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Acta Scientiae Veterinariae. 33(3): 265-269, 2005.ORIGINAL ARTICLE ISSN 1678-0345 (Print) ISSN 1679-9216 (Online)

Pub. 634

Avaliao toxicolgica do Ginkgo biloba sobre a fertilidade e reproduo de ratos Wistar*Toxicological evaluation of Ginkgo biloba in Wistar rat fertility and reproductionAngela Ptter de Castro1, Fernanda Bastos de Mello2 & Joo Roberto Braga de Mello2

RESUMO

Ginkgo biloba uma planta usada como fitoterpico por demonstrar efeitos benficos sobre algumas funes cerebrais, especialmente no tratamento das doenas de Alzeimer e Parkinson. Este trabalho teve por objetivo avaliar a toxicidade reprodutiva do extrato de Ginkgo biloba administrado em ratos Wistar. Os animais foram tratados diariamente por via oral, na dose de 17 mg/kg com auxlio de uma sonda orogstrica e os resultados comparados a um grupo controle tratado com soluo fisiolgica na dose de 10 mL/kg . Os machos de ambos os grupos foram tratados por 91 dias, e as fmeas por 77 dias, no perodo de pracasalamento, acasalamento, gestao e lactao. Com relao ao desenvolvimento ponderal, consumo de gua e rao os animais tratados com extrato de Ginkgo biloba no apresentaram alteraes comparados ao grupo controle. No foram detectadas alteraes morfolgicas nos rgos internos, cuja massa relativa no diferiu do controle. No houve interferncia sobre a gestao, assim como os ndices reprodutivos e de desenvolvimento ps-natal no apresentaram alteraes significativas em relao ao grupo controle. A avaliao do lquido seminal do ducto deferente e dos testculos no mostrou diferena na morfologia espermtica e na contagem de clulas espermticas, comparadas ao grupo controle. Os filhotes de animais tratados com Ginkgo biloba apresentaram desenvolvimento ps-natal com aparecimento de caractersticas de desenvolvimento sexual dentro do perodo previsto para a espcie. De acordo com os resultados obtidos, conclui-se que o extrato de Ginkgo biloba em dose 10 vezes a recomendada com finalidade teraputica, no possui efeito negativo na reproduo de ratos. O fitoterpico pode ser considerado atxico sobre a reproduo de ratos. Descritores: Ginkgo biloba, toxicidade reprodutiva, fitoterpico.

ABSTRACT

Ginkgo biloba is a plant used as phytotherapic based in benefic cerebral effects, specialy in the treatment of Alzeimer and Parkinson disease. In this study we investigated the potencial reproductive toxicity of a Ginkgo biloba extract in Wistar rats. The animals received daily per os 17mg/kg of the extract and the results were compared to a control group (saline - 10mL/kg). Mature male rats were treated over a period of 91 days, while the female rats were treated during the pre-mating, mating, pregnancy and lactation periods (77 days). The daily evaluation of body weight, water and food consumptiom did not show any difference between the Ginkgo biloba and the control group. No morphological alteration on visceral organ was observed, and the relative weight was similar to the control. The pregnancy was not affected and the dams gave birth to normal litters. The reproductive and post-natal index didnt show significant differences between groups. The seminal fluid evaluation didnt show differences between Ginkgo biloba and control group in spermatic count and morphology. The general and sexual development of the Ginkgo biloba offspring was normal, considering the specie. It is concluded that the administration of the Ginkgo biloba extract, 10 times the proposed therapeutic dose did not affect rat reproduction. The phytotherapic can be considered no toxic in rata reproduction. Key words: Ginkgo biloba, reproductive toxicity, phytoterapic.

Received: March 2005

www.ufrgs.br/favet/revista

Accepted: July 2005

* Trabalho originado da Dissertao de Mestrado do primeiro autor. Programa de Ps-graduao em Cincias Veterinrias (PPGCV), FaVet/UFRGS, Porto Alegre/RS. 1Departamento de Cirurgia, Fundao Universidade do Rio Grande (FURG), Rio Grande/RS. 2Departamento de Farmacologia, Instituto de Cincias Bsicas da Sade (ICBS)/UFRGS. CORRESPONDNCIA: A.P. Castro [[email protected]].

