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Ricardo Helman A expressão da mutação JAK2V617F em células endoteliais de pacientes com Síndrome Budd-Chiari e sua correlação com as doenças mieloproliferativas crônicas Ph negativo Tese apresentada ao Curso de Pós- Graduação da Faculdade de Ciências Médicas da Santa Casa de São Paulo para obtenção do título de Doutor em Medicina SÃO PAULO 2016
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Ricardo Helman
A expressão da mutação JAK2V617F em células endoteliais de
pacientes com Síndrome Budd-Chiari e sua correlação com as
doenças mieloproliferativas crônicas Ph negativo
Tese apresentada ao Curso de Pós-Graduação da Faculdade de Ciências Médicas da Santa Casa de São Paulo para obtenção do título de Doutor em Medicina
SÃO PAULO
2016
Ricardo Helman
A expressão da mutação JAK2V617F em células endoteliais de
pacientes com Síndrome Budd-Chiari e sua correlação com as
doenças mieloproliferativas crônicas Ph negativo
Tese apresentada ao Curso de Pós-Graduação da Faculdade de Ciências Médicas da Santa Casa de São Paulo para obtenção do título de Doutor em Medicina Área de Concentração: Ciências da Saúde Orientador: Prof. Dr. Carlos Sergio Chiattone
SÃO PAULO
2016
FICHA CATALOGRÁFICA
Preparada pela Biblioteca Central da
Faculdade de Ciências Médicas da Santa Casa de São Paulo
Helman, Ricardo A expressão da mutação JAK2V617F em células endoteliais de pacientes com Síndrome Budd-Chiari e sua correlação com as doneças meiloprofilerativas crônicas Ph negativo./ Ricardo Helman. São Paulo, 2016.
Tese de Doutorado. Faculdade de Ciências Médicas da Santa Casa de São Paulo – Curso de Pós-Graduação em Ciências da Saúde.
Área de Concentração: Ciências da Saúde Orientador: Carlos Sérgio Chiattone 1. Síndrome de Budd-Chiari; 2. Mutação; 3. Janus quinase 2; 4.
Células endoteliais BC-FCMSCSP/18-16
Dedicatória
DEDICATÓRIA
A meus pacientes, Delma e Claudio, que lutaram até o último minuto contra
uma doença cruel sempre com um sorriso no rosto.
À minha esposa, Luciana, sempre ao meu lado com muito carinho e amor.
Aos meus pais, Anita e Rafael, que sempre me apoiaram incondicionalmente.
Sou eternamente grato por tudo que fizeram por mim.
A minha irmã, Priscila, pela amizade e companheirismo, toda essa
caminhada.
Agradecimentos
AGRADECIMENTOS
À Faculdade de Ciências Médicas da Santa Casa de Misericórdia de São
Paulo – FCMSCSP – aonde iniciei minha jornada na medicina e aprendi a amar
cada tijolinho.
Ao Departamento de Hematologia, aonde me apaixonei por essa
especialidade vibrante, em que a cada ano o conhecimento parece multiplicar-se
numa velocidade difícil de imaginar. Local em que fiz amizades sinceras, Talita,
Sergio, João Paulo e Martucci, Edvan, vocês foram especiais nessa caminhada.
Às meus professores e mestres, que com muita dedicação e carinho, me
introduziram no mundo da Hematologia. Rodolfo, Vania, Cristina Bortolheiro, Sergio
Brasil, Carmem, Andreza, Fabio Kerbauy, obrigado por me apoiarem nessa jornada.
Aos meus amigos e colegas de trabalho, Fabio Pires, Tarcila, Iracema,
Guilherme, Breno, Morgani, Joyce, Claudia, Paulo, obrigado por fazermos parte
dessa equipe maravilhosa, aonde um sorriso e uma gargalhada sempre encerram
um dia difícil de trabalho.
Aos colegas médicos, biomédicos, enfermeiros, Isabel, Sandra, Michelli,
Renato Puga e Welbert, por ajudarem a criar o nosso Projeto LMA Brasil, que tornou
possível o sonho de concluir essa tese.
Agradecimento especial aos meus mestres, Carlos Chiattone e Nelson
Hamerschlak, que me inspiram diariamente, sempre lembrando que a medicina é
mais do que uma profissão, é um ofício.
Abreviaturas
ABREVIATURAS
CE Células Endoteliais
DMPC Doença Mieloproliferativa Crônica
DNA Deoxyribonucleic acid
LMA Leucemia mielóide aguda
LMC Leucemia mielóide crônica
LMCA Leucemia mielóide crônica atípica
LMMC Leucemia mielomonocítica crônica
LNC Leucemia neutrofílica crônica
MF Mielofibrose primária
MS Mastocitose Sistêmica
N Normal
PBMCs Linfo-Monocelulares de Sangue Periférico
PCR Polymerase Chain Reaction
PV Policitemia Vera
SBC Síndrome de Budd-Chiari
SHE Síndrome hipereosinofílica
T Tumor
TE Trombocitemia essencial
VAF Variant Allele Frequence
VEGF Fator de crescimento endotelial vascular
Sumário
SUMÁRIO
1. INTRODUÇÃO…………………………………………………………...……........ 1 1.1. Doenças Mieloproliferativas Crônicas (DMPC) .......................................... 2 1.2. Mutação JAK2V617F.................................................................................. 4 1.3 Células Endoteliais (CE) ............................................................................. 7 1.4. Síndrome de Budd-Chiari (SBC) ................................................................ 8 1.5. Sequenciamento genético ......................................................................... 10 2. OBJETIVOS…………………………………………………………………........... 13 3. CASUÍSTICA E MÉTODOS …………………………………………...……........ 15 3.1. Critérios de Inclusão………………………………………………….............. 16 3.2. Critérios de Exclusão…………………………………………...……………… 17 3.3. Métodos - Coleta de Amostras…………………………………...…………… 17 3.3.1. Coleta de Amostras de Sangue e/ou Medula Óssea............................ 17 3.3.2 Coleta de DNA germinativo.................................................................... 17 3.3.3. Biópsia e Aspirado de Medula Óssea................................................... 18 3.4. Processamento das amostras..................................................................... 18 3.4.1. Separação de células mononucleares (PBMCs) ................................. 18 3.4.2. Protocolo de Hill EndoCult – cultura de células Endoteliais................. 19 3.4.3 Extração de DNA a partir de biópsia de pele e células endoteliais
utilizando kit DNeasy.............................................................................
19 3.4.4. Avaliação de quantidade e qualidade de DNA, RNA e Proteína.......... 20 3.4.5. Critérios de quantidade e qualidade para utilização da amostra.......... 20 3.4.6 Células endoteliais: seleção e quantificação......................................... 21 3.4.7. Pesquisa de mutação JAK2V617F nas CE.......................................... 21 3.4.8. Sequenciamento e Análise Bioinformática........................................... 21 4. RESULTADOS ……………………………………………………………………... 23 4.1. Cultura de Células Endoteliais ………………….......................................... 25 4.2. Sorting de células endoteliais..................................................................... 25 4.3. Sequenciamento de exoma........................................................................ 27 5. DISCUSSÃO ………………………………………………………………….......... 28 6. CONCLUSÕES ………………………………………………………………......... 35 7. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS……………………………………….......... 37
RESUMO …………………………………………………………………................ 44 APÊNDICE ....................................................................................................... 46
1
1. INTRODUÇÃO
2
Introdução
1.1. Doenças Mieloproliferativas Crônicas (DMPC)
As doenças Mieloproliferativas Crônicas (DMPC) Philadelphia-negativa
classicamente incluem a Policitemia Vera (PV), Trombocitemia Essencial (TE) e a
Mielofibrose primária (MF) sendo que esta entidade também pode originar-se da PV
e TE. As DMPC são neoplasias mielóides crônicas que surgem após uma célula
tronco hematopoiética sofrer uma transformação maligna1-3.
As manifestações clínicas destas doenças são variadas e incluem a
poliglobulia, trombocitose, leucocitose, citopenias, hematopoiese extramedular (ex.
esplenomegalia), aumento do risco trombótico e de transformação para Leucemia
Mielóide Aguda (LMA). A expectativa de vida dos pacientes com DMPC varia de 5-6
anos nos pacientes com MF para mais de 15 anos em pacientes com PV e TE. As
outras DMPC Philadelphia-negativa de importância clínica são: Mastocitose
Sistêmica (MS), Síndrome hipereosinofílica (SHE), Leucemia Neutrofílica Crônica
(LNC), a Leucemia Mielomonocítica Crônica (LMMC) e a Leucemia Mielóide Crônica
atípica (LMCA)4,5.
