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PRISCILA AKEMI MORETTI NAKAMURA
Resistência aos antimicrobianos entre amostras de Streptococcus
agalactiae isoladas de espécimes do trato genitourinário
NITERÓI
2010
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PRISCILA AKEMI MORETTI NAKAMURA
Resistência aos antimicrobianos entre amostras de Streptococcus
agalactiae isoladas de espécimes do trato genitourinário
Dissertação apresentada ao Programa de Pós-
graduação em Microbiologia e Parasitologia
Aplicadas da Universidade Federal Fluminense,
como requisito parcial para obtenção do grau de
Mestre.
Orientadora: Profa. Dra. Rosana Rocha Barros
NITERÓI
2010
PRISCILA AKEMI MORETTI NAKAMURA
Resistência aos antimicrobianos entre amostras de Streptococcus
agalactiae isoladas de espécimes do trato genitourinário
Dissertação apresentada ao Programa de Pós-graduação em
Microbiologia e Parasitologia Aplicadas da Universidade
Federal Fluminense, como requisito parcial para obtenção
do grau de Mestre.
BANCA EXAMINADORA
______________________________________________________________________
Prof. Dr. Aloysio de Mello Figueiredo Cerqueira
UFF
_______________________________________________________________________
Dra. Fabiola Cristina de Oliveira Kegele
FIOCRUZ
_______________________________________________________________________
Profa. Dra. Lenise Arneiro Teixeira
UFF
NITERÓI
2010
AGRADECIMENTOS
À Deus pelo sustento, pelas bênçãos, enfim por mais essa etapa vencida.
Agradeço a Prof. Dra. Rosana Rocha Barros pela atenção, pelos conhecimentos transmitidos e
pela orientação fundamental à realização deste trabalho.
Aos professores do departamento de Microbiologia e Parasitologia, UFF, em especial, ao prof.
Aloysio de Mello F. Cerqueira e aos professores da disciplina de virologia pela disponibilidade de
equipamentos de seus laboratórios.
Às professoras Lúcia M. Teixeira e Regina Maria C.P. Domingues, Instituto de Microbiologia,
UFRJ e a Dra. Fabiola Cristina O. Kegele, Fiocruz, pela doação de insumos utilizados nesse estudo.
À rede de laboratórios NKB pela doação das amostras.
Ao professor Felipe Piedade G. Neves, pela revisão da dissertação.
Agradeço aos meus pais, Yasuyuki Nakamura e Valdiléa Moretti Nakamura, por terem me dado à
oportunidade de completar um curso superior e por me apoiarem em todos os momentos e
decisões.
Aos meus avós pelo carinho, amor e ajuda não apenas durante a pesquisa, mas por toda vida.
Agradeço ao João Ronaldo Hübner, pela ajuda na realização desse trabalho.
À Pro-Reitoria de Pesquisa, Pós-graduação e Inovação, PROPPI/UFF e à Fundação Carlos Chagas
de Amparo à Pesquisa do Estado do Rio de Janeiro, FAPERJ, pelo auxílio financeiro.
LISTA DE ABREVIATURAS
ACOG American College of Obstetricians and Gynecologists
ATCC American Type Culture Collection
CAMP Christie, Atkins, Munch-Peterson
CDC Centers for Disease Control and Prevention
CEP Comitê de Ética em Pesquisa
CLSI Clinical and Laboratory Standards Institute
CMB Instituto Biomédico
CMI Concentração Mínima Inibitória
CO2 dióxido de carbono
DNA ―deoxyribonucleic acid‖
dNTP desoxirribonucleotídeos fosfatados
EGB Estreptococos do grupo B
erm ―erythromycin ribosome methylation‖
E-test
Epsilometer test
f ―forward‖
gyrA gene que codifica as subunidades A e B da DNA girase
I Intermediário
ITU Infecções do Trato Urinário
kDa kiloDaltons
M fenótipo M
Mef “ macrolide efflux”
MgCl2 Cloreto de magnésio
MHA-S Agar Müeller Hinton acrescido de 5% de sangue desfibrinado de carneiro
min minutos
MLSB macrolídeos, lincosamideos e estreptogramina B
MLSBi fenótipo macrolídeos, lincosamideos e estreptogramina B indutivo
MLSBc fenótipo macrolídeos, lincosamideos e estreptogramina B constitutivo
µg micrograma
µL microlitro
mL mililitro
µm micrômetros
µM micromolar
mm milímetros
mM milimolar
P sítio peptil
parC gene que codifica as subunidades A e B da topoisomerase IV
pb pares de bases
PBP ―Penicillin Binding Protein‖
PCR ―Polimerase Chain Reaction‖
pH potencial hidrogeniônico
r ―reverse‖
R Resistente
RAPD ― Randon Amplified Polymorphic DNA‖
RNAt ― ribonucleic acid‖
rpm rotação por minuto
QRDR ― Quinolone Resistance Determining Region‖
S sensível
23S subunidade 23
TBE Tris- borato-EDTA
tet determinante genético de resistência à tetraciclina
TSA-S Agar Trypticase Soy suplementado com 5% de sangue desfibrinado de carneiro
TE Tris- EDTA
U unidades
UFC Unidade Formadoras de Colônias
UFF Universidade Federal Fluminense
UI Unidades Internacionais
UPGMA ―Unweighted Pair Group Method with Arithmetic Mean‖
UV ultra-violeta
V volts
LISTA DE TABELAS
Tabela 1 - Seqüência dos iniciadores para amplificação dos genes ermA, ermB e
mefA/E.------------------------------------------------------------------------------------------------
19
Tabela 2 - Reagentes utilizados na reação de amplificação dos genes de resistência
ermA, ermB e mefA/E.-------------------------------------------------------------------------------
19
Tabela 3 - Parâmetros de amplificação para PCR.---------------------------------------------- 20
Tabela 4 – Reagentes utilizados no RAPD-PCR.------------------------------------------------
21
Tabela 5 – Parâmetros de amplificação para RAPD-PCR.------------------------------------
21
Tabela 6. Total de amostras submetidas aos testes de sensibilidade a antimicrobianos,
através do método de difusão em agar.-----------------------------------------------------------
25
Tabela 7. Informações sobre as 15 amostras de S. agalactiae com resistência plena ou
intermediária à eritromicina pelo teste de difusão em agar.------------------------------------
26
Tabela 8. Distribuição das 15 amostras de S. agalactiae com resistência plena e
intermediária à eritromicina pelo método de difusão em agar, CMI pelo método de
diluição em agar, fenótipos e genes de resistência. --------------------------------------
27
LISTA DE FIGURAS
Figura 1. Ocorrência de resistência aos antimicrobianos entre as amostras isoladas a
partir da urina (30), trato genital masculino (esperma, secreções uretral e de prepúcio -
19) e trato genital feminino (secreções vaginal e cervical - 51).-----------------------------
28
Figura 2. Perfis eletroforéticos de amostras representativas de S. agalactiae resistentes
à eritromicina, obtidos por RAPD-PCR. -------------------------------------------------------
29
Figura 3. Dendrograma obtido após análise computadorizada dos perfis eletroforéticos
das amostras de S. agalactiae resistentes à eritromicina.-------------------------------------
30
Figura 4. Perfis eletroforéticos de amostras representativas de S. agalactiae sensíveis
à eritromicina obtidos por RAPD-PCR.---------------------------------------------------------
31
Figura 5. Dendrograma obtido após análise computadorizada dos perfis eletroforéticos
das amostras de S. agalactiae sensíveis à eritromicina.---------------------------------------
32
Figura 6. Dendrograma obtido após análise computadorizada dos perfis eletroforéticos
das amostras de S. agalactiae resistentes e sensíveis à eritromicina.------------------------
33
RESUMO
Streptococcus agalactiae (estreptococos do grupo B - EGB) é uma das espécies de estreptococos de maior
relevância clínica. Membro da microbiota de mucosas, coloniza os tratos gastrintestinal e genitourinário
humanos, podendo causar infecções em neonatos, gestantes e adultos não grávidos, principalmente entre
indivíduos com idade avançada, imunodebilitados, dentre outros fatores de risco. Infecções urinárias por
EGB compreendem uma das manifestações mais freqüentes, acometendo indivíduos de todas as idades. O
objetivo desse estudo foi avaliar, entre amostras de EGBs isoladas de espécimes do trato genitourinário de
indivíduos não grávidos, o perfil de resistência aos antimicrobianos recomendados para tratamento das
infecções causadas por esta espécie, bem como estudar características genéticas entre amostras que
apresentaram resistência ao antimicrobiano eritromicina. Foram analisadas 100 amostras isoladas a partir
de espécimes do trato genitourinário [secreção vaginal (49), urina (30), esperma (17), outras secreções (4)],
de indivíduos não grávidos (73 do sexo feminino e 27 do sexo masculino, com faixa etária variando de 6 a
79 anos) residentes na área metropolitana do Rio de Janeiro, entre 2008 e 2009. As amostras foram
caracterizadas como cocos Gram positivos, beta-hemolíticas, capazes de hidrolisar o hipurato e em 98% o
fator CAMP foi detectado. As amostras foram submetidas ao teste de susceptibilidade a antimicrobianos,
pelo método de difusão em agar. Todas as amostras foram sensíveis à ceftazidima, penicilina e
vancomicina. Foi observada resistência à levofloxacina em uma amostra, cuja concentração mínima
inibitória (CMI) foi superior a 32 g/mL, através do teste epsilométrico (E-test ). A resistência plena e
intermediária à tetraciclina ocorreu em 83 e 6 amostras respectivamente. A resistência à eritromicina foi
observada em 11 amostras, que apresentaram os fenótipos M (2), MLSB indutivo (4) e MLSB constitutivo
(5), este último conferindo também resistência à clindamicina. Foi ainda observada resistência
intermediária à eritromicina em 4 amostras, com os fenótipos M (1) e MLSBi (3). Todas as amostras que
apresentaram resistência plena ou intermediária à eritromicina foram resistentes, pelo método de difusão
em agar, à tetraciclina e à azitromicina. As amostras resistentes à eritromicina foram submetidas à
determinação da CMI pelo método de diluição em agar, cujos valores variaram entre 0,5 a > 256 g/mL.
Houve discrepância de interpretação entre as duas metodologias utilizadas em três amostras. As amostras
resistentes à eritromicina foram submetidas à pesquisa de determinantes genéticos de resistência. As
amostras com fenótipo M (3) apresentaram o produto de amplificação compatível com o esperado para o
gene mefA/E. O gene ermA foi observado nas amostras com fenótipo MLSBi (5) e MLSBc (4), enquanto o
gene ermB foi encontrado somente em uma amostra, cujo fenótipo foi MLSBi e apresentou
simultaneamente dois genes de resistência (ermA e ermB). Outra amostra de fenótipo MLSBi também
albergou simultaneamente os genes ermA e mefA/E. Uma amostra cujo fenótipo foi MLSBc não gerou
nenhum produto de amplificação após as reações com os iniciadores utilizados. Empregando-se a
metodologia de RAPD-PCR, observou-se diversidade tanto entre amostras resistentes como entre amostras
sensíveis à eritromicina, porém, notou-se a presença de perfis genéticos de significativa similaridade entre
amostras que albergam diferentes determinantes genéticos de resistência, assim como entre amostras
resistentes e sensíveis a este antimicrobiano, indicando que a aquisição destes genes não provocou
alterações no genoma detectáveis pela metodologia utilizada, ou ainda, que estes eventos ocorrem de forma
aleatória na população de amostras circulantes, não sendo capazes, portanto, de determinar a ocorrência de
grupos clonais específicos.
ABSTRACT
Streptococcus agalactiae (group B streptococci - GBS) is one of the major clinical relevant
streptococcal species. Member of the mucosal microflora, it colonizes the human gastrointestinal
and genitourinary tracts and can cause diseases in newborns, pregnant women and non-pregnant
adults, especially among the elderly, immunocompromised and other risk factors. Urinary tract
infections by GBS comprise one of the most frequent clinical manifestations, affecting individuals
of all ages. The aim of this study was to evaluate, among GBS isolates recovered from specimens
of the genitourinary tract of non pregnant individuals, the resistance to antimicrobial agents
recommended for treatment of infections caused by this species and to study the genetic
characteristics of erythromycin resistant isolates. One hundred isolates recovered from
genitourinary tract specimens [vaginal discharge (49), urine (30), sperm (17), other secretions (4)]
of non-pregnant individuals (73 females and 27 males, with ages ranging from 6 to 79 years)
living in the metropolitan area of Rio de Janeiro, between 2008 and 2009 were analyzed. The
isolates were characterized as Gram positive cocci, beta-hemolytic, able to hydrolyze hippurate
and in 98% the CAMP factor was detected. The isolates were submitted to antimicrobial
susceptibility tests by agar diffusion method. All isolates were susceptible to ceftazidime,
penicillin and vancomycin. One isolate was resistant to levofloxacin, with minimum inhibitory
concentration (MIC) higher than 32 µg/mL by E-test . Resistance and intermediary resistance to
tetracycline was found in 83 and 6 isolates respectively. Resistance to erythromycin was observed
in 11 isolates, which showed the M (2), inductive MLSB (4) and constitutive MLSB (5)
phenotypes, the latter also conferring resistance to clindamycin. It was also observed intermediary
resistance to erythromycin in four isolates, with the M (1) iMLSB (3) phenotypes. All samples that
showed full or intermediary resistance to erythromycin were resistant by agar diffusion method to
tetracycline and azithromycin. These isolates were submitted to MIC determination by agar
dilution method, with values ranging from 0.5 to > 256 µg/mL. There was a discrepancy in
methodologies interpretation in three isolates. Isolates resistant to erythromycin were tested for the
most common genetic determinants of resistance. In isolates with M phenotype (3) an amplicon
consistent with that expected for the gene mefA/E was detected. The ermA gene was observed in
isolates with phenotype iMLSB (5) and cMLSB (4), while the ermB gene was found only in one
isolate, with iMLSB phenotype, that presented two resistance genes (ermA and ermB)
simultaneously. Another isolate with iMLSB phenotype also harbored ermA and mefA/E
simultaneously. One isolate with cMLSB phenotype did not generate any amplification product
after PCR with primers used. By RAPD-PCR methodology, it was observed diversity among
erythromycin resistant and susceptible isolates. However, the presence of genetic profiles of
significant similarity among isolates that harbored different determinants of resistance, as well as
among resistant and susceptible isolates, indicates that the acquisition of these genes have not
caused detectable changes in the genome when analyzed by this methodology, or even that these
events occur randomly in the population of circulating strains, therefore, they are not able to
determine the occurrence of specific clonal groups.