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Castro A.P., Mello F.B. & Mello J.R.B. 2005. Avaliao toxicolgica do Ginkgo biloba sobre a fertilidade e reproduo de ratos Wistar. Acta Scientiae Veterinariae. 33: 265-269.INTRODUO

Em todo o mundo a utilizao de plantas medicinais vem sendo realizada como recurso teraputico, tanto na teraputica humana como veterinria. No Brasil a utilizao obteve sua oficializao (atravs da Farmacopia Brasileira) em 1929. Em pases como, Alemanha, China e Frana, este recurso representa cerca de 25% do arsenal Teraputico. Nos pases em desenvolvimento (75% da populao mundial), o porcentual chega a 80% do arsenal teraputico [9]. Os fitoterpicos sofrem uma grande restrio quanto ao uso e aceitao, devido ao reduzido nmero de estudos que comprovam sua ao biolgica e segurana quanto a efeitos txicos agudos, crnicos ou sobre a reproduo [9,10]. Os estudos toxicolgicos tm a finalidade de avaliar a idia errnea de que produtos fitoterpicos, por serem naturais, so isentos de efeitos txicos ou adversos, e que o uso popular de plantas medicinais serve como validao da eficcia de tais medicamentos [4]. O extrato das folhas de Ginkgo biloba mundialmente utilizado por apresentar efeitos benficos sobre algumas funes cerebrais. Seu extrato padronizado (EGb 761) tem sido mencionado como possibilidade teraputica para muitas seqelas ou danos causados por doenas neurodegenerativas [1-3]. Apesar da utilizao generalizada de Ginkgo biloba, no existem relatos sobre sua atividade toxicolgica, especialmente a toxicidade crnica e reprodutiva. O presente trabalho avaliou o efeito deste fitoterpico sobre a fertilidade e reproduo de ratos Wistar, usando o segmento I recomendado pela Food and Drug Administration (FDA) e Organization for Economic Cooperation and Development (OECD) para investigao de substncias com ao sobre a reproduo.MATERIAIS E MTODOS

O extrato de Ginkgo biloba, EGb 761, lote piloto n 99001, de procedncia Centroflora, lote L980913, foi fornecido pelo laboratrio Galenogal Farma, responsvel pela garantia de pureza do produto testado. A composio declarada do extrato seco liofilizado de Ginkgo biloba : 24% de glicosdeos flavonides, 6% de terpenos e excipientes como lactose, amido de milho, povidona, estearato de magnsio e talco. Foram utilizados 80 ratos albinos Wistar de ambos os sexos, sendo 10 machos e 30 fmeas para cada grupo, com idade aproximada de 120 dias, provenientes do Centro de Criao e Experimentao de Animais

de Laboratrio da UFRGS, com condies constantes de umidade, temperatura (21C 2) e ciclo de claro/escuro de 12 horas (claro das 9 s 21h), alimentados com rao comercial1 e gua vontade durante todo o perodo experimental. Os animais foram divididos aleatoriamente em dois grupos experimentais, contendo 10 machos e 30 fmeas em cada grupo. Todos receberam tratamento dirio por via oral com auxlio de uma sonda oro-gstrica, nas dosagens: grupo Ginkgo biloba dosagem diria de 17mg/kg de massa corporal, equivalente a 10 vezes a dosagem recomendada para seres humanos e um grupo controle tratado com soluo fisiolgica na dosagem de 10 mg/kg de massa corporal. Os machos foram tratados por 70 dias antes do acasalamento. As fmeas foram tratadas por 14 dias prvios ao acasalamento, durante o acasalamento, gestao e lactao (21 dias). O perodo de acasalamento teve durao de 21 dias, correspondente a trs ciclos de cinco dias consecutivos, com intervalo de 48 horas entre cada um dos ciclos. Na caixa de cada um dos machos, foram introduzidas trs fmeas virgens, permanecendo com eles durante as duas ltimas horas do perodo de escuro (entre 7 e 9 hs). Aps este perodo os animais foram separados e a constatao da prenhez foi realizada pela presena de espermatozides no esfregao vaginal, realizado diariamente e analisado ao microscpio ptico com aumento de dez vezes. Foi considerado primeiro dia de gestao, vinte e quatro horas aps a constatao de esfregao vaginal positivo. Nos machos foram avaliadas as seguintes variveis: massa corporal diria (g) durante 91 dias (antes e durante o acasalamento); consumo dirio de rao (g) e gua (ml) antes do acasalamento; peso relativo (%) das vsceras no dia do sacrifcio (fgado, bao, rins, corao, vescula seminal, prstata e epiddimo); anlise histopatolgica dos rgos enviados; nmero total de espermtides; produo diria de espermatozides; porcentual de alteraes morfolgicas nos espermatozides e aparecimento de sinais de toxicidade sistmica como: perda de peso progressiva e reduo na ingesto de gua e rao. Nas fmeas foram avaliados: massa corporal diria em (g) durante o pr-acasalamento, gestao e lactao;

