso de processos de comunicação e

integração de moléculas imunológicas, que possibilitam o reconhecimento de padrões

moleculares específicos expressos na superfície de microrganismos parasitas. Dentre as

moléculas imunológicas podem ser incluídas as proteínas plasmáticas e receptores

celulares como receptores toll-like (TLRs), o sistema de ativação de pro-fenoloxidases e o

sistema complemento (MYDLARZ ET AL., 2006).

Uma grande variedade de peptídeos com atividade antimicrobiana foi isolada de

invertebrados marinhos, os quais se apresentam, comumente, como moléculas menores

que 10 kDa, com características catiônicas e anfipáticas. Os peptídeos de invertebrados

marinhos classificados de acordo com as estruturas que apresentam sendo elas: lineares,

peptídeos anfipáticos em -hélice (peptídeos lineares com estrutura estendida,

caracterizados por repetições de determinado ou determinados aminoácidos, geralmente

prolina, triptofano, histidina ou glicina), folhas- ou estruturas mistas de -hélices e folhas-

estabilizadas por pontes dissulfeto entre os resíduos de cisteína (OTERO-GONZALEZ,

MAGALHAES, GARCIA-VILLARINO ET AL., 2010). Estes peptídeos têm sido isolados de diversos

filos, dentre estes artrópodes, moluscos, cnidários, anelídeos, equinodermos e cordatos,

como demonstra o Quadro 2 (TINCU AND TAYLOR, 2004; OTERO-GONZALEZ ET AL.,

2010).Desta forma a potente atividade antimicrobiana dos peptídeos isolados de animais

marinhos torna-os uma ferramenta útil para o desenvolvimento de fármacos e produtos

biotecnológicos.

Quadro 2: Peptídeos antimicrobianos isolados de animais marinhos.

Filo Espécie Peptídeo Filo Espécie Peptídeo

Cordados Styella clava Styelinas Moluscos Mytilus edulis Mitilina A e B

Clavaninas Mitimicina

Clavaspirinas Mytilus galloprovincialis Miticina A e B

Styella plicata Plicatamida Mitilinas B, C, D e G1

Halocynthia aurantium Dicintaurinas Dolabela auricularia Dolabelina B1, B2 e B3

Halocidinas Argopecten irradians AiBD

Halocynthia roretzi Halociaminas Porífera

Jaspis sp. Jaspamida

Artrópodes Pnaeus vannemi Penaeidinas 1 a 3

Discodermia kiiensis Discodermina A-H

Litopenaues vannamei Lv 1 a 6 Halichondria cylindrata Halicylindramides (A–C)

Litopnaeus setiferus Ls 1 a 3 Aciculites orientalis Aciculitinas A–C

Penaeidina 4 Cnidários

Carcinus maenas Crustina Cm-1 Aurelia aurita Aurelina

Callinectes sapidus Callinectina Chlorohydra viridissima Hydralisina

Pacifastacus leniusculus Astacidina 1 Stychodactyla helianthus Citolisina

Pacifastacus leniusculus Astacidina 2 Anelídeos

Hyas araneus Arasina 1 Perinereis aibuhitensis Perinerina

Scylla serrata Scygonadina Arenicola marina Arenicina

Tachyplesis tridentatus Taqueplesina I Nereis diversicolor Hedistina

Limulus polypfermus Taqueplesina II Ecnodermos

Polifemusina I e II

Strongylocentrotus

droebachiensis Strongyolocina 1 and 2

Tachyplesus gigas Taqueplesina III

*Adaptado de: (TINCU AND TAYLOR, 2004; OTERO-GONZALEZ ET AL., 2010)

35

36

1.9 CLAVANINAS

As clavaninas compõem uma família de quatro isoformas de peptídeos

antimicrobianos (“A”, “B”, “C” e “D”) isoladas dos hemócitos do tunicado Styela clava (Figura

8). Estes invertebrados marinhos apresentam cerca de 10 cm de comprimento (com

espécimes de até 20 cm), são sésseis, geralmente fixados a superfícies duras. Ocorrem

principalmente em regiões entre marés a profundidades acima de 25 m, com temperaturas

que variam de -2ºC a 23ºC e salinidade entre 22 e 36 ppt (sendo os indivíduos adultos

sensíveis a salinidades inferiores a 10 ppt e, as larvas a 18ppt) (LEE, ZHAO, CHO ET AL.,

1997; MOORE, 2003).

Figura 8: Tunicado Styela clava, do qual foi extraído o peptídeo antimicrobiano clavanina A

*Fonte: (http://wdfw.wa.gov)

O sistema imune de S. clava, quando na presença de patógenos induz a produção

de moléculas bioativas ativando células fagocitárias conhecidas por hemócitos, nos quais a

clavanina encontra-se amplamente distribuída (MENZEL, LEE, SJOSTRAND ET AL., 2002). A

clavanina A, presente em múltiplos granulócitos e macrófagos, pode apresentar diferentes

funções de defesa do hospedeiro como, por exemplo, fagócitaria, ação antimicrobiana e

imunoestimulatória . Desta forma a distribuição do peptídeo em diferentes subtipos de

granulócitos eosinofílicos sugere que estes subtipos possuam diferentes funções em vias

específicas, uma vez que alguns subtipos de grânulos citoplasmáticos podem ser

secretados dentro da hemolinfa e outros podem funcionar, primariamente, como fagócitos

(LEE ET AL., 1997; MOORE, 2003).

Lee e colaboradores (1997) demonstraram que as clavaninas são amplamente

eficazes contra bactérias Gram-positivas, incluindo S. aureus resistente a meticilina, bem

como bactérias Gram-negativas e fungos. As diferentes isoformas das clavaninas isoladas

apresentam grandes similaridades relacionadas à sequência primária (Quadro 3). Segundo

http://wdfw.wa.gov/ais/styela_clava/

37

Lee e colaboradores (1997b) as clavaninas são compostas por uma sequência de vinte e

três resíduos de aminoácido (sendo dezoito posições conservadas nos quatro peptídeos)

ricos em histidina, glicina e fenilalanina e possuem o C-terminal amidado. Além disso, sua

estrutura proposta apresenta uma α-hélice resolvida por dicroísmo circular. Finalmente,

estes peptídeos apresentam características catiônicas e anfipáticas muito comuns a

peptídeos antimicrobianos (LEE ET AL., 1997).

Quadro 3: Sequências primárias das clavaninas A-D.

Clavanina Sequência Primária

A VFQFL GKIIH HVGNF VHGFS HVF-NH2

B VFQFL GRIIH HVGNF VHGFS HVF-NH2

C VFHLL GKIIH HVGNF VYGFS HVF-NH2

D AFKLL GRIIH HVGNF VYGFS HVF-NH2

A presença do C-terminal na forma carboxamida no lugar do ácido carboxílico

impede a clivagem do peptídeo por carboxipeptidases e permite a formação de uma ligação

de hidrogênio adicional na formação de estruturas em α-hélice (LEHRER, LEE, MENZEL ET AL.,

2001). A amidação, uma das modificações pós-traducionais mais comuns que ocorrem nos

PAMs, envolve a descarboxilação oxidativa do carbono de um resíduo terminal de glicina

num processo enzimático de duas etapas. (BRADBURY AND SMYTH, 1987). De fato, peptídeos

com estruturas em -hélice apresentam a anfipaticidade segregada em volta da hélice

formada, a qual permite que ele interaja, após a interação eletrostática, com a membrana

bacteriana (NGUYEN ET AL., 2011).

Alguns experimentos utilizando peptídeos sintéticos com o grupo carboxamida presente

demonstraram um aumento significativo na atividade antimicrobiana comparativamente aos

análogos não modificados (MOR AND NICOLAS, 1994; CHENG, HALE, KINDRACHUK ET AL.,

2010). Dentre as isoformas observadas, a clavanina A se destaca por apresentar uma maior

atividade antimicrobiana e imunomodulatória. Este peptídeo apresenta atividade contra

bactérias Gram-negativas (P. aeruginosa, K. pneumoniae, E. coli), Gram-positivas

(Micrococcus flavus, Lactobacillus sake e S. aureus, inclusive cepas resistentes a meticilina)

bem como contra o fungo Candida albicans (SAWADA,ZHANG AND COOPER, 1993; LEE ET AL.,

1997; VAN KAN, DEMEL, BREUKINK ET AL., 2002; OTERO-GONZALEZ ET AL., 2010).

38

As glicinas nas posições 6 e 13 facilitam a formação da -hélice e permitem o caráter

anfipático da molécula aumentando a afinidade com membranas fosfolipídicas. A clavanina

A possui atividade otimizada para variações de pH entre 5,5 e 7,4, sendo que o aumento de

pH reduz a taxa de interação do peptídeo na membrana. (VAN KAN, VAN DER BENT, DEMEL ET

AL., 2001; VAN KAN ET AL., 2002). Apesar da eficiência antimicrobiana apresentada pela

clavanina A, análises estruturais e experimentos in vivo ainda são escassos para este

peptídeo.

1.10 NANOBIOTECNOLOGIA

A nanobiotecnologia consiste na interface entre nanotecnologia e biologia definida

como a ciência que estuda o desenvolvimento e a utilização de materiais, dispositivos e

sistemas em escala nanométrica (0.1 a 1000nm). Estima-se que os Estados Unidos gastem

mais de US$ 3,7 bilhões em nanociência e nanotecnologia apenas nos próximos três anos.

Para o mesmo período o Japão pretende investir US$ 3 bilhões e a Comissão Européia US$

7,5 bilhões apenas em seu Programa de Desenvolvimento Tecnológico, de 2007 a 2013. No

Brasil foram aplicados cerca de R$ 140 milhões a áreas nanobiotecnológicas entre os anos

de 2001 e 2006, distribuídos em diversas vertentes como agronegócio, energia, pigmentos e

tintas, saneamento básico e recursos hídricos, siderurgia, vidros e cerâmicos, setores

químicos e petroquímicos, têxteis, cosméticos e relacionados à saúde (humana e animal)

(HASSAN, 2005; ZANETTI-RAMOS AND CRECZYNSKI-PASA, 2008).

A nanotecnologia apresenta um amplo aspecto tecnológico, que abrange setores de

materiais e manufatura, dispositivos eletrônicos e ópticos, energia e meio ambiente,

biotecnologia e medicina, instrumentos e educação. Dentre estes a nanobiotecnologia

merece destaque por apresentar impactos positivos, principalmente na área da saúde

através da sua aplicação na melhoria de testes diagnósticos e tratamento de doenças. Sua

proposta consiste em desenvolver sistemas carreadores de medicamentos e moléculas em

escala nanométrica visando alcançar melhor estabilidade, absorção e controle de liberação

das drogas (SPEISER, 1991; ZANETTI-RAMOS AND CRECZYNSKI-PASA, 2008; AMARAL, BOCCA,

RIBEIRO ET AL., 2009).