SUMÁRIO
1. Introdução ------------------------------------------------------------------------------------ 1
1.1 Histórico ------------------------------------------------------------------------------------ 1
1.2 Características gerais ---------------------------------------------------------------------- 1
1.3 Síndromes clínicas ------------------------------------------------------------------------- 3
1.4 Antibioticoterapia e resistência a antimicrobianos ------------------------------------ 7
2. Objetivos ------------------------------------------------------------------------------------- 14
3. Material e Métodos ------------------------------------------------------------------------- 15
3.1) Amostras bacterianas --------------------------------------------------------------------- 15
3.2) Caracterização fisiológica --------------------------------------------------------------- 15
3.2.1) Observação das características morfológicas e hemólise ---------------- 15
3.2.2) Observação do fator CAMP-------------------------------------------------- 15
3.2.3) Teste de Hidrólise do Hipurato ---------------------------------------------- 16
3.3) Caracterização sorológica --------------------------------------------------------------- 16
3.4) Teste de susceptibilidade a antimicrobianos ------------------------------------------ 16
3.4.1) Método de difusão em agar -------------------------------------------------- 16
3.4.2) Determinação da Concentração Mínima Inibitória (CMI) --------------- 17
A) Diluição em agar ----------------------------------------------------------
B) Teste Epsilométrico (E test ) --------------------------------------------
17
18
3.5) Ensaios envolvendo realização de Reação em Cadeia de Polimerase (PCR) ------ 18
3.5.1) Obtenção de DNA ------------------------------------------------------------ 18
3.5.2) Detecção de determinantes genéticos de resistência a macrolídeos --- 18
3.5.3) Análise do polimorfismo do DNA através de PCR com amplificação
randômica do DNA (RAPD-PCR) --------------------------------------------------
20
3.5.4) Análise dos perfis eletroforéticos obtidos a partir de RAPD-PCR----- 21
4. Resultados ------------------------------------------------------------------------------------ 22
5. Discussão ------------------------------------------------------------------------------------- 34
6. Conclusão ------------------------------------------------------------------------------------ 38
7. Referências Bibliográficas ----------------------------------------------------------------- 39
1
1. INTRODUÇÃO
1.1 Histórico
Streptococcus agalactiae ou Estreptococos do grupo B (EGB) foi inicialmente descrito
por Nocard & Mollereau, em 1889, isolado de mastite bovina, com a designação de
―Streptococcus nocardi‖ e posteriormente renomeado Streptococcus agalactiae (apud KEEFE,
1997). A partir da década de 1930, esses microrganismos foram reconhecidos tanto como
integrantes da microbiota anfibiôntica de humanos, como agentes etiológicos de infecções pós-
parto, assim como infecções em adultos não grávidos, especialmente aqueles de idade avançada.
A partir da década de 1960, observou-se o envolvimento desta espécie em infecções sistêmicas
em neonatos e, na década seguinte, o EGB emergiu como o principal agente de infecção neonatal
(apud SCHUCHAT & WENGER, 1994; apud EDWARD & BAKER, 2005).
1.2 Características gerais
O gênero Streptococcus é formado por cocos Gram positivos, que se dispõem em cadeias
ou aos pares quando cultivados em meios líquidos. São anaeróbios facultativos e algumas
espécies necessitam de dióxido de carbono (CO2 – crescimento capnofílico) para o seu
desenvolvimento. Ao fermentarem a glicose, produzem predominantemente o ácido láctico,
sendo denominados homofermentadores. São oxidase e catalase negativos. Geralmente
necessitam de meios enriquecidos com sangue ou soro para o seu isolamento. Quando cultivados
em meio sólido contendo sangue, são observados os seguintes padrões de atividade hemolítica:
hemólise alfa ( ), caracterizada por uma zona esverdeada ao redor das colônias, resultado da lise
incompleta das hemácias (hemólise parcial) e hemólise beta ( caracterizada por uma zona clara
e/ou transparente ao redor das colônias devido à lise completa das hemácias (hemólise total). As
espécies que não são capazes de promover um dos tipos de hemólise são conhecidas como não
hemolíticas (KONEMAN et al, 2001; MURRAY, ROSENTHAL & PFALLER, 2006).
Os constituintes da parede celular de EGB são basicamente peptideoglicana, ácidos
teicóicos, glicoproteínas e proteínas antigênicas de superfície. Essas bactérias tanto podem fazer
parte da microbiota de seres humanos e animais, colonizando principalmente as mucosas dos
2
tratos genitourinário e gastrointestinal, quanto serem patógenos destes hospedeiros (KONEMAN
et al, 2001; MURRAY, ROSENTHAL & PFALLER, 2006).
Rebecca Lancefield, em 1933, desenvolveu o sistema sorológico para diferenciação de
amostras -hemolíticas. Os antígenos detectados por este sistema são polissacarídeos grupo-
específicos presentes na parede celular. Através deste sistema, as amostras -hemolíticas dos
grupos A, B, C, F e G são rapidamente identificadas na rotina do laboratório clínico. Na espécie
Streptococcus agalactiae, encontra-se o antígeno do grupo B, composto por ramnose, N-
acetilglicosamina e galactose (KONEMAN et al, 2001; MURRAY, ROSENTHAL & PFALLER,
2006).
Micromorfologicamente, os EGB apresentam-se como células esféricas ou ovóides, com
0,6 a 1,2 micrômetros (µm) de diâmetro que formam pares ou cadeias de tamanhos variados.
Macromorfologicamente, possuem colônias com dimensões de três a quatro milímetros (mm),
superfície plana, coloração amarelada e/ou acizentada. São exigentes em termos nutricionais e
possuem temperatura ótima de crescimento de aproximadamente 35oC. Ressalta-se ainda que
esses microrganismos são em sua maioria hemolíticos, porém, podem ser -hemolíticos ou
menos freqüentemente, não hemolíticos (MURRAY, ROSENTHAL & PFALLER, 2006;
JAWETZ, MELNICK & ADELBERG, 2009).
Morfologia colonial, padrões de hemólise em ágar-sangue, composição antigênica grupo-
específica da parede celular e testes fisiológicos como resistência à bacitracina e capacidade de
hidrolisar o hipurato de sódio, são combinações úteis na identificação dos EGBs, sendo este
último teste amplamente utilizado na identificação presuntiva desses microrganismos
(KONEMAN et al, 2001). Outro teste presuntivo tradicionalmente empregado na identificação
dos EGBs é a produção do fator CAMP, denominado por Christie, Atkins, Munch-Peterson, em
1944. Os EGBs possuem uma proteína extracelular termoestável de 23,5 kiloDaltons (kDa) com
capacidade de difusão, denominada de fator CAMP, que intensifica a capacidade hemolítica de
algumas amostras de Staphylococcus aureus (amostras produtoras de uma esfingomielinase C,
que apresenta propriedade de se ligar à membrana dos eritrócitos). Quando amostras de S. aureus
produtoras de lisina e S. agalactiae são inoculados perpendicularmente sobre a superfície do
agar-sangue, ocorre um sinergismo de hemólise, tipicamente com formato de ponta de seta
(KEEFE, 1997; KONEMAN et al, 2001; HENSLER et al, 2008). Além de seu papel na
identificação presuntiva, o fator CAMP tem sido apontado como um importante fator de
3
virulência da espécie, uma vez que promove poros em hemácias e é capaz de se ligar às
imunoglobulinas G e M via fração Fc. (SKALKA & SMOLA, 1981; JURGENS, STERZIK &
FEHRENBACH, 1987; DORAN & NIZET, 2004).
Outro componente celular é a cápsula, de natureza polissacarídica. Esta tem sido
considerada um fator de virulência essencial em S. agalactiae, já que inibe a fagocitose e a
ativação do complemento na ausência de anticorpos específicos. São descritos nove sorotipos de
polissacarídios capsulares (Ia, Ib, II a VIII), além de um décimo sorotipo (IX), recentemente
relatado (DOGAN et al, 2005; KARUNAKARAN et al, 2009). A cápsula é constituída por
galactose e glicose, combinados com 2-acetoamino-2-deoxiglicose, ramnose ou N-
acetilglicosamina e com a porção terminal formada por ácido siálico (KILLIAN, 1998). Foi
demonstrado que o ácido siálico, presente na porção terminal desses polissacarídeos, é essencial
para a maior patogenicidade de alguns sorotipos, entre eles o sorotipo III, classicamente
associado às infecções neonatais causadas por EGB (KONEMAN et al, 2001; MURRAY,
ROSENTHAL & PFALLER, 2006).
O conhecimento dos sorotipos é de extrema importância para a epidemiologia da doença,
desenvolvimento de vacinas, além de estarem associados à resistência bacteriana aos
antimicrobianos. É de conhecimento que mulheres grávidas, neonatos e adultos não grávidos são
comumente infectados pelos sorotipos Ia, III e V, este último emergindo como a principal causa
de enfermidade em adultos não grávidos, bem como está relacionado à resistência à eritromicina
(SAVOIA et al, 2008; KARUNAKARAN et al, 2009). Estes mesmos sorotipos são considerados
os principais causadores de infecções do trato urinário (ITU), enquanto que os sorotipos Ib, II e
IV são menos comumente associados à ITU em adultos (SAVOIA et al, 2008;
KARUNAKARAN et al, 2009; ULETT et al, 2009)
1.3 Síndromes clínicas
Os EGBs são normalmente isolados de amostras oriundas do reto, área perianal, uretra,
cérvice e vagina. A taxa de colonização é em média entre 20 a 35% em adultos não grávidos. Os
sítios anatômicos com menor freqüência de colonização incluem pele e faringe. Provavelmente a
aquisição desta bactéria no trato genitourinário é causada por contato íntimo, uma vez que a
prevalência é maior em pessoas sexualmente ativas (SCHUCHAT & WENGER, 1994; SENDI,
JOHANSSON & NORRBY-TEGLUND, 2008). O papel da atividade sexual tem sido
4
demonstrado em alguns estudos como de Franciosi e colaboradores, em 1973 (apud SHUCHAT
& WENGER, 1994), que observaram que parceiros de mulheres carreadoras de EGBs também
carreavam o microrganismo, inclusive de mesmo sorotipo capsular. A colonização por EGBs no
trato urinário em mulheres pode sobrevir através da ascensão dos EGBs a partir da vagina, sendo
provavelmente o caminho para a maioria das bacteriúrias assintomáticas (ULETT et al, 2009).
Esses microrganismos estão associados às infecções em neonatos, mulheres grávidas e
adultos não grávidos, estes, em especial, com condições debilitantes, tais como imunossupressão,
idade avançada, diabetes, entre outras. As portas de entrada para o microrganismo são: pele e
tecidos moles, ossos e articulações, tratos urinário, respiratório e gastrointestinal. A integridade e
funcionalidade da mucosa e da pele representam a primeira linha de defesa do hospedeiro.
Alterações nessas barreiras permitem o escape do patógeno, ocasionando doença invasiva.
Manifestações clínicas em adultos não grávidos incluem infecções do trato urinário (ITU), da
pele e tecidos moles, de ossos e articulações, bacteremia primária, pneumonia, urosepse,
peritonite, meningite, endocardite, além de miosite e síndrome do choque tóxico (HO et al, 2006;
SENDI, JOHANSSON & NORRBY-TEGLUND, 2008).
Apesar de estarem associados às doenças em adultos, os EGBs são tradicionalmente
considerados um patógeno de neonatos. Existem duas formas distintas de síndromes clínicas
ocasionadas por EGBs em neonatos, que incluem a síndrome precoce, onde a infecção ocorre nos
primeiros dias de vida, e a síndrome de ocorrência tardia, cuja infecção ocorre em crianças com
uma semana de vida até três meses de idade (DORAN & NIZET, 2004; BEITUNE, DUARTE &
MAFFEI, 2005).
Na síndrome precoce, o neonato pode infectar-se ainda na vida intrauterina, devido à
aspiração do líquido amniótico contaminado ou no momento do parto, por transmissão vertical
quando o paciente entra em contato com o trato genital materno colonizado por EGB. O primeiro
sintoma é, em sua maioria, a dificuldade respiratória nas primeiras 24 horas de vida. Outros
sintomas incluem: cianose e apnéia, pneumonia por aspiração, celulite, osteomielite, artrite
séptica, choque, septicemia e meningite (DORAN & NIZET, 2004; POGERE et al, 2005).
Na síndrome tardia, a contaminação pode ocorrer durante a passagem do neonato pelo
canal vaginal, por ingestão de leite materno, pelo contato íntimo com a mãe nos primeiros dias de
vida ou ainda por transmissão horizontal, por meio de fontes nosocomiais. Inicialmente, a criança
desenvolve febre, letargia, irritabilidade, dificuldade de se alimentar e taquipnéia, e comumente
5
evolui para meningite, podendo desenvolver seqüelas neurológicas permanentes, como paralisia
cerebral, retardo mental e surdez (DORAN & NIZET, 2004; POGERE et al, 2005).
Em gestantes, S. agalactiae está associado a doenças que variam desde infecção urinária
branda até quadros invasivos graves. A doença invasiva em gestantes e em mulheres após o parto
é identificada quando S. agalactiae é isolado de sítios estéreis, como sangue e líquido
cefalorraquidiano. A maior parte das infecções invasivas são sanguíneas, mas quadros de
osteomielite, endocardite e meningite já foram descritos (SCHUCHAT, 1998).
