07janeiro/fevereiro/março - 2009

informativo sbm • ano 2 • www.sbmicrobiologia.org.br

A revista doMicrobiologista.

ISSN 1982

-1301 Obtenção de pigmentos naturais a partir do cultivo

de Monascus SP

Ciência in Foco

Editorial

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Índice

ExpedienteEditores: - Aumento 1000xCarlos Taborda e Walderez Gambale

Editoração e Impressão:Marketing e Publicidade: Dolika Afa Artes Gráfica: (51) 3343.5533Prix Eventos: Silvia Neglia - Diretora Diagramação: Geanine Viviane BackesFone/fax: 51.32496164microbiologia@prixeventos.com.br Tiragem:

2000 exemplares - Circulação NacionalCapa: Distribuição gratuita para sócios SBMFoto de Dr. Fábio Ramos de Souza Carvalho. Imu-nofluorescência direta com anticorpos monoclo- Responsabilidade editorial:nais: Forma extracelular de L. pneumophila soro- Todos os artigos assinados são de responsabilida-grupo 1 e interação com Acanthamoeba castellanii de dos respectivos autores.

SBM in FocoRevista da Sociedade Brasileira de

Microbiologia

Ano 2, nº 7 (Janeiro, Fevereiro, Março)São Paulo: SBM, 2008

Periodicidade Trimestral

Ciência in Foco

LEGIONELLA SPP E LEGIONELOSE: LIÇÕES APRENDIDAS COM A BACTÉRIA FASTIDIOSA . . . . . . . . . . . . . . 04

AVALIAÇÃO DO POTENCIAL BIOSURFACTANTE DE FUNGOS FILAMENTOSOS ASSOCIADOS A CNIDÁRIOS MARINHOS COM ATIVIDADE DE DEGRADAÇÃO DE HPAs . . . . . . . . . . . . . . . . . 13

OBTENÇÃO DE PIGMENTOS NATURAIS A PARTIR DO CULTIVO DE MONASCUS SP. . . . . . . . . 19

NOVOS PADRÕES DE RESISTÊNCIA: COMO INCORPORAR A DETECÇÃO NO LABORATÓRIO . . . . . . . . . . . . 27

PrezadoMicrobiologista,

Editorial

Prezado colega

Desde o primeiro número da Revista, em julho de 2007, temos enfatizado a necessidade de sua colaboração, enviando notícias, sugerindo temas, pes-quisadores, ofertas de emprego, enfim qualquer assunto que envolva a micro-biologia e que achar interessante para publicação e divulgação. Infelizmente, não temos recebido sugestões por parte dos leitores e da comunidade científi-ca microbiológica e isso tem limitado em muito a abrangência que idealizamos para a Revista e que deveria se refletir em cada número.

Dessa maneira, voltamos a enfatizar que esperamos e contamos com sua colaboração ativa para que essa iniciativa da SBM atinja o objetivo de divul-gar a Microbiologia nos mais diversos setores da comunidade brasileira.

Lembramos ao colega que a revista é de informação e divulgação e é com-posta de várias seções:

Seção 1: Ciência in foco: artigos de informação sobre temas relevantesSeção 2: Resenhas: comentários sobre livrosSeção 3: Resumos comentados de trabalhos científicos relevantesSeção 4: Homenagens a profissionais com destaque na fundação da

SBM e no desenvolvimento da MicrobiologiaSeção 5: Ensino em MicrobiologiaSeção 6: Departamento in Foco- Departamentos em destaque: Notíci-

as de interesse da MicrobiologiaSeção 7: Leitor in Foco- Espaço aberto ao leitor.Seção 8: Empresas in Foco- Informes publicitários: Espaço destinado

a EmpresasContamos com sua colaboração.

Escrevam para vgambale@usp.br ou taborda@usp.br

Marina B. MartinezPresidente

Walderez GambaleCarlos Taborda

Editores

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O gênero Legionella foi descrito no ano de 1979, após um surto de pneumo-nia ocorrido entre os membros da Legião Americana, cuja convenção aconteceu na cidade Filadélfia, Estados Unidos, em julho de 1976. Naquela ocasião, 180 pes-soas contraíram a doença e 29 pacientes foram a óbito. Em janeiro de 1977, McDa-de e colaboradores (1977) isolaram uma bactéria gram-negativa de tecidos pulmo-nares daqueles pacientes e denomina-ram-na Legionella pneumophila, enquan-to a respectiva infecção foi denominada de Doença dos Legionários. Investiga-ções posteriores efetuadas pelo Centro de Controle de Infecções e Doenças nor-te-americano (CDC) identificaram o siste-ma de ar-condicionado do hotel, onde aconteceu a convenção, como a fonte am-biental de dispersão da bactéria. A partir deste fato, bactérias do gênero Legionel-la têm sido isoladas de ambientes aquáti-cos e terrestres, e estudos ecológicos da

LEGIONELLA SPP E LEGIONELOSE: LIÇÕES APRENDIDAS COM A BACTÉRIA FASTIDIOSA

Ciência in Foco

família Legionellaceae têm demonstrado a habilidade desta bactéria em habitar lo-cais sob condições ambientais adversas de pH, temperatura e salinidade (Carva-lho et al., 2006; Sheehan et al., 2005).

Fontes naturais de água, sistemas de distribuição municipais e tanques de ar-mazenamento de grandes volumes de água podem ser ambientes aquáticos pro-pícios para o desenvolvimento de Legio-nella spp. Estes locais podem fornecer condições naturais para a proliferação da bactéria, como temperaturas uniformes, oferta de nutrientes dissolvidos presen-tes em sedimentos e biofilmes e presença de microrganismos comensais. A presen-ça de Legionella pneumophila em siste-mas de distribuição, por exemplo, está associada com constituintes físico-quí-micos presentes na água e nos materiais constituintes dos sistemas de encana-mento, como altas concentrações de Cál-cio e Magnésio, principais componentes

dos sedimentos e biofilmes (Vickers et al., 1987). Apesar da uniformidade de tempe-ratura encontrada geralmente nos reser-vatórios de água, estudo in situ utilizando um modelo de sistema de encanamento demonstrou a capacidade de L. pneu-mophila de sobreviver e/ou crescer em temperaturas de 20 , 40 e 50 C, não apre-sentando, porém, viabilidade em tempe-ratura igual ou acima de 60 C (Rogers et al., 1994). Outro ambiente aquático propí-cio para a ocorrência de microrganismos do gênero Legionella são os sistemas de climatização de ambientes interiores, co-mo torres de refrigeração, bandejas de condensação, chuveiros e caldeiras (Car-valho et al., 2007). Estes sistemas artifici-ais de climatização estão presentes prin-cipalmente em prédios públicos, hospi-tais e indústrias, e alguns fatores podem ocasionar o desenvolvimento de Legio-nella spp nestes ambientes aquáticos. Dentre estes fatores podemos citar os ma-

Fábio Ramos de Souza CarvalhoUniversidade Federal de São Paulo/ Escola Paulista de Medicina

Doutor em Ciências, Microbiologia (ICB/ USP)

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teriais metálicos utilizados, principalmen-te ferro, e a complexidade na manuten-ção que podem submeter as partes cons-tituintes do sistema de climatização aos processos de oxidação e acumulação ao longo do tempo. Assim, a oferta de metais oxidados, na forma de íons dissolvidos, e a formação de biofilmes microbianos po-deriam ser fatores importantes na perpe-tuação e proliferação da bactéria nos sis-temas de climatização, uma vez que re-presentam uma fonte de nutrientes es-senciais para o metabolismo de Legionel-la spp e atuam como barreira natural à ação de agentes antimicrobianos, res-pectivamente.

Outro aspecto importante quanto ao desenvolvimento de Legionella spp em ambientes aquáticos está relacionado às interações ecológicas de simbiose esta-belecidas entre a bactéria e protozoários de vida livre. A multiplicação no interior de amebas de vida livre, por exemplo, tem de-monstrado uma associação com o poten-cial patogênico da bactéria, além de se-rem observadas algumas similaridades entre o processo de infecção de L. pneu-mophila em Acanthamoeba castellanii e a sua infecção em células humanas de defe-sa, incluindo os macrófagos e monócitos (Steinert et al., 1997). Algumas evidên-cias indicam que o sinergismo entre Le-gionella spp e os protozoários, considera-dos reservatórios da bactéria na nature-za, exercem importante papel na presen-ça de L. pneumophila no ambiente, assim como no processo de infecção da bacté-ria em humanos (Miyake et al., 2005). Bac-térias intracelulares, como Chlamydia pneumonia e Mycobacterium avium, tam-bém podem se reproduzir no interior de amebas, no entanto, Legionella sp é a úni-ca bactéria capaz de manter a multiplica-ção no meio intracelular (Abu-Kwaik et al., 1998). Além disso, esta bactéria apre-senta em sua forma extracelular, após o processo replicativo intracelular, resis-tência contra diversos fatores abióticos, por exemplo, antibióticos e variações bruscas de temperatura, pH e osmolari-dade, podendo sobreviver em águas tra-tada, destilada e salina por longos perío-dos de tempo (Abu-Kwaik et al., 1997; Bar-

ker et al., 1995b).Amebas de vida livre das espécies

Acanthamoeba castellanii, Acanthamoe-ba polyphaga e Hartmannella vermifor-mis têm sido comumente isoladas de sis-temas de distribuição, sendo, então, utili-zadas para isolamento e posterior identi-ficação de microrganismos do gênero Le-gionella em laboratório (Rohr et al., 1998; Steinert et al., 1997). Pesquisas in vitro de-monstraram que o potencial de virulência da bactéria, assim como a resistência aos agentes antimicrobianos, pode aumentar após o processo de fagocitose (ingestão) pelo protozoário (Cirillo et al., 1994). Por-tanto, a ocorrência de amebas em ambi-entes aquáticos pode induzir o cresci-mento e perpetuação da bactéria nos ecossistemas aquáticos e terrestres (Rohr et al., 1998).

Apesar de não existir uma metodolo-gia universal padronizada para detecção de Legionella sp tanto em amostras clíni-cas quanto em ambientes naturais (água, solo e sedimento), o procedimento adota-do como padrão é o cultivo em meio sele-tivo de ágar-carvão tamponado acrescido de extrato de levedura e alfa-cetoglu-tarato ( BCYE), baseando-se principal-mente nas normas internacionais propos-tas pelos seguintes órgãos: International Standard Method ISO 11731 (Internatio-nal Standard ISO 11731, 1998), French Standard Method AFNOR NF T90-41 (Association Française de Normalisation, 2003) e Nederlands Normalisatie-Instituut (Nederlands Normalisatie-Instituut, 1991). O meio de cultura BCYE, geralmente, é suplementado com L-cis-teína e pirofosfato férrico, devido aos re-querimentos nutricionais essenciais da bactéria por estes compostos. Agentes antimicrobianos como glicina, vancomici-na e polimixina B, podem ser adicionados ao meio para evitar a proliferação de ou-tras bactérias oportunistas e propiciar o isolamento de Legionella spp. Assim, es-te meio de cultura é denominado ágar BCYE-GVP (Alpha-ketoglutarate Buffe-red Charcoal Yeast Extract Agar-Glicine, Vancomycin, Polymyxin B). Além disso, procedimentos sorológicos, como imuno-fluorescência direta e aglutinação em par-

tículas de látex, têm sido utilizados para identificação presuntiva dos isolados de Legionella. Apesar do reconhecimento quanto à importância epidemiológica acerca da obtenção de isolados ambien-tais de Legionella spp, principalmente, pa-ra o estudo estrutural da população desta bactéria, diversas limitações quanto à sensibilidade e especificidade, têm sido associadas aos métodos descritos anteri-ormente de isolamento e identificação da bactéria em amostras naturais (Behets et al., 2007; Joly et al., 2006). Assim, consi-derando a baixa concentração celular da bactéria nos diferentes ambientes e a bai-xa sensibilidade e especificidade dos mé-todos de isolamento e identificação de Le-gionella spp, técnicas moleculares inde-pendentes de cultivo, a partir de produtos da reação em cadeia da polimerase (PCR), têm sido propostas como procedi-mento alternativo para aumentar a sensi-bilidade e especificidade na detecção e quantificação destas bactérias em amos-tras ambientais e clínicas.

A família Legionellaceae é constituída apenas do gênero Legionella (Fields et al., 2002). Alguns pesquisadores propu-seram a inclusão de outros dois gêneros, Fluoribacter e Tatlockia (Fox, Brown, 1993; Garrity et al., 1980). Porém, estu-dos moleculares confirmaram a presença apenas de um gênero (Legionella), bem como a família Legionellaceae como sub-grupo monofilético da subdivisão gam-ma-2 de Proteobacteria (Benson, Fields, 1998; Fry et al., 1991). Assim, as denomi-nações de algumas espécies de Legio-nella, por exemplo, Legionella (Fluoribac-ter) dumoffi, Legionella bozemanii (Fluo-ribacter bozemanae), Legionella (Tatloc-kia) maceachernii e Legionella (Tatlockia) micdadei, permanecem atualmente sob discussão taxonômica de grupos de pes-quisa especializados. Atualmente, exis-tem 51 espécies de Legionella e 72 soro-grupos (Tabela 1), sendo Legionella jeonii a última espécie descrita em literatura (Park et al., 2004).

Legionella spp são microrganismos

CARACTERÍSTICAS DA FAMÍLIA LE-

GIONELLACEAE.

* As espécies estão listadas segundo a ordem da data de isolamento ou identificação.**Sorogrupo 2 de L. erythra tem sido associado a doença em humanos.

Espécies* N° de sorogrupos Capacidade de causar legioneloseL. pneumophila 15 SimL.bozemanii 2 SimL. dumoffii 1 SimL. micdadei 1 SimL. longbeachae 2 SimL. jordanis 1 SimL. wadsworthii 1 SimL. hackeliae 2 SimL. feeleii 2 SimL. maceachernii 1 SimL. birminghamensis 1 SimL. cincinnatiensis 1 SimL. gormanii 1 SimL. sainthelensi 2 SimL. tucsonensis 1 SimL. anisa 1 SimL. lansingensis 1 SimL. erythra 2 Sim**L. pariensis 1 SimL. oakridgensis 1 SimL. spiritensis 1 NãoL. jamestowniensis 1 NãoL. santicrucis 1 NãoL. cherri 1 NãoL. steigerwaltii 1 NãoL. rubrilucens 1 NãoL. israelensis 1 NãoL. quinlivanii 2 NãoL. brunensis 1 NãoL. moravica 1 NãoL. gratiana 1 NãoL. adelaidensis 1 NãoL. fairfieldensis 1 NãoL. shakespearei 1 NãoL. waltersii 1 NãoL. genomospecies 1 NãoL. quarteirensis 1 NãoL. worsleiensis 1 NãoL. geestiana 1 NãoL. natarum 1 NãoL. londoniensis 1 NãoL. taurinensis 1 NãoL. lytica 1 NãoL. drozanskii 1 NãoL. rowbothamii 1 NãoL. fallonii 1 NãoL. gresilensis 1 NãoL. beliardensis 1 NãoL. busanensis 1 NãoL. drauncortii 1 NãoL. jeonii 1 Não

TABELA 1. ESPÉCIES DE DE CAUSAR DOENÇA (LEGIONELOSE).

LEGIONELLA E PROSSIBILIDADE

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sem a adição deste aminoácido (Fields, 1992). Tesh e Miller (1981), utilizando a espécie L. pneumophila, demonstraram a assimilação de nove aminoácidos como fonte de carbono e energia adicionais por esta bactéria. Estudos realizados por Wa-

dowsky e Yee (1983; 1985) demonstra-ram o efeito de bactérias não-Legio-nellaceae na multiplicação de cepas de L. pneumophila em amostras de água potá-vel quando cultivadas em meio de cultura seletivo sob condição de ausência do ami-noácido L-cisteína. Além disso, foi de-monstrado que a presença de íons metá-licos em baixas concentrações no ambi-ente aquático, principalmente ferro, zinco e potássio, poderiam induzir a prolifera-ção de microrganismos do gênero Legio-nella (States et al., 1985).

As características fenotípicas conhe-cidas das espécies de Legionella, com ex-ceção de L. pneumophila, são limitadas. Apresentam-se como bacilos gram-negativos, não-esporulados, de formas e tamanhos variáveis (0,3-0,9 m de diâme-tro x 2,0-20,0 m de comprimento), se-gundo a fonte nutricional e condições de desenvolvimento. Por exemplo, em teci-dos infectados ou secreções pulmonares de humanos, onde a temperatura corpo-ral interna varia entre 37 e 42 C, a bacté-ria pode ser encontrada na forma de baci-los filamentosos multinucleados e não-septados, enquanto em ambientes natu-rais, como água e solos úmidos, onde a temperatura é geralmente 25 C, Legio-nella spp podem ser encontradas na for-ma bacilar curta e delgada (Piao et al., 2006). Características bioquímicas adici-onais, comuns do gênero são: mobilida-de devido à presença de um, dois ou mais flagelos situados nas regiões polares ou laterais da bactéria; variabilidade na rea-ção de oxidase; reações negativas para redução de nitrato, urease, catalase e uti-lização (fermentação e oxidação) de car-boidratos; não formam endósporos ou mi-crocistos; não-encapsulados e não apre-sentam álcool-ácido resistência (Ben-son, Fields, 1998). A maioria das espé-cies produz a enzima beta-lactamase e li-quefaz a gelatina (Fields et al., 2002), en-quanto algumas espécies, quando culti-vadas, demonstram autofluorescência sob luz ultravioleta (UV) com comprimen-to de onda de 365 nanômetros. Neste ca-so, L. anisa, L. bozemanii, L. parisiensis, L. tucsonensis, L. gormanii, L. cherrii, L.

aeróbios estritos e quimiorganotróficos, utilizando aminoácidos, principalmente L-cisteína, como fontes de carbono e energia (Brenner et al., 1979), com exce-ção das espécies L. oakridgensis e L. spi-ritensis que crescem em meio seletivo

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competem com Legionella spp pela mes-ma fonte nutricional (Fields et al., 2002).

