‐ UNIVERSIDADE DE SÃO PAULO ‐–  

 Tese de Doutorado | Henrique C De Paoli 

Junho - 2010

‐PÓS‐GRADUAÇÃO GENÉTICA ‐ 

SCI1, UM NOVO INIBIDOR TECIDO‐ESPECÍFICO DA PROLIFERAÇÃO CELULAR RELACIONADO À SINALIZAÇÃO POR AUXINA 

 

 

SCI1, UM NOVO INIBIDOR TECIDO-ESPECÍFICO DA PROLIFERAÇÃO CELULAR RELACIONADO À SINALIZAÇÃO POR AUXINA Henrique Cestari De Paoli

Orientação, Profa. Dra. Maria Helena S. Goldman (USP-RP/BRASIL)

Co-Orientação, Prof. Yunde Zhao – PhD. (UCSD/USA)

Universidade de São Paulo

Faculdade de Medicina de Ribeirão Preto

Programa de Pós-Graduação em Genética

Ribeirão Preto – SP – BRASIL Junho - 2010

TESE  DE  DOUTORADO  apresentada ao  programa  de  Pós‐graduação da  Faculdade  de  Medicina  de Ribeirão  Preto  da  Universidade de  São  Paulo,  como  parte  dos requisitos  para  a  obtenção  do Título  de  DOUTOR  EM  CIÊNCIAS, área  de  concentração  Genética Geral 

 

Ficha Catalográfica  Henrique Cestari De Paoli DePaoli, H.C. Título: SCI1, UM NOVO INIBIDOR TECIDO‐ESPECÍFICO DA PROLIFERAÇÃO CELULAR RELACIONADO À SINALIZAÇÃO POR AUXINA. Ribeirão Preto: FMRP, 2010  Número de Páginas: #183# Tese de Doutorado apresentada ao Departamento de Genética da Faculdade de Medicina de Ribeirão Preto da Universidade de São Paulo – USP  Orientadora: Profa. Dra. Maria Helena S. Goldman Co‐Orientador: Prof. Yunde Zhao, PhD.  As atividades apresentadas nesta Tese foram realizadas no Laboratório de Biologia Molecular de Plantas, da Faculdade de Filosofia Ciências e Letras da Universidade de São Paulo/BRASIL; e no Laboratório do Prof. Yunde Zhao, na “Section of Cell and Developmental Biology, University of California San Diego/CA‐USA”.   

Descrição da Capa  A  imagem  da  capa mostra  uma microscopia  eletrônica  de  varredura  de estigmas  no  estágio  ‐2  e  pistilos  no  estágio  1  de  plantas  de  Nicotiana tabacum  selvagens  (no  topo;  “wild‐type”),  superexpressando SCI1  (canto inferior‐esquerdo;  “SCI1  overexpression”)  e  silenciadas  para  SCI1  (canto inferior‐direito; SCI1 RNAi). Embora os estigmas estejam no mesmo estágio do desenvolvimento, os de SCI1 RNAi mostraram um aumento marcante do  tecido  estigmático,  comparado  com  o  selvagem,  enquanto  que  um fenótipo  oposto  foi  observado  nas  plantas  de  superexpressão. Adicionalmente,  nas  plantas  de  RNAi,  o  estilete  elonga  mais  que  nas plantas  selvagens,  posicionando  o  estigma  acima  das  anteras  e introduzindo em nossas plantas o que chamamos de heterostilia. Propõe‐se que SCI1 seja um novo regulador tecido‐específico do ciclo celular que provavelmente modula  a  atividade de CDK, na parte  superior do pistilo, através da interação com ciclinas do tipo A. As pequenas flores por detrás do  título  são  de  Arabidopsis  thaliana  e  representam  algumas  variações florais  de  duas,  três,  quatro  ou  cinco  pétalas  que,  às  vezes,  foram observadas no duplo mutante sci1npy1. 

 

The heavens declare the glory of GOD; the skies proclaim the work of His hands, day after day they pour forth speech; night after night they display KNOWLEDGE” Psalm 19:1‐2 

 

AAAgggrrraaadddeeeccciiimmmeeennntttooosss Ao DEUS DE ISAQUE, ABRAÃO E JACÓ, que triunamente trabalhou em meu favor e me capacitou a vencer cada etapa para esta vitória;

Aos meus pais, Fernando Antônio De Paoli e Mari Angela Cestari De Paoli pelo amor, incentivo, por direcionar minhas decisões e, principalmente, pela compreensão e por serem porto seguro em minha vida, amo vocês;

À Jaqueline Moisés Tobal, “carne da minha carne, osso dos meus ossos”, sem a qual meu ser ainda seria manco, por cada incentivo, pelo apoio, pela compreensão, pela paciência, paciência, paciência, paciência, amor e por ser “a melhor do mundo!”;

À Profa. Maria Helena Goldman, mais que uma orientadora, pelos ensinamentos e oportunidade na Ciência, pelo zelo pessoal, pelas lutas em busca de sonhos, pela paciência e compreensão às minhas limitações e, é claro, pelas discontrações;

Ao Prof. Dr. Yunde Zhao, que um dia disse “sim” a um simples email, e mudou a minha vida, por cada ensinamento, pelo apoio e, principalmente, pela oportunidade e paciência;

À minha família, Carolina, Samuel e Leonardo Bortoletto, Felipe Cestari De Paoli, avôs, avós, tios, tias, primos e primas, que torceram por mim, mesmo que de longe;

Aos Professores e ex-orientadores, que se empenharam para o meu crescimento, em especial ao Dr. José Edson Fontes Figueiredo, instrutor dos meus primeiros passos, e às oportunidades do Prof. Dr. Marcelo C. Dornelas e Dra. Maria Cristina Pranchevicius;

Aos membros do LBMP/USP do passado, pelo incentivo; aos do presente, pela participação ativa no meu crescimento, pela amizade, companheirismo e paciência, em especial pela dedicação da Dra. Andréa C. Quiapim no suporte ao sequenciamento de clones e; aos que chegam, com contribuições modestas, meu muito obrigado e boa sorte, façam bom proveito do que conquistamos;

Aos meus amigos de Rep, aos Manos da Bio, aos colegas de Departamento na Genética e na Biologia, aos parceiros da Salinha e aos Futebolistas (Prof. Abel), que me permitiram aliviar as pressões do dia a dia e se tornaram companheiros de uma jornada;

Ao Goldman´s Team, especialmente ao Prof. Dr. Gustavo Henrique Goldman, por ceder equipamentos e representar um alicerce, sem o qual meu trabalho e conhecimento jamais seriam o mesmo;

Aos membros do Laboratório do Prof. Yunde Zhao, pela receptividade, companheirismo, apoio e carinho;

Aos amigos Brazucas, em San Diego/CA, os quais não tenho palavras para descrever minha gratidão e carinho, em especial, à Katlin Massirer e Leonardo Karan Teixeira;

Aos Professores Lieven De Veylder (Ghent Univeristy); Mark Estelle, Julian Schroeder, Martin F. Yanofsky, Laurie Smith, Robert Schmidt (UCSD); Elliot Meyerowitz (CalTech); Wagner Ferreira dos Santos, Maria Cristina Roque Barreira, Constance Oliver, Maria Célia Jamur, Zilá Luz Paulino Simões, Roy Edward Larson, Simone de Pádua Teixeira, Carlos Alberto Martinez y Huaman, John Campbell McNamara (USP), por gentilmente cederem parte de seus equipamentos e espaços físicos, apoiando a realização deste trabalho;

Aos Professores Luis Lamberti P da Silva, Adriana Hemerly, Jen Sheen, Joanne Chory, Jeffrey Long, James Umen, Anthony Hunter e aos revisores do periódico The Plant Cell, por sugestões e estimularem a discussão do trabalho;

Às agências de fomento FAPESP, CNPq, CAPES, Genética/FMRP, FAEPA e Biologia/FFCLRP, por cada centavo que, suado, foi atenciosamente concedido, em fé de que seria bem aproveitado, e aos que contribuíram de alguma forma nesta jornada, agradeço sem palavras.

 

ÍÍÍnnndddiiiccceee

CONTEÚDO PÁGINAS Resumo da Tese 1 Thesis Abstract 4 Introdução 7

As espécies Nicotiana tabacum e Arabidopsis thaliana. 9 A reprodução de plantas no modelo vegetal N. tabacum 9 O transcriptoma no estigma e estilete 13 O desenvolvimento floral: enfoque no carpelo de N. tabacum. 15 A maquinaria da divisão celular em plantas 18 Uma visão da atuação da auxina no desenvolvimento do pistilo 23

Objetivos 27 Material e Métodos 30

Material Vegetal 32 Sequenciamento, primers e análises computacionais 32 Manipulação de ácidos nucléicos e construções gênicas 34 Extração de RNA 35 RT-PCR quantitativo (qRT-PCR), “semi-quantitativo” (RT-PCR) e hibridização in situ 36 Importação dos dados de Microarranjo 38 Transformação de Plantas 38 Testes de interação genética 39 Experimentos de Microscopia 40 Coloração com GUS 41 Números de acesso de seqüências utilizadas 41 Mutantes de T-DNA de Arabidopsis analisados 42

Resultados e Discussão 43

Capítulo I: Um novo gene de estigma/estilete de Nicotiana tabacum, SCI1, que codifica uma proteína rica em lisina e controla a divisão e diferenciação celular durante o desenvolvimento 44

Resultados 45 Identificação do gene SCI1 e análise de sua localização subcelular 45 SCI1 é um gene específico de estigma/estilete regulado ao longo do desenvolvimento 50 O gene SCI1 é expresso exclusivamente nos tecidos especializados do estigma/estilete relacionados com a reprodução de plantas 50 O produto do gene SCI1 controla o tamanho do estigma 52 A proteína SCI1 é um regulador negativo do ciclo celular 55 SCI1 é expresso nos estágios iniciais do desenvolvimento do estigma/estilete 58 SCI1 controla a proliferação/diferenciação celular e influencia o momento do desenvolvimento do estigma/estilete 61

 

A proteína SCI1 tem as Ciclinas do tipo A como suas parceiras de interação 64 SCI1 influencia os níveis de transcrição de alguns genes regulados por auxina 65 Discussão 67 SCI1 é um regulador tecido-específico do ciclo celular que influencia o desenvolvimento do pistilo 67 SCI1 é um regulador do ciclo celular distinto dos inibidores de CDK já descritos em plantas 70 SCI1 conecta a sinalização de auxina e o controle da divisão/diferenciação celular? 73

Capítulo II: Caracterização do gene SCI1 na via de sinalização de auxina do pistilo 76

Resultados 77 Identificação e análise de SCI1 em Arabidopsis: AtSCI1 77 Caracterização do locus At1g79200 (AtSCI1) de Arabidopsis thaliana 78 Análise da região promotora e de expressão do gene AtSCI1 80 SCI1 atua no desenvolvimento, dependente de auxina, do pistilo 83 Interação genética entre sci1 e, yuc2yuc6, pid336 e npy1 em Arabidopsis 85 Discussão 87 SCI1 em diferentes espécies vegetais: N. tabacum e A. thaliana 87 SCI1 e a via de sinalização de auxina no pistilo 89 SCI1 no controle do ciclo celular dependente de auxina 91

Considerações Finais 93 Referências 96 Anexos 109

Anexo 1 - Artigo submetido para publicação no periódico “The Plant Cell” Anexo 2 - Curriculum Vitae

DePaoli,H.C 2010 

 

Resumo 

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DePaoli, H.C., 2010.

SCI1, UM NOVO INIBIDOR TECIDO-ESPECÍFICO DA PROLIFERAÇÃO CELULAR RELACIONADO À SINALIZAÇÃO POR AUXINA

sucesso da reprodução de plantas depende do desenvolvimento apropriado dos

órgãos reprodutivos, o qual envolve redes regulatórias específicas. Realizou-se a

caracterização de um gene previamente desconhecido, identificado em uma

biblioteca subtrativa de estigmas/estiletes de Nicotiana tabacum. Esse gene codifica uma proteína

pequena, rica em lisina, a qual mostrou-se ser específica de pistilo e, mais precisamente, transcrita

nos tecidos especializados do estigma/estilete: zona secretória do estigma (SSZ) e o tecido

transmissor do estilete (STT). A seqüência da proteína, deduzida do cDNA, demonstrou ter dois

domínios putativos de interação com ciclina, 15 sítios preditos de fosforilação (p ≥ 96%) e um

putativo sinal de localização nuclear, que foi confirmado pela localização da proteína de fusão

com GFP na região intercromática/corpos nucleares. O maior nível de transcritos ocorre nos

estágios bem jovens do desenvolvimento floral, em que o estigma/estilete está se diferenciando.

Plantas transgênicas de RNAi e superexpressão (OE) de N. tabacum resultaram, notoriamente, em

estigmas com áreas aumentadas e reduzidas, respectivamente. Cortes longitudinais do

estigma/estilete maduro demonstraram que essa alteração em tamanho é uma conseqüência da

alteração no número de células, que está aumentado nas plantas de RNAi e diminuído nas plantas

OE. Juntamente com a demonstração de que esta proteína interage com ciclinas do tipo A, in vitro

e in vivo, pôde-se concluir que esta proteína é um regulador negativo do ciclo celular, que

provavelmente regula a atividade de CDK de forma tecido-específica. Com base nestes

resultados, este gene foi denominado SCI1, a partir de “Stigma/style Cell-cycle Inhibitor 1”. SCI1

é distinto dos inibidores de CDK já descritos em plantas e animais, propondo-se assim que este

gene seja o primeiro membro de uma nova classe de inibidores de CDK, aqui definida com TICK

(“Tissue-specific Inhibitors of CDK). As diferenças na divisão celular causadas por SCI1

afetaram o momento da diferenciação das células papilares, mostrando que sua diferenciação é

acoplada às divisões celulares que ocorrem no estigma, consistente com um papel de SCI1 no

desencadeamento da diferenciação através do controle da proliferação celular. Baseado na

similaridade fenotípica entre as plantas de RNAi de N. tabacum e os pistilos de Arabidopsis

O

DePaoli,H.C 2010 

 

Resumo 

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tratados com um inibidor do transporte polar de auxina (NPA), decidiu-se analisar a expressão de

três genes relacionados à via de auxina, ARF8, Aux/IAA13 e Aux/IAA19, em quatro plantas

transgênicas independentes de RNAi e OE. Todos os três genes foram significativamente

alterados, em até 5,1 vezes para Aux/IAA19, mostrando que SCI1 influencia a regulação

transcricional de alguns genes de resposta rápida à auxina. A caracterização do mutante sci1, uma

linhagem de inserção de T-DNA em Arabidopsis, também revelou um tecido estigmático maior

devido a um aumento no número de células, como ocorre em plantas de RNAi de N. tabacum.

Surpreendentemente, os pistilos de sci1 são bem semelhantes aos do duplo mutante yuc2yuc6, que

perderam a habilidade de sintetisar auxina, de forma adequada, neste tecido. Cortes longitudinais

e imagens de contraste de fase (DIC) mostraram que a aumentada estrutura estigmática de

yuc2yuc6, assim também como a aumentada estrutura estigmática dos sinalizadores de auxina

pid336 e npy1, são todas conseqüências do aumento no número de células. Coerentemente, o gene

AtSCI1 tem sua expressão diminuída nos mutantes yuc2yuc6, pid336 e npy1. Testes de interação

genética mostraram que sci1, npy1 e sci1npy1 têm uma estrutura estigmática bastante semelhante

entre si, enquanto que sci1 mostrou uma interação sinergística com yuc2yuc6 e pid336. Esses

resultados consistentemente enquadram SCI1 na sinalização de auxina, que controla a divisão

celular na parte superior do pistilo. Em conjunto, os resultados mostraram que SCI1 é um novo

inibidor de CDK, que atua como componente da via de transdução de sinal de auxina no

estigma/estilete, para controlar a proliferação e diferenciação celular, representando um efetor

molecular deste hormônio no desenvolvimento do pistilo.

DePaoli,H.C 2010 

 

Abstract 

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DePaoli, H.C., 2010.

SCI1, A NOVEL TISSUE-SPECIFIC INHIBITOR OF CELL PROLIFERATION RELATED TO AUXIN SIGNALING

he success of plant reproduction depends on the appropriate development of the

reproductive organs that involve specific regulatory networks. We have undertaken

the characterization of apreviously unknown gene identified in a N. tabacum

stigma/style (S/S) subtracted cDNA library. This gene encodes a small lysine-rich protein which

was shown to be pistil-specific and, more precisely, transcribed in the reproductive specialized

tissues: stigmatic secretory zone - SSZ- and stylar transmitting tract - STT. The deduced protein

sequence has two putative cyclin interaction domains, 15 predicted phosphorylation sites (p≥96%)

and a putative nuclear localization signal, which was confirmed by localization of the GFP fusion

protein in the interchromatin/nuclear bodies. The highest transcript levels occur at the very early

stages of flower development, in which the S/S is differentiating. Transgenic RNAi and

overexpression (OE) N. tabacum plants resulted in stigmas with remarkably enlarged and reduced

areas, respectively. Longitudinal sections of the mature S/S clearly showed that this change in size

occurs as a consequence of the alteration in cell numbers, which is increased in RNAi plants and

decreased in OE plants. Together with the in vitro and in vivo interaction of this protein with A-

type cyclinsit was possible to conclude that this protein is a negative cell cycle regulator, that

probably regulates the CDK activity I a tissue specific manner. Based on these results, this gene

was named SCI1, from Stigma/style Cell-cycle Inhibitor 1. SCI1 is distinct from the plant and

animals CDK inhibitors already described, and so it is proposed that it is the first member of a

new class of CDK inhibitors, here defined as TICK (Tissue-specific Inhibitors of CDK).

Differences on cell division caused by SCI1 affected the differentiation timing of the papillar

cells, showing that its differentiation is coupled to stigmatic cell division, which is consistent with

a role for SCI1 in triggering cell differentiation through cell proliferation control. Based on the

phenotypic similarity between the N. tabacum RNAi plants and the Arabidopsis pistils treated

with an inhibitor of polar auxin transport (NPA), it has been decided to analyze the expression of

three auxin related genes, ARF8, Aux/IAA13 and Aux/IAA19, in four independent RNAi and OE

plants. All three genes were significantly altered, up to 5.1 fold for Aux/IAA19, showing that

SCI1 influences the transcriptional regulation of some early auxin responsive genes. The

T

DePaoli,H.C 2010 

 

Abstract 

‐ 6 ‐ 

characterization of the sci1 mutant, an Arabidopsis T-DNA insertion line, also revealed a bigger

stigmatic tissue due to an increased cell number, like the N. tabacum RNAi plants. Surprisingly,

the sci1 pistils are very similar to those of the yuc2yuc6 double mutants, which lack proper auxin

synthesis on this tissue. Longitudinal sections and DIC images showed the yuc2yuc6 enlarged

stigmatic tissue, as well as the enlarged stigmas of the auxin signalers pid336 and npy1 mutants,

are all consequences of the increased cell number. Coherently, the AtSCI1 gene is down-regulated

on yuc2yuc6, pid336 and npy1 mutants. Genetic interactions tests showed that sci1, npy1 and

sci1npy1 have very similar pistil structures, while sci1 showed synergistic interaction with

yuc2yuc6 and pid336. These results consistently enframe SCI1 in the auxin signaling that controls

cell division in the upper pistil. Taken together, the results showed that SCI1 is a new CDK

inhibitor, which acts as a component of the auxin signalling transduction pathway in S/S to

control cell proliferation/differentiation, representing a molecular effector of this hormone on

pistil development.

DePaoli,H.C. 2010 

  

Introdução 

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Introdução Geral

Henrique C. DePaoli 1,2 e Maria Helena S. Goldman 1

1 Departamento de Biologia, Faculdade de Filosofia, Ciências e Letras de Ribeirão Preto, Universidade de São Paulo, Brazil 14040-901 2 PPG Genética, Faculdade de Medicina de Ribeirão Preto, Universidade de São Paulo, Brazil; 14049-900

DePaoli,H.C. 2010 

  

Introdução 

‐ 9 ‐ 

As espécies Nicotiana tabacum e Arabidopsis thaliana. 

O termo angiosperma tem origem grega e vem da fusão de duas palavras: angeion, que

significa vaso, e sperma, que significa semente (Raven et al., 1996). As angiospermas são um

grupo de plantas com sementes distintas dos demais filos por terem um ciclo de vida

característico, e pela presença de flores e frutos. A maioria das plantas ao nosso redor é de

angiospermas, com uma grande variedade de espécies diferentes, que podem ser divididas em

monocotiledôneas (com apenas um cotilédone), eudicotiledôneas (dicotiledôneas – com dois

cotilédones) e as magnolideas (angiospermas basais com um ou mais cotilédones).

Dentre as famílias de eudicotiledôneas, encontram-se exemplares distintos, modelos de

estudo em genética de plantas, como Nicotiana tabacum e Arabidopsis thaliana. O modelo

vegetal Nicotiana tabacum, tem um genoma relativamente grande (de aproximadamente

4.500Mb), parcialmente sequenciado (NCBI ID: 13234), tem um ciclo de vida relativamente curto

(em média 6 meses de semente a semente), possui flores relativamente grandes e que permitem

auto-polinização, e cresce bem em climas tropicais. Em paralelo, o modelo vegetal Arabidopsis

thaliana, tem um genoma pequeno (125Mb), totalmente sequenciado e anotado (NCBI ID:9506),

a disponibilidade de um banco de mutantes de perda de função gênica (por inserção de T-DNA),

tem um ciclo de vida curto (em média 2 meses de semente a semente), possui flores bem

pequenas e que permitem a auto-polinização, e cresce bem em climas temperados. Essas

características fazem dessas plantas os dois principais modelos vegetais de estudo no mundo,

dependendo das vantagens e desvantagens associadas aos alvos de cada pesquisa.

A reprodução de plantas no modelo vegetal N. tabacum 

Em plantas, o desenvolvimento ocorre, em vários aspectos, após a embriogênese, com

diferentes órgãos/tecidos se diferenciando ao longo do seu ciclo de vida. Para tanto, existem

populações de células tronco, capazes de gerar outros tipos celulares, localizadas nos meristemas

da raiz e apical. No meristema apical, ocorre a diferenciação do meristema vegetativo em

meristema floral (detalhes no tópico “O desenvolvimento floral: enfoque no pistilo de N.

tabacum” abaixo) que originará a flor. Esta é responsável pela reprodução, transmitindo as

características da planta ao longo de um número ilimitado de gerações (Curtis, 1976).

As flores são compostas de órgãos estéreis e órgãos férteis. Há dois grupos de órgãos

estéreis, que são as sépalas e as pétalas (Curtis, 1976). O conjunto de sépalas é denominado cálice

e o conjunto de pétalas, corola (Esau, 1977). Os órgãos férteis são os estames e os pistilos. O

androceu é o conjunto de estames que, por sua vez, são constituídos pelo filete e pela antera,

responsável pela formação e disseminação dos gametófitos masculinos (grãos-de-pólen) (Esau,

1977; Figura 1). Os pistilos, órgãos reprodutivos femininos, são coletivamente chamados de

gineceu. Em N. tabacum o gineceu é formado a partir da fusão de dois carpelos, sendo

DePaoli,H.C. 2010 

  

Introdução 

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denominado pistilo, formado por estigma, estilete e ovário (Figura 2). O estigma, do tipo úmido, é

bilobado, sendo formado, em sua superfície, por uma epiderme com células papilares (Figura 2).

Logo abaixo da epiderme, observa-se uma zona secretória (SSZ) (Bell & Hicks, 1976) (Figura 2)

responsável pela produção do exudato, um secretado viscoso rico em açúcar, aminoácidos,

lipídeos e glicoproteínas (Labarca et al., 1970). Dando continuidade à zona secretória do estigma,

observa-se o tecido transmissor do estilete (STT), que conduzirá o tubo polínico, no processo de

fecundação, até o óvulo. Em torno do tecido transmissor, é encontrado um tecido parenquimatoso,

comumente denominado córtex (Figura 2). O córtex, tem a função de suporte (Raven et al., 1996).

Cada pistilo, em N. tabacum, possui um único feixe vascular localizado paralelamente ao tecido

transmissor no estilete.

O ovário, por sua vez, representa a porção mais densa das três partes do pistilo. Sua

epiderme não apresenta modificações especializadas como no estigma, e freqüentemente

apresenta estômatos (Mauseth, 1988). Algumas famílias apresentam uma hipoderme, além de um

considerável mesófilo, juntamente com o tecido vascular. Em N. tabacum, aproximadamente

2000 óvulos são produzidos pelo ovário (Huang & Russell, 1992), e se apresentam dispostos ao

longo de uma camada de células denominada placenta. Cada óvulo é unido à placenta por um

grupo limitado e estreito de células, denominado funículo, que determina a posição do óvulo em

relação à placenta. A partir do funículo, próximo à base do nucelo, duas camadas finas de células

se projetam acima deste, rodeando-o, denominadas integumento. Na extremidade dos

integumentos, uma pequena abertura é encontrada, denominada micrópila, por onde ocorre a

penetração do tubo polínico (Fahn, 1982). Uma célula do nucelo, usualmente uma das que estão

abaixo da camada de células mais externa, próxima à micrópila, se diferencia na célula mãe do

megásporo (Fahn, 1982). Esta passa por diferentes processos de crescimento, diferenciação e

divisão celular até atingir a maturação completa.

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Introdução 

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Figura 1 – Esquema do ciclo reprodutivo e da morfologia floral de uma angiosperma, discriminando as diferentes estruturas florais. (Modificado de www.portalsaofrancisco.com.br).

A reprodução nas angiospermas ocorre através de um ciclo do tipo haplodiplobionte, com

alternância de gerações. O primeiro processo que ocorre é a polinização, que se dá quando as

anteras se abrem e liberam o grão-de-pólen que, com a ajuda de diferentes vetores, como insetos,

mamíferos, pássaros, vento, água, entre outros, são depositados na superfície do estigma. Os grãos

de pólen, ao entrar em contato com a superfície do estigma, dão início às interações pólen-pistilo,

ou seja, uma série de processos que incluem o reconhecimento e a aceitação ou rejeição do grão

de pólen, feito pelos tecidos especializados do pistilo.

Com isso, o pistilo discrimina entre os diferentes tipos de grãos-de-pólen recebidos, e,

além disso, é o responsável por produzir o gametófito feminino no óvulo, tendo assim uma dupla

função (Cornish et al., 1988). Em geral, cruzamentos intergenéricos e interespecíficos não

ocorrem. Os mecanismos que impedem os grãos de pólen de efetuar a fertilização em pistilos de

gêneros ou espécies diferentes constituem a incongruidade (Linskens, 1983; 1986). Por outro

lado, os cruzamentos intraespecíficos geralmente são bem sucedidos, e têm a base molecular do

seu funcionamento representada por interações proteína-proteína, como, por exemplo, proteínas

ligantes a kinases de sinalização, ou recrutar moléculas mais simples como água, cálcio, lipídeos e

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Introdução 

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açúcares (Gaude & McCormick, 1999). Uma exceção a este sucesso acontece quando os genes do

sistema de auto-incompatibilidade impedem a fertilização (Takayama & Isogai, 2005). A auto-

incompatibilidade é um mecanismo de reconhecimento que resulta na rejeição, pelos tecidos

especializados do pistilo, de grãos-de-pólen que exibem a expressão dos mesmos genes do

sistema de auto-incompatibilidade da planta receptora (Takayama & Isogai, 2005). A

conseqüência mais direta da auto-incompatibilidade é que este mecanismo impede a auto-

fecundação, aumentando desta forma a variabilidade genética. A base molecular da auto-

incompatibilidade tem sido amplamente estudada (para revisão ver Kao & Tsukamoto, 2004). O

principal locus envolvido nesse mecanismo é o locus S que, no sistema gametofítico, codifica os

genes de S-RNase, suficientes para a rejeição do grão de pólen incompatível em algumas espécies

do gênero Nicotiana (Lee et al., 1994). Além disso, há outros fatores envolvidos no processo de

auto-incompatibilidade, que atuam em paralelo ao locus S (Mcclure et al., 2000). A ausência de

um ou mais elementos-chaves, dentre esses fatores, pode justificar a autocompatibilidade

encontrada em N. tabacum.

O grão de pólen que, em N. tabacum é binucleado, chega à superfície do estigma, se hidrata

e germina, formando assim o tubo polínico. Uma célula geradora (n) é a responsável por se

dividir, mitoticamente, e formar duas células espermáticas, responsáveis pela dupla fecundação do

óvulo. O estigma e o estilete sofrem algumas mudanças estruturais e fisiológicas necessárias para

a realização desses processos. Na maioria das angiospermas os estiletes são sólidos com uma ou

mais faixas de tecido transmissor se estendendo do estigma até o óvulo (Raven et al., 1996), onde

os tubos polínicos podem crescer entre as células do tecido transmissor ou dentro das paredes

espessas das células. Na planta do fumo, especificamente, o tubo polínico cresce através dos

espaços intercelulares da zona secretória do estigma e do tecido transmissor do estilete em direção

ao ovário, transportando os dois núcleos espermáticos até o saco embrionário (gametófito

feminino) (Bell & Hicks, 1976; Sanchez et al., 2004). Além disso, a nutrição e o crescimento

direcionado do tubo polínico até o ovário ocorrem sob influência de compostos presentes no

exudato (Cheung et al., 1993; Goldman et al., 1994; Cheung et al., 1995; Wolter-Arts et al.,

1998). O tubo polínico penetra no óvulo através da micrópila, uma abertura na extremidade deste

formada pela fresta na camada do tegumento externo do óvulo, e libera os núcleos espermáticos

no saco embrionário. Um núcleo espermático fecunda a oosfera, originando o zigoto 2n, enquanto

o outro se une aos núcleos polares, dando origem ao endosperma, que na maioria das vezes é 3n.

Após a dupla fertilização, os tegumentos do óvulo se desenvolvem no envoltório da semente, e as

paredes do ovário e estruturas associadas se desenvolvem no fruto.

Em resumo, a reprodução sexual de plantas depende de interações específicas entre os

grãos-de-pólen e o pistilo, sendo que este último, e principalmente os tecidos especializados do

estigma e estilete, têm um papel decisivo na determinação do genótipo dos futuros embriões e

plantas (Linskens, 1983).

DePaoli,H.C. 2010 

  

Introdução 

‐ 13 ‐ 

Figura 2 – Desenho da morfologia do pistilo de Nicotiana tabacum, discriminando as diferentes estruturas do estigma,

estilete e ovário (Adaptado de Kandasamy et al., 1990).

O transcriptoma no estigma e estilete 

O transcriptoma (o conjunto de transcritos de uma célula) é a base do controle de

diferentes processos dentro da célula, como a formação dos órgãos/tecidos e, na reprodução de

plantas, no controle das interações específicas entre os grãos-de-pólen e o pistilo.

Subseqüentemente, o transcriptoma dará origem ao proteoma (o conjunto de proteínas), que

representa o motor molecular do metabolismo celular. Com isso, desvendar e conhecer os

mecanismos moleculares envolvidos no desenvolvimento e no processo reprodutivo são a chave

para o melhor entendimento desses eventos nas plantas.

O modo predominante da regulação tecido específica é transcricional (Wickens et al.,

2000). Há uma série de outros mecanismos para a regulação nas vias de expressão gênica, como a

elongação da transcrição, estabilidade do RNA mensageiro (RNAm), “splicing” do pré-RNAm, a

poliadenilação, transporte do RNAm do núcleo para o citoplasma e controles traducionais. Porém,

pode-se considerar que o método “mais econômico” para a célula modular a expressão de um

gene é controlar a taxa de início da transcrição (Carey & Smale, 2000). Existem distintas

vantagens em se utilizar outros mecanismos para regular certas classes de genes, porém, se o

produto gênico não é necessário em um determinado tipo celular, então energia será economizada

se o gene não for transcrito. Esse processo se faz necessário principalmente pelo fato das células

serem idênticas quanto a sua seqüência de DNA, mas não necessariamente possuírem os mesmos

genes sendo transcritos. É neste contexto de expressão coordenada de genes que se desenvolve a

diferenciação celular.

DePaoli,H.C. 2010 

  

Introdução 

‐ 14 ‐ 

Feitas essas considerações, não é surpreendente que o início da transcrição seja o

principal modo de regulação da maioria dos genes (Carey & Smale, 2000) e, assim, analisar o

transcriptoma pode nos fornecer dados específicos, acerca das necessidades fisiológicas e

bioquímicas da célula, diretamente relacionados com a função exercida pelo tecido/órgão. Nesse

âmbito, vários genes vêm sendo caracterizados e, atualmente, são conhecidos muitos genes que se

expressam de forma específica ou predominante no pistilo, envolvidos no correto

desenvolvimento dos órgãos reprodutivos, a partir do meristema floral, e também no

funcionamento do pistilo, para exercer as atividades ncessárias durante a interação pólen-pistilo.

Uma excelente estratégia é a identificação e análise de genes em larga escala, a qual tem

se tornado uma ferramenta útil para obter uma visão global do processo de desenvolvimento e

preparação do pistilo para a fecundação, junto com sua interação e crescimento do tubo polínico.

Yoshida et al. (2005) utilizaram microarranjos de cDNA para realizar uma análise da expressão

gênica no pistilo de arroz durante a polinização, elongação do tubo polínico, fertilização e o início

da embriogênese. Os genes identificados foram agrupados de acordo com o padrão de expressão,

revelando vários genes que não haviam sido descritos como específicos de pistilo,

desempenhando um papel na patogenicidade, germinação do pólen, elongação do tubo polínico e

degradação de amido. Tung et al. (2005) foram mais adiante e utilizaram microarranjos

comerciais de Arabidopsis para comparar o padrão de expressão do estigma e estilete da planta

selvagem, com o estigma e estilete de uma planta transgênica, sem as células da epiderme do

estigma e do tecido transmissor do estilete. Além disso, compararam o padrão de expressão do

estigma e estilete com o perfil transcricional do ovário em plantas selvagens. Swanson et al.

(2005) utilizaram microarranjos de cDNA e biblioteca subtrativa para, em conjunto, analisar o

padrão de expressão no estigma de Arabidopsis. Dentre 24.000 genes analisados, foram

identificados 11.403 genes expressos no tecido estigmático. O preparo do estigma pôde ser

evidenciado por classes de genes envolvidos em modificação da parede celular e metabolismo de

lipídeos, assim como genes potencialmente envolvidos nas vias de interação pólen-pistilo. Em N.

tabacum, DePaoli (2006) e Quiapim et al. (2009) utilizaram diferentes estratégias para a análise

em larga escala para identificar genes expressos de forma específica/preferencial em

estigmas/estiletes durante o desenvolvimento e a preparação para os eventos da polinização. Foi

criado um banco de dados, TOBEST (TOBacco EST), com 11.216 etiquetas de seqüências

expressas (ESTs) organizadas em 6177 agrupamentos (“contigs”) distintos, onde 51,2% são

transcritos/genes do estigma/estilete de função desconhecida. Destes, 782 agrupamentos foram

analisados por macroarranjo, revelando 46 transcritos preferencialmente expressos no

estigma/estilete, dos quais 10 genes foram analisados por RT-PCR em tempo real, confirmando a

expressão pistilo-específica de 9 deles (Quiapim et al., 2009). Para complementar o banco de

dados TOBEST, DePaoli et al. (manuscrito em preparação) construíram duas bibliotecas

subtrativas de cDNAs de estigma/estilete para identificar transcritos preferencial/especificamente

DePaoli,H.C. 2010 

  

Introdução 

‐ 15 ‐ 

expressos nesses tecidos, quando comparados com raiz, caule, folha, sépala, pétala, anteras e

estigmas/estiletes de plantas STIG1::barnase (as quais não possuem a zona secretória do estigma;

Goldman et al., 1994). Foram isoladas 1101 ESTs, que agrupadas geraram 882 agrupamentos, dos

quais 585 (66,3%) não haviam sido identificados no TOBEST. Dessa forma, juntamente com

algumas análises de genes individualmente caracterizados na reprodução de plantas (para revisão

em Solanaceas ver DePaoli, 2006), a categorização dos genes identificados na análise em larga

escala pode nos dar uma visão de como os mecanismos intracelulares se coordenam em diferentes

vias para promover o desenvolvimento e o preparo do estigma/estilete para a polinização.

O desenvolvimento floral: enfoque no carpelo de N. tabacum 

O desenvolvimento dos órgãos reprodutivos em plantas é iniciado a partir do meristema

floral. Nos estágios iniciais, a ativação de alguns genes, que codificam fatores de transcrição,

determina a identidade de cada órgão floral. Portanto, estes genes são conhecidos como genes de

identidade floral. Ao longo dos anos, análises genéticas realizadas com mutantes para estes genes,

originaram o modelo ABC, que evolui recentemente para ABCE (Figura 3a-e). Este modelo

postula que quatro classes de genes, A (APETALA1, APETALA2), B (APETALA3,

PISTILLATA), C (AGAMOUS) e E (SEPALATA1, SEPALATA2, SEPALATA3,

SEPALATA4), trabalham de forma combinada em complexos protéicos entre eles (Figura 3

painel inferior), para determinar o órgão que se desenvolverá em cada um dos quatro verticilos

florais, os quais são sépalas (Figura 3a1), pétalas (Figura 3a2), estames (Figura 3a3) e pistilos

(Figura 3a4) (Krizek & Fletcher, 2005).

DePaoli,H.C. 2010 

  

Introdução 

‐ 16 ‐ 

Krizek and Fletcher, Nature Reviews Genetics (2005)

Figura 3 – O modelo ABCE proposto para a padronização dos órgãos florais (painel superior, a-e) com o modelo molecular de complexos proteícos que os formam (painel inferior). se/Sepals, sépalas; pe/Petals, pétalas; st/Stamens, estames; ca/Carpels, carpelos. (a) As flores de Arabidopsis thaliana (e também de N. tabacum) consistem de quarto verticilos florais. A identidade das sépalas (se) é conferida no primeiro verticilo pela atividade dos genes de classe A, a identidade das pétalas (pe) é conferida no segundo verticilo pela atividade de genes das classes A e B, a identidade dos estames (st) é conferida no terceiro verticilo pela atividade dos genes das classes B e C e a identidade dos carpelos (ca) é conferida no quarto verticilo pela atividade do gene da classe C. A atividade da classe E é necessária para a especificação de cada tipo de órgão. (b) Flor do mutante apetala 2 (ap2) que consiste em carpelos no primeiro e quarto verticilos e estames no segundo e terceiro verticilos. Esse mutante não tem atividade de genes da classe A, resultando em expressão da atividade de genes da classe C nos quatro verticilos. (c) Flor do mutante pistillata (pi) que consiste em sépalas no primeiro e segundo verticilos, e carpelos no terceiro e quarto verticilos. O mutante não tem atividade do gene da classe B. (d) Flor do mutante agamous (ag) que consiste de sépalas no primeiro verticilo, pétalas no segundo e terceiro verticilos, e repetição deste padrão nas camadas interiores, indefinidamente. O mutante não possui atividade do gene da classe C, resultando em expansão da atividade da classe A e perda da determinação floral. (e) Uma flor mutante para os quatro genes SEPALLATA (sep1 sep2 sep3 sep4) que consiste em verticilos reincidentes de estruturas semelhantes a folhas. O mutante quádruplo não possui a atividade dos genes da classe E, resultando em perda de função das classes A, B e C e perda da determinação floral. Painel inferior: Os tetrâmeros se formam através da interação proteína-proteína entre os dímeros de proteínas “MADS Box”. A proposta de composição dos tetrâmeros em cada um dos quatro verticilos é: AP1–AP1–SEP–SEP no verticilo 1 para especificar sépalas; AP1–SEP–AP3–PI no verticilo 2 para especificar pétalas; AG–SEP–AP3–PI no verticilo 3 para especificar estames; e AG–AG–SEP–SEP no verticilo 4 para especificar carpelos. AG, AGAMOUS; AP1, APETALA 1; AP3, APETALA 3; PI, PISTILLATA; SEP, SEPALLATA .

DePaoli,H.C. 2010 

  

Introdução 

‐ 17 ‐ 

Em especial, o gene AGAMOUS, além de determinar o quarto verticilo em carpelos, tem

duas outras funções fundamentais: determinar o final da diferenciação dos órgãos florais (o

carpelo é o último órgão a se diferenciar) e; ativar, juntamente com outros genes semelhantes ao

agamous (“agamous-like”), a expressão de genes da classe D, que determinam a identidade do

óvulo.

O ápice do meristema floral é constituído de três camadas de células germinativas

independentes, designadas L1, L2 e L3. O início dos primórdios do pistilo são determinados por

divisões celulares da camada mais interna, a camada L3, em vários planos (Satina, 1944). Este

momento foi definido como o estágio -7 do desenvolvimento floral (Figura 4; Koltunow et al.,

1990). Em N. tabacum, o pistilo é constituído pela fusão de dois carpelos, um conjunto de células

que crescem lado a lado, formando uma espécie de “cone”, que se funde no topo próximo ao

estágio -4 formando dois lóculos. Neste momento, começa a diferenciação do estigma/estilete a

partir da camada celular L1, que tem origem epidérmica (Satina, 1944). A camada L2 dará origem

ao córtex (tecido parenquimático) no estilete, e as células provenientes da camada L3 continuam

se desenvolvendo e vão originar, também, os feixes vasculares do estilete. Logo após a fusão dos

carpelos no estágio -3, as papilas estigmáticas começam a se diferenciar no estágio -2 e,

gradualmente, aumentam em número mas sem se desenvolver na extremidade externa dos lóbulos

(Wolters-Arts et al., 1996). Durante estes estágios bem jovens do desenvolvimento do pistilo, que

vai do -2 ao 2, os tecidos especializados do estigma/estilete (SSZ e STT) se expandem devido às

divisões celulares, com um indice mitótico 5 vezes maior nos estágios -2 e -1 que nos estágios 1 e

2 (Wolters-Arts et al., 1996), quando o pistilo já está totalmente diferenciado em estigma, estilete

e ovário (Koltunow et al., 1990). A partir daí, o índice mitótico, ou seja, a velocidade com que as

células se dividem, diminui até o estágio 6, quando as células não se dividem mais e somente a

elongação celular ocorre. No estágio 12, ocorre a antese e a flor de N. tabacum está madura e

pronta para fornecer e receber os grãos de pólen, culminando com a fertilização (Figura 4). Ao

final, é fato que a regulação dos mecanismos desenvolvimentais está associada com o controle da

proliferação/diferenciação e, portanto, envolvem a maquinaria de controle do ciclo celular.

DePaoli,H.C. 2010 

  

Introdução 

‐ 18 ‐ 

Figura 4 – Os estágios de desenvolvimento floral em N. tabacum (modificado de KOLTUNOW et al., 1990). O início

da formação dos verticilos florais se dá no estágio -7, diferenciando os órgãos florais até o estágio 1, onde a

diferenciação dos órgãos florais está completa (à excessão dos gametófitos masculino, grãos de pólen, e feminino,

ovócitos). O estigma/estilete se prepara, dos estágios 1 ao 11, para os eventos da polinização, que ocorrerá no estágio 12

(antese). Os tamanhos médios (mm) de cada botão, do estágio -7 ao 12, são, respectivamente, 0,75, 1,5, 3, 4, 5, 6, 7, 8,

11, 14, 16, 20, 22, 28, 39, 43, 45, 47 e 46.

A maquinaria da divisão celular em plantas 

É esperado que o controle do ciclo celular tenha uma função ímpar no crescimento e

desenvolvimento vegetal. Como em outros eucariotos, quinases dependentes de ciclina (CDK)

governam o ciclo celular em plantas. A chave do desenvolvimento vegetal, controlado pela

proliferação (controle do ciclo celular, quiescência e morte celular) e diferenciação celular, é

exatamente a atividade de CDK nos tecidos/órgãos em questão (De Veylder et al., 2007). Como o

próprio nome diz, para serem funcionais, as CDKs precisam se complexar com as ciclinas,

proteínas que determinam os “ciclos” da célula. Dessa forma, os diferentes complexos

ciclina/CDK irão fosforilar uma série de fatores ao longo das fases do ciclo celular, G1-S-G2-M

(iniciais de gap1, síntese, gap2 e mitose, respectivamente), promovendo a divisão celular (Figura

5) (Menges et al., 2005; Inzé & De Veylder, 2006). Embora o controle do ciclo celular em plantas

tenha os mesmos mecanismos fundamentais que outros eucariotos, elas desenvolveram novas

moléculas, orquestrando o controle do ciclo. Em Arabidopsis, pode-se citar 12 CDKs (CDKA a

CDKF), 15 CKLs (“CDK-like kinases”, CKL1 a CKL15), e, ao menos, 49 ciclinas diferentes

(ciclinas e “cyclin-like”), que irão determinar a especificidade da divisão celular

unidirecionalmente, e, muito provavelmente, permitir a flexibilidade do desenvolvimento pós-

embrionário observado nas plantas (Menges et al., 2005; De Veylder et al., 2007). Como as

DePaoli,H.C. 2010 

  

Introdução 

‐ 19 ‐ 

CDKs, as ciclinas também são classificadas em diferentes grupos. As ciclinas do tipo D (CYC-D),

desempenham um papel na transição G1-para-S, na etapa inicial do controle do ciclo celular; as

ciclinas do tipo A (CYC-A), têm um papel previsto durante a fase S e no ponto de controle de S-

para -M; e as ciclinas do tipo B (CYC-B) controlam a saída de G2 e entrada na fase M, além de

exercer funções na fase M (para uma revisão ver Inzé & De Veylder, 2006). Adicionalmente à

associação de CDKs com ciclinas, outros níveis de regulação da atividade de CDK são sua

própria fosforilação por quinases que ativam a atividade de CDKs (“CDKs-activating kinases”, as

clássicas e o gene WEE1) e a inibição da atividade de CDK por inibidores de CDK (CKI – “CDK

inhibitors”) (De Veylder et al., 2003; Dewitte & Murray, 2003; Inzé, 2005; Verkest et al., 2005).

Menges et al., Plant Journal (2005) Figura 5 – Visão combinada da regulação transcricional no controle do ciclo celular em Arabidopsis, descrito por MENGES et al. (2005). Várias alterações pós-traducionais também ocorrem e são tão importantes quanto à ativação transcricional. Em amarelo, estão as fases do ciclo celular (G0 e G1-S-G2-M). CDK, quinases dependentes de ciclina; CYC, ciclina; KRP, “Kip-related proteins”; Rb, “retinoblastome protein”; WEE1, uma “CDK-activating kinase”.

DePaoli,H.C. 2010 

  

Introdução 

‐ 20 ‐ 

As CKIs inibem diretamente a atividade de CDK por interagirem com o complexo

ciclina/CDK. Em mamíferos, duas famílias de CKIs foram identificadas: INK4 (Inhibitors of

CDK4/6) e Cip/Kip (CDK-interacting protein/CDK-inhibitor proteins). Os inibidores da família

INK4 (p16INK4A, p15INK4B, p18INK4C, p19INK4D) se ligam especificamente a CDK4 e CDK6,

complexos específicos da fase G1, e são caracterizados pela presença de uma sequência de

aminoácidos repetida de 4 a 5 vezes, denominada “ankyrin” (“ankyrin repeats”). Até hoje,

nenhum inibidor de planta semelhante à família INK4 foi identificado.

Os membros de Cip/Kip foram os primeiros a serem identificados em humanos (p21CIP1,

p27KIP1 e p57KIP2) e se ligam a uma variedade de complexos de CDKs, com uma preferência para

complexos das fases G1 e S. Todos os inibidores da família Kip/Cip têm um domínio amino-

terminal envolvido na ligação de CDKs e ciclinas (Pei & Xiong, 2005; Verkest et al., 2005).

Embora os membros da família INK4 tenham mostrado alguma regulação ao longo do

desenvolvimento (expressão em diferentes tecidos/órgãos/tipos celulares), os membros das duas

famílias, INK4 e Kip/Cip, são amplamente expressos e suas funções específicas propostas são

mais prováveis de serem relacionadas a modificações pós-traducionais que a uma expressão e/ou

alvo(s) tecido específicos. (Cánepa et al., 2007).

Em plantas, todas as CKIs que foram identificadas compartilham uma similaridade,

embora limitada, com o inibidor de mamíferos p27KIP1. Por esta razão, as CKIs de plantas foram

denominadas de KRPs (“Kip-related proteins”) (Verkest et al., 2005). Porém, Barroco et al.

(2006), também as definiu como ICKs (“interactors of CDC2 kinases”), existindo assim na

literatura dois nomes diferentes para se referir à mesma classe de proteínas (CKIs de plantas). Ao

contrário dos inibidores de mamíferos, os domínios conservados de ligação à ciclina/CDK nas

KRPs está localizado na porção carboxi-terminal da proteína (Figura 6). Em Arabidopsis, sete

KRPs (KRP1-7) foram identificadas através de ensaios de duplo híbrido e análises in silico (De

Veylder et al., 2001). Em N. tabacum, uma proteína semelhante às KRPs, denominada NtKIS1a,

foi isolada e mostrou ser capaz de reduzir a atividade de CDK in planta. Também foram

identificadas ICKs de plantas em tomate (LeKRP1, Bisbis et al., 2006), milho (Zeama;KRP1-2,

Coelho et al., 2005) e arroz (Oryza;KRP1, Barroco et al., 2006). Mais recentemente foi

identificada uma nova classe de ICK específica de plantas em Arabidopsis, SIM (SIAMESE e os

“siamese-related” SMR1-3). A família SIM/SMR tem 5 domínios curtos conservados e, embora o

domínio 4 (≈ 10aa) compartilhe uma alta similaridade com a região carboxi-terminal das

CKI/KRPs (Churchman et al., 2006), de uma forma geral, esta família não apresenta similaridade

com as CKIs já descritas. O produto do gene SIM suprime a mitose direcionando a célula para

endoreplicação, processo de duplicação do material genético sem o processo de divisão celular

(Churchman et al., 2006). Esta proteína é capaz de interagir com ciclinas do tipo D e CDKA, mas

não com as CDKB, específicas de plantas.

DePaoli,H.C. 2010 

  

Introdução 

‐ 21 ‐ 

Em plantas, a organogênese requer um aumento no número de células e, portanto, uma

ativação da maquinaria de ciclo celular. Ao mesmo tempo, as células precisam se diferenciar e,

portanto, sair do ciclo celular. Com isso, devido à necessidade de controlar esse equilíbrio entre

proliferação/diferenciação, a atividade de CDK acaba por ser modulada a nível pós-traducional,

como relatado acima, com sua ativação e inibição ocorrendo por diferentes classes de proteínas.

