Sección de Microbiología Cina a su alcance/AspTecEnsay.pdf · con la inocuidad de los alimentos...

Aspectos técnicos de los ensayos relacionados con la inocuidad de los alimentos para animales

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Sección de Microbiología

2

Ensayos para medir inocuidad

Escherichia coli O157:H7, RT mesófilo aerobio, RT

hongos/levaduras, Salmonella, Escherichia

coli NMP, serotipificación de

Salmonella, Clostridium

Aflatoxinas (B1, B2, G1, G2 y M1); DON;

Fumonisina (B1 y B2); Ocratoxina A; T-2;

Zearalenona

Monensina, narasina, tilosina, tetraciclinas

(tetraciclina, oxitetraciclina, clortetraciclina,

doxiciclina, minociclina, 4-epitetraciclina)

Como realizar el muestreo

Cliente responsable

Homogeneidad de la muestra.

Esterilidad◊

Muestras secas almacenar y transportar a

temperatura ambiente

Muestras con ↑ % humedad almacenar y transportar a 4 °C

Traer al laboratorio máximo dentro de las 24 horas inmediatas a la toma de la muestra ◊

◊ Aplica muestras microbiológicas

3

Microorganismos de interés en

alimentos para animales

Detección de

Salmonella

RT mesófilo aerobio

Escherichia coli NMP

Detección Escherichia

coli O157:H7

Clostridium perfringens

en rendering

Serotipificación

Salmonella

RT hongos/ levaduras

Aplicaciones

Recuentos

(bacterias, hongos y levaduras)

Carga de microorganismos

Deterioro/Caducidad del producto

Estabilidad del producto

en condiciones de almacenamiento y transporte

LMP no se han definido

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Aplicaciones Escherichia coli (NMP/g)

Presencia indica contaminación fecal

Alerta sobre posibles patógenos en muestra

LMP no se han definido

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Aplicaciones Detección de Salmonella

Vigilancia epidemiológica Inocuidad en materias primas y alimento terminado para consumo animal LMP Ausencia en 25 g muestra

7

Para que serotipificar?? Prevalencia de serotipos de Salmonella

8 Salmonella serovars isolated from table eggs: An overview. Francesca Martelli , Robert H. Davies. Food Research International 45 (2012) 745–754

Porcentaje de muestras de huevo positivas para Salmonella Enteritidis, S.Typhimurium, y otras serovariedades de Salmonella sobre el número total de muestras analizadas

Mecanismos de transferencia de

genes entre serovariedades

diferentes

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Salmonella en alimento para animales en Costa Rica

Serovariedad Tipo de alimento Salmonella Anatum 3,(10)(15)(15,34):eh:1,6

Salmonella Manchester 6,8:I,v:1,7

Salmonella Rissen 6,7,14_:f,g:-Negativo

Salmonella Soerenga 30:i:Iw

Salmonella Give 3(10)(15)(15,34):I,v:1,7

Salmonella Rissen 6,7,14:f,g:-Negativo

Salmonella Brandenburg: 1,4(5),12:I,v:e,n,z15

Salmonella Mbandaka 6,7,14:z10:e,n,z15

Salmonella Havana 1,13,23:f,g,(s):-Negativo

Salmonella Muenster 3,10(15)(15,34):e,h:1,15

Salmonella Yoruba 16:c:I,w

Salmonella Montevideo 6,7,14:g,m,{p},s: {1,2,7}Negativo

Salmonella entérica subespecie O3,10:z10:-Negativo

Salmonella Infantis 6,7,14:r:1,5

Harina de carne y hueso

Salmonella Soerenga 30:i:Iw

Salmonella Orannienburg 6,7,14:m,t:(z57) Negativo

Salmonella Alachua 35:z4,z23:-Negativo

Salmonella Amsterdam 3,(10)(15,34):g,m,s:-Negativo

Salmonella Rissen 6,7,14:f,g:-Negativo

Salmonella Yoruba 16:e:I,w

Salmonella Havana 1,13,23:f,g,(s):-Negativo

Salmonella Havana 1,13,23:f,g:-Negativo

Salmonella Yoruba 16:c:I,w

Salmonella I:O15 pendiente completar

Salmonella Mbandaka 6,7,14:z10:e,n,z15

Salmonella Anatum 3,(10)(15)(15,34):eh:1,6

Salmonella entérica I,O rugoso:f,g:-Negativo

Salmonella Senftenberg O 1,3,19 positivo, H fase 1:g,(s)t: positivo, H fase 2 -Negativo

