RMN em proteínas - geral

Pode ser dividida em 3 etapas:

• assinalamento seqüencial das ressonâncias 1H utilizando-se experimentos quedemonstrem conexões através de ligações químicas (acoplamento escalar) e atravésdo espaço (<5Å, acoplamento dipolar);

• identificação e quantificação da maior quantidade possível de NOEs que levem aum conjunto de restrições de distâncias interprotônicas aproximadas;

• cálculo de estruturas tridimensionais com base nessas restrições de distâncias, depreferência complementadas por restrições de ângulos torcionais obtidas deconstantes de acoplamento.

TOCSY – PfTrx (104 resíduos + 10 resíduos da cauda de His)

NOESY – PfTrx (104 resíduos + 10 resíduos da cauda de His)

15N-HSQC – PfTrx (104 resíduos + 10 resíduos da cauda de His)

13C-HSQC – PfTrx (104 resíduos + 10 resíduos da cauda de His)

RMN em proteínas pequenas e médias

Proteínas pequenas (até ~80 aminoácidos) - 2D

• TOCSY• COSY• NOESY

Proteínas um pouco maiores (até ~100 aminoácidos) - 2D, 3D

• TOCSY• COSY• NOESY• 15N-HSQC• 13C-HSQC• 15N-NOESY• 13C-NOESY

2D homonuclear (~12 horas cada)

2D homonuclear (~12 horas cada)

2D heteronuclear (~1 hora cada)

3D (~3 dias cada)

RMN em proteínas maiores

Proteínas maiores (a partir de ~100 aminoácidos) - 2D, 3D, tripla ressonância

• NOESY• 15N-HSQC• 13C-HSQC• 15N-NOESY• 13C-NOESY• HCCH-TOCSY• HNCA• HN(CO)CA• CBCA(CO)NH• CBCANH• HNCO

2D homonuclear (~12 horas)

2D heteronuclear (~1 hora cada)

3D (~3 dias cada)

3D de tripla ressonância (~3 dias cada)

Experimentos 3D

Construído a partir do 2D, adicionando-se um novo tempo de evolução e um novotempo de mistura.

Duas principais classes de experimentos 3D:

• experimentos consistindo de 2D consecutivos• experimentos de tripla ressonância

15N-NOESY-HSQC

Correlaciona prótons amídicos 1HN com osdemais prótons através do acoplamentodipolar (distância).

Os picos de correlação dipolar 1H-1Haparecerão na “fatia” (plano) que possui ovalor do deslocamento químico do 15Namídico (terceira dimensão)

13C-NOESY-HSQC

Ídem, porém o heteroátomo (e portanto aterceira dimensão) é o 13C.

MENOR SOBREPOSIÇÃO DE SINAIS !!!

Experimentos 3D (2D consecutivos)

15N-NOESY – PfTrx (104 resíduos + 10 resíduos da cauda de His)

15N-NOESY – PfTrx (104 resíduos + 10 resíduos da cauda de His)projeção 1H-1H

15N-NOESY – PfTrx (104 resíduos + 10 resíduos da cauda de His)projeção 15N-1H

Experimentos 3D de correlação entre 1H, 13C e 15N.

• Vantagem mais importante: simplicidade poucos picospouca sobreposição

• Possibilita o assinalamento de proteínas maiores.

Experimentos 3D (tripla ressonância)

1H

15N

1H, 15N, 13C

1H,15

N

C i-1

C i

C i-1

C i

A escolha correta de conectividades é um dos desafios do assinalamento porressonância tripla.

i-1 i

Experimentos-padrão (assinalamento sequencial)

• HNCAHN(i)-N(i)-C (i)HN(i)-N(i)-C (i-1)muito sensível (picos fortes, completo)

• HN(CO)CAHN(i)-N(i)-[CO (i-1)]-C (i-1)pouco sensível (picos fracos, incompleto)

• CBCANHC (i)-C (i)- N(i)-HN(i)C (i-1)-C (i-1)-N(i)-HN(i)pouco sensível (picos fracos, incompleto)

• CBCA(CO)NHC (i-1)-C (i-1)-[CO (i-1)]-N(i)-HN(i)muito sensível (picos fortes, completo)

Estratégia:

(i) separar fatias do espectro: deslocamento químico do HN, plano do N.

a b c d

Deslocamentos químicos dos carbonos são característicospara cada tipo de aminoácido.C (i-1), C (i)

C (i-1), C (i)

1H

15N

15N-HSQC

CBCANH

(ii) combinar as fatias com base nos deslocamentos químicos dos C e C .

(E)A (A)Y (Y)V (V)L

C (i-1), C (i)

C (i-1), C (i)

1H

15N

a d b c

15N-HSQC

CBCANH Assinalamento seqüencial:

EAYVL

C 1

HNCA

C 2

C C

O

O

N N

H

H

HNCOCA

C 1

C 2

C C

O

O

N N

H

H

HNCA – PfTrx (104 resíduos + 10 resíduos da cauda de His)projeção 1H-13C

CBCA(CO)NH – PfTrx (104 resíduos + 10 resíduos da cauda de His)projeção 1H-13C