Dessa forma, não poderia ser diferente que as CKIs tivessem uma proposta de estar envolvidas

como integradoras dos sinais desenvolvimentais e o controle do ciclo celular (revisto em Verkest

et al., 2005). Embora alguns membros sejam mostrados como sendo ativados e/ou inibidos por

diferentes classes de hormônios (ex., KRP1 é induzida por ABA – “abscisic acid”, Wang et al.,

1998; e KRP2 é reprimida por auxina, Himanen et al., 2002), ainda são necessários maiores

estudos para preencher a ponte sinalizadora entre a maquinaria do ciclo celular e os fatores

exógenos de resposta ao ambiente e a hormônios que alteram o desenvolvimento vegetal. A tabela

1 relaciona alguns controladores do ciclo celular que, quando modificados, também provocam

alterações de desenvolvimento/organogênese em plantas.

Figura 6 – Estrutura dos membros da família KRP em Arabidopsis e um membro de N. tabacum, NtKIS1, descritos por JASINSKI et al. (2002). Os exons (caixas) e introns (linhas) de cada gene são indicados. As caixas pretas representam a região de homologia entre CKIs de plantas e de animais (Kip/Cip). A parte hachurada (juntamente com a caixa preta) representa a região de homologia entre as CKIs de plantas. (A) KRPs de Arabidopsis e N. tabacum com os respectivos nomes e números de acesso. (B) NtKIS1a, e sua variante de “splicing” do último exon NtKIS1b. NtKIS1b perde a habilidade de ligar ciclinas e CDKs in vitro, e inibe a capacidade de NtKIS1a de inibir a atividade de CDK in vitro.

DePaoli,H.C. 2010 

  

Introdução 

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Tabela 1 – Relação de alguns controladores do ciclo celular com as vias/fatores que os relacionam à organogênese/desenvolvimento em plantas.

GENE DESCRIÇÃO REFERÊNCIA

CDKA;1 Auxina induz a expressão de CDKA, mas sua atividade de quinase com subsequente entrada na mitose é dependente de citocina, via desfosforilação;

Superexpressão de AtCDKA não produz mudanças macroscópicas; a expressão de uma forma dominante negativa (semelhante à perda de função) inibe a divisão, mas não a morfogênese.

Zhang et al. (1996)

Hemerly et al. (1995).

CDKB1;1 Uma diminuição da atividade de CDKB1;1 prejudica o desenvolvimento de estômatos pelo bloqueio da divisão celular (neste caso a diferenciação é desvinculada da divisão celular)

Brassinosteróides induzem a expressão de CDKB1;1

Boudolf et al. (2004).

CDKE Perda de função em CDKE (mutantes HUA ENHANCER 3), tem especificação imprópria de órgãos florais e término da atividade de células tronco no meristema floral

Wang e Chen (2004).

CYCA2:2 Expressão de CYCA2;2 é induzida por auxina durante a iniciação e elongação de raiz lateral . Consistentemente, CYCA2 tem sido envolvida com ciclos mitóticos, mas não com endociclos ou diferenciação celular

Roudier et al. (2003)

CYCA3:2 Redução na expressão de CYCA3;2 produz embriões defeituosos e prejudica a formação de calo;

A superexpressão leva à redução do potencial de diferenciação celular e previne a regeneração da planta a partir de discos foliares.

Yu, et al. (2003).

CYCB1:2 A superexpressão de CYCB1;2 gera tricomas multicelulares Schnittger, et al. (2002). CYCD2 Superexpressão de CYCD2 aumenta a taxa de crescimento pela

diminuição do período que a célula fica em G1, em meristemas Cockcroft et al., (2000).

CYCD3 Superexpressão de CYCD3 parcialmente restaura o fenótipo causado pela superexpressão de KRP1/2;

O aumento no tamanho do órgão por superexpressão do gene aintegumenta (ANT; Mizukami and Fischer, 2000) ou o gene ARGOS (induzido por auxina, Hu et al., 2003) é resultado da proliferação celular que ocorre através do aumento na expressão de CYCD3;

A ativação transcricional de CYCD3 por citocinina é a evidência principal do envolvimento de citocinina na regulação de G1-S;

Superexpressão de CYCD induziu o crescimento independente de citocinina (em calos de Arabidopsis) e divisões celulares ectópicas, produzindo folhas com mais células, porém menores;

A expressão de CYCD3 é aumentada no tratamento com Brassinolídeo

DeVeylder et al. (2001); Wang et al. (2000); Zhou et al. (2003)

Soni et al. (1995)

Riou-Khamlichi, et al.

(1999); Dewitte, et al. (2003).

Goda et al. (2002) E2Fa/DPa Dentro da classe de ativadores transcricionais do grupo E2F/DP, o

dímero E2Fa/DPa induz a divisão celular quando superexpresso DeVeylder et al. (2002)

E2Fc/Dpb Atuam como repressores transcricionais no equilíbrio da proliferação celular e desenvolvimetno das células do periciclo;

del Pozo et al. (2006)

KRP1 Apresenta anomalias no desenvolvimento (folhas serrilhadas) Wang et al. (2000) KRP2 KRP2 parece regular o desenvolvimento inicial do ramo lateral da raiz

pelo bloqueio da transição de G1 para S; É regulado transcricionalmente por auxina.

Himanen et al., (2002)

DePaoli,H.C. 2010 

  

Introdução 

‐ 23 ‐ 

Uma visão da atuação da auxina no desenvolvimento do pistilo 

O primórdio do pistilo é um pequeno grupo de células capaz e comprometido a dividir e

diferenciar para gerar os tecidos do pistilo. Tal processo desenvolvimental inclui principalmente a

organogênese mediada por hormônio associada à divisão celular, crescimento e sinais de

diferenciação. Frequentemente, alteração no tamanho final do órgão é uma das conseqüências de

uma sinalização por fitohormônio modificada. Neste processo, o principal fitohormônio para o

crescimento vegetal é o ácido indol-acético (IAA), o hormônio auxina mais frequente nas plantas.

Auxina é um efetor da divisão e expansão celular bem conhecido (Leyser, 2002;

Vandenbussche and Van Der Straeten, 2004) e seu transporte polar adequado é essencial para a

iniciação do meristema floral (Okada et al., 1991), assim como também para o desenvolvimento

do pistilo e, mais diretamente, na diferenciação do estigma, estilete e tecido transmissor (Figura 7;

Nemhauser et al. 2000; Sundberg & Østergaard, 2009). O local da síntese, o nível da síntese e o

sentido do transporte do hormônio precisam ser finamente regulados para que o desenvolvimento

correto de cada órgão possa ocorrer. Nemhauser et al. (2000) propuseram um modelo no qual

altos níveis de auxina na região apical do pistilo promovem o desenvolvimento do estilete e do

estigma, enquanto níveis intermediários e baixos de auxina especificariam o ovário e o ginóforo,

respectivamente. Neste modelo, a síntese de auxina ocorreria preferencialmente no ápice e o

hormônio seria transportado do ápice para a base do órgão. De forma coerente com este modelo,

genes propostos como sendo reguladores da biossíntese de auxina (STYLISH [STY]/SHORT

INTERNODES [SHI], NGATHA [NGA]) e seus alvos (p.ex.: os genes de biossíntese de auxina

YUC2 (yucca), e YUC4) são todos expressos na extremidade apical do pistilo em

desenvolvimento (Cheng et al. 2006; Kuusk et al. 2006; Sohlberg et al. 2006; Alvarez et al. 2009;

Trigueros et al. 2009). Mais especificamente, o desenvolvimento do tecido transmissor também é

altamente dependente da atividade de genes relacionados à produção de auxina ou de resposta à

auxina, tais como os genes HECATE (HEC), SPATULA (SPT), STYLISH (STY)/SHORT

INTERNODES (SHI) e ETTIN (ETT)/AUXIN RESPONSE FACTOR (ARF3) (Heisler et al.

2001; Alvarez & Smyth 2002; Kuusk et al. 2006; Sohlberg et al. 2006; Gremski et al. 2007;

Crawford & Yanofsky, 2008).

Além dos genes envolvidos na síntese e/ou resposta de auxina, também podem ser citados

os produtos dos genes PINFORMED (PIN; Krecek et al., 2009), AUX1 (Pickett et al., 1990),

PINOID (PID; Bennett et al., 1995) e NPY (naked pins in yucca mutants; Cheng et al., 2007), que

atuam no transporte (Figura 7) e/ou transdução do sinal deste hormônio (Figura 8). Mais

especificamente, a proteína PINOID é uma quinase que regula a sinalização de auxina e tem um

papel fundamental no desenvolvimento floral, principalmente na formação do pistilo. Plantas de

Arabidopsis carregando diferentes mutações de perda de função no gene PID geram desde pistilos

alterados (fenótipo mais brando) até inflorescências em forma de pino, ou seja, sem verticilos

DePaoli,H.C. 2010 

  

Introdução 

‐ 24 ‐ 

florais (mutante pid; fenótipo mais severo) (Bennett et al., 1995; Christensen et al., 2000). Foi

isolado recentemente, um alelo parcialmente funcional no locus do gene PID, o PID336 (Genji et

al., comunicação pessoal). pid336 não apresenta grandes alterações fenotípicas por si só em

plantas de Arabidopsis, mas sim quando combinado com outro(s) mutante(s) relacionado à

síntese/sinalização de auxina nos tecidos em que o gene PID se expressa. Com isso, a variante

PID336 é uma ferramenta poderosa em experimentos de interação genética, para identificar genes

envolvidos na via de auxina, principalmente no pistilo, o primeiro órgão a apresentar alterações

fenotípicas nos mutantes pid (Bennett et al., 1995). De forma semelhante, mutantes para o gene

NPY1 (mutantes npy1) desenvolvem inflorescências semelhantes às apresentadas pelo mutante

pid somente quando no “background” do duplo mutante yuc1yuc4, um mutante deficiente na

síntese de auxina (Cheng et al., 2007). Adicionalmente, foi demonstrado que o produto do gene

NPY1 trabalha junto com a proteína quinase PID, colocando em uma mesma via genética os

genes de síntese de auxina da família YUC e os genes de sinalização de auxina PID e NPY1

(Cheng et al., 2007). Dessa forma, esta via parece ser fundamental para o correto

desenvolvimento de órgãos florais, especialmente o pistilo.

No que diz respeito à sinalização intracelular do hormônio, as famílias de fatores de

transcrição Aux/IAA (“Auxin/Indole-3-Acetic Acid”; Figura 8A) e ARF (“auxin response factor,

Figura 8A) representam reguladores chaves com funções bem caracterizadas nesta resposta à

auxina (Benjamins e Scheres, 2008). As proteínas Aux/IAA se dimerizam com proteínas ARFs,

que têm a habilidade de se ligar no elemento de resposta à auxina (AREs) em promotores, para

reprimir a transcrição gênica dependente de auxina. Quando a concentração de auxina intracelular

aumenta, as proteínas Aux/IAA são degradadas, desligando-se, portanto, das proteínas ARF.

Estas, por sua vez, podem então regular a transcrição gênica dependente de auxina (Figura 8B)

(Teale et al., 2006). Essa resposta ocorre de forma relativamente rápida e, em minutos, os genes

de resposta à auxina estão sendo modulados. Por serem membros de uma família gênica, aos

proteínas ARF e Aux/IAA (23 e 29 membros em Arabidopsis, respectivamente) (Paponov et al.,

2009) podem possuir uma certa sobreposição de funções (ex. ARF6 e ARF8; Nagpal et al., 2005).

Ao mesmo tempo, é interessante notar que mutantes de perda de função dos genes ARF3, ARF5 e

ARF7 geram fenótipos bem distintos (Berleth e Jürgens, 1993; Liscum e Briggs, 1995; Sessions e

Zambryski, 1995; Ruegger et al., 1997; Watahiki e Yamamoto, 1997), o que sugere também que

alguns deles controlam processos morfológicos e desenvolvimentais diferentes, com pouca

sobreposição funcional. Conforme citado para alguns genes descritos na Tabela 1, o hormônio

auxina pode influenciar alguns membros da maquinaria de controle do ciclo celular. Percebe-se,

assim, que a síntese, transporte e quantidade do hormônio são percebidas pela sinalização

intracelular, para molecularmente controlar a transcrição de diferentes genes, promovendo assim a

correta organogênese vegetal.

DePaoli,H.C. 2010 

  

Introdução 

‐ 25 ‐ 

Figura 7: Morfologia do pistilo (“gynoecium”) de Arabidopsis e a teoria do gradiente de auxina. O primórdio do pistilo se desenvolve como um cilindro aberto (A) que se fusiona na parte apical para formar o estilete e o estigma (B) e, internamente, para formar o septum (cinza) e a placenta com os óvulos (A, cinza). Foi sugerido que o padrão apical-basal depende de um gradiente de auxina (Nemhauser et al. 2000) e, de acordo com o modelo proposto (C), uma alta concentração de auxina na parte apical (amarelo) resulta na proliferação do estilete e do estigma, enquanto níveis intermediários de auxina são necessários para a formação do ovário e baixos níveis para a formação do ginóforo. Redução no transporte polar de auxina (PAT) resultaria no aprisionamento da auxina produzida apicalmente e em um gradiente de auxina mais abrupto (E), alterando as delimitações das estruturas do gineceu (F). Um modelo alternativo (D), proposto por Sundberg & Østergaard (2009), sugere que o ovário é formado em uma região de baixas concentrações de auxina (amarelo) e citocinina (laranja), enquanto que altas concentrações de auxina induzem estilete e estigma, e altas concentrações de citocinina, o ginóforo (retirado de Sundberg & Østergaard, 2009).

A  B  C D  E F 

DePaoli,H.C. 2010 

  

Introdução 

‐ 26 ‐ 

Figura 8 – Fatores e sinalização intracelular da via de auxina em células vegetais.

(A) Esquema representativo da família ARF e Aux/IAA de fatores de transcrição, com seus respectivos domínios (B-3 e

I-IV). O domínio B-3 é o domínio de ligação a AREs nos membros da família ARF. Os domínios III e IV são

conservados entre ARF e Aux/IAA e são os responsáveis por suas heterodimerizações. Os domínios I e II são

característicos da família Aux/IAA e estão envolvidos com a repressão da transcrição na heterodimerização com ARFs

e degradação da proteína, respectivamente. Os membros da família ARF possuem domínios ricos em determinados

aminoácidos na região entre B-3 e o domínio III. Essas diferenças é que caracterizam se um determinado membro da

família ARF atua como repressor (ex. Região rica em Serina – S) ou ativador (ex. Região rica em glutamina – Q) da

transcrição (Quint e Gray, 2006). (B) Há quatro etapas distintas na regulação da expressão gênica mediada por auxina

(1 a 4). Membros da familia ARF, se ligam a elementos de resposta à auxina (AREs), em promotores de genes de

resposta primária à auxina, e medeiam a transcrição destes (etapa 1). Aux/IAAs são proteínas de resposta rápida a

auxina, que dimerizam consigo mesmas e com membros da família ARF, e, como conseqüência, inibem a transcrição

de genes mediados por ARE (etapa 2). As proteínas Aux/IAAs são alvos de degradação mediada pelo proteasoma 26S,

e essa degradação é direcionada pela poliubiquitinação (Ub) das Aux/IAAs; uma reação que é catalisada pelo complexo

SCF, que possui a capacidade de ubiquitinar proteínas (“E3 ubiquitin ligase”) (etapa 3). A proteólise das Aux/IAAs

mediada pela sua ubiquitinação é estimulada pela ligação do hormônio auxina na proteína F-box TIR1, um componente

do “SCF E3 ligase“, que especificamente reconhece as proteínas a serem degradadas (etapa 4). IAA, “indole-3-acetic

acid”. (A) Paponov et al., 2009. (B) Teale et al., 2006.

DePaoli,H.C. 2010 

 

Objetivos 

‐ 28 ‐ 

Objetivos

Henrique C. DePaoli 1,2,3,4, Yunde Zhao3,4 e Maria Helena S. Goldman 1

1 Departamento de Biologia, Faculdade de Filosofia, Ciências e Letras de Ribeirão Preto, Universidade de São Paulo, Brazil 14040-901 2 PPG Genética, Faculdade de Medicina de Ribeirão Preto, Universidade de São Paulo, Brazil 14049-900 3 Department of Cell & Developmental Biology, University of California San Diego, La Jolla, CA/USA 92093 4 SALK Institute for Biological Studies, La Jolla, CA/USA 92037

DePaoli,H.C. 2010 

 

Objetivos 

‐ 29 ‐ 

OBJETIVOS 

Para entender o processo de desenvolvimento e os eventos relacionados à fecundação,

faz-se necessária a identificação e caracterização de genes expressos de forma preferencial e/ou

específica nos tecidos reprodutivos das plantas. Nesse contexto, esta tese teve como objetivo

iniciar a caracterização do clone HS1-002E06 (SCI1), identificado em uma biblioteca subtrativa

de cDNAs de estigmas/estiletes (DePaoli, 2006), explorando sua função no órgão reprodutor

feminino das plantas, utilizando dois modelos vegetais diferentes: Nicotiana tabacum e

Arabidopsis thaliana.

Os objetivos específicos foram:

I. Examinar a expressão do gene, referente ao clone HS1-002E06 (NtSCI1), nos

diferentes órgãos/tecidos da planta de N. tabacum, através das técnicas de RT-

PCR em tempo real e hibridização in situ;

II. Realizar experimentos de localização subcelular e de interação de proteínas

(BiFC) in planta, através da fusão de SCI1 com proteínas fluorescentes;

III. Identificar a função do gene através da análise dos fenótipos de plantas

transgênicas de N. tabacum que superexpressam o gene ou que tenham o gene

silenciando, pela técnica de RNA de interferência (RNAi);

IV. Caracterizar o homólogo de NtSCI1 em A. thaliana, AtSCI1 (At1g79200),

através da análise dos fenótipos de plantas que superexpressam o gene ou de

mutantes de inserção de T-DNA (perda de função) disponíveis para compra no

“Arabidopsis Biological Resource Center”;

V. Estudar a expressão de AtSCI1 em diferentes tecidos/órgãos de A. thaliana,

através dos dados de microarranjo disponíveis em banco de dados internacional e

da caracterização da sua região promotora, em fusão com os genes repórteres

GFP e GUS;

VI. Entender o envolvimento de SCI1 na sinalização de auxina, pela análise de

interação genética com mutantes de auxina (pid336, npy1 e yuc2yuc6), análise do

nível de expressão de SCI1 nestes mesmos mutantes e pela indução do promotor

sintético de resposta à auxina (DR5), em plantas mutantes de SCI1 (sci1).

DePaoli,H.C 2010 

 

Métodos  

‐ 31 ‐ 

Material e Métodos

DePaoli,H.C 2010 

 

Métodos  

‐ 32 ‐ 

Material Vegetal 

Nicotiana tabacum cv Petit Havana SR-1 e as plantas transgênicas foram crescidas sobre

condições padrão de casa de vegetação em Ribeirão Preto – SP, Brasil (Latitude - 21º 10'24" S,

Longitude - 47º 48'24" W, com média de temperatura de 22˚C no inverno e 27˚C no verão; a

diferença entre dia longos e curtos é de menos de duas horas). Amostras de raiz, caule, folha,

sépala, pétala, estame, estigma/estilete e ovário foram coletadas em nitrogênio líquido e estocadas

a -70˚C para a extração de RNA. Para os estudos de expressão no desenvolvimento floral,

estigmas/estiletes foram excisados de flores nos estágios -4 a 12 de flores de N. tabacum,

conforme descrito por Koltunow et al. (1990).

Sementes de Arabidopsis thaliana Col-0 e de cada um dos mutantes sci1-1, sci1-2, sci1-3,

sci1-4, sci1-5, yuc2yuc6, npy1 e pid336 e de plantas DR5:GUS, foram esterilizadas (5minutos em

etanol 75% e mais 5minutos em etanol absoluto), semeadas em meio MS (Murashige & Skoog,

1962) com 3% de sacarose e 0,7% de ágar, por uma semana, transplantadas para o solo e mantidas

em camara de crescimento (fotoperíodo de 16/8horas, luz/escuro respectivamente, a 24ºC). Foram

coletados meristemas florais e flores jovens, e armazenadas a -70˚C para a extração de RNA. Os

cruzamentos para obter duplos e triplos mutantes foram feitos polinizando flores jovens de

Arabidopsis emasculadas.

Sequenciamento, “primers” e análises computacionais 

Os clones HS1-002E06 de uma biblioteca subtrativa de cDNA de estigma/estilete de N.

tabacum (DePaoli 2006; DePaoli et al., manuscrito em preparação) e TOB068F10 do projeto

TOBEST foram completamente seqüenciados, utilizando a metodologia previamente descrita

(Quiapim et al., 2009). Uma vez que eram clones parciais, mas complementares, suas seqüências

foram usadas para definir “primers” para amplificar a seqüência codante completa de SCI1. O

fragmento NtSCI1-ORF foi amplificado diretamente de cDNAs de estigma/estilete (conforme

preparado para qRT-PCR, veja abaixo), utilizando os primers Ct11attB1FW

(5’gcaggcttcaccATGGGGAGCGATAAGAAGAC3’) e Ct11attB2RW

(5’aagctgggtcTTACTTTTTGATATTCCAAGCGTG3’), que contêm parte dos sítios de

recombinação (mostrados em letras minúsculas). As condições do PCR foram: 94ºC por 4 min; 35

ciclos de 94ºC, 50ºC e 72ºC por 1 min cada; e 72ºC por 10 min. Uma alíquota de 5µl do produto

deste PCR foi utilizada para uma segunda reação de PCR, nas mesmas condições (exceto pela

temperatura de pareamento, que nesta segunda reação foi de 45ºC), utilizando os primers BP1

(5’ggggacaagtttgtacaaaaaagcaggcttc3’) e BP2 (5’ggggaccactttgtacaagaaagctgggtc3’). Uma

alíquota de 10µl deste segundo produto de PCR foi utilizado para a recombinação no vetor de

entrada pDONR201 (Gateway, Invitrogen, USA) utilizando a “BP clonase” (Invitrogen, USA), de

acordo com as intruções do fabricante. Uma alíquota de 8µl (de um total de 20µl) da reação BP,

DePaoli,H.C 2010 

 

Métodos  

‐ 33 ‐ 

foi usada para transformar células DH5α de E. coli, químico-competentes (Sambrook and Russell,

2001).O clone resultante, denominado NtSCI1-ORF, foi completamente sequenciado.

De forma semelhante, a região codante completa de AtSCI1 (SCI1FL) foi amplificada

utilizando os primers AtSCI1OxFW (5’gcaggcttcATGGTAAGCGAACGGAGCTCCA3’) e

AtSCI1OxRW (5’aagctgggtcTCACCTACGCTTGATCATCCAGTC3’), e a região codante que

inclui os exons 1, 2 e 3 (AtSCI1123) utilizando os primers AtSCI1OxFW e AtSCI1123OxRW

(5’aagctgggtcTCATAGCTTGTGGTCGCTTTCCGTATG3’). Estes primers contêm parte dos

sítios de recombinação (mostrados em letras minúsculas). Em seguida, foi então realizada a

reação de PCR com os primers BP1/BP2. Igualmente, os primers AtSCI1PROM1FW (5’

gcaggcttcTACTTTGCTTGTAGTAAATACTTTTCTG3’) e AtSCI1PROM1RW

(5’aagctgggtcTATTTCCCGACGGACTAAAA3’) foram utilizados para amplificar a região

promotora de 287pb de AtSCI1, e os primers AtSCI1PROM1FW e AtSCI1PROM2RW (5’

aagctgggtcCTTCCATTGATAGCTCTGGAATT3’) para amplificar a sequência genômica de

1392pb de AtSCI1, ambos seguidos da reação de PCR com os primers BP1/BP2, gerando os

clones de entrada pENTRYAtSCI1PROM1 e pENTRYAtSCI1PROM2. A citosina em negrito e

sublinhada, no “primer” AtSCI1PROM2RW, foi inserida para manter a fase de leitura entre a

proteína SCI1 de fusão, incluída no promotor2, com a GFP-GUS do plasmídeo de destino,

baseado na seqüência disponível para o plasmídeo pKGWFS7 (Karimi et al., 2002). As reações de

PCR e BP foram realizadas conforme descrito acima para NtSCI1-ORF, e posteriormente

sequenciadas. Os mutantes de T-DNA foram genotipados por reações de PCR (5 minutos a 95ºC;

45 ciclos de 15segundos a 95ºC, 30segundos a 60ºC e 1minuto a 72ºC) em volume de 10µl,

utilizando os “primers” já descritos para yuc2, yuc6, npy1 e pid (Cheng et al., 2006; Cheng et al.,

2007), sendo que para pid336, após a amplificação, seguiu-se à digestão com a enzima RsaI, a

qual digere o alelo selvagem, mas não o mutante, por 4 horas a 37ºC (10µl de tampão 2x com

0,1U de enzima); e os “primers” Atsci1-1FW

5’GCAGTCTCTTGTCTTTGTAGACCAAATGCG3’ e Atsci1-1RW

5’ATTGATGGCATTTCTCGGGAATCGGAAGA3’ para sci1-1, Atsci1-2FW

5’CAGCAAAGAAGTCCAAGGATGATAAGCCG3’ e Atsci1-2 RW

5’AGCTCTGGAATTCCCTCTTTCTGGA3’ para sci1-2, Atsci1-3FW

5’ACAACGAGTTTGCTACATGGCTGAAAGA3’ e Atsci1-U-RW

5’AAACGGTCTATTTCTCCCTTAACCGGA3’ para sci1-3, sci1-4 e sci1-5. Os “primers”

localizados no T-DNA foram os “primers” universais JMLB1

(5’GCGTGGACCGCTTGCTGCAACT3’), para sci1-1, sci1-3, sci1-4 e sci1-5, e SAIL-LB1 (5′-

GCCTTTTCAGAAATGGATAAATAGCCTTGCTTCC-3′), para sci1-2. Os produtos de PCR de

cada mutante do locus At1g79200, dos alelos selvagem e mutante (sci1-x), foram sequenciados

(ETON BioSciences Company, La Jolla/CA-USA; http://www.etonbio.com) direto do produto de

PCR (250ng) para confirmar a posição de inserção do T-DNA.

DePaoli,H.C 2010 

 

Métodos  

‐ 34 ‐ 

As seqüências de nucleotídeos e aminoácidos foram analisadas por vários programas de

computador: “Translate” no “ExPASy Proteomics Tools” (www.expasy.org), BLAST no NCBI

(http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi) e SOL Genomics Network

(http://sgn.cornell.edu/solanaceae-project/), ClustalW

(http://www.ebi.ac.uk/Tools/clustalw2/index.html), MotifScan (http://myhits.isb-sib.ch/cgi-

bin/motif_scan), PSORT (http://psort.ims.u-tokyo.ac.jp/form.html), PredictNLS

(http://cubic.bioc.columbia.edu/predictNLS/), “ELM prediction” (http://elm.eu.org/), NetPhos e

NetPhosK (http://www.cbs.dtu.dk/services/), PAIL (http://bioinformatics.lcd-

ustc.org/pail/prediction.php), “Protein Molecular Weight” e “Isoelectric Point with

phosphorylation” (http://scansite.mit.edu/calc_mw_pi.html), T-Coffee (www.ebi.ac.uk/t-coffee/),

Multalign (http://www.expasy.org/tools/#align) e GPS (Group-based prediction system; Xue et

al., 2008; http://gps.biocuckoo.org/).

Manipulação de ácidos nucléicos e construções gênicas 

Todas as manipulações de ácidos nucléicos foram feitas conforme descrito em Sambrook

e Russell (2001). Para obter a construção 35Spro:SCI1-GFP, a seqüência codante de NtSCI1 foi

amplificada a partir do clone NtSCI1-ORF, utilizando os “primers” Ct11attB1FW e

Ct11attB2GFPRW (5’aagctgggtcCTTTTTGATATTCCAAGCGTG3’), que exclui o códon de

término da tradução da seqüência SCI1-ORF criando, coincidentemente, um sítio de restrição para

AvaII (negrito e sublinhado). O produto do PCR foi recombinado no vetor de entrada pDONR201

conforme descrito acima para NtSCI1-ORF. O clone resultante, pENTRY SCI1-ORFss (sem

“stop codon”) foi confirmado por digestão com AvaII e posterior sequenciamento. Depois, 300ng

do DNA positivo foi utilizado para a reação de recombinação LR, com o vetor de expressão

pK7FWG2 (Karimi et al., 2002) via LR clonase (Invitrogen, USA). A construção foi sequenciada

para confirmar que mutações indesejadas não ocorreram. Para se obter as construções de RNAi e

superexpressão, 300ng de DNA de NtSCI1-ORF original (com códon de término da tradução) foi

recombinado nos vetores de expressão pK7GWIWG2(I) e pK7WG2 (Karimi et al., 2002), para

gerar as construções SCI1Ri e SCI1OE, respectivamente. Essas reações de recombinação foram

realizadas utilizando a LR clonase (Invitrogen, USA), conforme as instruções do fabricante. De

forma semelhante, obteve-se a superexpressão de AtSCI1 (AtSCI1FL e AtSCI1123) recombinando

os respectivos clones de entrada, via LR clonase, no plasmídeo pK7WG2. A construção

35Spro:YFP-SCI1, com o gene AtSCI1 fusionado à YFP (proteína amarela fluorescente – “yellow

fluorescent protein”), foi obtida via LR clonase do pENTRY AtSCI1FL no vetor pK7WGY2,

conforme descrito acima. A construção SCI1PROM1:GFP-GUS e SCI1PROM2:GFP-GUS foi obtida

via LR clonase do clone pENTRYAtSCI1PROM1 e pENTRYAtSCI1PROM2 no vetor pKGWFS7.

DePaoli,H.C 2010 

 

Métodos  

‐ 35 ‐ 

Cada vetor de expressão de planta foi introduzido separadamente em Agrobacterium tumefaciens

C58C1RifR (pGV2260) por eletroporação.

As seqüências de NtCYCA1;1 e NtCYCA2;2, clonadas no vetor pDONR221 (Strini,

2010) foram reamplificadas utilizando os primers CYCA1.1FW

(5’agcaggcttcGAAGGAGATAGAACCATGGCGACGACYCAGAATAG3’) e CYCA1.1ssRV

(5’aagctgggtcGCAGCTTATGTTCTGGAAG3’), e CYCA2.2FW

(5’agcaggcttcGAAGGAGATAGAACCATGAGGCATGCAAATATAAAAC3’) e

CYCA2.2ssRV (5’aagctgggtcGAACAGTGATTGGACTGGTTTTG3’), respectivamente, para

retirar o códon de término da tradução. Os sítios de recombinação attB são mostrados em letras

minúsculas e os sítios de ligação ao ribossomo estão sublinhados. Os produtos desta primeira

PCR foram reamplificados (0,5µl) com os primers BP1 e BP2, e inseridos no vetor de entrada

pDONR201, conforme já descrito acima. Os clones foram sequenciados para confirmar a ausência

do códon de término da tradução. A seqüência NtCYCA2;296-398 (sem o “destruction-box”) foi

obtida por PCR a partir de NtCYCA2;21-398 (ORF completa), utilizando os primers

CYCA2.2DelFW (5’agcaggcttcGAAGGAGATAGAACCATGAATTGCATCAACGGAAG3’) e

CYCA2.2ssRV.

Para se obter NtSCI1 fusionado à “cabeça” da GFP (aminoácidos 1 a 149)

(35Spro:NtSCI1-hGFP), foi recombinado o pENTRY p35S - attL4/R1, o pENTRY hGFP -

attR2/L3 e o pENTRY SCI1-ORF (no caso L1/L2) sem o códon de término da tradução, no vetor

pK7m34GW via reação LR. Semelhantemente, para se obter NtCYCA1;1, NtCYCA2;21-398 (ORF

completa) e NtCYCA2;296-398 (sem o “destruction-box”) fusionados à tGFP (aminoácidos 150 a

238) (35Spro:NtCYCA-tGFP), recombinou-se o pENTRY p35S – attL4/R1, o pENTRY NtCYCA

– attL1/L2 apropriado, e o pENTRY tGFP - attR2/L3 no vetor pH7m34GW. Ambas as reações

foram realizadas utilizando 100ng de cada DNA e 2µl da LR clonase com tampão 5x. Neste caso,

a reação ocorreu por 16 horas a 25ºC, antes da adição de proteinase K (conforme as instruções do

fabricante). Em seguida, 1,5µl de cada reação LR foi utilizada para transformar E. coli DH10B

eletrocompetentes. Cada construção foi sequenciada a partir de 3 pontos diferentes para confirmar

que a recombinação ocorreu de forma correta e sem mutações indesejáveis. Os clones

selecionados foram separadamente introduzidos em Agrobacterium tumefaciens C58C1RifR

(pGV2260) por eletroporação.

Extração de RNA 

Para N. tabacum, o RNA total foi extraído a partir de uma quantidade grande de material

vegetal congelado, essencialmente conforme descrito por Dean et al. (1985). Para as análises das

plantas transgênicas de N. tabacum (SCI1Ri and SCI1OE) e comparações com as plantas selvagens,

quatro amostras de estigma/estilete no estágio 4 do desenvolvimento floral foram coletadas de

DePaoli,H.C 2010 

 

Métodos  

‐ 36 ‐ 

cada planta e o RNA total foi extraído utilizando o “Plant RNA purification Reagent” (Invitrogen,

USA). As amostras foram quantificadas por medições feitas a OD260 e OD280. Para avaliar a

integridade do RNA, este foi resolvido em gel de agarose 1,2% com 2,2M de formaldeído, corado

com brometo de etídio em solução (1µg/ml) e visualizado sobre luz U.V. A presença de rRNA

18S e 28S intactos foi utilizada como critério para a integridade do RNA. Em Arabidopsis, o

material congelado foi macerado e extraído utilizando o kit “RNeasy" com DNAse (Quiagen),

segundo instruções do fabricante, e quantificado.

RT‐PCR quantitativo (qRT‐PCR), “semi‐quantitativo” (RT‐PCR) e hibridização in situ 

Em N. tabacum, aproximadamente 20µg de RNA total, de cada um dos tecidos, obtidos

como descrito acima, ou os RNAs extraídos pelo “Plant RNA purification Reagent”, foram

tratados com 5U de DNAse (Promega), em 5µl de tampão da DNase 10x, 1 µl de DTT 100mM,

20U de RNase out e água DEPC 0,01%, em um volume final de 50 µl, e deixados por 1,5 horas a

37ºC. Em seguida, foi retirada uma alíquota de 2 µl que, por sua vez, foi diluída em 8 µl de água.

Destes 10 µl, foi utilizado 1 µl para uma reação de qRT-PCR (vide abaixo), utilizando os

“primers” da actina, para constatar que todo o DNA havia sido degradado. Uma vez livre de

DNA, o RNA foi limpo com fenol (Sambrook & Russell, 2001) e utilizado na síntese de cDNA,

na presença de 150pmol de oligo dT, que foi previamente colocado a 75ºC por 10min,

adicionando, logo após, 5 µl de tampão de primeira fita 5X, 1 µl de DTT 100mM, 20U de RNase

out, 1 µl de dNTPs (10mM de cada), deixando a 42ºC por 5min. Em seguida, adicionou-se 200U

de Superscript II (Invitrogen) e incubou-se a 42ºC por mais 1 hora, completando o volume para

70µl (ou 35µl para os RNAs provenientes da extração com “Plant RNA purification Reagent”)

após o término da reação, antes de armazenar a -20ºC. As reações padrão de qPCR foram

realizadas usando uma alíquota de 1µl do cDNA, 2 µl de cada “primer” específico (Tabela 1) a

1pmol e 5 µl do “Power SYBR Green PCR Master Mix” (Applied Biosystems, UK) em um

volume final de 10µl. Os PCRs foram realizados em placas de 96 poços utilizando o “ABI

Sequence Detection System 7500 Fast” (Applied Biosystems, UK). As condições da ciclagem

foram, um passo inicial a 50ºC por 2 minutos, seguidos de 10 minutos a 95°C; 40 ciclos, com cada

ciclo consistindo de 15 segundos a 95°C e 1 minuto a 60°C e uma curva de dissociação final, com

a temperatura gradualmente aumentando de 60ºC até 95ºC. A curva padrão foi construída para

cada gene usando uma diluição seriada para calcular o número log de cópias de transcritos

baseado nos valores de Ct conforme descrito por Semighini et al. (2002). Todas as análises foram

realizadas em triplicatas e pelo menos duas replicatas biológicas foram feitas para a quantificação

de plantas selvagens. Em todos os experimentos, controles negativos adequados, sem conter DNA

ou RNA, foram submetidos ao mesmo processo para excluir ou detectar qualquer contaminação

possível. O nível de expressão em unidades arbitrárias corresponde ao log de cópias calculado do

DePaoli,H.C 2010 

 

Métodos  

‐ 37 ‐ 

gene de interesse sobre o log de cópias calculado do controle interno da β-actina ou

poliubiquitina. Os “primers” utilizados para as reações de qRT-PCR estão na Tabela 1. As

análises estatísticas foram realizadas utilizando o programa “SigmaStat.v3.5”.

Tabela 1: “Primers” usados nas análises de expressão gênica por RT-PCR em tempo real. Gene Forward (5’- 3’) Reverse (5’- 3’)

β–actina agatgatgctccaagggctgtgtt ccatgccaaccatcacaccagt

Poliubiquitina tccgacacaatcgacaacgtaa gacgtactgttgtaatcggctagggtacgtc

SCI1 gccacaaacataaggataaatcg cagccacgtagcaaattcattgtt

NtARF8 ggcaggattgcagtgaaagctaca ggtctgattctcttcttcccaagg

NtAux/IAA13 gctcacaactacctctgaagatcgca acctcacgggtaacaaactggtca

NtAux/IAA19 gctgcgagctttaagcacattatcc ggacgagtggcctctcatataatc

As seqüências de “primers” foram determinadas com base na seqüência dos seguintes

“clusters” encontrados no TOBEST (Quiapim et al., 2009): β-actina (TOBC110E12),

poliubiquitina (TOBC018H09), NtARF8 (TOB044H02), NtAux/IAA13 (TOB100E10) e

NtAux/IAA19 (TOB056F02).

Para os experimentos com Arabidopsis thaliana, os RNAs extraídos (já livres de DNA),

foram convertidos (1µg de RNA total) em cDNA (conforme descrito acima). O volume foi

completado para 50µl e 1 µl de cada reação foi utilizada em uma diluição 1:2, 1:4, 1:8, 1:16, 1:32,

1:64, 1:128 e 1:256. As diluições de 1:8 a 1:256 foram submetidas à reação de PCR (1µl cDNA;

94ºC 3minutos; 27 ciclos de 94ºC por 15 segundos, 58ºC por 30 segundos e 72ºC por 30

segundos) utilizando os “primers” AtSCI1OxFW e AtSCI1OxRW (amplicom de 480pb) ou os

“primers” UbqFW 5’CTAGCTTGTGTGAGACCTAGCC3’ e UbqRW

5’GAGGCACATACTGTCTAGACAAAC3’ (amplicom de 232pb), correspondentes a AtSCI1 e

AtUBQ (At5g12120), respectivamente. Os produtos dos PCRs foram resolvidos em gel de

agarose 1,5%, com brometo de etídio (0,1µg/ml) e a intensidade das bandas de ambos os

amplicons foram medidas no aparelho “ImageQuant TL vs2005”. O valor gerado, para a banda

correspondente a AtSCI1, foi dividido pelo valor gerado para a banda correspondente a AtUBQ

em cada uma das plantas, incluindo a planta selvagem, para normalizar o valor de expressão entre

as amostras. Os valores normalizados de cada amostra desconhecida foram, então, divididos pelo

valor normalizado encontrado na planta selvagem (Col-0) e multiplicados por 100 (planta

selvagem = 100%). A diluição seriada escolhida para as análises foi a de 1:32, que apresentou

estar na fase exponencial da amplificação do PCR, em todas as amostras comparadas. Foram

realizadas 5 replicatas experimentais de uma única amostra biológica (que corresponde ao

material de várias plantas, de diferentes idades, crescidas em diferentes momentos, com material

coletado em diferentes períodos do dia).

DePaoli,H.C 2010 

 

Métodos  

‐ 38 ‐ 

Para os experimentos de hibridização in situ, estigmas/estiletes nos estágios 4, 7 e 10 do

desenvolvimento floral (Koltunow et al., 1990) foram fixados em glutaraldeído 4%, desidratados

em uma série de etanol-xilol, embebidos em parafina (TissuePrep2 - Fisher Scientific, USA),

seccionados em 8µm, hibridizados e revelados essencialmente como descrito em Jackson et al.

(1991). As sondas de ribonucleotídeos foram preparadas por transcrição in vitro utilizando o clone

HS1-002E06linearizado na extremidade 3’, sonda senso, ou 5’, sonda anti-senso. Para este

propósito, foi utilizado o Kit “DIG RNA Labeling Kit SP6/T7 (Roche, Germany) de acordo com

as instruções do fabricante e a mistura de detecção NBT/BCIP da Fisher “1-step NBT/BCIP

detection mixture” (Thermo Fisher Scientific, USA).

Importação dos dados de Microarranjo 

A análise de expressão gênica de AtSCI1 foi realizada importando-se os dados de

microarranjo disponíveis no “Bio-Array Resource” (http://bar.utoronto.ca/) para serem plotados

em um gráfico (Capítulo 2; Figura3). Dentro deste banco de dados, existe uma ferramenta

chamada “e-Northerns w. Expression Browser”. Ao clicar nesta ferramenta, na página principal,

se abre o “Expression Browser”, onde se pode selecionar: 1) o banco de dados de interesse; 2)

Restringir entre diferentes áreas de pesquisa (opcional) e; 3) especificar o tipo de dados de saída

(crua ou normalizada). Então, se digita o(s) locus de interesse (em nosso caso At1g79200) e

submete. No nosso caso, o banco de dados selecionado foi “AtGenExpress_Plus – Extended

Tissue Series”, restringindo os dados a serem analisados na área de pesquisa “Developmental

Baseline”. Ao submeter a busca, se abre uma janela com os arquivos de saída. Foi selecionado o

arquivo “View Graphical Representation of Clustered Data (Recommended)”, que contém os

dados de expressão já normalizados e agrupados. Ao clicar no arquivo, se abre uma nova janela

com a interface dos resultados. Para se extrair os valores que geraram a interface, clicou-se em

“get details” e, em seguida, nos links do tecido desejado (ex. Root, Flower Stage 9), que

direcionam para os dados das lâminas de arranjo, em triplicata, no “NASCArrays”. Clicou-se,

finalmente, em “Get the data!” para salvar cada uma das 3 planilhas excel (replicatas) que contêm

os valores de expressão já normalizados para todos os locus, copiando apenas o valor do locus de

interesse (At1g79200).

Transformação de Plantas 

Sementes de N. tabacum cv Petit Havana SR1 foram esterilizadas e plaqueadas em placas

de Petri com meio MS (Murashige and Skoog, 1962) suplementado com 3% de sacarose, 0.5 g/l

MES, pH 5.8 e 0,7% agar (Bacto Agar). As plântulas foram crescidas em câmaras de germinação

a 27ºC (±1ºC) com fotoperíodo de 16h/8h. Para os ensaios de expressão transiente, as plantas (6

semanas de idade) foram transferidas para o solo e suas folhas foram infiltradas com uma cultura

DePaoli,H.C 2010 

 

Métodos  

‐ 39 ‐ 

de Agrobacterium contendo as construções apropriadas, conforme descrito por Sawers et al.

(2006), e foram analisadas de 2 a 5 dias após a infiltração.

Para as plantas transgênicas estáveis, discos foliares de N. tabacum foram co-cultivados

com o clone de Agrobacterium contendo as construções adequadas, de acordo com protocolo

descrito previamente (Brasileiro & Carneiro, 1998). As plantas transgênicas foram regeneradas

em meio contendo canamicina (200µg/ml) durante o processo inteiro de cultura in vitro e

transferidas para a casa de vegetação em solo (mistura de vermiculite). Para garantir que as

condições ambientais não estavam influenciando o fenótipo de nossas plantas, transferiu-se

algumas plantas durante o inverno/primavera (por exemplo, SCI1Ri4.4.1 e SCI1Ri13.2) e outras

durante o verão/outono (por exemplo, SCI1Ri14.2 e SCI1Ri16.1). Depois de 2 semanas, as plantas

foram transferidas para o solo onde cresceram até o florescimento e formação de frutos. Essas

plantas representam a primeira geração de transgênicos (T0), que foi analisada nos experimentos

de qRT-PCR e microscopia ótica. A geração seguinte (T1) foi produzida por polinização

controlada e as sementes foram esterilizadas, plaqueadas em meio MS com canamicina

(200µg/ml), e as plântulas resistentes foram transferidas para o solo, sendoa primeira florada

usada para as análises de microscopia eletrônica de varredura (MEV).

Para a transformação de plantas de Arabidopsis, plantas selvagens e mutantes (teste de

complementação) foram crescidas por 4 semanas e borrifadas (2 vezes em um período de 7 dias)

com uma solução de Agrobacterium carregando a construção de interesse. A solução de

Agrobacterium borrifada foi preparada crescendo-se, por 48 horas, 100ml de cultura da bactéria

em meio LB líquido com marcador de seleção, precipitada e ressuspendida em meio MS

(Murashige & Skoog, 1962) líquido, com 5% de sacarose e 0,032% de Silwet L77 (pode ser

utilizado tween 20). As sementes destas plantas foram coletadas após 3 e 4 semanas, esterilizadas

(5min. EtOH70% e 5min. EtOH100%) e semeadas em meio MS sólido com agente seletivo

(Kanamicina, 25µg/ml). Os transformantes (plântulas que apresentaram folhas bem verdes e bom

desenvolvimento radicular) foram transferidas para o solo após 10 dias, confirmadas quanto à

inserção do transgene por PCR de folha (vide genotipagem abaixo) e tiveram seus fenótipos

analisados. A análise das plantas foi feita pela observação de alterações no fenótipo,

acompanhada de experimentos moleculares complementares.

Testes de interação genética em Arabidopsis 

O mutante de perda parcial de função (“knockdown”) sci1-1 foi utilizado para as análises

de interação genética com mutantes da via de auxina. Os mutantes homozigotos da via de auxina,

pid336, npy1 e o duplo mutante yuc2yuc6 foram cultivados conforme descrito acima para plantas

selvagens de Arabidopsis. Flores maduras do mutante sci1-1 homozigoto foram dissecadas e as

anteras maduras (abertas e com os grãos de pólen expostos) foram utilizadas para polinizar

DePaoli,H.C 2010 

 

Métodos  

‐ 40 ‐ 

pistilos de flores emasculadas de cada um dos 3 mutantes da via de auxina. As sementes foram

coletadas após 3 semanas, secas “overnight” em sílica, esterilizadas e semeadas. A geração

seguinte (F1, totalmente heterozigota) foi autopolinizada para se obter, então, a segunda geração

(F2). Nesta geração, foi feita a identificação dos duplos e triplos mutantes, por reação de PCR,

utilizando os “primers” alelo específicos citados acima a partir de DNA genômico extraído de

folhas (macerado em 125mM NaCl, 100mM TrisHCl pH7,5, 12,5mM EDTA, 0,25% SDS e 50%

isopropanol, centrifugado a 12000rpm por 10min e resuspendido em 150-200µl de água;

1µl/reação). A análise dos mutantes foi feita pela observação de alterações no fenótipo,

comparando os duplos/triplos mutantes com os mutantes simples, e acompanhados de

experimentos moleculares e/ou bioquímicos complementares. Foram realizados testes de

complementação (restaurar SCI1 selvagem nos mutantes de T-DNA), para garantir que as

alterações observadas foram causadas pela perda de função no locus At1g79200.

Experimentos de Microscopia 

Para a análise de localização subcelular de SCI1-GFP, folhas de N. tabacum de 6 semanas

de idade foram infiltradas como descrito em Sawers et al. (2006), cortadas em pequenos pedaços,

fixados em formaldeído 3,7%, 50mM NaH2PO4 e 0,2% Triton X-100 por 30minutos, corados com

4,6'-diamidino-2-phenylindole (DAPI) por 15 minutos (1.25µg/ml em PBS) no escuro, lavados

em PBS e montados em água logo antes da análise. Para os experimetnos de complementação de

fluorescência “Biomolecular Fluorescence Complementation” (BiFC), as folhas foram infiltradas

conforme supra citado e infiltradas com uma combinação de duas construções diferentes: NtSCI1-

hGFP e, NtCYCA1;1 ou NtCYCA2;21-398 ou NtCYCA2;296-398. As fluorescências da GFP e do

DAPI foram obtidas no microcópio confocal a laser “Leica TCS SP2” (Leica Microsystems). As

fatias individuais dos diferentes canais (GFP, DAPI e cloroplasto) foram montadas com Adobe

Photoshop CS (Adobe Systems, San Jose, CA). Pelo menos três análises adicionais sem fixar o

material foram realizadas para confirmar que a autofluorescência do formaldeído não estava

interferindo nos resultados. As imagens mostradas para os experimentos de BiFC representam

uma série de fatias montadas. Pelo menos três repetições biológicas foram realizadas para este

experimento.

Para as análises de microscopia ótica, estigmas/estiletes e anteras de N. tabacum e pistilos

de Arabidopsis foram dissecados de botões florais nos estágios do desenvolvimento floral citados,

fixados e embebidos em parafina conforme descrito para os experimentos de hibridização in situ.

O material embebido foi cortado em seções de 8µm, montado em slides, desparafinizado e corado

com 0,05% de azul de toluidina em tampão fosfato pH4.4 (O'Brien et al., 1964). As fotos foram

tiradas utilizando o microscópio Leica DM4500B equipado com a câmera Leica DFC320. As

DePaoli,H.C 2010 

 

Métodos  

‐ 41 ‐ 

análises dos tecidos foram feitas usando o programa “Leica Q-Win Plus v3.4.0” (Switzerland) e

as análises estatísticas foram realizadas utilizando o programa “SigmaStat.v3.5”.

