IBRAC – IX Seminário Internacional de Defesa da Concorrência - 2003
Seminário sobre Validação 2003
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Validação de métodos Validação de métodos cromatográficoscromatográficos
Mestranda: ADRIANA ELIAS PIRES
Orientadora: CLÁUDIA CARDOSO
Departamento de Química – UFMS
Campo Grande – MS, 2003
SINAIS
OBJETIVO DO MÉTODO?
RESULTADOS PRETENDIDOS?
MATRIZES DE AMOSTRAS?
POSSÍVEIS INTERFERENTES?
NÍVEIS DE EXATIDÃO, PRECISÃO, SENSIBILIDADE, LD REQUERIDOS?
PLANEJAMENTO DE METODOLOGIA
SELEÇÃO DA MATRIZ
DETERMINAÇÃO DAS SUBSTÂNCIAS DE INTERESSE
DETERMINAÇÃO DO SOLVENTE EXTRATOR, VOLUME DE SOLVENTE, MODO DE
EXTRAÇÃO E TEMPO DE EXTRAÇÃO (n>3)
RECUPERAÇÃO 4 CONC. EM TRIPLICATA
MONITORAMENTO POR CLAE:
CONDIÇÕES CROMATOGRÁFICAS;
CURVA DE CALIBRAÇÃO
VALIDAÇÃO
QUALIFICAÇÃO DO EQUIPAMENTO ANALÍTICO
ESTABILIDADE DAS SOLUÇÕES ANALÍTICAS ICH
TESTE DE ADEQUAÇÃO DO SISTEMA
Processo que fornece uma evidência documentada de que o método é confiável dentro de uma determinada faixa de aplicação que o analito será analisado.
VALIDAÇÃO
VALIDAÇÃO
Assegura credibilidade às medidas obtidas.
Requisito indispensável para publicação de novas metodologias.
Permite que a transferência de um método entre laboratórios ocorra da forma mais satisfatória.
Guias da US Food and Drug Administration (FDA)Reviewer guidance, Validation of chromatographic methods
guideline for submitting samples and analytical data for methods validation
guidance for industry: analytical procedures and methods validation
guidance for industry: bioanalytical method validation
US Pharmacopeia 24
Internacional Conference on Harmonization (ICH)Q2A Texto on validation of analytical methods
Q2B Validation of analytical procedures: methodology
No BRASIL: Agência Nacional de Vigilância Sanitária.
RE nº899, de 29 de maio de 2003.
ESTRUTURA PARA VALIDAÇÃO DE MÉTODOS
PARÂMETROS DE
VALIDAÇÃO
ESPECIFICIDADE
EXATIDÃO
PRECISÃO
LINEARIDADE
FAIXA DE APLICAÇÃO
LIMITE DE DETECÇÃO
LIMITE DE QUANTIFICAÇÃO
ROBUSTEZ
ESPECIFICIDADE
Capacidade de um método de diferenciar um composto em presença de outros componentes da amostra (impurezas, intermediários de síntese, excipientes, produtos de degradação e componentes da matriz).
Potenciais interferentes ⇒ ESTRESSE
Especificidade x Seletividade
EXATIDÃO
Grau de concordância ou compatibilidade entre o valor médio dos resultados e o valor de referência aceito.
Exatidão X Acurácia
Exatidão = Conc. média experimental X 100% ANVISA
Conc. aceita
4 CAMINHOS:
1. Análise de amostra de concentração conhecida (padrão de referência) e comparação dos dados com o valor verdadeiro.
2. Comparação dos dados do método novo com os de uma metodologia bem caracterizada de exatidão estabelecida.
3. Recuperação de quantidades conhecidas de analito adicionadas à matrizes brancas.
4. Recuperação de quantidades conhecidas de analito adicionadas à matrizes com o analito.
EXATIDÃO
ICH, ANVISA, USP
EXATIDÃO
Nº DE DETERMINAÇÕES:
Três concentrações em triplicata: 80, 100 e 120% da concentração teórica da amostra. ANVISA, ICH
Recuperação para resíduos: Três concentrações: 1L OQ, 2 LOQ e 10 LOQ.GARP
CRITÉRIOS DE ACEITAÇÃO:Amostras, inclusive produtos farmacêuticos: 100 2%
Impurezas: 0,1% absoluto ou 10% relativoJ.of Chromatography A, 987 (2003) 57
Resíduos: 70 a 120%GARP
Análises bioanalíticas: 15%, sendo no LQ 20%.ANVISA, FDA, ICH
Traços 100ppb 60 a 110%J. Liq. Chrom. & Rel. Technol., 19 (5) 737-757, 1996.
