Separação de pigmentos por cromatografia em papel

Introdução

Clorofilas são pigmentos responsáveis pela conversão da radiação luminosa em

energia, sob a forma de ATP e NADPH, por essa razão, são estreitamente relacionadas com a

eficiência fotossintética das plantas e, conseguintemente, ao seu crescimento e adaptabilidade a

diferentes ambientes (Neves et al., 2005).

Segundo Taiz e Zeiger (2004) nas plantas superiores são encontradas as clorofilas A e B

(figura 1), os carotenos e as xantofilas. Estas clorofilas são os principais pigmentos relacionados

com a fotossíntese. Todas as clorofilas possuem uma estrutura em anel, quimicamente

relacionada ao grupo das porfirinas, contendo um Mg2+ no centro. Em adição, uma longa cauda

hidrofóbica ancora a clorofila na porção hidrofóbica do seu ambiente. Já os carotenos e as

xantofilas são tetra terpenos formados pela junção de unidades de isopreno.

As clorofilas localizam-se nos cloroplastos, sendo esta organela o continente da

fotossíntese, isto é, onde ocorrem as duas reações importantes: a fotoquímica, nas membranas

dos tilacóides e a bioquímica, no estroma do cloroplasto. Tais organelas, além das clorofilas,

contêm outros pigmentos chamados acessórios, como os carotenóides (carotenos e xantofilas).

As ligações entre as moléculas de clorofilas são muito frágeis (não-covalentes), rompendo-se

com facilidade ao macerar o tecido em solventes orgânicos. O caráter hidrofílico/hidrofóbico de

uma substância influi diretamente na escolha do melhor solvente para a sua extração. Os

solventes polares como a acetona, o metanol, o etanol, o acetato de etila, a piridina e a

dimetilformamida são os mais eficazes para a extração completa das clorofilas. Os solventes

apolares como o hexano e o éter de petróleo são os menos eficazes. No caso das clorofilas a e b,

o aumento da polaridade da clorofila b em relação à clorofila a deve-se ao substítuinte aldeído

(VON ELBE, 2000; SATIRO, 2009). A cromatografia é uma técnica extremamente simples e

permite a separação destes pigmentos. Adequada para ilustrar os conceitos de interações

intermoleculares, polaridade e propriedades de funções orgânicas, com uma abordagem

ilustrativa e relevante. Os métodos cromatográficos são utilizados para separar misturas

contendo duas ou mais substâncias ou íons (FONSECA E GONÇALVES, 2004).

O método consiste no uso de tiras de papel-filtro como suporte de uma fase aquosa, no

qual uma fase móvel orgânica se dirige para o ápice. As substâncias a serem separadas são

colocadas próximas á base da tira e se movem verticalmente, dependendo de sua afinidade por

uma das fases. A separação é, portanto, baseada na separação entre pigmentos da solução.

Objetivo

Extrair os pigmentos fotossintéticos por partição em solventes com diferentes

polaridades; separar clorofilas e carotenóides através da técnica de cromatografia em papel.

Material e métodos

Caracterização da área de estudo

O estudo foi realizado na Universidade Federal do Mato Grosso, campus Sinop,

que está localizada no estado de Mato Grosso a 500 km da capital Cuiabá a uma latitude

Figura 1: Estrutura química da clorofila A e clorofila B. Fonte: Streit et al, 2005.

11º50’53” sul e a uma longitude 55º38'57" oeste, com uma população estimada em 114.051 e

uma área territorial de 3.206,86 Km². A vegetação é de floresta tropical, do tipo Ombrófila ou

Tropical. Predomina o clima Tropical Chuvoso, com precipitação média anual de 1.900

milímetros. Temperatura máxima anual de 33º C e mínima de 27º C. A altitude em relação do

nível do mar é de 384 metros (IBGE Cidades, 2009; ATR).

Material experimental

Foram utilizados três espécies de plantas: Plectranthus barbatus A. (Boldo),

Tradescantia pallida e anacardium occidentale (caju). Cadinho e pistilo para maceração das

folhas, 10 ml de álcool metílico para cada espécie utilizada, béquer de 100 ml para acondicionar

as soluções das amostras extraídas através das macerações com adição de álcool metílico. Papel

filtro para realização do processo de cromatografia, pipeta Pasteur e grampeador.