Para a microscopia eletrônica de varredura (MEV), botões florais e flores maduras de

plantas selvagens de N. tabacum (estágios -4 a 1), Arabidopsis (Col-0), transgênicas de N.

tabacum (estágios -4 a 1) e de cada mutante de T-DNA de Arabidopsis analisado, foram coletados

em FAA (formaldeído, ácido acético e etanol 50%, 1:1:18), submetidos a 3 etapas de vácuo de 15

minutos cada, mantidos no fixador por 24horas, desidratados em uma série de etanol (50, 60, 70,

80, 90, 100, 100 e 100%), submetidas à secagem por ponto crítico e cobertas com 30nm de ouro

para serem levadas ao microscópio eletrônico. Para as plantas de N. tabacum, durante a coleta dos

botões florais, uma única antera foi separada do botão floral e submetida à análise por

microscopia ótica (para confirmação dos estágios de desenvolvimento). Foram analisadas pelo

menos duas replicatas biológicas de cada estágio pra cada planta (selvagem e transgênicas) em N.

tabacum, e pelo menos cinco replicatas biológicas de cada mutante, transgene ou planta selvagem

em Arabidopsis.

Para as análises em contraste de fase (DIC), o material vegetal foi fixado em etanol 100%

e ácido acético (3:1) por 2 horas e substituído pela solução de clareamento (100g de tri-cloro-

acetaldeído monohidratado (“Chloral hydrate”), 5ml de glicerol 100%, 60ml de água e 7,5g de

goma arábica) “overnight”. O material foi observado no microscópio de Normasky (descrever

modelo e marca!).

Coloração com GUS 

Os tecidos a serem submetidos à coloração com GUS foram coletados em acetona 90%

gelada, deixados por no mínimo 25 minutos no gelo e lavados com tampão de coloração (0.2%

Triton X-100, 50mM NaPO4, 2mM Ferrocianato de Potássio, 2mM Ferricianato de Potássio). Foi,

então, adicionado tampão de coloração com X-Gluc (2mM), gelado, e o material foi infiltrado em

vácuo por três etapas de 10 minutos, até que os tecidos afundassem e a solução parasse de

borbulhar. Em seguida, as amostras foram incubadas a 37ºC overnight. Para parar a reação e

conservar o material para fotografar, foram, então, feitas lavagens com etanol 20%, 35%, FAA

(etanol 50%, 5% Formaldeído e 10% ácido acético), etanol 70% e 100% duas vezes, por 30

minutos cada.

Números de acesso de seqüências utilizadas 

As seqüências de cDNA de SCI1-ORF, HS1-002E06, TOB068F10, NtARF8, NtIAA13 e

NtIAA19 foram depositadas no GenBank sobre os números de acesso GQ272329, GQ272330,

GQ272331, GQ272332, GQ272334, GQ272333. As seqüências mencionadas nesta tese podem

ser achadas nas bibliotecas do GenBank/EMBL sobre os números de acesso: X92966 -

DePaoli,H.C 2010 

 

Métodos  

‐ 42 ‐ 

NtCYCA1;1; D50736 - NtCYCA2;2; AC212309 – SlSCI1 de tomate; AC233353 – StSCI1 de

batata; AM424297, clone VV78X084703.3 – VvSCI1 de uva; AK252156, clone FLbaf149e13 –

HvSCI1 de trigo; NM_001052562 (Os02g0170200) – OsSCI1 de arroz; EU958997, clone 208741

– ZmSCI1 de milho; NM_106571 (At1g79200) – AtSCI1 de Arabidopsis; CAB85553 - SIM

(At5g04470); BAC42937 - SMR1 (At3g10525); AAF18255 - SMR2 (At1g08180); CAB85979 -

SMR3 (At5g02420); CAD56868 – N. tabacum NtaKIS2; CAC82732 – N. sylvestris NsKIS1;

CAC82731 – N. tomentosiformis NtKIS1a; CAC82734 – N. tomentosiformis NtKIS1b;

NP_179924 – A. thaliana AtKRP1; NP_190632 – A. thaliana AtKRP2.

Mutantes de T‐DNA de Arabidopsis analisados 

Locus At1g79200: SALK_005710.29.99 (sci1-1), SAIL_31_D10.v1 (sci1-2),

SALK_137501.54.50.x (sci1-3), SALK_142445.50.60.x (sci1-4) e SALK_083219.53.50.x (sci1-

5).

DePaoli,H.C. 2010 

 

Cap

ítulo 1 – SCI1, Stigma/style Cell‐cycle Inhibitor 1 

‐ 44 ‐ 

- Capítulo 1 -

Um novo gene de estigma/estilete de Nicotiana tabacum, SCI1, que codifica uma

proteína rica em lisina e controla a divisão e diferenciação celular

durante o desenvolvimento

Henrique C. DePaoli 1,2 , Michael S. Brito 1,2 , Andréa C. Quiapim 1 ,Simone P. Teixeira 3, Gustavo H. Goldman 3,4 , Marcelo C. Dornelas 5 e Maria Helena S. Goldman 1

1 Departamento de Biologia, Faculdade de Filosofia, Ciências e Letras de Ribeirão Preto, Universidade de São Paulo, Brazil 14040-901 2 PPG Genética, Faculdade de Medicina de Ribeirão Preto, Universidade de São Paulo, Brazil; 14049-900 3 Departamento de Ciências Farmacêuticas, Faculdade de Ciências Farmacêuticas de Ribeirão Preto, Universidade de São Paulo, Brazil; 14040-903 4 Laboratório Nacional de Ciência e Tecnologia do Bioetanol (CTBE), Brazil 5 Departamento de Biologia Vegetal, Instituto de Biologia, Universidade de Campinas, Brazil; 13083-970

DePaoli,H.C. 2010 

 

Cap

ítulo 1 – SCI1, Stigma/style Cell‐cycle Inhibitor 1 

‐ 45 ‐ 

RESULTADOS 

Identificação do gene SCI1 e análise de sua localização subcelular 

Foram construídas recentemente duas bibliotecas de cDNA de hibridização subtrativa

suprimida (SSH), que permitiram a identificação de vários genes especificamente ou

preferencialmente expressos no pistilo de Nicotiana tabacum (DePaoli et al., manuscrito em

preparação). Entre eles, optamos por um clone, TOBSH1-002E06, para posterior análise e

caracterização. Como este era um clone de cDNA parcial (Figura 1A), que representa a

extremidade 5' do transcrito, foi realizada uma pesquisa por BLASTn no banco de dados

TOBEST (Quiapim et al., 2009) e encontrou-se dois clones muito semelhantes com sobreposição

ao clone TOBSH1-002E06: TOB048C05 e TOB068F10. O clone TOB068F10 foi completamente

seqüenciado e demonstrou conter, além da região codificadora, uma 3’UTR e uma cauda polyA.

O alinhamento do HS1-002E06e o clone TOB068F10 pode ser visto na Figura 1.

É interessante notar que ele tem um 3'UTR excepcionalmente longo (395 pb), que pode

ser importante para regulação do transcrito, por exemplo, para influenciar a sua estabilidade. O

gene correspondente foi designado SCI1 (inibidor do ciclo celular estigma-1) com base nos

resultados mostrados abaixo.

A busca por homologia em banco de dados internacional, utilizando a seqüência de SCI1,

via TBLASTX (Altschul et al., 1997), mostrou que a proteína codificada é semelhante às

proteínas de função desconhecida presentes em diversos organismos vegetais. As seqüências com

a maior similaridade com o produto do gene SCI1 são de batata (AC233353), tomate

(AC212309), cevada (AK252156), milho (EU958997), arroz (NM_001052562) e uva

(AM424297). A suposta seqüência homóloga no genoma de Arabidopsis é At1g79200

(NM_106571), que compartilha a identidade de 65% e 86% de similaridade com SCI1. O

alinhamento dessas proteínas (Figura 2) permitiu o reconhecimento de 3 domínios: I) uma

pequena sequência conservada no N-terminal; II) um domínio intermediário rico em lisina com

baixa conservação de seqüências e; III) domínio altamente conservado no C- terminal.

Para descobrir mais informações sobre essa seqüência de proteína putativa e orientar

nossos experimentos futuros, foi feita uma detalhada análise in silico utilizando a sequência

completa de 154 aminoácidos de SCI1. Através da combinação de vários pacotes de software de

análise de seqüência (ver Métodos), identificamos um domínio N-terminal rico em lisina (LRD)

(MotifScan, Evalue = 6,5 E-07), com resíduos de lisina previstos para serem Nε-acetilados, um

sinal de localização nuclear - NLS (PSORT, 0,992 afirmativa; PredictNLS), dois domínios de

interação com ciclina (previsão ELM) e um total previsto de 15 sítios de fosforilação (NetPhos, ≥

96%) (Figura 1B). Os domínios de interação com ciclina identificados, consenso [RK]. L. (0,1)

[FYLIVMP], estão presentes em uma ampla gama de proteínas que interagem com ciclinas e/ou

DePaoli,H.C. 2010 

 

Cap

ítulo 1 – SCI1, Stigma/style Cell‐cycle Inhibitor 1 

‐ 46 ‐ 

CDKs (Takeda et al., 2001). Além disso, encontrou-se sítios de fosforilação alvos de diferentes

moléculas sinalizadoras (caseína quinase 1 - CK1; CK2 cinase 2 - caseína e MAPKs), todos os

três presentes em SCI1 (NetPhosK; previsão ELM: 23aa posições 17, 54 60aa, 109 115aa, 112

118aa para CK1 , as posições 4 10aa, 44 50aa, 53 59aa para CK2 e posições 4 10aa, 15 e 18-21aa-

24aa para MAPK).

DePaoli,H.C. 2010 

 

Cap

ítulo 1 – SCI1, Stigma/style Cell‐cycle Inhibitor 1 

‐ 47 ‐ 

HS1-002E06 1 TCAGAGGTGC GAGTAAATGG GGAGCGATAA GAAGACGACG GAGGAGAAGA SCI1-ORF 1 ---------- ------ATGG GGAGCGATAA GAAGACGCCG GAGGAGAAGA TOB068F10 ---------- ---------- ---------- ---------- ---------- HS1-002E06 51 GGAAGCATAA GAGAAATTCG CCTTCTTCTC CACGAGATGA AGTGAAAAGC SCI1-ORF 35 GGAAGCATAA GAGAAGTTCG CCTTCTTCTC CACGAGATGA AGTGAAAAGC TOB068F10 ---------- ---------- ---------- ---------- ---------- HS1-002E06 101 AAACGCCAGA ATATCAAAGG GGATGAAGAG CGAAGGAAAG AAAAG---GA SCI1-ORF 85 AAACGCCAGA ATATCAAAGG GGATGAAGAG CGAAGGAAAG AAAAGAAGGA TOB068F10 ---------- ---------- ---------- ---------- ---------- HS1-002E06 148 CAAATCCAAG AAGGAGAAGC ACAAATCCCA TAAATCCAAA TGTCATTCTA SCI1-ORF 135 CAAATCCAAG AAGGAGAAGC ACAAATCCCA T--------- ------TCTA TOB068F10 ---------- ---------- ---------- ---------- ---------- HS1-002E06 198 GTGAAGAGAA GAAGTCAGGG GAAAAGCACA AAACCAAGAG CCACAAACAT SCI1-ORF 170 GTGAAGAGAA GAAGTCAGGG GAAAAGCACA AAACCAAGAG CCACAAACAT TOB068F10 1 ---------- ---------- ---------- ---------- ---------- HS1-002E06 248 AAGGATAAAT CGAAAAACAA GTTTGAAGAG TTATCAAAAG ATGATTATTT SCI1-ORF 220 AAGGATAAAT CGAAAAACAA GTTTGAAGAG TTATCAAAAG ATGATTATTT TOB068F10 1 ---------- CGAAAAACAA GTTTGAAGAG TTATCAAAAG ATGATTATTT HS1-002E06 298 CTCTAAGAAC AATGAATTTG CTTCTTGGCT GAAAGATAAG AAGAATTTGT SCI1-ORF 270 CTCTAAGAAC AATGAATTTG CTACTTGGCT GAAAGATAAG AAGAATTTGT TOB068F10 41 CTCTAAGAAC AATGAATTTG CTACTTGGCT GAAAGATAAG AAGAATTTGT HS1-002E06 348 TCTTCTCAGA TCTTTCGTCT GAGACTGCAC GCAATTTATT CTCTGACTTT SCI1-ORF 320 TCTTCTCAGA TCTTTCGTCT GAGACTGCAC GCGATTTATT CTCTGACTTT TOB068F10 91 TCTTCTCAGA TCTTTCGTCT GAGACTGCAC GCGATTTATT CTCTGACTTT HS1-002E06 398 GTCATACAAT GGAACAAGGG AAAGCTTGAC AGCCAATACT ATGAGGGAAT SCI1-ORF 370 GTCATACAAT GGAACAAAGG AAAGCTTGAC AGCCAATACT ATGAGGGAAT TOB068F10 141 GTCATACAAT GGAACAAAGG AAAGCTTGAC AGCCAATACT ATGAGGGAAT HS1-002E06 448 TGCAACCGG- ---------- ---------- ---------- ---------- SCI1-ORF 420 TGCAACCGGG CCTCGGTCAT CCCACGCTTG GAATATCAAA AAGTAA---- TOB068F10 191 TGCAACCGGG CCTCGGTCAT CCCACGCTTG GAATATCAAA AAGTAATAGA HS1-002E06 457 ---------- ---------- ---------- ---------- ---------- SCI1-ORF 466 ---------- ---------- ---------- ---------- ---------- TOB068F10 241 ATTCCATGTT TCTTCTCTTT AAGGAGCAGT TGTATTGTCT TTTTTCCAGT HS1-002E06 457 ---------- ---------- ---------- ---------- ---------- SCI1-ORF 466 ---------- ---------- ---------- ---------- ---------- TOB068F10 291 TGTCCGATGG TTATGTCTTA GGCTTCTGTA TTTTTGTGTT TTCTTTTTTC HS1-002E06 457 ---------- ---------- ---------- ---------- ---------- SCI1-ORF 466 ---------- ---------- ---------- ---------- ---------- TOB068F10 341 AGCAGAACAT GCTTAGTCTT ATGAAGTTAC TTTCTTGGAT AATGGTAAAA HS1-002E06 457 ---------- ---------- ---------- ---------- ---------- SCI1-ORF 466 ---------- ---------- ---------- ---------- ---------- TOB068F10 391 TCACCATCTC TGTTGTAAGC TATGTTGTCC GGACTCTCCA AAATCCTGCC HS1-002E06 457 ---------- ---------- ---------- ---------- ---------- SCI1-ORF 466 ---------- ---------- ---------- ---------- ---------- TOB068F10 441 GCATCCCCGT CGGACCCTCC AAAAATGCAC ATACTTTTAG AGGATCCGAC HS1-002E06 457 ---------- ---------- ---------- ---------- ---------- SCI1-ORF 466 ---------- ---------- ---------- ---------- ---------- TOB068F10 491 ACGCACCTGG TAACATTTTT AGTGAGTCTG GGCAACATAG GTTGTAAGAG HS1-002E06 457 ---------- ---------- ---------- ---------- ---------- SCI1-ORF 466 ---------- ---------- ---------- ---------- ---------- TOB068F10 541 TTCTATGCTA GTCCTACCAC GTGACTGCAT TTATCATGGC CTTTGGCTGC HS1-002E06 457 ---------- ---------- ---------- ---------- ---------- SCI1-ORF 466 ---------- ---------- ---------- ---------- ---------- TOB068F10 591 AGAGACGGAC AATACTTCTT ATGATTCACG TAAACTCAAT AGTTTTTATT HS1-002E06 457 ---------- ---------- ---------- ---------- ---------- SCI1-ORF 466 ---------- ---------- ---------- ---------- ---------- TOB068F10 641 CATACTTTCT ATATGTATTA AAAATTTATT GAATATTTAT AAATGTTAAA HS1-002E06 457 ---------- ---------- ---------- ---------- --- SCI1-ORF 466 ---------- ---------- ---------- ---------- --- TOB068F10 691 ACTATAAATT CCAATAAAAA AAAAAAAAAA AAAAAAAAAA AAA

A 

DePaoli,H.C. 2010 

 

Cap

ítulo 1 – SCI1, Stigma/style Cell‐cycle Inhibitor 1 

‐ 48 ‐ 

atggggagcgataagaagacgccggaggagaagaggaagcataagagaagttcgccttct 60 M G S D K K T P E E K r k h k r s s p s 20

tctccacgagatgaagtgaaaagcaaacgccagaatatcaaaggggatgaagagcgaagg 120 s p r d e v k s k r q n i k g d e e r r 40

aaagaaaagaaggacaaatccaagaaggagaagcacaaatcccattctagtgaagagaag 180 k e k k d k s k k e k H K S H S S E E K 60

aagtcaggggaaaagcacaaaaccaagagccacaaacataaggataaatcgaaaaacaag 240 K S G E K H K T K S H K H K D K S K N K 80

tttgaagagttatcaaaagatgattatttctctaagaacaatgaatttgctacttggctg 300 F E E L S K D D Y F S K N N E F A T W L 100

aaagataagaagaatttgttcttctcagatctttcgtctgagactgcacgcgatttattc 360 K D K K N L F F S D L S S E T A R D L F 120

tctgactttgtcatacaatggaacaaaggaaagcttgacagccaatactatgagggaatt 420 S D F V I Q W N K G K L D S Q Y Y E G I 140

gcaaccgggcctcggtcatcccacgcttggaatatcaaaaagtaa 465 A T G P R S S H A W N I K K * 154

 Figura 1 – Seqüência dos clones de cDNA de SCI1 e dos aminoácidos deduzidos destes com os domínios funcionais identificados in silico. (A) Seqüência de nucleotídeos do clone TOBSH1-002E06, representando três seqüências identicas identificadas por SSH (DePaoli et al., manuscrito em preparação), do clone TOB068F10, identificado na busca por homologia no banco de dados TOBEST (Quiapim et al., 2009), e o produto de PCR da fase de leitura aberta putativa (“SCI1-ORF”), que foi utilizada nas contruções SCI1Ri e SCI1OE, alinhadas pelo Dialign 2.2.1 (Brudno et al., 2003). As sequencias dos primers utilizados nas reações de PCR estão sublinhados, letras em negrito e itálico representam o 5’UTR e 3’UTR respectivamente. O ATG inicial está destacado em cinza claro, o códon de terminação está em cinza escuro e as diferenças nucleotídicas em preto. Os gaps (-) foram inseridos para permitir o melhor alinhamento das sequencias, que demonstraram ter deleções de códons e/ou inserções (AAG, codificando o amino ácido Lisina; e CATAAATCC AAATGT, codificando os amino ácidos Lisina, Serina, Lisina, Cisteína e Histidina, respectivamente). (B) Sequencias de nucleotídeos e amino ácidos deduzidos de “SCI1-ORF” mostrando o domínio rico em lisina (LRD) em cinza claro, o sinal de localização nuclear (NLS) indicado em letras minúsculas, os sítios de fosforilação em ser/thr/tyr (prediction ≥ 96%) são mostrados por amino ácidos negritos e sublinhados e, por fim, os dois domínios putativos de interação com ciclinas (LIG_CYCLIN) estão destacados em cinza escuro. O primeiro aminoácido “K” do domínio LIG_CYCLIN também pertence ao domínio LRD. Os nucleotídeos sublinhados e em negrito representam os primers de RT-PCR em tempo real. O símbolo “*” refere-se ao codon de terminação. As posições dos nucleotídeos e dos amino ácidos estão indicadas.

B 

DePaoli,H.C. 2010 

 

Cap

ítulo 1 – SCI1, Stigma/style Cell‐cycle Inhibitor 1 

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┌----------DOMAIN I----------┐┌------------------------DOMAIN II-----------------------------┐┌----------------------------------DOMAIN III---------------------------------┐ NtSCI1 MGSDKKTPEEKRKHKRSSPSSPR-DEVKS-KRQNIKGD-----------EERRK-E--KKDKS-KKEKHKSHSSEEKKSGEKHKTKSH-KHKDKSKNKFEELSKDDYFSKNNEFATWLKDKKNLFFSDLSSETARDLFSDFVIQWNKGKLDSQYYEGIATGPRSSHAWNIK-K SlSCI1 MGSDRKRKEEKMKHKRNSPSSPQADEGRS-KRQKIKGD-----------EETSK-DKSRKEKH-KSHKSKRRSNEDRESGEKHKSKSH-KHKDKLKIKFEELSKDDYFSKNNEFATWLKDKKKLFFSDLSSEAARDLFSDFVKEWNKGKLDIQYYEGITTAPRSSHAWNIK-K StSCI1 MGSDRKMKEEKIKHKRSSPSSPQADEGRS-KRQKIKGD-----------EEPSK-DKSRKDKH-KSHKSKRHSNEEKESGEKHKSKSH-KHKDKLKIKFEELSKDDYFSKNNEFATWLKEKKKLFFSDLSSEAARDLFSNFVKDWNKGKLDIQYYEGITTAPRSSHAWNIK-K VvSCI1 MGS-----ESKEKKRRSSPSISS-DGGKG-KRRRSVED------------K-KE-K--RKDKK-SHRHSKHHSDKEKKSEGKHKDKRH-KRDRHLILEFQELSNDDYFSKNNEFAAWLKEKRKIYFADLSTESARELFTEFVKDWNKQKLESKYYEGIVTGPRTSHKWNIK-Q HvSCI1 MGGG----EAKSRKRRSSPSSGEEGERERKKRRDKKESRRSGR----GSDEEEE-KRRRKKKHGDRGKDKERDSKERRSKEKDKSKRKDKDVSSLKQDIKEISKDDYFAKNNEFATWLKEEKGKYFSDLSSESARDIFLKFVKQWNKGKLPSQYYEGITTGPRSAHNWNIKKA OsSCI1 MGG-----EGKSRKRRSSPSSGEEEERERKKRRDKKESRRSSRDEQAEEEEEEERRRRKKKKHGDRGKDKERDSKEKHSKEKEKSKRKHKD-----DDFKEISKDDYFAKNNEFATWLKEEKGKFFSDLSSESARDLFEKFVKTWNKGKLPSQYYEGITRGPRSAHKWNIK-V ZmSCI1 MGGG----EGKSKKRRSSTSSAEEEGGER-KRRDKKESKRRSRDD----REDDDDRHKKKGKHIDRNKGKERDSKDRHSKEKT-SKRKDKD-----AAFKEISKDDYFAKNNEFATWLKEEKGKYFSDLSSESARDLFLKFVKQWNKGKLPSQYYEGITSGPRSAHNWNIK-A AtSCI1 MVSERSSKEKKRSRARSEDSSSSDYEEKVKRHRGTEKD-----------DERRSRRSDKKDK--KSHKHHKSSTSKKSKDDKPKKKHT-ESDHKLKEGIPELSMEDYFSKNNEFATWLKEEKRTYFNDLTTEAARGLFSRFVKRWNRGKLESRYYEGISTAPRTAHDWMIKRR cons * . * * : *.. * . ::: . : . :* * . : : . ..: . * * : : *:* :***:******:***::: :* **::*:** :* ** **: ** :***** .**::* * **

BAD AVG GOOD   

 

Figura 2 – Alinhamento da sequencia de amino ácidos de SCI1 em tabaco (NtSCI1) com seus putativos homólogos em outras espécies de plantas. O alinhamento múltiplo foi construído no programa T-COFFEE (versão 5.53). A s cores representam o valor do alinhamento (BAD, ruin; AVG, médio; GOOD, bom). Os domínios I, II e III propostos estão indicados. NtSCI1 (sequencia de N. tabacum descrita aqui), SlSCI1 - tomate (AC212309), StSCI1 - batata (AC233353), VvSCI1 - uva (AM424297), HvSCI1 - cevada (AK252156), OsSCI1 - arroz (NM_001052562), ZmSCI1 - milho (EU958997), AtSCI1 – Arabidopsis At1g79200 (NM_106571). Cons., seqüência consenso.

DePaoli,H.C. 2010 

 

Cap

ítulo 1 – SCI1, Stigma/style Cell‐cycle Inhibitor 1 

‐ 50 ‐ 

Para o estudo da potencial localização nuclear de SCI1, fundiu-se a proteína fluorescente

verde (GFP) ao C-terminal de SCI1 (35SPROM:SCI1-GFP) e analisou-se sua localização subcelular

in planta. A microscopia de fluorescência revelou que a proteína SCI1-GFP foi exclusivamente

localizada no núcleo (Figuras 3A-B), contrastando com 35SPROM:GFP que mostrou uma

distribuição uniforme da GFP no núcleo e no citoplasma (dados não mostrados). Sabe-se que

DAPI cora preferencialmente a heterocromatina e, curiosamente, a fluorescência de SCI1-GFP

estava presente no nucleoplasma, onde DAPI não foi detectado, correspondendo à intercromatina

e ao nucléolo (Figuras 3E-L). Ambos os padrões relatados da proteína de fusão ocorrem com

baixos e altos níveis de expressão, que foram estimados pela sua intensidade de fluorescência sob

o microscópio. Esta observação indica que a superexpressão da proteína de fusão não está

influenciando os diferentes padrões de localização observados. Na verdade, o padrão nuclear de

SCI1-GFP se assemelha aos observados pelas proteínas transducina/WD-40, que interage com

reguladores do ciclo celular, e a proteína ribossomal L27A da subunidade 60S, ambas de

Arabidopsis (Brown et al., 2005). Em conclusão, SCI1 é uma proteína nuclear que co-localiza

com o núcleo, especificamente na região intercromática.

SCI1 é um gene específico de estigma/estilete regulado ao longo do desenvolvimento 

Para determinar o padrão de expressão do gene SCI1 e confirmar a sua especificidade de

pistilo, foram realizados experimentos de qRT-PCR utilizando RNA a partir de raízes, caules,

folhas, sépalas, pétalas, estames, estigmas/estiletes e ovários. SCI1 é pelo menos 34 vezes mais

expresso no estigma/estilete do que em qualquer outra parte da planta (Figura 3M). Analisou-se

também o padrão de expressão temporal do gene SCI1 no estigma/estilete durante os 12 estágios

do desenvolvimento descrito por Koltunow et al. (1990). No estágio 1, o pistilo está totalmente

diferenciado e vai crescer e se preparar para a receptividade e maturidade, até o estágio 12, no

qual ocorre a antese e a polinização. A Figura 3N mostra que o maior nível de expressão de SCI1

é observada no estágio 1, o estágio mais jovem investigado. Nas fases seguintes, a transcrição

diminui sua abundância e o seu nível varia durante a primeira metade do período de

desenvolvimento, onde ocorrem os níveis mais altos (estágios iniciais de 1 a 6) do que nas fases

posteriores em direção à antese (7-12) (Figura 3N). Assim, o padrão de expressão de SCI1 sugere

que o seu produto gênico esteja mais envolvido com os eventos que acontecem no início do

desenvolvimento do que nos que ocorrem no final do desenvolvimento do pistilo.

O  gene  SCI1  é  expresso  exclusivamente  nos  tecidos  especializados  do  estigma/estilete 

relacionados com a reprodução de plantas 

Para verificar quais tipos de células transcreviam o gene SCI1, foram realizados

experimentos de hibridização in situ (Figuras 3O-P). No estágio 4, observou-se um sinal de

DePaoli,H.C. 2010 

 

Cap

ítulo 1 – SCI1, Stigma/style Cell‐cycle Inhibitor 1 

‐ 51 ‐ 

hibridação na zona secretora do estigma, incluindo as células papilares, e no tecido transmissor do

estilete (Figura 3P). Um sinal fraco foi observado no feixe vascular, porém este também foi visto

nas seções de estigmas/estiletes hibridizados com a sonda senso (controle). Não havia sinal

detectável nos estágios 7 e 10 (dados não mostrados). Estes resultados estão de acordo com o

padrão de expressão do gene SCI1 ao longo do desenvolvimento determinado por qRT-PCR, em

que uma redução significativa da expressão de SCI1 foi observada nos estágios 7 e 10 quando

comparados à expressão no estágio 4.

Figura 3- Análise de localização subcelular e de expressão gênica de SCI1. (A-L) SCI1-GFP está localizada no núcleo in planta (folhas de tabaco), e claramente situada na região intercromática (A, C, E e G) e no nucléolo (B, D, F e H). (A, B): expressão do 35S:SCI1-GFP; (C, D): Coloração com DAPI; (E, F): sobreposição dos paineis de cima e do meio mais a fluorescência do cloroplasto em vermelho (merge); (G, H): sobreposição de 10 (G) e 12 (H) seções dos sinais de GFP, DAPI e cloroplasto através da fatia celular (“3D” merge). A imagens são representadas como cortes das seções vizinhas. (I, J, K, L): imagens representativas em escala de cinza dos paineis E, G, F e H, respectivamente. Barra de escalas são 4μm em todos os painéis. cl, cloroplasto; is, espaço da intercromatina; n, núcleo; nu, nucléolo. (M) Nível de expressão de SCI1 em diferentes órgãos de N. tabacum (SR-1) determinados por qRT-PCR. Expressão em unidades arbitrárias (U. A.) correspondem à taxa do número de cópias de cDNAs de SCI1 sobre o número de cópias do controle constitutivo do gene da β-actina em uma quantidade definida de RNA total de cada amostra (ver Métodos). (N) Nível de expressão no stigma/estilete durante os 12 estágios do desenvolvimento da flor de tabaco (estágios descritos em Koltunow et al., 1990) (Uma escala logarítmica foi utilizada para permitir a visualização de baixos níveis de expressão. (O) Hibridização in situ realizada em cortes longitudinais do stigma/estilete no estágio 4, utilizando uma sonda senso preparada a partir do clone HS1-002E06(controle negativo) e (P) Localização dos mRNAs de SCI1 como revelado pela sonda anti-senso de TOBSH1-002E06. O fator de aumento é de 40x; arrow cap, célula papilar; p, parênquima; ssz, zona secretória do estigma; stt, tecido transmissor do estilete; vb, feixe vascular.

DePaoli,H.C. 2010 

 

Cap

ítulo 1 – SCI1, Stigma/style Cell‐cycle Inhibitor 1 

‐ 52 ‐ 

A transcrição de SCI1 é claramente mais abundante nos tecidos especializados do

estigma/estilete nos estágios iniciais do desenvolvimento do órgão. Embora esses tecidos estão

intrinsecamente relacionados à interação pólen-pistilo, a maioria dos genes relacionados a essas

interações têm um nível de expressão maior nas fases finais do desenvolvimento da flor (Goldman

et al., 1992, Wang et al., 1993; McClure et al. , 1999). Por outro lado, espera-se que os genes que

controlam a proliferação e diferenciação celular são expressos em níveis mais elevados nos

estágios iniciais do desenvolvimento da flor. Em conjunto, os padrões de expressão temporal e

espacial sugerem um envolvimento do produto do gene SCI1 no desenvolvimento morfológico

e/ou fisiológico do pistilo ao invés de contribuir diretamente para as interações pólen-pistilo.

O produto do gene SCI1 controla o tamanho do estigma 

Para desvendar a função da proteína SCI1, foram geradas plantas transgênicas de tabaco

com a expressão deste gene sendo silenciado por “RNA de grampo” (hairpin RNA - RNAi).

Adicionalmente, foram construídas plantas que superexpressam SCI1. Foram obtidas 13 plantas

transgênicas independentes possuindo a construção de RNAi, as quais foram designadas SCI1Ri, e

9 plantas transgênicas independentes, possuindo o cassete de superexpressão, designadas SCI1OE.

A Figura 4A mostra que o resultado do qRT-PCR no silenciamento mediado por RNAi,

demonstrando que houve uma diminuição eficiente nos níveis de transcrito (até 6,4% do nível de

transcrito do tipo selvagem para SCI1Ri17.9). As plantas com os mais baixos níveis de transcrição

mostraram um aumento nítido no tamanho do estigma (Figura 5B) e um elongamento marcante de

estilete, de até 28% na antese (Figura 5A). Este fenótipo foi observado em 9 das 13 plantas

transgênicas e RNAi e foi visível quando os níveis de transcrito de SCI1 foram abaixo de 27,8%

do nível das plantas do tipo selvagem (Figura 4A barras tracejadas). Houve uma correspondência

direta entre os níveis de mRNA (RNA mensageiro) de SCI1 e a presença dos fenótipos

observados, com a planta SCI1Ri14.2 (8,4% do mRNA de SCI1) apresentando o fenótipo mais

expressivo (Figura 5A). As diferenças entre o tipo selvagem SR-1 e os fenótipos de RNAi foram

mais evidentes no estágio 10 do desenvolvimento floral (Figura 5A). Nesta estapa, o

estigma/estilete permanece fechado dentro da corola em plantas do tipo selvagem (Figura 5A*),

enquanto que nas plantas de RNAi o estigma/estilete é pronunciado para fora da corola (Figura

5A), fenótipo observado desde o estágio 8. De acordo com o fenótipo gerado pelo silenciamento

de SCI1, as plantas SCI1OE revelaram uma alteração oposta com relação ao estigma, ou seja, um

tamanho menor (Figura 5B). Entre 9 plantas transgênicas independentes de superexpressão, 5

transformantes apresentaram o mesmo fenótipo, que foi associada com os maiores níveis de

transcrito de SCI1 (48,8 vezes ou mais do que em plantas do tipo selvagem), conforme

demonstrado por qRT-PCR (Figura 4B). Por outro lado, não observamos alterações no

comprimento do estilete nas plantas SCI1OE, que posicionou os estigmas na mesma altura do topo

DePaoli,H.C. 2010 

 

Cap

ítulo 1 – SCI1, Stigma/style Cell‐cycle Inhibitor 1 

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dos estames e pétalas na antese (como ocorre nas plantas selvagens SR-1). A planta SCI1OE1.1

mostrou um fenótipo semelhante ao das plantas de RNAi e, consequentemente, o nível de mRNA

de SCI1 nesta planta transgênica foi de apenas 17,7% do nível de plantas do tipo selvagem

(Figura 4B). Este efeito de co-supressão é um mecanismo de silenciamento gênico pós-

transcricional conhecido, induzido em algumas plantas em resposta à tentativa de superexpressão

de um gene (Napoli et al., 1990; Taylor, 1997). Nenhum outro órgão da planta mostrou um

fenótipo alterado, macroscopicamente notável, quando se comparam as plantas do tipo selvagem e

as transgênicas (SCI1Ri e SCI1OE). Em conjunto, estes resultados implicam em um forte

envolvimento da proteína SCI1 no controle do tamanho do estigma, provavelmente através da

inibição da proliferação celular e/ou inibição da expansão celular de forma tecido-específica.

Figura 4 – Nível de expressão de SCI1 em estimgas/estiletes no estágio 4 da plantas transgênicas SCI1Ri and SCI1OE, determinado por qRT-PCR. Nível de expressão em unidades arbitraries (A.U.) corresponde à taxa do número de cópias de cDNAs do gene SCI1 em cada planta transgênica (normalizado pelo controle interno do gene da β-actina) pelo número de cópias do cDNA do gene SCI1 em plantas selvagens SR-1 (W.T.) (barras pretas) (igualmente normalizados pelo gene da β-actina), em uma quantidade definida de RNA total (Métodos). As barras hachuradas representam as plantas transgênicas que apresentaram um fenótipo alterado com estiletes elongados e superfícies estigmáticas maiores. As barras em xadrez correspondem às plantas com tamanho do stigma reduzido, em contraste às barras vazias que representam um fenótipo parecido com o tipo selvagem. (A) Nível de expressão em porcentagem (A.U. x100) pra cada planta de RNAi obtida. (B) Nível de expressão em A.U. pra cada planta de superexpressão (OE) obtida (Uma escala logarítmica foi usada para permitir a compração entre os níveis de expressão bem diferentes).

Nível d

e Expressão

 (U.A.) 

Nível de Expressão

 (%) 

Plantas Plantas 

DePaoli,H.C. 2010 

 

Cap

ítulo 1 – SCI1, Stigma/style Cell‐cycle Inhibitor 1 

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Figura 5 – Análise do fenótipo das plantas transgênicas de SCI1. (A) Flores de três transformantes independentes de RNAi mostrando o aumento na elongação do estilete nos estágios 12, 10 e 9 (da esquerda para a direita) do desenvolvimento floral. (*) Vista de cima da planta selvagem no estágio 10 do desenvolvimento floral mostrando o stigma/estilete comletamente envolvido pela corolla. As barras representam 10mm. As porcentagens correspondem ao nível de transcrito de SCI1 em comparação ao nível da planta selvagem, considerado 100%. (B) Vista superior do stigma no estágio 12 do desenvolvimento floral mostrando a redução no tamanho em plantas de superexpressão (SCI1OE 11.1; Ba) e o aumento no tamanho em plantas de RNAi (SCI1Ri14.2; Bc), comparados com a planta selvagem (W.T.; Bb). O nível de expressão está em unidades arbitrárias (U.A.) como descrito na Figura 4. As barras de escala representam 1mm para todas as imagens. (C) Esquema de um corte longitudinal (Ca) representando a região onde as camadas celulares da SSZ foram contadas (≡) (5D; Figura 6). A interseção entre SSZ e STT foi definida por uma linha reta traçada nas curvas inferiores da estrutura em forma de guarda-chuva no stigma (linha pontilhada verde em 5Ca). Em cinza claro está mostrada a area da SSZ avaliada e medida nas seções

Nível d

e Expressão

 (U.A.) 

DePaoli,H.C. 2010 

 

Cap

ítulo 1 – SCI1, Stigma/style Cell‐cycle Inhibitor 1 

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longitudinais das plantas transgênicas e selvagem (Figura 6; plano longitudinal 5Ec1). O quadrado (□) indica a região em que o número de células na SSZ foi contado em uma área de 20.000μm2. O STT está representado em cinza escuro e sua espessura foi medida a 400µm abaixo da interseção SSZ/STT (5Ca, linha pontilhada verde). O retângulo representa a região mostrada em 5Ea/b para cada planta e na qual a espessura do STT e do número de células no parênquima foram medidas. Seções longitudinais de estigmas/estiletes no estágio 11 e coradas com azul de toluidina (0,05%) são mostradas em (Cb) para a planta de superexpressão SCI1OE3.1.1, (Cc) tipo selvagem SR-1 (W.T) e (Cd) planta de RNAi SCI1Ri14.2, fornecendo evidências da diferença de área ocupada por cada SSZ. As barras de escala representam 500µm pra todas as fotos. As setas azuis e pretas indicam, respectivamente, uma junção do carpelo mais funda na planta SCI1OE3.1.1 e o feixe vascular. (D) Seções longitudinais de estigmas/estiletes no estágio 11 em um aumento maior que mostrado em 5C (200x), demonstrando o número de células alterado na SSZ. (E) Cortes histológicos de estiletes no estágio 11. Seções longitudinais das plantas SCI1OE3.1.1, W.T. e SCI1Ri14.2, mostrando as diferenças na espessura no tecido transmissor do estilete (Ea) e do parênquima (Eb), feitos no plano longitudinal indicado em Ec2. Note as diferenças na espessura do STT de cada planta, indicando alteração no número de células desse tecido. (Ec) Seção transversal do estilete selvagem mostrando os dois planos longitudinais onde foram determinados a área, as camadas celulares a o número de células na SSZ, assim como a espessura do STT (Ec1; Figura 6) e onde a espessura do estilete a o número de células do parênquima foram determinados (Ec2; Figura 6). O plano longitudinal “2” corresponde à primeira camada de células atrás do tecido vascular. As barras de escala representam 50μm em Ea/Eb e 500μm em Ec. p, parênquima; stt, tecido transmissor do estilete; ssz, zona secretória do estigma; vb e black arrow, feixe vascular.

A proteína SCI1 é um regulador negativo do ciclo celular 

Como um esforço para elucidar a função de SCI1 e distinguir entre os efeitos de

proliferação celular e/ou expansão celular, preparou-se cortes longitudinais de estigmas/estiletes

no estágio 11 do desenvolvimento floral em plantas SCI1Ri14.2, SCI1OE3.1.1 e plantas do tipo

selvagem. Avaliou-se a área da zona secretora do estigma (SSZ) (Figura 6 e Tabela 1), bem como

o número de camadas celulares na SSZ na região indicada na Figura 5Ca. A Figura 5 mostra que

o número de células é claramente maior (p <0,05) na zona secretora do estigma (Figuras 5Cd e

5D, Figura 6 e Tabela 1) como consequência da redução dos níveis de mRNA de SCI1, enquanto

que a superexpressão de SCI1 resultou em uma diminuição do número de células (p <0,05) na

SSZ (Figuras 5Cb e 5D, Figura 6 e Tabela 1). Por conseguinte, a planta transgênica SCI1Ri14.2

mostrou uma área média de SSZ de 367.355,3 μm2, 48% maior que a área média da planta

selvagem SR-1, que foi de 248.272 μm2 (Figura 5Cd e 5Cc, respectivamente, Figura 6 e Tabela

1). Em contrapartida, a planta transgênica SCI1OE3.1.1 mostrou uma área média de SSZ de

191.381,3 μm2, 23% menor do que a da planta selvagem SR-1 (Figura 5Cb; Figura 6 e Tabela 1).

Da mesma forma, o número de camadas de células (cl) no topo da SSZ (Figura 5Ca) foi

significativamente reduzida para cerca de 8cl em SCI1OE3.1.1, enquanto que este valor foi de 13cl

para a planta selvagem, e significativamente aumentado para 18cl em SCI1Ri14.2 (Figura 6 e

Tabela 1). Além da medição da área da SSZ e dos dados de camadas celulares (cl), também foi

determinado o número de células em uma área delimitada de 20.000 μm2 na SSZ (Figura 5Ca,

Tabela1) para estimar alterações no tamanho das células. Neste contexto, o número de células da

planta de superexpressão SCI1OE3.1.1 é menor, mas não estatisticamente diferente do tipo

selvagem e da planta SCI1Ri14.2, ambas com valores muito semelhantes (Figura 6 e Tabela 1).

DePaoli,H.C. 2010 

 

Cap

ítulo 1 – SCI1, Stigma/style Cell‐cycle Inhibitor 1 

‐ 56 ‐ 

Não se observou o fenômeno chamado de compensação, que aumenta o tamanho da célula em

uma resposta de equilíbrio para a diminuição do número de células nas plantas de superexpressão.

No entanto, as células da SSZ na planta SCI1OE3.1.1 eram mais circulares em forma e mais

esparçadas, de forma que o espaço intercelulares foi ligeiramente aumentado, o que é consistente

com uma menor densidade celular. Além disso, uma junção carpelar mais profunda foi observada

(Figura 5Cb, seta). Por outro lado, as células da SSZ na planta SCI1Ri14.2 parecem ser

ligeiramente menores, provavelmente devido a um crescimento empacotado e/ou uma rápida re-

entrada no ciclo celular. No entanto, tomados como um todo, as células das plantas transgênicas e

do tipo selvagem demonstraram ter aproximadamente os mesmos tamanhos.

Uma vez que os experimentos de hibridização in situ demonstraram que SCI1 também

possui expressão no tecido transmissor do estilete (STT), analisou-se possíveis alterações neste

tecido nas plantas transgênicas. Como as células do STT são mais empacotadas, contá-las

individualmente como fêz-se para as células da SSZ é muito difícil. Assim, mediu-se a espessura

do STT em plantas transgênicas e do tipo selvagem (Figura 5Ea; Figura 6 e Tabela 1), em cortes

longitudinais do estigma/estilete a uma distância de 400μm abaixo da interseção entre a SSZ e o

STT (para ver detalhes desta definição veja Material e Métodos e Figuras 5E e 5Ca). De forma

coerente, a espessura do STT foi diminuído nas plantas SCI1OE3.1.1 (p <0,05) e aumentado nas

plantas SCI1Ri14.2 (p <0,05), quando comparados com o STT em plantas do tipo selvagem

(Figura 6 e Tabela 1), indicando, respectivamente, um menor e um maior número de células neste

tecido. É importante salientar que a planta de RNAi SCI1Ri14.2 mostrou um número maior de

células também no parênquima, quando comparado às plantas selvagem e SCI1OE3.1.1 (Figura

5Eb e Figura 6). Uma vez que SCI1 não é expresso nas células do parênquima, nossos resultados

sugerem que as células do SSZ e STT podem produzir sinais capazes de influenciar a divisão

celular nos tecidos adjacentes, mantendo a proporcionalidade certa: quanto mais células nos

tecidos especializados, maior o número de células no tecido de apoio. Resumindo, a maior

espessura do estilete em plantas SCI1Ri14.2 (Figura 6 e Tabela 1) é um somatório do

supercrescimento de dois tecidos, o parênquima e o STT, enquanto que o tecido do parênquima

permanece aproximadamente o mesmo na planta de SCI1OE3.1.1. Em conjunto, estes resultados

revelam a participação da proteína SCI1 na inibição do ciclo celular de uma forma tecido-

específica.

DePaoli,H.C. 2010 

 

Cap

ítulo 1 – SCI1, Stigma/style Cell‐cycle Inhibitor 1 

‐ 57 ‐ 

Figura 6 – Análises realizadas no estigma/estilete das plantas transgênicas e tipo selvagem. Seções longitudinais de estigmas/estiletes de cada planta foram analizados como descrito na Figura 5Ca para a camada de células, área e número de células (em uma área de 20.000µm2) da SSZ e espessura do estilete (µm), do STT (µm) e do parênquima (numero de células) (n=3 para cada planta mostrada). Os valores acima representam porcentagens dos valores em relação à planta selvagem (100%). Os dados numéricos estão descritos na Tabela 1. * Significantemente diferente do tipo selvagem pelo teste T de Student (p<0.05).

Tabela 1 – Análise dos tecidos do estigma/estilete em plantas transgênicas e selvagem.

SCI1OE 3.1.1 Wild type SCI1Ri 14.2

Camada de célulasa *8.3 ± 0.6 13.0 ± 1.0 *17.7 ± 2.1

Área da SSZ (μm2)a *191,381.3 (77%) ± 10,834 248,272.0 (100%) ± 9,441 *367,355.3 (148%) ± 13,474

Tamanho celular na SSZb 29.3 ± 4.0 36.0 ± 1.0 36.7 ± 1.5

Espessura do estilete (μm)c *510.7 ± 16.8 559.9 ± 20.4 *657.0 ± 37.3

Espessura do STT (μm)d *58.5 ± 7.2 88.4 ± 7.1 *113.1 ± 5.5

Espessura do parênquimae 14.0 ± 1.0 14.3 ± 0.6 *17.3 ± 0.6

aComo mostrado na Figura 5Ca e 5D. bRepresenta o número de células contadas em uma área da SSZ de 20.000μm2, Figura 5Ca e 5D. cMedido a 400μm abaixo da interseção SSZ/STT como mostrado na Figura 5Ca/5Eb. dMedido a 400μm abaixo da interseção SSZ/STT como mostrado na Figura 5Ca/5Ec1). eNúmero de camadas celulares contadas no plano longitudinal logo atrás do feixe vascular, como mostrado na Figura 5Ec2. Os valores representam a media de três determinações individuais com desvio padrão. *Significantemente diferente da tipo selvagem pelo teste T de Student (p<0.05).

DePaoli,H.C. 2010 

 

Cap

ítulo 1 – SCI1, Stigma/style Cell‐cycle Inhibitor 1 

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SCI1 é expresso nos estágios iniciais do desenvolvimento do estigma/estilete 

Devido ao alto nível de expressão de SCI1 no estágio 1 do desenvolvimento floral e seus

efeitos sobre o tamanho final do estigma/estilete nas plantas transgênicas, decidiu-se investigar a

sua expressão nos estágios iniciais do desenvolvimento floral (estágios -4 a -1), em que o estigma

está se diferenciando (Koltunow et al., 1990; Wolters-Arts et al., 1996). Para melhor correlacionar

a função de SCI1 com os acontecimentos que ocorrem no início do desenvolvimento do

estigma/stilete, foi realizada microscopia eletrônica de varredura (MEV) de botões florais dos

estágios -4 a 1, bem como experimentos de qRT-PCR em estigmas/estiletes nestes mesmos

estágios do desenvolvimento. Além de medir o comprimento do botão floral (característica que

diferencia cada um dos estágios), foram considerados também marcadores morfológicos de

anteras já descritos anteriormente (Koltunow et al. 1990) para distinguir, de forma confiável, entre

cada estágio do desenvolvimento (Figura 7; Métodos).

O pistilo de tabaco é formado pela fusão de dois carpelos que dão origem ao estigma em

torno do estágio -4 do desenvolvimento floral (Figuras 8Af e 9Bd). O tecido estigmático começa a

diferenciação na região de fusão do carpelo em direção às bordas do mesmo (Figura 8Ak). No

estágio -3, a superfície do estigma torna-se evidente com um aspecto áspero, contrastando com a

superfície lisa da epiderme do carpelo (Figura 8Ag), e o estilete começa a elongar (Figura 8Ab).

Além disso, esta fase é caracterizada por uma grande ampliação no tamanho da parte superior do

pistilo e uma visível diferenciação de células papilares na epiderme do estigma (Figuras 8Ag e

5AL). No estágio -2, o estilete está visivelmente elongado (Figura 8Ac), as células papilares se

transformam em estruturas em forma de dedo (“finger-like structure”) (Figura 8Am) na borda

distal do carpelo e começam a se tornar muito mais evidentes na área central do estigma (Figura

8Ah). Em uma visão superior do estigma, vemos claramente as células papilares em

desenvolvimento a partir das bordas do carpelo e margeando a junção do carpelo em direção à

parte externa da área central (Figuras 8Bb e 8Bc, amarelo). Além disso, a epiderme ainda é visível

nas bordas centrais do pistilo durante este estágio (Figura 8Ah e 8Bc, azul). A epiderme na ponta

do carpelo está quase ereta, como conseqüência da pressão provocada pelo crescimento da SSZ. O

estágio -1 é retratado por um estilete bem elongado (Figura 8Ad) e uma ampliação clara nas

dimensões do estigma (Figura 8Ai), com a epiderme superior do carpelo e o parênquima

começando a dobrar para trás, originando a parte abaxial do estigma (Figura 8Bd). A

diferenciação das papilas ocorrem em toda a superfície do estigma. Por fim, no estágio 1, a SSZ é

totalmente diferenciada e a epiderme do carpelo superior e do parênquima se dobrou

completamente, formando uma estrutura em forma de guarda-chuva em uma visão lateral (Figura

8Ae e 9Af). A dobra da epiderme do carpelo superior e do parênquima ocorrem principalmente

devido à aceleração da proliferação celular na região central, onde os carpelos não fundidos.