Atualmente, 95% das moléculas com potencial terapêutico possuem propriedades

cinéticas e biofarmacêuticas pobres apresentando dificuldades relacionadas à baixa

solubilidade, difusividade, meia-vida, controle de liberação e imunogenicidade (Zanetti-

Ramos et al., 2008). Os fármacos, em geral, produzem efeitos por reagirem com outras

39

moléculas e desta forma podem causar efeitos nos mais diversos níveis da organização

biológica. Neste sentido ensaios biológicos tem sido necessários para avaliar e comparar a

atividade de futuros fármacos, estes ensaios se definem pela estimativa da concentração,

da potencia e da resposta biológica produzida pelo fármaco de interesse (RANG, DALE,

RITTER ET AL., 2008).

A produção de nanoestruturas carreadoras de fármacos tem se mostrado uma

ferramenta útil, uma vez que possuem capacidade de transportar moléculas bioativas, de

forma específica, a órgãos e tecidos alvo (ZHANG ET AL., 2008). Estes produtos divergem

entre si em tamanho, forma e composição. Além disso, estes compostos possuem, ainda,

propriedades físico-químicas específicas como, por exemplo, o aumento da área de

superfície e da reatividade da molécula associada a produtos terapêuticos. Alguns autores

demonstram que estas características promovem uma maior solubilidade, aumento da meia

vida da molécula no sangue, diminuição da toxicidade da droga, uma extensa variedade de

vias de administração e a capacidade de seletividade para tecidos e órgão afetados pela

patologia (REIS, NEUFELD, RIBEIRO ET AL., 2006; ZHANG ET AL., 2008; BAWA, 2009).

A diversidade de materiais empregados, bem como a diversidade de técnicas

aplicadas no desenvolvimento de estruturas em escala nanométrica permite uma

diversidade de sistemas nanométricos e modelos estruturais (REIS ET AL., 2006). Dentre as

nanoestruturas mais utilizadas (Figura 9) podem ser observadas estruturas como:

dendrimeros, moléculas sintetizadas por crescimento radial a partir de um núcleo

polifuncionalizado; nanoemulsões, sintetizadas a partir de uma dispersão nanométrica de

gotículas oleosas em uma fase aquosa externa, estabilizada por um sistema tensoativo

adequado; nanopartículas lipídicas sólidas; sistemas de liberação formados por lipídios em

estado sólido; lipossomas, vesículas esféricas formadas por bicamadas de fosfolipídios em

meio aquoso; nanopartícula metálicas, estruturas formadas por material metálico;

ciclodextrina, unidades de D-glucopiranose, formadoras de estruturas cíclicas tronco-

cônicas; nanopartículas poliméricas, estruturas formadas a partir de polímeros

biodegradáveis, nanotubo de carbono, estrutura em forma de tubos formada a partir de

carbonos e fulerenos, moléculas estruturadas em forma circulara partir de carbono (ROCHA-

FILHO, 1996; OLBRICH, BAKOWSKY, LEHR ET AL., 2001; FRONZA,CAMPOS AND TEIXEIRA, 2004;

CUNHA-FILHO AND SÁ-BARRETO, 2007).

40

Figura 9: Exemplos de tipos de nanoestruturas utilizadas como carreadores de moléculas bioativas

(ilustração esquemática). (A) Dendrimeros, (B) Nanoemulsões, (C) Nanopartículas Lipídicas sólidas,

(D) Lipossomas (E) Nanopartícula metálicas (F) Ciclodextrina, (G) Nanopartículas poliméricas (H)

Nanotubo de carbono e (I) Fulerenos.

*Fonte: http://www.canon.com/technology/s_labo/nano/003/01.html

1.10.1 Nanocarreadores e sistemas poliméricos

Dentre os vários sistemas utilizados para a estruturação de fármacos as

nanopartículas poliméricas consistem em um sistema coloidal carreador menor que 1 m,

sintetizados a partir de polímeros, sendo apropriadas para o transporte de fármacos,

peptídeos, antígenos e vacinas de DNA (SANTOS-MAGALHAES, PONTES, PEREIRA ET AL.,

2000). O termo nanopartículas tem sido utilizado para denominar nanocápsulas e

nanoesferas. Nas nanocápsulas, o fármaco está confinado em uma cavidade com núcleo

líquido circundado por uma membrana polimérica, enquanto nas nanoesferas o princípio

ativo pode estar adsorvido na superfície da esfera ou incrustado na matriz polimérica (Figura

10) (REIS ET AL., 2006).

Estas estruturas são consideradas eficientes carreadores de drogas devido às suas

características de biodegradabilidade e biocompatibilidade. Além disto, garantem o aumento

da meia-vida da droga no organismo, diminuindo a necessidade de frequente administração,

trazendo maior conforto ao paciente e maior garantia de não interrupção do tratamento. Na

literatura pode-se observar o uso destes sistemas para as mais diversas patologias, dentre

A B C

D E F

41

elas podemos citar agentes quimioterápicos, broncodilatadores, e antibióticos (REIS ET AL.,

2006; SURI,FENNIRI AND SINGH, 2007; TUROS, REDDY, GREENHALGH ET AL., 2007a; TUROS,

SHIM, WANG ET AL., 2007b; KREYLING,HIRN AND SCHLEH, 2010).

Figura 10: Nanopartículas poliméricas utilizadas como carreadores de moléculas bioativas (ilustração

esquemática). (A) Nanoesferas e (B) nanocápsulas

. *Fonte: (http://www.canon.com/)/ 2011.

As nanopartículas poliméricas têm sido utilizadas como carreadores de antibióticos,

neste sentido, Turos e colaboradores (2007) descreveram nanopartículas poliméricas

covalentemente ligadas à penicilina com atividade contra cepas de S. aureus resistentes a

meticilina. As partículas foram preparadas por polimerização em emulsão e apresentam

ação prolongada contra a bactéria S. aureus. Em artigo publicado no mesmo ano, o autor

demonstra a facilidade de preparação e controle de partículas poliméricas, bem como a alta

eficiência quando comparada a penicilina livre (TUROS ET AL., 2007b). Rai e colaboradores

(2010) relataram a síntese de nanopartículas de ouro contendo o antibiótico cefaclor. Neste

trabalho as nanopartículas obtidas apresentaram entre 22 e 52 nm, demonstrando MIC de

10 mg.ml-1 e 100 mg.ml-1 contra S. aureus e E. coli, respectivamente. Os autores sugeriram,

ainda, que a ação das nanopartículas associadas ao cefaclor inibiu a síntese da camada de

peptídeoglicano, gerou poros na parede celular bacteriana, aumentando a permeabilidade

da parede e resultando na morte celular (RAI,PRABHUNE AND PERRY, 2010). Apesar dos

relatos sobre o uso de nanopartículas contendo antibióticos convencionais, não foram

encontrados relatos de nanopartículas contendo peptídeos com atividade antimicrobiana, o

que torna este trabalho inovador em relação ao desenvolvimento de nanoantibióticos

eficazes contra infecções bacterianas.

No sentido de se obter maior eficiência terapêutica, o uso de sistemas poliméricos

para nanoestruturação de antibióticos pode ser, também, arquitetado no sentido de se

A

B

http://www.canon.com/)/

42

proteger a droga do organismo do hospedeiro, aumentar a especificidade com a membrana

bacteriana (ou possíveis marcadores presentes na membrana), manter uma liberação

controlada (diminuindo as concentrações e as administrações necessárias) e evitar os

mecanismos de resistência apresentados por microrganismos (SURI ET AL., 2007; TUROS ET

AL., 2007b). Para isso as propriedades químicas e físicas específicas, como por exemplo,

alta viscosidade, elasticidade ou dureza, resistência ao calor, à umidade e à abrasão,

podem ser exploradas permitindo a utilização de metodologias distintas para a formação de

nanopartículas. Dentre estas metodologias a polimerização in situ de monômeros, ou

dispersão de polímeros pré-formados, pode ser utilizada no desenvolvimento de

nanopartículas poliméricas a depender do polímero e da molécula de interesse (REIS ET AL.,

2006).

Neste trabalho os polímeros utilizados para a formação de nanopartículas

poliméricas contendo o peptídeo antimicrobiano clavanina A foram polímeros de metacrilato

(Eudragit®). Estes polímeros têm sido comumente utilizados no encapsulamento de

fármacos. Apesar do tamanho do polímero o grau de pureza e a eficiência de encapsulação

fazem destes polímeros materiais eficientes na formação de cápsulas ou partículas

poliméricas. O Eudragit® L100-55 caracteriza-se como um copolímero aniônico á base de

ácido metacrílico e metil metacrilato (Figura 11A) e o Eudragit® RS 30D, um copolímero

formado de ésteres de ácido acrílico e metacrílico contendo grupos quaternários de amônio,

os quais tornam o polímero permeável, como demonstrado na Figura 11B (EVONIK®, 2004a,

2004b).

Figura 11: Estrutura molecular dos polímeros Eudragit® L100-55 (A) e RS 30D (B).

*Fonte: Evonik Industries® (www.evonik.com.br)/2011.

Morishita e colaboradores (1992) descreveram o uso do polímero Eudragit® para

estruturação de microesferas contendo inibidores enzimáticos importantes para o aumento

A B

http://www.evonik.com.br/region/brazil/pt/Pages/default.aspx

43

da biodisponibilidade de insulina. Em estudo mais recente Zhang e colaboradores (2008)

desenvolveram micelas formadas a partir de dois ou mais blocos de cadeias de polímeros

com características hidrofóbicas distintas. Desta forma os blocos hidrofóbicos formam um

núcleo apto a expulsar a água e a parte hidrofílica forma uma estrutura ao redor do núcleo

para estabilizá-lo e obter contato com a água. A porção hidrofílica garante uma proteção

estéril da micela, alem da estabilidade na corrente sanguínea (ZHANG ET AL., 2008).

Nassar e colaboradores (2009) descreveram a nanoencapsulação do composto

imunomodulatório tacrolimus, utilizando um sistema de nanocápsulas de dupla camada,

para isso o autor utilizou nanopartículas poliméricas envoltas em micropartículas de

hidroxipropilmetil celulose (HPMC). Este sistema garantiu a proteção do peptídeo por um

núcleo formado por dois polímeros de polimetacrilato, e aumentou a sua biodisponibilidade

no sistema dos camundongos testados. Os polímeros utilizados para este estudo possuem

como característica a solubilidade de um dos polímeros em pH 5,5 (Eudragit L 100-55) e a

não solubilidade do outro no mesmo pH Eudragit RS 30D. Este fato que confere ao autor a

possibilidade de testar a formação de nanopartículas a partir de diferentes proporções (3:1,

1:1 e 1:3 de Eudragit L100-55 e RS30D respectivamente) e compará-las em relação as suas

características quando administradas de forma oral. A segunda camada foi feita utilizando

metodologia de microencapsulação em HPMC, este polímero tem como função primordial a

proteção das nanopartículas em relação às barreiras metabólicas de primeira passagem

(NASSAR, ROM, NYSKA ET AL., 2009).