A primeira classificação das DMPC organizada pela Organização Mundial de
Saúde (OMS) foi realizada em 2001, sendo atualizada em 2008 e revista em 2015,
quando uma nova atualização da classificação foi proposta por Barbui e
colaboradores6. Nessa revisão os autores sugeriram que as mutações genéticas
específicas de cada uma das DMPC fossem incluidas como critérios diagnósticos,
além das alterações morfológicas que distinguem cada uma delas. Em relação à PV
a presença da mutação JAK2 permanece como um critério maior, associado aos
níveis diminuídos de eritropoetina, que permanece como o único critério menor, e é
usado para ajudar no diagnóstico dos caso JAK2 negativo. Em relação ao
diagnóstico de TE e MF, as mutações utilizadas como critério diagnóstico agora
incluem a CALR, JAK2 e MPL.
Em 1960 a Leucemia Mielóide Crônica (LMC) tornou-se o primeiro tipo de
câncer a estar associado com uma alteração genética específica (cromossomo
Philadelphia), que depois se comprovou estar relacionada a uma translocação
cromossômica t(9;22)7, esta descoberta tornou possível uma acurácia maior nos
3
Introdução
testes diagnósticos, na descoberta de terapias alvo, o monitoramento molecular de
resposta terapêutica e a pesquisa de doença residual mínima. Recentemente a
descoberta da mutação JAK2V617F8,9 trouxe o mesmo desenvolvimento no
entendimento das DMPC.
Uma das principais causas de morbidade e de mortalidade nas DMPC
decorre da transformação para leucemias agudas, da falência medular e dos
eventos trombóticos arteriais e venosos. A fisiopatologia dos eventos trombóticos
depende dos seguintes fatores: idade dos pacientes, quantidade de células clonais,
aumento da atividade endotelial e mais recentemente da presença da mutação
JAK2V617F10.
Embora tenhamos vários estudos internacionais sobre incidência, prevalência
e evolução das DMPC, o conhecimento sobre a casuística brasileira ainda é muito
restrito, recentemente foi publicado um estudo comprovando que nossa coorte
apresenta os mesmos scores prognósticos e a mesma estratificação de risco que
grupos internacionais11.
Desde 2005, quando foi descrita a mutação JAK2V617F, em diante, mais de
20 mutações somáticas foram descritas nas DMPC. Outras mutações da JAK2, por
exemplo, a JAK2 exon12 foram descritas em pacientes com PV12. Na atualização da
classificação das DMPC de 2008, a pesquisa da mutação JAK2 foi adotada como
critério diagnóstico de PV. Na prática clínica a ausência da mutação JAK2 torna o
diagnóstico de PV improvável, porém a sua presença por si só, não permite a
distinção entre PV, TE e MF, sendo necessária a confirmação com biópsia de
medula óssea.
A atualização dos critérios diagnósticos proposta em 2015 leva em conta não
apenas a descoberta de novos marcadores moleculares, mas também a diminuição
dos níveis de hemoglobina e do hematócrito, assim como uma maior valorização da
morfologia da Medula Óssea, sendo este considerado um critério maior. Portanto se
faz necessário uma maior precisão das descrições histopatológicas focadas
principalmente na fibrose medular, principalmente nos casos de TE6.
4
Introdução
Ao longo dos últimos 10 anos algumas mutações novas foram descritas em
pacientes portadores de DMPC, sendo as principais: Myeloproliferative Leukemia
Virus (MPL), TET oncogene Family member 2 (TET2), Additional Sex Combs-Like 1
(ASXL1), Casitas B-lineage lymphoma proto-oncogene (CBL), Isocitrate
dehydrogenase (IDH) e IKAROS Family zinc finger 1 (IKZF1), porém nenhuma delas
foi específica para DMPC ou foi encontrada em uma célula ancestral comum13.
1.2. Mutação JAK2V617F
A mutação JAK2V617F representa uma mutação somática da tirosina quinase
JAK2 no nucleotídeo 1849, do exon 14, resultando na substituição de uma valina por
uma fenilalanina no códon 61714. A mutação foi descrita inicialmente em neoplasias
mielóides, incluindo doenças mieloprolferativas atípicas e síndrome mielodisplásicas,
e em seguida foi descrita também em leucemias agudas15,16. A mutação de
JAK2V617F tornou-se o equivalente ao BCR-ABL com sua relevância na
patogênese e no diagnóstico destas doenças.
A tirosina quinase citoplasmática JAK2 é uma proteína crítica na sinalização
intracelular dos receptores para eritropoetina, trombopoetina, interleucina 3, fator
estimulante de granulócitos e fator estimulante de macrófagos17. A tirosina quinase
JAK2 é uma proteína vital na transmissão da sinalização da eritropoietina ao seu
receptor. Assim que ela se liga ao receptor no retículo endoplasmático, ocorre a
expressão das vias de sinalização da STAT5, RAS-MAPK e PI3K. Quando a
eritropoetina liga-se ao receptor, provoca-se uma alteração na forma deste, ativando
a sua fosforilação e ativação da JAK2, ativando a sinalização da cascata intracelular.
(Fig. 1).
5
Introdução
Adaptado: Campbell, Green, 2006
4.
Figura 1: Papel da JAK2 na sinalização celular.
6
Introdução
A mutação JAK2 explica muitas das alterações principais das DMPC, mas
assim como na LMC, as transformações malignas das DMPC derivam de aquisições
de mutações adicionais18. Já existem evidências de que mutações cooperativas
podem ocorrer em estágios iniciais das DMPC JAK2V617F, e podem eventualmente
preceder a mutação JAK2, sendo a deleção do braço 20q a mais prevalente
podendo estar presente em até 10% dos pacientes.
Quando a mutação V617F está presente em homozigose há uma maior
expressão de proteínas quando comparado com a heterozigose. Essa alteração
reflete um aumento na sinalização mediada pelo dobro da dose da V617F, com a
perda da inibição do alelo selvagem. A homozigose está presente em cerca de 30%
dos pacientes com PV14.
A alta prevalência da mutação JAKV617F na população de pacientes com
DMPC, chegando a 90% dos pacientes com PV, já foi confirmada em coortes de
pacientes brasileiros, que apresentam taxas da mutação muito semelhantes ao resto
do mundo19,20.
O risco de trombose associada a mutação JAK2V617F já está bem definido a
muito tempo, principalmente nos paciente com PV e TE, sendo que 2 meta análises
independentes já foram publicadas recentemente21,22. Na meta análise publicada por
Ziakas, incluindo 2905 pacientes com TE, a mutação JAK2V617F foi relacionada
com tromboses tanto arteriais quanto venosas, assim como na meta análise
publicada por Dahabreh que comparou o risco de trombose em pacientes com
mutação e pacientes com o alelo selvagem. Embora o risco de trombose em
pacientes com TE seja elevado, o mesmo não se pode dizer em relação a PV. Em
um estudo prospectivo de Vannucchi23, apenas os pacientes com carga alélica da
mutação acima de 75% apresentaram risco de trombose aumentado. Nos estudos
retrospectivos de pacientes com TE e PV que evoluíram com episódios trombóticos,
apenas os pacientes que tinham uma carga alélica da mutação JAK2V617F com
valores superiores há 50% tiveram eventos trombóticos24.
O risco de tromboses intra-abdominais em pacientes com DMPC,
especialmente portadores de PV, é conhecido a mais de 10 anos25. Todavia alguns
indivíduos com contagens sanguíneas normais e sem evidência de doenças
7
Introdução
hematológicas cursam com tromboses e podem apresentar a mutação JAK2V617F
em até 30% dos casos26. Alguns autores acreditam que esta tendência trombótica
associada com mutação preceda o desenvolvimento de alguma DMPC27.
A presença da mutação da tirosina-quinase JAK2V617F em pacientes com
PV aumenta a expressão de Lu/BCAM, que são proteínas de ativação endotelial que
podem estar associados ao maior risco de trombose, embora esta associação ainda
não tenha sido replicada em outros estudos28.
Nos pacientes com TE a presença da mutação JAK2 também é relacionada
com risco aumentado de tromboses cerebrais e mesentéricas, com um risco relativo
de 3,83% nos pacientes abaixo de 60 anos comparados com pacientes com TE e a
proteína selvagem29.
Alterações na carga alélica da mutação pode estar relacionado ao maior risco
de trombose, sendo que pacientes que apresentam uma carga alélica da mutação
superior a 20% podem apresentar um risco aumentado de trombose em geral30.
1.3. Células Endoteliais (CE)
Durante o desenvolvimento dos mamíferos, uma célula de origem comum na
formação das células hematopoiéticas e das células endoteliais (CE) foi identificada
e denominada de hemangioblasto; está presente em indivíduos adultos, embora o
seu papel na hematopoiese normal ou na patogênese de doenças mielóides ainda
seja desconhecida31. As células progenitoras endoteliais, via de regra encontram-se
na medula óssea e na circulação sanguínea periférica. Apresentam um papel
importante na vasculogênese e na homeostasia vascular. Várias questões ainda
estão abertas na literatura em relação a sua principal função e quais são os seus
principais marcadores de membrana32.