DePaoli,H.C. 2010 

 

Cap

ítulo 1 – SCI1, Stigma/style Cell‐cycle Inhibitor 1 

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Figura 7 – Análise de marcadores morfológicos em antera nos botões florais de estágios muito jovens do desenvolvimento floral. As anteras foram coletadas dos mesmos botões florais que foram utilizados para a microscopia eletrônica de varredura (MEV) de estigmas/estiletes, e para a extração de RNA para o RT-PCR em tempo real. As anteras foram separadas dos botões florais nos estágios desenvolvimentais relevantes, fixadas, embebidas em parafina, cortadas transversalmente em seções de 8µm e coradas com azul de toluidina (0,05%). Essa análise foi realizada para confirmar a correta avaliação do estágio desenvolvimental através da comparação com os marcadores morfológicos de antera descritos por Koltunow et al. (1990). (A) Seção transversal de anteras no estágio -4, coradas com azul de toluidina (0,05%) mostrando a célula mãe do micrósporo (seta branca), formada dentro do saco polínico, visivelmente discernível das células do tapete. Nesse estágio, o tapete é claramente dividido em interno (seta vermelha) e externo (seta amarela). (B) Seção transversal da antera no estágio -3, com uma deposição de calose evidente na parede da célula mãe do megásporo (seta marrom). (C) Antera no estágio -2, mostrando o tapete mais largo e multinuclear (setas pretas). (D) Antera no estágio -1, detalhando a díade (seta preta e verde) resultante do final da meiose I. (E) Antera no estágio 1, apresentando a meiose completa, evidente pela formação das tétrades (seta branca).

DePaoli,H.C. 2010 

 

Cap

ítulo 1 – SCI1, Stigma/style Cell‐cycle Inhibitor 1 

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Figura 8 – Desenvolvimento e diferenciação bem inicial da parte superior do pistilo em plantas selvagens (SR-1).

(A) Microscopia eletrônica de varredura de pistilos em estágios bem jovens do desenvolvimento. Botões florais nos estágios indicados (estágio -4 até estágio 1, respectivamente Aa a Ae) tiveram as sépalas e pétalas removidas para permitir a visualização do pistilo. Vemos a formação e o desenvolvimento da SSZ (Af to Aj), junto com a diferenciação da epiderme em células papilares (Ak to Ao). As barras de escala indicam 500µm (Aa to Ae), 200µm (Af to Aj) e 50µm (Ak to Ao). (B) Um esquema ilustrativo do desenvolvimento e da formação da SSZ, desde o estágio -4 até o estágio 1 (Ba to Be, respectivamente) do desenvolvimento floral. amarelo, tecido estigmático; azul, epiderme do carpelo. Barra de escala corresponde a 500µm para todas as imagens. (C) Nível de expressão de SCI1 determinado por RT-PCR em tempo real em estigmas/estiletes selvagens nos estágios -4 a 1 do desenvolvimento floral. Expressão em unidades arbitrárias (U.A.) como descrito na Figura 3M.

Conforme mostrado na Figura 8C, SCI1 é altamente expresso em fases muito precoces do

desenvolvimento do estigma/estilete, com o nível mais elevado de expressão observado no estágio

-3, quando a SSZ inicia a sua diferenciação. O transcrito de SCI1 diminui em fases posteriores (-

2, -1 e 1), durante o qual o tecido estigmático está proliferando e continuamente diferenciando.

Esse padrão de expressão é consistente com um papel no controle da proliferação/diferenciação

celular na parte superior do pistilo.

DePaoli,H.C. 2010 

 

Cap

ítulo 1 – SCI1, Stigma/style Cell‐cycle Inhibitor 1 

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SCI1 controla a proliferação/diferenciação celular e influencia o momento do desenvolvimento 

do estigma/estilete 

A fim de estudar como o produto do gene SCI1 estava afetando o tamanho do estigma e o

elongamento do estilete, decidimos comparar os estágios iniciais do desenvolvimento do

estigma/estilete em plantas do tipo selvagem e transgênicas por microscopia eletrônica de

varredura (MEV). Foram analisadas as plantas transgênicas com os fenótipos mais extremos:

SCI1Ri14.2 e SCI1OE3.1.1. Pistilos no estágio -4 da planta SCI1Ri14.2 apresentou características

semelhantes às do pistilo de tipo selvagem em estágios de desenvolvimento floral -4/-3 (Figuras

9Ba, 9Bd e 9Be). Durante as primeiras etapas da formação do estigma/estilete, a planta

SCI1Ri14.2 claramente exibiu um crescimento mais rápido do estigma através de estágios -3 e -2

(Figuras 9Bb e 9Bc, respectivamente) em relação à planta selvagem, nos mesmos estágios

(Figuras 9Be e 9Bf). De fato, no estágio -3 a epiderme do carpelo na planta SCI1Ri14.2 já começa

a se dobrar para trás (Figura 9Bb), um evento observado somente no estágio -1 da planta do tipo

selvagem (Figuras 8Ad, 8Ai e 8Bd). A diferenciação do estigma foi também avançada na planta

SCI1Ri14.2, ocorrendo assim que o número de células ia se tornando maior (Figuras 9Ca-9Cc),

mostrando que a diferenciação celular no estigma é acoplada à proliferação nas plantas

silenciadas para o gene SCI1. Além disso, os pistilos da planta SCI1Ri14.2 atingiram a estrutura de

guarda-chuva no estágio -2 (Figuras 9Ab e 9Bc), um fenótipo observado apenas no estágio 1 da

planta tipo selvagem (Figuras 8Ae, 8Aj e 9Af). Da mesma forma, a elongação do estilete segue o

crescimento acelerado do estigma, tornando-o mais longo e conduzindo a superfície do estigma a

uma posição superior em relação às anteras já no estágio 1 (Figura 9Ac), enquanto que isso não é

observado em plantas do tipo selvagem (Figura 9Af). A aceleração do desenvolvimento

observado na planta SCI1Ri14.2, com um nível reduzido de mRNA de SCI1, sugere fortemente

que o produto do gene SCI1 seja um regulador chave no controle do desenvolvimento do

estigma/estilete. O tamanho de cada célula no estigma da planta de RNAi é similar aos do tipo

selvagem, confirmando que um maior número de células devem estar presentes no estigma de

plantas de RNAi para ocupar a maior área observada. Nossos resultados mostraram que o

estímulo para o elongamento do estilete, o que gera um estilete saliente da planta SCI1Ri14.2 na

antese, começa em estágios muito precoces do seu desenvolvimento, causada pelo silenciamento

de SCI1. Em conjunto, estes resultados são uma forte evidência de que o produto do gene SCI1

influencia o tamanho final do estigma e a elongação do estilete, através do controle da divisão

celular, desde os estágios iniciais da formação do órgão em plantas do tipo selvagem.

A parte superior dos pistilos da planta de superexpressão SCI1OE3.1.1 mostrou um

fenótipo semelhante ao de pistilos do tipo selvagem no estágio -4 (Figuras 9Bg e 9Bd,

respectivamente). Contudo, foi observado um atraso no desenvolvimento do estigma/estilete da

planta SCI1OE3.1.1 nos estágios -4 a -3, com um mínimo de diferenciação das células papilares

DePaoli,H.C. 2010 

 

Cap

ítulo 1 – SCI1, Stigma/style Cell‐cycle Inhibitor 1 

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(Figuras 9Cg e 9Ch). As características típicas da superfície do estigma, observadas no pistilo das

plantas do tipo selvagem no estágio -3, são visíveis apenas no estágio -2 em pistilos da planta

SCI1OE3.1.1 (Figura 9Ce e 9Ci, respectivamente). É interessante observar que a diferenciação da

SSZ está estritamente ligada à proliferação celular. Pistilos nos estágios -1 e 1 da planta de

superexpressão são morfologicamente e desenvolvimentalmente semelhantes aos estágios -2 e -1

da planta selvagem, respectivamente. Além disso, o estilete em SCI1OE3.1.1 é visível apenas no

estágio -2 (Figura 9Ah), permanecendo mais curto que o tipo selvagem no estágio 1 (Figura 9Ai).

Consistentemente, os estigmas da planta SCI1OE3.1.1 têm um tamanho menor do que os da planta

selvagem quando são comparadas lado a lado nos estágios -3, -2, -1 e 1 do desenvolvimento

floral. Em resumo, pistilos da planta de superexpressão mostram um atraso no crescimento e

diferenciação de cerca de um estágio, quando comparados com pistilos da planta selvagem.

Como pode ser observado na Figura 9Ag, o desenvolvimento da antera também foi

afetado na planta SCI1OE3.1.1, devido à expressão ectópica de SCI1 sob controle do promotor

35S. Os outros órgãos vegetativos e florais de ambas as plantas transgênicas não demonstraram

nenhuma outra alteração macroscópica. Embora a expressão ectópica de SCI1 resultou em anteras

menores nos primeiros estágios de desenvolvimento da flor (Figuras 9Ag e 9Ah), no estágio 1

elas já tinham recuperado seu tamanho normal (Figura 9Ai). No estágio -3, plantas SCI1Ri14.2 e

selvagem exibem anteras de tamanho similar (Figura 9Aa e 9Ad, respectivamente). Tomados em

conjunto, podemos propor que a proteína SCI1 inibe a divisão celular nas fases iniciais do

desenvolvimento da flor de maneira tecido-específica e é suficiente para modular o momento do

desenvolvimento do estigma/estilete. Estas observações sugerem que SCI1 pode ser o motor de

um “relógio molecular” na via de sinalização do desenvolvimento do pistilo que determina o

tamanho final do órgão e o número de células.

DePaoli,H.C. 2010 

 

Cap

ítulo 1 – SCI1, Stigma/style Cell‐cycle Inhibitor 1 

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Figura 9 – Microscopia eletrônica de

varredura (MEV) de plantas transgênicas (T1) e selvagens SR-1 (W.T.).

DePaoli,H.C. 2010 

 

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ítulo 1 – SCI1, Stigma/style Cell‐cycle Inhibitor 1 

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(A) Comparação da elongação do estilete no começo do desenvolvimento nas plantas SCI1Ri14.2 (Aa, Ab e Ac), e selvagem (W.T.) (Ad, Ae e Af). Observe que no estágio 1 (Ac), o estigma de SCI1Ri14.2 já está posicionado acima das anteras. A elongação do estilete, por outro lado, é atrasada na planta de superexpressão SCI1OE3.1.1 (Ag, Ah e Ai). No estágio -3 do desenvolvimento floral é possível observar que a expressão ectópica de SCI1 em anteras atrasou o seu desenvolvimento. Este órgão tem o mesmo tamanho e marcadores morfológicos (Koltunow et al., 1990) nas plantas de RNAi SCI1Ri14.2 e do tipo selvagem. (B) Aumento prematuro da parte superior do pistilo da planta de RNAi SCI1Ri14.2 (Ba, Bb e Bc), comparada com a planta selvagem (Bd, Be e Bf), em contraste ao atraso no desenvolvimento observado para a planta de superexpressão SCI1OE3.1.1 (Bg, Bh e Bi), nos estágios -4 (Ba, Bd e Bg), -3 (Bb, Be e Bh) e -2 (Bc, Bf e Bi) do desenvolvimento floral. (C) Crescimento e diferenciação das células papilares, na parte superior do pistilo, que, nas plantas SCI1Ri14.2 e tipo selvagem, se iniciam a partir do estágio -4 (Ca e Cd, respectivamente) e desenvolve nos estágios -3 e -2 (Cb;Cc e Ce;Cf, respectivamente) em diante, em contraste à planta SCI1OE3.1.1 que inicia o desenvolvimento da papila no estágio -3 (Ch) e desenvolve a partir do estágio -2 (Ci) em diante. As escalas são indicadas e representam 500μm (Aa a Ai), 100μm (Ba a Bi), e 50µm (Ca a Ci).

A proteína SCI1 tem as Ciclinas do tipo A como suas parceiras de interação 

Devido ao seu papel previsto como um regulador negativo do ciclo celular in planta e

pela presença de dois domínios putativos de interação com ciclina, resolveu-se testar se SCI1

poderia ser um regulador direto de complexos ciclina/CDK.

Para verificar se a interação entre SCI1 e as ciclinas do tipo A ocorria in planta, foram

executados ensaios de BiFC (Biomolecular Fluorecense Complementation) com as seqüências de

CYCA1;1 (NtCYCA1;1) e CYCA2;2 (NtCYCA2;2) de N. tabacum. Para tanto, NtSCI1 foi

fusionado à “cabeça” da GFP (hGFP; aminoácidos 1-149) e NtCYCA1;1, NtCYCA2;21-398 (ORF

completa) e NtCYCA2;296-398 (ORF sem o “destruction box”) C-terminais foram fusionadas à

“cauda” da GFP (tGFP; aminoácidos 150-238). Conforme mostrado na Figura 10, NtSCI1 exibiu

interação com NtCYCA1;1, restaurando a fluorescência da GFP in planta, que ficou localizada no

núcleo conforme o esperado. Até o momento, não fomos capazes de demonstrar a interação de

NtSCI1 com ambas isoformas de NtCYCA2;2. Nossos resultados mostram que SCI1 interage

com ciclinas do tipo-A in planta.

Figure 10 – Interação de SCI1 com Ciclina A1;1. As interações foram testadas utilizando a técnica de BiFC. Células da epiderme de folhas foram transformadas com o gene NtSCI1 fusionado à cabeça da GFP (hGFP, amino ácidos 1 a 149) e com o gene NtCYCA1;1 fusionado á calda da GFP (tGFP, amino ácidos 150 a 238). Painéis da esquerda e central – Fluorescência da GFP restaurada, que foi localizada no núcleo (diferentes aumentos são mostrados); painel da direita – painel do meio mesclado com o campo claro. Barras de escala são de 10µm.

DePaoli,H.C. 2010 

 

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ítulo 1 – SCI1, Stigma/style Cell‐cycle Inhibitor 1 

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SCI1 influencia os níveis de transcrição de alguns genes regulados por auxina 

Devido à similaridade fenotípica dos pistilos das nossas plantas transgênicas de RNAi e

os pistilos de Arabidopsis tratados com ácido N-1-naphthylphthalamic (NPA; Nemhauser et al.,

2000), decidimos investigar os níveis de transcrição de três genes regulados por auxina,

identificados no banco de EST de estigma/estilete (banco de dados TOBEST; Quiapim et al.

2009), em plantas transgênicas (SCI1Ri e SCI1OE) comparando com o tipo selvagem. Os níveis dos

transcritos dos genes de tabaco homólogos aos fatores de transcrição “Fator de Resposta a

Auxina” em Arabidopsis (ARF8), e aos “auxina/ácido indol-3-acético” (Aux/IAA) Aux/IAA13 e

Aux/IAA19 foram medidos por qRT-PCR em estigmas/estiletes de plantas do tipo selvagem,

quatro transgênicos independentes de RNAi e quatro transgênicos independentes de

superexpressão (Figura 11). Estes genes foram escolhidos com base em seu envolvimento com o

desenvolvimento da flor (ARF8, Wu et al., 2006), a capacidade de alterar múltiplas respostas a

auxina (Aux/IAA19, Tatematsu et al., 2004) e por prejudicar o desenvolvimento regulado por

auxina (Aux/IAA13, Weijers et al., 2005). Para este experimento, optou-se pelas plantas

transgênicas que apresentaram o menor e o maior nível de mRNA de SCI1 (Figura 5). Aqui,

optamos por substituir o controle interno utilizado na análise de qRT-PCR. O gene da β-actina

mostrou ser o melhor controle interno para a comparação da expressão gênica entre diferentes

órgãos de tabaco (Quiapim et al., 2009) e foi utilizado nos experimentos acima. Por outro lado, o

gene da ubiquitina é sugerido como controle mais adequado quando o mesmo órgão é comparado

durante alterações no controle do ciclo celular (Eloy et al., 2006; Masuda et al., 2008). Uma vez

que SCI1 está mudando o número de células no estigma/estilete, o gene da ubiquitina foi utilizado

como controle interno para este experimento. A Figura 11A mostra a re-análise dos níveis de

expressão de SCI1 nas plantas transgênicas com o gene da ubiquitina como controle interno.

Coerentemente com a idéia de que este gene de referência pode ser mais apropriado quando os

genes envolvidos no controle do ciclo celular são alterados, os resultados obtidos para o nível de

expressão de SCI1 em plantas transgênicas de RNAi correspondem perfeitamente com o grau de

alteração do seu fenótipo no estigma/estilete.

O acúmulo de mRNA de NtARF8 não foi afetado em plantas SCI1Ri (Figura 11B). No

entanto, observamos um aumento de seus níveis de transcrição de até 2,8 vezes maior em plantas

SCI1OE (p <0,05) (Figura 11B). NtAux/IAA13 e NtAux/IAA19 também foram induzidos em

plantas de superexpressão em até 4,2 vezes e 5,1 vezes (p ≤ 0,001), respectivamente (Figura 11C

e 11D). Além disso, a transcrição de NtAux/IAA13 (Figura 11C) e NtAux/IAA19 (Figura 11D)

foram alteradas em plantas de RNAi, com a expressão de NtAux/IAA19 sendo proporcionalmente

associada à diminuição da expressão de SCI1 nessas plantas (p <0,05). Nossos resultados sugerem

que SCI1 pode influenciar a regulação da transcrição de alguns genes regulados por auxina e de

DePaoli,H.C. 2010 

 

Cap

ítulo 1 – SCI1, Stigma/style Cell‐cycle Inhibitor 1 

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alguma forma estar relacionado com a sinalização de auxina no desenvolvimento da parte

superior do pistilo.

Figura 11 – Nível dos transcritos para cada gene indicado determinado por RT-PCR em tempo real, em estigmas/estiletes no estágio 4 das plantas selvagem (W.T.) (barras pretas), SCI1Ri (barras hachuradas) e SCI1OE (barras em xadrez). (A) gene SCI1, (B) gene NtARF8, (C) gene NtAux/IAA13 e (D) gene NtAux/IAA19. Unidades arbitrárias (U. A.) em A está como descrita na Figura 4, exceto que foi utilizado o gene da poliubiquitina como controle interno (ver Métodos para detalhes). O eixo Y da esquerda mostra os valores para as plantas de RNAi (SCI1Ri) e o eixo Y da direita mostra os valores para as plantas de superexpressão (SCI1OE). Unidades arbitrárias (U. A.) em B-D como descrito na Figura 3M, exceto pelo uso do gene da poliubiquitina como controle interno. Os asteriscos indicam as diferenças estatisticamente significantes entre cada planta transgênica comparada à planta selvagem pelo teste T de Student (*, p<0.05; **, p≤0.001).

SCI1/Ubiquitina

***

**

**

*

**

**

** ***

*

** ** *

*

***

**

Plantas

A B C D

0

0,5

1

1,5

2

2,5

3

SC

I1R

i14

.2

SC

I1R

i17

.9

SC

I1R

i11

.3

SC

I1R

i4.

4.1

Nív

el d

e E

xpre

ssão

de

SC

I1R

i (U.A

.)

0,01

0,1

1

10

100

1000

10000W

.T.

SC

I1O

E11

.1S

CI1

OE

8.3

SC

I1O

E6.

4S

CI1

OE

3.1.

1

Nív

el d

e E

xpre

ssão

de

SC

I1O

E(U

.A.)

ARF8

0

0,005

0,01

0,015

0,02

0,025

0,03

0,035

0,04

0,045

0,05

SC

I1R

i 14.

2

SC

I1R

i 17.

9S

CI1

Ri 1

1.3

SC

I1R

i 4.4

.1

W.T

.S

CI1

OE11

.1S

CI1

OE8.

3

SC

I1O

E6.

4S

CI1

OE3.

1.1

Plantas

Nív

el d

e E

xpre

ssão

(U.A

.)

IAA13

0

0,005

0,01

0,015

0,02

0,025

0,03

0,035

0,04

0,045

Plantas

Nív

el d

e E

xpre

ssão

(U.A

.)

IAA19

0

0,01

0,02

0,03

0,04

0,05

0,06

0,07

0,08

Plantas

Nív

el d

e E

xpre

ssão

(U.A

.)

SC

I1R

i 14.

2

SC

I1R

i 17.

9S

CI1

Ri 1

1.3

SC

I1R

i 4.4

.1W

.T.

SC

I1O

E11

.1S

CI1

OE8.

3

SC

I1O

E6.

4S

CI1

OE3.

1.1

SC

I1R

i 14.

2

SC

I1R

i 17.

9

SC

I1R

i 11.

3S

CI1

Ri 4

.4.1

SC

I1O

E11

.1

SC

I1O

E8.

3

SC

I1O

E6.

4

SC

I1O

E3.

1.1

W.T

.

DePaoli,H.C. 2010 

 

Cap

ítulo 1 – SCI1, Stigma/style Cell‐cycle Inhibitor 1 

‐ 67 ‐ 

DISCUSSÃO 

 

SCI1  é um  regulador  tecido‐específico do  ciclo  celular que  influencia o desenvolvimento do 

pistilo 

Nós identificamos um gene que codifica uma proteína rica em lisina especificamente

expressa nos tecidos especializados do estigma/estilete durante a sua fase inicial de

desenvolvimento. Com base na análise fenotípica das plantas transgênicas de superexpressão e

silenciamento, nossos resultados indicam fortemente que SCI1 tem uma atividade inibitória na

proliferação celular. A menor SSZ observada em plantas transgênicas de superexpressão é

formada por células com aproximadamente o mesmo tamanho que as células das plantas do tipo

selvagem. Além disso, a análise em MEV dos botões florais das plantas de superexpressão

demonstrou um atraso na proliferação/diferenciação. Assim, a presença de uma SSZ menor é

conseqüência de uma redução no número total de células acumulada durante o desenvolvimento

do estigma. Por outro lado, a maior SSZ obtida em plantas de RNAi está diretamente associada

com um início mais cedo e/ou mais rápido na proliferação/diferenciação celular e não com células

maiores. Portanto, nossos resultados sugerem que SCI1 participa no controle do momento da

proliferação/diferenciação celular do estigma/estilete e parece ser um integrador entre a regulação

do ciclo celular e o programa de desenvolvimento do estigma/estilete, garantindo que o processo

de proliferação e diferenciação, que são interconectados, ocorra no momento apropriado.

Em meristemas florais, células indiferenciadas se dividem assimetricamente, dando

origem a células-filhas que transportam a informação do destino da célula. Entretanto, a

diferenciação final é adiada até que algumas rodadas de divisão celular simétrica ocorra. O

momento exato em que essas células vão sair do ciclo celular e se diferenciar, ou seja, o momento

da diferenciação, é controlado por diversos fatores, como atividade de CDK e fatores de

crescimento (revisto em De Veylder et al., 2007). De Veylder et al. (2007) recentemente

propuseram um modelo para o controle da proliferação/diferenciação celular baseado na atividade

de CDK, que deve cair abaixo de um limiar para que as células sofram a saída do ciclo celular e

entrem na diferenciação. A interação de SCI1 com ciclinas do tipo-A sugere que este gene

controla a diferenciação celular e o tamanho do órgão através de uma modificação direta de

atividade de CDK. Entre os repressores de crescimento conhecidos que regulam a atividade de

diferentes “fatores de restrição do crescimento”, somente DA1 muda o tamanho do órgão sem

alterar o tamanho das células (Li et al. 2008), como SCI1 faz no estigma/estilete. Considerando

que DA1 controla o tamanho do órgão em diferentes tecidos, como sementes, embriões e

cotilédones, folhas, caules e flores, é plausível de se propor que SCI1 represente um efetor à

jusante de DA1 entre os “fatores de restrição do crescimento” tecido-específicos, o que

DePaoli,H.C. 2010 

 

Cap

ítulo 1 – SCI1, Stigma/style Cell‐cycle Inhibitor 1 

‐ 68 ‐ 

complementaria o modelo recentemente descritos por Krizek (2009), em vias de controle do

tamanho final do órgão.

Adicionalmente ao momento da diferenciação, um tópico interessante no

desenvolvimento de plantas é se a divisão celular segue um programa desenvolvimental (teoria

“organismal”) ou se a divisão celular instrui a organogênese e o desenvolvimento (teoria celular).

Devido a resultados ambiguos descritos na literatura que podem se enquadrar em ambas as

teorias, foi proposta a “teoria neo-celular”. (Tsukaya, 2002; Beemster et al. 2003). Nesta teoria,

um modelo integrativo entre crescimento e divisão celular é proposto. Nas plantas transgênicas de

SCI1, as alterações na taxa de divisão celular nos tecidos do estigma/estilete afetam tanto o

tamanho final do orgão quanto o momento da diferenciação, o que apoia a teoria celular.

Entretanto, enquanto que a grossura do STT é modificado em ambas as plantas de SCI1 (SCI1Ri e

SCI1OE) devido à taxa de divisão celular alterada, o comprimento foi modificado apenas nas

plantas de RNAi. Nas plantas de superexpressão o estilete se elonga até um comprimento

parecido com o da planta selvagem. Este fenótipo representa um programa desenvolvimental

inalterado, que não foi influenciado pela redução na taxa de divisão celular nos tecidos

especializados do estigma/estilete nas plantas SCI1OE, o que apoia a teoria “organismal”. A

deleção das células da SSZ em plantas STIG1 (plantas transgênicas STIG1pro:barnase; Goldman

et al., 1994) gerou estiletes mais curtos e não teve alteração nas células do STT. Em conjunto,

estas observações sugerem que o programa de elongamento de estilete é um resultado de

diferentes sinais, incluindo os provenientes do tecido do estigma (SSZ). Assim, uma possível

explicação para o fenótipo das plantas transgênicas é que o menor número de células em estigmas

SCI1OE produziu um “sinal de elongamento estigma-dependente” suficiente para elongar os

estiletes nestas plantas de forma semelhante ao que ocorre na planta selvagem. Por outro lado, o

estilete projetado para fora da corola nas plantas SCI1Ri seria uma consequência do aumento do

número de células do estigma, que por sua vez produziram mais do “sinal de elongamento

estigma-dependente” ou, alternativamente, começaram a produzí-lo antes. De acordo com a idéia

de um sinal que pode se mover entre as células, observou-se nos estiletes de plantas SCI1Ri um

aumento do número de células do parênquima, um tecido que não expressa SCI1. As

conseqüências da modulação de SCI1 no tamanho do estigma e no comprimento do estilete

sugerem que o desenvolvimento do pistilo é regido por uma variedade de sinais, em concordância

com a proposta de que os processos de crescimento são implementados a nível celular, mas

também envolvem a troca de informações entre os níveis organizacionais, e não simplesmente

seguindo as teorias celular ou “organismal”. Considerando esse ponto de vista, como é que os

resultados de SCI1 se encaixam na “teoria neo-celular”? Em nossas plantas SCI1Ri, um aumento

na divisão celular no estigma e uma diferenciação prematura são observados. Assim, propõe-se

que a divisão celular inibe a diferenciação celular até que o número de células no estigma atinja

um limiar acima do qual se acumulam os sinais de diferenciação e, em seguida, a taxa de divisão

DePaoli,H.C. 2010 

 

Cap

ítulo 1 – SCI1, Stigma/style Cell‐cycle Inhibitor 1 

‐ 69 ‐ 

celular diminui e será acompanhada da diferenciação celular (Figura 12). Coerentemente com esta

proposta, as plantas SCI1OE, em que observou-se um excesso de inibição da divisão celular no

estigma, começam o processo de diferenciação do estigma/estilete depois da planta do tipo

selvagem, mas as etapas subseqüentes da diferenciação acompanham a taxa de desenvolvimento

da planta selvagem (Figura 12). Nossos resultados mostram que o gene SCI1 codifica um

regulador tecido-específico importante no controle do ciclo celular que influencia o crescimento e

o desenvolvimento da parte superior do pistilo, sem alterar o tamanho das células.

A regulação dos níveis de expressão de SCI1 é suficiente para influenciar o tamanho do

estigma e o comprimento do estilete, que podem ter consequências importantes na reprodução das

plantas. A diminuição do nível de SCI1 resultou em estigmas posicionados acima das anteras e

em heterostilia na nossa população de plantas transgênicas de tabaco. Na natureza, a regulação

dos níveis de expressão das seqüências homólogas de SCI1 pode contribuir para o heterostilia

observada em algumas espécies com flores perfeitas (bi-sexuais), e ter consequências sobre as

taxas de auto-polinização e de polinização cruzada.

Figura 12 - Modelo proposto para o mecanismo de ação de SCI1 no controle da proliferação da parte superior do pistilo ao longo do desenvolvimento. Depois que os dois carpelos se formam e fundem, as células posicionadas no topo do pistilo começam a se dividir na linha de junção do carpelo. Quando um número apropriado de células é alcançado, elas iniciam a diferenciação em zona secretória do estigma (SSZ) e tecido transmissor do estilete (STT) (a). Na planta selvagem, o nível de SCI1 regula a proliferação celular e determina o estágio desenvolvimental correto em que a diferenciação ocorre. Nas plantas de RNAi (SCI1Ri), o nível de SCI1 reduzido permite que as células comecem a se proliferar mais rápido e/ou mais cedo, alcançando o limiar de diferenciação em um estágio mais jovem do desenvolvimento floral. Como estas células vão parar de dividir no mesmo momento do desenvolvimento que a planta selvagem, provavelmente sobre o controle de um fator ainda desconhecido, elas vão acumular um número maior de células. Nas plantas de superexpressão (SCI1OE), o alto nível de SCI1 vai reduzir e/ou atrasar as divisões celulares, que consequentemente vão diferenciar mais tarde. Denovo, o fator desconhecido, que é independente de SCI1, iria regular o momento em que essas células iriam parar a proliferação, resultando em um número reduzido de células especializadas no estigma/estilete (SSZ and STT).

DePaoli,H.C. 2010 

 

Cap

ítulo 1 – SCI1, Stigma/style Cell‐cycle Inhibitor 1 

‐ 70 ‐ 

SCI1 é um regulador do ciclo celular distinto dos inibidores de CDK já descritos em plantas 

Diferentes aspectos do desenvolvimento da planta têm sido estudados para descobrir a

rede molecular por detrás do crescimento e desenvolvimento dos órgãos, culminando com a

descoberta de diferentes classes de genes, como aqueles envolvidos no controle da divisão celular.

Para alcançar esse controle, a célula reconhece diferentes sinais de uma variedade de fontes, que

são transduzidas pelos reguladores do ciclo celular para provocar a ativação ou inibição do ciclo

celular. As CKI/KRPs de plantas, que têm semelhança com os inibidores Kip/CIP de mamíferos,

interagem diretamente com CDK e/ou ciclina e constituem os principais reguladores negativos

destes complexos (ciclina/CDK) para controlar o ciclo celular em plantas (De Veylder et al.

2007). Apesar do seu efeito na inibição de proteínas do ciclo celular, SCI1 não tem nenhuma

semelhança com a seqüência das CKI/KRPs, mesmo quando as regiões mais conservadas do C-

terminal são utilizados em programas de busca (BlastX) ou alinhados de forma independente. Por

outro lado, SCI1 tem uma semelhança limitada, mas reconhecível, com o produto do gene SIM

(Figura 13A), uma nova classe de inibidores de CDK, em uma pequena região que coincide com a

região de semelhança entre SIM e CKI/KRPs (Figura 13B). Foi demonstrado que esta região age

como um domínio de interação com ciclina (Peres et al., 2007). Assim, utilizando o sistema de

complementação de fluorescência (BiFC) encontrou-se que SCI1 interage com ciclina A

(CYCA1;1) in planta, em contraste com as CKIs/KRPs e SIMs que associam com ciclinas do tipo

D (Wang et al., 2000; De Veylder et al., 2001; Jasinski et al., 2002a; Zhou et al., 2002;

Churchman et al., 2006). O significado biológico da especificidade de ligação de SCI1 com essa

classe de ciclinas é desconhecida neste momento.

SCI1 é uma nova classe de inibidores de CDK? Os inibidores de CDK em planta

costumam ter um pequeno peso molecular, contêm motivos conservados, como os domínios de

ligação a ciclina (Tabela 3), e estão exclusivamente presentes no núcleo das células (Wang et al.

2008), características presentes em SCI1. Na verdade, as CDKs se tornam ativas somente após

complexar com ciclinas, e foi mostrado que SCI1 tem uma ligação direta com a maquinaria do

ciclo celular pela sua capacidade de interagir com ciclinas do tipo A. Assim, com base nos

fenótipos das plantas transgênicas de SCI1, nos resultados de interação proteína-proteína e em

conformidade com o modelo atual para o controle da proliferação/diferenciação celular (De

Veylder et al. 2007), é plausível sugerir que a atividade de CDK está sendo alterado em plantas

SCI1OE e SCI1Ri. No entanto, ainda é um mistério se SCI1 seqüestra as ciclinas do tipo A ou

forma um complexo com os heterodímeros de ciclina/CDK para inibir a

proliferação/diferenciação tecido-específica.

Todas as CKI/KRPs de plantas superexpressas até agora causaram um crescimento global

reduzido, folhas serrilhadas e flores anormais (Wang et al., 2000; De Veylder et al., 2001; Jasinski

et al., 2002a; Zhou et al., 2002; Ren et al., 2008). Em contraste com CKI/KRPs e SIMs, plantas

DePaoli,H.C. 2010 

 

Cap

ítulo 1 – SCI1, Stigma/style Cell‐cycle Inhibitor 1 

‐ 71 ‐ 

transgênicas de SCI1 apresentaram um fenótipo tecido-específico. Apenas pistilos e anteras foram

afetados como conseqüência da superexpressão conduzida pelo promotor 35S, o que significa que

SCI1 depende de um “background” celular específico para inibir o ciclo celular e, em seguida,

regular a organogênese. Como as ciclinas do tipo A são amplamente expressas na planta inteira

(Menges et al. 2005), esse controle é provavelmente dependente de modificações pós-traducionais

tecido-específicas (por exemplo, eventos de fosforilação e desfosforilação, Figura 1B) e/ou

ocorrer através de interação(ões) com um alvo(s) tecido-específico(s). Desvendar um regulador do

ciclo celular que atua de forma tecido-específica sugere a existência de proteínas com funções

semelhantes em outros tecidos vegetais. Assim, propomos que SCI1 representa uma nova classe

de inibidores de CDK, distinta das CKI/KRPs e SIMs, e a existência então de pelo menos três

classes de inibidores de CDK: a) CKI/KRPs (inibidores de CDK e proteínas relacionadas a KIP),

b) SIMs (proteínas SIAMESE e relacionadas à SIAMESE); ambas amplamente expressas nos

tecidos da planta e com uma alteração direta na atividade de CDK e; c) TICK (inibidores de CDK

tecido-específicos – “Tissue-specific Inhibitors of CDK”), que têm tecido-especificidade e

interagem com ciclinas, provavelmente regulando a atividade de CDK de forma indireta. SCI1

seria assim o primeiro membro da classe TICK (Figura 13C).

Figura 13 – Análise de seqüências entre SCI1 e as classes de reguladores do ciclo celular mais relacionados. (A) Similaridade entre NtSCI1 e AtSIM revelada por BLASTp de duas sequencias. A região sublinhada em negrito representa o domínio conservado entre AtSIM e a classe de CKI/KRPs conforme descrito por Churchman et al. (2006). Essa região inclui um dos domínios de interação com ciclina reconhecidos na sequencia da proteína NtSCI1. (B) Alinhamento entre NtSCI1, AtSIM e os membros da família de CKI/KRPs mais relacionados, na região conservada entre os inibidores de CDK (descrita por Churchman et al., 2006). O alinhamento foi produzido pelo programa Multalign (http://www.expasy.org/tools/#align). Note os dois resíduos de Fenilalanina (F) conservados e a região bastante carregada antes dela presente em todas as proteínas alinhadas. (C) Árvore filogenética gerada pelo programa ClustalW2, feita a partir das sequencias mostradas em B. As cores foram inseridas para facilitar a visualização das três classes diferentes de reguladores do ciclo celular (CKI/KRPs, SIM e SCI1).

DePaoli,H.C. 2010 

 

Cap

ítulo 1 – SCI1, Stigma/style Cell‐cycle Inhibitor 1 

‐ 72 ‐ 

Tabela 3 – Sequencias de amino ácidos de cada domínio de interação depositado no ELM (Eukaryotic Linear Motif) identificados nas proteínas NtSCI1 e nos inibidores de CDK, descritos em N. tabacum e outros organismos relevantes.

Genes  Domínios ELM 

  LIG_APCC D/KEN box 

LIG CYCLIN_1 

MOD_CDK MOD ProDKin_1 

LIG MAPK_1 MOD CK1_1  MOD CK2_1 

NtSCI1  ‐  KNLFF RDLF 

‐ DKKTPEE KRSSPSS SPSSPRD 

KDKKNLFF SSPSSPR  SPSSPRD  SHSSEEK  SDLSSET  SSETARD 

DKKTPEE  KDKSKKE  KSHSSEE 

SIM  ‐  RKLM  ‐ GCTTPTS TATTPPP  PPSTPSS 

‐ STPSSLG  SSTTTAI  STTTAIT  SFRSCSR 

TSLSKYE 

SRM1    RKLLV  KLLV 

NFPTPIK NFPTPIK RCSTPTS  VVDSPPP 

RSCKRKLLV SKTSKTK  STPTSQE  SAPSATA 

STPTSQE  LLVSTCE 

SRM2    KDLRF  SLCTPTS RKRPREISL KRPREISL  

KKTRLSKDLRF  KTRLSKDLRF 

SLCTPTS LLETLEE  KPRSQEE  QDSSKKE 

SRM3    RKLTP  GCKTPTS RKLTPVN 

KRKLTPVNV RKLTPVNV 

SSGTKRK  RLPTRPE  IPDSDHE  EDPTVNE 

NtaKIS2  EREVLE  SRRRLT PKENA 

KSLDL  ‐ SLVTPTSELSSPKE 

KSKGIGEMTV SLVTPTS  SELSSPK  SNGSSKS  SSKSLDL  SKESIKA 

GEMTVME  CVRSHSE  ELSSPKE  PSETDLE 

NsKIS1  LKEND  ‐  RERTPEK KLISPAL VGDTPAG  NLVSPSG  RERTPEK 

‐ SCCSRNG  SAESKEA 

RNGSTEE  KLSSERE  KMPSEKE 

NtKIS1*  ‐  ‐  RQRTPEK KLMSPPL VGDTPAG  SLVSPSS  RQRTPEK 

RKCKGIEEVTI KCKGIEEVTI 

SLVSPSS  SPSSSVN  SAESKEA 

EEVTIME  RNGSSEE  KMPSEKE 

AtKRP1  ‐  KELI RKLF 

‐ ‐ RSRRIVYV RSEKSSSVSV  KKKELIHL  KKELIHL 

SEKSSSV  SSVSVVG  SSCSGSN 

GRKTMEE  ETVTAEE  EMPTESE  PTESEIE 

AtKRP2  SRIILS  SRRRLR  LRKSLH  LRNKLL 

‐  ‐ IILSPCV RRDSPPV 

KRRKMEEEVDL RRKMEEEVDL  RKMEEEVDL  KSKRRIEFVDL  KRRIEFVDL  RRIEFVDL 

SETSVVI  SSVSCCS  SCCSTSE  SEESMNM 

SCCSTSE  CCSTSEE  LRKSLHE  LHETVKE 

Nta, Nicotiana tabacum; Ns, Nicotiana sylvestris; Nt, Nicotiana tomentosiformis; At, Arabidopsis thaliana. *As isoformas NtKIS1a e NtKIS1b (variantes de splicing) têm os mesmos domínios identificados. O símbolo “-” significa que o domínio em questão está ausente ou não obteve um valor acima do limiar estabelecido pelo ELM para ser significativo. LIG_APCC Dbox_1/KENbox_2, motivos contendo RXXL e KEN, respectivamente, que ligan nos componentes do complex APC/C, Cdh1 e/ou Cdc20, direcionando a proteína para degradação dependente do ciclo celular através do proteassoma 26S. Dbox .R..L. , KEN .KEN.; LIG CYCLIN_1, Sítio de reconhecimento do substrato que interage com ciclina e aumenta a fosforilação por complexos ciclina/CDK. A protein também deve ter o sítio MOD_CDK, que também é usado por inibidores de ciclinas [RK].L.{0,1}[FYLIVMP]; MOD_CDK, Motivo do substrato para fosforilação por CDK, ...([ST])P.[KR] MOD ProDKin_1, Sítio de fosforilação pela quinase direcionada por prolina (Proline-Directed Kinase, e.g. MAPK, CDK-like kinases) em eucariotos superiores, ...([ST])P..; LIG MAPK_1, Moléculas de interação com MAPK (e.g. MAPKKs, substratos, fosfatases) carregam o domínio de ligação que ajudam a regular interações específicas na cascada de MAPK,o motivo clássico se aproxima a (R/K)xxxx#x# onde # é um resíduo hidrofóbico, [KR]{0,2}[KR].{0,2}[KR].{2,4}[ILVM].[ILVF]; MOD CK1_1 e MOD CK2_1, Sítios de fosforilação por CK1 e CK2, S..([ST])... e ...([ST])..E , respectivamente. Números de acesso: SIM (At5g04470); SMR1 (At3g10525); SMR2 (At1g08180); SMR3 (At5g02420); N. tabacum NtaKIS2 (CAD56868); N. sylvestris NsKIS1 (CAC82732); N. tomentosiformis NtKIS1a (CAC82731); N. tomentosiformis NtKIS1b (CAC82734); A. thaliana AtKRP1 (NP_179924); A. thaliana AtKRP2 (NP_190632).

DePaoli,H.C. 2010 

 

Cap

ítulo 1 – SCI1, Stigma/style Cell‐cycle Inhibitor 1 

‐ 73 ‐ 

SCI1 está localizada no núcleo, como demonstrado aqui em células de folhas

transientemente transformadas com o gene quimérico 35SPROM:SCI1-GFP. Portanto, a sua

localização nuclear é independente da interação (s) com o proteínas específicas do estigma/estilete

ou fosforilações resultantes da transdução de sinais específicos do estigma/estilete. A proteína de

fusão SCI1-GFP confirmou a presença do NLS previsto e exibiu duas localizações distintas:

predominantemente no interior do nucléolo, e distribuída no nucléolo e em corpos nucleares,

sempre colocados na região da intercromatina. Apesar da sua participação bem conhecida na

biogênese dos RNAs ribossomais (rRNA) e dos pequenos RNAs nucleolares (snoRNA), o

nucléolo foi recentemente considerada uma estrutura nuclear multifuncional, exercendo funções

em diferentes tarefas, tais como no controle do ciclo celular (Zimber et al., 2004 ). Foi

demonstrado que alguns reguladores do ciclo celular são seqüestrados no nucléolo, o que aponta

para um papel desta organela na regulação da sua atividade (Visintin e Amon, 2000). Além disso,

demonstrou-se que as mudanças na arquitetura e organização funcional das organelas nucleares

acompanham a troca de um programa desenvolvimental e a ativação da atividade proliferativa das

células vegetais (Testillano et al., 2005; Echeverría et al. , 2007). A compartimentalização dos

corpos nucleares também foi descrita para a proteína de Arabidopsis ICK1/KRP1 (Zhou et al.,

2006) e para NtKIS1a, quando esta foi co-expressa com a proteína AtAJH1, o homólogo em

plantas de JAB1 de humanos (domínio de ativação da proteína c-Jun 1), uma proteína que

acredita-se ser a responsável por medear a degradação do inibidor de CDK p27KIP1 (Le Foll et al.,

2008). Dessa forma, propõe-se que a distribuição de SCI1-GFP no nucléolo e sua movimentação

para corpos nucleares pode estar ligada a diferentes destinos da célula ou diferentes fases do ciclo

celular durante o desenvolvimento do pistilo, o que é coerente com a participação de SCI1 no

controle da proliferação/diferenciação celular.

SCI1 conecta a sinalização de auxina e o controle da divisão/diferenciação celular? 

As células iniciais do carpelo são um grupo pequeno de células capazes e comprometidas

a se dividirem e diferenciarem para originar o pistil adulto. Tal processo desenvolvimental inclui

principalmente a organogênese mediada por hormônio associada à divisão e diferenciação

cellular. Frequentemente, a alteração do tamanho final do órgão é uma das conseqüências de uma

sinalização hormonal modificada (Nemhauser et al., 2000; Krizek, 2009). Considerando que o

fenótipo do stigma/estilete de plantas de tabaco SCI1Ri são análogos aos pistilos de Arabidopsis

tratados com NPA (Nemhauser et al., 2000), investigou-se a possibilidade de alguns genes de

resposta à auxina estarem sendo influenciados pelo nível de expressão de SCI1.

Como mencionado anteriormente, a família de fatores de transcrição Aux/IAA e ARF são

reguladores chaves com funções bem caracterizadas na resposta a auxina. Recentemente, Jurado

et al. (2008) relataram a estabilização do heterodímero E2Fc/DPB, um regulador negativo do

DePaoli,H.C. 2010 

 

Cap

ítulo 1 – SCI1, Stigma/style Cell‐cycle Inhibitor 1 

‐ 74 ‐ 

ciclo celular, mostrando que divisão celular, diferenciação e a sinalização de auxina têm algumas

interseções moleculares. O mutante de Arabidopsis “auxin insensitive mutant” msg2-1, que

codifica a protein Aux/IAA19, é deficiente na indução dos genes Aux/IAA4, DFL1 (DWARF IN

LIGHT 1) e SAUR-AC1 após o tratamento com o hormônio auxina, quando comparado com a

alta indução observada em plantas selvagens (Tatematsu et al., 2004). Os genes Aux/IAA4, DFL1

and SAUR-AC1 pertencem, respectivamente, às três classes de genes de resposta rápida à auxina

(Aux/IAA, GH3 e SAUR - small auxin up RNA), que são diretamente influenciadas pelo

tratamento com auxina. Dessa forma, a expressão alterada desses três genes no mutante msg2-1

coloca o Aux/IAA19 nas etapas primárias da resposta a auxina. Alterar os níveis de SCI1 pra

baixo ou para acima do nível encontrado na planta selvagem pode alterar, respectivamente, para

baixo ou para cima, os níveis do NtAux/IAA19, indicando que SCI1 está, de alguma forma,

ligado a uma regulação positiva da expressão de NtAux/IAA19. O homólogo do NtAux/IAA19

em arroz, OsIAA3, é preferencialmente expresso em folhas e tem sua expressão diminuída em

plântulas tratadas com “2,4-dichlorophenoxyacetic acid” (2,4-D), um análogo da auxina (Jain et

al., 2006). Em concordância, nas plantas SCI1Ri, as quais mostraram um aumento no número de

células da SSZ e STT, o nível de transcritos de NtAux/IAA19 está diminuído, o que, por

conclusão, parece simular uma indução da divisão celular por auxina. Da mesma forma, o

Aux/IAA19 e o Aux/IAA13, que em Arabidopsis são reprimidos por auxina (Weijers et al., 2005),

tiveram seus níveis de transcritos aumentados nas plantas SCIOE, que mostraram um número

reduzido de células. Ao mesmo tempo, a superexpressão de SCI1 resultou no aumento de

transcritos do gene equivalente ao ARF8 de Arabidopsis. Este gene, ARF8, mostrou ser

responsável pela repressão da elongação celular através da redução dos níveis de IAA livre (Tian

et al., 2004). Com isso, a correlação entre a indução da expressão de NtAux/IAA19,

NtAux/IAA13 e NtARF8 com um número reduzido de células com tamanho normal é totalmente

coerente com o fenótipo observado nas plantas SCI1OE e aponta pra um contínuo equilíbrio do

crescimento do órgão. Por outro lado, a expressão inalterada de NtARF8 e NtAux/IAA13 nas

plantas SCI1Ri suggere que a ativação desses genes pode ser suprida por outros fatores na ausência

de SCI1. Em conjunto, nossos resultados sugerem que SCI1 está, de alguma forma,

interconectado com a via de sinalização por auxina durante seu controle na divisão celular e na

diferenciação do estigma/estilete (Figura 14).

DePaoli,H.C. 2010 

 

Cap

ítulo 1 – SCI1, Stigma/style Cell‐cycle Inhibitor 1 

‐ 75 ‐ 

Figura 14: Modelo molecular proposto para o mecanismo de ação de SCI1 no desenvolvimento da parte superior do pistilo. Ciclinas e CDKs devem interagir para iniciar/progredir a proliferação celular. SCI1 interage com ciclina A (CYCA) para inibir a proliferação/diferenciação no início do desenvolvimento do pistilo (barra de ponta reta). Existe uma contribuição da via de auxina no controle da proliferação/diferenciação (seta pontilhada), a qual acreditamos que SCI1 faça parte.

Resumidamente, nossa caracterização inicial dessa proteína rica em lisina, SCI1, revelou

uma nova classe de proteínas, capaz de inibir o ciclo celular de forma tecido específica. Nós

acreditamos que SCI1 é uma molécula sinalizadora que influencia o desenvolvimento da parte

superior do pistilo, inibindo a proliferação/diferenciação celular, provavelmente através da

interação com ciclinas do tipo A. A função de SCI1 é muito provavelmente modulada por

diferentes interações proteína-proteína e por eventos de fosforilação, possivelmente tendo

interseções moleculares com a via de sinalização por auxina.

DePaoli,H.C 2010 

 

Cap

ítulo 2 – SCI1 e auxina 

‐ 76 ‐ 

- Capítulo 2 -

Caracterização do gene SCI1 na via de sinalização de auxina do pistilo

Henrique C. DePaoli 1,2,3,4, Yunde Zhao3,4 e Maria Helena S. Goldman 1

1 Departamento de Biologia, Faculdade de Filosofia, Ciências e Letras de Ribeirão Preto, Universidade de São Paulo, Brazil 14040-901 2 PPG Genética, Faculdade de Medicina de Ribeirão Preto, Universidade de São Paulo, Brazil 14049-900 3 Department of Cell & Developmental Biology, University of California San Diego, La Jolla, CA/USA 92093 4 SALK Institute for Biological Studies, La Jolla, CA/USA 92037

DePaoli,H.C 2010 

 

Cap

ítulo 2 – SCI1 e auxina 

‐ 77 ‐ 

RESULTADOS 

 

Identificação e análise de SCI1 em Arabidopsis: AtSCI1 

O gene NtSCI1, um gene que controla a divisão e diferenciação em estigmas/estiletes de

Nicotiana tabacum, foi descrito e caracterizado (Capítulo 1). O gene ortólogo em Arabidopsis,

AtSCI1 (At1g79200), foi identificado em uma busca por homologia em banco de dados como o

TAIR (“The Arabidopsis Information Resource”), utilizando a ferramenta BlastX (Altschul et al.,

1997), e é mostrado na Figura 1A. AtSCI1 compartilha 65% de identidade e 86% de similaridade

com NtSCI1. Esta busca demonstrou que, assim como em N. tabacum, AtSCI1 é um gene único

no genoma de Arabidopsis, não pertencendo a uma família multigênica,. No domínio II da

proteína encontram-se os putativos sinais de localização nuclear (Figura 1C, roxo), e o domínio

rico em lisina (Figura 1C, vermelho). AtSCI1 também possui vários sítios potenciais de

fosforilação, como em NtSCI1 (Figura 1B).