Em suma, observa-se que a grande necessidade de obtenção de novas drogas

eficazes contra a resistência bacteriana tem aumentado a busca por metodologias

inovadoras. O uso de sistemas poliméricos para a nanoestruturação de antibióticos, e

fármacos em geral, tem se mostrado uma ferramenta útil no melhoramento das drogas

atuais. Diminuindo partes duradouras de pesquisas na busca de novos agentes e

aumentando o uso de agentes já descritos, permitindo a inovação biotecnológica no

desenvolvimento de novos fármacos (MORISHITA, MORISHITA, TAKAYAMA ET AL., 1992; ZHANG

ET AL., 2008; NASSAR ET AL., 2009). Nesse sentido, tem sido de particular interesse a

avaliação do possível melhoramento na atividade antibacteriana da clavanina A, através do

encapsulamento do peptídeo em nanocarreadores poliméricos.

44

2 HIPÓTESE

A clavanina A nanoestruturada apresentará atividade antimicrobiana in vitro e in vivo

contra as bactérias Staphylococcus aureus, Escherichia coli, Pseudomonas aeruginosa e

Klebsiella pneumonia.

45

3 JUSTIFICATIVA

O aumento significativo de mortes causadas por infecções hospitalares no Brasil leva

a crescente necessidade de descoberta e formulação de novos compostos com atividade

antimicrobiana. Neste sentido os peptídeos tem se mostrado como uma excelente estratégia

para o desenvolvimento de fármacos biocidas devido a sua alta e múltipla atividade

antimicrobiana. Entretanto, a instabilidade destes peptídeos ao entrar em contato com o

metabolismo humano, torna-os inviáveis para aplicações diretas ao organismo. Por outro

lado, o desenvolvimento de nanoformulações capazes de manter a estabilidade destes

compostos e realizar a liberação sustentada torna-se uma ferramenta útil para o

desenvolvimento de produtos biotecnológicos eficazes. Desta forma, espera-se também

diminuir a dose utilizada, reduzindo o risco de superdosagem e necessidade de múltiplas

administrações, mantendo o método terapêutico por tempo prolongado, diminuindo a chance

de resistência microbiana por interrupção do tratamento.

46

4 OBJETIVOS

Este trabalho tem como objetivo a nanoestruturação do peptídeo antimicrobiano

clavanina A e a avaliação comparativa entre a atividade do peptídeo livre e nanoformulado

quanto a sua atividade antibacteriana in vitro e em modelos septicêmicos in vivo.

4.1 OBJETIVOS ESPECÍFICOS

Desenvolver nanopartículas poliméricas a partir do polímero Eudragit L100-55 e do

copolímero Eudragit RS 30D em diferentes proporções.

Analisar a taxa de liberação sustentada do peptídeo nanoestruturado.

Analisar as características morfológicas, relacionadas ao diâmetro e altura das

nanoestruturas formadas, por meio de microscopia de força atômica (AFM) e

espectroscopia de espalhamento de luz dinâmico (Dynamic Light Scattering - DLS).

Avaliar a taxa de encapsulação dos complexos nanoformulados contendo a

clavanina.

Comparar o potencial in vitro do peptídeo livre e do peptídeo nanoestruturado contra

as bactérias Staphylococcus aureus, Escherichia coli, Pseudomonas aeruginosa e

Klebsiella pneumoniae.

Comparar o potencial in vivo (contra o pool de bactérias contendo S. aureus, E. coli,

P. aeruginosa e K. pneumoniae) do peptídeo nanoformulado, com o peptídeo livre

em modelo animal induzido a sepse.

Avaliar o efeito da clavanina A nanoestruturada na evolução da sepse polimicrobiana

Avaliar o efeito anti-inflamatório da clavanina A nanoestruturada.

47

5 MATERIAL E MÉTODOS

5.1 SÍNTESE E DETERMINAÇÃO DE PUREZA DOS PEPTÍDEOS SINTÉTICOS:

A clavanina A (VFQFL GKIIH HVGNF VHGFS HVF-NH2) foi sintetizada pela China

Peptides Co., Ltd., República Popular da China, segundo o método de síntese em fase

sólida através da estratégia F-moc (HIRATA, CEZARI, NAKATE ET AL., 1994). O peptídeo foi

purificado por cromatografia líquida de alta eficiência em fase reversa (RT-HPLC). A massa

molecular e a pureza do peptídeo sintetizado foram confirmadas por espectrometria de

massa utilizando o equipamento MALDI-TOF/TOF Ultraflex III (Bruker Daltonics). As

amostras foram solubilizadas em solução saturada de ácido alfa-ciano-4-hidroxicinâmico

(1:3) e 1µL dessa mistura foi depositada sobre placa de MALDI tipo MTP 384 e secas a

temperatura ambiente. Para determinação da massa exata do peptídeo realizou-se a

calibração utilizando-se Peptide calibration standard II (Bruker Daltonics) como padrão de

massas moleculares. O valor teórico obtido pelo serviço online Protein Prospector

(http://prospector.ucsf.edu/prospector/mshome.htm) foi comparado com o valor experimental

obtido pela análise feita no espectrômetro de massa.

5.2 PREPARAÇÃO DAS NANOPARTÍCULAS POLIMÉRICAS:

Para estruturação das nanocápsulas foram utilizados inicialmente 100 g do peptídeo

sintético e diferentes proporções dos polímeros, sendo elas 1:3, 1:1 e 3:1 (Eudragit® L100-

55 e Eudragit® RS 30D, respectivamente). Posteriormente a proporção (3:1

respectivamente L100-55:RS30D) foi mantida, sendo então utilizados 22,5 mg do polímero

Eudragit® L100-55 e 7,5 mg do copolímero Eudragit® RS 30D, obedecendo-se a proporção

de peptídeo, L100-55 e RS30D, respectivamente, 0,1:3:1. A Figura 11 demonstra as

estruturas do polímero e do copolímero utilizados para a nanoestruturação do peptídeo

antimicrobiano clavanina A (NASSAR ET AL., 2009). A quantificação do peptídeo sintético foi

realizada observando-se as absorbâncias medidas nos comprimentos de onda com 205,

215 e 225 nm e os valores obtidos foram aplicados às seguintes fórmulas (MURPHY AND

KIES, 1960).

X = (A215-225)x144 (1)

Y= (A105)x31 (2)

(X+Y) /2 x Fator de diluição = [Peptídeo] g.ml-1 (3)

48

As nanopartículas foram preparadas a partir de emulsificação óleo/água, utilizando-se

solução de acetona 95 % e etanol 5 % (utilizando-se uma proporção de 1:10 de solução em

relação a massa total de polímero e copolímero, neste caso 30 mg) objetivando-se a

solubilização dos componentes (copolímero, tensoativo, peptídeo e polímero). Após a

formação da fase oleosa, foram adicionados 2,5 ml de água milli-Q autoclavada. Em seguida

a amostra foi incubada a 4 ºC por 12 h e posteriormente centrifugada a 13,400 rpm por 30

min, objetivando a limpeza das estruturas formadas. Desta forma o sobrenadante foi

coletado e o precipitado descartado. Para retirada do solvente utilizou-se o sistema de

rotavaporação em equipamento Buchi® RIII, a pressão constante de 20 in.Hg, por 10 min

com temperatura ajustada a 37ºC.

5.3 ANÁLISE MORFOLÓGICA

5.3.1 Microscopia de Força Atômica

Para a análise morfológica foi avaliada a altura (nm) das partículas por microscopia de

força atômica (Atomic force microscopy - AFM) em aparelho Agilent 9600 (Shimadzu,

Japão). A fim de se obter uma concentração adequada para melhor visualização das

estruturas formadas, as amostras foram diluídas utilizando de 1:1000 (l) amostra/ água

ultrapura filtrada e , 1 l de amostra diluida foi aplicado à superfície de mica-moscovita,

recém clivada e fixada à superfície metálica plana. As análises foram realizadas em modo

dinâmico, utilizando-se sonda PPP-NCHR NanoSensors® (SHENG,QING AND MAO, 2007).

Após a secagem das amostras foram obtidas imagens com resolução de 512 x 512 pixels,

utilizando-se scanner de dimensão máxima de 125 μm x 125 μm de varredura, e áreas de

varredura de 50 μm x 50 μm e 10 μm x 10 μm. As imagens obtidas foram corrigidas em

relação ao plano pelo software SPM-9600 off-line, as análises relacionadas a altura das

partículas foram segmentadas e correlacionadas utilizando-se o mesmo software.

5.3.2 Espectroscopia de espalhamento de luz dinâmico

De forma complementar aos dados obtidos por microscopia de força atômica, o efeito

das nanoestruturas em valores de diâmetro hidrodinâmico de LUVs, foram avaliados por

espectroscopia de espalhamento de luz dinâmico, com um analisador de partículas

49

Zetasizer nano ZS (Malvern Instruments Ltd.), usando células descartáveis de polietileno.

Para cada experimento foram realizadas sucessivas leituras em cubeta de 1 mL contendo

LUVs, o experimento foi realizado a 25ºC, foram realizadas três corridas com quinze

medidas para cada corrida. As soluções foram submetidas ao espalhamento de luz

monocromática (10 mW Ele-Ne laser, λ = 632,4 nm) e a intensidade de luz espalhada foi

medida em um ângulo de espalhamento de 90°. As soluções de nanopartículas foram

previamente centrifugadas a 13.400 g, e o precipitado descartado, visando eliminar

partículas contaminantes, que pudessem interferir na leitura (restos de polímeros ou

tensoativo).

5.4 EFICIÊNCIA DE ENCAPSULAÇÃO

5.4.1 Quantificação de encapsulação

A eficiência de encapsulação do peptídeo na vesícula foi avaliada pela diferença

entre a quantidade total do peptídeo usado para preparar os sistemas de liberação

sustentada e o peptídeo livre encontrado após a metodologia de encapsulação. Após a

encapsulação do peptídeo a amostra foi aplicada em filtro Amicon® 10 kDa e centrifugado a

4.400g por 15 min, sendo o precipitado coletado, filtrado e injetado em coluna de

cromatografia de fase-reversa (HPLC) Phenomenex® C-18. Para quantificação específica,

foi construída uma curva padrão utilizando-se concentrações crescentes do peptídeo, sendo

elas de 1 a 10 g (1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 e 10g), e de 10 a 100 g (10, 20, 30, 40, 50, 60,

70, 80, 90 e 100g), aplicadas na coluna acima descrita, a utilização de duas curvas (1-

10g e 10-100g) possibilitou ampla relação entre a amostra e a curva padrão obtida. A

porcentagem de peptídeo encapsulado e liberação sustentada do mesmo foram observadas

utilizando-se gradiente linear de solução de acetonitrila contendo ácido trifluoracético (TFA)

0,1 % (variando de 5 a 95 %) e solução aquosa + TFA 0,1 %. De acordo com os

cromatogramas obtidos, calculou-se a área do pico referente ao peptídeo. Para isso utilizou-

se o software Star Chromatography Workstation (Versão 6.41), o qual permite visualizar a

área do pico de interesse em mAu x seg. As concentrações de peptídeos encontradas após

o teste de liberação sustentada foram então correlacionadas à curva previamente

estabelecida.