Estudos ecológicos de simbiose têm demonstrado a importância da presença de protozoários de vida livre na perpetua-ção e replicação de espécies de Legionel-la em corpos de água cujas condições não favorecem o crescimento da bactéria extracelularmente (Harb et al., 2000). A re-lação ecológica estabelecida geralmente é de parasitismo, e amebas de vida livre dos gêneros Acanthamoeba, Hartmanel-la e Naegleria, por exemplo, estão comu-mente relacionadas à presença de algu-mas espécies Legionella, principalmente L. pneumophila, no ambiente aquático (Fi-gura 1). Os gêneros Saccamoeba, Vexilli-fera e Platyamoeba também constituem um importante grupo de amebas de vida livre que podem estar associadas à pre-sença de Legionella spp no ambiente aquático (Steinert et al., 2002). Outros protozoários de vida livre, como os cilia-dos Tetrahymena pyriformis, Tetrahyme-na thermophila, e Tetrahymena vorax tam-bém podem favorecer a proliferação in-tracelular de algumas espécies desta bac-téria, como L. pneumophila e L. longbea-chae, em ambientes naturais (Kikuhara et al., 1994; Smith-Sommerville et al., 1991; Steele, Mclennan, 1996). Estudos adicio-nais de interação hospedeiro-parasita, uti-lizando L. pneumophila como modelo nos ensaios de co-cultivo, demonstraram que o crescimento intracelular prévio desta bactéria em protozoários de vida livre, po-de potencializar o processo de infecção deste patógeno em células humanas de defesa (Cirillo et al., 1994), induzir a modu-lação fenotípica (Abu-Kwaik et al., 1993;

Barker et al., 1995a) e aumentar o fator de resistência a desinfetantes químicos, bio-cidas e antibióticos (Barker et al., 1992; Barker et al., 1995b).

A maior ocorrência de Legionella spp está relacionada com sistemas de climati-zação de ambientes interiores, como equi-pamentos relacionados a centrais de aquecimento de água (caldeiras, chuvei-ros e torneiras) e sistemas de refrigera-ção central, como torres de resfriamento, bandejas de condensação e caixas de re-posição de água das torres de refrigera-ção (Atlas, 1999). Estes sistemas de cli-matização artificiais são geralmente en-contrados em hospitais, hotéis, indústri-as, prédios comerciais e centros de con-sumo e lazer, como supermercados e cen-tros comerciais (shopping centers). Nes-tes ambientes, o contato humano com a bactéria ocorre pela inalação de aeros-sóis dispersos na atmosfera provenien-tes do resfriamento ou aquecimento da água dos sistemas de climatização conta-minados, apesar da transmissão deste pa-tógeno entre humanos não ocorrer (Fi-elds, 1996). Uma vez estabelecida a colo-nização, a erradicação da bactéria destes sistemas tem sido uma problemática re-corrente. Dentre os diversos fatores limi-tantes para o sucesso do processo de de-sinfecção, seja ele químico ou físico, po-demos citar a ocorrência de biofilmes mi-crobianos.

A presença de biofilmes microbianos tem demonstrado importância fundamen-tal na resistência e proliferação de algu-mas espécies de Legionella em sistemas de distribuição de água e sistemas de cli-matização artificial de ambientes interio-

Figura 1: Fotomicrografia fluorescente de L. pneumophila. A: forma intracelular viável da bactéria (pontos verdes demonstrados nas setas) obtidas pelo procedimento de

co-cultivo das amostras ambientais em culturas axênicas de A. castellanii. Coloração fluorescente de Live-Dead (Molecular Probes, Inc.) com corantes SYTO9 e Iodeto de

Propídio. B: aumento de 400x; A e C: aumento de 1000x.

steigerwaltii e L. dumoffii apresentam au-tofluorescência branco-azulada; L. bir-minghamensis e L. wadsworthii autofluo-rescem verde-amareladas, enquanto L. erythra e L. rubrilucens apresentam fluo-rescência avermelhada sob luz UV (Winn, 1999).

O ambiente aquático constitui o princi-pal reservatório para microrganismos do gênero Legionella e espécies desta bac-téria podem ser encontradas sob as mais adversas condições naturais, como águas doce (rios e lagos), salobra (ambi-ente estuarino) e salgada (mares e ocea-nos), águas subterrâneas (lençóis freáti-cos), águas residuárias, solos úmidos, além de gotículas de água dispersas na at-mosfera na forma de aerossóis (Bartie et al., 2003; Carvalho et al. 2007; Catalan et al., 1997; Fliermans et al., 1981; Ortiz-Roque, Hazen, 1987; Palmer et al., 1993; Pascual et al., 2001). A temperatura de crescimento ideal destas bactérias é 35 C, podendo variar entre 25 e 42 C (Katz, Hammel, 1987), considerando que ambi-entes aquáticos alterados termicamente podem gerar mudança na comunidade mi-crobiana local e, conseqüentemente, alte-ração no balanço entre as populações de protozoários e bactéria (Fields et al., 2002). Este fato pode resultar em rápida multiplicação de Legionella spp e, even-tualmente, se traduzir no aumento do ris-co de infecção em humanos imunodepri-midos se expostos a aerossóis contendo esta bactéria. Além da presença de Le-gionella spp no ambiente aquático e da temperatura aquecida da água na qual ge-ralmente se encontra, a composição de nutrientes pode atuar como terceiro fator relevante para a proliferação destas ba-ctérias na água. No entanto, microrganis-mos do gênero Legionella requerem uma combinação específica de certos nutrien-tes, semelhantes aos incorporados nos meios de cultura elaborados em laborató-rio, os quais são raramente encontrados dissolvidos na água, e quando ocorrem são assimilados principalmente por bac-térias cujo crescimento é mais rápido e

ECOLOGIA DE LEGIONELLA SPP NO AMBIENTE

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bros da família Legionellaceae em formar biofilmes utilizando diferentes substratos, como vidro, poliestireno e polipropileno. Neste estudo ele concluiu que L. pneu-mophila possui melhor capacidade de for-mação de biofilme em todos os materiais testados quando comparadas às outras es-pécies do gênero, além de relacionar as di-ferenças morfológicas de L. pneumophila e dinâmica de formação de cada biofilme, com a temperatura de incubação e condi-ção nutricional experimentadas.

A etiologia causada por microrganis-mos do gênero Legionella é denominada legionelose. Esta infecção se manifesta sob duas formas clínicas denominadas fe-bre de Pontiac e Doença dos Legionários. A febre de Pontiac é uma enfermidade leve e autolimitada de curta duração, caracteri-zada principalmente por aumento da tem-peratura corporal, mialgia, mal-estar, cefa-léia e ausência de pneumonia. Por outro la-do, a manifestação clínica da Doença dos Legionários (DL) é semelhante à de outras doenças respiratórias de origem bacteria-na, como pneumonias por micobactérias e clamídia, podendo levar o indivíduo ao óbi-to. Os sintomas da DL, em geral, incluem pneumonia aguda, tosse seca, febre alta (38.8 a 40 C), calafrios, diarréia, escassez de respiração, dores no peito, cefaléia, su-dorese excessiva, náuseas e dores abdo-minais. Eventualmente, se observa pre-sença de sangue no escarro (Koneman et al. 2001). Letargia e confusão podem ocor-rer em casos graves progressivos.

Após o processo de contágio, a bacté-ria se instala no trato respiratório, pulmões e alvéolos pulmonares, podendo entrar na corrente sangüínea sistêmica e infectar ou-tros órgãos humanos relacionados princi-palmente aos tratos gastro-intestinal e uri-nário. O processo de resposta imune do or-ganismo humano a presença de Legionel-la spp ocorre pelas células de defesa, co-mo macrófagos, monócitos e células epi-teliais pulmonares, cujos mecanismos de reconhecimento, englobamento e inativa-ção da bactéria, assemelham-se aos mes-mos processos de interação realizados na natureza pelos protozoários de vida livre

PATOGENICIDADE E EPIDEMIOLOGIA

(Abu-Kwaik et al., 1998; Shin, Roy, 2008).Os casos clínicos de legionelose co-

meçaram a surgir na segunda metade do século 20, devido principalmente às alte-rações ambientais decorrentes da ação humana. A espécie L. pneumophila é o agente etiológico de 98% dos casos de Doenças dos Legionários descritos em li-teratura, e o sorogrupo 1 desta espécie é responsável por 95% destas infecções (Doleans et al., 2004). Em termos mun-diais, L. longbeachae é a segunda espé-cie mais isolada de pacientes portadores de legionelose, sendo responsável por 30% dos casos clínicos de Doença dos Le-gionários diagnosticados na Austrália (Yu et al., 2002). A transmissão de L. longbea-chae, ao contrário das demais espécies cuja transmissão ocorre pela inalação de aerossóis contaminados com a bactéria, tem sido associada ao manejo de solos úmidos, principalmente em países como Japão, Austrália, Nova Zelândia e Esta-dos Unidos (den Boer et al., 2007; Koide et al. 2001; Roig et al., 2003). Por outro la-do, outras espécies como, L. anisa, L. mic-dadei, L. dumoffii ou L. feeleii são rara-mente patogênicas para os humanos, em-bora sejam frequentemente isoladas de sistemas de distribuição de água (Muder, Yu, 2002).

Levantamentos epidemiológicos rea-lizados regularmente pelo Grupo de Pes-quisa Internacional de Infecções por Le-gionella spp (EWGLI - The European Wor-king Group of Legionnaires' Infections), in-dicam o número crescente de casos de le-gionelose que ocorrem principalmente na Europa e demonstram a preocupação dos órgãos de saúde daquele continente em diagnosticar precocemente a infec-ção e identificar as fontes ambientais de dispersão da bactéria (Figura 2). Este gru-po de pesquisa é composto pela maioria dos países membros do bloco europeu, como Andorra, Áustria, Bélgica, Bulgária, Croácia, República Tcheca, Dinamarca, Estônia, Finlândia, França, Alemanha, Grécia, Islândia, Irlanda e Irlanda do Nor-te, Itália, Luxemburgo, Malta, Noruega, Polônia, Portugal, Eslovênia, Espanha, Suécia, Suíça, Holanda, Turquia, Ingla-terra e País de Gales e Escócia, além de

res (Piao et al., 2006). Segundo Donlan e Costerton (2002), biofilme é uma "comu-nidade microbiana séssil caracterizada por células aderidas irreversivelmente a um substrato, ou uma interface, ou a am-bos, imersas em uma matriz de substân-cias poliméricas extracelulares produzi-das pelos próprios microrganismos cons-tituintes daquela comunidade, bem como exibem modificações fenotípicas relacio-nadas à taxa de crescimento e transcri-ção gênica". A formação de biofilmes mi-crobianos produz uma comunidade mi-crobiana aderida, hidratada e estrutura-da, podendo conferir algumas vantagens para a sobrevivência e proliferação da-queles microrganismos sob condições desfavoráveis de crescimento, como pro-teção a compostos nocivos (agentes anti-microbianos), variações bruscas de tem-peratura, pH e salinidade e prevenção à dissecação (Donlan, 2002; Dunne, 2002). Ou seja, os biofilmes microbianos podem atuar como uma barreira biológica para a penetração e ação de agentes antimicro-bianos químicos e/ou físicos na inativa-ção celular, tornado os microrganismos componentes do biofilme resistentes, por exemplo, a altas concentrações de cloro. Murga e collaboradores (2001), utilizan-do modelo de biofilme em sistemas de água potável e inoculando neste reator uma comunidade definida de bactérias, composta basicamente de espécies de Pseudomonas, Klebsiella, Flavobacte-rium além de L. pneumophila e Hartma-nella vermiformis (como hospedeiro natu-ral das bactérias no ambiente), observou um equilíbrio reprodutível entre bactérias heterotróficas e amebas de vida livre quando Hartmanella vermiformis foi adi-cionada ao reator. Além disso, aqueles pesquisadores observaram que apesar da persistência extracelular da bactéria ter sido observado na ausência de H. ver-miformis, a multiplicação extracelular de L. pneumophila e o desenvolvimento planctônico da bactéria estariam direta-mente associados à presença de amebas de vida livre em biofilmes microbianos. Estudos complementares recentes con-duzidos por Piao e colaboradores (2006) demonstraram a capacidade de mem-

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entre 50 e 80 anos, em contrair legionelo-se. Hicks e colaboradores (2006) obser-varam o aumento súbito nos casos de le-gionelose reportados ao CDC durante a estação da primavera. Estudos ecológi-cos e epidemiológicos realizados por aqueles autores relacionaram o aumento do número de casos de legionelose diag-nosticados ao aumento do índice pluvio-métrico nos estados amostrados, suge-rindo uma maior transmissibilidade da bactéria ao homem durante as estações climáticas de períodos chuvosos nos Estados Unidos. Naquele país, o número estimado de pacientes portadores de Doença dos Legionários diagnosticados pode variar entre 8.000 e 18.000 casos anualmente, apesar da suspeita de alguns pesquisadores de que o número re-al possa variar entre 25.000 e 100.000 casos clínicos desta doença por ano (Brooks et al., 2004; Fields, 2002).

Pouco se conhece sobre a ecologia da família Legionellaceae no Brasil, onde os estudos têm sido desenvolvidos em sua maioria para o diagnóstico clínico. No ca-so da região metropolitana de São Paulo, o interesse pelo estudo de Legionella spp tanto no aspecto clínico como no ambien-tal existe desde os primeiros descritos da ocorrência da bactéria na cidade de São Paulo (Veronesi et al., 1984). No entanto, após a e aprovação da Lei número 8080, de 19 de setembro de 1990, acerca da qualidade do ar de interiores de ambien-tes climatizados, houve um maior interes-se científico sobre a origem, persistência, resistência a agentes de desinfecção des-te microrganismo no ambiente. Levin e co-

países de outros continentes como Israel, Austrália e Estados Unidos. A preocupa-ção concentrada do bloco europeu quan-to aos estudos epidemiológicos constan-tes acerca dos casos de legionelose se de-ve ao fato, principalmente, dos sistemas de distribuição de água de consumo entre os países serem interligados e compos-tos, em sua maioria, por tubulações metá-licas de ferro, zinco e cobre cujos efeitos da oxidação ao longo do tempo, propici-am a colonização de bactérias do gênero Legionella e, consequentemente, a con-taminação da água para consumo huma-no (Robey, Cianciotto, 2002). A crescente ocorrência de surtos de legionelose levou as autoridades de vigilância pública da-queles países a desenvolverem um pro-grama específico unificado de controle epidemiológico e a utilização de um pro-tocolo de diagnóstico clínico padronizado (European Working Group for Legionella Infections, 2005). A implantação destes processos, ao longo de duas décadas, ge-raram dados preocupantes acerca das in-fecções por Legionella spp no continente europeu, como demonstrado na figura 2, e tem despertado os órgãos responsá-veis de vigilância pública quanto à impor-tância do estudo das fontes ambientais de dispersão da bactéria como método preventivo da ocorrência de surtos de legi-onelose (Pereira et al., 2006; Velonakis et al., 2006).

Outros resultados, disponibilizados pelo EWGLI para conhecimento da comu-nidade científica internacional, demons-tram a maior predisposição de indivíduos do sexo masculino, cuja idade pode variar

Figura 2: Levantamento epidemiológico anual de casos clínicos de Doença dos Legionários diagnosticados em países membros do Grupo de Pesquisa Internacional de Infecções por Legionella spp no período 1997 a 2006. Fonte: The European Working Group of Legionnaires' Infections (EWGLI) website.

laboradores (1991) descreveram o isola-mento de Legionella pneumophila soro-grupo 1 em amostras provenientes de água de torres de ar - condicionado e Le-gionella anisa em amostras de água de torneiras hospitalares. Em 1995, Pellizari e Martins descreveram o isolamento de Legionella pneumophila, sorogrupos 1 e 6, e Legionella bozemanii, totalizando de-zenove isolados, provenientes de dois hospitais e um prédio público, situados na cidade de São Paulo, Brasil (Pellizari, Mar-tins, 1995). No aspecto clínico, em 1989, Pereira Gomes e Mazzieri descreveram o isolamento de Legionella pneumophila so-rogrupo 1 proveniente de amostra clínica, no Hospital das Clínicas da Faculdade de Medicina de São Paulo (Pereira Gomes et al., 1989). Em estudo conduzido por Fer-reira, L. pneumophila foi detectada em amostras de água de sistemas de distri-buição hospitalar (Ferreira, 2004). Re-centemente, Chedid e colaboradores des-creveram a identificação de L. pneumop-hila em amostras clínicas provenientes de três pacientes internados no Hospital Universitário da região sul do Brasil (Che-did et al., 2005).

Apesar da denominação de microrga-nismo fastidioso, a ocorrência de Legio-nella sp em infecções humanas e no ambiente natural tem sido acompanhada de forma crescente pela comunidade cien-tífica. Devido aos poucos estudos publi-cados, a incidência deste microrganismo no Brasil pode estar sendo subestimada, uma vez que a literatura tem demonstra-do que microrganismos do gênero Legio-nella ocorrem a nível global em diferentes ambientes. Diversos fatores limitantes es-tão relacionados a dificuldade do estudo da incidência da bactéria. O diagnóstico clínico de legionelose muito se asseme-lha às manifestações clínicas de outras pnemopatias atípicas de origem bacteria-na. Outro fator limitante existente é a es-cassez celular de Legionella spp e a pre-sença de microrganismos de crescimento rápido nas amostras, tanto de origem clí-nica quanto ambiental. Assim, se consi-derarmos a necessidade de aplicação de métodos de tratamento químico e/ou físi-

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co para redução da carga microbiana in-desejada e, quando presente, a baixa con-centração de Legionella spp nas amos-tras, estes fatos quando analisados em conjunto dificultam o isolamento e, con-seqüentemente, a identificação da bacté-ria. Por isso, diferentes técnicas de detec-ção deste patógeno têm sido propostas e avaliadas. No entanto, estudos compara-tivos relacionados à aplicação de diferen-tes metodologias de isolamento e identifi-cação, realizados por diferentes grupos de pesquisa em todo mundo, tem conver-gido para a mesma opinião: a comple-mentaridade. Assim, a utilização de técni-cas presuntivas e confirmativas está dire-tamente relacionada à maior sensibilida-de e especificidade na detecção de mi-crorganismos do gênero Legionella. Con-siderando os aspectos morfológicos e fisi-ológicos deste microrganismo, bem como a interação hospedeiro-parasita estabe-lecida entre a bactéria e diferentes célu-las eucarióticas, poderemos entender com maior clareza os mecanismos de mul-tiplicação intra e extracelulares e os fato-res de resistência associados à persis-tência e dispersão de Legionella spp a par-tir de fontes ambientais.

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2. Michel R. Z. Passariniπ,

3. Marili V. L. Rodriguesπ,

4. Lucia R. Durrant≤ & 5. Lara D. Setteπ

π Divisão de Recursos Microbianos DRM - CPQBA ≤ Faculdade de Engenharia de Alimentos - DCA

Universidade Estadual de Campinas (Unicamp) - Campinas - SP

AVALIAÇÃO DO POTENCIAL BIOSURFACTANTE DE FUNGOS FILAMENTOSOS ASSOCIADOS A CNIDÁRIOS MARINHOS COM ATIVIDADE DE DEGRADAÇÃO DE HPAs

Ciência in Foco

INTRODUÇÃO As diversas atividades como explora-

ção, produção, refino e principalmente o transporte do petróleo resultam em aci-dentes com vazamentos de óleo para o me-io ambiente, os quais têm ocorrido com fre-

qüência devido ao fato da intensa utiliza-ção do petróleo e de seus derivados em nossas vidas (Fingas, 2001). Derrames ca-usados por navios são responsáveis por dois milhões de toneladas de óleo por ano no mar, sendo que 92% dos acidentes

ocorrem próximos à costa e são resultan-tes de erros operacionais ou de falta de ma-nutenção (Ferrão, 2005). Bicca e colabo-radores (1999) relataram que a descarga anual de óleo no oceano é em torno de 1.7 a 1.8 toneladas por metro. O impacto des-

5

ta poluição resulta em um severo desequi-líbrio ambiental além de danos sociais e econômicos, principalmente no que diz res-peito às atividades costeiras e de explora-ção dos recursos do mar.