As síndromes não invasivas associadas ao S. agalactiae durante a gravidez e o período
após o parto incluem, em adição à infecção no trato urinário, geralmente bacteriúria
assintomática, quadros de infecções intra-amnióticas (corioamnionite), endometrites, infecções de
feridas cirúrgicas (pós-cesariana e outros), celulite e fascite. Os EGBs são isolados do trato
genital de cerca de 25% das mulheres. Sendo assim, estes microrganismos podem disseminar-se
para sítios adjacentes e então isolados a partir de outros espécimes, como as superfícies
placentárias, mesmo sem estarem associados à etiologia de algumas patologias (SCHUCHAT,
1998; BEITUNE, DUARTE & MAFFEI, 2005).
De acordo com recomendações do CDC - Centers for Disease Control and Prevention - e
do ACOG - American College of Obstetricians and Gynecologists - vários países vêm adotando
medidas profiláticas para a prevenção da infecção neonatal por EGB em gestantes que
apresentam fatores de risco para o desenvolvimento da doença neonatal ou que tenham sido
submetidas à pesquisa de EGB durante as 35a - 37
a semanas de gestação, com isolamento do
microrganismo. A medida mais eficaz consiste na administração, durante o trabalho de parto, de
penicilina, ou outros agentes, como cefazolina, clindamicina, eritromicina ou vancomicina, de
acordo com a sensibilidade da parturiente à penicilina G e com o perfil de susceptibilidade a
antimicrobianos das amostras de EGB isoladas nestas mulheres (SCHRAG et al, 2002; APGAR
et al, 2005). Tais medidas têm contribuído para uma redução significativa da ocorrência destas
infecções nos diferentes locais aonde foram implantadas (ISAACS & ROYLE, 1999; SCHRAG
et al, 2000).
As informações coletadas para estudos epidemiológicos sobre as infecções por EGBs
incluem idade, gênero, possível sítio de infecção, existência de condições debilitantes e
microrganismos isolados no caso de culturas polimicrobianas (KARUNAKARAN et al, 2009).
Em um estudo realizado nos EUA que abrangeu 10 estados, no período de 1990 a 2007,
6
observou-se 19.512 casos de doença invasiva por esta espécie em adultos não-grávidos, com
aumento significativo da incidência ao longo dos anos. Em 1990, a incidência foi de 3,6
casos/100.000 habitantes, enquanto que em 2007, a incidência foi de 7,3 casos/100.000 habitantes
(SKOFF et al, 2009). Neste mesmo estudo, os autores observaram, como principais fatores
associados, idade avançada e ocorrência de diabetes.
A evolução de casos de doença invasiva e bacteremia entre pacientes idosos pode estar
associada ao aumento de condições clínicas crônicas. Cerca de 17-30% dos casos de infecção por
EGBs ocorrem num período superior a 48 horas após internação hospitalar, provavelmente
devido a exposição a técnicas de instrumentação. O risco de morte do paciente por infecção
invasiva aumenta proporcionalmente ao avanço de sua idade. Para indivíduos acima de 84 anos,
os casos excedem a 30 por 100.000 admissões. Porém, quando comparado a infecções associadas
a Streptococcus pneumoniae, a incidência é menor (25,4 e 42,2 casos/ 100.000 admissões,
respectivamente) (EDWARDS & BAKER, 2005; HO et al, 2006; SENDI, JOHANSSON &
NORRBY-TEGLUND, 2008).
As ITU são caracterizadas pelo desenvolvimento de microrganismos nas vias urinárias,
que percorrem o trajeto da uretra até a bexiga (cistite) (VALLADA, 1995; HARRISON, 2002). A
pielonefrite bacteriana precedida freqüentemente por infecção da bexiga, deve-se à ascensão dos
microrganismos para os rins e seus sistemas coletores (LENZ, 1994; ROBBINS et al, 1996;
HARRISON, 2002). É de conhecimento que o S. agalactiae causa cistite e pielonefrite em
gestantes, bem como em homens, mulheres não grávidas e crianças. A pielonefrite e abscesso
renal são ainda possíveis complicações da disseminação hematogênica do S. agalactiae,
caracterizando a urosepse (KONEMAN et al, 2001).
Diversos estudos têm reconhecido os EGBs como causa de ITU em adultos (PERSSON et
al, 1988; MUÑOZ et al, 1992). EGB é a segunda causa mais comum de infecção urinária entre
membros da família Streptococacceae em adultos não grávidos, depois dos enterococos
(GIRGITZOVA, MINKOV & ZOZIKOV, 1991). Estes autores correlacionaram o isolamento de
EGB em amostras de urina com a sintomatologia apresentada pelo paciente. Foram analisados 54
pacientes sintomáticos (com sinais clínicos de infecção urinária de causa bacteriana
desconhecida, incluindo disúria, febre, dores em baixo ventre, leucocitúria e leucocitose).
Diabéticos, mulheres com vaginite crônica e homens com uretrites não responsivas, além de
pacientes imunossuprimidos também foram incluídos na pesquisa. O EGB foi isolado em 32
7
amostras (59,2%), sete oriundas de homens e 25 de mulheres acima de 14 anos. Destes, 15,6%
eram diabéticos, 31,2% tinham ITU pós operatória e 53,2% tinham ITU primária, sendo que
destes 64,7% apresentavam cistites. Infecções urinárias recorrentes foram observadas em 28,1%
do total dos isolados. Além disso, houve isolamento de EGBs em quatro amostras uretrais e 11
amostras vaginais. EGB foi ainda isolado nas fezes de 90,9% das pacientes que apresentavam
colonização vaginal.
Os EGBs são comumente isolados em amostras urinárias comunitárias de idosos,
associados, em ambos os sexos, a doenças de base, como diabetes, cirrose hepática e
insuficiência renal crônica, além de anomalias no trato urinário que incluem cálculos e hipertrofia
prostática (HERNÁIZ et al, 2004; EDWARDS & BAKER, 2005). Hernáiz e colaboradores
(2004) relatam que a cistite não complicada é o diagnóstico mais encontrado nos casos de ITU
por EGB em adultos não grávidos, seguida da bacteriúria assintomática .
Em um estudo populacional conduzido por Ulett e colaboradores (2009), observou-se
1,1% (387/34.367) de urinoculturas positivas para EGBs. Deste total, 89,4% foram obtidas por
micção espontânea e 10,6% foram oriundas de pacientes cateterizados. A maioria das culturas
positivas foi obtida de mulheres (83,2%). Quanto à origem, foram obtidas de pacientes da
comunidade (52,4%), seguido por mulheres em cuidados obstétricos (21,0%), hospitalizados
(18,8%) e pacientes em emergências (7,8%). O diagnóstico de ITU por EGB foi definido a partir
dos achados de bacteriúria (>107
UFC/L) associada ao isolamento do microrganismo em cultura
pura, além de pelo menos um sintoma clínico de ITU. O isolamento de EGB em cultura pura
ocorreu em 207 amostras de urina e destas, 62 apresentavam contagem compatível com
bacteriúria. Associando-se os achados microbiológicos e clínicos, foi possível observar que 50 e
12 pacientes apresentavam quadros de cistite e pielonefrite, respectivamente. Nenhum dos 62
pacientes estava em uso de cateter urinário e um paciente apresentou concomitantemente EGB no
sangue, indicando a ocorrência de urosepse.
1.4 Antibioticoterapia e resistência a antimicrobianos
No que tange ao tratamento das infecções causadas por estreptococos β-hemolíticos, a
droga de escolha é a penicilina, devido à contínua susceptibilidade destes microrganismos ao
antimicrobiano (CULEBRAS et al, 2002; DOGAN et al, 2005; GONZALEZ et al, 2005; SENDI,
JOHANSSON & NORRBY-TEGLUND, 2008; PINHEIRO et al, 2009). O mecanismo de ação
8
deste β-lactâmico consiste na ligação covalente do antimicrobiano a proteínas, estas denominadas
de proteínas fixadoras de penicilinas (PBP, do inglês, Penicillin Binding Protein), ancoradas na
membrana citoplasmática. Essas proteínas participam ativamente da síntese da peptidioglicana,
atuando como transglicosidases, transpeptidases e carboxipeptidases, durante a formação da
parede celular. Quando a penicilina se liga às PBPs, bloqueiam a formação da parede celular e
estimulam a produção bacteriana de autolisinas, promovendo assim a lise da célula bacteriana
(SILVA, 1999; CHAMBERS, 2000). Os β-lactâmicos são antimicrobianos que apresentam baixa
toxicidade e baixo custo. Podem causar, entre outros efeitos adversos, granulopenia e diarréias.
Contudo, o efeito colateral mais grave associado aos β-lactâmicos é a alergia. Este efeito deve-se
aos produtos de degradação do antimicrobiano (como o ácido penicilóico) que ao se combinarem
com as proteínas do paciente, sensibilizam o sistema imune (SILVA, 1999).
Na profilaxia intra-parto, recomenda-se alternativamente cefalosporinas para pacientes
alérgicas e com baixo risco de reações anafiláticas (CDC, 2002; CHOHAN et al, 2006; CLSI,
2009). Pacientes com alto risco de reação anafilática devem ser tratadas com macrolídeos, como
a eritromicina e lincosamídeos, como a clindamicina (DE MOUY et al, 2001; CHOHAN et al,
2006; PINHEIRO et al, 2009). Devido à emergência da resistência a estes dois últimos
antimicrobianos, observada em diversos estudos, não é recomendada, em pacientes alérgicos e
com risco de anafilaxia, a utilização destes antimicrobianos sem a prévia realização do teste de
susceptibilidade (CDC, 2002; HEELAN, HASENBEIN & MCADAM, 2004; MARTÍNEZ et al,
2004; BORGER et al, 2005; GONZALEZ et al, 2005; GHERARDI et al, 2007). Na ocorrência de
resistência a estes antimicrobianos, recomenda-se a vancomicina (CDC, 2002; CHOHAN et al,
2006; MURRAY, ROSENTHAL & PFALLER, 2006).
As cefalosporinas também são representantes da classe de antimicrobianos β-lactâmicos,
apresentando similaridades à penicilina em relação à estrutura e modo de ação, porém possuem
maior espectro antibacteriano, são resistentes a muitas β-lactamases (enzimas que hidrolisam o
anel β-lactâmico) e possuem melhores propriedades farmacológicas. Estes antimicrobianos são
derivados do ácido 7-aminocefalosporânico (fusão do anel β-lactâmico com o anel diidrotiazina
de seis átomos de carbono, ao invés do anel de tiazolina de cinco átomos de carbono,
característico das penicilinas). São classificadas em quatro grupos e/ou gerações de acordo com o
espectro de ação (SILVA, 1999; MURRAY, ROSENTHAL & PFALLER, 2006). Não há relatos
9
de resistência à cefalosporinas entre os EGBs (MOTLOVÁ et al, 2004; MARTÍNEZ et al, 2004;
BORGER et al, 2005).
A vancomicina é um glicopeptídeo que interrompe a síntese do peptideoglicano da parede
celular bacteriana. Este antimicrobiano interage com o dipeptídeo terminal D-Ala-D-Ala das
cadeias laterais dos pentapeptídeos, interferindo estericamente na formação das ligações cruzadas
entre as cadeias de peptideoglicano (SILVA, 1999; MURRAY, ROSENTHAL & PFALLER,
2006). Apesar da resistência intrínseca ou adquirida à vancomicina, observada entre enterococos
e outros gêneros da família Streptococacceae, esta nunca foi relatada em EGBs, e assim mantêm-
se efetiva para tratamento de infecções causadas por estes microrganismos (UTTLEY et al, 1989;
HEELAN, HASENBEIN & MCADAM, 2004; BORGER et al, 2005; GONZALEZ et al, 2005;
KARUNAKARAN et al, 2009).
A eritromicina é um antimicrobiano pertencente à classe dos macrolídeos. É constituída
por um anel macrocíclico de lactona, contendo 14 átomos de carbono, ligado a duas porções de
açúcar (cladinose e desosamina). Nesta classe encontram-se outros representantes que diferem no
número de átomos de carbonos no anel lactona (15 ou 16), como a azitromicina, josamicina, entre
outros (STEIGBIGEL, 1991; MURRAY, ROSENTHAL & PFALLER, 2006).
A lincomicina e seu derivado mais potente, a clindamicina, pertencem à outra classe de
antibiótico, os lincosamídeos, os quais possuem propriedades semelhantes quanto aos
mecanismos de ação, atividade antimicrobiana e farmacologia clínica (STEIGBIGEL, 1991;
MURRAY, ROSENTHAL & PFALLER, 2006).
Tanto os macrolídeos quanto os lincosamídeos atuam sobre a subunidade 50S, impedindo
a síntese protéica. O primeiro se liga ao ribossomo impedindo sua translocação, logo não
permitindo que o RNAt descarregado abandone o sítio peptil (P), enquanto o segundo, inibe a
peptidiltranferase bacteriana e assim impedindo a união dos aminoácidos (SILVA, 1999;
MURRAY, ROSENTHAL & PFALLER, 2006).
A resistência aos macrolídeos e lincosamídeos entre EGB tem sido relatada por diversos
autores e tem, como principal conseqüência, a não utilização destas drogas, consideradas as
principais alternativas de tratamento para pacientes sensíveis à penicilina. Os principais
mecanismos de resistência aos macrolídeos pelos EGBs são mediados por dois determinantes
genéticos:
10
erm (erythromycin ribosome methylation) – envolvendo principalmente os genes ermA e
ermB. O gene ermB está presente no cromossomo dos EGBs dentro de um transposon.