Avaliações experimentais

O experimento foi realizado durante a aula prática de Fisiologia Vegetal no

laboratório de sementes da Universidade Federal de Mato Grosso no dia 8 de julho de 2013. E

teve por finalidade separar os pigmentos de três espécies: Plectranthus barbatus A. (Boldo),

Tradescantia pallida e anacardium occidentale (caju). Houver a maceração das três espécies

com auxilio de um cadinho e pistilo. Para cada espécie macerada, foram adicionados 10ml de

álcool metílico dentro do cadinho e posteriormente foi transferido somente a parte liquida para

um béquer de 100ml. Após essa fase, um papel filtro retangular arranjado em formato cilíndrico

foi inserido dentro do béquer contendo a solução da extração por maceração, o mesmo

procedimento foi realizados para todas as espécies.

Resultados

O experimento mostrou-se eficaz, sendo bem perceptível a absorção dos

pigmentos. Em todos os casos a absorção máxima do solvente ficou no mesmo nível que a

absorção que o pigmento antocianina. Quatro tipos de pigmentos foram identificados na

separação por cromatografia em papel. A ordem de separação dos pigmentos, de baixo para

cima, foi a seguinte: clorofila B, clorofila A, carotenoide e antocianina.

O gráfico da figura 2 mostra os níveis dos pigmentos obtidos no processo de

cromatografia:

Clorofila B Clorofila A Carotenoite Antocianina Solvente0

1

2

3

4

5

6

BoldoTradescantiaCaju

Altu

ra e

m cm

obti

do p

elos

pig

mtn

os

Discussão

Boldo apresentou os maiores níveis em clorofila a com 2,5 cm de altura e

antocianina com 1,7 cm de altura; tradescantia apresentou o maior nível em clorofila b com 3,0

cm de altura e os níveis de carotenoides foram os mesmos para as duas espécies, sendo 0,5 cm

de altura. O cajueiro apresentou os menores níveis para todos os pigmentos.

Figura 2: A altura obtido em centímetros no papel filtro, nas analises dos pigmentos. Dados

O experimento funcionou pelo fato das moléculas possuírem uma propriedade chamada

polaridade em comum e tenderem a se atrair mutuamente. A clorofila b apresentou uma cor

verde clara, a clorofila a apresentou uma cor verde escuro, carotenoides coloração amarelada e

antocianina coloração roxa. Foi observado que as clorofilas A e B apresentam maior fator de

retenção, pois foram mais difíceis de serem arrastadas já que apresentaram uma maior interação

com o papel, indicando que as mesmas são substâncias polares (Degani, 1998). O experimento

foi concluído com sucesso, pois segundo Félix (2009) o solvente sobe por capilaridade no papel

e arrasta os diferentes pigmentos ficando estes dispostos, da parte inferior para a parte superior,

na seguinte ordem: clorofila b, clorofila a, xantofilas e carotenos.

Conclusão

A separação dos principais pigmentos (clorofila a, clorofila b e antocianina)

presentes no vegetal através de cromatografia em papel, mostrou-se eficiente, pois apresenta

linhas de fácil visualização com relação de um pigmento para o outro e de baixo custo. O

experimento dá margem a discussões sobre interações intermoleculares, polaridade e funções

orgânicas.

Bibliografia

DEGANI, A. L. G. Cromatografia um breve ensaio. Química Nova na Escola, nº7, pag. 21-25,

Maio 1998.

FÉLIX, A. A. F. Extração e separação de pigmentos fotossintéticos. Terra Universo de Vida,

ano1, 2ª parte, Porto Editora, 2007.

FONSECA, S.F. e GONÇALVES, C.C.S. Extração de pigmentos do espinafre e separação em

coluna de açúcar comercial. Química Nova na Escola, São Paulo, n. 20, p. 55-58, novembro,

2004.

NEVES, O. S. C.; CARVALHO, J. G.; MARTINS, F. A. D.; PÁDUA, T. R. P.; PINHO, T. R.

P. Uso do SPAD-502 na avaliação dos teores foliares de clorofila, nitrogênio, enxofre, ferro e

manganês do algodoeiro herbáceo, v.40, n.5, p.517-521, maio, 2005.

SATIRO, E. S. Texto acadêmico: Separação de pigmentos por cromatografia. Minas Gerais.

Universidade do estado de Minas Gerais, 2009.

STREIT, N. M.; CANTERLE, L. P.; CANTO, M. W.; HECKTHEUER, L. H. H. As clorofilas.

Cienc. Rural v.35, n.3, Mai/Jun 2005.

TAIZ, L. & E. ZEIGER. Fisiologia Vegetal. Tradução: SANTARÉM, E. R., et al. 3ª ed. Porto

Alegre: Artmed, 2004.719p

VON ELBE J.H. Colorantes. In: FENNEMA, O.W. Quimica dos alimentos. 2.ed. Zaragoza :

Wisconsin - Madison, 2000. Cap.10, p.782-799.