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consumo dirio de rao (g) e gua (ml) durante o pracasalamento e gestao; peso relativo em (%) dos rgos ao final da lactao (fgado, rins, bao, corao, ovrios e tero); sinais de aborto, distocia e prolongamento do perodo gestacional; nmero de implantes uterinos; anlise das taxas reprodutivas; anlise histopatolgica dos rgos enviados e sinais de toxicidade sistmica como: perda de peso progressiva e reduo na ingesto de gua e rao.

Nos filhotes avaliou-se: alteraes macroscpicas externas em todos os filhotes nascidos; nmero de filhotes por ninhada; nmero de machos e fmeas nascidos; nmero de filhotes nascidos vivos; nmero de filhotes nascidos mortos; peso individual dos filhotes ao nascer; peso individual dos filhotes nos dias 0, 7, 14 e 21; e desenvolvimento fsico de caractersticas gerais e sexuais dos filhotes.

As fmeas apresentaram tempo de gestao conforme o previsto (21 a 23 dias), no havendo diferena significativa sobre a gestao. Nmero e massa corporal de filhotes normais, no diferindo significativamente das fmeas usada no grupo controle. Consumo de gua e rao e desenvolvimento ponderal no apresentaram qualquer diferena significativa. Os ndices reprodutivos e de desenvolvimento ps-natal no apresentaram alteraes significativas em relao ao grupo controle (Tabela 4). As proles nascidas de ratas tratadas durante o pr-acasalamento, acasalamento, gestao e lactao, noTabela 1. Massa relativa dos rgos (%) dos machos tratados durante 91 dias consecutivos com extrato de Ginkgo biloba na dose de 17 mg/kg e um grupo controle tratado com soluo fisiolgica na dosagem de 10 mL/kg. So apresentados os valores mdios epm.Massa relativa dos rgos (%) Corao Bao Fgado Rim direito Rim esquerdo Testculo direito Testculo esquerdo Epiddimo direito Controle n = 10 0,38 0,01 0,15 0,01 3,48 0,08 0,32 0,01 0,32 0,006 0,36 0,01 0,37 0,009 0,15 0,006 0,15 0,003 0,14 0,004 0,13 0,01

Ginkgo biloba n = 100,35 0,007 0,14 0,004 3,38 0,04 0,33 0,01 0,33 0,01 0,37 0,008 0,37 0,008 0,15 0,004 0,16 0,003 0,12 0,009 0,15 0,01

Os dados foram analisados por anlise de varincia (ANOVA). O teste de Tukey foi usado para identificar diferenas entre grupos. As porcentagens foram analisadas pelo teste Qui-quadrado. Adotou-se como estatisticamente significativo o nvel de 5% [5].RESULTADOS