As pesquisas envolvendo CE são dificultadas por vários fatores, entre eles: a
dificuldade de se separar esta linhagem celular de linhagem de linfócitos e
monócitos, a escolha adequada dos marcadores de membrana celulares e a falta de
protocolos específico de painéis de imunofenotipagem33. Vários protocolos foram
8
Introdução
publicados até o momento, sendo que o mais adequado parece ser o descrito por
Ozdogu e colaboradores34.
A intrínseca ligação entre as CE e as células tronco hematopoiética, levou
alguns pesquisadores a procurar as CE em diferentes doenças oncológicas,
principalmente as onco-hematológicas. Finalmente foram descritos séries de casos
que demonstraram CE circulantes em doenças como Leucemias agudas e crônicas,
Mieloma Múltiplo, Síndrome Mielo-displásicas, além das doenças inflamatórias
crônicas35-39.
A origem comum de CE células de linhagem hematopoiética estimulou a
pesquisa e em seguida a identificação da mutação JAK2V617F nestas CE40,41.
Alguns autores sugerem que a disfunção das CE pode contribuir para o estado de
hiper coagulabilidade associado à PV, aumentando tônus vascular e diminuindo a
liberação de óxido nítrico, culminando com eventos trombóticos mesentéricas42. Hoje
sabemos que alguns pacientes com SBC e outras tromboses apresentam a mutação
JAK2V617F em suas CE.
Além da hipótese de que CE e as células tronco hematopoiéticas possam ter
a mesma origem embrionária, alguns autores sugerem que a maior parte do pool de
células tronco hematopoiéticas estejam localizadas adjacentes aos sinusóides
endoteliais dentro da Medula Óssea, e que estas CE sejam responsáveis pela
manutenção deste pool de células tronco através da liberação de citoquinas43.
O papel das CE na patogênese das DMPC ainda não foi totalmente
elucidado, alguns autores descreveram a presença da mutação JAK2V617F em
células formadoras de colônia endoteliais isoladas de sangue periférico em
pacientes com DMPC44.
1.4. Síndrome de Budd-Chiari (SBC)
A SBC primária é caracterizada por tromboses das veias hepáticas e supra-
hepáticas até a veia cava inferior, resultando na obstrução do fluxo venoso hepático.
Em conjunto com a Trombose de Veia Porta, essas duas alterações são conhecidas
9
Introdução
como Tromboses Esplâncnicas45. A Trombose de Veia Porta também está
relacionada com a vasculatura hepática, que frequentemente está relacionada com
fatores locais, como cirrose e neoplasias. Na ausência de cirrose hepática ou
neoplasias, as tromboses da veia Porta é menos frequentemente encontrada, sendo
a sua etiologia semelhante a SBC46. Esta definição da SBC exclui a Síndrome
Obstrução Sinusoidal e as obstruções hepáticas secundárias à insuficiência
Cardíaca Direita. A SBC é uma entidade rara e potencialmente fatal, a sua
prevalência é influenciada por diferenças geográficas. No Ocidente a incidência de
SBC é de um caso para cada 2,5 milhões de pessoas e sua etiologia está mais
relacionada ao uso de anticoncepcionais orais e com DMPC47.
Independente da causa da obstrução do fluxo venoso, o aumento da pressão
sinusoidal e da hipertensão portal acabam resultando em congestão venosa e
lesões isquêmicas dos hepatócitos que estão cercados pelos sinusóides hepáticos.
Se as alterações de pressão não forem rapidamente revertidas, pode-se resultar em
regeneração nodular, fibrose e inclusive cirrose48.
As principais manifestações clínicas variam desde insuficiência hepática,
ascite, varizes esofágicas até em casos de pacientes assintomáticos. A tríade
clássica de diagnóstico inclui dor abdominal, ascite e hepatomegalia. Podendo
evoluir com curso fulminante, agudo, subagudo ou crônico49.
Com o avanço das técnicas de radiologia, principalmente com a utilização da
angio ressonância e angio tomografias de alta resolução as taxas de diagnóstico das
tromboses esplâncnicas aumentaram sensivelmente nos últimos anos. O ultrassom
com doppler é o exame de escolha para detecção de trombose hepática e de veia
porta que evoluem com ascite, esplenomegalia e alterações do parênquima
hepático, enquanto a angio ressonância e angio tomografia contrastada são melhor
indicadas para avaliar tromboses mesentéricas. Os procedimentos de angiografia
com cateterização arteriovenosa ficam cada vez mais restritos aos procedimentos
terapêuticos49.
Dentre as principais etiologias das tromboses esplâncnicas estão as doenças
trombóticas, conhecidas como Trombofilias, sendo as mais prevalentes: a mutação
do fator V Leiden, mutação Protrombina G20210A, deficiência Proteína C e S,
10
Introdução
deficiência anti-trombina III, anticorpos anti-fosfolípide, hiper homocisteinemia,
Hemoglobinúria Paroxística Noturna. As doenças inflamatórias crônicas como
Doença de Behcet e Sarcoidose, além do uso dos contraceptivos orais e da
gestação. As DMPC são responsáveis por cerca de 39% dos casos, sendo que 46%
dos pacientes apresentam múltiplos fatores de risco50,51.
A mutação JAK2V617F isoladamente já mostrou ser um fator de risco
importante para tromboses mesentéricas, embora a sua fisiopatologia ainda não
tenha sido definida52.
1.5. Sequenciamento genético
O Sequenciamento do genoma ou do exoma está cada vez mais acessível na
prática clínica, milhares de exames estão sendo oferecidos para os pacientes para
ajudar no diagnóstico de doenças raras, clinicamente irreconhecíveis ou agrupando
doenças suspeitas de terem uma origem genética. O fato de podermos identificar
mutações de cerca de 20.000 genes ao mesmo tempo torna essa metodologia uma
arma poderosa e efetiva como método diagnóstico.
Independentemente da metodologia utilizada, o sequenciamento começa com
a extração do DNA de leucócitos, seguido da fragmentação deste DNA em
fragmentos pequenos, cujas sequencias de bases nitrogenadas são determinadas
de acordo com alguma das várias técnicas de sequenciamento utilizadas.
Basicamente os fragmentos de bases, que representam nucleotídeos de DNA são
alinhados com posições específicas do genoma humano de referência e analisados
por programas de computadores. As similaridades e diferenças entre as sequencias
dos pacientes e o genoma de referência são tabuladas e determinadas à
especificidade do genótipo e cada posição do exoma ou do genoma é
determinado53.
O sequenciamento de alta resolução é mais útil na detecção de substituições
de um único nucleotídeo, sejam inserções ou deleções de até 8 a 10 nucleotídeos
ou até mesmo menores. A Figura 1 representa resumidamente as etapas de
11
Introdução
sequenciamento de exoma.
Os resultados do sequenciamento variam de acordo com a clínica do
paciente, sendo que em alguns casos uma única alteração genética pode estar
associada com a doença estuda, sendo que em outros casos vários genes
candidatos são identificados, mas devem ser cuidadosamente analisados pelos
clínicos dos pacientes, sendo que em várias ocasiões nenhuma variável plausível é
identificada.
O uso do sequenciamento de segunda geração tem sido cada vez mais
utilizado nas pesquisas em doenças malignas, principalmente nas doenças
mielóides. Em coortes pacientes com síndrome mielo displásica o sequenciamento
de genoma já ajudou na identificação de mutações implicadas em splicing de RNA,
modificações de DNA, regulação de cromatina e sinalização celular. No estudo de
Papaemmanuil e colaboradores54 738 pacientes tiveram seu genoma sequenciado e
111 genes relacionados a doenças mielóides foram identificados. Pelo menos 78%
dos pacientes apresentaram pelo menos um onco gene mutado, sendo que alguns
pacientes apresentaram mutações em genes de splicing de RNA (SF3B1, U2AF1,
SRSF2, ZRSR2) que podem ser consideradas mutações pré-malignas.
Nos estudos recentes de leucemias mielóides agudas as técnicas de
sequenciamento de genoma e principalmente de exoma, tem sido muito utilizadas
na identificação de mutações novas, principalmente em genes modificadores
epigenéticos, ajudando a elucidar a fisiopatologia e possivelmente ajudar na
descoberta de novos alvos terapêuticos55.
12
Introdução
Fonte: Biesecker, Green, 2014
53
Figura2: Sequenciamento do Exoma.
13
2. OBJETIVOS
14
Objetivos
1 - Analisar a presença da mutação JAK2V617F em células endoteliais de
pacientes com Síndrome de Budd-Chiari, portadores ou não de doença mielo-
proliferativa crônica.
2 - Determinar o estado mutacional dos pacientes portadores de Síndrome de
Budd-Chiari que apresentem mutação JAK2V617F.