Salmonella Anatum O3,(10)(15)(15,34) Positivo, H fase 1e,h:positivo, H fase 2 1,6 positivo

Salmonella Berta O1,9,12 positivo; H fase 1f,g positivo; H fase 2 -negativo

Salmonella Schwarzengrund O 1,4,12,27: Positivo, H fase 1 d:positivo, H fase 2 1,7 positivo

Salmonella Havana O 1,13,23: positivo, H fase 1 f,g,(s): Positivo, H fase 2 - negativo

Salmonella Rissen O 6,7,14: positivo, H fase 1 f,g: positivo, H fase 2 - negativo

Alimento para pollo

Salmonella Heidelberg 1,4,(5),12:r:1,2 Carne para perro

Salmonella Soerenga 30:i:Iw Alimento para pescado

Salmonella Molade 8,20:z10:z6 Alimento para cerdo

Salmonella I:O35 Pendiente completar Harina de tilapia 10

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Metodología

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Método de oro

Ventajas

Desventajas

Métodos rápidos

Ventajas

Desventajas

Sensibilidad método (porque algunos laboratorios detectan y otros no?? CINA detecta ≥ 2,8 UFC/25 g

Serie 1 + medidas correctivas Serie 2 + Suspensión de certificado de exportador y medidas correctivas Serie 3 + Retiro del CVO indefinidamente y medidas correctivas

Legislación LMP Ausencia en 25 g de muestra (matriz o alimento terminado para consumo animal)

Nº 37548-MAG, 12/09/2012, La Gaceta N° 46 del: 06/03/2013

Aplicaciones

Escherichia coli O157:H7

Vigilancia epidemiológica

LMP ausente en 25 g alimento

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Aplicaciones Clostridium perfringens

Vigilancia de infecciones en animales

Indicador de funcionamiento de cocinas rendering → priones (Encefalopatía espongiforme bovina)

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¿Qué son las Micotoxinas?

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Toxina Tipo micotoxina, dosis, duración

ingesta

Individuo Especie animal, género, edad,

raza, estado general nutricional y salud, estatus inmunológico

Ambiente Manejo en campo, higiene,

temperatura, humedad, otros agentes tóxicos

Humano Carcinogénica, teratogénica,

mutagénica, inmunosupresora, hepatotóxica, nefrotóxica,

neurotóxica, Síndrome de Reye, gastritis crónica, cirrosis infantil,

enfermedades respiratorias ocupacionales.

Animales Gastroenteritis, diarrea, hemorragia

intestinal, fallo en función rumen, cetosis

↓ producción

Infertilidad

Mastitis

Contaminación de leche

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Toxina Hongo productor Alimentos donde se

encuentra

Especie más

susceptible

Principales efectos sobre el sistemas de

los mamíferos

Referencia

Toxina T2 y HT2 Especies de Fusarium F.sambucinum, F. venenatum, F. camptoceras, F. poae, F. sporotrichioides, F.acuminatum, F. graminearum, F. culmorum, F. crookwellense, F. equiseti, F. lateritium y F. solani

Cereales, harina, arroz Humanos, ganado bovino, pollos, pavos, ratas, ratones, caballos

Inhibidor de la síntesis de proteínas y función mitocondrial tanto in vivo como in vitro, inmunosupresor y citotóxico, efectos tóxicos sobre la piel y membranas mucosas. Hemorragia estomacal, intestinal, pulmonar, en riñón y vejiga Bloqueo de la síntesis de proteínas por inhibición de la enzima peptidil trasferasa

Cano-Sancho et al 2012; Desjardins and

Proctor 2001 Seo, J & Yu, J 2005

Fumonisina B1 y B2

Fusarium moniliforme Fusarium verticillioides y Fusarium proliferatum; Alternaria alternata f.sp. lycopersici