100ppb 80 a 100%
1ppm 70 a 120%
PRECISÃO
Avaliação da proximidade dos resultados obtidos em uma série de medidas do método.
CV = DP x 100 ICH, ANVISA
CMD
onde, CV é o coeficiente de variação, DP é o desvio padrão e CMD, a concentração média determinada.
PRECISÃO
1. REPETITIVIDADE:
Expressa precisão entre os resultados de medidas do mesmo método para a mesma amostra, no mesmo laboratório, pelo mesmo operador usando mesmo equipamento em um curto intervalo de tempo.
Nº DE DETERMINAÇÕES:
3 concentrações em triplicata contemplando intervalo linear ou 6 determinações a 100% da concentração teórica da amostra. ICH, ANVISA, J.Chromatogr.A 987 (2003) 57
Análises bioanalíticas: 3 concentrações em quintuplicata. ICH, ANVISA, J.Chromatogr.A 987 (2003) 57
Precisão do instrumento: 10 injeções de uma solução de amostra. FDA
PRECISÃO: 1. REPETITIVIDADE
CRITÉRIOS DE ACEITAÇÃO:
DOSEAMENTO: 2%; precisão do instrumento 1% J.Chromatogr.A 987 (2003) 57
IMPUREZAS: 5% no LQ; precisão do instrumento 10% no LQ. J.Chromatogr.A 987 (2003) 57
RESÍDUOS: 20% GARP
PRECISÃO
2. PRECISÃO INTERMEDIÁRIA:
Expressa a precisão dos resultados obtidos usando o mesmo laboratório, mas em dias diferentes, com analistas diferentes e/ ou equipamentos diferentes.
Um mínimo de 2 dias diferentes com analistas diferentes. ANVISA
Uso de amostras autênticas é indicado. ICH
PRECISÃO
3. REPRODUTIVIDADE:
Expressa a precisão dos resultados obtidos pelo mesmo método e mesma amostra, por diferentes operadores, usando diferentes equipamentos em diferentes laboratórios. Estudos colaborativos, geralmente
aplicados à padronização de metodologia analítica, por exemplo, para inclusão em farmacopéias. ICH, ANVISA
ALGUNS CRITÉRIOS DE ACEITAÇÃO:± 2% do valor do laboratório primário;
J.Chromatog.A 987 (2003) 57
não se admite valores acima de 5%.ANVISA
Análises bioanalíticas: 15%, sendo no LQ, 20%.ANVISA,FDA
LINEARIDADE & FAIXA DE VARIAÇÃO
Linearidade é a habilidade do método produzir resultados diretamente proporcionais à concentração do analito numa dada faixa de variação.
Faixa de variação é o intervalo entre o maior e o menor níveis de analito que demonstra ser determinado com precisão, exatidão e linearidade usando o método como descrito.
LINEARIDADE & FAIXA DE VARIAÇÃO
80 a 120% da concentração teórica do teste; ICH, ANVISA,
FDA
Impurezas: desde o nível esperado até 120% do limite máximo especificado. Em toxicologia os limites devem se adequar às quantidades a serem controladas; ICH, ANVISA, FDA
Resíduos: ½ a 5 LOQ. GARP
Testes de uniformidade de conteúdo: 70 a 130%; ICH, ANVISA
Ensaios de dissolução: 20% em relação à faixa de variação do teste. ICH, ANVISA
Nº DE DETERMINAÇÕES:
Cinco concentrações em replicata (n>2), ANVISA,,ICH nas seguintes faixas mínimas de variação:
LINEARIDADE & FAIXA DE VARIAÇÃO
A linearidade pode ser demonstrada pelo exame visual do gráfico que relaciona os sinais obtidos na análise e a concentração do analito.
A equação da reta é definida por:
y = ax + b onde: y= resposta; x= concentração; a = coeficiente angular (inclinação/sensibilidade); b = coeficiente linear (intersecção no eixo y qdo x=0)
0 20 40 60 80 100
0
50000
100000
150000
200000
Área
Concentração
Curva de calibração: padrão externo relaciona a resposta do aparelho com a massa do analito sem levar em conta a matriz.