3 - Determinar a carga alélica da mutação JAK2V617F em pacientes com
SBC.
15
3. CASUÍSTICA E MÉTODOS
16
Casuística e Método
3.1. Critérios de Inclusão
Entre o período de março 2013 e janeiro 2015 foram avaliados 32 pacientes
com o diagnóstico de SBC que estavam em acompanhamento no ambulatório de
hepatologia clínica do programa de transplante hepático do Hospital Israelita Albert
Einstein. Todos os pacientes apresentaram o diagnóstico de SBC confirmado por
exames de imagem: angio ressonância ou angio tomografia.
Os pacientes foram avaliados para identificação de doenças trombóticas.
Foram pesquisadas as seguintes patologias:
A) Hemoglobinúria Paroxística Noturna – método de citometria de fluxo;
B) Mutação do Fator V Leiden – Análise das mutações Q506 do gene do Fator V
por PCR em tempo real;
C) Pesquisa Mutação Protrombina – pesquisa da mutação G20210A da
protrombina por PCR em tempo real;
D) Deficiência proteína C – método determinação quantitativa de proteína C
funcional, com base no prolongamento da atividade de tempo de tromboplastina
parcial ativada;
E) Deficiência proteína S – método Imunoturbidimétrico;
F) Deficiência anti-trombina III - método colorimétrico com utilização de substrato
cromogênico;
G) Pesquisa de anticoagulante Lúpico: A pesquisa do Anticorpo Anticoagulante
Lúpico foi realizada por metodologia coagulométrica funcional em testes
triadores, fosfolípides-dependente, o tempo de tromboplastina parcial ativada
(TTPA) e o veneno de víbora de Russel diluído (dVVRT). A confirmação da
presença do anticoagulante lúpico foi feita através de testes confirmatórios que
utilizam excesso de fosfolípide padrão (dVVRT) e/ou hexagonal.
H) Pesquisa de anticorpo Anti Cardiolipina IgA: Método: Ensaio Imunoenzimático;
I) Homocisteína: método cinético de 2 pontos - Fusion ®;
J) Mutação JAK2 – método pesquisa da mutação JAK2V617F por PCR em tempo
real.
17
Casuística e Método
Dos pacientes triados para Trombofilia, foram incluídos 10 pacientes que
apresentaram a mutação JAK2V617F no sangue periférico e que foram negativos
para outras patologias e mutações relacionadas a SBC.
Todos os pacientes eram maiores de 18 anos e concordaram em assinar o
Termo de Consentimento Livre e Esclarecido. O projeto foi aprovado pelo Comitê de
Ética da Irmandade da Santa Casa de Misericórdia de São Paulo e do Hospital
Israelita Albert Einstein (Apêndice 3).
3.2. Critérios de Exclusão
Diagnóstico de Leucemia Mielóide Crônica;
Recusa em assinar termo de consentimento informado.
3.3. Métodos - Coleta de Amostras
3.3.1. Coleta de Amostras de Sangue e/ou Medula Óssea
Após a inclusão do paciente e avaliação inicial, o paciente realizou a coleta de
amostras de medula óssea.
Foram coletados 23 ml de aspirado de medula óssea em tubo de EDTA (20
ml – cinco tubos de 4 ml) e frasco de cultura específico (3ml).
3.3.2. Coleta de DNA germinativo
Foram coletadas amostras de DNA germinativo normal, a partir de biópsia de
pele.
A biópsia de pele foi realizada com agulha tipo punch de 6mm. O
procedimento para coleta de biópsia de pele consistiu nas seguintes etapas:
18
Casuística e Método
1) Limpeza e assepsia da pele (evitando lesões cutâneas, regiões com hemorragia,
face, palma das mãos, planta dos pés; preferência para face anterior do
antebraço ou região da crista ilíaca póstero-superior);
2) Colocação de campo estéril fenestrado;
3) Anestesia local com lidocaína (aproximadamente 3-4ml);
4) Punção com agulha tipo punch de 6mm após anestesia local ter efeito;
5) Hemostasia tópica com gaze estéril;
6) Sutura da ferida cirúrgica com fio Nylon 3-0/4-0/5-0;
7) Colocação de curativo.
3.3.3. Biópsia e Aspirado de Medula Óssea
Foram coletadas biópsia de Medula Óssea para identificação de doença
mieloproliferativa e aspirado 20ml de Medula Óssea para extração de células
endoteliais e subsequente análises moleculares.
3.4. Processamento das amostras
3.4.1. Separação de células mononucleares (PBMCs)
Em tubos falcon de 15ml, adicionamos 4ml de Ficoll-Paque. Em seguida,
adicionamos vagarosamente pela parede do tubo a amostra de medula óssea sobre
o ficoll, tomando cuidado para que estes não se misturassem. Centrifugamos os
tubos a 1800rpm, 30min, 20°C, aceleração sete e desaceleração zero. Separamos a
camada de PBMCs (tomando cuidado para não tocar no Ficoll) e passamos para
novos tubos falcon de 50ml acrescidos de 15ml de PBS. Em um tubo Falcon
acrescentamos cinco volumes do preservante de RNA RNALater. Centrifugamos os
tubos a 300rpm, 10min, 4°C e vertemos o tubo para descartar o sobrenadante. Os
peletes foram armazenados em -80oC.
19
Casuística e Método
3.4.2. Protocolo de Hill EndoCult – cultura de células endoteliais
A cultura de células endoteliais foi realizada com os meios de cultura
comerciais Endocult™ Liquid Medium Kit. Este meio de cultura é indicado para
cultura de suspensões de células enriquecidas para células hematopoiéticas CD34,
sucintamente os seguintes passos foram necessários para cultura das células:
1) Separamos a fração de células mononucleares de aspirado de medula óssea
por centrifugação com Ficoll-Paque PLUS (TBD LTS 1077);
2) As células separadas foram lavadas duas vezes com PBS a 2% e depois
preparadas suspensões com Endocult liquid médium;
3) As células foram diluídas com ácido acético a 3% numa diluição 1/20, em
seguida contamos as células nucleadas, que foram colocadas em placas de
cultura fibronectina (SIGMA F2006) contendo EndoCult Liquid Medium, numa
quantidade de 5x106;
4) As placas foram incubadas por dois dias a 37o C, com 5% de CO2 e 95% de
umidade para separar as células endoteliais maduras, e após dois dias, as
células não aderentes foram transferidas para tubo EP, sendo as células
nucleadas retiradas usando ácido acético 3% na diluição de 1/10 células por
tubo;
5) As células não aderentes foram novamente coletadas e em seguida, 1x106
células, foram transferidas para placas de fibronectina e colocadas em cultura
contendo EndoCult Liquid Medium e novamente incubadas a 370C, com 5% de
CO2 e 95% de umidade por cinco dias;
6) As placas foram retiradas da incubadora, sendo as colônias de células
endoteliais contadas através de microscopia. As colônias de células endoteliais
foram definidas como células arredondadas em formato de “cacho de uva”.
3.4.3. Extração de DNA a partir de biópsia de pele e células endoteliais utilizando kit DNeasy
Cortamos o tecido em pequenos pedaços sobre uma placa de petri, utilizando
um bisturi. Adicionamos 180ul de Tampão ATL, e 20ul de Proteinase K. Colocamos
no Vortexa “pulsadamente” por 15s e incubamos em banho seco a 56°C por 1-3
20
Casuística e Método
horas. Centrifugamos brevemente e adicionamos 200ul de Tampão AL, novamente
no vortex “pulsadamente” por 15s, e incubamos a 70°C por 10 minutos.
Centrifugamos brevemente. Aplicamos delicadamente na coluna e centrifugamos a
6000g por um minuto. Transferimos a coluna para um novo tubo coletor e adicionar
500ul de Tampão RW1 e centrifugamos a 6000g por um minuto. Transferimos a
coluna para um novo tubo coletor e adicionamos 500ul de Tampão RW2 e
centrifugamos a 20.000g por 3 min. Vertemos o líquido do tubo coletor retirando o
excesso em um papel toalha. Centrifugamos a 20000g por um minuto. Transferimos
a coluna para um eppendorf novo, e adicionamos 200ul de Tampão AE, ou água
destilada. Incubamos por 1-5 minutos e centrifugamos a 6000g por um minuto.
3.4.4. Avaliação de quantidade e qualidade de DNA, RNA e Proteína
A quantificação de DNA foi feita com o kit Quant-iT PicoGreen dsDNA Assay
Kit da Life Technologies seguindo instruções do fabricante. Avaliação de quantidade
e qualidade do RNA foi feita com o ensaio RNA 6000 Nano Kit da Agilent no
aparelho Bioanalyzer 2100, seguindo instruções do fabricante. A avaliação da
quantidade de proteína foi feita com o BCA da Pierce Technology seguindo
instruções do fabricante.