Maíz, alimentos a base de maíz, sorgo, cerveza

Humano, caballos, cerdos, ratas, ratones

Leucoencefalomacia equina, edema pulmonar e hipertrofia de arterias pulmonares en porcinos, nefrotoxicidad y cáncer hepático en ratas, Inmunosupresión en pollos, hemorragia cerebral en conejos, cáncer hepático y esofágico en humanos. Inhibición de la enzima ceramida-sintasa

Soriano et al 2004 Seo, J & Yu, J 2005

Deoxinivalenol (DON)

Fusarium culmorum Fusarium graminearum Especies de Stachybotrys

Cereales Humanos, ganado bovino, pollos, pavos, ratas, ratones, caballos

Inhibe síntesis de proteínas. Gastroenteritis, Náusea, diarrea, vómito, rechazo del alimento, anorexia, alteración de la función inmune. Cerdos son los más sensibles. Hemorragia estomacal, intestinal, pulmonar, en riñón y vejiga Bloqueo de la síntesis de proteínas por inhibición de la enzima peptidil trasferasa

Pestka, 2007 Seo, J & Yu, J 2005

Zearalenona Fusarium graminearum(Gibberella zeae), F culmorum, F. crockwellense, F. avenaceum, F.tritinctum, F. equiseti, F. oxysporum F. cerealis, F. semitectum

Granos, Maíz, cebada, trigo, cebada, avena, soya, cerveza, alimento para animales(pollo,

vacas), frutas y vegetales deshidratados

Cerdos, ganado lechero, pollos, ratas, ratones, humanos

Disruptor endocrino, propiedades estrogénicas. Problemas reproductivos en animales, infertilidad, abortos. infertilidad, abortos afecta principalmente cerdos. En humanos causa síndrome hiperestrogénico , Carcinogenica, hepatotóxica, hematotóxica, inmunotóxica y genotóxica. Unión a receptores de estrógenos.

Döll y Dänicke 2011 Zinedine et al 2007 Seo, J & Yu, J 2005

Ocratoxina A (OTA)

Aspergillus ochraceus, Aspergillus melleus, Aspergillus sulphureus, Aspergillus nigri. Aspergillus lanosus, Aspergillus alliaceus, Aspergillus carbonarius yAspergillus awamori, Penicillium verrucosum, Penicillium chrysogenum y Penicillium nordicum

Cereales, cerveza, vino, cacao, café, uvas pasas, especias, frutas

deshidratadas, productos cárnicos

Humanos, patos juveniles, cerdos, perros, ratas,

Carcinogénica, nefrotóxica, hepatotóxica, teratogenica e inmunosupresora., nefropatía porcina Inhibición de la enzima fenilalanina hidroxilasa

Aish et al 2004Pattono et al 2013

Turner et al 2009 Maff, 1993

Seo, J & Yu, J 2005

Citrinina Penicillium expansum Penicillium citrinum, otras especies de Penicillium , Aspergillus y Monascus

Granos, cereales, maíz, arroz, trigo, cebada, avena, frutas, maiz

fermentado, queso, manzana, cerveza, carne, ensilajes, alimentos

para animales y humanos, fluido biológicos

Humanos, aves, cerdos, roedores

Nefrotóxica (daña los túbulos proximales del riñón) , hepatotóxica, afecta síntesis de macromoléculas Carcinogénica, mutagénica, neurotóxica, genotóxica, inmunosupresora

Bao-jun et al 2006 Sanzani et al 2012 Seo, J & Yu, J 2005

Patulina Aspergillus clavatus, Penicillium expansum, Penicillium clavigerum, Penicillium griseofulvum , Byssoclamys nivea y Byssoclamys fulva.