De acordo com Ferrão (2005) os efei-tos sobre os organismos marinhos e sobre as comunidades ribeirinhas ao longo da costa afetada serão sentidos por pelo me-nos uma década. Quanto às atividades pesqueiras comerciais, sabe-se que um derrame de petróleo pode contaminar equi-pamentos de pesca e instalações de mari-cultura. O suprimento de água do mar para operações industriais também pode ser afetado por estes derrames, bem como po-dem ser interrompidas as rotinas das ativi-dades dos portos tais como balsas e servi-ços de comportas, principalmente se fo-rem derramados petróleo leve, gasolina ou outros materiais inflamáveis. Em adi-ção, os problemas gerados pelo derrama-mento acidental de petróleo no ambiente além de demandar elevados custos de lim-peza da maré negra, podem acarretar ris-cos intrínsecos à saúde pública, como as mortes causadas por explosões e incêndi-os, intoxicação causada pela ingestão de alimentos contaminados, ou problemas dermatológicos e irritações nos olhos, cau-sadas pelo contato direto com o óleo.

Após o derramamento do óleo na água ocorre o intemperismo, ou seja, um con-junto de processos químicos, físicos e bio-lógicos que como conseqüência, resulta na degradação do óleo ao longo do tempo (Dias 2008). Dentre estes fatores, pode-mos destacar a biodegradação, um pro-cesso biológico relacionado com a meta-bolização dos hidrocarbonetos do petró-leo, promovido por microorganismos (bac-térias e fungos) que podem ser encontra-dos no ambiente aquático ou terrestre.

Os hidrocarbonetos policíclicos aro-máticos (HPAs) derivados do petróleo são compostos de difícil degradação podendo permanecer no ambiente (ar, água, solo, sedimentos) durante longos períodos de tempo, pois possuem uma alta afinidade com solos ricos em matéria orgânica e se-dimentos marinhos (AbbondanzI et al., 2005). Os HPAs são uns dos principais po-luentes ambientais e podem causar riscos para a saúde e meio ambiente devido à for-

mação de substâncias genotóxicas e car-cinogênicas (Baborová et al., 2006). Desta forma, a preocupação mundial relaciona-da à liberação de hidrocarbonetos no ambi-ente decorrente da atividade industrial e do derramamento acidental de óleo e de seus componentes vem crescendo inces-santemente nos últimos anos.

Inúmeros trabalhos envolvendo a bior-remediação, ou seja, a busca por micror-ganismos capazes de degradar os HPAs têm sido conduzidos visando transforma-ção desses compostos em moléculas me-nos tóxicas, incluindo a mineralização com-pleta ou ao menos sua biotransformação, resultando em metabólitos altamente solú-veis em água e biologicamente menos rea-tivos (Cerniglia & Sutherland, 2001; da Sil-va et al., 2003; da Silva et al., 2004). A re-introdução de microrganismos autócto-nes isolados de áreas contaminadas após cultivo em laboratório tem demonstrado ser uma eficiente estratégia no processo de biorremediação (Korda et al., 1997). Baseado neste contexto, a degradação de HPAs por fungos filamentosos marinhos, pode ser considerada uma vantagem bio-lógica, visto que estes organismos estão adaptados às condições de salinidade des-te ecossistema.

Uma das principais características dos HPAs é a baixa solubilidade em água, o que dificulta o processo de biodegrada-ção. Neste sentido, a aplicação de biosur-factantes, compostos de origem microbia-na que contenham propriedades surfac-tantes, ou seja, que possuem a capacida-de de diminuir a tensão superficial pode ser considerado uma interessante alterna-tiva para o aumento da solubilidade dos compostos hidrofóbicos, resultando em uma maior degradação destes poluentes no ambiente impactado. Os tipos e as pro-priedades dos biosurfactantes são deter-minados pelas fontes de carbono utiliza-das pelos microrganismos na sua produ-ção, e conseqüentemente uma grande va-riedade é conhecida (Banat, 1995). São compostos de extrema importância em vá-rios setores industriais como o alimentício e farmacêutico, entretanto, seu maior mer-cado é a indústria petrolífera (Desai & Ba-nat, 1997).

Levando-se em consideração as con-

siderações acima citadas, o presente tra-balho teve como objetivo principal a avali-ação da degradação de HPAs e da produ-ção de biosurfactantes por nove fungos fila-mentosos isolados de invertebrados mari-nhos previamente selecionados pela capa-cidade de tolerância/descoloração do co-rante RBBR (da Silva et al., 2008). Em adi-ção, os fungos filamentosos foram carac-terizados taxonomicamente e depositados na Coleção Brasileira de Microrganismos de Ambiente e Indústria (CBMAI).

METODOLOGIA

Fungos filamentosos derivados de cnidários marinhos (Mussismilia hispida, Palythoa caribaeorum, Palythoa variabilis) previamente

selecionados pela descoloração/tolerância ao corante

RBBR (da Silva et al, 2008)

Avaliação da degradação dos hidrocarbonetos policíclicos aromáticos, (da Silva et al., 2004): caldo sabouraud

dextrose acrescidos de 2 mg de pireno e 1 mg de benzo[a]pireno. Avaliação por (GC-MS) da porcentagem dos HPAs consumida após 4 e 8 dias de cultivo

Avaliação da produção de biosurfactantes (Willumsen e Karlson, 1997): meio salino (0,6g MgSO4, 3,6g

Na2PO4, 1,2g Kh2PO4, 3% NaCl)acrescido de 1% de hexadecano como fonte de carbono (15 dias a 150 rpm)

Teste de emulsificação (Johnson et al.,1992): meio salino (0,6g MgSO4,

3,6g Na2PO4, 1,2g Kh2PO4, 3% NaCl) acrescido de

2,0 mL de óleo diesel e tolueno

Caracterização taxonômica dos fungos filamentosos derivados de ambiente

marinho por meio de análises morfológicas, seqüenciamento da região

ITS1-5,8S-ITS2 e análise filogenética (Sette et al., 2006)

Depósito dos fungos filamentosos na Coleção Brasileira de Microrganismos

de Ambiente e Indústria (CBMAI)

13

14

RESULTADOS E DISCUSSÕES Os nove fungos filamentosos isolados

de cnidários marinhos avaliados no pre-sente estudo quanto à produção de biosur-factantes e degradação dos HPAs de alto peso molecular (pireno e benzo[a]pireno) foram previamente selecionados por apre-sentarem tolerância/descoloração ao co-rante RBBR (Remazol Brilliant Blues R), como reportado por da Silva et a.l (2008). O uso de corantes poliméricos tem sido proposto como um método eficiente para a seleção de fungos que apresentam capa-cidade para degradar poluentes recalci-trantes, incluindo compostos aromáticos tais como os HPAs (Sato et al., 2003; Vitali et al., 2006). Neste contexto, o RBBR é considerado como o corante mais apro-

TABELA 2: IDENTIFICAÇÃO DOS FUNGOS DERIVADOS DE CNIDÁRIOS MARINHOS, DADOS DE AMOSTRAGEM, ISOLAMENTO E NÚMEROS DE ACESSO.

CBMAI GenBank Invertebrado Identificação Molecular IdentificaçãoMarinho Similaridade - BLAST Morfológica

847 FJ790879 M. hispida 97% Mucor racemosus CBS 111228 M. racemosus97% Mucor racemosus CBS 111229

97% Mucor fragilis IFO 644997% Mucor racemosus ATCC 1216B

849 FJ790880 P.variabilis 99% Aspergillus bridgeri NRRL 13000 A. sclerotiorum99% Aspergillus sclerotiorum NRRL 35054

99% Aspergillus persii NRRL 3566998% Aspergillus sulphureus NRRL 4077

850 P.variabilis NS Khuskia oryzae852 FJ790881 P.variabilis 99% Trichoderma sp. CBMAI 58 Trichoderma sp.

99% Trichoderma harzianum IMI 30405699%Trichoderma aureoviride IMI 112086

99% Trichoderma harzianum ATCC 20873853 FJ790883 Z. solanderi 99% Penicillium citrinum NRRL 35459 P. citrinun

99% Penicillium westlingii NRRL 80098% Penicillium sartoryi NRRL 783

854 FJ790882 M. hispida 100% Fusarium oxysporum CBS 129.24 F. oxysporum99% Fusarium oxysporum ATCC MYA-393199% Fusarium oxysporum ATCC MYA-3926

856 FJ790884 P. caribaeorum 99% Microsphaeropsis arundinis AMMRL 159.00 Microsphaeropsis sp.99%Paraconiothyrium cyclothyrioides CBS 972.9599% Paraconiothyrium estuarinum CBS 109850

96% Paraconiothyrium variabile CBS 119633857 FJ790885 P. caribaeorum 99% Cladosporium cladosporioides ATCC 6721 C. cladosporioides

99% Cladosporium cladosporioides MUCC21799% Cladosporium cladosporioides ATCC 34668

NS = não seqüenciado

TABELA 1: DEGRADAÇÃO DE HPAS E PRODUÇÃO DE BIOSURFACTANTES POR FUNGOS ISOLADOS DE INVERTEBRADOS MARINHOS

* P = Pireno (após 4 dias de cultivo) ; ** Bp = Benzo[a]pireno (após 8 dias de cultivo)***Tensão superficial expressa em mN/m, usando meio salino como controle (54.6mN/m).π Média - ≤ Desvio padrão

Linhagem CBMAI % degradação Tensão P* Bp** Superficial***

Aspergillus sclerotiorum 849 84,9 60,9 68.3π±3.7≤Microsphaeropsis sp. 856 43,2 29,3 51.5π±2.6≤Cladosporium cladosporioides 857 29,3 30,9 66.0π±7.1≤Mucor racemosus 847 26,2 44,3 57.1π±1.6≤Penicillium citrinum 853 21,5 12,9 58.1π±3.7≤Khuskia oryzae 850 20,4 14,5 72.7π±0.1≤Fusarium oxysporum 854 18,4 19,4 61.6π±0.7≤Trichoderma sp. 852 16,4 10,3 68.5π±2.7≤

15

Figura 1: Árvore filogenética baseada na análise ITS dos fungos derivados de cnidários marinhos (Kimura 2p e neighbor-joining e 1.000 bootstrap replicatas). Valores de boostrap

70 podem ser observados na árvore. Ordens: Eur (Eurotiales), Hyp (Hypocreales), Cap (Capnodiales), Ple (Pleosporales) e Muc (Mucoralles).

priado para a seleção de fungos degrada-dores de HPAs, visto que o mesmo é deri-vado do antraceno, um HPA de baixo peso molecular.

O fungo Aspergillus sclerotiorum CBMAI 849 apresentou o melhor resultado de degradação de pireno (84,9%) e benzo-[a]pireno (60,9%) após 4 e 8 dias de culti-vo, respectivamente (Tabela 1). Todos os outros fungos apresentaram menos de 50% de degradação dos HPAs nas condi-ções estudadas. Entretanto, resultados de degradação acima de 30% foram obtidos com o fungo Microsphaeropsis sp. CBMAI

856 para pireno; Mucor racemosus CBMAI 847 e Cladosporium cladosporioides CBMAI 857 para benzo[a]pireno (Tabela 1).

De acordo com a literatura fungos do gê-nero Aspergillus (Capotorti et al. 2004); Cla-dosporium (Potin et al., 2004a; Potin et al., 2004b); Mucor (Ravelet et al. 2000; Potin et al., 2004a) e Microsphaeropsis (Ravelet et al. 2000; Potin et al. 2004a) apresentam ca-pacidade de degradação de HPAs de alto peso molecular, tais como pireno e benzo-[a]pireno. Entretanto, os fungos utilizados no presente estudo foram capazes de de-gradar os HPAs após o crescimento em me-

io contendo 3% de salinidade (condição si-milar à encontrada no ambiente marinho), o que confere a estes microrganismos uma vantagem biológica na degradação destes compostos em ambiente salino. Em adição, não existem relatos na literatu-ra a respeito da degradação de pireno e benzo[a]pireno por fungos derivados de ambientes marinhos pertencentes aos gê-neros Aspergillus, Cladosporium, Mucor e Microsphaeropsis.

São poucos os estudos reportados em literatura sobre a relação da produção de biosurfactantes e a degradação de HPAs

CBMAI 849 (FJ790880)Aspergillus bridgeri NRRL 13000 (EF661404)Aspergillus persii NRRL 35669 (EF661399)

Aspergillus sclerotiorum NRRL 35024 (EF661401)

Aspergillus sulphureus

NRRL 4077 (EF661409)

CBMAI 853 (FJ790883)

Penicillium sartoryi

NRRL 783 (AF033421)

Penicillium westlingii

NRRL 800 (AF033423)

Penicillium citrinum

NRRL 35459 (EF634428)

Trichoderma harzianum (AJ224016)

Trichoderma aureoviride

IMI 112086 (AF194020 )

CBMAI 852

(FJ790881)

Trichoderma harzianum ATCC20873 (AF057575) CBMAI 854

(FJ790882) Fusarium oxysporum

ATCC MYA-3931 (FJ196767)

Fusarium oxysporum ATCC MYA-3926 (FJ196765) Fusarium oxysporum CBS 129.24 (DQ453704)

Cladosporium cladosporioides MUCC217 (EU301110)

Cladosporium cladosporioides

ATCC 34668 (AY463365 )

Cladosporium cladosporioides ATCC 6721 (AY625059)

CBMAI 857

(FJ790885)

Paraconiothyrium variabile

CBS 119633 (EU295649)

Paraconiothyrium cyclothyrioides CBS 972.95 (AY642529)

Paraconiothyrium estuarinum CBS 109850 (AY642530)

Microsphaeropsis arundinis

AMMRL 159.00 (EF094553) *

CBMAI 856

(FJ790884)

Mucor racemosus CBS 111228 (AY243945)

Mucor fragilis

IFO6449 (AF474242)

CBMAI 847

(FJ790879)Mucor racemosus CBS 111 229 (AY243946) Mucor racemosus ATCC1216B (AJ271061)

100

100

89

100

100

99

100

100

7277

100

8780

0.05

*Fungo mitospórico

Eu

rH

yp

Ca

pP

leM

uc

16

por fungos filamentosos. Arun et al. (2008) verificaram que o melhor resultado de de-gradação de HPAs pelo basidiomiceto Co-riolus versicolor correspondeu ao maior re-sultado de atividade biosurfactante. Entre-tanto, no presente estudo o fungo degra-dador de HPAs A. sclerotiorum não apre-sentou resultados satisfatórios de redução da tensão superficial. Os melhores resul-tados foram observados para os fungos Mi-crosphaeropsis sp. CBMAI 856; M. race-mosus CBMAI 847 e P. citrinum CBMAI 853, os quais apresentaram redução da tensão superficial abaixo dos valores utili-zados como controle (Tabela 1), contudo para ser considerando como biosurfactan-te o composto além da redução da tensão superficial deve possuir alta capacidade emulsificante. Os fungos Microsphaerop-sis sp. CBMAI 856; M. racemosus CBMAI 847 e P. citrinum CBMAI 853 não apresen-taram atividade emulsificante. Resultados similares foram reportados por Vasconcel-los (2006), onde bactérias derivadas de pe-tróleo biodegradadoras de hidrocarbone-tos não mostraram bons rendimentos quanto à produção de biosurfactantes, su-gerindo que a produção de determinados biosurfactantes poderia ser um mecanis-mo de sobrevivência, ou seja, a bactéria que não consegue degradar os substratos disponíveis produziria exopolímeros no in-tuito de torná-los mais acessíveis ao con-sumo. De fato, no meio ambiente os mi-crorganismos atuam em interdenpendên-cia metabólica, assim, enquanto alguns produzem biosurfactantes para tornar os substratos hidrofóbicos disponíveis, ou-tros podem atuar especificamente na de-gradação do substrato.

Os resultados derivados da caracteri-zação taxonômica e análise filogenética (Tabela 2, Figura 1) revelaram que os fun-gos derivados de cnidários marinhos, são em sua maioria, frequentemente encon-trados em ambiente terrestre e, portanto, foram classificados como marinhos facul-tativos. A identificação e caracterização ta-xonômica de microrganismos em estudos de compostos naturais bioativos é crítica, visto que na ausência de uma correta iden-tificação e preservação dos isolados as in-vestigações químicas tornam-se difíceis de serem realizadas e impossíveis de se-

rem reproduzidas (Bugni & Ireland, 2004). Em adição, o conhecimento da diversidade de fungos filamentosos derivados de ambi-ente marinho além de contribuir para com-preensão das relações destes microrganis-mos com seus hospedeiros é de extrema importância ambiental, pois pode evitar pro-blemas associados à utilização e liberação no ambiente de potenciais patógenos de plantas e animais (Sette et al., 2005).

Os resultados apresentados no presen-te estudo demonstram o potencial de utili-zação dos fungos filamentosos isolados de cnidários marinhos em biorremediação de ambientes contaminados com HPAs, prin-cipalmente em áreas marinhas, devido ao fato dos mesmos estarem adaptados às condições de salinidade destes ambientes. Entretanto, estudos posteriores devem ser conduzidos visando caracterização dos compostos formados a partir do metabolis-mo dos isolados frente à degradação dos HPAs, bem como, o conhecimento dos me-canismos que podem estar envolvidos no processo de produção de biosurfactantes, visto que, em alguns dos trabalhos reporta-dos na literatura os biosurfactantes foram capazes de estimular a biodegradação e em outros funcionaram como substâncias de inibição.

Os autores agradecem ao apoio finan-ceiro da Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de São Paulo (FAPESP) e ao Conselho Nacional de Desenvolvimento Ci-entífico e tecnológico (CNPq) pela bolsa de Doutorado concedida a Rafaella C. Bonu-gli-Santos.

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AGRADECIMENTOS

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18

OBTENÇÃO DE PIGMENTOS NATURAIS A PARTIR DO CULTIVO DE MONASCUS SP

Ciência in Foco

Débora Domenes Palmieri RodriguezNatura Inovação e Tecnologia de Produtos Ltda., Departamento de Tecnologia de Insumos - Biotecnologia

Rodovia Anhanguera, Km 30,5 Bloco A. 07750-000, Cajamar, São Paulo Brasil.