3.4.5. Critérios de quantidade e qualidade para utilização da amostra
Os seguintes critérios foram utilizados para utilização da amostra na análise
de sequenciamento:
DNA células CD34+/PBMC
o Absorbância 260/280: 1.8-2.0
o Quantidade: 6.9 mcg DNA
DNA germinativo (pele ou células CD3+)
o Absorbância 260/280: 1.8-2.0
o Quantidade: 4.9 mcg DNA
21
Casuística e Método
3.4.6. Células endoteliais: seleção e quantificação
As CE foram selecionadas através de citometria de fluxo, utilizando-se painel
de quatro cores com os seguintes marcadores: FITC – CD31 (BD Pharmingen,
USA), CD 146 (Serotec, UK), phycoerythrin (PE)-conjugated CD133 (Miltenyi Biotec,
Germany), CD 105 (Serotec, UK), CD 36 e CD106 (Pharmingen, USA), PecCP-
conjugated CD45 (BD Pharmngen, USA) e APC-conjugated CD 34 (BD Pharmingen,
USA). As CEs foram definidas como CD45(-), CD133(-), CD31(+), CD34(+), CD
146(+) e negativas para os marcadores de ativação (CD105, CD 106)34. Foi
realizado sorting de células endoteliais através do citômetro de fluxo FACS Aria (BD
Biosciences). As células endoteliais foram extraídas da amostra com cerca de 98%
de pureza.
3.4.7. Pesquisa de mutação JAK2V617F nas CE
A pesquisa da mutação JAK2V617F foi realizada no DNA extraído das células
endoteliais através de PCR alelo-específico.
As etapas descritas até o item 3.4.7 foram realizadas no Laboratório de
Técnicas Especiais (LATE) e no Laboratório do Instituto de Pesquisa Clínica (IIEP)
ambos localizados no Hospital Israelita Albert Einstein.
3.4.8. Sequenciamento e Análise Bioinformática
A análise de sequenciamento de exoma foi realizada pela Universidade de
Columbia, Nova York, Estados Unidos da América. A análise de bioinformática foi
realizada no Instituto de Pesquisa Clínica (IIEP) do Hospital Israelita Albert Einstein,
São Paulo, Brasil.
Foi feito sequenciamento de exoma utilizando-se DNA extraído de
granulócitos de sangue periférico e de pele, as sequencias foram geradas pelo
sequenciador HiSeq 2000 da ilumina com o kit de sequenciamento SureSelectXT
Human All Exon 50Mb da Agilent. A profundidade de sequenciamento foi de 150x
22
Casuística e Método
para amostra tumoral (granulócitos) e 60x para amostra normal (pele). Cada amostra
foi mapeada contra a sequência referência do genoma humano versão
hg19/GRCh37 (http://genome.ucsc.edu/) com o software Burrows-Wheeler Aligner
(BWA) versão 0.7.12-r1039 (http://bio-bwa.sourceforge.net/). Após o mapeamento foi
utilizado o pacote de análise Genome Analysis Toolkit (GATK) utilizando o pipeline
de boas práticas do Broad Institute (https://www.broadinstitute.org/gatk/guide/best-
practices.php) para identificação de duplicatas de PCR, realinhar regiões de
inserções/deleções e recalibrar a qualidade das bases mapeadas. Depois deste pré-
processamento buscamos por Single Nucleotide Variants (SNVs) utilizando dois
softwares: SomaticSniper 1.0.2 (https://github.com/genome/somatic-sniper) e Mutect
1.0.5 (http://www.broadinstitute.org/cancer/cga/mutect), comparando as amostras
normal vs. amostra tumoral. Para alterações estruturais foi utilizado o software
Pindel 0.2.4 (https://github.com/genome/pindel).
O resultado da busca por variantes foi salvo no formato Variant Call Format
4.1 (VCF) que é a entrada para análise de anotação funcional das variantes com o
software ANNOVAR (http://www.openbioinformatics.org/annovar/). Os bancos de
dados utilizados com o ANNOVAR foram: refGene (sequencias para todos os
transcritos anotados no RefSeq - http://www.ncbi.nlm.nih.gov/refseq/), esp6500si_all
(frequência de alelos variante do projeto NHLBI-ESP com 6500 exomas – http://
http://evs.gs.washington.edu/EVS/), 1000g2012apr_all (frequência de alelos
variantes no projeto 1000 Genomes - http://www.1000genomes.org/), dbSNP137
(Banco de Variantes Genéticas do NCBI - http://www.ncbi.nlm.nih.gov/SNP/),
LIBJ2_all (combinação de bancos de dados com que score de alterações funcionais
na proteína) e COSMIC 65 (catálogo de mutações somáticas no câncer -
http://cancer.sanger.ac.uk/cosmic).
Após a anotação dos tipos de variantes, suas funções e regiões foi aplicado
um filtro in house para separar os melhores SNVs/Indels em cada amostra com os
seguintes critérios: cobertura total da base ≥8 na amostra normal e na amostra
tumoral; total de alelos variantes no tumor ≥ 2; ausência nos bancos de mutações
dbSNP (exceto quando presente no banco COSMIC), ESP6500 e 1000 genomas;
relação alelo variante: tumoral/normal ≥3. Dessa forma foi obtida a tabela de
variantes que apresentaram variantes genéticas de interesse.
23
4. RESULTADOS
24
Resultados
Dos dez pacientes com SBC e mutação de JAK2V617F avaliados para
inclusão no estudo, três pacientes que haviam assinado o TCLE foram excluídos da
análise, pois faleceram por insuficiência hepática antes da coleta de aspirado de
medula óssea.
Foram incluídos no estudo sete pacientes, sendo que cinco pacientes não
apresentavam quadro clínico de DMPC, inclusive com Medula Óssea com
celularidade normal e maturação normal. Dois pacientes apresentaram o diagnóstico
de DMPC tipo Mielofibrose Crônica. A Tabela 1 apresenta os dados demográficos
dos pacientes e a Tabela 2 apresenta os dados laboratoriais.
Tabela 1: Perfil dados clínicos pacientes incluídos para análise.
Paciente Sexo Idade Etnia Cirrose Tratamento Mielofibrose
1 F 49 Branco Sim AvK Sim
2 M 30 Branca Sim AvK Não
3 F 34 Branca Sim TIPS/ AvK Não
4 F 27 Negra Sim TIPS/Avk Não
5 F 32 Negra Sim TIPS/Avk Não
6 F 45 Negra Sim Avk Não
7 M 36 Branco Sim Avk Sim
F- feminino; M- masculino; Avk– anticoagulante oral tipo dicumarínico; TIPS– Stent trans-jugular intra-hepático.
Tabela 2: Exames laboratoriais pacientes com SBC e JAK2.
Paciente Hb
(g/dl) Leuc
X103/uL Plaq
X105/uL Albumina
(g/dl) TGO (U/L)
TGP (U/L)
BT (mg/dl)
Creat (mg/dl)
1 9,7 11800 4,0X106 3,7 24 36 1,0 0,6
2 7,0 9200 4,3X105 5,0 30 36 0,4 1,0
3 15,3 7000 2,9X105 3,9 41 42 0,9 3,0
4 12,4 4700 1,8x105 3,8 29 50 0,5 0,7
5 11,6 6850 3,9X105 2,8 117 85 4,3 0,5
6 15,0 18910 4,3X105 4,5 43 55 0,6 0,9
7 15,9 6070 2,5X105 3,5 47 33 1,0 0,8
Legenda: Hb– Hemoglobina; Leuc– Leucócitos; Plaq– Plaquetas; BT– bilirrubina total; Creat- creatinina
25
Resultados
4.1. Cultura de Células Endoteliais
Em todos os sete pacientes incluídos foi possível realizar a cultura de células
endoteliais com material extraído de aspirado de Medula Óssea, cultura foi realizada
conforme descrita nos Materiais e métodos. A Figura 3 representa a cultura de
células.
Figura 3: Cultura de células endoteliais após cinco dias incubação.
4.2. Sorting de células endoteliais
Após a extração das células endoteliais do meio de cultura foi realizado
sorting das mesmas conforme protocolo descrito acima. A Figura 4 representa os
histogramas da citometria de fluxo. A pureza de células endoteliais obtida após o
sorting com citometria de fluxo foi superior a 96%.
26
Resultados
Figura 4: Painel de citometria de fluxo de ECs CD45negVEGFR2+CD31+CD34+CD133.
Após a extração das CE foi pesquisada a presença da mutação JAK2V617F
nestas células, dos sete pacientes avaliados, em um deles a reação de PCR alelo-
específico não funcionou.
Em um paciente com diagnóstico de SBC a presença de JAK2 não
apresentava a mutação, apenas a tirosino quinase selvagem.
Nos outros cinco pacientes avaliados todos apresentaram a mutação
JAK2V617F em suas células endoteliais, sendo dois pacientes com diagnóstico de
Mielofibrose.