Figura 1 – Comparação da estrutura primária do produto gênico de NtSCI1 e AtSCI1. (A) Alinhamento entre as seqüências de aminoácidos dos dois ortólogos NtSCI1 e AtSCI1. As identidades estão destacadas por asteriscos e a similaridade (aminoácidos de propriedades fisico-quimica semelhantes) por pontos (ClustalW). (B) Predição de fosforilação para as proteínas NtSCI1 e (C) AtSCI1 (NetPhos). Os possíveis sítios de fosforilação estão indicados em azul (serinas), verde (treonina) e vermelho (tirosina), e a probabilidade de receberem o grupo fosfato varia de 0 a 1 (100%). As setas pretas acima do gráfico representam os domínios de SCI1 (I, II e III, da esquerda para a direita, Capítulo 1 - Figura 2). As caixas coloridas são: domínio rico em lisina (vermelho), sinal de localização nuclear (roxo) e domínios de interação com ciclinas (azul claro). Há 2 domínios putativos de interação com ciclinas em NtSCI1 e apenas 1 em AtSCI1, correspondendo exatamente à posição do segundo de NtSCI1 (RDLF em NtSCI1 e RGLF em AtSCI1).

DePaoli,H.C 2010 

 

Cap

ítulo 2 – SCI1 e auxina 

‐ 78 ‐ 

Caracterização do locus At1g79200 (AtSCI1) de Arabidopsis thaliana 

O gene órtologo a NtSCI1 em Arabidopsis, At1g79200 (AtSCI1), é composto por uma

região promotora curta, seguida por 4 exons e 3 introns (Figura 2A), codificando uma proteína de

159 aminoácidos. Para comparar o fenótipo de perda de função nas plantas de Arabidopsis com as

plantas de RNAi em N. tabacum, foram analisadas todas as 5 inserções de T-DNA disponíveis

para esse locus (Atsci1-1 a Atsci1-5; Figura 2A).

A primeira linhagem (Atsci1-1; SALK_005710.29.99) mostrou ser uma inserção

localizada na região promotora, na posição -232. Essa inserção foi capaz de reduzir o nível de

transcritos de AtSCI1 pela metade em plantas homozigotas e heterozigotas (Figura 2C), quando

comparadas com a planta selvagem, e demonstrou ser haplóide insuficiente, ou seja, além da

homozigose (Atsci1-1-/-), também apresenta perda de função quando em heterozigose (Atsci1-1+/-)

(Figura 2Db). A parte superior do pistilo das plantas Atsci1-1 demonstrou um fenótipo similar ao

descrito para as plantas de RNAi de N. tabacum, com um aumento da estrutura estigmática e

elongação do estilete (Figuras 2Ba painel do meio; 2Db, 2Dc), quando comparado com a

variedade selvagem Col-0 (Figura 2Ba painel da esquerda, 2Da). Estas plantas são parcialmente

estéreis, com poucas flores se desenvolvendo em siliquas por autopolinização natural (Figura 2E).

Isto ocorre devido a diferenças no comprimento dos órgãos masculinos e femininos, uma vez que

os estigmas saem da corola antes da abertura e maturação da flor e dos estames (Figura 2E, painel

da direita). Nenhuma outra parte aérea da planta demonstrou ser fenotipicamente alterada quando

comparada macroscopicamente com a planta selvagem, variedade Col-0. Para confirmar que as

alterações fenotípicas observadas vieram da inserção do T-DNA no locus At1g79200, plantas de

Arabidopsis background Atsci1-1-/- foram transformadas com a construção 35S:SCI1FL (FL =

“full length”, exons 1,2,3 e 4), para tentar restaurar o fenótipo selvagem. Como pode ser visto na

Figura 2Dh, a superexpressão de AtSCI1 complementou totalmente o mutante Atsci1-1.

A segunda linhagem de T-DNA (Atsci1-2; SAIL_31_D10.v1) tem uma inserção

localizada no começo do terceiro íntron, na posição genômica +882 (Figura 2A). Essa inserção

atrapalha a excisão adequada do terceiro intron (Figura 2Bb, painel de cima), produzindo uma

nova proteína com os primeiros 3 exons originais (Figura 2Bb, painel de baixo) mais 41

aminoácidos provenientes da tradução do T-DNA. Surpreendentemente, os pistilos da planta

Atsci1-2, assim como o restante da planta, mostraram ser muito semelhantes à planta selvagem

(Figura 2Ba, painel da direita), sugerindo que, de alguma forma, a proteína truncada deve ser

funcional. Para confirmar essa funcionalidade, transformou-se plantas de Arabidopsis background

Atsci1-1-/-, que têm um fenótipo de perda de função, com uma construção que superexpressava

apenas os três primeiros exons de AtSCI1, 35S:SCI1123 (123 = exons 1,2 e 3). Como pode ser

observado na Figura 2Di, a versão truncada da proteína complementou totalmente o mutante

DePaoli,H.C 2010 

 

Cap

ítulo 2 – SCI1 e auxina 

‐ 79 ‐ 

Atsci1-1, restaurando o fenótipo selvagem, justificando a semelhança de Atsci1-2 com a planta

selvagem.

Figura 2 – Caracterização do gene AtSCI1. (A) Estrutura genômica indicando as inserções de T-DNA disponíveis. (B) (a) Fenótipo dos mutantes Atsci1-1 e Atsci1-2 comparados com a planta selvagem. Note o estigma/estilete mais desenvolvido em Atsci1-1, como observado nas plantas de RNAi de N. tabacum (Capítulo 1). Barra de escala é de 1mm. (b) Gel de agarose 1% com o resultado de um RT-PCR que demonstra que o mutante Atsci1-2 transcreve os exons 1,2 e 3 de AtSCI1, mas não o transcrito completo com os 4 exons. (C) Análise de expressão por RT-PCR do gene AtSCI1 no mutante Atsci1-1+/- e Atsci1-1-/-

(hetero e homozigoto, respectivamente). O nível de expressão em unidades arbitrárias (U.A.) foi obtido dividindo-se o valor de expressão do gene SCI1 nos mutantes (normalizado pelo gene da poliubiquitina), pelo valor de expressão do gene SCI1 na planta selvagem (também normalizado pelo gene da poliubiquitina), multiplicado por 100 (%). Os resultados são a média de 3 replicatas biológicas independentes. (D) Fenótipo do mutante Atsci1-1 (Db, Dc e Df), e de superexpressão de SCI1 (35S:SCI1FL; Dd) e YFP-SCI1 (35S:YFP-SCI1FL; Dg). Note as alterações nas estruturas estigmáticas, comparadas com a planta selvagem, variedade Col-0 (a e e). Observe que o mutante heterozigoto (Atsci1+/-) possui um fenótipo parecido com o homozigoto Atsci1-1-/-, o que demonstra que esta inserção é haplóide insuficiente. Dh e Di são os testes de complementação realizados no “background” do mutante Atsci1-1-/- (sci1), superexpressando SCI1 “full length” (35S:SCI1FL) e truncada (exons 1,2 e 3; 35S:SCI1123), respectivamente. Note que ambas as formas, SCI1FL e SCI1123 foram capazes de restaurar o fenótipo selvagem. Barras de escala representam 200µm. (E) Fenótipo das plantas adultas Col-0 (esquerda) e Atsci1-1 (direita), demonstrando a esterilidade parcial da planta mutante para SCI1 (setas brancas indicando siliquas abortadas). A esterilidade parcial é causada pela projeção do estigma para fora da corola já nos estágios iniciais do desenvolvimento floral (microscopia eletrônica de varredura, paineis inferiores; note que na planta selvagem o estigma ainda está dentro da corola, aberta nesta imagem artificialmente). Barras de escala são 1cm para as plantas e 200µm para a microscopia eletrônica.

DePaoli,H.C 2010 

 

Cap

ítulo 2 – SCI1 e auxina 

‐ 80 ‐ 

Conforme o esperado pelos resultados descritos acima, a inserção no exon 4, Atsci1-4

(SALK_142445.50.60.x), que tem somente os últimos 18 aminoácidos originais deletados,

mostrou um fenótipo semelhante à planta selvagem, de forma similar ao que foi observado em

Atsci1-2. As linhagens Atsci1-3 (SALK_137501.54.50.x) e Atsci1-5 (SALK_083219.53.50.x),

disponíveis no banco de dados como mutantes para este locus, nunca demonstraram uma inserção

e são totalmente selvagens (fenotípica e genotipicamente). Dessa forma, não há nenhuma planta

de perda de função (“knockout”) disponível para o locus At1g79200; apenas um mutante de perda

parcial de função (“knockdown”), Atsci1-1, que foi a selecionado para todos os nossos

experimentos, referido de agora em diante como sci1.

Para complementar as análises de perda de função no locus At1g79200, transformou-se

plantas selvagens de Arabidopsis com a construção 35S:SCI1FL. Em paralelo, transformou-se

plantas de Arabidopsis com a construção 35S:YFP-SCI1FL, que tem a proteína amarela

fluorescente, YFP (yellow fluorescent protein), fusionada à extremidade amino-terminal de SCI1.

Entre as 6 plantas de 35S:SCI1FL analisadas por microscopia eletrônica de varredura (MEV), 5

plantas demonstraram uma região estigmática reduzida, com bem poucas células papilares (Figura

2Dd). Este fenótipo é exatamente como o descrito para N. tabacum (NtSCI1OE) e corresponde ao

fenótipo contrário ao apresentado por sci1-1. É interessante notar que as plantas 35S:YFP-SCI1FL

(n= 5) mostraram um fenótipo semelhante ao das plantas 35S:SCI1FL, mas com uma menor

intensidade, sugerindo que a proteína YFP-SCI1 seja parcialmente funcional, ou seja,

parcialmente capaz de inibir a proliferação celular (Figura 2Dg).

Análise da região promotora e de expressão do gene AtSCI1 

Para ter uma melhor compreensão da região promotora de AtSCI1, foram produzidas

plantas transgênicas expressando o gene quimérico GFP-GUS (fusão da proteína verde

fluorescente – GFP - com a proteína da beta-glucuronidase - GUS) sobre controle do promotor de

AtSCI1. Para determinar a região promotora de AtSCI1, analisou-se a seqüência genômica de

1924 pares de bases no programa PLACE (plant cis-acting elements), para identificar os possíveis

elementos regulatórios presentes em AtSCI1 e direcionar nossos experimentos. A região acima do

códon de início da tradução de AtSCI1 (At1g79200) e abaixo do códon de parada da tradução do

locus At1g79190, é composto de apenas 287 pares de bases. Nesta região foram encontrados

alguns elementos como TATA box (TTATTT, posições -31 e -147), o sítio de ligação ao fator de

transcrição LEAFY (CCAATGT, posição -138) e um sítio (GTTTAAGTGT, posição -97)

bastante similar ao sítio de ligação do fator de transcrição APETALA3 (GTTTAGGTGT). Em

contrapartida, alguns elementos, considerados importantes pela função conhecida do gene, foram

encontrados na região intragênica, ou seja, fora da putativa região promotora (entre as regiões

codificadoras dos genes At1g79190 e At1g79200). Estes elementos foram o sítio de ligação da

DePaoli,H.C 2010 

 

Cap

ítulo 2 – SCI1 e auxina 

‐ 81 ‐ 

proteína WUSCHEL (TTAATGG), encontrado na posição +540, localizada no íntron 2 de

AtSCI1. Este sítio também está presente no gene NtSCI1 (Strini, 2010), no qual localiza-se no

íntron 3. O sítio de ligação do fator de transcrição WUSCHEL está presente ainda no íntron 2 do

gene AGAMOUS, o qual é ativado por WUSCHEL (Lohmann et al., 2001). Foram também

encontrados sítios de ligação de membros da família de fatores de transcrição Myb (AACGG),

nas posições +545 e +1055, íntrons 2 e 3, respectivamente, os quais estão presentes no promotor

de ciclina B1;1, e um sítio (TGTTG) na posição +614, íntron 2, de ligação do fator de transcrição

RAV1-A, uma proteína que contém os domínios “APETALA2-like” e “B3-like”. Baseado nesses

resultados in silico, decidiu-se realizar as construções de fusão, com GFP-GUS, com duas

seqüências diferentes: SCI1PROM1, composto pelos 287 pares de base acima do códon de início da

tradução; e SCI1PROM2, composto por estes mesmos 287 pares de base, acrescidos de 1101 pares

de bases abaixo do códon de início da tradução (compreendendo os exons 1, 2, 3 e 10

aminoácidos do exon 4, e os introns localizados entre estes exons) (Figura 3Aa). Dessa forma, os

dois “promotores” foram fusionados à quimera GFP-GUS e utilizados para transformar plantas

selvagens de Arabidopsis. Dentre as 24 plantas analisadas para a construção SCI1PROM1:GFP-

GUS, somente 4 plantas mostraram alguma coloração azul, sendo que apenas duas tiveram

resultados semelhantes (Figura 3Ab), com alguma expressão no pistilo em estágios jovens.

Adicionalmente, essas plantas apresentaram, respectivamente, expressão em pétalas (Figura 3Ab,

painel esquerdo) e no contorno das anteras (Figura 3Ab, painel direito). Não foram obtidas plantas

com a construção SCI1PROM2:GFP-GUS até o momento.

Para estudar o padrão de expressão de AtSCI1 em plantas de Arabidopsis, utilizou-se os

dados disponíveis no “Bio-Array Resource” (BAR; Toufighi et al., 2005), um banco de dados que

reúne, entre outras informações, resultados de expressão por microarranjo. Esses resultados são

agrupados em diferentes categorias, dependendo dos padrões que foram estabelecidos com base

nas necessidades de cada estudo. Dessa forma, todos os tecidos/órgãos de Arabidopsis, que

tinham o resultado da análise de expressão do locus At1g79200 na categoria “desenvolvimento”,

foram selecionados. Os tecidos e os níveis de expressão das 25 amostras analisadas podem ser

observados na Figura 3B. Pode-se observar que o gene AtSCI1 foi transcrito nos tecidos de raiz,

meristema apical, transição de meristema apical para meristema floral, meristema floral, pétalas

jovens, estames jovens, carpelo jovem e carpelo quase maduro (Figura 3Ba). Os outros tecidos

não apresentam uma expressão significativa baseada no limiar proposto pelo programa BAR

(http://bar.utoronto.ca/). Dentre esses tecidos, o nível de expressão mais significativo foi em

carpelos no estágio 9, o que sugere que em Arabidopsis o gene SCI1 também é preferencialmente

expresso em pistilos. O banco de dados não possui dados de expressão para os tecidos florais em

estágios bem jovens (abaixo do 9), como foi estudado em N. tabacum (Capítulo 1, Figura 8C).

Uma vez que AtSCI1 apresentou expressão em tecidos meristemáticos, explorou-se a

possibilidade de sua expressão estar alterada em mutantes conhecidamente importantes para a

DePaoli,H.C 2010 

 

Cap

ítulo 2 – SCI1 e auxina 

‐ 82 ‐ 

formação e desenvolvimento do meristema floral. AtSCI1 não apresentou alteração transcricional

significativa em nenhum dos sete mutantes analisados (Figura 3Bb).

Figura 3 – Análise da expressão gênica de SCI1. (Aa) Esquema indicando a região genômica correspondente ao “promotor 1” (SCI1PROM1) e “promotor 2” (SCI1PROM2) (linhas/caixas pretas) dentro da estrutura genômica de AtSCI1 (linhas/caixas cinzas). As “caixas” representam exons e as “linhas”, os introns. (Ab) Coloração de GUS para a construção SCI1PROM1:GFP-GUS. As setas amarelas ressaltam as marcações que aparecem no pistilo. (B) Expressão gênica de AtSCI1 extraída do “Bio-Array Resource” (BAR) em (a) diferentes tecidos e (b) meristema floral (selvagem e de alguns mutantes) em Arabidopsis. O sinal do arranjo representa os valores associados à fluorescência de SCI1, já normalizados e filtrados, em três replicatas biológicas independentes (para detalhes vide Material e Métodos). Cotyledon, cotilédones; hypocotyl, hipocótilo; seedling, plântula; root, raiz; rosette leaves, folhas; stem, caule; SAM, meristema apical; SAMFM, transição para meristema floral; FM, meristema floral; flower, flor; sepal, sépalas; petal, pétalas; stamen, estames; carpel, carpelo (estigma/estilete/ovário); st, estágios (9, 12 e 15); lfy, LEAFY; clv, CLAVATA; ap, APETALA; ag, AGAMOUS; ufo, (UNUSUAL FLORAL ORGANS).

DePaoli,H.C 2010 

 

Cap

ítulo 2 – SCI1 e auxina 

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SCI1 atua no desenvolvimento, dependente de auxina, do pistilo  

Após a caracterização inicial do gene AtSCI1 de Arabidopsis, foi iniciada a investigação

sobre a relação de SCI1 com a via de auxina, sugerida no final do Capítulo 1, pela semelhança das

plantas transgênicas de N. tabacum com plantas onde a via de auxina estava alterada e pela

alteração da expressão de três genes da família ARF/Aux/IAA nos pistilos de plantas transgênicas

SCIRi e SCIOE de N. tabacum.

Inicialmente, foi analisada a resposta de DR5:GUS à auxina no “background” selvagem

(Col-0) e no mutante sci1-1 (daqui para frente denominado apenas sci1). O promotor DR5:GUS

corresponde a uma região sintética de DNA que, na presença de auxina, ativa a transcrição do

gene repórter GUS (Sabatini et al., 1999). Conforme observado na Figura 4A, sci1 tem uma

resposta reduzida da expressão do repórter à auxina no meristema da raiz (4Ad), e também em

alguns pontos do pistilo jovem (4Af), mas não na formação de raiz secundária ou nas anteras

(4Ab e 4Af, respectivamente). Considerando o padrão de expressão de AtSCI1, esses dados

indicam que SCI1 é necessário para a correta ativação da sinalização por auxina nestes tecidos.

Adicionalmente, de posse do fenótipo do mutante sci1, observou-se que o duplo mutante

yuc2yuc6 (Cheng et al., 2006) tinha pistilos muito parecidos com os de sci1 (Figura 4Bc).

Adicionalmente, foram analisados dois mutantes deficientes na sinalização de auxina neste órgão,

pid336 e npy1. Os resultados demonstraram que, em flores maduras, os três mutantes

apresentaram uma estrutura estigmática aumentada (Figura 4Bc, 4Bd e 4Be) quando comparados

com a estrutura da planta selvagem (Col-0, Figura 4Ba). Entre esses três, o mutante deficiente em

síntese de auxina yuc2yuc6 foi o que apresentou a maior estrutura estigmática. Coerentemente, o

estilete também apareceu mais elongado nos mutantes yuc2yuc6, pid336 e npy1, conforme

observado em imagens de contraste de fase (DIC) (Figura 4Dc, 4Dd e 4De, respectivamente).

Para confirmar que o fenótipo apresentado em sci1 era ocasionado pela alteração do número de

células, conforme demonstrado em N. tabacum (Capítulo 1), além das análises de MEV foram

realizadas seções longitudinais no pistilo de sci1. Conforme pode ser observado na Figura 4Db e

4Eb, o número de células está bem aumentado na porção superior do pistilo de Arabidopsis.

Assim, foi observado que a redução da expressão de SCI1, em mutantes sci1, para um nível

próximo da metade do nível presente na planta selvagem, é suficiente para gerar o fenótipo de

aumento de tamanho do estigma/estilete, o qual é conseqüência de uma maior proliferação

celular. Semelhantemente, o aumento do tecido estigmático nos mutantes yuc2yuc6, pid336 e

npy1 é conseqüência de uma maior proliferação celular (Figura 4Ec, 4Ed e 4Ee, respectivamente).

De forma notável, o nível de expressão de SCI1 é reduzido nesses mutantes para um nível similar

ao observado no mutante sci1. Com isso, é possível sugerir que a redução do nível de expressão

de SCI1 nos mutantes yuc2yuc6, pid336 e npy é a causa do aumento da proliferação celular

observada na parte superior do pistilo desses mutantes. Em conjunto, esses resultados permitem o

DePaoli,H.C 2010 

 

Cap

ítulo 2 – SCI1 e auxina 

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enquadramento do gene SCI1 na via de auxina que controla a proliferação celular no

estigma/estilete durante o seu desenvolvimento.

Figura 4 – Estudo de SCI1 na via de auxina em Arabidopsis. (A) Coloração de GUS em raiz e flores de plantas DR5:GUS no “background” selvagem (Col-0) e de sci1 (sci1+/-). Note a redução da resposta à auxina na ponta da raiz e no pistilo (setas amarelas). (B) Microscopia eletrônica de varredura de flores maduras das plantas selvagem (Ba), sci1 (Bb) e três mutantes relacionados à síntese de auxina, yuc2yuc6 (Bc) e à sinalização de auxina, pid336 (Bd) e npy1 (Be). Note o aumento da superfície estigmática nos três mutantes, conforme encontrado em sci1. Barras de escala correspondem a 500µm em todos os painéis. (C-D) Imagens de constraste de fase de flores maduras (C) e pistilo apical (D) das plantas mostradas em B (respectivamente). Note as

DePaoli,H.C 2010 

 

Cap

ítulo 2 – SCI1 e auxina 

‐ 85 ‐ 

estruturas estigmáticas e o estilete aumentados em todos os mutantes de auxina, de forma similar ao que ocorre em sci1. Magnitude é de 100x (C) e 200x (D) para todos os painéis. (E) Cortes longitudinais do pistilo de Arabidopsis em plantas selvagens (Ea) e nos mutantes sci1 (Eb), yuc2yuc6 (Ec), pid336 (Ed) e npy (Ee). Note que o número de células no estigma/estilete é bem aumentado nos quatro mutantes, quando comparados à planta selvagem (os mutantes da síntese de auxina, azul claro, e da sinalização de auxina, lilás, apresentam fenótipos adicionais à alteração do número de células). Os painéis laterais de cada figura (a-e) mostram a análise de expressão por RT-PCR do gene AtSCI1 nos mutantes sci1 (Eb), yuc2yuc6 (Ec), pid336 (Ed) e npy (Ee), conforme a descrição apresentada na Figura 2C. Note que todos os quatro mutantes apresentam um nível relativo de expressão próximo à metade do nível de expressão encontrado na planta selvagem. Magnitude é de 100x em todos os painéis.

Interação genética entre sci1 e, yuc2yuc6, pid336 e npy1 em Arabidopsis 

Para determinar se o gene SCI1 apresentava alguma interação genética com os genes

YUCCA (YUC2 e YUC6), PINOID (PID) e NPY (NYP1), o mutante sci1 foi cruzado com os

mutantes yuc2yuc6, pid336 e npy1. A geração de triplo e duplos mutantes foi analisada quanto ao

fenótipo do pistilo, para determinar se o efeito combinado da perda de função desses genes iria

reverter, manter ou ampliar o fenótipo observado em cada um deles separadamente.

De forma interessante, existe uma diferença entre os fenótipos das primeiras floradas e

das floradas mais tardias nas flores dos mutantes yuc2yuc6 (Figuras 4Bc e 5Ca/Cb) , pid336 (4Bd

e 5Da) e npy1 (Figuras 4Be e 5Ba). Adicionalmente ao fenótipo descrito por Cheng et al. (2006)

em flores iniciais de yuc2yuc6, observou-se que as flores tardias deste mutante apresentavam

dificuldade em estabelecer os quatro verticilos florais de forma adequada, exibindo tecidos

estigmáticos de forma ectópica (Figura 5Ca) e, em alguns casos, desenvolvendo apenas estruturas

características de pistilos (Figura 5Cb). De forma semelhante, as flores iniciais de pid336 (Figura

4Bd) apresentavam apenas uma superfície estigmática aumentada, enquanto que as flores mais

tardias passaram a apresentar flores não totalmente separadas umas das outras e com estruturas

em forma de pistilo em outros verticilos (Figura 5Da). Notóriamente as flores yuc2yuc6

apresentam anomalias mais severas que as flores pid336. As flores iniciais e tardias do mutante

npy1 se mostraram com aumento da severidade no desenvolvimetno do pistilo e de alguns

verticilos florais, mas sem expressão ectópica de órgãos/tecidos (Figura 5Ba).

A análise do duplo mutante sci1npy1 mostrou que a parte superior do pistilo se mantinha

praticamente a mesma, quando comparada com sci1 e npy1, não apresentando outro tipo de

anomalia na morfologia floral (Figura 5Bb). De forma esperada, as flores jovens do duplo

mutante também apresentaram um desenvolvimento pronunciado, projetando o estigma para fora

da corola (Figura 5Bc), como ocorre nos mutantes simples. Considerando que npy1 apresenta

outras anomalias não presentes em sci1, é possível sugerir que SCI1 não só está na mesma via que

NPY1 no controle do desenvolvimento do pistilo, mas também se encontra abaixo deste gene, sob

o controle funcional, direto ou indireto, do mesmo.

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Cap

ítulo 2 – SCI1 e auxina 

‐ 86 ‐ 

A análise do triplo mutante sci1yuc2yuc6 mostrou efeitos ligeiramente adicionais aos

apresentados nos mutantes sci1 e yuc2yuc6, com um maior pronunciamento do pistilo nos

estágios iniciais do desenvolvimento (Figura 5Ce) e um desenvolvimento semelhante de tecido

estigmático ectópico, porém estendido para todos os verticilos florais (Figura 5Cc/Cd). Com base

nessas observações, os genes SCI1, YUC2 e YUC6 devem trabalhar juntos para proporcionar a

formação adequada da parte superior do pistilo.

Figura 5 – Interações genéticas entre sci1 e três mutantes da via de auxina no pistilo. (A) Microscopia eletrônica de varredura de flores de Col-0(Aa) e sci1(Ab) (envolvido no controle da proliferação celular; linha laranja). (B) Flores tardias maduras de npy1 (Ba) e dos duplos mutantes sci1npy1 (Bb/Bc). (C) Flores tardias maduras de yuc2yuc6 (Ca/Cb) e dos triplos mutantes sci1yuc2yuc6. (D) Flores tardias maduras de pid336 (Da) e de sci1 no “background” pid336+/- (Db/Dc/Dd). Note os meristemas finais desenvolvidos apenas em pistilo (Dd). (E) Plântulas de 9 dias de idade de sci1 (Ea), pid336 (Eb), sci1pid336+/- (Ec) e sci1pid336-/- (Ed). As plântulas dos mutantes sci1 e pid336 se desenvolvem normalmente; as do mutante sci1 no “background” pid336+/- retardam o desenvolvimento (Ec) e a maioria das plântulas dos duplo mutantes sci1pid336 morre sem desenvolver o primeiro par de folhas (Ed). As setas indicam estruturas estigmáticas desenvolvidas fora do quarto verticilo (C e D). As barras de escala são 200µm (A-D) e 5mm (E).

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Cap

ítulo 2 – SCI1 e auxina 

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A análise do duplo mutante sci1pid336+/- mostrou que a estrutura floral foi bastante

afetada quando a flor tem a funcionalidade de SCI1 e PINOID diminuída (Figura 5Db-d). Em

alguns casos mais extremos, o meristema desenvolvia estruturas em forma de pistilo (Figura 5Dc)

ou até mesmo apenas pistilos no seu ápice (Figura 5Dd). De forma inesperada, os fenótipos

observados no desenvolvimento floral são de mutantes homozigotos para SCI1, mas heterozigotos

para PID. Quando sci1 e pid336 são colocados juntos em homozigose, a maioria das plantas

apresenta dificuldades de desenvolver os cotilédones, retardando/impedindo o desenvolvimento

das plântulas (Figura 5Ed). Em conjunto, os resultados mostram que SCI1 e PID trabalham em

conjunto para promover um desenvolvimento adequado do pistilo, durante o desenvolvimento

floral. Adicionalmente, a sinalização de auxina parece ser afetada a níveis capazes de prejudicar o

desenvolvimento do meristema apical de plântulas em Arabidopsis.

DISCUSSÃO 

SCI1 em diferentes espécies vegetais: N. tabacum e A. thaliana 

A caracterização inicial de SCI1 em N. tabacum demonstrou que este gene controla o

número de células na parte superior do pistilo, alterando a estrutura estigmática deste órgão. De

forma semelhante aos pistilos de plantas transgênicas SCI1Ri de N. tabacum, os pistilos do

mutante sci1 de Arabidopsis demonstraram uma estrutura estigmática aumentada, com aumento

do número de células, quando comparada com a planta selvagem (Col-0). Interessantemente,

somente as plantas SCI1Ri de N. tabacum, que tiveram a expressão de SCI1 diminuída para 28%

ou menos da expressão selvagem, apresentaram um fenótipo de aumento do estigma/estilete,

enquanto que nas plantas de Arabidopsis, uma diminuição de aproximadamente 50% já foi

suficiente para produzir o mesmo fenótipo. Adicionalmente, os resultados mostraram que, em

Arabidopsis, a perda de apenas um alelo funcional de SCI1 (sci1+/-) é o suficiente para reduzir o

nível deste transcrito para níveis próximos ao encontrado na planta com perda dos dois alelos

(sci1-/-). Esses resultados sugerem que Arabidopsis é mais sensível à perda de função de SCI1 que

N. tabacum.

De forma bastante interessante, foi identificado o mutante sci1-2, que não possui o exon 4

de SCI1, e apresenta um fenótipo totalmente selvagem. Experimentos de complementação,

expressando os exons 1, 2 e 3 no mutante de perda de função sci1 (sci1-1), demonstraram que

estes exons são suficientes para permitir a inibição da proliferação celular, mantendo a

funcionalidade de SCI1 na formação da estrutura estigmática em Arabidopsis. Intrigantemente, o

exon 4 corresponde à porção mais conservada da proteína entre os ortólogos de diferentes

espécies (domínio III, Capítulo 1 – Figura 2). Le Foll et al. (2008) demonstraram que o inibidor

DePaoli,H.C 2010 

 

Cap

ítulo 2 – SCI1 e auxina 

‐ 88 ‐ 

de CDK de N. tabacum NtKIS1a, interage com a proteína AJH1 para ser degradado, e que o

reconhecimento por AJH1 ocorre através do domínio DLS, presente nas extremidades amino ou

carboxi-terminal de diferentes inibidores de CDK, em plantas e animais. Este domínio, tem o

consenso D/EX(20-22)LX(8-10)S/T (onde X representa qualquer aminoácido (n) vezes).

Coerentemente, esse domínio pode ser encontrado em NtSCI1 (e seus ortólogos; Capítulo 1,

Figura 2) em dois sítios putativos na região carboxi-terminal, ambos dentro do domínio III

(D88L111S121; D110L132S146). Em conjunto, é plausível especular que o domínio III de SCI1 poderia

estar relacionado ao controle da degradação da proteína, mais do que diretamente relacionado

com a habilidade de SCI1 em inibir a proliferação celular.

Os estudos em N. tabacum por hibridização subtrativa e qRT-PCR mostraram que

NtSCI1 é específico de estigma/estilete (em experimentos com amostras de raiz, caule, folha,

sépala, pétala, estame, estigma/estilete e ovário; Capítulo 1, Figura 3). Ao mesmo tempo, na

espécie Arabidopsis thaliana, dados de expressão de microarranjo mostram que AtSCI1 é

preferencial de carpelo, apresentando expressão em raiz, meristemas e, pétalas e estames jovens

(Figura 3). Mesmo com expressão nestes órgãos, SCI1 demonstra alta tecido-especificidade, uma

vez que os sinais de DR5:GUS foram reduzidos no meristema apical da raiz em sci1, mas não na

formação de raízes secundárias. De forma semelhante, a ativação da expressão de AtSCI1 no

desenvolvimento do meristema floral está em concordância com os testes genéticos realizados, os

quais demonstraram alterações no desenvolvimento floral de sci1pid336 e sci1yuc2yuc6. Baseado

no fenótipo de sci1, onde os verticilos 2 e 3 (pétalas e estames) são totalmente idênticos à planta

selvagem, a presença deste transcrito nestes verticilos deve ser complementar a outros fatores

desenvolvimentais. Esses fatores teriam a capacidade de suprir a ausência de SCI1, assim como

responder ao seu excesso, como ocorrido em plantas de superexpressão de SCI1 em N. tabacum,

SCI1OE, as quais demonstraram uma alteração no desenvolvimento de anteras nos estágios bem

jovens (que foi restaurado ao longo do desenvolvimento). Dessa forma, SCI1 seria um elemento

chave e fundamental no desenvolvimento do quarto verticilo, mais especificamente na porção

apical, onde há um incomparável nível de expressão deste gene e ausência de redundância

funcional. Coerentemente, a fusão SCI1PROM1:GUS, demonstrou coloração nos verticilos 2, 3 e 4,

com uma maior coloração no verticilo 4 (pistilo), tanto em estágios jovens quanto em estágios

quase maduros (ainda que de forma reduzida). Por outro lado, não se identificou coloração de

GUS em raiz ou meristemas, locais indicados por microarranjo como apresentando expressão de

AtSCI1. Este resultado sugere que alguns elementos regulatórios estejam faltando na região de

287pb acima do códon de início de tradução e suporta a identificação de outros elementos

identificados na região intragênica, que seriam, então, importantes para a correta expressão do

gene. Em conjunto, é possível sugerir que SCI1 possua uma região promotora complexa, para

controlar sua função de inibidor do ciclo celular tecido-específico, conservada em diferentes

espécies vegetais, conforme aqui demonstrado para N. tabacum e Arabidopsis.

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ítulo 2 – SCI1 e auxina 

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SCI1 e a via de sinalização de auxina no pistilo 

O destino de um tecido em desenvolvimento pode ser determinado pela sensibilidade das

células em crescimento à concentração de auxina. A análise de duplos e triplos mutantes,

juntamente com a resposta de DR5:GUS no “background” sci1, demonstra que, de alguma forma,

SCI1 participa da via de sinalização de auxina. No modelo atual de desenvolvimento do pistilo,

foco do presente estudo, propõe-se a existência de um gradiente de concentração de auxina, apico-

basal, que, quando alterado, modifica o desenvolvimento do órgão. De acordo com este modelo, é

necessária uma alta concentração de auxina na parte apical do pistilo para levar ao

desenvolvimento de uma estrutura estigmática (Nenhauser et al., 2000). Baseado nesse modelo,

com a super-proliferação celular e aumento da superfície estigmática em sci1, deveria-se esperar

que a quantidade de auxina estivesse aumentada. Porém, de forma intrigante, o mutante sci1 tem

uma estrutura estigmática aumentada, com maior número de células, igualmente ao duplo mutante

yuc2yuc6 (Figura 4), que é deficiente na síntese de auxina. Esses resultados geram uma aparente

contradição, mas que aponta para uma necessidade não só de se transportar direcionalmente o

hormônio, mas também de sintetizá-lo de forma específica, em alguns grupos de células, para

promover o correto desenvolvimento do órgão. Com isso, a aparente contradição que existe entre

essas respostas, permitiria um controle fino do momento em que cada grupo celular/tecido deve se

desenvolver. Dando suporte a essa proposta, existe o fato de que diferentes mutantes afetam

subgrupos específicos de tecidos, distintos morfológica e funcionalmente, que vão compor o

carpelo maduro, sugerindo que o desenvolvimento de cada tecido seja, em boa parte,

desvinculado um dos outros (Nenhauser et al., 2000; Staldal et al., 2008). Alternativamente, pode-

se citar o controle do desenvolvimento lateral de raiz pela ação de NAC1 e SINAT5. SINAT5 é

antagônico a NAC1 e ambos são induzidos por auxina, porém com uma pequena diferença de

tempo, garantindo o fino ajuste da resposta ao hormônio (revisado em Benjamins e Scheres,

2008). Sob essa perspectiva, SCI1 e YUC2YUC6 estariam controlando o desenvolvimento de um

grupo específico de células, que seria diferente daquele controlado pelo transporte polar de auxina

no carpelo ou, alternativamente, teriam um momento de ativação/inibição diferente entre si na

cascata de sinalização dependente de auxina. Ao final, é possível sugerir que a síntese localizada,

transporte direcionado e a concentração final do hormônio nas células acontecem de forma

balanceada e tecido-específica, para que, ao longo do desenvolvimento, diferentes grupos de

células sejam estimulados a promover o correto crescimento do órgão.

A proteína PINOID pertence à classe de quinases AGC em plantas. Foi demonstrado que

PINOID se autofosforila, e que esta autofosforilação é necessária para sua ativação na

fosforilação de seus alvos. Um destes alvos é a proteína PIN, que acaba por ser fosforilada por

PINOID e remanejada dentro da célula, direcionando o transporte de auxina (Friml et al., 2004).

Mutantes pid não desenvolvem inflorescências e têm o meristema apical em forma de pino

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ítulo 2 – SCI1 e auxina 

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(Bennett et al., 1995; Christensen et al., 2000). Esses resultados mostram que a proteína PINOID

tem uma função chave no controle do transporte de auxina, e é essencial para o desenvolvimento

do meristema floral. A partir do momento que mutantes sic1 e pid336 demonstraram interação

sinergística entre si, conclui-se que eles possam trabalhar em conjunto no desenvolvimento do

pistilo. Em paralelo, o fenótipo observado em plântulas e em flores do mutante sci1pid336,

lembra os fenótipos de mutantes deficientes em auxina (npy1pid, yuc1yuc4pid, Cheng et al.,

2007). Considerando o envolvimento concreto de PINOID no transporte de auxina, e que o

mutante pid336 apresenta alterações brandas no desenvolvimento, é razoável propor que SCI1

afeta, de alguma forma, a sinalização de auxina no pistilo, uma vez que sci1pid336 têm efeitos

adicionais a pid336. Em conjunto, o transporte, mediado por PINOID, e a sinalização, dependente

de SCI1, estariam somando alterações para gerar os fenótipos observados no mutante sci1pid336.

SCI1 possui 6 sítios de fosforilação (serinas) alvos de AGC quinases (PKA e/ou PKC, homóloga

de PINOID em humanos), conservados entre os principais ortólogos (Capítulo 1, Figura 2) em

espécies vegetais, e que estão presentes na primeira parte da proteína (Domínios I e II,

codificados pelos exons 1, 2 e 3), responsáveis pela funcionalidade de SCI1 (conforme

demonstrado pelo mutante sci1-2). Com isso, uma outra alternativa seria a proteína PINOID, que

é uma quinase de relativo amplo espectro, fosforilar SCI1 e coordenar a cascata de

desenvolvimento dependente de auxina no pistilo, abaixo de SCI1.

Além da autofosforilação, a proteína PINOID depende de NPY para atuar em alvos da

cascata de sinalização por auxina e mutantes pidnpy1 falham na formação de órgãos aéreos

(Cheng et al., 2007). Quando foi analisado o mutante sci1npy1, observou-se que ele tem

praticamente a mesma estrutura estigmática que os mutantes sci1 e npy1 separadamente. Essa

observação mostra que a quebra funcional de SCI1 não modificou a quebra funcional já existente

no gene NPY, levando à conclusão de que SCI1 deva ser um dos alvos de NPY no controle do

desenvolvimento da parte superior do pistilo. Utilizando os três argumentos: a) NPY atua em

conjunto com o gene PINOID para formar os órgãos aéreos (fenótipo pidnpy1); b) SCI1 está sob

controle da cascata de NPY (fenótipo sci1npy1) e; c) PID atua na formação de diferentes órgãos

florais, mas com ajuda de SCI1 no desenvolvimento do pistilo (fenótipo sci1pid336); também é

possível que PID e NPY juntos coordenem a cascata de sinalização por auxina no pistilo através

de SCI1 (Figura 6). Considerando as análises dos fenótipos dos duplos/triplos mutantes de SCI1,

na via YUC/PID/NPY, e o aumento observado no número de células na parte superior do pistilo

de cada um desses mutantes, é plausível propor que SCI1 esteja abaixo destes genes na via de

sinalização de auxina que estabelece o número de células do estigma/estilete durante o

desenvolvimento do pistilo.

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Cap

ítulo 2 – SCI1 e auxina 

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Figura 6 – Modelo para explicar o envolvimento de SCI1 na via de auxina durante seu controle no desenvolvimento do pistilo (verticilo 4). Auxina controla o desenvolvimento floral a partir de diferentes vias, incluindo a via YUC/PID/NPY (Cheng et al., 2007). Neste trabalho foi mostrado que SCI1 está abaixo de NPY no controle do desenvolvimento do pistilo. Em paralelo, os genes PID/NPY trabalham juntos para permitir a formação de órgãos florais (Cheng et al., 2007). Uma vez que SCI1 demonstrou uma interação sinergística com PID, alternativamente, NPY estaria controlando seus alvos, como SCI1, de uma maneira dependente de PID (seta pontilhada PID/NPY SCI1). Dessa forma, SCI1, que controla a proliferação celular através da interação com ciclinas A, representa o motor molecular da sinalização de auxina no controle da proliferação celular, para coordenar o desenvolvimento da parte superior do pistilo.

SCI1 no controle do ciclo celular dependente de auxina 

Diferentes mutantes relacionados às vias de auxina vêm demonstrando o efeito deste

hormônio no controle do tamanho dos órgãos. Mutantes dos genes TOUSLED, CRABS CLAW,

SPATULA e SEUSS, envolvidos em respostas mediadas por auxina, mostraram defeitos na

formação do carpelo com uma redução da estrutura estigmática (Roe et al., 1997; Alvarez e

Smith, 1999; Bowman e Smith, 1999; Franks et al., 2002). Entretanto, a primeria evidência

molecular de que a maquinaria da sinalização de auxina reprimia a divisão celular veio quando

Schruff et al. (2006) demonstraram que o gene MEGAINTEGUMENTA(MNT)/ARF2 controla o

número de células em óvulos, produzindo sementes maiores no mutante mnt/arf2. Recentemente,

Ishida et al. (2010) demonstraram que auxina influencia a saída da divisão celular e entrada no

endociclo (endoreplicação), um processo intimamente relacionado com a diferenciação celular.

Células de raiz em vários mutantes de síntese, sinalização e transporte de auxina desencadeiam

esse processo pela diminuição dos níveis de auxina, sentidos pelo complexo SCFTIR1 (Ishida et al.,

2010). Entretanto, os mecanismos moleculares pelo qual os limiares de auxina vão determinar a

proliferação, expansão ou endoreplicação celular, através da maquinaria do ciclo celular, ainda

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Cap

ítulo 2 – SCI1 e auxina 

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são desconhecidos. Neste estudo, foi demonstrado que SCI1 tem uma função chave no controle da

estrutura estigmática em pistilos, que ocorre, pelo menos em parte, pela correta homeostase do

hormônio auxina. Ao mesmo tempo, SCI1 é capaz de controlar a proliferação celular interagindo

diretamente com a maquinaria do ciclo celular, ciclinas A (Capítulo 1; Figura 10) e,

provavelmente, alterando a atividade de CDK, que é fundamental para o processo de divisão

celular. Em conjunto, pode-se dizer que SCI1 representa o motor molecular da via de sinalização

de auxina para controlar a progressão do ciclo celular, durante o controle que este hormônio

exerce no desenvolvimento da parte apical do pistilo. Certamente, identificar os elementos

regulatórios que coordenam a ativação/repressão deste transcrito/proteína vai contribuir para o

entendimento do controle de SCI1 na organogênese dependente de auxina.

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Considerações Finais  

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Considerações Finais

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Considerações Finais  

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A caracterização de SCI1 revelou alguns mecanismos celulares que ocorrem durante o

desenvolvimento do órgão reprodutor feminino dependente de auxina, mais especificamente, no

seu controle da proliferação/diferenciação celular (Figura 1). Várias perguntas, então, surgem a

partir daqui: Quais os elementos que estão diretamente sendo alterados por NPY/PID para ativar

(ou reprimir) a ação de SCI1? Esta regulação ocorre ao nível transcricional ou pós-traducional? Se

transcricional, quais os elementos responsáveis pela ativação/repressão de SCI1 e quais

mecanismos os desencadeiam? Como SCI1 responde diretamente ao hormônio (auxina) a nível

transcricional e protéico? Quais domínios de SCI1 são fundamentais na sua função biológica?

Ocorre mesmo alguma alteração pós-traducional (fosforilação/acetilação) para

ativar/inibir/degradar/transportar a proteína? Qual elemento é o responsável pela “parada” da

proliferação celular? Existem proteínas tecido-específicas, presentes em outros órgãos, capazes de

atuar de forma semelhante a SCI1 no pistilo? Responder estas e outras perguntas vai ajudar na

compreensão dos mecanismos de regulação da organogênese reprodutiva, assim como também na

compreensão de questões mais gerais em biologia do desenvolvimento.

Figura 1 – Proposta final dos mecanismos moleculares de atuação/interação de SCI1 nas células do pistilo. SCI1 é uma proteína nuclear, possivelmente regulada pós-transducionalmente. SCI1 interage com ciclinas do tipo A (CycA) para inibir a divisão celular, a qual está em equilíbrio com a expansão e tem uma interação regulatória com a diferenciação celular. Auxina influencia a proliferação/diferenciação através de diferentes vias, e SCI1 está envolvido com a sinalização de auxina, conforme mostrado pelas análises com mutantes de Arabidopsis e por sua capacidade de alterar o nível de transcrição da classe de fatores ARF/Aux/IAA, que respondem a modulações do hormônio dentro da célula.

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Referências  

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Anexo 1

ARTIGO SUBMETIDO PARA PUBLICAÇÃO NO PERIÓDICO

THE PLANT CELL

 

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Decision Letter[Return to Queue]

To: "Maria-Helena S. Goldman" &lt;mgoldman@ffclrp.usp.br&gt;

From: jlong@aspb.org

Subject: PLANTCELL/2009/069286 - Manuscript Decision

Cc:

Dear Dr. Goldman:

We have received reviews of your manuscript entitled "A NOVEL TOBACCO

STIGMA/STYLE GENE, SCI1, ENCODING A LYSINE-RICH PROTEIN THAT CONTROLS CELL

DIVISION AND DIFFERENTIATION," which you may view by visiting

http://submit.plantcell.org. On the basis of the advice received and my own

evaluation, I regret that I must decline this version of your manuscript.

However, I would like to encourage you to consider resubmission of a

substantially revised manuscript that fully addresses the following concerns.

The reviewers and I found this to be a very interesting manuscript with some

novel findings. Unfortunately, all agree that this study is largely descriptive

and could go further to reveal the molecular mechanism of SCI1 action on cell

cycle control. In particular, it would be of interest to evaluate interactions

between SCI1 and CDKs/cyclins in vitro and in planta. The reviewers suggest

several suitable strategies to analyse these interactions. Other helpful and

important comments are found throughout the reviewer remarks, and these should

be addressed as well prior to resubmitting.

Because of the substantial nature of the revisions necessary to produce a

manuscript suitable for further consideration by The Plant Cell, any

View Correspondence http://submit.plantcell.org/submission/viewcorr?msid=PLANTCELL/2...

1 de 3 17/05/2010 16:14

resubmission will be subject to our full review process in the same manner as a

new manuscript (unless specified otherwise above). Please note that

resubmissions that do not fully address concerns in the manuscript itself, but

instead provide arguments against making revisions in the "response to

reviewers" section, are often returned without review.

The Plant Cell considers resubmissions for up to 6 months after a manuscript has

been declined; limited extension of this timeframe is at the discretion of the

handling editor. A reminder notice will be sent to you after 5 months, at which

time you may choose to contact Annette Kessler (akessler@aspb.org) to request an

extension; if so, please provide a justification for your request. Any related

manuscript that is submitted to The Plant Cell after expiration of this deadline

would have to be provided as a new submission, though you will be able to

indicate its relationship to a previously declined manuscript in the Benchpress

system if you choose to do so. Also, because the field of plant biology is

continually evolving, The Plant Cell's expectations for novelty and significance

also evolve; thus, after a period of time, previously considered work may no

longer be deemed suitable for publication in the journal.

Please be certain to review our Instructions for Authors and ensure that any

resubmitted manuscript complies fully with journal style and policies. Note that

The Plant Cell strongly encourages authors to deposit novel materials such as

genetic stocks in an appropriate genetic stock center (e.g., ABRC/NASC for

Arabidopsis stocks) so that they will be available conveniently to the entire

scientific community.

When you log into the online submission system, this article will be listed in

the "Resubmit a Manuscript" queue. You may include an itemized list of changes

made in the revised manuscript in the "Response to Reviewers" section; please

note that reviewers do not have access to your cover letter and so will not see

View Correspondence http://submit.plantcell.org/submission/viewcorr?msid=PLANTCELL/2...

2 de 3 17/05/2010 16:14

any comments you provide there. If you have any questions about these reviews or

the resubmission procedures, please feel free to contact me or the Manuscript

Manager, Annette Kessler, respectively.

Thank you for your interest in The Plant Cell.

Sincerely,

Chris Staiger

Coeditor, The Plant Cell

HENRIQUE DE PAOLI, University of Sao Paulo, Av Bandeirantes 3900, Cidade Universitaria Ribeirão Preto, SP 14140-901 Brazil Tel: (55-16) 36023852, Email: depaoli@rge.fmrp.usp.br

The Plant Cell

American Society of Plant Biologists, 15501 Monona Drive, Rockville, Maryland 20855-2768 USATel: 301-251-0560; Fax: 301-279-2996; Email: akessler@aspb.orgCopyright © 2010 by American Society of Plant Biologists

View Correspondence http://submit.plantcell.org/submission/viewcorr?msid=PLANTCELL/2...