RESUMOOs pigmentos naturais produzidos pelo

fungo filamentoso Monascus sp são tradi-cionalmente utilizados nos países orienta-is asiáticos, principalmente no sul da Chi-na, Taiwan, Japão e Indonésia. Tem sido objeto de intensivas pesquisas nas últimas décadas devido ao seu potencial de apli-cação na coloração de vários alimentos. Atualmente esses pigmentos estão substi-tuindo os sais de nitrito, precursores da ni-trosamina. São tradicionalmente cultiva-dos em meio sólido, grãos de arroz ou pão (fermentação sólida). Porém, o controle de alguns parâmetros de cultivo, tais como transferência de oxigênio, concentração celular e umidade, é difícil neste tipo de cul-tivo. Por esse motivo, recentemente inicia-ram-se diversos estudos a respeito do cul-tivo de Monascus sp em meios de cultura líquidos (fermentação submersa). O gêne-ro Monascus é dividido em sete espécies denominadas M. ruber, M. pilosus, M. pur-pureus, M floridans, M. pallens, M. sangui-neus e M. mucoroides, sendo M. ruber, M. purpureus e M. pilosus as espécies de mai-

or importância para indústria alimentícia. Produz seis principais pigmentos: verme-lhos: rubropunctamina e monascorubra-mina, amarelos: monascina e ankaflavina e laranjas: rubropunctatina e monascoru-bina. Através de estudos de purificação e identificação foi isolado um composto de-nominado monascidina A, também conhe-cido como citrinina. Trata-se de uma mico-toxina de ação nefrotóxica que também é um poderoso antibiótico. O principal objeti-vo deste trabalho foi realizar uma revisão bibliográfica a respeito da obtenção de pig-mentos naturais a partir do cultivo do fungo filamentoso Monascus sp abordando os aspectos legais e mercadológicos quanto ao uso de pigmentos naturais no Brasil e no mundo, as vantagens e desvantagens da produção desses pigmentos, as carac-terísticas microscópicas e macroscópicas do gênero Monascus, as principais cepas produtoras de pigmentos, os principais ti-pos de pigmentos produzidos, os métodos de fermentação, produção de citrinina, con-dições de cultivo e os processos de extra-ção e purificação desses pigmentos. Com

base na pesquisa realizada, conclui-se que os estudos relacionados à produção de biopigmentos a partir do cultivo de Mo-nascus sp não retratam a viabilidade de produzi-los em escala industrial, já que são realizados em escala de bancada. Isso só será minimizado quando for possí-vel uma maior interação entre a universi-dade e o setor industrial.

Ao final do século XIX, o desenvolvi-mento da indústria alimentícia levou à pro-dução de diversos corantes sintéticos, os quais chegaram a totalizar o número de 700. Seguiu-se, então, a elaboração de le-is para o uso destes corantes, com o obje-tivo de proteger a saúde do consumidor. Desse modo, no início do século XX, uma lista de corantes permitidos foi divulgada nos Estados Unidos e atualmente, apenas cinco corantes sintéticos são permitidos. Nos últimos anos, a preocupação dos con-sumidores com a qualidade dos alimentos vem aumentando, e por isso há uma ten-dência cada vez maior de preferência por

1. INTRODUÇÃO

19

produtos naturais (Ribeiro, et al., 2004).A utilização de substâncias sintéticas,

derivadas de produtos petroquímicos, atin-ge diretamente a produção de corantes ali-mentares, fato este que preocupa quanto ao aspecto de alterações orgânicas que possam ser causadas pela ingestão des-tas substâncias ao longo do tempo (Hipler, et al., 2002). De vinte e nove corantes para alimentos aprovados pela União Européia, dezesseis são sintetizados quimicamente, e treze provêm de fontes naturais. É bem provável que o aumento das restrições quanto aos derivados petroquímicos ve-nha a eliminar alguns corantes que são atu-almente utilizados. Conseqüentemente, há necessidade de se encontrar fontes al-ternativas para corantes em alimentos, sendo a cultura microbiana uma ferramen-ta importante a ser explorada. Assim, os pigmentos microbianos, apresentam-se como uma alternativa viável aos outros pig-mentos naturais de origem animal ou vege-tal, porque, além de serem considerados naturais, não apresentam problemas de sazonalidade e possuem alta produtivida-de (Carvalho, 2004).

Entre os pigmentos passíveis de pro-dução por fermentação, destacam-se os pigmentos de Monascus sp, um fungo fila-mentoso que produz uma série de pigmen-tos de estrutura policetídica, com cores que variam entre tons de amarelo, laranja e vermelho. Como ocorre com diversos ou-tros fungos, as linhagens de Monascus pro-duzem também micotoxinas, contaminan-tes, cuja quantidade deve ser a mínima possível em um produto. No caso de Mo-nascus sp, a micotoxina produzida é a citri-nina, uma substância nefrotóxica que tam-bém apresenta atividade antibiótica (Pisa-reva, et al., 2005).

Os pigmentos de Monascus sp vêm sendo utilizados em alimentos tradiciona-is, em países orientais, há séculos. No en-tanto, a pesquisa sobre a produção e apli-cação industrial desses pigmentos é bem mais recente e ganhou força especialmen-te na última década, em conjunção com a produção de outros aditivos alimentares por fermentação. A produção tradicional desses pigmentos é feita por fermentação em arroz (fermentação sólida), sendo que a produção industrial normalmente utiliza

a fermentação em meios de cultivo líquidos (fermentação submersa) (Moritz, 2005).

Vale ressaltar que a maioria dos estu-dos apresentados atualmente, tanto no Bra-sil, quanto no Japão, Estados Unidos, Fran-ça e Alemanha são realizados com fermen-tação sólida, uma vez que neste tipo de fer-mentação a produção de pigmentos de Mo-nascus sp é ainda maior. Porém, alguns au-tores (Hajjaj, et al., 2000), afirmam que a produção de pigmentos de Monascus sp em cultivo submerso deve ser melhor ex-plorada, por acreditarem ser possível pro-duzir elevadas concentrações destes co-rantes neste tipo de processo, além de pos-sibilitar melhor controle dos parâmetros de cultivo quando comparado ao cultivo em substrato sólido. Estratégias para extrair o pigmento do interior das células fúngicas, descobertas de novos metabólitos bioati-vos e enzimas de interesse comercial, são atrativos que favorecem o investimento nes-ta área de conhecimento. Além disso, é sa-bido que moléculas tóxicas (citrinina) são produzidas concomitantemente com os pig-mentos de Monascus sp durante o cultivo em meio sólido ou líquido (submerso). Este fato é extremamente importante, uma vez que a utilização dos pigmentos de Monas-cus foi proibida em alguns países devido à presença de citrinina. Tal avaliação ainda é polêmica na atualidade, pois, segundo vá-rios autores, o potencial tóxico da citrinina é muito mais baixo que da nitrosamina utiliza-da em carnes curadas (Bakosova, 2001).

Embora o consumo de um determinado alimento devesse depender principalmente do seu valor nutricional, a sua cor, aroma e textura são fatores que conduzem à prefe-rência do consumidor. Dentre estes fatores, a cor é o mais importante fator de preferên-cia, já que a qualidade que mais facilmente desperta a atenção do consumidor e é con-seqüentemente o principal critério para identificação e julgamento da qualidade do produto (Ribeiro, et al., 2004).

Pigmentos sintéticos, tradicionalmente usados nos processamentos alimentícios, continuam sendo utilizados com sucesso, mas, por outro lado, está ocorrendo o au-mento da preferência do consumidor por aditivos alimentares naturais. Apesar da óti-

2. PIGMENTOS E CORANTES

ma oportunidade na utilização de pigmen-tos de origem biotecnológica, como o

-caroteno e a riboflavina, seu segmento é limitado. Isto se deve ao custo elevado de produção destes pigmentos extraídos de fontes naturais em relação aos pigmentos sintéticos (Bailly, et al., 2002).

Uma grande variedade de vegetais, plantas, animais e microrganismos produ-zem pigmentos. Sua forma de produção é variada e a tecnologia utilizada para sua produção, depende principalmente, do agente empregado neste processo (Ribei-ro, et. al., 2004).

Tanto os corantes naturais como os sin-téticos são, na maioria das vezes, isentos de qualquer valor nutricional. A maior des-vantagem dos corantes sintéticos se deve à crescente descoberta de efeitos desagra-dáveis como toxicidade, mutagênese e po-tencial carcinogênico (Bailly, et al., 2002).

Quase todos os pigmentos naturais pre-sentes nos alimentos possuem estruturas complexas com diferentes grupos funcio-nais nas moléculas. Os principais tipos de pigmentos naturais estão agrupados pelo tipo de estrutura básica em: porfirinas, beta-laínas, flavonóides (antocianinas - cores azul e vermelho, antoxantinas - cores nos tons amarelos, leucoantocianidinas - inco-lores), carotenóides, taninos e outros pig-mentos como quinonas - ácido carmínico, polifenóis, Monascus - Monascin, etc.) (Du-ran, et.al., 2002).

Inovações tecnológicas podem melho-rar a produção de pigmentos, melhorando microrganismos ou formando novas linha-gens que justifiquem a substituição dos pro-dutos sintéticos. Neste contexto, o desen-volvimento de novos sistemas fermentati-vos como cultura de células, de plantas ou microalgas, em níveis competitivos; ou ain-da técnicas de mutagênese que aumentem a produtividade destes metabólitos e/ou re-duzam sua toxicidade. Oportunidades adi-cionais para pigmentos derivados de fer-mentação existem em função da raridade do produto ou na dificuldade de síntese, co-mo por exemplo, o pigmento Monascus, as ficocianinas e as xantofilas, onde avanços tecnológicos sempre serão de grande con-tribuição (Duran, et al., 2002).

Embora os corantes sejam considera-dos essenciais à indústria alimentícia, po-

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dendo ser obtidos através de fontes natu-rais, este campo ainda é pouco explorado, em particular os produzidos por microrga-nismos. Os corantes vermelhos produzi-dos por culturas em meios sólidos (arroz, por exemplo) são os mais estudados na Ásia, por diversas espécies do gênero Mo-nascus; utilizados principalmente para co-lorir alimentos fermentados. Isso demons-tra que os países em desenvolvimento tam-bém podem investir neste campo de co-nhecimento, buscando competir neste mercado, principalmente o Brasil devido a sua imensa biodiversidade (Moritz, 2005).

Corantes são considerados essenciais na indústria de processamento de alimen-tos. A maioria dos corantes naturais é ex-traída de plantas ou de produtos de plan-tas ou são produzidos por microrganis-mos. Uma vez que o número de corantes sintéticos está diminuindo devido aos inde-sejáveis efeitos tóxicos incluindo mutage-nicidade e potencial carcinogênico, o foco no desenvolvimento de pigmentos para ali-mentos de fontes naturais está aumentan-do (Constant, et al., 2002).

A literatura é farta em apontar cuidados com a ingestão de corantes sintéticos, ape-sar do grande uso deles pelos produtores de alimentos e bebidas processadas. Esses corantes são pigmentos ou tintas sintéticas do grupo azóico, sendo a maior parte delas sintetizadas a partir do alca-trão do carvão mineral. Aproximadamente 20% da população é alérgica a esses co-rantes artificiais. A quantidade dos coran-tes sintéticos em produtos não é muito grande (em frações médias de 0,01%), mas preocupam os especialistas a fre-qüência do expressivo consumo diário nos mais variados alimentos e bebidas, desde balas, laticínios, sobremesas até refrige-rantes e sucos (Constant, et al., 2002; Du-fossé, 2006).

As pesquisas nessa área, além de aler-tar sobre os limites de tolerância dos co-rantes permitidos, já fizeram vários sintéti-cos serem proibidos pela maior parte dos países. A publicação de estudos do Codex Alimentarius, já fundamentou a eliminação de alguns corantes por ministérios da saú-

2.1 CORANTES NATURAIS X CORAN-TES SINTÉTICOS

de de todo o mundo, inclusive o brasileiro. Os Estados Unidos, onde apenas cinco sin-téticos são permitidos, e o Japão já alerta-ram suas indústrias de que pretendem ba-ni-los na próxima década. A Austrália e os países escandinavos também possuem le-is restritivas aos corantes sintéticos e o mesmo deve ocorrer nos demais países europeus, que já dão preferência a produ-tos naturais (Constant, et al., 2002).

A legislação brasileira, atualizada com boa parte das leis internacionais e seguin-do as recomendações multilaterais da FAO (Food and Agriculture Organization), permite apenas oito sintéticos e mais cinco sintéticos idênticos aos naturais (betaca-roteno, beta-apo 8' carotenal, éster etílico do ácido beta-apo 8 carotenóico, riboflavi-na e xantofila). A permissão é condiciona-da à indicação nos rótulos sobre a sua con-dição sintética e sobre a ingestão diária aceitável (Anvisa, 2008).

Como resposta aos riscos e má fama dos sintéticos, os corantes naturais vêm ganhando espaço. Trata-se de uma con-quista gradual, não maior por causa das vantagens competitivas dos sintéticos. Além da estabilidade bastante superior aos naturais, esses corantes artificiais pos-suem maior capacidade tintorial, traduzida por um poder de melhor fixação nos ali-mentos, com cores mais intensas e menor custo, tanto por necessitar de dosagens menores como por seu preço direto infe-rior (Sato et. al., 1992).

Os desenvolvimentos de novos coran-tes englobam as principais famílias cromá-ticas dos corantes naturais: amarelo (cur-cumina, luteína, carotena); a laranja (uru-cum e páprica); vermelho (carmim, licope-na, betanina e antociana) e verde (clorofi-la). Mas, de forma específica, prevalece-ram nos cinco corantes naturais conside-rados de maior importância no mercado mundial: o urucum, a páprica, a cúrcuma, as antocianinas e o carmim de cochonilha. Destacam-se ainda os esforços para tor-nar os corantes solúveis em água. Isso é possível com o encapsulamento dos co-rantes em bases de amido, gomas e gelati-nas, tornando-os uma emulsão. Isso am-plia o uso para outros produtos, tendo em vista que a maior parte deles, sobretudo os carotenóides e antraquinonas, são ape-

nas lipossolúveis (Constant, et. al., 2002).A notoriedade que os corantes naturais

vêm assumindo deve-se não só à tendência mundial de consumo de produtos naturais, mas também às propriedades funcionais atribuídas a alguns desses pigmentos. O apelo mercadológico estimula cada vez ma-is o desenvolvimento de novos estudos com o intuito de superar as limitações tecnológi-cas existentes (Constant, et. al., 2002).

Os corantes naturais obtidos através de diversos processos, além de serem reco-nhecidos com o rótulo "naturais", apresen-tam outras vantagens, como:

• São encontrados em vegetais, frutas, raízes e sementes. Estima-se que somente 0,5% das plantas terrestres são exploradas quanto ao uso de seus corantes. Portanto, a exploração de pigmentos naturais pode crescer muito, embora novas moléculas de-vam passar por todas as etapas do Food and Drug Administration (FDA) antes do uso regulamentar, demandando elevados in-vestimentos (Moritz, 2005).

• Na formulação do pigmento natural in-dustrializado, são utilizadas moléculas que conferem maior solubilidade, estabilidade, poder de emulsificação. Estes são fatores importantes que favorecem sua substitui-ção em detrimento dos pigmentos sintéticos (Kilikian, 2002).

Como principais desvantagens para a obtenção dos corantes naturais, citam-se:

• Estas moléculas possuem baixa solu-bilidade em água. Porém, podem facilmente reagir com compostos aminados do meio de cultura e formar complexos solúveis em água (Moritz, 2005).

• A cinética do cultivo submerso para ob-tenção dos corantes naturais tem sido pou-co descrita na literatura refletindo em pouco conhecimento dos parâmetros cinéticos e, conseqüentemente, um aumento na escala de reatores mais eficazes para produção desses pigmentos (Pereira, et. al., 2003).

• Formação conjunta de metabólitos in-desejáveis (por exemplo, citrinina), deman-dando a necessidade de realização de tes-tes de seguranças, que são caros e longos, antes do emprego desses produtos como aditivos alimentares (situação nos países

2.2 VANTAGENS E DESVANTAGENS DA PRODUÇÃO DE CORANTES NATURAIS

20

desenvolvidos) (Moritz, 2005).• A maioria dos pigmentos obtidos por

processos biotecnológicos, não são ex-cretados pelas células, mas sim, armaze-nados em seu interior, aumentando com is-so, os gastos com processos de extração e purificação dos corantes intracelulares (Kilikian, 2002).

Embora o custo de produção dos co-rantes naturais seja mais elevado em rela-ção aos sintéticos, o interesse por esses produtos está crescendo no Brasil e no mundo. Segundo a "Biotropical" empresa de corantes naturais, localizada no Belém do Pará, citado por Maimom (2000), o mer-cado internacional de corantes naturais movimenta cerca de US$ 5 bilhões. Em ter-mos da distribuição geográfica, estimou-se que esta apenas acompanha o merca-do de alimentos, aumentando-se a partici-pação do Japão, pelo fato desse país re-gistrar um consumo privilegiado de coran-tes naturais. Sendo assim, pesquisadores nacionais citaram, em seu último relatório, a seguinte participação no mercado: EUA (30%), Japão e Ásia (30%), resto do mun-do (10%) (Maimom, 2000).

No Brasil, a legislação de alimentos e cosméticos está a cargo do Ministério da Saúde, sendo que as normas brasileiras de corantes e aditivos são baseadas nas normas americanas especificadas pelo FDA (Food and Drug Administration) (Car-valho, 2004).

De acordo com a Portaria SVS/MS 540/97, considera-se corante a substância ou a mistura de substâncias que possuem a propriedade de conferir ou intensificar a coloração de alimentos e bebidas.

Pela Resolução - CNPA n° 44, de 1977, os corantes são classificados em:

a) Corante Orgânico Natural: é aque-le obtido a partir de um vegetal ou, eventu-almente, de um animal, cujo princípio te-nha sido isolado com o emprego de pro-cessos tecnológicos adequados.

b) Corante Orgânico Sintético: é aquele obtido por síntese orgânica, medi-ante emprego de processos tecnológicos adequados, e não encontrado em produ-tos naturais.

2.3 LEGISLAÇÃO NACIONAL E INTER-NACIONAL DE CORANTES

c) Corante Artificial: é o corante orgâ-nico sintético não encontrado em produtos naturais;

d) Corante Orgânico Sintético Idên-tico ao Natural: é o corante elaborado sin-teticamente, cuja estrutura química é se-melhante a do princípio isolado do corante orgânico natural.

e) Corante Inorgânico: é aquele obti-do a partir de substâncias minerais e sub-metido a processos de elaboração e purifi-cação adequados a seu emprego em ali-mentos.

f) Corante Caramelo: é aquele obtido através do aquecimento controlado do açú-car invertido ou de outros carboidratos na presença de compostos de amônia e de sulfitos.

g) Corante Caramelo (processo amô-nia): é o corante orgânico sintético idênti-co ao natural obtido pelo processo amô-nia, desde que o teor de 4-metil, imidazol não exceda no mesmo a 200mg. kg-π.