LINEARIDADE & FAIXA DE VARIAÇÃO
Rev. Brasileira de Toxicologia. 11 (1) (1998) 1 e Q.B.Cass; A.L.G. Degani. Desenvolvimento de métodos por HPLC: fundamentos, estratégias e validação.
0 20 40 60 80 100 0
50000
100000
150000
200000
250000
Área
Concentração
Curva de calibração: padrão interno cuja medida permite comparação relativa com o analito, sem interferir com a resposta deste.
LINEARIDADE & FAIXA DE VARIAÇÃO
Padrão interno: retenção próxima, boa resolução em relação ao analito, alta pureza e estabilidade.
Rev. Brasileira de Toxicologia. 11 (1) (1998) 1 e Q.B.Cass; A.L.G. Degani. Desenvolvimento de métodos por HPLC: fundamentos, estratégias e validação.
0 20 40 60 80 100
0
50000
100000
150000
200000
Y
X
Y = A. analito
A. p.interno
X = C. analito
Curva de calibração com adição do analito à matriz elimina a interferência da matriz e outras etapas do método.
LINEARIDADE & FAIXA DE VARIAÇÃO
Rev. Brasileira de Toxicologia. 11 (1) (1998) 1 e Q.B.Cass; A.L.G. Degani. Desenvolvimento de métodos por HPLC: fundamentos, estratégias e validação.
Intersecção no eixo y = qtde de analito na amostra.
Quando há Impossibilidade de matriz branca.
0 20 40 60 80 100 0
500
1000
1500
2000
2500
Área
Concentração
LINEARIDADE & FAIXA DE VARIAÇÃO
REGRESSÃO LINEAR (método dos mínimos quadrados) : é uma forma de estimar qual a melhor reta que passa pelos pontos obtidos experimentalmente.
0 5 10 15 20
0
5
10
15
20
y=-0,15+0,88x
r=0,9981
Área
Concentração
LINEARIDADE & FAIXA DE VARIAÇÃO
COEFICIENTE DE CORRELAÇÃO (r) : expressa a relação de x e y na curva, onde os valores ideais são 1 e –1.
CRITÉRIO MÍNIMO ACEITÁVEL:
= 0,99 ANVISA ; 0,999 FDA
COEFICIENTE DE DETERMINAÇÃO (R) : r 2
0 20 40 60 80 100
0
50000
100000
150000
200000
y=-19,72+198,66x
r=0,9998
Área
Concentração
LIMITE DE QUANTIFICAÇÃO (LQ)
É a menor quantidade do analito em uma amostra que pode ser determinada com precisão e exatidão aceitáveis sob as condições experimentais estabelecidas.
LIMITE DE QUANTIFICAÇÃO
FORMAS DE DETERMINAÇÃO:
1. BASEADA NA AVALIAÇÃO VISUAL: métodos não instrumentais. ICH, ANVISA
ex. CCD, Titulação, Mudança de cor.
2. BASEADA NA RELAÇÃO SINAL-RUÍDO: procedimentos analíticos que exibem ruído de linha de base. Relação sinal-ruído típica é 10:1.ICH, ANVISA, FDA, USP
LQ: FORMAS DE DETERMINAÇÃO
3. BASEADA NO DESVIO PADRÃO DA RESPOSTA E NA INCLINAÇÃO DA CURVA DE CALIBRAÇÃO. ICH,
ANVISA
LQ: FORMAS DE DETERMINAÇÃO
LQ = 10 DP
S
onde DP é o desvio padrão da resposta e S é a inclinação da curva de calibração.
LIMITE DE DETECÇÃO (LD)
É a menor quantidade do analito em uma amostra que pode ser detectado, porém não necessariamente quantificado, sob as condições experimentais estabelecidas.
LIMITE DE DETEÇÃO
FORMAS DE DETERMINAÇÃO:
1. BASEADA NA AVALIAÇÃO VISUAL ICH, ANVISA
2. BASEADA NA RELAÇÃO SINAL-RUÍDO. Relação sinal-ruído típica é 2 ou 3:1. ICH, ANVISA, FDA, USP
3. BASEADA NO DESVIO PADRÃO DA RESPOSTA E NA INCLINAÇÃO DA CURVA DE CALIBRAÇÃO, ICH, ANVISA, USP
LD = 3,3 DP ICH, USP ou LD = 3 DP ANVISA
S S
ROBUSTEZ
Um método robusto tem a capacidade de não ser afetado por uma pequena e deliberada modificação em seus parâmetros.