Codifica uma metiltransferase, que na presença de eritromicina, induz uma modificação
ribossômica, ao adicionar dois radicais metil a um sítio no RNAr 23S próximo a região
ligante aos macrolídeos, assim alterando a conformação e reduzindo a afinidade aos
macrolídeos, lincosamideos e estreptogramina B (MLSB). A resistência pode ser induzida
(MLSBi) ou constitutiva (MLSBc). A resistência tanto à clindamicina quanto à
eritromicina caracteriza o fenótipo MLSBc, indicando produção contínua da enzima
metilase. A resistência à eritromicina e a diminuição da susceptibilidade à clindamicina,
com achatamento do halo de inibição do crescimento bacteriano ao redor do disco de
clindamicina na região próxima ao disco de eritromicina, é caracterizada pelo fenótipo
MLSBi, devido à produção de metilase apenas na presença de eritromicina (SUTCLIFFE,
TAIT-KAMRADT & WONDROCK, 1996).
mef (macrolide efflux) – Possui como principais variantes mefE e mefA, as quais foram
originalmente descritos em S. pneumoniae e Streptococcus pyogenes, respectivamente.
Estudos posteriores mostraram que devido à alta homologia, estes podem ser
considerados um único gene, mefA/E. Codifica uma proteína hidrofóbica ligada à
membrana, que promove uma bomba de efluxo, que retira a droga ativamente do
microrganismo. Este mecanismo caracteriza o fenótipo M, que confere resistência a
macrolídeos de 14 ou 15 átomos de carbono, mas não aos macrolídeos de 16 átomos de
carbono, aos lincosamídeos e às estreptograminas (SUTCLIFFE, TAIT-KAMRADT &
WONDROCK, 1996).
Além da resistência aos macrolídeos e liconsamídeos, o EGB desenvolveu resistência a
outras classes de antimicrobianos, tais como as tetraciclinas e fluoroquinolonas. A resistência à
tetraciclina é bastante disseminada em diversas espécies bacterianas e seus determinantes
genéticos são freqüentemente encontrados em elementos móveis como plasmídeos ou
transposons, muitas vezes associados aos determinantes de resistência aos macrolídeos
(CHOPRA & ROBERTS, 2001; CULEBRAS et al, 2002). A tetraciclina age por formar um
complexo com os íons de magnésio (Mg2+
), que no interior celular, se une a radicais fosfato da
subunidade 30S dos ribossomos, diminuem a afinidade do aminoacil-RNAt no sitio A do
ribossomo e assim impedindo o alongamento da cadeia péptica em formação (SILVA, 1999;
11
CHOPRA & ROBERTS, 2001). Os mecanismos de resistência à tetraciclina são o efluxo da
droga mediado pela expressão de bombas de efluxo que se localizam na membrana e a
modificação do sítio alvo devido à proteção enzimática do ribossomo. São descritos diversos
determinantes genéticos de resistência à tetraciclina, conhecidos como genes tet. Os principais,
entre EGB, são os genes tetK e tetL, que codificam proteínas que participam da bomba de efluxo
e tetM e tetO, que codificam proteínas que conferem proteção ribossomal a este antimicrobiano
(CHOPRA & ROBERTS, 2001; CULEBRAS et al, 2002).
As fluoroquinolonas são agentes quimioterápicos sintéticos derivados do ácido nalidíxico. O
mecanismo de ação consiste na inibição da DNA girase e da topoisomerase IV bacterianas,
enzimas necessárias para a duplicação, recombinação e reparo do DNA. A DNA girase é formada
por duas subunidades α e duas subunidades β, com as quinolonas se ligando à subunidades α. O
principal mecanismo de resistência a estes antimicrobianos ocorre devido a mutações pontuais
nos genes gyrA e parC, em suas regiões internas denominadas regiões determinantes de
resistência à quinolonas (QRDR, do inglês, quinolone resistance-determining region). Outro
mecanismo observado é a diminuição da captação do fármaco. A diminuição da captação decorre
de alterações das proteínas porinas existentes na superfície bacteriana (PIDDOCK, 1999;
MURRAY, ROSENTHAL & PFALLER, 2006).
Dados mundiais sobre o perfil de susceptibilidade a antimicrobianos indicam que o EGB é
sensível a drogas, como -lactâmicos e vancomicina, enquanto que resistência a macrolídeos,
lincosamídeos, tetraciclina e fluoroquinolonas vem ocorrendo em diferentes regiões geográficas.
Gonzalez e colaboradores (2005), na Espanha, observaram 12,4% e 11,8% de resistência à
eritromicina e à clindamicina, respectivamente. Motlová e colaboradores (2004), na República
Tcheca, observaram taxa de resistência à eritromicina e à clindamicina de aproximadamente
3,0%, enquanto Chohan e colaboradores (2006), nos EUA, observaram 10,0% de resistência a
ambos antimicrobianos. Em um estudo realizado na Grécia, onde analisou-se amostras de EGB
isoladas de diferentes infecções em adultos não grávidos, observou-se susceptibilidade à
penicilina, cefotaxima e vancomicina, enquanto que 44,0% e 14,2% apresentaram-se como não
susceptíveis à eritromicina e à clindamicina, respectivamente (FALAGAS et al, 2006). Nos EUA,
o estudo realizado por Ulett e colaboradores (2009) em amostras urinárias de pacientes adultos
demonstrou resistência de 39,5% à eritromicina e 26,4% à clindamicina. Já Karunakaran e
12
colaboradores (2009) na Malásia, analisando amostras oriundas de pacientes adultos de vários
sítios de infecção, encontraram 2,3% de resistência à eritromicina e 2,4% à clindamicina.
De fevereiro a dezembro de 2002, no Japão, Kawamura e colaboradores (2003) isolaram três
amostras de EGB resistentes a levofloxacina, um de neonato e dois idosos com condições
debilitantes. Na Espanha, Miró e colaboradores (2006), observaram 1,2% de resistência à
levofloxacina entre 172 amostras provenientes de diferentes sítios anatômicos, oriundas de
homens de idade avançada portadores de sonda urinária. A mesma incidência de resistência foi
observada por Wu e colaboradores (2008), em Taiwan, no qual em um total de 1.994 amostras
clínicas de EGBs coletadas entre 1993 a 2006, foram isoladas 26 amostras (1,3%) resistentes à
levofloxacina. Neste estudo, observou-se que após o surgimento da primeira amostra resistente à
fluoroquinolona, isolada em 2004, a incidência anual aumentou gradativamente, de 0,3% em
2004 para 3,8% em 2005 e 5,0% em 2006.
A resistência à tetraciclina é extremamente disseminada na espécie, com relatos de estudos
realizados em diferentes regiões, nos quais a incidência excede 80,0%. Betriu e colaboradores
(2004), na Espanha, encontraram taxa de resistência a este antimicrobiano de 89,8%. Heelan e
colaboradores (2004), nos EUA, observaram susceptibilidade em apenas 15,0% das amostras
estudadas. Savoia e colaboradores (2008), na Itália, relataram 78,1% de resistência a este
antimicrobiano.
Dados referentes a estudos realizados no Brasil são condizentes com os da literatura
internacional, demonstrando, em conjunto, a sensibilidade à penicilina, a alta resistência à
tetraciclina e a resistência variável à eritromicina e clindamicina. D'Oliveira e colaboradores em
2003(a), relataram 87,0% de resistência à tetraciclina, 5,4% à eritromicina e 1,1% à clindamicina
entre 92 amostras isoladas de pacientes residentes do Rio de Janeiro, sem distinção de
manifestação clínica, gênero, idade e ocorrência de gravidez. Na mesma região, Duarte e
colaboradores em 2005(a) observaram que em um total de 151 amostras isoladas de diferentes
sítios anatômicos humanos, todas foram resistentes à tetraciclina, bem como 4,6% destas também
foram resistentes à eritromicina. Em outro estudo realizado no Rio de Janeiro, Borger e
colaboradores (2005), analisaram amostras isoladas de gestantes no período de 2003 a 2004 e
relataram susceptibilidade à cefotaxima, cloranfenicol, meropenem, ofloxacina, penicilina e
vancomicina, além das taxas de resistência de 9,4% à eritromicina e de 6,2% à clindamicina.
13
Devido à freqüência relevante de infecções por EGB e a ocorrência de resistência a
antimicrobianos utilizados no tratamento destas infecções se faz necessário o contínuo
monitoramento do perfil de resistência destes microrganismos em diferentes regiões geográficas,
visando à obtenção de dados que contribuam para uma melhor definição de estratégias de
controle e prevenção de infecções. Dados brasileiros são relativamente limitados e
desatualizados. Desta forma, este estudo tem como objetivo determinar o perfil de resistência dos
EGBs aos antimicrobianos visando às seguintes estratégias.
14
2. OBJETIVOS
2.1) Objetivo Geral
Avaliar, entre amostras de S. agalactiae isoladas de espécimes do trato genitourinário de
indivíduos não grávidos, o perfil de resistência aos antimicrobianos recomendados para
tratamento das infecções causadas por esta espécie, bem como estudar características genéticas
entre amostras que apresentaram resistência ao antimicrobiano eritromicina.
2.2) Objetivos Específicos
2.2.1) Avaliar a performance dos testes fisiológicos tradicionalmente utilizados na identificação da
espécie;
2.2.2) Determinar o perfil de resistência de amostras de S. agalactiae frente aos antimicrobianos
através do método de difusão em agar;
2.2.2) Determinar a Concentração Mínima Inibitória (CMI) de eritromicina e de levofloxacina
entre amostras que se apresentaram resistentes ou intermediárias a estes antimicrobianos, pelo
método de diluição em agar e pelo E-test, respectivamente;
2.2.3) Investigar a presença de determinantes genéticos de resistência aos macrolídeos através de
PCR;
2.2.4) Avaliar a diversidade genética entre amostras resistentes e sensíveis à eritromicina
utilizando-se a metodologia de amplificação randômica do DNA (RAPD-PCR).
15
3. MATERIAIS E MÉTODOS
3.1) Amostras bacterianas
Foram estudadas 100 amostras de S. agalactiae isoladas de espécimes do trato
genitourinário, provenientes de uma rede de laboratórios clínicos que atende a região
metropolitana do Rio de Janeiro, no período de fevereiro de 2008 a outubro de 2009. As amostras
são provenientes de indivíduos não grávidos, sendo 73 do sexo feminino e 27 do sexo masculino,
com faixa etária variando de 6 a 79 anos. O isolamento bacteriano foi realizado a partir dos
seguintes espécimes: secreção vaginal (49), urina (30), esperma (17), secreções da cérvice (2),
secreção uretral (1) e secreção de prepúcio (1). Tais amostras pertencem à coleção de cultura do
Laboratório de Cocos Gram-positivos do Depto Microbiologia e Parasitologia, CMB, UFF, e
foram estocadas em leite desnatado a 10% (Nestlé, São Paulo, SP) adicionado de glicerol a 10%
(Reagen, Rio de Janeiro, RJ) a – 20ºC. Este estudo faz parte de um projeto submetido ao CEP
desta Universidade, sob número do protocolo CAAE 0172.0.258.000-08.
3.2) Caracterização fisiológica
3.2.1) Observação das características morfológicas e hemólise
Para observação da morfologia colonial e das propriedades hemolíticas, as amostras foram
cultivadas, a partir do estoque congelado, em Agar Trypticase Soy (Difco - BD, Sparks, MD,
EUA) suplementado com 5% de sangue desfibrinado de carneiro (TSA-S) e incubadas a 35ºC ±
2ºC por 18-24h.
3.2.2) Observação do fator CAMP
O teste de observação do fator CAMP foi realizado semeando-se uma amostra de
Staphylococcus aureus (ATCC 25923) produtora de β-lisina em TSA-S (Difco) e em seguida,
fez-se estrias perpendiculares próximas a esta com as amostras suspeitas de serem S. agalactiae.
Após incubação a 35ºC ± 2ºC por 18-24h, foi observada reação positiva se houvesse formação de
hemólise em forma de seta na região aonde os dois microrganismos se encontram próximos. A
amostra Streptococcus agalactiae ATCC 13813 foi utilizada como controle positivo.
16
3.2.3) Teste de Hidrólise do Hipurato
As amostras foram semeadas em TSA-S (Difco) a 35ºC ± 2ºC por 18-24h. Após este
período, 2 a 3 colônias foram semeadas em caldo com hipurato de sódio (Inlab, São Paulo, SP,
Brasil) e incubadas durante esse mesmo intervalo e temperatura. O caldo obtido foi centrifugado
a 1500 rotações por minutos (rpm) durante 10 minutos (min). Uma alíquota de 800 µL do
sobrenadante foi transferido para outro tubo e depois adicionado 200µL de solução de cloreto
férrico 12,0% (Vetec, Duque de Caxias, RJ). Os tubos foram homogeneizados e as reações
positivas se caracterizaram pela formação de precipitado (FACKLAM & WILKINSON, 1981).
Foram utilizadas como controle negativo e positivo, as amostras de Streptococcus pyogenes
ATCC 19615 e Streptococcus agalactiae ATCC 13813, respectivamente.
3.3) Caracterização sorológica
Para a determinação do sorogrupo foi utilizado o kit comercial para identificação dos
estreptococos (Streptococal Grouping Kit, Oxoid, Basingstoke, Inglaterra) de acordo com as
orientações do fabricante. Suspensões de 2 a 5 colônias de estreptococos β-hemolíticos foram
feitas em um tubo de ensaio contendo 0,4 mL da enzima extratora e incubadas a 35ºC ± 2ºC por
10 min. Em um cartão foi adicionada uma gota da suspensão bacteriana a ser identificada e sobre
esta, uma gota de antissoro específico para um dos grupos sorológicos (A, B, C, D, F e G) de
estreptococos. Após homogeneização, a amostra foi identificada como pertencente ao grupo
sorológico com o qual é observada uma reação de aglutinação. As amostras pertencentes ao
grupo B foram identificadas como S. agalactiae.
3.4) Teste de susceptibilidade a antimicrobianos
3.4.1) Método de difusão em agar
A detecção da susceptibilidade das amostras bacterianas frente aos antimicrobianos foi
realizada através do teste de difusão em agar seguindo as recomendações do Clinical and
Laboratory Standards Institute (CLSI) de 2009.