50

5.4.2 Testes de liberação in vitro

Para as análises de liberação sustentada in vitro a amostra foi dividida em alíquotas de 1

ml de solução aquosa contendo a clavanina A nanoestruturada, e posteriormente incubadas

a 37ºC. Objetivando a separação do peptídeo livre das estruturas e restos de estruturas, as

amostras foram coletadas e aplicadas em tubos Amicon® 10 kDa e centrifugadas a 4.400 g

por 15 min. Em seguida, o sobrenadante foi descartado e o precipitado coletado e aplicado a

cromatografia de fase-reversa em coluna Phenomenex® C-18. Visando, maior eficiência de

obtenção de dados sobre a liberação sustentada do fármaco, este experimento foi dividido

em duas partes, possibilitando leituras a cada hora (totalizando 12 h) e leituras a cada 6 h

totalizando 48 h de incubação das amostras.

5.5 BIOENSAIOS IN VITRO

As análises in vitro foram realizadas contra a bactéria Gram-positiva Staphylococcus

aureus ATCC25923 e as bactérias Gram-negativas Escherichia coli ATCC8739, Klebsiella

pneumoneae ATCC13885 e Pseudomonas aeruginosa ATCC 27853. Para realização dos

bioensaios as bactérias foram previamente plaqueadas e incubadas por 48 h. Em seguida

uma das colônias foi repicada em 5 ml de meio Luria Bertani (LB) para incubação por 12 h.

As diferentes amostras foram previamente preparadas, sendo elas: o peptídeo (clavanina

A), as nanopartículas sem o peptídeo e as nanopartículas contendo o peptídeo. Como

controle positivo utilizou-se o antibiótico comercial cloranfenicol em uma concentração final

de 40 g.ml-1 e como controle negativo utilizou-se água destilada. A avaliação in vitro da

atividade antibacteriana dos peptídeos foi realizada pela determinação da absorbância a 595

ηm, sendo avaliada a cada 30 min totalizando 12 h de experimento (0, 30, 60, 90, 120, 150,

180, 210, 240, 270, 300, 330, 360, 390, 420, 450, 480, 510, 540, 570, 600, 630, 660, 690 e

720 min). Os ensaios foram realizados em microplaca de ELISA contendo 96 poços, as

amostras foram aplicadas em triplicata, com volume final de 100 l em cada poço (NCCLS,

2003).

5.6 ANÁLISES IN VIVO

Para as análises in vivo utilizou-se a metodologia proposta por Moreno et al (2006), a

qual propõe a indução de sepse intraperitoneal por injeção de um pool de bactérias. O

conjunto de bactérias foi obtido por coleta do ceco de três camundongos seguida de

51

filtração, as culturas foram realizadas em placas de petri contendo meio BHI (brain heart

infusion) e incubadas a 37 ºC. Para estocagem a suspensão de bactérias foi centrifugada e

o precipitado foi ressuspendido em solução salina estéril, em seguida adicionou-se glicerol

60 % ás suspensões e se estocou a -80ºC. Para uso uma das alíquotas foi incubada a 37ºC

por 21 h. Posteriormente diluída, de forma seriada, e quantificada em espectrofotômetro

com absorbância a 595 nm. As bactérias foram identificadas por três diferentes testes

bioquímicos denominados TSI (Triplo açúcar ferro) contendo ágar, pelo método SIM (Sulfito,

Indol, Motilidade) e pelo teste do citrato, sendo identificadas as bactérias: P. aeruginosa, S.

aereus, E. coli e K. pneumonia, com 4,1 x 1010 UFC.ml-1. Desta forma foi definido o grupo de

acordo com a quantidade de suspensão aplicada a cada camundongo, sendo aplicado ao

grupo letal (L) 25µl de suspensão bacteriana por camundongo. Para realização do

experimento de sobrevida à sepse letal e subletal utilizou-se camundongos C57B6 (black)

divididos em 05 grupos (Quadro 4), sendo eles Infectados com 25 l de inoculo bacteriano

diluídos em 175 l de soro fisiológico. Os animais, foram pré tratados, com 15 min de

diferença da aplicação da suspensão bacteriana, e foram administradas as doses, de acordo

com o grupo, a cada 24 h.

52

Quadro 4: Grupos e tratamentos utilizados na realização dos testes de sepse in vivo,

realizados em camundongos C57B6 (black) :

Grupo Infectados

01 Infectados e não tratados

02 Infectados, tratados com antibiótico comercial (cloranfenicol 40

g.ml-1).

03 Infectados, tratados com peptídeo nanoestruturado (2, 4 e 12

g.ml-1)

04 Infectados, tratados com a nanoestrutura sem o peptídeo.

05 Infectados, tratados com o peptídeo livre (2, 4 e 12 g.ml-1).

5.6.1 Avaliação de migração de neutrófilos

Para indução inflamatória utilizou-se a carragenina injetada por via intraperitoneal,

sendo que para cada animal utilizou-se 500 l de solução salina adicionada de carragenina

0,001 g.ml-1, para os devidos tratamentos os animais foram divididos em 12 grupos, como

demonstra a Quadro 5. Após 6 h do estímulo flogístico (carragenina) os grupos de animais

pré-tratados com o peptídeo livre, peptídeo nanoestruturado e a nanoestrutura, foram

avaliados a migração de neutrófilos para a cavidade peritoneal dos camundongos. Os

animais foram eutanasiados em câmara de CO2 e a cavidade peritoneal lavada com 3 mL de

solução salina contendo EDTA 0,1M e solução fisiológica. A partir do exudato coletado foi

realizada a contagem total e diferencial das células presentes. A contagem total de células

foi realizada pelo equipamento Sysmex® modelo KX-21N e expressa como número de

53

células x 106.mL-1. A contagem diferencial foi realizada em lâminas do esfregaço de células

do exudato, devidamente coradas utilizando-se metodologia de panótico rápido (Laborclin®).

As laminas obtidas foram examinadas em microscópio óptico (objetiva x1000), foram

contadas 100 células por lâmina, diferenciando-se quatro tipos celulares: neutrófilos,

eosinófilos, basófilos e mononucleares. A quantidade de cada tipo celular presente na

cavidade peritoneal foi calculada pela percentagem dessas células contadas nos esfregaços

e pela quantidade de células totais obtidas na contagem total. Os resultados foram

expressos como nº de neutrófilos x 106.mL-1 (MORENO, ALVES-FILHO, RIOS-SANTOS ET AL.,

2006).

Quadro 5: Grupos e tratamentos utilizados na realização dos testes inflamatórios in vivo,

realizados em camundongos C57B6 (black) :

Grupo Tratamento Concentração do

peptídeo

Controle positivo

Solução salina

-

Controle negativo Carragenina -

Controle fármaco

comercial

Carragenina + Dexametasona -

Controle peptídeo Peptídeo livre 2 g

4 g

12 g

*Controle nanoestrutura Nanoestrutura sem peptídeo Equivalente a 2 g

Equivalente a 4 g

Equivalente a 12 g

Amostra Peptídeo Nanoestruturado 2 g

4 g

12 g

*O grupo controle da nanoestrutura apesar de não conter o peptídeo possui uma quantidade de nanoestruturas

aproximada da quantidade de nanoestruturas presentes na amostra.

54

6 RESULTADOS E DISCUSSÃO

6.1 CARACTERIZAÇÃO DAS ESTRUTURAS:

Objetivando o desenvolvimento de nanoformulações capazes de manter a

estabilidade do peptídeo antimicrobiano clavanina A e realizar a liberação sustentada do

fármaco, este trabalho teve como principio a nanoestruturação do peptídeo antimicrobiano

clavanina A. Para isso, utilizou-se sistema de emulsificação óleo/água, sendo encapsulados

100g do peptídeo, em 22,5 mg de polímero Eudragit® L 100-55 e 7,5 mg de copolímero

Eudragit® RS 30D. A formação de emulsões de óleo em água ocorreu devido a dissolução

dos componentes oleosos em um solvente hidrofóbico (solução de acetona e etanol) sendo

posteriormente adicionada a água, ocorrendo desta maneira a formação de gotículas de

óleo, que por sua vez envolvem o polímero, o copolímero e o peptídeo, permitindo a sua

solubilização em água após a retirada do solvente (REIS ET AL., 2006).

As nanopartículas obtidas foram caracterizadas utilizando-se, de forma complementar,

microscopia de força atômica e espectroscopia de espalhamento de luz dinâmico.

Primeiramente a nanoformulação do peptídeo antimicrobiano clavanina A foi realizada, nas

diferentes proporções de polímero Eudragit® L 100-55 e copolímero Eudragit® RS 30D,

respectivamente, sendo elas 3:1, 1:1 e 1:3. Para as formulações 1:3 não foi possível

observar a formação de nanopartículas como demonstra a Figura 12. Na proporção 1:1 não

foi possível obter imagens, possivelmente por contaminação da ponteira de sílica utilizada

na varredura da amostra. As análises por microscopia de força atômica ocorrem por contato

direto da ponteira de sílica com a amostra, desta forma a contaminação da ponteira com a

amostra a ser analisada pode interferir diretamente na obtenção das imagens. Para análise

das imagens das nanopartículas obtidas utilizando-se as amostras preparadas em

proporção 3:1 de polímero e copolímero, respectivamente, utilizou-se microscopia de força

atômica em aparelho Agilent 9600 (Shimadzu, Japão), em superfície de mica moscovita

(amostra seca).

55

Figura 12: Nanoestruturas formadas a partir de sistema de emulsificação o/a, utilizando polímero e

copolímero em proporção 1:3 (respectivamente) adicionados de 100 g de clavanina “A” sintética.

Amostra não centrifugada e não diluída.

Foi possível observar nanoestruturas com distribuição gaussiana unimodal de altura,

variando entre 69 e 260 nm, sendo em maioria as nanopartículas com cerca de 120 nm

(Figura 13). As análises por microscopia de força atômica permitem observar estruturas

contendo de 1 nm a 5 m. No entanto, as nanopartículas analisadas podem apresentar uma

redução de 20 % e um desvio padrão de 15 %, sendo possível diminuir esse erro de acordo

com a escolha da ponteira de sílica, a ser utilizada no aparelho de AFM (SCALF AND WEST,

2006).

508.04

[nm]

0.002.00 um 5.00 x 5.00 um

Peptideo 1 3-1

56

Figura 13. Nanopartículas poliméricas obtidas utilizando polímero e copolímero em proporção 3:1

(respectivamente) adicionados de 100 g de clavanina “A” sintética. Imagens obtidas por microscopia

de força atômica, utilizando aparelho Agilent 9600 (Shimadzu, Japão). Para obtenção da imagem

utilizou-se superfície de mica muscovita. As imagens foram corrigidas nos planos X e Y, as linhas que

apresentavam má formação foram retiradas. (A) Área de varredura de 50 x 50 m e (B) Área de

varredura de 10 x 10 m.

A

B

57

O desenvolvimento de nanopartículas contendo fármacos vem sendo utilizado no

tratamento de diversas doenças, objetivando o desenvolvimento de drogas que apresentam

curto tempo de meia-vida, o que torna a administração do fármaco frequente, e

consequentemente aumenta o efeito citotóxico desses medicamentos (DUNCAN, 2006). Em

revisão Zhang e colaboradores (2008) demonstraram que micelas contendo o fármaco de

interesse, formadas a partir de dois ou mais blocos de cadeias de polímeros com

características hidrofóbicas distintas, tendem a formar um núcleo para expulsar a água,

assim a parte hidrofílica forma uma estrutura ao redor do núcleo para estabilizá-lo e obter

contato com a água. Os autores defenderam, ainda, que a porção hidrofílica garante uma

proteção estéril da micela, além da estabilidade na corrente sanguínea (ZHANG ET AL., 2008).