27
Resultados
Tabela 3: Frequência alélica mutação JAK2V617F.
ID_LAB ID_SEQ Tipo JAK2V617F DP VAF
1 MPC011 WP034 T
+ 150 0,13
WP035 N 70 .
2 MPC012 WP036 T
+ 159 0,05
WP037 N 86 .
3 MPC016 WP427 T
+ 190 0,88
WP051 N 91 .
4 MPC027 WP138 T
+ 123 0,20
WP139 N 81 0,01
5 MPC128 WP166 T
+ 142 0,06
WP167 N 90 .
Legenda: Identificação da amostra no laboratório (ID_LAB); identificação da amostra enviada para sequenciamento (ID_SEQ); tipos de amostra T = tumor e N = normal; Mutação JAK2V617F (chr9:5073770 G/T); número total de sequencias na posição da mutação JAK2V617F (DP) e a frequência do alelo variante Variant Allele Frequence (VAF).
4.3. Sequenciamento de exoma
Nos três pacientes com SBC sem DMPC a única mutação foi a mutação
JAK2V617F, embora numa frequência alélica baixa: 5%, 6% e 13%,
respectivamente. Nos dois pacientes com diagnóstico de MF, a frequência alélica da
mutação foi próxima de 90%.
28
5. DISCUSSÃO
29
Discussão
As doenças trombóticas apresentam uma enorme morbidade, podendo evoluir
muitas vezes com grande mortalidade. Dentre as principais localizações de
tromboses venosas graves, as tromboses mesentéricas incluindo tromboses de
veias Porta e Hepática, também conhecidas como Síndrome de Budd-Chiari, são as
que cursam com maior mortalidade.
O quadro grave de insuficiência hepática, cursando com ascite, icterícia,
sangramentos por varizes de Esôfago, decorrentes de hipertensão portal muitas
vezes é o primeiro sinal de alerta para uma doença trombótica ainda não
identificada.
A investigação completa de alterações genéticas ou adquiridas, conhecidas
genericamente como “trombofilias” deveria, portanto, ser considerada obrigatória em
todos pacientes que cursam com tromboses esplâncnicas. No grupo de pacientes
em acompanhamento no Hospital Albert Einstein apenas cinco pacientes não
apresentam nenhum tipo de trombofilia, sendo a presença e anticorpos
antifosfolípides e a mutação JAK2V617F as alterações mais diagnosticadas.
As primeiras publicações relacionando a mutação JAKV617F com tromboses
mesentéricas graves, inclusive com casuísticas com mais de 100 pacientes datam
do ano de 200856, inclusive com publicações importantes que analisaram a carga
alélica da mutação JAK2 em pacientes com trombose57.
Estas publicações deram origem a uma série de outros estudos retrospectivos
que comprovaram a relação entre a mutação JAKV617F com as doenças
trombóticas em geral, o que culminou com a publicação de uma meta-análise58
demostrando uma maior incidência desta mutação em pacientes com tromboses
portal e SBC de até 26% em relação à trombose em outros órgãos.
Em nossa opinião a investigação da presença da mutação JAK2V617F é
obrigatória em pacientes com tromboses mesentéricas, e embora não seja consenso
a sua investigação em pacientes com trombose em outras localidades, ela deve ser
realizada em paciente sem outros fatores de risco, como idade avançada, neoplasia,
tabagismo, obesidade e uso de anticoncepcionais orais.
30
Discussão
A correlação de DMPC com tromboses mesentéricas já está bem
estabelecida há muito tempo50,59 embora a sua fisiopatologia ainda não esteja
definida. Alguns autores advogam que o risco de trombose esteja relacionado com a
leucocitose presente nestes pacientes60, outros acreditam estar relacionada ao
aumento da viscosidade sanguínea, principalmente nos pacientes com Policitemia
Vera, mesmo os pacientes já em tratamento cito-redutor, com normalização dos
níveis de hematórcrito, hemoglobina e plaquetas, mantenham elevado risco de
novas tromboses, inclusive nos casos de pacientes em uso de medicações anti-
coagulantes.
A correlação entre as células endoteliais com a células tronco-
hematopoiéticas está bem estabelecida, seja através de teorias que correlacionam a
mesma origem embrionária, seja através da manutenção do pool de células tronco-
hematopoiéticas através da produção e liberação de fatores de crescimento pelas
células endoteliais43. Esta intrínseca relação entre estas duas linhagens nos
estimulou o procurar a expressão da mutação JAK2V617F nas CE.
A caracterização da tirosina quinase em CE foi descrita pela primeira vez na
dissecção de biópsia de fígado em pacientes com SBC61, e em seguida foi
demonstrado que a mutação JAK2 está presente em CE de modelos animais com
DMPC62.
Embora nos últimos anos tenham sido publicados diversos trabalhos
demonstrando a presença de mutação JAK2V617F nas CE, nenhum autor
conseguiu isolar estas células em pacientes vivos, com um grau de pureza acima de
90%. Normalmente as CE estão presentes em número muito restrito no sangue
periférico dos indivíduos, o que nos obriga a isolar estas células de algum órgão ou
tecido. Os primeiros estudos com aspirado de medula óssea foram realizados com
células isoladas de aspirado esternal de crianças cardiopatas no momento da
cirurgia cardíaca, com bons resultados após incubação em meio de cultura
desenvolvida por Hill e colaboradores63.
Em nosso estudo tentamos num primeiro momento utilizar exatamente a
mesma técnica de isolamento e expansão utilizados pelos autores chineses, porém
não conseguimos um número adequado de células após o “sorting” que fosse
31
Discussão
suficiente para a extração de DNA. Como nossa intenção foi extrair uma quantidade
de células endoteliais com um grau de pureza elevado, acima de 95%, tivemos que
fazer algumas alterações no protocolo original de cultivo EndoCult. Em primeiro
lugar coletamos uma quantidade maior de aspirado de medula óssea, cerca de 20
ml contra 5 ml que foi descrito pelo grupo chinês, em segundo lugar, prolongamos o
período de incubação em meio de cultura para sete dias ao invés de cinco.
No trabalho realizado pelo prof. Wu63 não foi realizada a quantificação
de pureza de CE após cultivo e expansão em meio de cultura, portanto não há
certeza se houve ou não contaminação com células polimorfo-nucleares.
Acreditamos que nosso estudo seja pioneiro na técnica de isolamento, cultivo
e expansão de células endoteliais, tendo como fonte aspirado de medula óssea,
uma vez que conseguimos uma pureza na amostra superior a 96% em todos os
pacientes estudados, confirmada através de painel de quatro cores de citometria de
fluxo.
As CE estão presentes numa quantidade muito pequena na medula óssea.
Planejamos num primeiro momento realizar o sequenciamento de exoma pareado
em tecido de pele, para termos o DNA chamado germinativo, pareado ao DNA
extraído das células tumorais, no caso os granulócitos e as células endoteliais
extraídas da medula óssea. Nosso objetivo a princípio era tentar identificar a
mutação JAK2V617F, assim como tentar identificar outras mutações relacionadas
DMPC nos dois tipos de linhagens celulares. Infelizmente a quantidade de DNA que
conseguimos extrair das nossas CE extremamente reduzida, o que inviabilizou a
realização de sequenciamento do exoma deste material. Não encontramos na
literatura nenhum estudo publicado de sequenciamento de células endoteliais,
acreditamos que a dificuldade de trabalhar com este tipo de linhagem celular ainda
seja uma barreira a ser superada. O meio de cultura desenvolvido por Hill e
colaboradores certamente nos ajudou muito a entender estas células, porém novas
técnicas de cultivo devem ser desenvolvidas nos próximos anos.
Nos sete pacientes estudados foi possível a extração de DNA das CE numa
quantidade suficiente para a realização de PCR alelo-especifico para a identificação
32
Discussão
da mutação JAK2V617F. Infelizmente em um dos pacientes a reação de PCR foi
inconclusiva, já em outro paciente a proteína expressa foi a selvagem.
Nos outros cinco pacientes estudados todos apresentaram a mutação
JAK2V617F em suas CE, o que corrobora nossa hipótese de que os pacientes com
SBC e mutação JAK2V617F em granulócitos também possuam a mutação em
células endoteliais. Os dois pacientes que eram portadores de Mielofibrose
apresentaram a mutação em CE.
Quando analisamos o sequenciamento do exoma pareado de pele e
granulócitos percebemos que os cinco pacientes apresentaram a mutação
JAK2V617F. Os dois pacientes com Mielofibrose apresentaram a mutação com uma
carga alélica muito elevada, próximo de 90%, enquanto nos três pacientes com SBC
sem DMPC a carga alélica foi baixa, menor do que 13%.