Pela legislação atual através das reso-luções n.º. 382 e 388 da ANVISA, no Brasil é permitido o uso de apenas oito corantes artificiais: amarelo crepúsculo, tartrazina, azul brilhante, indigotina, Bordeaux S (amaranto), eritrosina, ponceau 4R e ver-melho 40.

Facilmente encontrado em diversos ecossistemas, fungos do gênero Monas-cus são usados tradicionalmente em paí-ses orientais, originalmente na China e na Tailândia. Enquanto alguns metabólitos do Monascus sp são importantes devido à for-te coloração, outros possuem atividade hi-pocolesterêmica e antimicrobiana, e vêm sendo estudados com mais intensidade na última década (Carvalho, 2004). São culti-vados tradicionalmente em meio sólido, grão de arroz ou pão. Porém, o controle de alguns parâmetros de cultivo tais como transferência de oxigênio, concentração celular e umidade, é difícil neste tipo de cul-tivo. Já em cultivo submerso em meio com-plexo ou sintético, os estudos começaram a ser desenvolvidos recentemente (Oroz-co, et al. 2008).

3. GÊNERO MONASCUS

3.1 OCORRÊNCIA DO MICRORGANIS-MO

O gênero Monascus é dividido em sete espécies denominadas M. ruber, M. pilo-sus, M. purpureus, M. floridans, M. pallens e M. sanguineus e M. mucoroides. Porém, as espécies de maior importância para a in-dústria alimentícia são: M. ruber, M. purpu-reus e M. pilosus (Wang, 2005).

Recentemente, pesquisadores estu-dando fungos termorresistentes, descobri-ram que o fungo Monascus ruber também faz parte deste grupo, tendo sido isolado após processamento térmico de conser-vantes de azeitonas verdes (Panagou, et al., 2003).

Há formação de colônias de 20 a 30 mm de diâmetro em PDA, após 7 dias. As colô-nias são planas, eventualmente com pe-queno desenvolvimento aéreo, esparsas, com textura superficial floculenta, micélio inicialmente branco (1 a 2 dias), passando para laranja, a vermelho pardo à medida que a cultura se desenvolve, com a forma-ção de cleistotécios (Figura 1). Geralmente há formação de pigmentos solúveis que se difundem no ágar. Os cleistotécios são esfé-ricos, de 30 a 60 m de diâmetro, formados como um nó de hifas a partir de um "pedún-culo" bem definido, com paredes celulares tornando-se marrons com a maturação; as-cósporos, elipsóides, hialinos, 5-7 x 4-4,5 m, parede celular lisa. As colônias de M. ruber são de crescimento mais rápido que as outras espécies (Carvalho, 2004).

A escolha dos nutrientes adequados à geração do produto de interesse está rela-cionada à atividade metabólica desenvolvi-da pelos microrganismos. Destaca-se a im-portância das informações obtidas sobre as exigências nutricionais dos organismos en-volvidos no processo (Moritz, 2005).

Assim, é preciso suplementar o meio de cultivo ou controlar os componentes que possam inibir o seu desenvolvimento, de modo a permitir uma rápida e eficiente con-versão da fonte de carbono em produto (Carvalho, 2004).

Os pigmentos produzidos por Monas-cus são tradicionalmente produzidos por

3.2 MORFOLOGIA

3.3 FATORES QUE INFLUENCIAM O CRESCIMENTO E A PRODUÇÃO DE METABÓLITOS

µ

µ

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processos biotecnológicos em estado sóli-do ou pedaços de pão ou arroz. Estudos envolvendo cultivos submersos têm au-mentado recentemente (Hajjaj et al., 2000). Os principais fatores que influenci-am o crescimento e produção de pigmen-tos são: composição do meio de cultivo, temperatura, presença de oxigênio e aera-ção, pH, fonte de nitrogênio e umidade (Carvalho, 2004).

Temperatura: A faixa de temperatura ótima é, em média, de 28-32°C, de acordo com os registros de cada espécie em ban-cos de cepas, embora essa temperatura varie dependendo da linhagem entre 25°C e 37° C (Rasheva et al., 1997).

Presença de oxigênio: Os fungos do gênero Monascus são incapazes de cres-cimento estritamente anaeróbio usando gli-cose como substrato, mas podem crescer em condições de limitação de oxigênio. Nessas condições, aumenta a produção de etanol e de CO , mas há menor produ-≤ção de pigmento; em condição de maior ae-ração, a produção de etanol diminui en-quanto a de pigmento aumenta. Obser-vou-se ainda que um aumento na pressão parcial do CO aumenta a produção de pig-≤mento (Rasheva et al., 1997).

pH inicial: Em diferentes trabalhos ob-servou-se crescimento em uma ampla fai-xa de pH, desde 2,5 até 8,0, sendo a faixa ideal de 4,0 a 7,0 (Yongsmith et al., 1993).

pH durante o crescimento: A mudan-ça de pH durante o crescimento depende das fontes de nitrogênio, em primeiro lu-gar, e em segundo das fontes de carbono. Independentemente do pH inicial, o pH fi-

Figura 1: Cultura de Monascus em PDA, após 7 dias de incubação a 32°C. Nota-se o halo de difusão de pigmentos e a cor característica do micélio.

nal tende a ser o mesmo na faixa de 7 a 8. (Yongsmith, et al., 1993).

Teor de umidade em meios sólidos: O processo tradicional de produção de ang-kak é o mesmo usado para outras varieda-des de koji (arroz fermentado com diferen-tes espécies de fungos, geralmente Asper-gillus), daí o nome alternativo "koji verme-lho". A umidade exigida na fermentação de arroz varia dependendo da descrição tradi-cional, mas recomenda-se que a umidade seja suficiente para garantir o crescimento do micélio pelo grão sem a desintegração dos grãos (faixa de 56% com pH 6) (Yong-smith, et al., 1993).

Composição do meio de cultivo:Fontes de carbono: diversas fontes de

carbono vêm sendo usadas como substra-to para o crescimento de Monascus sp, sen-do as mais comuns a glicose, a sacarose e o amido. O melhor crescimento geralmente é observado com glicose. A produção volu-métrica de pigmento em meio submerso é melhor com amido e dextrina, enquanto a produção específica é melhor com maltose e quase tão boa quanto com glicose, mas essa comparação entre açúcares deve ser feita verificando-se cuidadosamente as con-centrações. Uma boa fonte alternativa de carbono é o etanol, que é produzido natu-ralmente pelo fungo em condições de limi-tação de oxigênio ou excesso de glicose (Yongsmith, et al., 1993).

Fontes de nitrogênio: as fontes de ni-trogênio usadas para o crescimento de Mo-nascus sp vão desde nitrogênio inorgânico (amônia e nitratos) até peptonas. Na produ-ção tradicional de angkak, não há necessi-

dade de adição de fonte de nitrogênio, já que o arroz possui de 5 a 8% de proteínas, (base seca). Ao usar outros substratos, a adição de uma fonte de nitrogênio (especialmente nitrogênio orgânico) estimula a produção de pigmentos (Carvalho, et al., 2004).

Outros Fatores Nutricionais: diversos outros fatores podem afetar o crescimento do fungo e a produção de pigmentos. Altas concentrações de fosfato e de sulfato de magnésio são inibidoras da produção de pig-mentos; por outro lado, o crescimento é uma função linear e crescente da concentração de MgSO4, na faixa de 0,5-16mM. A adição de óleo de milho estimula (dobra) a produ-ção de pigmento, enquanto a adição de 0,4% de tween 80 não afeta o consumo de glicose nem retarda a taxa de crescimento, mas aumenta a produtividade de pigmento (Yongsmith, et al., 1993).

Diversos trabalhos foram já realizados com relação ao estudo da toxicidade de pig-mentos Monascus, que aparentemente são inócuos nas quantidades testadas. O longo tempo pelo qual os pigmentos Monascus já vêm sendo usados depõem a favor da sua to-xicidade baixa ou inexistente. Por algum tem-po, desde que os fungos do gênero Monas-cus começaram a ser estudados sistemati-camente, acreditou-se que os pigmentos produzidos apresentavam também proprie-dades antibióticas; mais tarde, verificou-se que essa atividade deve-se principalmente a outra substância, chamada monascidina A (Wang, et al., 2005).

Estudos posteriores mostraram que es-sa substância é na verdade a citrinina, uma micotoxina de ação nefrotóxica e hepatotó-xica produzida por diversos fungos e que nem todas as cepas de Monascus sp a pro-duz. A síntese de citrinina é dependente da cepa de Monascus sp, tipo de fonte de car-bono (extrato de levedura e arroz estimulam a síntese de citrinina e o glutamato monos-sódico e etanol a inibem) e fatores ambien-tais (oxigênio e temperatura) (Wang, et al., 2005). Embora a baixa concentração de oxi-gênio dissolvido iniba fortemente a síntese de citrinina, também reduz a produção de pigmentos vermelhos (Hajjaj, et al., 2000). Não existem dados reportados que compro-

3.4 TOXICIDADE E PRODUÇÃO DE ME-TABÓLITOS

23

dade inicial no substrato (em torno de 25%), reduzindo o risco de contaminação e de aglomeração do substrato (Hajjaj, et al., 2000).

O cultivo de Monascus sp tem sido rea-lizado principalmente em meio sólido, en-tretanto o rendimento de produção é muito baixo para a produção em escala industri-al. Para aumentar o rendimento de pig-mentos, alguns pesquisadores têm focado em culturas submersas (Hajjaj, et al., 2000). Existem artigos abrangendo muta-ção de cepas, mudanças na composição dos nutrientes e mudanças nas condições físicas de cultivo. Técnicas de cultivos en-volvendo fed-batch, imobilização por resi-nas poliméricas e cultivos semi-sólidos usando sacos de plásticos (Lotong) tam-bém foram desenvolvidas (Moritz, 2005).

A utilização de técnicas de cultivo sub-mersas, para a produção de pigmentos de Monascus sp tem sido estudada para mini-mizar os problemas de espaço, escala e controle de processos (Moritz, 2005).

Os corantes produzidos por fermenta-ção industrial estão ainda limitados à pro-dução de -caroteno por algas. Porém existem muitas outras formas de produção de corantes, com grande potencial de mer-cado (Moritz, 2005).

Em um processo fermentativo tradicio-nal (Figura 3), como ocorre nos países do oriente, o pigmento formado pelo Monas-cus sp é adicionado ao mosto de arroz. Após um período de 2 a 4 semanas, o pro-duto é seco e armazenado na forma de grão ou pó (Moritz, 2005).

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vem a influência do pH na produção de ci-trinina (Orozco, et al., 2008).

A citrinina possui caráter fortemente ácido, sendo praticamente insolúvel em água, porém, solúvel em álcool aquecido, dioxano e outros solventes não polares. Estudos em sistemas in vivo e in vitro indi-cam que a citrinina tem uma ação biológi-ca na inibição da síntese do colesterol e tri-glicérides, essa inibição possivelmente vem sendo causada pelo dano ao sistema de transporte e/ou interferências no meta-bolismo energético (Carvalho, et al., 2005).

Fink-Gremmels et al., 1991 e Carvalho, et al., 2005, mediram a atividade antibac-teriana dos pigmentos Monascus depois de empregados em alimentos e o resulta-do foi uma ação inibitória contra Listeria monocytogenes, Salmonella, Escherichia coli, Bacillus subtilis, Enterococcus faeca-lis e Staphylococcus aureus.

Embora não haja uma conclusão defi-nitiva sobre a toxicidade dos pigmentos e da produção de citrinina em processos in-dustriais, diversas ações podem ser toma-das para evitar ou minorar a produção de toxinas: o uso de cepas que não produzam citrinina; o controle da fonte de nitrogênio (fontes de nitrogênio orgânico favorecem a produção de pigmentos vermelhos e des-favorecem a produção de citrinina); o con-trole das condições de cultivo (aeração, pH, fermentação sólida ou submersa); a transformação de pigmentos laranja em complexos vermelhos, atóxicos, usando aminoácidos e a extração em condições de baixa solubilidade de citrinina, o que po-de ser feito controlando-se o pH, já que a ci-

trinina apresenta caráter fortemente ácido (Orozco, et al., 2008).

Também foi isolada em várias cepas de Monascus sp uma substância chamada mevinolina, também conhecida como lo-vastatina, monacolina ou mecavor. Essa substância é um potente competitivo da en-zima HMG-CoA (3-hidroxi-3-metilglutaril-coenzima A) que limita a biossíntese do colesterol. Ela é efetiva na hipercolestero-lemia, sendo usada como produto medici-nal. Foi primeiramente isolada de Asper-gillus terreus (Pattanagul, et al., 2008).

O cultivo tradicional de fungos do gêne-ro Monascus para produção de pigmentos é feito em suporte de arroz, obtendo assim altas concentrações destes metabólitos se-cundários. Uma das condições para o su-cesso do cultivo é a utilização de baixa umi-

4. PRODUÇÃO DE PIGMENTOS Monas-

cus - VIA BIOTECNOLÓGICA

Citrinina Mevinolina

Figura 2: Estrutura química dos principais metabólitos produzidos pelo gênero Monascus.

Figura 3: Esquema ilustrativo do processo de produção industrial do pigmento Monascus.

5. CARACTERÍSTICAS DO PIGMENTO DE Monascus sp

Pigmentos de Monascus formam um grupo de metabólitos secundários chama-dos azafilonas, produzindo seis tipos de pigmentos, divididos em três grupos:

1. Pigmento laranja: rubropunctatina (C 2 1 H 2 3 NO 4 ) e monascu rub r i na (C23H26NO4);

2. Pigmento vermelho: rubropuncta-mina (C21H23NO4) e monascurubramina (C23H27NO4);

3. Pigmento amarelo: monascina (C21H26O5) e ankaflavina (C23H30O5) que são formas reduzidas dos dois pigmentos laranja (Figura 5) (Babitha, et al., 2007).

Embora por muito tempo se tenha reco-nhecido que há seis pigmentos, na última década foram descobertos alguns novos, como a xantomonascina e o amarelo II, possivelmente derivados da rubropuncta-tina. Recentemente duas novas estrutu-ras, chamadas monascopiridinas A e B, análogos hidrogenados dos pigmentos vermelhos, foram descritas. Esses com-postos apresentam máximos de absorção em UV a 306nm, e a sua contribuição na coloração de Monascus sp ainda não foi in-vestigada. Segundo alguns autores, há mais de dez pigmentos, embora nem to-dos de estrutura conhecida (Hamano, et al., 2006).

6. EXTRAÇÃO E PURIFICAÇÃO DO PI-GMENTO Monascus

Alguns pigmentos produzidos por Mo-nascus sp são intracelulares e insolúveis em água, mas as condições de cultivo (es-pecialmente relacionadas com fonte de ni-trogênio e pH) podem resultar na forma-ção de pigmentos extracelulares e hidros-solúveis (Hamano, et al., 2006).

Os mecanismos de biossíntese desses pigmentos são pouco conhecidos. No en-tanto, a conversão de pigmentos intracelu-lares e insolúveis em pigmentos extracelu-lares e hidrossolúveis, pode ocorrer atra-vés do processo de cultivo que resulta na alta solubilização e aumento da recupera-ção do produto no processo de downstre-am (purificação). Uma alta produção tam-bém pode ser obtida pela extração de pig-mentos intracelulares utilizando métodos de ruptura celular. Essas técnicas podem ser classificadas como química, física, en-zimática ou mecânica. Apesar de existirem muitos exemplos de ruptura celular por mé-todos enzimáticos e químicos, os métodos mecânicos são os mais empregados pelas indústrias. A utilização simultânea de dois ou mais de métodos também estão em fo-co devido à sua ação sinérgica. A escolha do método de ruptura celular a ser utiliza-do depende das características do micror-ganismo (ex. composição da parede celu-

lar), do produto a ser recuperado, seu ren-dimento, especificidade, e capital investi-do. (Pessoa Jr., et al., 2005).

Os fungos filamentosos, como o Mo-nascus sp, possuem uma parede celular resistente constituída basicamente de glu-cana e quitina, o qual necessita de alta ten-são de cisalhamento para ser lisada. Co-mo conseqüência dessas características, é necessário fazer um pré-tratamento quí-mico com solvente orgânico (normalmente utiliza-se etanol 60%, 70%, 90% ou 95%) e um tratamento mecânico (sonificação) pa-ra extrair seus pigmentos (Hamano, et al., 2006).

O uso de corantes naturais na indústria alimentícia vem aumentando significante-mente, seja como alternativa às restrições legais de uso dos corantes sintéticos, seja por exigência do consumidor por produtos mais naturais. Nesse contexto, os pigmen-tos microbianos são uma alternativa pro-missora em relação a outros aditivos ex-traídos de animais ou vegetais, porque eles são considerados naturais, não apre-sentam problema de sazonalidade e mos-tram grande produtividade. Dentre os pig-mentos produzidos por processos biotec-nológicos, um dos mais importantes são os pigmentos de Monascus, que são utili-zados por séculos como corantes de ali-mentos em países orientais, e que apre-sentam potencial para uso em carnes, be-bidas, sopas e molhos. O Monascus sp é um fungo filamentoso e produz seis pig-mentos principais, entre os quais o verme-lho é apontado como o mais importante, devido à sua aplicabilidade em diversos ali-mentos. Esses pigmentos podem ser in-tracelulares e insolúveis ou extracelulares e hidrossolúveis, dependendo das condi-ções de cultivo (principalmente a fonte de nitrogênio). Os pigmentos intracelulares necessitam de métodos de ruptura celular para se extrair o pigmento de interesse, sendo o mecânico o mais utilizado pela in-dústria.

Existem inúmeros estudos sobre a produção dos pigmentos de Monascus, nos quais pesquisadores buscam alterna-tivas de substratos, visando menor custo e maior produtividade, isolamento de cepas

7. CONCLUSÃOFigura 4: Estruturas dos principais pigmentos formados pelo gênero Monascus. Fonte: HAJJAJ et al., 2000.

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não produtoras de citrinina, otimização do processo de cultivo através da suplemen-tação dos meios e alterações dos parâme-tros de cultivo. Todavia, todos esses estu-dos são realizados em escala de bancada e não retratam a viabilidade de se produzir esses pigmentos em escala industrial o que, de certa forma limita a sua comerciali-zação. É necessário que haja uma maior in-teração entre a academia e as indústrias, pois, somente dessa forma, será possível produzi-los em larga escala e isso vale pa-ra uma infinidade de biomoléculas. Exis-tem muitos trabalhos produzidos pelas uni-versidades que, poderiam contribuir para o desenvolvimento da sociedade, se colo-cados em prática, mas, no Brasil, apesar da evidente evolução nesse aspecto, ain-da existe um grande desafio a ser vencido.