Nassar e colaboradores (2009) descreveram a nanoencapsulação do fármaco

imunosupressor tacrolimus utilizando um sistema de nanocápsulas de dupla camada. Este

sistema garantiu a proteção do peptídeo por um núcleo formado por dois polímeros de

polimetacrilato, e aumentou a sua biodisponibilidade no sistema dos animais testados. Os

polímeros utilizados para este estudo possuem como característica a solubilidade de um dos

polímeros em pH 5,5 (Eudragit L 100-55) e a não solubilidade do outro no mesmo pH

(Eudragit RS 30D, fato que confere ao autor a possibilidade de testar a formação de

nanopartículas a partir de diferentes proporções (3:1, 1:1 e 1:3 de Eudragit L100-55 e

RS30D respectivamente) e compará-las em relação as suas características quando

administradas de forma oral. A segunda camada foi feita utilizando metodologia de

microencapsulação em hidroxipropilmetilcelulose (HPMC). Este polímero tem como função

primordial a proteção das nanopartículas em relação as barreiras metabólicas de primeiras

passagem (NASSAR ET AL., 2009). Até a presente data não foram encontrados peptídeos

nanoencapsulados no mercado de fármacos.

Independente do polímero a ser utilizado o tamanho das nanopartículas obtidas está

diretamente relacionado à via de administração a qual se pretende utilizar. Segundo Gref e

colaboradores (1996) nanopartículas ideais para fins injetáveis são biodegradáveis,

biocompativeis e possuem tamanho menor que 200 nm. Os autores propõem o uso de

nanopartículas de PLGA associadas à PEG contendo fragmentos dos anticorpos Fab ou

Fab2. As nanopartículas obtidas foram capazes de proteger o fármaco do sistema imune do

hospedeiro, bem como manter uma liberação sustentada do mesmo (GREF,MINAMITAKE AND

LANGER, 1996). Fraceto e colaboradores (2006) desenvolveram nanocápsulas de

lipossomas injetáveis contendo benzocaína, fármaco utilizado como anestésico local, as

estruturas apresentaram entre 100 e 200 nanômetros. Este trabalho teve como objetivo

desenvolver estruturas injetáveis que aumentassem a especificidade do fármaco com o

58

tecido em questão, além de sustentar de forma controlada sua liberação (FRACETO AND DE

PAULA, 2006; MELO, 2011). Neste sentido, as nanopartículas obtidas apresentam-se viáveis,

em teoria, para o uso endovenoso. Uma vez que a administração por via endovenosa

permite a aplicação de grandes volumes diretamente na corrente sanguínea, desta forma,

garantindo que o medicamento seja rapidamente absorvido, metabolizado e distribuído.

(CASSIANI, 2000; RANG ET AL., 2008; DINIZ, 2010).

As análises morfológicas de nanopartículas poliméricas podem ser realizadas por

diferentes metodologias (microscopia eletrônica, de varredura ou de transmissão,

microscopia de força atômica e espalhamento de luz dinâmico), estas metodologias podem

ser utilizadas de forma complementar, possibilitando a caracterização da amostra com uma

maior especificidade. O uso de espectroscopia de espalhamento de luz dinâmico (DLS)

permite a observação de partículas em escala nanométrica a partir do espalhamento de luz

causado pelas partículas da amostra (CHICEA, 2010), desta forma, em complemento às

análises por AFM, a metodologia de espectroscopia de espalhamento de luz dinâmico

(Zetasizer nano ZS -Malvern®) realizadas em meio aquoso permitiram a demonstração do

comportamento das nanopartículas em solução, de acordo com as análises foi possível

observar nanoestruturas contendo cerca de 372 nm de diâmetro, como demonstra a Figura

14.

Figura 14. Diâmetro das nanopartículas poliméricas obtidas utilizando polímero e copolímero em

proporção 3:1 (respectivamente) adicionados de 100 g de clavanina “A” sintética. Análise obtida

utilizando-se metodologia de Dynamic light scattering (DLS) em aparelho Malvern Zetasizer Nano-Zs.

As nanopartículas foram observadas em meio aquoso, permitindo uma análise em solução de suas

dimensões e propriedades.

Tamanho (nm)

Nú

me

ro (

%)

59

As análises complementares utilizando AFM e DLS permitem corroborar o tamanho e

o nível de agregados formados ou não pelas nanopartículas obtidas, além do formato de

suas estruturas (esférica, achatada, estrelar, entre outras). A diferença encontrada nas

análises morfológicas, realizadas por AFM e DLS, permitiu observar que em meio aquoso

(DLS) as nanopartículas apresentam em média 372 nm de diâmetro, e em superfície (AFM)

as mesmas estruturas apresentaram em média 120 nm de altura, provavelmente por seu

achatamento após secagem. Domingues (2006) discute em tese as características de

diferentes sistemas de nanoparticularização. O trabalho teve como objetivo caracterizar

sistemas aquosos e secos e compreender o impacto da secagem em nanopartículas. Para

isso a autora utilizou os polímeros poli(-caprolactona) e o polímero Eudragit® RS100

contendo indometacina. Foi observada variação do tamanho das estruturas após a

secagem, sendo diminuídas em cerca de 100 nm para as duas estruturações, poli(-

caprolactona) e Eudragit® RS100 (DOMINGUES, 2006). Perevyazko e colaboradores (2010)

demonstraram a caracterização de nanopartículas de poli (metil metacrilato) utilizando DLS

e SEM (microscopia eletrônica de varredura), os autores demonstraram que além da

diferença de tamanho de nanopartículas obtidas utilizando-se diferentes metodologias de

produção das nanopartículas, também se observa diferenças quando utiliza-se DLS ou SEM

na caracterização destas moléculas (PEREVYAZKO, VOLLRATH, HORNIG ET AL., 2010).

As análises realizadas por DLS permitiram, ainda, a observação do índice de

polidispersividade (polydispersity index - PDI) de 0,123. O índice de polidipersividade é um

parâmetro calculado em função da autocorrelação obtida pela análise de DLS. Em suma,

este dado consiste em uma extrapolação da função de autocorrelação, que pode ser

alterado de acordo a variabilidade de tamanhos encontrados na amostra (NIDHIN,

INDUMATHY, SREERAM ET AL., 2008). O PDI apresenta limites entre 0,01 e 0,5, no entanto

amostras com grande variabilidade de tamanho entre as estruturas apresentam PDI de 0,7.

Em relação à nanopartículas infere-se que quanto maior o PDI, maior a probabilidade de

formação de agregados por parte da amostra. Neste caso o índice se encontra ideal para a

não formação de agregados por parte da amostra (MALVERN, 2010). Trierweiler (2009)

demonstrou que o PDI de 0,30 para nanopartículas poliméricas está relacionado com a alta

homogeneidade na distribuição de tamanho das nanopartículas (TRIERWEILER, 2009). O

potencial zeta é uma medida que relaciona a carga total das estruturas de interesse e a

relaciona com a estabilidade dessas estruturas. Em se tratando de nanopartículas pode-se

encontrar cargas variando entre + 30 mV, sendo que quanto mais próximo de 0 mV maior a

probabilidade de elas se aglomerarem, uma vez que não há cargas para se repelirem

60

(Carneiro-da-Cunha, 2011). As medidas de potencial zeta permitiram a observação da carga

das nanopartículas, as quais apresentaram um potencial zeta de -7,16 mV (Figura 15).

Figura 15. Potencial zeta, das nanopartículas obtidas utilizando polímero e copolímero em

proporção 3:1 (respectivamente) adicionados de 100 g de clavanina “A” sintética. As análises

foram realizadas utilizando-se Dynamic light scattering (DLS) em aparelho Malvern Zetasizer

Nano-Zs. As nanopartículas foram observadas em meio aquoso, permitindo uma análise em

solução de suas dimensões e propriedades.

Potencial zeta (mV)

Estr

utu

ras (

x1

03)

6

0 -100 0 100

61

Eficiência de encapsulação e liberação sustentada in vitro:

A eficiência de encapsulação do peptídeo na vesícula foi avaliada pela diferença entre

a quantidade total do peptídeo usado para preparar os sistemas de liberação sustentada e o

peptídeo livre encontrado após a metodologia de encapsulação. Para isso 1 ml de amostra

foi aplicada a filtro Amicon® 10 kDa e centrifugado a 4.400g por 15 min, o precipitado foi

coletado e aplicado à cromatografia de fase-reversa em coluna de HPLC Phenomenex® C-

18, e posteriormente comparada à curva padrão do peptídeo, obtida a partir de

concentrações conhecidas do peptídeo aplicadas à mesma metodologia aplicada às

amostras. De acordo com os dados obtidos foi possível observar uma eficiência de

encapsulação de 98% do peptídeo aplicado. A eficiência de encapsulação do fármaco pode

ser afetada por inúmeras vertentes, dentre elas, as características físico-químicas do

fármaco e do polímero, pH as solução, características relacionadas à superfície das

partículas, quantidade de fármaco nanoestruturado, metodologia de nanoformulação e tipo

de tensoativo (SCHAFFAZICK AND GUTERRES, 2003). Nassar e colaboradores 2009) utilizaram

o mesmo polímero em metodologia similar à utilizada no presente estudo. O autor observou

uma taxa de encapsulação de 85 % de tacrolimus em nanopartículas contendo entre 350 e

400 nm (NASSAR ET AL., 2009). Medeiros (2011) demonstrou nanopartículas de quitosana

contendo os peptídeos antitumorais PSLEM 0817 (isolado de Phyllomedusa tomopterna),

PSLEM 0906 (isolado de Trachycephalus venulosus), PSLEM 0904 (fragmento de proteína

supressora de metástase) e PSLEM 0850 (isolado de veneno de abelhas), com uma

eficiência de encapsulação de 97% (MEDEIROS, 2011). Li (2005) observou uma taxa de

encapsulação de até 80 % de albumina em polímeros de metacrilato Eudragit S100 (LI,

2005).

De acordo com o ensaio de liberação sustentada foi possível observar que durante as

doze primeiras horas não houve liberação do peptídeo encapsulado. A partir da 12ª hora foi

possível observar a liberação de até 3,5 g do peptídeo encapsulado (Figura 16).

62

Figura 16. Teste de liberação com leituras a cada 12 horas, totalizando 48 h. Quantificação de

liberação por cromatografia de fase-reversa em coluna Phenomenex C-18. Utilizou-se como

parâmetro de quantificação a área do pico referente à presença do peptídeo, comparada a área de

picos previamente conhecidos, utilizando-se curva padrão de quantificação.

A liberação sustentada do fármaco pode ser influenciada, primeiramente, pela

associação fármaco – polímero e, posteriormente pela relação nanoestrutura – solução.