A partir de culturas recentes, foram feitas suspensões bacterianas em solução salina estéril
0,9% (Vetec), com turvação equivalente à escala 0,5 de MacFarland. As suspensões foram
semeadas com auxílio de um swab estéril sobre a superfície de agar Müeller Hinton (Difco)
17
acrescido de 5% de sangue desfibrinado de carneiro (MHA-S). Após a semeadura, foram
aplicados os discos de antimicrobianos, contudo, os discos de eritromicina e clindamicina foram
dispostos a uma distância de aproximadamente 15-20 mm entre eles, objetivando a observação
dos fenótipos de resistência (MLSBi, MLSBc e M). Os meios foram incubados em atmosfera de
5% de CO2, a 35ºC ± 2ºC por 20-24h.
Os antimicrobianos utilizados foram: ceftriaxona (30µg), clindamicina (2µg), eritromicina
(15µg), levofloxacina (5µg), penicilina G (10UI), tetraciclina (30µg) e vancomicina (30µg)
(Cecon, São Paulo, SP). As amostras que apresentaram resistência à eritromicina e à
levofloxacina foram ainda submetidas ao teste de susceptibilidade à azitromicina (15µg) e à
ciprofloxacina (5µg) (Cefar, São Paulo, SP) respectivamente.
O comportamento das amostras frente aos antimicrobianos foi analisado pela medição do
halo de inibição do crescimento bacteriano. A interpretação da leitura do teste de sensibilidade
aos antimicrobianos foi realizada segundo as normas do CLSI (2009). A amostra de
Streptococcus pneumoniae ATCC 49619 foi utilizada como controle.
3.4.2) Determinação da Concentração Mínima Inibitória (CMI)
A) Diluição em agar
A determinação da CMI de eritromicina foi realizada em todas as amostras de S.
agalactiae com resistência plena ou intermediária ao antimicrobiano, através do método de
diluição em ágar. O teste foi realizado de acordo com as recomendações do CLSI (2009).
Diluições seriadas de eritromicina (Sigma, St. Louis, MO, EUA) foram adicionadas ao
MHA-S (Difco) durante o seu preparo, a fim de se obter meio de cultura com concentrações de
antimicrobiano que variaram entre 0,125 a 256 µg/mL. A partir de culturas recentes, os
microrganismos foram suspensos em solução salina 0,9% estéril (Vetec) até atingir uma turvação
semelhante a escala 0,5 de MacFarland. As suspensões foram diluídas em 1:10 na mesma solução
e 1µL destas foi depositado em um local de cada placa contendo MHA-S (Difco) e sua respectiva
concentração de antimicrobiano, resultando num inóculo bacteriano final de 104 UFC.
Após incubação por 24 horas a 35ºC ± 2ºC em atmosfera de 5% de CO2, a CMI foi
definida como menor concentração capaz de inibir o crescimento bacteriano. Como controle, foi
utilizada a amostra de Streptococcus pneumoniae ATCC 49619.
18
B) Teste Epsilométrico (E test )
Uma amostra com resistência à levofloxacina foi submetida à determinação da CMI para
este antibiótico utilizando o sistema E test (AB Biodisk, Solna, Suécia). Este método consiste
em uma estreita fita, contendo um gradiente de concentração do antimicrobiano, variando de
0,002 a 32μg/mL o qual foi aplicado na superfície do MHA-S (Difco) previamente semeada com
a amostra em questão. Após incubação por 24 horas a 35ºC ± 2ºC em atmosfera de 5% de CO2, a
CMI foi definida como a concentração no qual se inicia a formação da elipse de inibição do
crescimento bacteriano (MENDES et al, 1993; SILVA, 1999).
3.6) Ensaios envolvendo realização da Reação em Cadeia de Polimerase (PCR)
3.5.1) Obtenção de DNA
A preparação do DNA genômico foi baseada nas recomendações de Beall e colaboradores
(1996), com modificações. Os microrganismos foram suspensos em 300µL de solução salina
estéril 0,9% (Vetec) até atingir uma turvação semelhante a 3,0 da escala MacFarland. As
suspensões foram centrifugadas a 5000 rpm por 5 min e o sedimento ressuspenso em 200µL de
tampão TE (Tris-HCl 10mM, EDTA 1mM) pH 8 (Amresco, Solon, OH, EUA) acrescido de 5µL
de solução de mutanolisina 2000U/mL (Sigma). As suspensões foram incubadas a 35ºC por 30
min e em seguida, a 100ºC por 5 min. Depois, centrifugadas a 3000 rpm por 30 segundos e
mantidas a – 20oC. O sobrenadante foi utilizado como molde de DNA nas reações de
amplificação.
3.5.2) Detecção de determinantes genéticos de resistência a macrolídeos
O DNA bacteriano foi utilizado como molde em reações de amplificação conforme os
protocolos específicos (PÉREZ-TRALERO et al, 2007). Todos os reagentes envolvidos nas
reações de PCR (específicos e randômico) foram provenientes do mesmo fabricante (Fermentas,
Burlington, ON, Canadá), exceto os iniciadores (Imprint do Brasil, Campinas, SP). A
amplificação do DNA ocorreu em termociclador Gene Amp 9700 (Applied Biosystems, Foster
City, CA, EUA), com os parâmetros descritos nas Tabelas 1, 2 e 3. Os produtos de amplificação
foram submetidos à eletroforese em gel de agarose 1,2% (Fermentas), em tampão TBE 0,5X
(TBE 10X, Tris base 1M, Ácido bórico 1M e EDTA 0,01M) pH 8,4 (Amresco), utilizando-se um
19
marcador molecular de 100 pb (Fermentas), com voltagem de aproximadamente 100V. Os
fragmentos correspondentes a estes produtos foram visualizados após coloração do gel com
solução de brometo de etídio, sob luz UV.
Tabela 1. Seqüência dos iniciadores para amplificação dos genes ermA, ermB e mefA/E.
Iniciador Seqüência Tamanho do
produto (pb)
ermB forward (f) ATTGGAACAGGTAAAGGGC 442
ermB reverse (r) GAACATCTGTGGTATGGCG
ermA forward(f) AACTTGTGGAAATGAGTCAACGG 375
ermA reverse (r) CAGAATCTACATTAGGCTTAGGG
mefA/E forward(f) AGTATCATTAATCACTAGTGC 345
mefA/E reverse (r) TTCTTCTGGTACTAAAAGTGG
Tabela 2. Reagentes utilizados na reação de amplificação dos genes de resistência ermA, ermB e
mefA/E.
Reagentes
Concentração da Reação
Volume de
1 reação
MgCl2 2,0 mM 2,4 µL
Tampão 1x 3,0 µL
dNTP 0,2 mM 3,0 µL
Iniciadores (f) e (r) 1,0 µM 3,0 µL (x2)
Taq DNA Polimerase 1,0 U 0,2 µL
H2O – 12,4 µL
DNA 3,0 µL 3,0 µL
Volume Total da Reação 30µL
20
Tabela 3. Parâmetros de amplificação para PCR.
Temperatura (ºC) Tempo (minutos) Ciclos
94 3
94 1
52/50* 1 35
72 1
72 5
* Temperatura de anelamento (Ta) para ermA e ermB: 52
oC, e para mefA/E: 50
oC.
3.5.3) Análise do polimorfismo do DNA através de PCR com amplificação randômica do DNA
(RAPD-PCR)
A diversidade genética das amostras que apresentaram resistência a eritromicina (15) e
amostras susceptíveis representativas (10), selecionadas a fim de contemplar todos os espécimes
e período estudado, foi avaliada pela reação de amplificação utilizando-se o iniciador 1254 (CCG
CAG CCA A), descrito por Pacheco e colaboradores (1997), que reconhecem alvos no DNA
genômico randomicamente. A amplificação do DNA ocorreu em termociclador Gene Amp 9700
(Applied Biosystems), com os parâmetros descritos nas Tabelas 4 e 5. Os produtos de
amplificação foram submetidos à eletroforese em gel de agarose 1,2% (Fermentas), em tampão
TBE 0,5X (Amresco) utilizando-se um marcador molecular de 100 pb (Fermentas), com
voltagem de aproximadamente 100V. Os fragmentos correspondentes a estes produtos foram
visualizados após coloração com solução de brometo de etídio, sob luz UV.
21
Tabela 4. Reagentes utilizados no RAPD-PCR
Reagentes
Concentração da Reação
Volume de
1 reação
MgCl2 2,0 mM 1,2 µL
Tampão 1x 3,0 µL
dNTP 0,2 mM 3,0 µL
Iniciador 1,0 µM 3,0 µL
Taq DNA Polimerase 1,0 U 0,2 µL
H2O – 16,6 µL
DNA 3,0 µL 3,0 µL
Volume Total da Reação 30µL
Tabela 5. Parâmetros de amplificação para RAPD-PCR.
Temperatura (ºC) Tempo (minutos) Ciclos
94 3
94 1
37 1 35
72 1
72 5
3.5.4) Análise dos perfis eletroforéticos obtidos a partir de RAPD-PCR.
A análise comparativa dos perfis eletroforéticos de RAPD-PCR foi realizada utilizando-se
o programa Molecular Analyst Fingerprint Plus 1.12 (Bio-Rad, Hercules, CA, EUA). A
similaridade entre os perfis foi estimada pelo coeficiente de Dice, e os agrupamentos gerados
pelo método de UPGMA, com índice de tolerância de 1,0%.
22
4. RESULTADOS
As 100 amostras selecionadas para o estudo foram submetidas às provas fisiológicas
presuntivas para identificação dos EGBs (fator CAMP e teste de hidrólise de hipurato). A
determinação sorológica do carboidrato de parede foi realizada quando um dos testes de
identificação presuntiva apresentou resultados inesperados. Todas as amostras apresentaram
reação positiva no teste de hidrólise de hipurato e em 98 amostras detectou-se o fator CAMP. O
carboidrato do grupo B de Lancefield foi detectado nas duas amostras CAMP negativas.
Os perfis de resistência aos antimicrobianos das 100 amostras são apresentados na Tabela
6. A ocorrência de resistência entre amostras isoladas em diferentes espécimes clínicos é
apresentada na Figura 1. Não foi detectada resistência à ceftriaxona, penicilina e vancomicina,
contudo foi observada resistência à levofloxacina em uma amostra oriunda de paciente do sexo
feminino de 66 anos, isolada em abril de 2008, com evidência de ITU (≥ 105 UFC/mL), esta
também resistente à ciprofloxacina pelo teste de difusão em ágar e com CMI para levofloxacina
superior a 32µg/mL, detectado através de E-test . A resistência plena e intermediária à tetraciclina
ocorreu em 83 e seis amostras, respectivamente. A resistência à eritromicina foi observada em 11
amostras, as quais apresentaram os fenótipos M (2), MLSB indutivo (4) e MLSB constitutivo (5),
este último conferindo também resistência à clindamicina. Ressalta-se ainda que quatro amostras
apresentaram resistência intermediária à eritromicina, com os fenótipos M (1) e MLSBi (3). Todas
as amostras que apresentaram resistência à eritromicina foram também resistentes à tetraciclina e à
azitromicina, através do método de difusão em agar. Informações a respeito da origem destas
amostras são listadas na Tabela 7.
As amostras que se apresentaram com resistência plena ou intermediária à eritromicina
pelo método de difusão em agar foram submetidas à determinação da CMI, através da metodologia
de diluição em agar, cujos valores variaram de 0,5 a >256 µg/mL (Tabela 8). Houve concordância
entre os resultados obtidos pelos dois métodos empregados, exceto em três amostras, pois
apresentaram resistência intermediária pelo método de difusão e se mostraram resistentes pelo
método de diluição em agar. Considerando-se os resultados de CMI, conclui-se que a resistência à
eritromicina foi de 14,0%. Observou-se uma correlação entre valores mais elevados de CMI e
ocorrência do fenótipo MLSBc.
Estas amostras foram ainda submetidas à detecção, através de PCR, dos genes ermA, ermB
e mefA/E, os quais estão associados à resistência do S. agalactiae a este antimicrobiano. Observou-
23
se que as três amostras com fenótipo M apresentaram o produto de amplificação compatível com o
esperado para o gene mefA/E. O gene ermA foi detectado isoladamente nas amostras com fenótipo
MLSBi (5) e MLSBc (4), enquanto o gene ermB foi encontrado somente em uma amostra, cujo
fenótipo foi MLSBi e apresentou simultaneamente dois genes de resistência (ermA e ermB).
Ressalta-se ainda, a presença simultânea de dois determinantes genéticos de resistência em uma
amostra de fenótipo MLSBi, os genes ermA e mefA/E. Uma amostra, cujo fenótipo foi MLSBc não
gerou nenhum produto de amplificação após as reações com os iniciadores utilizados. A
correlação entre CMI, fenótipos e genes de resistência detectados nestas amostras pode ser
observada na Tabela 8.
O polimorfismo do DNA obtido a partir de RAPD-PCR pode ser observado nas Figuras 2 e
4, as quais mostram os perfis representativos de amostras resistentes e sensíveis à eritromicina,
respectivamente. O dendrograma resultante da análise de amostras representativas resistentes à
eritromicina é apresentado na Figura 3. Observou-se dois agrupamentos (I e II), nos quais as
amostras pertencentes a cada um compartilham no mínimo 60,0% de similaridade. Outras
amostras analisadas em um ensaio de RAPD-PCR anterior também compartilharam similaridade
significativa com as incluídas nesta análise, alocando-se no grupo I (amostra 316) e no grupo II
(amostras 277 e 380). Informações a respeito destas amostras são apresentadas na Tabela 7. Três
amostras estudadas no mesmo ensaio foram excluídas da análise computadorizada devido ao
número escasso de bandas de amplificação de DNA. Amostras de dois subgrupos pertencentes ao
grupo II apresentaram o maior grau de similaridade entre si (aproximadamente 90,0%). As
amostras 242 e 208 foram oriundas de secreções genitais masculina e feminina, respectivamente,
de pacientes com faixa etária de 24 e 26 anos, isoladas em 06/2008 e 03/2008 e apresentavam em
comum, o mesmo fenótipo de resistência à eritromicina (MLSBc). As amostras 200 e 225 foram
oriundas de urina de pacientes do sexo feminino, com idade de 32 e 25 anos, isoladas em 03/2008
e 04/2008, respectivamente. Estas amostras não compartilharam fenótipos (M e MLSBi) ou
genótipos (mefA/E e ermA) de resistência a eritromicina.