Em nosso estudo optamos por utilizar amostras de tecido de pele, para
caracterizar a amostra de DNA germinativo ou considerado Normal, ou seja, não
neoplásico. A utilização de pele, com suas camadas mais profundas, como a derme,
pode apresentar contaminação de sangue, ou seja, não podemos garantir que não
haja células de outras linhagens nessa amostra, principalmente granulócitos e as
próprias CE. Outras opções de tecidos não tumorais que poderiam ser estudados
seriam amostras de cabelo e saliva, porém a quantidade e principalmente a
qualidade do DNA extraído desses tecidos inviabilizariam o sequenciamento de
exoma.
Nossos resultados, embora numa amostra muito pequena, nos levam a
extrapolar que a mutação da tirosina-quinase está presente tanto nos granulócitos
quanto nas células endoteliais. A frequência alélica baixa pode sugerir uma lesão
“pré-neoplásica”, ou seja, o paciente já apresenta a mutação em suas células tronco
hematopoiética e nas CE, e embora a mutação ainda não tenha levado a um quadro
de DMPC, ocorreu a ativação da tirosina quinase no endotélio, já sendo capaz de
produzir eventos trombóticos.
Alguns autores sugerem que os pacientes portadores de SBC sejam
investigados para detecção de DMPC51,64, e que sejam seguidos ao longo dos anos,
33
Discussão
pois acreditam que esse indivíduos possam em algum momento evoluir para DMPC.
A biópsia de medula óssea muitas vezes não pode ser realizada, pois tratam-se de
pacientes clinicamente graves e em uso de medicações anticoagulantes. A pesquisa
da mutação JAK2V617F em sangue periférico, assim como a quantificação de sua
carga alélica pode tornar-se uma ferramenta muito útil no diagnóstico e seguimento
a longo prazo. Uma possibilidade de seguimento seria a aferição da carga alélica em
períodos de tempo determinados, e assim que a carga alélica apresentar acréscimos
significativos preparar o paciente adequadamente para a punção biópsia da medula
óssea.
A fisiopatologia da trombose mesentérica em pacientes com DMPC ainda não
foi totalmente elucidada, alguns autores demonstraram a relação de trombose com
aumento de células endoteliais circulantes, fatores de coagulação aumentados,
proteínas de ativação endotelial como V-CAM1, fator de crescimento endotelial
vascular (VEGF) e o fator de crescimento placentário65,66. Em nosso estudo não
realizamos nenhum estudo funcional de ativação endotelial, essa pode ser uma nova
linha de pesquisa para tentar elucidar o papel da ativação de tirosina quinases em
células endoteliais em pacientes com trombose em geral e principalmente com
DMPC.
O prognóstico dos pacientes com SBC é muito variável, depende
basicamente da estratificação de risco ao diagnóstico e a etiologia da trombose. Na
nossa experiência os pacientes apresentam uma alta morbidade, porém com uma
mortalidade relativamente baixa. Os pacientes normalmente apresentam um índice
de MELD baixo, o que dificulta a indicação de transplante de fígado, em nossa
casuística apenas dois pacientes com SBC foram transplantados nos últimos dez
anos.
O tratamento da SBC vai depender da etiologia da trombose, sendo o controle
dos sintomas clínicos como a ascite, através do uso de diuréticos, e a
descompressão da hipertensão portal através de shunts venosos, são o tratamento
de escolha. Sabidamente os pacientes com DMPC bem controlada continuam a
apresentar risco aumentado de trombose. A descoberta da associação da mutação
JAK2V617F como possível agente etiológico dos quadros trombóticos pode abrir um
novo leque de opções terapêuticas para os pacientes. Os inibidores de JAK2, como
34
Discussão
o Ruxolitinib, entre outros, talvez possam ser usados em outras patologias que não
DMPC. Estudos clínicos fase 1 devem ser iniciados em pacientes com SBC com
presença de mutação de tirosina quinase com a esperança de que o bloqueio da
proteína possa prevenir a ativação endotelial e evitar novos episódios de trombose.
As técnicas de sequenciamento tanto de exoma quanto de genoma estão
cada vez mais factíveis na prática clínica, e devem ser cada vez mais utilizadas
como ferramenta diagnóstico em doenças raras, pois auxiliam na identificação de
mutações pré-malignas que podem ser tratadas antes de causar uma doença grave.
No nosso caso a identificação da mutação JAK2V617F com uma carga alélica baixa
pode ajudar na identificação precoce de uma doença potencialmente grave.
35
6. CONCLUSÕES
36
Conclusões
A presença da mutação JAK2V617F foi confirmada nas células endoteliais
isoladas de medula óssea em pacientes portadores de Síndrome de Budd-Chiari que
expressavam a mutação em sangue periférico.
O estudo mutacional dos granulócitos nos pacientes de Budd-Chiari confirmou
a presença da mutação JAK2V617F, sendo esta a única mutação encontrada.
A mutação JAK2V617F em pacientes com SBC apresenta frequência alélica
mais baixa quando comparado com os pacientes portadores de doença
mieloproliferativa cônica que evoluem com SBC.
37
7. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS
38
Referências Bibliográficas
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44
RESUMO
45
Resumo
Helman R. A expressão da mutação JAK2V617F em células endoteliais de pacientes com Síndrome Budd-Chiari e sua correlação com as doenças mieloproliferativas crônicas Ph negativo. Tese (Doutorado); 2016.
As Doenças Mieloproliferativas Crônicas (DMPC): Policitemia Vera (PV),
Trombocitemia Essencial (TE) e Mielofibrose (MF) estão associadas com tromboses
venosas graves, principalmente com a Síndrome de Budd-Chiari (SBC) e outras
tromboses esplâncnicas. A fisiopatologia destas tromboses acredita-se estar
associada às alterações de viscosidade sanguínea gerada pela hipercelularidade
presente nestas patologias. A mutação JAK2V617F está presente em mais da
metade dos pacientes com MF e TE e em cerca de 90% dos portadores de PV,
ajudando muito no diagnóstico precoce e correto das DMPC. Nos últimos anos a
mutação JAK2V617F foi descrita em pacientes com tromboses esplâncnicas sem
alterações hematológicas, indicando que esta alteração pode preceder o surgimento
de doenças mieloproliferativas. Nos últimos dois anos foi comprovada a presença da
mutação JAK2V617F na célula endotelial de pacientes com SBC e outras tromboses
venosas.Com o advento do sequenciamento de DNA de nova geração (NGS),
tornou-se possível a detecção de todas as mutações presentes nas células tumorais
de um paciente, o que contribuiu sobremaneira para: 1- A identificação de novas
mutações; e; 2- A análise global das diferentes mutações presentes em um mesmo
tumor e que provavelmente atuam de forma cooperativa, permitindo a identificação
das vias moleculares alteradas nestes casos. A importância das células endoteliais,
tanto na fisiopatologia das doenças mieloproliferativas, quanto nas doenças
trombóticas ainda é uma questão aberto na literatura, principalmente pelas
dificuldades técnicas para extração e quantificação de pureza das células. A
utilização de técnicas refinadas para cultivo de células com o EndoCult e a utilização
de técnicas de citometria de fluxo com sorting de células selecionadas através de
fluocromos permitiu a identificação de células endoteliais com 98% de pureza e
permitiu a extração de DNA dessas células e identificação da mutação JAK2V617F
presentes nestas células em pacientes com doenças trombóticas. A presença da
mutação JAK2V617F nas células endoteliais em paciente com SBC, com
diagnóstico ou não de Doenças Mieloproliferativas sugere um papel importante
desta mutação na fisiopatologia das tromboses esplâncnicas.
Palavras-chave: Síndrome Budd-Chiari, mutação JAK2V617F, células endoteliais
46
APÊNDICE
47
Apêndice
APÊNDICE 1
APROVAÇÃO DO COMITÊ DE ÉTICA DA IRMANDADE DA SANTA CASA DE MISERICÓRDIA DE SÃO PAULO
48
Apêndice
49
Apêndice
50
Apêndice
APÊNDICE 2
APROVAÇÃO DO COMITÉ DE ÉTICA DO HOSPITAL ISRAELITA ALBERT EINSTEN
51
Apêndice
52
Apêndice
53
Apêndice
APÊNDICE 3
TERMO DE CONSENTIMENTO LIVRE E ESCLARECIDO
“A expressão da mutação JAK2V617F em células endoteliais de pacientes com
Síndrome Budd-Chiari e sua correlação com as doenças mieloproliferativas crônicas
Ph negativo”
Você está sendo convidado(a), a participar de um estudo clínico desenvolvido no
Instituto Israelita de Ensino e Pesquisa (IIEP) do Hospital Israelita Albert Einstein
(HIAE) e no Hospital da Irmandade da Santa Casa de Misericórdia de São Paulo.