Manzana, productos de manzana, albaricoque, pera, uvas, fresas,

arándanos y duraznos

Humanos, ganado bovino Citotóxica, genotóxica, mutagénica, carcinogénica, teratogénica inmunosupresora, neurotóxica. Causa lesiones intestinales, degeneración celular epitelial, inflamación, ulceración, hemorragias. Síntomas de intoxicación aguda: Agitación, convulsiones, edema, ulceración y vómito. Los efectos crónicos incluyen genotoxicidad, inmunotoxicidad y neurotoxicidad. Inhibición de la función de la barrera epitelial por inactivación de la enzima tirosina fosfatasa

Sanzani et al 2012 Al-Hazmi, N.A, 2010 Pattono et al 2013 Moukas et al 2008 Seo, J & Yu, J 2005

Aflatoxina B1, B2, G1 y G2

Aflatoxina M1 y M2

A. flavus, A. parasiticus, Aspergillus bombycis, Aspergillus ochraceoroseus, Aspergillus nomius y Aspergillus pseudotamari

nueces, granos, cereales, maíz y arroz

Humanos, ganado bovino, pollos, perros, gatos

Carcinogénicas/hepatitis aguda (tumores en hígado) trastornos del sistema inmunológico Hemorragia tracto intestinal y en riñones Epoxido-AFB1 bioactivo ataca macromoléculas y causa tumores por formación de aductos AFB1-ADN

Peraica et al 1999 Zain 2011; Turner et al

2009 Seo, J & Yu, J 2005

Micotoxinas en alimentos

Panorama mundial de las micotoxinas

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Legislación de las MYC

¿Costa Rica?

AF total (20 µg/kg ) igual a FDA

Decreto N 27980-S; L Gaceta viernes 9 julio 1999 y martes 20 julio 1999.

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• País de clima tropical

• Condiciones pobres de almacenamiento de granos

• Temperatura, precipitación y humedad relativa elevadas

○ Unión Europea (UE) * Food And Drug Administration (FDA)

Analito Límite de cuantificación

(LoQ) µg.kg-1

Límite máximo

permitido (LMP) µg.kg-1

Aflatoxina B1 0,015 12○

Aflatoxina B2 0,259 -

Aflatoxina G1 0,330 -

Aflatoxina G2 0,224 -

Aflatoxina total 0,1 15○ /20*

Aflatoxina M1 0,014 0,05○ / 0,5*

Fumonisina B1 50 5000

Ocratoxina A 0,011 10

Zearalenona 0,022 500

Deoxinivalenol 10 5000

Toxina T-2 5 -

Análisis de MYC

¿Qué analitos se determinan?

Metodología ensayo MYC

• Preparación de la muestra con columnas de inmunoafinidad

Análisis por HPLC del extracto

Condiciones Valor óptimo

Sistema Agilent 1200 Series SL, Bomba cuaternaria

Tiempo balanceo luego de la corrida (min) 2 min

Presión (bar) 88max

Columna Zorbax Eclipse Plus C18 5 μm, 3.0 mm × 150 mm

OTA


Fase móvil A = ACN, D = H2O 0,2 mol/L TFA, pH = 2.1

Modo Isocrático 50% A y 50 % D

Volumen de inyección (μL) 20

Flujo (mL/min) 0,7

Ganancia del detector (PMT) 12

Detector de fluorescencia (nm) Excitación, 247; emisión, 480

Duración de la corrida (min) 10 min

ZEA


Fase móvil A = ACN, B = MeOH C = H2O

Modo Isocrático 40% A, 10% B, 50% C


Flujo (mL/min) 0,7




AFM1


Fase móvil A = ACN, B = MeOH C = H2O

Modo Isocrático 10% A, 35% B, 55% C


Flujo (mL/min) 0,6




AFB1, AFB2, AFG1, AFG2


Fase móvil A = ACN B = MeOH C = H2O

Modo Isocrático Isocrática 5% A, 30% B, 65% C


Flujo (mL/min) 0,8




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Resultados de MYC por ELISA y HPLC de muestras de alimentos para animales

Toxina Muestras Positivas * Unidades Límite de

detección. ELISA

Aflatoxinas totales (n=133) 61 [2-285] µgkg-1 3

Zearalenona (n=78) 49 [21-726] µgkg-1 20

Ocratoxinas (n=84) 7 [2-36] µgkg-1 1,9

Fumonisinas (n=102) 58 [0,30-36] mgkg-1 0,25

Toxina T2 (n=107) 37 [39-761] µgkg-1 35 Deoxinivalenol (n= 91) 75[0,3-21] mgkg-1 0,25