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Corresponding author:

mais versátil entre os antimicrobianos, fru-to da grande diversidade em termos de pro-priedades químicas e de espectro de ação. Existem quatro subclasses de

-lactâmicos: (I) as penicilinas e seus deri-vados semi-sintéticos, como a penicilina G, amoxicilina, ampicilina e ticarcilina; (II) as cefamicinas e cefalosporinas de 1ª, 2ª, 3ª e 4ª gerações, constituindo o maior nú-mero de representantes; (III) monobactâ-micos, como, o aztreonam; e (IV) os carba-penêmicos, como o imipenem, o merope-nem e o ertapenem (2).

Ainda que os mecanismos de imper-meabilidade e de alteração de sítio de ação, acima citados, contribuam para a re-sistência bacteriana aos -lactâmicos, as

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-lactamases, enzimas capazes de clivar o sítio de ação destes agentes, represen-tam a maior ameaça à utilização terapêuti-ca desta classe de antimicrobianos (3;4). Entre os fatores que contribuíram para o sucesso das -lactamases, destacam-se: a crescente diversidade tanto em termos de estrutura, como de espectro de ativida-de; e a plasticidade das estruturas genéti-cas que abrigam os genes que as codifi-cam. Estes genes comumente estão loca-lizados em elementos genéticos móveis, capazes de conferir resistência a bactérias antes sensíveis através da troca de mate-rial genético, inclusive entre bactérias de gêneros distintos (2;5).

Diferentes tipos de -lactamases já fo-

NOVOS PADRÕES DE RESISTÊNCIA: COMO INCORPORAR A DETECÇÃO NO LABORATÓRIO

Ciência in Foco

1. Renata C. Picãoπ2. Danilo E. Xavierπ

3. Ana C. Galesπ* π Laboratório ALERTA, Disciplina de Infectologia,

Universidade Federal de São Paulo, São Paulo, Brazil;

21 3

As bactérias, procariotos que existem há milhões de anos na superfície terrestre, são seres extremamente adaptáveis e que, portanto, respondem facilmente às mudanças do ambiente. A esta capacida-de de adaptação podemos atribuir tam-bém o desenvolvimento de resistência os antimicrobianos. Embora existam diver-sas classes de antimicrobianos, as estra-tégias utilizadas pelas bactérias para dri-blar a ação destas drogas são limitadas, envolvendo três principais mecanismos de resistência: redução da acumulação intra-celular destas drogas, modificação do sítio de ação e alteração enzimática dos antimi-crobianos (1).

Os -lactâmicos constituem a classe â

Ana Cristina Gales.Rua Pedro de Toledo, 781São Paulo, SP - 04039-032 - BrazilPhone/Fax: + 55-11-5084-6538Email: ana.gales@gmail.com

tante no cenário da resistência bacteriana (3). Assim, em meados dos anos 80 as cefa-losporinas de amplo espectro passaram a ser amplamente utilizadas, favorecendo a seleção de bactérias produtoras de -lacta-mases de espectro ampliado, conhecidas como ESBL (6). O surgimento dessas no-vas enzimas, que apresentam atividade hi-drolítica sobre as oximino cefalosporinas, fez com que as opções terapêuticas entre os agentes -lactâmicos para o tratamento de infecções causadas por bactérias produ-toras de ESBL ficassem limitadas aos agen-tes carbapenêmicos. Já na década de 90, o surgimento de bactérias produtoras de car-bapenemases passou a ser observado, pro-vavelmente como resposta à maior utiliza-ção dos carbapenens na prática clínica (7).

Sempre que um novo mecanismo de re-sistência é descrito, é importante questio-

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nar qual é o impacto clínico que este cau-saria e quais metodologias poderiam ser implantadas para sua detecção nos labo-ratórios clínicos de microbiologia. Infeliz-mente, sempre temos mais perguntas que respostas, e não raramente, só a realiza-ção de estudos clínicos é capaz de res-ponder estes questionamentos. Por outro lado, a detecção dos mecanismos de re-sistência pelo laboratório clínico de micro-biologia ainda constitui uma ferramenta va-liosa para os serviços de controle de infec-ção hospitalar.

Alguns podem se perguntar qual a per-tinência de realizar a detecção de meca-nismos de resistência, uma vez que o anti-biograma comum permite classificar as bactérias como sensíveis ou resistentes aos antimicrobianos. É verdade que mui-tas vezes a detecção do mecanismo de re-

ram descritos e inúmeras tentativas de es-tabelecer um sistema de classificação para essas enzimas foram propostas ao longo dos anos. Atualmente, duas classificações têm sido consideradas como de maior im-portância: a de AMBLER, com base na es-trutura molecular das -lactamases, e a de BUSH-JACOBY-MEDEIROS que correla-ciona o substrato preferencial e proprieda-des inibitórias à estrutura molecular da enzi-ma, como ilustrado na Tabela 1 (4).

Na tentativa de resumir a cronologia da evolução das -lactamases, podemos di-zer que a introdução da penicilina em larga escala durante e após a segunda guerra mundial foi rapidamente acompanhada pe-lo surgimento de bactérias produtoras de penicilinases. A descrição dessas -lacta-mases entre bactérias antes sensíveis às penicilinas representou um marco impor-

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TABELA 1: CARACTERÍSTICAS FUNCIONAIS E MOLECULARES DOS PRINCIPAIS GRUPOS DE â-LACTAMASES.

Classificação de BUSH-JACOBY- Classificação de Características funcionais MEDEIROS, 1995 AMBLER, 1989Grupo Funcional Subgrupos Classe Molecular

1 C Enzimas cromossômicas e plasmidiais dos Gram-negativos.Isoladamente conferem resistência a todos os â-lactâmicos, excetocarbapenens. Não são inibidas pelo ácido clavulânico.

2 A, D Grande maioria das enzimas é inibida por ácido clavulânico2ª A Penicilinases produzidas por Staphylococcus spp. e Enterococcus

spp. Conferem altos níveis de resistência às penicilinas2b A â-lactamases de espectro reduzido de bactérias Gram-negativas.

Inclui TEM-1 e SHV-1.2be A â-lactamases de espectro ampliado conferem

resistência às cefalosporinas de amplo espectro e monobactâmicos

2br A â-lactamases derivadas da TEM resistentes ao inibidor de â-lactamases (IRT)2c A Enzimas que hidrolisam a carbenicilina2d D Enzimas que hidrolisam a cloxacilina (oxacilina); pouco inibidas pelo

ácido clavulânico2e A Cefalosporinases inibidas pelo ácido clavulânico2f A Enzimas que hidrolisam carbapenens com sítio ativo serina,

inibidas pelo ácido clavulânico3 3a, 3b, 3c B Metalo-â-lactamases que conferem resistência aos carbapenens e

todos os outros â-lactâmicos com exceção dos monobactâmicos. Não são inibidas por ácido clavulânico

4 ND Enzimas não seqüenciadas que não se encaixam em outros gruposAbreviatura: N.D., não determinada (Adaptado do artigo de Bush, 2001).

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tência à cefepime e sensibilidade à ceftazi-dima entre amostras de Pseudomonas aeru-ginosa e (II) a emergência de amostras clíni-cas de enterobactérias resistentes aos car-bapenens (9). Neste artigo pretendemos dis-cutir quais os mecanismos responsáveis por estes fenótipos e as estratégias que po-dem auxiliar o laboratório clínico na detec-ção destes mecanismos de resistência.

Amostras clínicas de P. aeruginosa que são resistentes à cefepima, mas que man-tém sensibilidade à ceftazidima, são fre-quentemente isoladas em laboratórios clíni-cos de diferentes partes do mundo. Alguns estudos têm atribuído tal fenótipo a dois prin-cipais mecanismos de resistência: à produ-ção de ESBL, especialmente as cefotaxi-mases (CTX-M) e as oxacilinases (6;10); as-

RESISTÊNCIA À CEFEPIMA E SENSIBI-LIDADE À CEFTAZIDIMA EM AMOSTRAS DE PSEUDOMONAS AERUGINOSA

sim como à hiperexpressão dos sistemas de efluxo MexXY-OprM (11).

Escherichia coli e Klebsiella spp. são os principais reservatórios de enzimas do tipo ESBL. Entretanto, nos últimos anos, tem-se observado sua produção também por amostras de Salmonella spp., Proteus spp., Enterobacter spp., Citrobacter spp., Serratia spp. e Pseudomonas spp. isola-das de ambiente hospitalar (6). Existem re-latos da ocorrência de amostras de P. aeru-ginosa produtoras de ESBL em todos os continentes, evidenciando a grande disse-minação desses determinantes de resis-tência. As enzimas do tipo ESBL que já fo-ram descritas em P. aeruginosa são: SHV, TEM, PER, VEB, BEL, GES e CTX-M (10).

De forma geral, as ESBL não hidroli-sam a cefoxitina e tem a sua atividade ini-

PRODUÇÃO DE ESBL EM P. AERUGI-

NOSA

Escherichia coli ,Klesiella spp. e P. mirabilis

Caldo de Müeller-Hinton ajustado com cátions.

Incubar por 16-20h em ar ambiente a 35 ± 2 C

Ágar Müeller-Hinton.Incubar por 16-18h em ar

ambiente a 35 ± 2°C

°

Microdiluição em caldoMIC > 2µg/ml para aztreonam, ceftazidima, cefotaxima ou ceftriaxona ou MIC > 8µg/ml para cefpodoxima. Para P. mirabilis, MIC > 2µg/ml para cefpodoxima, ceftazidima ou cefotaxima. Disco DifusãoZonas de inibição:Aztreonam: < 27 mm;Cefpodoxima: < 17 mm;Ceftazidima: < 22 mm;Cefotaxima: < 27 mm;Ceftriaxona: < 25 mm.

Para P. mirabilis, considerar:Cefpodoxima: < 22 mm;Ceftazidima: < 22 mm;Ceftriaxone: < 27 mm

Redução 3 diluições da MIC de

ceftazidima e da cefotaxima na

presença de 4µg/ml de clavulanato

Aumento > 5 mm no halo de inibição da ceftazidima e da cefotaxima na

presença de 10µg de clavulanato

> Positivo:K. pneumoniae ATCC

700603

Negativo: E. coli ATCC 25922

sistência tem somente valor epidemiológi-co, e, nestes casos, a detecção laborato-rial é facultativa. Porém, em algumas situ-ações, pelo antibiograma comum, a bacté-ria mostra-se sensível a um dado agente, mesmo possuindo mecanismos de resis-tência que inviabilizam a utilização tera-pêutica deste mesmo agente, acarretando graves conseqüências como a falha tera-pêutica. Este é o caso, por exemplo, de uma bactéria produtora de carbapenema-se do tipo KPC (Klebsiella pneumoniae car-bapenemase) que se pode se mostrar sen-sível in vitro aos carbapenems. A utilização de carbapenens para tratar esta infecção, principalmente em um sítio, onde o antimi-crobiano não apresenta boa concentra-ção, provavelmente resultará em falha te-rapêutica (8).

Alguns dos novos padrões de resistên-cia observados entre os bacilos Gram-negativos incluem: (I) o fenótipo de resis-

TABELA 2: TESTES FENOTÍPICOS RECOMENDADOS PELO CLSI (2009) PARA DETECÇÃO DE AMOSTRAS DA PRODUÇÃO DE â-LACTAMASES DE ESPECTRO AMPLIADO (ESBL) ENTRE AMOSTRAS DE

E. COLI, KLEBSIELLA SPP. E PROTEUS MIRABILIS.

Microrganismo Meio de cultura e Teste de Triagem Teste Confirmatório Controle de QaulidadeCondições de incubação

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29

TABELA 3: PRINCIPAIS CARACTERÍSTICAS QUE DIFERENCIAM AS CARBAPENEMASES EM DOIS GRUPOS DISTINTOS.

a. Inibidores de betalactamases disponíveis clinicamente: ácido clavulânico, sulbactam e tazobactam;

Metalo-betalactamases Serino-betalactamases

- Tabela 2 (14). A técnica de disco aproximação consis-

te em posicionar os discos de diferentes substratos -lactâmicos, como ceftazidi-ma, cefepima, cefotaxima e ceftriaxona a três centímetros de distância de um disco de amoxicilina com ácido clavulânico. A de-formação do halo de inibição ou o apareci-mento de uma zona fantasma entre o subs-trato e o inibidor caracteriza fenotipicamen-te a amostra como produtora de ESBL. A Fi-gura 1 mostra o teste de disco aproximação positivo para produção de ESBL em K. pne-umoniae, cepa ATCC 700603. Ainda que não seja a técnica padronizada pelo CLSI, a disco aproximação é utilizada como teste de triagem em diversos estudos com o obje-tivo de investigar a prevalência de produ-ção de ESBL entre amostras clínicas (13).

A descrição de ESBLs em amostras de P. aeruginosa é cada vez mais comum, e re-presenta um grande desafio ao laboratório clínico já que o teste utilizado para a sua de-tecção em enterobactérias não apresenta sensibilidade e especificidade satisfatórios quando aplicados a P. aeruginosa (12).

Essa dificuldade é conseqüente a dife-rentes fatores, como a presença de cefa-losporinases cromossomais do tipo AmpC, que inativam as cefalosporinas de amplo es-pectro e não são inibidas pelos inibidores de -lactamases. Estas enzimas podem mascarar a presença de ESBL favorecendo a ocorrência de resultados falsos negati-vos. Tal interferência poderia ser anulada

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com a adição de um inibidor de AmpC co-mo, por exemplo, a cloxacilina ao meio de cultura (15). Entretanto, isolados de P. aeru-ginosa freqüentemente produzem enzimas do tipo OXA que possuem atividade hidrolí-tica potente sobre a cloxacilina, o que tam-bém prejudicaria a interpretação deste tes-te. Outra forma de driblar a interferência da AmpC, é a introdução no teste de disco aproximação dos discos de ticarcilina, uma ureidopenicilina que é resistente à ação dessas cefalosporinases e, portanto, a re-sistência a este agente em isolados clínicos de P. aeruginosa pode indicar a presença de uma ESBL. Por outro lado, a ticarcilina é um bom substrato para algumas bombas de efluxo presentes em P. aeruginosa que, se hiperexpressas, podem representar ou-tra interferência para a detecção de ESBL (16). Amostras clínicas de P. aeruginosa po-dem possuir, ainda, diferentes mecanismos de resistência combinados, como a produ-ção de metalo- -lactamases, a hiperex-pressão de bombas de efluxo e/ou a perda de porinas. As alterações de permeabilida-de da parede celular podem influenciar ne-gativamente a sensibilidade do teste. Final-mente, muitas ESBLs não clássicas como GES-2 e algumas oxacilinases apresentam relativa resistência aos inibidores das seri-no- -lactamases (17).

Até o momento, não existe um teste fe-notípico que apresente boa sensibilidade e especificidade para detectar amostras de P. aeruginosa produtoras de ESBL. Recen-

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Espécies mais freqüentes

Classe Molecular de AmblerTipos

Resistência ao aztreonamInibição pelos inibidores de

abetalactamases Inibição pelos EDTA, e derivados do tiolLocalização do gene

P. aeruginosa, Acinetobacter spp.,

EnterobactériasB

IMP, VIM, SPM, GIM, SIM, AIM, KHM, NDM,

NãoNão

Sim

Variável

S. marcescens, E. cloacae, K. pneumoniae,

Acinetobacter spp.A e D

KPC, GES, OXA IMI, NMC-A, SME,

SimSim (fraca)

Não

Variável

bida pelos inibidores de serino- -lactamases, tais como sulbactam, ácido clavulânico e tazobactam. Por isso, os tes-tes fenotípicos empregados no laboratório de rotina para a detecção da produção de ESBL em amostras clínicas se baseiam na reversão da resistência a um substrato -lactâmico, quando este é associado a um desses inibidores (12).

As metodologias disponíveis para a de-tecção fenotípica de ESBL são disco apro-ximação e disco adição. Tais testes são re-alizados em ágar Müeller-Hinton previa-mente inoculado com uma suspensão da bactéria a ser testada, de acordo com as re-comendações do CLSI para o teste de dis-co difusão (13). O teste de triagem é reco-mendado somente para amostras de E. co-li, K. pneumoniae, K. oxytoca e P. mirabilis e consiste em testar os substratos

-lactâmicos como cefpodoxima, ceftazi-dima, aztreonam, cefotaxima ou ceftriaxo-na. A redução da sensibilidade a estes agentes pode indicar a produção de ESBL. O CLSI recomenda que amostras triadas como produtoras de ESBL tenham este fe-nótipo de resistência confirmado. O teste confirmatório preconizado pelo CLSI que utiliza ambos os agentes antimicrobianos, cefotaxima e ceftazidima, individualmente e em combinação com ácido clavulânico, testados pela técnica de disco difusão (dis-co adição) ou microdiluição em caldo. O au-mento de pelo menos cinco milímetros no diâmetro do halo, ou uma redução maior ou igual a 3 diluições logarítmicas na con-centração inibitória mínima (MIC) para qua-isquer dos dois agentes antimicrobianos testados em combinação com ácido clavu-lânico contra o seu halo ou MIC testado in-dividualmente, indica a produção de ESBL

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Figura 1: Disco aproximação evidenciando a produção de ESBL pela cepa de K. pneumoniae ATCC 700603.

30

O gene que codifica esta enzima foi cap-turado do cromossomo de bactérias ambien-tais do gênero Kluyvera spp. e incorporado a elementos genéticos móveis, o que possibili-tou sua disseminação entre bactérias pato-gênicas. Inicialmente, acreditava-se que es-tas enzimas estavam disseminadas somen-te entre membros da família Enterobacteria-ceae, porém, recentemente, ESBL do tipo CTX-M foram descritas em isolados clínicos de Acinetobacter baumannii no Japão (20) e entre isolados clínicos de P. aeruginosa pro-venientes da Holanda, Bolívia e Brasil (21-23).

No estudo realizado no Brasil, a detecção fenotípica da enzima CTX-M-2 só foi possí-vel com a realização do teste de disco apro-ximação em condições especiais: os discos de cefotaxima e de cefepime dispostos a 1,5 cm de distância (centro a centro) do disco de amoxicilina com ácido clavulânico (Figura 2). Este achado é de extrema importância clíni-ca, visto que muitos infectologistas, ao se de-pararem com um antibiograma de uma bac-téria que é resistente à cefepime e sensível à ceftazidima, sem a informação de que esta bactéria é produtora de uma ESBL, podem utilizar a ceftazidima para o tratamento da respectiva infecção, podendo resultar em fa-lha terapêutica (21).

Ainda que saibamos que as enzimas do tipo CTX-M já se disseminaram entre isola-dos de P. aeruginosa no Brasil, sua prevalên-cia ainda é desconhecida e, portanto, outros estudos são necessários para que se possa avaliar a real magnitude deste problema.

O termo ESBL foi utilizado, inicialmente, para designar apenas aquelas enzimas clas-sificadas no grupo funcional 2be, da classe A de Ambler. Porém, com o aparecimento de oxacilinases da classe D (Tabela 1), também capazes de hidrolizar cefalosporinas de am-plo espectro, o termo ESBL passou a ser uti-lizadas igualmente para estas enzimas, de-signadas ESBL do tipo OXA (6).