Desta forma a distribuição do fármaco na superfície das partículas; difusão do fármaco

através da matriz das nanoestruturas; difusão através da parede polimérica; a relação de

erosão da matriz polimérica ou combinação dos processos de difusão e erosão são

processos diretamente relacionados à cinética de liberação do fármaco (SOPPIMATH,

AMINABHAVI, KULKARNI ET AL., 2001). Assim, as taxas de liberação do fármaco in vitro podem

se apresentar de forma rápida ou lenta, ou ainda não serem observadas, no entanto esta

relação de liberação in vitro, pode ou não influenciar na atuação do fármaco in vitro e/ou in

vivo. Medeiros (2011) não observou liberação dos peptídeos antitumorais encapsulados em

nanopartículas de quitosana in vitro, no entanto análises in vivo relacionadas ao uso das

nanopartículas de quitosana permitiu a atividade antitumoral dos peptídeos encapsulados.

Nassar e colaboradores (2009) observaram uma rápida taxa de liberação do fármaco

tacrolimus encapsulado em nanopartículas de metacrilato, apresentando 100% de liberação

do fármaco em 4 horas de experimento.

0

1

2

3

4

5

0 12 24 36 48

Pe

pti

de

o li

vre

(

g)

Tempo (horas)

63

6.2 ENSAIOS IN VITRO

Os ensaios in vitro tiveram por finalidade observar e avaliar as possíveis atividades

antibióticas apresentadas pela amostra de interesse, neste caso, a suscetibilidade dos

patógenos E. coli, K. pneumoniae, S. aureus e P. aeruginosa às nanopartículas contendo o

peptídeo antimicrobiano clavanina A. Para realização dos bioensaios utilizou-se meio de

cultura Luria Bertani (LB) líquido. Cada bioensaio teve duração de 12 h, com leituras de

absorbância a cada 30 min. As porcentagens de inibição foram calculadas de acordo com o

controle negativo (H2O destilada), considerando que o controle negativo representa 100 %

de desenvolvimento bacteriano. De acordo com as análises foi possível observar que as

nanopartículas contendo 12 g do peptídeo encapsulado apresentaram 91 % de atividade

antimicrobiana in vitro contra as cepas de S. aureus, como demonstrado na Figura 17. Não

foi encontrada ação antibiótica utilizando-se a mesma concentração do peptídeo livre e nem

das nanopartículas sem o peptídeo.

Ainda de acordo com os bioensaios realizados a inibição do crescimento de K.

pneumoniae foi de 20% para o tratamento utilizando o peptídeo nanoestruturado, sendo de

13% para a nanopartícula sem o peptídeo e não apresentando inibição para o tratamento

contendo apenas o peptídeo (Figura 18).

Figura 17. Avaliação de atividade antibacteriana das nanoestruturas contendo clavanina A, a uma

concentração de 12g, contra Staphylococcus aureus. Utilizou-se como controle negativo (c-) água

destilada e como controle positivo (c+) o antibiótico comercial cloranfenicol 40 g.ml-1

. As barras

verticais representam o desvio padrão.

Tempo (horas)

Ab

s. (5

95

nm

)

0,0

0,1

0,2

0,3

0,4

0,5

0,6

0,7

0,8

0,9

0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12

C+

C-

Nano. + Pep.

Nanop.

Pep.

Tempo (horas)

Ab

s. (5

95

nm

)

64


uma concentração de 12g, contra Klebsiella pneumoniae. Utilizou-se como controle


cloranfenicol 40 g.ml-1. As barras verticais representam o desvio padrão.

Em bioensaios desenvolvidos contra as cepas de E. coli não foi observada inibição

para os tratamentos contendo o peptídeo livre, nem para as nanopartículas contendo o

peptídeo antimicrobiano e nem para as estruturas sem o peptídeo (Figura 19). O bioensaio

contra as cepas de P. aeruginosa apresentaram inibição do crescimento bacteriano de

39,8% para o tratamento utilizando o peptídeo associado à nanopartícula, contra 7,33% para

a nanopartícula não contendo o peptídeo. Não foi observada inibição para o tratamento

contendo o peptídeo livre (Figura 20). A Figura 21 resume a atividade in vitro do peptídeo e

das nanoparticulas contra as quatro bactérias acima citadas.

Figura 19 Avaliação de atividade antibacteriana das nanoestruturas contendo clavanina A, a uma

concentração de 12g, contra Escherichia coli. Utilizou-se como controle negativo (c-) água destilada

e como controle positivo (c+) o antibiótico comercial cloranfenicol 40 g.ml-1

. As barras verticais

representam o desvio padrão.

0,0

0,1

0,2

0,3

0,4

0,5

0,6

0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12

C+

C-

Nan. + Pep

Nanop.

Pep.

Tempo (horas)

Ab

s. (5

95

nm

)

Tempo (horas)

Ab

s. (5

95

nm

)

65

Figura 20. Avaliação de atividade antibacteriana das nanoestruturas contendo clavanina A, a uma

concentração de 12g, contra Pseudomonas aeruginosa. Utilizou-se como controle negativo (c-) água

destilada e como controle positivo (c+) o antibiótico comercial cloranfenicol 40 g.ml-1

. As barras

verticais representam o desvio padrão.

0,0

0,1

0,2

0,3

0,4

0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12

C+

C-

Nan. + Pep

Nanop.

Pep.

0,0

0,1

0,2

0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12

C+

C-

Nan. + Pep

Nanop.

Pep.

Ab

s. (5

95

nm

)

Tempo (horas)

Ab

s. (5

95

nm

)

66

Figura 21. Avaliação de atividade antibacteriana das nanopartículas contendo clavanina A (N+P), a

uma concentração de 12g, contra Staphylococcus aureus, Escherichia coli, Klebsiella pneumoneae

e Pseudomonas aeruginosa. Utilizou-se como controle negativo (c-) água destilada e como controle

positivo (c+) o antibiótico comercial cloranfenicol 40 g.ml-1

., como comparativo foram utilizados o

peptídeo livre (P.L.) e as nanopartículas sem o peptídeo (N). As barras verticais representam o desvio

padrão.

De acordo com a literatura, poucas nanopartículas contendo peptídeos

antimicrobianos com atividade contra micro-organismos patogênicos têm sido

desenvolvidas. No entanto, Turos e colaboradores (2007) descreveram nanopartículas

covalentemente ligadas à penicilina com atividade contra cepas de MRSA. As partículas

foram preparadas por polimerização em emulsão e apresentaram ação prolongada contra a

bactéria. Em artigo publicado no mesmo ano, o autor demonstra a facilidade de preparação

e controle de partículas poliméricas, bem como a alta eficiência quando comparada ao

antibiótico livre (TUROS ET AL., 2007b). Alguns autores têm sintetizado nanopartículas de

íons de prata contra S. aureus, MRSA, Staphylococcus epidermidis (MRSE), Streptococcus

pyogenes, Salmonella typhi, E. coli, P. aeruginosa, K. pneumoniae. Essas partículas

apresentaram atividade contra todas as bactérias citadas. Para isso as bactérias foram

tratadas com as nanopartículas de íons de prata (AgNO3). Estes íons causaram

modificações morfológicas nas células bacterianas levando à inibição de seu

desenvolvimento. As células afetadas apresentaram estado ativo, no entanto demonstraram-

se inviáveis quando cultivadas (FENG, WU, CHEN ET AL., 2000; MORONES, ELECHIGUERRA,

CAMACHO ET AL., 2005; KIM, KUK, YU ET AL., 2007; JUNG, KOO, KIM ET AL., 2008; NANDA AND

SARAVANAN, 2009).

67

Além de poucos estudos utilizando nanopartículas no controle de infecções

bacterianas, não foram encontrados relatos de nanopartículas poliméricas contendo

peptídeos antimicrobianos. Neste sentido o presente estudo demonstra-se inovador no

desenvolvimento de produtos biotecnológicos farmacológicos.

6.2.1 Teste de hemólise

O ensaio hemolítico foi realizado com o uso de triton X-100 0,1% como controle

positivo (C+), PBS 0,01M como controle negativo (C-). O peptídeo livre foi comparado com o

peptídeo nanoestruturado, e a nanoestrutura livre, a qual não contém o peptídeo. Para o

cálculo de taxa de hemólise a liberação de hemoglobina foi medida a λ 405 nm e expressa

como porcentagem de hemólise, sendo o controle positivo considerado como 100%

hemolítico. Para representatividade dos dados o ensaio foi realizado em triplicata. De acordo

com os dados obtidos (Figura 21) não houve atividade hemolítica para nenhuma das

amostras testadas (nanopartículas contendo o peptídeo, peptídeo livre e nanopartículas sem

o peptídeo). Estes dados demonstram que o uso do peptídeo nanoestruturado não

apresenta indícios de citotoxicidade relacionada a hemólise de células sanguineas

humanas, podendo ser viável para uso farmacológico (DRESCH, HAESER, LERNER ET AL.,

2005).

Figura 22. Ensaio hemolítico realizado com o uso de Triton X-100 0,1% como controle positivo (C+),

PBS 0,01M como controle negativo (C-). As barras verticais correspondem ao desvio padrão. Foram

utilizadas 12 g do peptídeo (clavanina A), as nanopartículas sem o peptídeo e as

nanopartículas contendo o peptídeo (12 g).

0,00

0,20

0,40

0,60

0,80

1,00

1,20

1,40

1,60

1,80

C+ C- Pep. Nano +Pep. Nanop

Ab

s: 4

05

nm

Amostra

68

Gou e colaboradores (2009) desenvolveram de nanopartículas de Poly(ε-

caprolactone)/ Poly(ethyleneglycol)/ Poly(ε-caprolactone) contra tumores. Os autores

demonstraram que as nanopartículas obtidas não apresentaram atividade hemolítica,

viabilizando seu uso no desenvolvimento de novos fármacos (GOU, ZHENG, MEN ET AL.,

2009). Por outro lado, Creangã e colaboradores (2009) demonstraram os efeitos de

nanopartículas de magnetita em eritrócitos. Os autores concluíram que o fluido magnético se

apresentava incompatível com as células sanguíneas, inviabilizando seu uso farmacêutico

(CREANGĂ, CULEA, NĂDEJDE ET AL., 2009). Desta forma pode-se observar que os ensaios de

hemólise in vitro podem ser essenciais para o conhecimento prévio de indícios de toxicidade

do composto em desenvolvimento, no entanto os resultados destes testes não dispensam

testes in vivo e análises específicas relacionadas à toxicidade do composto.

6.3 ANÁLISES IN VIVO

6.3.1 Sobrevida

Como descrito anteriormente, a sepse caracteriza-se pelo desencadeamento de

SIRS relacionado a uma infecção, no entanto, a sepse pode evoluir apresentando quadros

de disfunção orgânica secundária, passando a ser definida como sepse grave e, por fim,

instabilidade cardiovascular, requerendo vasopressores, definindo o quadro de choque

séptico (MEDICINE, 1992 ). Os quadros de sepse evoluem de acordo com o tempo e a

resposta inflamatória do individuo, quando a resposta é, ainda, controlada existe um

equilíbrio entre os mediadores anti e pró inflamatórias restaurando-se a homeostase. No

entanto, quando há avanço da infecção consequentemente a perturbação deste equilíbrio

levando ao desencadeamento de SIRS, desencadeando processos de disfunção e,

posteriormente, falência múltipla de órgãos (BONE,GRODZIN AND BALK, 1997).