Os perfis de RAPD-PCR de amostras sensíveis à eritromicina são apresentados na Figura
4. A Figura 5 traz o dendrograma gerado a partir da análise desta imagem. As amostras
distribuíram-se em quatro pares, cada qual com aproximadamente 90,0% de similaridade.
Observa-se o agrupamento de amostras oriundas de espécimes diferentes. Ressalta-se que as
amostras 221 e 222, com 94,0% de similaridade, foram coletadas no mesmo dia, de espécimes
24
(urina e secreção vaginal) de duas pacientes distintas. A amostra 221 apresentou resistência à
levofloxacina, enquanto a amostra 222 mostrou-se sensível a este antimicrobiano.
O dendrograma gerado a partir da análise conjunta dos perfis de RAPD-PCR obtidos revela
a distribuição da maioria das amostras em dois grupos de similaridade principais, os quais alocam
amostras resistentes e sensíveis à eritromicina concomitantemente (Figura 6).
25
Tabela 6. Total de amostras submetidas aos testes de sensibilidade a antimicrobianos, através do
método de difusão em agar.
Antimicrobianos
Sensível
(S)
Intermediário
(I)
Resistente
(R)
Total
(N)
Ceftriaxona
(CRO)
100
—
—
100
Clindamicina
(CLI)
95
—
5
100
Eritromicina*
(ERI)
85
4
11
100
Levofloxacina**
(LVX)
99
—
1
100
Penicilina
(PEN)
100
—
—
100
Tetraciclina
(TET)
11
6
83
100
Vancomicina
(VAN)
100
—
—
100
*Todas as amostras resistentes à eritromicina foram também resistentes à azitromicina.
** A amostra resistente à Levofloxacina foi também resistente à ciprofloxacina.
26
Tabela 7. Informações sobre as 15 amostras de S. agalactiae com resistência plena ou
intermediária à eritromicina pelo teste de difusão em agar.
Amostra Data de coleta
(mês/ano)
Material Clínico Gênero Faixa etária
(anos)
190 03/2008 Secreção Vaginal Feminino 38
196 03/2008 Secreção Vaginal Feminino 49
200 03/2008 Urina Feminino 32
206 03/2008 Secreção Vaginal Feminino 22
208 03/2008 Secreção Vaginal Feminino 26
210 03/2008 Urina Masculino 37
212 04/2008 Urina Feminino 27
225 04/2008 Urina Feminino 25
242 06/2008 Secreção Uretral Masculino 24
277 08/2008 Esperma Masculino 44
304 10/2008 Secreção Vaginal Feminino 62
309
316
380
414
10/2008
02/2009
05/2009
08/2009
Urina
Urina
Secreção Vaginal
Esperma
Masculino
Feminino
Feminino
Masculino
24
27
63
25
27
Tabela 8. Distribuição das 15 amostras de S. agalactiae com resistência plena e intermediária à
eritromicina pelo método de difusão em agar, CMI pelo método de diluição em agar, fenótipos e
genes de resistência.
Amostra Difusão em agar
(I / R)
Diluição em agar
(CMI - µg/mL
/Interpretação dos
resultados)
Fenótipos Genes de
resistência
ermA ermB mefA/E
190 R >256 / R MLSBc - - -
196 I 0,5 / I MLSBi + - -
200 R 2 / R M - - +
206 R >256 / R MLSBc + - -
208 R >256 / R MLSBc + - -
210 R 2 / R MLSBi + - -
212 R 2 / R MLSBi + - -
225 R 2 / R MLSBi + - -
242 R >256 / R MLSBc + - -
277 I 2 / R M - - +
304 R 4 / R MLSBi + + -
309 R 16 / R MLSBc + - -
316 R 2 / R M - - +
380 I 2 / R MLSBi + - +
414 I 8 / R MLSBi + - -
MLSBi, fenótipo macrolídeos, lincosamideos e estreptogramina B indutivo; MLSBc, fenótipo macrolídeos,
lincosamideos e estreptogramina B constitutivo; M, fenótipo M; CMI, Concentração Mínima Inibitória; R,
Resistente; I, Intermediário; erm, erythromycin ribosome methylation; mef, macrolide efflux.
28
29
Figura 2. Perfis eletroforéticos de amostras representativas de S. agalactiae resistentes à
eritromicina, obtidos por RAPD-PCR.
MM, marcador molecular (pb); 1, 414; 2, 309; 3, 200; 4, 212; 5, 225; 6, 304;
7, 242; 8, 196; 9, 190; 10, 206; 11, 208; 12, 210.
MM 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 MM
100
500
1000
30
Figura 3. Dendrograma obtido após análise computadorizada dos perfis eletroforéticos das
amostras de S. agalactiae resistentes à eritromicina.
414
210
309
242
208
212
200
225
304
I
II
31
Figura 4. Perfis eletroforéticos de amostras representativas de S. agalactiae sensíveis à
eritromicina, obtidos por RAPD-PCR.
PM 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 PM
MM 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 MM
100
500
1000
MM, marcador molecular (pb); 1, 221; 2, 222; 3, 286;
4, 305; 5, 306; 6, 310; 7, 335; 8, 342; 9, 383; 10, 410.
32
Figura 5. Dendrograma obtido após análise computadorizada dos perfis eletroforéticos das
amostras de S. agalactiae sensíveis à eritromicina
306
342
383
410
221
222
286
310
33
Figura 6. Dendrograma obtido após análise computadorizada dos perfis eletroforéticos das
amostras de S. agalactiae resistentes e sensíveis à eritromicina
S, sensível à eritromicina.
309 410 S 306 S 342 S 414 210
212 221 S 222 S 383 S 225 242 208 200 286 S
310 S 304
34
5. DISCUSSÃO Streptococcus agalactiae compartilha algumas características morfológicas e fisiológicas
com outras espécies do gênero. A identificação da espécie pode ser realizada a partir da utilização
de testes fisiológicos presuntivos (hidrólise do hipurato e fator CAMP), bem como do teste
sorológico, já que a detecção do carboidrato antigênico de Lancefield, é considerada o método
definitivo de identificação. Contudo, pelo menos duas metodologias devem ser utilizadas em
conjunto. O fator CAMP, proposto originalmente por Christie e colaboradores, em 1944, é um
teste comumente usado em laboratórios clínicos devido a sua simplicidade e baixo custo, além de
possuírem alta sensibilidade e especificidade (apud ZÁRATE et al, 2005). Porém, assim como
observado neste estudo, algumas amostras podem apresentar resultados negativos, como relatado
por ZÁRATE e colaboradores em 2005. Mesmo a sorologia não deve ser utilizada isoladamente
na identificação da espécie, uma vez que outras espécies de estreptococos beta-hemolíticos, como
Streptococcus porcinus, podem gerar reações positivas com o anticorpo do grupo B (DUARTE et
al, 2005b).
Um dos maiores problemas no tratamento das infecções bacterianas está na relação entre
as falhas no tratamento e o uso indiscriminado de antibióticos pelos pacientes, fatores estes que
favorecem a emergência da resistência aos antimicrobianos. No presente estudo, não houve
resistência aos antimicrobianos ceftriaxona, penicilina e vancomicina. Contudo, foi observada
resistência à tetraciclina, eritromicina, clindamicina e levofloxacina. Enquanto que a resistência
aos três primeiros antimicrobianos tem sido amplamente relatada em estudos realizados em
diferentes regiões geográficas, inclusive no Brasil (D’OLIVEIRA et al, 2003a; DUARTE et al,
2005a; BORGER et al, 2005; FALAGAS et al, 2006; MIRÓ et al, 2006; GHERARDI et al, 2007,
SAVOIA et al, 2008; WU et al, 2008; KARUNAKARAN et al, 2009; ULETT et al, 2009), em
relação às fluoroquinolonas, este parece ser o primeiro relato de resistência de EGB a estas
drogas no país. Em estudos realizados por Kawamura e colaboradores (2003), no Japão e por
Miró e colaboradores (2006), na Espanha, os EGBs apresentaram taxas de resistência à
levofloxacina semelhantes à encontrada neste estudo.
A resistência à tetraciclina é extremamente disseminada entre EGB, com relatos de
incidência superiores a 80% (BETRIU et al, 2004; SAVOIA et al, 2008). Neste estudo, a taxa de
resistência a este antimicrobiano foi 83%, muito semelhante à observada em estudos anteriores
conduzidos na mesma região (D’OLIVEIRA et al, 2003a; DUARTE et al, 2005a).
35
Neste estudo, foi observada resistência à eritromicina em 14,0% das amostras de EGB.
Este dado, quando comparado a estudos anteriores, realizados na mesma região, por D’Oliveira e
colaboradores (2003a) e por Duarte e colaboradores (2005a) que obtiveram 5,4% e 4,6% de
amostras resistentes a este antimicrobiano, respectivamente, revelando um aumento pontual no
isolamento de amostras resistentes. Tal fato aponta para a formulação de estratégias que
contemplem o monitoramento contínuo do perfil de susceptibilidade a antimicrobianos, bem como
políticas de racionamento do uso de macrolídeos, uma vez que entre espécies relacionadas, a
ocorrência de resistência está diretamente relacionada ao consumo da droga (SEPPALA et al,
1997).
O teste de susceptibilidade à eritromicina, a partir do emprego das metodologias de difusão
e diluição em agar, revelou discrepância de interpretação de resultados em três amostras. Estas
discrepâncias relacionadas à metodologia utilizada foram observadas em outros estudos
envolvendo diferentes espécies de estreptococos beta-hemolíticos (D’OLIVEIRA et al, 2003a;
D’OLIVEIRA et al, 2003b). Tais resultados demonstram que, para fins terapêuticos, as amostras
de EGBs que apresentam resistência intermediária à eritromicina pelo método de difusão em agar,
devem ser consideradas resistentes à mesma, a fim de garantir o sucesso do tratamento.
Foi observada resistência à azitromicina entre todas as amostras resistentes à eritromicina.
Esta representante da classe dos azalídeos, cujos membros são derivados dos macrolídeos, foi
incluída neste estudo devido suas diferenças em relação à eritromicina, seu anel lactona é
constituído por 15 átomos de carbono e contém um átomo de nitrogênio enquanto que o anel
lactona da eritromicina é constituído por 14 átomos, não possuindo o átomo de nitrogênio. Estas
diferenças são responsáveis pelas melhores características farmacológicas da azitromicina, ou
seja, seu espectro de ação é mais amplo frente aos microorganismos, sua difusão tecidual é mais
rápida e mais elevada e, sua meia-vida biológica é mais prolongada do que a de outros
macrolídeos, porém seu espectro de ação é semelhante ao da eritromicina. Todas estas vantagens
têm contribuído para o amplo uso deste antimicrobiano em nosso meio (STEIGBIGEL, 1991;
SILVA, 1999; HARRISON, 2002).
Neste estudo foram observados os fenótipos de resistência a macrolídeos M (3), MLSBi (7)
e MLSBc (5). A distribuição destes três fenótipos de resistência à eritromicina, em amostras
oriundas de diferentes espécimes clínicos têm sido relatada em diversos estudos (BETRIU et al,
2004; DUARTE et al, 2005a; GHERARDI et al, 2007; PUOPOLO et al, 2007; PINHEIRO et al,
36
2009). Todas as amostras de EGBs, independente do mecanismo de resistência à eritromicina,
mostraram-se também resistentes à tetraciclina, como relatado por Duarte e colaboradores em
2005(a). Isso se deve ao fato de que os determinantes genéticos de resistência à tetraciclina são
freqüentemente encontrados em elementos móveis como transposons ou plasmídeos, os quais
estão associados aos determinantes genéticos de resistência aos macrolídeos (CHOPRA &
ROBERTS, 2001; CULEBRAS et al, 2002).
Comparando-se os valores de CMI, fenótipos e genótipos de resistência, foi possível
detectar neste estudo que todas as amostras com fenótipo M (3) apresentaram o gene mefA/E e
CMI 2µg/mL, resultados condizentes com os observados anteriormente (VARMAN et al, 2005;
GHERARDI et al, 2007; PINHEIRO et al, 2009). Das amostras com fenótipo MLSBi (7), cinco
apresentaram o gene ermA, uma apresentou simultaneamente ermA e ermB e uma apresentou
ermA e mefA/E. A CMI variou entre 0,5 a 8,0 µg/mL. A presença simultânea de dois
determinantes genéticos em uma mesma amostra já foi relatada por outros autores (CULEBRAS et
al, 2002; BETRIU et al, 2004; PEREZ-TRALLERO et al, 2007; PINHEIRO et al, 2009). Entre as
amostras com fenótipo MLSBc (5), quatro apresentaram somente o gene ermA, com CMI variando
entre 16 a > 256 µg/mL. Valores de CMI mais elevados entre amostras com fenótipo MLSBc
também foram observados por Varman e colaboradores (2005) e Pinheiro e colaboradores (2009).
Uma amostra cujo fenótipo foi MLSBc não apresentou nenhum produto de amplificação a partir
dos iniciadores utilizados. A ausência de amplificação com os genes ermA e ermB ou mefA/E entre
amostras que apresentavam o fenótipo MLSBc foi previamente relatada por outros autores
(BETRIU et al, 2004; PINHEIRO et al, 2009). Ainda que os genes pesquisados sejam os mais
freqüentemente encontrados entre amostras de EGB que apresentam resistência aos macrolídeos,
outros genes, tais como ermC e msrA podem estar envolvidos (PINHEIRO et al. 2009).