Um estudo realizado na França, a partir de um isolado clínico de P. aeruginosa, reve-lou que o fenótipo de resistência à cefepime e sensibilidade à ceftazidima estava relacio-nado à produção de uma ESBL do tipo OXA, OXA-31. Neste trabalho, os pesquisadores realizaram ainda o estudo da cinética enzi-

ESBL DO TIPO OXA

mática da oxacilinase OXA-1, observando que esta enzima também era capaz de hi-drolisar cefepime (24). Até o momento, não existem estudos realizados no Brasil que relatem a prevalência de ESBL do tipo OXA entre isolados clínicos de P. aerugi-nosa.

A detecção fenotípica da produção de oxacilinases em P. aeruginosa não é tarefa de fácil realização para o laboratório clíni-co. Isto porque, além das dificuldades ante-riormente mencionadas, a maioria das en-zimas do tipo OXA não são sensíveis à ação dos inibidores de -lactamases. Atualmente, não existe um teste fenotípico para identificação deste mecanismo de re-sistência ou qualquer recomendação do CLSI para que se faça a detecção de enzi-mas do tipo OXA nos laboratórios clínicos. Esta identificação, geralmente, é feita so-mente em laboratórios de pesquisa a partir da amplificação e seqüenciamento do ge-ne blaOXA que as codificam (6).

Efluxo é um processo em que a célula transporta ativamente para seu exterior substâncias potencialmente tóxicas como metabólitos, drogas e outros compostos químicos. Os sistemas de efluxo podem ser expressos constitutivamente, quando geralmente são codificados por genes cro-mossomais, contribuindo assim para o fe-nótipo de resistência intrínseca do micror-ganismo a determinadas drogas antimi-crobianas. A resistência adquirida ocorre após mutações nos genes reguladores, o que leva à hiperexpressão desses siste-mas e o surgimento de resistência (25).

O sistema MexXY-OprM é responsável

â

HIPEREXPRESSÃO DOS SISTEMAS DE EFLUXO MEX-XY-OPRM

temente, pesquisadores chineses desen-volveram um estudo no qual foram feitas mo-dificações nos testes fenotípicos para a de-tecção de ESBL em amostras clínicas de P. aeruginosa. Segundo este estudo, o teste de disco adição utilizando ceftazidima como substrato e ácido clavulânico como inibidor, em ágar Müeller-Hinton contendo cloxacili-na 200 µg/ml e o inibidor de bomba de eflu-xo phenyl-arginine-beta-naphthylamide (PA N) 20 µg/ml apresentou sensibilidade de 97,1% para detecção de amostras pro-dutoras de ESBL. Entretanto, a enzima ma-is prevalente neste estudo foi a VEB-3, que é inibida pelo ácido clavulânico, e, portanto, a acurácia deste teste poderia ser limitada para a detecção de ESBL em amostras P. ae-ruginosa que produzem enzimas fracamen-te inibidas pelo ácido clavulânico (18;19).

Pelas razões acima apresentadas, a pre-valência de amostras de P. aeruginosa pro-dutoras de ESBL pode estar subestimada, o que dificultaria o julgamento da importância da padronização de um teste fenotípico pe-los laboratórios de microbiologia para a de-tecção deste fenótipo de resistência nesta espécie. Por não ser possível, até o mo-mento, a caracterização fenotípica da pro-dução de ESBL em P. aeruginosa, a detec-ção dos genes que codificam as ESBLs atra-vés de testes moleculares seria a única ma-neira de estimar qual a prevalência local de ESBL nesta espécie. Para tal, as metodolo-gias indicadas são: reação da polimerase em cadeia (PCR) para a amplificação do ge-ne e o seqüenciamento do mesmo. Porém, a realidade de grande parte dos laboratóri-os clínicos brasileiros não comporta a im-plementação de testes genotípicos, muitas vezes caros, laboriosos e que demandam a existência de uma estrutura específica e de técnicos especializados.

As -lactamases do tipo CTX-M, assim designadas por apresentarem a cefotaxima como substratos preferenciais, apresentam como característica marcante a grande ca-pacidade de hidrolisar penicilinas, cefotaxi-ma, cefepime e aztreonam, enquanto prati-camente não hidrolisam ceftazidima. Outra característica importante das ESBL do tipo CTX-M é a sensibilidade in vitro aos inibido-res de -lactamases (6).

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ESBL DO TIPO CEFOTAXIMASES (CTX-M)

Figura 2: Disco aproximação realizada em condições não usuais evidenciando a produção da ESBL

do tipo CTX-M-2 por um isolado clínico de P. aeruginosa isolada em São Paulo.

Cepas selvagens de Proteus mirabilis são desprovidas de -lactamases, e por-tanto, são naturalmente sensíveis às ami-nopenicilinas, às carboxipenicilinas, às urei-dopenicilinas, ao aztreonam, às cefalospo-rinas e aos carbapenens. O diâmetro do ha-lo de inibição de imipenem, no entanto, mui-tas vezes é reduzido entre isolados clínicos de P. mirabilis, como para outras espécies do grupo Proteae. Tal diminuição foi atribuí-da à baixa afinidade do imipenem pela pro-teína ligadora de penicinina (PBP2) dessas espécies. Adicionalmente, algumas amos-tras de Enterobacter cloacae, Serratia mar-cescens e S. fonticola produzem carbape-nemases da classe A cromossomais e indu-zíveis, como, por exemplo, as enzimas NMC-A, IMI, SME e SFC-1 (5;7). Estes iso-lados apresentam sensibilidade diminuída ou são resistentes às penicilinas, às cefa-losporinas de primeira e segunda geração, ao aztreonam e ao imipenem, mantendo a sensibilidade às cefalosporinas de terceira e quarta geração. Estes mecanismos são, entretanto, naturais da espécie ou muito ra-ros. Além disso, não existem relatos da pre-sença de enterobactérias produtoras das carbapenemases NMC, IMI, SME ou SCF no Brasil. Por estas razões, neste tópico va-mos nos concentrar naqueles mecanismos de resistência adquirida aos carbapenens já descritos ou observados no Brasil.

Dois mecanismos principais estão rela-cionados à resistência adquirida aos carba-penens em enterobactérias: a produção de

-lactamases de amplo espectro associa-da aos mecanismos de impermeabilidade, como a perda de porinas; e a produção de carbapenemases (28).

Não é raro encontrarmos na literatura ci-entífica relatos de isolados clínicos de ente-robactérias, principalmente Klebsiella spp., Escherichia coli e Enterobacter spp. resis-tentes aos carbapenens que não apresen-tam produção detectável de carbapenema-ses (29). Estes isolados normalmente apre-sentam mecanismos de impermeabilidade associados à produção de -lactamases, tais como ESBL, AmpC plasmidiais ou ain-da AmpC cromossomal em grande quanti-

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PRODUÇÃO DE -LACTAMASE DE AMPLO ESPECTRO ASSOCIADO A ME-CANISMOS DE IMPERMEABILIDADE

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dade. É sabido que tais enzimas não são ca-pazes de hidrolisar os carbapenens com efi-ciência. Porém, em situações onde a con-centração de carbapenens no interior da cé-lula se torna baixa, como, por exemplo na-quelas bactérias que perderam uma porina, a mais ineficiente hidrólise é capaz de for-necer à bactéria condições de sobrevida na presença do antibiótico.

K. pneumoniae normalmente expressa três principais porinas, OmpK35, OmpK36 e OmpK37. Porém, somente a diminuição da expressão ou a perda das porinas OmpK35 e OmpK36 são associadas à re-sistência aos -lactâmicos. Estudos inte-ressantes foram realizados introduzindo di-ferentes -lactamases em cepas mutantes de K. pneumoniae deficientes em ambas as porinas OmpK35 e OmpK36 (30;31). Os au-tores observaram que a expressão das ce-falosporinases, tanto as cromossomais, co-mo as plasmidiais, aumentaram a MIC de imipenem em até 5 diluições, conferindo re-sistência aos carbapenens. A introdução de ESBL da classe A do tipo TEM, SHV e CTX, aumentou a MIC de ertapenem em pelo me-nos 4 diluições, enquanto que houve um au-mento máximo de 2 diluições nas MICs de imipenem e de meropenem (29).

Ao contrário do que se conhece sobre porinas em K. pneumoniae produtoras de ESBL, escassos são os dados sobre pori-nas naturalmente expressas e/ou possivel-mente relacionadas à resistencia bacteria-na E. coli. Sabe se que esta espécie bacte-riana apresenta duas principais porinas, OmpF e OmpC, e alguns relatos indicaram que a perda dessas duas estruturas leva-ram à resistência a agentes -lactâmicos na presença de -lactamases. Ainda que a perda de OmpF em E. coli produtores de ESBL tenha causado discretas mudanças no perfil de sensibilidade aos â-lactâmicos, é importante ressaltar que as MICs para imi-penem e meropenem nestas amostras fo-ram mais elevadas, mas não o suficiente pa-ra que estas amostras fossem classificadas como resistentes a estes agentes (32).

Existem muitos relatos da associação de perda de porina e maiores níveis de re-sistência aos antimicrobianos em outras en-terobactérias, como Salmonella enterica, Enterobacter spp. e Serratia spp (33). Ape-sar de poucos artigos tratarem especifica-

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31

pela resistência intrínseca a aminoglicosí-deos, eritromicina e tetraciclina em cepas selvagens de P. aeruginosa. O uso de ami-noglicosídeos pode levar à hiperexpres-são deste sistema que é induzível, sendo assim capaz de ejetar fluoroquinolonas e vários -lactâmicos, incluindo algumas ce-falosporinas. É interessante ressaltar que entre as cefalosporinas, a cefepima é eje-tada por este sistema, mas não a ceftazidi-ma (26). O fenômeno de indução pode ser observado no antibiograma através do achatamento do halo de inibição do cresci-mento bacteriano, produzido pela cefepi-ma e por quinolonas, quando esses agen-tes estão dispostos próximos a discos im-pregnados por aminoglicosídeos. Ainda que a cefepima e as fluoroquinolonas não sejam capazes de induzir a expressão de MexXY-OprM, mutantes resistentes que hi-perexpressam esse sistema podem ser se-lecionados pela exposição a esses agen-tes. Dessa forma o fenótipo de resistência a cefepima e sensibilidade a ceftazidima pode ser também ser sugestivo da hipe-rexpressão de MexXY-OprM (11).

Pouco se sabe sobre a prevalência da hiperexpressão deste sistema em isola-dos clínicos de P. aeruginosa sensíveis a ceftazidima e resistentes a cefepima. Ape-nas um estudo realizado na França atribui este fenótipo a este sistema de efluxo. Da mesma maneira, não existem estudos clí-nicos que nos permitam concluir se cefta-zidima seria uma boa opção para o trata-mento de infecções por estas bactérias. Não existe ainda qualquer recomendação para que se faça a detecção laboratorial de cepas que hiperexpressem sistemas de efluxo (11).

Os carbapenens são comumente pres-critos para o tratamento de infecções cau-sadas por bacilos Gram-negativos produ-tores de ESBL. É cada vez mais frequente, porém, o isolamento de bactérias resisten-tes a estes agentes no laboratório clínico. Estes achados são inquietantes visto que, muitas vezes, as opções terapêuticas para o tratamento destas infecções ficam limita-das às polimixinas (27).

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RESISTÊNCIA AOS CARBAPENENS EM AMOSTRAS CLÍNICAS DE ENTE-ROBACTÉRIAS

minar facilmente, especialmente quando carregados por K. pneumoniae que apre-senta notória capacidade de transferir ele-mentos de resistência. Vários fatores difi-cultam a detecção deste fenótipo de resis-tência (39). Primeiro, as amostras produto-ras de KPC frequentemente não são detec-tadas como resistentes aos carbapenens, quando os testes de sensibilidade a antimi-crobianos (TSA) são realizados rotineira-mente. Geralmente, estas amostras são de-tectadas como produtoras de ESBL e de-monstram sensibilidade ao imipenem no TSA. Esta situação se agrava ainda mais quando os TSA são realizados por meio de aparelhos automatizados, já que imipenem e meropenem, os carbapenens testados por estes métodos, apresentam baixa sen-sibilidade e especificidade na detecção de amostras produtoras de KPC. Além disso, a sensibilidade da detecção de enzimas do ti-po KPC é altamente influenciada pelo inú-culo bacteriano e, portanto, caso um inócu-lo baixo seja testado, uma amostra produ-tora de KPC pode não ser detectada.

No Brasil, as primeiras amostras de K. pneumoniae produtoras de KPC foram de-tectadas na cidade de Recife, em 2007 (39), seguidas pela cidade do Rio de Janei-ro e São Paulo (38). No documento M100-S19 (2009), o CLSI passou a recomendar a detecção da produção de KPC pelo teste de Hodge modificado. Este documento pre-coniza que isolados clínicos de K. pneumo-niae triados como produtores de ESBL e que apresentem redução da sensibilidade aos carbapenens (Figura 4) devem ser sub-metidos ao teste de Hodge modificado para a confirmação da produção de carbapene-mases por esses isolados. Esse teste con-siste na observação do crescimento da E. coli ATCC 25922, inoculada a partir de uma suspensão bacteriana equivalente a 1:10 de uma suspensão 0,5 da escala de McFar-land em uma placa contendo ágar Müeller-Hinton, ao redor do halo de inibição de um disco contendo 10 µg de ertapenem, de on-de um "traço" da amostra teste é semeado partindo da borda do disco de antimicrobia-no até a periferia da placa. A observação de uma seta na direção do disco de ertape-nem, formado pelo crescimento da E. coli ATCC 25922, é sugestiva da produção de carbapenemase pela amostra teste e re-

presenta um teste de Hodge positivo (Fi-gura 3) (14).

Resultados falsos positivos para o tes-te de Hodge modificado têm sido observa-do entre amostras hiperprodutoras de AmpC ou entre aquelas que produzem ESBL associada à deficiência na expres-são de porinas. Desta maneira, a utiliza-ção do teste de Hodge modificado fica com-prometida em regiões, onde é alta a preva-lência de amostras produtoras de ESBL e/ou AmpC.

Adicionalmente, a produção de MBL, antes observada entre amostras de Gram-negativos não-fermantadores, tais como, Pseudomonas spp. e Acinetobacter spp., a produção das MBL do tipo IMP e VIM vem sendo detectada em espécies da famí-lia Enterobacteriaceae (40). O apareci-mento de enterobactérias produtoras de MBL foi reportado em hospitais brasileiros, em 2003, com um relato de uma cepa K. pneumoniae que carreava o gene IMP-1 na cidade de São Paulo. A presença da en-zima IMP-1 no Brasil foi reportada em pelo menos outras duas espécies de entero-bactérias, Providencia rettgeri e em E. cloa-cae, além de relatos da presença de isola-dos de K. pneumoniae geneticamente rela-cionadas em hospitais brasileiros (41;42).

Interessantemente, apesar de sua for-te atividade hidrolítica, as MBLs presentes em enterobactérias freqüentemente con-ferem baixa resistência aos carbapenens. A concentração inibitória mínima para imi-

32

mente de isolados produtores de ESBL ou AmpC, é muito provável que o observado pa-ra K. pneumoniae e E. coli, acima menciona-do, seja também válido para estas outras en-terobactérias. Não existem métodos labora-toriais padronizados e rotineiramente em-pregados para a detecção de isolados bac-terianos que possuam alteração nas proteí-nas de membrana externa.

Novas enzimas bacterianas capazes de hidrolisar os carbapenens, carbapenema-ses, surgiram na década de 90. De modo prá-tico, baseadas no seu mecanismo de ação, as carbapenemases são subdivididas em do-is tipos: as metalo-â-lactamases (MBL) e as serinos â-lactamases (SBL) (27).

Na Tabela 3, estão citadas as principais diferenças entre estes dois grupos de carba-penemases e os exemplos dos principais ti-pos de betalactamases englobadas por es-tes dois subgrupos.

Entre as SBL, as enzimas do tipo KPC têm ganhado maior notoriedade. Estas enzi-mas são capazes de hidrolisar todos os â-lactâmicos, incluindo penicilinas, cefalospo-rinas, monobactans e carbapenens e são co-dificadas por genes localizados em plasmí-deos. O primeiro isolado clínico produtor de KPC foi detectado na Carolina do Norte, em 1996 (34). Até o ano 2001, isolados clínicos produtores de KPC foram raramente detec-tados, mas desde então, vários surtos hos-pitalares têm ocorrido nos estados de Nova York e Nova Jersey. Embora a produção de KPC seja detectada com maior freqüência entre amostras de K. pneumoniae e E. coli, KPCs têm sido reportadas em outros gêne-ros da família Enterobacteriaceae, como, Proteus, Serratia, Salmonella e Citrobacter, e, mais raramente, em P. aeruginosa (35;36). Organismos produtores de KPC também têm sido isolados em outros esta-dos americanos e se disseminado para ou-tros países como China, Colômbia, Brasil, França e Israel (36-39). A disseminação glo-bal de amostras produtoras de KPC tem sido relativamente rápida, talvez porque a coloni-zação/infecção por estes microrganismos possa passar despercebida e/ou porque os genes codificadores de KPC, geralmente, lo-calizados em plasmídeos podem se disse-

CARBAPENEMASES EM ENTEROBA-CTÉRIAS Figura 3: Teste de Hodge modifi-

cado indicando a possível produção de uma carbapenemase por uma amostra

clínica de K. pneumoniae. Notar que houve o crescimento da cepa de E.

coli ATCC 25922 próximo ao disco de ertapenem. Este crescimento ocorreu

porque provavelmente houve a inativação (hidrólise) do ertapenem

pela amostra clínica testada.

33

co de imipenem em associação a 10 l de uma solução de EDTA a 100 mM, e consi-derando-se 5 mm de variação no halo, em relação ao tamanho do halo na ausência do inibidor, como ponto de corte para suge-rir a produção de MBL (40).

Neste manuscrito, optamos por discutir dois mecanismos: resistência à cefepima com sensibilidade à ceftazidima em amos-tras de P. aeruginosa e resistência aos car-bapenens em enterobactérias que, apesar de conhecidos, têm sido observados com freqüência cada vez maior em nosso meio. Novos padrões de resistência têm surgido, mas infelizmente, a detecção fenotípica destes nem sempre tem sido uma tarefa simples de ser incorporada pelos laborató-rios clínicos de microbiologia. Esta dificul-dade se deve principalmente a dois fato-res: diferentes mecanismos de resistência podem mostrar o mesmo fenótipo; e a as-sociação de mecanismos de resistência freqüentemente está presente em amos-tras clínicas, o que limita o desenvolvimen-to e implementação de testes fenotípicos com boa sensibilidade e especificidade na rotina laboratorial. Entretanto, consideran-

µ do que um teste fenotípico pode apresen-tar excelente desempenho em uma deter-minada região geográfica e um desempe-nho insatisfatório em outra localidade, ca-be aos laboratórios de pesquisas determi-narem a freqüência destes mecanismos lo-calmente, para que estudos epidemiológi-cos possam ser realizados com o intuito de determinar o seu impacto clínico e, a partir destas análises, validar e/ou aperfeiçoar os testes fenotípicos a serem incorpora-dos na rotina dos laboratórios de microbio-logia clínica.