Para realização dos teste de sobrevida os camundongos foram pré tratados (15

minutos antecedentes a aplicação da suspensão bacteriana) com as diferentes amostras,

sendo elas peptídeo nanoestruturado, peptídeo livre, a nanoestrutura sem o peptídeo e os

controles positivo (cloranfenicol 40 g.ml-1 ) e negativo (animais não tratados). Em seguida

foram administradas doses dos tratamentos referentes a cada grupo (2, 4 e 12 g.ml-1). As

doses foram administradas a cada 24 h, objetivando a observação da sequência terapêutica

durante sete dias (tempo total de observação). De acordo com os resultados obtidos (Figura

69

22) foi possivel observar uma sobrevida, ao fim do sétimo dia, de 100 % dos animais

induzidos a sepse subletal tratados com as nanopartículas associadas a clavanina A,

utilizando-se uma concentração de 2 g do peptídeo. Para os animais tratados com as

nanopartículas associadas a clavanina A (12 e 4 g do peptídeo) observou-se uma taxa de

sobrevida de 20%. Os animais tratados com a estrutura sem o peptídeo apresentaram 80%

de sobrevida. Para o grupo tratado com o peptídeo livre (12 g) não foi observada

sobrevida.

Figura 23. Análise de sobrevida realizada após indução de sepse subletal intraperitoneal, com

administração, também intraperitoneal, dos tratamentos de cada grupo. A indução de sepse foi

realizada utilizando-se um pool de bactérias constituído de S. aureus, E. coli, P. aeruginosa e K.

pneumoniae. O peptídeo livre (Pep.) foi comparado com o peptídeo nanoestruturado (Nano. + Pep.) e

a estrutura livre (Nanop.), o qual não contém o peptídeo, utilizando-se diferentes concentrações do

peptídeo nanoencapsulado (2, 4 e 12 g do peptídeo clavanina A).

Os resultados obtidos pela curva de sobrevida dos animais induzidos a sepse letal

(Figura 23) demosntraram diferenças significativas dos resultados obtidos para sepse letal.

Neste caso, os animais tratados com as nanopartículas associadas a clavanina A,

utilizando-se uma concentração de 2 g do peptídeo, apresentaram 40% de sobrevida ao

fim do sétimo dia. O grupo tratado com as estruturas sem o peptídeo observou-se uma taxa

de sobrevida de 20%, o grupo tratado com o peptídeo livre (12 g) não foi observada

sobrevida.

Nanop.

Nano + Pep. 2 g

Nano + Pep. 12 g

Nano + Pep. 4 g

Pep. 12 g

70

Figura 24. Análise de sobrevida realizada após indução de sepse letal intraperitoneal, com

administração, também intraperitoneal, dos tratamentos de cada grupo. A indução de sepse foi

realizada utilizando-se um pool de bactérias constituído de Staphylococcus aureus, Escherichia coli,

Pseudomonas aeruginosa e Klebsiela pneumoniae. O peptídeo livre (Pep.) foi comparado com o

peptídeo nanoestruturado (Nano. + Pep.) e a estrutura livre (Nanop.), o qual não contém o peptídeo,

utilizando-se diferentes concentrações do peptídeo nanoencapsulado (2, 4 e 12 g do peptídeo

clavanina A).

A análise dos dados permite observar que a taxa de sobrevida dos animais durante

o experimento varia de acordo com o tempo de indução à sepse. Neste sentido foi possível

observar que a evolução do quadro de sepse para os animais não tratados (letal), tratados

somente com a estrutura (Nanop.) e tratados com o peptídeo livre (Pep.) não se modifica

após o segundo dia, sendo apenas 20% sobreviventes após 48 h de experimento. Para os

animais tratados com as nanopartículas associadas à clavanina A (2 g) a taxa de sobrevida

observada foi de 80 % até o segundo dia e de 60 % do segundo ao sexto dia. Estudos

posteriores poderão demonstrar se esta relação poderá prolongar o tempo de tratamento,

quando associado a outros antibióticos já utilizados. Alem disso, os resultados sugerem

fortemente que o efeito observado pode estar relacionado a atividade imunomodulatória

associada a atividade antibiótica do peptideo, novos experimentos poderão elucidar essa

caracteristica imunomodulatória.

O modelo de sepse caracterizado pela administração intraperitoneal da bactéria viva

ou de componentes microbianos tem sido muito utilizado para observação de sobrevida de

0 1 2 3 4 5 6 70

20

40

60

80

100

Nano Pep 2 ug

Estrutura 50 ul

Letal

Pep. Livre 12 ug

Dias após a Sepse

So

bre

vid

a (

%)

Nanop.

Nano + Pep. 2 g

Pep. 12 g

71

modelos animais. Essa metodologia reproduz os sintomas da sepse, demonstrando uma

real proximidade do quadro de sepse observado em casos clínicos, uma vez que o processo

se inicia a partir do foco infeccioso induzido na cavidade peritoneal, sendo disseminado de

forma rápida. Giacometti e colaboradores (2002) demonstraram a atividade de três proteínas

sendo elas a buforina II (BUF), a indolicidina (IND) e a sequência KFFKFFKFF (KFF), em

três diferentes formas de indução da sepse por E. coli (infusão intraperitoneal de LPS,

infusão intraperitoneal de colônias bacterianas, perfuração do ceco). Inicialmente não foi

observada diferença significativa entre os resultados obtidos para cada metodologia. Para

as metodologias de administração de LPS e infusão de colônias bacterianas não foi

observada sobrevida para os grupos controle, para os grupos tratados com as amostras de

BUF, IND e KFF, respectivamente, 26, 40 e 53 % de sobrevida nos grupos em que foi

utilizada a infusão intraperitoneal da bactéria e 33, 53 e 66% de sobrevida, respectivamente

(GIACOMETTI, CIRIONI, GHISELLI ET AL., 2002).

Cirioni e colaboradores (2002) demonstraram o uso das magaininas I (M1), II (M2) e

magainina II amidada (M2-NH2) no tratamento contra sepse bacteriana. Para isso os autores

induziram a sepse em camundongos por infusão intraperitoneal de colônias de E. coli. Os

autores demonstraram que 86,7% dos animais não tratados não sobreviveram, os grupos

tratados com M1, M2 e M2-NH2 apresentaram, respectivamente, 73,3; 80 e 66,7 % de

sobrevivência (CIRIONI, GIACOMETTI, GHISELLI ET AL., 2002). Coopersmith e colaboradores

(2002) demonstraram a relação entre o nível de apoptose celular no intestino de pacientes

com sepse bacteriana e os níveis de mortalidade encontrados. Para isso os autores

utilizaram camundongos previamente induzidos a super-expressão da proteína

antiapoptótica BCl2. Os animais foram, posteriormente, induzidos a sepse por infusão

intraperitoneal de colônias de P. aeruginosa, a sobrevida observada foi de 40% dos animais

com a super expressão protéica contra 4 % dos animais controle (COOPERSMITH,

STROMBERG, DUNNE ET AL., 2002). Os estudos acima descritos apresentam o uso de

peptídeos antimicrobianos utilizados no controle de infecções septicêmicas. Entretanto o uso

de nanopartículas poliméricas contendo peptídeos antimicrobianos não foi, ainda, relatado o

que dificulta uma comparação exata.

6.3.1 Análises de migração de neutrófilos após indução de sepse

Como anteriormente descrito, a sepse resulta da complexa interação entre o micro-

organismo infectante e a resposta imune, pró-inflamatória e pró-coagulante do hospedeiro,

desta forma a resposta imune inata pode ser responsável pelo processo inflamatório inicial

da sepse, a qual corresponde a alterações relacionadas a oferta de oxigênio e substratos,

72

levando as células a reagir à agressão séptica modificando seu comportamento, função e

atividade. Apesar dos mecanismos de disfunção orgânica não estarem completamente

elucidados estes mecanismos podem ser classificados em sistêmicos ou orgão específico.

Desta forma a resposta imune em relação a sepse pode desencadear tanto uma resposta

imune exagerada quanto a falta de resposta imune levando a falência multipla dos orgãos, a

depender do tempo de evolução da doença (HENKIN ET AL., 2009).

De acordo com os dados obtidos pela contagem total e diferencial das células

retiradas do lavado peritonial dos camundongos foi possivel observar que os camundongos

tratados com o antibiotico comercial, cloranfenicol 40 g.ml-1 (c+), os animais não tratados,

e os animais tratados somente com a nanoparticula, sem o peptídeo, apresentaram niveis

simililares de migração de neutrófilos (Figura 26). No entanto, segundo a análise estatística

por ANOVA e Teste de Tukey com p<0,0001 , realizada com auxilio do software GraphPad

Prism 5, não houve diferença significativa entre os grupos testados.

Figura 25. Análises de correlação de sepse e migração, realizadas após a indução de sepse letal por

via intraperitonial, com administração dos tratamentos de cada grupo. Os grupos foram divididos em

Letal, controle positivo (C+), 2 g de peptídeo nanoestruturado (Pep. Nano) e nanoestrutura (Nano).

A indução de sepse foi realizada utilizando-se um pool de bactérias constituído de S. aureus, E. coli,

P. aeruginosa e K. pneumoniae. O lavado peritoneal foi obtido após 6 horas de indução de sepse. A

análise estatística foi realizada por ANOVA e Teste de Tukey, utilizando p>0,05, onde as amostras

foram comparadas entre sí, objetivando demonstrar sua similaridade (*).

0.0

0.5

1.0

1.5

2.0

2.5

Letal C+ Pep. Nano.(2 ug)

Nano

Ne

utr

ófi

los

x 1

03

l

* *

*

*

Segundo Fialkow e colaboradores (2006) a apoptose de neutrófilos pode ser

inversamente proporcional a gravidade da sepse, neste sentido quanto maior a presença de

neutrófilos, mais facilmente pode-se controlar a infecção. Desta forma, o aumento na

73

contagem de neutrófilos encontrada para os animais tratados com a nanoestrutura contendo

a clavanina A, pode ser associada a regulação do tempo de evolução da sepse,

aumentando o tempo entre a infeção dos animais e a falência multipla dos orgãos (FIALKOW,

FOCHESATTO FILHO, BOZZETTI ET AL., 2006). Alves-Filho e colaboradores (2005)

demonstraram a importância da migração de neutrófilos para o foco infecioso, uma vez que

estes são capazes de controlar o desenvolvimento bacteriano e estimular a ativação de

outras celulas do sistema imune (ALVES-FILHO, BENJAMIM, TAVARES-MURTA ET AL., 2005).