Estudos de diversidade genética e tipagem epidemiológica podem ser realizados com a
utilização de uma grande variedade de técnicas moleculares. Através de RAPD-PCR, diversos
autores (BERG, AKOPYANTS & KERSULYTE, 1994; LIMANSKY et al, 1998; PUOPOLO et
al; 2007) observaram diversidade entre os perfis de amplificação randômica do DNA, indicando a
ocorrência de eventos genéticos entre amostras de uma dada espécie. RAPD-PCR como
ferramenta de tipagem de S. agalactiae tem revelado-se como uma metodologia de maior poder
discriminatório quando comparada à sorotipagem capsular ou eletroforese de isoenzimas (MLEE)
e comparável à eletroforese em gel em campo pulsado (PFGE), considerada a metodologia
37
padrão-ouro para análise de diversidade genética entre esta espécie (CHATELLIER et al, 1997;
MARTINEZ et al. 2000; ZHANG, KOTIW & DAGGARD, 2002).
Embora o RAPD-PCR tenha gerado perfis com poucas bandas, o que limitou o potencial
discriminatório da metodologia, foi possível observar a ocorrência de diferentes perfis entre
amostras que apresentaram o mesmo comportamento frente ao antimicrobiano, assim como foi
possível detectar amostras resistentes e sensíveis com perfis genéticos similares. Empregando-se o
RAPD-PCR para a análise de amostras resistentes à eritromicina, observou-se perfis genéticos de
significativa similaridade entre amostras que albergam diferentes determinantes genéticos de
resistência, indicando que a aquisição destes genes não provocou alterações no genoma detectáveis
pela metodologia utilizada. Da mesma forma, a análise de amostras sensíveis a este antimicrobiano
revelou a ocorrência de grupos de similaridade que alocam amostras de diferentes origens clínicas.
É importante ressaltar a significativa similaridade entre uma amostra sensível e outra resistente à
levofloxacina. A ocorrência de amostras significativamente similares e com diferenças de
comportamento frente a antimicrobianos, como as fluoroquinolonas, corrobora as observações
sobre a similaridade de perfis genéticos entre amostras resistentes e sensíveis à eritromicina,
observada no dendrograma resultante na análise conjunta dos perfis de RAPD-PCR. É interessante
notar neste dendrograma que nos dois grupos de similaridade encontram-se amostras resistentes e
sensíveis, o que indica que a aquisição de resistência ocorre de maneira aleatória na população de
EGB circulante, uma vez que não foram observados perfis genéticos específicos. Portanto, a
aquisição de determinantes genéticos de resistência aos antimicrobianos parece não ser suficiente
para definir um único grupo clonal entre as amostras desta espécie.
38
6. CONCLUSÃO
Os testes fisiológicos tradicionalmente empregados na identificação de S. agalactiae, quando
utilizados em conjunto, apresentaram excelente performance;
As amostras estudadas apresentaram-se uniformemente sensíveis a alguns antimicrobianos,
sobretudo beta-lactâmicos e vancomicina. Contudo, foi observada resistência à tetraciclina,
eritromicina, clindamicina e levofloxacina;
A resistência à eritromicina sugere que, em nosso meio, macrolídeos só devem ser utilizados
para tratamento das infecções por EGB após a obtenção do perfil de sensibilidade da amostra
frente a estes antimicrobianos;
Comparando-se os resultados de sensibilidade à eritromicina pelas duas metodologias
utilizadas, tais resultados demonstram que, para fins terapêuticos, as amostras de EGB que
apresentam resistência intermediária à eritromicina pelo método de difusão em agar, devem ser
consideradas resistentes, a fim de garantir o sucesso do tratamento;
Em relação à levofloxacina, este parece ser o primeiro relato de resistência de EGB a esta
droga no Brasil, revelando o aumento pontual da resistência a este antimicrobiano usualmente
empregado em infecções do trato urinário em indivíduos não-gestantes;
Pela técnica de PCR, foram detectados os genes de resistência a macrolídeos (ermA, ermB e
mefA/E), cujos fenótipos de resistência quando associados a estes genes (MLSBi, MLSBc e M)
foram condizentes com dados da literatura nacional e internacional;
Empregando-se a metodologia de RAPD-PCR, observou-se diversidade de perfis tanto entre
amostras sensíveis quanto entre amostras resistentes aos macrolídeos. Porém, a análise conjunta
destes perfis revelou significativa similaridade entre amostras com diferentes comportamentos a
este antimicrobiano, sugerindo que a aquisição de genes de resistência não determinou o
surgimento de um ou poucos grupos clonais.
39
REFERÊNCIA BIBLIOGRÁFICA
APGAR, B.S.; GREENBERG, G. & YEN, G.. Prevention of group B streptococcal disease in the
newborn. Amer. Fam. Phys.: vol. 71, n. 1, p. 903-910, 2005.
BEALL, B.; FACKLAM, R. & THOMPSON, T.. Sequencing erm-specific PCR products for
routine and accurate typing of group A streptococci. J. Clin. Microbiol.: vol. 34, p. 953-958, 1996.
BEITUNE, P.E.; DUARTE, G. & MAFFEI, C.M.L.. Colonization by Streptococcus agalactiae
during pregnancy: Maternal and perinatal prognosis. Braz. J. Infect. Dis.: vol. 9, n. 3, p. 276-282,
2005.
BERG, D.E.; AKOPYANTS, N.S. & KERSULYTE, D.. Fingerprinting Microbial Genomes Using
the RAPD or AP-PCR Method. Meth. Mol. Cell. Biol. : v. 5, p. 13-24, 1994.
BETRIU, C.; CULEBRAS, E.; RODRÍGUEZ-AVIAL, I.; GÓMEZ, M.; SÁNCHEZ, B.A. &
PICAZO, J.J.. In vitro activities of tigecycline against erythromycin-resistant Streptococcus
pyogenes and Streptococcus agalactiae: Mechanisms of macrolide and tetracycline resistance.
Antimicrob. Agents Chemother: vol. 48, n. 1, p. 323-325, 2004.
BORGER, I.L.; D’OLIVEIRA, R.E.C.; CASTRO, A.C.D. & MONDINO, S.S.B.. Streptococcus
agalactiae em gestantes: prevalência de colonização e avaliação de suscetibilidade aos
antimicrobianos. Rev. Bras. Ginecol. Obstet.: vol. 27, n. 10, p. 575-579, 2005.
CENTERS FOR DISEASE CONTROL AND PREVENTION. Prevention of perinatal of group B
streptococcal diseases: Revised guidelines from CDC. Morbid. Mortal. Wkly. Rep: 51,RR-
11,2002.
40
CHAMBERS, H.F.. Penicillins. In: Principles and practice of infection disease. Nova Iorque.
Editora: Churchill Livingstone, vol.1, p. 291-298, 2000.
CHATELLIER, S.; RAMANANTSOA, C.; HARRIAV, P.; ROLLAND, K.; ROSENAV, A. &
QUENTIN, R.. Characterization of Streptococcus agalactiae strains by Randomly Amplied
Polymorphic DNA Analysis. J. Clin. Microbiol.: vol. 35, n. 10, p. 2573-2579, 1997.
CHOHAN, L.; HOLLIER, L.M.; BISHOP, K. & KILPATRICK, C.C.. Patterns of antibiotic
resistance among group B Streptococcus isolates: 2001-2004. Infect. Dis. Obstet. Gynecol.: p. 1-4,
2006.
CHOPRA, I. & ROBERTS, M.. Tetracycline antibiotics: Mode of action, applications, molecular
biology and epidemiology of bacterial resistance. Microbiol. Mol. Biol. Rev.: vol. 65, n. 2, p. 232-
260, 2001.
CLSI Document M07-A8, Vol. 29, n. 2, 2009. CLSI, Wayne, PA.
CLSI Document M02- A10, Vol. 29, n. 1, 2009. CLSI, Wayne, PA.
CLSI Document M100- S19, Vol. 29, n. 3, 2009. CLSI, Wayne, PA.
CULEBRAS, E.; RODRIGUEZ-AVIAL, I.; BETRIU, C.; REDONDO, M. & PICAZO, J.J..
Macrolide and tetracycline resistance and molecular relationships of clinical strains of
Streptococcus agalactiae. Antimicrob. Agents Chemother.: vol. 46, n. 5, p. 1574-1576, 2002.
DE MOUY, D.; CAVALLO, J. D., LECLERCQ, R.; FABRE, R. & THE AFORCOPI-BIO
NETWORK. Antibiotic susceptibility and mechanisms of erythromycin resistance in clinical
isolates of Streptococcus agalactiae: French multicenter study. Antimicrob. Agents Chemother.:
vol. 45, n. 8, p. 2400-2402, 2001.
41
DOGAN, B.; SCHUKKEN, Y.H.; SNTISTEBAN, C. & BOOR, K.J.. Distribution of serotypes
and antimicrobial resistance genes among Streptococcus agalactiae isolates from bovines and
human hosts. J. Clin. Microbiol.: vol. 43, n. 12, p. 5899-5906, 2005.
D’OLIVEIRA, R.E.C.; BARROS, R.R.; MENDONÇA, C.R.V; TEIXEIRA, L.M. & CASTRO,
A.C.D.. Susceptibility to antimicrobials and mechanisms of erythromycin resistance in clinical
isolates of Streptococcus agalactiae from Rio de Janeiro, Brazil. J. Med. Microbiol.: p. 1029-
1030, 2003a.
D’OLIVEIRA, R.E.C.; BARROS, R.R.; MENDONÇA, C.R.V; TEIXEIRA, L.M. & CASTRO,
A.C.D.. Antimicrobial susceptibility and survey of macrolide resistance mechanisms among
Streptococcus pyogenes isolated in Rio de Janeiro, Brazil. Microbial Drug Resistance: vol. 9, n.
1, 87-91, 2003b.
DORAN, K.S. & NIZET, V.. Molecular pathogenesis of neonatal group B streptococcal infection:
no longer in its infancy. Molecular Microbiology: vol. 54, n. 1, p. 23-31, 2004.
DUARTE, R.S.; BELLEI, B.C.; MIRANDA, O.P.; BRITO, M.A.V.P. & TEIXEIRA, L.M..
Distribution of antimicrobial resistance and virulence-related genes among Brazilian Group B
Streptococci recovered from bovine and human sources. Antimicrob. Agents Chemother.: vol. 49,
n. 1, p. 97-103, 2005a.
DUARTE, R.S.; BARROS, R. R.; FACKLAM, R.R. & TEIXEIRA, L.M.. Phenotypic and
genotypic characteristics of Streptococcus porcinus isolated from human sources. J. Clin.
Microbiol.: vol. 43, n. 9, p. 4592–4601, 2005b.
EDWARDS, M.S. & BAKER, C.J.. Group B Streptococcal infection in elderly adults. Aging and
Infectious Diseases: vol. 41, p.839-847, 2005.
42
FACKLAM , R.R. & WILKINSON, H.W.. The family Streptoccaceae (Medical Aspects). In: The
prokariotes - A handbook of habits, isolation and identification of bacteremia. Nova Iorque:
Springer Verlag., 1981.
FALAGAS, M.E.; ROSMARAKIS, E.S.; AVRAMOPOULOS, I. & VAKALIS, N..
Streptococcus agalactiae infections in non-pregnant adults: Single Center experience of a
growing clinical problem. Med. Sci. Monit.: vol. 12, n. 11, p. 447-451, 2006.
GHERARDI, G.; IMPERI, M.; BALDASSARRI, L.; PATARACCHIA, M.; ALFARONE, G.;
RECCHIA, S.; OREFICI, G.; DICUONZO, G. & CRETI, R.. Molecular epidemiology and
distribution of serotypes, surfaces proteins, and antibiotic resistance among group B streptococci
in Italy. J. Clin. Microbiol.: vol. 45, n. 9, p. 2909-2916, 2007.
GIRGITZOVA, B.; MINKOV, N. & ZOZIKOV, B.. Streptococcus agalactiae as a urinary tract
pathogen in males and non-pregnant females. International Urology and Nephrology: vol. 23, n. 4,
p. 365-369, 1991.
GONZALEZ, J.J.; ANDREU, A. & SPANISH GROUP FOR THE STUDY OF PERINATAL
INFECTION FROM THE SPANISH SOCIETY FOR CLINICAL MICROBIOLOGY AND
INFECTIOUS DISEASES. Multicenter study of the mechanisms of resistance and clonal
relationships of Strptococcus agalactiae isolates resistant to macrolides, lincosamides and
ketolides in Spain. Antimicrob. Agents Chemother.: vol. 49, n. 6, p. 2525-2527, 2005.
HARRISON. Medicina Interna. 15ª edição. Rio de Janeiro: McGraw-Hill Interamericana do
Brasil Ltda, 2002.
HEELAN, J.S.; HASENBEIN, M.E. & MCADAM, A.J.. Resistance of Group B Streptococcus to
selected antibiotics, including erythromycin and clindamycin. J. Clin. Microbiol.: vol. 42, n. 3, p.
1263-1264, 2004.
43
HENSLER, M.E.; QUACH, D.; HSIEH, C.J.; DORAN, K.S. & NIZET, V.. CAMP Factor is not
essential for systemic virulence of Group B Streptococcus. Microb. Pathog.: vol. 44, n. 1, p. 84-
88, 2008.
HERNÁIZ, C.; ANTÓN, N.; ALÓS, J.I.; ORDEN, B.; ORELLANA, M.A.; COLOMINA, J.;
REDONDO, J. & GÓMEZ-GARCÉS, J.L.. Significado clínico del aislamiento de Streptococcus
agalactiae de orina de pacientes de centros de salud. Enferm. Infecc. Microbiol. Clin.: vol. 22, n.
2, p. 89-91, 2004.