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REFERÊNCIAS

Halo de inibição (mm) MIC ( g/mL)µ

penem destes isolados varia de 0,12-0,25 µg/mL a 1-4 µg/mL, valores abaixo do limi-te de sensibilidade estabelecidos pelo CLSI (14). A maior permeabilidade a essas drogas entre as diferentes espécies bacte-rianas seria uma das hipóteses para justifi-car o baixo nível de resistência aos carba-penens apresentado pelas enterobacté-rias. Uma vez que os genes codificadores das MBLs relatadas em enterobactérias encontram-se em estruturas genéticas mó-veis, passíveis de transferência inter-espécie, sua detecção e o conhecimento da sua epidemiologia é essencial para o controle da disseminação desse mecanis-mo de resistência. A detecção da produ-ção de MBL pode ser feita fenotipicamente pela observação da restauração da sensi-bilidade da cepa teste na presença de um inibidor de MBL. Entretanto, esse método não é satisfatório como aquele observado para os grupos de P. aeruginosa e Acineto-bacter spp devido a pouca variabilidade nos valores da MIC na presença do inibi-dor. Uma estratégia para a detecção da produção de MBL entre enterobactérias é o teste de disco combinado utilizando dis-

Ertapenem 19-21 2Imipenem - 2-4Meropenem 16-21 2-4

Sem aumento do crescimento

da cepa ATCC:

Teste de Hodge Negativo

Realizar o Teste de Hodge Modificado

E. coli

ATCC 25922

Inóculo 1:10 McFarland 0,5

Discos de ertapenem 10 µg

ou meropenem 10

µg

Semear a amostra teste da periferia do disco em direção à periferia da placa de Petri

por pelo menos 25 mm

Cepas Controle de qualidade:

BAA-1705 (Positivo) e BAA-1706 (negativo)

Incubar por 16-20h em ar ambiente a 35 ?

2?

C

Com aumento do crescimento

da cepa ATCC:

Teste de Hodge Positivo

Para interpretação dos resultados do

TSA aos carbapenens - utilizar o critério

do CLSI

Reportar a MIC dos carbapenens sem

utilizar o critério para interpretação dos

resultados do TSA -

Nota:

Este isolado demonstra produção de

carbapenemase. A eficác ia clínica dos

carbapenens ainda não foi bem

estabelecida para o tratamento das

infecções causadas por Enterobactérias

produtoras de carbapenemases, mas apenas

com a sensibilidade aos carbapenens

preservada in vitro.

Figura 4: Testes de triagem e confirmatório para detecção fenotípica da produção de carbapenemase em Enterobacteriaceae de acordo com o documento M100-S19 (CLSI, 2009).

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13 de janeiro de 2005. Os leucócitos obti-dos serão submetidos à transformação por EBV, com o intuito de perenizar a fon-te de informação. O mapeamento dos po-limorfismos utilizará plataforma de geno-tipagem baseadas no uso de SNPs tipo \"tag\" (etiquetados), escolhidos predo-minantemente conforme dados obtidos no HapMap Project.

O painel para o ensaio deverá ser pre-parado para incluir marcadores de ancestralidade (em torno de 50) e genes candidatos para as diversas doenças em estudo pela equipe do iii. Os SNPs deverão, na medida do possível, serem funcionalmente relevantes, localizados em genes para citocinas, quimiocinas e respectivos receptores, genes de res-posta inata como receptores tipo Toll e KIR, moléculas de adesão e de \"ho-ming\", entre outros. A previsão é de que cada array para genotipagem por SNPs seja representativo de aproximadamen-te 300 genes.

Este projeto se beneficiará de cone-xão com as plataformas de Bioinformáti-ca (ferramentas de análise), Epidemiolo-gia e Ensaios Clínicos (estatística e amostragem) e Ensino e Relação com a Sociedade (formação de recursos huma-nos), já existentes na rede integrada de pesquisadores do iii.

É recomendável o candidato ter expe-riência prévia em biologia molecular e ge-nética de populações.

Os interessados deverão enviar cur-rículo completo atualizado e carta de in-tenções para: Anna Carla Goldberg no endereço <goldberg@einstein.br>.

Profa. Dra. Anna Carla Goldberg - Pesquisadora Instituto Israelita de Ensi-no e Pesquisa Albert Einstein.

Contato: goldberg@einstein.br ou 11-3747 0941

PÓS DOC EM MICROBIOLOGIA -

DEPARTAMENTO DE QUÍMICA - UNIVERSIDADE FEDERAL DE SÃO CARLOS

Abrimos uma vaga para Pós-dou-torando com experiência em Microbio-logia, principalmente de fungos filamen-tosos.

Uma bolsa de pós-doutoramento está disponível para recém doutores com especialidade em Microbiologia para atuar em um projeto visando à bus-ca de compostos inseticidas em extratos obtidos de micro-organismos. O candi-dato se envolverá com a obtenção e manutenção de cepas e o cultivo de fun-gos filamentosos, a preparação de extra-tos, e colaborar na condução de ensaios para detecção de atividade inseticida em Diaphorina citri e Spodoptera frugiperda. São exigidas capacidades de interação com especialistas em química de produtos naturais e entomo-logistas. Os interessados devem ter o título de doutor em microbiologia ou área correlata com especialidade em fungos filamentosos; devem ter no míni-mo três artigos na área, publicados em revistas especializadas, e bom desem-penho acadêmico.

O projeto terá início em maio de 2009. Os candidatos devem enviar CV, lista de publicações e duas cartas de re-comendação via e-mail, endereçadas à Profa. Dra. Maria Fátima das Graças Fer-nandes da Silva (dmfs@power. ufs-car.br) com cópia para Prof. Edson Ro-drigues Filho (edinho@pq.cnpq.br)

VIII ENCONTRO DO INSTITUTO ADOLFO LUTZ.

Será realizado entre 19 e 22 de outu-bro de 2009, no Centro de Convenções Rebouças, São Paulo, o VIII Encontro do Instituto Adolfo Lutz. Para maiores infor-mações e programação científica aces-sar o site htpp://encontro.ial.sp.gov.br

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Notícias in Foco

Caros colegas e amigos:

Sob a nova gestão o Instituto Israeli-ta de Ensino e Pesquisa Albert Einstein está expandindo suas linhas de pesqui-sa e recrutando novos pesquisadores. O seu Centro de Pesquisa Experimental conta com um laboratório com toda a in-fra-estrutura para biologia molecular e ce-lular, uma equipe com larga experiência e competência em análises de seqüenci-amento, cultura celular, citometria, ob-tenção e pesquisa com células-tronco de medula e de cordão, técnicas de ima-gem e arrays, entre outros.

Procuramos um pós-doutor Junior pa-ra preenchimento imediato de vaga com Bolsa CNPq, para trabalhar: Em Imuno-genética: Implantação do BIGiii, Banco Brasileiro de Informação Genética em Imunologia (INCT- Instituto de Investiga-ção em Imunologia).

O objetivo principal desta plataforma é estabelecer o primeiro Banco Brasilei-ro de Informação Genética em Imunolo-gia (BIGiii), para aplicação no estudo de doenças típicas do Brasil, em andamen-to no iii.

Análise preliminar do tamanho amos-tral de indivíduos sadios indica que um N de 1000 amostras seja suficiente. Esse cálculo se baseia em SNPs já analisa-dos, ao longo dos últimos anos (22 SNPs em genes não-HLA), com freqüências do alelo raro entre 3,3 e 43,5%. Essas amos-tras serão de 2 tipos, cada uma com um N de 500:

1) amostras pediátricas de sangue pe-riférico, de indivíduos não relacionados e

2) amostras de sangue periférico de indivíduos adultos não relacionados, com dados demográficos similares aos da população de pacientes em tratamen-to no complexo hospitalar do HC-FMUSP. Coleta será feita obedecendo as diretrizes da resolução CNS 347 de

EDITAL DO CONCURSO PARA OBTENÇÃO DO TÍTULO

DE ESPECIALISTA EM MICROBIOLOGIA - TEMICRO 2009.

1. ApresentaçãoO Presidente da Sociedade Brasileira de Microbiologia, MARINA BAQUERIZO MARTINEZ, e o Secretário, Carlos Peleschi Taborda, no uso de suas atribuições legais, farão realizar Concurso para Obtenção do Título de Especialista em Mi-crobiologia-TEMICRO, no dia 08 de novembro de 2009, regulamentado pelo presente Edital.

O Título de Especialista em Microbiologia terá validade por 5 (cinco) anos, de-vendo ser renovado de acordo com as normas estabelecidas pela Comissão Na-cional de Titulação SBM.

2. Das inscrições2.1. A inscrição do candidato implicará o conhecimento e a tácita aceitação das normas e condições estabelecidas neste Edital, em relação às quais não poderá alegar desconhecimento.2.2. As inscrições serão recebidas no período de 01de junho a 30 de agosto de 2009, por via eletrônica (www.sbmicrobiologia.org.br).2.3. O candidato deverá efetuar o pagamento da taxa de inscrição conforme no valor de R$ 615,00

As Especialidades É importante esclarecer que as especialidades regulamentadas são profissio-nais, isto é, são especialidades no campo do exercício profissional do microbio-logista. Foram regulamentadas algumas que se configuraram como mais defini-das e consensuais. A Saber: Microbiologia AmbientalMicrobiologia de AlimentosMicrobiologia Industrial Microbiologia ClínicaDeve ser destacado que o título de especialista em microbiologia é uma referên-cia sobre a qualificação do profissional, não se constituindo condição obrigatória para o exercício da profissão. Podem solicitar o título de Especialista os Biólogos, Biomédicos, Farmacêuti-cos, Médicos, Médicos Veterinários e outros profissionais que tenham atuação em uma das áreas da Microbiologia, desde que preencham alguns dos prerequi-sitos abaixo relacionados:

I - Das Inscrições:- O candidato deverá ser associado da Sociedade Brasileira de Microbiologia (SBM) tendo quitado o ano vigente;- O candidato deverá ter nível superior e cinco anos de experiência profissio-nal comprovada na área após a graduação OU carga horária mínima de 1.200 horas de estágio em microbiologia comprovadas depois de formado;- Pagar a taxa estabelecida pela SBM;- O candidato deverá ter uma carta de apresentação e três indicações de as-sociados da SBM;- O certificado terá validade por cinco anos.

II - Documentos necessários para Inscrição:- Preencher a ficha de inscrição;

Enviar para a SBM via correio curriculum vitae documentado, que deverá ser confeccionado de acordo com a "Plataforma Lattes" , histórico escolar e carteira ou comprovante de trabalho e uma fotografia recente 3x4;

III - Pontuação dos Títulos e Atividades:- Para obtenção do título o candidato deverá atingir média final = 7,0;Provas - 90% Títulos - 10%

IIIa - ProvasProva escrita: será composta de questões de múltipla escolha e dissertativas sendo que 60% do conteúdo deverá versar sobre Microbiologia Geral e 40% so-

bre Microbiologia Específica da área de especialização escolhida.Prova Prática: Versará sobre temas específicos da área de especialização esco-lhida

Critérios a serem utilizados na avaliação do CV para OBTENÇÃO do Título de Especialista

TÍTULOSDoutor na área escolhida, Mestre na área escolhida Especialização na área escolhida

Liderança técnica

Atividade Docente

Artigos científicos

Apresentação em Congresso

Cursos de aperfeiçoamento

Cursos de atualização

Estágio em microbiologiaEventos

Eventos

ExigênciasPrograma regular credenciado pela CAPES

Programa regular credenciado pela CAPES

Deverão ter carga horária mínima de 720 ho-ras, considerando-se as horas-aulas e os tra-balhos de campo, experimental, de estudo e monografia, bem como deverão atender às exigências do Conselho Federal de Educa-ção e deverão ser reconhecidos pela SBMLiderança técnica em Laboratórios de Micro-biologia nos últimos 10 anos

Atividade Docente em Microbiologia nos últi-mos 10 anos

Artigo científico em Microbiologia na área es-colhida, publicados em revistas indexadas no ISI e/ou PubMed, como autor ou co-autor nos últimos 5 anosTrabalhos científicos em Microbiologia, apre-sentados em Congressos reconhecidos pela SBM, como autor ou co-autor Em microbiologia nos últimos 5 anos, carga horária mínima de 180 horas, reconhecido pela SBMEm microbiologia nos últimos 5 anos, , reco-nhecido pela SBM. Abaixo de 36 horas de atualização nos últimos cinco anos não será pontuadoPeríodo mínimo de 480 h consecutivas, nos últimos cinco anosParticipação em Congresso de Microbiologia e afins nos últimos 5 anos. Somente eventos reconhecidos pela SBM serão pontuados (ve-ja anexo). Eventos não reconhecidos serão julgados pela comissãoParticipação ativa como palestrante em Con-gressos de Microbiologia nos últimos 5 anos

Pontuação5

3

1,5

1 ponto a cada 2 anos de atividade (máximo 5 pontos)1 ponto a cada 2 anos de atividade (máximo 5 pontos)1 ponto por artigo (máximo 5 pontos)

0,2 por apresentado(máximo 1 pontos)

1 ponto

36 - 72 h 0,5; 73 - 109 h 1.0; >110 h

1,5(máximo 1,5 ponto)Máximo de 1 ponto

0,2 por evento(Máximo de 1 ponto)

0,2 por evento(Máximo de 1 ponto)

TEMICRO 2009TEMICRO 2009

OBS: Os documentos referentes às atividades pontuadas deverão ser enviados organizadamente, agrupados por atividade. Caberá à SBM, através da Comis-são de Titulação, proceder a pontuação estabelecida nos itens acima discrimi-nados, para cada candidato, ação essa que será executada antes da realização da prova. Outrossim, a comprovação de títulos e atividades constantes do currículo de-vem somar no mínimo 10 pontos nos últimos 5 anos para a aprovação da inscri-ção no concurso. O título terá validade por cinco anos. Para revalidação, o solicitante deve-rá encaminhar CV circunstanciado à SBM. A avaliação será feita pela Co-missão de Titulação pela análise e pontuação do CV. Pontuação mínima exigida será de 10 pontos.

Procedimento:

Categorias de associação e seus respectivos valores:

Formas de pagamento:

O interessado deverá preencher a ficha de adesão, especificando a categoria (Estudante de graduação, Estudande de Pós-Graduação ou Profissional).

Aluno de Graduação e Pós-Graduação: R$ 55,00Aluno de Pós-Doutorado: R$ 105,00Profissional: R$ 185,00

Enviar a ficha de adesão por E-mail (cadastro@sbmicrobiologia.org.br), solicitando o boleto bancário.Informações sobre pagamento com boleto que poderá ser acesso na área restrita logo após o cadastramento em nossos sistemas.

COMO ASSOCIAR-SECOMO ASSOCIAR-SE

FICHA DE ADESÃOFICHA DE ADESÃODATA:___________________________________________________________ ANO DE REFERÊNCIA:___________________________Categoria: ( ) Estudante de Graduação ( ) Estudante de Pós-Graduação ( ) ProfissionalNome completo:__________________________________________________________________________________________________RG:______________________________________________________ CPF:________________________________________________Endereço Res:__________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________ Bairro:___________________________________Cidade:__________________________________________________________ UF:___________ CEP:__________________________TEL.:____________________________________________________ FAX:________________________________________________E-MAIL:_________________________________________________________________________________________________________Instituição:_______________________________________________________________________________________________________Departamento:___________________________________________________________________________________________________Cargo que exerce:_________________________________________________________________________________________________Titulação:________________________________________________________________________________________________________Endereço:__________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________ Bairro:______________________________________Cidade:__________________________________________________________ UF:___________ CEP:__________________________TEL.:____________________________________________________ FAX:________________________________________________E-MAIL:_________________________________________________________________________________________________________Microbiologia Especializada em: 1.Alimentos (MAL); 2.Ambiental (MAM); 3.Básica (BAS); 4. Biotecnologia (BIO); 5.Clínica (MC); 6.Industrial (MIN); 7.Micologia (MI); 8.Micotoxinas (MX); 9.Oral (MO); 10.Solo (MS); 11.Veterinária (MV); 12.Virologia (VI); 13.Outros (especificar):

Endereço para correspondência: Residencial ( ) Comercial ( )

Presidente

Vice-presidente

1º Secretário

2º Secretário

1º Tesoureira

2º Tesoureira

Conselho Fiscal:

Marina Baquerizo Martinez (USP-SP)

Maria José M. Giannini (UNESP-SP)

Carlos Taborda (USP-SP)

Loreny Giugliane (UNB-DF)

Adalberto Pessoa Jr. (USP-SP)

Alexandre S. Rosado (UFRJ-RJ)

Bernadete G. Franco (USP-SP)Sergio E. L. Fracalanzza (UFRJ-RJ)

Antonio Fernando Pestana de Castro (USP-SP)

Coleções de Cultura Micro Clinica Parasito-Hospedeiro- Lara D Sette, UNICAMP-SP - Lauro Santos Filho, UFPB-PB - Sandro R. de Almeida, USP-SP- Elisa Cupollilo, FIOCRUZ-RJ - Pedro D´Azevedo, FFFCMPA-RS - Marcelo Bozza, UFRJ-RJ

Ensino Micro Industrial Solo- Alexandre Lourenço, UNIP/UNISA/FMU -SP - José Gregório, USP-SP - Vivian H. Pelizzari, USP-SP- Maria Ligia C. Carvalhal, USP-SP - Eleni Gomes, UNESP-Rio Preto - Mariangela Hungria, EMBRAPA-PR

Infecção Hospitalar Micro Médica Veterinária- Ana Lúcia Darini, USP-RP - Elizabeth Marques, UERJ-RJ - Walter Lilenbaum, UFF-RJ- Jorge Sampaio Fleury, SP - Waldir P Elias Jr, I. Butantan, SP - Vasco Azevedo, UFMG-RJ

Micro de Alimentos Micologia Virologia- Bernadete G. Franco, USP - Rosana Puccia, UNIFESP-SP - Maurício L. Nogueira, FAMERP-SP- Ricardo Dias, FUNED -MG - Marilene Vainstein, UFRGS-RS

Presidente do CBM 2007Micro Ambiental Micotoxinas Prof. Dr. Marina B. Martinez- Irma Grivera, USP-SP - Marta Taniwaki ITAL-SP- Leda M. Hagler, UFRJ-RJ - Myrna Sabino Instituto Adolfo Lutz-SP

DiretoriaDiretoriaBiênio 2008-2009

Representantes de ÁreaRepresentantes de ÁreaSBM 2008-2009