Seleção de

Transconjugantes

Tópicos a abordar:

• Resultados da aula anterior

• Tipos de antibióticos

• Encontro entre bactérias

• Bactéria dadora

• Bactéria recetora

• Transconjugantes

• População da placa de conjugação

• Meios de cultura

-Tipos de meios de cultura

-Exemplos de meios de cultura

• Meio de seleção

• Previsão das colónias que se esperam obter

• Colónias âmbar

• Colónias vermelhas

Antibióticos• AMC – Amoxicilina + Ácido Clavulânico

• FOX – Cefoxitina (cefalosporina da 2ª geração)

• NA – Ácido Nalidíxico (quinolona da 1ª geração)

• ATM – Aztreonamo (monobactamo)

• KF – Cefalotina (cefalosporina da 1ª geração)

• FEP – Cefepima (cefalosporina da 4ª geração)

Aspeto inicial das placas

999K802N

Aspeto inicial das placas

405405

  405 999 K802N

AMC (amoxicilina + clavulânico)

4 mmRESISTENTE SENSÍVEL

 0 mmRESISTENTE

NA (ácido Nalidíxico) 23 mmSENSÍVEL

24 mmSENSÍVEL

0 mmRESISTENTE

ATM (aztreonamo) 1 mmRESISTENTE

Sinergismo com AMC

0 mmRESISTENTE

FEP (cefepima) 18 mmSENSÍVEL

Sinergismo com AMC

0 mmRESISTENTE

FOX (cefoxitina) 0 mmRESISTENTE

8 mmRESISTENTE

25 mmSENSÍVEL

KF (cefalotina) 0 mmRESISTENTE

0 mmRESISTENTE

10 mmRESISTENTE

Resultados da aula anterior

Resultados da aula anterior  Resistent

eIntermédi

o Sensível Classe

AMC (amoxicilina + clavulânico)

≤ 13 mm 14 – 16 mm

≥ 17 mm Penicilinas

NA (ácido Nalidíxico) ≤ 13 mm 14 – 18

mm≥ 19 mm Quinolonas

ATM (aztreonamo) ≤ 15 mm 16 – 21

mm≥ 22 mm

Monobactamos

FEP (cefepima) ≤ 14 mm 15 – 17 mm

≥ 18 mm

Cefalosporina B

FOX (cefoxitina) ≤ 14 mm 15 – 17 mm

≥ 18 mm

Cefalosporina B

KF (cefalotina) ≤ 14 mmm 15 – 17 mm

≥ 18 mm

Cefalosporina A

β - Lactâmicos• Anel β–Lactâmico

• Inibem a síntese da parede celular bacteriana, por inibição das transpeptidases

Penicilinas• Anel β-Lactâmico associado a um anel de tiazolidina

• Ativas contra bactérias Gram positivo, não produtoras de β-lactamases e com fraca atividade contra bactérias Gram negativo

Amoxicilina (AMX)• β-lactâmico de espectro moderado utilizado no

tratamento de infeções bacterianas

Cefalosporinas• Anel β-lactâmico associado a uma molécula de

dihidrotiazina

• Atividade contra bactérias Gram negativo

• Resistentes a β-lactamases estafilocócicas

• 1ª, 2ª, 3ª,4ª geração

Cefoxitina• Cefalosporina 4ª geração• Menos ativa que as primeiras contra cocos Gram

positivo• Moderadamente resistentes às beta-lactamases dos

bacilos Gram negativo

Cefepima• Largo espectro

• Estáveis contra beta-lactamases de largo espectro

• Colmatam deficiências das cefalosporinas da 3ª

geração

Cefalotina Cefalosporinas da primeira geração

Maior atividade contra bactérias de Gram positivo do que Gram negativo

Monobactamos

• Inibem a síntese da parede bacteriana

• Inibidores de bactérias Gram negativo

Aztreonamo• β-lactâmico monocíclico

• Molécula anfotérica

• Espectro de actividade:

◦ Com atividade: bacilos Gram negativo anaeróbios

◦ Sem atividade: bactérias Gram positivo, aeróbios

restritos

Quinolonas• São efetivos contra Gram-negativos e positivos• Inibição do DNA girase e de topoisomerase IV

• Ácido nalidíxico: inibe a síntese dos ácidos nucleicos

Encontro bacteriano: Conjugação

Conjugação é a transferência de DNA plasmídico de uma bactéria dadora para uma bactéria recetora

“Mating” designa o contacto físico entre a bactéria dadora e a bactéria recetora

MAS COMO SE FAZ?

Em caldoMisturam-se 100 μl da bactéria dadora e da bactéria recetora num cado fresco.