3 de 3 17/05/2010 16:14

Ribeirão Preto – SP (Brazil), February 4th

, 2010

Dear Dr. Chris Staiger,

Enclosed you will find the revised version of the manuscript entitled: “A novel

tobacco stigma/style gene, SCI1, encoding a lysine-rich protein that controls cell division

and differentiation”, to be considered for publication in The Plant Cell – Section

Development. This manuscript has not been submitted for publication elsewhere. The

manuscript cover page is complete and includes the materials distribution responsibility

footnote as well as an estimate of the length of this article, when published, from the page

calculator (20.4 pages). As the manuscript already contains a huge amount of data and is

calculated to be long, the DNA and protein sequence analyses were included as

Supplemental Figures and Tables.

As suggested in your letter and by the reviewers, we went further to reveal the

molecular mechanism of SCI1 action on cell cycle control performing a two-hybrid screen

against the core of cell cycle regulators, including cyclins and CDKs, in Arabidopsis. The

N. tabacum orthologous genes were cloned and the interaction with A-type cyclins was

validated by BiFC experiments (in planta as requested). We have addressed all the

reviewers’ comments by performing additional experiments, including new figures in the

new version of the manuscript and carefully answering all their comments. Furthermore,

the text of the manuscript has been modified, to incorporate the new results and all the

points/concerns raised by the reviewers. We truly hope you will find our manuscript

suitable for publication after all these modifications.

In case our manuscript is accepted for publication in The Plant Cell, we have a

special figure to be considered for the cover (enclosed as an Additional Supplemental file).

We would like to thank you very much for how you have handled our manuscript.

The reviewers' comments helped us to improve considerably the quality of the manuscript.

Please, feel free to contact me for any further questions.

Sincerely yours, -- Maria Helena Goldman

Address for correspondence: Dr. Maria Helena S. Goldman

Depto. Biologia - FFCLRP/USP

Av. Bandeirantes, 3900.

14040-901, Ribeirão Preto, SP – BRAZIL.

Phone: 55-16-3602-3702

FAX: 55-16-3602-4886

E-mail: mgoldman@ffclrp.usp.br

1

A NOVEL TOBACCO STIGMA/STYLE GENE, SCI1, ENCODING A LYSINE-RICH

PROTEIN THAT CONTROLS CELL DIVISION AND DIFFERENTIATION

Running title: a stigma/style cell cycle inhibitor

Henrique C. DePaoli1,2, Michael S. Brito1,2, Andréa C. Quiapim1, Edward J. Strini1,2, Simone

P. Teixeira3, Lieven De Veylder4,5, Gustavo H. Goldman3,6, Marcelo C. Dornelas7 and Maria

Helena S. Goldman*1

1Departamento de Biologia, Faculdade de Filosofia, Ciências e Letras de Ribeirão Preto, Universidade de São Paulo, Brazil 14040-901 2PPG Genética, Faculdade de Medicina de Ribeirão Preto, Universidade de São Paulo, Brazil; 14049-900 3Departamento de Ciências Farmacêuticas, Faculdade de Ciências Farmacêuticas de Ribeirão Preto, Universidade de São Paulo, Brazil; 14040-903 4Department of Plant Systems Biology, Flanders Institute for Biotechnology (VIB), B-9052 Gent, Belgium 5Department of Plant Biotechnology and Genetics, Ghent University, B-9052 Gent, Belgium 6Laboratório Nacional de Ciência e Tecnologia do Bioetanol (CTBE), Brazil; 7Departamento de Biologia Vegetal, Instituto de Biologia, Universidade de Campinas, Brazil; 13083-970

*Corresponding author: Prof. Dr. Maria Helena S. Goldman Departamento de Biologia Faculdade de Filosofia, Ciências e Letras de Ribeirão Preto Universidade de São Paulo Avenida Bandeirantes, 3900 Ribeirão Preto, SP - CEP 14040-901 BRAZIL Phone: 55-16-3602-3702 FAX: 55-16-3602-4886 E-mail: mgoldman@ffclrp.usp.br

The author responsible for distribution of materials integral to the findings presented in this

manuscript in accordance with the policy described in the Instructions for Authors

(www.plantcell.org) is: Maria Helena S. Goldman (mgoldman@ffclrp.usp.br).

Estimated length of this article: 20.4 pages

2

ABSTRACT

The success of plant reproduction depends on the appropriate development of the

reproductive organs, which involves specific regulatory networks. We have characterized a

gene, SCI1 (stigma/style cell cycle inhibitor 1) that encodes a small lysine-rich protein with a

putative nuclear localization signal. Fluorescence microscopy with SCI1-GFP protein fusion

confirmed its nuclear localization, which is confined to the interchromatic region. Real time

RT-PCR and in situ hybridization experiments showed that SCI1 is stigma/style-specific and

developmentally regulated. SCI1 RNAi knockdown and overexpression plants resulted in

stigmas/styles with remarkably enlarged and reduced areas, respectively, which were

demonstrated to be the result of differences in cell numbers. These results, combined with an

observed interaction between SCI1 and A-type cyclins, suggest that SCI1 is a novel tissue-

specific negative cell cycle regulator. The differences in cell division caused by SCI1

affected the differentiation timing of the papillar cells, showing that their differentiation is

coupled to stigma cell divisions, consistent with a role for SCI1 in triggering differentiation

through cell proliferation control. SCI1 also influenced the transcriptional regulation of

specific early auxin regulated genes. We conclude that SCI1 represents a novel

developmentally regulated tissue-specific gene that controls cell proliferation/differentiation,

probably as a component of a signaling pathway involved in upper pistil development.

INTRODUCTION

The efficiency of sexual plant reproduction depends on the appropriate development

of the reproductive organs, the adequate transfer of pollen grains to a receptive stigma

surface, as well as on compatible pollen-pistil interactions, which culminate in fertilization.

The pistil has fundamental roles in receiving and discriminating the pollen grains, which are

performed by its specialized tissues (mainly stigmatic secretory zone, SSZ, and stylar

transmitting tissue, STT). Recently, efforts to unravel genes that control the plethora of

events behind pistil development and function have emerged (Endo et al., 2002; Swanson et

al., 2005; Tung et al., 2005; Li et al., 2007; Quiapim et al., 2009). To exert the reproductive

associated functions the pistil cells should proliferate and differentiate properly, i.e., promote

pistil development. Pistil development in Solanaceae has been studied at ultrastructural,

microscopical and histochemical levels (Satina, 1944; Cresti et al., 1976; Kandasamy and

Kristen 1987; Goldberg, 1988; Koltunow et al., 1990; for a review see de Graaf et al., 2001).

3

In Nicotiana tabacum, wild-type and stigmaless pistils were used to study the development of

the SSZ (Goldman et al., 1994; Wolters-Arts et al. 1996).

Cell proliferation and differentiation events are important to establish organogenesis

and final organ size and disruption of these events impairs appropriate organ development.

Different factors were found to influence organ size in plants, such as endoreduplication and

polyploidy (Hase et al., 2000; Kondorosi et al., 2000; Larson-Rabin et al., 2009), changes in

organ identity genes (Ingram et al., 1995), altered phytohormone signaling (Nemhauser et al.,

2000; Krizek, 2009) and direct alterations in cell division control (Mizukami and Fischer,

2000; Mizukami, 2001). As in yeast and mammals, the plant cell cycle machinery is

governed by cyclin-dependent kinases (CDKs). The plant CDKs were classified into at least

five classes, A-E, with one of them (CDKB) being unique to plants (Joubès et al., 2000;

Wang et al., 2008). The CDKs should complex with cyclins to gain protein kinase activity

and phosphorylate targets that will regulate the progression through the cell cycle. Like

CDKs, cyclins are classified into different groups, including the D-type cyclins (CYCDs) that

play a role at the G1-to-S transition; A-type cyclins with an anticipated role during the S

phase and at the S-to-M control point; and B-type cyclins that control the G2-M switch and

intra-M phase (for a review see Inzé and De Veylder, 2006). Cell cycle regulation is also

influenced by CDK inhibitors, which bind to CDK/cyclin complexes specifically inhibiting

their activities (Verkest et al., 2005). Plant CDK inhibitors are represented by the CKI (CDK

Inhibitors)/KRP(Kip-related proteins) family and by the more recently described SIM family,

which includes the SIAMESE and SMR (SIAMESE-related) proteins (Churchman et al.,

2006; Peres et al., 2007). In Arabidopsis, the CKI/KRP family comprises 7 members (KRP1-

7) (De Veylder et al., 2001; for a review see Verkest et al., 2005). In tobacco, two CKI/KRPs

were identified, NtKIS1a/b (splicing variants) and NtKIS2, and were shown to be expressed

in different plant tissues (Jasinski et al., 2002b; 2003). All plant CKI/KRPs share a restricted

C-terminal region of similarity among them (Η45aa) and the mammalian Kip/Cip inhibitors

(Η22aa) (Jasinski et al., 2002b; for reviews see Verkest et al., 2005; Wang et al., 2008). The

SIM/SMR family has 5 short conserved domains from which the domain 4 (Η10aa) shares a

high similarity with a region in the CKI/KRPs C-terminal (Churchman et al., 2006). The

overexpression of CKI/KRPs or SIM impairs the correct development of different organs and

leads to an overall reduced growth (Wang et al., 2000; De Veylder et al., 2001; Jasinski et al.,

2002a; Zhou et al., 2002; Churchman et al., 2006; Ren et al., 2008).

4

The level of CDK activity is essential for cell cycle entry. The main CDK/cyclin

complex involved in the initial step of cell cycle is the CDKA/CYCD (for a review see Inzé

and De Veylder, 2006). Its activation promotes cell cycle progression beyond the restriction

point of the G1 phase and activates late G1 and S phase genes. The plant CDKA is involved

in cell cycle regulation in an organogenesis-independent manner because CDKA1 dominant-

negative mutants inhibit cell division without blocking morphogenesis in planta and CDKA

overexpression does not produce any macroscopical organ-changes (Hemerly et al., 1995).

Accordingly, the CYCD subfamily has well known inducers of cell division that increase

meristem growth rate when overexpressed without affecting organogenesis (Cockcroft et al.,

2000; Zhou et al., 2003). Since plant development is largely post-embryonic and cell

proliferation is intrinsically related to differentiation, there is possibly some cell cycle

regulators involved in both processes. Cell cycle regulators have been proposed as targets for

coupling cell proliferation and development in a cell type-, tissue-, and organ-specific manner

(Ramirez-Parra et al., 2005). For example, CDKB1;1 is required for stomatal divisions and

CYCA3;2 impairs differentiation of callus (Boudolf et al., 2004; Yamaguchi et al., 2003).

Loss of function studies with the G1/S phase E2F/DP class of transcriptional repressors,

E2Fc/DPb, suggested that it balances cell proliferation and development in pericycle cells

(del Pozo et al., 2006). Similarly, the CKI/KRP family has members which are proposed to

be integrators of plant development through cell division control (Himanen et al., 2002).

Recently, in parallel to the cell cycle machinery, some “growth restricting factors” have been

identified as coordinators of organ size (reviewed in Krizek, 2009). These molecular factors,

Auxin Response Factor 2 (ARF2) (Schruff et al., 2006), BIG BROTHER (BB) (Disch et al.,

2006), DA1 and DAR1 (DA1-related) (Li et al., 2008), are involved in organ size control by

cell number changes either altering or not the cell size. Though their involvement in organ

size, the molecular mechanisms by which they regulate cell proliferation/growth remains to

be established.

Thus, it is clear that cell proliferation and differentiation enclose a regulatory

interaction and represent a prerequisite for development. However, although cell cycle

regulators are known key effectors of cell proliferation, how these molecules are

activated/inhibited by the cell proliferation/differentiation control mechanisms is only poorly

understood. Identifying the molecular bridges that interconnect cell differentiation control

and development through cell cycle regulation is therefore of primary importance. Here, we

report the identification and characterization of a novel stigma/style-specific gene, which

inhibits cell proliferation and coordinately controls upper pistil differentiation timing and, for

5

this reason was denominated SCI1 (stigma/style cell cycle inhibitor 1). SCI1 protein is

distinct from the two other types of CDK inhibitors (KRP and SIM families) already

described in plants. Moreover, whereas KRPs and SIMs mainly target CYCD complexes,

SCI1 shows a binding preference for A-type cyclins. Therefore, it represents a new type of

protein capable of inhibiting the cell cycle, which acts in a tissue-specific manner. SCI1

exerts a control in tobacco upper pistil organogenesis and influences stigma/style final size,

most likely acting as a component of a signal transduction pathway, important for proper

pistil development.

RESULTS

Identification of the SCI1 gene and analysis of its protein subcellular localization

We have recently constructed two suppression subtractive hybridization (SSH) cDNA

libraries which allowed the identification of several genes specifically or preferentially

expressed in the pistil of Nicotiana tabacum (DePaoli et al., manuscript in preparation).

Among them, we chose a clone, TOBSH1-002E06, for further analysis and characterization.

As this clone was a partial cDNA (Supplemental Figure 1A), representing the 5’ end of a

transcript, we have performed a BLAST search in the TOBEST database (Quiapim et al.,

2009) and found two very similar overlapping cDNA clones (TOB048C05 and TOB068F10).

The clone TOB068F10 was completely sequenced and shown to contain, in addition to part

of the coding region, the 3’ UTR and polyA tail. The alignment of the TOBSH1-002E06 and

TOB068F10 clones can be seen in Supplemental Figure 1. It is interesting to note that it has

an unusually long 3’UTR (395 bp), which may be important for its transcript regulation, e.g.

to influence its stability. The corresponding gene was designated SCI1 (stigma cell-cycle

inhibitor 1) based on the results shown below.

The homology search, using the complete coding sequence via TBLASTX

(Altschul et al., 1997), showed that the encoded protein is similar to proteins of unknown

function present in different plant organisms. The sequences with the closest similarity to

SCI1 gene product are from potato (AC233353), tomato (AC212309), barley (AK252156),

corn (EU958997), rice (NM_001052562) and grapevine (AM424297). The putative

homologous sequence in the Arabidopsis genome is At1g79200 (NM_106571), which shares

65% identity and 86% similarity with SCI1. The alignment of these proteins (Supplemental

Figure 2) allows the recognition of 3 domains: I) a short conserved sequence at the N-

6

terminus; II) an intermediary lysine-rich domain with low sequence conservation; and III) a

highly conserved C-terminal domain.

To uncover more information about this putative protein sequence and guide our

future experiments, we performed a detailed in silico analysis using the complete sequence of

154 amino acids. Through the combination of several sequence analysis software packages

(see Methods), we identified an N-terminal lysine-rich domain (LRD) (MotifScan, evalue =

6.5e-07), with lysine residues predicted to be Nε-acetylated, a nuclear localization signal -

NLS (PSORT, 0.992 affirmative; PredictNLS), two cyclin interaction domains (ELM

prediction) and a total of 15 predicted phosphorylation sites (NetPhos, ≥96%) (Supplemental

Figure 1B). The identified cyclin interaction domains, consensus [RK].L.{0,1}[FYLIVMP],

are present in a wide range of cyclin/CDK interacting proteins (Takeda et al., 2001), which

commonly share different phosphorylation sites targeted by different signaling molecules

(casein kinase 1 - CK1; casein kinase 2 - CK2; and MAPKs), all three present in SCI1

(NetPhosK; ELM prediction: positions 17-23aa, 54-60aa, 109-115aa, 112-118aa for CK1,

positions 4-10aa, 44-50aa, 53-59aa for CK2 and positions 4-10aa, 15-21aa and 18-24aa for

MAPK).

To study the potential nuclear localization of SCI1, we fused the green fluorescent

protein to the SCI1 C-terminal (35Spro:SCI1-GFP) and analyzed the subcellular in planta

localization. The fluorescence microscopy revealed that the SCI1-GFP protein is exclusively

localized in the nucleus (Figures 1A-B), contrasting to the 35Spro:GFP construct that showed

a uniform distribution of GFP in both nucleus and cytoplasm (data not shown). It is known

that DAPI preferentially stain heterochromatin and, interestingly, the SCI1-GFP fluorescence

was present as spots within the nucleoplasm, where DAPI was not detected, therefore

corresponding to the interchromatin and nucleolus (Figures 1E-L). We found that the

reported patterns of the fusion protein occur with both low and high expression levels, which

were estimated by their fluorescence intensity under the microscope. This observation

indicates that the overexpression of the fusion protein is not influencing its localization.

Indeed, the nuclear pattern of the SCI1-GFP resembles the one shown for different

transducin/WD-40 repeat proteins, which interact with cell cycle regulators, and the 60S

ribosomal protein L27A both from Arabidopsis thaliana (Brown et al., 2005). In conclusion,

SCI1 is a nuclear protein that seems to co-localize with the nucleolus and the interchromatic

regions.

SCI1 is a developmentally regulated stigma/style-specific gene

7

To determine the expression pattern of SCI1 gene and confirm its pistil specificity, we

performed qRT-PCR experiments using RNA from roots, stems, leaves, sepals, petals,

stamens, stigmas/styles and ovaries. SCI1 is at least 34-fold more expressed in the

stigma/style than in any other part of the plant (Figure 1M). We also analyzed the temporal

expression pattern of SCI1 gene in the stigma/style during the 12 developmental stages

described by Koltunow et al. (1990). At stage 1, the pistil is already fully differentiated and

will grow and prepare itself for receptivity and maturity until stage 12, in which anthesis and

pollination occur. Figure 1N shows that the highest SCI1 expression level is observed at stage

1, the earliest developmental stage investigated. In the following stages, the transcript

abundance decreases and its level fluctuates during the first half period of development, with

the highest levels occurring at the early stages (from 1 to 6) than in the later stages towards

anthesis (from 7 to 12) (Figure 1N). Thus, SCI1 expression pattern suggests that its gene

product might be implicated in events taking place rather early than late in pistil

development.

The SCI1 gene is exclusively expressed at the stigma/style specialized tissues related to

plant reproduction

To verify which cell types transcribe the SCI1 gene, in situ hybridization experiments

were performed (Figures 1O-P). Sense and antisense riboprobes were hybridized to

longitudinal sections of stigmas/styles at stages 4, 7 and 10 of flower development. At stage

4, we observed a hybridization signal in the stigmatic secretory zone, including the papillar

cells, and in the stylar transmitting tissue (Figure 1P). A weak signal was observed in the

vascular bundle; however this was also seen in sections of stigmas/styles hybridized to the

sense probe (control). There was no detectable signal at stages 7 and 10 (data not shown).

These results are in agreement with the developmental expression pattern of the SCI1 gene,

as determined by qRT-PCR, in which a significant reduction of SCI1 expression was

observed in stigma/style tissues at stages 7 and 10 comparatively to the expression at stage 4.

SCI1 transcript is clearly more abundant in stigma/style specialized tissues at the

initial stages of flower development. Although these tissues are intrinsically related to pollen-

pistil interaction, most of the genes related to these interactions have a higher expression

level at late stages of flower development (Goldman et al., 1992; Wang et al., 1993; McClure

et al., 1999). On the other hand, it is expected that genes controlling cell proliferation and

differentiation are expressed at higher levels in the initial stages of flower development.

Taken together, the temporal and spatial expression patterns suggest an involvement of the

8

SCI1 gene product in the morphological and/or physiological development of the pistil, rather

than contributing directly to pollen-pistil interactions.

The SCI1 gene product controls stigma size

To unravel the SCI1 protein function, we generated tobacco transgenic plants with the

SCI1 gene expression being silenced by hairpin (hp) RNA (RNAi). Additionally, plants that

overexpress SCI1 were constructed. We obtained 13 independent transgenic plants possessing

the RNAi construct, which were designated SCI1Ri and 9 independent transgenic plants

harboring the overexpression cassette, designated as SCI1OE. The Figure 2A shows that the

RNAi-mediated silencing efficiently reduced the transcript levels (up to only 6.4% of the

wild-type transcript level for SCI1Ri 17.9), as monitored by qRT-PCR. The plants with the

lowest transcript levels showed a clear enlargement in stigma size (Figure 3B) and a

remarkable style elongation, up to 28% at anthesis (Figure 3A). This phenotype was observed

in 9 out of 13 RNAi transgenic plants and was visible when the SCI1 transcript levels were

below 27.8% of that of the wild-type plants (Figure 2A dashed bars). There was an overall

correspondence between the degree of the altered phenotypes and the SCI1 mRNA levels,

with the plant SCI1Ri 14.2 (8.4% of SCI1 mRNA) exhibiting the most expressive phenotype

(Figure 3A). The differences between the wild-type SR-1 and RNAi phenotypes were more

evident at stage 10 of flower development (Figure 3A). At this stage, the stigma/style remains

enclosed by the corolla limb in wild-type plants (Figure 3A*) while the RNAi plants exhibit a

protruding stigma/style (Figure 3A), apparent since stage 8 (data not shown). In accordance

to the phenotype generated by silencing SCI1, the SCI1OE plants revealed an opposite

modification on stigma, i.e., a smaller size (Figure 3B). Among 9 independent overexpression

transgenic plants, 5 transformants showed the same phenotype, which was associated with

the highest SCI1 transcript levels (48.8 fold or higher than wild-type plants), as revealed by

qRT-PCR (Figure 2B). On the other hand, we did not observe alterations in the style length

of the SCI1OE plants, which positioned the stigmas at the same height as the top of stamens

and petals at anthesis. The plant SCI1OE 1.1 showed an RNAi-like phenotype and,

accordingly, the SCI1 mRNA level in this transgenic plant was only 17.7% of the level in

wild-type plants (Figure 2B). This co-suppression effect is a known post-transcriptional gene

silencing mechanism induced in some transgenic plants as a response to the overexpression

of a gene (Napoli et al., 1990; Taylor, 1997). No other plant organ showed a macroscopically

altered phenotype when comparing wild-type and transgenic plants (SCI1Ri and SCI1OE; data

not shown). Taken together, these results strongly imply an involvement of the SCI1 protein

9

in controlling stigma size, probably by inhibiting cell proliferation and/or avoiding cell

enlargement in a tissue-specific manner.

The SCI1 protein is a negative regulator of the cell cycle

As an effort to elucidate SCI1 function and distinguish the effect on cell proliferation

and/or enlargement, we prepared longitudinal sections of stage 11 stigmas/styles from SCI1Ri

14.2, SCI1OE 3.1.1 and wild-type plants. We evaluated the stigmatic secretory zone (SSZ)

area (Figure 4 and Supplemental Table 1) as well as the number of SSZ cell layers in the

region indicated at Figure 3Ca. Figure 3 shows that the cell number is clearly increased

(p<0.05) in the stigmatic secretory zone (Figures 3Cd and 3D; Figure 4 and Supplemental

Table 1) as a consequence of reduced SCI1 mRNA levels, whereas SCI1 overexpression

resulted in a decreased cell number (p<0.05) in the SSZ (Figures 3Cb and 3D; Figure 4 and

Supplemental Table 1). Consequently, the SCI1Ri 14.2 transgenic plant showed a SSZ

average area of 367,355.3µm2, 48% larger than the average area (248,272µm2) of the wild-

type plant (Figure 3Cd and 3Cc, respectively; Figure 4 and Supplemental Table 1). In

contrast, the SCI1OE 3.1.1 transgenic plant revealed an SSZ average area of 191,381.3µm2,

23% smaller than the SR-1 control plant (Figure 3Cb; Figure 4 and Supplemental Table 1).

Accordingly, the number of cell layers (cl) at the top of the SSZ (Figure 3Ca) was

significantly reduced to around 8cl in SCI1OE 3.1.1, while the SSZ of the wild-type plant

showed 13cl and of the SCI1Ri 14.2 RNAi plant increased to approximately 18cl (Figure 4

and Supplemental Table 1). In addition to the SSZ area and cl data, we also counted the cell

number in a defined area of 20,000µm2 (Figure 3Ca). The cell number of the SCI1OE 3.1.1

overexpression plant is smaller but not statistically different from the wild-type and SCI1Ri

14.2 plant, both with very similar values (Figure 4 and Supplemental Table 1). We did not

observe the phenomenon called compensation, in which cell size increases to balance for the

decrease in cell number, in the overexpression plants. However, the SCI1OE 3.1.1 SSZ cells

were more circular in shape and the intercellular spaces were slightly increased, consistent

with a lower cell density. In addition, a deeper carpel junction was observed (Figure 3Cb,

arrow). On the other hand, the cells of the SSZ seem smaller in RNAi plants, probably due to

a packed growth and/or a rapid re-entry into the cell cycle. However, taken as a whole, the

cells of the transgenic and wild-type plants were approximately of the same size.

Since the in situ hybridization experiments also revealed SCI1 expression in stylar

transmitting tissue (STT), we searched for alterations in this tissue. As the cells of the STT

are more packed, counting them individually as we have done for the SSZ cells is very

10

difficult. Thus, we measured the STT thickness in transgenic and wild-type plants (Figure

3Ea; Figure 4 and Supplemental Table 1) in longitudinal sections of stigma/style at 400µm

below the SSZ/STT intersection (for definition see Methods and Figures 3Ca and 3E).

Consistently, the STT thickness was decreased on SCI1OE 3.1.1 plant (p<0.05) and increased

in SCI1Ri 14.2 plant (p<0.05), when compared to the wild-type (Figure 4 and Supplemental

Table 1), indicating a smaller and a higher number of cells in this tissue, respectively. It is

noteworthy that the RNAi plant SCI1Ri 14.2 showed a higher cell number also in the

parenchyma tissue, when compared to wild-type and SCI1OE 3.1.1 plants (Figure 3Eb and

Figure 4). Since SCI1 is not expressed in the parenchyma cells, our results suggest that the

cells of the SSZ and STT may produce signals capable of influencing cell division in adjacent

tissues, maintaining certain proportionality: the more cells from the specialized tissues, the

more supporting tissue. Briefly, the higher SCI1Ri 14.2 style thickness (Figure 4 and

Supplemental Table 1) is a result of both, STT and parenchyma overgrowth, while the

parenchyma tissue remains approximately the same in the overexpression plant. Taken

together, these results reveal the involvement of the SCI1 protein in inhibiting the cell cycle

in a tissue-specific manner.

SCI1 is expressed at the very early stages of stigma/style development

Due to the high SCI1 expression level at stage 1 of flower development and its effects

on the final stigma/style size on transgenic plants, we decided to investigate its expression in

the very early stages of flower development (stages -4 to stage -1), in which the stigma is

differentiating (Koltunow et al., 1990; Wolters-Arts et al., 1996). In order to better correlate

the SCI1 function with the early events occurring at the stigma/style, we performed a

scanning electron microscopy (SEM) analysis of flower buds from stages -4 to stage 1, as

well as collected stigmas/styles from the same developmental stages for qRT-PCR

experiments. Besides measuring the floral bud length, we also considered floral and anther

morphological markers described previously (Koltunow et al., 1990) to reliably distinguish

among each developmental stage (Supplemental Figure 3; Methods).

The tobacco pistil is formed by the fusion of two carpels that give rise to the stigma

tissue around stage -4 of flower development (Figures 6Af and 7Bd). The stigmatic tissue

starts differentiation from the region of carpel fusion outwards (Figure 5Ak). At stage -3, the

surface of the stigma becomes evident with a rough aspect contrasting to the smooth surface

of the carpel epidermis (Figure 5Ag), and the style begins to elongate (Figure 5Ab).

Furthermore, this stage is characterized by a great enlargement in upper pistil size and a

11

visible differentiation of papillar cells at the stigma epidermis (Figures 5Ag and 5Al). At

stage -2, the style is definitely elongated (Figure 5Ac), the papillar cells turn into finger-like

structures (Figure 5Am) at the distal carpel edges and start to become much more evident at

the stigma central area (Figure 5Ah). In an upper view of the stigma, we clearly see the

papillar cells developing from the carpel edges and bordering the carpel junction towards the

outside in the central area (Figures 5Bb and 5Bc, yellow). Furthermore, the epidermis is still

visible at the central borders of the pistil at this stage (Figure 5Ah and 5Bc, blue). The

epidermis of the carpel tip is almost straight, as a consequence of the growth pressure

provoked by the stigmatic secretory zone. The stage -1 is portrayed by an extended style

(Figure 5Ad) and a clear enlargement in stigma size (Figure 5Ai), with the upper carpel

epidermis and parenchyma starting to bend backward, originating the abaxial part of the

stigma (Figure 5Bd). The papillae differentiation occurs throughout the stigma surface. At

stage 1, the SSZ is fully differentiated; the upper carpel epidermis and the parenchyma have

bended completely, forming an umbrella-like structure in a side view (Figure 5Ae and 6Af).

The bending of the upper carpel epidermis and parenchyma occurs mainly due to the

acceleration of the cell proliferation in the central region, where the carpels have fused.

As shown in Figure 5C, SCI1 gene is highly expressed at the very early stages of

stigma/style development, with the highest expression level observed at stage -3, when the

stigmatic secretory zone starts its differentiation. SCI1 transcript level decreases at later

stages (-2, -1 and 1) during which the stigmatic tissue is proliferating and continuously

differentiating. This expression pattern is consistent with a role in controlling cell

proliferation/differentiation in the upper pistil.

SCI1 controls cell proliferation/differentiation and influences the stigma/style

developmental timing

In order to study how the SCI1 gene product was affecting the stigma size and style

elongation, we decide to compare the very early stages of stigma/style development in wild-

type and transgenic plants by scanning electron microscopy (SEM). We analyzed the

transgenic plants with the most striking phenotypes: the RNAi SCI1Ri 14.2 and the

overexpression SCI1OE 3.1.1. Stage -4 pistils of the RNAi SCI1Ri 14.2 plant showed features

similar to the wild-type pistil at stages -4/-3 of flower development (Figures 6Ba, 6Bd and

6Be). During the first steps of stigma/style formation, the SCI1Ri 14.2 plant clearly exhibited

a faster growth of the stigma through stages -3 and -2 (Figures 6Bb and 6Bc, respectively)

compared to the wild-type plant at the same stages (Figures 6Be and 6Bf). Indeed, at stage -3

12

the SCI1Ri 14.2 carpel epidermis already begins to bend backward (Figure 6Bb), an event

observed at stage -1 of the wild-type plant (Figures 5Ad, 5Ai and 5Bd). The stigma

differentiation was also advanced in the SCI1Ri 14.2 plant, occurring as soon as the cell

number became increased (Figures 6Ca-6Cc), showing that cell differentiation is coupled to

proliferation in SCI1 silencing plants. Additionally, pistils of the SCI1Ri 14.2 plant reached

the umbrella-like structure at stage -2 (Figures 6Ab and 6Bc), a phenotype observed only at

stage 1 of the wild-type plant (Figures 5Ae, 5Aj and 6Af). Likewise, the style elongation

follows the accelerated growth of the stigma, becoming longer and conducting the stigma

surface to a higher position in relation to the anthers already at stage 1 (Figure 6Ac), while

this is not observed in wild-type plants (Figure 6Af). The developmental acceleration

observed in the SCI1Ri 14.2 plant, with a reduced level of SCI1 mRNA, suggests that the

SCI1 gene product might be a key regulator in the stigma/style developmental control. The

size of each cell at the RNAi stigma is similar to those of the wild-type, confirming that a

higher number of cells should be present in the RNAi stigmas to occupy the larger area

observed. Our results showed that the stimuli for style elongation, which generates a

protruding style in the SCI1Ri 14.2 plant at anthesis, starts at the very early stages of its

development, caused by SCI1 silencing. Taken together, these results strongly suggest the

involvement of the SCI1 gene product in influencing the final stigma size and style

elongation, through the control of cell divisions, since the initial stages of organ formation in

wild-type plants.

The upper pistils of the overexpression SCI1OE 3.1.1 plant showed a comparable

phenotype to the wild-type pistils at stage -4 (Figures 6Bg and 6Bd, respectively). However,

the upper pistil of this transgenic plant showed a delayed development from stage -4 to stage

-3, with a minimal differentiation of papillar cells (Figures 6Cg and 6Ch). The typical stigma

surface characteristics, observed at stage -3 pistils of the wild-type plants, are visible only at

stage -2 pistils of the SCI1OE 3.1.1 plant (Figure 6Ce and 6Ci, respectively). It is interesting

to observe that the SSZ differentiation is strictly linked to cell proliferation. Pistils at stages -

1 and 1 of the overexpression plant are morphologically and developmentally similar to

stages -2 and -1 of the wild-type plant, respectively. Besides, the SCI1OE 3.1.1 style is visible

only at stage -2 (Figure 6Ah), remaining shorter than the wild-type one at stage 1 (Figure

6Ai). Consistently, stigmas of the SCI1OE 3.1.1 plant have a smaller size than the ones of the

wild-type plant when they are compared side by side at stages -3, -2, -1 and 1 of flower

development. In summary, pistils of the overexpression SCI1OE 3.1.1 plant show a growth

and differentiation delay of nearly one stage when compared to pistils of the wild-type plant.

13

As can be seen at Figure 6Ag, the anther development was also affected in the SCI1OE 3.1.1

plant, due to the ectopic expression of SCI1 gene under the control of the 35S promoter,

while no other vegetative or floral organs were macroscopically altered. The SCI1 ectopic

expression resulted in smaller anthers at very early stages of flower development (Figures

6Ag and 6Ah), although at stage 1 they had already recovered their normal size (Figure 6Ai).

At stage -3, the SCI1Ri 14.2 and the wild-type plants exhibit similar anther size (Figure 6Aa

and 6Ad, respectively). Taken together, we can propose that the SCI1 protein inhibits cell

division at very early stages of flower development in a tissue-specific manner and is

sufficient to modulate the developmental timing of the stigma/style. These observations

suggest that SCI1 may be part of a molecular developmental clock pathway that influences

the final organ size and its number of cells.

SCI1 associates with A-type cyclins

Because of its anticipated role as a negative regulator of the cell cycle and the

presence of two putative cyclin-interaction domains, it was tested whether SCI1 could be a

direct regulator of CDK/cyclin complexes. As all CDKs and cyclins have been well

annotated for Arabidopsis thaliana, the orthologous SCI1 gene (AtSCI1) was cloned from this

species, and subsequently tested for interaction with 11 CDKs and 24 different cyclins using

the yeast 2-hybrid system. The interaction between two proteins was considered positive only

when two independent reporter genes were activated (the biosynthetic histidine gene HIS3,

resulting into histidine prototrophy, and the β-galactosidase-encoding gene LacZ, resulting in

blue colonies in the presence of 5-bromo-4-chloro-3-indolyl-β-d-galactopyranoside). None of

the CDKs tested displayed interaction with AtSCI1 (Supplemental Table 2). By contrast, two

related A-type cyclins scored positive, being AtCYCA1;1 and AtCYCA2;2 (Figure 7A;

Supplemental Table 2). The binding specificity of AtSCI1 towards CDKs and cyclins differs

from that of AtKRP2 (one of the founding members of the ICK/KIP family), which

associated in the yeast 2-hybrid system with D-type cyclins only. Additionally, AtKRP2 also

binds CDKA;1 (Figure 7A and Supplemental Table 3).

To check whether the interaction between SCI1 and A-type cyclins also occurs in

planta, we cloned the N. tabacum CYCA1;1 (NtCYCA1;1) and CYCA2;2 (NtCYCA2;2)

homologous sequences and performed Biomolecular Fluorescent Complementation (BiFC)

tests (see Methods). The NtSCI1 C-terminus was fused to the head of the GFP (hGFP; amino

acids 1 to 149) and the NtCYCA1;1, NtCYCA2;21-398 (full length) and NtCYCA2;296-398

(without the destruction-box) C-termini were fused to the tail of the GFP (tGFP; amino acids

14

150 to 238). As shown in Figure 7B, the NtSCI1 exhibited interaction with NtCYCA1;1,

restoring GFP fluorescence in planta, which is nuclear localized as expected. So far, we have

not been able to demonstrate interaction of NtSCI1 with the NtCYC2;2 isoforms. Our results

clearly show that both N. tabacum and Arabidopsis SCI1 proteins interact with A-type

cyclins, in vitro and in planta.

SCI1 influences the transcript levels of some auxin-regulated genes

Due to the phenotype similarity of the pistils of our RNAi transgenic plants with

Arabidopsis pistils treated with N-1-naphthylphthalamic acid (NPA; Nemhauser et al., 2000),

we decided to investigate the transcription levels of three auxin-regulated genes, identified in

the tobacco stigma/style EST pool (TOBEST database; Quiapim et al., 2009), in the

transgenic SCI1 plants (SCI1Ri and SCI1OE) comparatively to the wild-type. The transcript

levels of the tobacco genes homologous to the Arabidopsis Auxin Response Factor 8 (ARF8)

and the Auxin/Indole-3-Acetic Acid (Aux/IAA) Aux/IAA13 and Aux/IAA19 transcription

factors were measured by qRT-PCR in stigmas/styles of wild-type plants, four independent

RNAi plants and four independent overexpression plants (Figure 8). These genes were

chosen based on their involvement with flower development (ARF8, Wu et al., 2006), ability

to change multiple auxin responses (Aux/IAA19, Tatematsu et al., 2004) and to impairs

auxin-regulated development (Aux/IAA13, Weijers et al., 2005). For this experiment, we

chose the transgenic plants that displayed the lowest and the highest SCI1 mRNA levels

(Figure 2). Here, we decided to substitute the internal control on the qRT-PCR analysis. The

β-actin gene was shown to be the best internal control for gene expression comparisons

among different tobacco organs (Quiapim et al., 2009) and used on the above experiments.

On the other hand, the ubiquitin gene is suggested as the most suitable control when the same

organ is compared during alterations on cell cycle control (Eloy et al., 2006; Masuda et al.,

2008). Since SCI1 is changing the cell number on stigmas/styles, the ubiquitin gene was used

as internal control for this experiment. Figure 8A shows the re-analysis of SCI1 expression

levels in those transgenic plants using the ubiquitin gene as an internal control. Coherently

with the idea that this reference gene might be more appropriate when genes involved in cell

cycle control are altered, the results obtained for SCI1 expression level in the RNAi

transgenic plants correspond perfectly with the alteration degree of their stigma/style

phenotypes.

The NtARF8 mRNA accumulation was not affected in SCI1Ri plants (Figure 8B).

However, we observed an increase in its transcript levels of up to 2.8-fold in SCI1OE plants

15

(p<0.05) (Figure 8B). NtAux/IAA13 and NtAux/IAA19 were also upregulated in

overexpression plants, up to 4.2-fold and 5.1-fold (p≤0.001), respectively (Figure 8C and

8D). Additionally, the transcription of NtAux/IAA13 (Figure 8C) and NtAux/IAA19 (Figure

8D) were altered in RNAi plants, with the NtAux/IAA19 expression proportionally

associated to SCI1 downregulation in these plants (p<0.05). Our results suggest that SCI1

may influence the transcriptional regulation of some auxin-regulated genes and somehow be

related to auxin signaling in upper pistil development.

DISCUSSION

SCI1 is a tissue-specific cell cycle regulator that influences pistil development

We have identified a gene encoding a lysine-rich protein specifically expressed on

stigma/style specialized tissues during its early stages of development. Based on the

phenotypic analysis of the overexpression and silenced transgenic plants, our results strongly

indicate that SCI1 has a cell proliferation inhibitory activity. The smaller SSZ observed in

SCI1 overexpression transgenic plants is formed of cells with approximately the same size as

cells of wild-type plants. Additionally, the SEM analysis of the floral buds of overexpression

plants has demonstrated a delay in cell proliferation/differentiation. Thus the smaller SSZ is a

consequence of a decrease total number of cells accumulated during stigma development. On

the other hand, the larger SSZ obtained in SCI1 RNAi plants is directly associated with an

earlier start in the cell proliferation/differentiation activity and not with larger cells.

Therefore, our results suggest that SCI1 participates in the timing control of stigma/style cell

proliferation and differentiation and seems to be an integrator of cell cycle regulation to the

stigma/style developmental program, ensuring that the interconnected cell proliferation and

differentiation processes occur at the appropriate moment.

In flower meristems, undifferentiated cells divide asymmetrically giving rise to

daughter cells, which carry the cell fate information. However, the final differentiation is

postponed until some rounds of symmetric cell divisions. The right moment in which these

cells exit the cell cycle and differentiate, i.e. the differentiation timing, is controlled by

different factors, as CDK activity and growth factors (reviewed in De Veylder et al., 2007).

De Veylder et al. (2007) recently proposed a model for the control of cell

proliferation/differentiation by CDK activity, which might drop below a threshold to the cells

undergo cell cycle exit and differentiate. SCI1 interaction with A-type cyclins suggests that it

16

controls cells differentiation and organ size through a direct modification of CDK activity.

Among the known repressors of growth that regulate the activity of different growth

restricting factors, only DA1 changes organ size without changing the cell size (Li et al.,

2008), as SCI1 does on tobacco stigma/style. Considering that DA1 control organ size in

different tissues, as seeds, embryos, cotyledons, leaves, stems and flowers, it is tempting to

speculate that SCI1 represents a downstream effector of DA1 among the tissue-specific

growth restricting factors, complementing the model recently outlined by Krizek (2009) on

pathways controlling final organ size.

Additionally to the differentiation timing, an interesting issue in organ development is

whether the cell division follows a developmental program (organismal theory) or the cell

division instructs organogenesis and development (cellular theory). Due to ambiguous results

present in the literature that can fit in both theories, the “neo-cell-theory” has been proposed

(Tsukaya, 2002; Beemster et al. 2003). In this theory, an integrating model between growth

and division is supported. In SCI1 transgenic plants, alteration in cell division activity on

stigma/style tissues affects both the final organ size and the differentiation timing, which

supports the cellular theory. However, while the STT thickness is modified in both types of

SCI1 transgenic plants due to altered cell division activity, the style length is modified only in

the RNAi plants. In the overexpression plants the style elongated to a similar length as in the

wild-type. This phenotype represents an unaltered developmental program, which was not

influenced by the reduced cell division activity in the SSZ/STT of the SCI1OE plants,

supporting the organismal theory. The SSZ cell ablation led to shorter styles in

STIG1pro:barnase transgenic plants (Goldman et al., 1994), which had no alteration in STT

cells. Taken together, these observations suggest that the style elongation program is a result

of different signals, including those from stigma tissue (SSZ). Thus, one possible explanation

for the phenotypes in SCI1 transgenic plants is that the lower number of cells in SCI1OE

stigmas had produced sufficient “stigma-dependent elongation signal” for SCI1OE styles to

elongate to the wild-type length. On the other hand, the protruded style in SCI1Ri plants

would be a consequence of the increased number of stigma cells, which in turn produced

more of the “elongation signal(s)” or, alternatively, had started to produce the “elongation

signal(s)” earlier. In agreement with the idea of a signal that can move between cells, in

SCI1Ri styles we observed an increase in the parenchyma cell number, a tissue that does not

express SCI1. The consequences of SCI1 modulation on stigma size and style length suggest

that pistil development is governed by a variety of signals, in agreement with the proposal

that growth processes are implemented at the cellular level but engage crosstalk between

17

organizational levels, not simply following the organismal or the cellular theories.

Considering this point of view, how do the SCI1 results fit into the “neo-cell theory”? In our

SCI1Ri plants, an increase in cell division on stigma and a premature differentiation is

observed. Thus, we propose that cell division is inhibiting cell differentiation until the

stigmatic cell number reaches a threshold above which the differentiation signals accumulate

and, hereafter, cell division rate slows down and will be coupled with cell differentiation

(Figure 9). Coherently with this proposal, the SCI1OE plants, in which an over inhibition of

stigma cell division occurs, begin their stigma/style differentiation process later than the

wild-type plant, but the subsequent steps of differentiation follow the wild-type

developmental rate (Figure 9). Our results show that SCI1 gene encodes an important tissue-

specific cell cycle regulator that influences the upper pistil growth and development, without

changing the cell size.

The regulation of SCI1 expression levels is sufficient to influence stigma size and

style length, which may have important consequences in plant reproduction. A decreased

SCI1 level has resulted in stigmas positioned above the anthers and in heterostyly in our

population of tobacco transgenic plants. In nature, the regulation of expression levels of the

SCI1 homologous sequences may contribute to the heterostyly observed in some species with

perfect (bisexual) flowers and have consequences on the rates of self- and cross-pollination.

SCI1 is a cell cycle regulator distinct from the plant CDK inhibitors already described

Different aspects of plant development have been studied to uncover the molecular

network behind organ(s) growth and development, culminating with the discovery of

different classes of genes, as those involved in cell division control. To achieve this control,

the cell recognizes different signals from a variety of pathways, which are transduced by cell

cycle regulators and result in the activation or inhibition of the cell cycle. Plant CKI/KRPs,

which have similarity with the mammalian Kip/Cip inhibitors, directly interact with CDK

and/or cyclin proteins and constitute the major negative regulators of CDK/cyclin complexes

to control cell cycle entry in plants (De Veylder et al., 2007). Despite its effect in inhibiting

the cell cycle, SCI1 protein has no evident sequence similarity with the CKI/KRPs, even

when their more conserved C-terminal regions are either searched or aligned independently.

On the other hand, SCI1 shows a limited but recognizable similarity with SIM (Supplemental

Figure 4A), a new class of CDK inhibitors, in a short region that coincides with the region of

similarity between SIM and CKI/KRPs (Supplemental Figure 4B). This region was shown to

act as a cyclin interaction domain (Peres et al., 2007). Accordingly, using the yeast 2-hybrid

18

system, SCI1 was found to interact with two different A-type cyclins (CYCA1;1, CYCA2;2)

and, using BiFC, with at least CYCA1;1. In contrast to the CKI/KRP and SIM inhibitors,

SCI1 did not associate with D-type cyclins and CDKA;1 in the yeast 2-hybrid system. The

biological significance of the binding specificity towards A-type cyclins remains elusive at

this point.

Is SCI1 a new class of CDK inhibitor? Plant CDK inhibitors usually have a small

molecular weight, contain conserved motifs, like the cyclin-binding domains (Supplemental

Table 4), and are exclusively present in the nucleus of the cell (Wang et al., 2008),

characteristics shared with SCI1. Indeed, CDKs become active only after their interaction

with cyclins, and we showed that SCI1 has a direct link with the cell cycle machinery by its

ability to bind A-type cyclins. So, based on the phenotypes of SCI1 transgenic plants, protein-

protein interaction experiments and in conformity with the current model for the control of

cell proliferation/differentiation (De Veylder et al., 2007), it is plausible to suggest that the

CDK activity is being changed on SCI1OE and SCI1Ri plants. However, whether SCI1

sequester A-type cyclins or form a complex to inhibit the CDK/cyclin heterodimers, remains

to be established.

All plant CKI/KRPs overexpressed until now caused an overall reduced growth,

serrated leaves and abnormal flowers (Wang et al., 2000; De Veylder et al., 2001; Jasinski et

al., 2002a; Zhou et al., 2002; Ren et al., 2008). In contrast to CKI/KRPs and SIMs, SCI1

transgenics showed a tissue-specific phenotype. Only pistils and anthers have been affected

as a consequence of overexpression driven by the 35S promoter, which means that SCI1

depends on a specific cellular background to inhibit the cell cycle and then regulate

organogenesis. As the A-type cyclins are broadly expressed in the whole plant (Menges et al.,

2005), this control is probably dependent on tissue-specific post-translational modifications

(e.g. phosphorylation and dephosphorylation events, Supplemental Figure 1B) and/or occurs

through interaction(s) with a tissue-specific target(s). The unraveling of a cell-cycle regulator

that acts in a very specific tissue suggests the existence of proteins with similar functions in

other plant tissues. Therefore, we propose SCI1 as a new class of CDK inhibitor, distinct

from the CKI/KRPs and SIMs, and the existence of at least three classes of CDK inhibitors:

a) CKI/KRPs (CDK inhibitors/Kip-related proteins); b) SIMs (SIAMESE and SIAMESE-

related proteins), both broadly expressed among plant tissues and with a direct change of

CDK activity; and c) TICKs (Tissue-specific inhibitors of CDK), which show tissue

specificity and interact with cyclins, probably regulating CDK activity indirectly. SCI1 would

be the first member of the TICK class.

19

SCI1 is localized in the nucleus, as demonstrated here in leaf cells transiently

transformed with a 35Spro:SCI1-GFP quimeric gene. Therefore, its nuclear localization is

independent of interaction(s) with stigma/style-specific proteins and/or phosphorylations

resulting from stigma/style-specific transduction signals. The SCI1-GFP fusion protein

confirmed the presence of the predicted NLS and exhibited two distinct nuclear localizations:

predominantly inside the nucleolus; and distributed in both nucleolus and nuclear bodies,

always placed in the interchromatin region. Despite the well-known involvement of the

nucleolus in ribosomal RNA (rRNA) and small nucleolar RNA (snoRNA) biogenesis, it has

recently been considered a multifunctional nuclear structure, exerting different functions such

as in cell cycle control (Zimber et al., 2004). It has been shown that cell cycle regulators are

sequestered in the nucleolus, which points to a role for this organelle in regulating their

activity (Visintin and Amon, 2000). Additionally, in previous reports it has been shown that

changes in the architecture and functional organization of the nuclear bodies accompanied the

switch of the developmental program and the activation of the proliferative activity in plant

cells (Testillano et al., 2005; Echeverría et al., 2007). The compartmentalization to the

nuclear bodies were also described for the Arabidopsis ICK1/KRP1 protein (Zhou et al.,

2006) and for NtKIS1a protein, when the latter was co-expressed with the AtAJH1, the plant

homolog of the human JAB1 (c-Jun activation domain binding protein 1) protein that is

believed to target the degradation of the p27KIP1 CDK inhibitor (Le Foll et al., 2008). We

propose that SCI1-GFP distribution in the nucleolus and its relocation to nuclear bodies

might be linked to different cell fates or cell cycle phases during pistil development, which is

coherent with the SCI1 involvement in the cell proliferation/differentiation control.

Does SCI1 transduce signals engaging auxin signaling and cell division/differentiation?

The initial carpel cells are a small group of cells able and committed to divide and

differentiate to give rise to the adult pistil. Such developmental process includes mainly

hormone-mediated organogenesis associated to cell division and differentiation. Often,

alteration of final organ size is one of the consequences of modified phytohormone signaling

(Nemhauser et al., 2000; Krizek, 2009). Taking in consideration that the SCI1Ri tobacco

stigma/style phenotypes are analogous to those of the NPA-treated Arabidopsis pistils

(Nemhauser et al., 2000), we have investigated the possibility that some auxin responsive

genes could be influenced by SCI1 level.