Epiddimo esquerdo Vescula seminal vazia Prstata

No foram observadas alteraes significativas nos ratos tratados com Ginkgo biloba em comparao aos animais do grupo controle, quanto ao desenvolvimento ponderal. As oscilaes dirias no consumo de gua e rao no mantiveram relao com o desenvolvimento ponderal dos animais. No foram observadas alteraes morfolgicas nos rgos internos, cuja massa relativa no difere significativamente do controle (Tabela 1). O exame do lquido seminal do ducto deferente e dos testculos no mostrou diferenas na morfologia espermtica ou na contagem de clulas espermticas do grupo Ginkgo biloba comparado ao controle (Tabela 2). As fmeas tratadas durante os perodos de pracasalamento, acasalamento, gestao e amamentao no apresentaram alteraes comportamentais ou de respirao que indicassem toxicidade do fitoterpico. No se observou alteraes morfolgicas nos rgos internos, cuja massa relativa no diferiu significativamente do controle (Tabela 3).

n = nmero de animais por grupo.

Tabela 2. ndices de fertilidade dos ratos tratados durante 91 dias consecutivos com extrato de Ginkgo biloba 17 mg/kg e um grupo controle tratado com soluo fisiolgica na dosagem de 10 mL/kg. So apresentados os valores mdios epm.Controle n=30 Produo diria de espermatozides (x106)* Nmero de espermatozides (x106)** Espermatozides anormais (%)*

Ginkgo biloba n=3027,933,8 203,635,2 5,41,0

27,2 2,1 176,7 27,1 5,7 0,8

A produo diria de espermatozides foi medida a partir da contagem de clulas espermticas em cmara de Neubauer, a partir de macerados de testculos. Mello, 2001 [4]; **O nmero de espermatozides foi definido a partir de sua contagem em alquota do macerado da cauda do epiddimo em cmara de Neubauer. Mello, 2001 [4].

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Tabela 3. Massa relativa dos rgos (%) das fmeas tratados durante os perodos de pr-acasalamento, acasalamento, gestao e lactao, com extrato de Ginkgo biloba 17 mg/kg e um grupo controle tratado com soluo fisiolgica 10 mL/kg. So apresentados os valores mdios epm.Massa relativa dos rgos(%) Corao Bao Fgado Rim direito Rim esquerdo Ovrio direito Ovrio esquerdo tero Controle n = 30 0,4 0,007 0,17 0,01 5,21 0,22 0,38 0,006 0,38 0,01 0,01 0,001 0,01 0,001 0,08 0,04

Ginkgo biloba n = 300,38 0,01 0,16 0,005 4,99 0,11 0,38 0,004 0,37 0,007 0,01 0,001 0,01 0,001 0,09 0,007

mostrou diferena quanto ao desenvolvimento fsico psnatal em relao as proles das ratas controle, at o desmame, 21 dias. O desenvolvimento das caractersticas gerais como: descolamento dos pavilhes auriculares, surgimento da penugem, surgimento do pelo, erupo dos incisivos, abertura dos olhos e caractersticas sexuais como: descida dos testculos, separao prepucial e abertura do canal vaginal das prognies tratadas com extrato de Ginkgo biloba no apresentaram diferena com relao ao grupo controle. Esses dados no diferem dos dados histricos do Departamento de Farmacologia da UFRGS, para o aparecimento dessas caractersticas.DISCUSSO

n = nmero de animais por grupo.

Tabela 4. ndices de fertilidade e taxas reprodutivas de ratas tratadas diariamente durante o pr acasalamento, acasalamento, gestao e lactao com extrato de Ginkgo biloba 17 mg/kg e um grupo controle tratado com soluo fisiolgica 10 mL/kg. So apresentados os valores mdios epm.ndices de fertilidade e taxas reprodutivas Fmeas prenhes Filhotes Filhotes/ninhada Peso do filhote ao nascer (g) Taxa de natalidade Taxa de viabilidade Taxa de desmame Taxa de gestao Taxa de perdas ps-implantao Alteraes macroscpicas fetais Controle 6 69 11,50,65 5,870,09 100 100 98 90 6 Nihil