O objetivo do presente estudo é o de identificar as causas genéticas de presença
de Tromboses Venosas em pacientes portadores da mutação Somática JAK2V617F e
em pacientes portadores de Doenças Mieloproliferativas Crônicas (Policitema Vera,
Trombocitemia Essencial e Mielofibrose), através da comparação do genoma
(material genético total) de células hematológicas (acometidas pela doença), células
endoteliais (presente na Medula Óssea e no Sangue) e com o genoma de células de
pele (tecido normal).
Se você aceitar participar deste estudo, o material de sangue periférico ou
aspirado de medula óssea será colhido ao mesmo tempo em que você estiver
colhendo estes exames para avaliação clínica, evitando assim a necessidade de
punções adicionais.
A biópsia de pele será realizada em antebraço, sob anestesia local. Será feito um
“punch” com agulha específica para biópsia de pele. Você receberá um ponto de
sutura no local da biópsia.
Suas amostras não serão utilizadas para fins comerciais. A sua doação não
influenciará no seu tratamento, uma vez que o presente estudo não visa alterações
no tratamento dos pacientes, mas poderá beneficiar pacientes no futuro.
A doação de amostras não será remunerada e serão identificadas, através de um
sistema alfa numérico com a finalidade de preservar sua privacidade. Apenas os
pesquisadores envolvidos no estudo terão acesso à sua informação clínica.
Os riscos envolvidos nesta doação são mínimos e envolvem a possibilidade de
sangramento local, hematoma, cicatriz cutânea e dor leve. Caso você decida não
participar do estudo, isso não afetará de forma alguma o seu tratamento.
54
Apêndice
Se você concordar, o material biológico coletado poderá ser utilizado em outros
estudos realizados pelos mesmos pesquisadores responsáveis por este estudo, sem
que seja necessário solicitar novamente a sua autorização.
Concordo Não Concordo
Como a tecnologia utilizada neste estudo, será a de sequenciamento de exoma
de suas células, existe a possibilidade de encontrarmos alterações genéticas
conhecidas, associadas a um risco aumentado de desenvolvimento de determinadas
doenças. Você deve optar por ser ou não informado a respeito destes achados, caso
eles ocorram.
Sim: Desejo ser informado, caso sejam encontradas alterações genéticas que
aumentam a probabilidade de desenvolvimento de doenças no meu genoma.
Não desejo ser informado, caso sejam encontradas alterações genéticas que
aumentam a probabilidade de desenvolvimentos de doenças no meu genoma.
Direitos do participante
Sua participação é voluntária e você pode retirar seu consentimento ou ainda
descontinuar sua participação em qualquer momento, se o assim o preferir, sem
penalização e/ou prejuízo de qualquer natureza. Não haverá nenhum custo a você
proveniente deste estudo, assim como não haverá qualquer tipo de remuneração
pela sua participação. Ao assinar este termo você não abre mão de nenhum direito
legal.
Confidencialidade
Apenas a equipe do estudo e a equipe assistencial, terão acesso aos seus dados.
Seu anonimato é garantido e a possível publicação cientifica resultantes deste
estudo não o (a) identificará em nenhuma circunstância como participante. Os dados
obtidos serão tratados sob estritas condições de confidencialidade.
Para qualquer dúvida relacionada ao assunto de direitos do paciente, entrar em
contato com o Comitê de Ética em Pesquisa: 2151-2181 [email protected]
Para qualquer dúvida relacionada ao estudo, por favor, sinta-se à vontade para
entrar em contato com os médicos responsáveis pela condução do estudo: Dr.
Ricardo Helman (11 2151- 3203/ 11 98202-5132).
55
Apêndice
Assinaturas de Consentimento
Fui informado de todos os detalhes relacionados ao estudo ao qual serei
submetido.
Entendo que sou livre para aceitar ou recusar a participar e que posso retirar-me
do estudo em qualquer ocasião, sem nenhuma consequência para a continuação de
meu tratamento.
Concordo que os dados coletados para o estudo serão usados para os fins
descritos acima, e que serão mantidos sob sigilo e confidencialidade.
Ao assinar este termo de consentimento não estarei abrindo mãos de meus
direitos legais
Li e compreendi todas as informações apresentadas neste Termo de
Consentimento Livre e Esclarecido. Tive a o tempo necessário para fazer perguntas
e todas as minhas dúvidas foram esclarecidas.
Receberei uma cópia assinada e datada deste Termo de Consentimento Livre e
Esclarecido.
________________________________________________ Nome Completo do paciente de pesquisa
________________________________________________ Data: ___/___/____ Assinatura do paciente de pesquisa
__________________________________________________
Nome completo e legível do médico responsável pela obtenção do consentimento
__________________________________________________ Data: __/___/____
Assinatura do médico responsável pela obtenção do consentimento
56
Apêndice
APÊNDICE 4
Apresentação Oral – Congresso EHA 2015
Presence of JAK2V617F mutation in endothelial cells from Budd-Chiari Syndrome patients is not correlated with Ph-negative myeloproliferative
neoplasm
Introduction
The role of the endothelial cell in the pathogenesis of Ph-negative MPNs is still
not elucidated. Some have reported the presence of the JAK2V617F mutation in
endothelial colony forming cells (ECFC) isolated from peripheral blood in patients
with Ph-negative MPNs (Teofili L et all, Blood 2011). Others, however, did not find
such an association (Piaggio G et al, Blood 2009). In patients with Budd-Chiari
Syndrome (BCS), the JAK2V617F mutation has been found in endothelial cell (ECs)
isolated by micro dissection from liver biopsies in patients both with and without MPN
(Sozer S et al, Blood 2009). Besides the JAK2V617F mutation, other mutations (e.g.
ASXL1, TET2, DNMT3A, SRSF2) have been described in patients with Ph-negative
MPNs, but their presence has not been evaluated in patients with BCS who carried
the JAK2V617F mutation.
Objectives
1. To evaluate the presence of the JAK2V617F mutation in CECs from patients with
BCS both with and without concomitant Ph-negative MPNs; 2. To determine the
mutational landscape of granulocytes in patients with BCS who harbored the
JAK2V617F mutation but did not have the clinical diagnosis of a Ph-negative MPN.
Methods
We identified 10 patients from our institution who had a diagnosis of BCS and
harbored the JAK2V617F mutation in granulocytes. Three patients died from hepatic
failure before they could be evaluated by bone marrow biopsy, so 7 patients remain
for the analysis. All patients were investigated for the presence of Ph-negative MPNs
with bone marrow trephine biopsy. ECs assays were performed according to the
method of Hill. Briefly, Ficoll-Paque density gradient–isolated mononuclear cells were
plated on fibronectin coated 6-well dishes with EndoCult medium (Stem Cell
Technologies) for 48 hours, when non adherent cells were recovered and re-plated in
a new dish at 106/mL concentration. After an additional 5 days, adherent cells were
plucked and analyzed by flow cytometry. The ECs population was sorted using a
FACS Aria BD Biosciences sorter according to the following phenotype: CD45-
PerCP-negative, CD31-FITC-positve, VEGFR2-PE-positive, CD34-PECy7-positive,
CD133-APC-negative. The presence of the JAK2V617F mutation was investigated by
57
Apêndice
allele-specific PCR. Paired DNA (sorted CD66b-granulocytes/skin biopsy) from 3
patients with JAK2V617F-positive BCS without a clinical diagnosis of Ph-negative
MPN was subjected to whole exome sequencing on a Illumina HiSeq 2000 platform
using Agilent SureSelect kit. Tumor coverage was 150x and germline coverage was
60x. Somatic variants calls were generated by combining the output of Somatic
Sniper (Washington University), Mutect (Broad Institute) and Pindel (Washington
University), followed by in-house filters to reduce false positive calls.
Results
We were able to obtain CECs from all 7 patients. The purity of the CECs
populations obtained was over 96% in all cases. Among the 7 patients with BCS, five
did not have any clinical feature of a Ph-negative MPN, with a normal bone marrow
biopsy. The JAK2V617F mutation was positive in the CECs from 5 cases, including 3
patients who only had BCS. In one patient with BCS solely the reaction did not work,
and in another the JAK2 was wild-type in the ECs. The mutation was positive in
CECs from both patients with myelofibrosis and BCS. Three patients with BCS solely
were evaluated by whole exome sequencing. The only known pathogenic
abnormality found was the JAK2V617F mutation, albeit at a low allele fraction (5%,
6%and 12.6%).
Conclusion
The presence of the JAK2V617F mutation in CECs from patients with BCS who
did and did not have a diagnosis of Ph-negative MPN suggest that the mutation plays
an important role in the development of vascular complications in these patients.
Further studies with a larger number of patients are needed to precisely define the
importance of CECs in the pathogenesis of MPNs. The sole presence of the
JAK2V617F mutation in circulating granulocytes at a very low allele fraction in
patients with BCS without Ph-negative MPNs suggest that these patients have a pre-
malignant clone that would probably remain undiagnosed had it been not for the
development of hepatic venous thrombosis.