The Auxin/Indole-3-Acetic Acid (Aux/IAA) and Auxin Response Factor (ARF)

families of transcription factors are key regulators with well-characterized roles in auxin

20

responses (Benjamins and Scheres, 2008). The Aux/IAA proteins dimerize with ARFs to

repress auxin-dependent gene transcription. In high intracellular auxin concentrations, the

Aux/IAA are degraded, thereby releasing the ARF proteins, which can regulate auxin-

dependent gene transcription through their ability to bind auxin responsive elements (AREs).

Recently, Jurado et al. (2008) reported auxin stabilization of the E2Fc/DPB heterodimers, a

negative cell cycle regulator, showing that cell division, cell differentiation and auxin

signaling have some molecular intersections. The Arabidopsis auxin insensitive mutant msg2-

1, which encodes the Aux/IAA19 protein, is defective in the induction of Aux/IAA4, DFL1

(DWARF IN LIGHT 1) and SAUR-AC1 genes after hormone treatment, when compared to

the high induction observed in wild-type plants (Tatematsu et al., 2004). The Aux/IAA4,

DFL1 and SAUR-AC1 belong, respectively, to the three Aux/IAA, GH3 and SAUR (small

auxin up RNA) classes of early auxin responsive genes, which are directly and quickly

influenced by auxin treatment. Thus, the altered expression of these genes in the msg2-1

mutant invokes the Aux/IAA19 in the primary steps of auxin response. The down- or up-

regulation of SCI1 levels can, respectively, down- and up-regulate the NtAux/IAA19 mRNA

levels in transgenic plants, indicating that SCI1 is somehow positively correlated to

NtAux/IAA19 gene expression. The Aux/IAA19 homolog in rice, OsIAA3, is preferentially

expressed in flowers and is down regulated in coleoptiles treated with 2,4-

dichlorophenoxyacetic acid (2,4-D), an auxin analogue (Jain et al., 2006). Accordingly, in the

SCI1Ri plants, which showed an increased SSZ and STT cell numbers, the NtAux/IAA19

transcription level was reduced, simulating an auxin induction of cell division. Interestingly,

the T-DNA mediated knockout of SCI1 gene in Arabidopsis has an extremely similar stigma

morphology as yuc2yuc6 stigmas (DePaoli et al., unpublished data), which are deficient in

proper auxin synthesis (Cheng et al., 2006). These observations suggest that an appropriate

auxin signaling on stigma/style might be necessary for the correct changes on gene

transcription during cell proliferation/differentiation control. Likewise, the Aux/IAA19 and

the Aux/IAA13, which in Arabidopsis are repressed by auxin (Weijers et al., 2005), had their

transcription induced in SCI1OE plants, which showed a reduced number of cells. At the same

time, the overexpression of SCI1 resulted in the up-regulation of the ARF8 homologous

transcript, which has been shown to repress tissue elongation through a reduction in the free

IAA content (Tian et al., 2004). Therefore, the correlation between the induction of

NtAux/IAA19, NtAux/IAA13 and NtARF8 expressions and a reduced cell number of unaltered

size is totally coherent with the phenotype observed in SCI1OE plants and points towards a

continuous equilibrium on organ growth. On the other hand, the unaffected expression of

21

NtARF8 and NtAux/IAA13 in SCI1Ri plants suggests that the activation of these genes can be

supplied by other factors in the absence of SCI1. Taken together, our results suggest that

SCI1 is somehow interconnected with the auxin signaling pathway during its control of the

cell division and differentiation in the stigma/style.

In summary, our characterization of this lysine-rich protein, SCI1, revealed a new

class of protein able to inhibit the cell cycle in a tissue-specific manner. We believe that SCI1

is a signaling molecule that influences the upper pistil development by inhibiting cell

proliferation/differentiation, probably through its interaction with A-type cyclins. SCI1

function is most likely modulated by different protein-protein interactions and

phosphorylation events and possibly has molecular intersections with the auxin signaling

pathway.

METHODS

Plant Material

Wild-type tobacco (Nicotiana tabacum cv Petit Havana SR-1) and tobacco transgenic

plants were grown under standard greenhouse conditions in Ribeirão Preto – SP, BRAZIL

(Latitude - 21º 10'24" S, Longitude - 47º 48'24" W, with average temperature of 22˚C in

winter and 27˚C at summer; the difference in day length between summer and winter is less

than 2 hours). Samples of roots, stems, leaves, sepals, petals, stamens, stigmas/styles and

ovaries were collected from wild-type plants, frozen in liquid nitrogen and stored at -70˚C for

RNA extraction. For the developmental expression studies, stigmas/styles were excised from

flowers at stages -4 to 12 of the tobacco flower development as described previously

(Koltunow et al., 1990).

Sequencing and computational analyses

The clones TOBSH1-002E06 from a tobacco stigma/style SSH library (DePaoli et al.,

manuscript in preparation) and TOB068F10 from the TOBEST project were completely

sequenced using the methodology previously described (Quiapim et al., 2009). As they are

partial but complementary clones, their sequences were used to define primers for amplifying

the complete SCI1 coding sequence. The SCI1-ORF fragment was amplified directly from

stigma/style cDNAs (as prepared for qRT-PCR, see below) using the Ct11attB1FW

(5’gcaggcttcaccATGGGGAGCGATAAGAAGAC3’) and the Ct11attB2RW

(5’aagctgggtcTTACTTTTTGATATTCCAAGCGTG3’) primers, which contain part of the attB

recombination sites (shown in lowercase). The PCR conditions used were: 94ºC for 4 min; 35

22

cycles of 94ºC, 50ºC and 72ºC for 1 min each; and 10 min for 72ºC. An aliquot (5µL) of this

PCR product was used for a second PCR reaction, at the same conditions (except for a

temperature of 45ºC during the annealing step), using the primers BP1

(5’ggggacaagtttgtacaaaaaagcaggcttc3’) and BP2

(5’ggggaccactttgtacaagaaagctgggtc3’). An aliquot (10µL) of the second PCR product

was used for a recombination into the pDONR201 entry vector (Gateway, Invitrogen, USA)

using the BP clonase (Invitrogen, USA), as manufacturer’s instructions. An aliquot (7µL) of

the BP reaction was used to transform competent DH5α Escherichia coli cells (Sambrook

and Russell, 2001). The resulting clone, denominated SCI1-ORF, was also completely

sequenced.

The nucleotide and deduced amino acid sequences were analyzed by several computer

programs: Translate at ExPASy Proteomics Tools (www.expasy.org), BLAST at NCBI

(http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi) and SOL Genomics Network

(http://sgn.cornell.edu/solanaceae-project/), ClustalW

(http://www.ebi.ac.uk/Tools/clustalw2/index.html), MotifScan (http://myhits.isb-sib.ch/cgi-

bin/motif_scan), PSORT (http://psort.ims.u-tokyo.ac.jp/form.html), PredictNLS

(http://cubic.bioc.columbia.edu/predictNLS/), ELM prediction (http://elm.eu.org/), NetPhos

and NetPhosK (http://www.cbs.dtu.dk/services/), PAIL (http://bioinformatics.lcd-

ustc.org/pail/prediction.php), Protein Molecular Weight and Isoelectric Point with

phosphorylation (http://scansite.mit.edu/calc_mw_pi.html), T-Coffee (www.ebi.ac.uk/t-

coffee/) and Multalign (http://www.expasy.org/tools/#align).

RNA Extractions

Total RNA was extracted from large samples of frozen material essentially as

described by Dean et al. (1985). For the analyses of transgenic plants (SCI1Ri and SCI1OE)

and comparisons with wild-type plants, four samples of stigmas/styles at stage 4 of flower

development were collected from each plant and total RNA was extracted using the “Plant

RNA purification Reagent” (Invitrogen, USA). The RNA samples were quantified by

measuring OD at 260 and 280nm. To evaluate the RNA integrity, RNA was fractionated in a

2.2 M formaldehyde-1.2% agarose gel, stained with ethidium bromide, and visualized with

UV light. The presence of intact 28S and 18S rRNA bands was used as the criterion for RNA

integrity.

Quantitative real time RT-PCR and in situ hybridization

23

For qRT-PCR, 20µg of total RNA from each wild-type organ or the total RNA sample of the

“Plant RNA purification Reagent” extraction were treated with 5U of DNAse (Promega,

USA) for 1,5h as manufacturer’s instructions, and checked for genomic DNA contamination

in a standard PCR reaction, using the β-actin primers (Table 1). Each DNA free RNA sample

was used as template for reverse transcription using 150 pmol of oligo dTV primer (dT18V)

and 200 U of the Superscript II enzyme (Invitrogen, USA) as manufacturer’s instructions.

After the first strand cDNA synthesis, water was added to complete a volume of 70µL. The

standard qPCR reaction was performed using an aliquot (1µL) of the cDNA, 2µL of each

gene-specific primer (Table 1) at 1pmol and 5µL of the Power SYBR Green PCR Master

Mix (Applied Biosystems, UK) in a final volume of 10µL. The PCRs were performed in 96-

well plates using an ABI Sequence Detection System 7500 Fast (Applied Biosystems, UK).

The PCR thermal cycling conditions were an initial step at 50°C for 2 min; followed by 10

min at 95°C; 40 cycles, with each cycle consisting of 15 s at 95°C and 1 min at 60°C and a

final dissociation curve, with the temperature gradually rising from 60ºC to 95ºC. A standard

curve was built for each gene using a serial dilution to calculate the log of copies of the

transcripts based on the Ct value as described at Semighini et al. (2002). All analyses were

performed in triplicate and at least two biological replicates were done for wild-type gene

quantification. In all experiments, appropriate negative controls containing no template DNA

or RNA were subjected to the same procedure to exclude or detect any possible

contamination or carryover. The expression level in arbitrary units corresponds to the

calculated log of copies of the gene of interest on the calculated log of copies of the β-actin or

polyubiquitin internal control (Quiapim et al., 2009). The primers used for qRT-PCR are

shown in Table 1. The statistical analyses were performed using the SigmaStat.v3.5 software.

For in situ hybridization experiments, stigma/styles at stages 4, 7 and 10 of flower

development (Koltunow et al., 1990) were fixed in 4% glutaraldehyde, run through the

alcohol-xylol series and embedded in paraffin wax (TissuePrep2 - Fisher Scientific, USA),

sliced into 8µm sections, hybridized and revealed essentially as described by Jackson et al.

(1991). The riboprobes were prepared by in vitro transcriptions using the clone TOBSH1-

002E06 linearized at the 3’end, sense probe, and 5’end, antisense probe. For this purpose, we

used the DIG RNA Labeling Kit SP6/T7 (Roche, Germany) as manufacturer’s instructions.

DIG-labeled probes were detected using the anti-DIG antibody conjugated with AP (Roche,

Germany) and the 1-step NBT/BCIP detection mixture (Thermo Fisher Scientific, USA).

Nucleic acid manipulations and gene constructions

24

All the basic nucleic acid manipulations were as described at Sambrook and Russell

(2001). To obtain the 35Spro:SCI1-GFP construction, the SCI1 coding sequence was

amplified from the SCI1-ORF clone, using the primers Ct11attB1FW (described above) and

the Ct11attB2GFPRW (5’aagctgggtcCTTTTTGATATTCCAAGCGTG3’), which excluded the stop

codon from the SCI1-ORF sequence, creating an AvaII restriction site (bold underlined). The

procedure was performed as described above for the SCI1-ORF, including the recombination

of the PCR fragment into the pDONR201 vector. The resulting clone, pENTRY SCI1-ORFss

(without stop codon) was confirmed by AvaII digestion. Then, 300µg DNA of a positive

clone was used in the LR recombination reaction with the pK7FWG2 (Karimi et al., 2002)

plant expression vector, using the LR clonase from Invitrogen (USA). The construction was

sequenced to confirm the absence of undesirable mutations.

To obtain the SCI1 RNAi and overexpression constructions, 300µg DNA of the

original SCI1-ORF, cloned in the pDONR201 as described above, was recombined into the

pK7GWIWG2(I) and pK7WG2 (Karimi et al., 2002) plant expression vectors to generate the

SCI1Ri and SCI1OE constructs, respectively. These recombination reactions were performed

using the LR clonase (Invitrogen, USA). Each plant expression vector was introduced

separately in the Agrobacterium tumefaciens C58C1RifR (pGV2260) by electroporation.

The NtCYCA1;1 and NtCYCA2;2 sequences were obtained by RT-PCR from

stigma/style mRNAs, using the primers CYCA1.1FW

(5’agcaggcttcGAAGGAGATAGAACCATGGCGACGACYCAGAATAG3’) and CYCA1.1ssRV

(5’aagctgggtcGCAGCTTATGTTCTGGAAG3’), CYCA2.2FW

(5’agcaggcttcGAAGGAGATAGAACCATGAGGCATGCAAATATAAAAC3’) and CYCA2.2ssRV

(5’aagctgggtcGAACAGTGATTGGACTGGTTTTG3’), respectively. The attB recombination sites

are shown in lowercase and the ribosome binding sites are underlined. The amplified

fragments were purified, used for a second PCR using the BP1 and BP2 primers, and cloned

into the pDONR201 entry vector by recombination, as described above. The clones were

sequenced to confirm their identity as NtCYCA1;1 and NtCYCA2;2. The sequence

NtCYCA2;296-398 (without the destruction-box) was obtained by PCR, from the NtCYCA2;21-

398 (full length), using the primers CYCA2.2DelFW

(5’agcaggcttcGAAGGAGATAGAACCATGAATTGCATCAACGGAAG3’) and CYCA2.2ssRV.

To obtain the NtSCI1 fused to the hGFP (35Spro:NtSCI1-hGFP), we recombined the

pENTRY p35S - attB4/1R, the pENTRY hGFP - attB2R/3 and pENTRY SCI1-ORF without

stop codon – attB1/B2, into the pK7m34GW via LR recombination reaction. Similarly, to

25

obtain the NtCYCA1;1, NtCYCA2;21-398 (full length) and NtCYCA2;296-398 (without the

destruction-box) fused to the tGFP (35Spro:NtCYCA-tGFP) we recombined the pENTRY

p35S – attB4/1R, pENTRY tGFP - attB2R/3 and the appropriate pENTRY NtCYCA –

attB1/B2, into the pH7m34GW. Each construction was sequenced from 3 different points to

confirm the correct recombination without mutations, and individually introduced in the

Agrobacterium tumefaciens C58C1RifR (pGV2260) by electroporation.

Plant transformation

Nicotiana tabacum cv Petit Havana SR1 seeds were surface sterilized and sowed in

Petri dishes containing MS medium (Murashige and Skoog, 1962) supplemented with 3%

sucrose, 0.5 g/L MES, brought to pH 5.8 and 7% agar (Bacto Agar). Seedlings were grown in

a growth chamber at 26-27°C with a photoperiod of 16h light /8h dark. For transient

expression assays, plants (approximately 6 weeks old) were transferred to soil and their

leaves were infiltrated with the Agrobacterium culture(s) containing the appropriate

constructs, as described by Sawers et al. (2006), and were analyzed 2 to 5 days after

infiltration.

For stable transgenic plants, tobacco leaf discs were co-cultivated with the

Agrobacterium clone containing the appropriate construction, according to the protocol

previously described (Brasileiro & Carneiro, 1998). Transgenic plants were regenerated on

kanamycin containing medium during the whole in vitro procedure and then transferred to the

greenhouse in a soil:vermiculite mixture. To ensure that environmental conditions were not

influencing our plant phenotypes, we transferred some plants during the winter/spring

seasons (i.e., SCI1Ri4.4.1 and SCI1Ri13.2) and others during the summer/autumn seasons

(i.e., SCI1Ri14.2 and SCI1Ri16.1). After 2 weeks, the plants were transferred to soil where

they remain until flowering and fruit production. These plants represent the first transgenic

generation (T0), which were analyzed in the qRT-PCR and light microscopy experiments.

The next generation (T1) was produced by controlled pollination; the seeds were sowed in

MS medium containing kanamycin, the resistant seedlings were transferred to soil and the

first flowering was used for the SEM analyzes.

Microscopy experiments

For SCI1-GFP protein subcellular localization, leaves were infiltrated as described by

Sawers et al. (2006), cut in small pieces, fixed on 3,7% formaldehyde, 50mM NaH2PO4 and

0,2% Triton X-100 for 30min, stained with 4,6'-diamidino-2-phenylindole (DAPI) for 15 min

26

(1.25µg/mL on PBS) on darkness, washed in PBS and mounted on slides with water, just

prior to analyses. For Biomolecular Fluorescence Complementation (BiFC) experiments, the

leaves of 6 weeks old tobacco seedlings were agroinfiltrated as described above, with the

combination of two different constructs (NtSCI1-hGFP with NtCYCA1;1 or NtCYCA2;21-398

or NtCYCA2;296-398). GFP and DAPI fluorescences were imaged under a Leica TCS SP2

confocal laser scanning microscope (Leica Microsystems). The individual stacks were

assembled with Adobe Photoshop CS (Adobe Systems, San Jose, CA). At least three

additional analyses without fixing material were performed to confirm that the formaldehyde

self-fluorescence was not interfering in our results. The images shown for the BiFC

experiments represent a series of stacks merged.

For light microscopy analysis, stigmas/styles and anthers were dissected from floral

buds at the relevant developmental stages, fixed and embedded in paraffin as described for in

situ hybridization. The embedded material was sliced into 8µm sections, mounted on slides

and stained with 0.05% toluidine blue in phosphate buffer at pH4.4 (O'Brien et al., 1964).

The pictures were taken using a Leica DM4500B microscope equipped with a Leica DFC320

camera. The tissues analysis was done using the Leica Q-Win Plus v3.4.0 software

(Switzerland) and the statistical analyses were performed using the SigmaStat.v3.5 software.

For scanning electron microscopy (SEM), the floral buds from wild-type and T1

transgenic plants, resulting from the controlled pollination between the T0 transgenic pistils

and SR-1 pollen grains, were collected from stages -4 to 1. For each stage, one anther of each

floral bud was collected for light microscopy analysis. The remaining floral bud (pistil and 4

anthers) was fixed for 48h in formaldehyde, acetic acid and 50% ethanol (1:1:18), dehydrated

in an ethanol series, subjected to critical-point drying, and coated with 30nm of gold.

Preparations were examined using a Jeol JSM-5200 scanning electron microscope. At least

two biological replicates of each stage were analyzed from the transgenic and wild-type

plants.

Yeast two-hybrid analysis

Plasmids encoding the baits (pDEST32) and preys (pDEST22) were transformed into

the yeast strain PJ69-4α (MATα; trp1-901, leu2-3,112, ura3-52, his3-200, gal4∆, gal80∆,

LYS2::GAL1-HIS3, GAL2-ADE2, met2::GAL7-lacZ) and PJ69-4a (MATa; trp1-901, leu2-

3,112, ura3-52, his3-200, gal4∆, gal80∆, LYS2TGAL1-HIS3, GAL2-ADE2, met2TGAL7-

lacZ) by the LiAc method (Gietz et al., 1992). Transformed yeast cells were selected on

synthetic dextrose (SD) plates without Leu (pDEST 32) or without Trp (pDEST22),

27

respectively. Interactions between proteins were assayed by the mating method. All pDEST32

yeast cultures were inoculated in 200 µL SD without Trp in a 96-well microtiter plate

(Falcon), while one pDEST22 yeast culture was inoculated in 50 ml SD medium without Leu.

To upscale the yeast cultures, 20 µL of each culture grown for 2 days at 30°C were added to a

microtiter plate containing 125 µL of bacto-yeast extract (10 g/l), bacto-peptone (10 g/L, and

dextrose (20%) (YPD) medium, and again grown for 24 h at 30°C. The YPD medium was

replaced by SD medium without Leu and Trp. Diploid strains grown in a 96-well microtiter

plate (NUNC) for 2 days at 30°C were diluted until OD600 = 0.2 and then added to a 96-well

microtiter-plate (Falcon) containing either 190 µL SD medium without Leu and Trp, but with

His (as control) or SD medium without Leu, Trp, and His. The OD was measured after 2 days

of incubation at 30°C. Positive interactions were scored by dividing the OD600 of the SD

medium without Leu, Trp, and His by that of the SD medium without Leu and Trp. For the

LacZ test, 3 µL of the OD600 = 0.2 dilution was spotted on a Hybond-N+ membrane (GE-

Healthcare) on a YPD agar plate. After incubation of 2 days at 30°C, the membrane was snap

frozen in liquid nitrogen and placed on two Whatmann papers soaked in 6 mL of Z buffer

(16.1 g Na2HPO4.7H2O, 5.5 g NaH2PO4.H2O, 0.750g KCl, and 0.246g MgSO4.7H2O) with 11

µL β-mercaptoethanol and 100 µL 4% 5-bromo-4-chloro-3-indolyl-β-d-galactopyranoside.

After an incubation of 6 h at 37°C, colonies were scored for blue staining.

Accession Numbers

The SCI1-ORF, TOBSH1-002E06, TOB068F10, NtARF8, NtIAA13 and NtIAA19

cDNA sequences have been deposited at GenBank under accession numbers GQ272329,

GQ272330, GQ272331, GQ272332, GQ272334, GQ272333. Sequences mentioned in this

article can be found in the GenBank/EMBL data libraries under the following accession

numbers: X92966 - NtCYCA1;1; D50736 - NtCYCA2;2; AC212309 – SlSCI1 from tomato;

AC233353 – StSCI1 from potato; AM424297, clone VV78X084703.3 – VvSCI1 from

grapevine; AK252156, clone FLbaf149e13 – HvSCI1 from barley; NM_001052562

(Os02g0170200) – OsSCI1 from rice; EU958997, clone 208741 – ZmSCI1 from corn;

NM_106571 (At1g79200) – AtSCI1 from Arabidopsis; CAB85553 - SIM (At5g04470);

BAC42937 - SMR1 (At3g10525); AAF18255 - SMR2 (At1g08180); CAB85979 - SMR3

(At5g02420); CAD56868 – N. tabacum NtaKIS2; CAC82732 – N. sylvestris NsKIS1;

CAC82731 – N. tomentosiformis NtKIS1a; CAC82734 – N. tomentosiformis NtKIS1b;

NP_179924 – A. thaliana AtKRP1; NP_190632 – A. thaliana AtKRP2.

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Supplemental Data

The following materials are available in the online version of this article.

Supplemental Figure 1 - Sequences of the SCI1 cDNA clones and the deduced amino acid

sequence showing the functional domains identified by in silico analysis.

Supplemental Figure 2 - Amino acid sequence alignment of the SCI1 protein and the

putative homologous sequences found in other plant species.

Supplemental Figure 3 - Analysis of anther morphological markers from floral buds at very

early stages of flower development.

Supplemental Figure 4 - Sequence analysis between SCI1 and the most closely related

classes of cell cycle regulators.

Supplemental Table 1 - Stigma/style tissues analyses in transgenic and wild-type plants

(original raw data)

Supplemental Table 2 - Pairwise 2-hybrid interactions between Arabidopsis SCI1, and CDK

and cyclins.

Supplemental Table 3 - Pairwise 2-hybrid interactions between Arabidopsis KRP2, and

CDK and cyclins.

Supplemental Table 4 - Amino acid sequences belonging to each ELM (Eukaryotic Linear

Motif) interacting domain identified in CDK inhibitors, described in N. tabacum and other

plants, and in the NtSCI1 protein.

Acknowledgements

The authors are grateful to Prof. Dr. Maria-Cristina S Pranchevicius (FM-Universidade

Federal do Tocantins), Prof. Dr. Adriana S Hemerly (Universidade Federal do Rio de

Janeiro) and Prof. Dr. Eric Lam (Rutgers University, USA) for stimulating discussions and

suggestions; to Prof. Dr Wagner F dos Santos from FFCLRP-Universidade de São Paulo

(USP) and Marina F B Costa for their contributions in the optical microscopy; to José

Augusto Maulin and Maria Dolores S Ferreira from “Departamento de Biologia Celular e

Molecular de Bioagentes Patogênicos” of the FMRP-USP and to Rodrigo Silva from

“Departamento de Química” of the FFCLRP-USP for their technical services on electron

microscopy; to Dr. Lenaldo B Rocha from FMRP-USP and Luis A A Toledo-Filho for their

contribution in the confocal microscopy; to Hilde Van Den Daele for the yeast two-hybrid

analysis, and to CEMEQ for their help in statistical analysis. We would like to thank Gerard

29

M. van der Weerden and the Botanical Garden of the University of Nijmegen (Netherlands)

for providing us Nicotiana seeds and the Flanders Interuniversity Institute for Biotechnology

(VIB - Belgium) for providing us the Gateway vectors for Agrobacterium-mediated

transformation. This work was supported by grants from Fundação de Amparo à Pesquisa no

Estado de São Paulo - Brazil (FAPESP no. 06/54431-9) and from Conselho Nacional de

Desenvolvimento Científico e Tecnológico (CNPq) - Brazil. HC DePaoli was supported by a

fellowship from CAPES/CNPq; AC Quiapim, MS Brito and EJ Strini were supported by

fellowships from CAPES; GH Goldman and MHS Goldman are indebted to CNPq for their

research fellowships.

Figure Legends

Figure 1 – SCI1 subcellular localization and gene expression analyses.

(A-H) SCI1-GFP is nuclear localized in planta (tobacco leaves), and is clearly visible in the

interchromatic region (A, C, E and G) and in the nucleolus (B, D, F and H). (A, B):

35Spro:SCI1-GFP expression; (C, D): DAPI staining; (E, F): superposition of upper and

middle upper panels plus the chloroplast (red) fluorescence (merge); (G, H): superposition of

10 (G) and 12 (H) stacks of the GFP, DAPI and chloroplast signals through a cell slice (“3D”

merge). Images are presented as stacks of neighboring sections. (I, J, K, L): representative

image in grayscale of the panels E, G, F and H, respectively. Scale bars are 4μm in all panels.

cl, chloroplast; is, interchromatin space; n, nucleus; nu, nucleolus. (M) SCI1 expression level

in the different organs of N. tabacum (SR-1) as determined by qRT-PCR. Expression in

arbitrary units (A.U.) corresponds to the ratio of the copy number of cDNAs of the SCI1 gene

on the copy number of the constitutive control β-actin gene in a defined amount of total RNA

of each sample (see Methods). (N) Expression level in stigmas/styles during the 12 stages of

tobacco flower development (Koltunow et al., 1990) (A logarithmic scale was used to enable

the detection of the lower expression levels). (O) In situ hybridization on longitudinal

sections of stage 4 stigmas/styles, using a sense probe prepared from clone TOBSH1-002E06

(negative control) and (P) Localization of SCI1 mRNA as revealed by the TOBSH1-002E06

antisense probe. The magnification factor is 40x; arrow cap, papillar cell; p, parenchyma;

ssz, stigmatic secretory zone; stt, stylar transmitting tissue; vb, vascular bundle.

Figure 2 – Expression level of the SCI1 gene in stage 4 stigmas/styles of SCI1Ri and SCI1OE

transgenic plants, determined by qRT-PCR.

30

Expression level in arbitrary units (A.U.) corresponds to the ratio of the copy number of

cDNAs of the SCI1 gene in each transgenic plant (normalized by the internal control β-actin

gene) on the copy number of cDNAs of the SCI1 gene in wild-type plant SR-1 (black bars)

(equally normalized by the β-actin gene), in a defined amount of total RNA (Methods). The

dashed bars represent the transgenic plants that showed altered phenotypes with elongated

styles and larger stigma surface. The chess-painted bars correspond to plants with a smaller

stigma surface, in contrast to empty bars that represent the wild-type-like phenotype. (A)

Expression level in percentage (A.U. x100) for each RNAi transgenic plant obtained. (B)

Expression level in A.U. for each overexpression (O.E.) transgenic plant obtained (A

logarithmic scale was used to allow the comparison of the very different expression levels).

Figure 3 – Analyses of the SCI1 transgenic plant phenotypes.

(A) Flowers of three independent RNAi transformants showing the increased style length at

stages 12, 10 and 9 (from left to right) of flower development. (*) Upper view of wild-type

plant (W.T. SR-1), at stage 10 of flower development, showing the stigma/style completely

enclosed by the corolla. Scale bars represent 10mm. The percentages correspond to the

transcript level of the SCI1 gene in comparison to the wild-type level considered as 100%.

(B) Upper view of the stigma at stage 12 of flower development showing the decreased size

in overexpression plants (SCI1OE 11.1; Ba) and the increased size in RNAi plants

(SCI1Ri14.2; Bc), compared to the wild-type plant (SR-1; Bb). Expression level is in arbitrary

units as described in Figure 2. Scale bar represent 1mm for all images. (C) Longitudinal

section scheme (Ca) representing the region where the SSZ cell layers were counted (≡) (3D;

Supplemental Table 1). The SSZ/STT intersection was defined by a straight line drawn at the

abaxial curves of the stigmatic umbrella-like structure (green dotted line in 3Ca). In light gray

is shown the SSZ area evaluated and measured in the longitudinal sections (Supplemental

Table 1; longitudinal plane 3Ec1). The square (□) indicates the region in which the SSZ cell

numbers were counted in an area of 20,000μm2. The stylar transmitting tissue is represented

in dark gray and its thickness was measured at 400µm below the SSZ/STT intersection (3Ca

red line). The rectangle represents the region shown in 3Ea/b for each plant and in which the

STT thickness and parenchyma cell number were measured. Longitudinal sections of stage

11 stigmas/styles stained with 0.05% toluidine blue are shown at (Cb) for the overexpression

plant SCI1OE 3.1.1; (Cc) wild-type SR-1 and (Cd) RNAi plant SCI1Ri 14.2, providing

evidence for the different areas occupied by each SSZ. Scale bar represents 500μm for all

photos. The blue and black arrows indicate, respectively, the deeper carpel junction in

31

SCI1OE 3.1.1 plant and the vascular bundle. (D) Longitudinal sections of stage 11

stigmas/styles at a higher magnification (200x), demonstrating the altered number of cells in

the stigmatic secretory zone (E) Histological sections of stage 11 styles. Longitudinal

sections of the SCI1OE3.1.1, SR-1 and SCI1Ri14.2 plants, showing the thickness differences

in the stylar transmitting tissue (Ea) and the parenchyma tissue (Eb), taken on the

longitudinal plane indicated by Ec2. Note the differences in the STT thickness of each plant,

indicating the alteration on the cell number in this tissue. (Ec) Transversal section of the

wild-type SR-1 style showing the two different longitudinal planes where the stigmatic

secretory zone area, cell layers and cell number as well as the transmitting tissue thickness

were determined (Ec1; Supplemental Table 1) and where the style thickness and parenchyma

cell number were determined (Ec2; Supplemental Table 1). The longitudinal plane 2

corresponds to the first cell layer behind the vascular bundle. Scale bar represents 50μm in

Ea/Eb and 500μm in Ec. p, parenchyma; stt, stylar transmitting tissue; ssz, stigmatic

secretory zone; vb, vascular bundle; black arrow, vascular bundle.

Figure 4 –Stigma/style tissue analyses in transgenic and wild-type plants.

Longitudinal sections of stigmas/styles from each transgenic and wild-type plants were

analyzed as described in Figure 3Ca for SSZ cell layers, SSZ area, SSZ cell number (in a

20,000 000μm2 area), style thickness (μm), STT thickness (μm) and parenchyma thickness

(n=3 for each plant shown). The above values represent percentages of the wild-type values,

considered as 100%. The raw data can be found on Supplemental Table 1.

* Significantly different from the wild-type by Student’s t-test (p<0.05).

Figure 5 – Very early upper pistil development and differentiation in the wild-type plant

(SR-1).

(A) Scanning electron micrographs of pistils at very early stages of flower development.

Flower buds at the indicated stages (stage -4 to stage 1, respectively Aa to Ae) had the sepals

and petals removed to allow visualization of the pistils. Stigmatic secretory zone formation

and development (Af to Aj), together with epidermis differentiation in papillar cells (Ak to

Ao). Scale bars indicated in each image are 500µm (Aa to Ae), 200µm (Af to Aj) and 50µm

(Ak to Ao). (B) A scheme to illustrate the upper pistil development and stigmatic secretory

zone formation, from stages -4 to 1 (Ba to Be, respectively) of flower development. yellow,

stigmatic tissue; blue, carpel epidermis. Scale bar corresponds to 500µm for all images. (C)

Expression level of the SCI1 gene determined by qRT-PCR in wild-type stigmas/styles from

32

stage -4 to 1 of flower development. Expression in arbitrary units (A.U.) as described in

Figure 1M.

Figure 6 – Scanning electron microscopy (SEM) of the transgenic (T1) and wild-type SR-1

plants.

(A) The early style elongation of the SCI1Ri14.2 RNAi plant (Aa, Ab and Ac), compared to

the wild-type plant (Ad, Ae and Af). Observe that at stage 1 (Ac), the SCI1Ri14.2 stigma is

already positioned above anthers. The style elongation is delayed in SCI1OE3.1.1

overexpression plant (Ag, Ah and Ai). At stage -3 of flower development, it is possible to

observe that the ectopic expression of SCI1 gene in anthers has delayed its development. This

organ has the same size and morphological markers (Koltunow et al., 1990) in both

SCI1Ri14.2 RNAi and the wild-type plants. (B) The premature enlargement of the upper pistil

part of the SCI1Ri14.2 transgenic RNAi plant (Ba, Bb and Bc), compared to the wild-type

plant (Bd, Be and Bf), in contrast to the developmental delay observed for the SCI1OE3.1.1

overexpression plant (Bg, Bh and Bi), at stages -4 (Ba, Bd and Bg), -3 (Bb, Be and Bh) and -

2 (Bc, Bf and Bi) of flower development. (C) The upper pistil growth and differentiation of

the papillae cells that initiates in SCI1Ri14.2 transgenic RNAi plant and in wild-type plant

through stage -4 (Ca and Cd, respectively) and develops through stages -3 and -2 (Cb;Cc

and Ce;Cf, respectively) onward, in contrast to the SCI1OE3.1.1 overexpression plant that

initiates the papillae development through stage -3 (Ch) and develops through stage -2 (Ci)

onward. The scale bars are indicated in each image and represents 500μm (Aa to Ai), 100μm

(Ba to Bi), and 50µm (Ca to Ci).

Figure 7 – Interaction of SCI1 with A-type cyclins.

(A) Interactions were tested using the yeast 2-hybrid system. Baits (GUS, AtCYCA1;1,

AtCYCA2;2, AtCYCD5;1, AtCYCD6;1, AtCDKA;1, and AtCDKB1;1) and prey (AtSCI1,

and AtKRP2) constructs were combined by yeast mating. The GUS bait serves as negative

control. Interaction between prey and bait was assayed by growth on medium lacking

histidine (-His) and by β-galactosidase activity (Lac-Z). The asterisk indicates the use of an

N-terminal deleted version of AtCYC2;2 (the first 64 amino-acids deleted), removing the

destruction box to stabilize the protein. (B) Interactions were tested using the BiFC

technique. Leaf epidermal cell transformed with the NtSCI1 fused to the hGFP (amino acids

1 to 149) and the NtCYCA1;1 fused to the tGFP (amino acids 150 to 238). Upper and middle

33

panel - Restored GFP fluorescence, which is nuclear localized (different magnifications are

shown); bottom panel – middle panel merged with the bright field. Scale bars are 10µm.

Figure 8 – Transcript levels for each gene in stage 4 stigmas/styles of wild-type SR-1 (black

bars), SCI1Ri (dashed bars) and SCI1OE (chess-painted bars) transgenic plants, determined by

qRT-PCR.

(A) SCI1 gene, (B) NtARF8 gene, (C) NtAux/IAA13 gene and (D) NtAux/IAA19 gene.

Arbitrary units (A.U.) in A as described in Figure 2, except for the use of the polyubiquitin

gene as internal control (see Methods). The left axis shows the SCI1Ri plant values and the

right axis shows the SCI1OE plant values. Arbitrary units (A.U.) in B-D as described in Figure

1M, except for the use of the polyubiquitin gene as internal control. The statistically

significant differences between each plant vs. the wild-type by Student’s T-test are indicated

(*p<0.05; **p≤0.001).

Figure 9 - A proposed model for SCI1 action in upper pistil development. After the two

carpels are formed and fused, cells positioned at the upper pistil start dividing at the carpel

junction site. When an appropriate number of cells is reached, they start differentiation in

stigmatic secretory zone (SSZ) and stylar transmitting tissue (STT). In SR-1, the SCI1 level

would regulate cell proliferation and determine the correct developmental stage in which the

differentiation occurs. In RNAi plants (SCI1Ri), the reduced SCI1 level would allow cells to

start proliferating earlier or quicker, reaching the threshold for differentiation in an earlier

flower developmental stage. As these cells would stop dividing at the same developmental

moment as in SR-1, probably under the control of a yet unknown factor, they would

accumulate a greater number of cells. In overexpression plants (SCI1OE), the very high SCI1

level would reduce or delay cells divisions, which consequently would differentiate later.

Again, the unknown factor, that is independent on SCI1, would regulate the moment in which

these cells would stop proliferation, resulting in a reduced number of stigma/style specialized

cells (SSZ and STT).

34

Table 1: Primers used in the gene expression analyses by real time RT-PCR.

Gene Name Forward (5’- 3’) Reverse (5’- 3’)

β -actin agatgatgctccaagggctgtgtt ccatgccaaccatcacaccagt

polyubiquitin tccgacacaatcgacaacgtaa gacgtactgttgtaatcggctagggtacgtc

SCI1 gccacaaacataaggataaatcg cagccacgtagcaaattcattgtt

NtARF8 ggcaggattgcagtgaaagctaca ggtctgattctcttcttcccaagg

NtAux/IAA13 gctcacaactacctctgaagatcgca acctcacgggtaacaaactggtca

NtAux/IAA19 gctgcgagctttaagcacattatcc ggacgagtggcctctcatataatc

The primer sequences were determined based on the sequence of the following TOBEST

clusters: β-actin (TOBC110E12), polyubiquitin (TOBC018H09), NtARF8 (TOB044H02),

NtAux/IAA13 (TOB100E10) and NtAux/IAA19 (TOB056F02).

35

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A B

C

E

G

D

F

H

SCI1-GFP

DAPI

Merge

“3D” Merge

SCI1-GFP

DAPI

Merge

“3D” Merge

cl

cl

n

n

nunu

is

M

0

200

400

600

800

Roo

ts

Ste

ms

Leav

es

Sep

als

Pet

als

Sta

men

s

Stig

mas

/S

tyle

s

Ova

ries

Organs

Exp

ress

ion

Lev

el (

A.U

.)

N

0,001

0,01

0,1

1

10

100

1000

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12Stages

Exp

ress

ion

Lev

el (

A.U

.)

ssz ssz

sttstt

pp

vb

vb

O P

I Merge

cl

n

nu is

J “3D” Merge

K

L

Merge

“3D” Merge

cl

n

nu

Figure 1

Figure 1- SCI1 subcellular localization and gene expression analyses

(A-L) SCI1-GFP is nuclear localized in planta (tobacco leaves), and is clearly visible inthe interchromatic region (A, C, E and G) and in the nucleolus (B, D, F and H). (A, B):35S:SCI1-GFP expression; (C, D): DAPI staining; (E, F): superposition of upper andmiddle upper panels plus the chloroplast (red) fluorescence (merge); (G, H):superposition of 10 (G) and 12 (H) stacks of the GFP, DAPI and chloroplast signalsthrough a cell slice (“3D” merge). Images are presented as stacks of neighboringsections. (I, J, K, L): representative image in grayscale of the painels E, G, F and H,respectively. Scale bars are 4μm in all panels. cl, chloroplast; is, interchromatin space;n, nucleus; nu, nucleolus. (M) SCI1 expression level in the different organs of N.tabacum (SR-1) as determined by qRT-PCR. Expression in arbitrary units (A.U.)corresponds to the ratio of the copy number of cDNAs of the SCI1 gene on the copynumber of the constitutive control β-actin gene in a defined amount of total RNA of eachsample (see Methods).

(N) Expression level in stigmas/styles during the 12 stages of tobacco flowerdevelopment (Koltunow et al., 1990) (A logarithmic scale was used to enable thedetection of the lower expression levels). (O) In situ hybridization on longitudinalsections of stage 4 stigmas/styles, using a sense probe prepared from clone TOBSH1-002E06 (negative control) and (P) Localization of SCI1 mRNA as revealed by theTOBSH1-002E06 antisense probe. The magnification factor is 40x; arrow cap, papillarcell; p, parenchyma; ssz, stigmatic secretory zone; stt, stylar transmitting tissue; vb,vascular bundle.

A B

0102030405060708090

100

W.T

.

SC

I1R

i17

.9

SC

I1R

i11

.3

SC

I1R

i4.

4.1

SC

I1R

i 14.

2

SC

I1R

i9.

1.3

SC

I1R

i13

.3

SC

I1R

i6.

4.1

SC

I1R

i18

.9

SC

I1R

i16

.1

SC

I1R

i19

.9

SC

I1R

i8.

4

SC

I1R

i7.

1

SC

I1R

i20

.9

Plants

Exp

ress

ion

Lev

el (

%)

0,1

1

10

102

103

W.T

.

SC

I1O

E1.

1

SC

I1O

E12

.9

SC

I1O

E13

.9

SC

I1O

E14

.9

SC

I1O

E11

.1

SC

I1O

E10

.1

SC

I1O

E8.

3

SC

I1O

E6.

4

SC

I1O

E3.

1.1

PlantsE

xpre

ssio

n L

evel

(A

.U.)

Figure 2 – Expression level of the SCI1 gene in stage 4stigmas/styles of SCI1Ri and SCI1OE transgenic plants,determined by qRT-PCR.

Expression level in arbitrary units (A.U.) corresponds to the ratioof the copy number of cDNAs of the SCI1 gene in eachtransgenic plant (normalized by the internal control β-actin gene)on the copy number of cDNAs of the SCI1 gene in wild-type plantSR-1 (W.T.) (black bars) (equally normalized by the β-actingene), in a defined amount of total RNA (Methods). The dashedbars represent the transgenic plants that showed alteredphenotypes with elongated styles and larger stigma surface. Thechess-painted bars correspond to plants with a smaller stigmasurface, in contrast to empty bars that represent the wild-type-like phenotype. (A) Expression level in percentage (A.U. x100)for each RNAi transgenic plant obtained. (B) Expression level inA.U. for each overexpression (O.E.) transgenic plant obtained (Alogarithmic scale was used to allow the comparison of the verydifferent expression levels).

Figure 2

SCI1OE 11.1 W.T.

1

10

100

1000

10000

Exp

ressio

n L

evel

(A.U

.)

BSCI1Ri 14.2

a b c

A

W.T. (100%) SCI1Ri 4.4.1 (8.0%) SCI1Ri 16.1 (27.8%)

*

SCI1Ri 14.2 (8.4%)

a b c dSCI1OE 3.1.1 W.T. SCI1Ri 14.2C

Figure 3

1

2

sttp

cE

b

SCI1OE

3.1.1

W.T. SCI1Ri

14.2

a

p

vbvb

pp

ssz ssz ssz

D½

SCI1OE

3.1.1

W.T.

SCI1Ri

14.2

400µ

m

Figure 3 – Analyses of the SCI1 transgenic plant phenotypes.

(A) Flowers of three independent RNAi transformants showing the increased stylelength at stages 12, 10 and 9 (from left to right) of flower development. (*) Upper view ofwild-type plant (W.T.), at stage 10 of flower development, showing the stigma/stylecompletely enclosed by the corolla. Scale bars represent 10mm. The percentagescorrespond to the transcript level of the SCI1 gene in comparison to the wild-type levelconsidered as 100%. (B) Upper view of the stigma at stage 12 of flower developmentshowing the decreased size in overexpression plants (SCI1OE 11.1; Ba) and theincreased size in RNAi plants (SCI1Ri14.2; Bc), compared to the wild-type plant (W.T.;Bb). Expression level is in arbitrary units as described in Figure 2. Scale bar represent1mm for all images. (C) Longitudinal section scheme (Ca) representing the region wherethe SSZ cell layers were counted (≡) (3D; Figure 4). The SSZ/STT intersection wasdefined by a straight line drawn at the abaxial curves of the stigmatic umbrella-likestructure (green dotted line in 3Ca). In light gray is shown the SSZ area evaluated andmeasured in the longitudinal sections (Figure 4; longitudinal plane 3Ec1). The square(□) indicates the region in which the SSZ cell numbers were counted in an area of20,000µm2. The stylar transmitting tissue is represented in dark gray and its thicknesswas measured at 400µm below the SSZ/STT intersection (3Ca green dotted line). Therectangle represents the region shown in 3Ea/b for each plant and in which the STTthickness and parenchyma cell number were measured. Longitudinal sections of stagethickness and parenchyma cell number were measured. Longitudinal sections of stage11 stigmas/styles stained with 0.05% toluidine blue are shown at (Cb) for theoverexpression plant SCI1OE 3.1.1; (Cc) wild-type SR-1 (W.T) and (Cd) RNAi plantSCI1Ri 14.2, providing evidence for the different areas occupied by each SSZ. Scale barrepresents 500µm for all photos. The blue and black arrows indicate, respectively, thedeeper carpel junction in SCI1OE 3.1.1 plant and the vascular bundle. (D) Longitudinalsections of stage 11 stigmas/styles at a higher magnification (200x), demonstrating thealtered number of cells in the stigmatic secretory zone (E) Histological sections of stage11 styles. Longitudinal sections of the SCI1OE3.1.1, W.T. and SCI1Ri14.2 plants, showingthe thickness differences in the stylar transmitting tissue (Ea) and the parenchymatissue (Eb), taken on the longitudinal plane indicated by Ec2. Note the differences in theSTT thickness of each plant, indicating the alteration on the cell number in this tissue.(Ec) Transversal section of the wild-type style showing the two different longitudinalplanes where the stigmatic secretory zone area, cell layers and cell number as well asthe transmitting tissue thickness were determined (Ec1; Figure 4) and where the stylethickness and parenchyma cell number were determined (Ec2; Figure 4). Thelongitudinal plane 2 corresponds to the first cell layer behind the vascular bundle. Scalebar represents 50µm in Ea/Eb and 500µm in Ec. p, parenchyma; stt, stylar transmittingtissue; ssz, stigmatic secretory zone; vb, vascular bundle; black arrow, vascularbundle.

020406080

100120140160

SCI1OE W.T. SCI1Ri

Figure 4

Figure 4 –Stigma/style tissues analyses intransgenic and wild-type plants.

Longitudinal sections of stigmas/stylesfrom each transgenic and wild-type plantswere analyzed as described in Figure 3Cafor SSZ cell layers, SSZ area, SSZ cellnumber (in a 20,000µm2 area), stylethickness (µm), STT thickness (µm) andparenchyma thickness (n=3 for each plantshown). The above values representpercentages of the wild-type values,considered as 100%. The raw data can befound on Supplemental Table 1.* Significantly different from the wild-typeby Student’s t-test (p<0.05).

**

**

* *

* **

Stage -4 Stage -3 Stage -2 Stage

a b c

k l m

d

n

A

h if g

Ba c dbStage -4 Stage -3 Stage -2 Stage

Figure 5

Figure 5 – Very early upper pistil development(SR-1).

(A) Scanning electron micrographs of pistilsFlower buds at the indicated stages (stage -sepals and petals removed to allow visualizationformation and development (Af to Aj), togethercells (Ak to Ao). Scale bars indicated in eachto Aj) and 50µm (Ak to Ao). (B) A scheme tostigmatic secretory zone formation, from stagesdevelopment. yellow, stigmatic tissue; blue,500µm for all images. (C) Expression level ofwild-type stigmas/styles from stage -4 toarbitrary units (A.U.) as described in Figure 1

Stage -1 Stage 1

e

o

j

eStage -1 Stage 1

0

0,4

0,8

1,2

1,6

-4 -3 -2 -1 1Stages

C

Exp

ressio

n L

evel

(A.U

.)

Figure 5

500µm

development and differentiation in the wild-type plant

at very early stages of flower development.-4 to stage 1, respectively Aa to Ae) had the

visualization of the pistils. Stigmatic secretory zonetogether with epidermis differentiation in papillar

each image are 500µm (Aa to Ae), 200µm (Af

to illustrate the upper pistil development andstages -4 to 1 (Ba to Be, respectively) of flower

, carpel epidermis. Scale bar corresponds toof the SCI1 gene determined by qRT-PCR in

1 of flower development. Expression in1M.

STAGE -3 STAGE a b

d e

g h

SC

I1R

i 14

.2W

.T.

SC

I1O

E3

.1.1

AFigure 6

Ba b

d e

g h

STAGE -4 STAGE

SC

I1R

i 14

.2W

.T.

SC

I1O

E3

.1.1

SC

I1

Ca b

d e

g h

STAGE -4 STAGE

SC

I1R

i 14

.2W

.T.

SC

I1O

E3

.1.1

STAGE -2 STAGE +1c

f

i

Figure 6

c

f

i

STAGE -3 STAGE -2

c

f

i

STAGE -3 STAGE -2

Figure 6 – Scanning(SEM) of the transgenicSR-1 plants (W.T.).

(A) The early styleSCI1Ri14.2 RNAi plantcompared to the wildand Af). Observe thatSCI1Ri14.2 stigma isabove anthers. Thedelayed in SCI1OE3plant (Ag, Ah and Ai)development, it is possiblethe ectopic expressionthe ectopic expressionanthers has delayed itsorgan has themorphological markers1990) in both SCI1Ri

wild-type plants. (B)

enlargement of the upperSCI1Ri14.2 transgenicand Bc), compared to(Bd, Be and Bf),developmental delaySCI1OE3.1.1 overexpressionand Bi), at stages -4(Bb, Be and Bh) andflower development.growth and differentiationgrowth and differentiationcells that initiates in SCIRNAi plant and in wildstage -4 (Ca and Cd

develops through stagesand Ce;Cf, respectively)contrast to the SCI1OE

plant that initiates thethrough stage -3through stage -2 (Ci

bars are indicatedrepresents 500µm (Aa

to Bi), and 50µm (Ca

Scanning electron microscopytransgenic (T1) and wild-type

style elongation of theplant (Aa, Ab and Ac),wild-type plant (Ad, Ae

that at stage 1 (Ac), theis already positioned

style elongation is3.1.1 overexpression). At stage -3 of flower

possible to observe thatexpression of SCI1 gene inexpression of SCI1 gene in

its development. Thissame size and

markers (Koltunow et al.,Ri14.2 RNAi and the(B) The prematureupper pistil part of the

transgenic RNAi plant (Ba, Bb

to the wild-type plantin contrast to the

delay observed for theoverexpression plant (Bg, Bh

(Ba, Bd and Bg), -3-2 (Bc, Bf and Bi) of(C) The upper pistil

differentiation of the papillaedifferentiation of the papillaeSCI1Ri14.2 transgenic

wild-type plant throughCd, respectively) and

stages -3 and -2 (Cb;Cc

respectively) onward, inOE3.1.1 overexpression

papillae development(Ch) and develops

Ci) onward. The scalein each image and

Aa to Ai), 100µm (Ba

to Ci).