ROBUSTEZ
Preparo das amostras: estabilidade das soluções analíticas, tempo de extração.
Espectrofotometria: variação do pH da solução, temperatura, diferentes fabricantes de solventes.
Cromatografia Líquida: variação do pH da fase móvel, variação na composição da fase móvel, diferentes lotes ou fabricantes de colunas, temperatura, fluxo da fase móvel.
Cromatografia Gasosa: diferentes lotes ou fabricantes de colunas, temperatura, velocidade do gás de arraste.
Os principais parâmetros que podem resultar em variação na resposta do método
QUAIS OS PARÂMETRO
S DE VALIDAÇÃO REQUERIDO
S???
Características de performance versus tipo de procedimento analítico pela ICH:
Procedimento analítico
Identificação
Testes de impurezas Doseamento
Quantitativo
Ensaios-limite
Exatidão não sim não sim
PrecisãoRepetitividadeP. Intermediária
nãonão
simsim
nãonão
simsim
Especificidade sim sim sim sim
LD não não sim não
LQ não sim não não
Linearidade não sim não sim
Faixa de variação
não sim não sim
Características de performance versus tipo de procedimento analítico pela USP: USP Pharmacopeia 24, 1999
Procedimento
analítico
Principais component
es
Impurezas ou produtos dedegradação
características de
performance(ex.
dissolução)
Identificação
Quantitativo
Ensaios-limite
Exatidão sim sim * * nãoPrecisão sim sim não sim não
Especificidade
sim sim sim * sim
LD não não sim * simLQ não sim não * não
Linearidade não sim não * nãoFaixa de aplicação
sim sim * * não* Pode ser requerido dependendo da natureza do teste.
G.A.Shabir, J.of Chromatography A, 987 (2003) 57
J. Babak; H.M. Nielsen, J.of Chromatogr. A . 996 (2003) 213.
R.C. Prados-Rosales; J.L.L. García; M.D.L. de Castro, J.of Chromatogr. A.993(2003) 121.
M. Lampinen; U. Bondesson; E. Fredriksson; M. Hedeland, J.of Chromatogr. B. 789(2003) 347.
T. Verhaeghe; L. Diels; R.de Vries; M. De Meuder; J.de Jong, J of Chromatogr.B. 789(2003) 337.
C. A. L. Cardoso, N. K. Honda, A. Barison, J. Pharm. Biomed. Anal. 27(2002) 217.
Q.B.Cass; A.L.G. Degani. Desenvolvimento de métodos por HPLC: fundamentos, estratégias e validação. EdUFSCar, São Carlos, 2001.
Apostila do curso: Validação de métodos analíticos realizado por ISOLAB Consultoria e Cursos. C.B.Barros; Y.S.Hirata; N.M.N.Sato; Taboão da Serra, dez. 1997.
ICH Harmonised Tripartite Guideline, Validation of analytical procedures: methodology. Geneva, 1996.
F. Leite. Validação em análise química. ed. Átomo, Campinas, 1996.
A.A.M. Chasin; E.S. Nascimento; L.M. Ribeiro-Neto; M.E.P.B. Siqueira; M.H. Andraus; M.C. Salvadori; N.A.G. Fernícola; R. Gorni; S. Salcedo, Rev. Brasileira de Toxicologia. 11 (1) (1998) 1.
Reviewer Guidance. Validation of Chromatographic Methods. Center for Drug Evaluation and Research, US Food and Drug Administration, Rockville, MD, Nov, 1994.
M.E. Swartz; I.S. Krull, Pharmaceutical Technology, (1998) 12.
D.R. Jenke. Chromatographic method validation: a review of current practices and procedures. II. Guidelines for primary validation parameters. J. Liq. Chrom. & Rel. Technol., 19 (5) 737-757, 1996.
Resolução - RE nº 899, de 29 de maio de 2003.
Guidance for industry. Bioanalytical method validation. US Departament of Health and Human Services, Food and Drug administration, Center for Drug Evaluation and Research and Center for Veterinary Medicine, Rockville, MD, Maio, 2001.
J.K.Taylor (1987) Quality assurance of chemical measurements. 2 ed., Lewis Publishers, Chelsea, 1987.
USP 24 (United States Pharmacopeial Convention, Rockville, MD, 1999)
C.B.Barros, Biológico, 64(2) (2002) 175
REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS
FIM