HPLC Aflatoxinas totales** (n=114) 50[0,102-86,75] µgkg-1 0,0989*** Zearalenona (n=51) 25[1,56 - 434] µgkg-1 O,00 Ocratoxina A (n=54) 6[0,141 - 11,21] µgkg-1 0,0037 Fumonisinas (n=24) 6[0,3 - 31,88] mgkg-1 0,05 Toxina T2 (n=37) 21[35,24 - 434] µgkg-1 0,0042 Deoxinivalenol (n=21) 15[0,28-151,6] mgkg-1 0,05

* con concentraciones superiores al límite de detección. ** Sumatoria de las cuatro toxinas que se pueden detectar en caso de que la muestra tenga más de un tipo de Aflatoxina. ***Límite detección para micotoxinas Aflatoxina B1 0,0046 µg/kg, Aflatoxina B2 0,0777µg/kg ,Aflatoxina G1 0,0989 y Aflatoxina G2 0,0671

Algunos resultados… • Concentraciones elevadas suelen ocurrir

en materias primas como maíz Muestra 2113-12

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AFB1

Estándar 20 µg/L en orden de salida AFG2, G1 ,B2 y B1

Resultados históricos AFB1 en alimentos para animales Costa Rica

ELISA entre el 2010-2011 (n= 133; 61[3-285] µgkg-1 ; 46%)

HPLC entre el 2011-2013 (n=114; 50 [0,102-86,75] µgkg-1 44% )

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Antibióticos en alimentos

AB’s se usan en terapia o profilaxis sin saber si el alimento influencia la actividad biológica del AB (se analizan monensina, narasina, tilosina y familia tetraciclinas)

Tetraciclinas se unen fuertemente a proteínas y M2+

23 Government Accountability Office Antibiotic Resistance: Data Gaps Will Remain Despite HHS Taking Steps to Improve Monitoring. GAO-11-406. Washington, D.C.: June 1, 2011.

Análisis de Abs por CLAR (HPLC)

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CLAR (Análisis multiresidual para 14 analitos incluyendo metabolitos y derivados epiméricos

Datos interesantes de ABs en alimento para animales

25 25

Rango de concentración (mg kg-1)

Tipo de alimento Oxitetraciclina

(No. de muestras positivas)

Tetraciclina


Clortetraciclina


Doxiciclina


Tilapia (n=21) 119.1 – 1922.5 (3) 5755.0 – 8365.0 (4) 140.0 – 612.2 (2) 31.4 (1)

Pollo (n=21) 78.3 – 190.9 (3) Not detected 135.8 – 438.6 (6) No detectado

Cerdo (n=21) 1076.3 – 47.2 (4) 74.65 (1) 1012.3 – 284.4 (5) 41.7 – 109.5 (3)

Camarón (n=21) No detectado No detectado No detectado 21.5 – 51.3 (6)

Número de muestras negativas para cualquiera de las tetraciclinas ensayadas

Tilapia Pollo Cerdo Camarón

4 12 11 15

Datos de resistencia a ABs en Costa Rica

• Problemas de resistencia a ABs

• Caso en Costa Rica

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Beneficios Acreditación. Que valor agregado nos aporta??

Competencia técnica demostrada

Uso materiales de referencia certificados

Comparaciones de pares

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Análisis Valor z / resultado

Año

2014 2013 2012

RT mesófilo aerobio -0,70 -1,37 -0,22

RT hongos y levaduras 0,69 0,02 NR

RT hongos 1,80 0,09 0

RT levaduras 0,05 0 -0,17

Escherichia coli (NMP/g) 0,14 -0,81 1,65

Salmonella sp

(presencia/ausencia)

No

detectada+

No

detectada+

Detectada+

Escherichia coli O157:H7

(presencia/ausencia)

Detectada+ Detectada+ Detectada+

Aflatoxina total pendiente -0,79 -

Ocratoxina A pendiente -2,01 -

+ Valor congruente con el resultado esperado o aceptado como verdadero, NR no reportado

CINA… hacia donde vamos?

• Identificación de hongos toxigénicos en materias primas y alimentos para animales

• Ensayos de vida útil de materias primas y alimentos para animales

• Introducción medio cromogénico en Salmonella en lugar de SB

• Análisis de toxina HT-2 (metabolito toxina T-2; 2014)

• Patulina (CINA/CITA), jugos de frutos y citropulpa (2014)

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