Ginkgo biloba12 122 10,170,8 6,020,31 92 91 98 100 6 Nihil

Taxa de natalidade = n de filhotes nascidos vivos/n de filhotes nascidos x 100 Taxa de viabilidade = n de filhotes vivos at o 4 dia de lactao/n de filhotes nascidos vivos x 100 Taxa de desmame = n de filhotes ao desmame/n de filhotes nascidos vivos x 100 Taxa de gestao = n de fmeas prenhez/n de fmeas com espermatozides no esfregao vaginal x 100 Taxa de perdas ps-implantao = n de stios de implantao - n de fetos nascidos/n de stios de implantao x 100

A dose diria de Ginkgo biloba usada no presente estudo representa dez vezes a recomendada para seres humanos no tratamento de distrbios neurodegenerativos [1-3]. A relao de dez vezes, representa uma relativa segurana para a substncia qumica ou para o fitoterpico, ou ainda, baixa toxicidade [7,8]. Esta dose foi escolhida para a aferio de um possvel ndice teraputico (IT), que por definio, representa a relao entre a dose letal para 50% dos indivduos (DL50) e a dose eficaz para 50% dos indivduos (DE50). Para a segurana farmacolgica, uma definio mais conservadora a que relaciona a dose letal para 1% dos indivduos, ou ainda a menor dose capaz efeitos adversos (LOEL) em relao a maior dose incapaz de produzir efeitos adversos (NOEL). Considerando a dose diria utilizada de 17mg/kg e a durao do tratamento, o fitoterpico pode ser considerado atxico [8]. Toxicidade sistmica pode ser diagnosticada pela diminuio da massa corporal dos animais, diminuio do desenvolvimento ponderal, do consumo de gua e rao, pelo aparecimento de alteraes comportamentais como apatia, prostrao, pelos arrepiados, alm de alteraes na massa relativa dos rgos [6]. A administrao de Ginkgo biloba no determinou qualquer alterao nas variveis relacionadas com toxicidade sistmica, confirmando os resultados dos estudos multicntricos com o fitoterpico [1-3]. Substncias txicas ou produtos de sua biotransformao no organismo podem atravessar a barreira testicular, atuar sobre os tipos celulares existentes no testculo e, interferir na espermatognese e/ou esteroidognese. Redues no nmero e produo diria de espermatozides podem ser originados de leses do epitlio germinativo [11]. Os resultados observados quanto fer-

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tilidade dos machos indicam para a inexistncia de toxicidade reprodutiva para os ratos tratados com Ginkgo biloba. As taxas reprodutivas proporcionam em conjunto um excelente indicador da interferncia de diferentes substncias qumicas sobre a reproduo, podendo inclusive identificar o perodo no qual os efeitos txicos reprodutivos ocorreram [8]. No foram observadas diferenas estatisticamente significativas nas taxas reprodutivas dos animais tratados com Ginkgo biloba, o que reitera a ausncia de toxicidade reprodutiva. Durante a gestao, o peso das ninhadas pode ser influenciado pela capacidade intra-uterina, pelo tamanho da ninhada e pela durao da gestao. Aps o nascimento, alm da habilidade da fmea, o efeito de substncias qumicas pode comprometer o desenvolvimento [6]. No caso dos filhotes de ratos tratados com Ginkgo biloba no foram observadas alteraes no desenvolvimento ponderal e geral dos filhotes, descida de testculos bolsa escrotal, separao prepucial e abertu-

ra do canal vaginal. Portanto, os resultados no evidenciam interferncia de Ginkgo biloba sobre o desenvolvimento das proles.CONCLUSES

Pode-se concluir que a administrao do extrato seco liofilizado de Ginkgo biloba, na dose de 17 mg/kg em ratos Wistar, no interfere na reproduo e no desenvolvimento ponderal de machos, fmeas e caractersticas sexuais e de desenvolvimento dos seus filhotes. Considerando que o ndice teraputico a relao entre DL50 e DE50, podemos concluir que o ndice do extrato seco liofilizado de Ginkgo biloba para ratos maior que 10. Os resultados permitem concluir que o extrato seco liofilizado de Ginkgo biloba pode ser considerado praticamente atxico.NOTA INFORMATIVA1

Nuvilab CR1 - Nuvital, Colombo/PR.

REFERNCIAS

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