Em agarNuma placa de gelose aplicam-se 100 μl da bactéria recetora sob a forma de gota.Aplicam-se da mesma forma 100 μl da bactéria dadora superiormente à recetora.

Procedimento:

Técnica Assética

Estirpes bacterianasDentro das bactérias Gram negativas, as da família

Enterobacteriaceae, nomeadamente Escherichia coli e Klebsiella pneumoniae são as principais responsáveis pelas infeções do trato urinário, devido em parte à sua grande capacidade adaptativa.

Bactéria Recetora• Estirpe K802N: E.coli• Resistente ao ácido nalidíxico resistência

codificada por mutação no DNA cromossómico• Bacilo de Gram Negativo• GLUC + (via ácido mista)• LAC –• Citocromo c oxidase –• Móvel• Produtora de indol• Reduz nitratos a nitritos (nitrado redutase +)

Bactéria Dadora• Estirpe 999: Klebsiella pneumoniae

• Resistente à amoxicilina resistência

codificada por DNA plasmídico

• Bacilo de Gram Negativo• GLUC + (via butileno-glicólica)

• LAC +

• Citocromo c oxidase –

• Urease +

• Reduz nitratos a nitritos (nitrato

redutase +)

Transconjugantes

• São as bactérias que queremos obter e isolar!!

CARACTERÍSTICAS FENOTÍPICAS

o Possuem resistência ao ácido nalidíxico e à amoxicilina

o Possuem todo o fenótipo das bactérias recetoras

Placa de ConjugaçãoQue tipo de bactérias se

desenvolverão na placa de gelose?

• Bactérias Recetoras

• Bactérias Dadoras

• TransconjugantesComo passar para o

meio de seleção?

Procedimento

• Faz-se uma diluição em soro fisiológico

• Espalha-se na placa de seleção

• Promove-se o crescimento bacteriano - incubação

Técnica Assética

• Contêm todos os nutrientes necessários ao crescimento e desenvolvimento dos microorganismos, sob a forma assimilável e em concentração não inibitória

Meios de cultura

Meios de cultura• Devem ser esterilizados e para manter a cultura

pura é necessário manipulá-los recorrendo à técnica assética

• Podem ser classificados de acordo com o seu estado físico, composição química e objetivos funcionais

• Permitem manter os microorganismos viáveis no laboratório sob a forma de culturas puras

• A sua especificidade é muito importante, pois permite tirar muitas conclusões

• Permitem o isolamento, identificação e estudos importantes como o da sensibilidade aos antibióticos

Meios de cultura

Cled

• Diferencial para a lactose

• Não selectivo

• Indicador de pH: Azul de bromotimol  Ácido: Amarelo

Básico: Azul esverdeado

CONSTITUIÇÃO:

• Extrato de carne

• Lactose

• Agar

• L-cisteína

• Água

Cled

Mannitol• Diferencial para o manitol

• Selectivo para as Gram (+)

• Indicador de pH: Vermelho de fenol

  Ácido: amarelo

Básico: vermelho/rosa

CONSTITUIÇÃO:

• Extrato de carne

• peptona

• manitol

• Agar

• Água

• Elevada [NaCl]

Mannitol

McConkey

CONSTITUIÇÃO:

• Peptona

• Lactose

• Agar

• Sais biliares

• Cristal violeta

• Água

• Diferencial para a lactose

• Selectivo para Gram (-)

• Indicador de pH: Vermelho neutro

  Ácido: vermelho

Básico: âmbar/incolor

McConkey

Meio de seleção• Meio que permite que se detetem as bactérias

com as características desejadas, ou seja, as resultantes da conjugação

• O meio deve ser seletivo: evitar contaminações e selecionar as transconjugantes

Meio de seleção• O meio deve ser o meio de McConkey com adição de

antibióticos

• Antes da utilização o meio deve ser TESTADO

Mas como ??

Meio de seleção

Testemunho:

Teste de Viabilidade:

PrevisãoQuais serão as colónias que serão capazes de se

desenvolver no meio de selecção ??Que cor apresentarão ??

AMARELAS(transconjugantes)

VERMELHAS

AMARELAS A MUDAR

PARA VERMELHO

Colónias Amarelas

Verdadeiras transconjugantes

Recetoras:

- Degradação progressiva da amoxicilina pelas β-Lactamases provoca níveis cada vez mais baixos de antibiótico

- As recetoras conseguem desenvolver-se

- Crescem à volta das verdadeiras transconjugantes

Colónias Vermelhas Transconjugantes:

- Mudança de cor devido à acidificação do meio de cultura (degradação do antibiótico)

Dadoras:

- Ocorrência de uma mutação espontânea

“As bactérias são melhores engenheiros genéticos que o Homem e vão continuar a escapar ao efeito dos antibióticos.”