Benjamim e colaboradores 2000 demonstraram a deficiência de migração de neutrófilos em

camundongos submetidos a sepse letal e subletal, os autores relacionam o aumento da

deficiência ao estado de sepse, uma vez que os animais submetidos a sepse subletal

apresentaram maior migração de neutrófilos e menor número de bactérias no exsudato

peritoneal (BENJAMIM,FERREIRA AND CUNHA, 2000). Desta forma conclui-se que a

concentração diminuta do número de neutrófilos encontrada nos animais não tratados e dos

tratados com o cloranfenicol 40 g.ml-1 e com as nanoestruturas sem o peptídeo, podem se

relacionar ao maior desenvolvimento bacteriano. Para os animais tratados com as

nanopartículas associadas ao peptídeo antimicrobiano, os quais apresentaram niveis

maiores de migração de neutrófilos, pode-se relacionar a um leve aumento de atividade

imunológica contra a infecção.

6.3.2 Análises de migração de neutrófilos:

Os neutrófilos representam os principais mediadores da imunidade inata,

contribuindo para a eliminação de micro-organismos patogênicos. Em relação a septicêmias

a migração de neutrófilos relaciona-se diretamente com a diminuição de mortalidade, uma

vez que permite a continuidade da resposta imune ao processo infeccioso. Neste sentido a

análise de migração de neutrófilos objetiva a observação de indução ou inibição da

capacidade de resposta do organismo em relação ao processo infeccioso (BENJAMIM, 2001).

Para a análise de migração de neutrófilos, os animais foram previamente tratados utilizando-

se 500 g de carragenina, fármaco inflamatório/endematogênico, aplicada via

intraperitoneal. Objetivando a observação comparativa de inibição do processo inflamatório

utilizou-se um grupo controle de animais não tratados após a indução inflamatória e um

grupo de animais aos quais não foi aplicado o indutor inflamatório, os demais grupos de

camundongos foram induzidos ao processo inflamatório e receberam os diferentes

tratamentos, sendo eles, peptídeo livre, nanopartículas contendo o peptídeo e

nanopartículas sem o peptídeo.

74

De acordo com os dados obtidos pela contagem total e diferencial das células

retiradas do lavado peritonial dos camundongos (Figura 24) foi possivel observar a

diminuição de migração de neutrófilos tanto para o peptídeo livre como para as

nanopartículas contendo o peptídeo e para as nanoparticulas sem o peptídeo, como

demonstrado na Figura 9. Considerando-se a carragenina como 100 % indutor inflamatório,

o peptídeo livre com concentrações de 2, 4 e 12 g, apresentou respectivamente, 77, 80 e

58% de inibição da indução inflamatória causada pela carragenina. O peptídeo encapsulado

apresentou com concentrações de 2, 4 e 12 g, respectivamente, 51, 83 e 41% de inibição

da inflamação e as nanopartículas sem o peptídeo apresentaram, para as mesmas

concentrações, 82, 80 e 84% de inibição do processo de inflamação. Segundo a análise

estatística por ANOVA e Teste de Tukey com p<0,05 , realizada com auxilio do software

GraphPad Prism 5, houve diferença significativa entre a carragenina e as amostras de

peptídeo livre (2 e 4 g), peptídeo nanoestruturado (4 g) e nanoestrutura 50, 100 e 300 l.

Em relação a solução salina apenas apresentaram diferença significativa as amostras de

peptídeo livre 12 g, peptídeo nanoestruturado 2, 4 e 12 g e nanoestrutura (50 e 300 l).

Neste sentido pode-se inferir que para as amostras que demonstraram diferença

significativa com a carragenina houve dimuinuição do efeito inflamatório induzido, para as

amostras que demonstraram diferença significativa com a solução salina houve efeito

inflamatório mesmo que diminuto.

75

0.0

0.3

0.6

0.9

1.2

2 4 12

Pep. Livre (g)

2 4 12

Pep. Nano(g)

50 100 300

Nanoest. (l)

Carragenina (500g)

Salina

*

Car.

+

+

+

* **

*

+

Nº

de

Ne

utr

ófilo

s (

x1

03)

Figura 26. Análise de migração de neutrófilos após indução de processo inflamatório por carragenina,

administrada por via intraperitoneal, com administração dos tratamentos de cada grupo. A obtenção

do lavado peritoneal foi realizada após 6 horas da administração do indutor inflamatório. Foram

utilizadas como controle positivo solução salina (salina) e negativo a carragenina 500 g (Car.), as

amostras de peptídeo livre (pep. Livre), peptídeo nanoestruturado (Pep. Nano) e nanoestrutura

(Nanoest.) foram comparadas aos controles negativo e positivo visando a observação do efeito anti-

inflamatório. A análise estatística foi realizada por ANOVA e Teste de Tukey, utilizando p<0,05, onde

as amostras foram comparadas com as amostras controles sendo marcadas aquelas de acordo com

a similaridade entre a amostra e a solução salina (+) e a carragenina (*).

A análise comparativa das amostras obtidas (peptídeo livre, o peptídeo encapsulado,

12 g de peptídeo, e as nanopartículas sem o peptídeo) permitiu a observação de

modulação do efeito inflamatório causado por indução, para isso a carragenina foi

considerado como 100% indutor inflamatório. O peptídeo livre, o peptídeo encapsulado (12

g) e as nanopartículas sem o peptídeo apresentaram respectivamente 42, 37 e 24% de

inibição da indução inflamatória causada pela carragenina (Figura 25). , para as mesmas

concentrações, 82, 80 e 84% de inibição processo inflamatório. Segundo a análise

estatística por ANOVA e Teste de Tukey com p<0,05 , realizada com auxilio do software

GraphPad Prism 5, houve diferença significativa entre a carragenina e a amostra de

peptídeo livre (12 g) e nanoestrutura. Em relação a solução salina foi observada diferença

significativa para as amostras de peptídeo livre 12 g, peptídeo nanoestruturado 12 g e

76

0.0

0.5

1.0

1.5

Pep. Liv re

(12 g)

Pep. Nano

( 12 g)Nanoest.Sal. Dexa.

Carragenina (500g)

*

+

Car.

Nº

de

Ne

utr

ófilo

s (

x10

3)

##

#

+

*

nanoestrutura. Neste experimento observou-se ainda o efeito do fármaco anti-inflamatório

dexametasona, sendo que apenas a amostra de peptideo nanoestruturado 12 g

apresentou diferença significativa.

Figura 27. Análise de migração de neutrófilos após indução de processo inflamatório por carragenina,

administrada por via intraperitoneal, com administração dos tratamentos de cada grupo. A obtenção

do lavado peritoneal foi realizada após 12 horas da administração do indutor inflamatório. Foram

utilizadas como controle positivo solução salina (salina) e negativo a carragenina 500 g (Car.), as

amostras de peptídeo livre (Pep. Livre), peptídeo nanoestruturado (Pep. Nano) e nanoestrutura

(Nanoest.) foram comparadas aos controles negativo e positivo visando a observação do efeito anti-

inflamatório. A análise estatística foi realizada por ANOVA e Teste de Tukey, utilizando p>0,05, onde

as amostras foram comparadas com as amostras controles sendo marcada a similaridade entre a

amostra e a solução salina (*), a carragenina (+) e a dexametasona (#).

Com a indução do processo inflamatório estimula-se a migração de células

imunológicas para o local afetado, desta forma a contagem de neutrófilos pode ser utilizada

como um dosador da evolução do processo (ROBBINS,COTRAN AND KUMAR, 2001). Para isso

a análise de moléculas com potencial anti-inflamatório, por exemplo, pode ser realizada de

acordo com a avaliação de migração de células imunológicas para locais específicos, por

meio de indução destes processos.Guarna e colaboradores (2006) revisaram a potencial

atividade anti-inflamatória encontrada em peptídeos catiônicos com atividade

antimicrobiana, apesar dos mecanismos de ação destes peptideos não serem

completamente elucidados sugere-se que haja interação dos peptídeos com propriedades

catiônicas com as células de defesa do hospedeiro, regulando sua migração para o local da

infecção (GUARNA,COULSON AND RUBINCHIK, 2006). Neste trabalho foi utilizada metodologia

de indução inflamatória por applicação intraperitoneal de carragenina, metodologia

77

semelhante foi utilizada por Bank e colaboradores (1990) objetivando demonstrar a atividade

anti-inflamatória do peptídeo 401 isolado do veneno de abelhas européias. Neste trabalho

os autores utilizaram indução inflamatória sub-cutanea aplicando carragenina para idução

de edema de pata. Após aplicação do peptideo 401 foi observada redução de 50 % do

edema induzido, sendo relacionada a atividade anti-inflamatória do peptídeo com a

capacidade de degranulação de mastócitos (BANKS, DEMPSEY, VERNON ET AL., 1990). Luger

e colaboradores (2007) demonstraram o -MHS como uma nova classe de peptideos anti-

inflamatórios. Esses peptideos endógenos foram derivados do tri-decapeptídeo

proopiomelanocortina por modificações pós-traducionais, os autores demonstraram que este

peptídeo foi capaz de suprimir o processo inflamatório induzido e regular o processo de

migração de celulas do sistema imune (LUGER AND BRZOSKA, 2007).

78

7 CONCLUSÕES

De acordo com os resultados obtidos, foi possível observar a viabilidade do projeto para o

desenvolvimento de possíveis produtos biotecnológicos. Os resultados preliminares

possibilitam observar:

A partir do polímero Eudragit L100-55 e do copolímero Eudragit RS 30D utilizando a

proporção 3:1 de polímero e copolímero, respectivamente, as estruturas

apresentaram segundo análises de microscopia de força atômica, distribuição

unimodal de tamanho (entre 62 e 250 nm de altura).

As análises das características morfológicas, obtidas por DLS apresentaram

nanopartículas contendo 372 nm de diâmetro, além de índice de polidispersividade

de 0,123, o que possibilita inferir-se que as estruturas possuem baixa variação do

tamanho entre as nanopartículas e baixa tendência a se aglomerar.

De acordo com os bioensaios in vitro contra as bactérias S. aureus, E. coli, P.

aeruginosa e K. pneumoniae a clavanina “A” nanoestruturada apresentou índices de

inibição do crescimento bacteriano positivos.

O peptídeo nanoestruturado não apresentou atividade hemolítica.

A taxa de encapsulação apresentou 98% de eficácia na nanoestruturação do

peptídeo antimicrobiano clavanina A. A liberação sustentada in vitro demonstrou que

o peptídeo em questão libera até 3% do peptídeo encapsulado na 12ª hora de

experimento.

Foi possível observar o potencial in vivo (contra o pool de bactérias contendo S.

aureus, E. coli, P. aeruginosa e K. pneumoniae) do peptídeo nanoformulado,

comparado ao peptídeo livre. Sendo possível observar uma taxa de sobrevivência de

60% dos animais tratados com o peptídeo nanoestruturado ao fim do sétimo dia de

experimento.

Não foi observado efeito anti-inflamatório nos animais tratados com o peptídeo

nanoestruturado.

Neste sentido conclui-se que a estruturação dos peptídeos antimicrobianos, como a

clavanina “A”, em sistema polimérico apresenta grande potencial biotecnológico, uma

vez que se observou a possibilidade de nanoestruturação e o aumento da eficiência

79

destas nanopartículas em animais induzidos a sepse. Novos experimentos poderão

elucidar melhor o potencial biotecnológico das estruturas propostas.

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