HO, C.M.; CHI, C.Y.; HO, M.W.; CHEN, C.M.; LIAO, W.C.; LIU, Y.M.; LIN, P.C. & WANG,
J.H.. Clinical characteristics of group B streptococcus bacteremia in non-pregnant adults. J.
Microbiol. Immunol. Infect.: vol. 39, n. 1, p. 396-401, 2006.
ISAACS, D. & ROYLE, J.A.. Intrapartum antibiotics and early onset neonatal sepsis caused by
group B Streptococcus and by other organisms in Australia. Pediatr. Infect. Dis. J.: vol. 18, n.1, p.
524-528, 1999.
JAWETZ, E.; MELNICK, J.L. & ADELBERG, E.A.. Microbiologia Médica. 24ª edição. Rio de
Janeiro: Mc Graw-Hill Interamericana do Brasil Ltda; 2009.
JURGENS, B. D.; STERZIK, B. & FEHRENBACH, F.J.. Unspecific binding of group b
streptococcal cocytolysin (camp factor) to immunoglobulins and its possible role in
pathogenicity. J. Exp. Med.: v. 165, p. 720-732, 1987.
KARUNAKARAN, R.; RAJA, N.S.; HAFEEZ, A. & PUTHUCHEARY, S.D.. Group B
Streptococcus infection: Epidemiology, serotypes, and antimicrobial susceptibility of selected
isolated in the population beyond infancy (excluding females with genital tract- and pregnancy-
related isolates) at the University Malaya Medical Centre, Kuala Lumpur. Jpn. J. Infect. Dis.:
vol.62, n.1, p. 192-194, 2009.
44
KAWAMURA, Y.; FUJIWARA, H.; MISHIMA, N.; TANAKA, Y.; TANIMOTO, A.; IKAWA,
S.; ITOH, Y. & EZAKI, T.. First Streptococcus agalactiae isolates highly resistant to quinolonas,
with point mutations in gyrA and parC. Antimicrob. Agents Chemother.: vol. 47, n.11, p. 3605-
3609, 2003.
KEEFE, G.P.. Streptococcus agalactiae mastitis: A review. Can. Vet. J.: vol. 38, n. 1, p. 429-437,
1997.
KILLIAN, M. Streptococcus and Lactobacillus. In: Topley & Wilson’s Microbiology and
Microbial Infections. Systematic bacteriology. Collier, L., Ballows, A. & Sussman, M. (eds). Vol
2. 9th
ed., 1998.
KONEMAN, E.W.; ALLEN, S.D.; JANDA, W.M.; SCHRECKENBERGER, P.C. & JUNIOR,
W.C.W.. Diagnóstico Microbiológico – Texto e Atlas Colorido. 5ª edição. Rio de Janeiro: Editora
Medsi, 2001.
LENZ, L.L.. Infecções Urinárias. 3ª edição. Rio de Janeiro: Editora Guanabara Koogan, 1994.
LIMANSKY, A. S.; SUTICH, E.G.; GUARDATI, M.C.; TORESANI, I. E. & VIALE, A.M..
Genomic diversity among Streptococcus agalactiae isolates detected by a degenerate
oligonucleotide-primed amplification assay. J. Infect. Dis.: vol.177, n. 1, p. 1308-1313, 1998.
MARTINEZ, G.; HAREL, J.; HIGGINS, R.; LACOUTURE, S.; DAIGNAULT, D. &
GOTTSCHALK, M.. Characterization of Streptococcus agalactiae isolates of bovine and human
origin by randomly amplified polymorphic DNA analysis. J. Clin. Microbiol.: vol. 38, n. 1, p. 71-
78, 2000.
45
MARTÍNEZ, M.A.; OVALLE, A.; DURÁN, C.; REID, I.; URRIOLA, G.; GARAY, B.&
CIFUENTES, M..Serotipos y susceptibilidad antimicrobiana de Streptococcus agalactiae. Rev.
Méd Chile: vol. 132, n. 1, p. 549-555, 2004.
MENDES, C.M.F.; OPLUSTIL, C.P.; HONDA, R.; CAIAFFA FILHO, H.; FRANCISCO, W. &
ANDRIOLO, A.. Evaluation of the ―E Test‖, a new method for minimal inhibitory concentration
(MIC) determination. Rev. Bras. Patol. Clin.: vol. 29, n. 4, p. 135-140, 1993.
MIRÓ, E.; REBOLLO, M.; RIVERA, A.; ÁLVAREZ, M.T.; NAVARRO, F.; MIRELIS, B. &
COLL, P.. Streptococcus agalactiae altamente resistente a fluoroquinolonas. Enferm. Infecc.
Microbiol. Clin.: vol. 24, n. 9, p. 562-563, 2006.
MOTLOVÁ, J.; STRAKOVÁ, L.; URBÁSKOVÁ, P.; SAK, P. & SEVER, T.. Vaginal & rectal
carriage of Streptococcus agalactiae in the Czech Republic: incidence, serotypes distribution &
susceptibility to antibiotics. Indian. J. Med. Res.: vol. 119, s. 84-87, 2004.
MUÑOZ, P.; COQUE, T.; CRÉIXEMS, R.M.; DE QUIRÓS, B.J.C., MORENO, S. & BOUZA,
E.. Group B Streptococcus: a cause of urinary tract infection in nonpregnant adults. Clin. Infect.
Dis.: vol.: 14, n.2, p. 492-496, 1992.
MURRAY, P.R.; ROSENTHAL, K.S. & PFALLER, M.A.. Microbiologia Médica. 5ª edição.
Rio de Janeiro: Editora Elsevier, 2006.
PACHECO, A. B. F.; GUTH, B. E. C.; SOARES, K. C. C.; NISHIMURA, L.; ALMEIDA D. F.
& FERREIRA, L. C. S. Random amplification of polymorphic DNA reveals serotype-specific
clonal clusters among enterotoxigenic Escherichia coli strains isolated from humans. J. Clin.
Microbiol.: vol. 35, n. 6, p. 1521-1525, 1997.
46
PÉREZ-TRALLERO, E.; MONTES, M.; ORDEN, B.; TAMAYO, E.; GARCÍA-ARENZANA,
J.M. & MARIMÓN, J.M.. Phenotypic and genotypic characterization of Streptococcus pyogenes
isolates displaying the MLSB phenotype of macrolide resistance in Spain, 1999 to 2005.
Antimicrob. Agents Chemother.: vol. 51, n. 4, p. 1228-1233, 2007.
PERSSON, K.M.; GRABE, M.; KRISTIANSEN, P. & FORSGREN, A.. Significance of group B
streptococci in urine cultures from males and non-pregnant females. Scand. J. Infect. Dis.: vol.
20, n.1, p. 47-53, 1988.
PIDDOCK, L.J.. Mechanisms of fluoroquinolone resistance: an update 1994-1998. Drugs: vol.
58, s. 2, p. 11-18, 1999.
PINHEIRO, S.; RADHOUANI, H.; COELHO, C.; GONÇALVES, A.; CARVALHO, E.;
CARVALHO, J. A.; RUIZ-IARREA, F.; TORRES, C.; IGREJAS, G. & POETA, P.. Prevalence
and mechanisms of erythromycin resistance in Streptococcus agalactiae from healthy pregnant
women. Microbial Drug Resistance: vol. 15, n. 2, 2009.
POGERE, A.; ZOCCOLI, C.M.; TOBOUTI, N.R.; FREITAS, P.F.; D’ACAMPORA, A.J. &
ZUNINO, J.N.. Prevalência da colonização pelo estreptococo do grupo B em gestantes atendidas
em ambulatório de pré-natal. Rev. Bras. Ginecol. Obstet.: vol. 27, n. 4, p. 174-180, 2005.
PUOPOLO, K.M.; KLINZING, D.C.; LIN, M.P.; YESUCEVITZ, D.L. & CIESLEWICZ, M.J.. A
composite transposon associated with erythromycin and clindamycin resistance in group B
Streptococcus. J. Med. Microbiol.: vol. 56, n. 1, p. 947-955, 2007.
ROBBINS, S.L.; SCHOEN; F.J.; KUMAR, V. & COTRAN, R.S.. Patologia Estrutural e
Funcional. 5ª edição. Rio de Janeiro: Editora Guanabara Koogan, 1996.
SAVOIA, D.; GOTTIMER, C.; CROCILLA, C. & ZUCCA, M.. Streptococcus agalactiae in
pregnant women: Phenotypic and genotypic characters. Journal of Infection: vol. 56, n. 1, p. 120-
125,2008.
47
SCHRAG, S.J.; ZYWICKI, S. & FARLEY, M.M.; REINGNOLD, A.; HARRISON, L.H.;
LEFKOWITZ, L.B.; HADLER, J.L.; DANIELA, R.; CIESLAK, P.R. & SCHUCHAT, A.. Group
B streptococcal disease in the era of intrapartum prophylaxis. N. Engl. J. Med.: vol. 342, p. 15-20,
2000.
SCHRAG, S.; GORWITZ, R.; FULTZ-BUTTS, K. & SCUCHAT, A.. Prevention of perinatal
group B streptocoocal disease: revised guidelines from CDC. MMWR Recomm. Rep.: vol. 51, p.
1-22, 2002.
SCHUCHAT, A.. Epidemiology of group B streptococcal disease in the United States: shifting
paradigms. Clin. Microbiol. Rev.: vol: 11, n. 3, p. 497-513, 1998.
SCHUCHAT, A. & WENGER, J.D.. Epidemiology of group B streptococcal disease: Risk factors,
prevention strategies, and vaccine development. Epidemiol. Rev.: vol. 16, n. 1, p. 374-402, 1994.
SENDI, P.; JOHANSSON, L. & NORRBY-TEGLUND, A.. Invasive group B streptococcal
disease in non-pregnant adults: A review with emphasis on skin and soft-tissue infections.
Infection: vol. 36, n.2, p. 100-111, 2008.
SEPPALA, H., KLAUKKA, T., VUOPIO-VARKILA, J., MUOTIALA, A., HELENIUS, H.,
LAGER, K., HUOVINEN, P. AND THE FINNISH GROUP FOR ANTIMICROBIAL
RESISTANCE. The effect of changes in the consumption of macrolide antibiotics on
erythromycin resistance in group A streptococci in Finland. N. Engl. J. Med.: n. 337, p. 441-446,
1997.
SILVA, C. H. P. de M.. Bacteriologia: um texto ilustrado. 1a edição. Rio de Janeiro: Editora
Eventos, 1999.
SKALKA, B. & SMOLA, J.. Lethal effect of CAMP-factor and UBERIS factor -- a new finding
about diffusible exosubstances of Streptococcus agalactiae and Streptococcus uberis. Zentralbl
Bakteriol A.: vol. 249, n. 2, p. 190-194, 1981.
48
SKOFF, T.H.; FARLEY, M.M., PETIT, S.; CRAIG, A.S.; SCHAFFNER, W.; GERSHMAN, K.;
HARRISON, L.H.; LYNFIELD, R.; MOHLE-BOETANI, J.; ZANSKY, S.; ALBANESE, B.A.;
STEFONEK, K.; ZELL, E.R.; JACKSON, D.; THOMPSON, T. & SCHRAG, S.J.. Increasing
burden of invasive group B streptococcal disease in nonpregnant adults, 1990-2007. Clin. Infect.
Dis.: vol. 19, n. 1, p. 85-92, 2009.
STEIGBIGEL, N.H. Erythromycin, lincomycin and clindamycin. In: Principles and practice of
infectious diseases. Nova Iorque: Churchill Livingstone, 1991.
SUTCLIFFE, J.; TAIT-KAMRADT, A. & WONDRACK, L.. Streptococcus pneumoniae and
Streptococcus pyogenes resistant to macrolides but sensitive to clindamycin: a common resistance
pattern mediated by an efflux system. Antimicrob. Agents Chemother.: vol. 40, n. 8, p. 1817-1824,
1996.
ULETT, K.B.; JUNIOR, W.H.B.; ZHUO, F.; XIAO, M.; KONG, F.; GILBERT, G.L.;
SCHEMBRI, M.A. & ULETT, G.C.. Diversity of group B streptococcus serotypes causing urinary
tract infection in adults. J. Clin. Microbiol.: vol. 47, n. 7, p. 2055-2060, 2009.
UTTLEY, A.H.C.; GEORGE, R.C.; NAIDOO, J.; WOODFORF, N.; JOHNSON, A.P.;
COLLONS, C.H.; MORRISON, D.; GILFILLAN, A.J.; FITCH, L.E. & HEPTONSTALL, J..
High level vancomycin-resistant enterococci causing hospital infections. Epiderm. Infect.: vol.
103, n.1, p.173-181, 1989.
VALLADA, E.P.. Manual de exames de urina. 4ª edição. Rio de Janeiro: Editora Atheneu, 1995.
VARMAN, M.; ROMERO, J. R.; CORNISH, N.E.; MANLEY, J.; MEZA, J.L.; ZACH, T.L. &
CHARTRAND, S.A.. Eur. J. Clin. Microbiol. Infect. Dis.: vol. 24, n.1, p. 431-433, 2005.
WU, H; RAJENDRA, P.J.; HO, Y.; HUNG, K.; WU, C.; YAN, J. & WU, J.. Emergence of
fluoroquinolone resistance in Group B Streptococcal isolates in Taiwan. Antimicrob. Agents and
Chemother.: vol. 52, n. 5, p. 1888-1890, 2008.
49
ZÁRATE, M.S.; JORDÁ-VARGAS, L.; PACHECO, M.V.; FERNANDEZ-CANIGIA, L. &
SMAYEVSKY, J.. Modified spot CAMP test: A rapid, inexpensive and accurate method for
identification of group B stretococci. Rev. Argent. Microbiol.: vol. 37, n. 1, p. 126-128, 2005.
ZHANG, G.W.; KOTIW, M. & DAGGARD, G.. A RAPD-PCR genotyping assay which
correlates with serotypes of group B streptococci. The Society for Applied Microbiology, Letters in
Applied Microbiology: v. 35, p. 247-250, 2002.
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