Figure 7A

GUS

AtCYCA1;1

AtCYCA2;2*

AtCYCD5;1

AtCYCD6;1

AtCDKA;1

AtCDKB1;1

-His Lac-ZFigure 7 – Interaction of SCI1 with A-type cyclins.

(A) Interactions were tested using the yeast 2-hybrid system.Baits (GUS, AtCYCA1;1, AtCYCA2;2, AtCYCD5;1, AtCYCD6;1,AtCDKA;1, and AtCDKB1;1) and prey (AtSCI1, and AtKRP2)constructs were combined by yeast mating. The GUS baitserves as negative control. Interaction between prey and baitwas assayed by growth on medium lacking histidine (-His) andby β-galactosidase activity (Lac-Z). The asterisk indicates theuse of an N-terminal deleted version of AtCYC2;2 (the first 64amino-acids deleted), removing the destruction box to stabilizethe protein. (B) Interactions were tested using the BiFCtechnique. Leaf epidermal cell transformed with the NtSCI1fused to the hGFP (amino acids 1 to 149) and the NtCYCA1;1fused to the tGFP (amino acids 150 to 238). Upper and middlepanel - Restored GFP fluorescence, which is nuclear localized(different magnifications are shown); bottom panel – middlepanel merged with the bright field. Scale bars are 10µm.

B NtCYCA1;1-tGFP

NtS

CI1

-hG

FP

Restored GFP

GFP/Bright field

SCI1/Ubiquitin

***

**

**

*

**

**

** ***

*

** ** *

*

***

**

Plants

A B C D

0

0,5

1

1,5

2

2,5

3

SC

I1R

i14

.2

SC

I1R

i17

.9

SC

I1R

i11

.3

SC

I1R

i4.

4.1

SC

I1R

iE

xpre

ssio

n L

evel

(A

.U.)

0,01

0,1

1

10

100

1000

10000

W.T

.S

CI1

OE

11.1

SC

I1O

E8.

3S

CI1

OE

6.4

SC

I1O

E3.

1.1

SC

I1O

EE

xpre

ssio

n L

evel

(A

.U.)

ARF8

0

0,005

0,01

0,015

0,02

0,025

0,03

0,035

0,04

0,045

0,05

SC

I1R

i 14.

2

SC

I1R

i 17.

9S

CI1

Ri 1

1.3

SC

I1R

i 4.4

.1

W.T

.S

CI1

OE11

.1S

CI1

OE8.

3

SC

I1O

E6.

4S

CI1

OE3.

1.1

PlantsE

xpre

sio

n L

evel

(A

.U.)

IAA13

0

0,005

0,01

0,015

0,02

0,025

0,03

0,035

0,04

0,045

Plants

Exp

resi

on

Lev

el (

A.U

.)

IAA19

0

0,01

0,02

0,03

0,04

0,05

0,06

0,07

0,08

Plants

Exp

resi

on

Lev

el (

A.U

.)

Figure 8 – Transcript levels for each indicated gene in stage 4 stigmas/styles of wild-type (W.T.) (black bars), SCI1Ri (dashed bars) and SCI1OE (chess-painted bars) transgenic plants, determined by qRT-PCR.

(A) SCI1 gene, (B) NtARF8 gene, (C) NtAux/IAA13 gene and (D) NtAux/IAA19 gene. Arbitrary units (A.U.) in A as described in Figure 2, except for the use of the polyubiquitin gene as internal control (see Methods). The left axis shows the SCI1Ri

plant values and the right axis shows the SCI1OE plant values. Arbitrary units (A.U.) in B-D as described in Figure 1M, except for the use of the polyubiquitin gene as internal control. The statistically significant differences between each plant vs. the wild-type by Student’s T-test are indicated (*p<0.05; **p≤0.001).

Figure 8

SC

I1R

i 14.

2

SC

I1R

i 17.

9S

CI1

Ri 1

1.3

SC

I1R

i 4.4

.1W

.T.

SC

I1O

E11

.1S

CI1

OE8.

3S

CI1

OE6.

4S

CI1

OE3.

1.1

SC

I1R

i 14.

2

SC

I1R

i 17.

9S

CI1

Ri 1

1.3

SC

I1R

i 4.4

.1

SC

I1O

E11

.1

SC

I1O

E8.

3

SC

I1O

E6.

4S

CI1

OE3.

1.1

W.T

.

Cel

l nu

mb

er

Development

DifferentiationThreshold

Carpel Formed

SSZ/STT Formed

SCI1Ri

SCI1OEW.T. SCI1 level

LO

W

HIG

H

b

a

BA

SA

L

ME

D

Figure 9 - A proposed model for SCI1action in upper pistil development.

After the two carpels are formed andfused, cells positioned at the upper pistilstart dividing at the carpel junction site.When an appropriate number of cells isreached, they start differentiation instigmatic secretory zone (SSZ) and stylartransmitting tissue (STT). In W.T., the SCI1level would regulate cell proliferation anddetermine the correct developmental stagein which the differentiation occurs. In RNAiplants (SCI1Ri), the reduced SCI1 levelwould allow cells to start proliferatingearlier or quicker, reaching the thresholdfor differentiation in an earlier flowerdevelopmental stage. As these cells wouldstop dividing at the same developmentalmoment as in W.T., probably under thecontrol of a yet unknown factor, they wouldaccumulate a greater number of cells. Inoverexpression plants (SCI1OE), the veryhigh SCI1 level would reduce or delay cellsdivisions, which consequently woulddifferentiate later. Again, the unknownfactor, that is independent on SCI1, wouldregulate the moment in which these cellswould stop proliferation, resulting in areduced number of stigma/style specializedcells (SSZ and STT).

Figure 9

TOBSH1-002E06 1 TCAGAGGTGC GAGTAAATGG GGAGCGATAA GAAGACGACG GAGGAGAAGA

SCI1-ORF 1 ---------- ------ATGG GGAGCGATAA GAAGACGCCG GAGGAGAAGA

TOB068F10 ---------- ---------- ---------- ---------- ----------

TOBSH1-002E06 51 GGAAGCATAA GAGAAATTCG CCTTCTTCTC CACGAGATGA AGTGAAAAGC

SCI1-ORF 35 GGAAGCATAA GAGAAGTTCG CCTTCTTCTC CACGAGATGA AGTGAAAAGC

TOB068F10 ---------- ---------- ---------- ---------- ----------

TOBSH1-002E06 101 AAACGCCAGA ATATCAAAGG GGATGAAGAG CGAAGGAAAG AAAAG---GA

SCI1-ORF 85 AAACGCCAGA ATATCAAAGG GGATGAAGAG CGAAGGAAAG AAAAGAAGGA

TOB068F10 ---------- ---------- ---------- ---------- ----------

TOBSH1-002E06 148 CAAATCCAAG AAGGAGAAGC ACAAATCCCA TAAATCCAAA TGTCATTCTA

SCI1-ORF 135 CAAATCCAAG AAGGAGAAGC ACAAATCCCA T--------- ------TCTA

TOB068F10 ---------- ---------- ---------- ---------- ----------

TOBSH1-002E06 198 GTGAAGAGAA GAAGTCAGGG GAAAAGCACA AAACCAAGAG CCACAAACAT

SCI1-ORF 170 GTGAAGAGAA GAAGTCAGGG GAAAAGCACA AAACCAAGAG CCACAAACAT

TOB068F10 1 ---------- ---------- ---------- ---------- ----------

TOBSH1-002E06 248 AAGGATAAAT CGAAAAACAA GTTTGAAGAG TTATCAAAAG ATGATTATTT

SCI1-ORF 220 AAGGATAAAT CGAAAAACAA GTTTGAAGAG TTATCAAAAG ATGATTATTT

TOB068F10 1 ---------- CGAAAAACAA GTTTGAAGAG TTATCAAAAG ATGATTATTT

TOBSH1-002E06 298 CTCTAAGAAC AATGAATTTG CTTCTTGGCT GAAAGATAAG AAGAATTTGT

SCI1-ORF 270 CTCTAAGAAC AATGAATTTG CTACTTGGCT GAAAGATAAG AAGAATTTGT

TOB068F10 41 CTCTAAGAAC AATGAATTTG CTACTTGGCT GAAAGATAAG AAGAATTTGT

TOBSH1-002E06 348 TCTTCTCAGA TCTTTCGTCT GAGACTGCAC GCAATTTATT CTCTGACTTT

SCI1-ORF 320 TCTTCTCAGA TCTTTCGTCT GAGACTGCAC GCGATTTATT CTCTGACTTT

TOB068F10 91 TCTTCTCAGA TCTTTCGTCT GAGACTGCAC GCGATTTATT CTCTGACTTT

TOBSH1-002E06 398 GTCATACAAT GGAACAAGGG AAAGCTTGAC AGCCAATACT ATGAGGGAAT

SCI1-ORF 370 GTCATACAAT GGAACAAAGG AAAGCTTGAC AGCCAATACT ATGAGGGAAT

TOB068F10 141 GTCATACAAT GGAACAAAGG AAAGCTTGAC AGCCAATACT ATGAGGGAAT

TOBSH1-002E06 448 TGCAACCGG- ---------- ---------- ---------- ----------

SCI1-ORF 420 TGCAACCGGG CCTCGGTCAT CCCACGCTTG GAATATCAAA AAGTAA----

TOB068F10 191 TGCAACCGGG CCTCGGTCAT CCCACGCTTG GAATATCAAA AAGTAATAGA

TOBSH1-002E06 457 ---------- ---------- ---------- ---------- ----------

SCI1-ORF 466 ---------- ---------- ---------- ---------- ----------

TOB068F10 241 ATTCCATGTT TCTTCTCTTT AAGGAGCAGT TGTATTGTCT TTTTTCCAGT

TOBSH1-002E06 457 ---------- ---------- ---------- ---------- ----------

SCI1-ORF 466 ---------- ---------- ---------- ---------- ----------

TOB068F10 291 TGTCCGATGG TTATGTCTTA GGCTTCTGTA TTTTTGTGTT TTCTTTTTTC

TOBSH1-002E06 457 ---------- ---------- ---------- ---------- ----------

SCI1-ORF 466 ---------- ---------- ---------- ---------- ----------

TOB068F10 341 AGCAGAACAT GCTTAGTCTT ATGAAGTTAC TTTCTTGGAT AATGGTAAAA

TOBSH1-002E06 457 ---------- ---------- ---------- ---------- ----------

SCI1-ORF 466 ---------- ---------- ---------- ---------- ----------

TOB068F10 391 TCACCATCTC TGTTGTAAGC TATGTTGTCC GGACTCTCCA AAATCCTGCC

TOBSH1-002E06 457 ---------- ---------- ---------- ---------- ----------

SCI1-ORF 466 ---------- ---------- ---------- ---------- ----------

TOB068F10 441 GCATCCCCGT CGGACCCTCC AAAAATGCAC ATACTTTTAG AGGATCCGAC

TOBSH1-002E06 457 ---------- ---------- ---------- ---------- ----------

SCI1-ORF 466 ---------- ---------- ---------- ---------- ----------

TOB068F10 491 ACGCACCTGG TAACATTTTT AGTGAGTCTG GGCAACATAG GTTGTAAGAG

TOBSH1-002E06 457 ---------- ---------- ---------- ---------- ----------

SCI1-ORF 466 ---------- ---------- ---------- ---------- ----------

TOB068F10 541 TTCTATGCTA GTCCTACCAC GTGACTGCAT TTATCATGGC CTTTGGCTGC

TOBSH1-002E06 457 ---------- ---------- ---------- ---------- ----------

SCI1-ORF 466 ---------- ---------- ---------- ---------- ----------

TOB068F10 591 AGAGACGGAC AATACTTCTT ATGATTCACG TAAACTCAAT AGTTTTTATT

TOBSH1-002E06 457 ---------- ---------- ---------- ---------- ----------

SCI1-ORF 466 ---------- ---------- ---------- ---------- ----------

TOB068F10 641 CATACTTTCT ATATGTATTA AAAATTTATT GAATATTTAT AAATGTTAAA

A

TOBSH1-002E06 457 ---------- ---------- ---------- ---------- ---

SCI1-ORF 466 ---------- ---------- ---------- ---------- ---

TOB068F10 691 ACTATAAATT CCAATAAAAA AAAAAAAAAA AAAAAAAAAA AAA

atggggagcgataagaagacgccggaggagaagaggaagcataagagaagttcgccttct 60

M G S D K K T P E E K r k h k r s s p s 20

tctccacgagatgaagtgaaaagcaaacgccagaatatcaaaggggatgaagagcgaagg 120

s p r d e v k s k r q n i k g d e e r r 40

aaagaaaagaaggacaaatccaagaaggagaagcacaaatcccattctagtgaagagaag 180

k e k k d k s k k e k H K S H S S E E K 60

aagtcaggggaaaagcacaaaaccaagagccacaaacataaggataaatcgaaaaacaag 240

K S G E K H K T K S H K H K D K S K N K 80

tttgaagagttatcaaaagatgattatttctctaagaacaatgaatttgctacttggctg 300

F E E L S K D D Y F S K N N E F A T W L 100

aaagataagaagaatttgttcttctcagatctttcgtctgagactgcacgcgatttattc 360

K D K K N L F F S D L S S E T A R D L F 120

tctgactttgtcatacaatggaacaaaggaaagcttgacagccaatactatgagggaatt 420

S D F V I Q W N K G K L D S Q Y Y E G I 140

gcaaccgggcctcggtcatcccacgcttggaatatcaaaaagtaa 465

A T G P R S S H A W N I K K * 154

Supplemental Figure 1 – Sequences of the SCI1 cDNA clones and the deduced amino acid sequence showing

the functional domains identified by in silico analysis. (A) Nucleotide sequence of the clone TOBSH1-002E06,

representing three identical sequences identified by SSH (De-Paoli et al., manuscript in preparation), the clone

TOB068F10, identified by homology search against the TOBEST database (Quiapim et al., 2009), and the PCR

product of the putative open reading frame (“SCI1-ORF”), which was used in SCI1Ri

and SCI1OE

constructions,

aligned by Dialign 2.2.1 (Brudno et al., 2003). The PCR primer sequences are underlined, the bold letters

represent the 5’UTR sequence and the letters in italics represent the 3’UTR sequence. The initial ATG is

highlighted in light gray, the stop codon is highlighted in dark gray and the mismatches are highlighted in black.

The gaps (-) were introduced to better align the sequences, which showed codon deletions and/or insertions

(AAG, encoding the amino acid Lysine; and CATAAATCCAAATGT, encoding the amino acids Lysine,

Serine, Lysine, Cysteine and Histidine, respectively). (B) The “SCI1-ORF” nucleotide and deduced amino acid

sequences showing the putative lysine-rich domain (LRD) in light gray, the nuclear localization signal (NLS)

indicated in lowercase letters, the ser/thr/tyr phosphorylation sites (prediction ≥ 96%) are shown by bold

underlined amino acids and the two cyclin interaction domains (LIG_CYCLIN) are highlighted in dark gray.

The first amino acid “K” from the LIG_CYCLIN domain also belongs to the LRD domain. The bold underlined

nucleotide sequences represent the qRT-PCR primers. The symbol * refers to the stop codon. The nucleotide

and amino acid positions are indicated.

B

┌----------DOMAIN I----------┐┌------------------------DOMAIN II-----------------------------┐┌--- NtSCI1 MGSDKKTPEEKRKHKRSSPSSPR-DEVKS-KRQNIKGD-----------EERRK-E--KKDKS-KKEKHKSHSSEEKKSGEKHKTKSH-KHKDKSKNK

SlSCI1 MGSDRKRKEEKMKHKRNSPSSPQADEGRS-KRQKIKGD-----------EETSK-DKSRKEKH-KSHKSKRRSNEDRESGEKHKSKSH-KHKDKLKIK

StSCI1 MGSDRKMKEEKIKHKRSSPSSPQADEGRS-KRQKIKGD-----------EEPSK-DKSRKDKH-KSHKSKRHSNEEKESGEKHKSKSH-KHKDKLKIK

VvSCI1 MGS-----ESKEKKRRSSPSISS-DGGKG-KRRRSVED------------K-KE-K--RKDKK-SHRHSKHHSDKEKKSEGKHKDKRH-KRDRHLILE

HvSCI1 MGGG----EAKSRKRRSSPSSGEEGERERKKRRDKKESRRSGR----GSDEEEE-KRRRKKKHGDRGKDKERDSKERRSKEKDKSKRKDKDVSSLKQD

OsSCI1 MGG-----EGKSRKRRSSPSSGEEEERERKKRRDKKESRRSSRDEQAEEEEEEERRRRKKKKHGDRGKDKERDSKEKHSKEKEKSKRKHKD-----DD

ZmSCI1 MGGG----EGKSKKRRSSTSSAEEEGGER-KRRDKKESKRRSRDD----REDDDDRHKKKGKHIDRNKGKERDSKDRHSKEKT-SKRKDKD-----AA

AtSCI1 MVSERSSKEKKRSRARSEDSSSSDYEEKVKRHRGTEKD-----------DERRSRRSDKKDK--KSHKHHKSSTSKKSKDDKPKKKHT-ESDHKLKEG

cons * . * * : *.. * . ::: . : . :* * . : : . ..: . * * :

-------------------------------DOMAIN III---------------------------------┐ NtSCI1 FEELSKDDYFSKNNEFATWLKDKKNLFFSDLSSETARDLFSDFVIQWNKGKLDSQYYEGIATGPRSSHAWNIK-K

SlSCI1 FEELSKDDYFSKNNEFATWLKDKKKLFFSDLSSEAARDLFSDFVKEWNKGKLDIQYYEGITTAPRSSHAWNIK-K

StSCI1 FEELSKDDYFSKNNEFATWLKEKKKLFFSDLSSEAARDLFSNFVKDWNKGKLDIQYYEGITTAPRSSHAWNIK-K

VvSCI1 FQELSNDDYFSKNNEFAAWLKEKRKIYFADLSTESARELFTEFVKDWNKQKLESKYYEGIVTGPRTSHKWNIK-Q

HvSCI1 IKEISKDDYFAKNNEFATWLKEEKGKYFSDLSSESARDIFLKFVKQWNKGKLPSQYYEGITTGPRSAHNWNIKKA

OsSCI1 FKEISKDDYFAKNNEFATWLKEEKGKFFSDLSSESARDLFEKFVKTWNKGKLPSQYYEGITRGPRSAHKWNIK-V

ZmSCI1 FKEISKDDYFAKNNEFATWLKEEKGKYFSDLSSESARDLFLKFVKQWNKGKLPSQYYEGITSGPRSAHNWNIK-A

AtSCI1 IPELSMEDYFSKNNEFATWLKEEKRTYFNDLTTEAARGLFSRFVKRWNRGKLESRYYEGISTAPRTAHDWMIKRR

Cons : *:* :***:******:***::: :* **::*:** :* ** **: ** :***** .**::* * **

BAD AVG GOOD

Supplemental Figure 2 – Amino acid sequence alignment of the SCI1 protein and the putative homologous

sequences found in other plant species. Multiple sequence alignment built on T-COFFEE program (version

5.53). The color scale represents the alignment score. The proposed Domains I, II and III are indicated. NtSCI1

(the N. tabacum sequence here described), SlSCI1 - tomato (AC212309), StSCI1 - potato (AC233353), VvSCI1

- grapevine (AM424297), HvSCI1 - barley (AK252156), OsSCI1 - rice (NM_001052562), ZmSCI1 - corn

(EU958997), AtSCI1 – Arabidopsis At1g79200 (NM_106571).

E 20 µm

C D 20 µm

A B 50 µm 50 µm

Supplemental Figure 3 – Analysis of anther morphological markers from floral buds at very early stages of

flower development. Anthers were collected from the same floral buds as the ones from which the

stigmas/styles were used for scanning electron microscopy (SEM) analysis and for RNA extraction for qRT-

PCR. Anthers were dissected from floral buds at the relevant developmental stages, fixed, embedded in

paraffin, transversely sliced into 8µm sections and stained with 0.05% toluidine blue. This analysis was

performed to confirm the correct evaluation of the flower developmental stage by comparison with the anther

morphological markers described by Koltunow et al (1990). (A) Transversal section of anther at stage -4,

stained with 0.05% toluidine blue, showing the microspore mother cell (white arrow), formed inside the pollen

sac, visibly distinguishable from the tapetum cells. At this stage, the tapetum is clearly divided in inner (red

arrow) and outer tapetum (yellow arrow). (B) Transversal section of anther at stage -3, with an evident callose

deposition in the microspore mother cell walls (brown arrow) (C) Anther stage -2, showing the larger and

multinucleated (black arrows) tapetum. (D) Anther stage -1, detailing the dyad (black and green arrows),

resultant from the meiosis I completion. (E) Anther stage 1, presenting the completed meiosis shown clearly by

tetrad formation (white arrow).

NtSCI1 101 KDKKNLFFSDLSSET 115

KD+ FFS + ++T

AtSIM 89 KDEIERFFSSVYNQT 103

**: : ***.: .:*

NtSCI1 KDKKNLFFSDLSSETA-

AtSIM KDEIERFFSSVYNQTK-

NtaKIS2 -TDLEEFFAAAEKDILK

NtKIS1a -KEIEEFFAARQKAILK

NsKIS1 -KEIEDFFAVRQKAIFK

AtKRP1 -SEIEDFFVEAEKQLKE

AtKRP2 -AELEDFFQVAEKDLRN

Consensus ei# FF k

Prim.cons. K2EIEDFFA2AEK3I2K

Supplemental Figure 4 – Sequence analysis between SCI1 and the most closely related classes of cell cycle

regulators. (A) Similarity between NtSCI1 and AtSIM revealed by BLASTP two sequences. The bold

underlined region represents the conserved domain between AtSIM and CKI/KRPs classes as shown by

Churchman et al. (2006). This region includes one of the cyclin interaction domains recognized at the NtSCI1

protein sequence. (B) Alignment between NtSCI1, AtSIM and the most related CKI/KRPs at the conserved

region of the CDK inhibitors mentioned above. The alignment was produced by the Multalin program

(http://www.expasy.org/tools/#align). Note the two conserved phenylalanine (F) residues and the very charged

region before them present on all proteins aligned. (C) Phylogram tree generated by ClustalW2 alignment

performed using the sequences showed in B. The colors were inserted to facilitate the visualization of the three

different classes of cell cycle regulators (CKI/KRPs, SIM and SCI1).

A

B

C

Supplemental Table 1 –Stigma/style tissues analysis in transgenic and wild-type plants.

SCI1OE

3.1.1 Wild type SCI1Ri

14.2

Number of SSZ cell

layersa *8.3 ± 0.6 13.0 ± 1.0 *17.7 ± 2.1

SSZ area (µm2)

a *191,381.3 (77%) ± 10,834 248,272.0 (100%) ± 9,441 *367,355.3 (148%) ± 13,474

SSZ cell number b

29.3 ± 4.0 36.0 ± 1.0 36.7 ± 1.5

Style thickness (µm)c

*510.7 ± 16.8 559.9 ± 20.4 *657.0 ± 37.3

STT thickness (µm)d

*58.5 ± 7.2 88.4 ± 7.1 *113.1 ± 5.5

Parenchyma cell layerse

14.0 ± 1.0 14.3 ± 0.6 *17.3 ± 0.6 aAs shown in Figure 3Ca and 3D.

bCounted in an area of 20,000µm

2, Figure 3Ca and 3D.

cMeasured at 400µm below the intersection of the stigmatic secretory zone and transmitting tissue, as shown in Figure

3Ca/3Eb. dMeasured at 400µm below the intersection of the stigmatic secretory zone and transmitting tissue (showed in Figure 3Ca and

3Ec1). eCounted just behind the vascular bundle, as shown in Figure 3Ec2.

The values represent the mean of three individual determinations with the standard deviation.

*Significantly different from the wild-type by Student’s t-test (p<0.05).

Supplemental Table 2 - Pairwise 2-hybrid interactions between Arabidopsis SCI1, and CDK

and cyclins.

Gene

OD600 cells

grown in SD

-L/-T/+H

mediuma

OD600 cells

grown in SD

-L/-T/-H

mediuma

Ratiob X-Gal positive

CDKA;1 0.565 0.079 14% -

CDKB1;1 0.564 0.068 12% -

CDKB1;2 0.447 0.077 17% -

CDKB2;1 0.596 0.088 15% -

CDKB2;2 0.586 0.077 13% -

CDKC;1 0.562 0.079 14% -

CDKC;2 0.625 0.074 12% -

CDKD;1 0.552 0.073 13% -

CDKD;2 0.515 0.064 12% -

CDKD;3 0.305 0.072 24% -

CDKE;1 0.570 0.081 14% -

CYCA1;1 0.663 0.589 89% +

CYCA1;1c 0.578 0.073 13% -

CYCA2;1c 0.559 0.073 13% -

CYCA2;2 0.524 0.071 14% -

CYCA2;2c 0.434 0.518 119% +

CYCA2;3 0.552 0.096 17% -

CYCA3;1c 0.573 0.081 14% -

CYCA3;2 0.598 0.073 12% -

CYCB1;1 0.410 0.085 21% -

CYCB1;1c 0.544 0.070 13% -

CYCB1;3 0.534 0.084 16% -

CYCB1;3c 0.589 0.062 11% -

CYCB1;4c 0.488 0.069 14% -

CYCB2;1 0.540 0.069 13% -

CYCB2;1c 0.567 0.095 17% -

CYCB2;2 0.555 0.065 12% -

CYCB2;3 0.568 0.078 14% -

CYCB3;1 0.499 0.071 14% -

CYCC1;1 0.356 0.082 23% -

CYCD1;1 0.510 0.082 16% -

CYCD2;1 0.387 0.073 19% -

CYCD3;2 0.474 0.055 12% -

CYCD4;2 0.540 0.078 14% -

CYCD5;1 0.652 0.114 17% -

CYCD6;1 0.502 0.069 14% -

CYCH;1 0.488 0.083 17% -

CYCP3;1 0.559 0.072 13% -

CYCP3;2 0.564 0.080 14% -

CYCT1;3 0.580 0.082 14% -

CDKA;1 0.565 0.079 14% -

aOD600 of cells after two days of growth.

bRatio of the OD600 of cells grown in -L/-T/-H on -L/-T/+H.

cTruncated version lacking the destruction box in order to stabilize the protein

Supplemental Table 3 - Pairwise 2-hybrid interactions between Arabidopsis KRP2, and CDK

and cyclins.

Gene

OD600 cells

grown in SD

-L/-T/+H

mediuma

OD600 cells

grown in SD

-L/-T/-H

mediuma

Ratiob X-Gal positive

CDKA;1 0.664 0.685 103% +

CDKB1;1 0.676 0.076 11% -

CDKB1;2 0.668 0.090 13% -

CDKB2;1 0.698 0.112 16% -

CDKB2;2 0.716 0.152 21% -

CDKC;1 0.645 0.108 17% -

CDKC;2 0.635 0.121 19% -

CDKD;1 0.681 0.103 15% -

CDKD;2 0.652 0.590 90% -

CDKD;3 0.489 0.092 19% -

CDKE;1 0.466 0.090 19% -

CYCA1;1 0.718 0.082 11% -

CYCA1;1c 0.714 0.407 57% -

CYCA2;1c 0.688 0.109 16% -

CYCA2;2 0.723 0.115 16% -

CYCA2;2c 0.727 0.157 22% -

CYCA2;3 0.702 0.090 13% -

CYCA3;1c 0.422 0.120 28% -

CYCA3;2 0.709 0.128 18% -

CYCB1;1 0.46 0.123 27% -

CYCB1;1c 0.586 0.085 15% -

CYCB1;3 0.512 0.096 19% -

CYCB1;3c 0.715 0.107 15% -

CYCB1;4c 0.395 0.085 22% -

CYCB2;1 0.562 0.531 94% -

CYCB2;1c 0.701 0.108 15% -

CYCB2;2 0.725 0.407 56% -

CYCB2;3 0.721 0.136 19% -

CYCB3;1 0.517 0.102 20% -

CYCC1;1 0.708 0.108 15% -

CYCD1;1 0.552 0.072 13% -

CYCD2;1 0.433 0.403 93% -

CYCD3;2 0.419 0.122 29% -

CYCD4;2 0.718 0.422 59% +

CYCD5;1 0.513 0.521 102% +

CYCD6;1 0.483 0.471 98% +

CYCH;1 0.356 0.097 27% -

CYCP3;1 0.710 0.068 10% -

CYCP3;2 0.720 0.093 13% -

CYCT1;3 0.696 0.106 15% +

CDKA;1 0.664 0.685 103% +

aOD600 of cells after two days of growth.

bRatio of the OD600 of cells grown in -L/-T/-H on -L/-T/+H.

cTruncated version lacking the destruction box in order to stabilize the protein

Supplemental Table 4 – Amino acid sequences belonging to each ELM (Eukaryotic Linear Motif) interacting

domain identified in NtSCI1 protein and CDK/cyclin complex inhibitors, described in N. tabacum and some

related organisms.

Genes ELM Domains

LIG_APC

C D/KEN

box

LIG

CYCLIN_1

MOD_CDK MOD

ProDKin_1

LIG MAPK_1 MOD

CK1_1

MOD CK2_1

NtSCI1 - KNLFF

RDLF

- DKKTPEE

KRSSPSS

SPSSPRD

KDKKNLFF SSPSSPR

SPSSPRD

SHSSEEK

SDLSSET

SSETARD

DKKTPEE

KDKSKKE

KSHSSEE

SIM - RKLM - GCTTPTS

TATTPPP PPSTPSS

- STPSSLG

SSTTTAI STTTAIT

SFRSCSR

TSLSKYE

SRM1 RKLLV

KLLV

NFPTPIK NFPTPIK

RCSTPTS

VVDSPPP

RSCKRKLLV SKTSKTK

STPTSQE

SAPSATA

STPTSQE

LLVSTCE

SRM2 KDLRF SLCTPTS RKRPREISL

KRPREISL KKTRLSKDLRF

KTRLSKDLRF

SLCTPTS LLETLEE

KPRSQEE QDSSKKE

SRM3 RKLTP GCKTPTS

RKLTPVN

KRKLTPVNV

RKLTPVNV

SSGTKRK RLPTRPE

IPDSDHE

EDPTVNE

NtaKIS2 EREVLE

SRRRLT

PKENA

KSLDL - SLVTPTS

ELSSPKE

KSKGIGEMTV SLVTPTS

SELSSPK

SNGSSKS SSKSLDL

SKESIKA

GEMTVME

CVRSHSE

ELSSPKE PSETDLE

NsKIS1 LKEND - RERTPEK KLISPAL

VGDTPAG

NLVSPSG

RERTPEK

- SCCSRNG

SAESKEA

RNGSTEE

KLSSERE

KMPSEKE

NtKIS1* - - RQRTPEK KLMSPPL

VGDTPAG SLVSPSS

RQRTPEK

RKCKGIEEVTI

KCKGIEEVTI

SLVSPSS

SPSSSVN SAESKEA

EEVTIME

RNGSSEE KMPSEKE

AtKRP1 - KELI

RKLF

- - RSRRIVYV

RSEKSSSVSV

KKKELIHL

KKELIHL

SEKSSSV

SSVSVVG

SSCSGSN

GRKTMEE

ETVTAEE

EMPTESE

PTESEIE

AtKRP2 SRIILS SRRRLR

LRKSLH

LRNKLL

- - IILSPCV RRDSPPV

KRRKMEEEVDL RRKMEEEVDL

RKMEEEVDL

KSKRRIEFVDL

KRRIEFVDL

RRIEFVDL

SETSVVI SSVSCCS

SCCSTSE

SEESMNM

SCCSTSE CCSTSEE

LRKSLHE

LHETVKE

Nta, Nicotiana tabacum; Ns, Nicotiana sylvestris; Nt, Nicotiana tomentosiformis; At, Arabidopsis thaliana.

*The alternative spliced forms NtKIS1a and NtKIS1b have these same domains sequences. The symbol “-”

means the specified domain is either absent or has an e-value above the ELM threshold.

LIG_APCC Dbox_1/KENbox_2, motif containing an RXXL and KEN motif, respectively, that binds to the

Cdh1 and/or Cdc20 components of APC/C thereby targeting the protein for 26S proteasome mediated

degradation in a cell cycle dependent manner, Dbox .R..L. , KEN .KEN.;

LIG CYCLIN_1, Substrate recognition site that interacts with cyclin and thereby increases phosphorylation by

CDK/cyclin complexes, predicted protein should have the MOD_CDK site, also used by cyclin inhibitors

[RK].L.{0,1}[FYLIVMP];

MOD_CDK, Substrate motif for phosphorylation by CDK, ...([ST])P.[KR]

MOD ProDKin_1, Proline-Directed Kinase (e.g. MAPK, CDK-like kinases) phosphorylation site in higher

eukaryotes, ...([ST])P..;

LIG MAPK_1, MAPK interacting molecules (e.g. MAPKKs, substrates, phosphatases) carry docking motif

that help to regulate specific interaction in the MAPK cascade, the classic motif approximates (R/K)xxxx#x#

where # is a hydrophobic residue, [KR]{0,2}[KR].{0,2}[KR].{2,4}[ILVM].[ILVF];

MOD CK1_1 and MOD CK2_1, CK1 and CK2 phosphorylation sites, S..([ST])... and ...([ST])..E ,

respectively.

Accession numbers are: SIM (At5g04470); SMR1 (At3g10525); SMR2 (At1g08180); SMR3 (At5g02420); N.

tabacum NtaKIS2 (CAD56868); N. sylvestris NsKIS1 (CAC82732); N. tomentosiformis NtKIS1a (CAC82731);

N. tomentosiformis NtKIS1b (CAC82734); A. thaliana AtKRP1 (NP_179924); A. thaliana AtKRP2

(NP_190632).

 

Anexo 2

Curriculum vitae

 

CURRICULUM VITAE

HHEENNRRIIQQUUEE CCEESSTTAARRII DDEE PPAAOOLLII May, 2010

1. Professional Address:

University of São Paulo Faculty of Philosophy, Sciences and Languages of Ribeirão Preto Department of Biology 14040-901, Ribeirão Preto, SP, Brazil Phone: (+55) 16 3602 3702; (+1 858) 822 2673 Fax: (+55) 16 3602 4886 E-mail: depaolibio@gmail.com; depaoli@rge.fmrp.usp.br; hpaoli@ucsd.edu

2. Present Position

PhD Student at University of São Paulo (USP), Dr. Maria Helena de Souza Goldman’s laboratory, Department of Genetics at Faculty of Medicine at Ribeirão Preto/SP.

PhD Visiting Graduate Student at University of California San Diego (UCSD), Dr. Yunde Zhao’s laboratory, Department of Cell & Developmental Biology.

Research Projects: a) Auxin signaling; b) Characterization of plant reproductive genes; c) Studies and manipulation of flowering in plants.

3. Education 2006 – Nowadays PhD in Genetics. University of São Paulo, Faculty of Medicine of

Ribeirão Preto, Department of Genetics, with an internship at University of California San Diego/USA.

Thesis Title: “SCI1, A NOVEL TISSUE-SPECIFIC INHIBITOR OF CELL PROLIFERATION RELATED TO AUXIN SIGNALING”.

Thesis Advisor: Dr. Maria Helena de Souza Goldman

2004 – 2006 Ms. in Genetics. University of São Paulo, Faculty of Medicine of Ribeirão Preto, Department of Genetics.

Dissertation Title: ANALISYS OF GENE EXPRESSION IN Nicotiana tabacum PISTIL: IDENTIFICATION OF SPECIFIC GENES BY SUBTRACTIVE HYBRIDIZATION AND CELLULAR AND TEMPORAL CHARACTERIZATION.

Dissertation Advisor: Dr. Maria Helena de Souza Goldman

2000 – 2003 B.Sc. in Biological Sciences Izabela Hendrix University, FAMIH, Belo Horizonte, Brazil. Monograph Title: MOLECULAR CHARACTERIZATION OF MICRORGANISMS IN THE SAVANES ECOSSYSTEM - Coletotrichum graminicola. Monograph Advisor: Dr. José Edson Fontes Figueiredo (EMBRAPA).

4. Academic experience

- Continuing Education

1 – International Course and Practical Training on Molecular Techniques in Plant Science. Cold Spring Harbor Laboratory (CSHL). New York, USA. 2007 (210h)

 

2 – International Course and Practical Training on Functional Genomics of Vegetal Reproduction. Federal University of Rio de Janeiro, UFRJ. Financial aid from “National Council of Research and Development” (CNPq), Brazil. 2006 (90h).

3 – International Course on Molecular Mechanisms Controlling Flower Development. University of Campinas (UNICAMP), Campinas, Brazil. 2007 (24h).

4 – Practical Training on Bidimensional Electrophoresis. Brazilian Company of Agricultural Research (EMBRAPA), CNPMS, Sete Lagoas, Brazil, 2005 (40h).

5 – Course on Differential expression of genes in fungi. University of São Paulo (USP-RP), Ribeirão Preto. Financial aid from “National Council of Research and Development” (CNPq), Brazil. 2004 (34h).

6 – Course on Cell cycle control, Federal University of Minas Gerais, Belo Horizonte, Brazil. 2004 (45h).

- Advising

Marcella de Francisco Amorim. (Undergraduate program) Gene expression analysis of the ABC transporters from WBC family using real time RT-PCR (2006). Principal Advisor: Maria Helena S. Goldman; Supervisor: Ms. Henrique C. De Paoli (DE-PAOLI, H.C.).

DE-PAOLI, H.C. Surveyor of the International Symposium of Undergraduate Science of the University of São Paulo, 14ºSIICUSP. Ribeirão Preto, Brazil, 2006

Alexandre Palma Boer Martins. (Undergraduate program) Subcloning and sequencing genomic clones of the pistil specific methyl transferase from Nicotiana tabacum L. (2005). Principal Advisor: Maria Helena S. Goldman; Supervisor: Henrique C. De Paoli (DE-PAOLI, H.C.).

- Oral Presentations

1 – “SCI1 is a component of the nuclear signal transduction pathway engaging auxin signaling and cell division/differentiation control in upper pistil”. 6th Cell Cycle Meeting – Salk Institute, San Diego, CA, USA. 2009.

2 – “Suppression Subtractive Hybridization (SSH) to identify genes preferentially expressed in stigma/style of Nicotiana tabacum”. XXXIV Congress of the Brazilian Society for Biochemistry and Molecular Biology – SBBQ, Águas de Lindóia, SP, Brazil. 2005.

3 – “Assessment of the genetic diversity of Colletotrichum graminicola isolated from sorghum in Brazil based on sequencing analysis of 18S rDNA and 18S-28S intergenic spacer”. I Biological Sciences Week, Belo Horizonte, Brazil, 2001.

- Lectures

1 – “SCI1 is a component of the nuclear signal transduction pathway engaging auxin signaling and cell division/differentiation control in upper pistil”.Richard B. Simches Research Center, MGH/Harvard Medical School, Boston/MA, USA. 2009.

 

2 – “SCI1 is a component of the nuclear signal transduction pathway engaging auxin signaling and cell division/differentiation control in upper pistil”. Joint Lab Meeting UCSD/SALK Institute, San Diego/CA, USA. 2009.

3 – “A Nicotiana tabacum pistil specific lysine-rich protein controls stigma size and inhibits style elongation: a component of the auxin signal transduction pathway?. International Course and Practical Trainning on Molecular Techniques on Plant Science, New York/NY, USA. 2007.

4 - “Studies of gene expression in plants”. X Summer Course of Genetics. Faculty of Medicine of Ribeirão Preto.. University of São Paulo - Department of Genetics. Ribeirão Preto, SP, Brazil. 2005; 2010.

5 – Discipline on General Genetics. Izabela Hendrix University, Belo Horizonte, Brazil. 2002 and 2003.

- Relevant Abstracts and/or Participation in Meetings

DE-PAOLI, H. C.; BRITO, M. S. ; QUIAPIM, A. C.; TEIXEIRA, S. P.; GOLDMAN, G. H.; DORNELAS, M. C.; ZHAO, Y.; GOLDMAN, M. H. S. SCI1 is a component of the nuclear signal transduction pathway engaging cell division/differentiation control and auxin signaling in upper pistil. In: 6th Cell Cycle Meeting – Salk Institute, San Diego, CA, USA. 2009.

DE-PAOLI, H. C.; BRITO, M. S. ; QUIAPIM, A. C. ; PRANCHEVICIUS, M. C. S. ; DORNELAS, M. C. ; TEIXEIRA, S. P. ; GOLDMAN, G. H. ; GOLDMAN, M. H. S. A novel stigma/style-specific gene, SCI1, encodes a lysine-rich protein that controls cell division and differentiation. In: XX International Congress on Sexual Plant Reproduction. Brasília/DF, Brazil, 2008.

DE-PAOLI, H. C. ; BRITO, M. S.; QUIAPIM, A. C. ; DORNELAS, M. C. ; GOLDMAN, G. H. ; McClure, B. ; GOLDMAN, M. H. S. The self-incompatibility related HT-protein remains functional in self-compatible Nicotiana tabacum: does it have general role in pollination? In: XX International Congress on Sexual Plant Reproduction. Brasilia/DF, Brazil, 2008.

DE-PAOLI, H. C. ; BRITO, M. S. ; QUIAPIM, A. C. ; DORNELAS, M. C. ; TEIXEIRA, S. P. ; GOLDMAN, G. H. ; GOLDMAN, M. H. S. . A novel tobacco gene encodes a pistil-specific lysine-rich protein that controls stigma size via cell cycle inhibition and influences its developmental timing. In: III International Symposium of Developmental Biology. Uberaba, Brazil, 2007.

DE-PAOLI, H. C. ; BRITO, M. S. ; QUIAPIM, A. C. ; RODRIGUES, RAO ; DORNELAS, M. C. ; TEIXEIRA, S. P. ; GOLDMAN, G. H. ; GOLDMAN, M. H. S. . A tobacco pistil-specific lysine-rich protein controls stigma size and inhibits style elongation. In: 53º Brazilian Congress of Genetics. Águas de Lindóia, Brazil, 2007.

DE-PAOLI, H. C. ; BRITO, M. S. ; QUIAPIM, A. C. ; RODRIGUES, RAO ; DORNELAS, M. C. ; TEIXEIRA, S. P. ; GOLDMAN, G. H. ; GOLDMAN, M. H. S. . A Tobacco pistil-specific lysine-rich protein controls stigma size and inhibits style elongation. In: Plant Biology & Botany 2007, Chicago, USA, 2007.

DE-PAOLI, H. C. ; BRITO, M.S.; QUIAPIM, A.C.; RODRIGUES, R.A.O.; DORNELAS, M.C.; TEIXEIRA, S.P.; GOLDMAN, G.H.; GOLDMAN, M.H.S. A Nicotiana tabacum pistil specific lysine-rich protein controls stigma size and inhibits style elongation. In: I Brazilian Symposium of Molecular Genetics of Plants. Natal, Brazil, 2007.

 

DE-PAOLI, H. C. ; BRITO, M. S. ; QUIAPIM, A. C. ; GOLDMAN, G. H. ; GOLDMAN, M. H. S. . Suppression subtractive hybridization reveals genes specifically expressed in wet stigma and underlie plant reproduction mechanisms not present in dry stigmas. In: XIXth International Congress on Sexual Plant Reproduction: from gametes to genes. Budapest. Hungary, 2006.

DE-PAOLI, H. C. ; BRITO, M. S. ; QUIAPIM, A. C. ; GOLDMAN, G. H. ; GOLDMAN, M. H. S. . Suppression Subtractive Hybridization reveals the reproductive organs specific transcriptome of Nicotiana tabacum. In: International Symposium of Graduation and Research. 2ºSINPOSPq. Ribeirão Preto, Brazil. 2006.

DE-PAOLI, H. C. ; BRITO, M. S. ; QUIAPIM, A. C. ; RIBEIRO, D. C. D. ; Marques, E.R. ; MOLFETTA, J. B. ; GOLDMAN, G. H. ; DORNELAS, M. C. ; GOLDMAN, M. H. S. Suppression subtractive hybridization to identify genes preferentially expressed in stigma/style of Nicotiana tabacum. In: 51º Brazilian Congress of Genetics, Águas de Lindóia SP, Brazil, 2005.

5. Publications

DE-PAOLI, H.C., ZHAO, Y., GOLDMAN, M.H.S. (2010). SCI1 is a component of the nuclear signal transduction pathway engaging cell division/differentiation control and auxin signaling in upper pistil. Manuscript in preparation.

DE-PAOLI, H.C.; BRITO, M. S. ; QUIAPIM, A. C. ; TEIXEIRA, S. P. ; DeVeylder, L. ; STRINI, E.J.; GOLDMAN, G. H. ; DORNELAS, M. C. ; GOLDMAN, M. H. S. (2010). A novel tobacco stigma/style gene, SCI1, encoding a lysine-rich protein that controls cell division and differentiation. Plant Cell, submitted.

DE-PAOLI, H.C., BRITO, M.S., QUIAPIM, A.C., DORNELAS, M.C., GOLDMAN, G.H., McCLURE, B.A., GOLDMAN, M.H.S.(2010) The self-incompatibility related HT-protein remains functional in self-compatible Nicotiana tabacum: does it have general role in pollination? Manuscript in preparation.

DE-PAOLI, H.C., BRITO, M.S., QUIAPIM, A.C., BERNARDES, L., GOLDMAN, G.H., GOLDMAN, M.H.S. (2010) Unraveling the specific pattern of gene expression in the wet stigma specie N. tabacum by suppression subtractive hybridization underlie unique plant reproduction mechanisms. Manuscript in preparation.

AVANCI, N.C., ANGELO, P.C.S., CALIXTO, C.P.G., MOLFETTA-MACHADO, J.B., DE-PAOLI, H.C., QUIAPIM, A.C., GOLDMAN, G.H., BARKMAN, T.J., MURAKAMI, M.T., MORAES, L.A.B. & GOLDMAN, M.H.S.(2010) Is MeJa a hormone with a new role in Solanaceae sexual reproduction? Characterization of a novel tobacco pistil-specific methyltransferase gene. Manuscript in preparation.

QUIAPIM, A. C., BRITO, M.S., Malavazi, I., Bernardes, L.A.S., DE-PAOLI, H.C., Goldman, G.H., Goldman, M.H.S. (2009) Analysis of the Nicotiana tabacum stigma/style transcriptome reveals gene expression differences between wet and dry stigma species. Plant Physiol. 149:1211-1230.

FIGUEIREDO, José Edson Fontes ; COELHO, Vinicio Tadeu da Silva ; COELHO, E. A. F. ; OLIVEIRA, J. S. ; SANTORO, M. M. ; ALMEIDA, P. L. B. ; DE-PAOLI, H. C. ; CORREA, G. V. ; TEIXEIRA, M. A. (2005) Bioquímica molecular como ferramenta para conservação e uso da biodiversidade agrícola tropical: desenvolvimento de marcador imunoquímico para identificação de bactérias endofíticas do milho. Boletim de Pesquisa e Desenvolvimento - Embrapa CNPMS, v. 02, p. 1-12, 2005. ISSN/ISBN: 16790154

 

FIGUEIREDO, José Edson Fontes ; QUINTÃO, Pablo Lopes ; DE-PAOLI, H. C. ; COELHO, Vinicio Tadeu da Silva ; BRESSAN, Wellington ; GUIMARÃES, Cláudia Teixeira ; GOMES, Eliane Aparecida (2003). Caracterização Molecular de Microrganismos Isolados do Ecossistema Agrícola do Cerrado: bactérias endofíticas do milho. Comunicado Técnico - Embrapa CNPMS, v. 66, p. 1-10, 2003. ISSN/ISBN: 16790162.

FIGUEIREDO, José Edson Fontes ; COELHO, Vinicio Tadeu da Silva ; DE-PAOLI, H. C. ; BRESSAN, Wellington ; PURCINO, Antônio Álvaro Corcetti ; ROCHA, Tales Lima ; PRATES, Maura Vianna (2003). Desenvolvimento de Marcador Molecular para Bacillus subtilis Utilizando Proteomics. Comunicado Técnico - Embrapa CNPMS, v. 67, p. 1-10, 2003. ISSN/ISBN: 16790162.

FIGUEIREDO, José Edson Fontes ; DE-PAOLI, H. C. ; QUINTÃO, Pablo Lopes ; COELHO, Vinicio Tadeu da Silva ; CASELA, Carlos Roberto ; FERREIRA, A. S. ; BRESSAN, Wellington ; GUIMARÃES, Cláudia Teixeira ; GOMES, Eliane Aparecida (2003). Caracterização Molecular de Microrganismos do Ecossistema Agrícola do Cerrado: Colletotrichum graminicola. Comunicado Técnico - Embrapa CNPMS, v. 68, p. 1-10, 2003. ISSN/ISBN: 16790162.

FIGUEIREDO, José Edson Fontes ; DE-PAOLI, H. C. ; COELHO, Vinicio Tadeu da Silva ; PINTO, Nicésio F J de A ; FERNANDES, Fernando Tavares ; BRESSAN, Wellington ; GUIMARÃES, Cláudia Teixeira ; GOMES, Eliane Aparecida (2003). Caracterização Molecular de Microrganismos do Ecossistema Agrícola do Cerrado: Acremonium strictum. Comunicado Técnico - Embrapa CNPMS, v. 69, p. 1-10, 2003. ISSN/ISBN: 16790162.

6. Awards

1 – Honorable Mention. In: I Brazilian Symposium of Molecular Genetics of Plants. Natal, Brazil, 2007.

2 – Prêmio Pós-graduação, Brazilian Society of Genetics. Águas de Lindóia. Brazil, 2007.

7. Idioms

Idiom Reading Skills Speaking Skills

Listening Skills

Writing Skills

Portuguese* +++++++ +++++++ +++++++ +++++++English +++++ +++++ +++++ +++++ Spanish +++ ++ + + Chinese + +

*Mother tongue